Ines abilidad de la
ho quilla de eplicación
p o ocada po los
in e media ios de la u a
de epa ación po escisión
de bases
Tesis doc o al
Ma ía José Peña Gómez
Depa amen o de Gené ica
Facul ad de Biología
Ines abilidad de la ho quilla de eplicación
p o ocada po los in e media ios de la u a
de epa ación po escisión de bases
Tesis doc o al p esen ada po Ma ía José Peña Gómez, g aduada en Biomedicina Básica y
Expe imen al y con un más e en Fisiología y Neu ociencia, pa a op a al g ado de Doc o
en Biología Molecula , Biomedicina e In es igación Clínica po la Uni e sidad de Se illa
Di ec o de Tesis: I án Valle Rosado
Se illa, 2024
Ins i u o de Biomedicina de Se illa (IBiS)
Cen o Andaluz de Biología Molecula y Medicina Regene a i a (CABIMER)
I án Valle Rosado, p o eso con a ado doc o del depa amen o de Gené ica, Facul ad de
Biología, de la Uni e sidad de Se illa e in es igado p incipal del g upo “Replicación y
daño endógeno en el ADN” en CABIMER, ce i ica que la p esen e memo ia i ulada
“Ines abilidad de la ho quilla de eplicación p o ocada po los in e media ios de la u a de
epa ación po escisión de bases” ha sido ealizada po Ma ía José Peña Gómez bajo la
di ección de quien susc ibe, y cumple la condiciones exigidas pa a op a al í ulo de Doc o
en Biología Molecula , Biomedicina e In es igación Clínica po la Uni e sidad de Se illa.
I án Valle Rosado
FINANCIACIÓN
El abajo de in es igación desc i o en es a memo ia ha sido ealizado en el Ins i u o de
Biomedicina de Se illa (IBiS) y en el Cen o Andaluz de Biología Molecula y Medicina
Regene a i a (CABIMER).
Pa a su ejecución, el abajo de in es igación ha con ado con la colabo ación de los
siguien es P og amas de In es igación:
- Financiación adicional pa a la con a ación labo al de Doc o es po Cen o de
In es igación y Desa ollo (Ac uación Ramón y Cajal) del Minis e io de Ciencia y
Uni e sidades (RYC-2015-18670)
- Plan Es a al 2017-2020 Re os - P oyec os I+D+i del Minis e io de Ciencia,
Inno ación y Uni e sidades (RTI2018-100692-B-I00)
- P oyec os de In es igación en Salud de la Jun a de Andalucía (Conseje ía de Salud)
(PI-0005-2018)
- PAIDI 2018: P oyec os I+D+i de la Jun a de Andalucía (Conseje ía de Economía y
Conocimien o) (P18-RT-1271)
- P oyec os I+D+i FEDER Andalucía 2014-2020 de la Jun a de Andalucía
(Conseje ía de Economía, Conocimien o, Emp esas y Uni e sidad) (US-1381081)
- Plan Es a al 2021-2023 - P oyec os In es igación O ien ada del Minis e io de
Ciencia e Inno ación (PID2021-128988OB-I00)
Ma ía José Peña Gómez ha dis u ado de un con a o como Ti ulado Supe io con o me a
la Ley 12/2001 de 9 de julio (BOE de 10 de julio) especialmen e po su Disposición
adicional sép ima, po la Ley 14/2011 de 23 de diciemb e, y eal Dec e o 2.720/1998 de 18
de diciemb e (BOE de 8 de ene o), a ca go de los p oyec os RYC-2015-18670, RTI2018-
100692-B-I00 y P18-RT-1271, y de una ayuda p edoc o al inanciada po el p oyec o de
Con a ación de Pe sonal In es igado en Fo mación (Con oca o ia 2021) de la Jun a de
Andalucía (Conseje ía de T ans o mación Económica, Indus ia, Conocimien o y
Uni e sidades), con nº de expedien e PREDOC_00505.
AGRADECIMIENTOS
Después de 7 años es di ícil empeza . En p ime luga , quie o ag adece a I án su con ianza,
po apos a po aquella muchacha que llegó a su labo a o io sin ninguna expe iciencia, solo
con ganas de hace ciencia y ap ende . G acias po apos a po mí, po e mi po encial y
explo a lo al máximo, ya que g acias a eso has hecho que sea capaz de di undi ciencia a
a és de los di e en es cong esos a los que hemos asis ido, a e mundo y conoce a
pe sonas ele an es en nues o campo. G acias po enseña me a se mejo cien í ica.
G acias mamá, papá y he mana po odo ues o apoyo en es os años. A pesa de no
en ende mi abajo, de no en ende las ho as y los días que pasaba delan e del o denado ,
de los es i os y ines de semana yendo al labo a o io po que enía un expe imen o
impo an e, siemp e habéis es ado ahí dándome ue za pa a no abandona el camino, y al
inal lo he conseguido. G acias po no habe me dejado cae cuando me han al ado ue zas
pa a con inua , sob e odo du an e el úl imo año. Siemp e habéis es ado pa a da me el
ab azo que necesi aba. Sin ues a ayuda es o no hubie a sido posible.
And és, mi iel compañe o que ha su ido es a esis conmigo más que ninguno. G acias po
no abandona el ba co, g acias po habe seguido ahí a pesa de lo abandonado que has
es ado po mi, po que a pesa de los “mañana sábado/domingo engo que i ” u “hoy e a un
expe imen o la go y oy a llega a de”, siemp e has es ado pa a da me la ue za que
muchos días me ha al ado y po le an a me cada ez que ha habido un p oblema, o se el
p ime ab azo que he dado después de habe publicado un a ículo o habe sido
seleccionada pa a pode asis i a un cong eso. G acias y mil g acias po habe es ado, es a
y sé que siemp e es a ás. Hemos llegado al inal y sin i no hubie a podido hace lo.
Mis amigos… Mi abajo y mis células un mundo pa a ellos. Un abajo “muy abs ac o
que no se e”, pe o siemp e han es ado pa a saca me una son isa y da me palab as de apoyo
cada ez que he es ado bas an e agobiada. Du an e es os años habéis celeb ado conmigo
cada a ículo publicado o cada cong eso al que he asis ido como si ue a un log o ues o.
Habéis es ado p esen es en cada a en u a de mis iajes a los cong esos, p eocupados po
mi llegada y mi uel a, po que ambién pod ía esc ibi un lib o con cada una de las
anécdo as que he su ido. G acias po se mis amigos y una pa e de es a esis os la dedico
a oso os.
Sé que me quedo co a con lo que pongo, odas las pe sonas que han es ado ahí
con ibuyendo a que es a esis haya sido posible se me ecen mucho más, pe o ellos saben
lo que les quie o y lo impo an e que ha sido ene los a mi lado du an e es os años.
Compañe os de labo a o io, an o del IBiS como de CABIMER. Cla a, g acias po
enseña me odo lo que sé. Fuis e la p ime a que me acogió cuando llegué al g upo y siemp e
has es ado ahí pa a cada duda que he enido. G acias po odos los consejos que me has
dado y po odo u conocimien o. Fe nando, Diana, Espe, Joaquín, Ca men y José, con
oso os empezó es a a en u a en el labo a o io 212 y me sien o muy o gullosa de e como
inalmen e odos es amos e minando es a e apa y hemos log ado nues o obje i o. G acias
po odos los lab mee ings, que a pesa de empeza con miedo y con mi “chule a” delan e
de las diaposi i as, habéis sido muy impo an es en odos los pasos que he dado du an e
es e iempo y me habéis ayudado mucho. A las pe sonas que he conocido en CABIMER y
especialmen e al labo a o io CT4, habéis sido pa e del inal de es a esis y siemp e ais a
ene un espacio especial en mi. I ene, g acias po cada cha la que hemos enido al inal de
la gos días de expe imen os, he sen ido u apoyo du an e es os años y e ag adezco los
AGRADECIMIENTOS
consejos y las palab as de ánimo que me has dado. Yaiza y Ma a, llegás eis al g upo al
inal de es a e apa, pe o habéis sido un g an apoyo en es e iempo. G acias po las comidas
en “La Manuela”, po las o ganizaciones de la campana de cul i o pa a pode cuad a nos
las 3, y, sob e odo, po habe me acompañado en es a úl ima e apa, no me he sen ido sola
y eso os lo ag adezco.
Lau a, Me cedes y Paula, con oso as empezó odo aquel año 2013 cuando empezamos la
ca e a y no sabíamos qué nos iba a depa a el u u o, y a pesa de la dis ancia, habéis es ado
ahí. He sido la úl ima en consegui lo, pe o al inal “HABEMUS TESIS”.
GRACIAS, GRACIAS Y MIL GRACIAS.
ÍNDICE
1. INTRODUCCIÓN……………………………………………………………...
29
1.1. La eplicación del ADN y el es és eplica i o……………………………..
31
1.1.1. Replicación del ADN………………………………………………...
31
1.1.2. Es és eplica i o…………………………………………………….
34
1.1.2.1. Sín esis de anslesión (TLS)…………………………….....
36
1.1.2.2. Re e sión de la ho quilla de eplicación……………………
36
1.1.2.3. Recebado o ep iming……………………………………...
37
1.2. Los mecanismos de epa ación del ADN…………………………………..
38
1.2.1 El papel de la u a de epa ación Anemia de Fanconi (AF) pa a la
eliminación de los ICLs…………………………………………………….
39
1.2.2. El papel de la u a de epa ación po escisión de bases (BER) en la
eliminación de bases de ADN modi icadas…………………………………
41
1.2.3. Los mecanismos de epa ación de DSBs……………………………..
44
1.2.3.1. La u a de epa ación po unión de ex emos no homólogos
(NHEJ)……………………………………………………………...
44
1.2.3.2. La u a de epa ación po ecombinación homóloga (HR)….
45
1.3. Fac o es que es abilizan la ho quilla de eplicación en e al es és
eplica i o………………………………………………………………………
47
1.3.1. Componen es de la u a de epa ación AF que p esen an un papel en
el man enimien o de la es abilidad de la ho quilla de eplicación…………...
47
1.3.2. Componen es de la u a de epa ación BER que ienen unciones
elacionadas con el man enimien o de la es abilidad de la ho quilla de
eplicación………………………………………………………………….
50
1.4. La p esencia de huecos de ssDNA como uen e de daño en el ADN……….
52
1.5. HMCES, un ac o p o ec o de los si ios AP………………………………
54
1.6. La p esencia de bases de ADN modi icadas en el genoma puede causa
es és eplica i o……………………………………………………………
56
2. OBJETIVOS……………………………………………………………………
59
3. MATERIALES Y MÉTODOS………………………………………………...
63
3.1. P ocedimien os cul i os celula es………………………………………….
65
3.1.1. Líneas celula es……………………………………………………...
65
3.1.2. Cul i o celula ……………………………………………………….
65
3.2. Técnicas de biología celula ………………………………………………..
65
3.2.1. T ans ección con ARN pequeño de in e e encia (siRNA; del inglés
small in e e ing RNA)……………………………………………………...
65
3.2.2. T ans ección con plásmidos………………………………………….
66
3.2.3. Gene ación de líneas celula es mu an es median e la écnica
CRISPR-Cas9………………………………………………………………
66
3.2.4. Reacción celula Click-iT…………………………………………….
68
3.2.5. Análisis del ciclo celula ……………………………………………..
68
3.2.6. Inmuno luo escencia………………………………………………...
68
3.2.7. De ección de células B dU+ median e inmuno luo escencia………....
69
3.2.8. SIRF (in si u P o ein In e ac ion wi h Nascen DNA Replica ion
Fo ks)………………………………………………………………………
69
3.2.9. Ensayo de abe aciones c omosómicas………………………………
71
3.2.10. Ensayo de in e cambio de c omá idas he manas (SCEs)……………
72
3.2.11. Ensayo de iabilidad MTT………………………………………….
72
3.2.12. Ensayo de clonogenicidad…………………………………………..
73
3.3. Técnicas de biología molecula …………………………………………….
73
3.3.1. Wes e n Blo ………………………………………………………….
73
ÍNDICE
3.3.2. iPOND (Isola ion o P o eins on Nascen DNA)……………………..
74
3.3.3. Ensayo de e ención en c oma ina……………………………………
75
3.3.4. Ensayo de ib as de ADN…………………………………………….
76
3.3.5. Ensayo de come as en condiciones alcalinas…………………………
77
3.3.6. Mic oscopía elec ónica……………………………………………...
77
3.4. Análisis es adís icos………………………………………………………..
79
3.5. Tabla de ma e iales………………………………………………………...
79
3.5.1. Líneas celula es……………………………………………………...
79
3.5.2. siRNA………………………………………………………………..
80
3.5.3. Plásmidos…………………………………………………………….
81
3.5.4. An ibió icos de selección…………………………………………….
81
3.5.5. Reac i os…………………………………………………………….
82
3.5.6. An icue pos…………………………………………………………..
83
4. RESULTADOS…………………………………………………………………
85
4.1. CAPÍTULO 1: XRCC1 p e iene la ines abilidad de la ho quilla de
eplicación du an e la inco po ación e ónea de la base de ADN modi icada
5hmdU………………………………………………………………………….
87
4.1.1. La exposición a 5hmdC o a 5 dC desencadena la ac i ación de la u a
BER en la línea celula humana U2OS……………………………………...
89
4.1.2. XRCC1 man iene la es abilidad genómica y la supe i encia celula
as la exposición a 5hmdC…………………………………………………
93
4.1.3. XRCC1 man iene la es abilidad de la ho quilla de eplicación du an e
la eliminación de la 5hmdC…………………………………………………
96
4.1.4. El eclu amien o de PARP1 a la c oma ina exace ba el daño en el
ADN mediado po la 5hmdC en ausencia de XRCC1………………………
97
4.1.5. El a amien o con 5hmdU ecapi ula los eno ipos de ines abilidad
genómica y de a es o/bloqueo de la ho quilla de eplicación mediados po
5hmdC en ausencia de XRCC1……………………………………………..
100
4.2. CAPÍTULO 2: FANCD2 man iene la es abilidad del genoma du an e la
inco po ación e ónea de la base hid oxime ilada 5hmdU……………………...
105
4.2.1. El a amien o con 5hmdC desencadena la DDR en las células
de icien es en FANCD2…………………………………………………….
107
4.2.2. La 5hmdC se desamina a 5hmdU in i o y se inco po a du an e la
eplicación del ADN………………………………………………………..
114
4.2.3. La inco po ación de la 5hmdU p o oca daño en el ADN asociado a
la ase S del ciclo celula y bloquea la p og esión de la ho quilla de
eplicación………………………………………………………………….
116
4.2.4. La 5hmdU induce la deg adación nucleolí ica del ADN nacien e as
el bloqueo de la ho quilla de eplicación……………………………………
121
4.2.5. El inc emen o de PARP1 unido a c oma ina exace ba los eno ipos
obse ados en ausencia de FANCD2 as la inco po ación de la 5hmdU…...
125
4.2.6. La inco po ación e ónea de la 5hmdU du an e la sín esis de ADN
induce la ac i ación de la u a de epa ación HR……………………………
128
4.3. CAPÍTULO 3: Ines abilidad de la ho quilla de eplicación inducida po los
in e media ios de la u a de epa ación BER en ausencia de FANCD2…………
131
4.3.1.Los huecos de ssDNA que su gen po las ac i idades coo dinadas de
SMUG1 y APEX1/2 du an e la eliminación de la 5hmdU del ADN nacien e
son esponsables de los eno ipos de ines abilidad de la ho quilla de
eplicación………………………………………………………………….
133
ÍNDICE
4.3.2. La pe sis encia de los SSBs en la ho quilla de eplicación exace ba
la le alidad celula en la línea celula Fancd2-/-……………………………..
142
4.4. CAPÍTULO 4: HMCES pe u ba la es abilidad de la ho quilla de
eplicación du an e la inco po ación e ónea de la 5hmdU……………………..
147
4.4.1. La unión de HMCES con los si ios AP en la cadena nacien e,
gene ados as la eliminación de la 5hmdU, es esponsable de la o mación
de los huecos de ssDNA en las células de icien es en FANCD2……………
149
4.4.2. PRIMPOL es esponsable de la gene ación de un subconjun o de
huecos de ssDNA as la inco po ación de la 5hmdU……………………….
159
5. DISCUSIÓN…………………………………………………………………….
165
6. CONCLUSIONES……………………………………………………………...
183
7. BIBLIOGRAFÍA……………………………………………………………….
187
8. APÉNDICES……………………………………………………………………
199
ÍNDICE
ÍNDICE DE FIGURAS
Figu a I1. Esquema simpli icado de la sín esis de la heb a con inua y la heb a
ezagada du an e la eplicación del ADN………………………………………….
32
Figu a I2. P oceso de eplicación del ADN……………………………………….
34
Figu a I3. Lesiones gene adas po uen es endógenas y exógenas que causan
es és eplica i o…………………………………………………………………..
35
Figu a I4. Mecanismos de DDT…………………………………………………..
38
Figu a I5. Esquema simpli icado del mecanismo de epa ación de un ICL po la
u a de epa ación AF……………………………………………………………...
41
Figu a I6. Modelo de la u a de epa ación BER…………………………………..
43
Figu a I7. Mecanismo de acción de la u a de epa ación NHEJ…………………..
45
Figu a I8. Esquema simpli icado del mecanismo de epa ación HR……………...
46
Figu a I9. Mecanismo de acción de los PARPi……………………………………
53
Figu a I10. Mecanismo de p o ección de los si ios AP en ssDNA po la unión
co alen e de HMCES……………………………………………………………...
55
Figu a I11. Es uc u a química de los di e en es de i ados de la ci osina…………
57
Figu a M1. Rep esen ación de la localización de los guías de ARN elegidos pa a
la gene ación de mu an es median e la écnica CRISPR-Cas9……………………..
67
Figu a M2. Secuenciación del plásmido PX458 as la inse ción de los guías de
ARN pa a la ealización de la écnica CRISPR-Cas9……………………………...
67
Figu a M3. Esquema de la écnica SIRF pa a de ec a la asociación de p o eínas
con el ADN nacien e………………………………………………………………
70
Figu a C1.1. La u a de epa ación BER…………………………………………..
89
Figu a C1.2. Ensayo de e ención en c oma ina de XRCC1-RFP (X1-RFP)……...
90
Figu a C1.3. La inco po ación e ónea de la 5hmdC y la 5 dC induce el
eclu amien o de XRCC1-RFP a la c oma ina y un inc emen o de los ni eles
nuclea es de PAR………………………………………………………………….
91
Figu a C1.4. La inco po ación e ónea de la 5hmdC y la 5 dC induce un
inc emen o de los ni eles nuclea es de γH2AX concomi an e al eclu amien o de
XRCC1-RFP a c oma ina………………………………………………………….
92
Figu a C1.5. La e ención en c oma ina de XRCC1-RFP ocu e p incipalmen e
en células en ase S………………………………………………………………...
93
Figu a C1.6. Las células X cc1-/- son sensibles a MMS, a 5hmdC y en meno
medida a 5 dC……………………………………………………………………..
94
Figu a C1.7. La exposición a 5hmdC inc emen a los ni eles nuclea es de PAR y
γH2AX en las células X cc1-/-……………………………………………………...
95
Figu a C1.8. La exposición a 5hmdC inc emen a la ecuencia de abe aciones
c omosómicas en las células de icien es en XRCC1………………………………
96
Figu a C1.9. La inco po ación de la 5hmdC al e a la es abilidad de la ho quilla
de eplicación en las células de icien es en XRCC1……………………………….
97
Figu a C1.10. La inco po ación de la 5hmdC p o oca el eclu amien o de PARP1
a la c oma ina……………………………………………………………………...
98
Figu a C1.11. El a amien o combinado de 5hmdC y olapa ib exace ba el
eclu amien o de PARP1 a la c oma ina y los ni eles nuclea es de γH2AX……….
99
Figu a C1.12. La combinación de olapa ib y 5hmdC inc emen a la ines abilidad
de la ho quilla de eplicación y la le alidad celula de las células X cc1-/-………….
100
Figu a C1.13. El a amien o con 5hmdU disminuye la iabilidad celula ,
inc emen a los ni eles nuclea es de PAR y γH2AX y la ecuencia de abe aciones
c omosómicas en las células de icien es en XRCC1………………………………
101
ÍNDICE
Figu a C1.14. La inco po ación de la 5hmdU impac a en la p og esión de la
ho quilla de eplicación e induce la deg adación nucleolí ica del ADN en las
células X cc1-/-…………………………………………………………………….
102
Figu a C1.15. El a amien o con 5hmdU p omue e el eclu amien o de PARP1
a la c oma ina……………………………………………………………………...
102
Figu a C1.16. El a amien o combinado de olapa ib y 5hmdU exace ba los
ni eles nuclea es de γH2AX, la ines abilidad de la ho quilla de eplicación y la
le alidad celula de las células X cc1-/-……………………………………………..
103
Figu a C1.17. Modelo p opues o pa a la unción de XRCC1 du an e la
eliminación de la base de ADN hid oxime ilada 5hmdU…………………………..
104
Figu a C2.1. Las células Fancd2-/- exhiben sensibilidad as la exposición a
cispla ino y a 5hmdC………………………………………………………………
108
Figu a C2.2. Gene ación de la línea celula eHAP de icien e en FANCD2……….
109
Figu a C2.3. Las células eHAP FANCD2- son sensibles a cispla ino y a 5hmdC…
110
Figu a C2.4. Inc emen o de la le alidad celula de la línea celula MDA-MB-436
as la exposición a 5hmdC………………………………………………………...
110
Figu a C2.5. El a amien o con 5hmdC inc emen a los ni eles nuclea es de PAR
y γH2AX en las células Fancd2-/-………………………………………………….
111
Figu a C2.6. Inc emen o de la ecuencia de abe aciones c omosómicas en las
células de icien es en FANCD2 as la exposición a 5hmdC………………………
112
Figu a C2.7. A es o del ciclo celula en la ase G2/M y ac i ación del pun o de
con ol de ase S as la exposición a 5hmdC………………………………………
113
Figu a C2.8. La depleción de DCTD esca a la iabilidad celula as la
exposición a 5hmdC en las células Fancd2-/-……………………………………....
115
Figu a C2.9. La depleción de DCK esca a la iabilidad celula as la exposición
a 5hmdC en las células Fancd2-/-…………………………………………………..
115
Figu a C2.10. La inco po ación de la 5hmdU inc emen a los ni eles nuclea es de
PAR p incipalmen e en las células en ase S……………………………………….
116
Figu a C2.11. El a amien o con 5hmdC induce la co-p ecipi ación de EdU
(ADN nacien e) jun o con γH2AX en las células de icien es en FANCD2………...
117
Figu a C2.12. La exposición a 5hmdC inc emen a el núme o de ocos EdU-PAR
en las células Fancd2-/-…………………………………………………………….
118
Figu a C2.13. El a amien o con 5hmdC inc emen a la ecuencia de SSBs en las
células Fancd2-/-……………………………………………………………….......
119
Figu a C2.14. La inco po ación de la 5hmdU al e a la p og esión de la ho quilla
de eplicación e inc emen a el índice de asime ía en las células Fancd2-/-………...
120
Figu a C2.15. La exposición a 5hmdC du an e 3h no ac i a el pun o de con ol
de ase S…………………………………………………………………………...
121
Figu a C2.16. La inco po ación de la 5hmdU induce la deg adación nucleolí ica
del ADN…………………………………………………………………………...
122
Figu a C2.17. La exposición a 5hmdC inc emen a la ecuencia de amos de
ssDNA en las células Fancd2-/-…………………………………………………….
123
Figu a C2.18. La deg adación nucleolí ica del ADN nacien e depende de la
ac i idad de las nucleasas MRE11 y DNA2……………………………………….
124-
125
Figu a C2.19. El a amien o combinado de olapa ib y 5hmdC exace ba el de ec o
en la p og esión de la ho quilla de eplicación obse ado en las células Fancd2-/-.
126
Figu a C2.20. La combinación de olapa ib con la 5hmdC exace ba el inc emen o
del núme o de ocos de γH2AX y la ecuencia de abe aciones c omosómicas
obse adas en las células Fancd2-/- ………………………………………………..
127
ÍNDICE
Figu a C2.21. El a amien o combinado de olapa ib y 5hmdC inc emen a de
o ma sine gís ica la le alidad celula obse ada en las células Fancd2-/-………….
127
Figu a C2.22. La exposición a 5hmdC inc emen a la ecuencia de SCEs, la cual
se exace ba as el a amien o combinado con olapa ib…………………………...
129
Figu a C3.1. Ac i idad de la u a de epa acion BER asociada a la ho quilla de
eplicación…………………………………………………………………………
133
Figu a C3.2. Depleción de la glicosilasa de ADN SMUG1……………………….
134
Figu a C3.3. La depleción de SMUG1 disminuye los ni eles nuclea es de PAR
asociados a ase S y el núme o de ocos EdU-PAR inducidos po la exposición a
5hmdC en las células Fancd2-/-…………………………………………………….
135
Figu a C3.4. La depleción de SMUG1 disminuye la ecuencia de SSBs as la
exposición a 5hmdC en las células Fancd2-/-………………………………………
136
Figu a C3.5. La depleción de SMUG1 esca a la ines abilidad de la ho quilla de
eplicación y la iabilidad celula de las células Fancd2-/- expues as a 5hmdC…….
137
Figu a C3.6. Depleción de la endonucleasa APEX1……………………………...
137
Figu a C3.7. La depleción de APEX1 disminuye los ni eles nuclea es de PAR
asociados a ase S y el núme o de ocos EdU-PAR en las células Fancd2-/- as la
exposición a 5hmdC……………………………………………………………….
138
Figu a C3.8. La depleción de APEX1 disminuye la o mación de SSBs debida a
la inco po ación de la 5hmdU en las células Fancd2-/-……………………………..
139
Figu a C3.9. La depleción de APEX1 esca a de o ma pa cial la ines abilidad de
la ho quilla de eplicación y la iabilidad de las células Fancd2-/- expues as a
5hmdC……………………………………………………………………………..
140
Figu a C3.10. La co-depleción de APEX1 y APEX2 sup ime los ni eles
nuclea es de PAR asociados a ase S y la o mación de ocos EdU-PAR en las
células Fancd2-/- expues as a 5hmdC……………………………………………...
141
Figu a C3.11. La co-depleción de APEX1 y APEX2 sup ime la o mación de
SSBs y la le alidad celula dependien es de la inco po ación de la 5hmdU en las
células Fancd2-/- …………………………………………………………………..
142
Figu a C3.12. Esquema ep esen a i o de la acumulación de SSBs as la pé dida
de PARP1 o XRCC1………………………………………………………………
143
Figu a C3.13. Los ni eles nuclea es de PAR asociados a la eplicación son
dependien es de PARP1 y la depleción de PARP1 exace ba la le alidad obse ada
en las células Fancd2-/- expues as a 5hmdC………………………………………..
144
Figu a C3.14. La depleción de XRCC1 exace ba los ni eles nuclea es de PAR
asociados a la eplicación mediados po la inco po ación e ónea de la 5hmdU en
las células de icien es en FANCD2………………………………………………..
145
Figu a C3.15. La depleción de XRCC1 exace ba la le alidad celula mediada po
el a amien o con 5hmdC, pe o no impac a en la es abilidad de la ho quilla de
eplicación en las células Fancd2-/-………………………………………………...
146
Figu a C4.1. Gene ación de las líneas celula es que sob eexp esan la
cons ucción MmHMCES-FLAG…………………………………………………
149
Figu a C4.2. HMCES-FLAG se eclu a a c oma ina as la inco po ación e ónea
de la 5hmdU……………………………………………………………………….
150
Figu a C4.3. La inco po ación de la 5hmdU induce el eclu amien o de HMCES
a la c oma ina……………………………………………………………………...
151
Figu a C4.4. La depleción de APEX1 disminue el eclu amien o de HMCES-
FLAG a la c oma ina………………………………………………………………
152
ÍNDICE
Figu a C4.5. La depleción de HMCES disminuye los ni eles nuclea es de PAR
y el núme o de ocos EdU-PAR obse ados en las células Fancd2-/- expues as a
5hmdC……………………………………………………………………………..
153
Figu a C4.6. La depleción de HMCES inc emen a los ni eles nuclea es de
γH2AX en condiciones sin a amien o, pe maneciendo sin cambios as la
exposición a 5hmdC……………………………………………………………….
154
Figu a C4.7. La depleción de HMCES sup ime la o mación de SSBs causada
po la exposición a 5hmdC en las células de icien es en FANCD2………………...
155
Figu a C4.8. La depleción de HMCES es au a la es abilidad de la ho quilla de
eplicación as la inco po ación de la 5hmdU en las células Fancd2-/-…………….
156
Figu a C4.9. La depleción de HMCES disminuye la ecuencia de abe aciones
c omosómicas e inc emen a la supe i encia celula en las células Fancd2-/-
expues as a 5hmdC………………………………………………………………...
157
Figu a C4.10. La depleción de HMCES inc emen a la iabilidad celula de las
células BRCA2-/- as la exposición a 5hmdC………………………………………
158
Figu a C4.11. La co-depleción de HMCES con APEX1 o con APEX2 disminuye
de o ma epis á ica los ni eles nuclea es de PAR asociados a ase S y la le alidad
celula en las células Fancd2-/- expues as a 5hmdC………………………………..
159
Figu a C4.12. La depleción de PRIMPOL disminuye pa cialmen e los ni eles
nuclea es de PAR dependien es del p ocesamien o de la 5hmdU en las células
Fancd2-/-…………………………………………………………………………...
160
Figu a C4.13. La depleción de PRIMPOL sup ime pa cialmen e la o mación de
ocos EdU-PAR y de SSBs en las células Fancd2-/- expues as a 5hmdC…………..
161
Figu a C4.14. La depleción de PRIMPOL esca a pa cialmen e la iabilidad
celula de las células de icien es en FANCD2 expues as a 5hmdC………………...
162
Figu a C4.15. La co-depleción de PRIMPOL y HMCES disminuye de o ma
epis á ica el inc emen o de la ecuencia de SCEs mediado po la inco po ación
de la 5hmdU en las células de icien es en FANCD2……………………………….
163
Figu a C4.16. Modelo de abajo p opues o pa a la unción de HMCES du an e
la eliminación de la 5hmdU inco po ada de o ma e ónea du an e la sín esis de
ADN po la u a de epa ación BER……………………………………………….
164
ABREVIATURAS
INTRODUCCIÓN
31
En cada célula, el genoma es á expues o cons an emen e a ac o es endógenos o exógenos
que pueden al e a su in eg idad. El man enimien o de la es abilidad genómica es esencial
pa a la supe i encia y la ansmisión idedigna de la in o mación gené ica a lo la go de
las gene aciones. Es a ansmisión de la in o mación gené ica es á en un cons an e balance
selec i o en e el man enimien o de la es abilidad gené ica o la eliminación de los cambios
debidos a mu aciones y pé dida del po encial e olu i o.
Se es ima que el ADN su e más de 105 lesiones al día, p incipalmen e gene adas po los
p opios p ocesos celula es, como po ejemplo allos du an e la eplicación o la p esencia
de me aboli os gene ados du an e di e en es ac i idades isiológicas 1. En e las uen es
endógenas de daño des acan la inco po ación e ónea de ibonucleó idos al ADN du an e
la eplicación o las modi icaciones en las bases del ADN gene adas po p ocesos como la
desaminación, la adición de g upos alquilos po agen es alquilan es o las oxidaciones
causadas po las especies eac i as de oxígeno (ROS; del inglés adical oxygen species).
Las uen es exógenas que pueden induci daño en la es uc u a del ADN pueden se an o
ísicas ( adiación ionizan e, UV, e c.) como químicas (quimio e ápicos, químicos
indus iales, e c.). La exposición a es os ac o es puede gene a desde co es de cadena
sencilla o co es de cadena doble, has a uniones co alen es en e las bases de ambas heb as
de ADN. Es as lesiones pueden al e a la es uc u a de la doble hélice, a ec ando a los
p ocesos de eplicación y ansc ipción. Si es as lesiones pe manecen sin epa a , se pueden
gene a mu aciones que pod ían se ansmi idas a las células hijas, lo que puede ene
consecuencias dele é eas pa a la salud 1–3.
Pa a e i a la pe sis encia de es as lesiones en el ADN, las células han desa ollado un
complejo sis ema de epa ación compues o po nume osos mecanismos que p o egen al
genoma de es as lesiones geno óxicas. Es os mecanismos no solo epa an las lesiones
p esen es en el ADN, sino que ambién con olan la eplicación pa a e i a e o es du an e
la sín esis de ADN. Po an o, debe exis i una g an coo dinación en e los p ocesos de
sín esis y epa ación del ADN jun o con el p oceso de di isión celula , pa a man ene la
in eg idad del genoma y p e eni mu aciones y ees uc u aciones del ADN. Es e conjun o
de u as de epa ación del ADN y pun os de con ol del ciclo celula que ac úan de o ma
coo dinada pa a epa a el daño en el ADN es lo que se conoce como espues a al daño en
el ADN (DDR; del inglés DNA damage esponse) 1,4. Fallos du an e la p og esión del ciclo
celula , du an e la eplicación del ADN o du an e la DDR, pueden induci ines abilidad
genómica, lo que desencadena ía el desa ollo de en e medades 3,4.
1.1. La eplicación del ADN y el es és eplica i o
1.1.1. Replicación del ADN
Las células ienen como p incipal obje i o duplica el genoma y ansmi i la in o mación
gené ica de o ma idedigna a las células hijas. Es e obje i o equie e una e icien e y
igu osa sín esis de ADN, esencial pa a el man enimien o de la es abilidad genómica y la
co ec a ejecución de los p og amas de desa ollo y di e enciación celula 5,6. Sin emba go,
du an e el p oceso de eplicación, el ADN es más ulne able, debido a la posible p esencia
de obs áculos que pueden al e a la p og esión de la ho quilla de eplicación, po lo que la
in eg idad del genoma debe es a cons an emen e con olada pa a e i a el bloqueo de la
ho quilla de eplicación y la gene ación de o u as en el ADN 7.
INTRODUCCIÓN
32
El p oceso de eplicación es un p oceso semiconse a i o, en el cual una de las cadenas se
sin e iza de o ma di ec a, en la di ección en la que se desplaza la ho quilla de eplicación
(denominada heb a con inua o leading s and), mien as que la cadena opues a se sin e iza
de o ma discon inua, debido a que su sín esis a en la di ección opues a a la ho quilla de
eplicación (denominada heb a ezagada o lagging s and). La heb a con inua se sin e iza
po la polime asa de ADN ε (POLε), mien as que la sín esis de la heb a ezagada se lle a
a cabo po un complejo o mado po la polime asa de ADN α (POLα) y una p imasa de
ARN, y pos e io men e, es e complejo es sus i uido po la polime asa de ADN δ (POLδ).
El complejo p imasa-POLα sin e iza un pequeño cebado de ARN, de unos 7-14
nucleó idos, que ex iende con un pequeño amo de ADN, de unos 10-20 nucleó idos. Una
ez sin e izado es e cebado de ARN-ADN, es e complejo es eemplazado po la
polime asa POLδ, la cual ex iende es os cebado es de ARN-ADN en pequeños agmen os
de ADN denominados agmen os de Okazaki. A medida que se desplaza la ho quilla de
eplicación, los agmen os de Okazaki que se an sin e izando y con o man la heb a
ezagada, deben se unidos pa a inaliza la sín esis comple a de es a cadena. Todo es e
p oceso se conoce como madu ación de los agmen os de Okazaki (OFM; del inglés
Okazaki agmen ma u a ion), en el cual debe exis i una g an coo dinación en e las
eacciones secuenciales que se suceden en e las polime asas, nucleasas y ligasas de
ADN8,9.
Figu a I1. Esquema simpli icado de la sín esis de la heb a con inua y la heb a ezagada du an e la
eplicación del ADN.
La eplicación comienza con el ensamblaje del eplisoma, un complejo mul ip o eico que
se une a la doble hélice pa a su desen ollamien o y así pe mi i la en ada de las polime asas
de ADN que copian la in o mación en las cadenas de nue a sín esis. La ac i idad del
eplisoma es á egulada es ic amen e du an e odo el ciclo celula po múl iples pasos.
El p oceso de eplicación se inicia du an e la ase G1 del ciclo celula , en la cual los
o ígenes de eplicación se “licencian”, p oceso po el cual la helicasa eplica i a se une a
ellos pa a inicia la eplicación. Es a unión depende de la acción de los componen es del
complejo de p e- eplicación, el cual se o ma median e el ensamblaje secuencial de a ios
ac o es. En p ime luga , el complejo de econocimien o del o igen 1-6 (ORC1-6) jun o
con el ac o del ciclo de di isión celula 6 (CDC6), eclu an a la helicasa de ADN
eplica i a MCM2-7 (del inglés mini-ch omosome main enance 2-7), pa a o ma un
complejo con el ac o ansc i o dependien e de Cdc10 1 (CDT1). Pos e io men e, un
INTRODUCCIÓN
33
segundo complejo MCM2-7 – CDT1 es eclu ado al ADN, y es os 2 anillos hexamé icos
en en ados con o man un hexáme o doble simé ico que odea a la doble hélice. Es e doble
hexáme o es á inac i o y su ac i ación ocu e du an e la ansición en e las ases G1 y S,
en la cual se suceden una se ie de e en os de os o ilación po pa e de quinasas
dependien es de Db 4 (DDK) y dependien es de ciclina (CDK). Es os e en os de
os o ilación pe mi en el eclu amien o secuencial de los ac o es CDC45 y GINS1-4 al
doble hexáme o, cons i uyendo el complejo CMG, la o ma ac i a de la helicasa eplica i a.
Además, es as quinasas ambién os o ilan a o os ac o es adicionales que se unen a la
helicasa CMG, o mando así el complejo de p e-iniciación.
El complejo de p e-iniciación jun o a MCM10 induce el desen ollamien o de la doble
hélice, dando luga a amos de ADN de cadena sencilla (ssDNA; del inglés single-s anded
DNA) que son cubie os po la p o eína RPA (del inglés eplica ion p o ein A). Además, se
es ablecen dos eplisomas bidi eccionales, que sin e iza án ADN nacien e a a és de las
cadenas moldes en di ección 3’-5’, pe mi iendo la sín esis de ADN po pa e de las
polime asas eplica i as POLε y POLδ 6,9–11.
Pa a e i a que un segmen o del genoma sea eplicado una ez más an es de pasa a la ase
de mi osis, se inhibe un nue o eclu amien o de la helicasa MCM a los o ígenes de
eplicación du an e las ases S y G2 del ciclo celula , ga an izando que cada pa e del
genoma se eplica una única ez po cada ciclo celula , p ese ando así la in eg idad del
genoma 10.
Los componen es de la maquina ia de eplicación RFC1-5 (del inglés eplica ion ac o
C1-5) y CTF18 (del inglés ch omosome ansmission ideli y 18)-RFC2-5, son
esponsables de la ca ga de PCNA (del inglés p oli e a ing cell nuclea an igen) en el
ADN. PCNA es un anillo imé ico que odea las in e secciones de ssDNA y de ADN de
cadena doble (dsDNA; del inglés double-s anded DNA), necesa io pa a p omo e la
sín esis e icien e de las heb as de ADN nacien e, ya que a o ece la p ocesi idad de las
polime asas 6,12.
El p oceso de e minación de la eplicación se p oduce as la con e gencia de dos
ho quillas de eplicación, la cual desencadena la ubiqui inación y pos e io desensamblaje
de la helicasa CMG del ADN, y la ligación de los p oduc os inales gene ados 6,9.
INTRODUCCIÓN
34
Figu a I2. P oceso de eplicación del ADN. A) Fo mación del complejo de p e- eplicación en el o igen de
eplicación median e el ensamblaje secuencial de ORC1-6, CDC6, MCM2-7 y CDT1. B) Ac i ación de los
complejos MCM2-7 – CDT1 du an e la ansición en e las ases G1 y S median e e en os de os o ilación
po DDK y CDK, que pe mi en el eclu amien o de CDC45 y GINS pa a o ma complejo CMG, la o ma
ac i a de la helicasa eplica i a. C) Desen ollamien o de la doble hélice e inicio de la eplicación median e
las polime asas eplica i as POLε y POLδ. Imagen adap ada de Pe opoulos M e al, 2019 10.
1.1.2. Es és eplica i o
Du an e el p oceso de sín esis de ADN, las ho quillas de eplicación pueden encon a
lesiones en la molécula de ADN, o iginadas po ac o es endógenos o exógenos, que
pueden obs aculiza su p og esión, induciendo es és eplica i o. Se de ine como es és
eplica i o el enlen ecimien o ansi o io o la acele ación abe an e de la ho quilla de
eplicación, que pueden conduci a su bloqueo, en espues a a los obs áculos p esen es en
el ADN 5,10,13–15. El es és eplica i o implica un g a e p oblema pa a la es abilidad del
genoma, ya que, si se p olonga en el iempo, puede da luga a o u as i e e sibles de la
ho quilla de eplicación y al colapso de la misma, p o ocando ines abilidad genómica y el
desa ollo de en e medades, siendo la más común el cánce 5,10,14. En e las lesiones más
comunes que pueden induci es és eplica i o se encuen an la p esencia de si ios abásicos
(AP; del inglés apu inic/apy imidinic si e), las uniones co alen es en e el ADN y p o eínas
(DPC; del inglés DNA-p o ein c osslink), las modi icaciones de las bases, las uniones
co alen es en e las bases de las dos heb as del ADN (ICL; del inglés in e s and c osslink),
los con lic os eplicación- ansc ipción, los huecos de ssDNA, la p esencia de es uc u as
secunda ias de ADN, la educción en los ni eles de nucleó idos, e c. Es os obs áculos
p o ocan el desacoplamien o ísico en e la helicasa CMG y las polime asas, ya que la
helicasa eplica i a con inúa desen ollando la doble hélice mien as que la polime asa se
queda de enida po la lesión, dando luga a la o mación de amos de ssDNA 10,13,14.
INTRODUCCIÓN
35
Figu a I3. Lesiones gene adas po uen es endógenas y exógenas que causan es és eplica i o. Si ios
AP, DPCs, inco po ación de ibonucleó idos, es uc u as secunda ias de ADN, ICLs, bases dañadas po
agen es químicos, huecos de ssDNA, e c. Imagen adap ada de Cybulla E and Vindigni A, 2023 13.
Pa a minimiza los e ec os dele é eos del es és eplica i o, las células p esen an di e sos
mecanismos molecula es pa a es abiliza , epa a y einicia las ho quillas de eplicación
bloqueadas. Sin emba go, las células cance ígenas ambién usan es os mecanismos de
es abilización de las ho quillas de eplicación, disminuyendo la e ec i idad de los agen es
ci o óxicos que inducen es és eplica i o pa a p o oca su mue e. Conoce más a ondo
los mecanismos po los cuales las células es abilizan y epa an las ho quillas de eplicación
que se han bloqueado pod ía lle a al desa ollo de nue as es a egias pa a comba i la
esis encia de las células cance ígenas a los a amien os con encionales 5.
Las ho quillas de eplicación mues an una des acada plas icidad pa a adap a se al es és
eplica i o, siendo capaces de es au a su in eg idad y einicia la sín esis de ADN
ápidamen e. T as la gene ación de amos de ssDNA po el desacoplamien o en e la
helicasa eplica i a y las polime asas, es os amos se ecub en po la p o eína de unión a
ssDNA RPA, la cual si e de pla a o ma pa a eclu a a ATR (del inglés a axia
elangiec asia and Rad3- ela ed), la p incipal quinasa de espues a an e el es és
eplica i o, a a és de la p o eína de in e acción ATRIP. ATR os o ila di e en es sus a os
que ayudan a la supe i encia celula y a comple a de o ma idedigna la eplicación del
ADN. La p incipal diana que os o ila ATR es la quinasa de pun o de con ol 1 (CHK1; del
inglés checkpoin kinase 1), la cual se ac i a y desencadena el enlen ecimien o de la
p og esión del ciclo celula , impidiendo la p og esión de la ase G2 a la ase de mi osis y
el inicio de la eplicación en o os o ígenes, lo que pe mi e la esolución del daño que ha
causado es és eplica i o. Además de es os e ec os globales, ATR ambién p esen a e ec os
más locales, ayudando a p o ege a las ho quillas dañadas pa a acili a su ecupe ación y
con inua la eplicación, egulando la ac i idad de nucleasas y ac o es de emodelación
que es abilizan a las ho quillas bloqueadas 5,10,11,14,16,17.
An e la p esencia de lesiones que causan es és eplica i o, las células ac i an una espues a
denominada ole ancia al daño en el ADN (DDT; del inglés DNA damage ole ance), la
cual pe mi e a las células con inua la eplicación, p e iniendo un bloqueo pe sis en e de la
ho quilla de eplicación. La espues a de DDT se compone de los p ocesos de sín esis de
anslesión (TLS; del inglés anslesion DNA syn hesis), e e sión de la ho quilla de
eplicación (RFR; del inglés eplica ion o k e e sal), que o ma pa e del in e cambio de
molde (TS; del inglés empla e swi ching), y del p oceso de ecebado o ep iming 11,13,17.
INTRODUCCIÓN
36
1.1.2.1. Sín esis de anslesión (TLS)
La sín esis de anslesión (TLS) se p oduce po la acción de polime asas que sin e izan
ADN nacien e usando ADN molde dañado, ya que son capaces de sob epasa la lesión,
in oduciendo nucleó idos en la cadena de nue a sín esis, independien emen e de las bases
dañadas. Se ca ac e izan po se polime asas que ca ecen de ac i idad de co ección 3’-5’,
con asas de e o ele adas (1 po cada 10 nucleó idos), a di e encia de las polime asas
eplica i as que ienen unas asas de e o de 1 po cada 1010 nucleó idos. Po es a azón,
las polime asas de TLS se conside an polime asas mu agénicas. Es os e en os mu agénicos
pueden con ibui a la umo ogénesis.
El eclu amien o de las polime asas de TLS es á mediado po la ubiqui inación de PCNA
en la lisina 164 median e el complejo ubiqui in-ligasa E2-E3 RAD6-RAD18. Además, la
polime asa REV1, pe enecien e a la amilia Y de polime asas de TLS, si e como p o eína
de andamiaje pa a acili a el eclu amien o de o as polime asas de TLS, como POLζ
(REV3L-REV7), POLη, POLι, POLκ… 11,13
1.1.2.2. Re e sión de la ho quilla de eplicación
El mecanismo de e e sión de la ho quilla de eplicación es un mecanismo de p o ección
de la es uc u a eplica i a, complemen a io a la acción de las polime asas de TLS. Es e
mecanismo con ie e la es uc u a egula de 3 b azos de la ho quilla de eplicación en una
es uc u a de 4 b azos, ya que se p oduce el alineamien o coo dinado de las dos heb as de
ADN nacien e de ás de la ho quilla, o mando un b azo cen al que es á cons i uido po
las dos heb as de nue a sín esis. Es e b azo de ADN de nue a sín esis se p o ege po
ac o es p o eicos que e i an su deg adación po endonucleasas 5,11,13,17,18. El alineamien o
de las dos heb as de ADN nacien e es á mediado po la ecombinasa RAD51, la cual, a
a és de su ac i idad de in e cambio de heb as, gene a un dúplex de ADN, en el que ambas
heb as es án ca a a ca a de ás de la helicasa CMG. Es a es uc u a si e de sus a o pa a
las anslocasas de ADN que ca alizan la e e sión de la ho quilla de eplicación. T as la
o mación de es a es uc u a, la helicasa CMG queda delan e pa a inicia de o ma
inmedia a la sín esis de ADN una ez que la lesión en el ADN se ha epa ado 11.
Es e alineamien o iene un e ec o p o ec o , ya que pe mi e la epa ación de la lesión, así
como sob epasa la y sin e iza la nue a heb a de ADN usando como molde la o a cadena
de ADN nacien e. Además, pe mi e es ablece un modo “du mien e” has a que el es és
eplica i o se haya esuel o. Sin emba go, es a o ma de alineamien o deja a las cadenas de
nue a sín esis más suscep ibles a se deg adadas po nucleasas, pudiendo da luga a
ines abilidad genómica. Po ello, las heb as de ADN nacien e son p o egidas median e su
ecub imien o po nucleo ilamen os de RAD51, que se eclu a p incipalmen e po las
p o eínas BRCA1/2 (del inglés b eas cance ype 1/2 suscep ibili y p o ein) y algunos
componen es de la u a de epa ación Anemia de Fanconi (AF) 15.
Es e p oceso es á egulado, al menos en pa e, po la anslocasas de ADN de la amilia
SNF2 SMARCAL1 (del inglés SWI/SNF- ela ed, ma ix-associa ed, ac in-dependen ,
egula o o ch oma in, and sub amily A-like 1), ZRANB3 (del inglés zinc inge , RAN-
binding domain con aining 3) y HLTF (del inglés helicase-like ansc ip ion ac o ) 11,18.
O os ac o es desc i os como posibles mediado es de la gene ación de es a es uc u a de
e e sión son las helicasas BLM (del inglés Bloom’s synd ome RecQ helicase-like p o ein),
INTRODUCCIÓN
37
WRN (del inglés We ne synd ome ATP-dependen helicase), FANCM o FBH1 (del inglés
F-box DNA helicase 1) 5. La esolución de es a es uc u a se lle a a cabo po la helicasa
RECQ1, cuya ac i idad se egula po la enzima polime asa de poli(ADP)- ibosa 1 (PARP1;
del inglés poly(ADP- ibose) polyme ase 1), la cual sup ime la ac i idad de RECQ1 has a
que el daño se epa a 17.
Pa a el co ec o einicio de la sín esis de ADN, es necesa ia una deg adación con olada de
es a es uc u a de e e sión de la ho quilla de eplicación, mediada po nucleasas como
DNA2 o MRE11. Sin emba go, la deg adación nucleolí ica excesi a del ADN nacien e
puede ene consecuencias geno óxicas que den luga a abe aciones c omosómicas o a la
mue e celula 5,11.
1.1.2.3 Recebado o ep iming
Es una espues a al es és eplica i o muy conse ada. Es á mediada po la p o eína
PRIMPOL, una polime asa de TLS que iene ac i idad p imasa, capaz de einicia la
sín esis de ADN aguas abajo al si io de la lesión, siendo pa icula men e ele an e du an e
la sín esis de la heb a con inua 10,11,13. T as el bloqueo de la ho quilla de eplicación,
PRIMPOL gene a un cebado de ADN median e su ac i idad p imasa, aguas abajo al si io
de la lesión, el cual ex iende median e su ac i idad polime asa, e i ando así la lesión. Sin
emba go, el einicio de la sín esis deja huecos de ssDNA de ás de la ho quilla de
eplicación que necesi an se epa ados de o ma pos - eplica i a 11,13,17. Es a epa ación
pos - eplica i a se ealiza pos e io men e po los mecanismos de TLS o po in e cambio de
molde, los cuales pueden con ibui a la gene ación de mu aciones, debido a la acción de
las polime asas de TLS, o a eo denamien os c omosómicos o in e cambios de c omá idas
he manas (SCEs; del inglés sis e ch oma id exchanges), po la acción de los mecanismos
de in e cambio de molde. Fallos en la epa ación de es os huecos de ssDNA hacen que
pe sis an en el iempo y sean suscep ibles al co e endonucleolí ico po MRE11, gene ando
co es de cadena doble (DSBs; del inglés double s and b eaks), como se ha suge ido
ecien emen e 13,17,19.
INTRODUCCIÓN
38
Figu a I4. Mecanismos de DDT. Re e sión de la ho quilla de eplicación, in e cambio de molde, ep iming
y TLS. Imagen adap ada de Saldanha J e al, 2023 11.
El balance igu oso en e las dis in as ías de DDT es necesa io pa a supe a los obs áculos
que han de enido la eplicación, asegu ando que la sín esis de ADN se comple e en iempo,
además de p o ege la in eg idad de la ho quilla de eplicación. La elección de una ía u
o a es á egulada p incipalmen e po la na u aleza y la localización de la lesión, aunque
ambién depende de la magni ud del bloqueo de la ho quilla de eplicación o del ondo
gené ico de las células 11. Un ac o cla e en el p oceso de elección de la ía de DDT a usa
es PCNA y sus modi icaciones pos - aduccionales 11,17.
1.2. Los mecanismos de epa ación del ADN
Pa a con a es a el daño gene ado en el ADN y e i a la deses abilización de la ho quilla
de eplicación, las células han desa ollado mecanismos de epa ación especí icos que
ac úan an e las di e en es lesiones que pueden es a p esen es en la molécula de ADN,
p e iniendo el es és eplica i o. Dependiendo del ipo de daño que se encuen e en la
molécula de ADN, la u a de epa ación que ac úa es di e en e. En el caso de un
empa ejamien o e óneo en e las bases del ADN, la u a de epa ación que ac úa es la u a
de epa ación de empa ejamien os e óneos (MMR; del inglés misma ch epai ), mien as
que la p esencia de pequeñas modi icaciones químicas en las bases de ADN es epa ada
po la u a de epa ación po escisión de bases (BER; del inglés base excision epai ). Pa a
lesiones más complejas, como los díme os de pi imidina o la unión co alen e en e bases
de una misma heb a del ADN, ac úa la u a de epa ación po escisión de nucleó idos (NER;
del inglés nucleo ide excision epai ), mien as que los ICLs son epa ados po la u a de
epa ación AF. Los co es de cadena sencilla (SSBs; del inglés single s and b eaks) son
INTRODUCCIÓN
39
epa ados po la u a de epa ación de SSBs (SSBR; del inglés single-s and b eak epai )
y los DSBs pueden se epa ados po la u a de epa ación po unión de ex emos no
homólogos (NHEJ; del inglés non-homologous end joining) o po la u a de epa ación
ecombinación homóloga (HR; del inglés homologous ecombina ion) 1. Debido a la g an
ex ensión de es e campo de in es igación, en es a in oducción, solo se de allan los
mecanismos de epa ación más ele an es que han sido obje o de nues o es udio de
in es igación du an e el desa ollo de es a esis doc o al.
1.2.1. El papel de la u a de epa ación Anemia de Fanconi (AF) pa a la eliminación
de los ICLs
Una de las lesiones más dele é eas que supone uno de los p incipales desa íos pa a la
supe i encia celula son los ICLs, los cuales impiden p ocesos esenciales como la
eplicación o la ansc ipción, debido a que la unión co alen e en e las heb as del ADN no
pe mi e desen olla la doble hélice pa a inicia es os p ocesos 20–22. Fac o es exógenos
como los quimio e ápicos (cispla ino o mi omicina C), o agen es endógenos como los
aldehídos gene ados po los p ocesos me abólicos celula es (po ejemplo, ace aldehído o
o maldehído), inducen es e ipo de uniones 20,22,23. La al a de epa ación de es a lesión
puede conlle a a la o u a del ADN y a eo denamien os c omosómicos, que pueden
p omo e a la go plazo el desa ollo de en e medades como el cánce . Pa a epa a los
ICLs, las células han desa ollado una u a especí ica denominada Anemia de Fanconi
(AF)20.
Se han iden i icado al menos 22 genes pe enecien es a es a u a de epa ación: FANCA,
FANCB, FANCC, FANCD1 (BRCA2), FANCD2, FANCE, FANCF, FANCG, FANCI,
FANCJ (BRIP1), FANCL, FANCM, FANCN (PALB2), FANCO (RAD51C), FANCP
(SLX4), FANCQ (ERCC4), FANCR (RAD51), FANCS (BRCA1), FANCT (UBE2T),
FANCU (XRCC2), FANCV (REV7) y FANCW (RFWD3). Basado en las ac i idades
bioquímicas y en sus unciones, los genes AF se pueden di idi en 3 g upos:
G upo I: complejo cen al AF (FANCA, B, C, E, F, G, L, M, T y las p o eínas
asociadas FAAP20, FAAP24 y FAAP100). Es un complejo ubiqui in-ligasa E3.
G upo II: complejo he e odimé ico FANCD2-FANCI (ID2).
G upo III: ac o es de epa ación como nucleasas (FANCP (SLX4) y FANCQ
(ERCC4)), polime asas de TLS (FANCV (REV7) y POLζ) y ac o es de HR
(FANCD1 (BRCA2), FANCJ (BRIP1), FANCN (PALB2), FANCO (RAD51C),
FANCR (RAD51), FANCS (BRCA1), FANCU (XRCC2) y FANCW (RFWD3)).
Muchos de es os genes pe enecen a la u a de epa ación HR, como BRCA1/2
(FANCD1/S) o RAD51 (FANCR), y son conside ados como “genes simila es a AF” debido
a que la al a de alguno de es os genes iene una co elación geno ipo- eno ipo con la
en e medad. La pé dida bialélica de alguno de los genes que o man pa e de la u a AF da
luga al desa ollo de una en e medad a a denominada con el mismo nomb e 24.
La AF es una en e medad au osómica ecesi a que se ca ac e iza po el desa ollo de
anomalías congéni as (po ejemplo, anomalías en el desa ollo de las ex emidades o en la
pigmen ación de la piel), p og esión de allo medula , in e ilidad y al a suscep ibilidad de
desa ollo de umo es sólidos, especialmen e cánce de cabeza y cuello, y leucemia. La
mayo ía de las mu aciones p esen es en los pacien es de AF se encuen an en los genes que
INTRODUCCIÓN
40
codi ican las p o eínas FANCA (60%), FANCC (15%) y FANCG (10%), aunque ambién
se han encon ado mu aciones en o os genes que codi ican pa a el es o de p o eínas que
con o man es a u a, haciendo que es a en e medad sea gené icamen e muy he e ogénea, lo
que di icul a la búsqueda de a amien os e ec i os con a ella 24,25. Los eno ipos más
ca ac e ís icos que p esen an las células de los pacien es de AF son la hipe sensibilidad a
agen es que inducen ICLs, como la mi omicina C, el cispla ino o el diepoxibu ano 25,26. El
p incipal agen e endógeno que induce la pé dida de células mad e hema opoyé icas, allo
medula y p edisposición a cánce en ausencia de la u a AF es el o maldehído 27–30. El
o maldehído induce múl iples ipos de lesiones, y aún no se ha dilucidado cuál de ellas es
la que causa la le alidad en las células de icien es en la u a AF 31.
Las células de icien es en la u a AF mues an hipe sensibilidad an e la exposición a los
agen es o mado es de ICLs como consecuencia del inc emen o de ines abilidad
c omosómica in ínseco de es as células. Es a ines abilidad c omosómica se ca ac e iza po
la acumulación de c omosomas adiales, es uc u as c omosómicas o madas po la usión
de dos o más c omosomas me a ásicos que no p esen an homología en e ellos. Es a usión
es á mediada po la u a de epa ación NHEJ 25,32,33. Sin emba go, es udios ecien es han
mos ado que la o mación de c omosomas adiales an e la ausencia de la u a AF es
dependien e de la polime asa de ADN POLθ y de la u a de epa ación al e na i a de unión
de ex emos (al -EJ, del inglés al e na i e end-joining) 26. La p esencia de abe aciones
c omosómicas es la p ueba molecula es ánda usada pa a el diagnós ico inequí oco de la
en e medad AF, ya que las células de los pacien es de AF p esen an ni eles de o u as del
ADN 10 eces más ele ados, y una mayo p opo ción de c omosomas adiales, en
compa ación con las células con ol, as el a amien o con un agen e o mado de
ICLs25,26.
Los ICLs se epa an po sis emas de epa ación dis in os dependiendo de la ase del ciclo
celula . En las ases G1, G2 y M, la p incipal u a de epa ación que ac úa pa a epa a los
ICLs es la u a po escisión de nucleó idos asociada a la ansc ipción (TC-NER, del inglés
ansc ip ion-coupled nucleo ide excision epai ), jun o con las polime asas de TLS. En la
ase S, la u a AF es la p incipal u a que epa a es a lesión 21,34. Los ac o es pe enecien es
a la u a coo dinan la acción de di e en es p ocesos de epa ación, como la ac i idad de las
nucleasas que inducen el co e del ICL y o os p ocesos nucleolí icos pa a su epa ación.
Además, ambién ac úan las polime asas de TLS pa a la adición de la base a la heb a de
ADN, y la u a de epa ación HR, pa a epa a el DSB gene ado en la heb a opues a,
ecupe ando así la in o mación pe dida 23,24,34,35.
La epa ación del ICL comienza cuando dos ho quillas de eplicación colisionan con un
ICL. T as la colisión, BRCA1, median e su ac i idad ubiqui in-ligasa, p omue e el
desensamblaje de la helicasa CMG, pe mi iendo que la polime asa de ADN POLε se
ace que al ICL. Es e p oceso gene a amos de ssDNA que son ecubie os po RAD51 pa a
p o ege la ho quilla. A con inuación, FANCM in e ac úa con FAAP24 y MHF1/2 pa a
econoce la lesión y egula su pos e io epa ación. Una ez que el complejo FANCM-
FAAP24-MHF1/2 econoce el ICL, ac i a la cascada de señalización de ATR y p omue e
el eclu amien o del complejo cen al AF. En el complejo cen al AF cabe des aca el
subcomplejo FANCB-FANCL-FAAP100, que jun o a FANCT (UBET2; enzima con
ac i idad ubiqui in-ligasa E2), lle a a cabo la monoubiqui inación del he e odíme o
FANCD2-FANCI (ID2) en las lisinas 561 y 523 espec i amen e. El he e odíme o ID2
INTRODUCCIÓN
47
1.3. Fac o es que es abilizan la ho quilla de eplicación en e al es és
eplica i o
Múl iples mecanismos coope an pa a p ese a la in eg idad del genoma de las lesiones
que pueden pe u ba la eplicación del ADN, al e ando la ansmisión idedigna de la
in o mación gené ica 4,52. La capacidad de es abiliza y einicia las ho quillas de
eplicación bloqueadas es esencial pa a la es abilidad genómica y la supe i encia celula .
El bloqueo de la ho quilla de eplicación po lesiones p esen es en la molécula de ADN,
desencadena el eclu amien o de múl iples ac o es que es abilizan las ho quillas
bloqueadas, epa an las lesiones p esen es en el ADN y einician la eplicación. Si no se
p oduce el bloqueo de las ho quillas de eplicación an e la p esencia de daños en el ADN
o se p oducen allos en el einicio de la eplicación una ez que la lesión se ha epa ado, se
puede induci ines abilidad genómica y mue e celula . Po ello, múl iples ac o es, además
de su unción canónica en epa a lesiones especí icas que ocu en en el ADN, juegan un
papel impo an e en la es abilización de las ho quillas de eplicación pa a limi a el es és
eplica i o 52.
1.3.1. Componen es de la u a de epa ación AF que p esen an un papel en el
man enimien o de la es abilidad de la ho quilla de eplicación
La u a AF iene un papel ele an e en el man enimien o de la es abilización de la ho quilla
de eplicación. Las unciones de la u a AF con espec o al esca e de las ho quillas de
eplicación bloqueadas, pueden di idi se en 3 ni eles: p o ección de la ho quilla de
eplicación de la deg adación nucleolí ica, einicio de la eplicación y sup esión de la
ac i ación de nue os o ígenes de eplicación 53.
La u a AF se ac i a ápidamen e as la exposición a hid oxiu ea (HU) o a a idicolina, las
cuales inducen un bloqueo de la ho quilla de eplicación debido a la inhibición de la enzima
ibonucleó ido educ asa que causa la depleción del pool de dNTPs, o po la inhibición de
la ac i idad de las polime asas de ADN POLα, POLδ y POLε, espec i amen e, sin gene a
ICLs 53,54. En células de icien es en la u a AF se ha obse ado un inc emen o en la
ines abilidad c omosómica as el es és eplica i o inducido po HU, a ibuido a la al a de
es abilización de las ho quillas de eplicación bloqueadas. Sin emba go, aunque la
desp o ección de la ho quilla de eplicación p o oca un inc emen o en la ines abilidad
c omosómica, las células de icien es en la u a AF no son especialmen e sensibles a la
exposición a agen es que bloquean la eplicación, como HU, camp o ecina o gemci abina.
Es os da os sugie en la exis encia de u as edundan es que asegu an la iabilidad celula a
expensas de un inc emen o en la ines abilidad c omosómica 53,55.
Du an e el p oceso de e e sión de la ho quilla de eplicación, BRCA2 (FANCD1) p o ege
las ho quillas de eplicación bloqueadas de la deg adación excesi a mediada po las
nucleasas MRE11 o DNA2, median e la es abilización del nucleo ilamen o de RAD51
(FANCR), el cual p o ege el ADN nacien e 56. La es abilización del nucleo ilamen o de
RAD51 es esencial pa a man ene la es abilidad de las ho quillas de eplicación. La unión
de RAD51 a ssDNA depende de la acción de BRCA2, que desplaza a RPA y p omue e la
o mación del nucleo ilamen o pa a p o ege el b azo cen al de la es uc u a de e e sión
o mado po las cadenas de ADN nacien e. Adicionalmen e a RPA, o o ac o capaz de
uni se a ssDNA en el con ex o de la eplicación es RADX, el cual in e acciona con RAD51,
INTRODUCCIÓN
48
con olando la o mación del nucleo ilamen o. En p esencia de RADX, RAD51 no puede
ca ga se en el ssDNA y, po an o, no puede gene a el nucleo ilamen o que p o ege el
ADN nacien e. Median e la inhibición de la o mación del nucleo ilamen o de RAD51,
RADX e i a la o mación de la es uc u a de e e sión en ausencia de es és eplica i o,
p esen ando un papel ele an e en la p o ección de la ho quilla de eplicación. Además de
desplaza a RPA del ssDNA, BRCA2, median e sus dominios BRC, es capaz de
con a es a la ac i idad inhibi o ia de RADX sob e RAD51, pe mi iendo la o mación del
nucleo ilamen o de RAD51 pa a p o ege la ho quilla de eplicación 57. Adicionalmen e a
BRCA2, FANCD2 o ma un he e odíme o con FANCI, el cual ab aza al ADN y o ma
la gos ilamen os que ayudan a es abiliza el nucleo ilamen o de RAD51 an e un bloqueo
de la ho quilla de eplicación, pa a p o ege el ADN nacien e de la deg adación nucleolí ica
excesi a, y acili a el einicio de la eplicación una ez que la lesión que ha causado el
bloqueo se ha epa ado 24,52,55.
FANCD2 y BRCA2 p esen an unciones edundan es pa a p o ege a las ho quillas de
eplicación bloqueadas de la acción de MRE11 52,58. Células umo ales de icien es en
BRCA1/2 p esen an un inc emen o compensa o io de la exp esión y ac i idad de FANCD2.
FANCD2 se eclu a a las ho quillas de eplicación bloqueadas pa a p omo e su p o ección
y einicio, a o eciendo la supe i encia celula an e la al a de BRCA1/2. Es e inc emen o
en la supe i encia de las células de icien es en BRCA1/2 pod ía debe se al eclu amien o
de POLθ y C IP a las ho quillas de eplicación po FANCD2, pa a p omo e la epa ación
median e la u a de epa ación al -EJ. Es a u a de epa ación puede se la enca gada de
epa a los DSBs gene ados en las ho quillas de eplicación bloqueadas. La exp esión de
FANCD2 co elaciona con la exp esión de POLθ, la cual ambién p esen a un inc emen o
en las células de icien es en BRCA1/2. FANCD2 y POLθ colocalizan en si ios de o u as
en el ADN, y C IP in e acciona ísicamen e con FANCD2. Po an o, FANCD2 pod ía se
conside ado un ac o undamen al pa a el man enimien o de la iabilidad de células
umo ales de icien es en BRCA1/2, debido a su posible ac uación en la u a de epa ación
al -EJ, aguas a iba de POLθ y C IP, pa a egula su eclu amien o a los DSBs gene ados
en las ho quillas de eplicación 52.
La depleción conjun a de BRCA2 y FANCD2 p o oca una deg adación mayo del ADN
nacien e en compa ación con la depleción de ambos genes de o ma independien e,
indicando que es os dos ac o es p o egen a las ho quillas de eplicación bloqueadas
median e mecanismos dis in os. Adicionalmen e al inc emen o de deg adación del ADN
nacien e, se ha obse ado un mayo de ec o en el einicio de las ho quillas bloqueadas en
ausencia de ambos genes, en compa ación con la al a de cada gen independien e, indicando
que FANCD2 y BRCA2 ienen unciones independien es con espec o al einicio de la
eplicación as el bloqueo de la sín esis de ADN. Además, se ha obse ado un inc emen o
de abe aciones c omosómicas y de la os o ilación en la se ina 139 de la a ian e de
his ona H2AX (γH2AX) en células de icien es en BRCA2 y FANCD2, lo que sugie e que
FANCD2 es necesa io pa a p e eni la ines abilidad genómica en células de icien es en
BRCA2 24,58. Es os de ec os e elan una elación sin é ico le al en e ambos genes, ya que
la de iciencia combinada en ambos genes p o oca la mue e de células umo ales, an o in
i o como in i o, sugi iendo que FANCD2 ac úa como una u a al e na i a en la
es abilidad de la ho quilla de eplicación en ausencia de los ac o es BRCA 24,52,58.
INTRODUCCIÓN
49
Además del es és eplica i o inducido po agen es que bloquean la eplicación como HU,
las células de icien es en BRCA2 mues an al os ni eles de es és eplica i o endógeno.
An e es as condiciones de es és eplica i o asociado a la inac i ación de BRCA2, se ha
demos ado que FANCD2 limi a la sín esis de ADN, sup imiendo la ac i ación de o ígenes
de eplicación du mien es, pa a e i a una eplicación incon olada 58.
Las p o eínas de la u a AF pueden in e acciona ísicamen e con el eplisoma pa a egula
la eplicación, median e la ac i ación de ATR, la cual os o ila a componen es del
eplisoma y a o os ac o es que man ienen la es abilidad de la ho quilla de eplicación pa a
con ola su p og esión. T as el bloqueo de la ho quilla de eplicación a causa de la
depleción del pool de dNTPs po la exposición a HU, ATR os o ila a FANCD2, el cual es
eclu ado al ADN de nue a sín esis. La os o ilación de FANCD2 p omue e su asociación
con MCM2-7, que ambién es os o ilada po ATR en espues a al a es o de la eplicación.
Es a in e acción enlen ece la sín esis de ADN, p e iene la o mación de amos de ssDNA
y minimiza la esección del ADN nacien e dependien e de MRE11 y la ines abilidad
genómica. Además, FANCD2 in e ac úa con MCM2-7 independien emen e de su
monoubiqui inación, ya que la mu ación pun ual FANCD2-K561R, la cual p o oca que
FANCD2 no se ubiqui ine, no impide la in e acción con MCM2-7 11,17,35,53. FANCI ambién
se eclu a al ADN nacien e as el bloqueo de la ho quilla de eplicación y p omue e que
los o ígenes de eplicación du mien es se “licencien” po MCM2-7, acili ando el einicio
de la eplicación. Sin emba go, an e condiciones ex emas de es és eplica i o, ATR
os o ila a FANCI pa a inhibi la ac i ación de los o ígenes de eplicación du mien es,
p opo cionando su icien e iempo pa a la epa ación del daño 17,53.
Con espec o a la ubiqui inación de FANCD2, se ha desc i o que la pé dida de FANCA o
la p esencia de la mu ación pun ual que impide la ubiqui inación de FANCD2 (FANCD2-
K561R), conducen a la deg adación de la ho quilla de eplicación bloqueada as el
a amien o con HU. Es os da os sugie en que la es abilización de la ho quilla de
eplicación necesi a la ac i ación de la u a AF dependien e de la monoubiqui inación de
FANCD2. Po an o, los ac o es de la u a que ac úan aguas a iba de la ubiqui inación de
FANCD2 es án in oluc ados en la p o ección de la ho quilla de eplicación 53,55. Se ha
desc i o ecien emen e que los componen es del complejo cen al AF y FANCD2 p o egen
di e en es ipos de ho quillas de eplicación. Dependiendo de las helicasas que gene en la
es uc u a de e e sión de la ho quilla de eplicación, exis en dos mecanismos de p o ección
de la deg adación del ADN nacien e. FANCD2 p o ege el ADN nacien e de su deg adación
si la e e sión se ha p oducido po la acción de las helicasas SMARCAL1/ZRANB3/HLTF.
Sin emba go, si la es uc u a de e e sión se ha gene ado po la helicasa FBH1, los ac o es
p o ec o es son, en e o os, FANCA, FANCC o FANCG, componen es del complejo
cen al AF 59. Po an o, componen es de la misma u a de epa ación p o egen ho quillas
de eplicación di e en es.
Adicionalmen e a su papel en la p e ención de la esección nucleolí ica pe judicial del
ADN nacien e en las ho quillas de eplicación bloqueadas, algunas p o eínas de la u a AF
ienen unciones adicionales pa a con a es a el es és eplica i o. La monoubiqui inación
de FANCD2 p omue e el eclu amien o de o os ac o es asociados a la u a AF como la
helicasa de ADN BLM, la nucleasa FAN1 (del inglés Fanconi-associa ed nuclease 1), la
helicasa FANCJ o BRCA2, los cuales in e ienen en el einicio de la eplicación y la
es abilidad genómica 23. T as el bloqueo de la ho quilla de eplicación, la helicasa BLM
INTRODUCCIÓN
50
coope a con FANCD2, o mando un complejo que se une a la c oma ina pa a acili a el
einicio de la eplicación y sup imi la ac i ación de nue os o ígenes de eplicación 53. La
nucleasa FAN1 in e ac úa di ec amen e con el complejo FANCD2-BLM pa a con ibui al
einicio de la eplicación. El acceso de FAN1 a la c oma ina es á egulado po FANCD2,
la cual p e iene la deg adación descon olada del ADN nacien e de ás de la ho quilla
mediada po FAN1 y po MRE11 53,60.
FANCD2 p esen a ac i idad chape ona, esencial pa a la epa ación de los ICLs. Sin
emba go, es a ac i idad chape ona ambién se equie e pa a e i a la deg adación
nucleolí ica de la ho quilla de eplicación que ha sido e e ida. Se ha desc i o que la
me il ans e asa de lisinas SETD1A, la cual p omue e la me ilación de la lisina en posición
4 de la his ona H3, ac úa jun o con los ac o es p o ec o es de la ho quilla de eplicación
BODL1 y FANCD2. Es a in e acción a o ece la ac i idad chape ona de FANCD2, la cual
p e iene la deg adación nucleolí ica del ADN nacien e dependien e de la nucleasa DNA2
median e la es abilización del nucleo ilamen o de RAD51. Po an o, el emodelado de las
his onas dependien e de FANCD2 p o ege a las ho quillas de eplicación de un p oceso de
deg adación descon olado, man eniendo la es abilidad del genoma 61.
Recien emen e se ha desc i o que RFWD3 (FANCW) iene un papel en el eclu amien o de
la helicasa ZRANB3 pa a p omo e el p oceso de e e sión de la ho quilla de eplicación62.
Es e eclu amien o depende de su ac i idad ubiqui in-ligasa. La pé dida de RFWD3
p e iene la deg adación nucleolí ica del ADN nacien e o la sensibilidad a HU en células
de icien es en BRCA2, al igual que ocu e as la pé dida de la helicasa ZRANB3 o del
es o de helicasas pe enecien es a la amilia SNF2 en es e mismo ondo gené ico 63.
Además, RFWD3 p omue e la ubiqui inación de PCNA y su in e acción con ZRANB3,
e elando una nue a unción de RFWD3 en la p o ección de la ho quilla de eplicación 62.
Todos es os da os demues an el papel de múl iples ac o es de la u a AF que pa icipan
en el man enimien o de la es abilidad de la ho quilla de eplicación.
1.3.2. Componen es de la u a de epa ación BER que ienen unciones elacionadas
con el man enimien o de la es abilidad de la ho quilla de eplicación
Adicionalmen e a la u a AF/BRCA/RAD51, se ha desc i o que ac o es pe enecien es a
o as u as de epa ación p esen an un papel en el man enimien o de la ho quilla de
eplicación. Es os ac o es pueden se dependien es o independien es de la ac i idad de
RAD51 15. En es a sección nos cen amos en aquellos ac o es de la u a BER que ienen
un papel p o ec o de la ho quilla de eplicación.
Uno de es os ac o es es PARP1, el cual p esen a múl iples unciones du an e la eplicación
del ADN. T as el bloqueo de la ho quilla de eplicación y la o mación de la es uc u a de
e e sión, la pe sis encia de las lesiones u obs áculos que han desencadenado el bloqueo,
puede p o oca el colapso o o u a de las ho quillas de eplicación, gene ando DSBs de un
solo ex emo (one-ended double s and b eaks), los cuales ac i an a PARP1 pa a inicia la
epa ación. Una de las unciones de PARP1 en es e ipo de lesiones es e i a la unión óxica
de ac o es de NHEJ, como el complejo KU o 53BP1, y p omo e la unión de ac o es de
HR pa a su epa ación ap opiada 64. Además, PARP1 ambién egula el eclu amien o y la
ac i idad de la nucleasa MRE11 en las ho quillas de eplicación bloqueadas, median e la
in e acción ísica en e MRE11 y los políme os de PAR. Una ez eclu ada a la ho quilla
INTRODUCCIÓN
51
de eplicación, MRE11 acili a la esección de los ex emos 5’ del DSB pa a gene a un
ex emo 3’ de ssDNA, en el cual RAD51 es capaz de ca ga se pa a acili a el mecanismo
de in e cambio de molde y einicia la sín esis de ADN 5,64,65. Sin emba go, el eclu amien o
de MRE11 mediado po PARP1 puede se pe judicial en células de icien es en BRCA1/2,
ya que puede induci una deg adación excesi a del ADN nacien e, dando luga a
ines abilidad genómica en es as células 5,66. PARP1 ambién puede egula el iempo que la
ho quilla de eplicación pe manece en e e sión median e la inhibición de la helicasa
RECQ1, has a que la lesión que ha causado el bloqueo se ha epa ado. RECQ1 es capaz de
de ol e a la ho quilla de eplicación a su es uc u a o iginal independien emen e si la
lesión se ha esuel o o no, eniendo un e ec o nega i o en la epa ación de la ho quilla
bloqueada, siendo de g an ele ancia su egulación po PARP1 64,66.
Dado las múl iples unciones que p esen a PARP1 as el daño inducido po ac o es
exógenos, es impo an e iden i ica las uen es endógenas que desencadenan la señalización
de PARP1. La mayo pa e de la señalización de los políme os de PAR que se de ec a en
las células que no son expues as a daño exógeno, se localiza p incipalmen e en células que
es án en ase S, especí icamen e ce ca o en los si ios donde el ADN se es á eplicando. Pe o
es a señalización no se debe ni al daño es ocás ico que ocu e du an e el ciclo celula , ni
po inducción de es és eplica i o, si no que se p oduce cuando los agmen os de Okazaki
no se ligan adecuadamen e. Algunos de los millones de agmen os de Okazaki que se
gene an du an e la sín esis de la heb a ezagada, pueden escapa del p ocesamien o
canónico pa a su ligación. La señalización po PARP1 de aquellos agmen os que no se
han p ocesado comple amen e, egula el eclu amien o de XRCC1 pa a inicia la ac i idad
de la maquina ia de epa ación de los SSBs y así comple a su ligación. Po an o, huecos
de ssDNA en las cadenas nacien es de ADN pueden se señalizados po PARP1 pa a
comple a su ligación y así man ene la es abilidad del genoma 67.
O o ac o de BER que p esen a un papel en la es abilización de la ho quilla de eplicación
es XRCC1. Se ha desc i o que en ausencia de BRCA2, XRCC1 se eclu a a la ho quilla de
eplicación bloqueada jun o a ac o es que o man pa e de la u a de epa ación de unión
de ex emos po mic ohomología (MMEJ; del inglés mic ohomology-media ed end
joining). Es e eclu amien o p omue e la inalización de la eplicación del ADN, a
expensas de un inc emen o en la ines abilidad genómica, ya que induce la esección del
ADN nacien e pa a da luga al einicio de la eplicación. En condiciones de es és
eplica i o as la exposición a HU o a inhibido es de ATR, los cuales gene an DSBs,
XRCC1 o ma ocos que colocalizan con ac o es de MMEJ como PARP1, MRE11 o
POLθ, sugi iendo que XRCC1 pod ía ene un papel en la epa ación de los DSBs o mados
en espues a al es és eplica i o p omo iendo la ac i ación de la u a de MMEJ 68.
Además, se ha desc i o que BRCA2 y XRCC1 p esen an una elación sin é ico le al 68,69,
ya que la pé dida de XRCC1 en células de icien es en BRCA2 inc emen a la ci o oxicidad
a HU y a la inhibición de ATR de o ma signi ica i a, p o ocando una acumulación de
DSBs. Es os da os sugie en que XRCC1 juega un papel impo an e en la epa ación de los
DSBs gene ados du an e el p oceso de es és eplica i o obse ado en células de icien es
en BRCA2 68.
BRCA2 y XRCC1 pa icipan en dos u as dis in as pa a einicia las ho quillas de
eplicación. La depleción de XRCC1 e i a la deg adación del ADN nacien e en células
INTRODUCCIÓN
52
de icien es en BRCA2, p e iniendo el inc emen o de abe aciones c omosómicas inducidas
po es és eplica i o, de mane a simila a lo obse ado cuando se inhibe la ac i idad
exonucleolí ica de MRE11. Es os da os sugie en que MRE11 y XRCC1 pa icipan en la
misma ía esponsable de deg ada el ADN nacien e as el bloqueo de la eplicación en las
células de icien es en BRCA2. Po an o, XRCC1 p esen a unciones especí icas que
ayudan a man ene un equilib io en e la deg adación de la ho quilla de eplicación y el
einicio de la sín esis de ADN pa a p omo e la supe i encia celula a expensas de la
o mación de abe aciones c omosómicas en ausencia de BRCA2. Además, los umo es
de icien es en la u a de epa ación HR p esen an una exp esión ele ada de XRCC1 y
MRE11, lo que implica peo supe i encia debido al inc emen o de la ines abilidad
genómica o esis encia a las e apias po el inc emen o en el einicio de la p og esión de la
ho quilla de eplicación y la epa ación del ADN 68.
Además del eclu amien o de XRCC1 mediado po PARP1 a los SSBs, XRCC1 ambién
se eclu a a las ho quillas de eplicación bloqueadas, pa a desencadena la epa ación de la
lesión y el einicio de las mismas de o ma e icien e. PARP1 colabo a con DNA-PKcs,
ac o implicado en la u a de epa ación NHEJ, en el eclu amien o de XRCC1 a las
ho quillas de eplicación bloqueadas, sugi iendo así un papel de la maquina ia de NHEJ en
la p o ección de las ho quillas de eplicación 5,70.
1.4. La p esencia de huecos de ssDNA como uen e de daño en el ADN
Debido a la ele an e unción de PARP1 en el man enimien o de la ho quilla de eplicación,
una de las ap oximaciones e apéu icas que se lle a a cabo pa a el a amien o de umo es
de icien es en la u a HR, es el uso de inhibido es de PARPs (PARPi). Los PARPi inducen
le alidad sin é ica en ausencia de la u a HR, debido a que es a u a es esencial pa a el
man enimien o de la in eg idad genómica du an e la eplicación. PARP1 p esen a una
unción impo an e en p o ege la eplicación, e i ando la duplicación abe an e del genoma
y la mue e celula an e la al a de unción de la u a HR 64. Po ello, el desa ollo de e apias
basadas en PARPi ha mejo ado de o ma signi ica i a la supe i encia en pacien es con
umo es de icien es en HR 13. Sin emba go, el mecanismo molecula que subyace la
le alidad sin é ica de es os inhibido es en células de icien es en BRCA pe manece sin
dilucida . Uno de los mecanismos p opues os que p esen a mayo ele ancia pa a explica
la hipe sensibilidad de las células de icien es en BRCA a los PARPi, es la o mación
abe an e de huecos de ssDNA du an e la eplicación.
O iginalmen e, la oxicidad de los PARPi se elacionaba con la o mación de DSBs óxicos,
ya que además de inhibi la ac i idad ca alí ica de PARP1, es os inhibido es inducen su
a apamien o en la c oma ina en aquellos luga es donde se ha p oducido un SSB,
gene ándose una unión muy ue e en e PARP1 y el ADN, que puede bloquea la
eplicación o in e e i con la epa ación del SSB. Es e bloqueo de la ho quilla de
eplicación po la pe sis encia de es a unión en e PARP1 y el ADN o po la ele ada
acumulación de SSBs sin epa a , pod ía induci el colapso de la ho quilla de eplicación,
necesi ando de la unción de la u a HR pa a e i a la o mación de DSBs ci o óxicos y
p o ege a la ho quilla de eplicación 13,71–75.
INTRODUCCIÓN
53
Figu a I9. Mecanismo de acción de los PARPi. Los PARPi inhiben la ac i idad ca alí ica de PARP1 e
inducen el a apamien o de PARP1 en la c oma ina, lo que impide la epa ación del SSB y conduce a la
o mación de DSBs, que pueden causa el colapso de la ho quilla de eplicación en células de icien es en la
u a HR, conduciendo a la mue e celula . Imagen adap ada de Pa isi A e al, 2023 76.
Da os ecien es mues an que la pé dida de la glicosilasa de ADN SMUG1 (del inglés
single-s and-selec i e mono unc ional u acil DNA glycosylase 1) en células de icien es en
HR, induce esis encia al a amien o con olapa ib. Es o sugie e que as la escisión de la
base modi icada de ADN 5-hid oxime il-2’-desoxiu idina (5hmdU) del genoma po
SMUG1, los PARPi p oducen el a apamien o de PARP1 en la c oma ina que puede causa
el colapso de la ho quilla de eplicación y la o mación de DSBs, p o ocando la mue e
celula en las células de icien es en BRCA 77. Además, se ha desc i o que las células
umo ales de icien es en BRCA1/2 que su en mu aciones secunda ias que es au an la
uncionalidad de las p o eínas BRCA1/2, ecupe an la ac i idad de epa ación po HR y
mues an esis encia al a amien o con los PARPi 78.
Sin emba go, ecien emen e se ha desc i o que la inhibición de la ac i idad de PARP1
puede induci la o mación abe an e de huecos de ssDNA. Es os huecos de ssDNA pueden
o igina se po de ec os en la sín esis de la heb a ezagada o po la acción de PRIMPOL
du an e la sín esis de la heb a con inua 13,74,75. An e un bloqueo de la eplicación po la
p esencia de una lesión en la cadena molde du an e la sín esis de la heb a con inua, la
inhibición de PARP1 impide la o mación de la es uc u a de e e sión de la ho quilla de
eplicación, desencadenando la ac i idad de PRIMPOL, que einicia la sín esis de ADN
aguas abajo del si io de la lesión, a expensas de la o mación de huecos de ssDNA 13,75.
Du an e la sín esis de la heb a ezagada, los PARPi in e ie en en el p ocesamien o de los
agmen os de Okazaki, impidiendo que es os se liguen co ec amen e, lo que gene a
huecos de ssDNA en la heb a ezagada 74,75,79. An e un p oceso de OFM al e ado, la
inhibición de PARP inc emen a de o ma signi ica i a la p esencia de huecos de ssDNA
pos - eplica i os de ás de la ho quilla de eplicación, indicando que los agmen os de
INTRODUCCIÓN
54
Okazaki son una uen e endógena de la geno oxicidad inducida po los PARPi en las células
umo ales de icien es en BRCA 74,79.
Es e modelo de acumulación de huecos de ssDNA as el uso de PARPi, sugie e la
posibilidad de in es iga como posibles dianas e apéu icas los mecanismos que ellenan
es os huecos, especialmen e en el con ex o de la quimio esis encia a los PARPi que pueden
desa olla es os ipos de cánce de icien es en BRCA 13.
1.5. HMCES, un ac o p o ec o de los si ios AP
Los si ios AP son una de las lesiones más ecuen es que ocu en en el ADN, gene ándose
1-5·104 si ios AP al día po célula. La mayo ía de los si ios AP son eliminados cuando se
localizan en dsDNA po la u a de epa ación BER 37. Sin emba go, algunos si ios AP
pueden escapa de su p ocesamien o po la u a BER y du an e la eplicación, se localizan
en ssDNA, pudiendo bloquea a las ho quillas de eplicación en p og eso. Es os si ios AP
ambién pueden o ma se po la acción de enzimas que desaminan las ci osinas localizadas
en la heb a molde en ssDNA du an e el p oceso de eplicación, como las enzimas
AID/APOBEC3, o mando u acilos. Es os u acilos p esen es en el ADN son econocidos
po glicosilasas de ADN especí icas, gene ándose si ios AP en la cadena molde. Es os si ios
AP localizados en la cadena molde en ssDNA, pueden se epa ados de o ma pos -
eplica i a po las polime asas de TLS (POLζ o POLκ), las cuales pueden sin e iza a a és
de ellos, aumen ando la p obabilidad de la gene ación de mu aciones. Además, es os si ios
AP en ssDNA son más suscep ibles de su i eacciones de eliminación β 37 o de se
escindidos po la ac i idad de endonucleasas gene ando DSBs 80,81.
Se ha desc i o que HMCES (del inglés 5-hyd oxyme hylcy osine binding, ES-cell-speci ic),
es un ac o que sensa y p o ege los si ios AP en ssDNA en las ho quillas de eplicación80,81.
O iginalmen e, HMCES se desc ibió como un ac o especí ico de econocimien o de la
base de ADN de i ada del p oceso de desme ilación de la ci osina 5-hid oxime ilci osina
(5hmC) en células mad e emb iona ias de a ón (mESC; del inglés mouse emb yonic s em
cells). HMCES y sus o ólogos es án elacionados gené icamen e po la conse ación del
dominio SRAP (del inglés SOS esponse associa ed pep idase), asociado a la DDR. El
dominio SRAP es un dominio de au op o eólisis, implicado en la eliminación del esiduo
de me ionina 1 pa a posibili a la o mación del DPC median e el esiduo de cis eína 2, y
ambién iene ac i idad nucleasa, la cual escinde las bases de i adas de la oxidación de la
5-me ilci osina (5mC) del ADN 82,83.
HMCES p esen a al os ni eles de exp esión du an e la ase S del ciclo celula , siendo
eclu ada especí icamen e du an e la ase S a la c oma ina as la gene ación de daño en el
ADN. Además, in e acciona con PCNA median e el dominio PIP (del inglés PCNA
in e ac ing pep ide), pa a su eclu amien o a la ho quilla de eplicación 80,84.
El dominio SRAP con iene un esiduo conse ado de cis eína 2 en el ex emo amino, el
cual pe mi e la unión co alen e a los si ios AP localizados en ssDNA, median e un enlace
iazolidínico 80,81,85. Los esiduos de a ginina 98 y 212 del dominio SRAP se encuen an
conse ados y son imp escindibles pa a la unión de HMCES al ADN, y p e e en emen e a
ssDNA con espec o a dsDNA 80,86. HMCES eacciona con los si ios AP localizados en una
in e sección ssDNA-dsDNA que con iene un ex emo 3’ lib e, es uc u a simila a la
o mada cuando una ho quilla de eplicación se bloquea an e un si io AP localizado en la
INTRODUCCIÓN
55
cadena molde 81,85. Debido a su na u aleza ines able, los si ios AP pueden encon a se en
dos es ados: anillo de u anosa ce ado o anillo abie o con un g upo aldehído lib e
al amen e eac i o. Es a al a eac i idad hace de los si ios AP una uen e química muy
eac i a que o ma ICLs o DPCs 37. HMCES eacciona con el si io AP en con o mación
abie a a a és del esiduo de cis eína 2, el cual eacciona con el g upo aldehído del si io
AP o mando un DPC 80,87.
La o mación de HMCES-DPCs lle a a cabo dos unciones molecula es. En p ime luga ,
p e iene el co e mediado po la endonucleasa APEX1, e i ando la o mación de DSBs.
De es e modo, HMCES p o ege a los si ios AP de un p ocesamien o abe an e pa a
man ene la in eg idad del genoma. En segundo luga , impide la acción de las polime asas
de TLS as el bloqueo de la ho quilla de eplicación an e la p esencia de un si io AP en la
cadena molde, e i ando una p og esión abe an e de la ho quilla de eplicación y la
gene ación de mu aciones 80,81.
Figu a I10. Mecanismo de p o ección de los si ios AP en ssDNA po la unión co alen e de HMCES. La
unión co alen e de HMCES a los si ios AP localizados en ssDNA p e iene el co e endonucleolí ico de
APEX1, impidiendo la o mación de DSBs, y la acción de las polime asas de TLS, e i ando la gene ación de
mu aciones. Imagen adap ada de Nowo ny M, 2019 88.
Los HMCES-DPCs esul an en una lesión oluminosa que pod ía in e e i con los
p ocesos de eplicación y ansc ipción, po lo que deben se eliminados. HMCES puede
elimina se del genoma median e 3 mecanismos. Uno de ellos es la eliminación de es e
in e media io HMCES-DPC median e la p o eólisis lle ada a cabo po el p o easoma
mediada po ubiqui inación, sugi iendo que HMCES es una “enzima suicida” 80. Además
de la eliminación po el p o easoma, uno de los mecanismos mejo desc i os pa a la
eliminación de DPCs es la p o eólisis mediada po la p o easa SPRTN asociada a la
eplicación. Es a u a de epa ación no gene a DSBs y es c í ica pa a la iabilidad celula
y la sup esión de en e medades. La helicasa FANCJ coope a con SPRTN pa a elimina los
HMCES-DPC. FANCJ es la enca gada de desna u aliza la p o eína que con o ma el DPC,
INTRODUCCIÓN
56
pe mi iendo que SPRTN pueda ealiza el co e del DPC pa a elimina lo 89. Adicionalmen e
a los mecanismos desc i os an e io men e, exis e un mecanismo no dependien e de
p o eólisis pa a elimina los HMCES-DPCs. Se ha desc i o que HMCES puede au o e e i
su unión co alen e con el si io AP a a és del esiduo ácido glu ámico 127, y pa cialmen e
po la his idina 210, cuando el HMCES-DPC se localiza en dsDNA. Es os esiduos
pe mi en que HMCES sea capaz de au olibe a se, man eniendo la capacidad de o ma
enlaces co alen es an e la p esencia de o os si ios AP que se encuen en en ssDNA o en
una in e sección ssDNA-dsDNA. Es o demues a que el HMCES-DPC es e e sible 87,90.
Has a la echa, el papel de HMCES ha sido desc i o asociado a la heb a molde. An e la
p esencia de si ios AP en la heb a molde, gene ados po la exposición a agen es geno óxicos
o po la ac i idad de las glicosilasas de ADN, HMCES se une co alen emen e a ellos pa a
su p o ección. Sin emba go, los HMCES-DPC ambién se gene an como in e media ios de
epa ación. Los si ios AP en su con o mación abie a pueden eacciona con los aminos
exocíclicos de las bases de la cadena opues a gene ando un ICL. Es os AP-ICLs son
epa ados po la glicosilasa de ADN NEIL3 (del inglés nei endonuclease VIII-like amily
3). T as la acción de NEIL3, el si io AP queda lib e en una de las cadenas, pudiendo se
sob epasado po la helicasa eplica i a CMG y a con inuación, HMCES es capaz de
eacciona con él o mando un DPC, que es deg adado pos e io men e po SPRTN. Po
an o, es e HMCES-DPC pa icipa como in e media io de la epa ación del ADN,
sup imiendo la o mación de DSBs, alen izando el mecanismo de TLS y p omo iendo la
inse ción de una desoxiguanosina en en e del si io AP 91.
1.6. La p esencia de bases de ADN modi icadas en el genoma puede
causa es és eplica i o
La p esencia de bases de ADN que p esen an pequeñas modi icaciones químicas, puede
a ec a a la p og esión de la ho quilla de eplicación que es á en p og eso. Una de las
modi icaciones de las bases de ADN que se man iene es able en el genoma es la 5mC, la
cual se o ma median e la ans e encia enzimá ica de un g upo me ilo a la posición N5 del
anillo de ci osina 92–94.
La 5mC es una ma ca epigené ica que iene unciones ele an es, como el con ol de
di e sos p ocesos celula es (con ol de la ac i idad ansc ipcional, la imp on a genómica
o la inac i ación del c omosoma X), así como la egulación de la sup esión de los elemen os
de ansposición o la modulación de la es uc u a de la c oma ina. Un balance en e los
p ocesos de me ilación y desme ilación pa a man ene el es ado de me ilación, es c ucial
pa a el desa ollo. La pe u bación de es e balance puede lle a a pa ones de me ilación
abe an es que pueden induci el desa ollo de en e medades, como el cánce 93,95,96. La
p incipal unción de la 5mC p esen e en el genoma es la egulación de la exp esión génica,
eniendo un papel ep esi o de la ansc ipción, ya que impide la unión de cie os ac o es
de ansc ipción o eclu a enzimas que modi ican la es uc u a de la c oma ina, haciéndola
más compac a, lo que impide el inicio de la ansc ipción 92.
El g upo me ilo añadido a la ci osina es biológicamen e muy es able, pe o es a adición es
e e sible, pudiendo se eliminado median e di e en es mecanismos 92,96. El mecanismo
más ele an e es la oxidación enzimá ica secuencial que es lle ada a cabo po las enzimas
dioxigenasas TET. Es as enzimas ca alizan la ans e encia de una molécula de oxígeno al
3. MATERIALES Y MÉTODOS
MATERIALES Y MÉTODOS
65
3.1. P ocedimien os de cul i os celula es
3.1.1. Líneas celula es
Todas las líneas celula es que se han usado pa a lle a a cabo los p incipales expe imen os
desc i os en es a esis doc o al son ib oblas os emb iona ios de a ón (MEFs, del inglés
mouse emb yonic ib oblas s) (Tabla 3.5.1). También se han usado líneas celula es de
o igen humano pa a la ealización de expe imen os complemen a ios (Tabla 3.5.1).
3.1.2. Cul i o celula
La línea celula MEF y la línea celula humana U2OS ue on cul i adas en Dulbecco’s
Modi ied Eagle’s Medium (DMEM) (Biowes /Co ning), suplemen ado con 10% ( / ) de
sue o bo ino e al y 1% ( / ) de penicilina/es ep omicina.
La línea celula humana eHAP ue cul i ada en Isco e′s Modi ied Dulbecco′s Medium
(IMDM) (Biowes ), suplemen ado con 10% de sue o bo ino e al y 1% de
penicilina/es ep omicina.
Las líneas celula es humanas MDA-MB-231 y MDA-MB-436 ue on cul i adas en
Roswell Pa k Memo ial Ins i u e (RPMI) 1640 (Biowes ), suplemen ado con 10% de sue o
bo ino e al y 1% de penicilina/es ep omicina.
Las líneas celula es humanas DLD-1 sil es e y de icien e en BRCA2 ue on cul i adas en
RPMI 1640, suplemen ado con 2mM de glu amina, 10% de sue o e al bo ino y 1% de
penicilina/es ep omicina. Las células DLD-1 BRCA2-/- se man u ie on en cul i o
añadiendo al medio hig omicina B a una concen ación inal de 0.1mg/mL.
Todas las líneas celula es ue on man enidas en un incubado con una empe a u a
cons an e de 37ºC y una a mós e a de CO2 al 5%.
Pa a los di e en es ensayos que se han lle ado a cabo du an e la ealización de es a esis
doc o al, se han usado di e en es ipos de placas de cul i o, de las cuales se desc ibe a
con inuación el olumen inal en el que se ealiza la siemb a de las células:
Placa cul i o celula
Volumen inal
96 pocillos
100 µL
24 pocillos
500 µL
12 pocillos
1 mL
6 pocillos
2 mL
10cm
8 mL
3.2. Técnicas de biología celula
3.2.1. T ans ección con ARN pequeño de in e e encia (siRNA; del inglés small
in e e ing RNA)
Pa a lle a a cabo el silenciamien o de genes, u ilizamos siRNAs, los cuales pe mi en
silencia genes median e la deg adación del ARN mensaje o y, po an o, la sup esión de la
sín esis de p o eínas. Los siRNA usados pa a lle a a cabo el silenciamien o de los genes
de in e és, es án compues os po un pool de 4 secuencias diana dis in as con a el mismo
MATERIALES Y MÉTODOS
66
gen (Dha macon siGENOMETM siRNA pool), p opo cionados po la emp esa Ho izon. Los
siRNA que se han u ilizado pa a ealiza los ensayos p esen ados en es a esis doc o al se
han de allado en la Tabla 3.5.2.
Se siemb an 3·105 células en placas de 6 pocillos y al día siguien e, se ealiza la ans ección
usando el agen e de ans ección Lipo ec amine™ RNAiMAX (The mo Scien i ic),
siguiendo el p o ocolo p opo cionado po el ab ican e, con algunas modi icaciones pa a
su op imización:
- P epa ación de una solución A con medio lib e de sue o (Op imem; Gibco) jun o
con lipo ec amina. Pipe ea bien la mezcla.
- P epa ación de una solución B con medio lib e de sue o y la can idad
co espondien e de siRNA (3µL del s ock 20µM). Pipe ea bien la mezcla.
- Mezcla ambas soluciones e incuba 15 minu os a empe a u a ambien e.
- Añadi go a a go a a cada pocillo.
T as 30h desde que se ealizó la ans ección, se e i a el medio de ans ección y se lle a
a cabo la siemb a de los di e en es ensayos molecula es pa a analiza el silenciamien o del
gen de in e és y examina las consecuencias gené icas.
3.2.2. T ans ección con plásmidos
Pa a la sob eexp esión de di e en es genes de in e és, se lle ó a cabo la ans ección de los
plásmidos que con iene el ADN complemen a io (cDNA) del gen de in e és. Los plásmidos
u ilizados pa a la ealización de es e ensayo es án desc i os en la Tabla 3.5.3.
Se siemb an 4·105 células en placas de 6 pocillos y una ez adhe idas, se ealiza el
p o ocolo de ans ección. Se p epa a una p ime a mezcla con 4µg de ADN + 400µL de
medio Op imem, se agi a median e ó ex, y pos e io men e se añaden 6µL del agen e de
ans ección Tu boFec TM (The mo Scien i ic), p e iamen e agi ado po ó ex. Toda la
solución se mezcla median e ó ex y se añade go a a go a. T as 16h-18h, se e i a el medio
de ans ección, eemplazándolo po medio esco. 24h después, se añade la d oga de
selección (desc i as en la Tabla 3.5.4) pa a ob ene una línea celula homogénea que
sob eexp ese de o ma es able nues o gen de in e és.
3.2.3. Gene ación de líneas celula es mu an es median e la écnica CRISPR-Cas9
Pa a la gene ación de líneas celula es mu an es en un gen de in e és, lle amos a cabo la
écnica CRISPR-Cas9, que consis e en la u ilización de una molécula guía de ARN, la cual
pe mi e que la nucleasa Cas9 econozca la secuencia del gen de in e és y se una a ella. El
ARN guía con iene una secuencia PAM necesa ia pa a que Cas9 pueda in oduci co es en
la secuencia del gen diana. Los ARN guías especí icos con a el gen de in e és se diseña on
a a és de la aplicación CRISPR Sea ch (h ps://wge.s emcell.sange .ac.uk/ ind_c isp s).
En ella, se selecciona on dos secuencias de 20 nucleó idos co espondien es al exón 2 del
gen humano FANCD2 (la secuencia PAM sub ayada):
- 950056454 (sgFD2-4) 5’-TACTGGAGGCATCTTCTGTCAGG-3’
- 950056455 (sgFD2-5) 5’-AATGACTAGATACTTACTGGAGG-3’
MATERIALES Y MÉTODOS
67
Figu a M.1. Rep esen ación de la localización de los guías de ARN elegidos pa a la gene ación de
mu an es median e la écnica CRISPR-Cas9.
Es os guías ue on seleccionados po ene una meno ecuencia de unión a secuencias no
especí icas.
Una ez que se eligie on las secuencias de los ARN guías, se modi ica on sus ex emos
pa a añadi les la secuencia diana de la enzima de es icción BbsI/BpiI, y así acili a su
clonaje en el plásmido pSpCas9(BB)-2A-GFP (PX458, Addgene plasmid #48138), el cual
es dige ido po dicha enzima. Se ealiza la ligación de los guías al plásmido dige ido y se
ans o man bac e ias E. Coli DH5α pa a su ampli icación. Se selecciona on di e en es
colonias, de las cuales se ex ajo el ADN plasmídico y median e secuenciación Sange , se
e i icó que el plásmido con enía las secuencias de los ARN guías.
Figu a M.2. Secuenciación del plásmido PX458 as la inse ción de los guías de ARN pa a la ealización
de la écnica CRISPR-Cas9. En la imagen supe io se obse a la secuencia del ARN guía sgFD2-4 y en la
imagen in e io se obse a la secuencia del ARN guía sgFD2-5.
Una ez que ob enido el plásmido PX458 con los ARN guías, se ans ec an las células
siguiendo el p o ocolo explicado en el apa ado 3.2.2. Debido a que el plásmido PX458
exp esa la p o eína luo escen e GFP, seleccionamos las células que han adqui ido el
plásmido median e ci ome ía de lujo y se siemb a a azón de 1 célula po pocillo en placa
de 96 pocillos, pa a deja c ece clones independien es. A medida que los clones iban
c eciendo, se diluye on en pocillos de mayo amaño has a ene un núme o su icien e de
células que pe mi ió la comp obación de la al a de exp esión p o eica median e Wes e n
Blo y la ex acción de ADN pa a secuencia y comp oba las mu aciones que han sido
in oducidas. Median e es as dos écnicas, se selecciona on aquellos clones candida os
posi i os pa a se mu an es en el gen FANCD2.
MATERIALES Y MÉTODOS
68
3.2.4. Reacción celula Click-iT
Pa a la de ección de células en ase S median e mic oscopía o ci ome ía de lujo, se u ilizó
el análogo de la imidina 5-e inil-2’-desoxiu idina (EdU), el cual se añade a una
concen ación inal de 10µM du an e la úl ima ho a del a amien o. La de ección de EdU
se basa en una eacción química co alen e ca alizada po cob e en e una azida y un g upo
alquino ( eacción Click-iT). Las células se incuban du an e 30 min a empe a u a ambien e
y en oscu idad. Los eac i os deben se añadidos a la mezcla en el siguien e o den:
100mM T is-HCl pH 8.5
1mM CuSO4
1µM Azida Alexa Fluo 488
H2O milliQ
100mM ácido ascó bico
T as es a incubación, los pasos que se suceden di ie en dependiendo si las mues as son
pa a inmuno luo escencia o pa a ci ome ía de lujo.
3.2.5. Análisis del ciclo celula
Pa a examina el pe il de ciclo celula , se siemb an 2·105 células en placas de 6 pocillos y
una ez adhe idas, son a adas con la d oga de in e és y el iempo de incubación que se
equie a. Du an e las dos úl imas ho as del a amien o, se añade EdU a una concen ación
inal de 10µM pa a el ma caje de las células en ase S.
Una ez pasado el iempo de incubación con el a amien o, se ecogen las células con
ipsina, se la an con PBS y se ijan con e anol 70% ío, go a a go a y agi ando median e
ó ex. Las mues as se gua dan a 4ºC, du an e mínimo 4h, an es de ealiza la inción.
Pa a lle a a cabo la inción, se ob iene el pelle de células y se pe meabiliza con
PBS+0.1%T i ón X-100. A con inuación, se ob iene el pelle celula y se esuspende en
solución de bloqueo (PBS+0.3%Tween20+3%BSA), incubándolo du an e 30 min. T as el
bloqueo, se ob iene el pelle y se lle a a cabo la eacción celula Click-iT, incubando las
células du an e 30 min a empe a u a ambien e y en oscu idad.
T as la eacción Click-iT, se ob iene el pelle y se ealiza un la ado con solución de bloqueo.
Se uel e a ob ene el pelle y se esuspende en solución de inción (0.01mg/mL Iodu o de
P opidio + 0.2mg/mL RNAsa A, diluidos en PBS), incubando las células du an e 30 min a
empe a u a ambien e y en oscu idad. Finalmen e, se uel en a la a las células en solución
de bloqueo, se il an y son pasadas po el ci óme o LSRFo essa X-20.
El análisis de los da os se lle a a cabo con el so wa e FlowJo 9.0.
3.2.6. Inmuno luo escencia
Pa a la de ección de p o eínas a a és de mic oscopía, se siemb an 7.5·104 células en
cub eobje os de id io es é iles (VWR) colocados en placas de 24 pocillos. Una ez que
las células se han adhe ido, se añade el a amien o co espondien e du an e el iempo
es imado. T as la incubación con el a amien o, se la an las células con PBS y se ealiza
un paso de p e-ex acción celula , median e la adición de 0.25/0.5% T i ón X-100+PBS
ío du an e 2 minu os en hielo, seguido de un p oceso de ijación celula con 4%
o maldehído+PBS ío du an e 15 min en hielo. T as la ijación, se ealiza un la ado con
MATERIALES Y MÉTODOS
69
PBS pa a elimina los es os de solución de ijación que puedan queda y se p ocede al
bloqueo de las células con PBS+0.3%Tween20+3%BSA, du an e 20-30 minu os en
agi ación y a empe a u a ambien e.
La incubación con el an icue po p ima io se lle a a cabo median e la dilución del mismo
en solución de bloqueo, du an e 16-18h a 4ºC y en condiciones de humedad. Al día
siguien e, se ealizan 3 la ados en agi ación con PBS+0.3%Tween20 de 5 minu os.
Pos e io men e, el co espondien e an icue po secunda io conjugado con un luo ó o o se
diluye en la solución de la ado, jun o con 0.1mg/mL de DAPI (4’6-diamidine-2-
phenylindole dihyd ochlo ide; pe mi e la inción del núcleo), y se incuban du an e 1h en
oscu idad, a empe a u a ambien e y en condiciones de humedad. Finalmen e, se ealizan 3
la ados con PBS+0.3%Tween20, los cub eobje os de id io se dejan seca du an e 5
minu os y se mon an en un po aobje os usando el medio de mon aje an i-decolo ación
P oLong™ Gold (In i ogen).
Las imágenes son omadas en el mic oscopio Leica Thunde image DMi8 con el obje i o
40X. La cuan i icación de la in ensidad de señal nuclea y la ep esen ación g á ica de los
esul ados se ealizó usando los so wa es Fiji y G aphPad P ism 9.0 espec i amen e.
Los an icue pos p ima ios usados pa a los ensayos de inmuno luo escencia epo ados en
es a esis doc o al es án desc i os en la Tabla 3.5.6.
Pa a la de ección de células en ase S, se añade en la úl ima ho a del a amien o 10µM de
EdU. A con inuación, pe meabilizamos y ijamos de la misma o ma explicada p e iamen e
y as la ijación, bloqueamos con PBS+0.3%Tween20+3%BSA du an e 1h en agi ación y
a empe a u a ambien e. T as el bloqueo, se ealizan dos la ados de 5 min en agi ación con
PBS+1%BSA y se lle a a cabo la eacción celula Click-iT, incubando las células du an e
30 min a empe a u a ambien e y en oscu idad.
T as es a incubación, se ealizan dos la ados con PBS+0.3%Tween20 de 5 min en agi ación
y se uel e a bloquea du an e 20-30 min en agi ación. A con inuación, se p ocede a la
incubación del an icue po p ima io y secunda io de la misma o ma que se ha explicado
p e iamen e.
3.2.7. De ección de células B dU+ median e inmuno luo escencia
Pa a de e mina el po cen aje de células B dU+ as un p oceso de esección del ADN
nacien e, el análogo de la imidina 5-b omo-2’-desoxiu idina (B dU) se añade du an e 2
ciclos celula es y se ealiza el p o ocolo de inmuno luo escencia explicado en el apa ado
3.2.6.
3.2.8. SIRF (in si u P o ein In e ac ion wi h Nascen DNA Replica ion Fo ks)
Pa a la de ección de p o eínas que se encuen an p óximas (< 40nm) a la ho quilla de
eplicación, lle amos a cabo es e ensayo desc i o po Roy S and Schlache K, 2019 107, con
algunas modi icaciones. La ho quilla de eplicación se e ique a median e un pequeño pulso
de EdU, y a con inuación, se añade el a amien o, pa a de ec a aquellas p o eínas que se
eclu an a la ho quilla de eplicación as el daño inducido po el a amien o. Se lle a a
cabo la eacción celula Click-iT pa a bio inila la EdU que se ha inco po ado al ADN
nacien e y después se ealiza la incubación con los an icue pos con a la bio ina, pa a
iden i ica la EdU, y con a la p o eína de in e és. T as es a incubación se ealiza la
MATERIALES Y MÉTODOS
70
ampli icación de la señal median e PLA (del inglés P oximi y Liga ion Assay), lo que
pe mi i á la isualización de la p o eína de in e és que se localiza a una dis ancia < 40nm
del ADN ecién sin e izado.
Figu a M3. Esquema de la écnica SIRF pa a de ec a la asociación de p o eínas con el ADN nacien e.
Imagen adap ada de Tagliala ela A e al, 2017 63.
Se siemb an 105 células en cub eobje os de id io en placa de 24 pocillos. Al día siguien e,
se da un pulso con 125µM de EdU du an e 8 min, pa a e ique a el ADN que se es á
sin e izando. A con inuación, se e i a el medio ápidamen e y se dan 2 la ados con PBS,
pa a añadi el a amien o es imado du an e el iempo eque ido.
Una ez inalizado el a amien o, lle amos a cabo la pe meabilización de las células con
0.5%T i ónX-100+PBS ío du an e 2 min y as la pe meabilización, ijamos las células
con 2% o maldehído+PBS ío du an e 15 min. Se ealizan 2 la ados con PBS de 5 min y
se lle a a cabo la eacción Click-iT du an e 1h a empe a u a ambien e, en condiciones de
humedad y oscu idad:
2mM CuSO4
1µM Azida Alexa Fluo 488 (nos pe mi e isualiza la ase del ciclo celula y
selecciona solo aquellas células que es án en ase S)
9µM bio in-PEG3-azide (pa a bio ilina EdU que se ha inco po ado al ADN
nacien e)
PBS
100mM ácido ascó bico
T as la eacción Click-iT, se dan dos la ados con PBS de 5 min y se incuban las mues as
con la solución de bloqueo, du an e 1h a empe a u a ambien e, en condiciones de humedad
y oscu idad. A con inuación, se ealiza la incubación con los an icue pos p ima ios,
diluidos en la solución de bloqueo, du an e 16h a 4ºC y en condiciones de humedad. Los
an icue pos p ima ios usados pa a la ealización de es e ensayo se desc iben en la Tabla
3.5.6.
Al día siguien e, se lle a a cabo el ensayo PLA. Se ealizan 3 la ados con la solución de
la ado A (10mM T is-HCl pH 7.5 + 150mM NaCl + 0.05%Tween20) du an e 5 min en
agi ación y a con inuación se lle a a cabo la incubación con las sondas (Duolink® In Si u
PLA® P obe an i-mouse MINUS y an i- abbi PLUS) diluidas 1:5 en solución de bloqueo
du an e 1h a 37ºC en condiciones de humedad y oscu idad. T as la incubación con las
sondas, se ealizan 3 la ados con solución de la ado A du an e 5 min en agi ación y se
incuban las mues as con la ligasa en solución de ligación (diluidas 1:5 y 1:40
MATERIALES Y MÉTODOS
71
espec i amen e en H2O milliQ; Duolink® In Si u De ec ion Reagen s O ange) du an e 30
min a 37ºC en condiciones de humedad y oscu idad. Una ez inalizada la incubación con
la ligasa, se ealizan 2 la ados de 2 min con la solución de la ado A y se p ocede a la
incubación con la polime asa de cí culo odan e en solución de ampli icación (diluidas 1:5
y 1:80 espec i amen e en H2O milliQ; Duolink® In Si u De ec ion Reagen s O ange)
du an e 100 min a 37ºC y en condiciones de humedad y oscu idad.
T as la eacción de ampli icación, se ealizan 3 la ados de 10 min con la solución de la ado
B (200mM T is-HCl pH 7.5 + 100mM NaCl) en agi ación y un la ado de 1 min con una
dilución 0.01X de la solución de la ado B en H2O milliQ. T as es os la ados, se lle a a
cabo la inción con DAPI, diluido 1:1000 en PBS du an e 5 min en condiciones de
oscu idad y humedad. Una ez inalizada la inción con DAPI, se ealizan 2 la ados de 5
min con PBS y se p ocede al mon aje en po aobje os usando el medio de mon aje an i-
decolo ación P oLong™ Gold.
Las imágenes son omadas en el mic oscopio Leica Thunde image DMi8 con el obje i o
63X con acei e de inme sión. La cuan i icación de los ocos po célula y la ep esen ación
g á ica de los esul ados se ealizó usando los so wa es Fiji y G aphPad P ism 9.0
espec i amen e.
3.2.9. Ensayo de abe aciones c omosómicas
Pa a de e mina la p esencia de abe aciones c omosómicas, se siemb an 2.5·105 células en
placas de 10 cm y una ez adhe idas, se añade el a amien o du an e 2 ciclos celula es.
Una ho a y media an es de inaliza el segundo ciclo, se añade la solución Ka yoMAX
colcemid (Gibco) a una concen ación inal de 0.05µg/mL. Es a solución pe mi e de ene
las células en me a ase pa a el es udio pos e io de los c omosomas, ya que impide la
o mación del huso mi ó ico du an e la mi osis.
Una ez inalizado el segundo ciclo celula , se ecogen an o las células como el medio y
se ob iene el pelle celula , el cual se esuspende en una solución hipo ónica (75mM KCl),
p e iamen e a empe ada a 37ºC, du an e 50 min en un baño a 37ºC. Es a solución
hipo ónica pe mi e da un choque osmó ico a las células pa a acili a la o u a de las
memb anas celula es. A con inuación, se ob iene el pelle celula que se ija con la solución
de ijación (me anol:ácido acé ido (3:1)) ía, añadiéndola go a a go a y en con inua
agi ación manual. Es e paso se epi e en dos ocasiones más, disminuyendo el olumen de
solución de ijación. En el úl imo la ado, las células se concen an y se p ocede a la
ex ensión de las me a ases en un po aobje os. Pa a ello, se i an 3 go as de células po
po aobje o a una dis ancia de 45-50 cm. Los po aobje os se dejan seca a 50ºC du an e 30
min y se p ocede a la inción de los mismos.
Los po aobje os se sume gen en una solución compues a po Giemsa diluida 1:10 en H2O
milliQ y se incuban du an e 30 min. T as es e iempo, los po aobje os se la an con agua
des ilada y se dejan seca a 37ºC du an e 30 min. Po úl imo, se mon an los po aobje os
con un cub eobje os usando el medio de mon aje En ellanR Nue o (AP Medical). Al día
siguien e, se con abilizan las abe aciones c omosómicas, usando el mic oscopio óp ico
Leica DM6000, con el obje i o de magni icación 100X con acei e de inme sión, y pa a el
análisis de las imágenes se usa el so wa e LAS AF Leica.
MATERIALES Y MÉTODOS
72
3.2.10. Ensayo de in e cambio de c omá idas he manas (SCEs)
Es e ensayo consis e en la ex ensión de me a ases pa a la con abilización de p ocesos de
ecombinación homóloga que ocu en en las células de o ma espon ánea o inducida po
un a amien o. Se siemb an 2.5·105 células en placa de 10 cm y se añade 10µM de B dU
du an e 2 ciclos celula es comple os, pa a la inción di e encial de las c omá idas he manas.
De la misma o ma, el a amien o es añadido du an e dos ciclos celula es comple os o
du an e las úl imas 12h del segundo ciclo celula pa a ce cio a nos que el daño ocu e en
la cadena de ADN nacien e y du an e el ciclo celula que es á en p og eso.
Pa a la ex ensión de las me a ases una ez inalizado el a amien o, se lle a a cabo el
mismo p o ocolo explicado en el apa ado 3.2.9.
Una ez que se han ex endido las me a ases en los po aobje os, se p ocede a la inción. Se
sume gen los po aobje os en una solución de bisbenzimidazol (Hoechs 33442), diluido
10µg/mL, en ampón os a o (0.2M NaH2PO4 + 0.2M Na2HPO4, pH 6.8), du an e 25 min
en oscu idad. A con inuación, se hace un la ado con solución McIl aine (164mM Na2HPO4
+ 15mM ácido cí ico, pH 7), se coloca un cub eobje os y se exponen los po aobje os a
adiación UV du an e 35 min. T as es a exposición, se e i an los cub eobje os y se incuban
los po aobje os en solución 2XSSC (300mM NaCl + 30mM ci a o de sodio, pH 7) du an e
1h en un baño a 62ºC (la solución 2XSSC es p e iamen e a empe ada). T as es e iempo de
incubación, se iñen los po aobje os con la solución de inción, compues a po Leishman
(3g/L, diluido en me anol), diluido 1:4 en ampón os a o, que se il a, y se añade Tween20
a una concen ación inal de 0.05%. La inción se ealiza du an e 3 min y después, los
po aobje os se la an con agua des ilada y se dejan seca a 50ºC du an e 30 min. Po úl imo,
se mon an los po aobje os con un cub eobje os usando el medio de mon aje En ellanR
Nue o (AP Medical). Al día siguien e, se con abilizan los in e cambios de c omá idas
he manas, usando el mic oscopio óp ico Leica DM6000, con el obje i o de magni icación
100X con acei e de inme sión, y pa a el análisis de las imágenes se usa el so wa e LAS
AF Leica.
3.2.11. Ensayo de iabilidad MTT
Pa a es udia la iabilidad celula as la exposición a di e en es compues os, se usó un
ensayo colo imé ico que mide la ac i idad me abólica celula como indicado de la
iabilidad celula . Se basa en la o mación de c is ales de o mazán de colo mo ado, as
la educción de una sal de e azolio de colo ama illa (b omu o de 3-(4,5-dime il iazol-2-
il)-2,5-di enil e azolio o MTT) po las células me abólicamen e ac i as. Es os c is ales de
o mazán insolubles se disuel en en una solución de solubilización. De es a mane a, la
can idad de sal educida en el medio de cul i o as la incubación co elaciona con el
núme o de células me abólicamen e ac i as.
Pa a lle a a cabo es e ensayo, se siemb an 2.5·103 células en placas de 96 pocillos. Al día
siguien e, se añade el a amien o a di e en es concen aciones y se incuba du an e 72h.
T as es e pe iodo de incubación, se añaden 10µL de Thiazolyl Blue Te azolium
( esuspendido en H2O milliQ a una solubilidad de 5mg/mL) y se incuba, como mínimo,
du an e 4h a 37ºC. Pasado es e iempo, se añaden 100µL de la solución de solubilización
(10% de SDS + 0.01M HCl), el cual se incuba 16-18h. T as es e iempo, se ealiza la lec u a
de la placa en un espec o o óme o mul ipocillos (Va ioskan; The mo), el cual nos da el
MATERIALES Y MÉTODOS
79
pH8+900mM NaCl y se eluye el ADN con 600µL de 10mM T is-HCl pH8+1M
NaCl+1.8% ca eína.
Pa a la pu i icación inal del ADN, se añade odo el olumen de ADN eluido a los ubos
Amicon Ul a-0.5 Cen i uga Fil e Uni wi h Ul acel-100 (Millipo e, UFC510096), los
cuales se cen i ugan du an e 10min a 2400g a empe a u a ambien e. La memb ana se la a
dos eces con TE 1X, cen i ugando 10min a 10000g, y, po úl imo, se ecupe a el ADN
concen ado dándole la uel a a los ubos que con ienen la memb ana y cen i ugando de
nue o du an e 10min a 10000g.
Una ez pu i icado el ADN, se en ían las mues as al labo a o io del D . Vincenzo
Cons anzo, donde ealizan el p o ocolo desc i o en Han hi YW e al, 2024 109, pa a
isualiza las mues as median e mic oscopía elec ónica y cuan i ica la ecuencia de
ho quillas de eplicación o as.
3.4. Análisis es adís icos
El núme o de cada éplica expe imen al (R) y el núme o de células cuan i icadas (n) se
indica en la leyenda de las igu as. La cuan i icación de la in ensidad media de la señal
nuclea o el núme o de ocos den o del núcleo se ep esen a en un g á ico de pun os, donde
se mues a la mediana o la media jun o con la des iación es ánda (s.d.), indicado en la
leyenda de las igu as. Pa a la ep esen ación de la p opo ción IdU/CldU del ensayo de
ib as de ADN, se u iliza el diag ama de caja y bigo es, en el cual la caja ep esen a el
pe cen il 25-75, mien as que los bigo es ep esen an el pe cen il 10-90, y el cen o de la
caja es el alo de la mediana.
Pa a de e mina la signi icancia es adís ica de los da os ep esen ados, se han usado los es
Mann-Whi ney (no pa amé ico), de S uden o One-way ANOVA (*p < 0.05, **p < 0.01,
***p < 0.001, ****p < 0.0001). El análisis de los da os se ha ealizado con el so wa e
G aphPad P ism 9.
3.5. Tablas de ma e iales
3.5.1. Líneas celula es
Línea celula
Geno ipo
Re e encia
DLD1 BRCA2-/-
Línea celula DLD1 de icien e
en BRCA2
Cedida po D . And és
Aguile a (Uni e sidad de
Se illa/CABIMER)
DLD1 BRCA2+/+
Línea celula humana de
adenoca cinoma colo ec al
de i ada de pacien e
Cedida po D . And és
Aguile a (Uni e sidad de
Se illa/CABIMER)
eHAP (Fully-haploid
enginee ed HAP1 cell)
Línea celula humana haploide
Cedida po el D . Ge y
C ossan (LMB-MRC,
Camb idge, UK)
eHAP FANCD2-
Línea celula humana haploide
de icien e en el gen FANCD2
Línea celula gene ada
du an e es a esis
MDA-MB-231
Línea celula humana sil es e
Cedida po D . Pablo
Hue as (Uni e sidad de
Se illa/CABIMER)
MATERIALES Y MÉTODOS
80
MDA-MB-436
Línea celula humana de icien e
en BRCA1
Cedida po D . Pablo
Hue as (Uni e sidad de
Se illa/CABIMER)
MEFs Fancd2-/-
Fib oblas os emb iona ios de
a ón, con ondo gené ico
híb ido C57/BL6 y s 129
de icien es en el gen Fancd2
Línea gene ada en el
labo a o io po Cla a B.
Ga cía Calde ón
MEFs sil es es
Fib oblas os emb iona ios de
a ón, con ondo gené ico
híb ido C57/BL6 y s 129
sil es es
Línea gene ada en el
labo a o io po Cla a B.
Ga cía Calde ón
MEFs sil es es
Fib oblas os emb iona ios de
a ón sil es es
Cedidos po D . Kei h W.
Caldeco (Uni e sidad
de Sussex, UK)
MEFs X cc1-/-
Fib oblas os emb iona ios de
a ón de icien es en el gen
X cc1
Cedidos po D . Kei h W.
Caldeco (Uni e sidad
de Sussex, UK)
U2OS
Línea celula ob enida de un
os eosa coma humano
Cedida po D . Fe nando
Gómez He e os
(Uni e sidad de Se illa/
IBiS)
3.5.2. siRNA
Gen diana
Secuencia diana (5’-3’)
Re e encia
Apex1
CAAUGUGGCUCAUGAAGAA
GGACUUACAUGAUGAAUGC
CAACACUGCUUACGCUUAC
UGGAAUACCGACAGCGUUG
M-042935-01
Apex2
GGUUAUAACUCCUAUUUCA
GGGCGUAAGUGGAUGGAUG
GUACUGCCCUCACGCGGAU
ACAUAGGGCUCUUCAUGGA
M-050966-00
Dck
GAAGAGCGGUGGAAAUGUU
GAAACAGAGUGGACCAUAU
CGAGAAAUGCUUAAACAGA
AGUCAACGUUUGUGAAUAU
M-055649-01
Dc d
CCAAAUGGGUGCAGUGAUG
GUGAAGGGCUGCAGCAUGU
GAUCAAUAGCCGACCGAGU
UGAGUUUCGUCUCGUUAAA
M-058063-02
Hmces
GCAGAUGGAUUCUACGAGU
CAUCAGAUCGGAUAAUUAU
GUGAACAAUUCCCGAAACA
UGUCGUAGUGAUACCAUAA
M-062972-00
HMCES
GCGAACAUCCUGUCACUUA
GUGAACAACUCGCGAAACA
GGGAAGACGCUGUGUCGUU
CACGAGAGCUUGCGCCUAC
M-020333-01
MATERIALES Y MÉTODOS
81
Non- a ge ing
UAGCGACUAAACACAUCAA
UAAGGCUAUGAAGAGAUAC
AUGUAUUGGCCUGUAUUAG
AUGAACGUGAAUUGCUCAA
D-001206-13
Pa p1
GGAGGAAGGUGUCAACAAA
UAAAGAAGCUGACGGUGAA
CAAAGUAUCCCAAGAAGUU
GAAAUAUCCUACCUCAAGA
M-040023-00
P impol
CGGAAGAAUUACUGGUUUA
GGGAAAUGGACAACGUAUU
GUUUAUAGCAACCGUUCUA
CAUCUCAGACUAAACGAAA
M-067173-00
Smug1
GUAACUAUGUGACUCGCUA
GGAUGAGGGUUCAGCCAGA
GCGGACAGCCUCAAGUCUU
GGAUUAUGCUUGGGAGCCA
M-041546-01
X cc1
GCGCUGGGACCGUGUUAAA
CGCCAUACGGCCUGAGUUU
AUGGCGAGCUCGAGGACUA
GAGGCCGGAUUGUGCGUAA
M-046270-00
3.5.3. Plásmidos
Plásmido
Desc ipción
Re e encia
pCAG-MmHMCES-
FLAG
Plásmido que con iene el
cDNA pa a la sob eexp esión
de la p o eína HMCES de
a ón, usionada con el
epí opo FLAG
Plásmido gene ado en el
labo a o io po Yaiza
Rod íguez Ma ín
pRFP-HsXRCC1
Plásmido que con iene el
cDNA pa a la sob eexp esión
de la p o eína XRCC1
humana, usionada a la
p o eína luo escen e RFP
Cedido po D . Kei h W.
Caldeco (Uni e sidad de
Sussex, UK)
pSp-Cas9-GFP (Px458)
Plásmido que con iene Cas9
pa a la ealización de la
écnica CRISPR
Cedido po D . Feng Zhang
(Addgene #48138)
3.5.4. An ibió icos de selección
An ibió ico de selección
Concen ación usada
Blas icidina
4µg/mL
Hig omicina
0.1mg/mL
Neomicina (G418)
250µg/mL
MATERIALES Y MÉTODOS
82
3.5.5. Reac i os
Reac i o
Desc ipción
Re e encia
5cadC
5-ca boxi-2’-
desoxici idina
Be y & Associa es (PY
7593)
5dC
2’-desoxici idina
Sigma-Ald ich (D3897)
5 dC
5- o mil-2’-desoxici idina
Be y & Associa es (PY
7589)
5hmdC
5-hid oxime il-2’-
desoxici idina
Be y & Associa es (PY
7588)
Jena Bioscience (N-1070)
5hmdU
5-hid oxime il-2’-
desoxiu idina
Byosyn h (ND08018)
5mdC
5-me il-2’-desoxici idina
Be y & Associa es (PY
7635)
AZD-7762
Inhibido de CHK1 que
bloquea su ac i idad
quinasa
Sigma (SML0350)
Azida Alexa Fluo 488
Azida luo escen e que
eacciona con un g upo
alquino e minal median e
eacción celula Click-iT
In i ogen (A10266)
Benzonase® Nuclease
Nucleasa capaz de elimina
los ácidos nucleicos pa a
po encia la pu eza y la
calidad de las mues as
p o eicas
Sigma (E1014)
Bio in-PEG3-azide
Azida que eacciona con un
g upo alquino e minal
median e eacción celula
Click-iT y pe mi e la
adición de una bio ina
Baseclick (BCFA-021-5)
B dU
5-b omo-2’-desoxiu idina
Sigma-Ald ich (B5002)
CldU
5-clo o-2’-desoxiu idina
San a C uz Bio echnology
(sc-221018)
Duolink® In Si u
De ec ion Reagen s O ange
Ligasa, solución de
ligación, polime asa de
cí culo odan e y solución
de ampli icación pa a la
de ección de la señal PLA
Sigma (DUO92007)
Duolink® In Si u PLA®
P obe an i-mouse MINUS
Sonda que econoce el
an icue po con a a ón
pa a la ampli icación de la
señal median e PLA
Sigma (DUO92004)
Duolink® In Si u PLA®
P obe an i- abbi PLUS
Sonda que econoce el
an icue po con a conejo
pa a la ampli icación de la
señal median e PLA
Sigma (DUO92002)
EdU
5-e inil-2’-desoxiu idina
Baseclick (BCN-001-100)
MATERIALES Y MÉTODOS
83
IdU
5-iodo-2’-desoxiu idina
San a C uz Bio echnology
(sc-205720)
Inhibido C5
Inhibido de la ac i idad
ca alí ica de DNA2
GLPBIO (GC38207)
MG-132
Inhibido del p o easoma
Sigma (474790)
Mi ina
Inhibido de la ac i idad
exonucleolí ica de MRE11
Sigma (M9948)
MMS
Me anosul ona o de me ilo
Sigma (129925)
Olapa ib
Inhibido de PARP1
Selleckchem (S1060)
P o einasa K
Enzima p o eolí ica que
elimina las p o eínas de las
p epa aciones de ácidos
nucleicos
Roche (03115801001)
RNAsa A
Deg adación del ARN
Sigma (R6513)
UCN-01
Inhibido de CHK1 que
anula el pun o de con ol
G2/M
San a C uz Bio echnology
(sc-202376)
3.5.6. An icue pos
Diana
O igen
Aplicación (dilución)
Re e encia
APEX1
Rabbi
Wes e n Blo (1:1000 en TTBS+
5%leche)
ABclonal (A1117)
Bio ina
Mouse
SIRF (1:100 en solución de
bloqueo)
Sigma (B7653)
B dU
Mouse
Ensayo de ib as de ADN (1:250 en
PBS+0.1% T i ón X-100+3% BSA)
Inmuno luo escencia (1:1000 en
PBS+0.3%Tween20+ 3%BSA)
BD Bioscience
(347580)
B dU
Ra
Ensayo de ib as de ADN (1:250 en
PBS+0.1% T i ón X-100+3% BSA)
Abcam (Ab6326)
CHK1
Mouse
Wes e n Blo (1:2000 en TTBS+
5%leche)
San a C uz
Bio echnology
(sc-8408)
DCK
Rabbi
Wes e n Blo (1:1000 en TTBS+
5%leche)
ABclonal (A1794)
DCTD
Rabbi
Wes e n Blo (1:1000 en TTBS+
5%leche)
P o ein ech
(16784-1-AP)
ERCC1
Mouse
Wes e n Blo (1:1000 en TTBS+
5%leche)
San a C uz
Bio echnology
(sc-17809)
FANCD2
Rabbi
Wes e n Blo (1:1000 en TTBS+ 5%
leche)
Abcam
(EPR2302)
FLAG
Mouse
Inmuno luo escencia (1:25 en PBS+
0.3%Tween20+ 3%BSA)
Sigma (F1804)
HISTONA H3
Rabbi
Wes e n Blo (1:1000 en TTBS+
5%leche)
In i ogen (PA5-
16183)
MATERIALES Y MÉTODOS
84
HMCES
Rabbi
Wes e n Blo (1:1000 en TTBS+
1%BSA)
No us (NBP2-
14410)
IdU
Mouse
Ensayo de ib as de ADN (1:250 en
PBS+0.1% T i ón X-100+3% BSA)
Sigma
(SAB3701448)
LAMIN A/C
Mouse
Wes e n Blo (1:1000 en TTBS+
5%leche)
San a C uz
Bio echnology
(sc-376248)
PARP1
Rabbi
Wes e n Blo (1:1000 en TTBS+
5%leche)
Cell Signalling
(46D11)
PCNA
Mouse
Wes e n Blo (1:2000 en TTBS+
5%leche)
San a C uz
Bio echnology
(sc-56)
Phospho
CHK1
(se 345)
Rabbi
Wes e n Blo (1:1000 en TTBS+
3%BSA)
Cell Signalling
(133D3)
Phospho
H2A.X
(se 139)
Mouse
Inmuno luo escencia (1:1000 en
PBS+ 0.3%Tween20+ 3%BSA)
Wes e n Blo (1:2000 en TTBS+
5%leche)
Millipo e (05-
636)
Phospho
H2A.X
(se 139)
Rabbi
Inmuno luo escencia (1:2000 en
PBS+ 0.3%Tween20+ 3%BSA)
Cell Signalling
(20E3)
Poly(ADP)-
ibose (PAR)
Rabbi
Inmuno luo escencia/SIRF (1:1000
en PBS+ 0.3%Tween20 +3%BSA)
Millipo e
(MABE1016)
PRIMPOL
Rabbi
Wes e n Blo (1:500 en TTBS+
5%leche)
An icue po
pu i icado po el
D . Raimundo
F ei e
(Uni e sidad de
La Laguna)
RAD51
Rabbi
Wes e n Blo (1:500 en TTBS+
5%BSA)
Cell Signaling
(D4B10)
Se 33-RPA32
Rabbi
Wes e n Blo (1:1000 en TTBS+
3%BSA)
Cell Signaling
(E9N1T)
Se 4/se 8-
RPA32
Rabbi
Inmuno luo escencia (1:2000 en
PBS+ 0.3%Tween20+ 5%BSA)
BioNo a (A300-
245A)
SMUG1
Rabbi
Wes e n Blo (1:1000 en TTBS+
5%leche)
Cell Signaling
(E7P4I)
XRCC1
Mouse
Inmuno luo escencia (1:500 en
PBS+0.3%Tween20+3%BSA)
In i ogen (MA5-
12071)
XRCC1
Rabbi
Wes e n Blo (1:1000 en TTBS+
5%leche)
ABclonal (A0442)
α-TUBULINA
Mouse
Wes e n Blo (1:1000 en TTBS+
5%leche)
GeneTex
(GTX628802)
4. RESULTADOS
4.1. CAPÍTULO 1: XRCC1 p e iene la
ines abilidad de la ho quilla de eplicación
du an e la inco po ación e ónea de la
base de ADN modi icada 5hmdU
RESULTADOS
95
Figu a C1.7. La exposición a 5hmdC inc emen a los ni eles nuclea es de PAR y γH2AX en las células
X cc1-/-. A) Imágenes ep esen a i as de inmuno luo escencia de los ni eles nuclea es de PAR ( ojo) y de
γH2AX ( e de) de las líneas celula es sil es e y de icien e en XRCC1 as la exposición a 5hmdC (5µM y
10µM) du an e 3h. B) Cuan i icación de la in ensidad nuclea media de PAR po célula (n=150) as el
a amien o con 5hmdC (R=3; es es adís ico Mann-Whi ney; la línea cen al ep esen a el alo de la
mediana). C) Cuan i icación de la in ensidad nuclea media de γH2AX po célula (n=150) as el a amien o
con 5hmdC (R=3; es es adís ico Mann-Whi ney; la línea cen al ep esen a el alo de la mediana).
Ya que la de ección de γH2AX es una medida indi ec a de los DSBs, de e minamos la
p esencia de DSBs de mane a di ec a median e el ensayo de abe aciones c omosómicas.
Mien as que la exposición a 5hmdC no inc emen ó la ecuencia de abe aciones
c omosómicas de o ma signi ica i a en las células sil es es, en las células X cc1-/- se
obse ó un inc emen o signi ica i o y dosis-dependien e de la ecuencia de huecos, o u as
y c omosomas adiales as el a amien o con 5hmdC (Figu a C1.8 A y B). Es os da os
sugie en en las células X cc1-/- la inco po ación e ónea de la 5hmdC du an e la eplicación
gene a SSBs que se ans o man en DSBs.
RESULTADOS
96
Figu a C1.8. La exposición a 5hmdC inc emen a la ecuencia de abe aciones c omosómicas en las
células de icien es en XRCC1. A) Imágenes ep esen a i as de me a ases de células sil es es y X cc1-/- pa a
la cuan i icación de abe aciones c omosómicas as el a amien o con 5hmdC (1.25 µM y 2.5µM du an e 2
ciclos celula es). B) Cuan i icación del núme o de los di e en es ipos de abe aciones c omosómicas po
me a ase (n=50 de 2 éplicas biológicas independien es; es es adís ico de S uden ; las ba as ep esen an
la media ± s.d.).
Es os da os sugie en que la inco po ación e ónea de la 5hmdC du an e la eplicación
inc emen a los ni eles nuclea es de PAR y de γH2AX, la ines abilidad genómica y la
le alidad celula en ausencia de XRCC1.
4.1.3. XRCC1 man iene la es abilidad de la ho quilla de eplicación
du an e la eliminación de la 5hmdC
Además de su papel du an e la u a BER, se ha desc i o que XRCC1 ac úa jun o con DNA-
PKcs en la es abilización de las ho quillas de eplicación pausadas o bloqueadas po el
a amien o con HU 70. Además, en ausencia de BRCA2, XRCC1 p omue e la deg adación
del ADN nacien e po la nucleasa MRE11 du an e el einicio de la ho quilla de
eplicación68. Po an o, quisimos examina si XRCC1 p esen aba un papel en el
man enimien o de la es abilidad de la ho quilla de eplicación as la inco po ación de la
5hmdC du an e la sín esis de ADN. Pa a ello, lle amos a cabo la écnica de las ib as de
ADN, la cual pe mi e moni o iza la inco po ación de los análogos de la imidina 5-clo o-
2’-desoxiu idina (CldU) y 5-iodo-2’-desoxiu idina (IdU) du an e la sín esis de ADN y
pe mi e el cálculo de la p opo ción IdU/CldU. Pa a es udia el a es o o bloqueo de la
ho quilla de eplicación, la 5hmdC se añadió jun o con la IdU du an e 30 min. En células
sil es es, la adición de 5hmdC no modi icó la p opo ción IdU/CldU (Figu a C1.9 A). Sin
emba go, la exposición a 5hmdC en las células de icien es en XRCC1 disminuyó de o ma
signi ica i a y dosis-dependien e la p opo ción IdU/CldU (Figu a C1.9 A), sugi iendo que
XRCC1 es necesa ia pa a el man enimien o de la es abilidad de la ho quilla de eplicación
as la inco po ación de la 5hmdC du an e la sín esis de ADN.
An e la p esencia de lesiones en la cadena de ADN molde, la ho quilla de eplicación puede
enlen ece su elocidad o incluso de ene se pa a pe mi i que la lesión que ha obs aculizado
su p og esión se esuel a. Como consecuencia, en algunos casos se p oduce la o mación
de la es uc u a de e e sión y nucleasas ales como MRE11 o DNA2, deg adan el ADN
RESULTADOS
97
nacien e de una o ma con olada, pa a p omo e el einicio de la eplicación. Sin emba go,
si no hay un p oceso de epa ación adecuado, las nucleasas pueden deg ada de o ma
descon olada el ADN nacien e, dando luga a ines abilidad genómica 18. Po ello
e aluamos si XRCC1 p o ege al ADN nacien e de la deg adación po las nucleasas as el
a es o o bloqueo de la ho quilla de eplicación p o ocado po la inco po ación e ónea de
la 5hmdC. Pa a el es udio de la deg adación del ADN nacien e, la 5hmdC se añade du an e
3h as la adición secuencial de CldU e IdU y se de e mina la p opo ción IdU/CldU. Como
se obse a en la Figu a C1.9 B, las células de icien es en XRCC1 mos a on una
disminución signi ica i a de la p opo ción IdU/CldU en compa ación con las células
sil es es, sugi iendo que XRCC1 se equie e pa a e i a la deg adación del ADN nacien e
as la inco po ación e ónea de la 5hmdC.
Figu a C1.9. La inco po ación de la 5hmdC al e a la es abilidad de la ho quilla de eplicación en las
células de icien es en XRCC1. A) Panel izquie do, esquema de la écnica de las ib as de ADN pa a el
es udio del a es o/bloqueo de la ho quilla de eplicación, e imágenes ep esen a i as de las ib as de ADN
de células sil es es y de icien es en XRCC1 as el a amien o con 5hmdC a las dosis indicadas du an e
30min. Panel de echo, cuan i icación de la p opo ción IdU/CldU (n=150 de 2 éplicas biológicas
independien es; es es adís ico Mann-Whi ney). B) Panel izquie do, esquema ep esen a i o de la écnica de
las ib as de ADN pa a el es udio de la deg adación del ADN nacien e e imágenes ep esen a i as de las ib as
de ADN de células sil es es y de icien es en XRCC1 as el a amien o con 5hmdC a las dosis indicadas
du an e 3h. Panel de echo, cuan i icación de la p opo ción IdU/CldU (n=150 de 2 éplicas biológicas
independien es; es es adís ico Mann-Whi ney).
4.1.4. El eclu amien o de PARP1 a la c oma ina exace ba el daño en el
ADN mediado po la 5hmdC en ausencia de XRCC1
T as el p ocesamien o de la 5hmdC po las glicosilasas de ADN, el si io AP se p ocesa po
la ac i idad de las endonucleasas APEX1 y APEX2, las cuales gene an un SSB que induce
la ac i ación de PARP1. PARP1 ac úa como senso del SSB y median e la adición de los
políme os de PAR a cie os sus a os, acili a el eclu amien o del complejo de p eligación
XRCC1/POLβ/LIG3α pa a epa a el SSB. Se ha desc i o que XRCC1 es necesa io pa a la
libe ación de PARP1 del SSB gene ado as el a amien o con MMS. En ausencia de
XRCC1, PARP1 pe sis e en el SSB, impidiendo el eclu amien o pos e io del complejo de
p eligación XRCC1/POLβ/LIG3α. Sin emba go, la eliminación de PARP1 sup ime
comple amen e la le alidad mediada po MMS en las células de icien es en XRCC1 45. Po
ello, de e minamos si el p ocesamien o de la 5hmdC po la u a de epa ación BER, inducía
el eclu amien o de PARP1 a la c oma ina. Realizamos un ensayo de e ención en
c oma ina, en el cual se ob ienen an o la acción p o eica soluble como la c oma ínica de
las líneas celula es de in e és, y pos e io men e, los ni eles de PARP1 se de e minan
median e Wes e n Blo . Como con ol de la écnica usamos MMS, el cual p o ocó el
RESULTADOS
98
eclu amien o de PARP1 en c oma ina en ambas líneas celula es (Figu a C1.10 A).
So p enden emen e, la exposición a 5hmdC du an e 3h p o ocó el eclu amien o a la
c oma ina de PARP1 de mane a dosis-dependien e en ambas líneas celula es (Figu a
C1.10 A). Como el eclu amien o se obse ó en ambas líneas celula es, decidimos ealiza
una ciné ica empo al a dosis cons an e de 5hmdC (80µM du an e 15 min, 30 min y 1h).
Obse amos que as 1h de a amien o con 5hmdC, el eclu amien o en c oma ina de
PARP1 e a mayo en las células X cc1-/- que en las células sil es es (Figu a C1.10 B),
sugi iendo que, en ausencia de XRCC1, PARP1 se acumula en c oma ina. Es os esul ados
sugie en que la eliminación de la 5hmdC po la u a de epa ación BER induce el
eclu amien o de PARP1 a la c oma ina, el cual necesi a de XRCC1 pa a su libe ación
pos e io .
Figu a C1.10. La inco po ación de la 5hmdC p o oca el eclu amien o de PARP1 a la c oma ina. A)
Wes e n Blo de los ni eles de PARP1, HISTONA H3 y α-TUBULINA en c oma ina y en la acción soluble
as el a amien o con 5hmdC (20µM y 40µM) du an e 3h en células sil es es y X cc1-/-. Como con ol de
la écnica se usó MMS. B) Wes e n Blo de los ni eles de PARP1, HISTONA H3 y α-TUBULINA en
c oma ina y en la acción soluble as el a amien o con 5hmdC (80µM) du an e 15 min, 30 min y 1h en
células sil es es y X cc1-/-. Como con ol de la écnica se usó MMS.
T as la inco po ación e ónea de la 5hmdC y su eliminación median e la u a BER, PARP1
se acumula en la c oma ina. Po an o, decidimos examina si la pe sis encia de PARP1 en
la c oma ina pod ía se la causa de la ines abilidad genómica obse ada en la línea celula
de icien e en XRCC1 as el a amien o con 5hmdC. Pa a ello, lle amos a cabo un
a amien o combinado de 5hmdC y olapa ib, el cual inhibe la ac i idad enzimá ica de
PARP1 e induce su a apamien o en la c oma ina 78,111. Los ni eles de PARP1 en c oma ina
median e Wes e n Blo indica on que en ausencia de XRCC1, la combinación de 5hmdC y
olapa ib exace bó el eclu amien o de PARP1 a la c oma ina en compa ación con los
a amien os simples de ambos compues os (Figu a C1.11 A). Pa a examina si la
acumulación de PARP1 en c oma ina inducía daño en el ADN, medimos los ni eles de
γH2AX. Usamos dosis bajas de 5hmdC (1.25µM) y olapa ib (7.5nM) pa a e i a la
sa u ación de la señal. En la línea celula sil es e, el a amien o combinado no p o ocó
un inc emen o signi ica i o de los ni eles de γH2AX. Sin emba go, la combinación de
ambos compues os mos ó un e ec o siné gico en la línea celula X cc1-/-, mien as que los
a amien os simples no aumen a on los ni eles de γH2AX de o ma signi ica i a (Figu a
C1.11 B). Es os da os sugie en que el inc emen o de PARP1 a apado en c oma ina po
olapa ib as el daño p o ocado po la 5hmdC, causa ines abilidad genómica en ausencia
de XRCC1.
RESULTADOS
99
Figu a C1.11. El a amien o combinado de 5hmdC y olapa ib exace ba el eclu amien o de PARP1 a
la c oma ina y los ni eles nuclea es de γH2AX. A) Wes e n Blo de los ni eles de PARP1, HISTONA H3
y α-TUBULINA en c oma ina y en la acción soluble, as el a amien o con olapa ib (0.5µM), 5hmdC
(20µM) o 5hmdC combinado con olapa ib du an e 3h. B) Panel izquie do, imágenes ep esen a i as de
inmuno luo escencia de los ni eles nuclea es de γH2AX as el a amien o con olapa ib (7.5nM), 5hmdC
(1.25µM) o 5hmdC combinado con olapa ib du an e 3h, en células sil es es y X cc1-/-. Panel de echo,
cuan i icación de la in ensidad nuclea media de γH2AX po célula (n=150) as el a amien o con olapa ib,
5hmdC o 5hmdC combinado con olapa ib (R=3; es es adís ico Mann-Whi ney; la línea cen al ep esen a el
alo de la mediana).
Pa a in es iga si el inc emen o de PARP1 a apado en c oma ina inducía ines abilidad de
la ho quilla de eplicación en ausencia de XRCC1, lle amos a cabo un ensayo de ib as de
ADN en p esencia de olapa ib (0.5µM) añadido 1h an es de la adición de los nucleó idos
CldU e IdU y del a amien o con 5hmdC. Pa a es e ensayo, usamos una dosis de 5hmdC
(10µM) que no p o oca un a es o signi ica i o de la eplicación po sí sola (Figu a C1.9
A). Obse amos que los a amien os simples de 5hmdC y de olapa ib no p o oca on un
bloqueo de la p og esión de la ho quilla de eplicación, ya que la p opo ción IdU/CldU no
se al e ó de o ma signi ica i a con espec o a la condición sin a amien o (Figu a C1.12
A). Sin emba go, la combinación de 5hmdC y olapa ib p o ocó una ma cada educción de
la p og esión de la ho quilla de eplicación en ausencia de XRCC1, y en meno medida, en
la línea celula sil es e (Figu a C1.12 A). Además, las células de icien es en XRCC1
mos a on un descenso de la iabilidad celula en p esencia del a amien o combinado de
5hmdC con olapa ib (Figu a C1.12 B). Es os esul ados sugie en que la inco po ación
e ónea de la 5hmdC du an e la sín esis de ADN p oduce la e ención excesi a de PARP1
en la c oma ina, la cual equie e de XRCC1 pa a su libe ación y p e eni el inc emen o de
la ines abilidad de la ho quilla de eplicación y la consecuen e mue e celula .
RESULTADOS
100
Figu a C1.12. La combinación de olapa ib y 5hmdC inc emen a la ines abilidad de la ho quilla de
eplicación y la le alidad celula de las células X cc1-/-. A) Panel izquie do, esquema ep esen a i o del
ensayo de ib as de ADN pa a el es udio del a es o/bloqueo de la ho quilla de eplicación, e imágenes
ep esen a i as de las ib as de ADN de las células sil es es y de icien es en XRCC1 as el a amien o con
olapa ib (0.5µM), 5hmdC (10µM) o 5hmdC y olapa ib. Panel de echo, cuan i icación de la p opo ción
IdU/CldU (n=150 de 3 éplicas biológicas independien es; es es adís ico Mann-Whi ney). B) Ensayo de
iabilidad celula MTT de las líneas sil es e y X cc1-/- as el a amien o con olapa ib a las dosis indicadas
o combinado con una dosis ija de 5hmdC (0.3µM) du an e 72h (R=3, media ± s.d.).
4.1.5. El a amien o con 5hmdU ecapi ula los eno ipos de ines abilidad
genómica y de a es o/bloqueo de la ho quilla de eplicación mediados
po 5hmdC en ausencia de XRCC1
Se ha desc i o ecien emen e que la 5hmdC suplemen ada en el medio de cul i o, se
anspo a ac i amen e al ci oplasma celula , en el cual se desamina a 5hmdU po la acción
de la enzima desaminasa de ci osina DCTD, y se inco po a pos e io men e po las
polime asas eplica i as de ADN du an e la eplicación. T as su inco po ación, la 5hmdU
se econoce y escinde po la glicosilasa de ADN de la u a BER SMUG1. SMUG1 gene a
un si io AP, el cual puede se escindido pos e io men e po las endonucleasas APEX1/2, la
cuales gene an un SSB econocido po PARP1. Po an o, es p obable que la 5hmdU
de i ada de la desaminación de la 5hmdC, y no la 5hmdC p opiamen e dicha, pueda se la
uen e de ines abilidad genómica en ausencia de XRCC1, como se ha demos ado
ecien emen e 77. Pa a es udia si la inco po ación de la 5hmdU puede se esponsable de
los eno ipos obse ados en las células X cc1-/- po la exposición a 5hmdC, lle amos a cabo
expe imen os de ines abilidad gené ica y supe i encia como los desc i os en los apa ados
4.1.2, 4.1.3 y 4.1.4 as el a amien o con 5hmdU. Como se obse a en la Figu a C1.13
A, los expe imen os de supe i encia MTT mos a on una mayo le alidad de las células
de icien es en XRCC1 as la exposición a 5hmdU en compa ación con la línea celula
sil es e. Además, el a amien o con 5hmdU inc emen ó de o ma signi ica i a los ni eles
nuclea es an o de PAR como de γH2AX en las células X cc1-/- (Figu a C1.13 B). A la
misma dosis (5µM du an e 3h), an o los ni eles nuclea es de PAR como los de γH2AX
ue on es adís icamen e más ele ados as el a amien o con 5hmdU que con 5hmdC
(Figu a C1.13 B), sugi iendo que la 5hmdU es más ci o óxica que la 5hmdC. Es e
inc emen o en el daño en el ADN as la exposición a 5hmdU, medido como los ni eles
nuclea es de PAR y γH2AX, p o ocó un aumen o signi ica i o en la ecuencia de
abe aciones c omosómicas en ausencia de XRCC1 (Figu a C1.13 C).
RESULTADOS
101
Figu a C1.13. El a amien o con 5hmdU disminuye la iabilidad celula , inc emen a los ni eles
nuclea es de PAR y γH2AX y la ecuencia de abe aciones c omosómicas en las células de icien es en
XRCC1. A) Ensayo de iabilidad MTT de las células sil es es y X cc1-/- as el a amien o con 5hmdU a
las dosis indicadas du an e 72h (R=3, media ± s.d.). B) Panel izquie do, imágenes ep esen a i as de
inmuno luo escencia de los ni eles nuclea es de PAR ( ojo) y γH2AX ( e de) de las células sil es es y
X cc1-/- as el a amien o con 5hmdC o 5hmdU (5µM) du an e 3h. Panel de echo supe io , cuan i icación
de la in ensidad nuclea media de PAR po célula (n=150) as el a amien o con 5hmdC o 5hmdU (R=3; es
es adís ico Mann-Whi ney; la línea cen al ep esen a el alo de la mediana). Panel de echo in e io ,
cuan i icación de la in ensidad nuclea media de γH2AX po célula (n=150) as el a amien o con 5hmdC o
5hmdU (R=3; es es adís ico Mann-Whi ney; la línea cen al ep esen a el alo de la mediana). C) Panel
supe io , imágenes ep esen a i as de me a ases de células sil es es y X cc1-/- pa a la cuan i icación de
abe aciones c omosómicas as el a amien o con 5hmdU (0.3µM du an e 2 ciclos celula es). Panel in e io ,
cuan i icación del núme o de los di e en es ipos de abe aciones c omosómicas po me a ase (n=50 de 2
éplicas biológicas independien es; es es adís ico de S uden ; las ba as ep esen an la media ± s.d.).
Pa a examina si la inco po ación e ónea de la 5hmdU p o ocaba un a es o o bloqueo de
la p og esión de la ho quilla de eplicación, simila al obse ado con el a amien o con
5hmdC, lle amos a cabo el ensayo de ib as de ADN. Es e ensayo mos ó que la exposición
a 5hmdU disminuyó signi ica i amen e y de mane a dosis-dependien e la p opo ción
IdU/CldU en las células X cc1-/-, no llegando a se es adís icamen e signi ica i o en las
células sil es es (Figu a C1.14 A). Además, el ensayo de ib as de ADN de e minó que
el a amien o con 5hmdU p o ocaba la esección excesi a del ADN nacien e en ausencia
de XRCC1 (Figu a C1.14 B). Es os esul ados sugie en que XRCC1 man iene la
es abilidad de la ho quilla de eplicación du an e la inco po ación e ónea de la 5hmdU
du an e la sín esis de ADN, y p e iene su deg adación ex ensi a as el a es o de la
ho quilla de eplicación. Además, apun an a que la inco po ación de la 5hmdU y no de la
5hmdC es la causan e de los eno ipos desc i os has a es e momen o en es a esis doc o al.
RESULTADOS
102
Figu a C1.14. La inco po ación de la 5hmdU impac a en la p og esión de la ho quilla de eplicación e
induce la deg adación nucleolí ica del ADN en las células X cc1-/-. A) Panel izquie do, esquema
ep esen a i o del ensayo de ib as de ADN pa a el es udio del a es o de la ho quilla de eplicación, e
imágenes ep esen a i as de las ib as de ADN de las células sil es es y X cc1-/- expues as a 5hmdU (10µM
y 20µM) du an e 30 min. Panel de echo, cuan i icación de la p opo ción IdU/CldU (n=150 de 3 éplicas
biológicas independien es; es es adís ico Mann-Whi ney). B) Panel izquie do, esquema ep esen a i o del
ensayo de ib as de ADN pa a el es udio de la esección ex ensi a del ADN nacien e, e imágenes
ep esen a i as de las ib as de ADN de las células sil es es y X cc1-/- as la exposición a 5hmdU (10µM y
20µM) du an e 3h. Panel de echo, cuan i icación de la p opo ción IdU/CldU (n=150 de 2 éplicas biológicas
independien es; es es adís ico Mann-Whi ney).
Simila a lo obse ado as el a amien o con 5hmdC, la exposición a 5hmdU ambién
p o ocó el eclu amien o de PARP1 a la c oma ina en ambas líneas celula es, an o de
o ma dosis-dependien e (Figu a C1.15 A) como en ciné ica empo al a dosis cons an e
(Figu a C1.15 B), obse ándose un mayo eclu amien o de PARP1 a la c oma ina en las
células X cc1-/- a los 15 min de a amien o.
Figu a C1.15. El a amien o con 5hmdU p omue e el eclu amien o de PARP1 a la c oma ina. A)
Wes e n Blo de los ni eles de PARP1, HISTONA H3 y α-TUBULINA en c oma ina y en la acción soluble
as el a amien o con 5hmdU (20µM y 40µM) du an e 3h de las líneas celula es sil es e y X cc1-/-. Como
con ol de la écnica se usó MMS. B) Wes e n Blo de los ni eles de PARP1, HISTONA H3 y α-TUBULINA
en c oma ina y en la acción soluble as el a amien o con 5hmdU (40µM) du an e 15 min, 30 min y 1h de
las líneas celula es sil es e y X cc1-/-. Como con ol de la écnica se usó MMS.
En ausencia de XRCC1, la combinación de 5hmdU y olapa ib (1.25µM y 7.5nM
espec i amen e) inc emen ó de o ma signi ica i a los ni eles nuclea es de γH2AX en
compa ación con los a amien os simples (Figu a C1.16 A). Además, el ensayo de ib as
de ADN pa a es udia el a es o o bloqueo de la ho quilla de eplicación mos ó que el
a amien o combinado de olapa ib y 5hmdU p o ocó una disminución signi ica i a de la
p opo ción IdU/CldU en compa ación con los a amien os simples (Figu a C1.16 B), y
signi ica i amen e mayo a la causada po la combinación de 5hmdC y olapa ib (IdU/CldU
5hmdC+olapa ib 0.8795, IdU/CldU 5hmdU+olapa ib 0.7838). Finalmen e, la adición
RESULTADOS
103
conjun a de olapa ib y 5hmdU p o ocó una mayo mo alidad de las células de icien es en
XRCC1 (Figu a C1.16 C).
Figu a C1.16. El a amien o combinado de olapa ib y 5hmdU exace ba los ni eles nuclea es de
γH2AX, la ines abilidad de la ho quilla de eplicación y la le alidad celula de las células X cc1-/-. A)
Panel supe io , imágenes ep esen a i as de inmuno luo escencia de los ni eles nuclea es de γH2AX de las
líneas celula es sil es e y de icien e en XRCC1 as el a amien o con 5hmdC (1.25µM), 5hmdU (1.25µM)
o 5hmdC/5hmdU combinado con olapa ib (7.5nM) du an e 3h. Panel in e io , cuan i icación de la in ensidad
media nuclea de γH2AX po célula (n=150) as el a amien o con olapa ib, 5hmdC, 5hmdU o sus
combinaciones (R=3; es es adís ico Mann-Whi ney; la línea cen al ep esen a el alo de la mediana). B)
Panel izquie do, esquema ep esen a i o del ensayo de ib as de ADN pa a el es udio del a es o/bloqueo de
la ho quilla de eplicación e imágenes ep esen a i as de las ib as de las líneas celula es sil es e y de icien e
en XRCC1 as el a amien o con 5hmdC (10µM), 5hmdU (10µM) o 5hmdC/5hmdU combinado con olapa ib
(0.5µM). Panel de echo, cuan i icación de la p opo ción IdU/CldU (n=150 de 3 éplicas biológicas
independien es; es es adís ico Mann-Whi ney). C) Ensayo de iabilidad celula po MTT de las células
sil es es y X cc1-/- as el a amien o con olapa ib a las dosis indicadas, o combinado con 5hmdU a una
dosis ija (0.3µM) du an e 72h (R=3, media ± s.d.).
Es os esul ados nos pe mi en p opone un modelo de abajo que sugie e que la
inco po ación e ónea de la 5hmdU du an e la sín esis de ADN ac i a a la u a BER, cuya
ac i idad p o oca un aumen o de los ni eles de PARP1 en c oma ina, los cuales en ausencia
de XRCC1, inducen ines abilidad de la ho quilla de eplicación y le alidad celula (Figu a
C1.17).
RESULTADOS
104
Figu a C1.17. Modelo p opues o pa a la unción de XRCC1 du an e la eliminación de la base de ADN
hid oxime ilada 5hmdU. T as la inco po ación e ónea de la 5hmdU du an e la sín esis de ADN, se p oduce
la ac i ación de la u a de epa ación BER pa a su eliminación. T as la acción de la glicosilasa de ADN y la
pos e io incisión de las endonucleasas en el esquele o ibosa- os a o, se p oduce un SSB que puede se
po encialmen e óxico pa a la p og esión de la ho quilla de eplicación. PARP1 se une al SSB y p omue e el
eclu amien o de XRCC1 jun o con POLβ y LIG3α pa a inaliza el p oceso de epa ación. En ausencia de
XRCC1, la pe sis encia de PARP1 en los SSBs gene ados du an e la eliminación de la 5hmdU di icul a la
p og esión de la ho quilla de eplicación, lo que conlle a a ines abilidad genómica.
RESULTADOS
111
Pa a analiza si la exposición a 5hmdC causaba la ac i ación de la DDR en las células
de icien es en FANCD2, de e minamos los ni eles nuclea es de PAR y γH2AX como
ma cado es sub ogados de la p esencia de SSBs y DSBs espec i amen e. A di e encia del
es o de de i ados de la ci osina, el a amien o con 5hmdC (10µM du an e 16h) p odujo
un inc emen o signi ica i o de los ni eles nuclea es de PAR en las células de icien es en
FANCD2 (Figu a C2.5 A), p obablemen e debido a la ac i idad de PARP1 du an e la
epa ación de los SSBs gene ados po la u a BER. Además, la exposición a 5hmdC
inc emen ó de mane a concomi an e la o mación de ocos de γH2AX en las células
Fancd2-/- (Figu a C2.5 B), sugi iendo que la exposición p olongada a 5hmdC puede
gene a SSBs que, en caso de no se epa ados e icien emen e, desencadenan DSBs.
No ablemen e, la exposición a 5 dC inc emen ó de o ma signi ica i a los ni eles de PAR
y la o mación de ocos de γH2AX en la línea celula sil es e, pe o no en la línea celula
de icien e en FANCD2 (Figu a C2.5 A y B), aunque el mecanismo molecula po el cual
la de iciencia en la u a AF sup ime es os ma cado es de daño as la exposición a 5 dC se
desconoce has a la echa.
Figu a C2.5. El a amien o con 5hmdC inc emen a los ni eles nuclea es de PAR y γH2AX en las
células Fancd2-/-. A) Panel izquie do, imágenes ep esen a i as de inmuno luo escencia de los ni eles
nuclea es de PAR en las líneas celula es sil es e y Fancd2-/- as el a amien o con 5hmdC (10µM du an e
16h). Panel de echo, cuan i icación de la in ensidad media po célula (n=200) de PAR as el a amien o con
5dC, 5mdC, 5hmdC, 5 dC o 5cadC (10µM) du an e 16h (R=3; es es adís ico Mann-Whi ney; la línea cen al
ep esen a el alo de la mediana). B) Panel izquie do, imágenes ep esen a i as de inmuno luo escencia de
los ni eles nuclea es de γH2AX en las líneas celula es sil es e y de icien e en FANCD2 as el a amien o
con 5hmdC (10µM du an e 16h). Panel de echo, cuan i icación del núme o de ocos de γH2AX po célula
(n=200) as el a amien o con 5dC, 5mdC, 5hmdC, 5 dC o 5cadC (10µM) du an e 16h (R=3; es es adís ico
de S uden ; la línea cen al ep esen a el alo de la media ± s.d.).
Pa a de e mina de mane a di ec a si el a amien o con 5hmdC p o oca la o mación de
DSBs, lle amos a cabo un ensayo de abe aciones c omosómicas. En la Figu a C2.6 se
puede obse a que la exposición a 5hmdC p oduce un inc emen o signi ica i o de la
ecuencia de abe aciones c omosómicas en la línea celula Fancd2-/-, p incipalmen e
c omosomas adiales, sugi iendo que la exposición a 5hmdC gene a ines abilidad
c omosómica en ausencia de la u a de man enimien o de la es abilidad de la ho quilla de
eplicación FA/BRCA.
RESULTADOS
112
Figu a C2.6. Inc emen o de la ecuencia de abe aciones c omosómicas en las células de icien es en
FANCD2 as la exposición a 5hmdC. Panel izquie do, imágenes ep esen a i as de me a ases de células
sil es es y Fancd2-/- pa a la cuan i icación de abe aciones c omosómicas as el a amien o con 5hmdC
(10µM du an e 2 ciclos celula es). Panel de echo, cuan i icación del núme o de los di e en es ipos de
abe aciones c omosómicas po me a ase (n=50 de 2 éplicas biológicas independien es; es es adís ico de
S uden ; las ba as ep esen an la media ± s.d.).
La p esencia de daño en el ADN ac i a el pun o de con ol del ciclo celula , ca ac e izado
po la ac i ación de la quinasa ATR, la cual os o ila dis in os sus a os pa a bloquea la
p ogesión del ciclo celula . An e la p esencia de un impedimen o que al e e la p og esión
de la ho quilla de eplicación, la quinasa ATR os o ila a CHK1 en la se ina 345, la cual se
ac i a y p omue e la os o ilación de o os ac o es, conduciendo a un enlen ecimien o del
ciclo celula pa a pe mi i la epa ación del daño p esen e en el ADN 16.
Pa a dilucida si la exposición a 5hmdC p o ocaba la ac i ación del pun o de con ol de
ase S, lle amos a cabo un ensayo de ciclo celula . El a amien o con 5dC, 5mdC o 5hmdC
a la dosis de 10µM du an e 16h, no p o ocó ningún cambio signi ica i o en el pe il de
ciclo celula ni en las células sil es es ni Fancd2-/- (Figu a C2.7 A). Sin emba go, cuando
modi icamos el iempo de los a amien os a 1h, 4h, 8h y 12h, obse amos un inc emen o
del po cen aje de células en ase S a las 4h, que se sup ime en los siguien es iempos de
medición (8h y 12h) (Figu a C2.7 B). Es o sugie e que una exposición co a a nucleósidos
de i ados de la ci idina al e a momen áneamen e la p og esión del ciclo celula , que se
esca a a lo la go del iempo de exposición a los mismos. Pa a de e mina si la
inco po ación de 5hmdC p o ocaba daño en el ADN su icien e como pa a ac i a el pun o
de con ol de ase S, ealizamos un a amien o agudo de 30 min con una dosis más ele ada
(100µM) y analizamos el pe il de ciclo celula 48h después del a amien o.
So p enden emen e y a di e encia de lo que ocu e con 5dC y 5mdC, la exposición a 5hmdC
p odujo un a es o del ciclo celula en la ase G2/M en las células Fancd2-/-, el cual no se
obse a en células sil es es (Figu a C2.7 C), sugi iendo que la exposición a 5hmdC
p o oca daño en el ADN y ac i ación del pun o de con ol de ase S, el cual de iene el ciclo
en ase G2 e impide la en ada en mi osis. Ya que la ac i ación del pun o de con ol de ase
S ac i a a ATR, la cual os o ila a CHK1, decidimos de e mina los ni eles de os o ilación
en la se ina 345 de CHK1 (se 345-CHK1) como ma cado sub ogado de la ac i ación del
pun o de con ol de ase S. Obse amos que el a amien o con 5hmdC (10µM) du an e 16h
inc emen ó la señal se 345-CHK1 (Figu a C2.7 D). A di e encia de lo que obse amos
median e el análisis del pe il de ciclo celula , una exposición p olongada a 5hmdC induce
la os o ilación de CHK1, indicando una ac i ación del pun o de con ol de ase S. Sin
emba go, no se obse an cambios en el pe il del ciclo celula . Es e inc emen o en la
os o ilación de se 345-CHK1 ue concomi an e con un inc emen o en los ni eles de
RESULTADOS
113
γH2AX (Figu a C2.7 D), lo que sugie e la o mación de DSBs du an e la ase S en
condiciones de es és eplica i o.
Pa a examina si el a es o en ase G2/M po el a amien o agudo con 5hmdC en las células
Fancd2-/- depende de CHK1, u ilizamos los inhibido es de CHK1 AZD-7762 o UCN-01
combinados con 5hmdC. Obse amos un esca e del a es o en ase G2/M en las células
de icien es en FANCD2 (Figu a C2.7 E), indicando que el a es o del ciclo celula en ase
G2/M es dependien e de la ac i ación de CHK1.
La exposición a 5hmdC ambién p o ocó la ubiqui inación de FANCD2 en la línea celula
sil es e eHAP de una o ma dosis dependien e (Figu a C2.7 F), indicando la ac i ación
de la u a AF as el a amien o con 5hmdC.
Figu a C2.7. A es o del ciclo celula en la ase G2/M y ac i ación del pun o de con ol de ase S as
la exposición a 5hmdC. A) Po cen aje de células sil es es y Fancd2-/- en ase G1, S y G2 as la exposición
a 5dC, 5mdC o 5hmdC (10µM) du an e 16h (R=3; es es adís ico de S uden ; las ba as ep esen an la media
RESULTADOS
114
± s.d.). B) Po cen aje de células sil es es y Fancd2-/- en ase G1, S y G2 as la exposición a 5dC, 5mdC o
5hmdC (10µM) du an e 1h, 4h, 8h o 12h (R=4; es es adís ico de S uden ; las ba as ep esen an la media
± s.d.). U1 y U12 indican los pun os de con ol sin a amien o as 1h o 12h. C) Po cen aje de células
sil es es y Fancd2-/- en ase G1, S y G2 as la exposición a 5dC, 5mdC o 5hmdC (100µM) du an e 30 min
y analizado as 48h en cul i o (R=3; es es adís ico de S uden ; las ba as ep esen an la media ± s.d.). D)
Wes e n Blo de ex ac os ob enidos de las líneas celula es sil es e y Fancd2-/- pa a de ec a γH2AX, se 345-
CHK1, CHK1 y PCNA as la exposición a 5dC, 5mdC, 5hmdC, 5 dC y 5cadC (10µM) du an e 16h. E)
Po cen aje de células sil es es y Fancd2-/- en ase G1, S y G2 as la exposición a 5hmdC (100µM) du an e
30 min, en combinación con AZD-7762 (10nM) o UCN-01 (10nM), y analizado as 48h en cul i o.
AZD7762 o UCN-01 se añadie on du an e las úl imas 24h (R=3; es es adís ico de S uden ; las ba as
ep esen an la media ± s.d.). F) Wes e n Blo de ex ac os p o eicos de la línea celula eHAP sil es e pa a
de ec a los ni eles de FANCD2 monoubiqui inado (FANCD2-Ub) as la exposición a 5hmdC (20µM y
40µM du an e 16h). PCNA se usó como con ol de ca ga y el a amien o con cispla ino se usó como con ol
de la écnica.
T as la ob ención de es os esul ados, podemos p opone que la 5hmdC se inco po a po
las células y ac i a las u as BER y AF. En ausencia de la u a AF, se desencadena la
espues a clásica al daño en el ADN que p o oca un inc emen o de SSBs y DSBs, dando
luga a la ines abilidad c omosómica y a la le alidad celula . Todos es os esul ados indican
que la u a AF p esen a un papel en el man enimien o de la in eg idad del genoma y en la
supe i encia du an e la epa ación del daño p o ocado po la exposición a 5hmdC.
4.2.2. La 5hmdC se desamina a 5hmdU in i o y se inco po a du an e la
eplicación del ADN
La 5hmdC es un nucleósido de i ado de la ci idina que p esen a un g upo hid oxime ilo en
el ca bono 5 de la base pi imidínica. Se ha desc i o que las bases que p esen an pequeñas
modi icaciones no dis o sionan es de la doble hélice son capaces de inco po a se al ADN
nacien e po las polime asas eplica i as. Po an o, quisimos es udia si as la
suplemen ación de la 5hmdC al medio de cul i o, es a se inco po aba du an e la sín esis de
ADN. Pa a ello, en colabo ación con el D . Saulius Klimašauskas (Uni e sidad de Vilnius,
Li uania), se lle ó una de e minación cuan i a i a de las di e en es bases modi icadas
p esen es en el ADN genómico median e HPLC. Los esul ados desc i os en Peña-Gómez
MJ e al, 2022 116 y en la esis de la D . Paula Mo eno Go dillo, mues an que la 5hmdC
suplemen ada al medio de cul i o se inco po a al ADN genómico du an e la eplicación
celula . Es os es udios ambién mos a on una acumulación de 5hmdU-D3 en el ADN
genómico de las células sil es es y Fancd2-/-, supe io a la acumulación de la 5hmdC,
sugi iendo que la 5hmdC es desaminada in i o a 5hmdU 116.
Pa a de e mina si los eno ipos obse ados en la línea celula Fancd2-/- as el a amien o
con 5hmdC se deben a la inco po ación e ónea de la 5hmdU du an e la eplicación,
lle amos a cabo la depleción de algunos de los genes esponsables de la u a ci oplásmica
de desaminación de la 5hmdC (Figu a C2.8 A). Median e la écnica de siRNA,
deplecionamos el p oduc o del gen Dc d, que codi ica la desaminasa de ci osina que lle a
a cabo la desaminación de la 5hmdC mono os a o a la 5hmdU mono os a o en el pool de
nucleó idos 77. En p ime luga , alidamos la al a de exp esión p o eica median e Wes e n
Blo (Figu a C2.8 B). A con inuación, examinamos la sensibilidad a 5hmdC as la pé dida
de DCTD en ambas líneas celula es y obse amos que la depleción de DCTD sup imió
signi ica i amen e la le alidad p o ocada po la 5hmdC en las células Fancd2-/- (Figu a
C2.8 C), sugi iendo que la le alidad celula obse ada as la exposición a 5hmdC es
mediada po la inco po ación de la 5hmdU.
RESULTADOS
115
Figu a C2.8. La depleción de DCTD esca a la iabilidad celula as la exposición a 5hmdC en las
células Fancd2-/-. A) Esquema ep esen a i o de la u a de desaminación de la 5hmdC a 5hmdU en el
ci oplasma. B) Wes e n Blo de ex ac os p o eicos de células sil es es y de icien es en FANCD2 pa a la
de ección de los ni eles de DCTD as su depleción median e siRNA. C) Ensayo de iabilidad celula
median e MTT de las líneas celula es sil es e y Fancd2-/- as la depleción de DCTD, a adas con 5hmdC a
las dosis indicadas du an e 72h (R=3, media ± s.d.).
Adicionalmen e, lle amos a cabo la depleción del p oduc o génico Dck, enzima quinasa
esponsable de la con e sión de 5hmdC a 5hmdC mono os a o 77. Como se obse a en la
Figu a C2.9 C, la pé dida de DCK (Figu a C2.9 B) ambién sup imió comple amen e la
le alidad p o ocada po la exposición a 5hmdC en la línea celula Fancd2-/-.
Figu a C2.9. La depleción de DCK esca a la iabilidad celula as la exposición a 5hmdC en las
células Fancd2-/-. A) Esquema ep esen a i o de la u a de desaminación de la 5hmdC a 5hmdU en el
ci oplasma. B) Wes e n Blo de ex ac os p o eicos de células sil es es y de icien es en FANCD2 pa a la
de ección de los ni eles de DCK as su depleción median e siRNA. C) Ensayo de iabilidad celula median e
MTT de las líneas celula es sil es e y Fancd2-/- as la depleción de DCK, a adas con 5hmdC a las dosis
indicadas du an e 72h (R=3, media ± s.d.).
Es os esul ados demues an que la le alidad obse ada en las células Fancd2-/- po el
a amien o con 5hmdC, y p obablemen e los eno ipos de ines abilidad genómica, se deben
a la inco po ación e ónea de la 5hmdU du an e la sín esis de ADN. La 5hmdC es una
RESULTADOS
116
molécula más es able que la 5hmdU, y se han ob enido esul ados más ep oducibles as
la exposición a 5hmdC que as la exposición a 5hmdU. Po ello, odos los esul ados que
se mues an a con inuación en es a esis doc o al, se han lle ado a cabo as la exposición
a 5hmdC, eniendo en cuen a que los eno ipos que se obse an son debidos a la
inco po ación e ónea de la 5hmdU du an e la eplicación.
4.2.3. La inco po ación de la 5hmdU p o oca daño en el ADN asociado a
la ase S del ciclo celula y bloquea la p og esión de la ho quilla de
eplicación
La 5hmdU de i ada de la desaminación de la 5hmdC se inco po a en el ADN genómico
du an e la eplicación 77,116. Pa a examina si el daño en el ADN causado po el a amien o
con 5hmdC en las células de icien es en FANCD2 se asocia a la ase S del ciclo celula ,
de e minamos el daño en el ADN especí icamen e en las células en ase S. Pa a ello, las
células en ase S se ma ca on median e la adición del análogo de la imidina EdU, el cual
no es geno óxico, y de e minamos los ni eles nuclea es de PAR. En la Figu a C2.10 A se
obse a que el a amien o de las células de icien es en FANCD2 con 5hmdC (10µM
du an e 16h) inc emen ó los ni eles nuclea es de PAR de o ma signi ica i a
p incipalmen e en las células en ase S (72% de células PAR+ con espec o al o al de
células EdU+), y en un 27% de células sil es es PAR+ con espec o al o al de células
EdU+, sugi iendo que el daño mediado po la 5hmdU se asocia a la ase S del ciclo celula ,
du an e su inco po ación.
Pa a ce cio a nos que el daño inducido po la inco po ación e ónea de la 5hmdU ocu e
en el ADN nacien e del ciclo celula en cu so, y no en ciclos pos e io es, decidimos aco a
los iempos de a amien o. Po ello, ealizamos el a amien o con 5hmdC (10µM) du an e
3h y de e minamos los ni eles nuclea es de PAR median e inmuno luo escencia. El
a amien o con 5hmdC du an e 3h ambién inc emen ó los ni eles nuclea es de PAR de
o ma signi ica i a en las células Fancd2-/- en ase S (62% de células PAR+ con espec o al
o al de células EdU+) (Figu a C2.10 B), lo que sugie e que el daño mediado po la 5hmdU
se asocia a su inco po ación e ónea en la heb a de ADN nacien e en el ciclo celula ac ual.
Figu a C2.10. La inco po ación de la 5hmdU inc emen a los ni eles nuclea es de PAR p incipalmen e
en las células en ase S. A) Panel izquie do, imágenes ep esen a i as de inmuno luo escencia de los ni eles
nuclea es de PAR ( ojo) y las células en ase S (EdU+; e de) de las líneas celula es sil es e y Fancd2-/- as
el a amien o con 5hmdC (10µM) du an e 16h. Panel de echo, po cen aje de células PAR+ con espec o al
o al de células EdU+ (n=200) as el a amien o con 5hmdC du an e 16h (R=3; es es adís ico One-way
ANOVA; las ba as ep esen an la media ± s.d.). B) Po cen aje de células PAR+ con espec o al o al de
RESULTADOS
117
células EdU+ (n=200) as el a amien o con 5hmdC (10µM) du an e 3h (R=3; es es adís ico One-way
ANOVA; las ba as ep esen an la media ± s.d.).
Pa a de e mina si la inco po ación e ónea de la 5hmdU du an e la eplicación p o oca
daño en las ho quillas de eplicación, lle amos a cabo la écnica iPOND (del inglés
isola ion o P o eins On Nascen DNA), la cual pe mi e examina el eclu amien o de
p o eínas, como γH2AX, o modi icaciones pos - aduccionales de p o eínas asociadas al
ADN ecién sin e izado 108,117. El ADN ecién sin e izado se ma ca con EdU y
pos e io men e, se ealiza el a amien o con el agen e que induce es és eplica i o. A
con inuación, se p ecipi a el ADN nacien e y se analizan aquellas p o eínas que
in e accionan con él as el daño. Como con ol de la écnica se usó HU, un agen e que
inhibe la enzima ibonucleó ido educ asa, causando la depleción del pool de dNTPs y po
an o el bloqueo de la ho quilla de eplicación. T as el a amien o con HU se puede
obse a que la p ecipi ación del ADN nacien e con eniendo EdU co-p ecipi aba γH2AX
en ambas líneas celula es, indicando que γH2AX se asocia a la ho quilla de eplicación
(Figu a C2.11). So p enden emen e, as el a amien o con 5hmdC (160µM du an e 3h),
la co-p ecipi ación de EdU jun o con γH2AX se en iqueció p incipalmen e en la línea
celula Fancd2-/- en compa ación con la línea celula sil es e (Figu a C2.11). Es e
esul ado sugie e que los DSBs inducidos po el a amien o con 5hmdC en las células
de icien es en FANCD2 se asocia ían a las ho quillas de eplicación que se encuen an
bloqueadas.
Figu a C2.11. El a amien o con 5hmdC induce la co-p ecipi ación de EdU (ADN nacien e) jun o con
γH2AX en las células de icien es en FANCD2. Wes e n Blo de los ex ac os p o eicos de la mues a o al
(2.25%) y de la co-p ecipi ación de las líneas celula es sil es e y Fancd2-/- as el a amien o con 5hmdC
(160µM) o HU (1mM) du an e 3h, pa a de ec a los ni eles de γH2AX, PCNA y RAD51.
La écnica iPOND pe mi e de ec a la in e acción de p o eínas con el ADN ecién
sin e izado, pe o el esul ado ob enido es el p omedio de miles de ho quillas de eplicación
y de células. Pa a pode ealiza un análisis más exhaus i o a ni el de una única célula y
ob ene más in o mación, como el es ado del ciclo celula (de ec a las células en ase S),
ealizamos el ensayo de de ección de la in e acción de p o eínas in si u con el ADN nacien e
en las ho quillas de eplicación (SIRF; del inglés in si u P o ein In e ac ion wi h Nascen
DNA Replica ion Fo ks) 107. Es e ensayo iden i ica ac o es que se localizan p óximos a la
ho quilla de eplicación, especí icamen e a una dis ancia de < 40nm del ADN ecién
sin e izado, que es e ique ado median e la adición del análogo de la imidina EdU. En
nues o caso, de ec amos los ni eles de PAR asociados a la ho quilla de eplicación
median e la cuan i icación de ocos EdU-PAR. En la Figu a C2.12 se obse a que el
a amien o con 5hmdC (10µM o 40µM) du an e 3h p o ocó un aumen o signi ica i o
dosis-dependien e del núme o de ocos EdU-PAR en la línea celula Fancd2-/-, mien as
que en la línea celula sil es e solo la dosis de 40µM indujo un inc emen o
RESULTADOS
118
es adís icamen e signi ica i o. Ya que los ni eles nuclea es de PAR son un ma cado
sub ogado de la p esencia de SSBs, es os esul ados sugie en que la 5hmdU gene a SSBs
inmedia amen e as se inco po ada du an e la eplicación, a ec ando a la p og esión de la
ho quilla de eplicación.
Figu a C2.12. La exposición a 5hmdC inc emen a el núme o de ocos EdU-PAR en las células
Fancd2-/-. A) Imágenes ep esen a i as de los ocos EdU-PAR ( ojo) y las células en ase S (EdU+; e de) de
las células sil es es y Fancd2-/- as el a amien o con 5hmdC (10µM o 40µM) du an e 3h. B) Cuan i icación
del núme o de ocos EdU-PAR po célula EdU+ (n=200) as el a amien o con 5hmdC du an e 3h (R=3, es
es adís ico One-way ANOVA; la línea cen al ep esen a la media ± s.d.).
Pa a de e mina de o ma di ec a si la exposición a 5hmdC induce la o mación de SSBs,
lle amos a cabo un ensayo de come as en condiciones alcalinas. La unidad de medida que
usamos es el momen o de la cola del come a, que es el p oduc o del amaño de la cola del
come a y la acción del o al de ADN en la cola del come a (momen o de la cola = longi ud
de la cola del come a x po cen aje de ADN p esen e en la cola del come a). Como con ol
posi i o de la écnica se usó MMS (0.5mM du an e 30 min), el cual indujo una acumulación
signi ica i a de SSBs an o en las células sil es es como de icien es en FANCD2 (Figu a
C2.13 B). T as la exposición a 5hmdC (10µM du an e 3h), se obse ó un inc emen o de
SSBs es adís icamen e signi ica i o en la línea celula Fancd2-/-, mien as que la línea
celula sil es e no se io al e ada (Figu a C2.13), sugi iendo que la inco po ación e ónea
de la 5hmdU en las cadenas de ADN nacien e du an e la eplicación p oduce SSBs,
posiblemen e debido a su p ocesamien o po la u a BER.
RESULTADOS
119
Figu a C2.13. El a amien o con 5hmdC inc emen a la ecuencia de SSBs en las células Fancd2-/-. A)
Imágenes ep esen a i as del ensayo de come as en condiciones alcalinas de las líneas celula es sil es e y
Fancd2-/- as el a amien o con 5hmdC (10µM) du an e 3h. B) Cuan i icación del momen o de la cola po
célula (n=300) as el a amien o con MMS (0.5mM du an e 30min) o 5hmdC (10µM du an e 3h) (R=4; es
es adís ico One-way ANOVA; la línea cen al ep esen a la media ± s.d.).
Ya que la inco po ación e ónea de la 5hmdU du an e la eplicación induce un inc emen o
de los ni eles nuclea es de PAR asociados a la ho quilla de eplicación, p incipalmen e en
las células que es án en ase S, lle amos a cabo la écnica de las ib as de ADN, que pe mi e
medi la p og esión de las ho quillas de eplicación. Median e la suplemen ación secuencial
de los análogos de la imidina CldU e IdU, podemos moni o iza la p og esión de la
ho quilla de eplicación median e ma caje inmuno luo escen e di e encial. Como con ol
de la écnica, u ilizamos HU, la cual p o oca un bloqueo de la p og esión de la ho quilla
de eplicación po la depleción del pool de dNTPs 56. Como se obse a en la Figu a C2.14
A, el a amien o con HU p o ocó un aco amien o del amo ma cado con IdU y, po an o,
disminuyó la p opo ción IdU/CldU, indicando un bloqueo de la p og esión de la ho quilla
de eplicación y alida la op imización de la écnica. A con inuación, medimos la dinámica
de las ho quillas de eplicación as el a amien o con 5hmdC (40µM du an e 30 min).
Como se obse a en la Figu a C2.14 A, el a amien o con 5hmdC p o ocó una
disminución es adís icamen e signi ica i a de la p opo ción IdU/CldU en las células
de icien es en FANCD2, mien as que la adición de 5hmdC en las células sil es es no
a ec ó a la p opo ción IdU/CldU. Es e esul ado sugie e que la inco po ación e ónea de la
5hmdU en las cadenas de ADN nacien e al e a la p og esión de la ho quilla de eplicación
en ausencia del ac o de la u a AF FANCD2.
Además, de e minamos el índice de asime ía median e la medición de la p opo ción de los
dos amos ma cados con el análogo IdU en las ib as bidi eccionales. La sime ía de la
ho quilla de eplicación pe mi e moni o iza la p og esión sinc onizada de dos ho quillas
de eplicación que inician la sín esis desde un mismo o igen de eplicación en di ecciones
opues as. Es a sime ía de las ho quillas de eplicación se de ec a median e la cuan i icación
RESULTADOS
120
de los dos amos ma cados con el análogo de idimina IdU de las ib as bidi eccionales. Si
una de las ho quillas su e un enlen ecimien o de la p og esión o un bloqueo, el amo
ma cado con el análogo IdU se á más co o y la p opo ción en e ambos se á mayo de 1,
indicando asime ía. Obse amos que la línea celula Fancd2-/- as el a amien o con
5hmdC p esen ó un índice de asime ía signi ica i amen e mayo con espec o a la línea
celula sil es e (Figu a C2.14 B), indicando que el de ec o en la p og esión de la ho quilla
de eplicación se debe a la p esencia de una lesión ísica en algunas egiones del ADN y no
a un enlen ecimien o global de la eplicación.
Figu a C2.14. La inco po ación de la 5hmdU al e a la p og esión de la ho quilla de eplicación e
inc eme a el índice de asime ía en las células Fancd2-/-. A) Panel supe io , imágenes ep esen a i as de
las ib as de las células de icien es en FANCD2 as el a amien o con HU (0.5mM) o 5hmdC (40µM)
du an e 30 min. Panel in e io , cuan i icación de la p opo ción IdU/CldU (n=200 de 4 éplicas biológicas
independien es; es es adís ico One-way ANOVA). B) Panel supe io , esquema ep esen a i o del o igen de
asime ía de la ho quilla de eplicación e imágenes ep esen a i as de ib as asimé icas de las células
de icien es en FANCD2 as el a amien o con 5hmdC (40µM) du an e 30 min. Panel in e io , cuan i icación
del índice de asime ía ( es es adís ico One-way ANOVA).
La exposición a 5hmdC p odujo un inc emen o en el índice de asime ía de las ib as
bidi eccionales de las células Fancd2-/-, lo que sugie e que la inco po ación de la 5hmdU
no p o oca un enlen ecimien o global de la eplicación pa a inicia la epa ación del daño.
Pa a de e mina si el a amien o con 5hmdC a iempos co os p oduce la ac i ación del
pun o de con ol de ase S, examinamos la os o ilación en la se ina 345 de CHK1 (se 345-
CHK1) y en la se ina 33 de RPA (se 33-RPA32) median e Wes e n Blo . A di e encia de
lo que ocu e con el a amien o p olongado de 5hmdC du an e 16h (Figu a C2.7 D), el
a amien o con 5hmdC du an e 3h no induce la os o ilación de CHK1 en la se ina 345 ni
RESULTADOS
127
median e la u a de epa ación BER, PARP1 se eclu a de o ma pe sis en e a la c oma ina,
impidiendo la epa ación de los SSBs y como consecuencia, inc emen a la o mación de
DSBs y de abe aciones c omosómicas.
Figu a C2.20. La combinación de olapa ib con la 5hmdC exace ba el inc emen o del núme o de ocos
de γH2AX y la ecuencia de abe aciones c omosómicas obse adas en las células Fancd2-/-. A)
Cuan i icación del núme o de ocos po célula (n=200) de γH2AX as el a amien o con 5hmdC (2µM),
olapa ib (7.5nM) o combinados du an e 16h (R=2; es es adís ico Mann-Whi ney; la línea cen al ep esen a
la media ± s.d.). B) Panel izquie do, imágenes ep esen a i as de me a ases de células sil es es y Fancd2-/-
pa a la cuan i icación de abe aciones c omosómicas as el a amien o con 5hmdC (2µM), olapa ib (7.5nM)
o combinados du an e 2 ciclos celula es. Panel de echo, cuan i icación del núme o de los di e en es ipos de
abe aciones c omosómicas po me a ase as el a amien o con 5hmdC, olapa ib o combinados (n=50 de 2
éplicas biológicas independien es; es es adís ico de S uden ; las ba as ep esen an la media ± s.d.).
La pe sis encia de PARP1 unido a c oma ina po el uso de olapa ib exace bó la le alidad
celula obse ada en las células de icien es en FANCD2 as la exposición a 5hmdC. Tan o
la combinación de una dosis ija de olapa ib con dosis c ecien es de 5hmdC (Figu a C2.21
A), como la combinación de una dosis ija de 5hmdC jun o con dosis c ecien es de olapa ib
(Figu a C2.21 B), inc emen ó de o ma sine gís ica la le alidad celula en las células
Fancd2-/- sin ene ningún impac o en la iabilidad celula de las células sil es es.
Figu a C2.21. El a amien o combinado de olapa ib y 5hmdC inc emen a de o ma sine gís ica la
le alidad celula obse ada en las células Fancd2-/-. A) Ensayo de iabilidad celula median e MTT de las
líneas celula es sil es e y Fancd2-/- as el a amien o simple con 5hmdC a las dosis indicadas o combinado
con una dosis ija de olapa ib (15nM) du an e 72h (R=4, media ± s.d.). B) Ensayo de iabilidad celula
median e MTT de las líneas celula es sil es e y Fancd2-/- as el a amien o simple con olapa ib a las dosis
indicadas o combinado con una dosis ija de 5hmdC (1.25µM) du an e 72h (R=4, media ± s.d.).
RESULTADOS
128
Es os esul ados sugie en que la inco po ación e ónea de la 5hmdU du an e la ase S
p oduce SSBs, los cuales p o ocan la e ención excesi a de PARP1 en la c oma ina,
esul ando en la acumulación de de ec os en la ho quilla de eplicación y abe aciones
c omosómicas que conducen a la mue e celula en ausencia de FANCD2.
4.2.6. La inco po ación e ónea de la 5hmdU du an e la sín esis de ADN
induce la ac i ación de la u a de epa ación HR
Du an e las lesiones en el ADN que pe judican la in eg idad de la ho quilla de eplicación,
se ha desc i o que la u a de epa ación AF man iene y es ablece la unción del eplisoma
a a és de un mecanismo de escisión acoplado a la eplicación que desencadena SCEs. Se
ha desc i o que en ausencia de FANCC, la exposición a 1-óxido de 4-ni oquinolina
(4NQO), agen e que p oduce aduc os en el ADN, induce la o mación de SCEs, mien as
que la exposición a agen es que gene an ICLs (MMC o cispla ino) no 122,123. Ya que la
5hmdU es una base modi icada que se inco po a du an e la sín esis de ADN causando el
bloqueo de la ho quilla de eplicación en ausencia de FANCD2, quisimos dilucida si se
p oducían e en os de ecombinación en espues a a la inco po ación de la 5hmdU. Pa a
ello, lle amos a cabo el ensayo de SCEs, en el cual se ealiza la inción di e encial de una
de las c omá idas he manas a a és de la adición du an e dos ciclos celula es de B dU, lo
que pe mi e con abiliza los e en os de ecombinación homóloga que ocu en. Como se
obse a en la Figu a C2.22 A, la exposición a 5hmdC inc emen ó de o ma signi ica i a
la ecuencia de SCEs en las células de icien es en FANCD2, mien as que en la línea
celula sil es e no se inducen SCEs. Es os da os sugie en que la línea celula Fancd2-/- es
capaz de ac i a la u a HR asociada a la ho quilla de eplicación as la inco po ación
e ónea de la 5hmdU du an e la sín esis de ADN.
Como se ha obse ado en las Figu as C2.19 y C2.21, la pe sis encia de PARP1 en la
c oma ina exace bó la ines abilidad de la ho quilla de eplicación y la mue e celula en
ausencia de FANCD2. Po ello quisimos es udia si la e ención excesi a de PARP1 en la
c oma ina median e el uso de olapa ib, exace baba la ecuencia de SCEs mediados po la
inco po ación e ónea de la 5hmdU. Como se obse a en la Figu a C2.22 B, el a amien o
simple con olapa ib no p o ocó un inc emen o de SCEs en ninguna de las líneas celula es.
Sin emba go, la ecuencia de SCEs inc emen ó de o ma signi ica i a as la exposición
combinada de 5hmdC y olapa ib en la línea celula Fancd2-/-, y en meno medida en la línea
celula sil es e.
RESULTADOS
129
Figu a C2.22. La exposición a 5hmdC inc emen a la ecuencia de SCEs, la cual se exace ba as el
a amien o combinado con olapa ib. A) Panel izquie do, imágenes ep esen a i as de me a ases de células
sil es es y Fancd2-/- pa a la cuan i icación de SCEs as el a amien o con 5hmdC (2µM du an e 2 ciclos
celula es). Panel de echo, cuan i icación de la ecuencia de SCEs po c omosoma (n=200) as el a amien o
con 5hmdC (R=2; es es adís ico Mann-Whi ney; la línea cen al ep esen a el alo de la media ± s.e.m.).
B) Panel supe io , imágenes ep esen a i as de me a ases de células sil es es y Fancd2-/- pa a la
cuan i icación de SCEs as el a amien o con 5hmdC (2µM), olapa ib (7.5nM) o 5hmdC+olapa ib du an e
2 ciclos celula es. Panel in e io , cuan i icación de la ecuencia de SCEs po c omosoma (n=200) as el
a amien o con 5hmdC, olapa ib o 5hmdC+olapa ib (R=2; es es adís ico Mann-Whi ney; la línea cen al
ep esen a el alo de la media ± s.e.m).
Es os da os sugie en que FANCD2, la u a HR y PARP1 uncionan de o ma independien e
pa a man ene la es abilidad de la ho quilla de eplicación as la inco po ación de la
5hmdU du an e la eplicación, e i ando el colapso del eplisoma y el inc emen o de la
ines abilidad genómica.
4.3. CAPÍTULO 3: Ines abilidad de la
ho quilla de eplicación inducida po los
in e media ios de la u a de epa ación
BER en ausencia de FANCD2
RESULTADOS
133
4.3.1. Los huecos de ssDNA que su gen po las ac i idades coo dinadas
de SMUG1 y APEX1/2 du an e la eliminación de la 5hmdU del ADN
nacien e son esponsables de los eno ipos de ines abilidad de la ho quilla
de eplicación
La inco po ación e ónea de bases modi icadas du an e la sín esis de ADN, como guaninas
oxidadas, análogos de la imina o de i ados de la desaminación de la ci osina, son las
lesiones más comunes que ocu en de o ma espon ánea en el ADN 124. La p incipal u a
enca gada de elimina del ADN es as bases modi icadas es la u a BER.
Como se ha desc i o an e io men e en es a esis doc o al, la 5hmdU se inco po a de o ma
e ónea du an e la sín esis de ADN, inc emen ando la ecuencia de huecos de ssDNA o
SSBs (Figu a C2.12 y C2.13), así como la ecuencia de abe aciones c omosómicas
(Figu a C2.6), que a ec an a la p og esión de la ho quilla de eplicación (Figu a C2.14) y
a la iabilidad celula (Figu a C2.1) de las células de icien es en FANCD2. Es a
inco po ación e ónea de la 5hmdU ac i a la acción coo dinada de las u as BER y AF.
T as la inco po ación de la 5hmdU, la glicosilasa de ADN SMUG1 econoce la base y la
escinde gene ando un si io AP, el cual es p ocesado po las endonucleasas APEX1/2
gene ando un SSB. PARP1 se eclu a al SSB, se ac i a y p omue e el eclu amien o del
complejo de p eligación XRCC1/POLβ/LIG3α pa a la e icien e adición de la nue a base y
la ligación de los ex emos del co e en el esquele o ibosa- os a o (Figu a C3.1).
Figu a C3.1. Ac i idad de la u a de epa ación BER asociada a la ho quilla de eplicación. Esquema
simpli icado de la u a de epa ación BER du an e la eliminación de la 5hmdU en la ho quilla de eplicación
as su inco po ación e ónea du an e la sín esis de ADN.
Du an e la eliminación de las bases modi icadas inco po adas du an e la eplicación, los
in e media ios de epa ación gene ados po la u a BER, como los si ios AP o los SSBs,
pod ían pe sis i , pe u bando la maquina ia de eplicación que es á en acción, causando
es és eplica i o. Recien es publicaciones han desc i o que la le alidad obse ada en las
líneas celula es de icien es en la u a de epa ación HR as el a amien o con PARPi es
debida a la acumulación de huecos de ssDNA de ás de la ho quilla de eplicación 13.
Quisimos dilucida si la ac i idad de BER asociada a la ho quilla de eplicación as la
RESULTADOS
134
inco po ación de la 5hmdU du an e la sín esis de ADN pod ía se la esponsable de la
o mación de huecos de ssDNA en la cadena nacien e y consecuen emen e, se la causa de
la le alidad de las células de icien es en FANCD2. Pa a lle a a cabo es a ap oximación,
decidimos depleciona gené icamen e los di e en es ac o es de la u a BER pa a escla ece
cuál de los in e media ios de BER es el esponsable de los eno ipos de ines abilidad
gené ica asociada a la ho quilla de eplicación en ausencia de la u a AF.
Las glicosilasas de ADN que son capaces de elimina u acilos p esen es en el ADN son
UNG1/2, SMUG1, TDG y MBD4 39, pe o la que p esen a un papel p incipal en elimina la
5hmdU del ADN es SMUG1, ac uando como u a al e na i a pa a la eliminación del u acilo
p esen e en el ADN an e la de iciencia de UNG 104,125. Pa a inhibi el p ime paso de la u a
BER aguas a iba a la o mación del si io AP lle amos a cabo la depleción de SMUG1
(Figu a C3.2 A). En p ime luga , as la ealización de la écnica de siRNA pa a
depleciona SMUG1, se comp obó la al a de exp esión p o eica median e Wes e n Blo
(Figu a C3.2 B).
Figu a C3.2. Depleción de la glicosilasa de ADN SMUG1. A) Esquema ep esen a i o de la acción de la
glicosilasa de ADN SMUG1 pa a elimina la 5hmdU del ADN nacien e, gene ando un si io AP. B) Wes e n
Blo de ex ac os p o eicos de las líneas celula es sil es e y Fancd2-/- pa a la de ección de SMUG1 as su
depleción median e siRNA.
La pé dida de SMUG1 impedi ía la o mación de si ios AP en el ADN, con la consecuen e
acumulación de la 5hmdU en el ADN genómico. Pa a es udia las consecuencias gené icas
de la pé dida de SMUG1 en las células Fancd2-/- as la inco po ación de la 5hmdU,
de e minamos los ni eles nuclea es de PAR como ma cado sub ogado de la p esencia de
SSBs en las células en ase S (EdU+). Como se obse a en la Figu a C3.3 A, la depleción
de SMUG1 en las células Fancd2-/- EdU+ disminuyó los ni eles nuclea es de PAR de o ma
signi ica i a as la exposición a 5hmdC, sin ene un impac o signi ica i o en las células
sil es es. Es os da os sugie en que la acumulación de SSBs obse ada en las células
de icien es en FANCD2 as la inco po ación e ónea de la 5hmdU du an e la sín esis de
ADN se debe p incipalmen e a la ac i idad de SMUG1.
A con inuación, analizamos los ni eles de PAR asociados a la ho quilla de eplicación en
p og eso median e la écnica SIRF. Como se obse a en la Figu a C3.3 B, la depleción de
SMUG1 en la línea celula Fancd2-/- p o ocó un descenso signi ica i o del núme o de
ocos EdU-PAR as la exposición a 5hmdC, alcanzando el núme o de ocos EdU-PAR que
se p oducen de o ma espon ánea en la condición sin a amien o. Es os esul ados sugie en
que la señalización de PAR asociada a la ho quilla de eplicación en cu so as el
a amien o con 5hmdC, es dependien e de la ac i idad de SMUG1. Po an o, e i a la
RESULTADOS
135
o mación del si io AP as la pé dida de SMUG1 impide la gene ación del SSB, que es
señalizado po PAR.
Figu a C3.3. La depleción de SMUG1 disminuye los ni eles nuclea es de PAR asociados a ase S y el
núme o de ocos EdU-PAR inducidos po la exposición a 5hmdC en las células Fancd2-/-. A) Panel
izquie do, imágenes ep esen a i as de inmuno luo escencia de los ni eles nuclea es de PAR ( ojo) y las
células en ase S (EdU+; e de) de las líneas celula es sil es e y Fancd2-/- as la depleción de SMUG1,
expues as a 5hmdC (10µM) du an e 3h. Panel de echo, cuan i icación de la in ensidad media po célula EdU+
(n=200) de PAR as el a amien o con 5hmdC du an e 3h (R=3; es es adís ico One-way ANOVA; la línea
cen al ep esen a el alo de la mediana). B) Panel izquie do, imágenes ep esen a i as de
inmuno luo escencia de los ocos EdU-PAR ( ojo) y las células en ase S (EdU+; e de) de las líneas celula es
sil es e y Fancd2-/- as la depleción de SMUG1, expues as a 5hmdC (10µM) du an e 3h. Panel de echo,
cuan i icación del núme o de ocos EdU-PAR po célula EdU+ (n=200) as el a amien o con 5hmdC du an e
3h (R=2; es es adís ico One-way ANOVA; la línea cen al ep esen a la media ± s.d.).
El descenso obse ado en la señalización de PAR asociada a la eplicación po la pé dida
de SMUG1, pod ía indica la ausencia de o mación de SSBs obse ados en las células
Fancd2-/- as el a amien o con 5hmdC. Pa a de e mina si la depleción de SMUG1
impac a en la o mación de SSBs, de e minamos la ecuencia de SSBs de o ma di ec a
median e el ensayo de come as en condiciones alcalinas. El a amien o con 5hmdC en la
línea celula Fancd2-/- inc emen ó de o ma signi ica i a la ecuencia de SSBs, los cuales
ue on comple amen e sup imidos po la depleción de SMUG1 (Figu a C3.4). Es os
esul ados sugie en que la o mación de SSBs o huecos de ssDNA p o ocados po la
inco po ación e ónea de la 5hmdU du an e la sín esis de ADN depende de la ac i idad de
SMUG1 sob e la 5hmdU.
RESULTADOS
136
Figu a C3.4. La depleción de SMUG1 disminuye la ecuencia de SSBs as la exposición a 5hmdC en
las células Fancd2-/-. A) Imágenes ep esen a i as del ensayo de come as en condiciones alcalinas de las
células sil es es y de icien es en FANCD2 as la depleción de SMUG1, expues as a 5hmdC (10µM) du an e
3h. B) Cuan i icación del momen o de la cola po célula (n=300) as el a amien o con 5hmdC du an e 3h
(R=2; es es adís ico One-way ANOVA; la línea cen al ep esen a la media ± s.d.).
Ya que la pé dida de SMUG1 disminuyó signi ica i amen e la o mación de SSBs o huecos
de ssDNA dependien es de la inco po ación de la 5hmdU du an e la eplicación,
examinamos si la pé dida de SMUG1 impac a en la p og esión de la ho quilla de
eplicación. Como se obse a en la Figu a C3.5 A, la depleción de SMUG1 sup imió
comple amen e el a es o de la ho quilla de eplicación obse ado en la línea celula
Fancd2-/- as la exposición a 5hmdC. Es e esul ado sugie e que la gene ación del si io AP
y posiblemen e la consecuen e o mación del SSB, y no la pe sis encia de la 5hmdU en el
ADN nacien e, al e a la p og esión de la ho quilla de eplicación.
La sup esión de la o mación de SSBs y del bloqueo de la ho quilla de eplicación,
dependien es del a amien o con 5hmdC as la depleción de SMUG1 en la línea celula
Fancd2-/-, u o un impac o en la iabilidad celula , la cual inc emen ó has a alcanza los
ni eles obse ados en la línea celula sil es e (Figu a C3.5 B). Todos es os da os sugie en
que e i a la o mación de los si ios AP a causa de la pé dida de SMUG1, sup ime la
acumulación de si ios AP y huecos de ssDNA, la ines abilidad de la ho quilla de eplicación
y la le alidad dependien es de la inco po ación e ónea de la 5hmdU en las células
Fancd2-/-.
RESULTADOS
143
Figu a C3.12. Esquema ep esen a i o de la acumulación de SSBs as la pé dida de PARP1 o XRCC1.
La p esencia del SSB as el co e en el esquele o ibosa- os a o mediado po las
endonucleasas APEX1/2, conduce al eclu amien o de PARP1, la cual se ac i a pa a
eclu a al complejo de p eligación, que añade la base co ec a y p omue e la ligación de
los ex emos del SSB pa a es au a la con inuidad de la heb a de ADN. PARP1 ac úa como
senso de los SSBs pa a su pos e io epa ación, po lo que hipo e izamos que la pé dida de
PARP1 conduci ía a una acumulación de SSBs no epa ados. Pa a es udia el e ec o de la
acumulación de SSBs no epa ados, decidimos lle a a cabo la depleción de PARP1
median e siRNA. En p ime luga , comp obamos los ni eles de exp esión p o eica
median e Wes e n Blo (Figu a C3.13 A).
A con inuación, de ec amos los ni eles nuclea es de PAR an o en ase S como asociados
a la ho quilla de eplicación median e la écnica SIRF, y obse amos que la pé dida de
PARP1 en las células Fancd2-/- EdU+ disminuyó de o ma signi ica i a el inc emen o de
los ni eles nuclea es de PAR y del núme o de ocos EdU-PAR p o ocados po la
exposición a 5hmdC (Figu a C3.13 B y C), indicando que la señalización nuclea de PAR
depende p incipalmen e de PARP1. Sin emba go, el núme o de ocos EdU-PAR as el
a amien o con 5hmdC en las células Fancd2-/- deplecionadas de PARP1 no alcanzó el
núme o de ocos EdU-PAR obse ado en la condición sin a amien o (Figu a C3.13 C).
Es e esul ado indica que una p opo ción de la señalización de PAR asociada a la ho quilla
de eplicación as el a amien o con 5hmdC puede se independien e de PARP1, o es
consecuencia de la can idad es an e de PARP1 as la depleción.
La depleción de PARP1 exace bó la mue e celula de las células de icien es en FANCD2
as la exposición a 5hmdC (Figu a C3.13 D), sugi iendo que la con inua p esencia de
huecos de ssDNA debida a una ine icien e epa ación de los mismos, es la esponsable de
la le alidad celula du an e la eliminación de la 5hmdU en ausencia de FANCD2.
RESULTADOS
144
Figu a C3.13. Los ni eles nuclea es de PAR asociados a la eplicación son dependien es de PARP1 y la
depleción de PARP1 exace ba la le alidad obse ada en las células Fancd2-/- expues as a 5hmdC. A)
Wes e n Blo de ex ac os p o eicos ob enidos de las líneas celula es sil es e y Fancd2-/- pa a medi los
ni eles de PARP1 as su depleción median e siRNA. B) Panel izquie do, imágenes ep esen a i as de
inmuno luo escencia de los ni eles nuclea es de PAR ( ojo) y las células en ase S (EdU+; e de) de las líneas
celula es sil es e y Fancd2-/- as la depleción de PARP1, expues as a 5hmdC (10µM) du an e 3h. Panel
de echo, cuan i icación de la in ensidad media po célula EdU+ (n=200) de PAR as el a amien o con
5hmdC du an e 3h (R=3; es es adís ico One-way ANOVA; la línea cen al ep esen a el alo de la
mediana). C) Panel izquie do, imágenes ep esen a i as de inmuno luo escencia de los ocos EdU-PAR ( ojo)
y las células en ase S (EdU+; e de), de las líneas celula es sil es e y Fancd2-/- as la depleción de PARP1,
expues as a 5hmdC (10µM) du an e 3h. Panel de echo, cuan i icación del núme o de ocos EdU-PAR po
célula EdU+ (n=200) as la exposición a 5hmdC du an e 3h (R=2; es es adís ico One-way ANOVA; la línea
cen al ep esen a la media ± s.d.). D) Ensayo de iabilidad celula median e MTT de las líneas celula es
sil es e y Fancd2-/- as la depleción de PARP1, expues as a las dosis indicadas de 5hmdC du an e 72h (R=5,
media ± s.d.).
La u a de epa ación BER concluye con la inco po ación de la base co ec a y la ligación
de los ex emos del co e median e el complejo de p eligación XRCC1/POLβ/LIG3α. En
el apa ado 4.1 de es a esis doc o al, se ca ac e izó la sensibilidad y la DDR de la línea
celula de icien e en XRCC1 as la exposición a 5hmdC o a 5hmdU. En es e caso, con la
inalidad de ealiza el es udio en el mismo ondo gené ico, lle amos a cabo la depleción
de XRCC1 en la línea celula de icien e en FANCD2 pa a es udia su in e acción gené ica.
RESULTADOS
145
La depleción de XRCC1 (Figu a C.14 A), a pesa de no se comple a, p odujo un
inc emen o signi ica i o en los ni eles nuclea es de PAR en las células en ase S (Figu a
C.14 B), así como del núme o de ocos EdU-PAR (Figu a C.14 C) en la línea celula
Fancd2-/- as el a amien o con 5hmdC (10µM du an e 3h). En meno medida, la depleción
de XRCC1 ambién inc emen ó de o ma signi ica i a el núme o de ocos EdU-PAR en la
línea celula sil es e después de la exposición a 5hmdC (Figu a C.14 C), co elacionando
con los esul ados ob enidos con la línea celula de icien e en XRCC1 mos ados en el
apa ado 4.1.2 de es a esis doc o al. Es os esul ados sugie en que los SSBs asociados a la
ho quilla de eplicación, o iginados du an e la eliminación de la 5hmdU po la u a BER,
pe sis en más iempo o se acumulan en mayo p opo ción as la pé dida de XRCC1 en
ausencia de la u a AF. Además, como se ha desc i o que XRCC1 es el ac o enca gado de
elimina a PARP1 del SSB 45, posiblemen e la pé dida de XRCC1 inc emen e la
pe sis encia de PARP1 en los SSBs, impac ando en los ni eles de ec ados de PAR
asociados al ADN ecién sin e izado.
RESULTADOS
146
Figu a C3.14. La depleción de XRCC1 exace ba los ni eles nuclea es de PAR asociados a la eplicación
mediados po la inco po ación e ónea de la 5hmdU en las células de icien es en FANCD2. A) Wes e n
Blo de ex ac os p o eicos ob enidos de las líneas celula es sil es e y Fancd2-/- pa a la de ección de los
ni eles de XRCC1 as su depleción median e siRNA. B) Panel izquie do, imágenes ep esen a i as de
inmuno luo escencia de los ni eles nuclea es de PAR ( ojo) y las células en ase S (EdU+; e de), de las
líneas celula es sil es e y Fancd2-/- as la depleción de XRCC1, expues as a 5hmdC (10µM) du an e 3h.
Panel de echo, cuan i icación de la in ensidad media po célula EdU+ (n=200) de los ni eles nuclea es de
PAR as el a amien o con 5hmdC du an e 3h (R=3; es es adís ico One-way ANOVA; la línea cen al
ep esen a el alo de la mediana). C) Panel izquie do, imágenes ep esen a i as de inmuno luo escencia de
los ocos EdU-PAR ( ojo) y las células en ase S (EdU+; e de) de las líneas celula es sil es e y Fancd2-/-
as la depleción de XRCC1, as el a amien o con 5hmdC (10µM) du an e 3h. Panel de echo, cuan i icación
del núme o de ocos EdU-PAR po célula EdU+ (n=200) as el a amien o con 5hmdC du an e 3h (R=3; es
es adís ico One-way ANOVA; la línea cen al ep esen a la media ± s.d.).
La depleción de XRCC1 ambién exace bó la le alidad p o ocada po la exposición a
5hmdC en las células Fancd2-/- (Figu a C3.15 A), sugi iendo que la acumulación de SSBs
que pe manecen sin epa a impac a en la iabilidad celula de las células Fancd2-/-. Sin
emba go, la depleción de XRCC1 no inc emen ó los de ec os en la ho quilla de eplicación
inducidos po el a amien o con 5hmdC en la línea celula Fancd2-/- (Figu a C3.15 B).
Figu a C3.15. La depleción de XRCC1 exace ba la le alidad celula mediada po el a amien o con
5hmdC, pe o no impac a en la es abilidad de la ho quilla de eplicación en las células Fancd2-/-. A)
Ensayo de iabilidad celula median e MTT de las líneas celula es sil es e y Fancd2-/- as la depleción de
XRCC1 expues as a las dosis indicadas de 5hmdC du an e 72h (R=9; media ± s.d.). B) Cuan i icación de la
p opo ción IdU/CldU del ensayo de ib as de ADN pa a la de ección del bloqueo de la ho quilla de
eplicación, de las líneas celula es sil es e y de icien e en FANCD2 deplecionadas de XRCC1, as la
exposición a 5hmdC (40µM) du an e 30 min (n=200 de 2 éplicas biológicas independien es; es es adís ico
One-way ANOVA).
Globalmen e, odos es os esul ados nos pe mi en p opone un modelo de abajo que
sugie e que la epa ación de ec uosa de los SSBs gene ados as la inco po ación e ónea
de la 5hmdU y su pos e io p ocesamien o po la u a de epa ación BER, esul a en un
inc emen o de SSBs y de ci o oxicidad en las células Fancd2-/-.
4.4. CAPÍTULO 4: HMCES pe u ba la
es abilidad de la ho quilla de eplicación
du an e la inco po ación e ónea de la
5hmdU
RESULTADOS
149
4.4.1. La unión de HMCES a los si ios AP en la cadena nacien e,
gene ados as la eliminación de la 5hmdU, es esponsable de la
o mación de los huecos de ssDNA en las células de icien es en FANCD2
La 5hmdU se inco po a a la cadena de ADN nacien e du an e la eplicación, y es econocida
y eliminada po las glicosilasas de ADN du an e la u a de epa ación BER, gene ando
si ios AP u o os in e media ios que pueden obs aculiza la p og esión de la ho quilla de
eplicación. En cie as condiciones, los si ios AP localizados en ssDNA son p o egidos po
la p o eína HMCES. HMCES, a a és de la cis eína 2, eacciona co alen emen e con el
g upo aldehído del si io AP en con o mación abie a, o mando un DPC. Es e HMCES-
DPC p e iene el co e endonucleolí ico del si io AP po APEX1, e i ando la o mación de
DSBs en la ho quilla de eplicación 80,81. Ya que du an e el p oceso de eliminación de la
5hmdU, la glicosilasa de ADN SMUG1 gene a si ios AP en la cadena de ADN nacien e,
decidimos in es iga si HMCES iene la capacidad de eacciona con es os si ios AP pa a
p o ege los.
Pa a de e mina si HMCES eacciona con los si ios AP de i ados del p ocesamien o de la
5hmdU, lle amos a cabo la gene ación de líneas celula es sil es es y Fancd2-/- que
sob eexp esan de o ma es able la p o eína HMCES usionada aduccionalmen e al
epí opo FLAG. El epí opo FLAG pe mi e la iden i icación de las células que exp esan la
cons ucción y la de ección del eclu amien o de HMCES en c oma ina. Pa a ob ene una
población celula homogénea, las células se selecciona on en medio de cul i o con
blas icidina. Pa a de e mina el po cen aje de células que sob eexp esan la cons ucción
HMCES-FLAG, ealizamos un ensayo de inmuno luo escencia y analizamos la exp esión
de la cons ucción HMCES-FLAG. En es e ensayo de inmuno luo escencia, ealizamos un
paso de ijación celula p e io al paso de pe meabilización (Figu a C4.1).
Figu a C4.1. Gene ación de las líneas celula es que sob eexp esan la cons ucción MmHMCES-FLAG.
Esquema de la gene ación de la línea celula sil es e y Fancd2-/- que sob eexp esa la cons ucción
MmHMCES-FLAG, e imágenes ep esen a i as de inmuno luo escencia pa a de ec a la exp esión de la
cons ucción MmHMCES-FLAG en ambas líneas celula es as un paso de ijación seguido de un paso de
pe meabilización (imagen supe io ) o as un paso de pe meabilización seguido de un paso de ijación
(imagen in e io ).
Una ez ob enida la línea celula sil es e y Fancd2-/- que exp esa la cons ucción HMCES-
FLAG de o ma es able, examinamos la uncionalidad de la usión aduccional median e
un ensayo de e ención en c oma ina po inmuno luo escencia. En condiciones sin
a amien o, obse amos que las células Fancd2-/- p esen a on una mayo p opo ción de
RESULTADOS
150
núcleos posi i os HMCES-FLAG en compa ación con la línea celula sil es e (Figu a
C4.2 B), sugi iendo que las células de icien es en FANCD2 p esen an una ele ada
p opo ción de si ios AP a los que se une HMCES. Como con ol de la écnica se usó MMS,
agen e alquilan e que modi ica las bases de ambas heb as de ADN, po lo que, as la acción
de las glicosilasas de ADN, se p oducen si ios AP an o en la cadena molde como en la
cadena de ADN nacien e. Como se obse a en la Figu a C4.2 C, el a amien o con MMS
(0.5mM du an e 30 min) p odujo el eclu amien o de HMCES-FLAG a la c oma ina en
ambas líneas celula es, aunque la señal nuclea de HMCES-FLAG ue signi ica i amen e
más in ensa en las células Fancd2-/-. A con inuación, examinamos si el a amien o con
dosis c ecien es de 5hmdC (40µM, 80µM y 160µM du an e 3h) inducía la unión de
HCMES-FLAG a la c oma ina. Como se obse a en la Figu a C4.2 C, el a amien o con
5hmdC inc emen ó signi ica i amen e y de mane a dosis-dependien e la in ensidad nuclea
de HMCES-FLAG en las células Fancd2-/-, sin obse a se un inc emen o signi ica i o en
las células sil es es. Es os da os sugie en que el p ocesamien o de la 5hmdU po la u a
BER, gene a si ios AP en la cadena de ADN nacien e que son econocidos po HMCES.
Figu a C4.2. HMCES-FLAG se eclu a a c oma ina as la inco po ación e ónea de la 5hmdU. A)
Esquema de la gene ación de la línea celula sil es e y Fancd2-/- HMCES-FLAG y del ensayo de e ención
en c oma ina as el daño en el ADN. B) Panel izquie do, imágenes ep esen a i as del ensayo de e ención
en c oma ina de HMCES-FLAG median e inmuno luo escencia, de las líneas celula es sil es e y Fancd2-/-
en condiciones sin a amien o. Panel de echo, po cen aje de células HMCES-FLAG+ en condiciones sin
a amien o (R=3; es es adís ico de S uden ; la ba a ep esen a la media ± s.d.). C) Panel izquie do,
imágenes ep esen a i as del ensayo de e ención en c oma ina de HMCES-FLAG median e
inmuno luo escencia. Las líneas celula es sil es e y Fancd2-/- ue on expues as a 5hmdC (160µM) du an e
3h, seguido del a amien o con el inhibido del p o easoma MG-132 (10µM) du an e 3h. Panel de echo,
cuan i icación de la in ensidad media po célula (n=200) de la señal nuclea de HMCES-FLAG as el
a amien o con 5hmdC (40µM, 80µM o 160µM du an e 3h) o MMS (0.5mM du an e 30 min), seguido del
a amien o con MG-132 (R=3; es es adís ico One-way ANOVA; la línea cen al ep esen a el alo de la
mediana).
Pa a con i ma los esul ados ob enidos median e inmuno luo escencia, ealizamos un
sub accionamien o celula , en el cual ob u imos la acción soluble y c oma ínica de las
células sil es es y Fancd2-/- expues as a 5hmdC (40µM, 80µM y 160µM du an e 3h).
RESULTADOS
151
Median e Wes e n Blo analizamos los ni eles de p o eína en cada una de las acciones.
Como con ol de la écnica usamos MMS, el cual p o ocó el eclu amien o de HMCES en
c oma ina en ambas líneas celula es, aunque el eclu amien o ue mayo en las células
Fancd2-/- (Figu a C4.3). El a amien o con 5hmdC p o ocó el eclu amien o de HMCES
en c oma ina en mayo medida en las células de icien es en FANCD2, en compa ación con
las células sil es es (Figu a C4.3) Es os da os sugie en que HMCES se eclu a a la
c oma ina, p obablemen e a los si ios AP gene ados as la eliminación de la 5hmdU po la
u a BER.
Figu a C4.3. La inco po ación de la 5hmdU induce el eclu amien o de HMCES a la c oma ina. A)
Wes e n Blo de los ni eles en c oma ina y en la acción soluble de HMCES, HISTONA H3 y α-TUBULINA
as el a amien o con 5hmdC (40µM, 80µM o 160µM du an e 3h) o MMS (0.5mM du an e 30 min), seguido
del a amien o con MG-132 (10µM) du an e 3h, de la línea celula sil es e. B) Wes e n Blo de los ni eles
en c oma ina y en la acción soluble de HMCES, HISTONA H3 y α-TUBULINA as el a amien o con
5hmdC (40µM, 80µM o 160µM du an e 3h) o MMS (0.5mM du an e 30 min), seguido del a amien o con
MG-132 (10µM) du an e 3h, de la línea celula Fancd2-/-.
HMCES se une p e e en emen e a los si ios AP gene ados po la glicosilasa de ADN
SMUG1, solo cuando es os se encuen an en ssDNA, ya que en dsDNA los si ios AP se
p ocesan po la endonucleasa APEX1. Ya que los si ios AP gene ados po SMUG1 es a ían
localizados en dsDNA, quisimos de e mina si la incisión po APEX1 es necesa ia pa a la
unión de HMCES al si io AP gene ado as la eliminación de la 5hmdU. Pa a ello, lle amos
a cabo la depleción de APEX1 en las células que sob eexp esan la cons ucción HMCES-
FLAG y ealizamos un ensayo de e ención en c oma ina median e inmuno luo escencia.
Como se obse a en la Figu a C4.4, la depleción de APEX1 disminuyó de o ma
signi ica i a la e ención de HMCES en c oma ina en las células Fancd2-/- as la exposición
a 5hmdC. Es os da os sugie en que el co e gene ado po APEX1 es necesa io pa a
p omo e la unión de HMCES a los si ios AP de i ados de la eliminación de la 5hmdU.
Además, la depleción de APEX1 disminuyó de o ma signi ica i a la señal nuclea de
HMCES-FLAG en condiciones sin a amien o, an o en las células sil es es como en las
células Fancd2-/- (Figu a C4.4), sugi iendo que APEX1 pod ía p ocesa los si ios AP que
se o man du an e eacciones de BER no asociadas a la inco po ación de la 5hmdU, que
conducen a la unión de HMCES.
RESULTADOS
152
Figu a C4.4. La depleción de APEX1 dismuye el eclu amien o de HMCES-FLAG a la c oma ina.
Cuan i icación de la in ensidad media po célula (n=200) de la señal nuclea de HMCES-FLAG as el
a amien o con 5hmdC (160µM du an e 3h) o MMS (0.5mM du an e 30 min), seguido del a amien o con
MG-132 (10µM), de las líneas celula es sil es e y Fancd2-/- as la depleción de APEX1 (R=2; es es adís ico
One-way ANOVA; la línea cen al ep esen a el alo de la mediana).
Es os esul ados sugie en que HMCES se une a los si ios AP gene ados as el
p ocesamien o de la 5hmdU po la u a de epa ación BER. Si HMCES es un ac o
p o ec o de si ios AP, la pé dida de unción de HMCES e i a ía la o mación de HMCES-
DPCs, inc emen ando la ecuencia de si ios AP desp o egidos. Es os si ios AP se ían
p ocesados po APEX1, gene ándose mayo can idad de huecos de ssDNA ci o óxicos en
la cadena nacien e, lo que pod ía esul a en un aumen o de la le alidad de las células
de icien es en FANCD2. Po an o, p edecimos que la pé dida de unción de HMCES en
las células Fancd2-/- inc emen a ía la ines abilidad gené ica, dando luga a un eno ipo
sin é ico le al. Pa a e alua es a hipó esis, lle amos a cabo la depleción de HMCES en las
líneas celula es sil es e y Fancd2-/-. En p ime luga , comp obamos la al a de exp esión
p o eica median e Wes e n Blo (Figu a C4.5 A). Como medida indi ec a de la p esencia
de huecos de ssDNA o SSBs, de e minamos an o los ni eles nuclea es de PAR en células
en ase S, como la p oximidad de los políme os PAR a la ho quilla de eplicación median e
la écnica SIRF. So p enden emen e, la depleción de HMCES disminuyó de o ma
signi ica i a la señalización nuclea de PAR asociada a ase S (Figu a C4.5 B) y el núme o
de ocos EdU-PAR (Figu a C4.5 C) inducidos po el a amien o con 5hmdC (10µM
du an e 3h) en las células Fancd2-/- EdU+. Es os esul ados sugie en que la unión de
HMCES a los si ios AP localizados en la cadena de ADN nacien e, gene ados du an e la
eliminación de la 5hmdU median e la u a BER, es esponsable del inc emen o de los
huecos de ssDNA en las células de icien es en FANCD2.
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Figu e 4: XRCC1 deple ion exace ba e 5hmdC-induced genomic ins abili y and le hali y o
886
HRD cells.
887
A. Le , ep esen a i e PAR ( ed) immuno luo escence images o XRCC1-deple ed wild ype o
888
Fancd2-/- cells exposed o 5hmdC (10µM) o 3h. DAPI (blue) s ains nuclea DNA and EdU (g een)
889
s ains S-phase cells. Righ , plo depic ing PAR mean in ensi y signal pe nucleus. B. Le ,
890
ep esen a i e images o EdU-PAR oci ( ed) by SIRF assay o XRCC1-deple ed wild ype o
891
Fancd2-/- cells exposed o 5hmdC (10µM) o 3h. DAPI (blue) s ains nuclea DNA and EdU (g een)
892
s ains S-phase cells. Righ , plo depic ing EdU-PAR oci pe nucleus. C. Top, MTT cell
893
p oli e a ion assay o wild ype o Fancd2-/- cells lacking XRCC1 exposed o he indica ed dose o
894
5hmdC o 3 days (n=9, mean ± s.d.). Bo om, MTT cell p oli e a ion assay o wild ype, siPARP1,
895
Fancd2-/- and Fancd2-/- siPARP1 cells, exposed o he indica ed dose o 5hmdC o 3 days (n=5,
896
mean ± s.d.). D. Top le , scheme o DNA ibe assay. Bo om le , ep esen a i e images o DNA
897
ibe s om Fancd2-/- and Fancd2-/- siXRCC1 cells un ea ed o exposed o 5hmdC (40µM) o
898
30min. Righ , box plo o he equency o IdU/CldU a io o XRCC1-deple ed wild ype o Fancd2-
899
/- cells upon 5hmdC ea men (n=200 o each 2 biological eplica es). E. Top le , scheme o he
900
SCE assay. Righ , ba plo o SCE/ch omosome pe me aphase om SMUG1-, APEX1-, XRCC1-
901
o PARP1-deple ed Fancd2-/- cells exposed o 5hmdC (10µM) o 12h (n=50 o each o 2 biological
902
eplica es; ba ep esen s mean ± s.d.).
903
904
905
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906
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Figu e 5. HMCES accumula es in nuclei and is esponsible o 5hmdC-media ed genomic
907
ins abili y obse ed in HRD cells
908
A. Le , ep esen a i e immuno luo escence images o Flag- agged HMCES (g een) posi i e nuclei
909
om wild ype o Fancd2-/- cells. Righ , pe cen age o HMCES-FLAG+ wild ype and Fancd2-/-
910
cells. B. Le , ep esen a i e immuno luo escence images o HMCES posi i e nuclei om wild ype
911
o Fancd2-/- cells upon combined 5hmdC (160µM) and MG-132 (10µM) ea men s o 3h. Righ ,
912
HMCES-FLAG mean in ensi y signal pe nucleus om wild ype and Fancd2-/- cells upon 5hmdC
913
(3h) o MMS (0.5mM, 30min). T ea men s we e combined wi h MG-132 (10µM). C. Le , images
914
o FLAG- agged HMCES posi i e nuclei om Fancd2-/- cells, exp essing MmHMCES-WT-
915
FLAG, MmHMCES-C2A-FLAG o MmHMCES-R212E-FLAG upon 5hmdC exposu e (160µM,
916
3h). Righ , plo depic ing HMCES-FLAG mean in ensi y signal pe nucleus om wild ype o
917
Fancd2-/- cells exp essing MmHMCES-WT-FLAG, MmHMCES-C2A-FLAG o MmHMCES-
918
R212E-FLAG upon 5hmdC (indica ed dose o 3h) o MMS (0.5mM). T ea men s we e combined
919
wi h MG-132 (10µM). D. Le , ep esen a i e images o EdU-PAR oci by SIRF assay om
920
HMCES-deple ed wild ype o Fancd2-/- cells exposed o 5hmdC (10µM) o 3h. DAPI (blue) s ains
921
nuclea DNA. EdU (g een) s ains S-phase cells. Righ , plo depic ing EdU-PAR oci pe nucleus.
922
E. Le , ep esen a i e images o alkaline come assay om HMCES-deple ed wild ype o Fancd2-
923
/- cells ollowing 5hmdC ea men (10µM) o 3h. Righ , plo depic ing come ail momen pe cell.
924
925
926
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927
928
929
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Figu e 6. HMCES deple ion escues 5hmdC-induced eplica ion o k de ec s and ssDNA gap
930
accumula ion in HRD cells.
931
A. Top, scheme o DNA ibe assay and ep esen a i e images o DNA ibe s om Fancd2-/- and
932
Fancd2-/- siHMCES cells un ea ed o exposed o 5hmdC (40µM) o 30min. Bo om, box plo o
933
he equency o IdU/CldU a ios o HMCES-de icien wild ype o Fancd2-/- cells upon 5hmdC
934
ea men (n=200). B. Top, scheme o DNA ibe assay and ep esen a i e images o bidi ec ional
935
ibe s om Fancd2-/- and Fancd2-/- siHMCES cells un ea ed o exposed o 5hmdC (40µM) o
936
30min. Bo om, DNA ibe asymme y index om HMCES-deple ed wild ype o Fancd2-/- cells
937
upon 5hmdC ea men . C. Top, ch omosome abe a ions om HMCES- KD Fancd2-/- cells
938
ollowing 5hmdC ea men (10µM o 40h). Righ , plo depic ing ch omosome
939
abe a ions/me aphase (n=50 o each o 2 biological eplica es; ba ep esen s mean ± s.d.). D. MTT
940
cell p oli e a ion assay o HMCES-deple ed wild ype o Fancd2-/- cells, exposed o he indica ed
941
dose o 5hmdC o 3 days (n=5, mean ± s.d.). E. Le , HMCES p o ein deple ion examined by
942
wes e n blo s o DLD-1 o BRCA2-/- cells ex ac s. Righ , MTT cell p oli e a ion assay o HMCES-
943
de icien wild ype and BRCA2-/- cells, exposed o he indica ed dose o 5hmdC o 6 days (n=6;
944
mean ± s.d.). F. Le , ep esen a i e EM image o a b oken eplica ion o k om 5hmdC-exposed
945
Fancd2-/- cells (10µM o 3h). Rec angle shows o k junc ion magni ica ion. Red a ows indica e
946
ssDNA gaps. Righ , pe cen age o b oken o ks in HMCES- KD Fancd2-/- cells ollowing 5hmdC
947
ea men . 100 o ks we e sco ed o each condi ion (n=2). G. O e all su i al plo o b eas cance
948
coho o he TCGA eposi o y.
949
950
951
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952
953
954
955
Figu e 7. HMCES, APEX1 and APEX2 unc ion in a common BER gene ic pa hway du ing
956
5hmdU emo al
957
A. Le , ep esen a i e PAR ( ed) immuno luo escence images om Fancd2-/- cells upon deple ion
958
o HMCES, APEX1 o hei combina ions exposed o 5hmdC (10µM) o 3h. DAPI (blue) s ains
959
nuclea DNA and EdU (g een) s ains S-phase nuclei. Righ , plo depic ing PAR mean in ensi y
960
signal pe nucleus. B. Le , ep esen a i e PAR ( ed) immuno luo escence images om Fancd2-/-
961
cells upon deple ion o HMCES, APEX2 o hei combina ions exposed o 5hmdC (10µM) o 3h.
962
DAPI (blue) s ains nuclea DNA and EdU (g een) s ains S-phase cells. Righ , plo depic ing PAR
963
mean in ensi y signal pe nucleus. C. MTT cell p oli e a ion assay o HMCES-, APEX1- o
964
HMCES APEX1-deple ed wild ype o Fancd2-/- cells, exposed o he indica ed dose o 5hmdC o
965
3 days (n=5, mean ± s.d.). D. MTT cell p oli e a ion assay o HMCES-, APEX2- o HMCES
966
APEX2-deple ed wild ype o Fancd2-/- cells, exposed o he indica ed dose o 5hmdC o 3 days.
967
968
969
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970
971
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Figu e 8. HMCES is esponsible o PRIMPOL-dependen ssDNA gap accumula ion.
972
A. Le , ep esen a i e images o EdU-PAR oci ( ed) by SIRF assay om wild ype, siPRIMPOL,
973
Fancd2-/-and Fancd2-/- siPRIMPOL cells exposed o 5hmdC (10µM) o 3h. DAPI (blue) s ains
974
nuclea DNA. EdU (g een) s ains S-phase cells. Righ , plo depic ing EdU-PAR oci pe nucleus.
975
B. Plo depic ing come ail momen pe cell om PRIMPOL-deple ed wild ype o Fancd2-/- cells
976
ollowing 5hmdC ea men (10μM) o 3h. C. Top, MTT cell p oli e a ion assay o wild ype, si
977
APEX1, siPRIMPOL, siAPEX1 siPRIMPOL, Fancd2-/-, Fancd2-/- si APEX1, Fancd2-/-
978
siPRIMPOL and Fancd2-/- siPRIMPOL siAPEX1 cells exposed o he indica ed dose o 5hmdC o
979
3 days. Bo om, MTT cell p oli e a ion assay o wild ype, siHMCES, siPRIMPOL,
980
siHMCES/siPRIMPOL, Fancd2-/-, Fancd2-/- siHMCES, Fancd2-/- siPRIMPOL and Fancd2-/-
981
siHMCES/siPRIMPOL cells exposed o he indica ed dose o 5hmdC o 3 days. D. Le ,
982
ep esen a i e images o SCEs om Fancd2-/-, Fancd2-/- siHMCES, Fancd2-/- siPRIMPOL and
983
Fancd2-/- siHMCES/siPRIMPOL cells exposed o 5hmdC (10µM) o 12h. Top igh , scheme o
984
SCE assay. Bo om igh , ba plo o SCE/ch omosome pe me aphase (n=50 o each o 2 biological
985
eplica es; ba ep esen s mean ± s.d.). E. Wo king model depic ing he mechanism o eplica ion
986
o k ins abili y by HMCES du ing emo al o 5hmdU in he absence o he eplica ion o k
987
main enance FA pa hway.
988
989
990
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Supplemen a y Ma e ials
991
992
993
994
995
Supplemen a y igu e 1: DCTD, DCK, SMUG1, APEX1, XRCC1, PARP1, HMCES o
996
PRIMPOL siRNA-media ed p o ein deple ions in wild ype and Fancd2-/- cell ex ac s examined
997
by wes e n blo s. ERCC1, LMNA/C o PCNA we e used as loading con ols.
998
999
1000
1001
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1002
1003
Supplemen a y igu e 2. Nuclea PAR le els upon PARP1, SMUG1, APEX1 and XRCC1,
1004
PARP1 deple ion o wild ype and Fancd2-/- cells.
1005
A. Le , ep esen a i e o al PARyla ion ( ed) immuno luo escence images o PARP1-deple ed wild
1006
ype and Fancd2-/- cells exposed o 5hmdC (10µM) o 3h. DAPI (blue) s ains nuclea DNA. Righ ,
1007
plo depic ing PAR mean in ensi y signal pe nucleus. B. Le , ep esen a i e o al PARyla ion ( ed)
1008
immuno luo escence images o SMUG1-deple ed wild ype o Fancd2-/- cells and exposed o
1009
5hmdC (10µM) o 3h. DAPI (blue) s ains nuclea DNA. Righ , plo depic ing PAR mean in ensi y
1010
signal pe nucleus. C. Le , ep esen a i e o al PARyla ion ( ed) immuno luo escence images o
1011
APEX1-deple ed wild ype o Fancd2-/- cells exposed o 5hmdC (10µM) o 3h. DAPI (blue) s ains
1012
nuclea DNA. Righ , plo depic ing PAR mean in ensi y signal pe nucleus. D. Le , ep esen a i e
1013
o al PARyla ion ( ed) immuno luo escence images o XRCC1-deple ed wild ype o Fancd2-/- cells
1014
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1071
1072
Supplemen a y igu e 7. HMCES deple ion supp esses nuclea PARyla ion bu inc eases
1073
se 139-H2AX
1074
A. Le , ep esen a i e immuno luo escence images o o al PARyla ion ( ed) in wild ype, Fancd2-
1075
/-, siHMCES and Fancd2-/- siHMCES cells exposed o 5hmdC (10µM) o 3h. DAPI (blue) s ains
1076
nuclea DNA. Righ , plo depic ing PAR mean in ensi y signal pe nucleus. B. Le , ep esen a i e
1077
PAR ( ed) immuno luo escence images o HMCES-deple ed wild ype o Fancd2-/- EdU+ cells
1078
exposed o 5hmdC (10μM) o 3h. DAPI (blue) s ains nuclea DNA. EdU (g een) s ains S-phase
1079
cells. Righ , PAR mean in ensi y signal pe nucleus. C. Le , ep esen a i e se 139-H2AX (g een)
1080
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immuno luo escence images o HMCES-deple ed wild ype o Fancd2-/- cells a e 5hmdC
1081
ea men (10µM 3h). Middle, plo depic ing se 139-H2AX mean in ensi y signal o wild ype o
1082
Fancd2-/- cells. Righ , plo depic ing se 139-H2AX mean in ensi y signal o wild ype o Fancd2-/-
1083
cells exposed o 5hmdC (10µM) o 3h.
1084
1085
1086
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1087
1088
Supplemen a y igu e 8. HMCES- KD supp esses 5hmdC-induced ch omosome abe a ions
1089
Ba plo o di e en ypes o ch omosome abe a ions (Radial, gaps and b eaks) om HMCES- KD
1090
wild ype o Fancd2-/- cells ollowing 5hmdC ea men (10µM) o 40h. (n=50 o each o 2
1091
biological eplica es; ba ep esen s mean ± s.d.).
1092
1093
1094
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1095
1096
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1098
Supplemen a y igu e 9. Independen siRNAs agains HMCES ecapi ula es iabili y escue
1099
and nuclea PARyla ion obse ed by pooled siRNA in Fancd2-/- cells
1100
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A. Wes e n blo o HMCES-deple ed wild ype and Fancd2-/- cell ex ac s by pooled (P) o
1101
independen (#1 o #4) siRNAs. LAMIN A/C was used as loading con ol. B. MTT cell p oli e a ion
1102
assay o HMCES-deple ed (pooled o independen siRNAs) wild ype and Fancd2-/- cells exposed
1103
o he indica ed dose o 5hmdC o 3 days. C. Plo depic ing PAR mean in ensi y signal pe nucleus
1104
om HMCES-deple ed (pooled o independen siRNAs) Fancd2-/- EdU+ cells exposed o 5hmdC
1105
(10M) o 3h. D. Table o p edic ed o - a ge genes o independen siRNAs agains HMCES.
1106
1107
1108
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1109
1110
Supplemen a y igu e 10. Rep esen a i e EM images o eplica ion o ks o Fancd2-/- cells
1111
upon 5hmdC ea men and ssDNA gap quan i ica ion.
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A. Rep esen a i e EM images o eplica ion o k-con aining genomic DNA om HMCES KD
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Fancd2-/- cells ea ed as indica ed (10M 5hmdC o 3h). HMCES silencing (siHMCES) is
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indica ed. Ba ep esen s 500 nucleo ides (n ). Numbe s (whi e) ep esen s a m lengh (n ). Fo each
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image, ec angle shows o k junc ion magni ica ion. Red a ows indica e ssDNA gaps. B. Plo
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showing he numbe , he size and he dis ibu ion o ssDNA gaps. No signi ican di e ences we e
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ound in any condi ion. Up o 80 in e media es pooled om wo independen expe imen s we e
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sco ed o each condi ion. ns=non-signi ican di e ences assessed by one-way ANOVA.
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Supplemen a y igu e 11. Independen siRNAs agains HMCES ecapi ula es iabili y escue
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and nuclea PARyla ion obse ed by pooled siRNA in Fancd2-/- cells
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A. Sange sequencing o HMCES-, FANCD2- o HMCES FANCD2 CRISPR knockou RPE-1
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TP53-/- clones. B. Wes e n blo o clones ob ained by CRISPR-CAS9-media ed mu agenesis.
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Clones 9, 7, 3 and 12 we e selec ed as wild ype, HMCES-/-, FANCD2-/- and HMCES-/-FANCD2-/-
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DKO espec i ely o S1 nuclease assay. C. Do plo o IdU ack leng h o wild ype, FANCD2-/-
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(FD2-/-), HMCES-/- (HM-/-) o FANCD2-/- HMCES-/- (DKO) cells upon 5hmdC ea men (10μM)
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o 30 min. S1 ea men was ca ied ou o 30 min. (n=200 o each 2 biological eplica es). D.
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Le els o HMCES mRNA and o e all su i al in a b eas umou coho .
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Supplemen a y igu e 12. A. Le , ep esen a i e immuno luo escence images o nuclea
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PARyla ion ( ed) in EdU+ wild ype, Fancd2-/-, siHMCES and Fancd2-/- siHMCES cells upon
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exposu e o 5hmdC (10µM) o 3h. DAPI (blue) s ains nuclea DNA and EdU (g een) s ains S-
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phase cells. Plo depic ing PAR mean in ensi y signal in PRIMPOL-deple ed wild ype o Fancd2-
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/- EdU+ cells exposed o 5hmdC (10µM).
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