EL CULTIVO IN VITRO, UN MÉTODO PARA MEJORAR LA GERMINACIÓN DE
PLANTAS CON INTERÉS FORESTAL EN ANDALUCÍA.
M. CANTOS1, J. LIÑÁN1, J. TRONCOSO1, A. APARICIO2, A.TRONCOSO1.
(1) Ins i u o de Recu sos Na u ales y Ag obiología de Se illa. CSIC. Apa ado 1052.
41080. Se illa.
(2) Dp o. Biología Vege al y Ecología. Facul ad de Fa macia. Uni . de Se illa.
RESUMEN
Se compa a la ge minación ob enida po mé odos con encionales (siemb a de semillas en bandejas), con la
log ada po el cul i o in i o de semillas con cubie a, con cubie a esca i icada, sin cubie a o emb iones aislados, de
especies ege ales elegidas po su ca ác e endémico, su in e és como plan as o es ales en Andalucía, su di icul ad de
ge minación y su si uación de en pelig o de ex inción o cla a eg esión.
Los esul ados ob enidos con semillas po mé odos adicionales, ue on muy pob es an o en el po cen aje de
ge minación, como en el iempo p olongado, necesa io pa a ello. Po el con a io, los p ocedimien os de ge minación in
i o, que se u iliza on siemp e de mas sencillo (semilla comple a) a mas complicado (emb ión), die on an os po cien o
ele ados de ge minación en iempos educidos, como se especi ica pa a cada especie: A opa bae ica Willk., 100% de
ge minación en 30 días con semilla comple a sin esca i ica ; Echinospa um algibicum Tala e a & Apa icio, 100% de
ge minación en 30 días, con semilla comple a esca i icada; Junipe us oxyced us, L. subsp, oxyced us, y Junipe us
oxyced us, L. subsp, mac oca pa (Sib h. & Reu e ) Ball., 50% de ge minación en 45 días con emb iones aislados;
L
a a e a ma i ima Gouan, 76% de ge minación a los 21 días, con semillas comple as sin esca i ica ; Olea eu opaea L.
a .sa i a, Olea eu opaea L. a . syl es is B o ., 100% de ge minación en 10 días con emb iones aislados; Philly ea
la i olia L., 55% de ge minación a los 7 días en emb iones aislados y Rhododend on pon icum subsp. bae icum (Boiss. &
Reu e ) Hand-Mazz. 90 % en 30 días con semillas comple as. En odas las especies conside adas, se ob u ie on
po cen ajes ele ados de supe i encia (>85%) al asplan a las plán ulas desde in i o a condiciones ex e nas.
P.C.: semilla, emb ión, p opagación, conse ación, plan as leñosas
SUMMARY
IN VITRO CULTURE, A METHOD TO IMPROVE GERMINATION OF PLANTS WITH
FORESTAL INTEREST IN ANDALUSIA.
Seed ge mina ion by adi ional me hods and in i o cul u e o no mal, sca i ied o naked seeds, o isola e
d
emb yos o Andalusian o es al plan s, we e compa ed. The plan s we e chosen by hei endemic cha ac e , di icul y o
ge mina ion and endange ed si ua ion.
In gene al, adi ional me hods ga e bad esul s, in e ms o low pe cen age and long ime o ge mina ion. On he
con a y, by in i o cul u e, he ollowing esul s we e ob ained: A opa bae ica Willk., 100% o ge mina ion in 30 days
wi h no mal seeds; Echinospa um algibicum Tala e a & Apa icio, 100% o ge mina ion in 30 days, wi h sca i ied seeds;
J
unipe us oxyced us, L. subsps, oxyced us and mac oca pa, (Sib h. & Reu e ) Ball., 50% o ge mina ion in 45 days wi h
isola ed emb yos; La a e a ma i ima Gouan, 76% o ge mina ion in 21 days, wi h no mal seeds; Olea eu opaea L. a s.
sa i a and syl es is, B o . 100% o ge mina ion in 10 days wi h isola ed emb yos; Philly ea la i olia L., 55% o
ge mina ion in 7 days wi h isola ed emb yos and Rhododend on pon icum subsp. bae icum (Boiss. & Reu e ) Hand-
Mazz. 90 % o ge mina ion in 30 days wi h no mal seeds. All he species conside ed ga e high pe cen age o su i ing
plan s (> 85%) when ansplan ed om in i o o ou side condi ions.
K.W.: seed, emb yo, p opaga ion, conse a ion, woody plan s
INTRODUCCIÓN
La ge minación de la semilla es el p ocedimien o mas ecuen e pa a p opaga las plan as
supe io es, y el que mejo asegu a el man enimien o (Khan, 1982) o incluso el aumen o de la
b
iodi e sidad (Palme e al., 1998). No obs an e, en algunas especies con in e és medioambien al, la
ge minación es muy escasa y len a con lo que se di icul a el p oceso de egene ación del bosque. La
b
aja espues a a la ge minación se asocia a enómenos de do mición seminal (Upadhyaya, y
N
igam,-S.N., 1999) elacionados con: (i) la p esencia de una cubie a ( es a o endoca po) ligni icada,
que ac úa como una ba e a mecánica en la salida del emb ión o en el in e cambio híd ico y gaseoso
(López-G anados y Ga cía-To es, 1996; Ba ne , 1997; Ca dina y Spa ow, 1997; Bandyopadhyay y
al., 1999) (ii) equilib ios ho monales en el endospe mo no a o ables pa a el desa ollo del emb ión
(Pin ield y Gwa azimba, 1992; Jinks,-R.L. and Cicca ese,-L., 1997; Benech-A nold,-R.L.; e al.,
1999) y (iii) des ases en e el p oceso de madu ación del u o y del emb ión (Cheplick 1992).
Pa a disminui la do mancia seminal y con ello a o ece la ge minación, algunos au o es
(B oscha , 1998) han u ilizado la semilla sin cubie a an o en semille o como en cul i o in i o.
O os au o es como Acebedo e al., 1997; Ma hys-Rochon e al., 1998; Can os e al., 1998),
ob u ie on aun mejo es esul ados po ge minación in i o del emb ión aislado, aunque obligándose
a u iliza una écnica mas compleja.
El p esen e abajo p e ende pone a pun o écnicas de cul i o in i o de semillas o emb iones
aislados que mejo en la ge minación de plan as con ele ado in e és ecológico en Andalucía, muchas
de ellas en pelig o de ex inción.
MATERIAL Y MÉTODOS
Ma e ial ege al.- Pa a el es udio de ge minación, se u iliza on semillas de las especies
ege ales: A opa bae ica (Wilk), Echinospa um algibicum (Tala e a-Apa icio),
J
unipe us
oxyced us (L) subespecies oxyced us y mac oca pa, La a e a ma i ima (Gouan), Olea eu opaea
a iedades sa i a y syl es is B o ., Philly ea la i olia (L) y Rhododend on pon icum (L), subespecie
bae icum. La elección de las especies a p opaga se hizo basándose en las siguien es ci cuns ancias:
Su ca ác e endémico y con ello su in e és como plan a o es al en Andalucía; su di icul ad de
ge minación en campo o po p ocedimien os con encionales y su si uación de especies en pelig o de
ex inción o en cla a eg esión.
Mé odos de ge minación: Pa a los ensayos de ge minación de cada especie, se u iliza on
semillas madu as ecolec adas en los siguien es luga es: A. bae ica, E. algibicum y L. ma i ima en el
Pa que Na u al de G azalema (Cádiz-Málaga); J. oxyced us subsp. oxyced us en la Ga gan a del Rio
Via en Cazalla de la Sie a y J. oxyced us subsp. mac oca pa en Cabo Roche, Conil de la F on e a
(Cádiz); O. eu opaea sa i a, de plan as no cul i adas exis en es en el Pa que Nacional de Doñana y O.
eu opaea syl es is de plan as que c ecen en el Pa que Nacional de Doñana y en los Pa ques Na u ales
Ma ismas del Odiel (Huel a) y Bahía de Cádiz (Cádiz); P. la i olia y R. pon icum subsp. bae icum del
Pa que Na u al de los Alco nocales (Cádiz-Málaga). Las semillas, limpias de es os de pulpa, se
conse a on du an e 3-4 meses a 4ºC, sal o en el caso de ob ención de emb iones que se u iliza on
di ec amen e. En el conjun o de las especies conside adas, aunque no en cada una de ellas ( abla 1), se
u iliza on los p ocedimien os de ge minación que a con inuación se indican:
i) ge minación en semille os.- Se semb a on semillas comple as y con P. la o olia semillas sin
cubie a en bandejas de PVC (≅ 7 cm de p o undidad) con subs a o húmedo de suelo (no malmen e
del luga de p ocedencia de la semilla) y u ba, en p opo ción 4:1 / , en cáma a de cul i o a 25ºC de
empe a u a, 111 µE/m-2·s-1 de iluminación y 16 h. de o ope íodo.
ii) Ge minación in i o.- En elación con la especie, se u iliza on semillas comple as,
esca i icadas, sin cubie a o emb iones aislados ( abla 1).
Una ez ex aída del u o la semilla comple a, se desin ec ó po una p ime a inme sión en
e anol 70-80%, du an e 5-10 segundos, seguida de o a mas p olongada (≅ 20 min.) en solución al
20% de NaOCl, del 3.5 % de clo o ac i o, a empe a u a de 40ºC y agi ación. A con inuación, las
semillas se la a on cuidadosamen e con agua des ilada es é il.
La esca i icación de las semillas se ealizó po ozamien o con papel de lija ino, as lo cual
se some ie on a la desin ección indicada mas a iba. La semilla sin cubie a (desnuda) se ob u o
seccionando és a con un co a ubos en las mas du as, o po p esión en las mas ágiles. Pa a el
aislamien o del emb ión, la semilla sin cubie a, p epa ada como se indicó an es, se puso en placa
Pe i con agua des ilada es é il, y así se incubó a 25ºC du an e 48h. Es o p odujo hinchazón y
eblandecimien o de los ejidos del endospe mo, lo que acili ó la ealización de co es la e ales en el
mismo, que deja on isible el emb ión, que se ex ajo ácilmen e con la pun a del bis u í.
Pa a su cul i o in i o, an o las semillas como los emb iones, se cul i a on en ubos de
ensayo es é iles de 21x150 mm con 8 ml de medio nu i i o en aga 0.7% y pH 5.7. Como medio
nu i i o se u ilizó el MS (Mu ashige y Skoog, 1962). Las condiciones de la cáma a de cul i o ue on
empe a u a de 25±1ºC, iluminación 30µE/m-2·s-1 y o ope íodo de 16 ho as de luz. El asplan e
desde in i o a condiciones ex e nas se ealizó según el mé odo p opues o po Can os e al. (1993).
RESULTADOS Y DISCUSIÓN
Como se indicó an es, en las p uebas ealizadas, en gene al, se aplicó el c i e io de i desde el
mé odo mas sencillo al mas so is icado has a ob ene esul ados sa is ac o ios ( abla 1). Con A.
b
ae ica, de acue do con Apa icio (1993), la ge minación ob enida con semillas comple as en semille o
ue baja (30%), lo que puede con ibui a su si uación de especie en pelig o de ex inción (He nández y
Clemen e, 1994). Po el con a io, cuando la semilla se cul i ó in i o en p esencia de ci oquinina, se
alcanzó un 100% de ge minación en 30 días. Es deci , esas condiciones ue on su icien es pa a
ompe o almen e la do mancia seminal.
Según Apa icio (1993) y Apa icio y Guisande (1995) la semilla de E. algibicum iene
p
oblemas de ge minación en campo, lo que unido a la ue e p esión de los umian es p o oca su
p
eca ia si uación. Po ello, po el bajo núme o de semillas disponibles y su pequeño amaño, sólo se
ealiza on p uebas con semillas no males y esca i icadas in i o. En ambos casos, se ob u ie on
esul ados posi i os ( abla 1) pe o no ablemen e mejo es cuando se esca i icó la co eza, lo que
a i icó la acción posi i a de las condiciones del cul i o in i o sob e la ge minación y signi icó la
impo ancia del in e cambio semilla-medio.
Ninguna de las dos subespecies de eneb o ge minó cuando se u iliza on semillas con cubie a,
an o en bandejas de ge minación como en condiciones de cul i o in i o, incluso a
Tabla 1
Tan os po cien o de ge minación ob enidos en las especies conside adas.
Plan a Ge minación
en semille o Ge minación in i o
Semilla con
cubie a Semilla con
cubie a Semilla con
cubie a Semilla sin
cubie a Emb ión
aislado
% Días % Días % Días % Días % Días
A
. bae ica 30 40 100 30 - - - - - -
E
. al
g
ibicum - - 40 30 100 30 - - - -
J. oxyced us
ox
y
ced us
0
365
0
365
-
-
10
45
49
45
J
. oxyced us
mac oca pa
0
365
0
365
-
-
15
45
50
45
L. ma i ima 60 20 76 21 - - - - - -
O.eu opea
s
a i a
37
300
-
-
-
-
60
40
100
10
O. eu opea
sy
l es is
40
300
-
-
-
-
60
40
100
10
P
. la i olia 0
(21) 365
(195) - - - - 55 7
un año desde la siemb a. Cuando se eliminó la cubie a, se ob u ie on algunos, an os po cien o de
ge minación ( abla 1), lo que deno ó la muy ue e in luencia de la es a en la do mancia seminal. Los
p
o cen ajes de ge minación aumen a on signi ica i amen e, alcanzándose en ambos casos
p
ác icamen e el 50%, cuando se u ilizó el emb ión aislado, lo que indicó a es e p ocedimien o, como
mas adecuado pa a educi la do mancia de la semilla.
L. ma i ima, ue la única especie en e las ensayadas que alcanzó un po cen aje ele ado de
ge minación po mé odos con encionales ( abla 1). No obs an e, mejo ó algo dicho po cen aje po
cul i o de la semilla in i o, aunque la mejo a no jus i icó el uso de una écnica mas so is icada.
Como se obse a en la abla 1, las dos subespecies de O. eu opaea mos a on ge minaciones
muy pa ecidas: Con la semilla con endoca po en bandejas, se ob u ie on alo es p óximos al 40% de
p
lán ulas y pa a ello se necesi ó p ác icamen e un año. Cuando se cul i a on in i o semillas ca en es
de endoca po, mejo ó algo el an o po cien o de ge minación y, especialmen e, se aco ó mucho el
iempo necesa io pa a ello ( abla 1). Es os esul ados pusie on cla amen e de mani ies o el e ec o
nega i o de la cubie a leñosa de la semilla (endoca po) en el p oceso ep oduc o del oli o. No
obs an e, los esul ados mas espec acula es se ob u ie on con el cul i o in i o del emb ión aislado.
Es deci , cuando el emb ión pe dió la in luencia del endoca po y del endospe mo, desapa eció
p
ác icamen e cualquie e ec o de do mancia.
Con P. la i olia al no ob ene se ge minación en bandejas con la semilla comple a, se ensayó la
semilla sin es a alcanzándose un 21% de plán ulas a los 195 días (núme os en e pa én esis en abla
1). El cul i o in i o de emb iones mejo ó algo el po cen aje de ge minación y, en especial, edujo
muy cla amen e el iempo necesa io pa a ello.
Debido al pequeño amaño (1.5 x 0.5 mm) y peso (~ 0.05 mg) de la semilla de ododend o,
que hacía muy di ícil su manipulación, solamen e se ealiza on p uebas con semillas comple as.
Cuando la siemb a se hizo a ni el de semille o adicional en bandeja sólo se log ó un 15% de
ge minación a lo 90 días. Po el con a io, cuando las semillas se cul i a on in i o, la ge minación
aumen ó has a el 90% en un iempo de an sólo 30 días.
Siguiendo el mé odo de Can os e al. 1993, con odas las especies conside adas se ob u ie on
p
o cen ajes ele ados de supe i encia (>85%) al asplan a las plán ulas desde in i o a condiciones
ex e nas
CONCLUSIONES
- Excep o L. ma i ima, las semillas comple as de odas las especies es udiadas p esen a on
g andes di icul ades pa a ge mina cuando se usa on p ocedimien os con encionales.
- En odos los casos, el cul i o in i o se mos ó como un mé odo muy e icaz pa a mejo a la
espues a a la ge minación, an o po aumen o del po cen aje de plán ulas ob enidas como po la
disminución del iempo necesa io pa a ello.
- La combinación en e el cul i o in i o y el uso, según los casos, de semillas esca i icadas, sin
cubie a o emb iones, demos ó se un sis ema muy e icaz pa a la ob ención de plán ulas de especies
amenazadas con in e és o es al en Andalucía. Es e hecho es de g an impo ancia pa a la mejo
conse ación de las mismas.
AGRADECIMIENTOS
R. pon icum
bae icum
15
90
90
30
-
-
-
-
-
-
Es a in es igación ha sido inanciada median e los p oyec os: CICYT AMB94-1372 y FEDER
1FD97-0743-CO3-03.
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