Obtenció d'un inòcul de microalgues enriquit amb aigua contaminada per nitrats i estudi de la presència de comunitats microbianes

Au o : Joan Pascó
Tu o del cen e: l ma Roig-Villano a
Tu o ex e n: Mi iam Gui e nau
8 / gene / 2021
T eball inal de g au
Enginye ia de Sis emes Biològics
OBTENCIÓ D’UN INÒCUL DE
MICROALGUES ENRIQUIT AMB AIGUA
CONTAMINADA PER NITRATS I ESTUDI DE
LA PRESÈNCIA DE COMUNITATS
MICROBIANES
1
Escola Supe io d’Ag icul u a de Ba celona
UPC - Ba celonaTech
Resum
En l’ac uali a , més de 20 milions de pe sones només enen accés a on s d’aigua indi iduals, sen
l’aigua sub e ània una de les p incipals on s escollides pel subminis amen a pe i a escala. Un
an pe cen ele a d’aques a es à con amina amb ni ells de ni a s supe io s al lími es able
de 50 mg NO3-/L (91/676/EEC) a causa de l’ús in ensiu d’adob des del sec o ag ícola i la mala
ges ió dels esidus o gànics p oceden s de les ac i i a amade es.
Els objec ius del p esen eball són la ca ac e i zació i quan i icació de les poblacions mic obianes
p esen s en cul ius ma es p oceden s de dos bio eac o s expe imen als del g up de ece ca
IDAEA. Aques s cul ius s’u ili za an pe gene a un inòcul de mic oalgues amb el que es p e én
inocula un o obio eac o a escala pilo dissenya pe edui els ni ells de NO3- d’aigües
sub e ànies con aminades.
Amb els cul ius ma e s’han du a e me un segui d’assajos amb l’objec iu de oba l’inòcul adien
capaç de eballa e icien men en on al es concen acions de ni a s. S’han obse a esul a s
posi ius pel que a a p oducció de biomassa de mic oalgues i c eació de bio ilm sob e di e en s
ma e ials. No s’ha de ec a una educció dels ni ells de ni a s signi ica i a.
S’han e ex ac es de DNA dels cul ius ma e. U ili zan el mè ode de PCR quan i a i a en emps
eal (qPCR) s’ha pogu quan i ica la població bac e iana, úngica i bac e iana desni i ican
exis en s. S’ha seqüencia llib e ies massi es u ili zan la pla a o ma MiSeq Illumina pe al de
classi ica axonòmicamen les poblacions de mic oo ganismes més p e alen .
Pel que a a la població de mic oalgues p esen en els cul ius ma e, des aquen els gène es
Chlo ella i Scenedesmus. El ílum P o eobac e ia domina àmpliamen en la població bac e iana. Un
cop gene a l’inòcul, s’ha de ec a un can i poblacional on el gène e de mic oalgues Kalenjinia
passa a p edomina en un 65% i el ílum bac e ià Bac e oide es en un 70%.
S’ha pogu inicia l’escala de l’inòcul de mic oalgues, pe ò no s’ha pogu a iba a inocula en el
o obio eac o a escala pilo a causa de la si uació excepcional p o ocada pe la pandèmia de la
COVID-19.
2
Resumen
En la ac ualidad, más de 20 millones de pe sonas sólo ienen acceso a uen es de agua
indi iduales, siendo el agua sub e ánea una de las p incipales uen es escogidas pa a el
suminis o a pequeña escala. Un an o po cien o ele ado de es a es á con aminado con ni eles
de ni a os supe io es al lími e es ablecido de 50 mg NO3-/L (91/676/EEC) debido al uso in ensi o
de abono desde el sec o ag ícola y a la mala ges ión de los esiduos o gánicos p oceden es de las
ac i idades ganade as.
Los obje i os del p esen e abajo son la ca ac e ización y cuan i icación de las poblaciones
mic obianas p esen es en cul i os mad es p oceden es de dos bio eac o es expe imen ales del
g upo de in es igación IDAEA. Es os cul i os se u iliza án pa a gene a un inóculo de mic oalgas
con el que se p e ende inocula un o obio eac o a escala pilo o diseñado pa a educi los
ni eles de NO3- de aguas sub e áneas con aminadas.
Con los cul i os mad e se han lle ado a cabo una se ie de ensayos con el obje i o de encon a el
inóculo adecuado capaz de abaja e icien emen e en e al as concen aciones de ni a os. Se
han obse ado esul ados posi i os en cuan o a p oducción de biomasa de mic oalgas y c eación
de bio ilm sob e di e en es ma e iales. No se ha de ec ado una educción signi ica i a de los
ni eles de ni a o.
Se han hecho ex ac os de DNA de los cul i os mad e. U ilizando el mé odo de PCR cuan i a i a en
iempo eal (qPCR) se han podido cuan i ica las poblaciones bac e ianas, úngicas y bac e ianas
desni i ican es exis en es. Se han secuenciado lib e ías masi as u ilizando la pla a o ma MiSeq
Illumina pa a clasi ica axonómicamen e las poblaciones de mic oo ganismos más p e alen e.
En cuan o a la población de mic oalgas p esen e en los cul i os mad e, des acan los géne os
Chlo ella y Scenedesmus. El ilo P o eobac e ia domina ampliamen e en la población bac e iana.
Una ez gene ado el inóculo, se ha de ec ado un cambio poblacional donde el géne o de
mic oalgas Kalenjinia pasa a p edomina en un 65% y el ilo bac e iano Bac e oide es en un 70%.
Se ha podido inicia el escalado del inóculo de mic oalgas pe o no se ha podido llega a inocula
en el o obio eac o a escala pilo o debido a la si uación excepcional p o ocada po la pandemia
de la COVID-19.
3
Escola Supe io d’Ag icul u a de Ba celona
UPC - Ba celonaTech
Abs ac
Cu en ly, mo e han 20 million people only ha e access o indi idual wa e sou ces, wi h
g oundwa e being one o he main sou ces chosen o small-scale supply. A high pe cen age o
his is con amina ed wi h ni a e le els highe han he es ablished limi o 50 mg NO3-/L
(91/676/EEC) due o he in ensi e use o e ilize om he ag icul u al sec o and he poo
managemen o o ganic was e om li es ock ac i i ies.
The objec i es o his s udy a e he cha ac e iza ion and quan i ica ion o he mic obial
popula ions p esen in mo he cul u es om wo expe imen al bio eac o s o he IDAEA esea ch
g oup. These cul u es will be used o gene a e a mic oalgae inoculum wi h which i is in ended o
inocula e a pilo -scale pho obio eac o designed o educe NO3- le els in con amina ed
g oundwa e .
Wi h he mo he cul u es, a se ies o es s ha e been ca ied ou in o de o ind he adequa e
inoculum capable o wo king e icien ly agains high concen a ions o ni a es. Posi i e esul s
ha e been obse ed ega ding he p oduc ion o mic oalgae biomass and he c ea ion o bio ilm
on di e en ma e ials. No signi ican educ ion in ni a e le els has been de ec ed.
DNA ex ac s ha e been made om he s ock cul u es. Using he quan i a i e eal- ime PCR
me hod (qPCR), i has been possible o quan i y he exis ing bac e ial, deni i ying bac e ial, and
ungal popula ion. Massi e lib a ies ha e been sequenced using he MiSeq Illumina pla o m o
axonomically classi y he mos p e alen mic oo ganism popula ions.
Rega ding he mic oalgae popula ion p esen in he mo he cul u es, he gene a Chlo ella and
Scenedesmus s and ou . The phylum P o eobac e ia domina es widely in he bac e ial popula ion.
Once he inoculum was gene a ed, a popula ion change has been de ec ed whe e he mic oalgae
genus Kalenjinia p edomina es by 65% and he bac e ial phylum Bac e oide es by 70%.
The scaling o he mic oalgae inoculum has been s a ed bu i has no been possible o inocula e
he pho obio eac o on a pilo scale due o he excep ional si ua ion caused by he COVID-19
pandemic.
4
Suma i
ÍNDEX DE FIGURES_________________________________________________________________ 6
ÍNDEX DE TAULES ________________________________________________________________ 10
SÍMBOLS I ACRÒNIMS _____________________________________________________________ 11
AGRAÏMENTS ___________________________________________________________________ 12
1. INTRODUCCIÓ ______________________________________________________________ 13
1.1. P oblemà ica ........................................................................................................................... 13
1.2. Cicle mic obià del ni ogen ..................................................................................................... 14
1.3. Solució p oposada ................................................................................................................... 16
2. OBJECTIUS _________________________________________________________________ 19
3. MATERIALS I MÈTODES ______________________________________________________ 20
3.1. Ob enció Cul iu Mix ................................................................................................................. 20
3.1.1. Recepció d’inòculs ma e (mic oalgues de o obio eac o ) i d’inòculs desni i ican s
(bio il e amb pèl·le s de su o i pèl·le s de us a p oceden d’un we land) ................... 20
3.1.2. Ca ac e i zació aigües de Pou ......................................................................................... 22
3.1.3. Assaig c ib a ge d’inòculs ................................................................................................ 23
3.1.4. Assaig c ib a ge de ma e ials .......................................................................................... 26
3.1.5. P epa ació inòcul Mix .................................................................................................... 28
3.1.6. Ob enció mos es cul ius de mic oalgues pu s i Cul iu Mix .......................................... 31
3.2. Tècniques de Biologia Molecula ............................................................................................ 33
3.2.1. Ex acció d’Àcids Nucleics ............................................................................................... 33
3.2.2. PCR quan i a i a en emps eal (qPCR) ........................................................................... 36
3.2.3. Nex Gene a ion Sequencing (NGS) ................................................................................ 37
3.2.4. Anàlisi es adís ica ............................................................................................................ 38
3.3. Taules Resum........................................................................................................................... 40
4. RESULTATS I DISCUSSIÓ ______________________________________________________ 43
4.1. Anàlisi isicoquímic de les aigües con aminades amb ni a s................................................. 43
4.2. C ib a ge d’inòculs de mic oalgues ......................................................................................... 44
4.3. C eació de bio ilm sob e clo u de poli inil (PVC) i polie ilè d'al a densi a (PEHD) .............. 47
4.4. P epa ació d’un inòcul de mic oalgues a escala de labo a o i ............................................... 49
4.5. Quan i icació de la població o al bac e iana, úngica i bac e iana desni i ican pe qPCR . 52

5
Escola Supe io d’Ag icul u a de Ba celona
UPC - Ba celonaTech
4.6. Ca ac e i zació de les comuni a s bac e ianes, úngiques i d’algues mi jançan
seqüenciació massi a. ............................................................................................................. 55
4.6.1. Es uc u a poblacional de la comuni a bac e iana ....................................................... 55
4.6.2. Es uc u a poblacional de la comuni a d’algues ........................................................... 61
4.6.3. Es uc u a poblacional de la comuni a úngica ............................................................. 63
CONCLUSIONS ___________________________________________________________________ 66
BIBLIOGRAFIA ___________________________________________________________________ 67
6
Índex de igu es
Figu a 1-1. Cicle mic obià del ni ogen amb les p incipals eaccions que hi succeeixen. (1) Fixació
del ni ogen gas. (2) Oxidació ae òbica de l’amoni pe bac e is i a queobac e is. (3) Oxidació
ae òbica del ni i . (4) Desni i icació. (5) Oxidació anae òbica d’amoni. (6) Reducció a amoni
de ni i s i ni a s. (Je en, 2008). _____________________________________________ 15
Figu a 1-2. (A) P esen ació del o obio eac o a escala pilo dissenya pe l’emp esa Nenupha (B)
Pous de llum lo an s (làmpades), en el o obio eac o a escala pilo de l’IRTA de To e
Ma imon. _______________________________________________________________ 18
Figu a 3-1. (A) Fo obio eac o del g up de ece ca IDAEA (CSIC), en iqui amb un cul iu de
mic oalgues. A la pa supe io del cilind e que o ma el o obio eac o es poden eu e les
esponges u ili zades com a supo pel c eixemen de les algues. (B) Bio eac o s del g up de
ece ca IDAEA (CSIC) amb una base de su o i pèl·le s de us a. ______________________ 21
Figu a 3-2. (A) Mos es pe duplica del cul iu de mic oalgues (esponges), (B) Mos es del il e de
su o (a, b i d). Pèl·le s del we land SALA GRAUPERA de San And eu de Lla ane es (c). ___ 22
Figu a 3-3. Els ca o ze ma assos disposa s en una sa a a al cos a de la ines a, el ma eix dia de
la se a inoculació. _________________________________________________________ 25
Figu a 3-4. Ti es eac i es de ni a s i Ni achek 404, a dal de la ima ge. A la pa d e a del
Ni achek es po eu e l’o i ici a on es col·loca la i a eac i a pe pode du a e me la
mesu a. _________________________________________________________________ 26
Figu a 3-5. (A) Els qua e ma e ials e alla s amb la o ma que els pe oca, segons la Taula 3-2 (B)
Ma às 1.1, el p ime dia de la se a inoculació amb els qua e ma e ials. ______________ 27
Figu a 3-6. (A) Caixa de polies i è amb egulació au omà ica de empe a u a i il·luminació 24 h. A
la esque a de la ima ge el mecanisme de egulació de empe a u a i al cen e la caixa de
polies i è. A la pa supe io de la apa de la caixa es oba la lluminà ia. (B) Els dos
ma assos al p ime dia desp és de la se a inoculació dins la caixa de polies i è. A l’esque a
7
Escola Supe io d’Ag icul u a de Ba celona
UPC - Ba celonaTech
de la o og a ia es po obse a l’en ada del sis ema de egulació de empe a u a. El o
a a onja és degu a la lluminà ia u ili zada. _____________________________________ 30
Figu a 3-7. Cul ius aïlla s de Oocys is (duplica ), Scenedesmus (duplica ) i Sellapho a. D’esque a a
d e a espec i amen . ______________________________________________________ 32
Figu a 3-8. (A) A l’esque a un mic o ub i a la d e a un Spin Fil e . (B) Al ons de la ima ge, el
Powe Soil TM DNA Isola ion ki (MO BIO Labo a o ies, Inc., Ca lsbad, CA). Da an , les
solucions C1, C2, C3, C4, C5 i C6, d’esque a a d e a. ______________________________ 34
Figu a 3-9. (A) Fo og a ia del pas núme o 2 de l’ex acció de DNA, u ili zan el Powe Soil TM DNA
Isola ion ki . B) Es po ap ecia com s’es à in oduin la solució C1 dins el ub Powe Bead
en ús d’una mic opipe a. La mos a en qües ió co espon al il e de su o. ___________ 35
Figu a 4-1. (A) Con ol i ma assos 1.1 (e ique a e da), 2.2 (e ique a a onja) i 6.1 (e ique a
blanca) d’esque a a d e a. (B) Con ol i ma assos 3.2 (e ique a osa), 4.2 (e ique a g oga) i
5.1 (e ique a bla a) d’esque a a d e a. (C) Con ol i ma assos 1.1 i 1.2 (e ique a e da) (D)
Con ol i ma assos 2.1 i 2.2 (e ique a a onja). No a: Fo og a ies p eses 9 dies desp és de la
inoculació. El con ingu dels di e en ma assos es à desc i en la Taula 4 2. ____________ 46
Figu a 4-2. Di e ses làmpades lo an s e es amb PEHD i PVC. __________________________ 48
Figu a 4-3. (A) Ma às 6.1, es po obse a la biomassa e da en suspensió, co esponen a les
mic oalgues. Des aca la p oducció de bio ilm en els ma e ials, p incipalmen en el PVC
anspa en de g uix 150 µm (Ce cle) (B) Ma às 6.1, biomassa en suspensió i bio ilm
enganxa a les pa e s del ma às. (C) Ma às 1.1, biomassa diposi ada en el ons del ma às.
_______________________________________________________________________ 49
Figu a 4-4. (A) Ma assos 1 i 2 dins la capsa de polies i è el ma eix dia de la se a inoculació. El o
a a onja de la ima ge e dona pe la lluminà ia dins la caixa. (B) Ma assos 1 i 2, una
se mana desp és de la inoculació. La o og a ia s’ha p es dins una campana de lux. No a:
Ma às 1, e ique a g oga (Medi CM); No a: Ma às 2, e ique a a onja (Medi CM + Aigua de
Pou CASA) _______________________________________________________________ 50
8
Figu a 4-5. Cap u a d’una o og a ia d’una mos a del cul iu de mic oalgues (Ma às 1.1) p esa
amb un mòbil. Obse ada amb un mic oscopi Leica DM IL In e ed Phase Con as
Mic oscope Type 090-135.001 a 40 augmen s. Es an assenyala s dos gène es d’algues,
Oocys is i Scenedesmus. ____________________________________________________ 51
Figu a 4-6. Resul a s de la quan i icació gènica de la població o al. Població bac e iana o al (16S
RNA); Població úngica o al (ITS RNA); Població bac e iana desni i ican (nosZ1). No a:
Inòcul esponges (M1); Fil e de su o (M2); Pèl·le s we lands (M6); Cul iu pu Scenedesmus
(B2); Cul iu pu Oocys is (B12); Cul iu pu Sellapho a (B23). La mos a de pèl·le s de we land
ha e de con ol pel que a a ni ells nosZ. ______________________________________ 53
Figu a 4-7. Compa ació - P opo ció: % de població úngica e s la població bac e iana o al i la
població bac e iana desni i ican s. la població bac e iana o al. No a: Inòcul esponges
(M1); Fil e de su o (M2); Pèl·le s we lands (M6); Cul iu pu Scenedesmus (B2); Cul iu pu
Oocys is (B12); Cul iu pu Sellapho a (B23). _____________________________________ 54
Figu a 4-8. Rep esen ació g à ica de l’índex de B ay-Cu is (be a-di e si a ) a ni ell de amílies
bac e ianes. No a: Inoculum CSIC, Co k il e i Mix cul u e TM co esponen a les mos es
d’esponges, il e de su o i Cul iu Mix espec i amen . ____________________________ 56
Figu a 4-9. Mapa de calo en el qual es ep esen a la elle ància de les classes bac e ianes
exis en s en cada mos a i la simili ud en e mos es. Degu a la manca de esul a s
signi ica ius, les mos es dels cul ius pu s, s’han exclòs de la següen ep esen ació. L’escala
de colo ( e mell-blau), indica la p e alença de cada classe. No a colo mos es: T iplica il e
de su o ( osa), T iplica inòcul esponges i Cul iu Mix ( e d), Aigua Pou REG, CASA i Pe pinyà
(blau). __________________________________________________________________ 57
Figu a 4-10. Rep esen ació g à ica del Índex de Chao1 (al a-di e si a ) espec e les OTUS
bac e ianes no mali zades. No a: Inoculum CSIC, Co k il e i Mix cul u e TM co esponen a
les mos es d’esponges, il e de su o i Cul iu Mix espec i amen . __________________ 58
Figu a 4-11. Resul a s de seqüenciació massi a de la de e minació de la comuni a bac e iana a
ni ell de amília. Les amílies s’han ag upa en el ílum i les classes més ep esen a i es.
No a: Les amílies ag upades en claus co esponen a es classes bac e ianes,
15
Escola Supe io d’Ag icul u a de Ba celona
UPC - Ba celonaTech
Figu a 1-1. Cicle mic obià del ni ogen amb les p incipals eaccions que hi succeeixen. (1) Fixació del ni ogen gas. (2)
Oxidació ae òbica de l’amoni pe bac e is i a queobac e is. (3) Oxidació ae òbica del ni i . (4)
Desni i icació. (5) Oxidació anae òbica d’amoni. (6) Reducció a amoni de ni i s i ni a s. (Je en, 2008).
Es poden di e encia dos ipus de mic oo ganismes ixado s de ni ogen: obem els bac e is no
simbiò ics en e els quals des aquen els pe anyen s al ílum Cyanobac e ia i els bac e is
mu ualis es com el gène e Rhizobium que iuen en associació amb plan es. Aques g ups de
bac e is se cen en p incipalmen en la ans o mació del ni ogen elemen al (N2) a compos os
més eac ius com l’amoni, ni i s i ni a s (NH4, NO2-, NO3- espec i amen ). En aques pas en
conc e , podem di e encia una sube apa en que s’oxida l’amoni a ni i , l’anomenem ni i icació.
Els o ganismes que pa icipen en la p ime a e apa de la ni i icació on s’oxida l’amoni i s’ob é
hid oxilamina (NH2 OH) són els bac e is i a queobac e is que oxiden l’amoni (ammonia-oxidizing
bac e ia, AOB i ammonia-oxidizing a chaea, AOA) (Figu a 1-1, 2). Des aquem el gène e
Ni osomonas i ílum C ena chaeo a, espec i amen . Aques a es epa es dona en condicions
ae òbiques, eque eix la p esencia d’oxigen. A con inuació, els bac e is co esponen s al gène e
Ni obac e ans o men el p oduc e de l’e apa an e io en ni a i ni a acaban així la ni i icació
(Sun e al., 2019).
Aques és l’eix cen al del cicle del ni ogen (Figu a 1-1, 3) on els ni i s i ni a s pod an se cap a s
àcilmen pe les plan es. També és el pun de màxima con aminació an opogènica a causa de
l’al a demanda de ni ogen en la amade ia i ag icul u a. Cal des aca que el ni a és el p incipal

16
componen de l’adob u ili za en les ac i i a s ag ícoles jun amen amb els esidus de la
amade ia. És en aques pun on el cicle s’es à sob eca egan i pe si sol no es po egula .
A con inuació obem la desni i icació (Figu a 1-1, 4), un dels p incipals p ocessos d’emissió
d’òxid ní ic (NO) i ni ós (N2O) a l’a mos e a. Aques pas el poden eali za una al a gamma de
mic oo ganismes els quals pa icipen al lla g de la educció del ni a ins a ni ogen gas (N2). Una
g an pa d’aques s o ganismes són acul a ius, és a di que no es an limi a s pe la p esència
d’oxigen en el medi, o i que la g an majo ia són anae òbics (poden iu e en absència d’oxigen).
No malmen , en la na u a quan es p odueix el p océs de desni i icació una g an a ie a de lo a
es à in oluc ada en el p océs (Tiedje, 1982).
Com es po in ui , el cicle del ni ogen és mol complex i hi pa icipen una g an di e si a de
mic oo ganismes amb una gamma de ca ac e ís iques i necessi a s enca a més amplia. Pe això,
quan s’in en a eballa en una de les e apes del cicle, s’ha de eni en comp e que no es eballa
amb un sol mic oo ganisme sinó amb l’associació d’un g an núme o d’ells. Cadascú é unes
necessi a s i eballa en unes ce es condicions. En la na u alesa, poques egades es oba à un sol
o ganisme duen a e me un p océs. No malmen oba em una associació en e múl iples
o ganismes on cada un pa icipa de di e en o ma i quan les condicions ambien als li són
a o ables.
1.3. Solució p oposada
En el p esen eball, es eballa à sob e una no a ècnica la qual u ili za un o obio eac o
jun amen amb un bio il e pe edui els ni ells de ni a s d’aigües sub e ànies con aminades. El
p ojec e en qües ió po a pe nom Li e Spo (LIFE18 ENV / ES / 000199) i és un p ojec e eu opeu
encomana al Ins i u de Rece ca i Tecnologia Ag oalimen à ies (IRTA) jun amen amb cinc socis
més.
El p ojec e Li e Spo é com a objec iu desen olupa un nou p océs de ac amen d’aigües capaç
d’elimina ni a s i mic ocon aminan s de les aigües sub e ànies con aminades pe p odui aigua
po able de bona quali a que compleixi els equisi s de la Di ec i a 98/83/CE. Des del
depa amen de Ges ió In eg al de Residus O gànics (GIRO), ubica a les ins al·lacions de l’IRTA de
To e Ma imon, he pa icipa en l’e apa inicial del p ojec e del qual ac a el p esen eball.
17
Escola Supe io d’Ag icul u a de Ba celona
UPC - Ba celonaTech
L’objec iu p incipal del eball és l’ob enció d’un inòcul de mic oalgues u ili za pe ac a aigües
de pou con aminades amb al s alo s de ni a s i inocula -lo en un o obio eac o a escala pilo . A
con inuació, es a una b eu explicació de les ca ac e ís iques del o obio eac o en qües ió:
El u u o obio eac o cons a à d’un inòcul de mic oalgues i es a à en iqui amb aigua
sub e ània con aminada amb al s ni ells de ni a s. L’objec iu és es abli un conso ci en e
mic oo ganismes i mic oalgues el qual pugui edui l’al a concen ació de ni a s. L’e luen del
o obio eac o passa à a un bio il e el qual ind à la unció de edui els ni a s i
mic ocon aminan s es an s. Dins del il e, s’espe a una al a concen ació de comuni a s
bac e ianes desni i ican s.
El o obio eac o ha es a dissenya pe l’emp esa ancesa Nenupha (Figu a 1-2, A) que ha
desen olupa un inno ado p océs de cul iu de mic oalgues el qual es compon de pous de llum
lo an s que cap u en i di onen la llum al lla g de o el eac o . Aques a ecnologia augmen a
signi ica i amen el endimen de la p oduc i i a o osin è ica del cul iu de mic oalgues. El
p o o ip a escala pilo cons a d’un cilind e amb un olum especí ic de 300L el qual eballa en
con inu i amb biomassa en suspensió.
Les làmpades lo an s s’omplen amb aigua pe acili a la di usió de la llum ins a la pa in e io
del o obio eac o (Figu a 1-2, B). Pe un e ec e de ò ex o igina amb una bomba hid àulica es
c ea una co en en con a de les agulles del ello ge amb la qual s’assegu a de dis ibui la llum a
quasi la o ali a del eac o , alho a s’agi a el cul iu. Amb un di uso s’ai eja el cul iu des de la pa
in e io del bio eac o , pa al·lelamen s’in odueix CO2 al cul iu pe supli la demanda de ca boni
de les mic oalgues.
18
Figu a 1-2. (A) P esen ació del o obio eac o a escala pilo dissenya pe l’emp esa Nenupha (B) Pous de llum lo an s
(làmpades), en el o obio eac o a escala pilo de l’IRTA de To e Ma imon.
19
Escola Supe io d’Ag icul u a de Ba celona
UPC - Ba celonaTech
2. Objec ius
L’objec iu gene al del p ojec e en el que s’emma ca el p esen eball de inal de g au és
l’ob enció d’un inòcul de mic oalgues u ili za pe ac a aigües de pou con aminades amb al s
alo s de ni a s i inocula -lo en un o obio eac o a escala pilo .
Pe a assoli -lo, s’han plan eja els següen s objec ius conc e s:
 Ca ac e i zació isicoquímica d’aigües con aminades amb les quals s’en iqui à l’inòcul.
 Reali zació d’un assaig de p oducció de biomassa a pa i dels cul ius ma e de
mic oalgues (cul ius p oceden s de bio eac o s expe imen als).
 Reali zació d’un assaig de p oducció de bio ilms sob e di e en s ma e ials a pa i dels
cul ius ma e de mic oalgues.
 Ob enció, escala i ca ac e i zació mic oscòpica d’un inòcul de mic oalgues.
 Ca ac e i zació i quan i icació molecula de les comuni a s bac e ianes, úngiques i
d’algues p esen s en els cul ius ma es u ili za s pe p odui l’inòcul de mic oalgues.
20
3. Ma e ials i Mè odes
Al lla g del p esen eball s’han ob ingu un segui de mos es biològiques les quals s’han u ili za
amb l’objec iu d’ob eni un inòcul de mic oalgues u ili za pe ac a aigües de pou con aminades
amb al s alo s de ni a s. Pa aconsegui aques objec iu, s’han dissenya un segui d’assajos pe
al d’anali za el c eixemen de les mic oalgues i la p oducció de bio ilm sob e di e en s ma e ials
(apa a 3.1..3 i 3.1.4. espec i amen ) en sis inòculs di e en s. Un cop con i ma el bon
c eixemen de les mic oalgues, s’ha escolli un inòcul (Cul iu Mix ) pe escala -lo i ob eni
biomassa su icien pe pode inocula el o obio eac o Li e Spo .
Pa al·lelamen , s’han e ex ac es de DNA de les mos es biològiques (apa a 3.2.1.) i s’han
quan i ica i ca ac e i za les comuni a s mic obianes p esen s pe qPCR i Seqüenciació Massi a
(apa a 3.2.2. i 3.2.3. espec i amen ). Els esul a s ob ingu s han pe mès en end e en g an de all
quins bac e is, ongs i algues p edominen en les mos es ac ades.
A con inuació es de alla els ma e ials i la me odologia u ili zada pe du a e me els assajos i les
anàlisis e es al lla g del eball.
3.1. Ob enció Cul iu Mix
3.1.1. Recepció d’inòculs ma e (mic oalgues de o obio eac o ) i d’inòculs
desni i ican s (bio il e amb pèl·le s de su o i pèl·le s de us a p oceden d’un
we land)
L’ Ins i u de Diagnòs ic Ambien al i Es udis de l'Aigua (IDAEA) el qual pe any al Consell Supe io
d'In es igacions Cien í iques (CSIC) ha acili a mos es en duplica del cul iu de mic oalgues
p o inen s d’un o obio eac o el qual u ili za esponges com a mè ode de supo pe acili a la
p oli e ació de les mic oalgues. Les mos es p oceden s d’un segon eac o , el qual ec ea un il e
na u al o ma pe su o i pèl·le s de us a, ambé han es a subminis ades en iplica . Aques
úl im bio eac o es à en iqui amb l’e luen del p ime . L’aigua amb què s’ha es a en iquin els
dos eac o s é una concen ació ap oximada de 200 mg/L de ni a s (Figu a 3-1).

21
Escola Supe io d’Ag icul u a de Ba celona
UPC - Ba celonaTech
Figu a 3-1. (A) Fo obio eac o del g up de ece ca IDAEA (CSIC), en iqui amb un cul iu de mic oalgues. A la pa supe io
del cilind e que o ma el o obio eac o es poden eu e les esponges u ili zades com a supo pel
c eixemen de les algues. (B) Bio eac o s del g up de ece ca IDAEA (CSIC) amb una base de su o i pèl·le s
de us a.
Amb l’objec iu de eni un pun de e e ència pel que a a comuni a s bac e ianes desni i ican s,
s’han ecupe a pèl·le s de us a del we land SALA GRAUPERA de San And eu de Lla ane es,
ob ingu s d’un p ojec e an e io (CLEANLEACH ECO/12/332862 i del DEMO CLEANLEACH)
(Pelissa i e al., 2018).
22
Figu a 3-2. (A) Mos es pe duplica del cul iu de mic oalgues (esponges), (B) Mos es del il e de su o (a, b i d). Pèl·le s
del we land SALA GRAUPERA de San And eu de Lla ane es (c).
S’han ob ingu aliquo as de les mos es dels eac o s del CSIC en ubs alcon de 50 mL (Figu a 3-2)
pe a se gua dades a la ne e a a 4 ºC amb l’objec iu de p ese a -les en les millo s condicions
possibles.
3.1.2. Ca ac e i zació aigües de Pou
De les ins al·lacions de l’IRTA de To e Ma imon s’han mos eja dos pous (Pou CASA i Pou REG) i
una bassa (Bassa G an) u ili za s pe ac i i a s d’ag icul u a local. S’han ob ingu mos es de dos
pous di e en s, un de Pe pinyà (Pou Pe pinyà) i l’al e de Cas elló (Pou Cas elló), en iades pe les
emp eses NENUFAR i FACSA espec i amen . Ambdues emp eses són sòcies del p ojec e Li e
Spo .
Les mos es d’aigües de Pe pinyà i Cas elló han a iba en bidons i s’han aga a 3 alíquo es de cada
mos a en ubs alcon de 50 mL. Pel que a les aigües de pou de To e Ma imon (Caldes de
Mon bui) s’han mos eja ap oximadamen 25 li es del Pou CASA, Pou REG i Bassa G an de o ma
indi idual. S’han aga a alíquo es en ubs alcon de 50 mL pe al d’agili za la se a manipulació.
To es les aigües de pou s’han il a pe iplica amb els po a il es swinnex i il es d’ace a de
cel·lulosa de 0,2 m i xe ingues es è ils, on cada un dels il es s’han gua da al congelado (-20
ºC).
23
Escola Supe io d’Ag icul u a de Ba celona
UPC - Ba celonaTech
S’ha du a e me una anàlisi isicoquímica de les mos es d’aigua del Pou CASA, Pou REG i Pe pinyà
des del se ei d’analí iques del GIRO (IRTA). La me odologia emp ada es à p esen ada en la Taula
3-1.
Taula 3-1. Me odologia u ili zada en l’anàlisi isicoquímica de les mos es d’aigua du a e me des del se ei d’analí iques
del GIRO (IRTA).
Mesu a
Uni a s
Me odologia
Amoni (NH4+)
mg/L
NIOSH 6015 (Espec oscòpia ul a iolada)
Anions (NO3-, NO2-, PO43-)
mg/L
IT-MA-009 S anda d Me hods 4110 B. (C oma og a ia
de bescan i iònic)
Conduc i i a (20 ºC)
µS/cm
IT-MA-004 UNE-EN 27888:1994 (Conduc ome ia)
pH
pH
IT-MA-003 S anda d Me hods 4500- H+ B
(Conduc ome ia)
Cl-, Ca2+, Mg2+, Na+ i SO42-
mg/L
AMIC
3.1.3. Assaig c ib a ge d’inòculs
S’han u ili za els cul ius ma es ob ingu s dels eac o s del CSIC pe al de p odui 6 inòculs de
mic oalgues en iqui s amb les aigües sub e ànies p oceden s dels e enys de To e Ma imon.
S’espe a e una p ime a ap oximació pe oba el millo inòcul pel que a a c eixemen de les
mic oalgues en on de ni ells de ni a s ele a s i es udia la possible educció del compos en
qües ió. A con inuació es de alla la me odologia i ma e ials u ili za s pe du a e me l’assaig.
S’han p epa a ca o ze E lenmeye s de 125 mL, dos pe cada un dels sis inòculs ob ingu s. En el
p ime s’han in oduï 0,5 mL d’inòcul i s’han a egi 24,5 mL d’aigua (Pou REG). El segon s’ha diluï
1:3 pe al de edui la concen ació de 450 a 150 mg/L NO3-, s’ha a egi 0,5 mL d’inòcul, 16,34 mL
d’aigua (Pou REG) i 8,16 mL d’aigua MillliQ. L’assaig ha comp a amb dos con ols nega iu (sense
inòcul) que con enen 31 mL d’aigua (Pou REG). A con inuació, s’exposa com s’ha ob ingu els sis
nous inòculs:
24
Inòcul 1: S’ha aga a dues esponges i 4 mL de la suspensió en la qual es oben les esponges. To
s’ha diposi a en un nou ub alcon i ha es a comple a amb 30mL d’aigua (Pou REG).
Pos e io men s’ha agi a ( ò ex a màxima eloci a 5 minu s) i s’ha ecupe a el sob enedan (el
líquid amb pa ícules en suspensió). Amb l’inòcul 1, s’han inocula els ma assos 1.1 i 1.2.
Inòcul 2: S’ha aga a dues esponges i 4 mL de la suspensió en què es oba en. S’ha a egi 1 g del
ma e ial del il e de su o. To s’ha col·loca en un ub alcon nou i s’ha comple a amb 30 mL
d’aigua (Pou REG). S’ha agi a ( ò ex a màxima eloci a 5 minu s) i s’ha ecupe a el
sob enedan . Amb l’inòcul 2 s’han inocula els ma assos 2.1 i 2.2.
Inòcul 3: S’han aga a 30 mL d’aigua (Pou CASA) en un ub alcon nou. Amb l’inòcul 3 s’han
inocula els ma assos 3.1 i 3.2.
Inòcul 4: S’han aga a 15 mL d’aigua (Bassa G an) i 15 mL d’aigua (Pou REG) en un ub alcon nou.
S’ha homogeneï za manualmen . Amb l’inòcul 4 s’han inocula els ma assos 4.1 i 4.2.
Inòcul 5: S’han col·loca en un ub alcon 15 mL de l’inòcul 3 i 15 mL de l’inòcul 4. S’ha agi a
( ò ex) i el sob enedan s’ha ecupe a . Amb l’inòcul 5 s’han inocula els ma assos 5.1 i 5.2.
Inòcul 6: S’ha aga a dues esponges i 4mL de la suspensió en què es oba en. S’ha a egi 1 g dels
pèl·le s del we land. To s’ha col·loca en un ub alcon nou i s’ha comple a amb 30mL d’aigua
(Pou REG). S’ha agi a ( ò ex a màxima eloci a 5 minu s) i s’ha ecupe a el sob enedan . Amb
l’inòcul 6 s’han inocula els ma assos 6.1 i 6.2.
S’han es e ili za els ma assos apa s amb aps de co ó i gasa. L’ampolla on es gua da l’aigua de
Bassa Reg i la p o e a amb la qual s’in odui à l’aigua han es a es e ili zades jun amen amb els
ca o ze ma assos (amb el ap inclòs). L’es e ili zació s’ha du a e me amb un au oclau, a 121 ºC i
1 Ba .
To els inòculs s’han p epa a dins d’una i ina de lux lamina (Tels a ) i s’han col·loca en una
sa a a de plàs ic blanca a empe a u a ambien . La sa a a amb els ma assos s’ha deixa al cos a
d’una ines a pe al de subminis a les màximes ho es de llum na u al. To s’ha man ingu a una
empe a u a ambien d’ap oximadamen 20 ºC amb un cicle de llum/ osco de 12:12 ho es. Els
ma assos s’han agi a manualmen un cop al dia (Figu a 3-3).
31
Escola Supe io d’Ag icul u a de Ba celona
UPC - Ba celonaTech
Taula 3-4. Volums dels componen s u ili za s en el mun a ge dels nous cul ius de mic oalgues (Ampolla 1 i Ampolla 2)
jun amen amb el man enimen dels dos p ime s cul ius (Ma às 1 i Ma às 2). ). L’inòcul de mic oalgues
u ili za en els nous cul ius p o é dels Ma assos 1 i 2.
Componen s
Uni a s
Ma às 1
(Man enimen )
Ma às 2
(Man enimen )
Ampolla 1
Ampolla 2
Inòcul
mic oalgues
mL
-
-
5
5
Aigua Pou CASA
mL
50
50
100
200
Medi cul iu CM
mL
50
50
100
200
Mic onu ien s
µL
-
-
200
200
Degu a les condicions ad e ses p o ocades pe la pandèmia de la COVID-19 l’escala del Cul iu
Mix no ha es a possible dins del e mini habili a pe eballa a les ins al·lacions de l’IRTA de
To e Ma imon.
3.1.6. Ob enció mos es cul ius de mic oalgues pu s i Cul iu Mix
A pa i de l’inòcul de mic oalgues Cul iu Mix , des de l’IRTA de San Caldes de la Ràpi a, s’han
aïlla es cul ius pu s de mic oalgues co esponen s als gène es Scenedesmus, Oocys is i
Sellapho a.
Els cul ius han a iba en e lenmeye s de 250 mL a empe a u a ambien . Pos e io men , s’han
aga a mos es en mic o ubs d’1 mL i s’han cen i uga du an 5 minu s a 20000 g. El sob enedan
esul an s’ha desca a i les mos es s’han gua da al congelado (-20 ºC). S’ha p ocedi de la
ma eixa o ma amb la mos a del Cul iu Mix .

32
Figu a 3-7. Cul ius aïlla s de Oocys is (duplica ), Scenedesmus (duplica ) i Sellapho a. D’esque a a d e a espec i amen .
33
Escola Supe io d’Ag icul u a de Ba celona
UPC - Ba celonaTech
3.2. Tècniques de Biologia Molecula
3.2.1. Ex acció d’Àcids Nucleics
Amb l’objec iu d’anali za les mos es a ni ell molecula , s’ha du a e me una ex acció de DNA.
S’han du a e me ex ac es d’un o al de quinze mos es; inòcul esponges CSIC (pe iplica ),
il e de su o CSIC (pe iplica ), aigües dels qua e pous ac a s (Pou CASA, Pou REG, Pou
Pe pinyà i Pou Cas elló), pèl·le s de us a de we land, Cul iu Mix i els es cul ius pu s de
mic oalgues (Scenedesmus, Oocys is i Sellapho a).
S’ha u ili za un p o ocol adap a de Powe Soil TM DNA Isola ion ki (MO BIO Labo a o ies, Inc.,
Ca lsbad, CA), pe e l’ex acció. El p ocedimen es basa a ex eu e el DNA de les mos es
u ili zan un il e de sílice on mi jançan l’ús d’un segui de solucions el DNA s’hi queda à ixa i la
es a de ma e ial se à elimina .
A con inuació es desc iuen el con ingu i p opie a s de les solucions u ili zades en el ki d’ex acció
(Figu a 3-8, B):
 Solució C1: Con é SDS (dodecilsul a sòdic) i al es agen s dis up o s cel·lula s,
necessa is pe du a e me la lisis cel·lula .
 Solució C2: Con é un eac iu que a p ecipi a el ma e ial o gànic i ino gànic a excepció
del DNA.
 Solució C3: Un segon eac iu amb la ma eixa unció que la solució C2.
 Solució C4: Solució salina al amen concen ada. Assegu a la co ec a inculació del
DNA al il e de sílice i e i a que ho aci el ma e ial o gànic o ino gànic que enca a no
ha es a elimina .
 Solució C5: Amb una base d’e anol. Té com ha objec iu ne eja el DNA que ha queda
enganxa al il e de sílice.
 Solució C6: Bu e d’elució sense sals, sepa a el DNA del il e de sílice.
Els passos pe e l’ex acció han es a els següen s:
1. Descongela les mos es a 4 ºC du an ap oximadamen 30 minu s (en gel).
2. P epa ació de la quan i a de mos a u ili zada pe l’ex acció:
 Mos es sòlides: Col·loca 0,25g de la mos a en el ub Powe Bead (pe les
mos es d’esponges, il e de su o i pèl·le s, Figu a 3-9).
 Mos es líquides: En el cas de les aigües de pou, es posa à el esul a de il a
30 ml de les mos es (el il e s’in odui à di ec amen al ub Powe Bead).
34
 Mos es sòlides en o ma de p ecipi a : Pel Cul iu Mix i els cul ius pu s de
mic oalgues, el p ecipi a es esuspend à aplican 60 µl de la solució C1
di ec amen al mic o ub d’un mil·lili e en què es oba a la mos a. Un cop el
p ecipi a s’hagi esuspès es aspassa à o el con ingu al ub Powe Bead.
3. A egi 60 µl de la solució C1 i agi a manualmen (Aques pas no es a à pe la mos a
del Cul iu Mix i cul ius pu s, ja que ja s’ha du a e me p è iamen ). En cas que la
solució hagi p ecipi a , escal a -la a 60 ºC ins que es dissolguí comple amen .
4. Ba eja amb el ò ex (amb els ubs Powe Bead disposa s de o ma ho i zon al) a la
màxima eloci a du an 10 minu s.
5. Cen i uga el ub a 10000 g du an 30 segons.
6. T ans e i el sob enedan a un mic o ub nou (no sob epassa 500 µL de sob enedan ).
7. A egi 250 µL de la solució C2. Ba eja amb el ò ex du an 5 segons i incuba a 4 ºC
du an 5 minu s.
8. Cen i uga el ub a 10000 g du an 30 segons.
9. E i an el p ecipi a o ma , ans e i no més de 600 µL del sob enedan a un
mic o ub nou.
10. A egi 200 µL de solució C3. Ba eja amb el ò ex àpid (En e 1 i 3 segons, pe al
d’homogeneï za ). En aques pas, més emps de ò ex, pod ia enca les cadenes del
DNA. Incuba a 4 ºC du an 5minu s.
11. Cen i uga el ub a 10000 g du an 30 segons.
12. E i an el p ecipi a o ma , ans e i no més de 750 µL del sob enedan a un
mic o ub nou.
Figu a 3-8. (A) A l’esque a un mic o ub i a la d e a un Spin Fil e . (B) Al ons de la ima ge, el Powe Soil TM DNA Isola ion
ki (MO BIO Labo a o ies, Inc., Ca lsbad, CA). Da an , les solucions C1, C2, C3, C4, C5 i C6, d’esque a a
d e a.
13. A egi 1200 µL de la solució C4 i ò ex du an 5 segons.
35
Escola Supe io d’Ag icul u a de Ba celona
UPC - Ba celonaTech
14. Ca ega ap oximadamen 675 μL en un Spin Fil e (Figu a 3-8, A) i cen i uga a 10.000
g du an 1 minu , desca a el con ingu il a . A egi 675 μL addicionals de
sob enedan al Spin Fil e i o na a cen i uga a 10.000 g du an 1 minu , desca a el
con ingu il a . A egi el sob enedan es an al Spin Fil e i cen i uga a 10.000 g
du an 1 minu , desca a el con ingu il a . (Pe cada mos a se an necessà ies 3
cà egues de sob enedan al Spin Fil e ).
15. A egi 500 µL de la solució C5 al Spin Fil e i cen i uga a 10000 g du an 30 segons.
Desca a el con ingu il a .
16. To na a cen i uga a 10000 g du an 30 segons.
17. Amb cu a, col·loca el Spin Fil e dins un mic o ub nou.
18. A egi amb mol de comp e 100 µL de la solució C6 al cen e del Spin Fil e .
19. Cen i uga a 10000 g du an 30 segons.
20. Desca a el Spin Fil e . El DNA esul an ja es à p epa a pe se anali za .
Figu a 3-9. (A) Fo og a ia del pas núme o 2 de l’ex acció de DNA, u ili zan el Powe Soil TM DNA Isola ion ki . B)
Es po ap ecia com s’es à in oduin la solució C1 dins el ub Powe Bead en ús d’una mic opipe a. La
mos a en qües ió co espon al il e de su o.
Els ex ac es de DNA ob ingu s han es a emmaga zema s a -20 ºC pe pode se u ili za s
pos e io men .
36
3.2.2. PCR quan i a i a en emps eal (qPCR)
S’ha du a e me un o al de es eaccions en cadena de la polime asa en emps eal (qPCR), una
pe cada gen en qües ió (16S RNA, nosZ i ITS1 RNA). Les mos es d’esponges (M1) i il e de su o
(M2) han es a anali zades en iplica s u ili zan es ex accions de DNA independen s ( èpliques
biològiques). De les mos es es an s; dels qua e pous (Pou REG, Pou CASA, Pou Pe pinyà i Pou
Cas elló), pèl·le s de us a (M6) i cul ius d’algues pu s (B2, B12 i B23) només s’han du a e me una
única anàlisi, en comp es d’anali za -les en iplica .
Pe du a e me l’anàlisi s’ha u ili za un equip de PCR en emps eal MX3000-P (S a agene)
emp an la qPCR Mas e Mix B illian II SYBR® G een (S a agene, La Jolla, CA) amb els p o ocols
desc i s p è iamen a Calde e e al., 2014 i P ena e a-Boldú e al., 2012. Les ca ac e ís iques de
les eaccions s’exposen a con inuació: 10 minu s a 95 ºC, segui de 40 cicles de desna u ali zació a
95 ºC du an 30 segons, hib idació du an 30 segons a 50, 55 i 62 ºC (pe a 16S RNA, ITS1 RNA i
nosZ espec i amen ), elongació a 72 ºC du an 45 segons i mesu a de luo escència a 80 ºC.
Amb l’objec iu de de ec a la p esència de díme s dels encebado s, l’anàlisi de la co ba de mel ing
s’ha du a e me desp és de la ase inal d’elongació augmen an la empe a u a de 55 ins a 95 ºC
amb una à io d’escal amen de 0,05 ºC pe cicle. Cada eacció s’ha p oduï en un olum de 10 µL.
1 µL de DNA mo lle i 9 µL de mix de la eacció que con é 5 µL de Mas e Mix amb Syb G een,
dNTPs i el bu e , 200 nM de cada encebado (“ o wa d” i” e e se”) i 30 nM del luo ò o de
e e ència ROX ( o s els eac ius i ungible són de quali a molecula PCR clean).
El se d’encebado s pe la població bac e iana 16S són 519F (5’_ GCC AGC AGC CGC GGT AAT_3’) i
907R (5’_CCG TCA ATT CCT TTG AGT TT_3’) p oposa s pe Lane, 1992. Pe la població úngica,
ITS5F (5’_ GGA AGT AAA AGT CGT AAC AAG G_3’) i ITS2R (5’_ GCT GCG TTC TTA TCG ATG C_3’)
(Bellemain e al., 2010). Pel que a al gen nosZ, el pa ell d’encebado s són el nosZF (5’_WCS YTG
TTC MTC GAC AGC CAG_3’) i nosZR (5’_ATG TCG ATC ARC TGV KCR TTY TC_3’) (Hen y e al., 2006).
Pe eali za les co bes de calib a ge, els es ànda ds de e e ència s’han p epa a basan -se en els
gens de e e ència següen s: el gen 16S RNA de Desul o ib io ulga is subsp. ulga is ATCC
29579, inse i en un ec o TOPO TA (In i ogen, Me elbeke, Belgium); el gen ITS1 p o inen
d’una banda de DGGE (Gen-Bank accession no. JN982550) clonada en el ec o plasmidi PGEM,
u ili zan pGEM-T Easy Vec o Sys em I (P omega, Madison, WI); i el gen nosZ, ob ingu de

37
Escola Supe io d’Ag icul u a de Ba celona
UPC - Ba celonaTech
Pseudomonas luo escens DSM 50415, clonada amb el ma eix mè ode que el gen ITS1. Pe
eali za la co ba de calib a ge s’ha eali za un banc de dilucions de cada un d’ells els quals an de
101 a 108 còpies gèniques pe eacció i han es a quan i ica pe duplica .
Els pa àme es de quali a de les eaccions de qPCR es an basa s en les indicacions MIQE
(Annesley e al., 2009) on el coe icien de co elació ha de se > 98%, la penden ha de onda -
3.35 i l’e iciència de la eacció ha d’es a en e 90-110%. To es les eaccions eali zades han
comple s els pa àme es es able s.
Els passos pe e la qPCR han es a els següen s: Abans de comença , descongela les mos es de
DNA a 4 ºC pe al d’elimina la o ali a del gel o ma du an l’emmaga zema ge a -20 ºC. També
cal descongela els pa ons, els encebado s, el ROX i la Mas e Mix.
1. P epa ació de la Mix: Dins la campana de lux, u ili zan una mic opipe a amb pun es
de doble il e, disposa les quan i a s co esponen s de H2O, encebado di ec a,
encebado complemen a i, Mas e Mix i ROX dins una ma eix mic o ub d’1 mL.
2. Un cop e a la Mix, diposi a 9 µL de la solució mix a cada pou de la placa de 96 pous
que es a à se i pe quan i ica les mos es.
3. Diposi a 1 µL de cada mos a i els pa ons gènics de e e ència dins el pou que li
co espongui.
4. Seguidamen , col·loca la apa de plàs ic p o ec o a de quali a òp ica sob e la placa de
96 pous, pe e i a que la mescla de Mix i DNA no s’e apo i du an la qPCR.
5. Finalmen , diposi a la placa dins la qPCR. Tanca l’apa ell i inicia el p og ama è mic
co esponen .
Aques p océs s’ha epe i pe igual amb les qPCR de 16S RNA, nosZ i ITS1 RNA, pe ò s’han
u ili za els encebado s co esponen s pe cada eacció.
3.2.3. Nex Gene a ion Sequencing (NGS)
La seqüenciació massi a s’ha du a e me amb la pla a o ma MiSeq Illumina des del Molecula
Resea ch MR DNA Labo a o y (Shallowa e , TX, USA).
Els encebado s u ili za s pe c ea les llib e ies genè iques són els següen s: Pe les llib e ies de
Bac e ia 16S RNA, V3_F357_N-F (5'_CCT ACG GGN GGC WGC AG_3’) i V4_R805-R (5'_GAC TAC
HVG GGT ATC TAA TCC_3’); Pe la de ongs, els encebado s ITS3-F (5′_GCA TCG ATG AAG AAC GCA
38
GC_3′) i ITS4-R: (5′_TCC TCC GCT TAT TGA TAT GC_3’): Pe les algues, s’ha u ili za els encebado s
eukV4-F (5’_CCA GCA SCY GCG GTA ATT CC_3’) i zigEukV4-R (5’_ACT TTC GTT CTT GAT YRA
TGA_3’).
Les lec u es inals p oceden s del seqüenciado MiSeq s’han compila en i xe s FASTq, pe
pe me e un p ocessamen bioin o mà ic pos e io . Les seqüències ob ingudes han es a
e allades u ili zan el p og ama i QIIME e sió 1.8.0 (Capo aso e al., 2010). Les quime es han
es a eliminades jun amen amb e o s de lec u a. S’ha eali za un il a ge de quali a de les
lec u es ob ingudes a Q25, abans de du a e me l’ag upació en Uni a s Taxonòmiques Ope a i es
(OTU) amb un all del 97% o supe io d’homologia en e seqüències. To a aques il a ge s’ha du
a e me des del Molecula Resea ch MR DNA Labo a o y (Shallowa e , TX, USA).
A con inuació, des de l’IRTA de To e Ma imon, les OTU han es a classi icades axonòmicamen
mi jançan BLASTn (P og ama in o mà ic d'alineamen de seqüències d’ADN i p o eïnes) en e s
G eenGenes i la base de dades Ribosomal Da abase P ojec (RDP)(Bayesian Classi ie ) aplican un
boos s ap >80%. El esul a ha pe mès classi ica o es les OTU esul an s en cada ni ell
axonòmic (de ílum cap en da an ). U ili zan el p og ama de ull de càlcul Excel, els esul a s en
o ma d’OTU s’han anali za i classi ica eballan amb abundàncies ela i es. Finalmen , els
esul a s ob ingu s s’han ep esen a g à icamen amb el p og ama i Sigma Plo .
3.2.4. Anàlisi es adís ica
Amb l’objec iu d’a alua la di e si a poblacional de les mos es, s’ha calcula els alo s d’al a
di e si a (índex Chao 1). U ili zan l’índex de B ay-Cu is, s’han ob ingu els alo s de la be a
di e si a pe al d’ap o undi en la simili ud en e mos es pel que a a di e si a poblacional.
També, u ili zan un algo i me de clus e i zació (Wa d), s’ha ac a de ep esen a les mos es a
escala de semblança en e elles i pe la p e alença de les espècies de mic oo ganismes que s’hi
oben. La dis ància en e mos es s’ha calcula u ili zan la dis ancia Euclidiana.
To es les anàlisis es adís iques s’han eali za u ili zan el so wa e Mic obiomeAnalys on les
lec u es de seqüenciació massi a han es a no mali zades i a i icades amb l’objec iu de acili a
39
Escola Supe io d’Ag icul u a de Ba celona
UPC - Ba celonaTech
les compa acions des d’un pun de is a biològic (Dha iwal e al., 2017). Els ni ells de axonomia
co esponen al ma c SILVA Taxonomy.
40
3.3. Taules Resum
En la Taula 3-5 s’especi ica de o ma esumida l’es a ísic i el con ingu de o es les mos es
ob ingudes al lla g del eball.
Taula 3-5. In o mació de la p ocedència, es a i con ingu de les mos es ob ingudes.
In o mació
Mos a
P ocedència
Es a
Con ingu
Inòcul esponges
g up de ece ca IDAEA (CSIC)
aquós/sòlid
cul iu mic oalgues amb
esponges
Fil e de su o
g up de ece ca IDAEA (CSIC)
sòlid
pèl·le s su o osseja s
Bassa G an
g up de ece ca GIRO (IRTA)
aquós
aigua de pou
Pou REG
g up de ece ca GIRO (IRTA)
aquós
aigua de pou
Pou CASA
g up de ece ca GIRO (IRTA)
aquós
aigua de pou
Pou Pe pinyà
Nenupha
aquós
aigua de pou
Pou Cas elló
FACSA
aquós
aigua de pou
Cul iu Mix
g up de ece ca GIRO (IRTA)
aquós
cul iu mic oalgues
Scenedesmus
IRTA de San Caldes de la Ràpi a
aquós
cul iu mic oalgues pu
Oocys is
IRTA de San Caldes de la Ràpi a
aquós
cul iu mic oalgues pu
Sellapho a
IRTA de San Caldes de la Ràpi a
aquós
cul iu mic oalgues pu
Pèl·le s we lands
We land, San And eu de Lla ane es,
SALA GRAUPERA.
sòlid
pèl·le s us a osseja s
47
Escola Supe io d’Ag icul u a de Ba celona
UPC - Ba celonaTech
Taula 4-3 Concen ació de NO3- en mg/L dels cul ius de l’assaig de c ib a ge d’inòculs i educció en % de ni a s. S’ha
dissol amb aigua MilliQ en una p opo ció de 1:4 les mos es del 9dies. Els càlculs del % de educció de
NO3- s’han e des del se ei d’analí iques del GIRO (IRTA).
NO3- mg/L
% Reducció de NO3-
Cul iu
Inòculs
(1/4 dilució)
0dies
9dies
9dies
9dies
CTRL 1
-
445
82
410
7
CTRL 2
-
156
35
175
-12
1.1
1
432
84
420
5
1.2
1
150
27
135
13
2.1
2
432
84
420
5
2.2
2
150
34
170
-9
3.1
3
432
93
465
-4
3.2
3
150
39
195
-25
4.1
4
432
93
465
-4
4.2
4
150
34
170
-9
5.1
5
432
85
425
4
5.2
5
150
43
215
-37
6.1
6
432
84
420
5
6.2
6
150
33
165
-5
4.3. C eació de bio ilm sob e clo u de poli inil (PVC) i polie ilè d'al a
densi a (PEHD)
A con inuació s’ha dissenya un assaig amb l’objec iu d’es udia la c eació de bio ilms pe pa s de
les mic oalgues sob e qua e ma e ials di e en s i assegu a que no es dóna una inhibició del seu
c eixemen . El u u o obio eac o Li e Spo eballa à amb làmpades lo an s dissenyades pe

48
l’emp esa Nenupha les quals di onen la llum pe o el eac o (Figu a 4-2). Aques es làmpades
es an ab icades amb els qua e ma e ials que s’han p o a en l’expe imen : obem clo u de
poli inil (PVC) i polie ilè d'al a densi a (PEHD) en di e en s colo s i g uixos (Taula 3-2, apa a
3.1.4 Assaig c ib a ge ma e ials). Les mos es u ili zades en l’assaig són les ma eixes que en
l’assaig c ib a ge d’inòculs i es an enume ades en la Taula 3-6 (Apa a 3.3. Taules Resum).
Figu a 4-2. Di e ses làmpades lo an s e es amb PEHD i PVC.
Els cul ius s’han alo a isualmen i s’ha de ec a la o mació de bio ilm en els cul ius dels inòculs
1,2 i 6, esul a s semblan s a l’assaig de c ib a ge d’inòculs pel que a a p oducció de biomassa. Els
inòculs són els ma eixos que els p esen a s en la Taula 4-2. El ce cle anspa en de PVC (150 µm)
ha es a el ma e ial en què s’ha o ma més bio ilm dels qua e ac a s (Figu a 4-3, A). En la es a
de ma e ials, s’han c ea bio ilms pe ò en menys quan i a . Els cul ius amb els inòculs 3, 4 i 5 no
han o ma biomassa.
El e que en el ec angle blanc de PVC (150 µm) no s’hagi o ma an bio ilm com el ce cle
( ambé de PVC) po se degu al e que aques úl im és anspa en . Aques ac o po p opicia
l’a ibada de llum en ambdues ca es del ma e ial i conseqüen men acili a la o osín esi pels
o ganismes p esen s en les dues ca es.
No s’ha de ec a cap inhibició del c eixemen de les mic oalgues en els inòculs 1,2 i 6 els p ime s
dies d’incubació. Només s’ha pogu p opo ciona una anàlisi isual de l’assaig de c ib a ge de
ma e ials degu a la pandèmia de la COVID-19.
49
Escola Supe io d’Ag icul u a de Ba celona
UPC - Ba celonaTech
Figu a 4-3. (A) Ma às 6.1, es po obse a la biomassa e da en suspensió, co esponen a les mic oalgues. Des aca la
p oducció de bio ilm en els ma e ials, p incipalmen en el PVC anspa en de g uix 150 µm (Ce cle) (B)
Ma às 6.1, biomassa en suspensió i bio ilm enganxa a les pa e s del ma às. (C) Ma às 1.1, biomassa
diposi ada en el ons del ma às.
4.4. P epa ació d’un inòcul de mic oalgues a escala de labo a o i
A pa i dels esul a s ob ingu s en els c ib a ges d’inòculs i ma e ials, que han pe mès eu e la
espos a de les mos es d’algues on aigües amb al con ingu de ni a s així com la o mació de
bio ilms sob e ce s ma e ials, s’ha gene a un nou inòcul amb l’objec iu de p odui biomassa en
majo quan i a s (Cul iu Mix ). Pos e io men , aques nou cul iu s’u ili za à pe comença l’escala
de l’inòcul de mic oalgues inal amb el qual s’inocula à el o obio eac o Li e Spo a escala pilo .
S’han u ili za les mos es d’esponges pe p opo ciona les comuni a s de mic oalgues i s’ha
en iqui amb aigua Pou CASA i medi CM en di e en s p opo cions depenen del cul iu es a .
Els ma assos inocula s amb les mos es d’esponges han aga a un colo e d in ens desp és de 7
dies d’incubació (Figu a 4-4, B). El ma às en iqui amb aigua de Pou CASA (Ma às 2), ha adqui i
una onali a e da més osca. Aques colo ens indica un bon c eixemen de les mic oalgues
compa a amb el ma às en iqui només amb medi CM. El que sí s’obse a és que ambdós cul ius
p esen en c eixemen .
50
Aques s esul a s ens con i men una bona base amb la qual comença a escala l’inòcul (Cul iu
Mix ) amb el qual s’acaba à inoculan el u u o obio eac o Li e Spo . Pos e io men o s els
nous cul ius o igina s du an l’escala s’en iqui an amb Aigua de Pou CASA jun amen amb el medi
de cul iu CM.
Figu a 4-4. (A) Ma assos 1 i 2 dins la capsa de polies i è el ma eix dia de la se a inoculació. El o a a onja de la ima ge
e dona pe la lluminà ia dins la caixa. (B) Ma assos 1 i 2, una se mana desp és de la inoculació. La
o og a ia s’ha p es dins una campana de lux. No a: Ma às 1, e ique a g oga (Medi CM); No a: Ma às 2,
e ique a a onja (Medi CM + Aigua de Pou CASA)
Un anàlisis isual ha es a l’únic p ocedimen que s’ha pogu du a e me pe al d’anali za el
c eixemen del cul iu a causa de les condicions i al a de emps p o oca pe la si uació de
qua an ena pe la COVID-19.
A con inuació es an anali za mi jançan mic oscòpia els ipus de mic oalgues p esen s en el
cul iu del Ma às 2. Basan -nos en la mo ologia, s’han iden i ica dos gène es d’algues di e en s
(Figu a 4-5). Les cèl·lules soli à ies amb o ma el·lipsoïdal i de onali a e d cla apun en a se
Oocys is, un gène e planc ònic d’alga e da unicel·lula de la amília Oocys aceae (S oyne a e al.,
2007). D’al a banda, les cèl·lules alla gades que es an ag upades en e elles en ba e ia
co esponen al gène e d’algues e des Scenedesmus. La p incipal ca ac e ís ica que s’ha ingu en
comp e pe pode classi ica -les ha es a la mo ologia de les cèl·lules i l’associació en pe i es
colònies d’aques gène e en conc e (Ba , 1978).
51
Escola Supe io d’Ag icul u a de Ba celona
UPC - Ba celonaTech
Figu a 4-5. Cap u a d’una o og a ia d’una mos a del cul iu de mic oalgues (Ma às 1.1) p esa amb un mòbil.
Obse ada amb un mic oscopi Leica DM IL In e ed Phase Con as Mic oscope Type 090-135.001 a 40
augmen s. Es an assenyala s dos gène es d’algues, Oocys is i Scenedesmus.
Els esul a s ob ingu s pe mic oscòpia conco den amb els cul ius pu s aïlla s des de l’IRTA de San
Ca les de la Ràpi a. Cal des aca que no s’ha oba cap p esència de Sellapho a en l’anàlisi pe
mic oscòpia.
52
4.5. Quan i icació de la població o al bac e iana, úngica i bac e iana
desni i ican pe qPCR
L’objec iu d’aques a anàlisi ha es a e una p ime a ap oximació de les poblacions mic obianes
p esen en les mos es amb les quals s’han p epa a l’inòcul inal (Cul iu Mix ) abans de du a
e me la seqüenciació massi a. U ili zan el mè ode de PCR quan i a i a en emps eal (qPCR) s’ha
pogu quan i ica el o al de la població bac e iana exis en anali zan la egió V3 16S RNA. S’ha
escolli aques a egió a causa de la se a omnip esència en els es dominis Bac e ia, A chaea i
Euka yo a. En el cas del domini Bac e ia, co espon a la egió hype a iable V3, en conc e an sols
200 pa ell de bases. A més, el gen 16S RNA p opo ciona in o mació ilogenè ica mol aluosa
g àcies a la àcil compa ació amb col·leccions de bases de dades ja exis en s.
També s’ha quan i ica les poblacions bac e ianes desni i ican s amb el gen nosZ (clade I) el qual
a e e ència a la uni a ca alí ica òxid ni ós educ asa. Finalmen , s’ha quan i ica el nomb e de
agmen s d’ITS1 RNA pe al d’es abli la població úngica o al de les mos es. Les mos es
quan i icades es an enume ades en la Taula 3-7 (Apa a 3.3. Taules Resum).
La mos a de pèl·le s de we land ha se i de con ol pel que a a ni ells de poblacions bac e ianes
desni i ican s. És ben sabu l’al po encial desni i ican p esen en aques s pèl·le s els quals
p o enen d’aiguamolls dissenya s pe elimina p incipalmen ni a s d’aigües esiduals u banes.
Els pèl·le s allibe en la DQO (Demanda Química d’Oxigen) necessà ia pe a po encia la
desni i icació he e o ò ica en ambien s oligo ò ics, pob es en ma è ia o gànica (Pelissa i e al.,
2018).
Els esul a s quan i a ius ob ingu s pe qPCR il·lus a s a la Figu a 4-6 mos en una al a població
an bac e iana com úngica en les mos es d’esponges, il e de su o i pèl·le s de us a (we lands).
En el cas de la població úngica, s’han oba alo s de ins a 103-104 i 108 còpies ITS RNA · mL-1 de
mos a en els cul ius d’algues aïllades i de les esponges espec i amen .

53
Escola Supe io d’Ag icul u a de Ba celona
UPC - Ba celonaTech
Figu a 4-6. Resul a s de la quan i icació gènica de la població o al. Població bac e iana o al (16S RNA); Població
úngica o al (ITS RNA); Població bac e iana desni i ican (nosZ1). No a: Inòcul esponges (M1); Fil e de
su o (M2); Pèl·le s we lands (M6); Cul iu pu Scenedesmus (B2); Cul iu pu Oocys is (B12); Cul iu pu
Sellapho a (B23). La mos a de pèl·le s de we land ha e de con ol pel que a a ni ells nosZ.
Si ens cen em en la quan i icació de la egió 16S RNA i nosZ, podem obse a que els inòculs
p o inen s del CSIC es an mol en iqui s amb una població bac e iana o al d’ap oximadamen 109
còpies 16S RNA · mL-1 de mos a. Pel que a a la compa ació de les poblacions bac e ianes o als
(16S RNA) en e s les bac è ies desni i ican s (nosZ), els esul a s ob ingu s són mol posi ius, ja
que enim alo s poblacionals simila s en les mos es del CSIC i en les del we land, a iban a
supe a pe un o d e de magni ud en el cas de les mos es M1 a les del we land espec e a
població desni i ican . Aques e ens indica un al po encial desni i ican en les mos es
d’esponges que s’han emp a pe gene a el Cul iu Mix .
54
Figu a 4-7. Compa ació - P opo ció: % de població úngica e s la població bac e iana o al i la població bac e iana
desni i ican s. la població bac e iana o al. No a: Inòcul esponges (M1); Fil e de su o (M2); Pèl·le s
we lands (M6); Cul iu pu Scenedesmus (B2); Cul iu pu Oocys is (B12); Cul iu pu Sellapho a (B23).
Les aigües de pou de Pe pinyà i To e Ma imon (Bassa Reg) p esen en alo s de poblacions
bac e ianes o als de 106 còpies 16S RNA · mL-1 de mos a, men e que la mos a d’aigua de
Cas elló p esen a la població bac e iana més eduïda del conjun de mos es ac ades amb alo s
de 102 còpies 16S RNA · mL-1 de mos a. S’ha de ec a població desni i ican en o es les
mos es excep uan la Bassa Reg (possiblemen degu a un e o du an la quan i icació o oba -
nos pe so a del lími de quan i icació). L’aigua de Cas elló és la que p esen a el po encial
desni i ican més ele a pel que a al an pe cen . Si enim en comp e les còpies nosZ · mL-1 de
mos a, és en la que s’ha oba menys p esència de o es. Això ens in o ma que g an pa de la
població bac e iana quan i icada és desni i ican . (Figu a 4-7).
55
Escola Supe io d’Ag icul u a de Ba celona
UPC - Ba celonaTech
4.6. Ca ac e i zació de les comuni a s bac e ianes, úngiques i d’algues
mi jançan seqüenciació massi a.
Amb la in enció d’es udia en de all la di e si a de les poblacions bac e ianes, úngiques i
d’algues en les mos es ac ades, s’ha eali za una seqüenciació massi a (NGS). Els ex ac es de
DNA ob ingu s de les mos es ma e s’han en ia al Molecula Resea ch MR DNA Labo a o y
(Shallowa e , TX, USA) des d’on, u ili zan la pla a o ma MiSeq Illumina, s’han seqüencia llib e ies
massi es o mades pe amplicons dels gens 16S RNA, ITS2 RNA i 18S RNA co esponen s a les
comuni a s bac e ians, úngiques i d’algues. Les mos es en iades pe seqüencia es an
enume ades en la Taula 3-7 (Apa a 3.3. Taules Resum). S’han pogu en ia quasi o es les
mos es ob ingudes a lla g del eball, g àcies això s’ha pogu ob eni una isió mol
ep esen a i a, an de les mos es ma e amb les quals s’ha ob ingu l’ inòcul inal com la del p opi
inòcul.
4.6.1. Es uc u a poblacional de la comuni a bac e iana
Amb l’es udi de les poblacions del domini Bac e ia (llib e ies de 16S RNA), s’han ob ingu 232645
lec u es classi icades en 883 Uni a s Taxonòmiques Ope a i es (OTUs) di e en s. El e me OTU
s’u ili za quan en e dues seqüències de nucleò ids la simili ud és majo o igual al 97,5%. A
con inuació, són ag upades en una OTU i conseqüen men assignades a un ma eix ni ell
axonòmic.
Els esul a s ob ingu s amb la pla a o ma MiSeq Illumina demos en l’espe able simili ud de les
comuni a s mic obianes en e les mos es p eses en iplica i demos en una g an semblança
en e l’aigua de Pou Casa i el Cul iu Mix espec e la es a (aques úl im en iqui amb aigua de Pou
CASA i l’inòcul de les esponges). Els alo s de la be a-di e si a ep esen ada a la Figu a 4-8
e o cen aques s esul a s. La be a-di e si a co espon a la assa de can i en amílies bac e ianes
de dues mos es di e en s. S’u ili za pe ep esen a la composició de les mos es i la se a
he e ogeneï a . Conseqüen men , que les mos es de Pou CASA i Cul iu Mix es iguin
ep esen ades an p òximes, assenyala la se a semblança espec e a comuni a s bac e ianes.
56
Figu a 4-8. Rep esen ació g à ica de l’índex de B ay-Cu is (be a-di e si a ) a ni ell de amílies bac e ianes. No a:
Inoculum CSIC, Co k il e i Mix cul u e TM co esponen a les mos es d’esponges, il e de su o i Cul iu
Mix espec i amen .
Els esul a s ambé s’han ep esen a en un Mapa de calo (Figu a 4-9) el qual ens mos a els
clús e s en e mos es i en aques cas la ilogènia classi icada a ni ell de Classe. Cal des aca l’al a
p e alença de les classes Alphap o eobac e ia, Be ap o eobac e ia i Gammap o eobac e ia en les
mos es d’Aigua de Pou CASA i el Cul iu Mix . Pe al a banda, les Del ap o eobac e ia dominen el
il e de su o. La simili ud pel que a a poblacions bac e ianes en ambdues mos es segueix sen
pa en i de g an impo ància.
63
Escola Supe io d’Ag icul u a de Ba celona
UPC - Ba celonaTech
Aques a educció de la població mic obiana pod ia se deguda a la p esència d’En o loxacin i
Sul ame azina (An ibiò ics), ja que es udis p eceden s de les aigües de To e Ma imon e s des
d’IDAEA han oba quan i a s signi ica i es d’aques s dos compos os. Finalmen , les algues
p esen s en les esponges disposen d’una àmplia supe ície especí ica en la qual o ma bio ilm,
passa a c éixe en un medi amb una baixa supe ície po ha e causa aques can i signi ica iu en
les poblacions.
Compa an els esul a s de les anàlisis mi jançan NGS i els ob ingu s mi jançan mic oscòpia
p esen a s an e io men (apa a 4.4.), podem di que els o ganismes obse a s els quals es
pensa a que pe anyien als gène es Scenedesmus i Oocys is pod ien només co espond e al
gène e Scenedesmus, ja que els esul a s ob ingu s pe seqüenciació massi a classi iquen la
o ali a de les mic oalgues p esen s en els cul ius com Scenedesmus. El e de que no s’hagi
de ec a la p esència del gène e Oocys is po indica que els o ganismes isuali za s (classi ica s
com a Oocys is) no pe anyen a aques gène e ealmen o bé que la se a p esència és an ín ima
que han es a classi ica s com o he s. Els esul a s ob ingu s pe NGS de les mos es d’algues
pu es (aïllades des de l’IRTA de San Ca les de la Ràpi a) ambé han es a classi icades com a
Scenedesmus en la se a o ali a . Aques e e o ça les conclusions p esen ades an e io men .
4.6.3. Es uc u a poblacional de la comuni a úngica
Un cop anali za s els esul a s p o inen s de la seqüenciació de la llib e ia massi a de l’amplicó del
gen ITS2, no s’ha de ec a p esència úngica en qua e mos es ( iplica d’esponges i Cul iu Mix ).
Com es po obse a a la Figu a 4-14, en les mos es en qües ió, la o ali a de les OTUS ac ades
s’han classi ica com “unclassi ied”, és a di , quan s’han compa a les seqüencies de nucleò ids
en e les dues bases de dades i la simili ud ha es a in e io al 80% els esul a s s’han desca a
degu a la al a d’especi ici a . No es iable classi ica la OTU en qües ió en cap ni ell axonòmic.
Obse an amb més a enció els esul a s ob ingu s en la seqüenciació massi a, un cop e el
BLAST en e G eengen i RDP (Compa ació de les seqüencies ob ingu s pe NGS amb la base de
dades G eengen u ili zan el p og ama i Ribosomal Da abase P ojec (RDP)) un g an núme o
d’OTUs han es a classi icades en el sub egne Vi idiplan ae (algues e des). Pe consegüen , a
l’ho a de classi ica les lec u es pel que a a poblacions úngiques, o es aquelles OTUs que

64
co esponien al sub egne Vi idiplan ae (algues) han es a ag upades manualmen com a
“unclassi ied” pe al de acili a la classi icació de les comuni a s úngiques.
Figu a 4-14. Resul a s de seqüenciació massi a de la de e minació de la comuni a úngica a ni ell d’espècie. Les dues
mos es de cul ius d’algues pu s s’han omès en la ep esen ació g à ica degu a la se a al a de esul a s.
Els esul a s s’han p esen a amb la classi icació RDP amb un boo s ap >80% ; les espècies in e io s al 80%
són ep esen ades com “unclassi ied”. To es aquelles espècies que p esen a en alo s de ep esen ació
in e io al 0,5% han es a classi icades com “o he s”. Inoculum CSIC, Co k il e i Mix cul u e TM
co esponen a les mos es d’esponges, il e de su o i Cul iu Mix espec i amen .
Que s’hagin ob ingu esul a s co esponen a algues quan s’es a a in en an classi ica
poblacions de ongs, po a a la possibili a que la egió ITS2 (en conc e s les egions
complemen à ies als encebado s ITS3-F i ITS4-R) es obi en el genoma dels ongs i alho a, al de
les algues. Se ia una explicació aonable dels esul a s ob ingu s en les mos es amb una al a
p esència d’algues. En es udis an e io s, s’han classi ica comuni a s d’algues a escala de gène e i
espècie u ili zan la egió ITS1 i ITS2 (Sussmann e al., 1999). Compa an els esul a s de l’anàlisi
pe NGS amb els ob ingu s pe qPCR (apa a 4.5.), en el cas de la població úngica dels inòculs de
les esponges i els cul ius d’algues, no podem a i ma que els encebado s u ili za s en la
quan i icació pe qPCR siguin especí ics pe a la població úngica p esen . Pe NGS no s’ha pogu
de e mina cap a iliació axonòmica pe a ongs en les mos es ac ades i en la quan i icació pe
65
Escola Supe io d’Ag icul u a de Ba celona
UPC - Ba celonaTech
qPCR sí que s’ha oba p esència úngica en les ma eixes mos es. Aques s esul a s
con adic o is hau an de se comp o a s en u u es accions.
Pe quan i ica la egió ITS1 RNA pe qPCR, s’han u ili za els encebado s ITS5-F i ITS2-R i pe du a
e me la seqüenciació massi a de la egió ITS2, els encebado s ITS3-F i ITS4-R. Aques e no a
més que inc emen a la possibili a que els alo s ob ingu s de la quan i icació de la egió ITS1
co esponguin a ongs i algues al ma eix emps, igual que amb els esul a s p oceden s de NGS.
S’ha decidi eni en comp e els esul a s de seqüenciació en on dels esul a s ob ingu s pe
qPCR g àcies a la se a majo especi ici a .
No podem anali za els esul a s del iplica d’esponges i el Cul iu Mix en el cas dels ongs, degu
a la al a d’especi ici a dels encebado s u ili za s, pe ò sí que podem pa la del que s’ha oba en
la es a de mos es classi icades axonòmicamen amb èxi . En la Figu a 4-14 des aca l’al a
di e si a de la població úngica en els iplica s del il e de su o. El ma e ial del qual es à o ma
el il e, jun amen amb alo s ele a s de DQO p opo cionen les condicions ideals pe què hi hagi
una ele ada di e si a quan a espècies de ongs. S’ha oba la p esència d’Humicola nig escens
amb alo s mi jans del 30% en el il e de su o, una espècie de ong d’al in e ès bio ecnològic ja
que p odueix i asa, un enzim que ca ali za la hid òlisi de l’àcid í ic i s’allibe a com a o ma
u ili zable de òs o ino gànic (Bala e al., 2014). La p esència d’aques compos po p opo ciona
una base de òs o ino gànic disponible pe les mic oalgues i conseqüen men un augmen en el
seu c eixemen .
En les mos es d’aigües de pou obem una p esència dominan d’espècies de ongs no
classi icades i de poblacions úngiques ca ac e ís iques de mos es de sòls.
66
Conclusions
Degu a les condicions p o ocades pe la pandèmia de la COVID-19, aques eball s’ha du a
e me so a condicions excepcionals i no s’han pogu comple a o s els objec ius. Així doncs, les
p incipals conclusions del p esen eball són les següen s:
- La ca ac e i zació isicoquímica e a de les aigües demos a l’al a con aminació pe ni a s
p esen en les mos es Pou REG i Pou CASA.
- En els assajos de p oducció de biomassa, o i el bon c eixemen de les mic oalgues, no s’ha
de ec a una educció signi ica i a dels ni ells de ni a en cap dels inòculs p oduï s.
- El PVC anspa en de 150 µm ha esul a se el ma e ial més adien pel que a a p oducció de
bio ilm pels cul ius de mic oalgues.
- S’ha gene a i escala amb èxi el Cul iu Mix . A a és de la ca ac e i zació pe mic oscòpia s’ha
de ec a la p esència dels gène es de mic oalgues Scenedesmus i Oocys is.
- La ca ac e i zació de les comuni a s úngiques (ITS1 RNA) u ili zan la ècnica qPCR no ha es a
posi i a a causa de la baixa especi ici a dels encebado s u ili za s. Sí que s’ha pogu quan i ica
amb èxi la població o al bac e iana (16S RNA) i desni i ican (gen nosZ).
- La seqüenciació massi a (NGS) es e o ça com la ècnica més e icien pe ca ac e i za la
mic obio a p esen en una g an a ie a de mos es o i el seu al cos econòmic. U ili zan
aques a ècnica hem obse a que un cop ob ingu el Cul iu Mix , el gène e de mic oalgues
p edominan ha passa a se Kalenjinia (65%) i el ílum bac e ià Bac e oide es (70%).
Els esul a s ob ingu s en el p esen eball han es able els coneixemen s necessa is pe a la
u u a inoculació del Cul iu Mix (inòcul de mic oalgues) i el seu man enimen al lla g de l’escala
inal del o obio eac o a escala pilo (p océs que com ja s’ha comen a no s’ha pogu du a e me
degu a la COVID-19).
67
Escola Supe io d’Ag icul u a de Ba celona
UPC - Ba celonaTech
Bibliog a ia
Annesley, T. M., A bo , A., Boyd, J. C., Apple, F. S., Du ou , R., Mille , W. G., Sacks, D. B., Benne ,
M. J., Louis, S., Moons, K. G. M., Sco , M. G., B uns, D. E., Wi we , C. T., Diamandis, E. P., Young,
I., Al man, D. G., Mak igio gos, G. M., Hues is, M. A., Schwab, M., … Fe na, M. (2009). Clinical
Chemis y DEPUTY EDITORS ASSOCIATE AND SECTION EDITORS. In Clinical Chemis y (Vol. 55,
Issue 10).
A umugam, M., Aga wal, A., A ya, M. C., & Ahmed, Z. (2013). In luence o ni ogen sou ces on
biomass p oduc i i y o mic oalgae Scenedesmus bijuga us. Bio esou ce Technology, 131, 246–
249. h ps://doi.o g/10.1016/j.bio ech.2012.12.159
Azizi, S., Baya , B., Tayeba i, H., Hashemi, A., & Pajoum Sha ia i, F. (2020). Ni a e and phospha e
emo al om ea ed was ewa e by Chlo ella ulga is unde a ious ligh egimes wi hin
memb ane la pla e pho obio eac o . En i onmen al P og ess & Sus ainable Ene gy, e13519.
Bala, A., Sapna, Jain, J., Kuma i, A., & Singh, B. (2014). P oduc ion o an ex acellula phy ase om
a he mophilic mould Humicola nig escens in solid s a e e men a ion and i s applica ion in
dephy iniza ion. Bioca alysis and Ag icul u al Bio echnology, 3(4), 259–264.
h ps://doi.o g/10.1016/j.bcab.2014.07.002
Ba , D. J. S. (1978). Taxonomy and phylogeny o chy ids. BioSys ems, 10(1–2), 153–165.
h ps://doi.o g/10.1016/0303-2647(78)90037-0
Bellemain, E., Ca lsen, T., B ochmann, C., Coissac, E., Tabe le , P., & Kause ud, H. (2010). ITS as an
en i onmen al DNA ba code o ungi: an in silico app oach e eals po en ial PCR biases. BMC
mic obiology, 10(1), 189.
Budhi Venka esan, R., & Raja a hinam, R. (2019). Sui abili y o diclos e acua us MH013435 and
kalenjinia gela inosa MH012185 o g ow h in Ga cinia cambogia washwa e e luen wi h
e icien nu ien emo al. In e na ional Jou nal o Phy o emedia ion, 21(8), 816–820.
h ps://doi.o g/10.1080/15226514.2019.1566884
68
Calde e , M., Ma í, V., de Pablo, J., Gui e nau, M., P ena e a-Boldú, F. X., & Viñas, M. (2014).
E ec s o enhanced deni i ica ion on hyd odynamics and mic obial communi y s uc u e in a soil
column sys em. Chemosphe e, 111, 112–119.
h ps://doi.o g/10.1016/j.chemosphe e.2014.03.033
Capo aso, J. G., Bi inge , K., Bushman, F. D., Desan is, T. Z., Ande sen, G. L., & Knigh , R. (2010).
PyNAST: A lexible ool o aligning sequences o a empla e alignmen . Bioin o ma ics, 26(2),
266–267. h ps://doi.o g/10.1093/bioin o ma ics/b p636
Delwiche, C. C., Sou ce : Scien i ic Ame ican , Vol . 223 , No . 3 ( Sep embe 1970 ), pp . 136-147
Published by : Scien i ic Ame ican , a di ision o Na u e Ame ica , Inc . S able URL :
h p://www.js o .o g/s able/24925899. 223(3), 136–147.
Dha iwal, A., Chong, J., Habib, S., King, I. L., Agellon, L. B., & Xia, J. (2017). Mic obiomeAnalys : A
web-based ool o comp ehensi e s a is ical, isual and me a-analysis o mic obiome da a.
Nucleic Acids Resea ch, 45(W1), W180–W188. h ps://doi.o g/10.1093/na /gkx295
Hen y, S., B u, D., S es, B., Halle , S., & Philippo , L. (2006). Quan i a i e de ec ion o he nosZ
gene, encoding ni ous oxide educ ase, and compa ison o he abundances o 16S RNA, na G,
ni K, and nosZ genes in soils. Applied and En i onmen al Mic obiology, 72(8), 5181–5189.
h ps://doi.o g/10.1128/AEM.00231-06
Je en, M. S. M. (2008). The mic obial ni ogen cycle. En i onmen al Mic obiology, 10(11), 2903–
2909. h ps://doi.o g/10.1111/j.1462-2920.2008.01786.x
K ohn-Mol , I., Alawi, M., Fö s ne , K. U., Wiegand , A., Bu kha d , L., Indenbi ken, D., Thieß, M.,
G undho , A., Keh , J., Tholey, A., & S ei , W. R. (2017). Insigh s in o Mic oalga and bac e ia
in e ac ions o selec ed phycosphe e bio ilms using me agenomic, ansc ip omic, and p o eomic
app oaches. F on ie s in Mic obiology, 8(OCT), 1–14. h ps://doi.o g/10.3389/ micb.2017.01941
Lane, D. J. (1991). 16S/23S RNA sequencing. Nucleic acid echniques in bac e ial sys ema ics, 115-
175.

69
Escola Supe io d’Ag icul u a de Ba celona
UPC - Ba celonaTech
Mekonnen, M. M., & Hoeks a, A. Y. (2015). Global G ay Wa e Foo p in and Wa e Pollu ion
Le els Rela ed o An h opogenic Ni ogen Loads o F esh Wa e . En i onmen al Science and
Technology, 49(21), 12860–12868. h ps://doi.o g/10.1021/acs.es .5b03191
Pelissa i, C., Gui e nau, M., Viñas, M., Ga cía, J., Velasco-Galilea, M., Souza, S. S., Seze ino, P. H., &
Á ila, C. (2018). E ec s o pa ially sa u a ed condi ions on he me abolically ac i e mic obiome
and on ni ogen emo al in e ical subsu ace low cons uc ed we lands. Wa e Resea ch, 141,
185–195. h ps://doi.o g/10.1016/j.wa es.2018.05.002
P ena e a-Boldú, F. X., Gui e nau, M., Gallas egui, G., Viñas, M., de Hoog, G. S., & Elías, A. (2012).
Fungal/bac e ial in e ac ions du ing he biodeg ada ion o TEX hyd oca bons ( oluene,
e hylbenzene and p-xylene) in gas bio il e s ope a ed unde xe ophilic condi ions. FEMS
Mic obiology Ecology, 80(3), 722–734. h ps://doi.o g/10.1111/j.1574-6941.2012.01344.x
Rosenbe g, E., De Long, E. F., Lo y, S., S ackeb and , E., & Thompson, F. (2014). The p oka yo es:
O he majo lineages o bac e ia and he a chaea. The P oka yo es: O he Majo Lineages o
Bac e ia and The A chaea, 1–1028. h ps://doi.o g/10.1007/978-3-642-38954-2
Sa oj, D. B., Denge i, S. N., Ahe , S., & Gup a, A. K. (2015). ITS as an en i onmen al DNA ba code
o ungi: an in silico app oach e eals po en ial PCR biases. Wo ld Jou nal o Mic obiology &
Bio echnology, 31(6), 189–999. h ps://doi.o g/10.1016/j.enzmic ec.2010.03.010
S oyne a, M. P., Cocquy , C., Gä ne , G., & Vy e man, W. (2007). Oocys is lacus is
CHOD.(Chlo ophy a, T ebouxiophyceae) in Lake Tanganyika (A ica). Linze . Biol. Bei , 39, 571-
632.
Sun, R., My old, D. D., Wang, D., Guo, X., & Chu, H. (2019). AOA and AOB communi ies espond
di e en ly o changes o soil pH unde long- e m e iliza ion. Soil Ecology Le e s, 1(3–4), 126–
135. h ps://doi.o g/10.1007/s42832-019-0016-8
Sussmann, A. V., Mable, B. K., DeW eede, R. E., & Be bee, M. L. (1999). Iden i ica ion o g een
algal endophy es as he al e na e phase o Ac osiphonia (Codiolales, Chlo ophy a) using ITS1 and
ITS2 ibosomal DNA sequence da a. Jou nal o Phycology, 35(3 II), 607–614.
h ps://doi.o g/10.1046/j.1529-8817.1999.3530607.x
70
Tiedje, J. M. (1983). Deni i ica ion. Me hods o Soil Analysis: Pa 2 Chemical and Mic obiological
P ope ies, 9, 1011-1026.
UNECE, Abou he P o ocol on Wa e and Heal h. (n.d.). Re ie ed Janua y 6, 2021, om
h ps://unece.o g/en i onmen -policy/wa e /p o ocol-on-wa e -and-heal h/abou - he-
p o ocol/in oduc ion
Vasquez-Villalobos, V., Ve ga ay, D., Sua ez, S., Zamo a, A., Gaspa , K., & Escu a, X. (2014).
P opo ional in luence o sea wa e and bica bona e on he p oduc ion o Spi ulina sp . biomass
wi h ligh -emi ing diode ligh ing. Scien ia Ag opecua ia, 5, 199–209.
Yang, C., Wang, Q., Simon, P. N., Liu, J., Liu, L., Dai, X., Zhang, X., Kuang, J., Iga ashi, Y., Pan, X., &
Luo, F. (2017). Dis inc ne wo k in e ac ions in pa icle-associa ed and ee-li ing bac e ial
communi ies du ing a Mic ocys is ae uginosa bloom in a pla eau lake. F on ie s in Mic obiology,
8(JUN), 1–15. h ps://doi.o g/10.3389/ micb.2017.01202