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Identificação de negevírus em mosquitos colhidos no sul de Portugal e análise da sua replicação

CARAPETA, Sara Sofia Costa · 2015

Abstract

O género Negevirus foi descrito pela primeira vez em 2013, tendo sido proposto como um novo grupo taxonómico de vírus específicos de insetos com uma ampla distribuição geográfica, e caracterizado por uma considerável diversidade de hospedeiros, entre os quais flebótomos do género Lutzomyia e mosquitos, maioritariamente do género Culex mas também Anopheles e Aedes. Em Portugal, a primeira identificação de um negevírus foi obtida de um lote de mosquitos da espécie Oc. caspius, após o seu coisolamento com um flavivírus específico de insetos OCFVPT. A génese dos efeitos citopáticos exuberantes e de desenvolvimento rápido decorrentes da replicação destes vírus em culturas de células de inseto, a sua origem e evolução desconhecidas, as semelhanças de algumas das proteínas que codificam com as de vírus de plantas, e o seu potencial impacto na fitness e/ou na eventual competência vetorial dos insetos em que são encontrados, são questões que têm contribuído para o crescente interesse sobre o estudo destes vírus. No decurso do trabalho que aqui se apresenta foi efetuada a deteção, isolamento e caracterização genética de novos negevírus de mosquitos colhidos no sul de Portugal, tentativamente definida a sua gama de hospedeiros e analisada a sua estratégia de replicação, usando células de inseto mantidas em cultura. Através da utilização de RT-PCR e de primers degenerados (na sua maioria) foi possível identificar novas estirpes de negevírus, presentes em quatro espécies de mosquitos diferentes capturados no sul de Portugal: Ochlerotatus caspius, Cx. pipiens, Cx. theileri e Cx. univittatus. Inferências filogenéticas baseadas no alinhamento de sequências codificantes da polimerase viral, amplificadas de negevírus isolados em culturas de células C6/36, demonstraram a ocorrência de um novo grupo monofilético, filogeneticamente próximo do grupo monofilético do qual constam negevírus de tipo Negev e pertencente ao grupo taxonómico proposto recentemente, Nelorpivirus. A análise da replicação de negevírus in vitro permitiu observar a presença de efeitos citopáticos extensos e de desenvolvimento rápido, embora sem indicação óbvia da entrada das células infetadas em apoptose. Estes vírus comprovaram replicar de forma muito rápida, tendo sido possível detetar genomas virais no sobrenadante de culturas celulares C6/36 infetadas, 4 horas após o início da infeção. Neste trabalho foi também construído um vetor plasmídico, designado pIC111-V, o qual deverá permitir a expressão transitória de proteínas em células de inseto como consequência da presença de um promotor de transcrição de baculovírus reconhecido constitutivamente nestas células. A sua utilização na transfeção de células de inseto revelou poder representar um passo importante na melhoria das metodologias de análise proteómica nestas células.

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Identificação de negevírus em mosquitos colhidos no sul de Portugal e análise da sua replicação

Author: CARAPETA, Sara Sofia Costa
Publisher: Instituto de Higiene e Medicina Tropical
Year: 2015
Source: https://run.unl.pt/bitstream/10362/18552/1/Tese%20-%20Sara%20Carapeta.pdf
Uni e sidade No a de Lisboa
Ins i u o de Higiene e Medicina T opical
IDENTIFICAÇÃO DE NEGEVÍRUS EM MOSQUITOS
COLHIDOS NO SUL DE PORTUGAL E ANÁLISE DA SUA
REPLICAÇÃO
Sa a So ia Cos a Ca ape a
DISSERTAÇÃO PARA A OBTENÇÃO DO GRAU DE MESTRE EM CIÊNCIAS
BIOMÉDICAS ESPECIALIDADE EM BIOLOGIA MOLECULAR EM SAÚDE TROPICAL E
INTERNACIONAL
JANEIRO, 2015
i
Uni e sidade No a de Lisboa
Ins i u o de Higiene e Medicina T opical
IDENTIFICAÇÃO DE NEGEVÍRUS EM MOSQUITOS
COLHIDOS NO SUL DE PORTUGAL E ANÁLISE DA SUA
REPLICAÇÃO
Au o : Sa a So ia Cos a Ca ape a
O ien ado : P o esso Dou o Rica do Pa ei a
Coo ien ado : P o esso Dou o Paulo Almeida
Disse ação ap esen ada pa a cump imen o dos equisi os necessá ios à ob enção do
g au de Mes e em Ciências Biomédicas.
iii
A p esen e disse ação oi edigida de aco do com o no o aco do o og á ico.

Iden i icação de nege í us em mosqui os colhidos no sul de Po ugal e análise da sua eplicação
Elemen os Bibliog á icos Resul an es da Disse ação
Elemen os Bibliog á icos Resul an es da Disse ação
Os esul ados ap esen ados nes a disse ação o am obje i o de submissão em
coau o ia da seguin e comunicação sob a o ma de a igo subme ido pa a publicação:
Ca ape a, S., do Bem, B., Mc Guinness, J., Es e es, A., Abecasis, A., Lopes, Â., de
Ma os, A.P., Piedade, J., Almeida, A.P.G. and Pa ei a, R. Nege -like i uses ound in
mul iple species o mosqui oes om sou he n Po ugal: isola ion, gene ic di e si y, and
eplica ion in insec cell cul u e. Subme ido à e is a cien í ica Vi ology – Janei o, 2015.
Iden i icação de nege í us em mosqui os colhidos no sul de Po ugal e análise da sua eplicação
Dedica ó ia
ii
Dedica ó ia
Dedico es a ese ao meu a ô.

Iden i icação de nege í us em mosqui os colhidos no sul de Po ugal e análise da sua eplicação
Índice Ge al
x
Índice Ge al
Elemen os Bibliog á icos Resul an es da Disse ação ......................................................
Dedica ó ia ...................................................................................................................... ii
Ag adecimen os ............................................................................................................... ix
Resumo ............................................................................................................................ xi
Abs ac .......................................................................................................................... xiii
Índice Ge al ..................................................................................................................... x
Índice de Figu as ............................................................................................................ xix
Índice de Tabelas ......................................................................................................... xxiii
Lis a de Ab e ia u as .................................................................................................... xx
1. In odução ................................................................................................................... 1
1.1. Os mosqui os (Dip e a, Culicidae) e a sua impo ância ........................................ 2
1.2. Eme gência de no os í us associados a a ópodes ............................................. 5
1.3. Con ibu o do desen ol imen o das écnicas molecula es pa a a descobe a de
í us especí icos de inse os ........................................................................................... 8
1.4. O géne o Nege i us ............................................................................................. 10
1.4.1. Ca ac e ização ilogené ica dos nege í us .................................................... 10
1.4.2. Dis ibuição geog á ica e di e sidade de hospedei os .................................. 11
1.4.3. Manu enção na Na u eza .............................................................................. 13
1.4.4. O ganização genómica .................................................................................. 13
1.5. Ca ac e ís icas da eplicação de í us de RNA de pola idade posi i a ............... 15
1.6. Obje i os .............................................................................................................. 20
2. Ma e ial e Mé odos ................................................................................................... 21
2.1. O igem e cap u a de mosqui os ........................................................................... 22
2.2. P odução de mace ados de mosqui os ................................................................. 23
2.3. Manipulação de linhas celula es in e adas e não in e adas .................................. 23
2.3.1. Cul u a de células C6/36 e isolamen o i al ................................................. 23
2.3.2. Cul u a de células HEK293T ........................................................................ 24
Iden i icação de nege í us em mosqui os colhidos no sul de Po ugal e análise da sua eplicação
Índice Ge al
x i
2.3.3. T ans eção de células HEK293T e de células C6/36 .................................... 25
2.4. Ciné ica da eplicação i al .................................................................................. 26
2.5. A aliação da indução de apop ose ....................................................................... 27
2.6. Mic oscopia ele ónica de ansmissão................................................................. 28
2.7. Análise de p o eínas solú eis o ais po SDS-PAGE ........................................... 28
2.8. Ex ação de RNA i al ......................................................................................... 29
2.9. Sín ese de cDNA .................................................................................................. 30
2.10. Desenho e ca ac e ís icas de oligonucleó idos (p ime s) u ilizados na
ampli icação/sequenciação de sequências i ais ......................................................... 30
2.11. Ampli icações de sequências genómicas i al ................................................... 33
2.11.1. Ampli icação de agmen os de DNA po PCR con encional .................... 33
2.11.2. Ampli icação agmen os de DNA po PCR em empo eal ....................... 35
2.12. Hid ólise de DNA com endonucleases de es ição ........................................... 36
2.13. Clonagem de p odu os de PCR .......................................................................... 37
2.13.1. Clonagem no e o plasmídico pJe 1.2/blun .............................................. 37
2.13.2. Clonagem de DNA usando o e o plasmídico pIC111 .............................. 38
2.14. P epa ação de células compe en es de Esche ichia coli e a sua ans o mação
po choque é mico ...................................................................................................... 39
2.15. Ex ação, em pequena escala, de DNA plasmídico po lise alcalina ................. 40
2.16. Pu i icação de DNA ........................................................................................... 41
2.16.1. Pu i icação de moléculas de DNA ampli icadas po PCR .......................... 41
2.16.2. Pu i icação de moléculas de DNA plasmídico ............................................ 42
2.17. Sequenciação de DNA e análise de sequências nucleo ídicas e aminoacídicas . 43
3. Resul ados .................................................................................................................. 45
3.1. Dis ibuição quali a i a de nege í us em di e en es espécies de mosqui os
colhidos no sul de Po ugal ......................................................................................... 46
3.2. Isolamen o i al e análise mic oscópica de células C6/36 in e adas.................... 51
3.3. Análises ilogené icas das sequências de nege í us ob idas ................................ 56
3.4. Ca ac e ís icas ul aes u u ais associadas à eplicação i al do OCNV174 em
cul u a de células ......................................................................................................... 61
Iden i icação de nege í us em mosqui os colhidos no sul de Po ugal e análise da sua eplicação
Índice Ge al
x ii
3.5. Exp essão de p o eínas i ais du an e a eplicação i al do OCNV174 em células
C6/36: análise de pe is de p o eínas solú eis o ais po SDS-PAGE ........................ 63
3.6. Indução de apop ose du an e a eplicação i al do OCNV174 em células C6/36 . 66
3.7. Ciné ica da eplicação i al do OCNV174 em células C6/36 ................................ 68
3.8. Cons ução de e o plasmídico ecombinan e com sequência de um p omo o de
ansc ição econhecido em células de inse o ............................................................. 71
3.9. Exp essão de EGFP a pa i do e o pIC111-V em células euca ion es: análise
po mic oscopia de luo escência ............................................................................... 74
3.10. Cons ução de plasmídeos pa a exp essão de p o eínas codi icadas pelas ORF1,
ORF2 e ORF3 de OCNV174 undidas, em C- e minal, à EGFP ................................. 76
4. Discussão e Conclusões ............................................................................................. 83
4.1. Iden i icação de nege í us em mosqui os colhidos no sul de Po ugal ............... 84
4.2. Análise da eplicação de nege í us: OCNV174 como modelo de es udo ............. 91
4.3. Cons ução do e o plasmídico pIC111-V pa a exp essão cons i u i a de
p o eínas em células de inse o .................................................................................... 95
5. Re e ências Bibliog á icas ...................................................................................... 101
6. Anexos ...................................................................................................................... 115
Anexo 1 – Mapa ísico e sequência pa cial do e o plasmídico pJe 1.2/blun ........ 116
Anexo 2 – Mapa ísico e sequência pa cial do e o plasmídico pIC111 ................ 117
Iden i icação de nege í us em mosqui os colhidos no sul de Po ugal e análise da sua eplicação
Índice de Figu as
xix
Índice de Figu as
Figu a 1 - Dis ibuição geog á ica de á ios no os í us associados a a ópodes
descobe os na úl ima década... ........................................................................................ 5
Figu a 2 – Á o e ilogené ica cons uída com base no c i é io de máxima
e osimilhança e elando a exis ência de seis linhagens dis in as de nege í us,
ilogene icamen e dis in as do CiLV-C.. ........................................................................ 11
Figu a 3 – Dis ibuição geog á ica mundial de nege í us isolados en e 2013 e 2014. 12
Figu a 4 – O ganização genómica dos nege í us: posição das g elhas de lei u a abe a
e domínios p o eicos conse ados. ................................................................................. 15
Figu a 5 – Replicação de í us com genoma de ssRNA+. . ........................................... 16
Figu a 6 – Imagens de mic oscopia ele ónica das al e ações memb ana es
ca ac e izadas pela o mação de es é ulas du an e a eplicação dos í us BMV e FHV e
espe i os diag amas dos complexos eplica i os. ......................................................... 18
Figu a 7 – Imagens de mic oscopia ele ónica, a duas e ês dimensões, das al e ações
memb ana es associadas ao e ículo endoplasmá ico, induzidas pela eplicação do
DENV. ............................................................................................................................ 19
Figu a 8 – Imagens de mic oscopia ele ónica, a duas e ês dimensões, das al e ações
memb ana es associadas ao e ículo endoplasmá ico, induzidas pela eplicação do
SARS-V. ......................................................................................................................... 20
Figu a 9 – Ras eio da p esença de í us Nege , Piu a, Ngewo an, e/ou í us
gene icamen e semelhan es a es es, em ex a os de RNA p epa ados a pa i de
mace ados de mosqui os das espécies Cx. pipiens e Cx. uni i a us.. ............................ 47
Figu a 10 – Ras eio da p esença de í us de ipo Nege , Piu a, Ngewo an, e/ou í us
gene icamen e semelhan es a es es, em ex a os de RNA p epa ados a pa i de
mace ados de mosqui os das espécies Oc. caspius, Cx pipiens e Cx. uni i a us.. ......... 48

Iden i icação de nege í us em mosqui os colhidos no sul de Po ugal e análise da sua eplicação
Índice de Figu as
xx
Figu a 11 – Ras eio da p esença de í us Lo e o e/ou í us gene icamen e semelhan es
a es es, em ex a os de RNA p epa ados a pa i de mace ados de mosqui os da espécie
Oc. caspius. ..................................................................................................................... 49
Figu a 12 – Ras eio da p esença de í us San ana e Dezidougou, e/ou í us
gene icamen e semelhan es a es es, em ex a os de RNA p epa ados a pa i de
mace ados de mosqui os da espécie Cx. heile i. ............................................................ 50
Figu a 13 – Dis ibuição de sequências de p esumí eis nege í us em di e en es
espécies de mosqui os cap u ados no Alga e. Mapa do Alga e e pon os de colhei a
dis ibuídos po ês egiões p incipais: oes e, cen o e es e. Iden i icação dos lo es de
mace ados e espécies de mosqui os po encialmen e suges i os de con e em genomas de
nege í us e espe i os pon os de colhei a. ...................................................................... 51
Figu a 14 – Análise po mic oscopia ó ica (ampliação de 400x) de células C6/36 não
in e adas e 72h após in eção com uma alíquo a do mace ado 595, na qual oi de e ada a
p esença de la i í us e do mace ado 207, no qual oi de e ada a p esença de la i í us
OCFVPT em simul âneo com nege í us .......................................................................... 53
Figu a 15 – Análise po mic oscopia ó ica (ampliação de 400x) de células C6/36 não
in e adas e 24h, 48h e 72h (ampliação de 200x) após in eção com um mace ado de
mosqui os da espécie Cx. uni i a us. .............................................................................. 54
Figu a 16 – Iden i icação da p esença de genomas de nege í us e la i í us po RT-
PCR em ex a os de RNA p epa ados a pa i de sob enadan es de cul u a após
isolamen o i al. .............................................................................................................. 56
Figu a 17 – Relação ilogené ica en e sequências de nege í us baseada num
alinhamen o de sequências nucleo ídicas co esponden es a uma secção da polime ase
i al, com ap oximadamen e 1000 pb. Á o es ilogené icas cons uídas com base no
c i é io de máxima e osimilhança (ML) u ilizando como modelo e olu i o GTR+I+Γ e
com base no mé odo de junção de izinhos (NJ) u ilizando como modelo de subs i uição
Kimu a 2-Pa amê os. ..................................................................................................... 59
Iden i icação de nege í us em mosqui os colhidos no sul de Po ugal e análise da sua eplicação
Índice de Figu as
xxi
Figu a 18 – Relação ilogené ica en e sequências de nege í us baseada num
alinhamen o de sequências nucleo ídicas co esponden es a uma secção da polime ase
i al, com ap oximadamen e 2400 pb. Á o e ilogené ica cons uída com base no
mé odo de junção de izinhos (NJ) u ilizando como modelo de subs i uição Kimu a 2-
Pa amê os cuja consis ência opológica oi a aliada com base numa análise de
boo s apping, usando 1000 amos agens alea ó ias dos dados iniciais. ........................ 60
Figu a 19 – Al e ações mo ológicas induzidas pela eplicação i al do OCNV174 em
células C6/36. Análise po mic oscopia ó ica (ampliação de 400x) de células C6/36 não
in e adas e 48h após in eção com OCNV174. ................................................................. 62
Figu a 20 – Análise po mic oscopia ele ónica de ansmissão de secções inas de
células C6/36 não in e adas e 48 ho as após in eção com OCNV174. ............................. 63
Figu a 21 – A aliação da p esença de p o eínas solú eis em ex a os celula es in e ados
com OCNV174 ob idos a pa i de meios de cul u a suplemen ados com 2 % de FBS e
ecolhidos a di e en es empos após in eção (24, 48 e 72 ho as) ................................... 66
Figu a 22 – A aliação da indução de apop ose du an e a eplicação i al do OCNV174.
Ele o o ese em gel de aga ose 0,8 % (p/ ) do pe il ele o o é ico de ex a os de DNA
genómico o al ob idos a pa i de sedimen os de células não in e adas e in e adas com
OCNV174, ecolhidas com di e en es empos de incubação (0, 24, 48 e 72 ho as). ....... 67
Figu a 23 – Es udo da ciné ica da eplicação i al do OCNV174.. ................................. 69
Figu a 24 – Cons ução do e o plasmídico ecombinan e com a sequência do
p omo o OpIE1. ............................................................................................................. 73
Figu a 25 – Iden i icação de plasmídeos ecombinan es con endo a sequência do
p omo o OpIE1 de i ado do e o pIZT/His-V5 ........................................................... 74
Figu a 26 – Análise po mic oscopia de luo escência (ampliação 100x) do esul ado da
ans eção das linhas celula es HEK293T e C6/36 com o e o plasmídico pIC111-V..76
Figu a 27 – P odu os de ampli icação especí ica ob idos po RT-PCR a pa i de
ex a os de RNA o al e u ilizando os pa es de p ime s o 1BamHI/o 1No I,
Iden i icação de nege í us em mosqui os colhidos no sul de Po ugal e análise da sua eplicação
Índice de Figu as
xxii
o 2BamHI/o 2No I e o 3BamHI/o 3No I pa a ampli ica sequências de domínios
co esponden es às ORF1 (domínio da polime ase i al), ORF2 e ORF3, espe i amen e
do genoma do OCNV174.. ................................................................................................ 78
Figu a 28 – Es abilização dos agmen os do genoma i al do OCNV174 codi icados
pelo domínio da polime ase i al p esen e na ORF1 e pelo domínio da ORF2 no e o
plasmídico pJe 1.2/blun .. ................................................................................................ 79
Figu a 29 – Con i mação da p esença da sequência e e en e ao domínio da ORF2 do
genoma do OCNV174 no e o plasmídico pIC111-V. .................................................... 81
Iden i icação de nege í us em mosqui os colhidos no sul de Po ugal e análise da sua eplicação
Índice de Tabelas
xxiii
Índice de Tabelas
Tabela 1 – P ime s u ilizados pa a ampli icação/sequenciação do genoma de nege í us
........................................................................................................................................ 31
Tabela 2 – Valo es de C ob idos na eações de ampli icação em empo eal pa a cada
amos a, co esponden es a alíquo as de sob enadan es de cul u a colhidos com
di e en es empos após in eção (0, 1, 2, 3, 4, 5, 6, 8 e 48 ho as). ................................... 70
Iden i icação de nege í us em mosqui os colhidos no sul de Po ugal e análise da sua eplicação
Lis a de Ab e ia u as
xxx
TEM mic oscopia ele ónica de ansmissão, do inglês T ansmission Elec on
Mic oscopy
T is T is (Hid oxime il) Aminome ano
T is-HCl T is (Hid oxime il) Aminome ano – ácido clo íd ico
TSS solução de a mazenamen o e ans o mação, do inglês T ans o ma ion
and S o age Solu ion
U unidade de a i idade enzimá ica
UTR egiões não aduzidas, do inglês Un ansla ed Regions
V Vol , unidade de ensão elé ica
VIDISCA do inglês Vi us Disco e y cDNA-AFLP (Ampli ied F agmen Leng h
Polymo phism)
VP do inglês Vesicle Packs
/ olume po olume
WALV í us Walle ield

Iden i icação de nege í us em mosqui os colhidos no sul de Po ugal e análise da sua eplicação
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1|
INTRODUÇÃO
Iden i icação de nege í us em mosqui os colhidos no sul de Po ugal e análise da sua eplicação
1. In odução
2
1.1. Os mosqui os (Dip e a, Culicidae) e a sua impo ância
Os mosqui os são inse os díp e os pe encen es à amília Culicidae e encon am-
se dis ibuídos po ês sub amílias: Anophelinae e Culicinae, das quais azem pa e
espécies com impo ância médica, e Toxo hynchi inae, cons i uída po espécies sem
impo ância médica, dado que os mosqui os êmeas não se alimen am de sangue de
e eb ados. A amília Culicidae es á, igualmen e, di idida em géne os, dos quais se
des acam os géne os Anopheles (sub amília Anophelinae), Culex e Aedes (sub amília
Culicinae), pelo ac o de euni em espécies de mosqui os hema ó agas, capazes de
ansmi i agen es pa ogénicos ao Homem e a ou os animais e eb ados (Almeida,
2011). Pa a além do seu papel enquan o e o es de pa asi as unicelula es, como as
di e en es espécies do géne o Plasmodium passí eis de causa em malá ia, e pa asi as
mul icelula es, como as ilá ias causado as de ila ioses lin á icas, alguns mosqui os são
ambém e o es de á ios í us pa ogénicos causado es de a bo i oses. Des es são
exemplos o í us da eb e ama ela e da dengue, ou o í us chikungunya. Es es í us são
gene icamen e designados de a bo í us (do inglês a h opod-bo ne i uses) e são
man idos na na u eza essencialmen e po ansmissão ho izon al, em ciclos que
en ol em um e o in e eb ado e um hospedei o e eb ado. A a és da picada do
e o hema ó ago, o í us é ansmi ido ao hospedei o num p ocesso denominado de
ansmissão biológica, que en ol e eplicação dos í us nos mosqui os e a sua
disseminação pelos ecidos do inse o (Wea e e Reisen, 2010).
A maio ia dos a bo í us ansmi idos po mosqui os e que causam impac os
signi ica i os na saúde Humana e na e e iná ia, êm genoma de RNA e dis ibuem-se
po qua o amílias: Toga i idae, na qual se inclui o géne o Alpha i us, e na qual são
classi icados í us causado es de doenças como a ence ali e equina do les e, do oes e e
enezuelana; Fla i i idae, géne o Fla i i us, cujos í us são esponsá eis po doenças
como a eb e ama ela, a dengue, a eb e do Nilo Ociden al e a ence ali e Japonesa;
Bunya i idae à qual pe encem os géne os O hobunya i us, Nai o i us e Phlebo i us,
e da qual se des acam os í us causado es de doenças como a eb e hemo ágica da
C imeia-Congo, a eb e do ale do Ri e a ence ali e de La C osse; e Rhabdo i idae,
géne o Vesiculo i us, na qual se incluem os í us esponsá eis pela es oma i e esicula
Indiana, de Alagoas e No a Jé sia (Hubálek e al., 2014).
Iden i icação de nege í us em mosqui os colhidos no sul de Po ugal e análise da sua eplicação
1. In odução
3
De ido ao conside á el impac o dos mosqui os na saúde pública e e e iná ia,
á ios p og amas de con olo de doenças ansmi idas po es es inse os êm sido
e e uados, nos quais se incluem es udos de igilância en omológica, cujo p incipal
obje i o é a alia a dis ibuição geog á ica, bem como a abundância ela i a, de
po enciais populações e o as de agen es pa ogénicos. Mui os desses es udos êm sido
e e uados na Eu opa, alguns em Po ugal con inen al, pelo ac o de se um país com um
ele ado ní el de isco pa a a incidência de doenças in eciosas ansmi idas po
mosqui os. O isco associado esul a, essencialmen e, da conjugação de dois a o es: das
al e ações climá icas que se êm egis ado em Po ugal, p e endo um impac o po encial
na saúde humana (Calhei os, 2006) e da p esença de populações abundan es de
mosqui os compe en es pa a a ansmissão de di e sos agen es pa ogénicos (Almeida,
2011). Uma das al e ações climá icas egis adas p ende-se com o aquecimen o global, o
qual se p e ê con ibui pa a o aumen o da densidade de mosqui os na P ima e a e
Ou ono, que de ido ao aumen o do pe íodo a o á el pa a a sua ep odução (núme o
de semanas em que as condições climá icas são a o á eis à manu enção de g andes
populações de mosqui os) que da diminuição di e a do pe íodo de incubação ex ínseco
dos agen es pa ogénicos nos e o es (Calhei os, 2006).
Adicionalmen e, a auna culicideológica em Po ugal con inen al pode i a se
al e ada, no caso de se e i ica a in odução de ou as espécies de mosqui os e o es
ais como Ae. albopic us, um dos e o es mais compe en es na ansmissão, po
exemplo, do í us da dengue (Benedic e al., 2007) e com g ande sucesso de
implan ação1 p e is o pa a Po ugal (S ae emans e al., 2008) e Ae. aegyp i,
econhecido como e o do í us da dengue, da eb e ama ela e chikungunya. A
in odução de espécies exó icas de mosqui os é ei a ge almen e sob a o ma de o os, e
esul a essencialmen e de ocas come ciais, como o anspo e in e nacional de pneus
(Benedic e al., 2007) ou de plan as o namen ais (S ae emans e al., 2008).
Os es udos e e uados em Po ugal con inen al en e 2004 e 2010 e ela am que
as espécies de mosqui o mais abundan es e dispe sas no país e am Cx. heile i, Cx.
1 Resul a de qua o condições ambien ais p incipais: 1) Tempe a u as no in e no: acima de 0ºC, caso
con á io os o os mo em; 2) P ecipi ação anual: pelo menos 500 mm3 anuais o necem água su icien e
pa a os mosqui os se ep oduzi em; 3) Chu as de e ão: são necessá ias pa a man e os locais de
ep odução du an e o e ão; 4) Tempe a u as de e ão: in luenciam elocidade de desen ol imen o de
ases ima u as pa a mosqui os adul os. Ideal en e 25-30ºC.
Iden i icação de nege í us em mosqui os colhidos no sul de Po ugal e análise da sua eplicação
1. In odução
4
pipiens e Ochle o a us caspius (Almeida e al., 2008; Almeida e al., 2010; Osó io e
al., 2010). Es as espécies são a ualmen e econhecidas como e o es de a bo í us, ais
como o í us do Nilo Ociden al, Tahyna e da eb e do Vale do Ri (Lunds öm, 1999;
Hubálek, 2008), cons i uindo um po encial p oblema de saúde pública pa a Po ugal
con inen al.
Du an e os úl imos anos, a maio ia dos p oje os de in es igação cien í ica que
en ol em o es udo de í us ansmi idos po mosqui os êm sido e e uados com base
nos po enciais impac os des es úl imos, na medicina humana e e e iná ia (Junglen e
D os en, 2013). Adicionalmen e, o in e esse pela ecologia de í us pa ogénicos em
su gido, essencialmen e, de ido à g ande di e sidade e ápida e olução dos í us, que
p essupõe um aumen o dos es o ços com en oque na sua igilância epidemiológica,
como se em e i icado, po exemplo, com o í us da dengue (Badu been e al., 2013;
Lou enço e Recke , 2014) ansmi ido po Ae. aegyp i e Ae. albopic us. Além disso, a
necessidade de desen ol imen o de no os mé odos de diagnós ico, acinas ou a
de inição cla a de e iologias, em ambém con ibuído pa a o in e esse po es e ipo de
í us.
No en an o, os í us são p esumi elmen e, as en idades biológicas mais
abundan es do plane a (Hulo e al., 2011), possuindo uma dispe são geog á ica a ní el
mundial e uma as a, e di e sa, gama de hospedei os. Como al, conduzi a maio ia das
in es igações pa a a pesquisa de í us com aplicação p á ica, le a a que g ande pa e da
di e sidade i al pe maneça po descob i , podendo, inclusi amen e, um núme o
signi ica i o des es i a se encon ado em mosqui os sem impo ância médica. Es e
enómeno con ibui pa a um lamen á el iés do conhecimen o do mundo na u al, mas
es á endencialmen e a se con a iado, dado que o núme o de í us associados a inse os
desc i os na li e a u a (sendo es es ansmi idos, ou não, a humanos ou ou os animais)
es á a aumen a egula men e (Mokili e al., 2012).
Iden i icação de nege í us em mosqui os colhidos no sul de Po ugal e análise da sua eplicação
1. In odução
5
1.2. Eme gência de no os í us associados a a ópodes
O aumen o de opo unidades e me odologias pa a o es udo e ca ac e ização de
no os í us em pe mi ido não só e ela a exis ência de alguns í us po encialmen e
pa ogénicos, mas ambém a exis ência de uma imensa di e sidade de í us, mui os dos
quais sem ele ância em e mos clínicos, associada a á ios ipos de a ópodes (Junglen
e D os en, 2013). Na igu a 1 cons am alguns dos í us desc i os essencialmen e
du an e a úl ima década, um pouco po odo o mundo, isolados de mosqui os dos mais
a iados géne os como Anopheles, Culex, ou U ano aenia, e ambém de culicóides do
géne o Culicoides, como o í us Schmallenbe g (We nike e al., 2014) e de ca aças dos
géne os Haemaphysalis, Rhipicephalus, e Amblyomma, de onde, po exemplo, o am
isolados os í us Lone S a (Swei e al., 2013) e os í us Bhanja e Palma (Dilche e al.,
2012), o úl imo em Po ugal. F equen emen e, po cada es udo e e uado são desc i os
mais do que um í us (Mokili e al., 2012) suge indo que os í us especí icos de inse os
são agen es bas an e mais comuns e abundan es na na u eza, do que se julga a.
Figu a 1 - Dis ibuição geog á ica de á ios no os í us associados a a ópodes, descobe os na úl ima
década. As egiões colo idas co espondem aos países onde os í us o am isolados de inse os pela
p imei a ez. Em azul es ão iden i icados países cujos í us o am isolados de ca aças (Haemaphysalis
punc a a, Rhipicephalus in e media e Amblyomma ame icanun) em ama elo, í us isolado de culicóides
(Culicoides spp.) e, em e melho, í us isolados de mosqui os (An. cous ani, Ae. ci eneus, U ano aenia
mashonaensis, Cx. ocossa, Cx. ishnui, Cx. i aenio hynchus e Culex spp.). Adap ado de Junglen e
D os en, 2013.

Iden i icação de nege í us em mosqui os colhidos no sul de Po ugal e análise da sua eplicação
1. In odução
6
A denominação “ í us especí icos de inse os” começou po se u ilizada pa a
desc e e í us do géne o Fla i i us, p esen es na u almen e em inúme as populações
de mosqui os e que apa en a am eplica exclusi amen e em células des es
in e eb ados. Embo a es es í us, designados gene icamen e de ISF (do inglês insec -
speci ic la i i us) possuam uma o ganização genómica idên ica à dos demais la i í us
que in e am e eb ados, pa a além de não eplica em em células de e eb ado (que in
i o, que in i o), não apa en am se man idos a a és de um ciclo de ansmissão
semelhan e aos que pe mi em a manu enção dos a bo í us na Na u eza (Kuno, 2007).
A g ande maio ia dos ISF começou po su gi associada a mosqui os dos
géne os Aedes e Culex (Cook e al., 2012), sendo ep esen ados, en e ou os, pelos
designados í us Cell Fusing Agen (CFAV), isolados pela p imei a ez em 1975, de
mosqui os Ae. aegyp i (S olla e Thomas, 1975), pelo í us Kami i Ri e (KRV) isolado
de mosqui o da espécie Ae. macin oshi em 2003 no Quénia (C ab ee e al., 2003) e,
mais ecen emen e, os la i í us de Culex (CxFV), cujo p imei o isolado oi ob ido em
2007 a pa i de mosqui os da espécie Cx. pipiens (Hoshino e al., 2007).
O in e esse c escen e pela ecologia dos ISF conduziu a um aumen o do núme o
de in es igações sob e es es í us, e consequen emen e, a um aumen o do epo ó io
des e ipo de í us. Na úl ima década o am desc i os di e sos no os ISF, dos quais se
des acam aqueles que o am isolados de espécies de mosqui o dos géne os Aedes spp. e
Culex spp. ais como o í us Lammi isolado de Ae. cine eus na Finlândia (Huh amo e
al., 2009), o í us Calbe ado de Cx. a salis colhidos no Canadá (Booling e al., 2011)
e o í us Nanay, isolado de Cx. ocossa no Pe ú (E angelis a e al., 2013). Descobe as
ecen es ele a am, igualmen e, a exis ência de ISF associados a espécies de mosqui os
hospedei os de ou os géne os (Calzola i e al, 2012), al como o í us Nakiwogo
isolado de Mansonia a icana nige ima no Uganda (Cook e al., 2009), o í us
Nounané isolado de U ano aenia mashonaensis na Cos a do Ma im (Junglen e al.,
2009) e o í us A ipo isolado de Pso opho a albipes (Augus e e al., dados po
publica ).
Embo a du an e os úl imos anos, a g ande maio ia dos es udos, mui o deles
e e uados com base em análises ilogené icas e de e olução molecula , enham
pe mi ido a iden i icação de di e sos no os la i í us, apidamen e se cons a ou, e
al ez de modo não su p eenden e, que a di e sidade dos í us com genomas de RNA
Iden i icação de nege í us em mosqui os colhidos no sul de Po ugal e análise da sua eplicação
1. In odução
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associados a inse os, e a mosqui os em pa icula , se es endia pa a além dos la i í us
(Figu a 1). Assim, oi possí el começa a iden i ica á ios í us especí icos de inse os
pe encen es a ou os géne os ais como, Alpha i us ( amília Toga i idae) do qual é
exemplo o í us Eila , isolado de mosqui os An. cous ani em Is ael (Nasa e al., 2012).
Fo am igualmen e p opos os no os axa, ais como o géne o Dino e na i us ( amília
Reo i idae), esul ado da iden i icação do eo í us de Aedes pseudoscu ella is (A oui
e al., 2005), enquan o alguns í us, ais como o ecen emen e designado í us
Gouléako, isolado em á ias espécies de mosqui os dos géne os Anopheles, Culex e
U ano aenia, na Cos a do Ma im (Ma klewi z e al., 2011), pe manecem po classi ica
den o da amília Bunya i idae. Recen emen e oi desc i a, inclusi amen e, uma no a
amília de í us especí icos de inse os, denominada Mesoni i idae (Laube e al., 2012),
incluída na O dem Nido i ales, e na qual o am incluídos (no géne o Alphamesoni i us)
o í us Ca ally isolado de Cx. nebulosus na Cos a do Ma im (Zi kel e al., 2011), o
í us Nam Dinh isolado de Cx. ishnui e Cx. i aenio hynchus no Vie name (Nga e al.,
2011), e o í us Casua ina, isolado de mosqui os Coquille idia xan hogas e na
Aus ália (Wa ilow e al., 2014).
Pa icula men e em Po ugal, algumas equipas de in es igação êm-se dedicado,
nos úl imos anos, à explo ação da di e sidade i al pa en e em populações na u ais de
mosqui os, sob e udo no sul do país, endo sido possí el, a é ao p esen e, iden i ica
alguns ISF como o la i í us de Culex heile i (CTFV) (Pa ei a e al., 2012) e o
la i í us de Ochle o a us caspius (OCFVPT) (Fe ei a e al., 2013). Cu iosamen e, e
aciden almen e, o OCFVPT oi coisolado a pa i de um lo e de mosqui os onde,
adicionalmen e, se cons a ou a p esença de um ou o í us ilogene icamen e dis in o,
a ualmen e colocado num g upo di e so de í us de RNA econhecidos como
nege í us, iden i icados em á ias espécies de inse os (mosqui os e lebó omos)
colhidos em á ios con inen es (Fe ei a e al., 2013; Vasilakis e al., 2013; Augus e e
al., 2014; Nabeshima e al., 2014). Es e g upo pa ece ep esen a um no o géne o
(Nege i us) de agen es i ais especí icos de inse os e se á u ilizado como obje o de
es udo na p esen e disse ação ( e secções seguin es).
Embo a os í us especí icos de inse os, desc i os a é hoje, não sejam
esponsá eis po causa em doenças a humanos ou ou os animais, o in e esse c escen e
pela sua o igem, e olução, e ecologia em con ibuído pa a a expansão do conhecimen o
Iden i icação de nege í us em mosqui os colhidos no sul de Po ugal e análise da sua eplicação
1. In odução
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básico sob e os mesmos. Adicionalmen e, a sua análise em le an ado ques ões que se
p endem com o seu po encial impac o na eplicação de ou os í us, endo es udos
ecen es desc i o que a coin ecção de mosqui os, ou linhas celula es deles de i adas,
com la i í us pa ogénicos e ISF, pode po encia , ou sup imi , a eplicação dos
p imei os, es ando os ISF di e amen e implicados na de e minação da compe ência dos
e o es (Bolling e al., 2012; Hobson-Pe e s e al., 2013; Kenney e al., 2014; Ken e
al., 2010; Ken e al., 2010).
1.3. Con ibu o do desen ol imen o das écnicas molecula es pa a a
descobe a de í us especí icos de inse os
An e io men e ao desen ol imen o de écnicas molecula es, baseadas em
ampli icações de sequências genómicas i ais, á ias écnicas como a il ação, a cul u a
em ecidos, a mic oscopia ele ónica, a se ologia e a acinação e am aplicadas na
de eção de í us (Mokili e al., 2012). Des as écnicas, os sis emas de cul u as celula es,
u ilizados pa a a descobe a de a bo í us, o na am-se pa icula men e impo an es,
sendo mesmo conside ados a ecnologia pad ão nes e campo.
Desde o apa ecimen o das p imei as abo dagens molecula es que a de eção da
maio ia de no os í us, bem como a sua análise e ca ac e ização, em sido e e uada com
base em p o ocolos de ampli icação de secções do genoma i al, baseados em dois ipos
de mé odos: dependen es e independen es de um conhecimen o a p io i das sequências
a de e a . A u ilização dos p imei os implica a ealização de eações de RT-PCR/PCR,
equen emen e p ecedidas do isolamen o dos í us em cul u as celula es. No en an o,
qualque abo dagem que implique a ampli icação, ainda que pa cial, de sequências
genómicas i ais das quais se possua um conhecimen o a p io i das sequências a
ampli ica , limi a, po si só, a possibilidade de se descob i em í us gene icamen e
di e gen es dos que se conhecem a é hoje. Além disso, o ac o de alguns í us se em
di íceis de man e em cul u a, ou a é mesmo incapazes de eplica em células man idas
in i o (Junglen e D os en, 2013; Canu i e Hoek, 2014), le am a limi ações impos as
po es e ipo de abo dagem, suge indo a ino ação de ecnologias, independen es de
sis emas de cul u as e/ou do conhecimen o p é io de sequências i ais e, com uma
Iden i icação de nege í us em mosqui os colhidos no sul de Po ugal e análise da sua eplicação
1. In odução
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cobe u a de de eção de no os í us mais ampla. O apa ecimen o dos mé odos
independen es de um conhecimen o p é io das sequências a ampli ica , pe mi i am
começa a analisa o con eúdo gené ico di e amen e a pa i de amos as ambien ais,
eco endo a eações de ampli icação alea ó ias, ou em que a ampli icação p e endida
depende da u ilização de p ime s que hib idam com moléculas a i iciais (linke s),
ligadas aos ex emos das sequências a ampli ica . Des as, me odologias como SISPA
(do inglês sequence-independen single p ime ampli ica ion), VIDISCA (do inglês
Vi us Disco e y cDNA-AFLP), RACE (do inglês Rapid Ampli ica ion o cDNA Ends),
ampli icação de DNA baseada na polime ase do ago phi-29 e me odologias baseadas
em mic oa anjos (mic oa ays) (Amb ose e Clewley, 2006), são alguns exemplos.
Po ém, a exis ência de sequências i ais maio i á ias, po oposição aos í us que se ão
mino i á ios, ep esen ou uma limi ação à iden i icação des es úl imos.
Nes e sen ido, pa alelamen e ao desen ol imen o des es mé odos, su giu uma
e olução na análise me agenómica, deco en e da expansão da u ilização de
me odologias de NGS (do inglês Nex Gene a ion Sequencing), as quais pe mi i am
soluciona a g ande maio ia dos p oblemas encon ados a é en ão, e, sem as quais a
descobe a de g ande pa e dos í us na úl ima década, incluindo os especí icos de
inse os, não e ia sido possí el. A ecnologia de NGS engloba uma sé ie de no as
me odologias de sequenciação, não baseada no mé odo de Sange (1977) mas sim em
sis emas que pe mi em de e a milha es de sequências a as ou mino i á ias, pelo ac o
de ge a milha es de lei u as a pa i de uma única amos a (Mokili e al., 2012; Hall,
2007). T a a-se de um conjun o de abo dagens ecnológicas que pe mi em iden i ica
á ias sequências genómicas de o ma ápida, p ecisa, pouco dispendiosa e com um
ele ado endimen o. Embo a es e mé odo ainda não enha sido di e amen e u ilizado
pa a analisa o i oma de mosqui os, oi u ilizado pa a sequencia í us de mosqui os
desconhecidos, mas p e iamen e isolados em cul u a (Junglen e D os en, 2013).
O apa ecimen o de no as me odologias molecula es, nomeadamen e a NGS, em
pe mi ido ap imo a o conhecimen o sob e a di e sidade de í us exis en e, en e os
quais no os í us especí icos de inse os, in e i algumas das suas ca ac e ís icas
molecula es, ais como as semelhanças com ou os agen es pa ogénicos e, ambém,
cla i ica as elações ilogené icas com ou os í us, pe mi indo especula sob e as suas
o igens. Embo a o desen ol imen o des as écnicas enha con ibuído bas an e pa a
Iden i icação de nege í us em mosqui os colhidos no sul de Po ugal e análise da sua eplicação
1. In odução
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Figu a 5 – Replicação de í us com genoma de ssRNA+. Após a en ada dos i iões po endoci ose, o
genoma i al é libe ado pa a o ci oplasma onde oco e a adução das p o eínas i ais (A). P o eínas
i ais ecém- aduzidas, associadas ao complexo eplica i o, ec u am o genoma i al na o mação de um
in e mediá io de dsRNA, o qual se e de ma iz à eplicação e ansc ição do genoma des es í us (B).
Adap ado de Ahlquis , 2006.
O ciclo eplica i o dos í us de ssRNA+ oco e exclusi amen e no ci oplasma, e
são já inúme os os es udos que êm indo a e ela que a eplicação do genoma i al
es á o emen e associada a um ex enso ea anjo nas memb anas in acelula es
(Denison, 2008; Mille e K ijnse-Locke , 2008). Análises ealizadas com ecu so à
mic oscopia ele ónica e ela am que á ios í us de ssRNA+ induzem uma al e ação na
con o mação das memb anas celula es de o ma a da em o igem a compa imen os
especí icos. Es a compa imen ação, pa a além de pe mi i uma concen ação dos
a o es de eplicação de o igem i al e p o eínas do hospedei o (suge indo con ibui
pa a maximiza a e iciência no p ocesso), pe mi e ambém, que a sín ese de RNA oco a
isicamen e sepa ada da adução. Além disso, es as es u u as pe mi em c ia um
ambien e que con e e a p o eção do complexo eplica i o da deg adação po nucleases
celula es e p o eases, implicadas nas espos as de de esa do hospedei o à p esença de
dsRNA, ais como as mediadas pelo in e e ão ou po RNA de in e e ência (RNAi)
(Schwa z e al., 2002).

Iden i icação de nege í us em mosqui os colhidos no sul de Po ugal e análise da sua eplicação
1. In odução
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As p incipais al e ações es u u ais nos compa imen os endomemb ana es das
células iden i icadas du an e a eplicação de á ios í us de ssRNA+ são essencialmen e
de dois ipos: o mação de es é ulas e de esículas de memb ana dupla. As es é ulas são
es u u as ap oximadamen e es é icas, com o igem em in aginações de memb anas de
di e en es o ganelos celula es, ais como o e ículo endoplasmá ico (ER do inglês
endoplasma ic e iculum). A o mação das es é ulas esul a de uma in e ação en e o
genoma i al, p o eínas i ais e possi elmen e algumas p o eínas celula es, sendo que o
seu in e io con ém complexos de eplicação i al e RNA i al sin e izado de no o. A
impo ação de ibonucleó idos pa a o in e io das es é ulas e a expo ação de RNA i al
sin e izado de no o pa a o ci oplasma pa ece se e e uada a a és de uma es u u a em
o ma de canal oco, denominada, na li e a u a, de neck-like, que esul a das
in aginações aquando da o mação das es é ulas, o qual delimi a um po o que pe mi e
que o in e io da es é ula con ac e di e amen e com o ci oplasma.
Um dos í us que melho exempli ica a o mação de es é ulas de i adas de
memb anas in e nas e ex e nas do ER é o í us do mosaico de b omeliáceas (BMV do
inglês b ome mosaic i us), um b omo í us que in e a plan as (Schwa z e al., 2002)
(Figu a 6A). Po ém, a o mação de es é ulas enquan o compa imen o no qual deco e a
eplicação i al não em uma o igem es i a ao ER. O í us lock house (FHV do inglês
lock house i us) é um noda í us que in e a células de inse o, e embo a enha um
hospedei o dis in o do BMV, possui um mecanismo de eplicação semelhan e ao
mesmo (Mille e Ahlquis , 2002). A eplicação do FHV oco e na mi ocônd ia, a a és
da o mação de nume osas es é ulas de eplicação, a pa i da memb ana ex e na do
e e ido o ganelo (Figu a 6B).
Iden i icação de nege í us em mosqui os colhidos no sul de Po ugal e análise da sua eplicação
1. In odução
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Figu a 6 – Imagens de mic oscopia ele ónica das al e ações memb ana es ca ac e izadas pela o mação
de es é ulas du an e a eplicação dos í us BMV e FHV e espe i os diag amas dos complexos
eplica i os. (A) O BMV induz a o mação de es é ulas associadas à memb ana do ER. É possí el
e i ica que as es é ulas se o mam a pa i do olhe o ci oplasmá ico (FC) da memb ana do ER em
di eção ao lúmen do mesmo (LRE). (B) O FHV induz a o mação de es é ulas po in aginação da
memb ana mi ocond ial ex e na, algumas com es u u as neck-like isí eis (*). Adap ados de Schwa z e
al., 2002 (A) e Kopek e al., 2007 (B).
Além des es dois exemplos, o í us da dengue (DENV do inglês dengue i us)
ep esen a ambém, um exemplo cla o de um í us que p o oca al e ações memb ana es
du an e a eplicação i al. A in eção po es e la i í us é ca ac e izada po induzi a
o mação de di e sas es u u as a pa i das memb anas do ER, ais como conjun os de
esículas (VP do inglês esicle packs), memb anas con olu as (CM do inglês
con olu ed memb anes) e memb anas associadas à mon agem e saída de i iões (Figu a
7A) (Welsch e al., 2009). Nes e caso em pa icula , pa ece exis i uma in e ligação em
con ínuo en e es u u as especi icamen e implicadas na eplicação do genoma i al e
es u u as implicadas na mo ogénese e saída de i iões, cons i uindo uma ede
memb ana de i ada do ER (ER – de i ed memb ane ne wo k) (Figu a 7B). Nes a ede
memb ana , as esículas in e nas cons i uin es dos VP são o iundas de in aginações da
memb ana ex e na do ER, possuindo uma conexão en e o in e io das mesmas e o
ci oplasma a a és de po os semelhan es aos das esículas de eplicação dos BMV e
FHV. Embo a no caso do DENV, o núme o de es u u as associadas à eplicação i al
seja supe io àquelas que são e idenciadas pa a o BMV e FHV, a me odologia
eplica i a é mui o semelhan e.
Iden i icação de nege í us em mosqui os colhidos no sul de Po ugal e análise da sua eplicação
1. In odução
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Figu a 7 – Imagens de mic oscopia ele ónica, a duas e ês dimensões, das al e ações memb ana es
associadas ao e ículo endoplasmá ico, induzidas pela eplicação do DENV. (A) O DENV induz a
o mação de conjun os de esículas (Ve) e memb anas con olu as (CM) ao edo das memb anas do
e ículo endoplasmá ico (ER). (B) P esença de ede memb ana de i ada do ER. As se as, p e a e
e melha, indicam pa ículas i ais em associação a es u u as de mon agem e saída de i iões. Adap ado
de Welsch e al., 2009.
Pa a além da o mação de es é ulas, ou a emodelação do sis ema
endomemb ana egis ada du an e a eplicação de de e minados í us, é a o mação de
esículas de memb ana dupla (DMV do inglês double-memb ane esicles),
iden i icadas como sendo locais de eplicação i al, de ido à p esença de in e mediá ios
eplica i os (dsRNA). Es e ipo de al e ação memb ana é exempli icada pelo í us do
sínd ome espi a ó io agudo se e o (SARS-V do inglês se e e acu e espi a o y
synd ome i us), dado que du an e a eplicação, es e í us induz a o mação, não só de
um ea anjo mis o de VP e CM mas ambém, de esículas apa en emen e ecobe as de
uma dupla memb ana lipídica (Figu a 8) (Knoops e al., 2008). A o mação de DMV
em o igem, essencialmen e, em memb anas do ER, e pa ecem es a in e ligadas en e si
a a és de es u u as ubula es (Figu a 8 I, II e III).
Iden i icação de nege í us em mosqui os colhidos no sul de Po ugal e análise da sua eplicação
1. In odução
20
Figu a 8 – Imagens de mic oscopia ele ónica, a duas e ês dimensões, das al e ações memb ana es
associadas ao e ículo endoplasmá ico, induzidas pela eplicação do SARS-V. A eplicação do í us
SARS induz a o mação de DMV, com memb anas in e nas (MIV) e ex e nas (MEV) apa en emen e
in e ligadas en e si a a és de es u u as ubula es I, II e III), e a sua ligação ao e ículo endoplasmá ico
(ER). Adap ado de Knoops e al., 2008.
Dis in amen e do que acon ece nas esículas eplica i as de BMV, FHV e
DENV, as esículas do SARS-V não pa ecem ap esen a po os de conexão en e o
in e io das mesmas e o ci oplasma, pe manecendo po escla ece os mecanismos de
impo ação de ibonucleó idos e expo ação de RNA sin e izado de no o. Uma das
possibilidades é que o anspo e seja e e uado po canais p o eicos, de ido à p esença
de múl iplos domínios ansmemb ana es numa g ande ex ensão do genoma do SARS-
V. Além disso, es udos e ela am que a p esença desses domínios é esponsá el pela
indução de DMV e pela anco agem do complexo eplica i o às mesmas (Oos a e al.,
2008).
1.6. Obje i os
No âmbi o do abalho expe imen al, que oi desen ol ido endo em is a a
ob enção do G au de Mes e em Ciências Biomédicas, oi p opos a a p esen e
disse ação, a qual e e como obje i os a de eção, isolamen o e ca ac e ização gené ica
de no os nege í us de mosqui os colhidos no sul de Po ugal, a de inição da sua gama
de hospedei os e o es udo das es a égias de eplicação dos mesmos usando células de
inse o man idas em cul u a.
Iden i icação de nege í us em mosqui os colhidos no sul de Po ugal e análise da sua eplicação
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2|
MATERIAL
E MÉTODOS

Iden i icação de nege í us em mosqui os colhidos no sul de Po ugal e análise da sua eplicação
2. Ma e ial e Mé odos
22
2.1. O igem e cap u a de mosqui os
Nes e es udo o am analisados mosqui os ( êmeas) adul os cap u ados no sul de
Po ugal (dis i o de Fa o), en e os meses de Ab il e Ou ub o, dos anos 2009 e 2010
(Cos a, 2010). A pa i de 26 locais de o igem, os mosqui os o am cap u ados em 23
pon os de colhei a, localizados em di e en es localidades incluídas em ês egiões
p incipais: egião oes e com pon os de colhei a dis ibuídos po Es e ei a (n=2),
Odiáxe e (n=2), Po imão (n=1) e Lagoa (n=1); egião cen o com pon os de colhei a
dis ibuídos po Almancil (n=1), Co go da Zo a (n=2), Dunas Dou adas (n=1), Es oi
(n=2), Ga ão (n=1), Pechão (n=2), Quin a das Salinas (n=1) e Quin a do Lago (n=1); e
egião es e cujos pon os de colhei a se localiza am em Ta i a (n=2), Junquei a (n=1) e
Cas o Ma im (n=3). Den o de cada egião, a dis ância máxima en e os pon os de
colhei a oi de 2,27 Km, 17,08 Km e 20,41 Km, espe i amen e, pa a as egiões oes e,
cen o e es e, que es a am sepa adas po 69,38 Km (oes e-cen o) e 57,38 Km (cen o-
es e). Todos os pon os de colhei a ica am localizados a uma dis ância máxima de 8,30
Km da cos a. Adicionalmen e, alguns mosqui os o am cap u ados na egião da
Compo a, mais especi icamen e na localidade da Gâmbia, si uada no dis i o de
Se úbal, ap oximadamen e a 50 Km de Lisboa. A seleção e dis ibuição dos pon os de
colhei a oi e e uada de o ma a bi á ia pelo Dou o Paulo Almeida e es an e equipa de
colabo ado es.
Os mosqui os o am cole ados median e o uso de a madilhas luminosas do ipo
CDC (Sudia e Chambe lain, 1962), u ilizando gelo seco como on e de CO2 (Newhouse
e al., 1966), colocadas es a egicamen e o a dos ab igos dos animais ou na sua
p oximidade, du an e um pe íodo de pelo menos 12 ho as. Al e na i amen e, alguns dos
mosqui os o am cap u ados em locais de epouso median e a u ilização de aspi ado es
mecânicos manuais. Todos os exempla es o am man idos i os e e ige ados a é
se em anspo ados pa a o labo a ó io de En omologia do Ins i u o de Higiene e
Medicina T opical (IHMT) onde o am, de imedia o, congelados a -80ºC. A
iden i icação mo ológica dos mosqui os oi e e uada sob e uma placa de io, com o
auxílio de um es e omic oscópio, u ilizando como e e ência a cha e de Ribei o e
Ramos (1999) e endo po base os axa de dis ibuição Eu opeia e e ida po Snow e
Ramsdale (1999). Pos e io men e, os exempla es o am ag upados em á ios lo es de
Iden i icação de nege í us em mosqui os colhidos no sul de Po ugal e análise da sua eplicação
2. Ma e ial e Mé odos
23
aco do com a espécie a que pe enciam, a egião de colhei a e a da a em que o am
cap u ados.
No o al o am analisados 2.586 mosqui os, dis ibuídos po 56 lo es e 10
espécies: Oc. caspius (n=17), Cx. heile i (n=15), Cx. pipiens (n=9), An. a opa us
(n=6), Cx. uni i a us (n=3) e Cx. lac icin us (n=2). As espécies An. alge iensis,
Culise a annula a, Cu. longia eola a e Ae. de i us ica am ep esen adas po um lo e
cada. Cada lo e oi compos o po um núme o de mosqui os que a iou en e 14 e 62.
2.2. P odução de mace ados de mosqui os
Os mace ados de mosqui os que compuse am cada um dos lo es analisados
o am ob idos po agmen ação mecânica dos inse os com o auxílio de es e as de id o,
na p esença de óxido de alumínio, segundo o p o ocolo desc i o po Huang e al. (2001).
Sucin amen e, cada lo e de mosqui os, independen emen e do núme o de exempla es
que con inha, oi i u ado com o auxílio de um ó ex após a adição de 1,5 mL de PBS
(Phospha e-Bu e ed Saline; ampão os a o salino) con endo 4 % de FBS (Fe al Bo ine
Se um; so o bo ino e al), 0,25 g de óxido de alumínio e 5 es e as de id o (com
ap oximadamen e 3 mm de diâme o). Os mace ados o am cen i ugados a 14.500 g
(10 minu os a 4ºC) e o sob enadan e oi ecolhido e es e ilizado po il ação a a és de
il os PVDF (poly inylidene di luo ide) Millex® (Millipo e, E.U.A.). As amos as
o am a mazenadas a -80ºC a é uso pos e io .
2.3. Manipulação de linhas celula es in e adas e não in e adas
2.3.1. Cul u a de células C6/36 e isolamen o i al
Fo am u ilizadas cul u as de uma linha celula denominada C6/36 (ATCC®
CRL-1660TM), de i ada de células la a es de Ae. albopic us. As células o am
man idas a 28ºC em meio de cul u a Leibo i z L-15 (Lonza, E.U.A.) suplemen ado com
10 % de FBS ina i ado po aquecimen o (Lonza, Bélgica), 2 mM de L-glu amina
(Gibco BRL, E.U.A.), es ep omicina (100 µg/mL), penicilina (100 U/mL), e meio de
Iden i icação de nege í us em mosqui os colhidos no sul de Po ugal e análise da sua eplicação
2. Ma e ial e Mé odos
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ip ose- os a o concen ado 1X (AppliChem GmbH, Alemanha). A passagem das
células oi e e uada uma ez po semana, numa diluição de 1:10, di e amen e a a és da
essuspensão (após des acamen o, po aspagem, da supe ície sólida do asco de
cul u a) das células em meio de cul u a no o. Es a linha celula oi u ilizada não só pa a
isola po enciais í us, mas ambém como hospedei a de ampli icação dos mesmos,
endo em is a es udos de eplicação i al ou, simplesmen e, p odução de lisados de al o
í ulo.
O isolamen o i al oi iniciado com a in eção de uma monocamada
subcon luen e de células C6/36 em ascos de cul u a T25 (Nunc, Dinama ca) com um
olume de 500 µL de mace ado de mosqui o es e ilizado po il ação ( al como desc i o
na secção 2.2.), diluído em igual olume de PBS. Após a adso ção dos í us às células,
que oco eu du an e 2 ho as, com agi ação sua e a 28ºC, o inóculo oi e i ado, as
células o am la adas com PBS e oi adicionado um olume de 5 mL de meio de cul u a
Leibo i z L-15, suplemen ado com 2 % de FBS. As cul u as celula es o am man idas
numa a mos e a a 28ºC a é um máximo de 96 ho as.
Du an e o empo de incubação as células o am egula men e obse adas
u ilizando um mic oscópio in e ido, e os e ei os ci opá icos (CPE, do inglês Cy opa hic
e ec ) egis ados em o og a ias digi ais. Em unção da magni ude do CPE obse ado,
o am e e uadas duas passagens cegas com pe íodos de 96 ho as cada, segundo o
p o ocolo acima e e ido e a pa i de 500 µL de cada sob enadan e de cul u a. Os
sob enadan es e os sedimen os das cul u as in e adas o am sepa ados po cen i ugação
(10 minu os a 250 g), ecolhidos e conse ados a -80ºC a é u u a u ilização.
2.3.2. Cul u a de células HEK293T
Ao longo des e abalho oi ambém u ilizada uma linha celula con ínua
designada HEK293T (ATCC® CRL-11268TM), compos a po células de im
emb ioná io humano. Es as células o am man idas a 37ºC, numa a mos e a húmida
com 5 % de CO2, em meio de cul u a DMEM (Dulbecco’s Modi ied Eagle Medium;
Lonza, E.U.A.) suplemen ado com 10 % de FBS, 1 mM de L-glu amina (Gibco BRL,
E.U.A.), es ep omicina 100 µg/mL, penicilina 100 U/mL, 1 mM de pi u a o de sódio e
Iden i icação de nege í us em mosqui os colhidos no sul de Po ugal e análise da sua eplicação
2. Ma e ial e Mé odos
25
0,1 mM de aminoácidos não essenciais (Sigma-Ald ich, E.U.A.). A passagem das
células oi e e uada de ês em ês dias, numa diluição de 1:10, po essuspensão
mecânica das células em meio de cul u a no o, endo es e sido mudado dois dias após
cada passagem.
2.3.3. T ans eção de células HEK293T e de células C6/36
O p o ocolo de ans eção das linhas celula es HEK293T e C6/36 o am
adap ados, espe i amen e, de Dong e al. (2007) e Ogay e al. (2006). Pa a e e ua
ambas as ans eções o am u ilizadas placas de 12 al éolos, nas quais o am semeadas
células em monocamada sob e lamelas de id o (12x12 mm), de aco do com as
condições de cada cul u a desc i as nas secções 2.3.1. e 2.3.2., numa concen ação de
2,5x105 células po al éolo.
Sucin amen e a écnica de ans eção das células HEK293T consis iu na adição
de 2 µg de DNA plasmídico a 200 µL de meio de cul u a DMEM não suplemen ado
com FBS, seguido da sua mis u a po in e são. Pos e io men e oi adicionada
polie ilenimina (PEI; 1 mg/mL, pH=7), numa azão de massa 1:1,5 (DNA:PEI), e a
mis u a oi man ida 10 minu os à empe a u a ambien e. Após subs i uição do meio de
cul u a das células a ans e a po DMEM suplemen ado com 2 % de FBS, adicionou-
se a mis u a con endo os complexos DNA:PEI, go a a go a, à monocamada de células
HEK293T. Es as o am incubadas a 37ºC em a mos e a húmida com 5 % de CO2
du an e 48 ho as.
Rela i amen e à ans eção da linha celula C6/36, o p o ocolo oi semelhan e,
exce uando alguns passos in e médios. Resumidamen e, a 200 µL de uma solução de
NaCl (150 mM) o am adicionados 2 µg de DNA plasmídico e, após agi ação, a mis u a
oi incubada num banho seco a 72ºC (7 minu os) pa a es e iliza a solução con endo as
moléculas de DNA a se em u ilizadas na ans eção p e endida. Findo o empo de
incubação, a mis u a a e eceu a é à empe a u a ambien e. Pos e io men e oi
adicionada PEI (1mg/mL, pH=7) numa azão de massa 1:1,5 e a mis u a oi man ida à
empe a u a ambien e du an e 10 minu os. O meio de cul u a das células C6/36 a
ans e a oi subs i uído po Leibo i z L-15 suplemen ado com 2 % de FBS e a mis u a
Iden i icação de nege í us em mosqui os colhidos no sul de Po ugal e análise da sua eplicação
2. Ma e ial e Mé odos
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Lo F
CGGCAATTTGGAATCGAAGAGGAACTTGTC
6352-63823
60,1ºC
Lo R
TGTGCGATGAACTTCGATACATTCCGGGTC
7219-72483
61,6ºC
DenzF
TAATTTGTGYGTTACYGCTCTKACTMGGCACAC
4846-48784
61,4ºC
DenzR
ATACGAACYTTRGGATTRCGTTTCAGAGAC
5923-59524
57,4ºC
DenzinR
GCKGGAGCAGGAGTGCTCAACMMCGG
5606-56314
66,3ºC
OpIE1-F
TATATGCTAGCTTGGTCATGCGAAACACGCACG
1661-16825
58,9ºC
OpIE1-R
TATATAAGCTTGTCAACACGTGCTGCAGCCCG
1971-19925
61,8ºC
o 1BamHI
ATATGGATCCATAATGGTCTTGCGAACACCCATGCCTCAC
6044-60666
59,9ºC
o 2BamHI
ATATGGATCCATAATGGCCGACGAACGCAATTTCAGTCAACTG
7256-72816
58,9ºC
o 3BamHI
ATATGGATCCATAATGGCTGCTGCCCCCCGAAAGCGATCTGCA
8628-86536
66,9ºC
o 1No I
ATTATATAGCGGCCGCCGAAATCACGACTGAACACAACTGTATG
7312-73386
56,5ºC
o 2No I
ATTATATAGCGGCCGCCTATGGAAGAATCTGAATAGATTTTTACACA
8543-85726
51,9ºC
o 3No I
ATTATATAGCGGCCGCCAGCGGTAGTTGTGTTCGGCGCGAGCGC
9221-92476
68,5ºC
F0
CCTTCACCCGGTTCAAGTATCTTG
31-542
55,8ºC
R0
CGGAGGCGATGTTGGTCCTCC
570-5902
60,1ºC
F11
TACACTCGTGTCACCACCGACGC
5197-52192
60,8ºC
R11
AATGCTGWGCGTTCTTRAACTGCG
6926-69492
57,6ºC
F13
CCTCCCGACTGACAAACCCTATTGC
8237-82612
59,8ºC
R13
GACGCGGACGTTATCGGGTGTGTCG
8999-90232
63,3ºC
F12
CTTCCGAACATGACCGACGAACGC
7243-72662
62,1ºC
NegPolR
CRGTGAGGTTRGGTTTCGGCTTGCG
6364-63882
62,4ºC
1NS5F
GCATCTAYAWCAYNATGGG
9035-90537
46,9ºC
1NS5R
CCANACNYNRTTCCANAC
10129-101467
48,2ºC
2NS5F
GCNATNTGGTWYATGTGG
9103-91207
47,2ºC

Iden i icação de nege í us em mosqui os colhidos no sul de Po ugal e análise da sua eplicação
2. Ma e ial e Mé odos
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2NS5R
CATRTCTTCNGTNGTCATCC
10103-101227
49,4ºC
As sequências sublinhadas co espondem aos locais de econhecimen o das enzimas de es ição BamHI (GGATCC),
No I (GCGGCCGC), NheI (GCTAGC) e HindIII (AAGCTT). As sequências a neg i o co espondem à sequência de
Kozak. 1 Posição ela i a a genomas de e e ência; 2 í us Nege , es i pe EO-329 [ al como desc i o po Fe ei a e al.
(2013)]; 3 í us Lo e o, es i pe 3940-83; 4 í us Dezigougou, es i pe A A 20086; 5 sequência de e e ência: Ve o
pIZT/V5-His (In i ogen, E.U.A.); 6 OCNV174 (HF913429); 7 í us do Nilo Ociden al, es i pe NY99- lamingo382-99
[ al como desc i o po Vázquez, e al. (2012)].
No a: Posições degene adas – R=G/A; Y=T/C; M=A/C; K=G/T; W=A/T; N=A/C/G/T
2.11. Ampli icações de sequências genómicas i al
2.11.1. Ampli icação de agmen os de DNA po PCR con encional
As eações de ampli icação de DNA po PCR con encional o am execu adas
eco endo, essencialmen e, a dois sis emas come ciais. Numa p imei a e apa oi
u ilizado o sis ema come cial Phusion RT-PCR Ki (The mo Fishe Scien i ic, E.U.A.)
que, pa a além de pe mi i a sín ese de cDNA a pa i de RNA p e iamen e ex aído
pe mi e, adicionalmen e, e e ua eações de ampli icação de sequências nucleo ídicas
a a és do uso da polime ase PhusionTM High-Fideli y DNA Polyme ase (The mo
Fishe Scien i ic, E.U.A.). Es a enzima é ca ac e izada pela sua apidez e e icácia e, po
possui uma ele ada capacidade de co eção de p o as (do inglês p oo eading),
ap esen ando uma axa de e o de 4,4x10-7. Como al, es e sis ema oi pa icula men e
u ilizado pa a ampli ica agmen os de genomas i ais de nege í us po encialmen e
p esen es nos mace ados de mosqui os p oduzidos. Pa a o as eio de nege í us o am
aplicadas abo dagens de nes ed-PCR ou hemines ed-PCR, de o ma a aumen a a
sensibilidade e especi icidade das ampli icações p e endidas. Pa a o as eio de genomas
de nege í us em ex a os de RNA p epa ados a pa i de mace ados de mosqui os o am
u ilizados ês conjun os de p ime s: NegF/NegR e NegF2/NegR o am u ilizados na
de eção de í us Nege , Piu a e Ngewo an; Lo Fou /Lo Rou e Lo F/Lo R o am
u ilizados na de eção de í us Lo e o; DenzF/DenzR e DenzF/DenzinR o am u ilizados
na de eção de í us San ana e Dezidougou. Es es ês g upos de p ime s, pa a além de
pe mi i em, e en ualmen e, de e a os í us acima e e idos, pe mi i iam ambém
de e a e en uais í us com sequências genómicas semelhan es aos mesmos, den o de
Iden i icação de nege í us em mosqui os colhidos no sul de Po ugal e análise da sua eplicação
2. Ma e ial e Mé odos
34
cada g upo. Ocasionalmen e oi u ilizado ou o pa de p ime s, NeginF/NeginR,
desenhado com o in ui o de apenas pe mi i a ampli icação de í us de ipo Nege ,
diminuindo a possibilidade de ampli icação de í us de ipo Piu a ou Ngewo an.
A polime ase de DNA do sis ema come cial Phusion RT-PCR Ki oi igualmen e
u ilizada pa a ampli ica agmen os de genoma i al passí eis de se em u ilizados em
p ocessos de clonagem. Os pa es de p ime s u ilizados pa a ampli ica os agmen os a
clona o am: OpIE1-F/OpIE1-R pa a ampli ica o p omo o OpIE1 (p omo o dos
genes de exp essão p ecoce-imedia a do í us da polied ose de O gyia pseudo suga a -
OpMNPV) localizado no e o pIZT/V5-His (In i ogen, E.U.A.) e
o 1BamHI/o 1No I, o 2BamHI/o 2No I e o 3BamHI/o 3No I pa a ampli ica
sequências codi ican es da polime ase i al e p o eínas ansmemb ana es (ORF1 e
ORF2), espe i amen e.
O p o ocolo de ampli icação oi execu ado segundo as ins uções do ab ican e
e, sucin amen e, consis iu na u ilização de um olume de 2,5 µL de ma iz de cDNA, ao
qual o am adicionados p ime s (diluídos a 10 pmol/mL), pa a uma concen ação inal
de 0,5 µM, ampão de eação (5X) pa a uma concen ação de 1X, mis u a de dNTPs (10
mM) pa a uma concen ação inal de 200 µM cada e polime ase PhusionTM (2 U/µL)
cuja concen ação inal oi de 0,02 U/µL. A eação oco eu num olume o al de 25 µL.
Pa a as eações de nes ed-PCR, ou hemines ed-PCR, o am u ilizados 2 µL do p odu o
de PCR ob ido na p imei a ampli icação endo sido man idas as concen ações da
mis u a de eação. Os p o ocolos de ampli icação consis i am num passo inicial de
desna u ação a 98ºC (30 segundos), seguindo-se 40 ciclos cons i uídos po um passo de
desna u ação a 98ºC (10 segundos), um passo de hib idação dos p ime s, em que a
empe a u a a iou en e os 52ºC e 55ºC (30 segundos) e um passo de ex ensão dos
mesmos a 72ºC (1 minu o), e minando com uma ex ensão inal a 72ºC (5 minu os). No
inal des e p ocesso, as mis u as de PCR o am man idas a 4ºC.
Al e na i amen e, oi u ilizada a mis u a come cial Sup eme NZYTaq 2x G een
Mas e Mix (NZYTech, Po ugal). O p o ocolo oi execu ado de aco do com as
indicações do ab ican e e as eações e e uadas a pa i de um olume de ma iz que
a iou en e 2 e 5 µL pa a olumes inais de 25 µL. Os p ime s (diluídos a 10 pmol/mL)
o am adicionados à mis u a de eação con endo o olume de ma iz es abelecido, de
modo a que a concen ação inal dos mesmos osse de 400 nM. Quan o às condições de
Iden i icação de nege í us em mosqui os colhidos no sul de Po ugal e análise da sua eplicação
2. Ma e ial e Mé odos
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ampli icação dos á ios agmen os p e endidos, oi u ilizado um p o ocolo de base que
consis iu num passo inicial de desna u ação a 94ºC (2 minu os), seguindo-se 40 ciclos
de uma e apa de desna u ação a 94ºC (30 segundos), uma e apa de hib idação, em que a
empe a u a a iou en e os 50ºC e 55ºC (30 segundos; em unção do pa de p ime s
u ilizados), e uma e apa de ex ensão a 72ºC, cujo empo a iou en e 45 segundos e 3
minu os (de aco do com o amanho do agmen o a ampli ica ). Po úl imo, oi e e uada
uma ex ensão inal a 72ºC (5 minu os) seguida de um passo de manu enção das eações
de ampli icação a 4ºC. As eações de ampli icação o am execu adas em dois
e mociclado es, de aco do com o olume inal da eação: e mociclado mycycle (Bio-
Rad, E.U.A.) e e mociclado PCR Exp ess (The no Hybaid, Reino Unido).
Os p odu os de ampli icação o am analisados po ele o o ese em géis de
aga ose, cuja concen ação a iou en e 1% e 1,5%, em ampão TAE 0,5X, na p esença
de b ome o de e ídio (0,5 µg/mL). A mig ação dos p odu os de ampli icação deco eu
com co en e en e os 80 e os 150 V, endo o empo da mesma a iado en e 1 a 2 ho as,
em unção do amanho dos agmen os ampli icados. Pa a es ima o amanho dos
agmen os ampli icados o am u ilizados dois ma cado es cons ando de mis u as de
á ios agmen os de DNA de di e en es massas molecula es nomeadamen e o
NZYDNA Ladde VI (NZY ech, Po ugal), essencialmen e pa a quan i ica e de e mina
o amanho de agmen os de DNA, en e 50 e 1500 pb (pa es de bases), e o Lambda –
pUC Mix Ma ke 4 (Fe men as, Li uânia) pa a analisa géis nos quais i essem sido
sepa ados agmen os de DNA com dimensões en e 421 e 19329 pb.
2.11.2. Ampli icação agmen os de DNA po PCR em empo eal
A ampli icação de agmen os eco endo à écnica de PCR em empo eal oi
execu ada com a mis u a come cial Maxima SYBR G een/ROX qPCR Mas e Mix 2x
(The mo Fishe Scien i ic, E.U.A.). Nes e caso, a de eção do p odu o de ampli icação
es á dependen e da emissão de luo escência esul an e da ligação de SYBR G een I ao
DNA ampli icado. O p o ocolo oi execu ado segundo as ins uções do ab ican e e
incluiu a u ilização de 2 µL de ma iz (cDNA), p ime s (diluídos 10 pmol/mL) pa a uma
Iden i icação de nege í us em mosqui os colhidos no sul de Po ugal e análise da sua eplicação
2. Ma e ial e Mé odos
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concen ação inal de 300 nM, e 12,5 mL de mis u a de eação. As eações de
ampli icação oco e am num olume o al de 25 µL.
Es a eação oi execu ada num e mociclado Ro o Gene 3000 (Co be
Resea ch, Reino Unido) endo sido u ilizado um p o ocolo em ês passos que consis iu
numa desna u ação inicial a 95ºC (10 minu os), seguida de 30 a 40 ciclos de
desna u ação ápida a 95ºC (15 segundos), hib idação a 60ºC (30 segundos) e ex ensão
a 72ºC (30 segundos). Em cada um dos ciclos, a de eção de luo escência oi e e uada
du an e o passo de ex ensão do p o ocolo usado.
2.12. Hid ólise de DNA com endonucleases de es ição
Os agmen os de DNA ampli icados po PCR e os plasmídeos u ilizados como
e o es de clonagem o am dige idos com as enzimas: BamHI (Fe men as, Li uânia),
HindIII (Fe men as, Li uânia), No I (Fe men as, Li uânia) e NheI (Fe men as,
Li uânia). Pon ualmen e oi u ilizada a enzima BglII (Fe men as, Li uânia) ( e secção
2.13.1.).
As eações de diges ão o am execu adas segundo as ins uções disponibilizadas
pelo o necedo come cial das enzimas u ilizadas e consis iu em p epa a uma mis u a
de eação, num olume que a iou en e 20 e 30 µL, que con i esse o DNA a hid olisa ,
ampão de eação (10X) pa a uma concen ação inal de 1X e a espe i a endonuclease
de es ição (10 U/µL) numa concen ação inal en e 0,5 e 1 U/µL. Como nem odos os
ampões de eação con inham BSA [bo ine se um albumine; albumina sé ica bo ina
(10X)] na sua composição, es a oi ocasionalmen e adicionada às mis u as de eação,
numa concen ação inal de 1X, pa a ga an i a es abilização enzimá ica quando as
diges ões e am e e uadas du an e a noi e. A mis u a de eação oi incubada numa es u a
a 37ºC du an e a noi e, ou à mesma empe a u a em banho-ma ia, du an e 2 ho as.
De ido à incompa ibilidade en e os ampões de eação e as espe i as a i idades
enzimá icas, oi e e uado um passo de diálise, após o pe íodo de incubação. As enzimas
o am ina i adas du an e 20 minu os, NheI a 65ºC e HindIII, BamHI e No I a 80ºC, e a
mis u a dialisada com água des ilada du an e 1 ho a, a a és do uso de il os de diálise
de 0,025µm VSWP (Millipo e, E.U.A.).
Iden i icação de nege í us em mosqui os colhidos no sul de Po ugal e análise da sua eplicação
2. Ma e ial e Mé odos
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2.13. Clonagem de p odu os de PCR
2.13.1. Clonagem no e o plasmídico pJe 1.2/blun
O e o plasmídico pJe 1.2/blun , cons i uin e do sis ema come cial CloneJETTM
Cloning Ki (Fe men as, Li uânia) ( e Anexo 1), oi u ilizado pa a a es abilização de
agmen os de genoma i al cujo endimen o de ampli icação demons ou se baixo de
um modo ep odu í el, e i ando assim a sua epe ida ampli icação a pa i de cDNA. O
pJe 1.2/blun consis e num e o plasmídico de clonagem, ap esen ado come cialmen e
sob a o ma de uma molécula linea e ca ac e izado po possui ex emidades cegas e
os o iladas em 5’, pe mi indo a clonagem de moléculas de DNA com ex emidades
cegas. A seleção de clones ecombinan es baseia-se no ac o des e e o possui um
gene que codi ica uma enzima de es ição (eco47IR), a qual é exp essa quando oco e a
eci cula ização do e o , impedindo a p opagação de clones bac e ianos em que es es
plasmídeos es ejam p esen es, como consequência da cli agem do DNA bac e iano.
Adicionalmen e, o e o anspo a um gene (bla) que codi ica pa a uma be a-
lac amase. Como al, apenas os clones ecombinan es que anspo em plasmídeos
de i ados de pJe 1.2/blun com inse os, e que sejam, po conseguin e, esis en es a
an ibió icos be a-lac âmicos como a ampicilina, são passí eis de se em e elados em
meio de cul u a con endo es e an ibió ico.
O p o ocolo de clonagem oi execu ado segundo as ins uções do ab ican e e
consis iu na p epa ação de uma mis u a de ligação com um olume inal de 10 µL
con endo 50 ng do plasmídeo pJe 1.2/blun linea izado, ampão de eação (2X)
concen ado 1X, ligase de DNA do ago T4 (5 U/µL) numa concen ação inal de 0,25
U/µL e 4 µL de cada um dos p odu os de PCR co esponden es aos agmen os a clona
numa concen ação inal de 0,15 pmol/µL. A mis u a de ligação oi man ida num
banho-ma ia a 16ºC du an e a noi e e, no inal des e pe íodo, a ligase de DNA oi
ina i ada a 65ºC du an e 15 minu os.
A seleção de clones po encialmen e ecombinan es oi e e uada, após
ans o mação de uma es i pe hospedei a, e al como desc i o na secção 2.14., em placas
de meio de cul u a LB (Lu ia-Be ani) sólido (1 % ip ona, 0,5 % ex a o de le edu a, 1
% NaCl, 1,5 % aga em água des ilada, pH=7) suplemen ado com ampicilina (100
µg/mL). A e i icação da p esença de inse o no e o oi e e uada median e a análise
da p esença de moléculas de DNA plasmídico com mig ação e a dada ela i amen e a

Iden i icação de nege í us em mosqui os colhidos no sul de Po ugal e análise da sua eplicação
2. Ma e ial e Mé odos
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moléculas sem inse o. A alidação dos esul ados oi e e uada pela análise de pe is de
es ição após a diges ão dos clones po encialmen e ecombinan es com a enzima BglII
(Fe men as, Li uânia), de aco do com o p o ocolo desc i o na secção 2.12.
Al e na i amen e, a con i mação da p esença de inse o oi e e uada median e
ampli icação po PCR con encional com o pa de p ime s come cial pJe 1.2 F (5’-
CGACTCACTATAGGGAGAGCGGC-3’) e pJe 1.2 R (5’-
AAGAACATCGATTTTCCATGGCAG-3’) (The mo Fishe Scien i ic, E.U.A.),
seguida de mig ação dos p odu os de ampli icação em ele o o ese em gel de aga ose, a
100 V du an e 1 ho a.
2.13.2. Clonagem de DNA usando o e o plasmídico pIC111
O plasmídeo pIC111 (Cheeseman e Desai, 2005), de i ado do plasmídeo
pcDNA 3.1 (In i ogen, E.U.A.) ( e Anexo 2), oi u ilizado pa a e e ua clonagens de
agmen os de DNA codi ican es de p o eínas po nege í us, ou de domínios des as.
Pa a a clonagem de agmen os de DNA op ou-se pela u ilização de uma
p opo ção mola de 3:1 (inse o: e o ), endo o p ocedimen o consis ido,
essencialmen e, em ês e apas: hid ólise de DNA com endonucleases de es ição,
seguida de uma cop ecipi ação de DNA e e minando com a p odução de mis u a de
ligação, pa a uso pos e io na ans o mação de bac é ias compe en es.
Após a hid ólise do DNA inse o/ e o com endonucleases de es ição ( e
secção 2.12.), oi e e uada uma cop ecipi ação da mis u a inse o/ e o de clonagem, de
o ma a pe mi i que o olume inal das mis u as de ligação a e e ua , osse o meno
possí el. A écnica de cop ecipi ação consis iu em adiciona ace a o de sódio (3M) e
glicogénio concen ado (20 mg/mL) nas azões de 1:10 e 1:100, espe i amen e, ao
olume de suspensão con endo o DNA, seguida da adição de 3 olumes de e anol (96
%). Após uma incubação a -70ºC (1,5 ho as) o DNA oi ecupe ado po cen i ugação a
14.500 g (30 minu os), la ado com e anol (70 %) e o sedimen o seco numa es u a a
37ºC (15 minu os). A mis u a de ligação oi ob ida após hid a ação do sedimen o de
DNA em 8 µL de água pu a e adição de ampão de eação concen ado (2X) pa a uma
concen ação inal de 1X e ligase (5 U/µL) numa concen ação inal de 0,25 U/µL. A
Iden i icação de nege í us em mosqui os colhidos no sul de Po ugal e análise da sua eplicação
2. Ma e ial e Mé odos
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eação oi e e uada num olume inal de 10 µL endo a mis u a de ligação sido incubada
numa banho-ma ia a 16ºC du an e a noi e, seguindo-se a ina i ação da ligase a 65ºC
du an e 15 minu os.
A seleção de e en uais clones ecombinan es oi e e uada, após ans o mação
como desc i o na secção 2.14., eco endo a placas de meio de cul u a LB sólido
suplemen ado com ampicilina (100 µg/mL).
2.14. P epa ação de células compe en es de Esche ichia coli e a sua
ans o mação po choque é mico
O p o ocolo de p epa ação de células compe en es u ilizado oi adap ado de
Chung e al. (1989) endo sido u ilizadas células de E. coli No aBlue (Me ck KGaA,
Alemanha). Resumidamen e, a p epa ação de células compe en es oi iniciada com a
ob enção de uma cul u a sa u ada de E. coli No a Blue em 5 mL de meio de cul u a LB
líquido suplemen ado com 12,5 µg/mL de e aciclina, a qual oi man ida du an e a noi e
a 37ºC com agi ação cons an e (220 pm). Pos e io men e, oi u ilizado um olume de
150 µL da cul u a sa u ada assim ob ida pa a inocula 15 mL de meio de cul u a LB
líquido ( azão 1:10) suplemen ado com ampicilina (100 µg/mL). A cul u a icou
incubada a 37ºC, com agi ação, a é a ingi uma densidade ó ica no in e alo (0,3-0,5), a
um comp imen o de onda de 600 nm. As células o am ecolhidas po cen i ugação a
3.300 g (30 minu os a 4ºC) e essuspendidas em 500 µL de TSS e ige ado
[T ans o ma ion and S o age Solu ion; 10 % PEG (Polye hylene Glycol;
polie ilenoglicol), 5 % DMSO (Dime hyl Sul oxide; dime ilsul óxido), 20 mM MgCl2
em meio de cul u a LB líquido].
Pa a a e apa de ans o mação o am u ilizados 200 µL de células essuspendidas
em TSS aos quais se adiciona am 5 µL de cada mis u a de ligação, p epa adas como
desc i o na secção 2.13.2., e a mis u a oi man ida no gelo (45 minu os) com agi ações
pe iódicas. Pos e io men e, oi e e uado o choque é mico a 42ºC du an e 45 segundos,
endo a suspensão bac e iana sido imedia amen e ecolocada no gelo du an e 5 minu os.
Findo esse empo, a suspensão bac e iana oi adicionada de 800 µL de meio de cul u a
SOC (Supe Op imal b o h wi h Ca aboli e ep ession; Hanahan, 1983) e incubada a
Iden i icação de nege í us em mosqui os colhidos no sul de Po ugal e análise da sua eplicação
2. Ma e ial e Mé odos
40
37ºC (1 ho a) com agi ação (80 pm). A suspensão bac e iana oi, em seguida, semeada
(alíquo as de 200 µL) em placas com meio de cul u a LB sólido suplemen ado com
ampicilina (100 g/mL), seguida da incubação das mesmas numa es u a a 37ºC du an e
a noi e.
2.15. Ex ação, em pequena escala, de DNA plasmídico po lise alcalina
O as eio de clones bac e ianos possi elmen e ecombinan es oi e e uado com
ecu so a uma análise do DNA plasmídico de clones bac e ianos indi iduais, ob ido
a a és de uma ex ação do mesmo po lise alcalina, segundo o p o ocolo desc i o po
Samb ook e al. (1989). Colónias bac e ianas p esen es em placas com meio de cul u a
LB sólido, co esponden es a clones possi elmen e ecombinan es, o am epicadas com
o auxílio de um pali o es é il, inoculadas em meio de cul u a LB líquido suplemen ado
com ampicilina (100 µg/mL) e incubadas a 37ºC com agi ação (220 pm) du an e a
noi e. A pa i de cada cul u a isolada oi e e uada a ex ação de DNA plasmídico e a
écnica u ilizada oi iniciada com a ecolhei a das células con idas em 2 mL de cul u a
po cen i ugação a 14.500 g (2 minu os), seguida da essuspensão do sedimen o celula
em 250 µL de solução TEG (25 mM T is-HCl pH=8,0, 1 mM EDTA, 1 % Glucose).
Pos e io men e, oi adicionado igual olume de solução de lise (0,2 M NaOH,
1,5 % SDS), pa a p omo e a lise bac e iana, seguida de igual olume de solução de
ace a o de po ássio (3 M) pa a neu aliza o pH dos lisados. A mis u a oi cen i ugada a
14.500 g (15 minu os), o sob enadan e ecolhido e os ácidos nucleicos p ecipi ados po
cen i ugação a 14.500 g (25 minu os) após a adição de 700 µL de isop opanol absolu o.
O sedimen o con endo ácidos nucleicos oi la ado com e anol (70 %), seco na
es u a a 37ºC (15 minu os) e essuspendido em 30 µL de ampão TE suplemen ado com
100 µg/mL de RNase. O DNA oi incubado em banho-ma ia a 37ºC (30 minu os) pa a
deg ada o RNA p esen e.
Após a ex ação do DNA plasmídico, os clones ecombinan es o am
selecionados median e a análise do seu pe il ele o o é ico em géis de aga ose (como
desc i o na secção 2.11.1.), a 100 V du an e 1 ho a, po compa ação ao pe il de
plasmídeos de igual amanho desp o idos de inse o. A con i mação da p esença de
Iden i icação de nege í us em mosqui os colhidos no sul de Po ugal e análise da sua eplicação
2. Ma e ial e Mé odos
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clones ecombinan es oi igualmen e e e uada pela análise do pe il de ele o o ese após
diges ão com enzimas de es ição BamHI (Fe men as, Li uânia) e No I (Fe men as,
Li uânia), de aco do com o p o ocolo desc i o na secção 2.12.
2.16. Pu i icação de DNA
2.16.1. Pu i icação de moléculas de DNA ampli icadas po PCR
Pa a e e ua a pu i icação de moléculas de DNA ampli icadas po PCR o am
u ilizados dois sis emas come ciais, ambos execu ados de aco do com as suges ões do
ab ican e.
O sis ema ZymocleanTM Gel DNA Reco e y Ki (Zymo Resea ch, E.U.A.)
pe mi iu e e ua uma pu i icação de DNA a pa i de bandas con idas em géis de
aga ose. Pa a al, oi excisada uma secção do gel de aga ose con endo as moléculas de
DNA p e endidas, seguida da adição de 3 olumes do ampão dissol en e de aga ose
(ADB) e incubada a 55ºC (10 minu os) a é a aga ose se dissol e na o alidade. A
mis u a dissol ida assim ob ida, oi ans e ida pa a uma coluna (Zymo-SpinTM Column)
à qual, e após cen i ugação, ica am adso idas as moléculas de DNA. Pos e io men e,
a coluna oi la ada com uma solução de la agem (Wash Bu e ) e o DNA eluído, po
cen i ugação, em 10 µL de água es é il.
Em al e na i a, oi u ilizado o sis ema DNA Clean & Concen a o TM -5 (Zymo
Resea ch, E.U.A.) que pe mi iu pu i ica , e concen a , DNA di e amen e a pa i da
solução con endo ácidos nucleicos. Sucin amen e, oi adicionada uma solução
amponada (DNA Binding Bu e ), numa azão de 5:1 ( ampão:DNA) à solução
con endo as moléculas DNA, de o ma a que es as se ligassem a uma coluna (Zymo-
SpinTM Column). Após ans e ência da mis u a con endo o DNA pa a a coluna, es a oi
la ada e o DNA ecolhido po cen i ugação em 10 µL de ampão de eluição (DNA
Elu ion Bu e ).
A a aliação do endimen o das pu i icações execu adas, eco endo a ambos os
sis emas, oi e e uada po ele o o ese em gel de aga ose a 1 % (p/ ), a 80 V du an e 30
minu os.
Iden i icação de nege í us em mosqui os colhidos no sul de Po ugal e análise da sua eplicação
3. Resul ados
48
uso de p a icamen e odos os ex a os de cDNA analisados. No en an o, oi possí el
iden i ica a p esença de algumas bandas com maio in ensidade, usando ex a os de
RNA p epa ados a pa i de mace ados de mosqui os da espécie Oc. caspius. Apesa de
apenas uma das bandas, associada ao ex a o do lo e 390, e e elado a dimensão
espe ada pa a o agmen o ampli icado (ap oximadamen e 800 pb), as bandas
associadas aos ex a os dos lo es 183, 494 e 539 o am igualmen e conside adas como
indica i as de po enciais p odu os de ampli icação de sequências i ais (Figu a 10A).
Além disso, oi ambém possí el iden i ica a p esença de ês p odu os de ampli icação
com ap oximadamen e 800 pb cada, e e en es aos ex a os p epa ados a pa i dos lo es
de mace ados de mosqui os das espécies Cx. pipiens, iden i icados po 204 e 292, e Cx.
uni i a us, iden i icado po 730 (Figu a 10B). Cu iosamen e, os ex a os de RNA
e e en es aos lo es 204 e 730 inham an e io men e e elado a p esença de agmen os
de ampli icação com o amanho espe ado, ao u iliza o pa de p ime s NegF/NegR
(Figu a 9).
Figu a 10 – Ras eio da p esença de í us de ipo Nege , Piu a, Ngewo an, e/ou í us gene icamen e
semelhan es a es es, em ex a os de RNA p epa ados a pa i de mace ados de mosqui os das espécies (A)
Oc. caspius, (B) Cx pipiens (204 e 292) e Cx. uni i a us (730). Os p odu os de ampli icação de pa e da
sequência codi ican e da ORF1, co esponden e a uma egião do domínio da RdRp o am sepa ados po
ele o o ese em gel de aga ose 1 % (p/ ). M – Ma cado de massas molecula es: NZYDNA Ladde VI
(NZY ech, Po ugal).
O as eio de í us de ipo Lo e o, e/ou e en uais í us com sequências
genómicas semelhan es a es es, oi e e uado u ilizando uma abo dagem semelhan e à
an e io men e desc i a, mas des a ei a u ilizando os pa es de p ime s Lo Fou /Lo Rou
(ex e nos) e Lo F/Lo R (in e nos). Nes e caso, as sequências de í us Lo e o disponí eis

Iden i icação de nege í us em mosqui os colhidos no sul de Po ugal e análise da sua eplicação
3. Resul ados
49
nas bases de dados, e ela am-se bas an e idên icas, pelo que o conjun o de p ime s
desenhado demons ou uma al a conse ação (Tabela 1). P ecisamen e de ido à sua
baixa degene ação, os p ime s u ilizados de e iam pe mi i ampli ica , de o ma mais
especí ica, genomas des es í us caso es i essem p esen es nos ex a os de RNA
p epa ados. Em al e na i a, não se espe a ia a ob enção de p odu os de ampli icação
caso i) genomas des es í us não es i essem p esen es nos ex a os de RNA, e/ou ii)
ossem gene icamen e di e en es dos í us Lo e o desc i os a é en ão, limi ando a
capacidade de hib idação dos p ime s u ilizados.
De aco do com a análise dos esul ados das eações de ampli icação e e uadas a
pa i dos ex a os RNA ob idos de mosqui os de odas as espécies analisadas, oi
possí el iden i ica um o al de dois ex a os, ambos p epa ados a pa i de mace ados
de mosqui os da espécie Oc. caspius, pa a os quais a p esença de p odu os de
ampli icação se ia compa í el com a p esença de sequências de í us Lo e o. O as eio
e e uado com o pa de p ime s Lo Fou /Lo Rou pe mi iu obse a a p esença de um
p odu o de ampli icação com ap oximadamen e o amanho espe ado (1050 pb), e
e e en e ao ex a o 390 (Figu a 11). Quan o aos esul ados de nes ed-PCR, na qual oi
u ilizado o pa de p ime s Lo F/Lo R os quais de e iam pe mi i ampli ica um
agmen o com ap oximadamen e 900 pb, oi possí el iden i ica um p odu o de
ampli icação, com ap oximadamen e o amanho espe ado, co esponden e ao ex a o
837 (Figu a 11). Cu iosamen e, o ex a o co esponden e ao lo e 390 oi an e io men e
indica i o de con e sequências de nege í us, pa icula men e de í us Nege .
Figu a 11 – Ras eio da p esença de í us Lo e o e/ou í us gene icamen e semelhan es a es es, em
ex a os de RNA p epa ados a pa i de mace ados de mosqui os da espécie Oc. caspius. Os p odu os de
ampli icação de pa e da sequência codi ican e da ORF1, co esponden e a uma egião do domínio da
RdRp o am sepa ados po ele o o ese em gel de aga ose 1 % (p/ ). M – Ma cado de massas
molecula es: NZYDNA Ladde VI (NZY ech, Po ugal)
Iden i icação de nege í us em mosqui os colhidos no sul de Po ugal e análise da sua eplicação
3. Resul ados
50
A en a i a de de eção de í us San ana/ Dezidougou, e/ou e en uais í us com
sequências genómicas semelhan es a es es, oi igualmen e e e uada po ampli icação po
RT-PCR u ilizando um p o ocolo de nes ed-PCR e dois pa es de p ime s: DenzF/DenzR
(ex e nos) e DenzF/DenzinR (in e nos).
De aco do com os esul ados das eações de ampli icação e i icou-se que, a
g ande maio ia dos p odu os de ampli icação ob idos e ela am-se pouco abundan es e
não-especí icos. No en an o, oi possí el iden i ica um ex a o de RNA que e elou a
p esença de um p odu o de ampli icação, p esen e em mui o baixa quan idade, com
ap oximadamen e 785 pb, co esponden e à dimensão espe ada pa a agmen os
ampli icados com o pa de p ime s DenzF/DenzinR (Figu a 12). Embo a o e e ido
ex a o de cDNA, p epa ado a pa i de RNA ex aído de um mace ado de mosqui os da
espécie Cx. heile i iden i icado po 392, enha e elado a p esença de um p odu o de
ampli icação com a dimensão espe ada, a julga pela sua baixa abundância pode ia se
in e p e ado, não necessa iamen e, como suges i o da p esença de í us do ipo
as eado, mas sim indica i o de uma ampli icação não especí ica. A endendo à
especi icidade ela i a dos p ime s degene ados u ilizados, a p esença numa amos a
biológica, de genomas i ais com semelhanças ela i as aos que í us as eados pode,
casuis icamen e, ge a p odu os de ampli icação quando es es genomas são usados
como ma iz. Ainda assim, es e lo e oi selecionado pa a pos e io isolamen o em
cul u a celula pela e en ual possibilidade de con e genomas i ais.
Figu a 12 – Ras eio da p esença de í us San ana e Dezidougou, e/ou í us gene icamen e semelhan es a
es es, em ex a os de RNA p epa ados a pa i de mace ados de mosqui os da espécie Cx. heile i. Os
p odu os de ampli icação de pa e da sequência codi ican e da ORF1, co esponden e a uma egião do
domínio da RdRp o am sepa ados po ele o o ese em gel de aga ose 1 % (p/ ). M – Ma cado de massas
molecula es: NZYDNA Ladde VI (NZY ech, Po ugal
Iden i icação de nege í us em mosqui os colhidos no sul de Po ugal e análise da sua eplicação
3. Resul ados
51
No inal do as eio e e uado, oi possí el euni um conjun o de no e lo es de
mace ados po encialmen e suges i os de con e em genomas de nege í us, cons i uídos
po mosqui os de di e en es espécies e cap u ados em pon os de colhei a dis ibuídos
po odas as egiões do Alga e em es udo: cen o, ap oximadamen e de Loulé a Olhão;
oes e, ap oximadamen e en e os concelhos de Lagos e Albu ei a; e es e
ap oximadamen e de Ta i a a Vila-Real de San o An ónio (Figu a 13). Todos os lo es
pa a os quais os esul ados de ampli icação ob idos o am nega i os, ou e ela am a
p esença de p odu os de ampli icação com dimensões que aduziam, com g ande
p obabilidade, ampli icações não especí icas, não o am mais conside ados ao longo
des e abalho.
Os lo es iden i icados a e de na igu a 13 ep esen am os mace ados de
mosqui o de onde oi possí el isola , e e i amen e nege í us ( e secções seguin es).
Figu a 13 – Dis ibuição de sequências de p esumí eis nege í us em di e en es espécies de mosqui os
cap u ados no Alga e. Mapa do Alga e e pon os de colhei a dis ibuídos po ês egiões p incipais:
oes e, cen o e es e. Iden i icação dos lo es de mace ados e espécies de mosqui os po encialmen e
suges i os de con e em genomas de nege í us e espe i os pon os de colhei a. Em e de es ão
ep esen ados os lo es de mace ados de onde oi possí el isola nege í us. Adap ado de Cos a, 2011.
3.2. Isolamen o i al e análise mic oscópica de células C6/36 in e adas
A obse ação de p odu os de ampli icação indica i os da p esença de sequências
de genomas i ais em no e lo es de mace ados de mosqui os as eados le ou à
Iden i icação de nege í us em mosqui os colhidos no sul de Po ugal e análise da sua eplicação
3. Resul ados
52
en a i a de isolamen o dos mesmos, u ilizando cul u as de células de inse o,
especi icamen e da linha celula C6/36 (desc i o na secção 2.3.1.). De o ma a en a
ge i e en abiliza os cus os e o abalho ine en es à ealização dos ensaios p opos os,
oi ei a uma seleção p é ia dos lo es de mace ados de mosqui os a isola em cul u a,
endo em con a a di e sidade de espécies de mosqui os pa a os quais os esul ados
ob idos e am indica i os da p esença de sequências de nege í us. Pa a al, dos no e
lo es de mace ados iden i icados du an e os as eios o am selecionados se e,
co esponden es aos lo es 183, 204, 292, 390, 392, 539 e 730, pa a que hou esse uma
ep esen ação di e si icada das á ias espécies de mosqui o em es udo. Adicionalmen e,
o am analisados ês lo es de mace ados an e io men e analisados no labo a ó io de
Vi ologia do IHMT e iden i icados com os códigos 207, 350 e 595. Es es ês lo es e am
compos os po mosqui os êmeas (adul os) da espécie Oc. caspius (Cos a, 2011) e
e ela am a p esença de la i í us de inse os, especi icamen e OCFVPT, sendo que, dois
dos mace ados, iden i icados com os códigos labo a o iais 207 e 350, e ela am
ambém a p esença de nege í us (Fe ei a e al., 2013). Na o alidade o am analisados
dez lo es de mace ados, de onde, po encialmen e se pode iam i a isola nege í us.
Pa a a maio ia dos lo es (à exceção dos lo es 595 e 730) o am e e uadas duas
passagens cegas, no inal das quais se o na am mui o e iden es e ei os ci opá icos. A
a aliação do CPE oi e e uada a a és de uma compa ação en e cul u as de células
expos as a alíquo as dos mace ados de mosqui os co esponden es a cada um dos lo es
selecionados pa a es a segunda e apa do abalho, e células não in e adas, u ilizadas
como con olo nega i o.
Dos dez lo es analisados, as células expos as ao mace ado co esponden e ao
lo e 595, no qual se inha e i icado an e io men e a p esença do la i í us OCFVPT
(Fe ei a e al., 2013), e ela am um CPE ca ac e ís ico de ISF, que quando compa ado
às células do con olo nega i o (Figu a 14A), e elou se ligei o, e ca ac e izou-se
essencialmen e po uma pa agem do c escimen o celula e o mação de alguns
ag egados celula es (Figu a 14B). Os lo es de mace ados 207 e 350 o am igualmen e
selecionados pa a o isolamen o i al, dado que nes es, a p esença de genomas de
nege í us, pa a além do de OCFVPT, inha sido e elada po RT-PCR (Fe ei a e al.,
2013). Cu iosamen e, embo a o CPE obse ado nas células expos as ao mace ado do
lo e 207, que oi em udo mui o semelhan e ao lo e 350, enha e elado ca ac e ís icas
Iden i icação de nege í us em mosqui os colhidos no sul de Po ugal e análise da sua eplicação
3. Resul ados
53
an e io men e desc i as pa a as células expos as ao mace ado 595 (is o é CPE ípico de
la i í us), e elou ambém uma diminuição do amanho das células, associada a um
a edondamen o das mesmas (Figu a 14C).
Figu a 14 – Obse ação po mic oscopia ó ica (ampliação de 400x) de células C6/36 não in e adas (A) e
72h após in eção com uma alíquo a do mace ado 595, na qual oi de e ada a p esença de la i í us (B) e
do mace ado 207, no qual oi de e ada a p esença de la i í us OCFVPT em simul âneo com nege í us
(C).
As cul u as celula es expos as aos mace ados dos es an es lo es analisados (183,
204, 292, 390, 392, 539 e 730), e ela am CPE com ca ac e ís icas mui o semelhan es,
embo a as células expos as aos mace ados dos lo es 183, 204, 292, 390, 392 e 539
enham ap esen ado um CPE menos ex enso compa a i amen e às células expos as ao
mace ado do lo e 730. Po compa ação com as células do con olo nega i o (Figu a
15A) cons a ou-se que 24 ho as após o início da in eção com uma alíquo a do mace ado
730, o CPE obse ado e a e iden e e ex enso, e que a g ande maio ia das células se
encon a am desag egadas da monocamada que o ma am inicialmen e, des acando-se
do supo e ísico e o nando-se apa en emen e meno es e mais a edondadas (Figu a
15B). Es e e ei o oi-se o nando mais se e o com o deco e da eplicação i al, de al
o ma que 48 ho as após a in eção e i icou-se o des acamen o da quase o alidade das
células do supo e e a o mação de á ios aglome ados celula es (Figu a 15C).
Deco idas 72 ho as após a in eção, o CPE oi gene alizado em oda a cul u a in e ada
(Figu a 15D). As células expos as ao mace ado co esponden e ao lo e 730 o am as que
ap esen a am um CPE mais semelhan e àquele que oi an e io men e obse ado como
indica i o da eplicação de nege í us (Fe ei a e al., 2013), o qual se eio a con i ma
( e secção 3.4.).

Iden i icação de nege í us em mosqui os colhidos no sul de Po ugal e análise da sua eplicação
3. Resul ados
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Figu a 15 – Obse ação po mic oscopia ó ica (ampliação de 400x) de células C6/36 não in e adas (A) e
24h (B), 48h (C) e 72h (D, ampliação de 200x) após in eção com um mace ado 730 de mosqui os da
espécie Cx. uni i a us.
A en a i a de ca ac e ização dos í us isolados, e a a aliação da e en ual
p esença de mais do que um í us ( la i í us) num mesmo sob enadan e de cul u a
(coisolamen o) oi e e uada median e a ampli icação de pa e dos seus genomas po RT-
PCR, u ilizando ex a os de cDNA p epa ados a pa i dos sob enadan es de cul u a
e e en es a cada um dos lo es de mosqui os, a pa i dos quais se en a am isola í us.
Análises an e io es pe mi i am cons a a a p esença de mais do que um í us em
sob enadan es de cul u as expos as a alguns mace ados de Oc. caspius, enquan o que
nou os oi apenas de e ada a p esença (com consequen e isolamen o em cul u as
celula es C6/36) de OCFVPT (Fe ei a e al., 2013). Po essa azão, nes e ensaio oi
u ilizada uma abo dagem semelhan e, endo sido es ada a p esença que de la i í us,
que de nege í us, u ilizando di e en es conjun os de p ime s, en e os quais
1NS5F/1NS5R e 2NS5F/2NS5R (Vázquez e al., 2012), que pe mi iam ampli ica pa e
da sequência codi ican e da p o eína NS5 de la i í us (igualmen e codi ican e pa a a
RdRp i al); NegF/NegR, an e io men e e e ido no as eio de sequências de nege í us
e NeginF/NeginR, o qual inha pe mi ido, an e io men e, a ampli icação especí ica de
pa e do genoma de um nege í us (igualmen e codi ican e de pa e da RdRp i al),
isolado de um mace ado de mosqui os da espécie Oc. caspius (OCNV174) no labo a ó io
de Vi ologia do IHMT (Fe ei a e al., 2013).
O ensaio de de eção de sequências i ais a a és da sua ampli icação po RT-
PCR usando os p ime s Lo Fou /Lo Rou e DenzF/DenzR não e elou a p esença de
Iden i icação de nege í us em mosqui os colhidos no sul de Po ugal e análise da sua eplicação
3. Resul ados
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p odu os de ampli icação em nenhum dos ex a os de cDNA p epa ados a pa i de cada
sob enadan e de cul u a dos lo es de mace ados analisados.
Quan o aos esul ados de ampli icação po RT-PCR de pa e da sequência
codi ican e pa a o domínio da polime ase i al, localizado no ex emo ca boxilo da
ORF1, es es suge i am, de ac o, a p esença de genomas de nege í us no sob enadan e
de se e cul u as expos as aos mace ados dos lo es 183, 204, 207, 292, 350, 390, 392,
539 e 730. Em cada ex a o de cDNA, p epa ado a pa i dos sob enadan es expos os
aos mace ados dos e e idos lo es, oi possí el obse a a p esença de agmen os de
ampli icação especí ica, com ap oximadamen e 1260 pb e 1000 pb, co esponden es aos
amanhos espe ados pa a agmen os ampli icados, com ecu so aos pa es de p ime s
NegF/NegR e NeginF/NeginF, espe i amen e (Figu as 16A e C). Todos os p odu os de
ampli icação se ca ac e iza am pela p esença de bandas in ensas, em pa icula no
ex a o e e en e ao lo e 730 (Figu a 16A), p o a elmen e suge indo um í ulo i al
ele ado. Dada a especi icidade, e abundância, dos p odu os de ampli icação ob idos a
pa i do sob enadan e de células expos as ao mace ado do lo e 730, e o CPE p o uso
obse ado 48 ho as após in eção de células C6/36 (Figu a 15C), op ou-se po não
e e ua uma segunda ampli icação (usando NeginF/NeginR), assumindo-se a p esença
de nege í us no sob enadan e de cul u a em causa. O lo e 595 ambém não oi as eado
com o e e ido pa de p ime s, dado a a -se de um lo e no qual a p esença de la i í us
e ausência de nege í us inha sido an e io men e con i mada (Fe ei a e al., 2013).
O as eio e e uado com os pa es de p ime s que pe mi iam ampli ica pa e da
sequência do gene NS5 de la i í us indicou a p esença de p esumí eis genomas i ais
nos sob enadan es de cul u a expos os a cinco lo es de mace ados de mosqui os: 183,
207, 350, 539 e 595. A análise de ex a os de cDNA p epa ados a pa i dos espe i os
sob enadan es de cul u as de células C6/36 in e adas, pe mi iu a de eção de agmen os
de ampli icação com as dimensões an ecipadas, de aco do com o pa de p ime s usado,
is o é ap oximadamen e 1100 pb (1NS5F/1NS5R) e 1000 pb (2NS5F/2NS5R), os quais
se iam indica i os da p esença de sequências de ISF (Figu as 16B e D). Os esul ados
ob idos ela i amen e à de eção de í us nos sob enadan es de cul u as expos as a
alíquo as dos lo es 207, 350 e 595 con i ma am obse ações an e io es (Fe ei a e al.,
2013), e elando a p esença de la i í us.
Iden i icação de nege í us em mosqui os colhidos no sul de Po ugal e análise da sua eplicação
3. Resul ados
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Figu a 16 – Iden i icação da p esença de genomas de nege í us e la i í us po RT-PCR em ex a os de
cDNA p epa ados a pa i de sob enadan es de cul u a após isolamen o i al. Ele o o ese em gel de
aga ose 1 % (p/ ) dos esul ados das eações de ampli icação u ilizando os pa es de p ime s NegF/NegR
(A) e NeginF/NeginR (C) e os pa es de p ime s 1NS5F/1NS5R (B) e 2NS5F/2NS5R (D). M – Ma cado
de massas molecula es: NZYDNA Ladde VI (NZY ech, Po ugal).
No o al, oi possí el iden i ica a p esença po encial de genomas de nege í us
em seis sob enadan es de cul u a ob idos após o seu isolamen o, a pa i de mace ados
cons i uídos po mosqui os das espécies Oc. caspius (183, 207, 350, 390 e 539), Cx.
pipiens (204 e 292), Cx. heile i (392) e Cx. uni i a us (730), aduzidos não só pelas
ca ac e ís icas do CPE obse ado, mas ambém, e sob e udo, pela p esença de
agmen os de ampli icação especí ica de sequências i ais. Ve i icou-se, ambém, a
p esença suges i a de genomas de la i í us em cinco sob enadan es de cul u a, odos
in e ados com mace ados cons i uídos po mosqui os da espécie Oc. caspius (183, 207,
350, 539 e 595) e a p esença concomi an e de genomas de nege í us e la i í us em
sob enadan es de cul u a co esponden es ao isolamen o de qua o lo es de mace ados
cons i uídos po mosqui os da espécie Oc. caspius (183, 207, 350 e 539).
3.3. Análises ilogené icas das sequências de nege í us ob idas
Análises ilogené icas das sequências codi ican es pa a pa e da ORF1 i al
o am e e uadas após a ob enção de agmen os de ampli icação po u ilização de ês
pa es de p ime s (NeginF/NeginR, F11/NegPolR e F11/R11). Es es pe mi i am a
Iden i icação de nege í us em mosqui os colhidos no sul de Po ugal e análise da sua eplicação
3. Resul ados
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ampli icação po RT-PCR de agmen os com, ap oximadamen e, 1000 pb, 1200 pb e
1800 pb, espe i amen e, u ilizando ex a os de cDNA p epa ados a pa i dos
sob enadan es de cul u a dos lo es a pa i dos quais o am isolados p esumí eis
nege í us. Após sequenciação des es agmen os o am e e uados alinhamen os das
espe i as sequências nucleo ídicas, eco endo igualmen e ao uso de sequências de
nege í us disponí eis pa a consul a pública na da a da análise, iden i icados com os
núme os de acesso JQ675605, JQ675608 e JQ675609 (Nege Vi us), JQ675610,
JQ675612 e JQ675611 (Lo e o Vi us), JQ686833 (Ngewo an Vi us), JQ675607 (Piu a
Vi us), JQ675604 (Dezidougou Vi us) e JQ675606 (San ana Vi us). Foi igualmen e
u ilizada a sequência pa cial do gene que codi ica pa a a RdRp do nege í us OCNV174
(HF913429) an e io men e ob ida no labo a ó io de Vi ologia do IHMT (Fe ei a e al.,
2013). As elações ilogené icas o am in e idas com base na cons ução de á o es
pelos mé odos junção de izinhos e máxima- e osimilhança. U ilizou-se, no p imei o
caso, uma ma iz de dis âncias gené icas co igida com o modelo de subs i uição
Kimu a 2-Pa âme os, ao passo que no segundo caso, e e en e à econs ução de
ilogenias baseada no c i é io de máxima- e osimilhança oi ido em conside ação o
modelo GTR+I+Γ, selecionado segundo o c i é io de in o mação de Akaike ( al como
desc i o na secção 2.17.).
Numa p imei a análise o am cons uídas duas á o es a pa i de alinhamen os
de sequências de nege í us já publicadas e dez sequências nucleo ídicas com
ap oximadamen e 1000 pb, (Figu as 17A e B), ob idas após sequenciação de agmen os
ampli icados com o pa de p ime s NeginF/NeginR (lo es 183, 204, 207, 292, 350, 390,
392, 539, 595 e 730). Ambas as á o es e ela am cong uência gene alizada quando
compa adas en e si e, à semelhança dos esul ados ob idos an e io men e (Vasilakis e
al., 2013; Augus e e al., 2014; Nabeshima e al., 2014) oi possí el iden i ica ês
g upos mono ilé icos, odos es a is icamen e bem supo ados com alo es de boo s ap
supe io es a 85 %. Um deles e elou se cons i uído po sequências de í us de ipo
Nege , do qual azem igualmen e pa e os í us Ngewo an e Piu a, ou o cons i uído po
í us Lo e o e o úl imo po í us Dezidougou e San ana (Figu a 17A). Cu iosamen e, a
maio ia das sequências dos agmen os ampli icados, bem como a sequência do
OCNV174, esul a am na o mação de um no o g upo mono ilé ico, es a is icamen e
bem supo ado po alo es de boo s ap de 100 %, o qual, po sua ez pa ilha a o
Iden i icação de nege í us em mosqui os colhidos no sul de Po ugal e análise da sua eplicação
3. Resul ados
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solú eis du an e a eplicação i al de OCNV174, eco endo, simplesmen e, à análise dos
pe is ele o o é icos de p o eínas o ais solubilizadas, em géis de SDS-PAGE. Se ia de
an ecipa que, caso as es u u as ib ila es, cuja o igem pe manece po escla ece a é
hoje, ossem esul ado da polime ização de p o eínas i ais, es as pudessem i a se
iden i icadas em géis de SDS-PAGE co ados com azul de Coomassie, dado o núme o
de células apa en emen e in e adas. Nes e sen ido, o am u ilizadas alíquo as de ex a os
p o eicos p epa ados a pa i da solubilização (em ampão de SDS-PAGE) de
sedimen os de células C6/36 ecolhidas a 24, 48 e 72 ho as após in eção com OCNV174
(como desc i o na secção 2.7.). Como con olo, o am u ilizados ex a os p o eicos de
células não in e adas.
Inicialmen e oi e e uado um ensaio explo a ó io pa a o qual oi u ilizado um gel
de SDS-PAGE com uma concen ação cons an e de 12,5 % e ex a os p o eicos
p epa ados a pa i de células ecolhidas após in eção com OCNV174 em condições em
que es as o am p i adas de FBS. A azão pa a a p i ação do FBS de eu-se,
essencialmen e, à abundância de p o eínas p esen es no so o e al e, em pa icula , de
albumina sé ica, as quais pode iam pe u ba a mig ação das es an es p o eínas
solubilizadas p esen es nas amos as analisadas. Pa a con i má-lo, adicionalmen e
o am analisados ou os dois ex a os p o eicos, p epa ados a pa i de células colhidas
48 ho as após a in eção com OCNV174, num caso suplemen adas com 2 % de FBS e
nou o com 10 % de FBS. Os esul ados ob idos pe mi i am cons a a que o uso de 10 %
de FBS em cul u as de células C6/36 in e adas com OCNV174 é, de ac o, demasiado,
uma ez que oi possí el e i ica uma dis o ção no pe il de mig ação das es an es
p o eínas ( esul ados não ap esen ados). No en an o, e po oposição, a u ilização de
meios de cul u a o almen e desp o idos de FBS pa eceu igualmen e se uma condição
des a o á el, dado se con ap oducen e à eplicação i al. De ac o, e embo a enha
con ibuído pa a um pe il ele o o é ico sem dis o ções p o ocadas pelo excesso de
p o eínas sé icas, e i icou-se ausência ób ia de CPE aquando a en a i a de eplicação
de OCNV174 in i o, o que indicia que a eplicação i al possa e sido
conside a elmen e a e ada. Po úl imo, o suplemen o do meio de cul u a com 2 % de
FBS nes e ensaio explo a ó io, oi ido como uma si uação de comp omisso,
ca ac e izada pela p esença de um pe il ele o o é ico sem g andes e idências de
de o mação de ido ao excesso de p o eínas sé icas, endo pe mi ido, po ou o lado, o

Iden i icação de nege í us em mosqui os colhidos no sul de Po ugal e análise da sua eplicação
3. Resul ados
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desen ol imen o de CPE ób io, em associação com a eplicação i al. No en an o, e
independen emen e das conside ações e e idas, não oi possí el iden i ica a p esença
de bandas que pudessem se dis in amen e apon adas como co espondendo a p o eínas
i ais solú eis, e le indo o aumen o da sua ep esen a i idade ao longo do empo/em
momen os especí icos do ensaio, ela i amen e aos ex a os con endo exclusi amen e
p o eínas celula es.
Tendo em con a o amanho espe ado pa a os di e en es p odu os i ais, o ensaio
explo a ó io não pa eceu se o melho pa a ga an i uma boa sepa ação da maio ia das
p o eínas p esen es nos di e en es ex a os p o eicos. Assim, pelo ac o da baixa
esolução associada ao gel de concen ação uni o me pode es a a condiciona a
iden i icação das p o eínas i ais, op ou-se, em análises subsequen es, po u iliza géis
de g adien e con ínuo. Pa a al, oi u ilizado um gel de SDS-PAGE de g adien e e
ac ilamida de concen ação en e 7,5 % e 15 % e nes e o am sepa adas as p o eínas
solú eis p esen es nos ex a os p o eicos p epa ados a pa i de células C6/36 in e adas
com OCNV174, en iquecidas com 2 % de FBS e ecolhidas 24, 48 e 72 ho as após a
in eção. Adicionalmen e, o am u ilizados ex a os p o eicos de células não in e adas
como con olo nega i o.
Embo a a análise compa a i a dos pe is de p o eínas solú eis o ais obse ados
em gel de g adien e de ac ilamida de concen ação en e 7,5 % e 15 % i esse e elado
uma anca melho ia na esolução da sepa ação ob ida ( ace à obse ada em gel de
concen ação única de 12,5 %), não pe mi iu a iden i icação de quaisque bandas
p o eicas suges i as de co esponde em a p o eínas solú eis de o igem i al em nenhum
dos ex a os p epa ados a pa i de células ecolhidas aos di e en es empos após a
in eção (Figu a 21).
Iden i icação de nege í us em mosqui os colhidos no sul de Po ugal e análise da sua eplicação
3. Resul ados
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Figu a 21 – A aliação da p esença de p o eínas solú eis em ex a os celula es in e ados com OCNV174
ob idos a pa i de meios de cul u a suplemen ados com 2 % de FBS e ecolhidos a di e en es empos
após in eção (24, 48 e 72 ho as). M – Ma cado de massas molecula es: Low Molecula Weigh (LMW)
p o ein ma ke (NYTech, Po ugal).
3.6. Indução de apop ose du an e a eplicação i al do OCNV174 em células
C6/36
Embo a a análise po TEM de células C6/36, 48 ho as após a in eção com
OCNV174 não enha e elado a p esença ób ia de g andes acúolos ci opá icos no
ci oplasma de células C6/36, a o mação de co pos apop ó icos, hipe condensação da
c oma ina ou cisão nuclea , a sua o mação oi amplamen e suge ida em es udos
an e io es (Vasilakis e al., 2013; Augus e e al., 2014). Dado que os e ei os acima
desc i os podem se indicado es da en ada de células in e adas em apop ose, p e endeu
a alia -se se a eplicação do OCNV174 induzia, ou não, a apop ose de células C6/36.
Essa a aliação oi e e uada median e a análise do pe il ele o o é ico de ex a os de
DNA genómico o al colhidos ao longo de uma ciné ica de in eção, nos quais oi
analisada a e en ual cli agem da c oma ina em agmen os in e -nucleossómicos,
(como desc i o na secção 2.5.). Fo am analisados ex a os de DNA co esponden es a
células in e adas e não in e adas, colhidas ao im de 24, 48 e 72 ho as de incubação, e
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3. Resul ados
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pa alelamen e oi e e uado um egis o o og á ico ao longo de oda a ciné ica de in eção.
Como con olo nega i o o am u ilizados ex a os de DNA co esponden es a células
não in e adas.
Pela análise do pe il ele o o é ico ob ido, oi possí el e i ica que apenas num
dos ex a os de DNA genómico analisado, co esponden e a células in e adas com
OCNV174 ecolhidas 72 ho as após a in eção, oi possí el de e a a p esença de alguns
agmen os, com ap oximadamen e en e <500 e 1000 pb, suges i os de
co esponde em a agmen os in e -nucleossómicos (Figu a 22). Es e esul ado só oi
possí el de isualiza com o aumen o conside á el do con as e do gel, de ido à
eduzida abundância dos agmen os em causa. Os es an es ex a os, co esponden es a
células in e adas ecolhidas após 24 e 48 ho as, não e ela am quaisque des es
agmen os, nem mesmo com o aumen o do con as e do gel.
Figu a 22 – A aliação da indução de apop ose du an e a eplicação i al do OCNV174. Ele o o ese em
gel de aga ose 0,8 % (p/ ) do pe il ele o o é ico de ex a os de DNA genómico o al ob idos a pa i de
sedimen os de células não in e adas e in e adas com OCNV174, ecolhidas com di e en es empos de
incubação (0, 24, 48 e 72 ho as). M – Ma cado de massas molecula es: NZYDNA Ladde VI (NZY ech,
Po ugal).
Iden i icação de nege í us em mosqui os colhidos no sul de Po ugal e análise da sua eplicação
3. Resul ados
68
3.7. Ciné ica da eplicação i al do OCNV174 em células C6/36
Segundo os esul ados ob idos po Vasilakis e al. (2013), ao usa como modelo
o í us Nege EO-329 e cul u as celula es C6/36, 12 ho as após a in eção o í ulo i al
a inge um pico máximo que se man ém ap oximadamen e cons an e du an e 72 ho as,
suge indo que a es abilização do núme o de genomas i ais no sob enadan e de cul u a
é alcançada ao im de 12 ho as após a in eção. De ac o, e num cená io pa alelo, a
eplicação do OCNV174 p o oca um CPE ób io 24-48 ho as após o início da in eção de
células C6/36 ( e secção 3.4.), suge indo que a p odução de um g ande núme o de
pa ículas i ais de e á oco e de o ma p ecoce. Assim, a a és da análise da
eplicação i al ao longo do empo, p e endeu e i ica -se se a apa en e apidez com que
as células C6/36 pa ecem libe a í us EO-329 se e i ica a igualmen e pa a o
OCNV174. No en an o, op ou po u iliza -se uma abo dagem ligei amen e di e en e da
u ilizada no ensaio an e io men e desc i o (Vasilakis e al., 2013), na medida em que,
em ez de se e e ua a i ulação dos í us po ensaios de placas, p ocedeu-se à de eção
de genomas i ais nos sob enadan es de cul u a. A endendo à apa en e eplicação eloz
do í us EO-329, decidiu igualmen e encu a -se a análise da eplicação i al pa a
empos mais p óximos do ze o (0 ho as após in eção) conside ando que, ambém no
caso do OCNV174, o í ulo máximo de í us pode ia i a se a ingido poucas ho as após
o início da in eção.
A ciné ica de eplicação do OCNV174 oi e e uada median e a ampli icação
pa cial do genoma i al po RT-PCR usando PCR con encional e PCR em empo eal, e
o pa de p ime s F0/R0 (desc i o na secção 2.4.), o qual pe mi ia a ob enção de um
p odu o de ampli icação de ap oximadamen e 560 pb. Pa a al, o am u ilizadas
alíquo as de sob enadan es colhidos 0, 1, 2, 3, 4, 5, 6 e 8 ho as após a in eção e,
adicionalmen e, oi u ilizada uma alíquo a co esponden e a um sob enadan e colhido
48 ho as após in eção (Figu a 19B) como con olo posi i o. A análise dos p odu os de
ampli icação em gel de aga ose pe mi iu obse a a oco ência de ampli icação de um
agmen o com o amanho espe ado, nas alíquo as co esponden es aos sob enadan es
colhidos nos empos 4, 5, 6 e 8 ho as após a in eção (Figu a 23). Po oposição, es e
mesmo agmen o não oi obse ado nas eações de ampli icação p epa adas com
ex a os de cDNA ob idos a pa i de sob enadan es colhidos aos es an es empos (0, 1,
2 e 3 ho as). Tan o quan o a sensibilidade do mé odo u ilizado pe mi iu cons a a , os
Iden i icação de nege í us em mosqui os colhidos no sul de Po ugal e análise da sua eplicação
3. Resul ados
69
esul ados ob idos e ela am que a eplicação i al oco e de o ma mui o ápida, uma
ez que deco idas en e 3-4 ho as após a in eção já são cla amen e de e ados genomas
i ais no ex e io das células. Além disso, a in ensidade das bandas em endência a
aumen a ao longo do empo de in eção, suge indo um aumen o conside á el de
ma e ial genómico no ex e io das células ao longo da in eção, deco en e da eplicação
i al. As bandas co esponden es aos agmen os ampli icados de ex a os ecolhidos 8
e 48 ho as após a in eção, pa ecem possui uma in ensidade ap oximadamen e
semelhan e suge indo que, e en ualmen e, p óximo de 8 ho as após o início da in eção
de e á se a ingido o pico máximo de í ulo i al, o qual, e po compa ação ao que se
e i ica com o í us Nege EO-329, se de e á man e no decu so da in eção.
Figu a 23 – Es udo da ciné ica da eplicação i al do OCNV174. Ele o o ese em gel de aga ose 0,8 %
(p/ ) dos p odu os esul an es da ampli icação po PCR con encional de ex a os de RNA e o ansc i os
p epa ados a pa i de alíquo as de sob enadan es de cul u a colhidos a di e en es empos após in eção (0,
1, 2, 3, 4, 5, 6, 8 e 48 ho as). M – Ma cado de massas molecula es: NZYDNA Ladde VI (NZY ech,
Po ugal).
Dado que o uso do PCR con encional não pe mi e acompanha o p ocesso de
ampli icação ao longo do empo de uma o ma quan i a i a, limi ando po isso a
sensibilidade na de eção do momen o em que as ampli icações começam a oco e
exponencialmen e, o mesmo ensaio oi ealizado eco endo a PCR em empo eal,
numa en a i a de aumen a a sensibilidade dos esul ados an e io men e ob idos. Os
esul ados o am a aliados po uma análise compa a i a dos alo es de C (do inglês
cycle h eshold) associados a cada um dos pon os de colhei a (Tabela 2), de inido pelo

Iden i icação de nege í us em mosqui os colhidos no sul de Po ugal e análise da sua eplicação
3. Resul ados
70
núme o mínimo de ciclos necessá ios pa a se a ingido um alo de luo escência
co esponden e a 2 unidades na eação e e uada pa a cada amos a.
Tabela 2 – Valo es de C ob idos na eações de ampli icação em empo eal pa a cada amos a,
co esponden es a alíquo as de sob enadan es de cul u a colhidos com di e en es empos após in eção (0,
1, 2, 3, 4, 5, 6, 8 e 48 ho as).
Amos as
C(-)
0 h
1 h
2 h
3 h
4 h
5 h
6 h
8 h
48 h
Valo es de
C
0
>30
>30
>30
29
26
25
22
20
20
Ex a os de cDNA p epa ados a pa i de sob enadan es de cul u a colhidos en e
0 e 2 ho as após a in eção, pa a os quais o am ob idos alo es de C iguais ou
supe io es a 30, o am conside ados nega i os pa a a p esença de RNA de nege í us.
Ao longo da ciné ica de in eção, oi possí el e i ica que o ex a o p epa ado a
pa i do sob enadan e ecolhido 4 ho as após o início da in eção e elou um alo de C
já in e io a 30 (C =26), suge indo a p esença de genomas de nege í us no sob enadan e
de cul u a, à semelhança do esul ado ob ido an e io men e (Figu a 23). Embo a a
sensibilidade do mé odo u ilizado não enha pe mi ido de e a a p esença de po enciais
genomas i ais no sob enadan e ecolhido 3 ho as após o início da in eção, o alo de
C ob ido oi ligei amen e in e io a 30 (C =29), não excluindo a possibilidade de 3
ho as após a in eção, se possí el de e a alguns genomas i ais no ex e io das células.
A pa i das 5 ho as de in eção, o alo de C e e endência a diminui
ligei amen e, suge indo um aumen o g adual do núme o de genomas i ais p esen es no
meio ex acelula , aduzido po uma diminuição sucessi a do núme o de ciclos pa a
a ingi um mesmo alo de luo escência, a é a ingi uma ase es acioná ia, al u a em
que o sis ema a inge um es ado de sa u ação e a a iação dos alo es de C é mínima
(caso oco a de ac o).
Iden i icação de nege í us em mosqui os colhidos no sul de Po ugal e análise da sua eplicação
3. Resul ados
71
3.8. Cons ução de e o plasmídico ecombinan e com sequência de um
p omo o de ansc ição econhecido em células de inse o
O in e esse pelo escla ecimen o da es a égia eplica i a dos nege í us e a
en a i a de jus i ica as al e ações mo ológicas associadas ao sis ema endomemb ana ,
obse adas po TEM, le a am à en a i a de cons ução de um e o plasmídico
ecombinan e, com capacidade de supo a a exp essão de p o eínas i ais em células de
inse o. Po sua ez, a cons ução des e e o plasmídico pe mi i ia a ob enção de no os
plasmídeos de exp essão, passí eis de se em a aliados em sis emas de cul u as de
células de inse o, pe mi indo, po exemplo, uma melho comp eensão da o ma como
e oluem, ou quais as p o eínas i ais di e amen e implicadas, na génese dos CPE
obse ados em células in e adas po nege í us.
A cons ução do e o plasmídico ecombinan e p e endido oi e e uada
u ilizando como modelo de base o plasmídeo pIC111 (Cheeseman e Desai, 2005) que
possui dois p omo o es: um p omo o bac e iano, econhecido po E. coli localizado a
mon an e da sequência do gene que con e e esis ência à ampicilina aos clones que
possuam es e plasmídeo (ou seus de i ados), e um p omo o dos genes de exp essão
p ecoce-imedia a do ci omegalo í us humano (CMV), localizado a mon an e do gene da
p o eína EGFP (do inglês Enhanced G een Fluo escen e P o ein). O MCS (do inglês
Mul iple Cloning Si e), onde se encon am as sequências econhecidas po múl iplas
endonucleases de es ição de ipo II, si ua-se a mon an e do gene que codi ica a EGFP
( e Anexo 2).
A cons ução de um no o e o pa a exp essão de p o eínas em células de inse o
incluiu a en a i a de clonagem da sequência do p omo o de ansc ição OpIE1,
(p omo o dos genes de exp essão p ecoce-imedia a do í us da polied ose de O gyia
pseudo suga a), p esen e no e o pIZT/V5-His (In i ogen, E.U.A.), a jusan e do
p omo o do CMV econhecido em células de e eb ado (mas não econhecido em
células de inse o) (Wu e al., 2000).
Pa a a cons ução do e o em causa p ocedeu-se à ampli icação de um
agmen o de ap oximadamen e 330 pb, incluindo a sequência do p omo o OpIE1 (de
aco do com o p o ocolo desc i o na secção 2.11.1.), com ecu so ao pa de p ime s
OpIE1-F/OpIE1-R. Es e pa de p ime s oi desenhado de o ma a pe mi i a
ampli icação especí ica de odo o agmen o p e endido, sendo que, a es es p ime s, oi
Iden i icação de nege í us em mosqui os colhidos no sul de Po ugal e análise da sua eplicação
3. Resul ados
72
adicionada uma sequência sinalizado a (em inglês ag) em cadeia simples, incluindo os
locais de econhecimen o de enzimas de es ição de ipo II (NheI e HindIII), u ilizadas
na sua clonagem subsequen e em pIC111 (Tabela 1). As enzimas de es ição u ilizadas
no p ocesso de clonagem o am es a egicamen e selecionadas de modo a
econhece em/cli a em sequências al o localizadas no MCS, de o ma a iabiliza a
clonagem de ou os agmen os a jusan e des e p omo o .
Os esul ados da ampli icação com o pa de p ime s OpIE1-F/OpIE1-R o am
analisados median e ele o o ese em gel de aga ose e e ela am a p esença de um
agmen o, ca ac e izado po uma banda in ensa com ap oximadamen e o amanho
espe ado (Figu a 24A). A banda co esponden e ao agmen o ampli icado oi excisada
do gel e o agmen o de DNA em causa pu i icado ( e secção 2.16.1.). As diges ões
enzimá icas com as enzimas de es ição HindIII e NheI (como desc i o na secção 2.12.)
que do agmen o de DNA co esponden e ao p omo o OpIE1, que do e o pIC111,
o am e e uadas de o ma sequencial, in e caladas po uma eação de diálise. Pelo ac o
do e o pIC111 se ci cula e possui uma dimensão de 6236 pb, a a aliação do
esul ado da eação de diges ão com a enzima HindIII oi e e uada median e a análise do
plasmídeo na sua o ma linea , po ele o o ese em gel de aga ose (Figu a 24B). De
aco do com o esul ado da ele o o ese, oi possí el e i ica a p esença de um
agmen o único, com ap oximadamen e 6200 pb, co esponden e ao plasmídeo pIC111
linea izado. De ido à eduzida dimensão do agmen o do p omo o OpIE1, o esul ado
da eação de hid ólise com a enzima HindIII não oi a aliado median e ele o o ese em
gel de aga ose, dada a di iculdade em dis ingui o agmen o dige ido do agmen o
o iginal, pelo que o sucesso da eação oi in e ido a pa i do sucesso da hid ólise do
plasmídeo pIC111.
Iden i icação de nege í us em mosqui os colhidos no sul de Po ugal e análise da sua eplicação
3. Resul ados
73
Figu a 24 – Cons ução do e o plasmídico ecombinan e com a sequência do p omo o OpIE1. (A)
Ele o o ese em gel de aga ose 1 % (p/ ) do esul ado da ampli icação do agmen o co esponden e ao
p omo o OpIE1 u ilizando o pa de p ime s OpIE1-F/OpIE1. (B) Ele o o ese em gel de aga ose 1,5 %
(p/ ) do esul ado da diges ão enzimá ica do plasmídeo pIC111 com a enzima HindIII. M1 – Ma cado de
massas molecula es – NZYDNA Ladde VI (NZY ech, Po ugal); M2 – M – Ma cado de massas
molecula es – Lambda – pUC Mix Ma ke 4 (Fe men as, Li uânia).
A a aliação do esul ado das eações de diges ão com a enzima NheI dos
agmen os co esponden es ao p omo o OpIE1 e plasmídeo pIC111 p e iamen e
dige idos com a enzima HindIII, não oi e e uada median e à análise do pe il de
mig ação dos agmen os em ele o o ese em gel de aga ose, dado que a dimensão dos
agmen os ob idos após diges ão dupla se ia insu icien e pa a a alia o sucesso da
mesma. Como al, op ou po e e ua -se uma a aliação inal median e sequenciação do
e o ecombinan e, caso a cons ução i esse ido sucesso.
Após ans o mação de células de E. coli No aBlue (desc i o na secção 2.14.),
e i icou-se o c escimen o de á ias colónias isoladas, em placas de meio LB sólido
suplemen ado com ampicilina, as quais o am alea o iamen e selecionadas e das quais
oi ex aído DNA plasmídico. A seleção de clones bac e ianos po encialmen e
ecombinan es oi e e uada median e PCR con encional, u ilizando o pa de p ime s
OpIE1-F/OpIE1-R. Na o alidade oi possí el iden i ica dezasseis clones bac e ianos
possi elmen e ecombinan es, cujos ex a os de DNA plasmídico pe mi i am e ela a
p esença de agmen os de ampli icação especí ica, iden i icados no gel de aga ose po
bandas com maio ou meno in ensidade (Figu a 25). Os ex a os de DNA plasmídico
co esponden es aos demais clones bac e ianos analisados não suge i am a inse ção do
agmen o do p omo o OpIE1, de ido à ausência de p odu os de ampli icação
de e á eis no gel de aga ose.
Iden i icação de nege í us em mosqui os colhidos no sul de Po ugal e análise da sua eplicação
3. Resul ados
80
No sen ido de da con inuidade ao p ocesso de cons ução dos plasmídeos de
exp essão desejados, após ob enção e pu i icação dos ês agmen os a clona no e o
ecombinan e pIC111-V, es es o am dige idos sequencialmen e, e pa alelamen e à
diges ão do e o ecombinan e pIC111-V com as enzimas BamHI e No I (como
desc i o na secção 2.12.). O esul ado da diges ão enzimá ica do e o pIC111-V com
No I oi a aliado median e ele o o ese em gel de aga ose, no qual se iden i icou uma
única banda, com ap oximadamen e 6600 pb, ep esen a i a do e o ecombinan e
pIC111-V linea izado (6657 pb: 6326 pb do pIC111+ 331 pb do p omo o OpIE1) e
semelhan e à banda ilus ada na igu a 24B. À semelhança do p ocedimen o e e uado
an e io men e, aquando a cons ução do e o ecombinan e pIC111-V, de ido à
eduzida dimensão dos agmen os codi icados pelos domínios de cada ORF, o sucesso
da diges ão enzimá ica dos mesmos oi in e ido com base no sucesso da diges ão
enzimá ica do e o . Pos e io men e, e sob as mesmas condições oi e e uada uma
segunda diges ão enzimá ica com BamHI endo-se op ado po a alia o esul ado
somen e após a ob enção, e en ual, de um clone ecombinan e, po sequenciação.
A seleção de clones po encialmen e ecombinan es oi e e uada após
ans o mação de uma es i pe hospedei a de E. coli No aBlue, median e a análise do
pe il ele o o é ico de moléculas de DNA plasmídico de clones bac e ianos indi iduais
e subsequen e iden i icação da p esença de moléculas de mig ação e a dada
compa a i amen e ao e o plasmídico pIC111, desp o ido de inse o e conside ado
con olo nega i o do ensaio. O pad ão de mig ação oi semelhan e ao ep esen ado na
igu a 28A e, na o alidade, oi possí el e i ica a oco ência de apenas um clone
po encialmen e ecombinan e ob ido com o agmen o que codi ica a RdRp e á ios
clones po encialmen e ecombinan es com os agmen os que codi icam a ORF2 e
ORF3, embo a o pe il de mig ação ob ido pa a o DNA plasmídico ex aído de clones
ecombinan es com o agmen o codi ican e da ORF3, não enha ap esen ado uma
e a dação ão ób ia como os demais, de ido à pequena dimensão do e e ido agmen o
(ap oximadamen e 620 pb pa a 1300/1320 pb).
A con i mação da p esença de clones ecombinan es com os agmen os
codi icados pelo domínio da polime ase i al e pelos domínios das ORF2 e ORF3 o am
e e uados median e a análise do pe il de ele o o é ico dos ês e o es após diges ão
com as enzimas BamHI e No I (desc i o na secção 2.12.). A análise dos pe is ob idos

Iden i icação de nege í us em mosqui os colhidos no sul de Po ugal e análise da sua eplicação
3. Resul ados
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pe mi iu cons a a que odos os clones analisados e am ecombinan es, de ido à
p esença de duas bandas e e en es a cada clone, uma co esponden e ao e o
ecombinan e pIC111-V sem inse o e ou a ao inse o clonado. A igu a 29 ilus a o
pe il da diges ão enzimá ica ob ido pa a os clones com o agmen o codi ican e da
ORF2 analisados, na qual oi possí el iden i ica uma banda ep esen a i a do e o
pIC111-V sem inse o, com ap oximadamen e 6600 pb, e ou a ep esen a i a do
agmen o, com ap oximadamen e 1320 pb. O pe il ob ido pa a os demais clones
analisados oi semelhan e, à exceção da dimensão dos inse os, que a iou en e 1300
pb (domínio da polime ase i al) e 620 pb (domínio da ORF3).
Figu a 29 – Con i mação da p esença da sequência e e en e ao domínio da ORF2 do genoma do
OCNV174 no e o plasmídico pIC111-V. Ele o o ese em gel de aga ose 1 % (p/ ) do esul ado da
diges ão enzimá ica com BamHI e No I, dos clones po encialmen e ecombinan es com a sequência
codi icada pelo domínio da ORF2. M – Ma cado de massas molecula es – Lambda – pUC Mix Ma ke 4
(Fe men as, Li uânia).
Da o alidade de clones ecombinan es com os ês inse os p e endidos, o am
alea o iamen e selecionados cinco (iden i icados po pIC111-V::ORF1 – 13; pIC111-
V::ORF2 – 5 e 7; e pIC111-V::ORF3 – 7 e 11) pa a análise das suas sequências
nucleo ídicas. Após a ex ação de DNA plasmídico co esponden e a cada clone
selecionado, seguida de pu i icação dos mesmos (desc i o na secção 2.16.2.) e i icou-
se que o endimen o de ex ação de DNA plasmídico con endo o agmen o codi ican e
da polime ase i al e a baixa, azão pela qual se op ou pela u ilização de um sis ema
come cial pa a pu i ica DNA plasmídico em baixo núme o de cópias ( e secção
2.16.2.). Ainda assim, o esul ado da sequenciação do clone pIC111-V::ORF1 – 13
e elou-se inconclusi o, mesmo após á ias en a i as de sequenciação com di e en es
Iden i icação de nege í us em mosqui os colhidos no sul de Po ugal e análise da sua eplicação
3. Resul ados
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p ime s, en e os quais F12, R0 e NeginF. Rela i amen e aos esul ados de
sequenciação dos clones ecombinan es com o agmen o codi icado pela ORF2
(pIC111-V::ORF2 – 5 e 7), oi possí el de e a que a ano ação da sequência que
codi ica pa a a p o eína (ORF2) es a a inco e a (início inco e amen e assinalado),
conduzindo à inse ção p ema u a de um codão de e minação da adução localizado,
ap oximadamen e, cinquen a nucleó idos a mon an e do eal início da sequência
codi ican e p e endida. Quan o à sequenciação dos clones ecombinan es com o
agmen o codi icando a ORF3, os esul ados e ela am a inse ção de um nucleó ido
logo depois da ex emidade 3’ do p ime e e so, p o ocando a al e ação da g elha de
lei u a, e des asando a usão en e a ORF3 e a EGFP. De ido a es es esul ados, a
en a i a de cons ução de plasmídeos de exp essão icou comp ome ida.
Iden i icação de nege í us em mosqui os colhidos no sul de Po ugal e análise da sua eplicação
83
4|
DISCUSSÃO
E CONCLUSÕES
Iden i icação de nege í us em mosqui os colhidos no sul de Po ugal e análise da sua eplicação
4. Discussão e Conclusões
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4.1. Iden i icação de nege í us em mosqui os colhidos no sul de Po ugal
Desc i o pela p imei a ez em 2013, o géne o Nege i us oi en a i amen e
p opos o como um no o g upo axonómico de í us especí icos de inse os, com uma
ampla dis ibuição geog á ica e di e sidade de hospedei os, en e os quais lebó omos e
mosqui os (Vasilakis e al., 2013). O in e esse c escen e sob e es e no o géne o em
le ado a que á ias equipas de in es igação se deb ucem sob e o seu es udo,
con ibuindo pa a o aumen o do núme o de abalhos sob e eles publicados. Os
p imei os nege í us desc i os o am isolados de lebó omos do géne o Lu zomyia e de
mosqui os dos géne os Anopheles, Culex e A mige es cap u ados na Amé ica do No e e
do Sul, Á ica e Ásia (Vasilakis e al., 2013; Nabeshima e al., 2014; Augus e e al.,
2014). Em Po ugal, um es udo e e uado po Fe ei a e al. (2013) no labo a ó io de
Vi ologia do IHMT, pe mi iu igualmen e isola nege í us de mosqui os da espécie Oc.
caspius, enquan o que, mais ecen emen e, o am encon ados nege í us em mosqui os
de géne os di e en es dos a é en ão desc i os, incluindo Aedes, Mansonia, Pso opho a e
Wyeomyia, mas ambém T ichop osopon, Toxo hynchi es e Coquille idia (Kallies e
al., 2014), comp o ando, e e i amen e, que o géne o Nege i us possui uma ampla
di e sidade de hospedei os.
Um dos obje i os des e abalho consis iu na iden i icação de nege í us, em
mosqui os de di e en es espécies cap u ados no sul de Po ugal, con i mando des e
modo a expansão da di e sidade de hospedei os já conhecida do géne o Nege i us. No
o al o am analisados 2.586 mosqui os, dis ibuídos po 56 lo es e 10 espécies dis in as:
Oc. caspius (n=17), Cx. heile i (n=15), Cx. pipiens (n=9), An. a opa us (n=6), Cx.
uni i a us (n=3), Cx. lac icin us (n=2), An. alge iensis (n=1), Cu. annula a (n=1), Cu.
longia eola a (n=1) e Ae. de i us (n=1). Após o as eio de genomas i ais, o qual se
baseou na en a i a de ampli icação de sequências genómicas a pa i de cDNA
p oduzido de RNA o al ex aído de mace ados de mosqui os êmeas (adul os), oi
possí el iden i ica a p esença de genomas de nege í us em 9 dos 56 lo es de mosqui os
analisados (ap oximadamen e 16 % das amos as) e dos quais cons a am as espécies
Oc. caspius, Cx. pipiens, Cx. heile i e Cx. uni i a us (4 em 10 espécies es udadas).
Es es esul ados aduzi am-se em axas de in eção mínima (MIR do inglês Minimum
In ec ion Ra e) de, ap oximadamen e, 3,68, 4,45, 1,38 e 9,62 pa a lo es das espécies Oc.
caspius, Cx. pipiens, Cx. heile i e Cx. uni i a us, espe i amen e.
Iden i icação de nege í us em mosqui os colhidos no sul de Po ugal e análise da sua eplicação
4. Discussão e Conclusões
85
A maio ia dos p odu os de ampli icação ob idos, suges i os de co esponde em a
sequências i ais, esul a am da ampli icação com os pa es de p ime s desenhados pa a
pe mi i em ( an o quan o possí el) ampli ica sequências de í us Nege , Piu a,
Ngewo an, e/ou de í us gene icamen e semelhan es a es es, al como se e i icou após
a análise dos ex a os de RNA p epa ados a pa i dos mace ados de mosqui os das
espécies Oc. caspius (183, 390 e 539), Cx. pipiens (204 e 292) e Cx. uni i a us (730)
(Figu as 9 e 10). De aco do com os dados publicados po Vasilakis e al. (2013), os
í us de ipo Nege ( í us pe encen es à mesma linhagem gené ica que inclui as
es i pes i ais encon adas em mosqui os colhidos em Is ael, incluindo as es i pes de
e e ência Nege EO-329, Nege M30957 e Nege M33056) ep esen am,
apa en emen e, os nege í us com maio dis ibuição geog á ica, mo i o que pode
jus i ica o esul ado ob ido. Embo a o ex a o de cDNA p epa ado a pa i do mace ado
de Oc. caspius (390) enha e elado ambém a p esença de p odu os de ampli icação,
apa en emen e especí ica, como consequência da u ilização, nas eações de RT-PCR de
p ime s que de e iam pe mi i ampli ica sequências de í us Lo e o e/ou í us
semelhan es a es e (Figu a 11), al ac o pode se explicado pelas ca ac e ís icas poucos
es i i as das condições de PCR, e ela i a conse ação da sequência do gene-al o,
u ilizados. O ac o da egião que codi ica a RdRp i al, cuja sequência codi ican e oi
en a i amen e ampli icada du an e o as eio e e uado, se uma egião ela i amen e
conse ada en e o genoma de odos os í us, mesmo dos mais di e en es en e si do
pon o de is a gené ico, não excluiu a possibilidade de ampli icação, pelo menos em
alguns ex a os, de sequências i ais, especialmen e quando são u ilizados, nas eações
de PCR, pe is é micos pouco es ingen es. Se, po um lado, al pe mi e jus i ica
alguns dos p odu os de ampli icação ob idos, não deixa de se inespe ado o ac o de que
o ex a o de cDNA p epa ado a pa i de RNA ex aído do mace ado de Cx. heile i
(392) enha e idenciado a p esença de um p odu o de ampli icação (Figu a 12) ob ido,
exclusi amen e, com o pa de p ime s que pe mi iam ampli ica sequências do genoma
de í us San ana e Dezidougou e/ou í us semelhan es a es es.
Apesa do as eio ealizado e pe mi ido a obse ação de di e sos p odu os de
ampli icação, suges i os de co esponde em a sequências i ais, com base na u ilização
de á ios dos ex a os de cDNA p epa ados, oi igualmen e possí el obse a a p esença
de a iados p odu os de ampli icação não especí ica. A sua o igem pode se mui o

Iden i icação de nege í us em mosqui os colhidos no sul de Po ugal e análise da sua eplicação
4. Discussão e Conclusões
86
di e sa. Nesse sen ido, é impo an e econhece que os ex a os de RNA u ilizados não
e am pu os, na medida em que esul a am de uma ex ação de RNA a pa i de cada um
dos mace ados de mosqui os. Como al, pa a além de pode em con e moléculas de
RNA dos mosqui os e de e en uais genomas i ais, como se eio a cons a a , pode iam
con e RNA com o igem nos genomas de se es endossimbion es (ou ou as bac é ias),
ungos ou ec opa asi as que in e am os p óp ios mosqui os. A complexidade da amos a
de pa ida e as empe a u as de hib idação ela i amen e baixas usadas nos p o ocolos
de ampli icação podem, assim, e jus i icado a p esença de alguns dos p odu os de
ampli icação não especí ica obse ados. Além disso, é igualmen e de salien a que
á ios dos p ime s u ilizados no as eio inham ca ac e ís icas degene adas, de o ma a
pe mi i em ampli ica sequências conse adas da RdRp de um maio núme o de
po enciais nege í us p esen es nos ex a os analisados. Apesa de se uma es a égia
apa en emen e an ajosa, pode se a iscada na medida em que no malmen e, e al como
e e ido, exige a u ilização de p o ocolos de ampli icação com empe a u as de
hib idação menos es ingen es, diminuindo a especi icidade da ampli icação
conseguida.
É igualmen e impo an e e em conside ação a possí el p esença de elemen os
i ais endógenos, designados EVE (do inglês Endogenous Vi al Elemen s) in eg ados
no genoma de inse os aquando a ealização des e ipo de as eio. EVE de i ados de
í us de RNA o am desc i os pela p imei a ez po C ochu e al. (2004), e e indo-se à
in eg ação de agmen os de sequências homólogas às do la i í us CFAV no genoma
de mosqui os Aedes spp. Desde en ão êm sido iden i icados á ios EVE, de i ados de
í us de RNA de di e sas amílias, in eg ados no genoma de di e sos inse os e de
plan as de á ias espécies (Holmes, 2011). Um es udo e e uado ecen emen e
e idenciou a p esença de EVE, apa en emen e semelhan es às sequências de í us de
plan as com genoma de ssRNA+, no genoma de á ios inse os, incluindo moscas-da-
u a (D osophila hopaloa, D. ananassae e D. icusphila), abelhas (Bombus e es es,
B. impa iens e Megachile o unda a), o migas (Pogonomy mex ba ba us) bichos-da-
seda (Bombyx mo i), espas (Nasonia i ipennis, N. longico nis, e N. gi aul i),
bo bole as (Danaus plexippus), pulgões (Acy hosiphon pisum) e mosqui os (Ae.
aegyp i), co espondendo es as, a sequências codi ican es de p o eínas homólogas à
RdRp de í us semelhan es aos nege í us no genoma de a iados inse os (Cui e
Iden i icação de nege í us em mosqui os colhidos no sul de Po ugal e análise da sua eplicação
4. Discussão e Conclusões
87
Holmes, 2012). Ainda que a pesquisa des as sequências in eg adas no genoma das
espécies as eadas não enha sido e e uada, é possí el an ecipa que, caso exis am e
sejam ansc i as (ou pe maneçam sob a o ma de con aminações esiduais de
agmen os de DNA nos ex a os de RNA p epa ados), alguns dos p odu os de
ampli icação ob idos possam, e e i amen e, e esul ado da ampli icação de sequências
des es EVE. Nes e sen ido, o as eio e e uado oi assumido como indica i o, ou não, da
p esença de nege í us nas espécies analisadas, sendo que um dos obje i os p opos os
nes e abalho consis iu no isolamen o dos í us em ques ão, como o ma de con i ma
que os p odu os de ampli icação especí ica ob idos du an e o as eio esul a am,
e e i amen e, da ampli icação de sequências de RNA de o igem i al.
O isolamen o de p esumí eis nege í us em cul u as de células de inse o da linha
celula C6/36 pe mi iu con i ma a p esença des es nos lo es de mace ados, como
esul ado da de eção de genomas i ais a pa i de RNA ex aído, di e amen e, dos
sob enadan es de cul u a ob idos. Tendo em conside ação que a exposição di e a das
células em cul u a a alíquo as dos mace ados de mosqui os u ilizados pode ia p o oca
um CPE indesejado ( esul an e da ci o oxicidade de alguns dos componen es do
mace ado, e não, necessa iamen e, de ido à eplicação i al), o am e e uadas duas
passagens cegas, com in e alos de 96 ho as, as quais con ibuí am, igualmen e, pa a
ampli ica o í ulo i al. A análise po mic oscopia ó ica de cul u as de células C6/36
po encialmen e in e adas e elou a p esença de CPE ób io 24-48 ho as após o início da
in eção, ca ac e izado essencialmen e pela desag egação das células da monocamada
com des acamen o do supo e ísico, e subsequen e diminuição do amanho e
a edondamen o das células em cul u a (Figu a 15). O CPE obse ado oi mui o
semelhan e ao desc i o an e io men e po Fe ei a e al. (2013) como sendo suges i o da
eplicação de nege í us. A de eção de genomas de nege í us nos sob enadan es de
cul u a oi e e uada a a és da ampli icação especí ica de sequências i ais, suges i as
de co esponde em a sequências de nege í us de ipo Nege , Ngewo an, Piu a e/ou de
í us semelhan es a es es. Cu iosamen e, nenhum dos sob enadan es de cul u a
as eados oi suges i o de con e í us Lo e o, Dezidougou, San ana e/ou de í us
semelhan es a es es. Es e ac o e o ça a possibilidade do agmen o de DNA obse ado
após a análise do ex a o de cDNA p epa ado a pa i do mace ado do lo e de Oc.
caspius (390), e sido ampli icado a pa i do genoma de um nege í us de ipo Nege , e
Iden i icação de nege í us em mosqui os colhidos no sul de Po ugal e análise da sua eplicação
4. Discussão e Conclusões
88
não de um í us Lo e o. Quan o ao mace ado de Cx. heile i (392), inicialmen e
suges i o da p esença de sequências de nege í us de ipo San ana e Dezidougou,
e elou a p esença de genomas i ais de ipo Nege no sob enadan e de cul u a ob ido
após isolamen o. Es e esul ado, apa en emen e con adi ó io do indicado pelo as eio
e e uado, pode se jus i icá el na medida em que o ex a o de RNA ob ido a pa i do
sob enadan e de cul u a possui uma meno complexidade compa a i amen e ao ex a o
de RNA ob ido a pa i dos mace ados de mosqui os.
Aquando a en a i a de isolamen o de p esumí eis í us em cul u a, é impo an e
e ainda em conside ação que es a écnica, po si só, pode in oduzi ieses ao
isolamen o de ido à possibilidade de oco ência de e ei o de unil (em inglês
bo leneck). Es e ipo de enómeno ca ac e iza-se pela possibilidade de í us pode em
es a e e i amen e p esen es nos mace ados em análise, mas não se possí el isolá-los
em cul u a. No en an o, se po um lado é o malmen e p o á el que só enha sido
possí el isola pa e dos e en uais í us de inse os inicialmen e p esen es nas amos as
em es udo ( e abaixo), os esul ados demons ados nes e abalho pe mi i am,
inequi ocamen e, isola á ias es i pes de nege í us, e o çando ambém o ac o das
células C6/36 se em mui o pe missi as à eplicação i al, e po isso cons i uí em um
sis ema celula de e e ência endo em is a o isolamen o de í us de inse os.
Análises an e io es pe mi i am cons a a a p esença de mais do que um í us em
sob enadan es de cul u as expos as a alguns mace ados de Oc. caspius, enquan o que
nou os oi apenas de e ada a p esença de ISF, mais conc e amen e OCFVPT (Fe ei a e
al., 2013). No decu so des e abalho oi igualmen e possí el coisola nege í us e
la i í us em dois mace ados de Oc. caspius (183 e 539), de ido à ampli icação de
sequências i ais de ambos os í us p esen es nos sob enadan es de cul u a após
isolamen o. Além disso, oi igualmen e possí el con i ma a p esença exclusi a de
OCFVPT (ou um la i í us com sequências codi ican es de uma RdRp mui o semelhan e
a es e) no sob enadan e de cul u a ob ido após isolamen o com o igem no lo e de Oc.
caspius (595) (Fe ei a e al., 2013). Tal ac o oi e elado não só pela p esença de
p odu os de ampli icação especí ica co esponden es exclusi amen e a sequências do
genoma de la i í us, mas ambém de ido à ausência dos CPE exube an es pa en es nas
cul u as de células C6/36 in e adas com a maio ia dos nege í us. Po oposição a es es,
as células in e adas com OCFVPT e elam, essencialmen e, pa agem do seu c escimen o
Iden i icação de nege í us em mosqui os colhidos no sul de Po ugal e análise da sua eplicação
4. Discussão e Conclusões
89
e o mação de alguns ag egados. Es es esul ados se iam de an ecipa dado que o
OCFVPT oi desc i o como sendo gene icamen e mui o semelhan e ao HANKV
(Huh amo e al., 2012) e, consequen emen e, pouco ci opá ico.
Se, po um lado, a u ilização de sis emas celula es pode in oduzi e en uais
en iesamen os no ipo de í us isolados a pa i de mis u as, ambém é um ac o que
apesa do as eio e e uado nos sob enadan es de cul u a e pe mi ido apenas a de eção
de genomas de nege í us e la i í us não exclui a possibilidade de ou os í us pode em
es a p esen es nos sob enadan es analisados, os quais não o am con emplados no
as eio e e uado. É impo an e salien a que as eios de sequências i ais e e uados
com ecu so à p odução de mace ados de mosqui os ( al como oi u ilizado no decu so
des e abalho) em de imen o do uso de mosqui os de o ma indi idualizada, se po um
lado pe mi em a análise de um g ande núme o de espécimes, po ou o, caso sejam
isoladas múl iplas es i pes i ais a pa i da mesma on e, não pe mi em a i ma se os
í us coisolados p o êm de um mesmo espécime ( e dadei as coin ecções) ou de
indi íduos di e en es. Nes e sen ido, e ia sido an ajoso iden i ica a p esença de
coin ecções, especialmen e po que ecen emen e es udos êm demons ado que a
coin ecção de mosqui os com la i í us especí icos de inse os pode po encia , ou
sup imi , a ansmissão de la i í us pa ogénicos ansmi idos po mosqui os (Bolling e
al., 2012; Hobson-Pe e s e al., 2013; Kenney e al., 2014; Ken e al., 2010). Assim
sendo, a é que pon o é que a p esença de nege í us em mosqui os al e a a sua
capacidade de se i em de e o es ou simples hospedei os a ou os í us é uma ques ão
que de e á se abo dada no u u o.
Inicialmen e, o gené o Nege i us oi desc i o como sendo cons i uído po seis
linhagens i ais dis in as designadas de Nege , Ngewo an, Piu a, Lo e o, Dezidougou e
San ana, dis ibuídas po ês g upos mono ilé icos p incipais pa ilhando um ances al
comum (Vasilakis e al., 2013). Recen emen e, oi p opos a uma no a di isão des e
axon, baseada em análises ilogené icas de sequências p o eicas (domínio RdRp), de
genomas de odos os nege í us desc i os a é à da a, a qual e idencia a di isão do géne o
Nege i us em dois g upos mono ilé icos p incipais, os quais o am en a i amen e
denominados de Sandewa i us e Nelo pi i us (Kallies e al., 2014). No decu so do
abalho aqui ap esen ado, análises ilogené icas e e uadas com base no alinhamen o de
pa e das sequências nucleo ídicas codi ican es da RdRp da ORF1 i al pe mi i am
Iden i icação de nege í us em mosqui os colhidos no sul de Po ugal e análise da sua eplicação
4. Discussão e Conclusões
96
e e ência, endo em is a o desen ol imen o de no as me odologias pa a ul apassa as
limi ações dos p ocessos de ans eção de células de inse o, sobejamen e conhecidas, e
associadas, sob e udo, à oxicidade dos eagen es de ans eção e complexidade de
me odologias que se aduzem em e iciências de ans eção baixas e aca
ep odu ibilidade dos esul ados (Ogay e al., 2006).
A a aliação da uncionalidade do pIC111-V oi e e uada median e a análise da
exp essão p o eica de EGFP po mic oscopia de luo escência, após a ans eção de
células de e eb ado e de inse o das linhas celula es HEK293T e C6/36,
espe i amen e. Células HEK293T ans e adas com pIC111 o am u ilizadas como
con olo posi i o ao ensaio de ans eção, pelo ac o do p omo o CMV p esen e nes e
e o , se econhecido em células de e eb ado, endo es as e elado luo escência com
um ní el de in ensidade conside á el (Figu a 26B). Embo a as condições do p o ocolo
de ans eção u ilizado enham sido adap adas de Dong e al. (2007), o mesmo p o ocolo
inha pe mi ido a isualização de luo escência ex ensa (e in ensa) no decu so de um
ensaio semelhan e, ealizado an e io men e no labo a ó io de Vi ologia do IHMT
(Melo-Pimen a, 2013), azão pela qual, oi igualmen e u ilizado no deco e do abalho
aqui ap esen ado.
Ainda que o e o pIC111-V enha sido co e amen e cons uído, cons a ado pela
con i mação da sua sequência nucleo ídica, e i icou-se que, na p á ica, a sua u ilidade
como eículo pa a a exp essão de p o eínas em células de e eb ado, apa en ou es a
comp ome ida. Apesa do esul ado ob ido exigi uma con i mação numa u u a
ocasião, oi possí el e i ica que após a ans eção de células HEK293T, a emissão de
luo escência po es as células oi p a icamen e nula (Figu a 26C). Se ia de an ecipa
que a in ensidade da luo escência emi ida pelas células HEK293T ans e adas com
es e plasmídeo osse semelhan e à emi ida po células ans e adas com o e o pIC111,
uma ez que o e o pIC111-V oi cons uído de modo a man e o p omo o CMV
o iginá io do e o pIC111. Uma das azões que pode es a na o igem dos esul ados
ob idos elaciona-se, di e amen e, com a possibilidade da exis ência de e os associados
ao ensaio de ans eção. Embo a a ans eção de células HEK293T, que com pIC111,
que com pIC111-V, enha sido e e uada no mesmo dia e sob as mesmas condições, a
ep odu ibilidade do ensaio não oi, de ac o, e i icada. Po ou o lado, es e esul ado
pode ambém se indica i o da possibilidade da p esença de uma sequência de DNA

Iden i icação de nege í us em mosqui os colhidos no sul de Po ugal e análise da sua eplicação
4. Discussão e Conclusões
97
exógeno no e o pIC111, nes e caso o p omo o OpIE1, pode pe u ba a exp essão
p o eica de EGFP em células HEK293T, possi elmen e se a cons ução comp ome e ,
po exemplo, i) a es abilidade do ansc i o que codi ica a EGFP ii) a sua axa de
adução. A de e minação compa a i a do empo de semi ida dos ansc i os EGFP-
especí icos ob idos a pa i de pIC111 em células HEK293T pode ia se uma al e na i a
a ob ia e escla ece os esul ados ob idos.
Células C6/36 ans e adas com pIC111, as quais se i am de con olo nega i o
do ensaio de ans eção des a linhagem celula , e ela am uma axa de ansc ição basal
a pa i do p omo o CMV, aduzida num núme o mui o limi ado de células a exp essa
EGFP (Figu a 26E). Es e esul ado se ia de an ecipa na medida em que o p omo o
CMV é di icilmen e econhecido em células de inse o (Wu e al., 2000). O mesmo não
se e i icou nas células C6/36 ans e adas com pIC111-V dado e sido possí el
e i ica exp essão de EGFP, demons ando, apa en emen e, o econhecimen o do
p omo o OpIE1 nes as células (Figu a 26F). O ac o do núme o de células com
capacidade de exp essa EGFP a pa i do p omo o OpIE1 e sido ela i amen e baixo
co obo ou o ac o das células C6/36 se em di íceis de ans e a (Ogay e al., 2006).
Os p incipais obje i os deco en es da en a i a de cons ução de plasmídeos de
exp essão de algumas p o eínas codi icadas pelo OCNV174 em células euca ion es,
consis i am em i) a alia a possibilidade de mime iza os CPE, ou pa e deles,
obse ados no decu so da eplicação de nege í us, median e a exp essão ansi ó ia de
p o eínas i ais, em pa icula as p o eínas codi icadas pelos domínios da ORF2 e ORF3
e ii) localiza os complexos eplica i os nas células in e adas a a és da de eção da
polime ase i al. Po ém, e nes e caso em pa icula , é de salien a que o sis ema
u ilizado pode ia não pe mi i e ela a e dadei a localização da RdRp, especialmen e
no caso da sua localização nas células, depende da sua in e ação com as demais
p o eínas i ais.
Embo a a conc e ização da cons ução dos e e idos plasmídeos não enha sido
possí el, é impo an e e em conside ação á ias das limi ações ine en es à ealização
do ensaio. Uma das limi ações elacionou-se com a baixa axa de sucesso ob ido no
p ocesso de clonagem pa a a cons ução do plasmídeo de exp essão da p o eína de usão
RdRp-EGFP. Se po um lado o esul ado da sequenciação e elou se inconclusi o
(an ecipando, p o a elmen e, ea anjos es u u ais que e iam limi ado a capacidade de
Iden i icação de nege í us em mosqui os colhidos no sul de Po ugal e análise da sua eplicação
4. Discussão e Conclusões
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hib idação dos p ime s u ilizados na de e minação de pa e da sua sequência), po ou o,
a ob enção de apenas um clone po encialmen e ecombinan e já an ecipa a a
possibilidade da en a i a de clonagem não e sido bem-sucedida. É igualmen e
impo an e e em conside ação que a u ilização de sis emas de clonagem, uma ez que
são dependen es de sis emas i os (nes e caso bac é ias E. coli da es i pe No aBlue),
ap esen a limi ações que não são passí eis de an ecipa na sua o alidade. Ou seja, se o
p odu o de exp essão p e endido cons i ui de alguma o ma um p odu o óxico pa a as
bac é ias, comp ome endo inclusi amen e a sua sob e i ência, o mais p o á el é que
es as não pe mi am a es abilização do inse o en a i amen e clonado nos e o es de
exp essão p e endidos. Uma das o mas pa a soluciona es e p oblema pode ia passa
pela u ilização de bac é ias de E. coli de ou a es i pe ou, em al e na i a, en a
es abiliza o e o no in e io das células compe en es a a és da diminuição da
empe a u a de incubação das mesmas ou da u ilização de meios de cul u a menos icos,
le ando a uma exp essão mais len a dos p odu os sin e izados e con ibuindo pa a a
e en ual diminuição do s ess celula (Fak uddin e al., 2013). A al e na i a de op a
po um sis ema de exp essão es á el, en ol endo inse ções no genoma celula , ao in és
de um sis ema de exp essão ansi ó ia, não oi conside ada no deco e des e abalho.
Embo a pudesse o e ece an agens, na medida em que e a possí el es abiliza e
in eg a as sequências codi ican es das p o eínas a exp essa no genoma do hospedei o,
aca e a a di iculdades écnicas conside a elmen e maio es na sua conc e ização.
Po ou o lado, a inco e a ano ação da sequência codi ican e de uma das
p o eínas p e endidas ( usão ORF2-EGFP) oi ambém uma das limi ações ine en es à
cons ução de um dos plasmídeos de exp essão p e endidos e a qual, apesa de pode e
sido, não oi, in elizmen e, an ecipada. Somen e após a análise de alhada dos esul ados
de sequenciação de dois clones ecombinan es selecionados alea o iamen e oi possí el
e i ica a inse ção p ema u a de um codão de e minação da adução a mon an e do
início eal da sequência codi ican e p e endida. Como al, e uma ez que os p ime s
u ilizados nas eações de ampli icação dos agmen os a clona o am desenhados de
o ma especí ica a pa i das sequências de nege í us disponí eis pa a consul a pública,
a inco e a ano ação das mesmas le ou ao comp ome imen o do ensaio desde o início.
Po úl imo, apesa dos ensaios de clonagem e em sido e e uados sob condições
igo osas, en e as quais, a u ilização de uma polime ase de DNA com uma ele ada
Iden i icação de nege í us em mosqui os colhidos no sul de Po ugal e análise da sua eplicação
4. Discussão e Conclusões
99
capacidade de co eção de p o as no decu so das eações de ampli icação de sequências
i ais, oi possí el e i ica , após a análise do esul ado de sequenciação ob ido pa a os
clones ecombinan es com o agmen o codi icado pela ORF3, a inse ção de um
nucleó ido logo depois da ex emidade 3’ do p ime e e so, p o ocando a al e ação da
g elha de lei u a. Teo icamen e, es e ipo de acon ecimen os não se ia de p e e de ido
à baixa axa de inse ção de nucleó idos e ados no decu so da polime ização de no as
cadeias de DNA pela polime ase u ilizada, mas não pode se o malmen e excluída
como uma possibilidade. Além disso, e mais uma ez, é de elemb a que a u ilização
de sis emas i os ap esen a es ições p á icas ine en es a qualque ensaio des e ipo e
as quais são di íceis de an ecipa .
O desen ol imen o de sis emas baseados na u ilização de cul u as celula es
pe mi iu e oluciona , conside a elmen e, os es udos das in e ações en e mosqui os e
a bo í us. Po ém, a escolha da linhagem celula a u iliza em ambém um papel
undamen al no sucesso dos mesmos. No decu so des e abalho o am u ilizadas
cul u as de células C6/36, o iginá ias de mace ados de la as Ae. albopic us, as quais se
sabiam se bas an e pe missi as à eplicação i al, e especi icamen e à eplicação de
nege í us (Vasilakis e al., 2013). Como al, es a linha celula ep esen a uma mais-
alia pa a o es udo das es a égias eplica i as dos í us p opos os nes e abalho. No
en an o, sabe-se que embo a os mosqui os usem o RNA de in e e ência (RNAi) como
mecanismo de de esa con a as in eções i ais, as células C6/36 possuem um RNAi
dis uncional (B ackney e al., 2010), colocando em causa a sua u ilização enquan o
modelo de es udo de in e ações en e mosqui os e os í us que os in e am, na medida
em que não e le em, exa amen e, o que oco e in i o.
Ainda que as obse ações e eladas pela u ilização de cul u as de células C6/36
possam não aduzi , exa amen e, o que oco e in i o, a apidez e os ele ados í ulos
i ais de nege í us ob idos du an e a eplicação i al nes as células suge em que, nos
mosqui os possam se igualmen e a ingidos í ulos i ais ele ados, a não se que o
sis ema imune ina o dos inse os in e ados na na u eza consiga, de alguma o ma,
con a ia a eplicação i al. O eal impac o e a impo ância des es í us no
compo amen o dos inse os in e ados, al como na ecundidade, e ilidade e
sob e i ência dos mesmos, pe manece igualmen e po se explo ado, jus i icando a
ealização de es udos u u os nes a á ea.
Iden i icação de nege í us em mosqui os colhidos no sul de Po ugal e análise da sua eplicação
4. Discussão e Conclusões
100
O ac o do p opos o géne o Nege i us e sido desc i o pela p imei a ez em
2013 jus i ica que mui o pe manece po se descobe o, apesa dos es o ços e e uados
no sen ido de expandi o conhecimen o sob e es e no o géne o de í us de inse os.
Apesa da ansmissão e ical e/ou ené ea des es í us e sido suge ida po
Vasilakis e al. (2013) como o ma de jus i ica a sua manu enção na na u eza, es a
hipó ese pe manece po con i ma , e jus i ica u u as in es igações.
De aco do com os dados publicados po Vasilakis e al. (2013), a in eção de
e o es an opo ílicos ais como Ae. albopic us e Ae. aegyp i com o í us Nege EO-
329, po um lado ga an iu a sua in eção e e i a (a a és de um ensaio a i icial baseado
na in eção in a o áxica des es mosqui os), po ou o, pe mi iu cons a a a possibilidade
dos mosqui os u ilizados pode em se in e ados a a és de uma e eição sanguínea,
embo a de o ma pouco e icien e e dependen e da u ilização de uma suspensão i al
com um í ulo bas an e ele ado, en e 108 e 1010 p. .u/mL, adicionado exogenamen e à
e eição adminis ada. Cu iosamen e, es a obse ação suge e ou o ipo de
conside ações ace ca da o igem e e olução des es í us. De ido à elação ilogené ica
en e cile í us e nege í us (Kallies e al., 2014) é impossí el elimina a possibilidade
dos nege í us se em, pelo menos na sua o igem, í us de plan as3. No en an o, embo a a
susce ibilidade da in eção de mosqui os com nege í us po ia o al possa suge i que os
mosqui os enham adqui ido es es í us a pa i de uma on e ege al, p o a elmen e
néc a es, pa ece imp o á el que néc a es lo ais ou sucos de u as con i essem í ulos
i ais conside a elmen e ele ados, capazes de conduzi à in eção dos inse os pela sua
inges ão.
A o ma como os nege í us eplicam nos mosqui os é ou a das á eas que eque
maio a enção e que me ece se explo ada. Enquan o o ciclo de ansmissão biológica
dos a bo í us inclui a sua disseminação pelos ecidos de um a ópode hema ó ago, e
pos e io in eção das glândulas sali a es do mesmo de o ma a supo a a ansmissão
do í us pa a o hospedei o e eb ado, a e en ual possibilidade dos nege í us
consegui em igualmen e dissemina -se pelo co po dos inse os pe manece po se
escla ecida.
3 Os genomas dos nege í us, apa en emen e, não possuem genes que codi icam p o eínas de mo imen o
(em inglês mo emen p o eins) as quais são no malmen e encon adas no genoma de í us de plan as
(Lucas, 2005), con e indo-lhes capacidade de mobilidade ao longo do co po das plan as.
Iden i icação de nege í us em mosqui os colhidos no sul de Po ugal e análise da sua eplicação
101
5 |
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Iden i icação de nege í us em mosqui os colhidos no sul de Po ugal e análise da sua eplicação
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ANEXOS
Iden i icação de nege í us em mosqui os colhidos no sul de Po ugal e análise da sua eplicação
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Anexo 1 – Mapa ísico e sequência pa cial do e o plasmídico pJe 1.2/blun
A)
B)
Figu a A1 – Mapa ísico do e o plasmídico pJe 1.2/blun e ep esen ação dos espe i os MCS.
(A) Mapa ísico de pJe 1.2/blun : ep esen ação da localização do gene le al eco47IR e do gene bla o qual
codi ica pa a uma be a-lac amase que con e e esis ência à ampicilina. (B) Sequência da egião MCS com
ep esen ação dos locais de econhecimen o de endonucleases de es ição do ipo II. (Fon e:
h p://www.bioin o.p e.hu/ 2/pic _ 2/pJETmap.pd )
Iden i icação de nege í us em mosqui os colhidos no sul de Po ugal e análise da sua eplicação
6. Anexos
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Anexo 2 – Mapa ísico e sequência pa cial do e o plasmídico pIC111
A)
B)
Figu a A2 – Mapa ísico e sequência pa cial do e o plasmídico pIC111.
(A) Mapa ísico de pIC111; ep esen ação da localização dos genes que codi icam a EGFP e que con e e
esis ência à ampicilina (bla) aos clones que o anspo am, bem como dos locais de econhecimen o de
endonucleases de es ição do ipo II. (B) Rep esen ação de pa e da sequência nucleo ídica de pIC111:
la anja, cauda 6x(His); azul, local de cli agem P eScission (2x); e de, gene EGFP; e melho,
sequências pe i é icas ao gene EGFP. Os locais de es ição são únicos no plasmídeo. [Fon es:
h p://www.addgene.o g/b owse/sequence/60932/ (A); Cheeseman e Desai (2005) (B)].