De eção e iden i icação de bac é ias do géne o Lep ospi a
em amos as ambien ais e em pequenos mamí e os, de
dois dis i os de Po ugal, a a és de abo dagens
molecula es
Filipe Fe nandes Delgado
Disse ação pa a a ob enção do G au de Mes e em Mic obiologia Médica
Janei o 2020
De eção e iden i icação de bac é ias do géne o Lep ospi a
em amos as ambien ais e em pequenos mamí e os, de
dois dis i os de Po ugal, a a és de abo dagens
molecula es
Filipe Fe nandes Delgado
Disse ação pa a a ob enção do G au de Mes e em Mic obiologia Médica
O ien ado a: Dou o a Ma ia Luísa Viei a, In es igado a Auxilia e Responsá el do Lab. de
Lep ospi ose e Bo eliose de Lyme (LLBL), Unidade de Mic obiologia Médica (UMM) do Ins i u o de
Higiene e Medicina T opical, Uni e sidade NOVA de Lisboa.
Ins i u o de Higiene e Medicina T opical
Unidade de Mic obiologia Médica /Lab. de Lep ospi ose e Bo eliose de Lyme
Janei o, 2020
i
Pa e dos esul ados deco en es da p esen e Disse ação o am ap esen ados nos seguin es Cong essos,
Con e ências e/ou Seminá ios cien í icos:
 Ma ia Fe nandes*, Filipe Delgado, Te esa Ca ei a, Rosa Teodósio, Ma ia Luísa Viei a. (2019). “Lep ospi a
spp. em coleções de água doce me Po ugal: No os Desa ios”. Ap esen ado no 8.o Cong esso em
Pandemias na E a da Globalização, Ho el Vila Galé, Coimb a, Po ugal, de 30 e 31 de ab il’19.
[Pos e 1º au o ]
 Ma ia Fe nandes*, Filipe Delgado, Te esa Ca ei a, Rosa Teodósio, Ma ia Luísa Viei a. (2019) “Lep ospi a
spp. in eshwa e collec ions om Po ugal: New challenges”. Ap esen ado na 11 h In e na ional
Leo ospi osis Con e e ence, o ganized by In e na ional Lep ospi osis Socie y (ILS), Vancou e , Canada, de
8 a 12 de julho’19.
[comunicação o al 1º au o ]
 Ma ia Fe nandes*, Filipe Delgado, Te esa Ca ei a, Rosa Teodósio, Ma ia Luísa Viei a. (2019). “Lep ospi a
spp., in Roden s, Soils and F eshwa e Collec ions”. Ap esen ado no Seminá io o ganizado pela School o
Ve e ina y Science Semina Se ies 2019, Massey Uni e si y, No a Zelândia, em 14 de agos o de 2019.
[comunicação o al 1º au o ]
 Ma ia Fe nandes*, Filipe Delgado, Te esa Ca ei a, Rosa Teodósio, Ma ia Luísa Viei a. (2019). “Lep ospi a
spp., in soils and eshwa e collec ions: a public heal h conce n”. Ap esen ado na In e na ional
Con e ence on En i onmen al Heal h - "New" Challenges o he Fu u e. Escola Supe io de Tecnologia da
Saúde de Lisboa, Lisboa, Po ugal, de 25 a 27 de se emb o’19.
[comunicação o al 1º au o ]
 Ma ia Fe nandes*, Filipe Delgado, Te esa Ca ei a, Rosa Teodósio, Ma ia Luísa Viei a. (2019). “Lep ospi a
spp. in soils and eshwa e collec ions: a public heal h p oblem?”. Ap esen ado no Cong esso
Mic obio ec’19, numa o ganização conjun a da Sociedade Po uguesa de Mic obiologia (SPM) e
Sociedade Po uguesa de Bio ecnologia (SPBT). Faculdade de Ciências e Tecnologia da Uni e sidade de
Coimb a, Coimb a, Po ugal, de 5 a 7 de dezemb o’19.
[Pos e 1º au o ]
 Te esa Ca ei a*, Ma ia Fe nandes, Filipe Delgado, Rosa Teodósio, Ma ia Luísa Viei a. (2019). “Roden s
and lep ospi es: om he old ela ionship o he cu en challenges”. Ap esen ado no Cong esso
Mic obio ec’19, numa o ganização conjun a da Sociedade Po uguesa de Mic obiologia (SPM) e
Sociedade Po uguesa de Bio ecnologia (SPBT). Faculdade de Ciências e Tecnologia da Uni e sidade de
Coimb a, Coimb a, Po ugal, de 5 a 7 de dezemb o’19.
[Pos e 1º au o ]
ii
AGRADECIMENTOS
An es de p ocede aos ag adecimen os gos a ia de e e i que a ealização des e Mes ado oi, desde
o p imei o dia, um g ande desa io pa a mim. P imei amen e, pelo ac o de e sido eu a inancia odos os
cus os ine en es ao Mes ado e, pa a que isso osse possí el, o mesmo oi ealizado ao mesmo empo que
abalha a a empo in ei o no Bio é io de Roedo es do Ins i u o de Medicina Molecula (IMM). Em segundo
luga , e de ido ao ac o de es a a abalha , não me oi possí el pa icipa , desde início, nos módulos
lecionados nes e Mes ado, o que di icul ou mui o a minha ap endizagem. Po úl imo, o a anque da
ealização des a Disse ação não oi o mais eliz, uma ez que, depois de e acei e o con i e pa a a ealização
da mesma num labo a ó io do Ins i u o de Medicina Molecula , onde o p oje o es a a, inclusi e, alidado
pela comissão cien í ica do Mes ado em Mic obiologia Médica, oi-me comunicado, po pa e do labo a ó io
do IMM, que não pode ia ealiza o e e ido p oje o.
Felizmen e, odas es as ad e sidades o am ul apassadas, não sozinho, mas sim com odos aqueles
que me ajuda am a conc e iza es e obje i o. Nes e sen ido que o ag adece , em p imei o luga , às pessoas
que abalha am di e amen e comigo no Labo a ó io de Lep ospi ose e Bo eliose de Lyme:
À In es igado a Dou o a Ma ia Luísa Viei a, po me e ecebido no seu labo a ó io, po oda a sua
disponibilidade, p eocupação, in e esse, odas as explicações e chamadas de a enção que me ize am c esce
não só cien i icamen e, mas ambém enquan o pessoa.
À Técnica Supe io e Mes e Te esa Ca ei a, po oda a sua disponibilidade, ajuda e boa disposição
que o am mui o impo an es pa a que eu conseguisse ealiza as a e as labo a o iais.
Um especial ag adecimen o à Mes e Ma ia Oli ei a Fe nandes, pela possibilidade de me in eg a no
seu abalho de Dou o amen o, pelos ins-de-semana in ei os a ecolhe amos as ambien ais, pelas noi es
“em cla o” pa a cap u a oedo es, pelas ho as exaus i as passadas no labo a ó io e po me e
acompanhado e ajudado em udo o que oi possí el nes e úl imo ano.
À Mes e e ambém dou o anda Ia a Jain ilal, no e e ido labo a ó io, pela explicação e ajuda que
me deu na cons ução de á o es ilogené icas, incluindo a ap esen ada nes e abalho.
Em segundo luga , gos a ia de deixa o meu ag adecimen o às pessoas que, indi e amen e, me
ajuda am a consegui comple a es e obje i o:
À minha Família, pelo apoio incondicional que me deu ao longo des es dois anos, pela a enção,
p eocupação e ajuda que o am undamen ais pa a que a ealização des e mes ado osse possí el.
À Ges o a do Bio é io de Roedo es do Ins i u o de Medicina Molecula , Iolanda Mo ei a, po me e
p opo cionado melho es condições de abalho de aco do com as minhas necessidades, pa a que me
pudesse concen a no Mes ado e po odo o apoio, p eocupação e conside ação que e e pa a comigo
nes es úl imos dois anos.
iii
A odos os meus amigos, pela comp eensão e mensagens de apoio que me ize am chega e, que
o am, de al o ma impo an es, que pe mi i am que nunca desis isse.
Po im, que o ag adece à Comissão Cien í ica da p esen e edição do Mes ado, pela pe missão de
al e ações que o am ei as no ema da minha Disse ação e pela conside ação que semp e sen i no que diz
espei o ao meu caso pa icula .
A odas es as pessoas, o meu g ande e since o ob igado!

i
RESUMO
A lep ospi ose é uma doença in eciosa zoonó ica, eme gen e e de dis ibuição mundial, causada po
espi oque as pa ogénicas do géne o Lep ospi a. Os oedo es são os p incipais ese a ó ios des as bac é ias,
disseminando-as no ambien e a a és da u ina, onde podem sob e i e semanas ou meses em coleções de
água doce e solos húmidos. É assim, impo an e conhece a dis ibuição geog á ica de Lep ospi a spp., bem
como a espe i a axa bac e iana.
Assim, em dois dis i os de Po ugal (Lisboa e Se úbal), colhe am-se 327 amos as de água (lagos,
ios, on es públicas e bebedou os), 96 amos as de solo, e 139 amos as biológicas (sangue, u ina, ígado,
im, pulmão e baço) ob idas de 18 oedo es cap u ados nas p oximidades dos locais de colhei a das amos as
ambien ais. Todas as amos as (solos, águas e ó gãos/ oedo es) o am sujei as a ex ação de DNA genómico.
Pa a ampli icação do DNA, usa am-se dois p o ocolos de nes ed-PCR p imei amen e com p ime s uni e sais,
baseados no gene s (16S) pa a o géne o Lep ospi a, e depois p ime s especí icos pa a espécies pa ogénicas,
endo como al o o gene lipL32. Alguns dos p odu os ampli icados o am sequenciados e analisados po
BLAST.
Os p ime s uni e sais de e a am DNA lep ospí ico em 49% (159+/327) das amos as de água, 83%
(80+/96) das amos as de solo, e 44% (56+/127) nas amos as de oedo es. O im e o ígado o am os ó gãos
com maio axa bac e iana (65% e 67%) espe i amen e. Po sua ez, a nes ed-PCR ‘lipL32’ ampli icou DNA
de lep ospi as pa ogénicas em 35% das amos as de água (55+/159), 9% dos solos (7+/80), e em 79% das
amos as de oedo es (44+/56). Os esul ados da sequenciação mos a am a p e alência de duas espécies
pa ogénicas, Lep ospi a in e ogans e L. bo gpe e senii.
Es es esul ados con i ma am a p esença expec á el de lep ospi as pa ogénicas nos oedo es, mas
su p eenden emen e ambém em coleções de água doce e solos, cujos ambien es podem cons i ui um isco
pa a a saúde das populações expos as aos e e idos agen es in eciosos que em a i idades p o issionais que
de laze .
Pala as cha e: Lep ospi a spp.; lipL32; Amos as de água; Amos as de solos; Roedo es.
ABSTRACT
Lep ospi osis is a wo ldwide eme ging zoono ic in ec ious disease caused by pa hogenic spi oche es
o he genus Lep ospi a. Roden s a e he main ese oi s o his bac e ium, sp eading i h ough he u ine
in o he en i onmen , whe e hey can su i e weeks o mon hs in eshwa e collec ions and we soils. I is
he e o e essen ial o know he geog aphical dis ibu ion o Lep ospi a spp., as well as i s bac e ial a e.
Thus, in wo dis ic s o Po ugal (Lisbon and Se ubal), 327 wa e samples (lakes, i e s, public sou ces
and d inking oun ains), 96 soil samples and 139 biological samples (blood, u ine, li e , kidney, lung and
spleen) ob ained om 18 oden s cap u ed nea he en i onmen al sampling si es al eady men ioned. All
samples (soil, wa e and oden ’o gans) we e submi ed o genomic DNA ex ac ion. Fo DNA ampli ica ion,
wo nes ed-PCR p o ocols we e used, i s wi h uni e sal p ime s based on he s (16S) gene o he genus
Lep ospi a and hen wi h speci ic p ime s (pa hogenic species) a ge ing he lipL32 gene. Some o he
ampli ied p oduc s we e sequenced and analyzed by BLAST.
Uni e sal p ime s de ec ed lep ospi al DNA in 49% (159+/327) o wa e samples, 83% (80+/96) o soils
and in 44% (56+/127) o oden samples. Roden kidney and li e we e he o gans wi h he highes bac e ial
a e (65% and 67%) espec i ely. In u n, nes ed-PCR 'lipL32' ampli ied DNA om pa hogenic lep ospi es in
35% o wa e samples (55+/159), 9% o soils (7 +/80), and in 79% o oden samples (44+/56). The sequencing
esul s showed he p e alence o wo pa hogenic species, Lep ospi a in e ogans and L. bo gpe e senii.
These esul s con i med he expec ed p esence o pa hogenic lep ospi es in oden s, bu su p isingly
also in eshwa e collec ions and soils, whose en i onmen s may pose a heal h isk o popula ions exposed
o such in ec ious agen s in bo h p o essional and leisu e ac i i ies.
Keywo ds: Lep ospi a spp.; lipL32; wa e samples; soil samples; oden s.
i
ÍNDICE GERAL
AGRADECIMENTOS………………………………….………………………….……………………………………………………………………. ii
RESUMO..……………………………………………………….…………………………………………………………………………………………i
ABSTRACT………………………………………………………………………………………………………………………………………………….
ÍNDICE…..………………………………………………………………………………………………………………………………………………….. i
ÍNDICE DE FIGURAS………………………………………………………….………………………………………………………………………..ix
ÍNDICE DE QUADROS………………………………………………………….……………………………………………………………………xiii
ÍNDICE DE TABELAS………………………………………………………………………………………………………………………………xi
LISTA DE ABREVIATURAS E SIGLAS…….……………………………..……………………………………………………………………..x
I. INTRODUÇÃO……………………………………………………………….……………………………………………………….………..1
1.1 - Lep ospi as e lep ospi ose…………………………………………………………………………………………..1
1.1.1 - Biologia de Lep ospi a spp.……….………………………………………………..……………………..1
1.1.2 - Taxonomia e Classi icação.…………….…………………………..……………………………………..2
1.1.3 - Lep ospi a spp. - Ciclo zoonó ico .……………..……………………………………………………..3
1.1.3.1 - Roedo es como p incipais ese a ó ios ………………………………………..…..5
1.1.3.2 - A impo ância do ambien e……………………………………………………………..…8
1.1.3.3 - T ansmissão aos humanos………………………………………………………………….8
1.2 - Epidemiologia/Dis ibuição………………………………………………………………………………………….9
1.2.1 - A lep ospi ose no Mundo………………………………………………………………….………………9
1.2.2 - A lep ospi ose em Po ugal………………………………….………………………………………….11
1.3 - Pa ogénese …………………………….…………………………………………………………………………………13
1.3.1 - In eção e Respos a imune ..………………………..…………………………………………………..13
1.3.2 - Lep ospi ose anic é ica ………..…………………………………………………………………….….14
1.3.3 - Sínd ome de Weil (lep ospi ose ic é ica)…………………………………………………….…..15
1.4 - Diagnós ico labo a o ial………………………………………..…………………………………………………..15
1.4.1 - Mé odos di e os……………….…………………………………………………………………………….17
1.4.1.1 - Mic oscopia em undo escu o……………………………………………..…………….17
1.4.1.2 - Exame cul u al em meio sele i o EMJH …………………..……………….……….18
1.4.1.3 – Ampli icação de DNA (PCR)……………………………………………………………….19
1.4.2 - Mé odos indi e os………………………………………………………………………………………….20
1.4.2.1 - Tes es de Ras eio……………………….……………………………………………………20
1.5 - P e enção e Con olo.……………………..………………………………………………………………………..22
1.6 - Jus i icação do ema da Disse ação…………………………..……………………………………………..23
ii
1.6.1 - Obje i os……………………………………………………..………..………………………………….……24
II MATERIAIS E MÉTODOS………………………………………………………………………………………………………………………..25
A - Componen e de campo………………………………………………………………………………………………………………25
2.1 - Á ea geog á ica do es udo………………………………………………………………....................…..25
2.2 - P ocedimen os legais e é icos pa a p ospeção de amos as ambien ais e de
oedo es………………………………………………………………………………………………………………….26
2.3 - Locais de amos agem e ma e ial cole ado……………………………………………………………..27
2.4 - Coleções de água doce……………………………………………………………….…………………………..27
2.4.1 - Calenda ização e me odologia pa a a ob enção de amos as de água……….…27
2.5 - Solos……………………………………………………………………………………………………………………….29
2.5.1 - Calenda ização e me odologia pa a a ob enção de amos as de solo…………..29
2.6 - Roedo es………………………………………………………………………………………………………………..31
2.6.1- Calenda ização e me odologia pa a a cap u a de oedo es…………………..………31
2.6.2 – Eu anásia e nec opsia………………………………………………………………………………….32
B – Componen e labo a o ial ………………………………………………………………………………………………………….34
2.7 - Ex ação de DNA genómico…………………………………………………………………………………….34
2.7.3 - Amos as de água…………………………………………………………………………………………34
2.7.2 - Amos as de solo………………………………………………………………………………………….35
2.7.3 - Amos as biológicas ( oedo es)…..………………………..……………………………………..37
2.8 - Ampli icação de DNA lep ospí ico…….…………………………………………………………………….38
2.8.1 - Tes e de sensibilidade………………………………………………………………………………….38
2.8.2 - Tes e de especi icidade………………………………………………………………………………..39
2.8.3 - Ampli icação de DNA de amos as de águas e solos……………………………………..39
2.8.3.1- Nes ed-PCR com p ime s uni e sais (A e B)……………………………………..39
2.8.3.2- Nes ed-PCR com p ime s especí icos “LipL32”……………………………..….40
2.8.4 - Ampli icação de DNA de amos as de ó gãos e luidos biológicos…………….…..41
2.8.4.1 - Nes ed-PCR com p ime s uni e sais (A e B)……………….………..………...41
2.8.4.2 - Nes ed-PCR com p ime s especí icos “LipL32”…………………………….….42
2.9 - Cul u a de ecido enal em meio sele i o EMJH………………………………………………………42
2.10 - Sequenciação do DNA de Lep ospi a spp………………………………………………………………43
2.11 - Análise de esul ados……………………………………………………………………………………………44
xi
ÍNDICE DE TABELAS
Tabela 1 - Classi icação das genoespécies de Lep ospi a………………………………………………………………………………..3
Tabela 2 - Resul ados do es e Qui-Quad ado en e a ipologia da água e a p esença ou
ausência de Lep ospi a spp…………………………………………………………………………..……………………………53

x
LISTA DE ABREVIATURAS E SIGLAS
Ac – An ico po
Ag – An igénio
BLAST - Basic Local Alignmen Sea ch Tool
CDC - Cen e o Diseases Con ol
Cm – Cen íme os
DDO – Doença de Decla ação Ob iga ó ia
DNA – Deoxy ibonucleic acid (=ADN - Ácido desoxi ibonucleico)
ECDC - Eu opean Cen e o Disease P e en ion and Con ol
ELISA – Enzime-linked immunoso ben assay
EMJH – Ellinghausen, McCullough & Johnson and Ha is
EUA - Es ados Unidos da Amé ica
Fig. – Figu a
g - G ama
h - Ho a
HDESPD - Hospi al Di ino Espí i o San o de Pon a Delgada
IgG – Imunoglobulina do ipo G
IgM – Imunoglobulina do ipo M
IHMT/UNL – Ins i u o de Higiene e Medicina T opical / Uni e sidade No a de Lisboa
Km2 - Quilóme o quad ado
LCR – Líquido cé alo- aquidiano
LipL32 – Lipop o eína Lep o32
LLBL - Labo a ó io de Lep ospi ose e Bo eliose de Lyme
LPS – Lipopolissacá ido
MACROLep o - Tes e de Aglu inação Mac oscópico
mg - Milig ama
MgCl2 – Clo e o de Magnésio
min – Minu o
mL – Milili o
mm – Milíme os
NO2 - Dióxido de Ni ogénio
OMS – O ganização Mundial da Saúde
pb – Pa de Bases
PBS - phospha e bu e ed saline
PCR – Polyme ase Chain Reac ion (=Reação em cadeia da polime ase)
x i
pH – Po encial de hid ogénio
PLG – Plasminogénio humano
pm – o ação po minu o
spp. – Espécie
TAM – Tes e de Aglu inação Mic oscópica ( es e de e e ência)
Valo de p – P obabilidade de signi icância
WHO – Wo ld Heal h O ganiza ion
μg – Mic og ama
μl – Mic oli o
μm – Mic ome o
μM – Mic omola
χ2– Qui-quad ado
oC – G au Celsius
% – Pe cen agem
1
I. INTRODUÇÃO
1.1. Lep ospi as e lep ospi ose
1.1.1 - Biologia de Lep ospi a spp.
As lep ospi as cons i uem um g upo de bac é ias, designado po espi oque as ou espi oque ídeos.
São bac é ias ae óbias ob iga ó ias e g am (-), com mo ologia espi alada e helicoidal, ap esen ando ele ada
mo ilidade. Têm um diâme o de ap oximadamen e 0,1μm e um comp imen o que pode a ia en e 6 a
20μm, com ex emidades encu adas em o ma de gancho (Fig. 1.1), e possuem dois lagelos
pe iplasmá icos.
A pa ede celula é cons i uída po pep idoglicano, a qual se associa à memb ana ci oplasmá ica que
é e es ida pela bainha ex e na. En e a pa ede celula e a memb ana ex e na si uam-se os lagelos, que se
es endem de uma ex emidade à ou a da bac é ia (Le e , 2001).
As lep ospi as êm um empo de ge ação longo e exigem condições de c escimen o in i o mui o
especí icas, das quais se des acam a empe a u a que de e se man ida en e 28oC e 30oC e sob agi ação
pe manen e. Necessi am ainda de um meio de cul u a mui o ico em nu ien es, en e os quais i aminas B2,
B12 e ácidos go dos de cadeia longa, es es úl imos são mesmo a base ene gé ica que o seu c escimen o
exige. As lep ospi as, quando se encon am em ambien e abió ico (solos ou águas supe iciais) o pH des es
de e se neu o ou ligei amen e alcalino, o que lhes pe mi e sob e i e po um pe íodo p olongado de empo
que pode i de alguns meses a um ano ou mais (Faine e al., 1999; And e-Fon aine, G., 2015).
Figu a 1.1 - Mic o o og a ia ele ónica de Lep ospi a spp.
(Adap ado de Le e , 2001)
2
1.1.2 - Taxonomia e Classi icação
Os ês géne os de espi oque as com impo ância médica pe encem à O dem Spi ochae ales, da
qual azem pa e duas Famílias: Spi ochae aceae e Lep ospi aceae. Da p imei a Família azem pa e dois
géne os: T eponema e Bo elia, enquan o que o géne o Lep ospi a pe ence à Família Lep ospi aceae (Faine
e al., 1999).
Quan o à classi icação do Géne o Lep ospi a, coexis em a ualmen e dois sis emas: a classi icação
eno ípica ou con encional (de base an igénica) e a classi icação molecula (de base gené ica). A classi icação
eno ípica é amplamen e u ilizada e di ide o Géne o Lep ospi a em duas espécies, uma espécie pa ogénica,
conhecida como Lep ospi a in e ogans cons i uída po mais de 260 se o a es ag upados em 25 se og upos,
e uma espécie sap ó i a designada po L. bi lexa onde se incluem ce ca de 60 se o a es, cons i uindo 38
se og upos conhecidos, (Le e , 2001). De e e i que em ambos os sis emas de classi icação, o se o a é o
áxon base.
Além das ca ac e ís icas an igénicas das lep ospi as, a classi icação eno ípica baseia-se ambém em
c i é ios de pa ogenicidade deco en es dos an igénios (LPS, p o eínas) p esen es na espe i a memb ana
ex e na. Inclusi e é com bases nes as ca ac e ís icas que mui as ezes se eco e a es es eno ípicos pa a
iden i ica o ca ác e pa ogénico ou sap ó i o de um ‘no o’ isolado.
Mas, nos úl imos anos, os a anços egis ados nas écnicas molecula es êm sido impo an es em
di e sas á eas do conhecimen o e a á ea da mic obiologia não é exceção, endo pe mi ido uma mais ápida
iden i icação das espécies. Pa a além dessa pa icula idade, a biologia molecula eio igualmen e
e oluciona a o ma como o Géne o Lep ospi a é cons i uído, endo assim, su gido a classi icação molecula
(Pica deau, 2013) que, sem subs i ui a classi icação eno ípica, em hoje comple á-la, azendo mais e
melho in o mação, es imulando ambém o desen ol imen o exponencial de no as e amen as de
diagnós ico de base molecula que es ão hoje disponí eis nos labo a ó ios e, po consequência, ao se iço
das populações.
3
Tabela 1 - Classi icação das genoespécies de Lep ospi a. (Adap ado de Thibeaux e al., 2018)
Assim, com base na classi icação molecula , o Géne o Lep ospi a inclui di e sas genoespécies (Tabela
1), as quais são de inidas consoan e o g au de hib idação DNA-DNA (igual ou supe io a 70%). Es e sis ema
de classi icação em a ualmen e 22 genoespécies iden i icadas e alidadas, sendo que 10 são pa ogénicas,
seis (6) são sap ó i as, iden i icadas em amos as ambien ais, e seis (6) in e médias (Thibeaux e al., 2018).
Es as úl imas, di e enciam-se das genoespécies pa ogénicas e sap ó i as, po não se conhece o almen e o
g au de i ulência associado, apesa de possuí em algumas ca ac e ís icas comuns com ambos os g upos
(Pica deau, 2013).
1.1.3 - Lep ospi a spp. - Ciclo zoonó ico
A lep ospi ose é a zoonose com maio dis ibuição em odo o mundo, endo aumen ado
g adualmen e de impo ância nos úl imos anos (ECDC, 2018). Os humanos (hospedei os aciden ais) são
in e ados aquando de uma exposição di e a ou indi e a com u ina de animais colonizados ou in e ados com
lep ospi as, bem como a a és de água ou solos con aminados (Mwachui, 2015). Es as bac é ias pene am
no o ganismo dos a a és de uma esco iação/lesão da pele ou pelas mucosas (na iz, boca e olhos) (Ko e al.,
2009). Apesa de menos equen e, as lep ospi as podem ambém pene a a pele ín eg a, se o indi íduo
expos o pe manece po um longo pe íodo de empo den o de água (po exemplo, abalhado es de
Espécie
Pa ogénicas
In e médias
Sap ó i as
L. in e ogans
L. enezuelensis
L. bi lexa
L. ki schne i
L. lice asiae
L. yanagawae
L. noguchii
L. wol ii
L. meye i
L. alexande i
L. b oomii
L. an hielii
L. weilii
L. inadai
L. wolbachii
L. bo gpe e senii
L. ainei
L. e ps ae
L. mayo ensis
L. san a osai
L. als onni
L. kme yi

4
plan ações de a oz) ou em con ac o com solo con aminado pelas e e idas bac é ias. A ansmissão das
lep ospi as é, no en an o, a a en e humanos, bem como du an e a ges ação ou alei amen o, apesa de
exis i em alguns casos epo ados (Le e , 2001; Adle e al., 2010).
A pa dos humanos, exis em mais de 160 espécies de mamí e os (domés icos, de p odução pecuá ia
e sil á icos) capazes de se in e ados ou colonizados po lep ospi as, sendo esponsá eis pela ansmissão da
bac é ia aos humanos e/ou a ou as espécies animais. Con udo, são os oedo es os p incipais esponsá eis
pela ansmissão, sendo mesmo conside ados como ese a ó ios dos e e idos agen es pa ogénicos. Os
oedo es man êm uma elação de homeos asia com as lep ospi as, as quais pe manecem no seu o ganismo
( úbulos enais) sem que lhes causem qualque dano. Des a o ma, os oedo es são semp e assin omá icos,
eliminando lep ospi as a a és da u ina, du an e oda a sua ida. Es e ac o, aliado à sua ele ada axa de
p oli e ação e à capacidade de habi a em qualque local, con e e-lhes uma ele ada impo ância no que
espei a à ansmissão des e agen e in ecioso aos humanos e ou os mamí e os (Adle , 2015) (Fig. 1.2).
Assim, ou as espécies animais (canídeos, bo inos, suínos, equinos en e ou as) são igualmen e
susce í eis de se in e adas po lep ospi as al como os humanos, ou po ansmissão placen a ou po ia
geni al. Con udo, é o con ac o di e o, a p incipal causa de ansmissão, já que as lep ospi as sendo exc e adas
pela u ina de algumas des as espécies in e a sucessi amen e ou os mamí e os que con ac am com
alimen os ou águas con aminadas pelos p imei os (Faine e al., 1999).
Alguns se o a es es ão mesmo elacionados com algumas espécies de mamí e os, o que demons a
que exis e um ce o opismo en e as e e idas lep ospi as e as di e en es espécies de mamí e os. Exemplo
disso são os se o a es Ic e ohaemo hagiae e Copenhageni, que são encon ados com mais equência em
Figu a 1.2 - Ciclo zoonó ico de ansmissão das lep ospi as. (Imagem do au o )
Rese a ó io na u al:
-Ra os -Mu ganhos
Meio
ambien e
con aminado:
-Água doce
-Solos
Ou os mamí e os:
-Animais domés icos
-Animais de p odução
Fa o es de isco:
-Ag icul u a
-Pecuá ia
-Caça
-Na ação
-Canoagem
-Pesca
5
oedo es, espe i amen e das espécies Ra us no egicus, R. a us e Mus musculus; enquan o o se o a
Pomona é mais comum nos suínos, ou o se o a Canicola, que ap esen a uma g ande a inidade pa a os cães
(Bha i e al., 2003).
1.1.3.1 - Roedo es como p incipais ese a ó ios
Impo a dize que os oedo es e, em pa icula , os a os, são mamí e os pe encen es à O dem
Roden ia e à Família Mu idae, a qual comp eende ce ca de 650 espécies, ag upadas em 140 géne os. Como
e e ido, es es mamí e os são conside ados como p aga, ansmisso es de agen es pa ogénicos capazes de
causa doenças g a es aos humanos, mui as delas epidémicas e causado as de g andes ca ás o es, como
ela a a His ó ia (po exemplo, a epidemia da “pes e neg a”). Pa a além dos agen es pa ogénicos que podem
ansmi i , são ambém conhecidos pelos seus hábi os u i os, os quais es ão elacionados com a capacidade
de causa g andes p ejuízos económicos (Randall, 2001).
As ca ac e ís icas dos oedo es es ão pa icula men e associadas à capacidade de ansmissão das
lep ospi as, o nando-os os p incipais esponsá eis pela dis ibuição dos agen es causais da lep ospi ose.
Assim, impo a ealça algumas des as ca ac e ís icas, as quais são decisi as pa a que es a zoonose seja
conside ada de impo ância mundial. De ac o, a econhecida capacidade dos oedo es se adap a em às
di e sas condições ambien ais, o na-os capazes de habi a em di e en es locais, mui as ezes de g ande
p oximidade com os humanos (Randall, 2001).
Como an e io men e e e ido, os oedo es êm igualmen e um papel ele an e na dis ibuição dos
di e en es se o a es de Lep ospi a spp., pelas di e en es egiões, uma ez que exis e uma a inidade
( opismos) de alguns se o a es de Lep ospi a po uma de e minada espécie animal ( ese a ó io e/ou
hospedei o). Como exemplo, pode e e i -se a ele ada p e alência do se o a Ic e ohaemo hagiae
associada ao Géne o Ra us, e de lep ospi as do se o a Ballum, econhecidamen e associada ao a inho
casei o da espécie Mus musculus (Bha i e al., 2003).
Resumindo, pode en ão dize -se que as espécies de oedo es mais en ol idas na ansmissão de
Lep ospi a spp., são Ra us no egicus, Ra us a us (Fig. 1.3) e Mus musculus. Conside ando o âmbi o da
p esen e Disse ação, en endeu-se ú il aze uma b e e esenha das p incipais espécies, dada a sua pa icula
e e e ida associação às di e sas espécies de espi oque as do Géne o Lep ospi a.
6
Assim, a espécie Ra us no egicus, conhecida po a azana ou a o de esgo o ap esen a
ca ac e ís icas mo ológicas dis in as que a di e enciam das es an es espécies. T a a-se de uma espécie que
su giu no con inen e asiá ico, endo-se espalhado pelo mundo, mui o de ido ao compo amen o humano.
Es a espécie de oedo em ce ca de 25cm de comp imen o, cauda cu a, o elhas pequenas e memb anas
in e digi ais. O peso médio de um adul o pode a ia en e 275 e 575g e a colo ação da pelagem en e o
cas anho escu o, cinzen o e/ou p e o, sendo mais in ensa na egião en al (Randall, 2001; Bha i e al.,
2003). Os animais des a espécie i em em g upo e p e e em habi a em zonas baixas (solos), embo a
ambém sejam bons epado es. Em comum com os es an es oedo es, êm o ac o de se em animais
no u nos, com uma a i idade diu na apenas em caso de ausência de ameaça. A ep odução oco e nas
es ações quen es ( e ão e ou ono), com ce ca de cinco ninhadas po ano, cada uma com cinco a oi o c ias
(Randall, 2001).
A espécie Ra us a us ambém é o iginá ia do con inen e asiá ico, endo igualmen e chegado a
odas as pa es do mundo. Es es oedo es habi am na u almen e em egiões lo es adas, con udo, a
p oximidade aos humanos é comum nos dias de hoje, sendo no mal a is á-los em zonas u ais ou u banas.
Em compa ação com as a azanas da espécie R. no egicus, es es a os ap esen am uma cauda maio , o elhas
g andes e sem pelo. Quan o ao comp imen o des es animais, o adul o em ce ca de 32,4 a 46,4 cm, com uma
cauda de ce ca de 17 a 25cm de comp imen o, e um peso médio de 110 a 340g, como ilus ado na igu a 1.4.
São animais no u nos, apesa de es a em bem-adap ados à p oximidade com humanos podendo mesmo se
mui o a i os em zonas u banas e na ausência de p edado es (Randall, 2001; Bha i e al., 2003).
Ao con á io da espécie R. no egicus, os oedo es da espécie R. a us são excelen es epado es e
nadado es, sendo po isso habi ual que es es animais sejam a is ados em zonas al as, como á o es ou
elhados de casas. Fo mam g upos com uma hie a quia p óp ia, onde coabi am animais da mesma amília,
Figu a 1.3 - Exemplo de um oedo Ra us a us uma das espécies
esponsá eis pela disseminação de lep ospi as no ambien e.
( o og a ia adap ada de D eams ime)
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com á ios machos e habi ualmen e duas êmeas dominan es, além de odos os elemen os possuí em um
odo semelhan e. Quan o à sua ep odução, es a acon ece ge almen e en es meses de ma ço e no emb o,
con udo são capazes de p oduzi ninhadas du an e odo o ano, se i e em um ambien e es á el.
Habi ualmen e êm ês a cinco ninhadas, cada uma a iando en e uma e 16 c ias (Randall, 2001; Bha i e
al., 2003).
Po sua ez, a espécie Mus musculus é ambém conhecida po a o casei o é, en e as ês espécies
de oedo es, uma das mais associadas à ansmissão de lep ospi as, sendo que é ambém a que em a maio
dis ibuição mundial. Os ep esen an es des a espécie são econhecidos
como oedo es de pequeno po e (pesam en e 12 a 30 g amas), medindo en e 6,5 a 9,5cm de comp imen o,
não incluindo a longa cauda, que mede en e 6 a 10cm.
Ou as ca ac e ís icas que os dis inguem são a p oeminência dos olhos, as o elhas g andes e o
ocinho pon iagudo com bigodes longos. De o ma semelhan e às espécies an e io es, memb os da espécie
Mus musculus êm uma a i idade no u na, es ando em alguns casos dependen es dos humanos no que
espei a à alimen ação e ab igo, apesa de ambém exis i em espécimes que habi am longe dos cen os
u banos. Es es animais subsis em em g upos amilia es g andes, onde os machos são dominan es,
acasalando com mais do que uma êmea. Es as p oduzem no malmen e seis a oi o ninhadas em cada ano,
o iginando ce ca de 50 no as c ias odos os anos (Randall, 2001).
Figu a 1.4 - Compa ação das p incipais ca ac e ís icas mo ológicas das espécies
Ra us a us e Ra us no egicus. (Adap ado de Wikiwand)
maio que o
es o do co po
meno que o
es o do co po
Cauda
g andes
g andes
delgado
Fo ma do co po
pequenos
pequenas
obus o
O elhas
Olhos
Focinho
pon iagudo
a edondado
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1.3.2 - Lep ospi ose anic é ica
A lep ospi ose em um pe íodo de incubação médio de 5 a 14 dias, no en an o es e pode es ende -
se a é aos 30 dias. A doença pode mani es a -se de di e sas o mas, sendo que a mais comum é a
assin omá ica, no en an o, pode a ia en e um quad o semelhan e a uma sínd ome g ipal ou, na sua o ma
mais g a e, se a al pa a o hospedei o (Le e , 2001; Fa a e al., 2014).
En e os casos sin omá icos de lep ospi ose, a o ma anic é ica é a mais comum, egis ada em mais
de 90% dos doen es, e é conside ada como a o ma le e da doença (Fauci e al., 2008). A maio ia des es
casos em uma sin oma ologia inespecí ica, a qual é idên ica a um quad o de in eção aguda indi e enciada,
com os seguin es sin omas: eb e, cala ios, ce aleias, mialgias, náuseas e ómi os. Pa a além da
sin oma ologia inespecí ica, pode oco e ambém comp ome imen o pulmona , acompanhado de osse e
do o ácica (Kelley, 1998; Fauci e al., 2008; Sunil e al., 2016) (Fig. 1.5).
Figu a 1.5 - Radiog a ia ao ó ax e idenciando pneumonia po lep ospi ose.
(Adap ado de Hü ne , 2002)
A ase aguda du a ce ca de uma semana e é p ecedida po um pe íodo assin omá ico, na maio
pa e dos casos. A ase imune inicia-se após 1-3 dias em alguns casos e a sin oma ologia é dis in a da ase
an e io , com eb e e mialgias menos in ensas e, em algumas si uações, meningi e assép ica (Sunil e al.,
2016).
A axa de mo alidade associada à lep ospi ose anic é ica é ge almen e mui o baixa, a ní el mundial.
Con udo, em con ex o epidémico pode á oco e um maio núme o de mo es, dependendo da
sin oma ologia associada e da egião em causa (Wang e al., 1965; Fauci e al., 2008).

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Em países endémicos pa a lep ospi ose, a maio pa e dos casos são assin omá icos ou mani es am-
se na o ma anic é ica, con udo as di e enças que se obse am na clínica da doença es ão dependen es do
se o a in e an e en ol ido, o qual pode a ia de egião pa a egião, consoan e a dis ibuição das es i pes
in e an es num de e minado local, bem como as espécies de mamí e os p esen es (Le e , 2001; Ha skee l
e al., 2011).
1.3.3 - Sínd ome de Weil (lep ospi ose ic é ica)
A sínd ome de Weil ou lep ospi ose ic é ica é a o ma mais g a e da in eção po lep ospi as e
ca ac e iza-se po um conjun o de sinais e sin omas ípicos, ais como: ic e ícia, dis unção enal, hemo agias
e comp ome imen o pulmona . Pa a além des es, o doen e pode desen ol e alência mul io gânica, a qual
es á na o igem do su gimen o de coagulação in a ascula disseminada, mioca di e, insu iciência enal e
choque (Bha i e al., 2003).
A axa de mo alidade associada aos doen es com sínd ome de Weil é signi ica i amen e mais al a
( a iando en e 5-15%), quando compa ada com os doen es com a o ma anic é ica (Le e , 2001). Na
Eu opa, os casos de sínd ome de Weil es ão maio i a iamen e associados aos se o a es Ic e ohaemo hagiae
e Copenhageni, com sin oma ologia inicial que se assemelha à o ma le e, mas que começa a a ia ao inal
dos p imei os 4-9 dias. Após es a ase inicial ligei a, o doen e começa a mani es a sin oma ologia ípica da
o ma g a e: ic e ícia, dis unção enal e ascula (Le e , 2001; Fauci e al., 2008).
Nos casos mais se e os, obse a-se um en ol imen o mul issis émico, o qual p o oca em 60% dos
doen es um comp ome imen o mul io gânico, que a e a especialmen e o ígado, ins, pulmões, co ação,
sis ema ascula , olhos e sis ema neu ológico). Pa a além des as complicações, o su gimen o de hipo ensão
e hemo agia gene alizada são mani es ações comuns e que es ão ipicamen e associadas à sínd ome de
Weil (Le e , 2001; Fa a e al., 2014). Den o des as oco ências, a hemo agia pulmona é indica i a de
mau p ognós ico pa a o doen e (Vine z, 2001).
1.4 - Diagnós ico labo a o ial
O diagnós ico labo a o ial, como o ma de se iden i ica e con i ma uma suspei a de lep ospi ose
humana é um p ocedimen o essencial e indispensá el, de ido à inespeci icidade dos sin omas e às di e en es
ap esen ações da doença (Viei a, 2006).
Des a o ma, pa a se p ocede ao diagnós ico labo a o ial de lep ospi ose, u iliza-se, em cen os
di e enciados, como acon ece no IHMT, uma combinação de mé odos di e os e indi e os. Den o dos
mé odos di e os, é de e e i a u ilização de es es de biologia molecula , com p o ocolos de PCR [Reação em
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cadeia da polime ase] con encional e nes ed-PCR, podendo ainda eco e -se, em de e minadas
ci cuns âncias a PCR em empo eal.
Es es mé odos êm demons ado se impo an es na o ina labo a o ial pa a a de eção de DNA
lep ospí ico, no en an o, só de e ão se usados nos p imei os dias de in eção. Con udo, pa a além da biologia
molecula , ou os mé odos di e os igualmen e disponí eis passam pela mic oscopia ó ica em undo escu o
além da cul u a pa a isolamen o do agen e, o mé odo gold s anda d em bac e iologia, que consis e em
cul i a o agen e pa ogénico em meio de cul u a sele i o. Es a me odologia em, no en an o, algumas
limi ações deco en es da exigência, po um lado, de pessoal mui o einado pa a o e ei o e, po ou o, do
empo necessá io à ob enção de esul ados, uma ez que as lep ospi as êm um c escimen o len o e algo
as idioso (Le e , 2001; WHO, 2003) o que o o na pouco usado na o ina do labo a ó io, apesa de con inua
a se uma mais- alia pa a es udos epidemiológicos (ex. cul u a de ecido enal de oedo es) e em ma e ial
pos -mo em (humano).
Já no âmbi o dos mé odos indi e os, es es são os de maio u ilização na p á ica labo a o ial do
diagnós ico da lep ospi ose, a a és dos quais se p e ende de e a an ico pos especí icos an i-Lep ospi a spp.
Assim, como es es de as eio (sc eening) são u ilizadas di e sas abo dagens, uma das quais é o es e
Aglu inação Mac oscópica sob e lâmina (MACROLep o), en e ou as, e o es e ELISA (Enzyme Linked Immuno
So ben -Assay), sendo que o es e p econizado, ainda hoje, pela OMS sendo mesmo o es e de e e ência
imunológico con inua a se o Tes e de Aglu inação Mic oscópica (TAM) (Le e , 2001; WHO, 2003).
No en an o, apesa de exis i em di e sos es es de diagnós ico pa a a lep ospi ose, a seleção do es e
mais indicado depende de á ios a o es, en e os quais, a ase de e olução da doença, ou a é mesmo a
egião geog á ica onde os mesmos podem es a disponí eis, ou não, bem como os ecu sos humanos e de
equipamen o disponí eis. No que diz espei o à ase de e olução da doença, a seleção do mé odo (di e o ou
indi e o) mais adequado é c ucial pa a se ob e um diagnós ico co e o, uma ez que no deco e da in eção
po Lep ospi a, são di e sos os mecanismos imunológicos e celula es en ol idos. Como já e e ido, na
p imei a semana da doença, a bac é ia encon a-se ainda na co en e sanguínea ( ase lep ospi émica), o que
o na essencial a ealização da pesquisa das bac é ias no sangue, a a és de mé odos di e os (mic oscopia
de undo escu o, cul u a e/ou abo dagens molecula es). Assim, a pesquisa de an ico pos an i-Lep ospi a spp.,
não é ú il na p imei a ase da in eção. Ao in és, a u ilização de mé odos indi e os pa a o diagnós ico o na-
se essencial a pa i da segunda semana da doença, al u a em que se inicia a espos a imune do hospedei o
com p odução de an ico pos especí icos, os quais são libe ados na co en e sanguínea, sendo susce í eis de
de eção em amos as se ológicas (Le e ; 2001; WHO 2003; Pica deau, 2013).
Depois de iniciada a espos a imune do hospedei o, e com o consequen e apa ecimen o dos
an ico pos no sangue, as bac é ias em ci culação endem a desapa ece , o nando in iá el o diagnós ico
a a és de mé odos di e os, a pa i da segunda semana de in eção. Ao mesmo empo que as bac é ias saem
da ci culação, elas ão aloja -se nos ins do hospedei o. Des a o ma, a de eção de bac é ias na u ina é
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possí el a pa i da segunda semana da doença, al u a em que es as começam a se libe adas po es a ia.
A lep ospi ú ia du a ce ca de um mês no hospedei o humano (Le e ; 2001; WHO 2003; Pica deau, 2013).
Além da impo ância do diagnós ico labo a o ial, impo a e e i a necessidade do diagnós ico
di e encial em doen es que ap esen em um conjun o de sin omas inespecí icos (sínd ome eb il agudo,
mialgias, náuseas, ómi os e ce aleias), com his ó ia an e io de con ac o com água, solos e/ou animais (em
ambien e ec eacional ou ocupacional). A suspei a de lep ospi ose ambém aumen a em con ex o
epidémico, quando o núme o de no os casos aumen a exponencialmen e numa de e minada egião (Du a
& Ch is ophe , 2005; Fa a e al., 2014).
No en an o, especialmen e em países de clima opical, a possibilidade de não se a a de in eção
po Lep ospi a é maio , do que em países de clima empe ado. De ac o, em con ex o opical, doenças como
a malá ia e a dengue que são igualmen e endémicas, e numa p imei a ase da in eção, egis am uma
sin oma ologia em udo semelhan e com a que e i icamos na o ma le e da lep ospi ose, o que ocasiona
po ezes p oblemas de diagnós ico di e encial. Es a si uação di icul a o e e ido diagnós ico nes es países,
que habi ualmen e êm ambém de icien es ecu sos labo a o iais (Vine z, 2001; Du a & Ch is ophe , 2005).
Nos países de clima empe ado, a sínd ome eb il aguda pode se con undida com o í us In luenza
ou com uma in eção mo i ada po um í us en é ico. Nas o mas mais g a es de lep ospi ose, o diagnós ico
di e encial es á, mui as ezes, elacionado com uma meningi e assép ica ou sépsis. Os Han a í us são ou o
exemplo de uma in eção que ap esen a ca ac e ís icas comuns com a lep ospi ose, a começa na o ma de
ansmissão, a a és do con ac o com oedo es, mas ambém pela sin oma ologia, a qual es á associada a
eb es hemo ágicas e comp ome imen o enal (Fa a e al., 2014).
Re e idos que o am de modo gené ico as di e en es me odologias u ilizadas no diagnós ico
labo a o ial, en endeu-se se ú il no âmbi o da p esen e e isão da li e a u a, de alha um pouco mais, cada
uma das e e idas abo dagens.
1.4.1 - Mé odos di e os
1.4.1.1 – Mic oscopia em undo escu o
As lep ospi as podem se iden i icadas, como e e ido, a a és de di e sas écnicas de mic oscopia,
ais como, a mic oscopia de luo escência e de undo escu o (abo dagem con encional) mas ob iga ó ia, pa a
espi oque as, sendo que a iden i icação das lep ospi as es á associada às ca ac e ís icas ísicas e
mo ológicas (dimensões e mo ilidade) p óp ias des as bac é ias, ca ac e ís icas que as dis inguem e
acili am a sua iden i icação no exame di e o (Colla es-Pe ei a, 1994; WHO 2003; Viei a, 2006).
Con udo, apesa de se u ilizada no labo a ó io pa a o diagnós ico de lep ospi ose, es a écnica em
algumas limi ações. A p imei a das quais é a necessidade de pessoal écnico quali icado e expe ien e pa a
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p ocede à obse ação do ma e ial biológico ao mic oscópio, pa a que a in e p e ação seja co e a. Além
disso, impo a e e i a possibilidade da amos a pode con e á ios a e ac os, os quais pode ão con ibui
pa a a di ícil in e p e ação e, consequen emen e in iabiliza o diagnós ico. Po úl imo, a mic oscopia, apesa
de ú il na iden i icação do mic oo ganismo, o nando inequí oco o diagnós ico, ap esen a uma sensibilidade
e especi icidade baixas, exigindo a p esença de bac é ias in ac as e iá eis (com mo ilidade). Impo a ainda
e e i que a mic oscopia ambém é ú il numa in eção ecen e, quando as bac é ias ainda es ão em ci culação
na co en e sanguínea do hospedei o (Colla es-Pe ei a, 1994; WHO 2003; Viei a, 2006).
1.4.1.2 - Exame cul u al em meio sele i o EMJH
O exame cul u al é, como e e ido, o único mé odo que pe mi e o isolamen o das lep ospi as, pa a
pos e io iden i icação das espécies en ol idas na in eção. Des a o ma, a cul u a é ú il no es abelecimen o
do diagnós ico de lep ospi ose, auxiliando ainda no en endimen o epidemiológico, uma ez que pe mi e
de e a se o a es pa ogénicos especí icos de uma de e minada egião, além das mani es ações clínicas
associadas à bac é ia isolada, e ainda possí eis on es de con ágio ou a é se os meios de con olo es ão a se
e icazes (WHO, 2003).
Apesa da u ilidade pa a es udos epidemiológicos, especialmen e em oedo es, o exame cul u al
ap esen a algumas limi ações, sendo que a p incipal em a e com o empo de c escimen o das lep ospi as
no meio de cul u a, impossibili ando uma espos a ápida. Es e ac o ai, consequen emen e, impedi que o
diagnós ico seja dado com apidez, o que ap esen a ge almen e uma g ande des an agem, especialmen e
se es i e mos pe an e um quad o g a e da doença (Le e , 2001).
Ou as des an agens des e mé odo es ão elacionadas com a in e e ência de an ibió icos, ou da
u ilização das condições ó imas de c escimen o das lep ospi as logo após o cul i o. Es e úl imo aspe o pode
se especialmen e di ícil de cump i nos países com baixos ecu sos (Le e , 2001).
Pelas azões expos as, a u ilização do exame cul u al é indicada apenas pa a o início da in eção,
quando a bac é ia es á em ci culação no o ganismo, sendo que aquele pode se ei o a pa i de amos as de
sangue ou LCR (Líquido Cé alo-Raquidiano). Na ase imune (lep ospi ú ia) é ambém ecomendada a
u ilização de amos as de u ina, o que pode po encia a ob enção de isolamen o de Lep ospi a spp. (Fa a
e al., 2014)
O meio de cul u a comumen e u ilizado pa a o isolamen o de lep ospi as é o meio semissólido EMJH
(Ellinghausen-McCullough-Johnson-Ha is) (Fig. 1.6). As lep ospi as são incubadas em ae obiose, a uma
empe a u a en e 28-30oC, de endo o seu c escimen o se obse ado semanalmen e, u ilizando-se a
mic oscopia de undo escu o pa a moni o iza o e e ido c escimen o. Quando a cul u a é bem-sucedida
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obse a-se na pa e supe io do ubo uma zona com opacidade, que co esponde à concen ação de
lep ospi as a qual é designada po anel de Dinge (Le e , 2001; Wu hiekanun e al., 2007; Fa a e al., 2014).
Figu a 1.6 - Rep esen ação de c escimen o bac e iano (Lep ospi a spp.) em meio de cul u a (EMJH semi-
sólido). Pode obse a -se na pa e supe io do ubo de cul u a a p esença do anel de Dinge .
(Fo og a ia do au o )
1.4.1.3 - Ampli icação de DNA (PCR)
Os mé odos molecula es êm adqui ido, nos úl imos anos, uma impo ância c escen e no diagnós ico
da lep ospi ose. A écnica PCR é u ilizada com o obje i o de ampli ica o DNA lep ospí ico p esen e nas
di e sas amos as biológicas que chegam ao labo a ó io, en e as quais, sangue, so o, u ina, LCR, ou a é
mesmo ecidos sólidos como ( im, ígado, pulmão) (Le e , 2001; Viei a, 2006).
As an agens associadas a es a me odologia são á ias, começando na capacidade de de e a DNA
de lep ospi as em ci culação numa ase p ecoce da in eção, mesmo quando es as es ão ainda em escasso
núme o na co en e sanguínea, e em casos em que a espos a imune do hospedei o ainda não e e início ou
es e se encon a imunodep imido (Viei a, 2006).
Os mé odos molecula es são igualmen e impo an es pela capacidade de o nece um diagnós ico
ápido, o qual é especialmen e impo an e nos casos g a es da doença, podendo se a ais pa a o doen e.
Des a o ma, a ápida iden i icação do agen e causal da in eção ai pe mi i a adminis ação da e apêu ica
co e a de modo mais céle e (Mé ien e al., 1992).
A écnica de PCR baseia-se na ampli icação de uma sequência de DNA lep ospí ico p esen e numa
amos a, sendo que no inal se ob ém um agmen o de DNA ampli icado, o qual é de e ado num gel de
aga ose, sob luz ul a iole a. Es a écnica é ealizada após ex ação e pu i icação do DNA p o enien e das
Anel de Dinge

20
amos as an e io men e mencionadas. A especi icidade do p o ocolo de PCR u ilizado pa a a de eção de
lep ospi as é de e minada pelos p ime s usados, sendo que esul ados com uma baixa especi icidade es á
ge almen e elacionada com p ime s que apenas de e am o géne o Lep ospi a, enquan o que a u ilização de
p ime s que pe mi em de e a exclusi amen e DNA de espécie pa ogénicas con e e uma maio
especi icidade ao mé odo (Le e , 2001; Aldeia, 2016).
Apesa das inúme as an agens dos mé odos molecula es, es es ambém possuem algumas
des an agens, como o ele ado cus o dos eagen es e equipamen os, bem como a necessidade de
manu enção dos mesmos, os quais ge almen e, sob e udo em e mos de diagnós ico humano, eque em
labo a ó ios especializados e ce i icados. Des a o ma, a u ilização des e ipo de me odologia em países de
baixa enda não é mui o iá el, bem como em labo a ó ios com um ele ado núme o de amos as na o ina
(Le e , 2001; Aldeia, 2016).
1.4.2 - Mé odos indi e os
1.4.2.1 - Tes es de Ras eio
o Tes e de Aglu inação Mac oscópica (MACROLep o)
Exis em di e sos es es de as eio pa a lep ospi ose, dos quais se des acam os de aglu inação
mac oscópica que podem e di e sos supo es, lá ex ou mesmo uma lâmina de id o. Um des es, é o es e
designado po MACROLep o, cuja aglu inação oco e exa amen e sob e uma lâmina de id o. Es e es e oi
desen ol ido no Labo a ó io de Lep ospi ose e Bo eliose de Lyme (LLBL) no âmbi o de um p oje o
desen ol ido em pa ce ia com a indús ia, endo como inalidade se i como es e de as eio labo a o ial
no diagnós ico de lep ospi ose. Como undamen o, es e es e u iliza um pool de an igénios, os quais de em
se ep esen a i os dos se o a es mais p e alen es da egião ou do país onde o es e é aplicado, ac o que
con ibui pa a aumen a a sensibilidade do mé odo. A especi icidade, não é ele ada, oco endo com
equência eações c uzadas com ou os mic o ganismos, o que pode di icul a o en endimen o dos
esul ados ob idos (Gonçal es, 2009), de qualque modo, semp e que oco a um esul ado posi i o ou
du idoso, es e de e se semp e con i mado pelo es e de e e ência (TAM).
o Tes e ELISA
De modo análogo, aos es es de aglu inação mac oscópica, o es e ELISA é ambém conside ado
como es e de as eio no diagnós ico da lep ospi ose. U iliza um an igénio lep ospí ico que e es e as placas
de mic oaglu inação, ao con á io do es e em lâmina que usa um pool an igénico em suspensão. O so o-
21
p oblema é colocado em con ac o com o an igénio ixo na placa e, após um empo de incubação, oco e uma
eação an igénio-an ico po que é obse ada a a és da u ilização de um conjugado ma cado com uma
enzima e o espe i o subs a o. A eação colo imé ica esul an e i á pe mi i a de eção dos complexos
an igénio-an ico po o mados, sendo que a in ensidade da co é p opo cional à quan idade de an ico po
p esen e no so o-p oblema (WHO, 2003; Viei a, 2006).
o Tes e de Aglu inação Mic oscópica (TAM)
Apesa da sua an iguidade e de algumas des an agens me odológicas e exigência de ecu sos que
humanos que ma e iais, disponí eis apenas nos labo a ó ios com es a u o de Labo a ó ios de Re e ência
exis en es em alguns países nos di e sos con inen es, o Tes e de Aglu inação Mic oscópica (TAM) con inua
a se o es e de e e ência ecomendado pela OMS, pa a o diagnós ico de lep ospi ose. Es e es e pe mi e a
de eção de an ico pos an i-Lep ospi a spp., sendo o único que pe mi e iden i ica o se og upo da es i pe
in e an e, o que cons i ui uma g ande an agem sob e odos os ou os, inclusi e em con ex o epidemiológico
(Colla es-Pe ei a, 1994; Viei a, 2006). Tal como os es es de as eio desc i os an e io men e, a TAM baseia-
se igualmen e numa eação an igénio-an ico po, sendo que uma das p incipais di e enças é o ac o de a
isualização da aglu inação se ei a em mic oscópio de undo escu o. U ilizam-se an igénios i os que
cons i uem a ba e ia de e e ência (cons i uída po se o a es/es i pes ep esen a i os de se og upos com
dis ibuição mundial) os quais ão eagi com os so os diluídos, u ilizando-se mic oplacas de undo plano
(Gonçal es, 2009), como documen ado na (Fig. 1.7).
Figu a 1.7 - Aspe o dos ipos de eação an igénio-an ico po, obse adas
em mic oscopia de undo escu o. a - Ag o al (Con olo); b-g
- di e en es ní eis de aglu inação; h – Nega i o.
(Adap ado de Céspede, 2015)
22
1.5 - P e enção e Con olo
E adica a lep ospi ose é uma a e a quase impossí el de conc e iza dado o núme o de a iá eis
bió icas e abió icas que lhe es ão ine en es, como é o caso dos mais de 200 se o a es pa ogénicos e a
possibilidade de mais de 160 espécies de mamí e os pode em se in e adas pela bac é ia, e no caso dos
oedo es, o ac o de es es se o na em po ado es enais c ónicos (assin omá icos), disseminando
lep ospi as a a és da u ina (pa a o ambien e) du an e oda a ida. Des a o ma, o con olo da lep ospi ose
pode á se ei o pela en a i a de eduzi o con ac o dos humanos com o agen e in ecioso, seja de o ma
di e a ou indi e a (Bha i e al., 2003).
No con ex o ambien al exis em á ias medidas que podem se ado adas no sen ido de p e eni a
disseminação das lep ospi as, des acando-se as seguin es: i) iden i icação das zonas e g upos em isco de
con ac o com as lep ospi as; ii) ações de des a ização; iii) ga an ia de boas condições sani á ias e de higiene;
i ) u ilização de equipamen os de p o eção indi idual, no caso dos g upos p o issionais de isco; )
a amen o e acinação de animais; e, po úl imo i) a ealização de ações de sensibilização jun o da
população e dos p o issionais de saúde (Bha i e al., 2003).
No que diz espei o à acinação pa a p e enção da lep ospi ose em humanos, sabe-se que es a se
encon a num es ádio inicial, em di e sos países. Vá ios es udos êm demons ado uma o al ine icácia na
p o eção c uzada pa a di e sos se og upos (Bha i e al., 2003, Ha skee l e al., 2011). Con udo, o ac o das
lep ospi as es a em associadas a mecanismos complexos de imunidade, sendo es a se o a especí ica o que
é ou o incon enien e na p odução de uma acina e icaz. Po exemplo, a acinação em animais (domés icos
ou de p odução animal) apenas p e ine os sin omas, mas não é o almen e capaz de e i a a lep ospiú ia, o
que se aduz na con inuação da capacidade de ansmissão da bac é ia aos humanos. Des a o ma, as
maio es di iculdades ine en es à p odução de uma acina e icaz no con olo da lep ospi ose, es ão
p incipalmen e elacionadas com a sua capacidade de se poli alen e, p o egendo os humanos con a á ios
se o a es e simul aneamen e se du adou a (Shieh e al., 2006; Vijayacha i e al., 2008; Xu & Ye, 2018).
No que espei a aos oedo es, o con olo e p e enção assume uma dinâmica dis in a, a qual de e á
semp e in eg a o con ex o ambien al, económico e social de uma de e minada egião. O saneamen o básico
inexis en e ou de icien e, a ges ão de esíduos, além da escassez de higiene numa de e minada zona, são
a o es undamen ais pa a a disseminação de oedo es, os quais aca e am p ejuízos mone á ios, além de
se em po ado es de di e sos agen es de doenças in eciosas (bac é ias, p o ozoá ios, í us). A lep ospi ose
é assim, apenas um exemplo, sendo uma zoonose de impac e mundial, di e amen e associada à p esença
dos e e idos mic omamí e os. Des a o ma, con ola os oedo es o na-se undamen al pa a a p e enção
da oco ência da doença, além de se uma o ma de ga an i a melho ia económica e sani á ia de uma
de e minada egião (C espo, 2012).
23
O con olo da população de oedo es es á dependen e de á ios aspe os, ais como, a biologia,
hábi os compo amen ais e a iden i icação das espécies p esen es na egião que se p ende con ola . Es as
in o mações se ão de ex ema u ilidade no planeamen o das ações de con olo mais e icazes pa a
de e minado local, ga an indo assim o sucesso do mesmo. As di e en es espécies de oedo es possuem
ca ac e ís icas p óp ias no que espei a ao habi a , alimen ação, ou ní el compo amen al, as quais êm de
se idas em con a nas di e sas decisões da es a égia de con olo ais como: i) local onde as cap u as se ão
ei as; ii) qual o núme o de a madilhas necessá ias e a dis ância en e elas; iii) o ipo de a madilha mais
indicado consoan e a espécie e a é o an ido o (po exemplo, oden icida) a u iliza (SRAFAM, 2012; C espo,
2012).
Assim, o con olo de p aga de oedo es e, consequen emen e da ansmissão das lep ospi as num
de e minado local es á dependen e de uma abo dagem ab angen e e in eg ada, a qual u iliza di e en es
medidas. Des a o ma, a pa da u ilização de oden icidas é igualmen e necessá io elimina os a o es
ambien ais p opícios à manu enção da população de oedo es na egião. É, po isso, impo an e ga an i o
cump imen o das cinco e apas necessá ias pa a o con olo e icaz dos oedo es: i) inspeção: ii) iden i icação;
iii) medidas p e en i as; i ) des a ização; e ) moni o ização (SRAFAM, 2012; C espo, 2012).
A inspeção p essupõe a isualização da egião, na en a i a de se encon a e idências da p esença
de oedo es, bem como es abelece a análise dos ilhos, on es de alimen ação e locais que si am de ab igo.
Na ase da iden i icação, é ei a a dis inção das espécies p esen es na egião, as quais pe mi em ob e o
conhecimen o necessá io pa a se oma em as medidas co e as de des a ização. A ase seguin e (medidas
p e en i as) elaciona odos os meios p e en i os e co e i os necessá ios pa a impedi a disseminação de
oedo es numa de e minada egião. Alguns exemplos são: co e o acondicionamen o do lixo, canalização da
água, limpeza dos e enos baldios, en e ou os. Após a des a ização, u ilizando a oei as, a madilhas ou
oden icidas pa a elimina a população de oedo es numa de e minada egião, é necessá io ealiza a úl ima
e apa, a a aliação e moni o ização. Es a úl ima ase é undamen al pa a a alia os esul ados ob idos, sendo
necessá io con inua uma igilância pe iódica, de o ma a e i a -se no as in es ações (SRAFAM, 2012;
C espo, 2012).
1.6 - Jus i icação do ema da Disse ação
Da e isão da li e a u a que acaba de se ei a, ica a pe ceção de que a lep ospi ose é uma doença
in eciosa zoonó ica, eme gen e e de dis ibuição global que es á p esen e sob e udo, em países de clima
opical e empe ado. É p o ocada po espi oque as pa ogénicas pe encen es ao Géne o Lep ospi a, cujos
sin omas podem a ia de ligei os a mode ados, incluindo eb e, do es de cabeça, mialgias, mas que pode
le a a si uações po encialmen e a ais. A ualmen e, a doença a e a mais de um milhão de pessoas em odo
o mundo. A p incipal on e de in eção pa a os humanos e ou as espécies animais é o con ac o com u ina ou
30
À semelhança da me odologia pa a ob enção das amos as de água, odos os ubos com amos as de
solo o am e ique ados com a a ibuição de um núme o sequencial, ao qual es ão associados odos os
pa âme os ísico-químicos ecolhidos e in oduzidos numa abela já an e io men e mencionada.
Os meios de acondicionamen o e anspo e u ilizados pa a as amos as de solo o am idên icos aos
u ilizados pa a as amos as de água, al como a análise p elimina de alguns pa âme os ísicos e químicos
(pH e Ni i os) como ambém o egis o do ní el de humidade do solo, empe a u a e o amanho da
g anulagem dos sedimen os
Pa a a medição do pH e ni i os das amos as de solo o am u ilizados os mesmos Ki ’s usados nas
amos as de água.
Figu a 2.4 - Exemplos de locais onde o am ealizadas ecolhas de amos as de solo.
(Fo og a ias o iginais do au o )

31
2.6 – Roedo es
2.6.1 - Calenda ização e me odologia pa a a cap u a de oedo es
O ma e ial necessá io pa a o p esen e abalho incluiu ainda a cap u a de oedo es na p oximidade
dos locais onde o am ecolhidas amos as de água doce e de solos, a mesma e e início no dia 14 de ab il
de 2019 e es endeu-se a é ao dia 30 de junho de 2019, inclusi e.
Pa a o e ei o, o am u ilizadas a madilhas ipo She man® e Tomawhack®, des inadas a mu ganhos e a
a os, espe i amen e. Es as a madilhas são ei as de uma a mação de aço gal anizado com um sis ema
in e io com ala anca, que pe mi e o echo das mesmas após a en ada do animal, impossibili ando-o se sai .
Na cap u a de oedo es o am u ilizadas 4 a madilhas do ipo She man® e 4 a madilhas do ipo
Tomawhack®, p epa adas com isco compos o po sa dinha em conse a, e colocadas na p oximidade dos
locais de ob enção das amos as de água, após se em conside adas as ca ac e ís icas dos locais ace ao que
se conhece sob e os hábi os e p e e ências dos po encias espécimes a cap u a , nomeadamen e: i)
p esença/ausência de ege ação; ii) p oximidade de cu sos de água; iii) p esença/ausência de p edado es; e
i ) p esença/ausência de ilhos c iados po animais, como ilus ado na Figu a 2.5.
As a madilhas o am colocadas nos locais p e iamen e selecionas en e as 19 ho as e as 7 ho as da
manhã (pe íodo no u no), sendo obse adas de duas em duas ho as pa a e i ica : i) p esença/ausência de
Figu a 2.5 - Exempli icação de locais onde o am colocadas a madilhas
pa a a cap u a de oedo es. (Fo og a ias o iginais do au o )
32
oedo ; ii) p esença/ausência de isco no in e io da a madilha; e iii) se o sis ema de ala anca da a madilha
es a a acionado ou po aciona (Fig. 2.6).
Nos locais onde se e i icou a cap u a de oedo es, o am ecolhidos alguns pa âme os ambien ais: i)
p esença/ausência de ege ação; ii) p oximidade de cu sos de água; iii) auna exis en e no local; climá icos:
i ) empe a u a e humidade do a ; e os p incipais pa âme os mo omé icos de cada espécime.
2.6.2 - Eu anásia e nec opsia
Após se e i ica a cap u a dos animais, cada espécime oi ans e ido pa a uma caixa es anque (Fig.
2.7), onde de seguida, u ilizando uma sob edosagem de anes ésico (Iso lu ano®), cada animal oi
indi idualmen e eu anasiado, sendo a mo e con i mada a a és da écnica de deslocamen o da ce ical.
Figu a 2.7 - Exemplo de um dos oedo es cap u ados den o da caixa es anque
u lizada pa a a eu anásia. (Fo og a ia o iginal do au o )
Figu a 2.6 – Obse ação de a madilhas com a p esença de oedo es.
(Fo og a ias o iginais do au o )
33
Logo após a con i mação da mo e do animal, deu-se início à ecolha e egis o numa abela p epa ada
pa a o e ei o, dos dados mo ológicos: i) peso do espécime; ii) comp imen o o al do co po; iii) comp imen o
da cauda; i ) comp imen o da o elha; ) comp imen o da pa a pos e io , como ilus ado na Figu a 2.8,
seguindo-se a ecolha das amos as biológicas, ais como: i) sangue; ii) u ina (quando possí el); iii) baço; i )
im; ) ígado; e i) pulmão, u ilizando ma e ial ci ú gico es é il ap op iado pa a o p ocedimen o (Fig. 2.9 e
Fig. 2.10).
Figu a 2.8 – Exemplo de pesagem de um espécime
Mus musculus cap u ado.
(Fo og a ia
o iginal do au o )
Figu a 2.9 – Exemplo de ecolha de sangue po
punção ca díaca em Mus musculus.
(Fo og a ia o iginal do au o )
Figu a 2.10 - Nec ópsia pa a ecolha de
ó gãos em Mus musculus.
(Fo og a ia o iginal do au o )
34
Pa a a ecolha das amos as biológicas o am u ilizados ubos eppendo es é eis de 2mL de idamen e
e ique ados. O acondicionamen o das mesmas necessi ou de meios de conse ação di e en es, como é o
caso das amos as de sangue ecolhidas de cada espécime, con endo 10μL de an icoagulan e (Hepa ina®)
cada. Em elação às amos as de u ina, os ubos eppendo encon a am-se azios, enquan o que pa a as
es an es amos as biológicas de ecido sólido, os mesmos con inham PBS, à exceção de quando e a
p e endido u iliza , uma des as úl imas amos as, pa a cul u a, si uação em que se acondiciona a a mesma
em meio EMJH.
Após a ecolha, odas as amos as o am colocadas em caixa é mica a 4oC, e anspo adas pa a o
LLBL no IHMT, e p ocessadas num pe íodo não supe io a 24 ho as.
B. Componen e labo a o ial
2.7 - Ex ação de DNA genómico
2.7.1 - Amos as de água
Com o obje i o de elimina po enciais con aminan es, bem como ga an i que os de i os de maio es
dimensões se iam e i ados das amos as de água, p ocedeu-se a uma e apa p é ia de cen i ugação, de
o ma a ga an i a qualidade das amos as que i iam se subme idas a écnicas molecula es. Assim, após a
chegada ao labo a ó io, as amos as o am cen i ugadas a 2000 pm du an e cinco minu os. Após a
cen i ugação, ecolheu-se 1mL do sob enadan e, o qual oi ans e ido pa a um ubo eppendo de 1,5mL.
O eppendo oi e ige ado a é à e apa seguin e de ex ação de DNA das amos as.
O ki come cial u ilizado pa a a ex ação de DNA das amos as de água oi o Ci ogene® DNA Cell &
Tissue Ki , a a és do p ocedimen o de pu i icação de DNA a pa i de amos as biológicas (so o, sangue o al,
u ina, en e ou os), apesa de es e não e sido elabo ado especi icamen e pa a amos as de água, já oi
u ilizado com sucesso, no passado, em amos as des a na u eza.
Fo am adicionados 100μL de amos a de água (p o enien e da coleção de água doce) a 500μL de Cell
Lysis, de o ma a lisa as células exis en es. De ido à quan idade baixa de DNA exis en e nes as amos as de
água, oi de seguida adicionada 3μL da enzima P o einase K, seguindo-se uma incubação de 55oC du an e 1h.
Após a incubação, e de o ma a ob e maio endimen o na ex ação de DNA, adicionou-se a enzima
RNAse (3μL) onde oi ei a uma homogeneização, e de seguida uma incubação a 37oC du an e 20min. As
amos as ica am pos e io men e à empe a u a ambien e du an e 5min, onde depois oi adicionado 200μL
do eagen e P o ein P ecipi a ion, o qual pe mi iu emo e as p o eínas exis en es na amos a.
35
Pa a pe mi i a p ecipi ação das p o eínas, u ilizou-se o ó ex, a elocidade ele ada, agi ando-se as
amos as du an e 20seg, seguindo-se uma incubação em gelo de 10 minu os. Após es e empo, ealizou-se
uma cen i ugação das amos as du an e 6 minu os a uma elocidade de 14500 pm, de o ma a ob e -se um
pelle de p o eínas.
O sob enadan e, com o DNA, oi decan ado pa a um eppendo con endo 600μL de Isop opanol a 100%
e, uma ez mais, admi indo-se uma quan idade de DNA in e io a 20μg, adicionou-se 1μL de glicogénio de
o ma a aumen a o endimen o.
Após ob e a mis u a po in e são dos ubos e uma incubação 5 minu os à empe a u a ambien e, as
amos as o am cen i ugadas no amen e a 14500 pm du an e 6 minu os, com o obje i o de se ob e um
pelle de DNA. O sob enadan e oi en ão decan ado cuidadosamen e e adicionou-se 600μL de e anol a 70%,
com o obje i o de la a o pelle , seguindo-se uma homogeneização.
As amos as o am, po im, cen i ugadas du an e 3 minu os a 14500 pm e o e anol oi decan ado,
in e endo-se cuidadosamen e o ubo. P ocedeu-se en ão à secagem do pelle de DNA du an e 15min em
ácuo, eluindo-o de seguida com 20μL de solução DNA Hyd a ion. An es de coloca a 4oC, o DNA eluído oi
deixado o e nigh à empe a u a ambien e.
2.7.2 – Amos as de solo
O ki come cial da ma ca Nzy ech® NZY Soil and gDNA Isola ion Ki oi u ilizado pa a a ex ação de DNA
das amos as de solo. Es e ki oi desen ol ido pela ma ca, pa a a ex ação de DNA de di e sos ipos de solo
(Fig. 2.11), mas oi necessá io adap á-lo ao ipo de solo ecolhido. Des a o ma, p ocedeu-se inicialmen e a
uma o imização do ki , de o ma a pe cebe qual a quan idade ideal de amos a de solo a u iliza , bem como
qual o bu e (NSL1 ou NSL2) indicado pa a um maio endimen o do DNA ex aído.
Figu a 2.11 - Exemplos de amos as de solo ecolhidos an es do início
de ex ação de DNA. (Fo og a ia o iginal do au o )

36
Des a o ma, inoculou-se 100μL de uma es i pe de L. in e ogans (numa concen ação de 106) numa
amos a de 1000mg de solo, a qual icou du an e 1h à empe a u a ambien e. De seguida, iniciou-se o
p o ocolo desc i o no ki , endo-se u ilizado o bu e NSL1 em 500mg da amos a e o bu e NSL2 na es an e
po ção. U ilizou-se a quan idade máxima de amos a de solo indicada pelo ab ican e. O bu e NSL1
demons ou um melho desempenho pa a o ipo de solo analisado, compa ado com o bu e NSL2, ob endo-
se maio quan idade de DNA ampli icado com o p imei o eagen e. Des a o ma, o bu e NSL1 oi u ilizado
pa a a ex ação de DNA de odas as amos as de solo ecolhidas.
A ex ação de DNA iniciou-se com a p epa ação da amos a de solo, a qual se encon a a e ige ada
a 4oC num ubo Falcon®. Re i ou-se de cada amos a o iginal, uma po ção en e 250mg a 500mg, pesada no
NZYSpin Soil Bead Tube, um ubo o necido pelo ki que con ém es e as de ce âmica, as quais a uam na
dis upção das células pa a a libe ação do DNA exis en e. Logo após a pesagem do solo, oi adicionado 150μL
do eagen e de lise, seguindo-se uma e apa de agi ação no ó ex (5min), de o ma a pe mi i que o DNA
p esen e no solo seja libe o.
De o ma a elimina os con aminan es p esen es nas e e idas amos as, p ocedeu-se a uma
cen i ugação de 2 minu os a 14500 pm e à adição de 150 μL do bu e NSL3. A amos a oi no amen e
homogeneizada no ó ex po 5 segundos, endo-se seguido uma e apa de incubação a 4oC du an e 5
minu os e uma cen i ugação de 1 minu o a 14500 pm.
Iniciou-se depois o passo de il ação do lisado, de o ma a pu i ica o DNA p esen e na amos a.
Des a o ma, ans e iu-se 700μL do sob enadan e pa a a coluna con endo um il o (NZYSpin Soil Inhibi o
Remo al Column) e cen i ugou-se du an e 1 minu o a 14500 pm, desca ando-se a coluna.
De o ma a ajus a a capacidade de ligação do DNA à coluna, adicionou-se 550μL do bu e NSB e
homogeneizou-se a amos a no ó ex du an e 5 segundos. O il ado (550μL) oi de seguida ans e ido pa a
uma no a coluna e cen i ugado a 14500 pm du an e 1 minu o. Foi en ão desca ado o il ado e deu-se
início à la agem e secagem do DNA na memb ana de sílica. Des a o ma, adicionou-se 500μL de bu e NSB
e cen i ugou-se du an e 30 segundos a 14500 pm, seguindo-se a adição de 550μL de bu e NSW1 e
no amen e uma cen i ugação de 30 segundos a 14500 pm. Po im, adicionou-se 700μL do bu e NSW2 à
coluna e cen i ugou-se 30 segundos a 14500 pm, epe indo-se a cen i ugação po 2 minu os pa a uma
secagem mais e icaz da memb ana.
O DNA oi de seguida eluído com 30μL de bu e NSE seguido de uma cen i ugação de 30 segundos
a 14500 pm, sendo o DNA ex aído conse ado a 4oC.
37
2.7.3 - Amos as biológicas ( oedo es)
O p ocedimen o de ex ação de DNA dos ó gãos dos oedo es cap u ados, bem como das amos as de
sangue e u ina, e e início nas 24h após a eu anásia e a nec opsia, de o ma a p e eni deg adação das
e e idas amos as. Pa a ealiza a ex ação de DNA dos ó gãos dos oedo es, bem como das amos as de
sangue e u ina, oi u ilizado o ki come cial da ma ca Ci ogene® DNA Cell & Tissue Ki . O p ocedimen o de
pu i icação de DNA a pa i das amos as (so o, sangue o al, u ina, en e ou os) oi u ilizado ambém pa a
a ex ação de DNA do sangue e u ina ecolhidos e o p ocedimen o de pu i icação de DNA a pa i de ecido
sólido (1-5mg) oi u ilizado pa a a ex ação de DNA dos ó gãos dos oedo es (baço, ins, ígado, pulmões).
Des a o ma, os ó gãos anspo ados em PBS a é ao labo a ó io o am inicialmen e pesados e oi
e i ada uma amos a de 2mg de cada ó gão pa a se u ilizada na ex ação de DNA (Fig. 2.12). Que a
pesagem e o co e longi udinal dos ó gãos o am ealizados numa câma a de luxo lamina , na p esença de
um bico de Bunsen, de o ma a man e o ambien e es é il.
Cada amos a de 2g ob ida de cada ó gão oi de seguida colocada num ubo con endo 1,5mL do
eagen e Cell lysis. De o ma a ob e um máximo endimen o do DNA ex aído, adicionou-se 0,75μL da
enzima P o einase K, seguindo-se uma incubação a 55oC o e nigh , com a inalidade de ga an i a e icaz lise
das células p esen es no ecido animal.
Figu a 2.12 – Exemplo de pesagem do im de um dos oedo es cap u ado e po ção
u ilizada no p o ocolo de ex ação de DNA. (Fo og a ias o iginal do au o )
38
No dia seguin e, o p ocedimen o con inuou com a adição de 0,75μL da enzima RNAse ao lisado celula ,
seguida de homogeneização do ubo e no a incubação du an e 1 ho a a 37oC. Após o pe íodo de incubação
as amos as o am a e ecidas à empe a u a ambien e du an e 5 minu os e logo de seguida adiciona am-se
50μL de P o ein P ecipi a ion, pa a p ecipi a as p o eínas p esen es nas amos as.
As amos as o am agi adas no ó ex a elocidade ele ada du an e 20 segundos, ga an indo-se a
co e a homogeneização, seguindo-se uma incubação em gelo du an e 5 minu os. As amos as o am de
seguida cen i ugadas du an e 4 minu os a 14500 pm e o sob enadas e decan ado pa a um no o ubo
con endo 150μL de Isop opanol a 100%. De o ma a p e eni um endimen o baixo de DNA ex aído (<1 μg),
oi adicionado 0,5μL de glicogénio às amos as.
As amos as o am homogeneizadas cuidadosamen e po in e são dos ubos (50 ezes) e de seguida
cen i ugadas du an e 6 minu os a 14500 pm. O sob enadan e oi desca ado e o pelle de DNA la ado com
150μL de e anol a 70%, in e endo-se os ubos di e sas ezes pa a uma la agem e icaz.
Seguiu-se uma no a cen i ugação a 14500 pm du an e 2 minu os, endo-se desca ado no amen e o
sob enadan e, cuidadosamen e, de o ma a não sol a o pelle de DNA. Os ubos o am de seguida secos a
ácuo du an e 15min, eluindo-se pos e io men e o DNA com 30μL de DNA Hyd a ion. As amos as ica am a
incuba o e nigh à empe a u a ambien e, e pos e io men e e ige adas a 4oC a é pos e io análise.
A ex ação de DNA a pa i das amos as de sangue e u ina seguiu o mesmo p ocedimen o desc i o
an e io men e pa a as amos as p o enien es de coleções de água doce, com exceção do pe íodo de
incubação após a adição do eagen e Cell Lysis e da enzima RNAse. O eagen e Cell Lysis icou assim a incuba
o e nigh a 55oC, p e endendo-se o–b e no inal uma maio e icácia na lise celula . De igual modo, após a
adição da enzima RNAse, as amos as de sangue e u ina o am incubadas du an e 1h a 37oC. O es an e
p ocedimen o seguiu o an e io men e desc i o pa a as amos as de água.
2.8 – Ampli icação de DNA lep ospí ico
2.8.1 – Tes e de sensibilidade
An es de u iliza os p ime s escolhidos pa a a ampli icação de DNA lep ospí ico nas amos as de água,
solo e amos as biológicas ( oedo es) oi inicialmen e ealizado um es e de sensibilidade. Pa a isso, o am
u ilizados p ime s especí icos, enho como al o o gene lipL32 o qual é comum a odas as espécies pa ogénicas
do géne o Lep ospi a. Po uma ques ão p á ica, nes e manusc i o o p o ocolo de PCR, u ilizando es es
úl imos p ime s, é designado po “LipL32”.
Pa a o es e de sensibilidade, oi selecionada uma cul u a de lep ospi as de uma espécie pa ogénica
(Lep ospi a in e ogans) na qual se começou po de e mina a densidade ó ica num espec o o óme o
Sma SpecTM Spec opho ome e , BIORAD.
39
P epa am-se, de seguida, diluições se iadas a pa i de uma amos a de 107 células/mL a é à diluição
de 100 células/mL. Foi en ão ealizada a ex ação e pu i icação de DNA des as diluições, u ilizando o mesmo
ki come cial usado pa a as amos as de água. Seguiu-se a ampli icação do DNA (ex aído) po nes ed-PCR.
Os p odu os ampli icados esul an es da PCR o am en ão sujei os a sepa ação elec o o é ica, no
equipamen o BioRad®, em gel de aga ose a 2%, du an e 45 min, a 125 ol s. Fo am u ilizados o co an e
G eenSa e P emiumTM e o ma cado de peso molecula Hype Ladde (100-1000b pa a o p o ocolo “LipL32”),
pa a iden i ica , po compa ação, a dimensão do(s) agmen o(s) ampli icado(s). Fo am u ilizados 4µL do
p odu o ampli icado aos quais se adicionou 2µL de ampão de amos a (loadding bu e ). O gel oi depois
isualizado sob luz ul a iole a (UV), u ilizando o equipamen o Dolphin-DocGel Image Sys em, da Weal ec®.
2.8.2 – Tes e de especi icidade
Pa a o es e de especi icidade o am u ilizados dois con olos nega i os con endo água es é il, uma
amos a de DNA de L. bi lexa (Pa oc) e uma amos a de DNA de uma ou a espi oque a Bo elia bu gdo e i
s.l., nas mesmas eações de nes ed-PCR u ilizadas pa a o es e de sensibilidade, de o ma a e i ica a
especi icidade ou não, dos p ime s selecionados pa a ampli icação de DNA lep ospí ico. Após a nes ed-PCR,
os p odu os ampli icados o am sujei os a ele o o ese e obse ação em UV nas condições an e io men e
desc i as.
2.8.3 – Ampli icação de DNA de amos as de água e solo
2.8.3.1 - Nes ed-PCR com p ime s uni e sais (A e B)
Após a ex ação de DNA das amos as de água e solo, p ocedeu-se à ampli icação do mesmo. Des a
o ma, u ilizou-se numa p imei a ase um p o ocolo de nes ed-PCR com p ime s uni e sais (A e B) de uma
egião bas an e conse ada pa a o Géne o Lep ospi a.
Na 1ª eação de PCR oi p epa ada uma solução (mix) pa a um olume inal de 25μL po cada amos a
a se es ada. Des a o ma, num eppendo de 0,2mL oi colocada a solução (mix), que con inha: H2O
au ocla ada, Bu e 10X (Bioline®), MgCl2 50mM (Bioline®), DNTP’s 100mM (Bioline®), P ime A 100μM,
P ime B 100μM, Taq polime ase 5U/μL (Bioline®) e 2,5μL de amos a (DNA) ou empla e.
A 2ª eação de PCR oi ealizada u ilizando-se uma solução (mix) com os mesmos componen es
an e io men e desc i os pa a a 1ª eação e ambém pa a um olume inal de 25μL. No en an o, u iliza am-
se 3μL do p odu o an e io men e ampli icado e p ime s A1 e B1 (ampli icando uma egião in e na da egião
ampli icada inicialmen e).
46
Quad o 3 – Rep esen ação do núme o de amos as ecolhidas nos di e en es concelhos dos dois Dis i os
es udados.
Legenda: “Lis” – Lisboa; “Sin” – Sin a; “Ma ” – Ma a; “T.Ved” – To es Ved as; “Se ”- Se úbal; “Alm” –
Almada; “Mon” – Mon ijo; “Alc” – Alcoche e; “A.Sal” – Alcáce do Sal; “S. Cac” – San iago do Cacém
3.2.2 - Pa âme os ísico-químicos
Como e e ido no pon o 1.4.1 da secção Ma e iais e Mé odos, o am egis ados os esul ados dos
pa âme os ísico-químicos das coleções de água onde se e e ua am colhei as, logo após a ecolha das
mesmas de modo a e i a possí eis al e ações.
Os alo es da empe a u a da água que o am egis ados si ua am-se en e os 9,4oC e 21oC, enquan o
que os alo es da empe a u a do a oscila am en e os 11oC e 19oC.
Nos dis i os de Lisboa e Se úbal o alo do pH oi maio i a iamen e de 7, com pe cen agens de 65% e
81%, espe i amen e (Fig. 3.2). No o al das 327 amos as analisadas, (nágua=238; 73%) o alo de pH oi de
7, sendo que os es an es 27% co esponde am a alo es de pH de 5, 6 e 8, como se obse a na Figu a 3.3.
Concelhos
Lis
Sin
Ma
T.Ved
Se
Alm
Mon
Alc
A.Sal
S.Cac
To al
Dis i os
Lisboa
74
48
30
12
164
Se úbal
36
54
10
20
38
5
163
To al
74
48
30
12
36
54
10
20
38
5
327

47
Figu a 3.2 – Rep esen ação g á ica do o al de amos as (N=327) e sus o alo de pH egis ado nas coleções
de água a aliadas nos dois dis i os (Lisboa e Se úbal).
Figu as 3.3 - Rep esen ação g á ica da pe cen agem de amos as de água de aco do com o alo de pH,
conside ando o o al de amos as (N=327).
Quan o à análise de ni i os, odas as amos as o am analisadas na al u a da colhei a e ap esen a am
esul ados in e io es a 0,1 mg/ml NO2.
2%
18%
73%
7%
Amos agem o al
Nágua=327
pH 5 pH 6 pH 7 pH 8
n=4
n=48
n=106
n=6
n=2
n=12
n=131
n=18
5 6 7 8
PH
Valo de pH das amos as de água nos di e en es
locais dos dis i os de Lisboa e Se úbal
Lisboa
Se úbal
pH
48
No ipo de água ecolhida, e i icou-se que 80% (n=261) amos as co espondem a água co en e e os
es an es 20% (n=66) o am classi icadas como água es agnada. No dis i o de Lisboa e Se úbal, as ipologias
de água mais obse adas o am de água co en e (Fig. 3.4).
Figu as 3.4 - Rep esen ação g á ica da pe cen agem de água das amos as ecolhidas de aco do com a sua
ipologia e espe i o dis i o.
3.2.3 - Ampli icação de DNA lep ospí ico com p ime s uni e sais (A e B)
Após a ex ação de DNA, as 327 amos as o am subme idas a um p o ocolo de nes ed-PCR com
u ilizando p ime s uni e sais (A e B) (Fig. 3.5).
Figu a 3.5 - Obse ação de um gel de ele o o ese de amos as de água após ampli icação po nes ed-PCR
com p ime s uni e sais (A e B). (M – Ma cado molecula (100pb); 1 a 12 – amos as de água; P
– con olo posi i o; N1 a N4- con olo nega i o da ex ação; N5 a N8 – con olo nega i o da PCR)
0
20
40
60
80
100
120
140
160
Lisboa Se úbal
Tipologia da água
Co en e Es agnada
Núme o de amos as de água
72%
(n=118)
28%
(n=46)
88%
(n=143)
12%
(n=20)
M 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 P N1 N2N3 N4 N5N6N7N8
1000pb
289pb
100pb
49
No o al de amos as analisadas (N=327), 49% ap esen a am ampli icação de DNA lep ospí ico
enquan o que em 51% (nágua=168) não se obse ou ampli icação de Lep ospi a spp. ampli icadas (Fig. 3.6)
Figu a 3.6 – Rep esen ação g á ica das amos as de água onde se obse ou ampli icação de DNA de
Lep ospi a spp., pela nes ed-PCR com p ime s uni e sais (A e B) e sus as amos as onde não
oi de e ado DNA da e e ida bac é ia.
Das 164 amos as analisadas do dis i o de Lisboa, e i icou-se ampli icação DNA de Leps ospi a spp.,
com p ime s uni e sais em 106 amos as, o que co esponde a uma pe cen agem de 65%. Das 163 amos as
analisadas do dis i o de Se úbal e i icou-se ampli icação em 53 amos as (33%) sendo as es an es amos as
nega i as (Fig. 3.7).
Nes ed-PCR com p ime s uni e sais (A e B)
(Nágua=327)
Posi i a Nega i a
49%
(n=159)
51%
(n=168)
Posi i o
Nega i o
50
Figu a 3.7 – Rep esen ação g á ica dos esul ados ob idos nas amos as que o am subme idas ao p o ocolo
de nes ed-PCR com p ime s uni e sais (A e B) e e en es aos dois dis i os (Lisboa e Se úbal).
3.2.4– Ampli icação de DNA lep ospí ico com p ime s especí icos “LipL32”
Fo am u ilizadas as amos as em que hou e ampli icação de DNA lep ospí ico (N=159) num segundo
p o ocolo de nes ed-PCR, des a ez com p ime s especí icos “LipL32” (Fig. 3.8).
Figu a 3.8 - Obse ação de um gel de ele o o ese de amos as de água após ampli icação po nes ed-PCR
com p ime s especí icos “LipL32”. (M – Ma cado molecula ; 1 a 6 – amos as de água; P –
con olo posi i o; de N1 a N4 – con olo nega i o da PCR)
M 1 2 3 4 5 6 7 P N1 N2 N3 N4
1000pb
183pb
100pb
0
20
40
60
80
100
120
Lisboa Se úbal
Nes ed-PCR com p ime s uni e sais (A e B)
Nágua=327
Posi i a Nega i a
65%
(106)
35%
(58)
33%
(n=53)
67%
(n=110)
Núme o de amos as de água
Nega i o
Posi i o
51
Das 159 amos as analisadas, 55 (35%) ap esen a am ampli icação de DNA lep ospí ico
co espondendo a lep ospi as pa ogénicas, enquan o que em 104 das mesmas não se ob e e ampli icação
(65%) (Fig. 3.9).
Figu a 3.9 – Rep esen ação g á ica dos esul ados o ais da ampli icação de DNA de Lep ospi a spp., nas
amos as de água a aliadas pela nes ed-PCR com p ime s especí icos “LipL32”.
Das 106 amos as do dis i o de Lisboa, onde se obse ou a ampli icação de DNA de Leps ospi a spp.
com p ime s uni e sais, ob e e-se ampli icação de DNA de lep ospi as pa ogénicas em 28 amos as (26%),
não endo sido ampli icado DNA nas es an es 78 amos as (74%) (Fig. 3.10). No que espei a à mos agem
do dis i o de Se úbal o am a aliadas 53 amos as, endo-se e i icado ampli icação de DNA de lep ospi as
pa ogénicas em 51% sendo as es an es 26 amos as nega i as (49%), como se obse a na (Fig. 3.11).
Nes ed-PCR com p ime s especí icos "LipL32"
nágua=159
Posi i a Nega i a
35%
(n=55)
65%
(n=104)
Posi i o
Nega i o

52
Figu a 3.10 – Rep esen ação g á ica dos esul ados das amos as p o enien es do dis i o de Lisboa que
o am a aliadas pela nes ed-PCR com p ime s especí icos “LipL32”.
Figu a 3.11 – Rep esen ação g á ica dos esul ados das amos as do Dis i o de Se úbal que o am
subme idas ao p o ocolo de nes ed-PCR com p ime s especí icos “LipL32”.
0
10
20
30
40
50
60
70
80
90
Posi i a Nega i a
Nes ed-PCR com p ime s especí icos "LipL32"
Lisboa (nágua=106)
26%
(n=28)
74%
(n=78)
Núme o de amos as de água
0
10
20
30
40
50
60
70
80
90
Posi i a Nega i a
Nes ed-PCR com p ime s especí icos "LipL32"
Se úbal (nágua=53)
51%
(n=27)
49%
(n=26)
Posi i o
Nega i o
Núme o de amos as de água
Nega i o
Posi i o
53
Quad o 4 – Resumo dos esul ados ob idos nos dois di e en es p o ocolos de nes ed-PCR pa a as amos as
de água.
3.2.5 – T a amen o es a ís ico
Foi e e uado o es e Qui-quad ado pa a de e mina a associação en e os alo es de pH egis ados e
a p esença ou ausência de espi oque as do géne o Lep ospi a, o qual não oi alidado pois os c i é ios pa a
a sua aplicação não exis iam, des a o ma ealizou-se o es e exa o de Fishe onde se ob e e um alo de
p=0,000 que indica a exis ência de associação en e as a iá eis.
O mesmo es e oi aplicado pa a de e mina a associação en e a ipologia da água e a p esença ou
ausência de Lep ospi a spp., no qual se ob e e o alo de p=0,000 como é possí el obse a na Tabela 2.
Tabela 2 – Resul ados do es e Qui-Quad ado en e a ipologia da água e a p esença ou ausência de
Lep ospi a spp..
nes ed-PCR com p ime s
uni e sais A e B
nes ed-PCR com p ime s
especí icos “LipL32”
Posi i o
Nega i o
Posi i o
Nega i o
Lisboa
106
58
28
78
Se úbal
53
110
27
26
To al
159
168
55
104
Valo
gl
Signi icância
Assin ó ica
(Bila e al)
Qui-quad ado de Pea son
371,729a
4
,000
Razão de e ossimilhança
270,822
4
,000
N de Casos Válidos
371
a. 0 células (0,0%) espe a am uma con agem meno que 5. A con agem mínima
espe ada é 5,22.
54
3.3 - Amos as de solo
3.3.1 – Coleções de Solos
Foi ambém analisado um o al de 96 amos as de solos, das quais 42 são p o enien es do dis i o de
Lisboa enquan o as es an es 54 amos as o am ob idas no dis i o de Se úbal, como ilus ado no Quad o 4.
Quad o 5 - Dis ibuição do núme o de amos as ecolhidas nos di e en es concelhos dos dois dis i os
es udados.
Legenda: “Lis” – Lisboa; “Sin” – Sin a; “Ma ” – Ma a; “V.F.X” – Vila F anca de Xi a; “T.Ved” – To es
Ved as; “Se ”- Se úbal; “Alm” – Almada; “Mon” – Mon ijo; “Alc” – Alcoche e; “G ân” – G ândola;
“A.Sal” – Alcáce do Sal; “S.Cac” – San iago do Cacém.
3.3.2 - Pa âme os ísico-químicos
À semelhança do que oi ei o pa a as amos as de água, o am ano ados os esul ados dos
pa âme os ísico-químicos dos solos, imedia amen e após se e e ua a ecolha dos mesmos, de modo a
e i a possí eis al e ações nos alo es dos espe i os pa âme os em ap eço.
A empe a u a do solo que oi egis ada a iou en e os 12,5oC e 25,8oC, endo a empe a u a do a
egis ado uma a iação en e os 13o e os 23oC.
Como é possí el e i ica na Figu a 3.12, o alo de pH oi p edominan emen e 7, nas amos as de
solo ob idas nos dis i os de Lisboa e Se úbal, com pe cen agens de 81% e 85%, espe i amen e. Na
o alidade das 96 amos as analisadas, 83% ap esen a am um alo de pH igual a 7, sendo que os es an es
17% inham alo es de pH de 6 e 8, como documen ado na Figu a 3.13.
Concelhos
Lis
Sin
Ma
V.F.X
T.Ved
Se
Alm
Mon
Alc
G ân
A.Sal
S.Cac
To al
Dis i os
Lisboa
10
10
10
9
3
42
Se úbal
9
9
2
7
6
10
11
54
To al
10
10
10
9
3
9
9
2
7
6
10
11
96
55
Figu a 3.12 – Rep esen ação g á ica do o al de amos as de solo (Nsolo=96) e sus o alo de pH egis ado de
aco do com o dis i o de p o eniência.
Figu a 3.13 – Rep esen ação g á ica da dis ibuição pe cen ual de amos as de solo de aco do com o alo
de pH, no o al de amos as (Nsolo=96).
Ao analisa o ní el de humidade do solo ecolhido de uma o ma quali a i a, de aco do com a no ação
indicada em Ma e ial e Mé odos, e i icou-se que, no dis i o de Lisboa, o ní el 2 de humidade oi o mais
p edominan e, com uma pe cen agem de 40%, seguido pelo ní el 1 (21%), ní el 3 (19%) e ní el 4 e 5 com
10% cada. No dis i o de Se úbal, o ní el 2 de humidade oi ambém o mais p edominan e (37%) seguido pelo
ní el 4 (24%), ní el 3 (22%), ní el 5 (9%) e ní el 1 com uma pe cen agem de 8% (Fig. 3.14).
10%
83%
7%
Amos agem o al
Nsolo=96
pH 6 pH 7 pH 8
n=4
n=34
n=4
n=5
n=46
n=3
6 7 8
PH
Di e ença de ph das amos as de solo nos
di e en es dis i os
Lisboa
Se úbal
pH
Núme o de amos as de solo
62
3.3.5 – T a amen o es a ís ico
Tal como e e uado pa a as amos as de água, u ilizou-se o es e Qui-quad ado pa a de e mina a
associação en e os alo es de pH egis ados e a p esença ou ausência de espi oque as do géne o Lep ospi a,
o qual não pode se alidado dado que os c i é ios pa a a sua aplicação não e am adequados, pelo que se
aplicou o es e exa o de Fishe , a a és do qual se ob e e um alo de p=0,000 indica i o da exis ência de
uma associação es a ís ica en e as a iá eis em es udo.
O mesmo es e (Fishe ) oi aplicado pa a de e mina se exis ia associação en e o ní el de humidade
do solo e a p esença ou ausência de DNA lep ospí ico endo sido ob ido ambém um alo de p=0,000,
demons a i o da exis ência da e e ida associação.
3.4 – Amos as biológicas de oedo es
3.4.1 – Cap u a de oedo es
Pa a es e es udo oi possí el cap u a 18 espécimes de oedo es, dos quais no e o am cap u ados
no dis i o de Lisboa e os es an es no dis i o de Se úbal (Quad o 5).
Quad o 7 – Dis ibuição do núme o de espécimes ( oedo es) cap u ados nos di e en es concelhos dos dois
dis i os es udados (Lisboa e Se úbal)
Legenda: “Lis” – Lisboa; “Sin” – Sin a; “Ma ” – Ma a; “T.Ved” – To es Ved as; “Se ”- Se úbal; “Alm” –
Almada; “Mon” – Mon ijo; “Alc” – Alcoche e; “A.Sal” – Alcáce do Sal; “S.Cac” – San iago do
Cacém.
Dos 18 espécimes, após iden i icação mo omé ica e i icou-se que 11 pe ence em à espécie Mus
musculus, dos quais seis o am cap u ados no dis i o de Lisboa e cinco no de Se úbal; os es an es se e o am
iden i icados como ep esen an es da espécie Ra us no egicus, dos quais ês o am cap u ados no dis i o
de Lisboa e qua o no de Se úbal (Fig. 3.24).
Concelhos
Lis
Sin
Ma
T.Ved
Se
Alm
Mon
Alc
A.Sal
S.Cac
To al
Dis i os
Lisboa
2
3
4
0
9
Se úbal
0
2
4
2
0
1
9
To al
2
3
4
0
0
2
4
2
0
1
18

63
Figu a 3.24 – Rep esen ação g á ica da dis ibuição dos espécimes ( oedo es) cap u ados po espécie e po
dis i o.
Como e e ido an e io men e no pon o 2.6.1 de Ma e ial e Mé odos, os locais pa a coloca as
a madilhas de cap u a dos oedo es exigiam que se espei assem alguns pad ões de localização. Assim, após
se e e i a a cap u a de cada espécime, oi semp e egis ado o ipo de pe i e ia do local da cap u a (Fig. 3.25).
Figu a 3.25 – Rep esen ação g á ica da dis ibuição de espécimes ( oedo es) cap u ados po local de cap u a.
0
1
2
3
4
5
6
7
Mus musculus Ra us no egicus
Espécies de oedo es cap u ados nos di e en es dis i os (N=18)
Lisboa Se úbal
Núme o de espécimes cap u ados
n=6
n=5
n=3
n=4
0
1
2
3
4
5
6
7
8
A bus o Saída de esgo o Cana ial Caixo e do lixo Lago
Pe i e ias dos locais de cap u a dos oedo es
(N oedo es=18)
n=4
n=1
n=7
n=5
n=1
Núme o de espécimes cap u ados
64
3.4.2 - Pa âme os mo ológicos dos oedo es
Após a cap u a e eu anásia dos espécimes cap u ados, oi ealizada a sexagem e egis o de cada um
dos mesmos, sendo que dos 18 oedo es cap u ados, 16 (89%) e am machos e duas (11%) êmeas, como é
possí el obse a na dis ibuição ep esen ada na Fig. 3.26.
Figu a 3.26 – Rep esen ação g á ica da dis ibuição dos oedo es cap u ados po sexo.
Na al u a da ecolha das amos as biológicas, o am egis ados á ios pa âme os mo ológicos dos
oedo es, uma das ca ac e ís icas egis adas oi a colo ação do pelo, endo odos ap esen ado uma colo ação
cinzen o-acas anhada. O peso dos oedo es da espécie Mus musculus si uou-se en e 9g e 16g, endo o peso
dos oedo es da espécie Ra us no egicus oscilado en e 143g e 357g. Ou as ca ac e ís icas mo ológicas
como o comp imen o do co po (incluindo a cauda), cauda, o elha, pa a pos e io esque da, en e ou as,
o am egis adas.
3.4.3 - Amos as biológicas ecolhidas
Após a eu anásia de cada espécime, p ocedeu-se à ecolha das amos as biológicas necessá ias pa a
es e es udo. No o al, o am ecolhidas 139 amos as biológicas de ó gãos ( im, pulmão, ígado e baço) bem
como luidos o gânicos (sangue e u ina). Do o al de amos as, 127 o am analisadas no âmbi o molecula ,
isando a ampli icação de DNA lep ospí ico, e no e (9) o am p ocessadas pa a cul u a em meio sele i o
EMJH (Quad o 3), pa a possí el isolamen o de Lep ospi a spp..
89%
(n=16)
11%
(n=2)
Sexagem dos espécimes cap u ados
(Nsolos=18)
Machos Fêmeas
65
Quad o 8 – Dis ibuição das amos as biológicas ob idas dos oedo es cap u ados, po abo dagem
labo a o ial e ó gão/ ecido p ocessado
3.4.4 - Ampli icação de DNA lep ospí ico com p ime s uni e sais (A e B)
Tal como e e ido nos pon os 2.3 e 3.3 des a mesma Secção (Resul ados) após a ex ação de DNA,
127 amos as o am a aliadas quan o à p esença de DNA de espi oque as do géne o Lep ospi a, pelo ecu so
ao p o ocolo de nes ed-PCR com p ime s uni e sais (A e B); após a ele o o ese o am obse ados e
egis ados os espe i os esul ados (Fig. 3.27).
Figu a 3.27 - Obse ação de um gel de ele o o ese de amos as biológicas após ampli icação po nes ed-PCR
com p ime s uni e sais (A e B). (M – Ma cado molecula ; 1 a 12 – amos as biológicas; P –
con olo posi i o; N1 a N4- con olo nega i o do PCR)
Amos as
biológicas
Nº de amos as
ecolhidas
( oedo es)
Nº de amos as
p ocessadas po
écnicas
molecula es
Nº de amos as
p ocessadas
pa a Cul u a
(EMJH)
Sangue
18
18
0
U ina
13
13
0
Baço
18
17
0
Rins
36
26
9
Fígado
18
18
0
Pulmões
36
15
0
To al
139
127
9
M 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 P N1 N2 N3 N4
1000pb
289pb
100pb
66
Das amos as analisadas, 44% ap esen a am ampli icação de DNA lep ospí ico, enquan o que em 71
amos as não se obse ou ampli icação (56%) como demons ado na Fig. 3.28.
Figu a 3.28 – Rep esen ação g á ica dos esul ados ob idos nas amos as biológicas p o enien es dos
oedo es, que o am p ocessadas pela nes ed-PCR com p ime s uni e sais (A e B).
Das 60 amos as analisadas do dis i o de Lisboa, e i icou-se ampli icação de DNA de Leps ospi a
spp., com p ime s uni e sais (A e B) em 38 das mesmas, o que co esponde a 63%. Quan o às amos as
p o enien es de oedo es cap u ados no dis i o de Se úbal (n=67) e i icou-se ampli icação em 27%, endo
as es an es amos as mos ado ausência de ampli icação pa a espi oque as do géne o Lep ospi a (Fig. 3.29).
Figu a 3.29 – Rep esen ação g á ica dos esul ados das amos as biológicas ( oedo es) p o enien es dos
dis i os (Lisboa e Se úbal) p ocessadas pela nes ed-PCR com p ime s uni e sais (A e B).
Nes ed-PCR com p ime s uni e sais (A e B)
Nam biol=127
Posi i a Nega i a
Posi i o
Nega i o
56%
n=71
44%
n=56
0
10
20
30
40
50
60
Lisboa Se úbal
Nes ed-PCR com p ime s uni e sais (A e B)
Nam biol=127
Posi i a Nega i a
Posi i o
Nega i o
Núme o de amos as biológicas
63%
n=38
37%
n=22
27%
n=18
73%
n=49
67
As amos as ob idas dos ó gãos selecionados de cada oedo e a aliadas pelo mesmo p o ocolo de
nes ed-PCR pa a de eção de DNA de espi oque as do Géne o Lep ospi a pe mi iu cons ui o g á ico (Fig.
3.30) com os espe i os esul ados.
Figu a 3.30 - Rep esen ação g á ica dos esul ados ob idos pela nes ed-PCR com p ime s uni e sais (A e B)
nas amos as ob idas dos di e en es ó gãos dos oedo es.
3.4.5 - Ampli icação de DNA lep ospí ico com p ime s especí icos “LipL32”
À semelhança do que oi ei o nos pon os 2.4 e 3.4 des a Secção, o am u ilizadas as amos as em
que hou e p é ia ampli icação de DNA lep ospí ico (N=56) e p ocessadas com um ou o p o ocolo de nes ed-
PCR ago a com p ime s especí icos “LipL32”, cujos esul ados se documen am na Fig. 3.31.
Figu a 3.31 - Obse ação de um gel de ele o o ese de amos as biológicas, após ampli icação po nes ed-
PCR com p ime s especí icos “LipL32”. (M – Ma cado molecula ; 1 a 15 – amos as biológicas;
P – con olo posi i o; N – con olo nega i o do PCR).
M 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14 15 P N1 N2 N3 N4
1000pb
183pb
100pb
n=0
n=6
n=5
n=6
n=11 n=12
n=6
n=10
n=18
n=7
n=12
n=5n=4
n=6
n=11
n=8
0
2
4
6
8
10
12
14
16
18
20
Sangue U ina Baço Rim
esque do
Rim
di ei o
Fígado Pulmão
esque do
Pulmão
di ei o
Nes ed-PCR com p ime s uni e sais (A e B)
Nam biol=127
Posi i a Nega i a
Núme o de amos as biológicas
Posi i o
Nega i o

68
Analisados os esul ados e i icou-se que das 56 amos as analisadas, em 44 das mesmas, os p ime s
especí icos pa a de eção de DNA de espécies pa ogénicas de Lep ospi a mos a am de o ma inequí oca
(79%) o ca ác e pa ogénico das e e idas amos as (Fig. 3.32).
Figu a 3.32 – Rep esen ação g á ica dos esul ados ob idos nas amos as p ocessadas pela nes ed-PCR com
p ime s especí icos “LipL32”.
Quan o à dis ibuição po dis i o, os esul ados pe mi i am obse a que do o al de 38 amos as
dos oedo es cap u ados e a aliadas pela e e ida écnica (com p ime s especí icos), pa a o dis i o de Lisboa
e i icou-se a ampli icação de DNA de Lep ospi a spp., em 84%, não endo sido ampli icado DNA de espécies
pa ogénicas nas es an es seis amos as (16%), (Fig. 3.33). No que espei a ao ma e ial biológico o iundo de
oedo es do dis i o de Se úbal e i icou-se ampli icação de DNA de lep ospi as de espécies pa ogénicas em
67% das amos as como se documen a na Fig. 3.34.
Nes ed-PCR com p ime s especí icos "LipL32"
n=56
Posi i a Nega i a
21%
n=12
79%
n=44
Posi i o
Nega i o
0
5
10
15
20
25
30
35
Posi i a Nega i a
Nes ed-PCR com p ime s especí icos "LipL32"
Amos as ( oedo es), Dis i o de Lisboa (n=38)
84%
n=32
16%
n=6
Núme o de amos as biológicas
Posi i o
Nega i o
69
Figu a 3.33 – Rep esen ação g á ica dos esul ados do ma e ial biológico ( oedo es) do dis i o de Lisboa que
o am subme idas ao p o ocolo de nes ed-PCR com p ime s especí icos “LipL32”.
Figu a 3.34 - Rep esen ação g á ica dos esul ados do ma e ial biológico ( oedo es) do dis i o de Se úbal
que o am subme idas ao p o ocolo de nes ed-PCR com p ime s especí icos “LipL32”
Quad o 9 - Resumo dos esul ados ob idos nos di e en es nes ed-PCR pa a as amos as biológicas
p o enien es dos oedo es.
3.4.6 – Cul u a em meio de sele i o EMJH
Das amos as biológicas ecolhidas, como já e e ido, no e o am u ilizadas pa a cul u a em meio
sele i o EMJH semissólido. A é à da a em que se conclui a edação do p esen e manusc i o (ainda) não se
e i icou c escimen o bac e iano em nenhuma das cul u as.
3.5 - Sequenciação das amos as de água, solo e de amos as biológicas ( oedo es)
Após a eceção dos esul ados da sequenciação, es es o am analisados indi idualmen e no p og ama
BLAST, sendo possí el obse a os esul ados ob idos no ANEXO II.
nes ed-PCR com p ime s
uni e sais A e B (n=127)
nes ed-PCR com p ime s
especí icos “LipL32” (n=56)
Posi i o
Nega i o
Posi i o
Nega i o
Lisboa
38
22
32
6
Se úbal
18
49
12
6
To al
56
71
44
12
0
5
10
15
20
25
30
35
Posi i a Nega i a
Nes ed-PCR com p ime s especí icos "LipL32"
Amos as ( oedo es), Dis i o de Se úbal (n=18)
Núme o de amos as biológicas
33%
n=6
67%
n=12
Nega i o
Posi i o
70
Foi ambém elabo ada uma á o e ilogené ica, a a és do p og ama CLC Genomics Wo kbench 12, com
os esul ados da sequenciação, de modo a en a -se comp eende a e olução e co elação das amos as
ecolhidas (ambien ais e de oedo es) com as sequências disponí eis no GenBank (Fig. 3.35).
71
Figu a 3.35 – Á o e ilogené ica, ealizada no p og ama CLC Genomics Wo kbench 12, baseada no alinhamen o do segmen o do gene lipL32.
(Filogenia Maximum-likelihood; Modelo: Gene al Time Re e sible; Layou : Cladog ama). A nume ação p esen e na igu a ep esen a o
g au de pa en esco en e os di e en es axas
Sequências das amos as ecolhidas
Sequências de e e ência (GenBank)
Amos as de água
Amos as de solo
Amos as biológicas de oedo es
Sequências de e e ência (GenBack)
Sequencia de amos as ecolhidas
78
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84
VI. ANEXOS
85
ANEXO I
Au o ização É ica (CEFCM) e Legal (ICNF) pa a a ealização des e es udo.
Campo dos Má i es da Pá ia, 130 | 1169-056 Lisboa | Po ugal | T. +351 218 803 000 – Ex . 20447 E-mail ce[email p o ec ed]nl.p
Decisão inal sob e o p ojec o "De ecção e iden i icação de bac é ias do
géne o Lep ospi a em amos as ambien ais e em pequenos mamí e os de
dois dis i os de Po ugal a a és de abo dagens molecula es"
A Comissão de É ica da NMS|FCM-UNL (CEFCM) decidiu, po unanimidade,
ap o a o p ojec o de in es igação in i ulado "De ecção e iden i icação de
bac é ias do géne o Lep ospi a em amos as ambien ais e em pequenos
mamí e os de dois dis i os de Po ugal a a és de abo dagens molecula es"
(nº07/2019/CEFCM), subme ido po Dou o a Ma ia Luiza Viei a.
Lisboa, 26 de Ma ço de 2019
O P esiden e da Comissão de É ica,
(P o . Dou o Diogo Pais)
TO WHOM IT MAY CONCERN
The E hics Resea ch Commi ee NMS|FCM-UNL (CEFCM) has unanimously
app o ed he P ojec en i led "De ecção e iden i icação de bac é ias do géne o
Lep ospi a em amos as ambien ais e em pequenos mamí e os de dois dis i os
de Po ugal a a és de abo dagens molecula es" (n .07/2019/CEFCM),
submi ed by Ma ia Luiza Viei a MSc/ PhD.
Lisbon, Ma ch 26 h, 2019
The Chai man o he E hics Resea ch Commi ee,
(Diogo Pais, MD, PhD)
92
ANEXO III
Exempla da abela, u ilizada em abalho de campo, pa a a ano ação das ca ac e ís icas no
momen o da colhei a das amos as de água

93
Exempla da abela, u ilizada em abalho de campo, pa a a ano ação das ca ac e ís icas no momen o da colhei a das amos as de água
Nº de
amos a
Da a da
ecolha
Ho a da
ecolha
Dis i o/Concelho/F eguesia
Coo d.
Geog á icas
O igem da
amos a
( io, ibei o,
on e, lago,
e c)
Tempe a u a
(a e água)
Humidade
do a
Condições
clima é icas
(chu a, sol,
e c)
Ni i os
pH
Tu bidez/
Co
Sedimen os
No as