Estudo de infeção congénita por HCMV Rastreio Universal por PCR na saliva
Abstract
RESUMO: O vírus citomegálico humano (HCMV) é o principal agente de infeção congénita no mundo. Em Portugal estima-se que a prevalência desta infeção seja 1,05%, traduzindo-se em ≈900 recém-nascidos infetados por ano. A importância do rastreio tem vindo a ser debatida, pois 10% a 15% destes recém-nascidos não apresentam sequelas ao nascimento, mas estas poderão surgir tardiamente. A não implementação do plano de rastreio deve-se sobretudo ao custo associado, mas uma metodologia de pools de urina desenvolvida por uma equipa portuguesa demonstrou ser promissora para a sua realização, reduzindo significativamente este custo. No entanto, a colheita de urina revela-se pouco prática para adotar em larga escala. É conhecido que o vírus é excretado em quantidades similares na saliva e sendo a sua colheita consideravelmente mais simples, foi objetivo deste estudo verificar a possibilidade da aplicação de pools de saliva num programa de rastreio de infeção congénita por HCMV em recém-nascidos de dois Hospitais portugueses. Pretendeu-se ainda estimar a prevalência da infeção e o custo associado a este método de rastreio. O rastreio baseou-se na utilização de pools de 10 amostras de saliva para a deteção de DNA viral por PCR em tempo real. O algoritmo definido implicou que as amostras de cada pool positiva fossem posteriormente testadas individualmente e, a cada amostra positiva, o seu resultado fosse confirmado na amostra de urina colhida entre as 2 a 3 semanas de vida da criança. Testaram-se igualmente pools de 20 amostras de saliva. Foram rastreados 1492 recém-nascidos em 150 pools tendo-se verificado 14 resultados positivos, mas apenas 10 obtiveram infeção congénita confirmada. O método demonstrou ser exequível e de baixo custo para a implementação de um rastreio universal. A prevalência da infeção congénita por HCMV nos dois Hospitais em estudo foi de 0,67%.
Full text
Estudo de infeção congénita por HCMV Rastreio Universal por PCR na saliva Cláudia da Cunha Fernandes Dissertação para obtenção do Grau de Mestre em Microbiologia Médica Outubro de 2019
Estudo de infeção congénita por HCMV Rastreio Universal por PCR na saliva Cláudia da Cunha Fernandes Dissertação para obtenção do Grau de Mestre em Microbiologia Médica Orientadores: Professor Doutor Paulo Paixão (NMS|FCM) Doutora Maria de Jesus Chasqueira (NMS|FCM) Unidade de Infeção: etiologia, patogénese e bases terapêuticas Nova Medical School |Faculdade de Ciências Médicas Outubro de 2019
«I hear and I forget. I see and I remember. I do and I understand.» Confucius
i Elementos bibliográficos resultantes da dissertação Evaluation of saliva pools method for detection of congenital Human Cytomegalovirus infection. Julieta Silvaa, Cláudia Fernandesa, Augusta Marquesa, Ana Teresa Mariab, Cátia Correiab, Madalena Lopo Tunab, Maria de Jesus Chasqueiraa, Paulo Paixãoa. a – Centro de Estudos de Doenças Crónicas (CEDOC), Faculdade de Ciências Médicas|NOVA Medical School Lisboa, Portugal b – Unidade de Neonatologia do Serviço de Pediatria do Hospital de S. Francisco Xavier – CHLO Lisboa, Portugal.
ii Agradecimentos Ao Professor Doutor Paulo Paixão, pela oportunidade e confiança em mim depositada para a realização desta dissertação. Pela orientação e disponibilidade sempre que necessária para a transmissão de conhecimentos e esclarecimento de dúvidas. Á Doutora Maria de Jesus Chasqueira, pela entrega a esta dissertação e sua co-orientação. Pela dedicação, horas de partilha de conhecimentos, conselhos e recomendações para que esta dissertação se torna-se na melhor possível. Ao Hospital CUF Descobertas e ao Hospital Vila Franca de Xira pela participação, cooperação e apoio prestado no decorrer deste estudo. Ao Centro de Medicina Laboratorial Germano de Sousa por gentilmente codificar as amostras e disponibilizar o seu transporte desde os Hospitais participantes até à Faculdade de Ciências Médicas. Á Augusta, por todo o empenho e apoio demonstrados. Por todo o auxílio no trabalho prático desenvolvido e partilha de conhecimentos da área laboratorial e, em especial, do HCMV. Á Lúcia, pela boa disposição diária e por se demonstrar sempre disponível para ajudar. Á Neuza, companheira de laboratório, transportes públicos e de pausas para ouvir música. Por toda a ajuda informática (e não só) no decorrer desta dissertação e disponibilidade para ler a mesma, vezes sem fim. Á Julieta, companheira do HCMV, pela cooperação e entreajuda. Á Dra. Cátia Alves, por me mostrar a importância do acreditar. Pelo seu apoio e palavras sábias, importantes ferramentas que me permitiram chegar até aqui e alcançar este desejado objetivo. O meu simples agradecimento nunca será suficiente. Á Tânia, minha companheira daquilo que foi a grande aventura do ensino superior e daquilo que será o meu futuro daqui para a frente. Por estes 6 anos de amizade, entreajuda e partilha. Até sermos velhinhas. Á minha família. Em especial aos meus pais, o mais profundo agradecimento, por terem acreditado sempre nas minhas capacidades e escolhas. Por todo o esforço por mim feito e apoio incondicional durante o meu percurso académico. Sem vocês não teria sido possível.
iii Resumo O vírus citomegálico humano (HCMV) é o principal agente de infeção congénita no mundo. Em Portugal estima-se que a prevalência desta infeção seja 1,05%, traduzindo-se em ≈900 recém-nascidos infetados por ano. A importância do rastreio tem vindo a ser debatida, pois 10% a 15% destes recém-nascidos não apresentam sequelas ao nascimento, mas estas poderão surgir tardiamente. A não implementação do plano de rastreio deve-se sobretudo ao custo associado, mas uma metodologia de pools de urina desenvolvida por uma equipa portuguesa demonstrou ser promissora para a sua realização, reduzindo significativamente este custo. No entanto, a colheita de urina revela-se pouco prática para adotar em larga escala. É conhecido que o vírus é excretado em quantidades similares na saliva e sendo a sua colheita consideravelmente mais simples, foi objetivo deste estudo verificar a possibilidade da aplicação de pools de saliva num programa de rastreio de infeção congénita por HCMV em recém-nascidos de dois Hospitais portugueses. Pretendeu-se ainda estimar a prevalência da infeção e o custo associado a este método de rastreio. O rastreio baseou-se na utilização de pools de 10 amostras de saliva para a deteção de DNA viral por PCR em tempo real. O algoritmo definido implicou que as amostras de cada pool positiva fossem posteriormente testadas individualmente e, a cada amostra positiva, o seu resultado fosse confirmado na amostra de urina colhida entre as 2 a 3 semanas de vida da criança. Testaram-se igualmente pools de 20 amostras de saliva. Foram rastreados 1492 recém-nascidos em 150 pools tendo-se verificado 14 resultados positivos, mas apenas 10 obtiveram infeção congénita confirmada. O método demonstrou ser exequível e de baixo custo para a implementação de um rastreio universal. A prevalência da infeção congénita por HCMV nos dois Hospitais em estudo foi de 0,67%. Palavras-chave: HCMV; infeção congénita; rastreio; PCR em tempo real; saliva
iv Abstract Human cytomegalovirus (HCMV) is the leading congenital infection agent in the world. In Portugal, it is estimated that the prevalence of this infection is 1.05%, resulting in ≈900 infected newborns per year. The importance of screening for this infection has been cause for debate, as 10% to 15% of these newborns do not show sequelae at birth, but these may appear later in life. The lack of screening implementation is mainly due to the associated monetary cost but a urine pool methodology developed by a portuguese team proved to be promising, while significantly reducing the cost. However, urine collection proves to be impractical for large-scale application. It is known that the virus is excreted in similar amounts in saliva and its collection is considerably simpler. It was the aim of this study to verify the possibility of applying saliva pools in a screening program for congenital HCMV infection in newborns from two portuguese hospitals. It was also intended to estimate the prevalence of infection and the cost associated with this screening method.The screening was based on the use of pools of 10 saliva samples for detection of viral DNA by real time PCR. The defined algorithm implied that the samples from each positive pool were subsequently tested individually and, for each positive sample, the result was confirmed in the urine sample collected between the 2 to 3 weeks of the newborn's life. Pools of 20 saliva samples were also tested. 1492 newborns were screened in 150 pools with 14 positive results, but only 10 had confirmed congenital infection. The prevalence of congenital HCMV infection in both hospitals was 0.67%. The method has been shown to be feasible and inexpensive for the implementation of universal screening. Key-words: HCMV; congenital infection; screening; real time PCR; saliva
v Índice Elementos bibliográficos resultantes da dissertação ................................................................................. i Agradecimentos ..................................................................................................................................... ii Resumo ................................................................................................................................................ iii Abstract ................................................................................................................................................ iv Índice de Figuras .................................................................................................................................. vii Índice de Tabelas ................................................................................................................................ viii Abreviaturas ......................................................................................................................................... ix I Introdução ...................................................................................................................................... 1 Breve introdução histórica ....................................................................................................... 1 Taxonomia .............................................................................................................................. 2 Estrutura do vírus .................................................................................................................... 2 Replicação viral do HCMV ........................................................................................................ 3 Infeção congénita por HCMV ................................................................................................... 4 1.5.1 Epidemiologia ............................................................................................................................ 4 1.5.2 Caracterização da infeção .......................................................................................................... 5 1.5.3 Manifestações clinicas ............................................................................................................... 6 1.5.4 Prevenção da infeção ................................................................................................................ 8 1.5.5 Métodos de diagnóstico .......................................................................................................... 11 1.5.6 Rastreio .................................................................................................................................... 15 1.5.7 Tratamento .............................................................................................................................. 18 Técnica de PCR em tempo real ............................................................................................... 20 Objetivos .............................................................................................................................. 23 II Materiais e métodos ..................................................................................................................... 24 2.1 População em estudo .................................................................................................................. 24 2.2 Amostras .................................................................................................................................... 24 2.3 Procedimento experimental ........................................................................................................ 24 2.3.1 Processamento das amostras ......................................................................................................... 24
vi 2.3.2 Extração de DNA ............................................................................................................................. 25 2.3.3 Técnica de PCR em tempo real ....................................................................................................... 26 2.3.4 Quantificação da carga viral ........................................................................................................... 28 2.4 Estudo da viabilidade económica................................................................................................. 29 2.5 Determinação da prevalência da infeção congénita por HCMV ..................................................... 29 III Resultados e Discussão ................................................................................................................. 30 3.1 Rastreio da infeção congénita recorrendo a pools de saliva .......................................................... 30 3.2 Análise das cargas virais de HCMV ............................................................................................... 35 3.3 Estudo da viabilidade económica................................................................................................. 37 3.4 Prevalência da infeção congénita por HCMV ................................................................................ 38 IV Conclusões ................................................................................................................................... 39 V Referências Bibliográficas ............................................................................................................. 40 VI Anexos ......................................................................................................................................... 56
4 O HCMV vai invadir as células do hospedeiro de modo a replicar o seu genoma, produzindo novos vírus. A replicação do vírus inicia-se quando as glicoproteínas virais, nomeadamente a gB, interagem com os recetores de superfície da célula-alvo, ocorrendo a fusão do invólucro com a membrana plasmática. Ocorre então a libertação das proteínas da nucleocápside e do tegumento no citoplasma celular, iniciandose o processo de infeção (Tomtishen, 2012). Posteriormente, o genoma viral é libertado no núcleo da célula onde será replicado, transcrito e traduzido em 3 fases, sendo que em cada fase do ciclo replicativo do vírus as proteínas produzidas estimulam o início da fase seguinte. Na fase imediatamente precoce (do inglês immediatly-early – IE) ocorre a produção de antigénios ou proteínas não estruturais essenciais à regulação da transcrição. Estas são designadas por proteínas imediatamente precoces ou α, originadas por genes com a mesma designação que irão desencadear a expressão dos genes necessários às fases seguintes. De seguida, inicia-se a fase precoce (do inglês early – E) onde são transcritos os genes precoces ou β, que irão dar origem a antigénios ou proteínas com o mesmo nome. Estes serão responsáveis pela origem de novos vírus, pois produzem enzimas essenciais ao ciclo de replicação do genoma viral, como por exemplo a DNA polimerase. Por último ocorre a fase tardia (do inglês late – L), fase na qual são sintetizadas as proteínas estruturais que irão formar a cápside e o invólucro viral, podendo também ser denominadas de proteínas tardias ou . Estas proteínas possuem um papel importante na montagem das partículas virais e na sua libertação (Murray, 2005; Sinclair et al, 2006; Kalejta, 2008). Tal como vários outros membros da família Herpesvirus, o HCMV possui um mecanismo de manutenção de latência onde não ocorre a produção de viriões infeciosos, podendo o estado latente prolongar-se durante toda a vida do hospedeiro. No entanto, quando o hospedeiro sofre uma imunosupressão por exemplo através da transplantação, infeção pelo Vírus da Imunodeficiência Humana (HIV) ou por um estímulo associado a processos inflamatórios, o vírus pode reativar. O mecanismo pelo qual o processo de latência ocorre ainda é desconhecido, mas a reativação do HCMV está relacionada com a expressão dos genes virais imediatamente precoces (Sinclair et al, 2006; Jain et al, 2011). Infeção congénita por HCMV 1.5.1 Epidemiologia O HCMV é um agente de infeção comum na população em geral e prevalente mundialmente (Taylor, 2003). A taxa de seropositividade na população varia de acordo com a idade materna, etnia, condições socioeconómicas, nível educacional entre outros fatores (Ross et al, 2005; Colugnati et al, 2007; Cannon et al, 2010; Tavares et al, 2011).
5 Em 2010, os autores de um artigo de revisão concluíram que a seroprevalência em grupos “nãocaucasianos” era 20-30% superior à dos grupos caucasianos e que, entre as pessoas de menor estatuto socioeconómico, a seroprevalência seria cerca de 10-30% superior (Cannon et al, 2010). Um estudo publicado em 2015 veio confirmar estes factos, demonstrando que os anticorpos específicos para o HCMV foram encontrados em quantidades superiores nos grupos socioeconómicos menos favorecidos, tanto de países desenvolvidos como em desenvolvimento, tendo também sido verificado um aumento proporcional dos anticorpos em relação à idade (Sanousi et al, 2016). Como regra geral, os grupos socioeconómicos mais baixos têm maior incidência de exposição ao HCMV e os países com recursos limitados apresentam altos níveis de seroprevalência materna, com percentagens de seropositividade para imunoglobulinas da classe G (IgG) a variar entre 84%-100%, sendo a aquisição maioritariamente no início da vida (Lanzieri, 2014). Em Portugal o 2º Inquérito Serológico Nacional estabeleceu, pela primeira vez, a prevalência de indivíduos com anticorpos específicos para o HCMV. Os resultados deste inquérito revelaram que a infeção é altamente prevalente na população portuguesa estudada, atingindo 77% de seroprevalência, afirmando ainda que a infeção ocorre sobretudo nos primeiros anos de vida. Entre as mulheres portuguesas em idade reprodutiva foram demonstradas percentagens de seropositividade de 75,5% e 81,5% para as faixas etárias entre os 20-29 anos e 30-44 anos, respetivamente (Lopo et al, 2011). O HCMV é o principal agente de infeção congénita mundialmente, com uma incidência a variar entre 0,2 e 2% (Stagno et al, 1982; Fowler et al, 1992; Dollard et al, 2007). A infeção congénita por HCMV possui um carácter clinicamente importante na saúde infantil, sendo as suas sequelas a longo prazo tão ou mais comuns em relação a condições clinicas mais conhecidas como Síndrome de Down, Síndrome do álcool fetal, espinha bífida entre outras (Cannon et al, 2005). Em Portugal, um estudo publicado em 2009 estabeleceu uma prevalência de 1,05% relativamente à infeção congénita (Paixão et al, 2009). Tendo em conta os cerca de 86827 nascimentos no ano de 2018, esta percentagem traduz-se em cerca de 900 crianças nascidas em Portugal com infeção congénita por HCMV. 1.5.2 Caracterização da infeção A infeção por HCMV é endémica, sucedendo durante todo o ano e sem variações sazonais, e a sua transmissão é inter-humana (Ross et al, 2005; Malm et al, 2007). O vírus penetra nas mucosas podendo transmitir-se por contacto direto ou indireto com urina, saliva, secreções orofaríngeas, secreções endocervicais, esperma, leite materno, lágrimas, produtos sanguíneos ou órgãos transplantados.
6 As primeiras células a serem infetadas serão os leucócitos e as células endoteliais e, posteriormente, a propagação do vírus acontecerá por via hematogénica (Tavares et al, 2011; Mocarski et al, 2013). A infeção primária materna é a principal responsável pela transmissão congénita deste vírus. A mulher grávida pode sofrer infeção primária durante a gravidez mas, ao contrário da maioria das infeções congénitas virais, a infeção congénita por HCMV pode ocorrer também em mulheres com imunidade préconcecional ainda que numa percentagem significativamente menor (Fowler et al, 2003). Nesse caso, a infeção é denominada por secundária ou recorrente, podendo ocorrer por reativação ou reinfeção por uma nova estirpe viral (Revello et al, 2002; Malm et al, 2007; Mussi-Pinhata et al, 2009). O termo “transmissão vertical” é utilizado para indicar a transmissão do vírus da mãe para o feto, tendo lugar na fase virémica da mulher grávida e ocorrendo por via hematogénica transplacentar (Bhide et al, 2008; Tavares et al, 2011). O mesmo termo é ainda aplicado aquando da transmissão do vírus da mãe ao recém-nascido, ocorrendo durante a passagem no canal de parto devido ao contacto com as secreções cervicais, ou após, através do aleitamento, atribuindo-se nesta altura a designação de infeção perinatal (Bhide et al, 2008; Joseph et al, 2018). A infeção congénita é caracterizada pela ocorrência de infeção durante a gravidez, em que o vírus passa a barreira placentária provocando posterior infeção no feto, que se encontra imunologicamente imaturo. É importante denotar que a infeção placentar não se traduz obrigatoriamente em infeção fetal: a taxa de transmissão vertical varia entre 30-50% relativamente às infeções primárias e 0,1-3% para as infeções recorrentes (Benoist et al, 2008; Tavares et al, 2011). Esta taxa relaciona-se ainda com a idade gestacional: 30% a 40% durante o primeiro trimestre, aumentando para cerca de 75% no terceiro trimestre de gravidez (Joseph et al, 2018). No entanto, as consequências da infeção serão mais severas quando esta ocorre nas primeiras 20 semanas de gestação. Cerca de 20-30% dos fetos infetados na primeira metade da gestação apresentam sequelas graves, sobretudo neurológicas (Pass et al, 2006). Contudo, apesar da maior probabilidade de infeção no final da gravidez, a maioria das crianças infetadas neste período apresenta-se assintomática ao nascimento (Coonrod et al, 2008). 1.5.3 Manifestações clinicas Mais de 90% das infeções pelo vírus citomegálico humano em indivíduos adultos imunocompetentes é assintomática. No entanto, esta infeção é uma causa significativa de morbilidade e mortalidade em indivíduos imunocomprometidos, mulheres grávidas, recém-nascidos e crianças pré-termo (Lanari et al, 2006).
7 1.5.3.1 Manifestações clinicas na mulher grávida Na grávida, a manifestação de sintomas parece ter uma prevalência superior em mulheres com infeção primária, comparativamente com a infeção recorrente. Alguns estudos demonstram que 5% das mulheres com infeção primária apresentaram sintomas não específicos, consistentes com síndrome mononucleoselike, tais como febre (presente em 42,1% das infeções primárias e 17,1% das recorrentes), astenia (31,4 e 11,4%), mialgias (21,5 e 6,7%), rino-faringo-traqueo-bronquite (42,1 e 29,5%) e síndrome gripal definida pela co-existência de febre e pelo menos um dos sinais previamente citados (24,5 e 9,5%), linfocitose superior ou igual a 40% (39,2 e 5,7%) e aumento das transaminases (35,3 e 3,9%) (Nigro et al, 2003; Malm et al 2007; Naing et al, 2016). 1.5.3.2 Manifestações clinicas no feto e no recém-nascido A infeção congénita pelo vírus citomegálico humano é a principal causa de perda auditiva sensorial não hereditária (do inglês sensorineural hearing loss – SNHL) e atraso do desenvolvimento neurológico em crianças (Dollard et al, 2007; Lim et al, 2017). A deteção de anomalias no feto pode ser realizada através de ecografia, onde poderá ser visível ventriculomegália cerebral, calcificações cerebrais, microcefalia, rins hiperecogénicos, intestino hiperecogénico, hepatomegalia, ascite, cardiomegalia, hidrópsia fetal e restrição do crescimento fetal (Picone, 2014). Entre 85 a 90% dos recém-nascidos com infeção congénita confirmada laboratorialmente serão assintomáticos à nascença ou apresentarão sintomas inespecíficos, não sendo diagnosticados. No entanto, 10 a 15% destes recém-nascidos assintomáticos poderão vir a desenvolver sequelas tardias até aos 5 anos de idade (Zuylen et al, 2014). Algumas destas sequelas são: surdez neurosensorial, diminuição da acuidade visual e alterações neurológicas progressivas (Mocarski et al, 2013). A surdez neurossensorial é a sequela mais frequente, sendo que 7 a 15% dos recém-nascidos assintomáticos poderão vir a desenvolver esta anomalia (Fowler et al, 1997; Dahle et al, 2000; Naing et al, 2016). Por outro lado, cerca de 10 a 15% dos recém-nascidos congenitamente infetados pelo HCMV serão sintomáticos. As manifestações clinicas usuais incluem baixo peso, icterícia, petéquias, hepatoesplenomegália, trombocitopénia e alterações neurológicas tais como microcefalia e calcificações intracranianas. Com menor frequência poderá surgir microftalmia, anomalias cardíacas, miocardite, hipotonia com sonolência, dificuldades na sucção, espasticidade, colite, hemiparesia, ou convulsões (McMullan et al, 2011; Boppana et al, 2013; Harrison et al, 2015). É possível ainda que se manifeste a forma mais grave da infeção congénita, a CID. Nesta, para além do envolvimento multissistémico, existe comprometimento do Sistema Nervoso Central (SNC).
8 De uma forma geral, estes recém-nascidos têm um pior prognóstico: aproximadamente 5 a 15% morre nas primeiras 6 semanas de vida, devido a coagulação intravascular disseminada, disfunção hepática e hemorragias (Dollard et al, 2007; James et al, 2009; Boppana et al, 2013; Jückstock et al, 2015). Entre 40 a 60% dos recém-nascidos sintomáticos poderão desenvolver sequelas tardias a longo prazo, nomeadamente atraso do desenvolvimento neuropsicomotor, crises convulsivas, corioretinites, atrofia do nervo ótico, perda auditiva e defeitos na dentição (Mocarski et al, 2013; Jückstock et al, 2015). O desenvolvimento de surdez neurossensorial é passível de ser encontrado em aproximadamente metade dos recém-nascidos sintomáticos, tratando-se geralmente de uma surdez bilateral e progressiva (Fowler et al, 2006). O distúrbio ocular mais comum associado à infeção congénita por HCMV é a coriorretinite. Esta pode afetar até 20% destes recém-nascidos, existindo ainda risco de desenvolver atrofia ótica e estrabismo (Harrison et al, 2015). 1.5.4 Prevenção da infeção O conhecimento limitado dos progenitores sobre a infeção durante a gravidez é um fator preponderante para a morbilidade da infeção congénita provocada pelo HCMV. Num estudo publicado em 2012, Cannon e colaboradores analisaram as respostas de um questionário realizado pela Healthstyles tendo concluído que apenas 13% das mulheres e 7% dos homens inquiridos tinham conhecimento da infeção por HCMV. A consciencialização entre as mulheres variou significativamente de acordo com a idade, raça/etnia, nível de escolaridade, região geográfica e rendimento familiar. No entanto, mesmo entre as mulheres com níveis de educação superior, apenas 21% possuía conhecimento sobre a infeção congénita por HCMV tendo demonstrado um maior conhecimento sobre outras condições de saúde na infância, apesar das consequências desta infeção serem mais prevalentes (Cannon et al, 2012). Em relação aos prestadores de cuidados de saúde, são vários os estudos publicados na última década que demonstram que o conhecimento desta infeção é limitado e insuficiente (Korver et al, 2009; Cordier et al, 2012; von Gartzen et al, 2013; Baer et al, 2014). Um inquérito realizado pelo Centers for Disease Control and Prevention (CDC) em conjunto com o American College of Obstetricians and Gynecologists (ACOG) demonstrou que apenas 44% dos obstetras e ginecologistas associados a esta instituição terá aconselhado as suas pacientes relativamente à prevenção da infeção por HCMV, enfatizando a necessidade de formação adicional no que diz respeito a esta temática (CDC, 2008). A ausência de vacinas licenciadas e programas de tratamento recomendados faz com que, em inúmeros casos, os prestadores de cuidados de saúde não transmitam rotineiramente às grávidas ou às mulheres que tentam engravidar as medidas preventivas relativas à aquisição do vírus. No entanto, existem resultados que comprovam a eficácia de medidas simples de higiene (Hamilton et al, 2014).
9 A mulher deve, por isso, estar alerta para os comportamentos que reduzem o risco de adquirir a infeção no decursar da gravidez, tais como: lavar sempre as mãos depois de trocar fraldas, alimentar uma criança ou segurar em brinquedos; não partilhar utensílios utilizados nas refeições ou escovas de dentes com crianças; limpar os brinquedos ou outros utensílios que tenham estado em contacto com a saliva ou urina de crianças; não beijar crianças na boca ou perto da mesma (Cannon et al, 2005; Coll et al, 2009; Johnson et al, 2014). Estudos demonstraram que a instrução de gestantes sobre medidas de higiene durante a gravidez resulta na diminuição da taxa de seroconversão para o HCMV. No entanto, essas medidas não são 100% eficazes na prevenção da transmissão intrauterina (Adler et al 2004; Vauloup-Fellous et al 2009). Por isso, têm vindo a ser estudadas outras medidas preventivas possivelmente eficazes: a imunização passiva, recorrendo à Imunoglobulina Humana do HCMV (HCMV-HIG), e a imunização ativa via vacinação. A imunização passiva consiste na cedência de anticorpos (Igs) a um individuo não imune com o objetivo de lhe conferir imunidade imediata contra um determinado agente de infeção. Pode acontecer naturalmente, com a passagem de IgGs maternas ao feto via transplacentária e pelo aleitamento, ou pode ser adquirida recorrendo à administração de imunoglobulinas hiperimunes, sendo esta última geralmente aconselhada quando o individuo não imune é exposto ao agente e a imunização ativa não está disponível ou está contraindicada (Tavares et al, 2005; Baxter et al, 2007). A HCMV-HIG é preparada recorrendo a doadores com elevado título de anticorpos contra o HCMV, estimulando a imunidade humoral do recetor (Khalil et al, 2017). O seu uso e potencial benefício na mulher grávida serão justificados pelo facto de, como mencionado no capítulo “1.5.2. Caracterização da Infeção”, a infeção primária apresentar um maior risco de transmissão fetal do que a infeção secundária. O primeiro estudo relativamente à administração de HCMV-HIG na gravidez foi realizado por Nigro e colaboradores, tendo a terapêutica com HIG sido associada a uma diminuição significativa do risco de infeção congénita. No entanto, resultados adversos como parto pré-termo, pré-eclampsia e restrição do crescimento intrauterino verificaram-se em maior número no grupo tratado com a HIG (Nigro et al, 2005). Em 2012 surgiu um estudo observacional que voltou a demonstrar uma tendência para a diminuição da taxa de transmissão maternofetal após a administração de HIG (Buxmann et al, 2012). Mais tarde, um ensaio randomizado contou com uma amostragem de 124 grávidas com infeção primária. A HIG foi administrada mensalmente verificando-se uma taxa de transmissão fetal de 44% no grupo placebo e 30% no grupo que recebeu a imunoglobulina, não sendo esta diminuição significativa. À semelhança do estudo de Nigro, os resultados adversos também foram maiores no grupo sob terapêutica.
10 O grupo de investigadores concluiu que deveria ter sido inserido um maior número de grávidas no estudo (Revello et al, 2014). De momento encontra-se ainda em curso um ensaio clinico com o objetivo de avaliar a eficácia da administração intravenosa da imunoglobulina hiperimune Cytogam®, desenvolvida pela CSL Behring (Spong et al, 2012, ClinicalTrials.gov NCT01376778). O resultado deste estudo poderá ajudar a clarificar no que diz respeito à eficácia e segurança da utilização de HCMV-HIG como medida de prevenção. Uma vez que se verifica um menor número de recém-nascidos infetados em grávidas com imunidade préconcecional, a imunização ativa por meio de vacinação tem sido uma meta há muito desejada. O desenvolvimento de uma vacina eficaz contra a infeção por HCMV teve início nos anos 70, quando se tornou evidente o papel deste vírus nos fetos, recém-nascidos e pacientes submetidos a transplante. Foram testadas duas vacinas vivas baseadas em estirpes atenuadas isoladas laboratorialmente, a AD169 e a Towne, mas apenas a segunda continuou a ser estudada (Elek et al, 1974; Plotkin et al, 1976). A vacina Towne foi desenvolvida a partir de uma estirpe de HCMV proveniente de uma criança com infeção, tendo a estirpe sido atenuada através de várias passagens em culturas celulares de fibroblastos. A sua eficácia foi analisada em mulheres seronegativas em idade fértil expostas a crianças que frequentam creches, tendo ficado demonstrado que esta não conferiu proteção a longo prazo contra a infeção (Adler et al, 1995). De forma a obter melhores resultados no que diz respeito à duração e eficácia da resposta imunitária, têm vindo a ser formuladas vacinas quiméricas recorrendo à estirpe Towne atenuada e à estirpe Toledo não-atenuada. Foram avaliadas quatro destas vacinas relativamente à sua segurança e tolerância num ensaio clinico de fase I, tendo sido conseguidos resultados otimistas em indivíduos seropositivos para HCMV (Heineman et al, 2006). O estudo das quatro vacinas foi realizado posteriormente em indivíduos seronegativos, demonstrando serem bem toleradas. No entanto, serão necessários estudos futuros de forma a determinar a sua segurança e efeito imunogénico em outros grupos de indivíduos (Adler et al, 2016). Um passo importante na procura por uma vacina eficaz contra a infeção por HCMV foi a purificação da gB. Esta é codificada por um gene conservado do vírus com capacidade de induzir a produção de anticorpos neutralizantes e, por isso, começou a ser estudada uma vacina sub-unitária composta por esta proteína e o adjuvante MF59 (emulsão contendo esqualeno e água). Um ensaio clinico de fase I foi realizado em adultos seronegativos, tendo a vacina sido considerada segura e imunogénica. No entanto, verificou-se ser necessária uma dose adicional da vacina devido à rápida diminuição do título de anticorpos após a imunização (Pass et al, 1999). Procedeu-se ao ensaio clinico de fase II, onde a vacina foi administrada em 3 doses (0, 1 e 6 meses) a mulheres seronegativas para HCMV que tinham sido mães há menos de 1 ano.
11 A diminuição da taxa de infeção materna no grupo vacinado foi cerca de 50% e o título de anticorpos produzidos foi semelhante ao induzido aquando uma infeção natural (Pass et al, 2009). Num segundo ensaio clinico de fase II, a mesma administração foi feita em adolescentes do sexo feminino. Verificou-se que a vacina possuía efeito imunogénico, apresentando resultados semelhantes ao estudo em mulheres adultas. No entanto, existiram alguns efeitos adversos locais e sistémicos (Bernstein et al, 2016). A eficácia e segurança desta vacina necessitam de ser confirmadas em ensaios clínicos de fase III. Um estudo recente, desenvolvido em modelos animais, utilizou o Vírus da Coriomeningite Linfocítica (LCMV) como vetor associado a gB e pp65 para a produção de uma vacina. Os resultados demonstraram uma diminuição na virémia materna e nos efeitos adversos da infeção na gravidez, mostrando que a utilização do LCMV como vetor poderá ser um caminho para uma vacina recombinante contra a infeção por HCMV (Schleiss et al, 2017). O Institute of Medicine (National Academy of Medicine, EUA) definiu, no ano 2000, que a prevenção da infeção congénita por HCMV seria uma prioridade para o século XXI (Lawrence et al, 2000). No entanto, apesar dos estudos citados e investimento na área, ainda não está disponível uma vacina eficaz contra esta infeção. 1.5.5 Métodos de diagnóstico 1.5.5.1 Diagnóstico na mulher grávida Como já referido, a percentagem de mulheres grávidas que adquire infeção primária sintomática por HCMV durante a gravidez é inferior a 5% e os sintomas presentes são geralmente inespecíficos, pelo que a infeção materna é difícil de estabelecer sem a realização de um teste de rastreio à mulher grávida (Pass et al, 2006; Coll et al, 2009). A serologia é o método correntemente utilizado para o diagnóstico da infeção materna. Os testes serológicos incluem ensaios imunoenzimáticos e quimioluminescentes que detetam a presença da imunoglobulina M (IgM) e da imunoglobulina G (IgG) e respetiva avidez. O método ideal para identificar a infeção primária na mulher grávida é através da observação da seroconversão das IgGs durante a gravidez, utilizando as IgGs negativas obtidas em análise pré-natal como padrão de referência e fazendo a comparação com os resultados positivos obtidos posteriormente. No entanto, na maioria dos casos, o acompanhamento pré-natal não é realizado, não existindo seronegatividade basal para comparação (Malm et al, 2007; Lazzarotto et al, 2008; Naing et al, 2016).
12 A deteção apenas de IgMs não pode ser utilizada para diagnóstico definitivo, uma vez que estas podem permanecer elevadas durante vários meses após infeção primária, mas poderão surgir também em consequência da reativação do vírus ou devido a uma reinfeção. Além disso, poderão surgir em consequência de infeção pelo vírus Epstein-Barr, pertencente à mesma família do HCMV, parvovirus B19, ou devido a doenças autoimunes, dando origem a falsos positivos (Revello et al, 2002; Lazzarotto et al, 2011). Assim, a deteção de IgM e IgG simultaneamente poderá indicar uma infeção recente, mas não permite distinguir entre uma infeção primária e uma infeção recorrente ou reativação. Nesse caso, será necessário realizar um teste de avidez para as IgGs: se a avidez for baixa indicará uma infeção recente, se esta for alta indica uma infeção com mais de 3 meses (Macé et al, 2004; Joseph et al, 2018). Vários artigos mencionam a possível utilização de testes de antigenémia ou deteção de DNA de HCMV através da técnica de Polymerase Chain Reaction (PCR) para o diagnóstico da infeção primária materna. No entanto, os resultados obtidos revelam que estes métodos não permitem datar o curso da infeção nem estimar o risco de transmissão ao feto e gravidade da infeção congénita, não sendo suficientes para diagnosticar a infeção primária materna (Revello et al, 1998; Lazzarotto et al, 2004; Lazzarotto et al, 2008). 1.5.5.2 Diagnóstico no feto e no recém-nascido Após a confirmação da infeção materna por HCMV durante a gravidez, é de extrema importância considerar a possibilidade de infeção do feto. Para isso poderão ser utilizadas técnicas não invasivas, tais como a ecografia fetal e a ressonância nuclear magnética, ou técnicas invasivas, como a amniocentese e a cordocentese (Lazzarotto et al, 2011). O primeiro método que deve ser utilizado é a ecografia fetal, a partir da qual poderá ser possível observar lesões ecográficas classicamente associadas à infeção por HCMV. Duas das alterações que sugerem infeção, e que poderão ser visíveis na ecografia, é o aumento da espessura da placenta, por vezes com calcificações, e a restrição do crescimento intrauterino. Outros sinais típicos são as lesões cerebrais como por exemplo a microcefalia, calcificações intracranianas e ventriculomegália, ascite, oligohidrâmnios, intestino hiperecogénico, hidrópsia fetal e derrame pleural (Malinger et al, 2010; Picone et al, 2014; Hughes et al, 2016; Saldan et al, 2017). A ecografia fetal deve ser realizada a cada 2 a 4 semanas, de forma a monitorizar o aparecimento de alterações morfológicas ao longo da gravidez e auxiliar o prognóstico da infeção congénita (Bonalumi et al, 2011). No entanto, a sensibilidade deste método é reduzida: apenas cerca de 20% dos fetos infetados são identificados, o que significa que a ausência de alterações morfológicas não exclui a possibilidade de infeção congénita (Guerra et al, 2008).
13 A ressonância nuclear magnética (RNM) poderá ser utilizada como método complementar à ecografia quando são detetadas anomalias, facultando informações mais detalhadas principalmente a nível do SNC (Picone et al, 2008). A inclusão da RNM como exame complementar deve ser realizada durante o terceiro trimestre e irá aumentar o valor preditivo positivo do diagnóstico de alterações cerebrais em fetos infetados, permitindo estabelecer o prognóstico da infeção fetal pela presença das respetivas alterações morfológicas (Bonalumi et al, 2011; Cannie et al, 2016). Para o diagnóstico definitivo da infeção fetal é necessário o isolamento do vírus através de cultura ou a amplificação do seu genoma a partir do líquido amniótico, obtido por amniocentese. O vírus irá infetar o rim do feto, atingindo o líquido amniótico através da excreção do vírus pela urina fetal seis a oito semanas após a seroconversão. Assim sendo, a amniocentese deverá ser realizada após as 20 semanas de gestação, altura em que a diurese do feto se encontra bem estabelecida, de forma a diminuir o risco de falsos negativos (Lazzarotto et al, 2014; Hughes et al, 2016; Khalil et al, 2017). O isolamento do vírus através do método de cultura tradicional apresenta uma excelente especificidade (≈100%) com uma sensibilidade a variar entre 50-80% mas, no entanto, demora cerca de 14 dias a obter-se o resultado (Benoist et al, 2008). Surgiram então métodos de cultura rápidos, como o método shell vial. Este método combina a cultura celular, utilizando células MRC5 permissivas à infeção, com técnicas imunológicas de modo a detetar antigénios nucleares do HCMV. Após 16h a 36h de incubação realiza-se uma reação de imunofluorescência em que os anticorpos anti-CMV conjugados com fluoresceína reagem com uma das glicoproteínas do HCMV, usualmente a pp65. Os resultados serão obtidos através de observação microscópica da emissão de fluorescência de cor verde, mantendo os valores de sensibilidade e especificidade do método tradicional num menor tempo de resposta (Gleaves et al, 1985; Ross et al, 2005). Apesar de apresentarem valores de especificidade e sensibilidade desejáveis, os métodos de cultura têm vindo a ser substituídos pelos métodos moleculares, nomeadamente pelo método de PCR em tempo real. Esta técnica permite detetar a presença de DNA de HCMV na amostra em apenas poucas horas, com valores de especificidade entre 67% a 100% e de sensibilidade entre os 50% e os 100% (Benoist et al, 2008). Vários estudos sugerem que os valores de sensibilidade aumentam para 90% a 100% com valores preditivos positivos de cerca de 100% quando a amniocentese é realizada a partir da 20ª ou 21ª semana de gestação e 6 semanas após o primeiro teste serológico materno positivo, pelas razões descritas anteriormente (Revello et al, 1999; Revello et al, 2008; Ross et al, 2011; Saldan et al, 2015).
20 Quando utilizados para tratamento é importante ter em consideração os riscos relativos ao mesmo, e as famílias devem ser devidamente esclarecidas quanto à potencial toxicidade associada. Poderá ser necessário pôr fim ao tratamento e, por isso, é necessária monotorização durante todo o decorrer deste. Em relação à toxicidade a longo prazo ainda não existem evidências claras em humanos, mas têm sido levantadas questões sobre a possível carcinogenecidade e efeitos na fertilidade, consequências verificadas em alguns modelos animais (Kimberlin et al, 2003). Além disso, a imaturidade do sistema imunitário do recém-nascido poderá contribuir para a seleção de estirpes mutantes, sendo por isso importante a realização de estudos relativos ao aparecimento de resistências. As mutações associadas com a resistência ao ganciclovir e ao valganciclovir localizam-se normalmente na região UL97 (Campanini et al, 2012). Caso existam, são recomendados dois antivirais considerados de segunda linha para tratamento: o foscarnet e o cidofovir (Drew et al, 2001; Kotton et al, 2013). Técnica de PCR em tempo real A técnica de PCR foi desenvolvida em 1986 por Kary Mullis e colaboradores, consistindo na utilização da capacidade da enzima DNA polimerase para sintetizar uma cadeia de DNA complementar à cadeia utilizada como molde, tornando assim possível a amplificação de milhões de cópias idênticas a partir de uma pequena quantidade de DNA inicial (Mullis et al, 1986). Depressa a inovadora técnica começou a despertar interesse na comunidade científica, sendo agora utilizada para o diagnóstico laboratorial de várias infeções, substituindo muitas das técnicas clássicas (Yan et al, 2002; Mackay, 2004). Atualmente existem várias técnicas comerciais e in house (desenvolvidas por cada laboratório), sendo que as principais diferenças entre ambas poderão estar na sequência de DNA alvo a amplificar, reagentes e respetivas concentrações, equipamentos ou ainda nos parâmetros da amplificação (Razonable et al, 2002). A PCR demonstrou ser muito sensível, mas a visualização dos resultados obrigava à posterior manipulação dos produtos amplificados elevando o risco de contaminação. A principal desvantagem seria, no entanto, a morosidade desta técnica (Heid et al, 1996; Arya et al, 2005). Poucos anos mais tarde, em 1993, Higuchi e colaboradores descreveram pela primeira vez a técnica de PCR em tempo real, combinando a tecnologia de amplificação por PCR convencional com a deteção do produto através da emissão de fluorescência. Esta técnica permite visualizar a amplificação ciclo a ciclo e ainda quantificar a quantidade de produto amplificado através de uma curva padrão (Higuchi et al, 1993; Arya et al, 2005).
21 A utilização de sondas de hidrólise, como as TaqMan®, permite a deteção dos produtos de amplificação com elevada especificidade. Estas sondas são desenhadas especificamente para a sequência alvo, contendo um fluoróforo ligado ao terminal 5’ (reporter) e um recetor de fluorescência ligado ao terminal 3’ (quencher). A sonda irá hibridar na região específica da cadeia molde sendo que o quencher, ao captar a energia emitida pelo reporter, dissipa-a sob a forma de calor (Livak et al, 1995; Heid et al, 1996; Arya et al, 2005). Este fenómeno denomina-se FRET (Fluorescence Ressonance Energy Transfer) e ocorre em consequência de o espetro de emissão do reporter coincidir com o espetro de absorção do quencher (Didenko, 2001). A Taq polimerase inicia a síntese da nova cadeia a partir do local de hibridação dos primers com a sequência alvo. Como a enzima possui atividade exonucleotídica de 5’ para 3’, ao encontrar a sonda irá clivá-la, interrompendo a transferência de energia entre o reporter e o quencher e permitindo assim detetar a emissão de fluorescência pelo reporter (Figura 2) (Livak et al, 1995; Gibson et al, 1996; Heid et al, 1996). A quantidade de fluorescência emitida é proporcional à quantidade de DNA a ser amplificado (Arya et al, 2005). Figura 2. Princípio do funcionamento das sondas TaqMan®. Adaptado de Arya et al, 2005, Basic principles of real-time quantitative PCR. Expert review of molecular diagnostics, p211. O sinal de fluorescência será identificado por um detetor associado a um computador com um software que traduz a emissão de fluorescência graficamente, sob a forma de curva, em tempo real durante a amplificação (Arya et al, 2005).
22 No final da reação é traçada uma linha designada threshold, que permite separar a fluorescência de “background” daquilo que é a fluorescência correspondente à amplificação da amostra. O número do ciclo em que a fluorescência emitida ultrapassa essa linha é designado como threshold cycle (CT) sendo que quanto maior a concentração de DNA alvo na amostra, menos ciclos serão necessários para que a fluorescência ultrapasse o limiar de threshold (Figura 3) (Heid et al, 1996; Mackay et al, 2004; Kubista et al, 2006). Este ponto (CT) irá ser utilizado para a quantificação do DNA presente na amostra, quando se realiza uma reação de PCR quantitativa (Gibson et al, 1996). A técnica de PCR em tempo real possui várias vantagens relativamente à PCR convencional. A maioria dos resultados obtidos por PCR convencional são qualitativos: a quantidade de DNA apenas pode ser estimada comparando o resultado da corrida eletroforética da amostra com o de um padrão de peso molecular conhecido (Mackay et al, 2004). Em adição, a abordagem convencional possui um elevado risco de contaminação, principalmente no caso da nested-PCR, em que é necessário realizar duas amplificações consecutivas e manipular o produto da primeira amplificação. Para além de colmatar estas desvantagens, a técnica de PCR em tempo real permitiu a automatização e o aumento do rendimento das reações, diminuindo o risco de erro humano e o tempo de resposta dos ensaios (Espy et al, 2006). A utilização de sondas possibilita ainda um aumento da especificidade da reação, pois é necessário que ocorra hibridação especifica dos primers e da sonda com a sequência alvo para que ocorra amplificação e, consequentemente, emissão de fluorescência (Arya et al, 2005). Figura 3. Modelo gráfico de amplificação relativo à técnica de PCR em tempo real ilustrando a nomenclatura utilizada. Retirado de Kubista et al, 2006. The real-time polymerase chain reaction. Molecular aspects of medicine, p99.
23 Objetivos O principal objetivo deste estudo foi verificar a aplicação prática de pools de saliva num programa de rastreio de infeção congénita por HCMV em dois Hospitais com um elevado número de nascimentos anual. Neste programa foram rastreados recém-nascidos até duas semanas de idade, nascidos no Hospital CUF Descobertas e no Hospital de Vila Franca de Xira, durante um período de 7 meses. O rastreio baseou-se no diagnóstico da infeção congénita através de pools de amostras de saliva, seguido de análise quantitativa de DNA viral por PCR em tempo real. Como objetivos secundários pretendeu comparar-se a carga viral obtida na amostra de saliva com a carga obtida na amostra de urina correspondente, estudar o custo associado ao rastreio recorrendo à metodologia de pools de saliva e estimar-se a prevalência da infeção congénita em ambos os Hospitais.
24 II Materiais e métodos 2.1 População em estudo A população deste estudo incluiu 1492 recém-nascidos com idades compreendidas entre 1 dia a duas semanas, dos quais 748 nascidos no Hospital CUF Descobertas e 744 nascidos no Hospital Vila Franca de Xira. O estudo decorreu durante 7 meses, tendo as amostras sido colhidas entre 18 de Outubro de 2018 e 31 de Maio de 2019. A realização deste estudo foi autorizada pelas Comissões de Ética da Faculdade de Ciências Médicas (NMS|FCM) e de cada um dos Hospitais participantes, e todos os pais dos recém-nascidos incluídos no estudo leram e assinaram um consentimento informado (Anexos I,II,III, IV). 2.2 Amostras As amostras de saliva foram colhidas utilizando zaragatoas tipo rayon com haste quebrável. A zaragatoa (FLmedical, Torreglia, Itália) foi acondicionada num tubo de 3mL com 500 µL de meio RPMI (Life Technologies, Paisley, UK). Os tubos foram armazenados a 4ºC até serem processados. Foram solicitadas amostras de urina para confirmação de infeção congénita, nos casos em que se obteve um resultado positivo na amostra de saliva. Estas foram colhidas utilizando sacos coletores pediátricos de urina, posteriormente colocadas em frascos de 50mL e armazenadas a 4ºC até ao seu processamento. As amostras de ambos os Hospitais foram encaminhadas para o Centro de Medicina Laboratorial Germano de Sousa para serem codificadas através de um número aleatório e, posteriormente, transportadas para o Laboratório da UC de Infeção: Etiologia, Patogénese e Bases Terapêuticas da NMS|FCM acompanhadas de um termo de responsabilidade (Anexo V). 2.3 Procedimento experimental 2.3.1 Processamento das amostras Na NMS|FCM as amostras foram centrifugadas a 948 x g (Hettich Rotina 380 R) durante 5 minutos e transferidas, em câmara de segurança biológica, para tubos de congelação devidamente identificados. Durante este processo foram realizados procedimentos de desinfeção entre cada uma das amostras e a cada 5 amostras a área de trabalho e respetivo material era esterilizado através de radiação UV.
25 Preparação de pools de 10 amostras As amostras individuais de saliva foram agrupadas em séries de 10, por ordem de chegada ao Laboratório e de acordo com a idade do recém-nascido, sendo atribuído à pool um número sequencial. As pools foram preparadas pipetando 20µL de cada uma das 10 amostras individuais de saliva para um tubo eppendorf de 1,5mL, perfazendo os 200µL necessários para a realização da extração. Todas as amostras individuais de saliva foram congeladas a -20ºC para confirmação do resultado da pool. Perante um resultado positivo, foi necessário determinar qual ou quais as amostras individuais de saliva positivas. 2.3.2 Extração de DNA Para realizar o processo de extração de DNA em amostras de saliva, individuais ou agrupadas em pools, foi utilizado o PureLink® Genomic DNA Minikit (Invitrogen) de acordo com o protocolo do fabricante com ligeiras adaptações. O mesmo protocolo foi utilizado para extrair o DNA das amostras de urina. Para extrair DNA genómico seguiram-se 3 passos fundamentais: lise celular, purificação do DNA e eluição. Lise celular Adicionar 20 µl de proteinase K à amostra. Agitar no vórtex. Adicionar 200 µl de Tampão de Lise. Agitar novamente no vórtex. Incubar a 55ºC, durante 10 minutos. Fazer spin (Eppendorf Minispin). Purificação do DNA Adicionar 200 µl de etanol 96-100%. Agitar bem no vórtex. Fazer spin (Eppendorf Minispin). Transferir toda a mistura (~650 µL) para uma coluna fornecida pelo kit. Centrifugar a coluna à temperatura ambiente a 10.000 x g (Hettich Mikro 22 B), durante 2 minutos. Descartar o tubo coletor e passar a coluna para um novo tubo coletor, fornecido pelo kit. Pipetar 450 µL de tampão de lavagem 1 para a coluna. Centrifugar a coluna à temperatura ambiente a 10.000 x g (Hettich Mikro 22 B) durante 2 minutos. Descartar o tubo coletor e transferir a coluna para um novo tubo coletor, fornecido pelo kit. Adicionar à coluna 450 µl de tampão de lavagem 2. Centrifugar a coluna à velocidade máxima (17.000 x g, Hettich Mikro 22 B) durante 3 minutos, à temperatura ambiente. Descartar o tubo coletor e colocar a coluna num tubo eppendorf estéril de 1,5ml.
26 Eluição do DNA Adicionar à coluna 50 µl de tampão de eluição. Incubar à temperatura ambiente durante 5 minutos. Centrifugar a coluna à velocidade máxima (17000 x g, Hettich Mikro 22 B) durante 3 minutos à temperatura ambiente. Remover e descartar a coluna. Armazenar o DNA purificado a -20ºC ou efetuar a técnica de PCR em tempo real. 2.3.3 Técnica de PCR em tempo real A pesquisa de DNA de HCMV foi efetuada recorrendo a uma técnica de PCR em tempo real (PCRtr) in house. Foram utilizados primers e uma sonda Taqman® específicos para o gene UL83, que codifica a fosfoproteína pp65 do HCMV (Tabela 1) (Paixão et al, 2012). O procedimento descrito foi efetuado nas pools de saliva e nas amostras individuais de saliva e urina. Tabela 1. Sequência dos primers e sonda utilizados para a amplificação do gene UL83 de HCMV Primer Forward - CMVF 5’ CCCTCCGGCAAGCTCTTT 3’ Primer Reverse - CMVR 5’ CAGGTCCTCTTCCACGTCAGA 3’ Sonda FAM 5’TGCACGTCACGCTGG 3’ MGB A reação de PCR foi realizada numa placa de 96 poços utilizando a seguinte mistura de reação: a) 1x Luna® Universal Probe qPCR Master Mix b) 4µM de primers c) 0,3µM de sonda d) Água ultrapura livre de DNAses e RNAses para perfazer o volume de 20µL e) 5µL de DNA extraído Todas as amostras foram testadas em duplicado. Para excluir a existência de inibidores foi realizado um controlo interno (CI) para cada amostra, adicionando ao poço 5µL de DNA da amostra em estudo e 2µL de DNA extraído do sobrenadante de uma cultura pura da estirpe AD169 do HCMV com uma concentração de 69000 cópias/mL (diluição C). Para validar o resultado da amostra o CI deverá apresentar sempre um resultado positivo, não diferindo 2 CTs em relação ao controlo do controlo interno (CCI), excluindo dessa forma a presença de inibidores de reação e rejeitando a possibilidade de resultados falso negativos. Caso a diferença entre os CTs seja superior a 2, será necessário diluir a amostra e voltar a testa-la.
27 Em cada série de PCRtr foram utilizados os seguintes controlos: Controlo negativo (CN) (5µL de água ultrapura livre de DNAses e RNAses) Controlo positivo (CP) (5µL de DNA extraído do sobrenadante de uma cultura pura da estirpe AD169 do HCMV com concentração de 6900 cópias/mL) Controlo do controlo interno (CCI) (2µL de DNA da diluição C + 5µL de água ultrapura livre de DNAses e RNAses) Após a conclusão de todas as pipetagens, a placa foi selada com película própria para o efeito e centrifugada a 1481 x g (Hettich Rotina 380 R) durante 5 minutos. O sistema de deteção utilizado para a realização da técnica de PCRtr foi o ABI PRISM 7500 (Applied Biosystems). O ciclo de amplificação foi constituído por uma desnaturação inicial a 95ºC durante 10 minutos seguido de 40 ciclos de desnaturação a 95ºC durante 15 segundos e hibridação a 60ºC durante 1 minuto, fase em que se efetuou a leitura da fluorescência (Figura 4). Figura 4. Ciclo de amplificação utilizado na reação de PCR em tempo real Foram tidos em consideração os seguintes critérios para validação dos resultados: Os duplicados do CN obterem resultado negativo Os duplicados do CP e do CCI obterem resultado positivo A diferença entre duplicados não ser superior a 2 CTs Todas as reações cujo CT foi superior a 15 e inferior a 39 foram consideradas positivas Reações cujo CT foi igual ou superior a 39 foram consideradas negativas
28 2.3.3.1 Análise dos Resultados da PCRtr O resultado das pools foi analisado de acordo com o algoritmo descrito na Figura 5. Quando uma pool obtinha um resultado positivo, as 10 amostras de saliva que a compunham eram extraídas individualmente e testadas utilizando o protocolo acima mencionado. Após a identificação da(s) amostra(s) positiva(s), de forma a efetuar a confirmação da infeção congénita por HCMV, era solicitada uma amostra de urina tendo sido também testada pelas técnicas anteriormente descritas. Figura 5. Algoritmo utilizado no estudo para a deteção e identificação de amostras positivas para DNA de HCMV em pools de 10 amostras de saliva colhidas de recém-nascidos. 2.3.4 Quantificação da carga viral A análise quantitativa das pools e amostras individuais de saliva e urina positivas foi realizada através da técnica de PCRtr previamente descrita, recorrendo a uma curva de calibração efetuada utilizando quatro diluições seriadas de 1:10 do 1º Padrão Internacional da Organização Mundial de Saúde (OMS), NIBSC 09/162, para técnicas de amplificação de ácidos nucleicos de HCMV, com concentração inicial de 5x106 Unidades Internacionais por mililitro (UI/mL). As quantificações das pools e amostras individuais foram obtidas por extrapolação dos CT na curva de calibração e os resultados obtidos foram expressos em UI/mL. A sensibilidade analítica desta técnica foi testada previamente no presente Laboratório, onde foi descrita como sendo de 150 UI/mL (Silva et al, no prelo). 2.3.4.1 Análise das cargas virais de HCMV Foram analisados os valores das cargas virais obtidas nas pools de saliva, amostras de saliva individuais e amostras de urina. 1 pool (10 amostras) Reação de PCR positiva PCR das 10 amostras de saliva individuais Identificação da(s) amostra(s) positiva(s) Confirmação do resultado positivo por PCRtr da amostra de urina Reação de PCR negativa 10 amostras de saliva negativas
29 2.4 Estudo dos custos associados à deteção de DNA de HCMV através da utilização da metodologia de pools versus a análise de amostras individuais Os custos económicos inerentes à pesquisa de DNA de HCMV recorrendo à metodologia de pools de saliva, em comparação com amostras individuais, foram calculados de forma a estudar a viabilidade da implementação da metodologia em estudo num programa de rastreio universal. 2.5 Determinação da prevalência da infeção congénita por HCMV A determinação da prevalência da infeção congénita por HCMV nos dois Hospitais em estudo e respetivo intervalo e confiança a 95% (IC95%) foi realizada através da opção “Confidence limits for a proportion” da ferramenta Epitools Epidemiological Calculators disponível em: https://epitools.ausvet.io/ciproportion.
36 Os resultados apresentados demonstram que realizar pools de 10 ou pools de 20 amostras não altera significativamente a sensibilidade da metodologia em estudo. Estes resultados foram já submetidos para publicação, encontrando-se neste momento a aguardar a decisão do editor (Silva et al, no prelo). Pretendeu ainda comparar-se a carga obtida nas amostras de saliva positivas com as amostras de urina correspondentes. Para realizar esta comparação foram consideradas todas as amostras de saliva com resultado positivo, incluindo por isso as amostras negativas na urina (Tabela 7). Tabela 7. Valores de quantificação em UI/mL para as amostras de saliva positivas e amostras de urina correspondentes. O valor da carga viral apresentado representa o valor médio dos duplicados. Os resultados encontram-se apresentados por ordem decrescente da carga viral obtida na amostra de saliva. *Amostras com resultado positivo testadas por um laboratório diferente. Nº amostra Saliva Urina UI/mL UI/mL CMV57A 8,2x107 9,3x105 CMV82 1,5x107 5,3x106 CMV307A 2,0x106 Pos.* CMV253 8,4x105 Pos.* CMV566A 6,9x105 Pos.* CMV422A 8,8x104 7,2x105 CMV305A 6,1x104 1,2x106 CMV103A 4,2x104 Pos.* CMV633 3,1x104 Pos.* CMV12A 7,4x103 Pos.* CMV481A 6,9x103 Neg. CMV58A 1,3x103 Neg. CMV21A 7,4x101 Neg. CMV420A 1,8x101 Neg. Todas as amostras de saliva positivas foram quantificadas neste estudo mas apenas 4 amostras de urina foram quantificadas. As restantes amostras de urina foram enviadas pelos Hospitais de origem para outros laboratórios, apenas nos tendo sido comunicado o resultado qualitativo. Observando as cargas virais obtidas na quantificação das amostras CMV57A e CMV82 verificamos que a carga foi superior nas amostras de saliva, respetivamente 100x e 10x. Por outro lado, nas restantes duas amostras que foi possível quantificar, CMV422A e CMV305A, obteve-se a situação inversa: a carga viral foi superior nas amostras de urina, respetivamente 10x e 100x. Dado o baixo número de amostras quantificadas, não é possível retirar conclusões desta comparação e não se encontrou na literatura um estudo de comparação das cargas virais nestes produtos biológicos.
37 No entanto, num artigo publicado em 2014, Ross e colaboradores sugerem que a probabilidade de deteção do DNA de HCMV em amostra de saliva por PCRtr é igual ou superior à mesma probabilidade numa amostra de urina (Ross et al, 2014). Podemos ainda observar na Tabela 7 que em todas as amostras de saliva positivas com carga viral igual ou superior a 7,4x103 UI/mL (amostra CMV12A) se confirmou a infeção congénita através da análise na urina. No entanto, a amostra CMV481A, cuja carga viral obtida foi 6,9x103 UI/mL, não teve infeção congénita confirmada. Isto sugere que valores de carga viral de DNA de HCMV na saliva inferiores ou iguais a 6,9x103 UI/mL não serão indicadores de infeção congénita. Teria sido necessária uma maior amostragem e várias amostras com cargas virais baixas para podermos fundamentar esta afirmação. 3.3 Estudo dos custos associados à deteção de DNA de HCMV através da utilização da metodologia de pools versus a análise de amostras individuais Após a realização de todos os cálculos, descritos pormenorizadamente no Anexo VII, concluiu-se que o custo associado à realização da técnica de deteção de DNA de HCMV, no nosso laboratório, para uma amostra individual de saliva seria 8,45€. Neste estudo foram rastreados 1492 recém-nascidos o que significa que, caso o rastreio tivesse sido realizado testando cada amostra individualmente, o custo associado teria sido 12608€, um valor incomportável para ser aplicado num programa de rastreio universal. Ao utilizar a metodologia de pools de 10 amostras para o rastreio, o custo associado a cada pool foi de 13,10€ ficando cada amostra individual a 1,31€. Isto representa uma redução de custo de 85% em relação ao processamento individual. Ao rastrear 1492 recém-nascidos através do método de pools de 10 amostras neste estudo houve um gasto de apenas 1955€. Se a metodologia utilizada fosse a de pools 20 amostras, cada uma teria um custo associado de 18,31€ e cada amostra desta pool custaria apenas 0,92€, reduzindo o custo associado ao rastreio em 89%. Se tivessem sido adotadas pools de 20 amostras para este estudo, o custo associado teria sido cerca de 1373€. De notar que nestes cálculos não estão incluídos os valores associados ao processamento das amostras de urina.
38 3.4 Prevalência da infeção congénita por HCMV A prevalência da infeção congénita por HCMV foi estudada recorrendo à ferramenta Epitools tendo obtido um valor de 0,67% com intervalo de confiança a 95% entre 0,36% e 1,23% em recém-nascidos nascidos nos Hospitais CUF Descobertas e Vila Franca de Xira no período entre Outubro de 2018 e Maio de 2019. A grande amplitude do intervalo de confiança deve-se ao tamanho reduzido da amostra. Os resultados estão representados na Figura 6. Figura 6. Resultados relativos à prevalência da infeção congénita por HCMV nos dois Hospitais portugueses participantes no estudo e respetivo intervalo de confiança a 95%. O valor observado para a prevalência desta infeção encontra-se dentro dos intervalos descritos na literatura para os países desenvolvidos, que se situa em média entre 0,6% e 0,7% (Dollard et al, 2007; Cannon et al, 2014). No entanto, devido à reduzida amostragem deste estudo e o fato de esta ser limitada a dois Hospitais de Lisboa, é de salientar que esta percentagem não pode ser considerada como representativa da prevalência da infeção congénita por HCMV em Portugal.
39 IV Conclusões O rastreio para a infeção por HCMV na gravidez não é aconselhado por várias razões tais como a ausência de profilaxia, programas de tratamento efetivos e o difícil prognóstico no que diz respeito às sequelas desta infeção. Assim, apenas através de um programa de rastreio universal para a infeção congénita por HCMV em recém-nascidos será possível diagnosticar todos os casos de infeção, em especial os casos assintomáticos. A implementação deste procedimento por rotina iria possibilitar a monitorização precoce das crianças portadoras de infeção assintomática ao nascimento, nomeadamente no que se refere ao risco de desenvolvimento de sequelas tardias como SNHL e alterações neurológicas progressivas. O benefício desta intervenção precoce na qualidade de vida destas crianças está comprovado mas o custo associado à aplicação de um programa de rastreio em larga escala tem limitado a sua implementação. Neste estudo foi realizado um rastreio para a infeção congénita por HCMV, nos Hospitais CUF Descobertas e Vila Franca de Xira, através de pools de 10 amostras de saliva utilizando PCR em tempo real, tendo sido possível diagnosticar 10 casos de infeção congénita. A metodologia utilizada foi previamente descrita para amostras de urina mas o fato da colheita desta amostra ter vários inconvenientes para o recém-nascido, faz com que muitos pais recusem a realização da análise. Neste estudo confirmou-se que a saliva apresenta uma sensibilidade semelhante à da urina e que é possível aplicar a metodologia de pools recorrendo a este produto biológico. O nosso estudo alertou para a necessidade de, caso a metodologia de pools de saliva venha a ser implementada, será necessário que a colheita da amostra se realize antes da amamentação, de forma a evitar resultados falso-positivos. Todos os resultados positivos deverão ser confirmados pelo método de referência, a análise de uma amostra de urina colhida nas primeiras 2 a 3 semanas de vida da criança. Os dados deste estudo permitiram estimar uma redução do custo em 85% e 89%, respetivamente, para a metodologia de pools de 10 amostras e de pools de 20 amostras, quando comparado com o custo de uma análise individual. A prevalência da infeção nos 2 Hospitais participantes no presente rastreio foi de 0,67%, um valor mais baixo do que o esperado tendo em conta o estudo realizado anteriormente em Portugal, mas dentro dos intervalos descritos para os países desenvolvidos. A amostragem estudada não representa, no entanto, o panorama do país e, por isso, a equipa tem como objetivo futuro continuar o estudo numa maior população. A metodologia de pools de saliva demonstrou ser promissora para a implementação de um rastreio em larga escala a custo reduzido, permitindo detetar todos os casos de infeção congénita por HCMV e intervir precocemente no desenvolvimento das crianças afetadas, melhorando a sua qualidade de vida.
40 V Referências Bibliográficas A Ross, S., Novak, Z., Pati, S., & B Boppana, S. (2011). Overview of the Diagnosis of Cytomegalovirus Infection. Infectious Disorders-Drug Targets (Formerly Current Drug Targets-Infectious Disorders), 11(5), 466-474. Adler, S. P., Starr, S. E., Plotkin, S. A., Hempfling, S. H., Buis, J., Manning, M. L., & Best, A. M. (1995). Immunity induced by primary human cytomegalovirus infection protects against secondary infection among women of childbearing age. Journal of Infectious Diseases, 171(1), 26-32. Adler, S. P., Finney, J. W., Manganello, A. M., & Best, A. M. (2004). Prevention of child-to-mother transmission of cytomegalovirus among pregnant women. The Journal of pediatrics, 145(4), 485-491. Adler, S. P. (2011). Screening for cytomegalovirus during pregnancy. Infectious diseases in obstetrics and gynecology. Adler, S. P., Manganello, A. M., Lee, R., McVoy, M. A., Nixon, D. E., Plotkin, S., & Murray, S. E. (2016). A Phase 1 Study of 4 Live, Recombinant Human Cytomegalovirus Towne/Toledo Chimera Vaccines in Cytomegalovirus–Seronegative Men. The Journal of infectious diseases, 214(9), 1341-1348. Al-Orifi, F., McGillivray, D., Tange, S., & Kramer, M. S. (2000). Urine culture from bag specimens in young children: are the risks too high?. The Journal of pediatrics, 137(2), 221-226. Arya, M., Shergill, I. S., Williamson, M., Gommersall, L., Arya, N., & Patel, H. R. (2005). Basic principles of real-time quantitative PCR. Expert review of molecular diagnostics, 5(2), 209-219. Azenkot, T., Zaniello, B., Green, M. L., Selke, S., Huang, M. L., Magaret, A. & Johnston, C. (2019). Cytomegalovirus shedding from breastmilk and mucosal sites in healthy postpartum women: A pilot study. Journal of medical virology, 91(5), 894-898. Baer, H. R., McBride, H. E., Caviness, A. C., & Demmler-Harrison, G. J. (2014). Survey of congenital cytomegalovirus (cCMV) knowledge among medical students. Journal of Clinical Virology, 60(3), 222-242. Barbi, M., Binda, S., & Caroppo, S. (2006). Diagnosis of congenital CMV infection via dried blood spots. Reviews in medical virology, 16(6), 385-392. Barkai, G., Roth, D. A. E., Barzilai, A., Tepperberg-Oikawa, M., Mendelson, E., Hildesheimer, M., & Kuint, J. (2014). Universal neonatal cytomegalovirus screening using saliva–report of clinical experience. Journal of Clinical Virology, 60(4), 361-366.
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VI Anexos Anexo I – Autorização da Comissão de Ética da Faculdade de Ciências Médicas|Nova Medical School (CEFCM) para a realização do estudo
Anexo II – Autorização da Comissão de Ética do Hospital CUF Descobertas para a realização do estudo
Anexo III – Autorização da Comissão de Ética do Hospital de Vila Franca de Xira para a realização do estudo
Anexo IV – Consentimento Informado entregue a todos os pais de recém-nascidos participantes no estudo
Anexo V – Termo de Responsabilidade
Anexo VI – Resultados do rastreio realizado a 1492 recém-nascidos nos Hospitais portugueses CUF Descobertas e Vila Franca de Xira Nº Amostra Nº Pool Resultado PCR Pool Resultado PCR individual Nº Amostra Nº Pool Resultado PCR Pool Resultado PCR individual Nº Amostra Nº Pool Resultado PCR Pool Resultado PCR individual CMV1 1 Negativo Neg. CMV35 5 Negativo Neg. CMV61 9 Negativo Neg. CMV2 Neg. CMV1A Neg. CMV16A Neg. CMV3 Neg. CMV2A Neg. CMV17A Neg. CMV4 Neg. CMV3A Neg. CMV19A Neg. CMV5 Neg. CMV4A Neg. CMV62 Neg. CMV6 Neg. CMV5A Neg. CMV63 Neg. CMV7 Neg. CMV6A Neg. CMV64 Neg. CMV8 Neg. CMV7A Neg. CMV22A Neg. CMV9 Neg. CMV8A Neg. CMV65 Neg. CMV10 Neg. CMV40 Neg. CMV66 Neg. CMV11 2 Negativo Neg. CMV41 6 Negativo Neg. CMV67 10 Negativo Neg. CMV12 Neg. CMV42 Neg. CMV68 Neg. CMV13 Neg. CMV43 Neg. CMV23A Neg. CMV14 Neg. CMV44 Neg. CMV24A Neg. CMV15 Neg. CMV45 Neg. CMV25A Neg. CMV16 Neg. CMV46 Neg. CMV26A Neg. CMV17 Neg. CMV47 Neg. CMV27A Neg. CMV18 Neg. CMV50 Neg. CMV28A Neg. CMV20 Neg. CMV49 Neg. CMV69 Neg. CMV21 Neg. CMV48 Neg. CMV70 Neg. CMV22 3 Negativo Neg. CMV21A 7 Positivo Pos. CMV71 11 Negativo Neg. CMV23 Neg. CMV9A Neg. CMV72 Neg. CMV24 Neg. CMV10A Neg. CMV73 Neg. CMV25 Neg. CMV11A Neg. CMV74 Neg. CMV19 Neg. CMV12A Pos. CMV75 Neg. CMV26 Neg. CMV20A Neg. CMV77 Neg. CMV27 Neg. CMV13A Neg. CMV78 Neg. CMV28 Neg. CMV14A Neg. CMV76 Neg. ÁGUA Neg. CMV15A Neg. CMV31A Neg. ÁGUA Neg. CMV18A Neg. CMV32A Neg. CMV29 4 Negativo Neg. CMV51 8 Negativo Neg. CMV29A 12 Negativo Neg. CMV30 Neg. CMV52 Neg. CMV30A Neg. CMV31 Neg. CMV53 Neg. CMV33A Neg. CMV32 Neg. CMV54 Neg. CMV34A Neg. CMV33 Neg. CMV55 Neg. CMV35A Neg. CMV34 Neg. CMV56 Neg. CMV36A Neg. CMV36 Neg. CMV57 Neg. CMV37A Neg. CMV37 Neg. CMV58 Neg. CMV38A Neg. CMV38 Neg. CMV59 Neg. CMV39A Neg. CMV39 Neg. CMV60 Neg. CMV40A Neg.
Nº Amostra Nº Pool Resultado PCR Pool Resultado PCR individual Nº Amostra Nº Pool Resultado PCR Pool Resultado PCR individual Nº Amostra Nº Pool Resultado PCR Pool Resultado PCR individual CMV401 85 Negativo Neg. CMV475A 89 Negativo Neg. CMV490A 93 Negativo Neg. CMV402 Neg. CMV476A Neg. CMV491A Neg. CMV403 Neg. CMV477A Neg. CMV492A Neg. CMV404 Neg. CMV414 Neg. CMV495A Neg. CMV405 Neg. CMV415 Neg. CMV499A Neg. CMV406 Neg. CMV416 Neg. CMV501A Neg. CMV407 Neg. CMV417 Neg. CMV437 Neg. CMV408 Neg. CMV418 Neg. CMV438 Neg. CMV409 Neg. CMV419 Neg. CMV439 Neg. CMV410 Neg. CMV420 Neg. CMV440 Neg. CMV411 86 Negativo Neg. CMV478A 90 Positivo Neg. CMV436 94 Negativo Neg. CMV412 Neg. CMV479A Neg. CMV442 Neg. CMV413 Neg. CMV480A Neg. CMV443 Neg. CMV448A Neg. CMV481A Pos. CMV444 Neg. CMV449A Neg. CMV482A Neg. CMV445 Neg. CMV450A Neg. CMV483A Neg. CMV446 Neg. CMV451A Neg. CMV484A Neg. CMV447 Neg. CMV452A Neg. CMV485A Neg. CMV448 Neg. CMV453A Neg. CMV421 Neg. CMV449 Neg. CMV454A Neg. CMV422 Neg. CMV452 Neg. CMV455A 87 Negativo Neg. CMV423 91 Negativo Neg. CMV497A 95 Negativo Neg. CMV456A Neg. CMV424 Neg. CMV498A Neg. CMV457A Neg. CMV425 Neg. CMV500A Neg. CMV458A Neg. CMV426 Neg. CMV450 Neg. CMV459A Neg. CMV427 Neg. CMV502A Neg. CMV460A Neg. CMV428 Neg. CMV503A Neg. CMV461A Neg. CMV429 Neg. CMV504A Neg. CMV462A Neg. CMV434 Neg. CMV505A Neg. CMV463A Neg. CMV431 Neg. CMV506A Neg. CMV464A Neg. CMV435 Neg. CMV507A Neg. CMV465A 88 Negativo Neg. CMV430 92 Negativo Neg. CMV508A 96 Negativo Neg. CMV466A Neg. CMV432 Neg. CMV509A Neg. CMV467A Neg. CMV433 Neg. CMV510A Neg. CMV468A Neg. CMV486A Neg. CMV511A Neg. CMV469A Neg. CMV487A Neg. CMV512A Neg. CMV470A Neg. CMV488A Neg. CMV513A Neg. CMV471A Neg. CMV489A Neg. CMV441 Neg. CMV472A Neg. CMV493A Neg. CMV451 Neg. CMV473A Neg. CMV494A Neg. CMV453 Neg. CMV474A Neg. CMV496A Neg. CMV454 Neg.
Nº Amostra Nº Pool Resultado PCR Pool Resultado PCR individual Nº Amostra Nº Pool Resultado PCR Pool Resultado PCR individual Nº Amostra Nº Pool Resultado PCR Pool Resultado PCR individual CMV455 97 Negativo Neg. CMV538A 101 Negativo Neg. CMV486 105 Negativo Neg. CMV456 Neg. CMV539A Neg. CMV487 Neg. CMV457 Neg. CMV470 Neg. CMV488 Neg. CMV458 Neg. CMV471 Neg. CMV489 Neg. CMV459 Neg. CMV472 Neg. CMV492 Neg. CMV514A Neg. CMV473 Neg. CMV493 Neg. CMV515A Neg. CMV541A Neg. CMV494 Neg. CMV516A Neg. CMV474 Neg. CMV495 Neg. CMV517A Neg. CMV475 Neg. CMV496 Neg. CMV518A Neg. CMV476 Neg. CMV497 Neg. CMV519A 98 Negativo Neg. CMV542A 102 Negativo Neg. CMV498 106 Positivo Neg. CMV520A Neg. CMV543A Neg. CMV563A Neg. CMV521A Neg. CMV544A Neg. CMV564A Neg. CMV522A Neg. CMV477 Neg. CMV565A Neg. CMV523A Neg. CMV478 Neg. CMV566A Pos. CMV524A Neg. CMV479 Neg. CMV567A Neg. CMV525A Neg. CMV480 Neg. CMV568A Neg. CMV526A Neg. CMV481 Neg. CMV569A Neg. CMV527A Neg. CMV482 Neg. CMV499 Neg. CMV460 Neg. CMV545A Neg. CMV500 Neg. CMV461 99 Negativo Neg. CMV546A 103 Negativo Neg. CMV501 107 Negativo Neg. CMV462 Neg. CMV547A Neg. CMV502 Neg. CMV463 Neg. CMV548A Neg. CMV503 Neg. CMV464 Neg. CMV549A Neg. CMV570A Neg. CMV528A Neg. CMV550A Neg. CMV571A Neg. CMV529A Neg. CMV551A Neg. CMV572A Neg. CMV530A Neg. CMV552A Neg. CMV573A Neg. CMV465 Neg. CMV553A Neg. CMV574A Neg. CMV466 Neg. CMV483 Neg. CMV575A Neg. CMV467 Neg. CMV484 Neg. CMV576A Neg. CMV468 100 Negativo Neg. CMV485 104 Negativo Neg. CMV577A 108 Negativo Neg. CMV469 Neg. CMV554A Neg. CMV504 Neg. CMV531A Neg. CMV555A Neg. CMV505 Neg. CMV532A Neg. CMV556A Neg. CMV506 Neg. CMV533A Neg. CMV557A Neg. CMV578A Neg. CMV534A Neg. CMV558A Neg. CMV579A Neg. CMV535A Neg. CMV559A Neg. CMV580A Neg. CMV536A Neg. CMV560A Neg. CMV581A Neg. CMV537A Neg. CMV561A Neg. CMV508 Neg. CMV540A Neg. CMV562A Neg. CMV509 Neg.
Nº Amostra Nº Pool Resultado PCR Pool Resultado PCR individual Nº Amostra Nº Pool Resultado PCR Pool Resultado PCR individual Nº Amostra Nº Pool Resultado PCR Pool Resultado PCR individual CMV507 109 Negativo Neg. CMV591A 113 Negativo Neg. CMV555 117 Negativo Neg. CMV510 Neg. CMV596A Neg. CMV556 Neg. CMV511 Neg. CMV597A Neg. CMV557 Neg. CMV582A Neg. CMV537 Neg. CMV558 Neg. CMV583A Neg. CMV538 Neg. CMV559 Neg. CMV584A Neg. CMV598A Neg. CMV564 Neg. CMV585A Neg. CMV539 Neg. CMV565 Neg. CMV586A Neg. CMV540 Neg. CMV566 Neg. CMV587A Neg. CMV541 Neg. CMV567 Neg. CMV588A Neg. CMV542 Neg. CMV568 Neg. CMV589A 110 Negativo Neg. CMV599A 114 Negativo Neg. CMV560 118 Negativo Neg. CMV512 Neg. CMV600A Neg. CMV561 Neg. CMV513 Neg. CMV601A Neg. CMV562 Neg. CMV514 Neg. CMV543 Neg. CMV563 Neg. CMV515 Neg. CMV544 Neg. CMV569 Neg. CMV516 Neg. CMV545 Neg. CMV570 Neg. CMV518 Neg. CMV546 Neg. CMV571 Neg. CMV519 Neg. CMV602A Neg. CMV572 Neg. CMV520 Neg. CMV547 Neg. CMV573 Neg. CMV521 Neg. CMV548 Neg. CMV574 Neg. CMV522 111 Negativo Neg. CMV549 115 Negativo Neg. CMV617A 119 Negativo Neg. CMV523 Neg. CMV603A Neg. CMV618A Neg. CMV524 Neg. CMV604A Neg. CMV619A Neg. CMV525 Neg. CMV605A Neg. CMV620A Neg. CMV526 Neg. CMV606A Neg. CMV621A Neg. CMV527 Neg. CMV607A Neg. CMV622A Neg. CMV528 Neg. CMV608A Neg. CMV623A Neg. CMV529 Neg. CMV609A Neg. CMV624A Neg. CMV530 Neg. CMV610A Neg. CMV625A Neg. CMV531 Neg. CMV611A Neg. CMV575 Neg. CMV590A 112 Negativo Neg. CMV612A 116 Negativo Neg. CMV577 120 Negativo Neg. CMV592A Neg. CMV613A Neg. CMV578 Neg. CMV593A Neg. CMV614A Neg. CMV579 Neg. CMV594A Neg. CMV615A Neg. CMV626A Neg. CMV595A Neg. CMV616A Neg. CMV627A Neg. CMV532 Neg. CMV550 Neg. CMV628A Neg. CMV533 Neg. CMV551 Neg. CMV576 Neg. CMV534 Neg. CMV552 Neg. CMV581 Neg. CMV535 Neg. CMV553 Neg. CMV582 Neg. CMV536 Neg. CMV554 Neg. CMV580 Neg.
Nº Amostra Nº Pool Resultado PCR Pool Resultado PCR individual Nº Amostra Nº Pool Resultado PCR Pool Resultado PCR individual Nº Amostra Nº Pool Resultado PCR Pool Resultado PCR individual CMV583 121 Negativo Neg. CMV646A 125 Negativo Neg. CMV664A 129 Negativo Neg. CMV584 Neg. CMV647A Neg. CMV665A Neg. CMV585 Neg. CMV648A Neg. CMV666A Neg. CMV586 Neg. CMV607 Neg. CMV667A Neg. CMV629A Neg. CMV608 Neg. CMV668A Neg. CMV630A Neg. CMV609 Neg. CMV670A Neg. CMV587 Neg. CMV610 Neg. CMV671A Neg. CMV588 Neg. CMV611 Neg. CMV672A Neg. CMV589 Neg. CMV612 Neg. CMV673A Neg. CMV590 Neg. CMV613 Neg. CMV674A Neg. CMV592 122 Negativo Neg. CMV614 126 Negativo Neg. CMV669A 130 Negativo Neg. CMV593 Neg. CMV615 Neg. CMV675A Neg. CMV594 Neg. CMV616 Neg. CMV676A Neg. CMV595 Neg. CMV617 Neg. CMV629 Neg. CMV596 Neg. CMV618 Neg. CMV631 Neg. CMV597 Neg. CMV619 Neg. CMV632 Neg. CMV631A Neg. CMV620 Neg. CMV634 Neg. CMV632A Neg. CMV606 Neg. CMV637 Neg. CMV634A Neg. CMV649A Neg. CMV638 Neg. CMV601 Neg. CMV650A Neg. CMV639 Neg. CMV633A 123 Negativo Neg. CMV651A 127 Negativo Neg. CMV628 131 Positivo Neg. CMV598 Neg. CMV652A Neg. CMV630 Neg. CMV599 Neg. CMV653A Neg. CMV635 Neg. CMV600 Neg. CMV654A Neg. CMV636 Neg. CMV635A Neg. CMV655A Neg. CMV633 Pos. CMV636A Neg. CMV621 Neg. CMV640 Neg. CMV591 Neg. CMV622 Neg. CMV641 Neg. CMV602 Neg. CMV623 Neg. CMV642 Neg. CMV603 Neg. CMV624 Neg. CMV644 Neg. CMV604 Neg. CMV625 Neg. CMV677A Neg. CMV605 124 Negativo Neg. CMV656A 128 Negativo Neg. CMV678A 132 Negativo Neg. CMV637A Neg. CMV626 Neg. CMV679A Neg. CMV638A Neg. CMV627 Neg. CMV680A Neg. CMV639A Neg. CMV657A Neg. CMV681A Neg. CMV640A Neg. CMV658A Neg. CMV682A Neg. CMV641A Neg. CMV659A Neg. CMV683A Neg. CMV642A Neg. CMV660A Neg. CMV684A Neg. CMV643A Neg. CMV661A Neg. CMV685A Neg. CMV644A Neg. CMV662A Neg. CMV686A Neg. CMV645A Neg. CMV663A Neg. CMV687A Neg.
Nº Amostra Nº Pool Resultado PCR Pool Resultado PCR individual Nº Amostra Nº Pool Resultado PCR Pool Resultado PCR individual Nº Amostra Nº Pool Resultado PCR Pool Resultado PCR individual CMV688A 133 Negativo Neg. CMV700A 137 Negativo Neg. CMV692 141 Negativo Neg. CMV643 Neg. CMV701A Neg. CMV693 Neg. CMV645 Neg. CMV667 Neg. CMV694 Neg. CMV646 Neg. CMV668 Neg. CMV695 Neg. CMV647 Neg. CMV669 Neg. CMV696 Neg. CMV648 Neg. CMV670 Neg. CMV697 Neg. CMV649 Neg. CMV671 Neg. CMV698 Neg. CMV650 Neg. CMV673 Neg. CMV699 Neg. CMV651 Neg. CMV674 Neg. CMV700 Neg. CMV652 Neg. CMV675 Neg. CMV701 Neg. CMV653 134 Negativo Neg. CMV676 138 Negativo Neg. CMV702 142 Negativo Neg. CMV654 Neg. CMV677 Neg. CMV703 Neg. CMV655 Neg. CMV678 Neg. CMV704 Neg. CMV656 Neg. CMV679 Neg. CMV705 Neg. CMV657 Neg. CMV680 Neg. CMV706 Neg. CMV658 Neg. CMV681 Neg. CMV707 Neg. CMV659 Neg. CMV682 Neg. CMV721A Neg. CMV689A Neg. CMV707A Neg. CMV722A Neg. CMV690A Neg. CMV708A Neg. CMV723A Neg. CMV691A Neg. CMV709A Neg. CMV724A Neg. CMV692A 135 Negativo Neg. CMV710A 139 Negativo Neg. CMV725A 143 Negativo Neg. CMV693A Neg. CMV711A Neg. CMV726A Neg. CMV660 Neg. CMV712A Neg. CMV727A Neg. CMV661 Neg. CMV713A Neg. CMV728A Neg. CMV662 Neg. CMV714A Neg. CMV729A Neg. CMV663 Neg. CMV715A Neg. CMV708 Neg. CMV664 Neg. CMV716A Neg. CMV709 Neg. CMV665 Neg. CMV717A Neg. CMV710 Neg. CMV666 Neg. CMV718A Neg. CMV711 Neg. CMV694A Neg. CMV719A Neg. CMV735A Neg. CMV695A 136 Negativo Neg. CMV720A 140 Negativo Neg. CMV730A 144 Negativo Neg. CMV696A Neg. CMV683 Neg. CMV731A Neg. CMV697A Neg. CMV684 Neg. CMV732A Neg. CMV698A Neg. CMV685 Neg. CMV733A Neg. CMV699A Neg. CMV686 Neg. CMV734A Neg. CMV702A Neg. CMV687 Neg. CMV736A Neg. CMV703A Neg. CMV688 Neg. CMV712 Neg. CMV704A Neg. CMV689 Neg. CMV713 Neg. CMV705A Neg. CMV690 Neg. CMV714 Neg. CMV706A Neg. CMV691 Neg. CMV715 Neg.
Nº Amostra Nº Pool Resultado PCR Pool Resultado PCR individual Nº Amostra Nº Pool Resultado PCR Pool Resultado PCR individual CMV716 145 Negativo Neg. CMV746 149 Negativo Neg. CMV717 Neg. CMV747 Neg. CMV718 Neg. CMV748 Neg. CMV719 Neg. CMV749 Neg. CMV720 Neg. CMV750 Neg. CMV721 Neg. CMV751 Neg. CMV722 Neg. CMV752 Neg. CMV723 Neg. CMV753 Neg. CMV726 Neg. CMV747A Neg. CMV727 Neg. CMV752A Neg. CMV728 146 Negativo Neg. CMV748A 150 Negativo Neg. CMV729 Neg. CMV749A Neg. CMV730 Neg. CMV750A Neg. CMV731 Neg. CMV751A Neg. CMV732 Neg. ÁGUA Neg. CMV733 Neg. ÁGUA Neg. CMV724 Neg. ÁGUA Neg. CMV725 Neg. ÁGUA Neg. CMV737A Neg. ÁGUA Neg. CMV735 Neg. ÁGUA Neg. CMV734 147 Negativo Neg. CMV736 Neg. CMV737 Neg. CMV738 Neg. CMV739 Neg. CMV738A Neg. CMV739A Neg. CMV740A Neg. CMV741A Neg. CMV742A Neg. CMV743A 148 Negativo Neg. CMV744A Neg. CMV745S Neg. CMV746A Neg. CMV740 Neg. CMV741 Neg. CMV742 Neg. CMV743 Neg. CMV744 Neg. CMV745 Neg.
Anexo VII – Custos associados à utilização de pools de 20 amostras de saliva e pools de 10 amostras versus amostra individual para o rastreio de infeção congénita por HCMV Amostra Individual Pool 10 Pool 20 Processamento 0,56€ 5,21€ 10,42€ Extração de DNA 4,25€ 4,25€ 4,25€ PCR 3,64€ 3,64€ 3,64€ Total 8,45€ 13,10€ 18,31€ Total por amostra 8,45€ 1,31€ 0,92€ O custo associado ao processamento das amostras inclui: tubo de transporte, zaragatoa, meio de transporte, tubo de congelação, pipetas de Pasteur, eppendorfs de 1,5mL e pontas para micropipetas. O custo associado à realização da extração de DNA inclui: o valor dos reagentes do kit utilizado calculado para 1 extração, eppendorfs de 1,5mL e pontas para micropipetas. O custo associado à técnica de PCR inclui: placa de PCR, película transparente, primers F e R, sonda, água ultrapura, LUNA, eppendorfs de 1,5mL (específicos para o PCR, livre de DNAses e RNAses) e pontas para micropipetas.