UNIVERSIDADE NOVA DE LISBOA
INSTITUTO DE HIGIENE E MEDICINA TROPICAL
MESTRADO EM CIÊNCIAS BIOMÉDICAS
Especialidade de Biologia Molecula em Medicina
T opical e In e nacional
A ele ância do ac o de ansc ição Yap5
de Saccha omyces ce e isiae na
espos a ao excesso de e o
C is ina Ma ia Teixei a Vicen e
2010
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UNIVERSIDADE NOVA DE LISBOA
INSTITUTO DE HIGIENE E MEDICINA TROPICAL
A ele ância do ac o de ansc ição Yap5
de Saccha omyces ce e isiae na
espos a ao excesso de e o
C is ina Ma ia Teixei a Vicen e
Tese ap esen ada pa a ob enção do g au de Mes e
em Ciências Biomédicas, especialidade de Biologia
Molecula em Medicina T opical e In e nacional.
O ien ado :
P o ª Dou o a Claudina Rod igues-Pousada
2010
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O abalho desc i o nes a ese oi elabo ado no
Labo a ó io de Genómica e S ess,
Ins i u o de Tecnologia Química e Biológica,
Uni e sidade No a de Lisboa
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“Wha is a scien is a e all? I is a cu ious man looking h ough a keyhole,
he keyhole o na u e, ying o know wha ’s going on.”
Jacques-Y es Cous eau
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Ag adecimen os
À P o esso a Dou o a Claudina Rod igues-Pousada po odo o igo e conhecimen o
cien í ico demons ado no deco e des e es udo, pela o ien ação e amizade.
À Ca a ina Pimen el po odo o empenho, pela amizade e pela ajuda imp escindí el na
elabo ação da p esen e ese.
A odos os meus colegas de labo a ó io pelo companhei ismo e bons momen os ao longo de
odo o p ocesso e pela ajuda pon ualmen e necessá ia du an e o abalho expe imen al.
À Ca olina pela o ça e apoio incondicional.
E à minha amília, que mesmo longe, semp e me apoiou.

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Pala as-cha e
Saccha omyces ce e isiae; espos a ao s ess; e o; homeos ase; Yap5; CCC1
Resumo
A capacidade que os o ganismos possuem de al e a os seus pad ões de exp essão de genes
em espos a a al e ações no meio ambien e é essencial pa a a sua iabilidade. A le edu a
Saccha omyces ce e isiae, em pa icula , possui um p og ama complexo e mui o lexí el de
exp essão de genes quando expos a a mudanças ag essi as do seu meio ambien e. As células
man êm a sua homeos ase a a és de mecanismos coo denados de egulação de á ios ac o es de
ansc ição, cada um desempenhando unções especí icas.
Nes e abalho oi es udada a ele ância do ac o de ansc ição da amília Yap de S.
ce e isiae, o Yap5, na des oxi icação do excesso de e o na célula.
Os esul ados ob idos nes e abalho mos am que após a incubação com ele adas
quan idades de sul a o de e o, embo a o po encial de ansac i ação do Yap5 aumen e, os ní eis
da p o eína diminuem, sendo es a diminuição dependen e da concen ação de e o.
Demons ámos ambém que embo a a exp essão do gene CCC1 (que codi ica pa a o único
anspo ado acuola de e o conhecido) seja dependen e do Yap5 em condições de excesso de
e o, os ní eis basais de exp essão des e gene são su icien es pa a a sob e i ência nessas
condições.
Obse ámos ainda que, ao con á io do que acon ece em Schizosaccha omyces pombe, o
ac o de ansc ição Hap4, não pa ece es a en ol ido nes a egulação. A a és de delecções
sequenciais da egião p omo o a do CCC1, e i icámos que os ní eis de exp essão di ados po uma
egião de 58pb a mon an e do codão de iniciação, ATG, são su icien es pa a a célula sob e i e sob
concen ações ele adas de e o. Ve i icámos ainda que a egião 3’UTR do gene é impo an e pa a a
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sob e i ência celula . Nessa egião, iden i icámos uma es u u a em o ma de “hai pin” que pode á
es a en ol ida na egulação do gene.
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Keywo ds
Saccha omyces ce e isiae; s ess esponse; i on; homeos asis; Yap5; CCC1
Abs ac
The abili y o he o ganisms o al e hei gene exp ession pa e ns in esponse o
en i onmen al changes is essen ial o iabili y. In pa icula , Saccha omyces ce e isiae possesses a
e y lexible and complex p og amme o gene exp ession when exposed o a ple ho a o
en i onmen al insul s. Cells main ain hei homeos asis h ough a highly coo dina ed mechanism o
ansc ip ion egula ion in ol ing se e al ac o s, each pe o ming speci ic unc ions.
In his wo k, using se e al S. ce e isiae mu an s ains, we s udied he in luence o he Yap
amily membe , Yap5 in i on de oxi ica ion unde i on o e load condi ions.
The esul s ob ained in his wo k show ha a e incuba ion wi h high i on concen a ions,
al hough he ansac i a ion po en ial o Yap5 inc eases, he p o ein le els dec ease in a way ha is
dependen on he in ensi y o he s ess.
We demons a ed ha he exp ession o he CCC1 gene ( ha encodes o he only known
i on acuola anspo e ) is no ully dependen on Yap5 since basal exp ession le els o his gene
a e enough o o e come i on oxici y.
We showed ha in con as o wha happens in Schizosaccha omyces pombe, he Hap4
ansc ip ion ac o is no egula ing CCC1 exp ession. Th ough sequen ial dele ions o CCC1
p omo e egion we delimi ed a egion o 58bp ups eam he ini ia ion codon, ATG, which is
enough o endow cells wi h he abili y o g ow unde i on o e load condi ions. Wi hin his egion,
we iden i ied a hai pin s uc u e, which is localized immedia ely a e he s op codon, and ha
migh be impo an in CCC1 gene egula ion.
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Lis a de Ab e ia u as e Unidades
ºC G aus Celsius
A Adenina
AP-1 P o eína Ac i ado a 1
BSA Albumina de So o Bo ino
bZIP Domínio Básico de Ligação ao DNA
C Ci osina
dATP 2’-desoxiadenosina-5’- i os a o
dCTP 2’-desoxici idina-5’ i os a o
DMSO Dime ilsul óxido
DNA Ácido Desoxi ibonucleico
OD600nm Densidade Óp ica a 600 nanóme os
dTTP 2’-desoxi imidina-5’- i os a o
EDTA Ácido E ilenodiamina e acé ico
FeSO4 Sul a o de Fe o
FP “ ull p omo e ”
G Guanina
G x Glu a edoxina
HEPES 4-(2-hyd oxye hyl)-1-pipe azinee hanesul onic acid
Hsp “Hea Shock P o ein”
LB Lu ia-Be ani
M Mola (mol/L)
mM Mili Mola
MOPS “3-(N-mo pholino)p opanesul onic acid”
mRNA RNA mensagei o
MSC Meio Sin é ico Comple o
Capí ulo I – In odução
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I.1 - Saccha omyces ce e isiae - um modelo euca io a no es udo da espos a ao s ess
Na Na u eza, os o ganismos são con inuamen e subme idos a á ios s esses, is o é, ápidas e
b uscas a iações no meio ambien e que podem al e a as suas unções celula es e a é mesmo
impedi o seu c escimen o. A manu enção de um es ado de equilíb io, homeos ase, o nou-se
en ão um desa io cons an e e manda ó io de o ma a ga an i a sob e i ência dos o ganismos
quando expos os a di e sos s esses. São exemplos de s ess as mudanças de empe a u a, de
osmola idade, exposição a compos os óxicos, ca ência de nu ien es, i adiação, dissecção,
en e ou os (Gasch and We ne -Washbu ne, 2002).
O es udo das espos as aos di e en es s esses é c ucial pa a a comp eensão do modo como
os o ganismos uni e mul icelula es se adap am às e e idas al e ações. Es as espos as eque em
um complexo sis ema de econhecimen o e ansdução de sinal que esul am no aumen o da
exp essão de genes que codi icam pa a p o eínas en ol idas na espos a ao s ess em ques ão, as
chape ones molecula es (Rod igues-Pousada e al., 2005).
Es as p o eínas, de a iadas massas molecula es, con e em à célula mecanismos de
p o ecção ais como a deg adação de p o eínas mal o madas que ap esen am p op iedades
óxicas. Simul aneamen e, a sín ese p o eica cons i u i a é ep imida a a és de á ios
mecanismos, pa icula men e ao ní el da iniciação des a sín ese e/ou ao ní el da es abilidade
dos mRNAs. A exis ência des es mecanismos molecula es de espos a ao s ess, mui os dos
quais al amen e conse ados ao longo da na u eza, o necem à célula a lexibilidade necessá ia
pa a se adap a às di e sas a iações do meio ambien e que a odeia.
A le edu a Saccha omyces ce e isiae, ulga men e conhecida po “ e men o de padei o”
(“bake yeas ”) é conside ada um o ganismo modelo no es udo dos mecanismos de espos a ao
s ess. Apesa de se um o ganismo unicelula , como euca io a ap esen a uma o ganização
in acelula complexa e consequen emen e mecanismos complexos de egulação da exp essão
gené ica al como nos o ganismos mul icelula es. A u ilização de le edu as como modelo
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Capí ulo I – In odução
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expe imen al ap esen a inúme as an agens - a S. ce e isiae é de ácil manipulação gené ica,
em um empo de ge ação cu o e o seu genoma es á comple amen e sequenciado, o que pe mi e
uma iden i icação ápida dos genes en ol idos na espos a ao s ess, bem como a comp eensão
de de e minados mecanismos molecula es u ilizados pelos mamí e os na egulação de di e sos
ipos de s ess, ais como o s ess oxida i o, que pode es a associado a doenças
neu odegene a i as, má ci culação sanguínea, canc o, anemia, desen ol imen o ano mal dos
ossos e do sis ema ne oso bem como espos as imunes de icien es.
De ac o, S. ce e isiae con ém quase duzen os genes o ólogos aos que causam doença em
o ganismos euca io as supe io es. Exemplo dis o é o gene YCF1, que con e e esis ência ao
cádmio, e cuja sequência ap esen a g ande homologia com a dos memb os da supe amília de
anspo ado es ATP em humanos, M p1 e C 1, ambos en ol idos na doença ib ose cís ica (Li
e al., 1996; Li e al., 1997). Ou o exemplo são os genes PAT1 e PAT2, que codi icam pa a as
subunidades de um anspo ado pe oxisomal, necessá io pa a a impo ação de ácidos go dos de
cadeia longa pa a o pe oxisoma. Es es genes são o ólogos do gene ALD em humanos que
quando mu ado es á associado à doença neu odegene a i a pe oxisomal que a ec a o
c omossoma X - a ad enoleucodis o ia (ALD) (He ema e al., 1996). Também êm e elado se
um excelen e modelo pa a es uda ce os ipos de doenças neu odegene a i as (Khu ana and
Lindquis , 2010).
I.2 Fac o es de ansc ição en ol idos na espos a ao s ess
Embo a sejam conhecidos o Hsp1 e o Msn2 e Msn4 como ac o es de ansc ição en ol idos
na espos a ao s ess, nes e abalho apenas nos concen ámos na amília Yap.
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Capí ulo I – In odução
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I.2.3 A amília Yap (“Yeas Ac i a o P o ein”)
Todos os o ganismos euca io as desde as le edu as a é aos humanos con êm ac o es de
ansc ição AP-1 que egulam a exp essão de classes especí icas de genes em espos a a uma
g ande a iedade de es ímulos ex acelula es. Po de inição, as p o eínas AP-1 con êm um
domínio bZIP de ligação ao DNA. Es e domínio bZIP (“Basic egion leucine zippe ”) consis e
numa es u u a o mada po duas hélices α con endo leucinas de ambos os lados ao longo de
cada uma das hélices e que es á en ol ida na dime ização e o mação de uma in e ace
simé ica de ligação a sequências al o da dupla cadeia de DNA denominadas “AP-1 si es”
(TGACTCA) (Fig.I-1) (Coleman e al., 1997; Fe nandes e al., 1997; Toone and Jones, 1999).
Na le edu a S. ce e isiae o ac o de ansc ição AP-1 melho ca ac e izado é o Gcn4, que
ac i a coo denadamen e a ansc ição de pelo menos 40 genes em espos a a ca ência de
aminoácidos e ou as ci cuns âncias ambien ais.
Figu a I-1 Ligação ao DNA do ac o de ansc ição Gcn4
(h p://www.bio.jhu.edu/Facul y/P i alo /De aul .h ml)
Gcn4, Me 28, Ac 1/Sko1 e Hac1 são alguns dos 14 ac o es de ansc ição bZIP
iden i icados em S. ce e isiae, dos quais, oi o pe encem a amilia Yap (Yap1 - Yap8)
(Fe nandes e al., 1997).
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235 238 242 253 260 267 274 281
239 243
Figu a I-2 Compa ação da sequência dos domínios bZIP dos oi o memb os YAP de S. ce e isiae com as
egiões co esponden es do Gcn4 e o ólogos em Schizosaccha omyces pombe (Pap1) e Candida albicans
(Cap1). Na egião básica, os esíduos que in e agem di ec amen e com os pa es de bases (neg i o de amanho
in e io ) e os esíduos especí icos dos YAPs (neg i o de amanho supe io ) são indicados. Na egião “leucine
zippe ”, os esíduos de leucina conse ados e ou os, na posição d da es u u a “coiled coil” es ão a neg i o e
os esíduos na posição a da mesma es u u a, es ão sublinhados (Fe nandes e al., 1997).
No caso das p o eínas Yap1-Yap4, o domínio de ligação ao DNA oi ca ac e izado como
TTAC/GTAA, o qual di e e do Gcn4 (TGAG/CTCA) (Rod igues-Pousada e al., 2004). O
domínio de ligação ao DNA do Yap5 oi iden i icado como sendo TTACTAA (Li e al., 2008).
No caso do Yap8, no en an o, oi iden i icada uma sequência de 13pb especí ica:
TGATTAATAATCA (Ilina e al., 2008) (Ama al e al, esul ados não publicados). Não o am
ainda iden i icados domínios de ligação especí icos pa a as p o eínas Yap3 e Yap7.
Os memb os Yap1 e Yap2 da amília Yap ap esen am g ande homologia en e si, o Yap4
com o Yap6 e o Yap5 com o Yap7, sendo o Yap8 o elemen o menos elacionado com os
es an es memb os da amília (Fig. I-3).
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Figu a I-3 Relação ilogené ica en e os di e en es
memb os da amília Yap e sequências nucleo ídicas dos
seus domínios de ligação ao DNA (Tan e al., 2008).
Vá ios es udos êm demons ado que a amília Yap es á en ol ida numa g ande quan idade
de espos as ao s ess, incluindo o s ess oxida i o (Yap1), cádmio (Yap2), osmó ico (Yap4 e
Yap6), a sénico (Yap1 e Yap8), é mico (Yap1), a uma a iedade de d ogas, en e ou os. Aos
memb os Yap3 e Yap7 não oi ainda a ibuída uma unção especí ica (Rod igues-Pousada e al.,
2010). O Yap5, ecen emen e oi associado à espos a ao excesso de e o (Li e al., 2008;
Kaplan and Kaplan, 2009) e cons i ui o objec o de es udo des e abalho, pelo que lhe
dedica emos pa icula a enção.
I.2.3.1 – O Yap 5 na espos a ao excesso de e o – es ado da a e
O e o é um dos me ais mais abundan es na Te a e é essencial pa a a g ande maio ia das
o mas de ida. Es e elemen o az pa e in eg al de á ias p o eínas e enzimas, sendo em
humanos, um componen e essencial das p o eínas en ol idas no anspo e de oxigénio
(Dallman, 1986; Medicine, 2001).
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Capí ulo I – In odução
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As células euca ió icas (e a maio pa e dos o ganismos p oca ió icos) eque em e o, pa a
sob e i e e p oli e a , como cons i uin e de hemop o eínas, p o eínas com clus e s de e o-
enxo e (Fe-S) e p o eínas que u ilizam e o nou os g upos uncionais pa a assegu a as
unções undamen ais pa a o me abolismo celula . A ca ência des e elemen o nas células
bloqueia o seu c escimen o e pode le a a mo e celula (Hen ze e al., 2004).
A impo ância biológica do e o é la gamen e a ibuída às suas p op iedades químicas como
me al de ansição, que p on amen e, se en ol e em eacções de oxidação- edução en e o seu
es ado é ico (3+) e e oso (2+). Con udo, a mesma p op iedade química explica ambém a
oxicidade pa a a célula de i ada de um excesso de e o eac i o li e. No ci oplasma, uma
acção signi ica i a de e o é eduzida e pode pa icipa em eacções de Fen on:
Fe2+ + H2O2 → Fe3+ + OH▪ + OH-
Nes a, a oxidação do Fe2+ a Fe3+ pelo pe óxido de hid ogénio p o oca a libe ação de
adicais hid oxilo (OH▪) que dani icam memb anas lipídicas, p o eínas e ácidos nucleicos
(Halliwell and Gu e idge, 1992).
A p esença des e elemen o em ele adas concen ações pode se óxica. No homem, a
hemoc oma ose é uma doença que se aduz num depósi o des e me al em á ios ó gãos, como o
ígado, o pânc eas, o co ação e a hipó ise, le ando à pe da p og essi a da sua unção (Rouaul ,
2003; Dunn e al., 2007).
Des e modo, e uma ez que an o a ca ência como o excesso de e o no o ganismo
p o ocam a mo e celula , os ní eis de e o eac i o êm que se cuidadosamen e con olados e
limi ados ao ní el da sua in e nalização, a mazenamen o e dis ibuição in acelula (Hen ze e
al., 2004).
Também em le edu as êm sido es udados os mecanismos en ol idos na espos a ao s ess
p o ocado po es e me al. A le edu a S. ce e isiae consegue p ospe a num ambien e com
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Capí ulo I – In odução
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escassez ou excesso de e o e sob e i e a g andes lu uações de disponibilidade des e
elemen o. A espos a à dep i ação de e o es á pa icula men e bem es udada e consis e
essencialmen e em 3 e en es: (i) ac i ação dos sis emas de in e nalização de e o, (ii)
mobilização de e o a mazenado na célula, e (iii) adap ação me abólica à concen ação
limi an e de e o. Além disso, a espos a apa en emen e é g adual, na medida em que di e en es
g aus de dep i ação de e o despole am espos as de di e en es in ensidades, sendo es a
espos a mediada maio i a iamen e a a és de al e ações ao ní el da ansc ição (Philpo and
P o chenko, 2008).
Em S. ce e isiae, a espos a à de iciência de e o é mediada po um ac o de ansc ição
dependen e de e o, A 1p (Yamaguchi-Iwai e al., 1995; Yamaguchi-Iwai e al., 1996). A 1 é
cons i u i amen e exp esso e quando os ní eis de e o in acelula diminuem, es e ac o
concen a-se no núcleo ac i ando a ansc ição de uma ba e ia de genes-al o e pe mi indo des a
o ma uma adap ação ápida do o ganismo ao ambien e que o odeia (Yamaguchi-Iwai e al.,
2002).
A egulação da localização celula do A 1 eque a p esença das mono iol-glu a edoxinas
G x3 e G x4 (Ojeda e al., 2006; Pujol-Ca ion e al., 2006). As glu a edoxinas são pequenas
p o eínas que ac uam como iol oxi edu ases, sendo esponsá eis po man e o equilíb io edox
ao ní el celula , a a és da edução de pon es dissul ídicas (He e o e al., 2008).
A le edu a S. ce e isiae possui duas di iol-glu a edoxinas (G x1 e G x2) e ês mono iol-
glu a edoxinas (G x3, G x4 e G x5) (He e o e al., 2008). G x1 localiza-se no ci oplasma e
con e e à célula p o ecção ela i amen e ao anião supe óxido e ao pe óxido de hid ogénio,
enquan o G x2 se encon a no ci oplasma e na mi ocônd ia e con e e p o ecção apenas ao
pe óxido de hid ogénio. G x3 e G x4 êm localização nuclea e como unção egula a
localização celula do ac o de ansc ição A 1. Po sua ez, G x5 es á en ol ido na sín ese de
cen os Fe/S na mi ocônd ia.
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Capí ulo I – In odução
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Es u u almen e, G x3 e G x4 ap esen am dois domínios dis in os: io edoxina (T x) e
glu a edoxina (G x). O p imei o é C- e minal e es á elacionado com a p esença de G x4 no
núcleo, mas não necessa iamen e com o con olo da ac i idade de A 1, sendo es a unção
exe cida pelo domínio G x, N- e minal. Obse ou-se que G x3, G x4 e A 1 o mam um
complexo nuclea , sendo que a ligação en e cada dois dos ês memb os do complexo não
depende do e cei o memb o. A 1 liga-se aos domínios G x e T x de G x3 e G x4 (Pujol-
Ca ion e al., 2006).
A sob exp essão de G x4 inibe a ac i idade de A 1 no núcleo e a sua ausência, bem como
de G x3 pe mi e uma deslocação pa cial de A 1 do ci oplasma pa a o núcleo e ac i a
consequen emen e a ansc ição dos genes en ol idos na dep i ação de e o (He e o e al.,
2008; Li e al., 2009). O mecanismo a a és do qual é pe cepcionada a ca ência do elemen o
e o, pe manece no en an o ainda po explica (Yamaguchi-Iwai e al., 1996; Philpo and
P o chenko, 2008).
Ao con á io do que acon ece na de iciência de e o, os mecanismos subjacen es à espos a
ao excesso de e o êm sido pouco es udados. É conhecido que o anspo e de e o do
ci oplasma pa a o acúolo é mediado po um impo ado iden i icado em plan as e ungos, o
Ccc1 (Li e al., 2001). Li e al. demons a am cla amen e que CCC1 codi ica pa a um
anspo ado que conduz à acumulação de e o no acúolo e que a sua delecção esul a numa
diminuição da quan idade de e o acuola a mazenado, o que po sua ez a ec a os ní eis de
e o no ci oplasma e o c escimen o celula (Li e al., 2001). Recen emen e, os mesmos au o es
demons a am ambém que a exp essão de CCC1 é con olada apenas pelo ac o de ansc ição
Yap5 (Li e al., 2008). Os au o es demons a am que a delecção des e ac o de ansc ição
impede a sob e i ência celula num meio com excesso de e o. Foi demons ado ainda que o
Yap5 é cons i u i amen e nuclea , ocupando a egião p omo o a do gene CCC1, e que os ní eis
de exp essão de Yap5 se man êm cons an es independen emen e da concen ação de e o mas o
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Capí ulo I – In odução
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po encial de ansac i ação des e ac o de ansc ição é dependen e des a concen ação (Figu a
I-4).
Objec i os
Es e abalho e e como objec i o o es udo do ac o de ansc ição Yap5 na p esença de
concen ações óxicas de e o e, a a és dos seus genes-al o, nomeadamen e o CCC1, en a
en ende o seu mecanismo de egulação.
Figu a I-4 Modelo de egulação do gene CCC1
p
elo Yap5 na p esença de e o. O Yap5 ocup
a
cons i u i amen e a egião p omo o a do gene CCC1, e o e o em ele adas concen ações
p
o oca a modi icação das ligações sul id ilo, p omo endo des a o ma uma al e ação
con o macional do Yap5, le ando ao aumen o da ac i idade ansc ipcional do gene CCC1 e
consequen emen e da impo ação de e o pa a o acúolo. Baixas concen ações de e o
in acelula le am à diminuição da ac i idade ansc ipcional do Yap5 e, consequen emen e do
gene CCC1. Po ou o lado, à medida que a concen ação de e o no ci oplasma diminui, o
ac o de ansc ição A 1 é ac i ado. Os seus mais de 20 genes-al o que inclue
m
anspo ado es de memb ana celula e acuola , le am a um aumen o da concen ação de e o
no ci oplasma. Es e ac o de ansc ição induz ambém a exp essão do C h2, que se liga ao
mRNA do gene CCC1, des abilizando-o. A não ansc ição do gene CCC1 aliado a diminuição
da es abilidade do seu mRNA diminui o anspo e de e o pa a o acúolo, podendo des a o m
a
conclui -se que a homeos ase do e o na célula é man ida a a és da coo denação da exp essão
dos anspo ado es de e o da memb ana celula e acuola (adap ado de (Li e al., 2008)).
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Ma e iais e
Mé odos
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Capí ulo II
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Capí ulo II – Ma e iais e Mé odos
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(s ock 10X: T is 250mM, glicina 2M e 1% (w/ ) de SDS). A elec o o ese oi ealizada no
sis ema BioRad Mini-P o ean II e deco eu a 100V em ampão de co ida SDS-PAGE 1X a é as
amos as a ingi em o inal do gel.
Após a elec o o ese, o gel con endo as amos as de p o eína oi imedia amen e embebido
em ampão de ans e ência du an e 10 minu os. T ês olhas de papel 3MM (Wha man) do
amanho do gel o am p e iamen e embebidas no mesmo ampão de ans e ência e colocadas
no ânodo do apa elho de ans e ência “ATTA T ans-Blo SD T ans e Cell”. A memb ana de
ni ocelulose p e iamen e ime sas ambém em ampão de ans e ência oi colocada em cima
das olhas de papel 3MM e o gel oi colocado sob mais 3 olhas de papel 3MM. O cá odo oi
colocado sob e a mon agem de ans e ência e a co en e eléc ica oi ajus ada pa a 20V du an e
1 ho a. A e iciência da ans e ência das p o eínas oi assegu ada incubando-se a memb ana
com solução Ponceau S (30% (w/ ) TCA e 30% (w/ ) ácido sul osalicílico diluída 1:10 com
água bides ilada es é il).
A memb ana de ni ocelulose oi ime sa numa solução T1 (PBS 1X, 0,1%Tween 20) com
5% (w/ ) de lei e em pó e incubada à empe a u a ambien e du an e 1 ho a, com agi ação len a
de o ma a bloquea -se a abso ção não-especí ica de eagen es imunológicos. A memb ana oi
la ada com a mesma solução e incubada com o an ico po especí ico (an i-HA e p23) sendo que
o empo de incubação dependeu do an ico po usado. Pos e io men e a memb ana oi la ada ês
ezes du an e 10 minu os com solução T1 e incubada com o an ico po secundá io nos casos em
que oi necessá io (an i-p23). Finalmen e, a de ecção oi ealizada usando o sis ema de de ecção
químio-luminescen e ECL (Ame sham, Pha macia). A memb ana oi en ão expos a a um ilme
au o adiog á ico (Hype ilm MP, Ame sham).
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Capí ulo II – Ma e iais e Mé odos
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34
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Es i pe Genó ipo Fon e
Byα By4742; MATα; his3∆1; leu2∆0; lys2∆0; u a3∆0 EUROSCARF
yap5 By4742; MATα; his3∆1; leu2∆0; lys2∆0; u a3∆0; YIR018w::kanMX4 EUROSCARF
yap5a BY4741; MATa; his3∆1; leu2∆0; me 15∆0; u a3∆0; YIR018w::kanMX4 EUROSCARF
ccc1 By4742; MATα; his3∆1; leu2∆0; lys2∆0; u a3∆0; YLR220w::kanMX4 EUROSCARF
hap4 By4742; MATα; his3∆1; leu2∆0; lys2∆0; u a3∆0 Es e abalho
yap5hap4 By4742; MATα; his3∆1; leu2∆0; lys2∆0; u a3∆0; YIR018w::kanMX4 Es e abalho
yap5ccc1 By4742; MATα; his3∆1; leu2∆0; lys2∆0; me 15∆0; u a3∆0; YLR220w::kanMX4 Es e abalho
Tabela II-1 Es i pes de S.ce e isiae u ilizadas
P ime Sequência U ilização
A1_CCC1 5’TACAGGACCAAACCCCTCAG3’ Clonagem do
CCC1 e PCR
A4_CCC1 5’GGCCTCTTGGCAATAGAAAA3’
CCC1_ wd 5’AACGCAGTGGTGACCCTTAT3’ No he n
Blo
CCC1_ e 5’ACCACCCACAACAACCATTT3’
pCCC1_-58 5’TGGTATATTGAACAAAGAAA3’
Delecção das
egiões
p omo o a e
e minado a
do CCC1
pCCC1_-90 5’GAACGAAGCCTTTAGACTCT3’
pCCC1_-114 5’GGTTTATAGAATAGAAATATAAC3’
pCCC1_-123 5’GTTAAAGCGACATCACTCTC3’
pCCC1_-198 5’GATTATATATGAAAAATTGATACAAAAC3’
pCCC1_-240 5’CTTTGTTAGCCCGAATGTCTC3’
pCCC1_-261 5’GTGACCCGCATTTTTTGTTTT3’
pCCC1_-s op 5’TTAACCCAGTAACTTAACAAAG3’
Hap4_KO_ wd 5’ATGACCGCAAAGACTTTTCTACTACAGGCCTCCGCTAGTATCGTACGCTGCAGG3’ Delecção do
HAP4
Hap4_KO_ e 5’TCAAAATACTTGTACCTTTAAAAAATCGACATCTTCGTCTTAGGGAGACCGGCAGAT3’
Hap4_SD_ wd 5’CTTTAGACTCTTTTTTTTATTTATATTGAACAAAGAAAC3’ Mu agénese
di igida
Hap4_SD_ e 5’GTTTCTTTGTTCAATATAAATAAAAAAAAGAGTCTAAAG3’
A1_Yap5 5’CAAAACTGTGGTGTTAG3’ Clonagem do
YAP5
A4_Yap5 5’GAATGTATAGGCATAGTAAG3’
Yap5_HA_ wd 5’CCGGTCCATCATCCACATGTACCCATACGATGTTCCAGATTACGCTTGAAGAGAGAGAACTTCTTAATAC3’ Wes e n Blo
Yap5_HA_ e 5’GTATTAAGAAGTTCTCTCTCTTCAAGCGTAATCTGGAACATCGTATGGGTACATGTGGATGATGGACCGG3’
Tabela II-2 P ime s u ilizados nes e abalho
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Capí ulo III
Resul ados e
Discussão
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Capí ulo III – Resul ados e Discussão
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36
Nes e abalho p e endemos es uda a impo ância do ac o Yap5 na homeos ase do e o,
bem como a egulação da exp essão do gene CCC1.
III.1 – A exp essão do Yap5 diminui na p esença de ele adas concen ações de
e o.
Todos os memb os da amília Yap a é ago a es udados es ão incluídos numa de duas classes:
(i) ac o es cons i u i amen e nuclea es com egulação ao ní el ansc icional após o s ess –
Yap4 e Yap6 (Ne i e al., 2004) – (ii) ac o es ci oplasmá icos com localização nuclea após o
s ess – Yap1, Yap2 e Yap8 (Rod igues-Pousada e al., 2010). No que se e e e ao Yap5, Li e al
demons a am que o Yap5 em localização nuclea cons i u i a (Li e al., 2008).
De o ma a a e igua se à semelhança dos Yaps 4 e 6, a exp essão do Yap5 aumen a após o
s ess, moni o izámos po wes e n blo a exp essão do Yap5 conjugado com o epí opo HA. Os
nossos esul ados demons am cla amen e que a exp essão do Yap5 diminui após a incubação
du an e 30 e 60 minu os com 2mM de sul a o de e o ( igu a III-1).
Figu a III-1 Exp essão do Yap5 em células d
a
es i pe yap5 ans o madas com a cons ução
Yap5_HA quando expos as a 2mM de sul a o de
e o du an e 30 e 60 minu os.
A análise da exp essão do Yap5 pa a in e alos de empo mais cu os ( igu a III-2) e elou
que após 5 minu os de incubação com e o já se obse a uma diminuição acen uada dos ní eis
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Capí ulo III – Resul ados e Discussão
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37
da p o eína. Após o s ess, a exp essão do Yap5, ao con á io do Yap4 e Yap6, diminui pa a além
dos ní eis basais de exp essão.
Figu a III-2 Exp essão de Yap5 em células da es i pe yap5
ans o madas com a cons ução Yap5_HA quando expos as
a
2mM de sul a o de e o du an e os empos indicados.
Figu a III-3 Exp essão de Yap5 em células da es i pe yap5
ans o madas com a cons ução Yap5_HA quando expos as
a 5mM de sul a o de e o du an e os empos indicados.
Ve i icámos ainda que a exp essão de Yap5 ao longo do empo diminui de uma o ma mais
acen uada com o aumen o da concen ação de sul a o de e o ( igu a III-3).
Pa a a e igua se a egulação da exp essão do Yap5 é ansc icional ou pós- ansc icional,
ealizámos ensaios de no he n blo com sondas especí icas pa a o Yap5. No en an o, mesmo no
pon o sem s ess não de ec amos exp essão do gene. É possí el que al seja de ido a uma baixa
exp essão des e, pelo que expe iências de PCR em empo eal com p ime s especí icos pa a o
Yap5 (uma écnica mais sensí el) es ão em cu so.
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Capí ulo III – Resul ados e Discussão
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38
Nes e abalho, a a és de uma abo dagem di ec a, medimos o po encial de ansac i ação do
Yap5 na p esença de e o. A ac i idade do gene epó e lacZ sob o con olo de uma p omo o a
com a sequência de ligação do LexA oi medida em células que co-exp essa am a quime a Lex-
Yap5. A ac i idade do epó e aumen a após incubação com e o ( igu a III-4). Os nossos
esul ados co obo am os de Li e al que a a és de um mé odo indi ec o ambém e i ica am
que o po encial de ansac i ação do Yap5 aumen a após o s ess (Li e al., 2008).
Figu a III-4 Po encial de ansac i ação do Yap5 na p esença de e o. Células co-exp essando
a quime a Lex-Yap5 e uma casse e epó e con endo o gene lacZ sob o con olo de um
a
p omo o a com a sequência de ligação do LexA o am c escidas em meio líquido na ausência ou
p esença (incubação de 20 minu os) de sul a o de e o. Os alo es da ac i idade β-galac osidase
(média de ês ans o man es independen es) o am no malizados pa a OD600.
O po encial de ansac i ação do Yap5 aumen a d as icamen e na p esença de e o, após 20
minu os de incubação com 2mM de sul a o de e o. No en an o, nesse pon o os ní eis de
p o eína es ão diminuídos ( igu a III-2) Assim, como o Yap5 é cons i u i amen e nuclea (Li e
al., 2008) e como o seu po encial de ansac i ação é mui o al o na p esença de e o ((Li e al.,
2008) e igu a III-4), a diminuição d ás ica dos ní eis da p o eína ( igu a III-2) pode á se a
o ma que a célula possui de egula /modula a ac i idade des e ac o de ansc ição.
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Capí ulo III – Resul ados e Discussão
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39
III.2 – O c escimen o do mu an e yap5 é apenas ligei amen e a ec ado na p esença
de ele adas concen ações de e o.
Li e al demons a am ainda que o Yap5, uma ez ac i ado pelo e o le a ao aumen o da
exp essão do CCC1, o único anspo ado acuola de e o em le edu as, ajudando des a o ma
a es abelece a homeos ase des e elemen o (Li e al., 2008). No en an o, a sensibilidade exibida
pelo mu an e ccc1 quando expos o a ele adas concen ações de e o é mui o supe io quando
compa ada com a sensibilidade do mu an e yap5 ( igu a III-5).
Figu a III-5 C escimen o das es i pes mu an es e sel agem (By4742) du an e 48h ou 24h (*) em meio
sin é ico comple o sólido suplemen ado com 1mM, 6mM e 15mM de sul a o de e o.
A sensibilidade do mu an e ccc1 é no ó ia quando as células são c escidas em meio
con endo concen ações de sul a o de e o iguais ou supe io es a 6mM. O c escimen o do
mu an e yap5 é ligei amen e comp ome ido quando a concen ação de sul a o de e o a inge
20mM.
Ao a alia mos a exp essão de CCC1 como espos a ao e o e i icámos que es e gene é
mediado pelo Yap5, sendo es a espos a dependen e da concen ação de e o no meio ( igu a III-
6 A e B).
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Capí ulo III – Resul ados e Discussão
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40
Figu a III-6 Exp essão do gene CCC1 em células da es i pe sel agem e yap5 quando expos as a
di e en es concen ações c escen es de sul a o de e o du an e 20 minu os (A). A indução do CCC1 e
m
condições de p esença de e o é dependen e do Yap5. Células “wild ype” e mu an es yap5 o am
induzidas com 2mM FeSO
4
, ecolhidas nos empos indicados e analisou-se a exp essão génica po
N
o he n blo (B).
No conjun o, odos es es dados suge em que (i) na ausência do Yap5 uma possí el ia
al e na i a, independen e do CCC1, pode á se ac i ada, ou (ii) os ní eis basais de exp essão do
CCC1 independen es de e o ( igu a III-6) são su icien es pa a pe mi i o seu c escimen o em
al as concen ações de e o.
III.3 – Os ní eis basais de CCC1, não dependen es do Yap5, são su icien es pa a o
c escimen o em al as concen ações de e o.
Pa a es a a nossa p imei a hipó ese, cons uímos um duplo mu an e yap5ccc1. Se a
ausência do Yap5 osse o sinal indu o da possí el ia al e na i a, en ão o mu an e yap5 i ia
exibi uma sensibilidade simila à ap esen ada pelo duplo mu an e yap5ccc1. Con udo, o duplo
mu an e ap esen a uma sensibilidade simila à do mu an e ccc1 ( igu a III-7) e po an o,
a as ámos es a hipó ese.
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Capí ulo III – Resul ados e Discussão
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41
Figu a III-7 O duplo mu an e yap5ccc1 e o mu an e ccc1 exibem o mesmo enó ipo de c escimen o quando as células
são induzidas na p esença de e o. O mesmo núme o de células das es i pes indicadas oi plaqueado em meio SC sólido
(sin é ico comple o) suplemen ado com 5 e 6mM FeSO
4
. O c escimen o oi moni o izado du an e 48h a 30ºC.
Pos e io men e e de o ma a pe cebe se os ní eis de exp essão basal de CCC1 se iam
su icien es pa a pe mi i o c escimen o em concen ações óxicas de e o, oi ei a uma
cons ução con endo o gene CCC1 e a sua p omo o a sem os ês YRE (Yap Responsi e
Elemen s), localizados a -398pb, -359pb e a -303pb a pa i do codão de iniciação, ATG. Es a
cons ução, con endo apenas 273pb da egião p omo o a (CCC1_SP, do inglês “small
p omo e ”), oi usada pa a ans o ma a es i pe mu an e ccc1 e o c escimen o oi ei o em meio
sólido suplemen ado com sul a o de e o ( igu a III-8).

Figu a III-8 Rep esen ação esquemá ica das cons uções CCC1_FP (do inglês “ ull p omo e ”) e CCC1
_
SP
u ilizadas pa a ans o ma a es i pe ccc1 (A). A sensibilidade do mu an e ccc1 é sup imida pela complemen ação
com a cons ução que consis e no gene CCC1 sob o con olo de uma e são uncada da sua p omo o a, sem os
YREs (CCC1_SP). A es i pe ccc1 econs i uída com a e são na i a da p omo o a do CCC1, ccc1<CCC1
_
FP>, não
di e e, em e mos de c escimen o em condições de excesso de e o, da es i pe ccc1<CCC1
_
SP>. O c escimen o das
es i pes indicadas em meio selec i o sólido suplemen ado com 6mM de sul a o de e o oi moni o izado du an e
48h a 30ºC (B).
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Capí ulo III – Resul ados e Discussão
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42
Ve i icámos que as células mu an es ccc1 con endo a e são uncada da p omo o a do
CCC1 (CCC1_SP) conseguem sup imi a sensibilidade no c escimen o e i icada pa a a es i pe
ccc1, suge indo cla amen e que os ní eis de exp essão des e gene, não dependen es de e o
( igu a III-6), são su icien es pa a con e i às células a capacidade de con ola o s ess
p o ocado pelo excesso de e o.
III.4 – Análise uncional da egião p omo o a do gene CCC1.
Como demons ámos, os ní eis de CCC1 di ados po uma egião de 273pb ( igu a III-8)
con e em à célula a capacidade de c esce em meio com al as concen ações de e o. O ac o de
ansc ição esponsá el pelos ní eis basais des e anspo ado de e pois econhece uma
sequência localizada nessa egião. Assim, com o objec i o de iden i ica esse ac o , oi ei a
uma pesquisa de sequências egulado as (“cis-elemen s”) conhecidas, nessa egião, u ilizando o
mo o de busca da base de dados YEASTRACT (Teixei a e al., 2006; Mon ei o e al., 2008).
Apenas o am encon ados oi o ac o es de ansc ição que se encon am lis ados na abela III-1.
Fac o de ansc ição Sequência Localização*
Msn2p, Msn4p, N g1p, Rph1p CCCCT -270
R g1p, R g3p GGTAC -268
Gis1p, YER130C AGGGG -265
Swi4p CACGAAA -259
R g1p, R g3p GTCAC -257
S b5p CGGNS -228
Ash1p YTGAT -183
Ash1p YTGAT -151
Hap2P, Hap3p, Hap4p, Hap5p TNATTGGT -64
Tabela III-1 Po enciais ac o es de ansc ição do gene CCC1. (*) a pa i do ATG


49
Capí ulo IV
Conclusões e
Pe spec i as
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Capí ulo IV – Conclusões e Pe spec i as
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50
Nes e abalho, p opusemo-nos pesquisa a ele ância do ac o de ansc ição Yap5 em
células de le edu as expos as a ele adas concen ações de e o. Os esul ados aqui ap esen ados
e discu idos, pe mi i am-nos conclui e suge i como abalho u u o o seguin e:
(i) O Yap5 sendo um ac o cons i u i amen e nuclea , ap esen a uma egulação da sua
ac i idade di e en e dos ou os memb os, ambém nuclea es, da amília Yap (Yap4 e Yap6).
Após a incubação com g andes quan idades de sul a o de e o, embo a o seu po encial de
ansac i ação aumen e ( igu a III-4), os ní eis da p o eína diminuem ( igu a III-1 e III-2), sendo
essa diminuição mais d ás ica, com o aumen o da in ensidade do s ess p o ocado pelo excesso
de e o ( igu a III-3). Es a diminuição da exp essão pode á se a o ma que a célula possui de
modula a ac i idade des e ac o .
De o ma a a e igua se a egulação do Yap5 é ao ni el ansc icional ou pós ansc icional,
a exp essão do gene de e á se es udada po PCR em empo eal, uma ez que não nos oi
possí el de ec a a sua exp essão po no he n blo . Também se ia in e essan e a alia o
po encial de ansac i ação des e ac o na p esença de e o em in e alos de empo cu os de
modo a pode co elaciona com os ní eis de p o eína.
(ii) Ao con á io do mu an e ccc1, o c escimen o do mu an e yap5 em meio com excesso de
sul a o de e o é apenas ligei amen e comp ome ido ( igu a III-5). No en an o, o Yap5 egula
e ec i amen e a exp essão do gene CCC1 ( igu a III-6).
(iii) Os ní eis basais de CCC1 pa ecem se su icien es pa a que a célula c esça em
condições de al as concen ações de e o ( igu a III-8). De e -se-á a alia os ní eis de p o eína
Ccc1 po wes e n blo .
(i ) Ao con á io do que acon ece em S.pombe, o ac o de ansc ição Hap4 pa ece não
es a en ol ido na egulação da exp esão do gene CCC1 ( igu as III-9 e III-10).
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Capí ulo IV – Conclusões e Pe spec i as
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51
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( ) Delecções sequenciais da egião p omo o a do gene CCC1 e ela am que uma egião de
58pb a mon a e do ATG é su icien e pa a con e i ao mu an e ccc1 a capacidade de c esce em
meio com excesso de e o ( igu a III-13).
( i) A egião 3’UTR do gene CCC1 é impo an e na egulação do gene ( igu a III-13).
Nes a egião exis e uma es u u a em o ma de “hai pin” ( igu a III-14) que pode á es a
en ol ida nessa egulação. Assim, u u amen e se á impo an e de e mina o im da egião 3’ do
gene CCC1 a a és de ensaios de RACE (“Rapid Ampli ica ion o cDNA Ends”), emo e po
PCR de usão a es u u a em “hai pin” e moni o iza o c escimen o do mu an e ccc1
ans o mado com a cons ução esul an e. Como a emoção da egião 3’UTR do gene CCC1,
embo a comp ome a, não in iabiliza o c escimen o em meio com ele adas concen ações de
sul a o de e o ( igu a III-13), se á necessá io es a se na egulação da exp essão do gene são
impo an es an o a egião 3’UTR como a 5’ egulado a.
Face a es es dados, eme ge uma ques ão: qual a ele ância do Yap5 no excesso de e o? É
ac o que es e ac o em condições de excesso de e o egula o CCC1 e que o seu po encial de
ansac i ação aumen a na p esença de e o ( igu as III-4 e III-7, espec i amen e). No en an o o
c escimen o da es i pe yap5 não e ela um o e enó ipo de sensibilidade ao excesso de e o
( igu a III-5) e cons uções sem os YAP si es, quando in oduzidas no mu an e ccc1, e e em o
enó ipo de sensibilidade des a es i pe ( igu as III-8 e III-12). Assim, pa ece-nos plausí el
suge i que o Yap5 pode á desempenha um papel c ucial na sob e i ência celula em si uações
de excesso de e o, no caso de alha dos ac o es esponsá eis pela exp essão basal do gene
CCC1. Se es a hipó ese o álida, en ão uma cons ução do gene CCC1 com os YAP si es mas
sem a egião 3’UTR (CCC1_ p_s op) de e á ap esen a um c escimen o mais obus o na
p esença de e o do que a cons ução sem os YAP si es e sem a egião 3’UTR (CCC1_sp_s op).
Po ou o lado, o duplo mu an e yap5ccc1 ans o mado com CCC1_ p_s op de e á se mais
sensí el ao excesso de e o que a es i pe ccc1 ans o mada com a mesma cons ução.
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