UNIVERSIDADE NOVA DE LISBOA
INSTITUTO DE HIGIENE E MEDICINA
TROPICAL
MESTRADO EM CIÊNCIAS BIOMÉDICAS,
especialidade de Biologia Molecula em Medicina T opical e In e nacional
IDENTIFICAÇÃO MOLECULAR DE ESPÉCIES
CLINICAMENTE RELEVANTES DE ASPERGILLUS
Ma isa Isabel Benedi a Simões Elói
II
UNIVERSIDADE NOVA DE LISBOA
INSTITUTO DE HIGIENE E MEDICINA
TROPICAL
IDENTIFICAÇÃO MOLECULAR DE ESPÉCIES
CLINICAMENTE RELEVANTES DE ASPERGILLUS
Ma isa Isabel Benedi a Simões Elói
Tese ap esen ada pa a a ob enção do g au de
Mes e em Ciências Biomédicas,
especialidade de Biologia Molecula
em Medicina T opical e In e nacional
O ien ado : In es igado a Dou o a Ma ia da Luz Ma ins
Co-O ien ado : Dou o João Inácio Sil a
2009
III
Índice Ge al
Índice ge al …………………………………………………………………………… III
Índice de igu as ……………………………………………………………………… V
Índice de abelas ……………………………………………………………………… VI
Lis a de ab e ia u as ………………………………………………………………… VII
Resumo ……………………………………………………………………………….. VIII
Abs ac ………………………………………………………………………………. IX
Capí ulo I.....................................................................................................................1
1.1. In odução ge al...............................................................................................2
1.1.1. In odução his ó ica à micologia médica..................................................2
1.1.2 – O géne o Aspe gillus................................................................................4
1.1.3. Classi icação do géne o Aspe gillus...........................................................5
1.1.4 – Rele ância clínica do géne o Aspe gillus.................................................7
Aspe gilose b oncopulmona alé gica..............................................................8
Aspe gilose cu ânea..........................................................................................9
Aspe giloma pulmona e aspe gilose semi-in asi a .........................................9
Aspe gilose pulmona in asi a aguda............................................................10
Relação da in ecção po Aspe gillus com a imunode iciência......................12
1.1.5 – An i úngicos...........................................................................................13
1.1.6. Diagnós ico de ungos do géne o Aspe gillus..........................................13
Mé odos adicionais de diagnós ico.............................................................14
Mé odos molecula es de diagnós ico.............................................................17
1.1.7 – Objec i os do es udo e plano da disse ação.........................................18
Capí ulo II.................................................................................................................20
2.1. In odução ......................................................................................................21
2.1.1. A pa ede celula dos ungos do géne o Aspe gillus ................................21
2.1.2. Mé odos usados pa a a ex acção de DNA genómico de Aspe gillus.....22
2.1.3. Objec i o do abalho des e capí ulo ......................................................25
2.2. Ma e iais e Mé odos.......................................................................................27
2.2.2. Mé odos de ex acção de DNA genómico................................................28
Mé odo TL.....................................................................................................28
Mé odo TL modi icado..................................................................................28
Mé odo TE enol............................................................................................29
Mé odo AZ.....................................................................................................29
2.2.3. A aliação da e iciência dos mé odos de ex acção de DNA....................30
2.3. Resul ados e Discussão...................................................................................31
Capí ulo III................................................................................................................37
3.1. In odução ......................................................................................................38
3.1.1. Iden i icação molecula de ungos do géne o Aspe gillus.......................38
3.1.2. Objec i os dos abalhos des e capí ulo..................................................40
3.2. Ma e iais e Mé odos.......................................................................................41
3.2.1. Selecção das espécies de Aspe gillus clinicamen e ele an es.................41
3.2.2. Desenho de p ime s especí icos................................................................41
3.2.3. Espécies e es i pes u ilizadas nes e abalho...........................................42
3.2.4. Ex acção de DNA ...................................................................................42
3.2.5. Reacções de PCR .....................................................................................42
3.3. Resul ados e Discussão...................................................................................43
IV
Capí ulo IV................................................................................................................48
4.1 Conside ações inais........................................................................................49
Re e ências Bibliog á icas ........................................................................................51
V
Índice de Figu as
Fig. 1.1. Ilus ação de um “aspe gillum”, usado na li u gia pa a aspe gi água ben a e da
mo ologia de um Aspe gillus spp.……………………………………………………………........ 2
Fig. 1.2. Imagem ilus a i a da es u u a de u i icação ípica de Aspe gillus ................................ 5
Fig. 1.3. Aspe gilose pulmona em doen e ansplan ado. Obse a-se uma maio exp essi idade
adiog á ica na TAC do que na adiog a ia simples ...............................………………. 11
Fig. 1.4. Figu as ilus a i as de cul u as de Aspe gillus....……………………………………….. 16
Fig. 1.5. Mo ologia mic oscópica de Aspe gillus umiga us e esquema ilus a i o das es u u as de
Aspe gillus………………………....................................................................………… 17
Fig. 2.1. Ilus ação dos esul ados ob idos em eacções de PCR com os p ime s uni e sais pa a
ungos ITS1 e ITS4, usando como DNA molde as soluções ex aídas com o mé odo TL
modi icado.........................................................................................................................32
Fig. 2.2. Ilus ação dos esul ados ob idos em eacções de PCR com os p ime s uni e sais pa a
ungos ITS1 e ITS4, usando como DNA molde as soluções ex aídas com o mé odo TE
enol.............……………………………………………………………………………. 33
Fig. 2.3. Ilus ação das bandas de DNA de ele ado peso molecula , co esponden es ao DNA
genómico ex aído com o mé odo AZ, após mig ação num gel de elec o o ese......….. 34
Fig. 2.4. Compa ação dos empos expe imen ais pa a a execução de cada um dos qua o mé odos
de ex acção de DNA es ados nes e abalho………………………………………….. 34
Fig. 3.1. Resul ado da ampli icação com os p ime s uni e sais ITS1 e ITS4 a pa i das soluções
de DNA das á ias es i pes de Aspe gillus em es udo.............………………………… 44
Fig. 3.2. Reacções de PCR com o p ime especí ico e o espec i o p ime uni e sal em mis u as
eaccionais sepa adas.............................................................................……………….. 46

VI
Índice de Tabelas
Tabela 2.1. Compa ação en e mé odos come ciais de ex acção de DNA..……………………… 24
Tabela 2.2. Es i pes e espécies de Aspe gillus u ilizadas nes e abalho………………………….. 27
Tabela 3.1. P ime s desenhados nes e abalho, com base na egião ITS, pa a espécies de
Aspe gillus clinicamen e ele an es…………………………………………………. 43
VII
Lis a de ab e ia u as
A. – Aspe gillus
DNA – Ácido desoxi ibonucleico
DPOC – Doença Pulmona C ónica Obs u i a
EDTA – Ácido e ilenodiamino e a-acé ico
ELISA – Enzyme-Linked Immunoso ben Assay
FDNA – Fas DNA
Fig. – Figu a
h – ho a(s)
HCl – Ácido clo íd ico
HSCT – T ansplan e de células onco hema opoié icas
IgE – Imunoglobulina E
ITS – In e nal T ansc ibed Space
LBA – La ado b oncoal eola
LCR – Líquido ce alo aquidiano
MPPL – Mas e Pu e plan lea DNA pu i ica ion
MPY – Mas e Pu e yeas DNA pu i ica ion
NaCl – Clo e o de sódio
NaOH – Hid óxido de sódio
PCR – Reacção de Polime ização em Cadeia
PVPP – Poly inyl polypy oline
DNA – Ácido desoxi ibonucleico ibossómico
RNA – Ácido ibonucleico
pm – Ro ações po minu o
SDS – Sodium dodecylsulpha e
SIDA – Sínd ome da Imunode iciência Adqui ida
SM – SoilMas e DNA ex ac ion
SNC – Sis ema Ne oso Cen al
TAC – Tomog a ia Axial Compu o izada
TBE – Tampão T is, Ácido bó ico e EDTA
TE – Tampão T is e EDTA
UCS – Ul aClean DNA isola ion
VIH – Ví us da Imunode iciência Humana
YL-GNOME – Yeas cell lysis p epa a in plus GNOME
YM – Ex ac o de le edu a
VIII
Resumo
As aspe giloses são cada ez mais diagnos icadas em odo o mundo, nas suas di e sas o mas de
ap esen ação, an o pelo aumen o da população suscep í el como pela melho ia dos mé odos de
diagnós ico labo a o ial. Es as in ecções úngicas são causadas po algumas espécies do géne o
Aspe gillus. A espécie A. umiga us con inua a se a causa mais equen e de Aspe gilose In asi a.
No en an o, ou as espécies como A. la us, A. e eus, A. nige , A. nidulans e A. e sicolo êm
sido elacionadas com pa ologias no Homem. Es ão desc i os di e sos casos em que es as espécies
se êm o nado esis en es à medicação e, po es a azão, em sido ambém mui o impo an e a sua
ápida e co ec a iden i icação. Um g ande núme o de indi íduos é passí el de cu a após um
diagnós ico nas ases iniciais da in ecção e após aplicação dos a amen os mais adequados.
Ac ualmen e, as écnicas con encionais de diagnós ico são mo osas de ido ao ac o do ungo
Aspe gillus demo a á ios dias a c esce . Em adição, a iden i icação do ungo é depois mui as
ezes di icul ada de ido à ambiguidade de mui as das ca ac e ís icas eno ípicas usadas na
delimi ação das espécies.
O p incipal objec i o des e abalho oi desen ol e um mé odo baseado em PCR que pe mi isse
iden i ica as p incipais espécies de Aspe gillus clinicamen e ele an es: A. umiga us, A. la us, A.
e eus, A. nige , A. nidulans e A. e sicolo . O p imei o passo oi op imiza um mé odo de
ex acção de DNA genómico mais e icien e pa a es as espécies, a e a que se e elou bem mais
complexa e demo ada do que o inicialmen e p e is o. O segundo passo en ol eu o desenho de
sis emas de p ime s especí icos pa a cada espécie, baseados na análise das egiões ITS (In e nal
T anc ibed Space s 1 e 2 e egião 5.8S) do seu genoma, e a sua u ilização em eacções de PCR. Os
esul ados p elimina es ob idos com os p ime s desenhados e ela am-se p omisso es pa a a
iden i icação das á ias espécies, mas as eacções de PCR eque em ainda alguma op imização pa a
melho amen o da sua especi icidade. A u ilização u u a des es p ime s em eacções de PCR-
mul iplex pa a a iden i icação simul ânea das á ias espécies de Aspe gillus pode á assim i a se
possí el.
IX
Abs ac
The aspe gillosis a e mo e han e e diagnosed all o e he wo ld being p esen ed in se e al ways,
his is due o he sensi i e popula ion as well as be e labo a o y diagnos ic me hods. These yeas
in ec ions a e caused by ce ain species o Aspe gillus genus. The specie A. umiga us s ill con inues
o be he mos equen cause o In asi e Aspe gillosis. O he species such as A. la us, A. e eus,
A. nige , A. nidulans e A. e sicolo ha e been ela ed o he pa hologies in Man. The e a e ce ain
w i en cases whe e hese species ha e become esis an o medica ion and o his eason has also
been e y impo an o iden i y i quickly and co ec . A huge numbe o pa ien s a e able o be
cu ed i i is diagnosed om an ea ly s age o he in ec ion and a e applying adequa e ea men .
The p esen con en ional diagnos ic echniques las a long ime due o he ac he Aspe gillus ungi
ake se e al days o g ow. In addi ion o his he iden i ica ion o he ungi is also e y di icul due
he ambiguous pheno ypic cha ac e is ics used in species de ini ion.
The aim o his wo k was o de elop a me hod based on PCR which would allow us o iden i y he
species o Aspe gillus ele an o main clinics. The i s s ep was o op imize he ex ac ion o
genomic DNA me hod which would be mo e e icien o hese species. This ask became mo e
complex and ook longe han ini ially o eseen. The second s ep in ol ed he design o speci ic
p ime s o each specie based on ITS egions (In e nal T anc ibed Space s 1 and 2 and egion 5.8S)
analyses o i s genome, as well as hei use in PCR eac ions. The p elimina y esul s ob ained wi h
he designed p ime s e ealed o be p omising o he iden i ica ion o hese se e al species,
al hough PCR eac ions s ill equi e u he op imiza ion. The u u e use o hese p ime s in PCR-
mul iplex eac ions o he simul aneous iden i ica ion o se e al Aspe gillus species will be
possible.
7
p opos a nes e encon o a cons ução de uma base de dados in eg ada pa a a iden i icação de
Aspe gillus
, que de e á inclui in o mação sob e sequências nucleo ídicas, o og a ias, locais de
pesquisa e a possibilidade de cons ui á o es ilogené icas (Samson
e al
. 2007c).
1.1.4 – Rele ância clínica do géne o Aspe gillus
No início do século XIX, o micologis a alemão Johann Hein ich F ied ich Link desc e eu á ias
espécies de
Aspe gillus
, mas oi apenas em 1856 que ou o micologis a, Rudol Vi chow, desc e eu
o p imei o caso de aspe gilose pulmona (Robinson
e al
. 1995). As in ecções po
Aspe gillus
localizam-se p incipalmen e nos pulmões, mas podem a ec a qualque pa e do o ganismo (Hohl e
Feldmesse 2007; Ramos
e al
. 2002). Es es ungos causam doença p incipalmen e em pessoas com
o es ado imunológico en aquecido (p.e. com SIDA ou canc o), indi íduos com p oblemas an igos
que lesiona am os pulmões, como ube culose ou ib ose cís ica, e pessoas com asma (Hohl e
Feldmesse 2007). Um indi íduo saudá el não é no malmen e in ec ado po
Aspe gillus
(Cano e
Sole 2000). As lesões p o ocadas pela in ecção podem se a iadas, desde a i i ação c ónica dos
pulmões em doen es com asma a é danos pe manen es no ecido pulmona . Em alguns casos, o
ungo pode mesmo dissemina -se sis emicamen e a ou os ó gãos e p o oca mo e (Hohl e
Feldmesse 2007). As aspe giloses são cada ez mais diagnos icadas em odo o mundo, não só
de ido ao aumen o da população suscep í el mas ambém pelas melho ias dos mé odos de
diagnós ico labo a o ial u ilizados. É ambém de ealça que um diagnós ico p ecoce da in ecção e a
aplicação de um a amen o co ec o pe mi e a ecupe ação de um g ande núme o de pacien es
(Cano e Sole 2000; Lai
e al
. 2008).
Ce ca de 30 espécies do géne o
Aspe gillus
são conside adas pa ogénicas opo unis as, podendo
causa aspe gilose.
Aspe gillus umiga us
con inua a se a causa mais equen e de aspe gilose
in asi a, mas ou as espécies es ão ambém elacionadas com pa ologias no Homem, ais como
A.
la us
,
A. e eus
,
A. nige
,
A. nidulans
,
A. us us
e
A. e sicolo
(Cano e Sole 2000; Hin ikson
e
al
. 2005a; Lai
e al
. 2008). Têm indo a se egis ados casos de esis ência à medicação po pa e de

8
alguns des es ungos, sendo ambém po es e mo i o de ex ema impo ância um diagnós ico ápido
e iá el das in ecções que p o ocam (Hin ikson
e al
. 2005a; Lai
e al
. 2008).
A in ecção pulmona po
Aspe gillus
é secundá ia à inalação dos espec i os conídios e
subsequen e ge minação nos ecidos, podendo oco e numa a iedade de o mas clínicas,
localizadas ou disseminadas (Aspe gilose In asi a), sendo que qualque ó gão ou sis ema do co po
humano pode se a ec ado po es es ungos (Rad o d
e al
. 1998). Podem coloniza as ca idades
p é-exis en es de ido a ou as pa ologias, como a ube culose, sa coidose, bonquiec asis,
pneumoconiose, ou o ma en idades clínicas dis in as, denominadas aspe gilomas. A localização
dos aspe gilomas pode se di e sa, dependendo do local de nidi icação do ungo (p.e. pulmões, ins
ou cé eb o). Nou a o ma, a aspe gilose cu ânea pode su gi em locais de inse ção de ca e e es
in a enosos ou de ou os disposi i os médicos in asi os (Nunley
e al
. 2002; Richa dson e
Wa nock 2004). Também alguns an igénios de
Aspe gillus
são ale géneos, podendo inicia as
designadas aspe giloses b oncopulmona es alé gicas, p incipalmen e em hospedei os a ópicos e
p o ocando hipe sensibilidade dos pulmões (Hohl e Feldmesse 2007; Richa dson e Wa nock
2004).
Aspe gilose b oncopulmona alé gica
A aspe gilose b oncopulmona alé gica é uma pa ologia de hipe sensibilidade dos pulmões, mais
equen emen e encon ada em doen es a ópicos que desen ol em episódios de obs ução b ônquica
(asma) e eosino ilia em sangue pe i é ico subsequen e à inalação de espo os de
Aspe gillus
. A
sec eção de muco o na-se p onunciada e esul a na o mação de massas que obs uem os
b ônquios. Os sin omas mais equen es incluem eb e, asma não cu a i a, osse p odu i a, mal-
es a e pe da de peso (Laza us
e al
. 2008; Richa dson e Wa nock 2004). O modo de ac uação nes a
pa ologia es á di eccionado pa a o a amen o da asma aguda e exace bada e e i a o úl imo es ádio
da ib ose (Laza us
e al
. 2008). O uso de co icos e óides es á indicado quando é ele ada a
concen ação de IgE no so o e há um aumen o de in il ados nas adiog a ias o ácicas. A
9
p ednisona é a d oga escolhida pa a o a amen o, uma ez que é e icaz na edução dos sin omas, na
diminuição dos in il ados e na diminuição das cul u as de sali a posi i as. O papel das d ogas
an i úngicas no a amen o des e ipo de pa ologia ainda não es á cla i icado, mas o i aconazol
pa ece se ú il como agen e co icos e óide em di e sos es udos não compa a i os. Mais
ecen emen e, es udos alea ó ios mos am que o i aconazol em um e ei o bené ico (Rai
e al
. 2004;
Salez
e al
. 1999).
Aspe gilose cu ânea
Es ão desc i as duas o mas de aspe gilose cu ânea po
Aspe gillus
em indi íduos
imunocomp ome idos. Na aspe gilose cu ânea p imá ia as lesões su gem no local da inse ção de
ca e e es in a enosos, ou pe o dos mesmos, em pessoas que enham es ado em con ac o com
es uá io con aminado ou com alas aplicadas na pele. Na aspe gilose cu ânea secundá ia, as lesões
podem esul a an o de uma in ecção hema ógena ex ensa dos pulmões, como de uma ex ensão da
in ecção subjacen e ao ecido pa a a pele (Richa dson e Wa nock 2004). Es a o ma de aspe gilose
oco e em 5% dos pacien es com in ecção disseminada. As lesões podem se simples ou múl iplas e
e oluem pa a úlce as nec ó icas com bo dos dis in os e cobe as de esca as p e as. O diagnós ico da
maio ia das in ecções p imá ias e secundá ias po
Aspe gillus
eque uma biópsia da lesão cu ânea
pa a cul u a e his opa ologia. Pos e io men e, a amos a de e se ese ada pa a c escimen o em
cul u a e isolamen o do ungo. A cul u a das pon as de ca e e es em con i mado o diagnós ico ei o
com a cul u a das lesões, mas são ela i amen e insensí eis pa a o início do diagnós ico da
aspe gilose cu ânea. O modo de ac uação pa a es a pa ologia depende da ex ensão da in ecção e do
es ado do pacien e (Bu ik
e al
. 1998).
Aspe giloma pulmona e aspe gilose semi-in asi a
Um aspe giloma é uma massa densa e amo a de micélio de
Aspe gillus
que po ezes é encon ado
nas ca idades pulmona es esiduais causadas po uma ube culose, sa coidose, b onquies ase ou
10
pneumocis ose (Richa dson e Wa nock 2004). Os doen es são no malmen e assin omá icos, mas
podem ap esen a osse c ónica, pe da de peso e mal-es a . Mui os indi íduos êm episódios
in e mi en es de pequenos sang amen os. A hemop ise é o sin oma mais comum, oco endo em 50 a
80% dos casos. A aspe gilose semi-in asi a, ou aspe gilose nec osan e c ónica, ca ac e iza-se po
um p ocesso des u i o e indolen e dos pulmões de ido à in asão do ecido po hi as de
Aspe gillus
. Exis e in asão local do ecido do pulmão e não há necessidade da exis ência de uma
ca idade p eexis en e no pulmão pa a o início da doença. Es a pa ologia a ec a com maio
equência os po ado es de Doença Pulmona Obs u i a C ónica (DPOC) e em di e sas si uações
clínicas que comp ome em a a qui ec u a pulmona ou o es ado imunológico do indi íduo (Lopes
e
al
. 2004; Richa dson e Wa nock 2004). Não exis e um consenso quan o ao a amen o mais
co ec o pa a o aspe giloma pulmona . A ci u gia de emoção da lesão de e se ese ada pa a
indi íduos de al o isco, de ido às po enciais complicações, al como pa a pessoas com hemop ise
g a e. Se a in e enção ci ú gica não o indicada, a injecção pe cu ânea ou a ins ilação
endob onquial de an o e icina B pode ajuda . O a amen o de indi íduos assin omá icos e com
sang amen o médio ou g a e ainda é con o e so, mas a obse ação sem in e enção pode se o
melho modo de ac uação (Lopes
e al
. 2004; Robinson
e al
. 1995).
Aspe gilose pulmona in asi a aguda
A Aspe gilose pulmona in asi a aguda oco e em indi íduos imunocomp ome idos e pode se
classi icada como localizada ou di usa. A disseminação hema ogénea pa a ou os ó gãos é uma
complicação equen e em doen es com canc o neu opénico e em ecep o es de ansplan e. O
sis ema ne oso cen al (SNC) é o segundo local de disseminação des a doença em 10 a 20% dos
casos. A angio-in asão é um g ande ma co numa in asão po
Aspe gillus
. Seguidamen e pode
oco e ombose, en a e e nec ose do ecido que p o ege os pulmões. Também pode oco e e osão
da pa ede dos asos, le ando a uma hemo agia g a e (Richa dson e Wa nock 2004).
11
A ap esen ação clínica da aspe gilose pulmona in asi a é a iada e o diagnós ico é di ícil. A
si uação inicial mais comum em pacien es neu opénicos consis e numa eb e incessan e (acima dos
38ºC), sem qualque sin oma espi a ó io e que não esponde ao a amen o an ibac e iano. A osse
não p odu i a é ou o sin oma mui o comum. Inicialmen e, o diagnós ico de e inclui uma
adiog a ia ao ó ax e cul u a de sangue, embo a es e úl imo seja mui o equen emen e nega i o em
doen es com in ecção in asi a po
Aspe gillus
. A omog a ia axial compu o izada (TAC) mos a
lesões nos pulmões de doen es com aio-X sem qualque ipo de suspei a (Fig. 1.3). Os sinais de
in ecção di usa po
Aspe gillus
são menos e iden es do que na in ecção localizada, sendo
necessá io ou o ipo de mé odos pa a con i ma o diagnós ico. Em doen es neu opénicos e
ecep o es de ansplan e o exame mic oscópico e a cul u a do la ado b onco-al eola (LBA) são os
melho es meios pa a con i ma o diagnós ico de aspe gilose in asi a pulmona (Ga cía-Ruiz
e al
.
2004; Sole e Sala e 2008).
Fig. 1.3.
Aspe gilose pulmona em doen e ansplan ado. Obse a-
se uma maio exp essi idade adiog á ica na TAC (imagem di ei a)
do que na adiog a ia simples (imagem esque da) (adap ado de
Ga cía-Ruiz
e al
. 2004)
O sucesso de a amen o da aspe gilose pulmona in asi a em indi íduos imunocomp ome idos
depende do início do a amen o an i úngico co ec o, na co ecção do es ado imunológico do
indi íduo que é causa da e e ida in ecção, e numa in e enção ci ú gica ap op iada. A an o e icina
B é o a amen o pad ão pa a aspe gilose pulmona in asi a, pa icula men e em casos de
a amen o pa a o u u o ( oda a ida) e em casos de in ecções se e as (Lass-Flo l
e al
. 2004; Lopes
e al
. 2004; Richa dson e Wa nock 2004). Alguns clínicos ecomendam a imedia a ci u gia pa a
emoção de lesões de
Aspe gillus
dos pulmões du an e a neu opénia. No en an o, es as
12
in e enções não es ão indicadas em indi íduos com in ecção pe sis en e po
Aspe gillus
, com
hemop ise, ou com uma lesão ocal localizada numa zona p o unda (po exemplo, pe o do
medias ino). Es e úl imo g upo es á em maio isco de mo e po pe usão dos b ônquios, aqueia
ou asos p incipais e mui as ezes é essencial uma ápida in e enção ci ú gica (Lopes
e al
. 2004;
Winga d
e al
. 2008).
Relação da in ecção po Aspe gillus com a imunode iciência
A incidência das aspe giloses pulmona es em aumen ado em pacien es imunodep imidos nas
úl imas décadas. As azões pa a es a si uação são di e sas, nomeadamen e a c escen e u ilização de
co icóides e imunossup esso es pa a con ola ou as doenças an e io men e a ais, como a in ecção
pelo Ví us da Imunode iciência Humana (VIH) e os pós- ansplan es. O indi íduo
imunocomp ome ido ica mais suscep í el a di e en es ipos de in ecção po
Aspe gillus
, incluindo,
como já e e ido an e io men e, aspe gilose pulmona cu ânea, aspe gilose b ônquica obs u i a,
aqueob onqui e in asi a, inossinusi e disseminada, aspe gilose pulmona in asi a e semi-
in asi a. A aspe gilose in asi a é aquela que ap esen a uma maio axa de mo alidade em
imunocomp ome idos, p óxima dos 100% (Ga alda
e al
. 2005; Lopes
e al
. 2004). Os p incipais
ac o es de isco que p edispõem à doença in asi a são neu opénia, e apia com co icóides e
imunossup esso es, eacção de ejeição do enxe o-hospedei o po pa e do hospedei o após o
ansplan e de medula óssea, ou após o ansplan e de ó gão sólido, doença po ci omegalo í us
após ansplan e, VIH a ançada, uso p olongado de an ibió icos, his ó ia p é ia de aspe gilose e
quimio e apia em pacien es com leucemias com colonização nasal po
Aspe gillus
. Embo a odas
es as doenças sejam de en idades pulmona es dis in as, são a as as ocasiões em que uma pa ologia
e olui pa a ou a. Pode acon ece po exemplo com o aspe giloma que, dependendo do es ado
imunológico do hospedei o, pode e olui pa a aspe gilose pulmona in asi a (Lopes
e al
. 2004;
Richa dson e Wa nock 2004).

13
1.1.5 – An i úngicos
Exis em, signi ica i amen e, mui o menos compos os an i úngicos em compa ação com a
quan idade de medicamen os an ibac e ianos disponí eis no me cado apesa do núme o de d ogas
an i úngicas e indo a c esce nos úl imos anos. Exis em qua o g andes amílias de compos os
com p op iedades an i úngicas: os polienos, os azóis, as alilaminas e as equinocandinas. Exis e
ainda um g upo di e si icado de compos os, como a luci osina e a g iseo ul ina, que não pe ence
a nenhuma das g andes amílias. Es a a qui ec u a não é es á ica, uma ez que es ão semp e a
apa ece no os g upos de compos os em desen ol imen o (Richa dson e Wa nock 2004). Nos
úl imos anos, a an o e icina B e os azóis, p incipalmen e o ce oconazol, luconazol e i aconazol,
êm sido os á macos de p imei a escolha no a amen o dos doen es. Es as duas classes de
medicamen os êm como al o a memb ana celula dos ungos (Solé e Sala e 2008; Richa dson e
Wa nock 2004). Os polienos ligam-se aos es e óis da memb ana, p incipalmen e ao e gos e ol,
o mando po os ou canais. Al e am a pe meabilidade da memb ana e pe mi em o ex a asamen o de
di e sas moléculas, le ando à mo e celula (Be gold e Geo giadis 2004; Lai
e al
. 2008). Ainda
não oi es abelecida a du ação óp ima de um a amen o an i úngico, pois depende da ex ensão da
in ecção, da espos a do a amen o e da pa ologia subjacen e do doen e. O a amen o de e se
con ínuo enquan o o doen e es i e imunocomp ome ido e na maio ia dos casos de e á p olonga -se
pa a além do diagnós ico da cu a clínica (Richa dson e Wa nock 2004). As equinocandinas di e em
dos ou os agen es an i úngicos po que ac uam na pa ede celula dos ungos inibindo a sín ese do

-
1,3-D-glucano. O papel da equinocandinas no a amen o de aspe gilose in asi a ainda não es á
mui o bem es abelecido po es es se em á macos ela i amen e ecen es. No en an o, as
equinocandinas êm sido usadas con a as in ecções de
Aspe gillus
quando os doen es são
in ole an es aos ou os an i úngicos, mas a suscep ibilidade des es ungos a es e á maco em-se
e elado a iá el (Be gold e Geo giadis 2004; Diomedi 2004; Lai
e al
. 2008).
14
1.1.6. Diagnós ico de ungos do géne o Aspe gillus
Na maio ia dos casos, o diagnós ico de aspe gilose é baseado numa combinação de exames clínicos,
adiológicos, mic obiológicos e his opa ológicos (Balajee
e al
. 2007a; Sa da 2007; Richa dson e
Wa nock 2004). Um diagnós ico co ec o de e inclui um esul ado da cul u a posi i a pa a a
amos a ob ida de o ma es é il, ou um exame his opa ológico ou ci ológico da amos a com
p esença de hi as consis en es de
Aspe gillus
. Têm sido desen ol idos es es se ológicos e
molecula es baseados na eacção de polime ização em cadeia (PCR) pa a o diagnós ico da
aspe gilose in asi a, mas es es mé odos ainda es ão sob a aliação e o seu uso na o ina ainda não é
ecomendado (Lopes
e al
. 2004; Richa dson e Wa nock 2004).
Mé odos adicionais de diagnós ico
Como e e ido an e io men e, no diagnós ico da aspe gilose de em usa -se complemen a men e
écnicas de imagiologia, his ologia e micologia. O mé odo micológico de e e ência pa a o
diagnós ico pe manece a obse ação di ec a do ungo nas amos as biológicas e a iden i icação da
espécie após o c escimen o em cul u a, a pa i de biopsia ou aspi ado de locais es é eis. A cul u a
de amos as não es é eis, como a expec o ação de doen es imunocomp ome idos com e idência
clínica de in ecção, pode se usada pa a supo a o p o á el diagnós ico de aspe gilose in asi a em
ce os casos. Pa a assegu a o signi icado clínico, é necessá io que seja demons ada a p esença do
ungo num exame mic oscópico di ec o da amos a, que es e seja ambém isolado epe idamen e do
doen e e seja ei a a co elação com os esul ados da his opa ologia.
O exame mic oscópico comp eende o exame his opa ológico e o exame di ec o das amos as
biológicas. O exame his opa ológico de secções de ecido in ec ado é iá el quando se consegue a
isualização de hi as sep adas não pigmen adas com ami icações dico ómicas epe idas,
ca ac e ís ica da in ecção po
Aspe gillus
. Pa a al, é necessá io que a colhei a se aça exac amen e
no local da in ecção (as in ecções úngicas são mui o localizadas) e que se u ilizem as colo ações
adequadas pa a a obse ação de ungos. O exame mic oscópico di ec o das amos as de sali a ou de
15
expec o ação a amen e é ú il em doen es com suspei a de aspe gilose in asi a, pois os ungos do
géne o
Aspe gillus
são ubíquos no a . No en an o a obse ação de amos as de LBA, de sec eções
b ônquicas ou de biopsias pode se mui o signi ica i a. As p epa ações de exame di ec o de em se
ei as com hid óxido de po ássio pa a que, após a des uição das células do hospedei o, seja possí el
a isualização das hi as do ungo. Nes e exame de em obse a -se as ca ac e ís icas hi as sep adas
ami icadas dico omicamen e (Richa dson e Wa nock 2004). Uma das maio es limi ações des e
mé odo é a necessidade de se em ealizados po écnicos expe ien es pa a es e ipo de diagnós ico
em exames di ec os, ale ados pa a a eal alo ização dos elemen os úngicos nas amos as e
dis inção de esul ados alsos nega i os ou alsos posi i os.
O isolamen o do agen e e iológico em cul u a é essencial pa a con i ma o diagnós ico (Richa dson
e Wa nock 2004). Uma ez que as espécies de
Aspe gillus
se encon am na u almen e no a , o seu
isolamen o labo a o ial de e se ealizado com cuidados edob ados pa a e i a a oco ência de
alsos posi i os, ou seja, que o seu isolamen o seja de ido a con aminação ambien al. Mui as ezes,
a cul u a não é um mé odo mui o sensí el pa a o diagnós ico da in ecção po
Aspe gillus
(Luo e
Mi chell 2002). Es e ungo é a amen e isolado a pa i de amos as de sangue ou líquido
ce alo aquidiano (LCR) sendo, no en an o, mais comum a ob enção de cul u as posi i as des as
amos as em doen es com endoca di es. O isolamen o de espécies de
Aspe gillus
a pa i de
amos as de LBA ou de expec o ação p o enien e de indi íduos imunocomp ome idos com um
in il ado pulmona é no malmen e indica i o de in ecção. Em indi íduos neu opénicos com
canc o e ecep o es de ansplan e de células onco hema opoié icas (HSCT) com in ecção di usa, a
cul u a de LBA é posi i a em ce ca de 60% dos casos. Es e sucesso é mais baixo em ansplan ados
de ó gãos, com excepção dos ecep o es de ansplan e de pulmão. A cul u a de LBA não é mui o
ú il em doen es com doença localizada no pulmão.
A. umiga us
pode se isolado da amos a de
expec o ação de doen es com aspe gilose b oncopulmona alé gica (Richa dson e Wa nock 2004).
As espécies do géne o
Aspe gillus
são sensí eis à cicloheximida pelo que, quando há suspei a de
in ecção, não de em se inoculados em meios com es e compos o. De es o, es es ungos são pouco
16
exigen es em e mos nu i i os. Como se a am de ungos ilamen osos p odu o es de g ande
abundância de espo os, de em-se usa ubos de ensaio em ez de placas pa a p e eni desid a ação
do meio e con aminações das cul u as e do meio ambien e do labo a ó io. C escem apidamen e em
qualque meio de cul u a, como po exemplo meio de Sabou aud, mas nem semp e man êm as
ca ac e ís icas mo ológicas mac oscópicas de cada espécie. Classicamen e o meio de cul u a usado
pa a c escimen o e iden i icação di e encial do géne o
Aspe gillus
é o meio de aga de Czapek.
Mac oscopicamen e, a supe ície das colónias des es ungos ap esen a-se no início esb anquiçada e
depois assume co es e aspec os mui o a iá eis dependendo da espécie (Fig. 1.4), que ão desde os
ons de ama elo, e de ou cas anho cla os a é e de ou cas anho-escu o e p e o. A ex u a é
algodonada, pul e ulen a ou a eludada e o e e so das colónias é b anco, ama elo, acas anhado ou
neg o (58).
A
C
D
E
B
Fig. 1.4.
Figu as ilus a i as de cul u as de
Aspe gillus
: A -
Aspe gillus umiga us
; B -
Aspe gillus nige
; C -
Aspe gillus la us
, D -
Aspe gillus nidulans
; e E -
Aspe gillus e eus
Mic oscopicamen e, as hi as são sep adas e a pa i dessa e guem-se conidió o os aé eos, longos,
com esículas e minais sob e as quais nume osas iálides p oduzem longas cadeias de conídios
ae ossolizá eis (Fig. 1.5). A di e enciação das espécies é ei a com base na mo ologia dos
conidió o os e das iálides (58, 73).
23
2.1.2. Mé odos usados pa a a ex acção de DNA genómico de Aspe gillus
Os di e en es mé odos desc i os na li e a u a pa a ex acção do DNA de ungos ilamen os são
no malmen e mo osos e complicados de ido em g ande pa e à sua pa ede celula , que se e ela
bas an e complexa. Os mé odos pa a a ex acção de DNA das espécies de
Aspe gillus
u ilizam
no malmen e químicos óxicos, á ios passos de congelamen o e descongelamen o das amos as,
que podem mesmo se le adas a azo o líquido, e passos de agi ação com mic oes e as de id o,
sendo que a maio ia dos p ocedimen os é mo osa de ido à di iculdade na dis upção das pa edes
celula es. Po exemplo, o mé odo denominado de “
High-speed cell dis up ion
” oi es ado, em
1998, em algumas le edu as e dois ipos de ungos ilamen osos, sendo um deles o
Aspe gillus
umiga us
(Mulle
e al
. 1998). Es e p ocedimen o u iliza eagen es desna u an es e um mé odo
mecânico com mic oes e as de id o pa a lisa as células, o qual se demons ou e icaz e segu o,
an o pa a as le edu as como pa a os ungos ilamen osos. Os au o es deno a am, no en an o, que
es es úl imos ungos inham uma pa ede celula mui o ígida, não se e elando ácil a sua dis upção.
Os p ocedimen os de lise da pa ede celula a a és do congelamen o e descongelamen o das
amos as em á ios ciclos ou a incubação com de e gen es quen es e p o eases não são no malmen e
su icien es pa a ob e DNA de boa qualidade a pa i de ungos ilamen osos (F ed icks
e al
. 2005).
Exis em mui os mé odos desc i os pa a a ex acção de DNA genómico de ungos, incluindo ungos
do géne o
Aspe gillus
. A maio ia des es mé odos u iliza sis emas come ciais disponí eis no
me cado, que incluem eagen es p óp ios e, em alguns casos, são mesmo necessá ios ma e iais e
equipamen os especí icos pa a a execução desses mé odos. Os p o ocolos exis en es são u ilizados
na ex acção de DNA úngico a pa i de uma di e sidade de amos as, incluindo amos as
biológicas humanas, ecidos ege ais, e c.. Especi icamen e em elação à ex acção de DNA
genómico de ungos do géne o
Aspe gillus
, não exis e ainda um mé odo e icien e e aplicado
uni e salmen e. Aliás, Ka akousis
e al.
(2005) mos a am que não exis e um mé odo simples,
e icien e e uni e sal pa a lisa as pa edes celula es de odos ungos, sendo que os mé odos êm de
se mui as ezes op imizados pa a cada espécie. Cada labo a ó io acaba po adap a o melho

24
p o ocolo, dependendo da sua p óp ia o ina e do cus o associado ao mesmo. A maio ia dos
p o ocolos desc i os na li e a u a acaba ambém po se mo oso e complexo. Na Tabela 2.1 são
compa ados á ios mé odos come ciais de ex acção de DNA, usados em ungos, com base nos
cus os, empo e eagen es adicionais necessá ios.
Tabela 2.1.
Compa ação en e mé odos come ciais de ex acção de DNA (adap ado de F ed icks
e
al
. 2005)
Mé odo Tempo de
execução
Reagen es e consumí eis
adicionais
Equipamen o
necessá io
(MPY) P ecipi ação das
p o eínas, pu i icação do DNA
1h20m Isop opanol, e anol, ubos de
mic ocen í uga
Mic ocen í uga e placa
de aquecimen o
(MPPL) P ecipi ação alcoólica,
emoção inibido es do DNA e
e-p ecipi ação DNA
1h40m Isop opanol, e anol, ubos de
mic ocen í uga
Mic ocen í uga e placa
de aquecimen o
(SM) Lise com solução quen e
com de e gen e, p ecipi ação
das p o eínas, eliminação de
inibido es de PCR, p ecipi ação
alcoólica pa a pu i icação DNA
1h55m Tubos de mic ocen í uga Mic ocen í uga e placa
de aquecimen o
(UCS) Lise mecânica com
mic oes e as de id o, adso ção
e la agem do DNA em il o
2h40m Nenhum Mic ocen í uga e
adap ado de o ex
(FDNA) Lise mecânica com
mic oes e as de id o po
agi ação em equipamen o
p óp io (Fas P ep), adso ção e
la agem do DNA em coluna
1h15m Nenhum Mic ocen í uga e
máquina Fas P ep
(YL-GNOME) Lise
enzimá ica, p ecipi ação e
pu i icação do DNA
4h00m Isop opanol, ubos de mic ocen í uga Mic ocen í uga e placa
de aquecimen o
A pe o mance des es mé odos come ciais na ex acção de DNA de ungos oi es udada po
F ed icks
e al
. (2005). Os mé odos MPPL (
MAs e Pu e plan lea DNA pu i ica ion
” - Epicen e ,
Madison, WI), SM (
SoilMas e DNA ex ac ion
- Epicen e , Madison, WI) e YL-GNOME (
Yeas
cell lysis p epa a in plus GNOME
- Qbiogene, I ine, CA) mos a am-se de icien es na ex acção
25
de DNA a pa i de hi as de
Aspe gillus
. Já os mé odos UCS (
Ul aClean DNA isola ion
- MoBio,
Inc, Solana Beach, CA) e FDNA (Fas DNA - Qbiogene, I ine, CA) mos a am-se mais adequados
pa a a ex acção de DNA a pa i des es ungos, usando uma agi ação da amos a com mic os e as
pa a ompe a pa ede celula . Es es dois úl imos sis emas êm cus os mui o p óximos e in e médios
em elação aos ou os mé odos. An e io men e, já Mulle
e al
. (1998) inham demons ado que o
mé odo FDNA pa ecia unciona bem com
Aspe gillus umiga us
e ou as espécies de ungos
impo an es na clínica médica.
Os mé odos ísicos, químicos e enzimá icos pa a uma lise e icien e da pa ede celula de ungos
podem se uma al e na i a aos sis emas come ciais, com cus os mais baixos mas eque endo
no malmen e um pouco mais de empo. A compa ação de cada um des es mé odos indica que com
os agen es químicos, como o HCl e o NaOH, não se ob ém lise celula pa a o géne o
Aspe gillus
. A
diges ão enzimá ica (p.e. com p o einase K ou li icase) unciona apenas em 10% das amos as des e
ungo e a dis upção ísica das células pode se ú il em ce ca de 50 a 100% das amos as, dependo do
mé odo u ilizado. Pode-se ainda ob e uma média de 95% de amos as com a pa ede celula lisada
com o mé odo ísico de esmagamen o com um pilão e um mo ei o (Ka akousis
e al
. 2005).
Na selecção de um mé odo pa a a ex acção de DNA úngico, pa a além do endimen o, há ambém
de e em con a a qualidade e pu eza do DNA ob ido. Di e sos con aminan es inibi ó ios, como as
nucleases, os polissacá idos e os pigmen os, se não o em emo idos na ex acção, podem eduzi
signi ica i amen e a sensibilidade da eacção de PCR. Ou o ac o impo an e na op imização des e
ipo de mé odos é o cuidado no manuseamen o das amos as e ma e iais du an e a ex acção de
DNA de modo a e i a con aminações de o igem ambien al. Os ungos do géne o
Aspe gillus
, en e
ou os, são ubíquos no ambien e, sendo mui as ezes uma causa impo an e de con aminação e de
esul ados alsos posi i os nas eacções de PCR (Ka akousis
e al
. 2005; Loe le
e al
. 1999).
26
2.1.3. Objec i o do abalho des e capí ulo
Nes e Capí ulo são desc i os os p ocedimen os ealizados pa a a op imização de um mé odo de
ex acção de DNA genómico a pa i de cul u as de espécies de
Aspe gillus
, adap á el à o ina de
um labo a ó io de micologia clínica. O p incipal objec i o oi consegui op imiza um mé odo mais
e icaz pa a a lise da pa ede celula desses ungos, que osse pouco dispendioso, e icaz e ú il pa a a
o ina do labo a ó io.
27
2.2. Ma e iais e Mé odos
2.2.1. Es i pes u ilizadas
Fo am u ilizadas nes e abalho es i pes de espécies clinicamen e ele an es, ep esen a i as do
géne o
Aspe gillus
e p e iamen e iden i icadas po mé odos con encionais. Todas as es i pes são
man idas no Labo a ó io de Micologia do Ins i u o de Higiene e Medicina T opical. Es as es i pes
são man idas a – 70 ºC em meio de Sabou aud com 30% de glice ol. Pa a a ob enção de cul u as
escas, o am p imei amen e inoculadas em placas com meio de Sabou aud duas a ês ansadas de
micélio a pa i das cul u as congeladas. As placas o am incubadas du an e 72 h à empe a u a
ambien e. Seguidamen e, ês a qua o colónias en e an o o madas o am ans e idas pa a ubos
de ensaio com meio de cul u a líquido de ex ac o de le edu a (YM), u ilizando um bis u i e pinça
es e ilizadas e e i ando le a meio de cul u a sólido jun amen e com as colónias. As cul u as o am
incubadas du an e mais 72 h, com agi ação o bi al (200 pm) e sem a p esença de luz. Na Tabela 2.2
encon am-se indicadas as es i pes e espécies usadas nes e abalho.
Tabela 2.2.
Es i pes e espécies de
Aspe gillus
u ilizadas nes e abalho
Espécie Es i pe O igem
Aspe gillus e eus 2283 Sec eções b ônquicas (Ins i u o Po uguês de Oncologia)
10283 Sangue (Hospi al de San a Ma ia)
11283 Expec o ação (Ins i u o Po uguês de Oncologia)
Aspe gillus umiga us 5283 U ina (Hospi al de San a Ma ia)
7283 La ado b onco-al eola (Hospi al de San a Ma ia)
8283 La ado b onco-al eola (Ins i u o Po uguês de Oncologia)
Aspe gillus nige 6283 Sec eções b ônquicas (Hospi al S. Jo ge)
12283 La ado b onco-al eola (Ins i u o Po uguês de Oncologia)
Aspe gillus la us 3283 La ado b onco-al eola (Hospi al San a Ma ia)
Aspe gillus nidulans 4283 Expec o ação (Ins i u o Po uguês de Oncologia)
9283 Sec eções b ômquicas (Hospi al Egas Moniz)
Aspe gillus e sicolo 1283 La ado b onco-al eola (Ins i u o Po uguês de Oncologia)
Aspe gillus sp. 13283 U ina (Hospi al San a Ma ia)
28
2.2.2. Mé odos de ex acção de DNA genómico
Mé odo TL
No mé odo TL p epa a am-se ubos “Eppendo ” a que o am adicionados um olume equi alen e a
200

l de es e as de id o (
∅
0,4 – 0,6 mm) e 500
µ
l de Tampão de Lise 1 (T is 50 mM, EDTA 50
mM, SDS 0,3% (p/ ), pH 8). Dois a ês aglome ados de micélio c escidos em meio de cul u a
líquida o am e i ados pa a uma placa de Pe i es e ilizada, comp imindo-os p e iamen e con a as
pa edes do ubo de ensaio a im de aze a meno quan idade possí el de meio de cul u a. Com o
auxílio de uma pinça e bis u i es e ilizados à chama, os aglome ados de micélio o am la ados duas
a ês ezes em água des ilada es e ilizada pa a e i a odo o meio de cul u a. Em seguida, o
excesso de água oi emo ido dos aglome ados de micélio, comp imindo-os con a o id o da caixa
de Pe i. Fo am depois colocados nos ubos Eppendo com es e as de id o e Tampão de Lise 1 e a
suspensão esul an e oi agi ada o emen e no Vo ex du an e 15 minu os. Seguiu-se um passo de
incubação em banho de água a 65 ºC du an e uma ho a, após o que a suspensão oi no amen e
agi ada no Vo ex du an e 15 minu os e cen i ugada du an e mais 15 minu os a 11.000 g. O
sob enadan e, que con ém o DNA ex aído, oi depois e i ado pa a um no o ubo Eppendo ao
qual se adicionou 10
µ
l de P o einase K (0,5 mg/ml). Após uma incubação a 60 ºC du an e 60
minu os, a solução de DNA ex aído oi man ida a – 20 ºC a é u ilização.
Mé odo TL modi icado
O mé odo TL modi icado segue o mesmo p ocedimen o do mé odo TL, desc i o a ás, mas com
algumas modi icações. O passo de la agem do micélio oi e o çado pa a e a ce eza que os
inibido es da eacção de PCR e am emo idos, aumen ando pa a qua o as la agens do micélio. Po
ou o lado, os empos de agi ação em o ex da mis u a do micélio com as es e as de id o e o
ampão de lise o am aumen ados de 15 pa a 30 minu os, pa a en a uma melho up u a da pa ede
celula dos ungos.

29
Mé odo TE enol
No mé odo TE enol o am ambém e i ados e la ados dois a ês aglome ados de micélio a pa i
da cul u a líquida de meio YM, como desc i o an e io men e. O micélio oi p imei amen e suspenso
em 1,5 ml de água bides ilada es e ilizada, num ubo Eppendo de 2 ml, a que o am adicionados
p e iamen e ce ca de 200
µ
l de mic os e as de id o. A suspensão de micélio oi cen i ugada a
13.000 pm du an e 4 minu os, após o que se desca ou o sob enadan e. O sedimen o oi depois
congelado a – 20 ºC du an e 1 ho a, após o que se adicionou 250
µ
l de Tampão TE Fenol ( e i ado
do asco de enol, o ampão es á po cima do enol, na ase supe io ) pH 8, 250
µ
l de clo o ó mio e
500
µ
l de ampão de lise 1. A mis u a oi agi ada du an e 20 minu os no o ex e seguidamen e
cen i ugada du an e 30 minu os a 13.000 pm. De seguida, 400
µ
l do sob enadan e an e io o am
adicionados a 1 ml de e anol absolu o num ubo Eppendo de 1,5 ml e deixados a – 20 ºC du an e
45 minu os. Os ubos o am em seguida cen i ugados du an e 15 minu os a 13.000 pm. O
sob enadan e oi emo ido e deixou-se seca o sedimen o à empe a u a ambien e de modo a
emo e o e anol em excesso (es e p ocedimen o oi ealizado numa câma a de luxo lamina , mas
sem deixa seca demasiado o sedimen o). Finalmen e, o sedimen o oi dissol ido em 30
µ
l de
ampão TE (0,1M T is; 0,1M EDTA, pH 8) a 55 ºC du an e 15 minu os.
Mé odo AZ
No mé odo AZ, pa a a ex acção de DNA, dois a ês aglome ados de micélio o am la ados como
desc i o an e io men e e colocados em ubos Eppendo de 1,5 ml a que o am p e iamen e
adicionadas es e as de id o numa quan idade equi alen e a 200

l. Os ubos Eppendo o am
seguidamen e ime sos em azo o líquido du an e 5 minu os, de modo a eben a a pa ede celula dos
ungos, e ans e idos depois pa a gelo. Em seguida, o am adicionados 250 µl de enol, 250 µl de
clo o ó mio e 500 µl de ampão de lise 2 (100 mM NaCl, 10 mM T is-HCL pH 8.0, 1 mM EDTA,
2% T i on X-100, 1% SDS, 1% w/ PVPP). O PVPP oi adicionado ao ampão de lise 2
imedia amen e an es de se usado, de modo a elimina po enciais inibido es poli enólicos da eacção
30
de PCR. Os ubos o am agi ados no o ex du an e 20 minu os na o ação máxima e cen i ugados
a 14.500 pm du an e 25 minu os a 4 ºC. A ase aquosa do sob enadan e oi ans e ida pa a um
no o ubo Eppendo de 1,5 ml, ao qual se adicionou igual olume de isop opanol io e se agi ou
po in e são sua e. O isop opanol pe mi e uma maio co-p ecipi ação de sais que o e anol absolu o,
pe mi indo ainda uma maio p ecipi ação do DNA. Os ubos o am depois cen i ugados a 14.500
pm du an e 10 minu os, a 4 ºC, e o sob enadan e desca ado. O sedimen o oi la ado com 1 ml de
e anol a 70% io, seguindo-se uma no a cen i ugação a 14.500 pm du an e 5 minu os a 4 ºC (o
e anol elimina o excesso de sais). O sob enadan e oi desca ado e o sedimen o seco com o ubo
abe o e in e ido, à empe a u a ambien e, du an e 5 a 10 minu os ( endo o cuidado pa a não deixa
seca demais). O sedimen o oi depois dissol ido em 50 µl de ampão TE + RNAse A (10 mM T is
pH 8, 1 mM EDTA dissódico pH 8,50 µl.ml
-1
RNAse A), incubando os ubos du an e 15 minu os a
55 ºC, agi ando ocasionalmen e. A solução de DNA assim ob ida oi depois man ida a – 20 ºC a é
u ilização.
2.2.3. A aliação da e iciência dos mé odos de ex acção de DNA
A a aliação da e iciência da ex acção de DNA oi e ec uada co endo uma alíquo a da solução de
DNA ex aído numa elec o o ese em gel de aga ose. Foi ealizada uma elec o o ese em gel de
aga ose a 2% em 100 ml de ampão TBE 0,5x, ao qual o am adicionados 2
µ
l de b ome o de e ídio
(2mg/ml). O ma cado de pesos molecula es u ilizado oi o Molecula Ma ke GeneRule
TM
DNA
Ladde Mix. Pa a a elec o o ese o am adicionados 2
µ
l da solução de aplicação co ada a 7
µ
l da
solução de DNA. A elec o o ese deco eu a 100V du an e 40 minu os. As bandas o am
isualizadas num ansiluminado (UVi ec, Reino Unido) de luz ul a iole a e as imagens cap adas
com um sis ema de aquisição de imagem digi al (MITSUBISHI P93).
Adicionalmen e, em odos os p o ocolos es ados nes e abalho con i mou-se a exis ência ou
inexis ência de DNA ex aído da amos a a a és de uma eacção de PCR com os
p ime s
uni e sais pa a ungos ITS1 (TCCGTAGGTGAACCTGCGG) e ITS4
31
(TCCTCCGCTTATTGATATGC), com o seguin e p og ama: passo inicial de desna u ação a 95ºC
du an e 5 minu os; 94ºC du an e 45 segundos, 54ºC du an e 30 segundos, 72ºC du an e 1 minu os,
com 40 ciclos; e um passo inal de ex ensão a 72ºC du an e 5 minu os. A mis u a eaccional
con inha 23,8
µ
l de água bides ilada es é il (B aun), 5,0
µ
l de ampão 10x, 6,0
µ
l de MgCl
2
25 mM,
8,0
µ
l de dNTPs 1,25 mM, 3,0
µ
l de cada
p ime
uni e sal
[
5
µ
M
]
, 0,2
µ
l de Taq 1U e 1
µ
l de DNA
de cada amos a.
2.3. Resul ados e Discussão
Os mé odos desc i os pa a a ex acção de DNA de ungos ilamen osos do géne o
Aspe gillus
são
inúme os. Es es ungos ep esen am uma di iculdade ac escida pa a a ex acção de DNA de ido à
ígida pa ede celula que possuem, que é bas an e di ícil de lisa . Fo am es ados di e en es
mé odos, e a iações desses mé odos, pa a encon a aquele que osse mais adequado e e icien e
pa a as nossas condições expe imen ais. O p imei o mé odo a se es ado oi o mé odo TL, um
p ocesso que u iliza uma lise mecânica com mic oes e as de id o associada à incubação da amos a
a ele adas empe a u as. No en an o, es e mé odo e elou-se bas an e de icien e na ecupe ação de
ácidos nucleicos a pa i das á ias espécies de
Aspe gillus
es adas, não se isualizando quaisque
indícios de DNA ex aído após a ealização de elec o o ese em gel de aga ose com alíquo as da
solução esul an e da ex acção. Numa en a i a de melho a a e iciência da ex acção, oi es ado
em seguida o mé odo TL modi icado, em que o am aumen ados o núme o de la agens do micélio e
o empo de incubação em que deco eu a lise celula . Es e mé odo TL modi icado, no en an o,
ambém não oi o almen e e icaz. Aquando da u ilização das espec i as soluções de DNA ex aído
em eacções de PCR, usando
p ime s
uni e sais pa a ungos, apenas se egis ou ampli icação dos
agmen os de DNA co esponden es pa a as espécies
A. nidulans
(es i pe nº. 4283) e
A. umiga us
(es i pe nº. 7283) (Fig. 2.1.). A u ilização de di e en es diluições das soluções de DNA ex aído
(1:750; 1:500 e 1:200) na mis u a eaccional de PCR não melho a am os esul ados ob idos nas
ampli icações. Assim, es e mé odo e elou-se ambém pouco e icaz pa a a ex acção de DNA a
32
pa i de odas as espécies de
Aspe gillus
es adas, apesa de e uncionado bem pa a algumas
es i pes.
4283
10283
12283
7283
3283
1283
M
CP
Fig. 2.1.
Ilus ação dos esul ados ob idos em eacções de PCR com os
p ime s
uni e sais pa a ungos ITS1 e ITS4, usando como DNA molde as
soluções ex aídas com o mé odo TL modi icado. As es i pes usadas nes a
expe iência o am: 4283 (
A. nidulans
); 10283 (
A. e eus
); 12283 (
A. nige
);
7283 (
A. umiga us
); 3283 (
A. la us
); e 1283 (
A. e sicolo
). M - ma cado
de pesos molecula es de 100 pb (GeneRule
TM
). CP - con olo posi i o da
eacção de PCR com DNA ex aído de
Candida albicans
.
O e cei o mé odo es ado pa a a ex acção de DNA oi designado de TE enol. Es e mé odo associa
uma lise mecânica com mic oes e as de id o, a u ilização de agen es químicos pa a a lise e o
congelamen o/descongelamen o das amos as. Es e mé odo de ex acção e elou-se e icaz pa a a
ex acção de DNA apenas pa a algumas das espécies de
Aspe gillus
, nomeadamen e pa a
A.
nidulans
e
A. la us
(Fig. 2.2). A ex acção de DNA a pa i de
A. nige
mos ou-se pouco
ep odu í el e e icien e. Não oi de ec ado qualque DNA ex aído pa a as es an es espécies de
Aspe gillus
es adas.
39
e eus
,
A. la us
,
A. nidulans
,
A. nige
e
A. us us
a pa i de doen es com aspe gilose in asi a. A
egião ITS oi assim ampli icada e sequenciada. A sequência oi compa ada com ou as sequências
de espécies e e enciadas em bases de dados públicas (GenBank). Hin ikson
e al.
(2005b)
a alia am as egiões D1 e D2 da subunidade maio do RNA ibossómico e a egião ITS pa a a
iden i icação de 13 espécies de
Aspe gillus
ele an es a ní el clínico, incluindo
A. la us
,
A.
umiga us
,
A.
nidulans
,
A. nige
,
A. e eus
e
A. e sicolo
. Os au o es concluí am que as sequências
nucleo ídicas disponí eis nas bases de dados públicas, como o GenBank, ainda são incomple as e,
algumas, ap esen am uma qualidade bas an e du idosa. No en an o, e i ica am ambém que a
egião ITS e a a mais adequada pa a a disc iminação en e as espécies de
Aspe gillus
.
Alguns es udos êm desc i o écnicas de PCR-
mul iplex
pa a a di e enciação en e á ias espécies
mic obianas numa mesma eacção, incluindo espécies de
Aspe gillus
. Po exemplo, Luo e Mi chell
(2002) aplica am es a ecnologia pa a iden i icação de múl iplas espécies pa ogénicas de ungos.
Es es au o es desenha am cinco
p ime s
especí icos com al os complemen a es na egião ITS de
Candida albicans
,
C. glab a a
,
C. pa apsilosis
,
C. opicalis
e de
A. umiga us
. Quando aplicados
num sis ema en ol endo duas eacções de PCR-
mul iplex
, os au o es mos a am se possí el a
iden i icação das á ias espécies úngicas com es es
p ime s
, a pa i de DNA ex aído ou
di ec amen e a pa i das colónias dos ungos. O sis ema ap esen ou uma especi icidade e
sensibilidade de 100%, e elando-se uma al e na i a ápida e iá el pa a a iden i icação de espécies
de ungos clinicamen e ele an es (Luo e Mi chell 2002). Nou o exemplo, apesa de não se
p op iamen e um PCR-
mul iplex
, Zhao
e al
. (2001) desenha am um pa de
p ime s
especí icos pa a
A. umiga us
, baseados ambém na egião ITS. A especi icidade e a sensibilidade dos
p ime s
o am
a aliadas usando 24 isolados de
A. umiga us
e a ian es e 41 isolados de ou as espécies de
Aspe gillus
,
Candida
e espécies de bac é ias. O mé odo desen ol ido mos ou-se especi ico e com
um ele ado ní el de sensibilidade na iden i icação da espécie
A. umiga us
e de ou as espécies
p óximas. Num exemplo mais ecen e, Logo he i
e al
. (2008) desen ol e am um sis ema de PCR-
mul iplex
pa a a disc iminação en e as espécies
A. umiga us
,
A. la us
,
A. nige
e
A. e eus
. Nes e

40
es udo, no en an o, com a excepção de
A. e eus
, o am usadas ou as egiões do genoma que não a
egião ITS pa a o desenho dos
p ime s
especí icos, nomeadamen e os genes da
aspe gillopepsin
.
3.1.2. Objec i os dos abalhos des e capí ulo
No Capí ulo III des a disse ação são desc i os os abalhos ealizados no sen ido do
desen ol imen o de um sis ema de iden i icação molecula pa a as espécies clinicamen e ele an es
de
Aspe gillus
. Em p imei o luga , oi ealizado um es udo do es ado da a e pa a selecciona as
espécies de
Aspe gillus
clinicamen e ele an es. Em segundo luga , as sequências nucleo ídicas da
egião ITS dessas e de ou as espécies de ungos o am ecolhidas a pa i de bases de dados
públicas. Em e cei o luga , oi ealizada uma análise compa a i a das sequências de DNA com
is a à selecção de segmen os especí icos pa a cada espécie de
Aspe gillus
clinicamen e ele an e.
Em qua o luga , o am desenhados sis emas de
p ime s
, com base nos segmen os encon ados, que
pe mi issem disc imina en e as espécies de
Aspe gillus
seleccionadas. Em quin o e úl imo luga ,
o am ealizadas expe iências de PCR, baseadas nos sis emas de
p ime s
desenhados, pa a a
iden i icação das espécies de
Aspe gillus
. Es as expe iências p elimina es cons i uem uma base pa a
o desen ol imen o de um sis ema de PCR-
mul iplex
pa a a iden i icação de espécies clinicamen e
ele an es de
Aspe gillus
.
41
3.2. Ma e iais e Mé odos
3.2.1. Selecção das espécies de Aspe gillus clinicamen e ele an es
Foi decidido op imiza um sis ema de iden i icação molecula pa a espécies de
Aspe gillus
clinicamen e ele an es, nomeadamen e esponsá eis po casos de aspe gilose in asi a. Nes e
sen ido, oi ei o um le an amen o das p incipais espécies a a és de uma pesquisa na li e a u a da
especialidade, nomeadamen e já e e enciada no Capí ulo I des a disse ação. Com base na
in o mação ecolhida, o am seleccionadas pa a o es udo as seguin es espécies:
A. la us
,
A.
umiga us
,
A. nidulans
,
A. nige
e
A. e eus
.
3.2.2. Desenho de p ime s especí icos
Foi desen ol ido an e io men e um conjun o de p og amas in o má icos, designado YEAST 3000,
pa a o desenho in eg ado de sondas e
p ime s
especí icos de DNA (Inácio 2003). Es as e amen as,
desen ol idas pa a o ambien e Windows e em cons an e ac ualização, cob em odo o p ocesso do
desenho de sondas, desde a pesquisa e ecolha de sequências de DNA a pa i de bases de dados
públicas (SEQUENCE SEARCH ENGINE), a selecção de segmen os especí icos (PROBE
DESIGN) e o es e da especi icidade
in silico
das egiões-al o seleccionadas (PROBE MATCH).
Com base nes es p og amas in o má icos, o am ecolhidas cen enas de sequências da egião ITS de
Aspe gillus
spp. disponí eis a pa i da base de dados pública GenBank. Em seguida, oi ealizada
uma análise compa a i a dessas sequências e seleccionados segmen os especí icos pa a cada
espécie de
Aspe gillus
clinicamen e ele an e, an e io men e seleccionadas. Fo am em seguida
desenhados
p ime s
especí icos pa a cada espécie, com base nas egiões encon adas. Cada um
des es
p ime s
especí icos, em conjun o com um dos
p ime s
uni e sais ITS1
(TCCGTAGGTGAACCTGCGG) ou ITS4 (TCCTCCGCTTATTGATATGC), de e ia pe mi i a
ampli icação especí ica de um agmen o de DNA a pa i de cada uma das espécies
A. la us
,
A.
umiga us
,
A. nidulans
,
A. nige
e
A. e eus
.
42
3.2.3. Espécies e es i pes u ilizadas nes e abalho
As espécies e es i pes de
Aspe gillus
u ilizadas nes e abalho o am as que es ão e e enciadas na
Tabela 2.2 do Capí ulo II.
3.2.4. Ex acção de DNA
Pa a a ex acção de DNA a pa i das cul u as de
Aspe gillus
oi u ilizado o P o ocolo AZ desc i o
nos Ma e iais e Mé odos do Capí ulo II.
3.2.5. Reacções de PCR
Cada pa de
p ime s
[
p ime
especí ico +
p ime
uni e sal (ITS1 ou ITS4)] oi es ado em eacções
de PCR simples. U iliza am-se pa a es es ensaios mis u as eaccionais que con inham 1,8
µ
l de
MgCl
2
[
25 mM
]
, 2,4
µ
l de dNTPs
[
1,25 mM cada
]
, 0,9
µ
l de cada
p ime
[
5
µ
M
]
, 0,12
µ
l de
polime ase (Taq, 1U) e 1,5
µ
l do espec i o ampão 10×, e 7,34
µ
l de solução diluída (1:50) de
DNA ex aído. Pa a con olo nega i o adicionou-se água des ilada na mis u a eaccional em
subs i uição da solução de DNA. O p og ama de PCR u ilizado oi iniciado com um pe íodo de 5
minu os a 95 ºC, seguido de 40 ciclos consis indo em 94 ºC du an e 45 segundos, 54 ºC du an e 30
segundos e 72 ºC du an e 1 minu o. O úl imo passo do p og ama consis iu numa ex ensão inal a 72
ºC du an e 5 minu os. Os p odu os de ampli icação o am analisados a a és de uma elec o o ese
em gel de aga ose, al como es á desc i o nos Ma e iais e Mé odos do Capí ulo II.
43
3.3. Resul ados e Discussão
A sis emá ica de ungos do géne o
Aspe gillus
baseia-se p incipalmen e em ca ac e ís icas
mo ológicas, po ezes ambíguas, le ando a que mui as espécies pa eçam se , de ac o, complexos
de espécies quando analisadas com base em mé odos molecula es. Po exemplo, es i pes
classi icadas po mé odos adicionais como
A. la us
,
A. o yzae
e
A. pa asi icus
apa ecem mui o
p óximas en e si, em ag upamen os poli ilé icos, quando analisadas ilogene icamen e com base
nas suas sequências do DNA. Nes e con ex o, oi impossí el desenha
p ime s
comple amen e
especí icos pa a odas as es i pes classi icadas como
A. la us
,
A. umiga us
,
A nidulans
ou
A. nige
.
Op ou-se assim po desenha
p ime s
especí icos pa a g upos de espécies elacionadas de
Aspe gillus
, em elação aos quais as espécies a ás e e idas são as p incipais ep esen an es (Tabela
3.1).
Tabela 3.1.
P ime s
desenhados nes e abalho, com base na egião ITS, pa a espécies de
Aspe gillus
clinicamen e ele an es
Designação
do p ime
Sequência (5’ – 3’) Espécies al o F agmen os
ampli icados
1
A la _F cca cga ac c g c ga c a g A. la us (+ A. pa asi icus; A.
o yzae; A. sojae, e c.)
595 + 439
A um_R c g ca ac c aga aca gcg A. umiga us (+ A. b e ipes, e c.) 597 + 188
Anidul_R ccg ccg aag caa cag g A. nidulans (+ A. e sicolo , e c.) 570 + 98
Anig_R ggc caa cc ac aga gca g A. nige (+ A. ibe icus, e c.) 599 + 505
A e _R gc aag c ca gaa cag gg A. e eus 608 + 187
1
F agmen os espe ados em eacções de PCR usando uma mis u a dos dois
p ime s
uni e sais (ITS1
+ ITS4) e cada um dos
p ime s
especí icos (o agmen o com maio peso molecula co esponde à
ampli icação da egião ITS com os
p ime s
uni e sais)
Cada espécie, ou conjun o de espécies elacionadas, pode se eo icamen e iden i icada em eacções
de PCR usando uma mis u a com o
p ime
especí ico espec i o e um dos
p ime s
uni e sais ITS1
ou ITS4, dependendo da o ien ação do
p ime
especí ico: A la _F + ITS4 (
A. la us
: agmen o
44
especí ico com 439 pb); A um_R + ITS1 (
A. umiga us
: agmen o especí ico com 188 pb);
Anidul_R + ITS1 (
A. nidulans
: agmen o especí ico com 98 pb); Anig_R + ITS1 (
A. nige
:
agmen o especí ico com 505 pb); e A e _R + ITS1 (
A. e eus
: agmen o especí ico com 187 pb).
A especi icidade de cada
p ime
especí ico pa a as espécies-al o oi a aliada a a és de eacções de
PCR. Em cada eacção o am usadas as mis u as de
p ime
especí ico e
p ime
uni e sal espec i o
(ITS1 ou ITS4), usando como DNA molde amos as de espécies al o e de con olo nega i o de
Aspe gillus
.
Num es e p é io, oi a aliado se as alíquo as de solução de DNA molde das es i pes de
Aspe gillus
em es udo es a am em boas condições. Fo am, assim, ealizadas eacções de PCR com essas
alíquo as apenas com os
p ime s
uni e sais ITS1 e ITS4 (Fig. 3.1).
M
1283
3283
4283
9283
5283
7283
6283
12283
10283
CN
M
1283
3283
4283
9283
5283
7283
6283
12283
10283
CN
Fig. 3.1.
Resul ado da ampli icação com os
p ime s
uni e sais ITS1 e ITS4 a pa i
das soluções de DNA das á ias es i pes de
Aspe gillus
em es udo: 1283 (
A.
e sicolo
); 3283 (
A. la us
); 4283 e 9283 (
A. nidulans
); 5283 e 7283 (
A. umiga us
);
6283 e 12283 (
A. nige
); e 10283 (
A. e eus
). M - ma cado de pesos molecula es de
100 pb (GeneRule
TM
); CN – Con olo Nega i o.
Com a excepção da es i pe 5283, pe encen e à espécie
A. umiga us
, odas as es i pes es adas
ap esen a am semp e bandas in ensas co esponden es ao agmen o uni e sal ampli icado ( egião
ITS). A ex acção de DNA a pa i da cul u a da es i pe 5283 e elou-se semp e mui o pouco

45
e icien e em odas as expe iências em que al p ocedimen o oi e ec uado. Na ealidade, á ios
au o es êm desc i o a di iculdade da ex acção de DNA a pa i de cul u as de
Aspe gillus
, com
especial ên ase pa a a espécie
A. umiga us
( e Cap. II).
As mis u as de
p ime
especí ico e
p ime
uni e sal espec i o o am em seguida es adas, em
eacções de PCR sepa adas. Os esul ados ob idos es ão ilus ados na Figu a 3.2. Com es as
expe iências obse ou-se pa a o
p ime
especí ico A la _F, que hou e uma co ec a ampli icação
com a espec i a espécie-al o
A. la us
(es i pe 3283). No en an o, obse ou-se ambém uma
ampli icação o e com a es i pe de
A. e sicolo
usada (1283). Mais do que uma ampli icação
c uzada com es a espécie, os nossos esul ados apon am an es pa a uma con aminação des a es i pe
com DNA de
A. la us
. As es an es espécies de
Aspe gillus
mos a am ambém uma ampli icação
mais aca com es es
p ime s
, o que pode á es a elacionado com as condições ela i amen e pouco
es ingen es usadas nas eacções de PCR. Pa a o
p ime
especí ico A um_R hou e uma co ec a
ampli icação pa a a es i pe de
A. umiga us
es ada (7283). No en an o, o am ampli icadas ambém
pa a es a es i pe algumas bandas não especí icas ap esen ando ou os pesos molecula es. Também a
es i pe de
A. e eus
(10283) es ada ap esen ou ampli icação não especí ica com es e
p ime
. O
p ime
especí ico A e _R pe mi iu a ampli icação co ec a da es i pe de
A. e eus
(10283),
obse ando-se ainda uma ampli icação não especí ica, mas mui o menos in ensa, com a es i pe de
A. la us
. O
p ime
Anid_R pe mi iu a ampli icação co ec a com as es i pes de
A. nidulans
(3283)
e de
A. e sicolo
(1283). No en an o, oi ambém obse ada uma ampli icação não especí ica com
a es i pe de
A. nige
(6283). Po úl imo, o
p ime
Anig_R pe mi iu apenas a ampli icação especí ica
da es i pe de
A. nige
(6283).
46
187/188 pb
439 pb
MM
1283
3283
4283
7283
6283
10283
CN
1283
3283
4283
7283
6283
10283
CN
1283
3283
4283
7283
6283
10283
CN
A la _F + ITS4 A um_R + ITS1 A e _R + ITS1
M
1283
3283
4283
7283
6283
10283
CN
1283
3283
4283
7283
6283
10283
CN
Anid_R + ITS1 Anig_R + ITS1
98 pb
505 pb
187/188 pb
439 pb
MM
1283
3283
4283
7283
6283
10283
CN
1283
3283
4283
7283
6283
10283
CN
1283
3283
4283
7283
6283
10283
CN
A la _F + ITS4 A um_R + ITS1 A e _R + ITS1
M
1283
3283
4283
7283
6283
10283
CN
1283
3283
4283
7283
6283
10283
CN
Anid_R + ITS1 Anig_R + ITS1
98 pb
505 pb
M
1283
3283
4283
7283
6283
10283
CN
1283
3283
4283
7283
6283
10283
CN
Anid_R + ITS1 Anig_R + ITS1
98 pb
505 pb
Fig. 3.2.
Reacções de PCR com o
p ime
especí ico e o espec i o
p ime
uni e sal em
mis u as eaccionais sepa adas. Es i pes: 1283 (
A. e sicolo
); 3283 (
A. la us
); 4283 (
A.
nidulans
); 7283 (
A. umiga us
); 6283 (
A. nige
); e 10283 (
A. e eus
). M - ma cado de
pesos molecula es de 100 pb (GeneRule
TM
); CN – Con olo Nega i o.
47
Os esul ados p elimina es ob idos com as expe iências an e io es suge em que os
p ime s
desenhados pe mi em a ampli icação especí ica de DNA a pa i das espec i as espécies al o. No
en an o, a oco ência de algumas ampli icações não especí icas com espécies não al o de
Aspe gillus
indicam que a eacção de PCR p ecisa ainda de se ajus ada de modo a aumen a a
especi icidade da mesma. Apenas após es e passo de op imização das eacções de PCR indi iduais
se pode á passa ao desen ol imen o de mis u as de
p ime s
especí icos, em eacções de PCR-
mul iplex
, de modo a pe mi i a iden i icação das di e en es espécies al o de
Aspe gillus
.
48
CAPÍTULO IV
Conside ações inais
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