Uni e sidade No a de Lisboa
Es udos do e ei o da P o eína Recombinan e
Aki in na In eção po Plasmodium be ghei em
Anopheles gambiae s.s.
Má io João Ama o da Cos a
DISSERTAÇÃO PARA A OBTENÇÃO DO GRAU DE MESTRE EM
PARASITOLOGIA MÉDICA
Ou ub o, 2012
Uni e sidade No a de Lisboa
Ins i u o de Higiene e Medicina T opical
Es udos do e ei o da P o eína Recombinan e Aki in na
In eção po Plasmodium be ghei em Anopheles gambiae s.s.
Má io João Ama o da Cos a
Disse ação ap esen ada pa a cump imen o dos equisi os necessá ios à
ob enção do g au de Mes e em Pa asi ologia Médica
O ien ado :
P o . Dou o a Ana Domingos (UEIPM/IHMT/UNL)
Coo ien ado :
P o . Dou o Hen ique Sil ei a (UEIPM /IHMT/UNL)
Ou ub o, 2012
Em ua memó ia,
po que g ande pa e
do que sou hoje se de e a i…
i
AGRADECIMENTOS
À minha o ien ado a Dou o a Ana Domingos, po odos os ensinamen os
ansmi idos, pela ajuda na solução de odos os p oblemas, po me e ei o
“c esce ” enquan o in es igado e pessoa, e po me e ajudado a man e a calma
quando as coisas não co iam como espe ado. Ob igado po oda a paciência,
p eocupação e conselhos.
Ao meu coo ien ado Dou o Hen ique Sil ei a, po odos os ensinamen os
ansmi idos nes e “mundo” que é a Malá ia, po odas as c í icas/suges ões e pela
paciência que e e du an e odo es e ano de abalho.
Ao Dou o Jose de la Fuen e po e cedido ma e ial indispensá el a es e
abalho, po e possibili ado a minha es adia no IREC, pelos seus incen i os,
suges ões e co eções ealizadas ao longo de odo o abalho.
Ao P o . Dou o Paulo Almeida pela excelen e coo denação des e mes ado.
Ag adeço a odo o g upo de abalho. À Ana Cus ódio po odo o apoio
p es ado, pela paciência que e e comigo e pela ajuda na ealização de odo o
abalho p á ico. À Luisa Simões pelas suges ões, p eocupação e pela sua
disponibilidade pa a me auxilia semp e que necessá io. À La a Bo ges e Sand a
An unes pelos ensinamen os ansmi idos e pelo apoio na ealização do abalho. À
Ana Ca a ina Al es pela p odução dos mosqui os e po me disponibiliza os
mesmos, só assim oi possí el a ealização do abalho. Um since o ob igado a
odas.
A odos as amizades que iz nes es dois anos no IHMT, pela ajuda na
ealização de abalho e/ou po odos os momen os di e idos que me
p opo ciona am e pela “ amília” que o mamos nes a casa. Sem ocês es es dois
anos não se iam a mesma coisa, o am ocês que o na am es e abalho mais ácil.
Ag adeço especialmen e, ao “S . P esiden e” Rena o Fe nandes po odas as
“si uações di e idas” e pela colabo ação na ealização des e abalho; ao “S .”
Gonçalo Seixas pelos almoços di e idos; à Leono Pinho pelos bons momen os que
p opo cionou e pelas “ a eias” que me deu; à Fábia Gomes, apesa de e mos
con i ido pouco empo nes e Ins i u o, icou uma amizade, ob igado pelas
b incadei as e pela es adia em Mad id; à Ma a Machado pela sua “an ipa ia e má
ii
disposição”, enho de admi i que sem esse mau ei io os empos passados no
labo a ó io não se iam ão bons.
Aos meus colegas e amigos de Mes ado, pelas pessoas que o am e pelos
momen os que i emos jun os, que jamais se ão esquecidos. Fomos como uma
amília nes es dois anos, pa a o bom e pa a o mal! Ag adeço po me e em a u ado e
pela ossa paciência. Ob igado Ana Sousa, Ana Filipa Teixei a, Isa Pi es, Idalécia
Moiane, A le e T oco, Lis Coelho (Docinho de Geleia), Mónica Gue a e Miguel
Landum. Tenho que sauda em especial um memb o des a amília, não só pela
ENORME pessoa e AMIGO que é, mas po odo o apoio nos “al os e baixos” que
passamos jun os, o Vasco Go dicho. Só po e conhecido a ua pessoa já aleu a
pena e ei o es e mes ado, ob igado!
Muchisimas g acias às pessoas que me “acolhe am” e ajuda am du an e a
es adia em Ciudad Real, e que o na am esses empos inesquecí eis, pelos
bo ellóns, cenas in e nacionais e la amilia ONU. Um ag adecimen o especial ao
Juan Mo eno-Cid, pela sua amizade e pelos g andes momen os que passamos
jun os. Has a luego amigos.
Aos meus amigos pelos momen os de descon ação p opo cionados,
especialmen e ao Ped o, Fábio, Tiaguinho e Nuno.
Teço os meus mais since os ag adecimen os às duas pessoas mais
impo an es da minha ida, os meus pais. Po me apoia em em odas as minhas
decisões, po me p opo ciona em obje i os de ida mais ambiciosos e po odos os
es o ços que êm ei o pa a me ajuda a chega a é aqui. OBRIGADO!
O meu since o ag adecimen o às “ou as” duas pessoas (não menos)
impo an es na minha ida, po me e em ajudado no que podiam e mesmo no que
não podiam, os meus segundos pais. Que o ag adece especialmen e ao meu a ô,
po e iniciado es a e apa da minha ida ao meu lado e que in elizmen e não a pôde
e mina da mesma o ma. Sei que acompanhas de ou a o ma. Ob igado po udo
aos dois.
À Cá ia, mais que uma namo ada, és a pessoa que es á semp e ao meu lado,
que a u a o meu péssimo mau ei io quando as coisas co em mal (não sei como!), e
que me apoia e c í ica em odas as minhas decisões. Ob igado po udo, és
essencial!

i
RESUMO
Es udos do E ei o da P o eína Recombinan e Aki in na In eção com
Plasmodium be ghei em Anopheles gambiae s.s.
Má io João Ama o da Cos a
A malá ia é conside ada uma das doenças mais impo an es ansmi ida pelos
mosqui os, endo um g ande impac o nos países não desen ol idos. O con olo da
malá ia con inua o emen e dependen e do uso de á macos e es a égias pa a
con olo do e o . Como mui os compos os an i-malá icos já não são e icazes,
no as es a égias de con olo são u gen emen e necessá ias, especialmen e de ido
ambém ao ac o de exis i em poucos á macos disponí eis e não exis i em acinas
ap o adas. As p o eínas aki in cons i uem um g upo ecen emen e enomeado de
p o eínas conse adas em inse os e e eb ados. O gene aki in a ua em pa alelo
com o a o de ansc ição NF-kB, a jusan e na ia Imd, endo uma o e a i idade
an i-plasmódio. O o ólogo da aki in nas ca aças, subolesin, em-se e elado como
um an igénio p o e o con a ca aças em Ixodes scapula is. Es udos ecen es
mos a am uma edução na sob e i ência e/ou e ilidade des es e o es, após a
alimen ação em hospedei os imunizados com os an igénios aki in e subolesin.
Nos nossos ensaios, oi ealizado o silenciamen o do gene aki in po RNAi
em Anopheles gambiae s.s.. Os esul ados ob idos mos am uma diminuição na
p odução de o os de 39%, um aumen o da in ensidade de in eção de 35% e uma
diminuição da sob e i ência de 17%.
Es es esul ados o alecem dados an e io es ela i os à impo ância do gene
aki in no sis ema imune, suge indo ambém o seu papel na ep odução. Os nossos
dados e o çam a hipó ese de que a aki in pode cons i ui um po encial an igénio
p o e o pa a o con olo do mosqui o.
Expe iências sob e a alimen ação na u al de An. gambiae s.s. em mu ganhos
imunizados com aki in o am ealizados em pa alelo mas os esul ados ob idos não
mos a am p o eção con a a in eção po Plasmodium sp..
PALAVRAS-CHAVE: Anopheles gambiae, Plasmodium, aki in, an igénio p o e o
silenciamen o, malá ia
ABSTRACT
S udys o he E ec o he Recombinan P o ein Aki in on he
in ecion wi h Plasmodium be ghei in Anopheles gambiae s.s.
Má io João Ama o da Cos a
Mala ia is conside ed one o he mos impo an diseases ansmi ed by
mosqui o, ha ing a g ea impac on unde de eloped coun ies. Mala ia con ol is s ill
hea ily dependen o he use o d ugs and ec o con ol s a egies. As many an i-
mala ial compounds a e no longe e ec i e, new con ol app oaches a e u gen ly
needed, especially due oo he ac ha a e ew d ugs a ailable and no app o ed
accines. Aki ins cons i u e a ecen ly enamed g oup o e olu iona ily conse ed
p o eins in insec s and e eb a es. The gene aki in ac s in pa allel wi h he NF-kB
ansc ip ion ac o downs eam o he Imd pa hway ha ing a po en an i-Plasmodium
ac i i y. Subolesin, he o holog o aki in in icks, was e ealed as a ick p o ec i e
an igen in Ixodes scapula is. Recen s udies showed a educ ion in he su i al and/o
e ili y o hese ec o s a e eeding in hos s immunized wi h subolesin and aki in
an igens.
In ou expe imen s, aki in gene knockdown by RNAi in Anopheles gambiae s.s.
we e ca ied on. Resul s ob ained showed a dec ease in eggs p oduc ion o 39%, an
inc eased in ec ion in ensi y o 35% and a dec ease on su i al o 17%.
Toge he , hese esul s s eng hen p e ious da a conce ning he impo ance o
aki in gene in he immuni y sys em, sugges ing as well i s ole on he ep oduc ion. Ou
da a ein o ce ha aki in may cons i u e a po en ial p o ec i e an igen o he con ol o
mosqui o.
Expe imen s ega ding An.gambiae s.s. mosqui oes na u al eeding on mice
immunized wi h aki in we e as well de eloped bu he esul s ob ained didn’ show any
p o ec ion agains Plasmodium sp. in ec ion.
KEYWORDS: Anopheles gambiae, Plasmodium, aki in, p o ec i e an igen,
knockdown; mala ia
i
ÍNDICE GERAL
1. INTRODUÇÃO ......................................................................................................... 1
1.1 MALÁRIA ............................................................................................................ 4
1.1.1 Pa asi a ........................................................................................................ 4
1.1.1.1 Classi icação sis emá ica do pa asi a ................................................... 4
1.1.1.2 Ciclo de ida de Plasmodium spp. ...................................................... 5
1.1.2 Ve o ........................................................................................................... 7
1.1.2.1 Classi icação sis emá ica do géne o Anopheles .................................. 7
1.1.2.2 Bioecologia .......................................................................................... 7
1.2 MODELOS EXPERIMENTAIS ............................................................................... 8
1.2.1 Pa asi a – Plasmodium be ghei ................................................................... 9
1.2.2 Ve o ........................................................................................................... 9
1.3 VACINAS .......................................................................................................... 10
1.3.1 Vacinas an i- espo ozoí o (P é-e i oci á ias) ........................................... 11
1.3.2 Vacinas baseadas nas o mas sanguíneas assexuadas do pa asi a ............ 12
1.3.3 Vacinas baseadas nos game óci os do pa asi a (Vacinas de Bloqueio de
T ansmissão – TBV) ................................................................................................ 12
1.3.4 Vacinas baseadas em plasmídeos de DNA ou o ganismos i os
ecombinan es .......................................................................................................... 13
1.3.5 Vacinas an i- e o iais ............................................................................... 14
1.4 INTERAÇÃO PARASITA – VETOR ...................................................................... 16
1.4.1 Sis ema imunológico dos inse os .............................................................. 16
1.4.1.1 O sis ema imunológico do mosqui o ................................................. 18
1.4.2 Função da Aki in ...................................................................................... 22
1.4.2.1 Nos mamí e os ................................................................................... 24
1.4.2.2 Ou as ca a e ís icas e unções do gene aki in .................................. 26
1.4.2.3 Gene subolesin, o o ólogo do gene aki in ........................................ 29
1.4.2.4 Rea i idade c uzada en e Aki in e Subolesin ................................... 32
1.5 OBJETIVOS DO TRABALHO ............................................................................... 34
2. MATERIAIS E MÉTODOS .................................................................................... 35
ii
2.1 DECLARAÇÃO DE ÉTICA ................................................................................... 36
2.2 MURGANHOS .................................................................................................... 36
2.3 PARASITA ......................................................................................................... 36
2.4 MOSQUITOS ...................................................................................................... 36
2.5 EFEITO DO SORO COM TÍTULO ELEVADO DE ANTICORPOS ANTI-AKIRIN ........ 37
2.5.1 Desenho Expe imen al .............................................................................. 37
2.5.2 P odução da p o eína ecombinan e AKIRIN ........................................... 38
2.5.3 Imunização dos Mu ganhos ...................................................................... 38
2.5.4 De e minação do Tí ulo de An ico pos - Indi ec Enzyme-Lynked
Immonoso ben Assay (ELISA indi e a) ................................................................. 39
2.5.4.1 Tí ulo de an ico pos ........................................................................... 40
2.6 ENSAIO DE SILENCIAMENTO DO GENE aki in .................................................. 41
2.6.1 P odução de dsRNA .................................................................................. 42
2.6.2 Silenciamen o do gene aki in ................................................................... 43
2.6.3 In eção dos mosqui os po Plasmodium be ghei ...................................... 43
2.6.4 Recolha de ecidos pa a con i mação do silenciamen o, análise da
in ensidade de in eção e con agem de o os po êmea ............................................ 44
2.6.5 Quan i icação da exp essão do gene aki in .............................................. 44
2.6.6 Análise da quan idade da p o eína aki in po Ele o o ese de p o eínas em
gel de Poliac ilamida (SDS-PAGE) ........................................................................ 45
2.6.6.1 SDS-PAGE ........................................................................................ 45
2.7 CONTAGEM DO Nº DE OVOS, MORTALIDADE, TAXA E INTENSIDADE DE
INFEÇÃO ...................................................................................................................... 45
2.8 ANÁLISE ESTATÍSTICA ..................................................................................... 46
3. RESULTADOS ....................................................................................................... 47
3.1 AVALIAÇÃO DOS EFEITOS DOS ANTICORPOS ANTI-AKIRIN SOBRE MOSQUITOS
anopheles gambiae s.s. in e ados com Plasmodium be ghei ...................................... 48
3.1.1 Ca ac e ização do e ei o dos an ico pos an i-aki in em mosqui os
alimen ados em mu ganhos imunizados .................................................................. 48
3.1.2 E ei o dos an ico pos dos mu ganhos imunizados com Anopheles gambiae
s.s. - Alimen ação na u al ........................................................................................ 48
3.1.2.1 E ei os na in eção po Plasmodium be ghei ...................................... 49
4
egião a icana, sendo que nos g upos mais a e ados es ão incluídas as c ianças com
idade in e io a 5 anos e as mulhe es g á idas (OMS, 2011). É no con inen e a icano
que exis em as egiões de maio es axas de inoculação en omológicas e ní eis de
p e alência a ní el global (Fig. 1.1), e como consequência, maio es índices de
mo alidade e mo bidade de ido à malá ia (Sinka e al., 2010).
Fig. 1.1 Mapa ep esen a i o da dis ibuição da malá ia, a ní el mundial. Ge almen e oco e em á eas onde as
condições ambien ais pe mi em a mul iplicação do pa asi a no e o . Po ém a dis ibuição da malá ia é a e ada po
al e ações climá icas, como o aquecimen o global, e mo imen o de populações. Re i ado de
h p://www.dpd.cdc.go /dpdx/HTML/ImageLib a y/Mala ia_il.h m [Consul ado 3 de Ma ço de 2012]
1.1 MALÁRIA
1.1.1 Pa asi a
1.1.1.1 Classi icação sis emá ica do pa asi a
De aco do com Ayala e al. (1998), as cinco espécies de pa asi as que causam a
malá ia são classi icadas como:
Reino P o is a
Filo Apicomplexa
Classe Hema ozoa
O dem Haemospo ida
Família Plasmodiidae
Géne o Plasmodium

5
1.1.1.2 Ciclo de ida de Plasmodium spp.
A espécie do pa asi a P. alcipa um é esponsá el pela o ma mais se e a da
doença, sendo p edominan e em Á ica. A espécie P. i ax encon a-se mais dis ibuída
pelas di e en es egiões do globo e é conside ada menos pe igosa que a p imei a. As
demais espécies que a e am o homem (P. o ale, P. mala iae e P. knowlesi) são
encon adas menos equen emen e (Gi a d e al., 2007).
Pa a além des as espécies, são conhecidas ou as espécies de Plasmodium que
a e am mamí e os, ais como P. yoelii, P. be ghei e P. chabaudi, que es ão bem
adap adas aos seus hospedei os sel agens, não pa asi am humanos e são u ilizadas
como modelos expe imen ais em in es igação.
A malá ia é ansmi ida aos humanos pela picada dos mosqui os Anopheles
êmeas in e adas que ansmi em o pa asi a. Es e, po sua ez, em um ciclo de ida
complexo com 2 ases (hépa ica e e i oci á ia) endo como hospedei o de ini i o o
inse o e como hospedei o in e mediá io, o homem (Tyagi e al., 2012). O homem é o
único ese a ó io pa a P. alcipa um, P. i ax e P. o ale, enquan o as espécies P.
mala iae e P. knowlesi podem pa asi a ou os p ima as (Gi a d e al., 2007).
O ciclo de ida das espécies de Plasmodium, que in e am humanos, inicia-se
quando o mosqui o êmea du an e uma e eição sanguínea ansmi e os espo ozoí os
( o ma in e an e pa a os humanos) (Fig. 1.2). Os espo ozoí os a a és da ci culação
sanguínea in adem os hepa óci os, onde são subme idos a uma mul iplicação assexuada
(esquizogonia exo-e i oci á ia) esul ando na p odução de uma g ande quan idade de
me ozoí os. Es es me ozoí os en am na co en e sanguínea e in adem os e i óci os,
onde se desen ol em (denominados aqui po anéis, o ozoí os e inalmen e
esquizon es, na sua ase mul inucleada). Após o u a das hemácias pa asi adas pelos
esquizon es, quando ma u os, libe am-se os me ozoí os que in adem no as hemácias.
Es e p ocesso pode se epe ido e é esponsá el pela doença e consequen emen e, pelos
sinais clínicos.
En e an o alguns o ozoí os desen ol em-se em game óci os emininos e
masculinos que podem se inge idos po um mosqui o êmea, numa e eição sanguínea,
e desen ol e -se a a és do denominado ciclo espo ogónico: den o do lúmen do
in es ino médio do mosqui o, oco e a usão dos game óci os dando o igem à o mação
de um o o mó el ou oocine o que pene a na pa ede do in es ino médio onde se i á
6
ixa , sendo aqui denominado po oocis o. No oocis o, o pa asi a mul iplica-se
o mando milha es de espo ozoí os. Es es i ão mig a a é às glândulas sali a es onde
pe manecem e ma u am, a é uma no a e eição sanguínea onde se ão inoculados no
Homem (ou ou o hospedei o) e ocasiona uma no a in eção (Flo ens e al., 2002;
Gi a d e al., 2007; Tyagi e al., 2012).
Fig. 1.2 Ciclo de ida do pa asi a Plasmodium spp. onde se ep esen am dois hospedei os o Homem e o
mosqui o. Re i ado de Chiodini e al., 2010
7
1.1.2 Ve o
1.1.2.1 Classi icação sis emá ica do géne o Anopheles
De aco do com a classi icação de Richa d & Da ies (1977), o géne o Anopheles
em a seguin e posição sis emá ica:
Reino Animalia
Filo A h opoda
Classe Insec a
O dem Dip e a
Família Culicidae
Géne o Anophelinae
1.1.2.2 Bioecologia
Os mosqui os do géne o Anopheles cons i uem economicamen e e clinicamen e
os inse os mais impo an es do mundo po se em e o es de di e sas pa asi oses, mas
sob e udo po se em e o es ex emamen e e icien es da malá ia, al amen e
an opo ílicos (mais de 95% das suas e eições são ealizadas em humanos), ealizam 2
a 3 e eições po cada ciclo gono ó ico (pe íodo especi ico da ida das êmeas, que es á
di idido em ês ases (i) p ocu a po um hospedei o ap op iado e ealização da e eição
sanguínea; (ii) diges ão e ma u ação dos o os; (iii) p ocu a po um local pa a ealiza a
o iposição e pa a o c escimen o das la as) e po pode em sob e i e mais do que um
mês (Foy, 2002; Coe zee, 2004; Qiu e al., 2011; Loaiza e al., 2012).
A ualmen e conhecem-se 465 espécies de Anopheles e mais de 50 memb os sem
nome pe encen es a es e complexo de espécies. De odo es e complexo, ce ca de 70
espécies são capazes de ansmi i o pa asi a da malá ia dependendo do local geog á ico
em que se encon am. Po exemplo, nas egiões mais us igadas, como a egião a icana,
os memb os do complexo Anopheles gambiae e Anopheles unes us são co-dominan es
em g ande pa e do con inen e. O complexo An. gambiae con ém as espécies e o as
mais e icien es pa a a malá ia de odo o mundo, des acando-se as espécies An. gambiae
s.s. e An. a abiensis (Sinka e al., 2012). Na egião Ásia-Paci ico, a si uação é mui o
mais complexa uma ez que coexis em á ias espécies e a dominância das espécies é
a iá el, como se pode e i ica na igu a 1.3. Nes e complexo de espécies exis em
8
algumas conside adas espécies c íp icas que a iam no seu compo amen o e
capacidade e o ial, ap esen ando assim di iculdades ac escidas pa a a ges ão de
p og amas de con olo (Coe zee e al., 2000).
Todas as êmeas pe encen es a es as espécies são anau ógenas, is o é,
necessi am de ealiza e eições sanguíneas pa a p oduzi em os o os e consequen e
con inuidade do ciclo de ida e p opagação da espécie (Hillye , 2010).
Fig. 1.3 Dis ibuição global dos p incipais e o es de malá ia. Re i ado de Sinka e al., 2012.
1.2 MODELOS EXPERIMENTAIS
A in es igação na á ea da malá ia apoia-se em modelos expe imen ais como os
oedo es ou p ima as. Es es modelos êm sido uma e amen a aliosa no
desen ol imen o de linhas de in es igação elacionadas com a imunologia, pa ologia,
es e de á macos e desen ol imen o de acinas.
A ele ância da u ilização de oedo es como modelos expe imen ais em malá ia
é con o e sa pois algumas das conclusões ob idas em ce os es udos não são álidas
pa a os humanos (Langho ne e al., 2011), como são exemplo alguns ma cado es
molecula es indicado es de esis ência a á macos que são apenas obse ados em
plasmódios de oedo es. Con udo, os modelos animais con inuam a se a melho base de
9
es udos p olongados e em me odologias onde não exis am a o es in e nos (como po
exemplo ou as in eções, ou os plasmódios, backg ound gené ico do hospedei o) ou
ex e nos (ambien e de bio é io conse ado e con olado), como é o caso da malá ia
humana.
Os modelos in i o são ambém uma opção pa a iden i ica in e ações
molecula es en e o pa asi a e o hospedei o, mas ap esen am es ições nomeadamen e
em es udos p olongados e es udos que isam in e ações de ca ác e imuni á io. Ou os
modelos como po exemplo, p ima as não humanos, são dispendiosos e inacessí eis
pa a es udos como o aqui ap esen ado.
1.2.1 Pa asi a – Plasmodium be ghei
A espécie Plasmodium be ghei é uma das espécies que in e a oedo es mu inos.
O in e esse nes e modelo de oedo es de e-se ao ac o de se p á ico pa a o es udo
expe imen al da malá ia, uma ez que é análoga em aspe os es u u ais, isiológicos e
do ciclo de ida, à malá ia humana. Os p incipais mo i os que le am es e modelo a se
u ilizado nes es ipos de es udos são:
P odução e cul i o de cu a du ação e pu i icação das di e en es ases do ciclo
de ida do pa asi a in i o;
Genoma sequenciado;
Disponibilidade de me odologias pa a modi icação gené ica do pa asi a;
Clones bem ca ac e izados e g ande disponibilidade de linhas mu an es
gene icamen e modi icadas, que incluem pa asi as ansgénicos que exp essam
genes ais como G een Fluo escen P o ein (GFP) e Luci e ase
(Leids Uni e si ai Medisch Cen um, 2012)
Con udo, o ciclo de ida mos a um desen ol imen o não sinc onizado dos
di e sos es ádios de c escimen o e i oci á ios, ao con á io de P. acipa um.
1.2.2 Ve o
O único e o conhecido pa a as espécies de Plasmodium que in e am oedo es é
a espécie Anopheles du eni millecampsi, o hospedei o in e eb ado de P. be ghei.
Algumas das espécies de Anopheles es abelecidas em labo a ó io como Anopheles

10
s ephensi ou An. gambiae s.s., são conside ados bons ansmisso es de P. be ghei e, po
isso, são u ilizados em in es igação. O núme o de espo ozoí os que in adem as
glândulas sali a es são ela i amen e baixos em An. gambiae s.s., suge indo que as
condições de espo ogonia nes e hospedei o não são, no en an o, as ideais.
De aco do com alguns au o es, o mosqui o An. gambiae s.s. ep esen ado na
igu a 1.4, não pa ece se o e o na u al de nenhuma espécie de Plasmodium de
oedo es. A in ensidade de in eção p o ocada po P. be ghei ou P. alcipa um no
epi élio do in es ino médio do mosqui o, o núme o de oocis os ou mesmo de
espo ozoí os nas glândulas sali a es p oduz esul ados con adi ó ios en e as duas
espécies. (Sinden, e al., 2004; Dong e al., 2006). Os mosqui os An. gambiae s.s. e An.
s ephensi, con inuam no en an o, a se la gamen e u ilizados como se pode comp o a
a a és de uma consul a sumá ia dos abalhos publicados na á ea.
Fig. 1.4 Fêmeas de Anopheles. Gambiae s.s. : alimen ação num hospedei o.
Re i ado de h p://www. e o base.o g/Image/o ganism_pic u es/Anopheles%20gambiae/A.gamb_mali_852cc.jpg
[Consul ado 16 de Ma ço de 2012]
1.3 VACINAS
Com exceção de poucas doenças ansmi idas po inse os, como a eb e-ama ela,
não o am ainda desen ol idas ou implemen adas quaisque acinas e icien es con a
pa ógenos ansmi idos po e o es (de la Fuen e e al., 2011).
Com o aumen o da esis ência aos inse icidas e aos á macos, a necessidade de
desen ol e uma acina pa a a malá ia é cada ez mais necessá ia e expec á el
exis indo no momen o á ias acinas em ase de ensaio clínico, como é exemplo a
acina RTS,S/AS01 que é a mais a ançada a é à da a, e encon a-se em ase III de
ensaios clínicos, no es udo da e icácia, segu ança e imunogenicidade. A é ao momen o
ap esen a-se como uma o e candida a pois pode induzi uma e icácia clínica en e 25%
a 60% em indi íduos olun á ios de di e en es países endémicos (Schwa z e al.,
11
2012), é di igida con a a ase p é-e i oci á ia e baseia-se numa cons ução da p o eína
ci cunspo ozoí ica (CSP) da es i pe 3D7 de P. alcipa um, jun amen e com o an igénio
de supe ície da hepa i e B (S ou e e al., 1998; Gue in e al., 2002; Ballou e al., 2004;
Gi a d e al., 2007 ).
Os ensaios clínicos ealizados a é ago a êm demons ado:
1) A imunização de olun á ios humanos com espo ozoí os a enuados
con e iu 90% de p o eção con a a in eção po es i pe labo a o ial
mediada po mosqui os in e ados, de endo-se ealça que se u ilizou
o pa asi a in eg al na imunização (Gue in e al., 2002);
2) Imunidade na u almen e adqui ida con a o pa asi a, essencialmen e
cons uída du an e as duas p imei as décadas de ida em pessoas que
i em em zonas endémicas, aduz-se numa diminuição do impac o
da doença e pa ece es a elacionada com a es imulação con ínua
de ido às ein eções (Gue in e al., 2002);
3) É possí el p oduzi imunidade a a és da ans e ência de globulinas
hípe -imunes de adul os imunes pa a indi íduos nai e olun á ios;
As acinas podem e como al o di e en es ases do ciclo de ida do pa asi a, cada uma
com epo ó io an igénico dis in o embo a idealmen e se deseja ia uma acina e icaz
con a mais que uma ase de desen ol imen o do pa asi a.
Suma iamen e, exis em:
1.3.1 Vacinas an i- espo ozoí o (P é-e i oci á ias)
Es as acinas êm como obje i o a ingi os espo ozoí os ou os hepa óci os
in e ados e assim impedi a libe ação dos p imei os me ozoí os. A imunização com
espo ozoí os pode p oduzi imunidade, seja com espo ozoí os i adiados ou com o uso
de pa e dos an igénios do pa asi a (Gue in e al., 2002). A exis ência de polimo ismos
em egiões imunologicamen e impo an es dos epí opos e a baixa imunogenicidade dos
mesmos (Gi a d e al., 2007) êm di icul ado a p odução/ob enção des e ipo de acina.
12
1.3.2 Vacinas baseadas nas o mas sanguíneas assexuadas do pa asi a
A azão pa a o desen ol imen o de acinas des e ipo baseia-se nas seguin es
obse ações: (i) passagem de an ico pos ma e nos pa a o e o con e indo uma janela de
p o eção con a episódios clínicos de malá ia; (ii) após in eções epe idas de malá ia a
maio ia dos indi íduos que i em em á eas endémicas adqui e capacidade pa a
con ola a eplicação do pa asi a, pa a pa asi émias in e io es às que esul a iam em
casos clínicos; (iii) globulinas hípe -imunes do so o de indi íduos c onicamen e
in e ados podem elimina pa asi as ci culan es de P. alcipa um em indi íduos não-
imunes in e ados (Ballou e al., 2004).
O al o des as acinas são os an igénios da supe ície do pa asi a, que os à
supe ície do me ozoí o (MSP) que os à supe ície da memb ana das hemácias
pa asi adas (Ballou e al., 2004). O obje i o eó ico des as acinas é simula o que
oco e em adul os nas á eas hípe -endémicas, is o é, desen ol e imunidade mediada
po an ico pos de ido à exposição epe ida à in eção (Gue in e al., 2002). Uma edução
da ca ga pa asi á ia i á diminui ou sup imi os sin omas, sob e udo da malá ia g a e, e
le a a uma diminuição da mo alidade e mo bilidade.
1.3.3 Vacinas baseadas nos game óci os do pa asi a (Vacinas de
Bloqueio de T ansmissão – TBV)
Es e ipo de acinas em como obje i o e i a que os mosqui os que se
alimen am em indi íduos in e ados adqui am e, pos e io men e, ansmi am a in eção,
a a és da a uação dos an ico pos con a os an igénios das ases sexuais do pa asi a
(Schwa z e al., 2012; Tyagi e al., 2012). Es e ipo de acinação não em como
obje i o p o ege di e amen e o indi iduo acinado mas sim con ibui pa a a p o eção
da comunidade (Ballou e al., 2004). Es udos p é-clínicos demons am que os
an igénios baseados nes as o mas do pa asi a são capazes de p e eni o
desen ol imen o de espo ozoí os in eciosos nas glândulas de Anopheles, suge indo que
pode se uma boa a ma con a a malá ia (Ballou e al., 2004). O maio p oblema des e
ipo de acinação é que o indi iduo acinado não es á p o egido mas pode á a e a a
in eção de mosqui os e po an o p o ege a comunidade indi e amen e. Apesa de es a
abo dagem se e icaz em modelos expe imen ais, pa ece se limi ada po ap esen a
baixa imunogenicidade (Gue in e al., 2002).
13
1.3.4 Vacinas baseadas em plasmídeos de DNA ou o ganismos i os
ecombinan es
Es as acinas êm le an ado bas an e con o é sia de ido ao pe igo biológico
que podem ep esen a dado que não é possí el con ola uma e en ual in e e ência no
genoma do indi iduo acinado. Es as acinas êm essencialmen e como base an igénios
de P. alcipa um e nos p imei os ensaios clínicos ealizados demons a am se segu as
(Tyagi e al., 2012). No en an o, a p odução de an ico pos pelo indi íduo acinado é
baixa ou nula, não con e indo assim a p o eção desejada con a os espo ozoí os (Tyagi
e al., 2012). Exis em ambém as acinas que u ilizam o ganismos ecombinan es i os
a enuados. Como e o es u ilizam-se as es i pes modi icadas de Vaccinia Anka a
(MVA) (Gi a d e al., 2007; Tyagi e al., 2012), uma o ma modi icada do í us da
acina con a a a íola, e alguns ou os ipos de í us (Adeno i us, Sindbis í us, í us
da eb e ama ela ou es i pe a enuada do í us In luenza). Algumas des as acinas o am
es adas em combinações de o ma a se em mais e icazes a es imula o sis ema
imunológico, u ilizando o mulações de DNA e í us Fowlpox (FPV) ecombinan es ou
acinas MVA que codi icam pa a a p o eína CSP dos espo ozoí os de P. alcipa um.
Toda ia, não p oduzi am esul ados consis en es na p o eção con a os mesmos. Ambas
as acinas de MVA ou FPV ecombinan es o am conside adas segu as e adequadas
pa a se em aplicadas em ensaios de la ga escala em c ianças de Á ica, uma ez que não
p omo em in eção (Tyagi e al., 2012). Apesa de se e obse ado que a adminis ação
de algumas des as acinas em mu ganhos p omo iam o aumen o da imunidade humo al
e celula , em humanos não se e i ica am os mesmos esul ados, igualmen e e icazes e,
mesmo após e em sido es adas á ias ias de adminis ação.
Resumidamen e, o que em complicado, e dadei amen e, o desen ol imen o de
uma acina e icaz é a capacidade que o plasmódio em pa a se e adi à imunidade do
hospedei o e a sua complexidade an igénica aliada a um polimo ismo gené ico. Assim,
os seus an igénios pode ão es a di e enciados nas di e sas ases de desen ol imen o
nos dois hospedei os (Schwa z e al., 2012). Apesa de exis i em alguns al os
molecula es bem ca ac e izados, que podem se selecionados pa a acinas con a o
pa asi a, e alguns deles pos e io men e acaba em mesmo po aze pa e de acinas
p omisso as em modelos animais ou em es es pa alelos in i o, é necessá io uma
20
Fig. 1.7 Hemóci os e a o es da espos a imunológica no hemocélio do mosqui o, obse ação po mic oscopia
ele ónica. A) G anulóci o ci culan e; B) Oenoci óide ci culan e. C) Co po go do. D) Respos a imune a a és do
p ocesso melanização a S aphylococcus au eus no hemocélio. E) Lise de S. au eus no hemocélio. F) Fagoci ose de
Esche ichia coli ( ep esen ado pelas pon as das se as) e melanização de Mic ococcus lu eus ( ep esen ado pelas se as)
po um g anulóci o ci culan e. Re i ado de Hillye , 2010.
No que diz espei o à espos a humo al e celula mediada pelo conjun o de
células e sinalizado es an e io men e e e idos, a p odução de AMP’s e o p ocesso de
melanização são con olados pelas duas ias de ansdução do sinal: Toll e Imd, que po
sua ez a i am dis in os a o es de ansc ição do ipo NF-kB que le am exp essão de
genes especí icos (Schmid e al., 2008). As eações humo ais dos a ópodes podem se
di ididas em 4 passos, apesa de in i o odo es es p ocessos se desen ola em de o ma
encadeada e simul aneamen e:
a. Reconhecimen o das moléculas do agen e pa ogénico (pad ões molecula es
associados a pa ógenos – PAMPs) e subsequen e a i ação da espos a
imunológica ina a a a és da ligação a ece o es de econhecimen o de pad ões
(PRR’s). Es es PRR’s podem se i como opsoninas, acili ando a agoci ose,
como ece o es pa a as ias de ansdução do sinal que le am à sín ese de
moléculas pa a comba e a in eção po agen es pa ogénicos, como iniciado es da
coagulação, da melanização ou ou as casca as de modi icação de p o eínas que
são implicadas em di e en es ases da espos a imunológica. Um exemplo des as
PAMPs são as p o eínas que econhecem pep idoglicanos (PGRPs); es a amília
dis ingue-se po possui o domínio PGRP e em di e sas implicações na

21
a i ação na espos a imunológica do inse o, incluindo a casca a de melanização,
agoci ose e ias de ansdução do sinal pa a a p odução de e e o es an i-G am+
e an i-G am-;
b. Após se de e ada a in eção, iniciam-se as casca as ex acelula es de a i ação
das p o eases se ínicas e seus inibido es, se ealmen e exis e pe igo o sinal é
ampli icado caso con á io não é ansmi ido, a es e p ocesso chama-se
modulação da espos a;
c. A i ação de um conjun o di e si icado de moléculas e e o as, en e es es
pép idos an i-mic obianos e a casca a de melanização;
d. Reposição de moléculas elacionadas com o sis ema imunológico a a és da
a i ação das ias de ansdução do sinal como Toll e Imd, que le am à
ampli icação do sinal a a és da a i ação ansc icional de genes c uciais ao
comba e à in eção.
Rela i amen e a es e úl imo passo (d), a ia Toll é es imulada pela in asão de
bac é ias G am-posi i as (G am+), ungos, í us e po pa asi as como Plasmodium spp.,
e con ola a p odução de pép idos an i-mic obianos a a és do a o de ansc ição Rel1.
A indução da ia Toll pelo silenciamen o do egulado nega i o do a o de ansc ição
Rel1, o Cac us, diminui d as icamen e a in ensidade de in eção po P. be ghei e P.
gallinaceum no in es ino médio dos mosqui os Anopheles spp. e Aedes spp.,
espe i amen e. O co-silenciamen o do Cac us e Rel1, esul a numa maio sensibilidade
do mosqui o à in eção.
A ou a ia Imd, es á en ol ida no comba e à in asão de bac é ias G am- e
ambém de Plasmodium spp., e é con olada pelo a o de ansc ição Rel2, cuja
p o eína egulado a nega i a é a Caspa .
As duas ias es ão en ol idas na espos a imunológica con a algumas espécies
do pa asi a da malá ia, como é exemplo o P. be ghei, no en an o, a espos a
imunológica con a o pa asi a da malá ia humana é con olada p imei amen e pela ia
Imd, sendo es a a mais in luen e no a aque aos pa asi as. Têm sido ealizados á ios
es udos que comp o am a impo ância des a ia no comba e ao plasmódio (Schmid e
al., 2008; Hillye , 2010; Ga e e al., 2012). Mais ecen emen e oi desc i a uma
e cei a ia, JAK-STAT, que pa ece e maio impo ância nas in eções causadas pelos
22
í us, podendo es a igualmen e en ol ida no con olo ao a aque aos pa asi as
Plasmodium spp. (Hillye , 2010; Ga e e al., 2012).
1.4.2 Função da Aki in
Recen emen e oi descobe o po Go o e colabo ado es (2008), uma pequena
amília de p o eínas es i amen e nuclea es al amen e conse adas, inicialmen e de
unções desconhecidas e que à pos e io i se ie am a e ela impo an es na egulação
da ansc ição dos genes dependen es do complexo p o eíco NF-kB ou dos seus
homólogos (Rel1 e Rel2). Es as p o eínas são chamadas aki ins p o enien e da
exp essão japonesa ‘ aki aka ni su u’, que signi ica ‘ o na as coisas cla as’. Os inse os
êm apenas um gene aki in, enquan o a maio ia dos e eb ados ap esen am dois genes
homólogos aki in1 e aki in2 (Beu le , 2008; Go o e al., 2008; Wan & Lena do, 2010).
É econhecido que a ia Imd é a ia mais impo an e no comba e às in eções
com as p incipais espécies de plasmódios. Apesa do mecanismo de de eção do pa asi a
e subsequen emen e início des a ia ainda não es a em comple amen e escla ecidos, de
uma o ma gené ica, sabe-se que a ia Imd unciona da seguin e o ma de aco do com
os es udos ealizados no modelo D osophila e pos e io men e e i icados nos
mosqui os: é iniciada quando oco e a ligação das subunidades de pep idoglicanos às
p o eínas econhecedo as de pep idoglicanos - PGRP-LC e PGRP-LE – a i ando a
p o eína Imd, que é o elemen o c í ico do ece o que dá o nome à ia. Es ando es a
p o eína a i a, po sua ez ec u a as p o eínas Fadd e a caspase D edd que ão le a à
a i ação do complexo de p o eínas TAB2 e TAK1. De ido à a i idade da cinase TAK1,
oco e a a i ação de ou as duas enzimas a IRD5 (que em como homóloga nos
mamí e os a IKK-β, que es á en ol ida na a i ação do a o NF-kB) e a p o eína Kenny
(que em como homóloga a IKK-y, nos mamí e os); es as p o eínas, po sua ez,
adicionam um g upo os a o ao complexo Relish (o ólogo do complexo NF-kB, nos
mamí e os) que, ao ica os o ilado so e cli agem po acção de p o eases, causando a
anslocação do a o de ansc ição Rel pa a o núcleo, an e io men e e ido no
ci oplasma das células não es imuladas. Uma ez no núcleo oco e a ansc ição dos
genes al o e a p odução de pép idos an imic obianos pa a comba e a in ecção. Pa a que
acon eça a ansc ição e p odução de pép idos, é necessá io a p esença da aki in que
unciona ao mesmo ní el da Relish ou an es des a a ua , egulando assim a i idade do
23
a o de ansc ição Rel2 e ambém, de uma o ma indi ec a, a ansc ição dos genes
especí icos egulados po es e a o de ansc ição, (Figu a 1.8 ) (Ch is ophides e al.,
2002; Michel & Ka a os, 2005; Su e wala & Fla ell, 2008; Beu le , 2008; Wan &
Lena do 2010).
Fig. 1.8 Homologia do sis ema imuni á io en e os mamí e os e a maio ia dos inse os. (A) Em D osophila e
ou os inse os, a ia Imd a a és de uma casca a de sinalização ai esul a no mo imen o do componen e Rel ( a o
de ansc ição como NF-kB) pa a o núcleo. Uma ez no núcleo es e a o Rel ai media a ansc ição de genes que
codi icam pa a pép idos an i-mic obianos. (B) Nos mamí e os, a a i ação do ece o TNF 1 (TNFR-1), do Toll-Like
Recep o (TLR) ou do ece o In e leucina-1 (IL-1R) a i a a casca a de sinalização que esul a na passagem do a o
de ansc ição NF-kB do ci oplasma pa a o núcleo e a a i ação da ansc ição de á ios genes. A aki in de inse os é
uncionalmen e homóloga à aki in2 dos mamí e os, necessá ia pa a o a o de ansc ição NF-kB. Re i ado de
Su e wala e al., 2008.
A p esença des a p o eína aki in no núcleo e a inespe ada uma ez que não
ap esen a nenhum domínio es u u al ca ac e ís ico das moléculas de sinalização e a sua
ausência não a e a a ia Toll o que signi ica que es á essencialmen e en ol ida na
p odução dos pép idos an i-mic obianos e dos es an es genes en ol idos na imunidade
que são con olados pela ia Imd, is o é, em uma unção a jusan e ou ao mesmo ní el
do a o de ansc ição Rel (Go o e al., 2008). A aki in pode in e e i na exp essão de
alguns a o es do sis ema imunológico que são e icien es no comba e ao plasmódio,
uma ez que são con olados pela ia Imd a a és do a o de ansc ição Rel2 (Ga e
e al., 2012).
Foi demons ado que moscas em que o gene aki in oi silenciado, são
imunode icien es e não sob e i em a in eções po bac é ias G am-, con i mando mais
uma ez a impo ância des e gene na ia Imd. Apa en emen e a aki in pode á e ou as
24
unções além do seu en ol imen o na espos a imune uma ez que oi demon ado que
moscas Rel-/- ( elish de icien es) são iá eis e Aki in-/- não o são, o que le a a suge i
que êm um papel c ucial no desen ol imen o emb ioná io da D osophila sp. e dos
es an es díp e os (Go o e al., 2008).
1.4.2.1 Nos mamí e os
Apesa da quan idade de in o mação exis en e sob e a “máquina molecula ” NF-
kB, ainda exis em mui as dú idas pa a escla ece . São as in e ação de ou as p o eínas
exis en es no núcleo com es e complexo que de e minam a especi icidade e a i ação de
di e en es genes al o, culminando na ligação do NF-kB p esen e no núcleo ao DNA
(Su e wala & Fla ell, 2008; Wan & Lena do 2010).
Inicialmen e, o complexo NF-kB es á e ido no ci oplasma das células não
es imuladas, ligado a um memb o da amília das p o eínas inibido as IKK, mais
p ecisamen e ligado ao IkB, que masca a a localização nuclea da sequência das
p o eínas Rel associadas. O complexo de cinase (IKK) ao se a i ado induz a
os o ilação e subsequen e deg adação do inibido IkB, esul ando na libe ação do
complexo p o eico NF-kB e na sua anslocação pa a o núcleo onde se ai acumula e,
ao se es imulado po um mecanismo de sinalização, ai a ua como a o de ansc ição
pela sua ligação a sequências de DNA, conhecidas como locais kB. Nes es locais,
apesa da p esença de homodíme os ou he e odíme os da amília Rel (Wan & Lena do,
2010), es a ligação pa ece se insu icien e pa a a comple a indução dos genes al o,
pe manecendo assim po escla ece de que modo o complexo NF-kB selecciona
especi icamen e os locais de ligação.
Como acima e e ido, uma das suas unções da p o eína aki in consis e na
modulação da a i idade do a o NF-kB quando es e a inge o núcleo, mas não se sabe
conc e amen e como in e e em na unção do a o NF-kB e a o ma como in e agem,
con i mando a sua so is icada egulação (Figu a 1.9) (Wan & Lena do 2010).
25
Fig. 1.9 Regulação nuclea do a o NF-kB. O a o de ansc ição NF-kB após ganha acesso ao núcleo, a a i idade
é al amen e con olada po mui os egulado es nuclea es, como es á ep esen ado pelas se as azuis. A p o eína aki in
es á incluída no g upo de p o eínas es i amen e nuclea es que egulam es e ac o de ansc ição. Es ão ambém
ep esen adas duas ias dis in as, com se as e melhas, que esquema izam o que acon ece ao NF-kB após comple a a
sua unção (I) es i uição do NF-kB pa a o ci oplasma (II) deg adação nuclea do complexo NF-kB, a a és da sua
ubiqui inação. Adap ado de Wan e al., 2010.
Nos mu ganhos, Mus musculus, o am encon ados 2 pa álogos do gene aki in
no c omossoma 4, mas dis anciados um do ou o. Um, é o gene denominado po aki in1
que não é essencial no mu ganho, pois células de icien es pa a es e gene (MmAki in1-/-)
não êm um enó ipo dis in o, nem são imunologicamen e di e en es (Go o e al., 2008).
Em con as e, o gene aki in2 que é o que mais se assemelha em e mos de
unções ao único gene aki in dos inse os, é necessá io pa a o desen ol imen o no
mu ganho, uma ez que os homozigó icos knockdown (MmAki in2 -/-) não sob e i em
na ase emb ioná ia e, quando se in e e e na unção do gene em indi íduos adul os,
es es são de icien es na unção de ce os genes al o, egulados pelo complexo NF-kB
quando es imulados po algumas moléculas do sis ema imuni á ios, como os ligandos
Toll-Like-Recep o s, o TNF ou pela In e leucina - 1β (IL-1β) (Beu le , 2008; Su e wala
& Fla ell, 2008; Wan & Lena do, 2010).
A explicação mais iá el sob e a unção des e gene aki in2 é que em uma papel
essencial na egulação a jusan e do a o NF-kB, is o é, a p o eína aki in de e liga -se a
uma p o eína in e mediá ia que po sua ez in e age com o a o NF-kB e,

26
consequen emen e, es a ação a e a a in e ação com a c oma ina ou com componen es da
maquina ia ansc icional, uma ez que as p o eínas aki in não pa ecem liga -se ao
DNA, pois não possuem nenhum mo i o de ligação ao DNA ou RNA (Wan & Lena do
2010) .
1.4.2.2 Ou as ca a e ís icas e unções do gene aki in
Es as p o eínas são, como já e e ido, exclusi amen e nuclea es exibindo uma
sequência que consis e num sinal de localização nuclea (NLS) en e os aminoácidos 24
e 29, do domínio N- e minal da p o eína. A sua localização oi es udada po Go o e
colabo ado es (2008) com ecu so ao e o V5 o qual oi ans o mado com a sequência
do gene aki in de D. melanogas e (DmAki in). A a és da análise po immunoblo com
an ico po an i-V5 oi demons ado que a p o eína aki in em somen e localização
nuclea , e que es a localização es á dependen e da p esença da NLS, na egião N-
e minal. Se oco e cli agem des a sequência, a p o eína deixa de es a exclusi amen e
no núcleo (1.10a). Foi ealizado um ensaio idên ico com os genes aki in1 e aki in2 de
células humanas (HsAki in1 e HsAki in2), com ecu so ao e o Flag e à linha celula
HeLa, e os esul ados o am semelhan es aos an e io men e desc i os (Figu a 1.10b)
(Go o e al., 2008).
27
Fig. 1.10 Localização Nuclea da p o eína Aki in. (A) Células S2 de D osophila o am ans ec adas com e o es
V5 ma cados com di e en es sequências, um com a sequência DmAki in, ou o com a sequência DmAki in mas com
os nucleó idos co esponden es ao sinal de localização nuclea (NLS) dele ados, e ou o com a sequência PGRP-LE,
que se iu como con olo nega i o, uma ez que é uma p o eína ece o a que exis e exclusi amen e no ci oplasma.
As células o am co adas com DAPI (azul) pa a isualização do núcleo. Os di e en es e o es o am e elados com
um an ico po an i-V5 ( e de). Os di e en es campos da célula o am isualizados em con as e de ase (PH). (B)
Células Hela o am ans ec adas com os e o es Flag com as sequências comple as de HsAki in1 e HsAki in2, e
ambém sem as sequências NLS (do aminoácido 1 ao 20 ou do aminoácido 1 ao 30) de ambas as sequências. Re i ado
de Go o e al., 2008.
O gene de aki in é conse ado en e á ios o ganismos, po ém exis em
o ganismos que possuem 2 cópias homólogas, não o almen e iguais, com algumas
di e enças en e si e consequen emen e papéis di e en es no desen ol imen o e unções
dos o ganismos. Nas plan as, le edu as e bac é ias es e gene(s) não exis e(m). A
homologia en e as sequências das p o eínas esul an es des e gene aki in pe mi em
sepa a os o ganismos em g upos, o iginando assim um g upo nos inse os e dois g upos
nos e eb ados (Figu a 1.11). A sequência da p o eína de aki in2 es á mais elacionada
com a sequência da aki in dos e eb ados, como já oi e e ido.
28
Fig. 1.11 Aki ins são p o eínas al amen e conse adas. As sequências o am ob idas a a és da homologia com a
p o eía de D osophila melanogas e , com ecu so à e amen a Blas . Nos e eb ados a Aki in es á di idida em 2
g upos, Aki in1 e Aki in2; Aki in2 es á mais elacionada com Aki in dos in e eb ados. As sequências são as
seguin es: Dm Aki in (Aki in de D osophila melanogas e ), Ag Aki in (Aki in de Anopheles gambiae), Bm Aki in
(Aki in de Bombyx mo i), Am Aki in ( Aki in de Apis mellí e a) , Tc Aki in (Aki in de T ibolium cas aneum), Gg Aki in
( Aki in de Gallus gallus), HS Aki in 1 (Aki in1 de Homo sapiens), Mm Aki in 1 (Aki in 1 de Mus musculus); Xl
Aki in1 (Aki in1 de Xenopus lae is), D Aki in 1 (Aki in1 de Danio e io), HS Aki in2 (Aki in2 de Homo sapiens),
Mm Aki in2 ( Aki in2 de Mus musculus), Xl Aki in2 (Aki in2 de Xenopus lae is) e D Aki in2 (Aki in2 de Danio
e io). Re i ado de Go o e al., 2008.
O papel dos genes aki in nos díp e os e o gene aki in2 nos e eb ados não se
esume apenas ao sis ema imunológico, is o é, a sua impo ância es ende-se ambém ao
desen ol imen o do o ganismo. Algumas das ou as unções que o gene aki in pa ece
desempenha :
Modulação da ia de desen ol imen o Wn -Wingless (Wg) em D osophila e,
possi elmen e, nou os díp e os. Es a ia é uma ia de sinalização al amen e
conse ada que egula á ios aspe os do desen ol imen o, unções celula es dos
me azoá ios e pa ece es a en ol ida na espos a in lama ó ia. De iciências na
mesma pa ecem es a associadas a doenças em humanos (canc os, doença de
Alzheime ) (Go o e al., 2008; DasGup a, 2005);
In e ação com um dos a o es de ansc ição GATA que é essencial pa a o
desen ol imen o do ó ax em D osophila spp. e em ou os díp e os (Go o e al.,
2008; Su e wala & Fla ell, 2008);
29
Facili a a in e ação com o a o de ansc ição Twis e a c oma ina, in e agindo
com es e a o ísica e gene icamen e. Es e a o de ansc ição é al amen e
conse ado egulando á ias ias du an e a emb iogénese, bem como me ás ases
dos canc os. De igual modo, exe ce uma unção de egulação du an e o
desen ol imen o emb ioná io em D osophila spp.. Ensaios ealizados com
D osophila spp. que ap esen a am di e en es mu ações pa a o gene aki in,
demons a am a exis ência de enó ipos di e en es e de icien es ela i amen e à
muscula u a (Figu a 1.12) (Nowak e al., 2012).
Fig. 1.12 Moscas mu an es pa a aki in exibem di e en es enó ipos muscula es nos emb iões. Vis a la e al dos
emb iões, a pa e do sal es á à di ei a nas imagens As igu as i e ii ilus am emb iões com enó ipo Wild-Type, iii e i
emb iões com enó ipos esul an es de mu ações no gene aki in. U iliza am-se an ico pos an i- opomiosina pa a se
obse a os di e en es enó ipos a ní el da muscula u a. As se as a e melho demons am os de ei os muscula es
p edominan es, nas igu as (iii) obse a-se a ausência de músculos, (i ) músculos inde idamen e o mados, ( )
músculos duplicados. Re i ado de Nowak e al., 2012.
1.4.2.3 Gene subolesin, o o ólogo do gene aki in
Es udos ealizados an es de se conhecido o gene aki in, demons a am a
exis ência na ca aça Ixodes scapula is do gene subolesin, semelhan e aos genes aki in
nos inse os e e eb ados. Quando es a no a p o eína, aki in, oi descobe a não oi
associada a sua unção à subolesin exis en e nas ca aças. Foi demons ado que es a
p o eína nas ca aças em á ias unções, ais como con olo de múl iplas ias celula es
a a és da unção egulado a na exp essão global de alguns genes, modulação da
alimen ação e egulação da ep odução e desen ol imen o (Canales e al., 2009). O
36
2.1 DECLARAÇÃO DE ÉTICA
A manu enção e a amen o dos animais u ilizados nes e abalho, o am
ealizados em con o midade com as ecomendações na Di e i a Eu opeia 86/609/EEC e
lei Po uguesa, Dec e o-Lei 129/92 pa a in es igação biomédica en ol endo animais.
Todos os de alhes des e es udo o am ap o ados pela Di isão-Ge al de Ve e iná ia
(DGV), Po ugal, ao ab igo da Po a ia 8 nº 1005/92 de 23 de Ou ub o. Todos os
ensaios o am ealizados sob anes esia e os p ocedimen os em ge al, p ocu a am
minimiza o so imen o animal.
2.2 MURGANHOS
Os mu ganhos (Mus musculus) u ilizados em odas as expe iências o am
ob idos no bio é io do Ins i u o de Higiene e Medicina T opical e inham uma idade
en e 4-6 semanas. Pa a a alimen ação dos mosqui os nos ensaios de silenciamen o
o am u ilizados mu ganhos CD-1. Nos ensaios de alimen ação na u al o am u ilizados
mu ganhos BALB/C.
A in eção dos mosqui os com P. be ghei oi conseguida po alimen ação di e a
em mu ganhos p e iamen e in e ados. Os mu ganhos o am inoculados
in ape i onealmen e com 107 e i óci os pa asi ados com P. be ghei e a pa asi émia e a
game oci émia medidas dia iamen e, a pa i de amos as de sangue e i adas da cauda e
u ilizadas pa a e e ua es egaço sanguíneo. Pos e io men e ixadas com me anol
du an e 30 s e, em seguida, co adas com Giemsa (Sigma-Ald ich, USA).
2.3 PARASITA
O pa asi a u ilizado em odas as expe iências que en ol iam in eção de
mu ganhos e de mosqui os, oi a es i pe P.be ghei GFP CON. Es a es i pe é modi icada
gene icamen e pa a exp essa a p o eína e de luo escen e (GFP) possibili ando assim,
uma obse ação dos pa asi as, mais ácil.
2.4 MOSQUITOS
Os mosqui os An. gambiae s.s. da es i pe de Yaoundé, o ma molecula M,
o am ob idos do insec á io do IHMT, e u ilizados com 2-3 dias de idade, com exceção

37
dos u ilizados nos ensaios de alimen ação na u al e a i icial que inham 4-5 dias de
idade. Os mosqui os o am c iados den o de gaiolas de náilon, a uma empe a u a de
26oC e 75% de humidade num ciclo de 12/12 ho as de luz/escu o, e ecebe am um
suplemen o de glucose de 10%.
A in eção dos mosqui os oi ealizada quando pa a pa asi émias en e 10 -20% e
quando e a obse ada ex lagelação. An es da alimen ação, os mu ganhos o am
anes esiados e colocados na supe ície das gaiolas dos mosqui os du an e 45 minu os,
pe mi indo assim o acesso dos mosqui os aos mu ganhos (Fig.2.1). No inal odos os
mosqui os não alimen ados o am excluídos das expe iências.
As êmeas engo gi adas o am man idas a 19-21oC e a 80% de humidade pa a
pe mi i o desen ol imen o do P. be ghei. Den o da gaiola oi colocado um ecipien e
húmido pa a a pos u a de o os (apenas nos ensaios de alimen ação na u al).
Fig. 2.1 Mu ganhos anes esiados du an e a alimen ação de mosqui os.
2.5 EFEITO DO SORO COM TÍTULO ELEVADO DE ANTICORPOS ANTI-
AKIRIN
2.5.1 Desenho Expe imen al
Inicialmen e o am pensados ealiza dois ipos de expe iências, alimen ação
na u al e a i icial, pa a alimen a mosqui os An. gambiae s.s., con udo os ensaios de
alimen ação a i icial não es ão ainda concluídos, po an o só es ão p esen es nes e
38
abalho os esul ados da alimen ação na u al. Os mé odos o am idên icos pa a ambas
as expe iências e es ão esquema izados na igu a 2.2.
Fig. 2.2 Desenho expe imen al da alimen ação na u al e a i icial, dos mosqui os Anopheles gambiae s.s. em
mu ganhos BALB/C. Os ensaios de alimen ação a i icial não es ão ainda concluídos.
2.5.2 P odução da p o eína ecombinan e AKIRIN
A p odução de acinas com o an igénio aki in, p oduzidas a pa i da p o eína
ecombinan e aki in de Aedes albopic us, oi ealizada no Ins i u e de In es igación en
Recu sos Cinegé icos (IREC) em Ciudad Real, Espanha. A p o eína ecombinan e oi
p oduzida de aco do com o desc i o na bibliog a ia em Canales e al., 2009, u ilizando
como sis ema de exp essão le edu as Pichia pas o is.
2.5.3 Imunização dos Mu ganhos
Com o obje i o de a alia o e ei o da aki in em mosqui os in e ados com
Plasmodium sp., imuniza am-se mu ganhos u ilizados pos e io men e pa a alimen ação
de mosqui os. Fo am ealizadas 4 imunizações in ape i oneais, com um in e alo de 3
semanas. Fo am imunizados com doses de 100 uL de acina con endo 50 ug do
an igénio ecombinan e ou com ampão os a o-salino (PBS) adju ado com Mon anide
Mu ganhos
Imunização
(Aki in +
adju an e)
Recolha do So o
Alimen ação
a i icial
So o imunizado +
Sangue in e ado
In eção com
P.be ghjei
Alimen ação
na u al
Con olo
(PBS +
adju an e)
Recolha do So o
Alimen ação
a i icial
So o con olo +
Sangue in e ado
In eção com
P.be ghjei
Alimen ação
na u al
39
ISA 50 V2 (Seppic, Pa is, F ança) ( ig.2.3). Duas semanas após a úl ima imunização os
mu ganhos o am u ilizados na alimen ação de mosqui os.
Fig.2.3 Imunização de mu ganhos. Inoculação in ape i oneal num mu ganho BALB/C
2.5.4 De e minação do Tí ulo de An ico pos - Indi ec Enzyme-Lynked
Immonoso ben Assay (ELISA indi e a)
Os p incípios des a écnica imunoenzimá ica baseiam-se na ligação especí ica
en e o an ico po p imá io que que emos es a e o an igénio. Após essa ligação é
adicionado um an ico po secundá io conjugado a uma enzima, nes e caso a os a ase
alcalina, que ai econhece e liga -se ao an ico po p imá io. Po úl imo, adiciona-se o
subs a o que ai se deg adado pela enzima que es á conjugada ao 2º an ico po e dessa
eação imunoenzimá ica esul a um p odu o de co ama ela, que é mais in enso quan o
maio o o núme o de ligações en e o an ico po e o an igénio. Todo es e p ocesso es á
esumido na igu a 2.4.
Fig. 2.4 Técnica de ELISA indi e a. Es ão ep esen ados as 4 eações essenciais des a écnica: (1) Sensibilização da
placa com o an igénio, (2) Adição do an ico po p imá io do so o que que emos analisa ; (3) Adição do an ico po
secundá io conjugado com uma enzima, no malmen e a pe oxidase; (4) Adição do subs a o pa a eagi com a enzima
conjugada ao 2º an ico po, esul ando na mudança de co . Desenhado no so wa e ChemBioD aw.
40
2.5.4.1 Tí ulo de an ico pos
A placa de 96 poços (NunClon, The mo Scien i ic, Ge many) oi sensibilizada
com 100 uL de an igénio aki in (0,5 ug/100 uL), com as espe i as diluições se iadas
em cada poço, du an e a noi e a 4oC ( ig. 2.5). A placa oi la ada 3x com TBS-T e
bloqueada com 250 uL da solução de bloqueio ( abela A em anexo) du an e 1h a
empe a u a ambien e pa a ocupa os locais que não são ocupados pelo an igénio e
e i a as ligações inespecí icas do an ico po aos poços da placa. Em seguida, la ou-se
no amen e a placa 3x e o am adicionados 100 uL dos so os con olo e dos so os
posi i os, ambos diluídos em TBS (1:500), du an e 1h a 37oC. Em seguida, la ou-se a
placa no amen e 5x, e adicionou-se 100 uL do 2º an ico po p oduzido em cab a an i-
IgG, IgA e IgM de a o conjugado à enzima os a ase alcalina (Sigma-Ald ich, USA)
diluído 1: 10 000 ( / TBS-T) du an e 1h a 37o C. Após es a incubação, adicionou-se
100 uL do subs a o de p-ny ophenyl os a o (Sigma-Ald ich, USA) diluído no ampão
de diluição e icou du an e 40 min num local com ausência de luz a 37oC. Po im, leu-
se no espec o o ôme o (TRIAD Se ies Mul imode De ec o da DYNEX Technologies)
com um il o de 415 nm e os esul ados são ap esen ados em densidade ó ica (D.O).
Fig. 2.5 Esquema das diluições se iadas do an igénio (Ag) e do so o do animal imunizado (an ico po p imá io),
pa a de e minação do í ulo de an ico pos. No poçoA1 coloca-se 100 uL de an igénio com a máxima concen ação, e
depois dilui-se 1:2 ao longo das linhas de B a G. O mesmo se passa com o an ico po p imá io, que é diluído ao longo
das linhas Re i ado de www.pie cene .com/Files/1602127_Assay_De _HB_ 2_INTL.pd [Consul ado 1 de Ou ub o de
2012]
A
41
2.6 ENSAIO DE SILENCIAMENTO DO GENE aki in
O RNA de in e e ência (RNAi) é um mecanismo egulado da exp essão de
genes, a a és do p ocesso de deg adação do RNA p o enien e da ansc ição. Du an e
es e p ocesso a p esença do RNA de cadeia dupla (dsRNA) no ci oplasma da célula
unciona como um indu o do p ocesso de RNAi, de ido à sua ligação às moléculas de
RNA mensagei o (mRNA) do gene al o, le ando à sua des uição e, des a o ma,
impede a acumulação de mRNAs do gene al o no ci osol. A maio ia dos o ganismos
euca io as ap esen a es e sis ema de RNAi na u almen e de o ma a impedi a in asão
po ou os elemen os gené icos mó eis, ais como í us ou ansposões.
De um modo ge al o que acon ece quando es as moléculas de dsRNA se
encon am no in e io da célula, é p o oca uma a i ação de uma enzima da amília
RNaseIII, chamada DICER, que dige e as moléculas de dsRNA em pequenas moléculas
de RNA (siRNA) com um amanho a iá el en e 21 e 25 nucleó idos. Po sua ez es as
pequenas moléculas de RNA ligam-se a um complexo p o eico, o mando o RISC
(RNA-induced silencing complex), que é a i ado na p esença de ATP de o ma a
pe mi i que a cadeia an i-sense ique expos a e consequen emen e po homologia
empa elhe com o mRNA co esponden e e es e seja co ado, como es á ilus ado na
igu a 2.6 (Fi e; e al., 1998; Ag awal e al., 2003).
Fig. 2.6 Mecanismo ge al de uncionamen o do modelo de RNA de in e e ência a a és do RNA de cadeia dupla
(dsRNA). Re i ado de h p://www.nobelp ize.o g/nobel_p izes/medicine/lau ea es/2006/p ess.h ml [Consul ado 25 de
Junho de 2012]

42
2.6.1 P odução de dsRNA
Tendo como obje i o o silenciamen o do gene aki in em mosqui os, o am
desenhados p ime s com base na sequência do gene (Vec o base: AGAP006809). Foi
ealizada a écnica de Reação em Cadeia da Polime ase (PCR) usando como molde
DNA complemen a (cDNA) de An. gambiae s.s.. As condições seguidas e eagen es
u ilizados es ão desc i os nas abela C e G, espe i amen e, em anexo.
Um gene exógeno de mu ganho, be a-2mic oglobulina (b2m) (GenBank:
NM_009735), oi igualmen e usado pa a p oduzi dsRNA. Como desc i o em cima, um
pa de p ime s que incluíam a sequência T7 do p omo o mais 22 bp da sequência do
gene b2m o am u ilizados pa a ampli ica o gene a pa i de cDNA de Mus musculus
( abela B e G, espe i amen e, em anexo). Os p ime s especí icos pa a cada gene es ão
desc i os na abela F, em anexo.
Cada p odu o de PCR oi pu i icado usando o ki de pu i icação ilus a GFX
PCR and DNA Gel Band Pu i ica ion (GE Heal hca e, USA), e pos e io men e 1μg de
p odu o pu i icado oi u ilizado como molde pa a sin e iza dsRNA a a és da
ansc ição in i o usando o MEGAsc ip T7 ki (Ambion, USA) seguindo as ins uções
do ab ican e. A concen ação e qualidade do dsRNA o am medidas a a és de
espec ome ia (NanoD op 1000, The mo Scien i ic, Ge many) e em gel de 1.5% (m/ )
de aga ose (Figu a 2.7).
Fig. 2.7 Fo og a ia de um gel de aga ose a 1,5% após elec o o ese de 1 uL de amos as de dsRNA dos genes
aki in e b2m. Poços 1- 9 co espondem ao dsRNA do gene aki in (509 bp), enquan o os úl imos 10 poços
co espondem ao gene b2m (447bp). Ma cado Hype Ladde II, 50 – 2,000 bp (100 lanes)
43
2.6.2 Silenciamen o do gene aki in
Mosqui os êmeas de A. gambiae s.s. com 2-3 dias de idade, o am anes esiados
em gelo e injec ados no ó ax com 69 nL de uma solução de dsRNA com uma
concen ação ap oximadamen e de 3 ug ul-1 (~ 207 ng) de cada gene, como es á
ep esen ado na igu a 2.8. Nes es ensaios de silenciamen o, o g upo con olo oi
inje ado com dsRNA B2M, pa a se i de e e ência em elação à in ensidade de
in eção e pa a quan i icação dos ní eis de exp essão do gene em es udo.
Todas as injeções dos mosqui os o am ealizadas com um sis ema de
mic oinjeção (Nanoinjec ; D ummond Scien i ic, USA). O silenciamen o do gene oi
con i mado 4 dias após a injeção po PCR quan i a i o em empo eal (RT-qPCR) em
que se u ilizou o gene ibossomal s7 (Vec o base: AGAP010592) pa a no malização da
exp essão, uma ez que é um gene cons i u i o.
Fig. 2.8 Mic oinjeção dsRNA no ó ax de um mosqui o êmea An. gambiae s.s.
2.6.3 In eção dos mosqui os po Plasmodium be ghei
No 4º dia após a injeção os mosqui os o am alimen ados em mu ganhos
in e ados com P. be ghei, de aco do com o pon o 2.4. Du an e a alimen ação o am
ealizadas ocas egula es en e os mu ganhos das gaiolas, pa a ob ia e en uais
di e enças de pa asi émia en e os mu ganhos.
44
2.6.4 Recolha de ecidos pa a con i mação do silenciamen o, análise da
in ensidade de in eção e con agem de o os po êmea
Pa a os mosqui os silenciados, o am ecolhidos os in es inos médios de
ap oximadamen e 30 mosqui os 4 dias após o silenciamen o e imedia amen e an es da
alimen ação. Os mosqui os o am dissecados e os in es ino médios ans e idos pa a 300
uL de solução RNAla e (Ambion, USA), e no inal o am a mazenados a -20oC a é à
ex ação de RNA.
Oi o dias pós-in eção, os mosqui os êmeas o am dissecados e em cada uma
con ou-se o nº de o os no in e io do abdómen e ecolheu-se o in es ino médio pa a
de e mina a in ensidade de in eção (nº de oocis os / mosqui o) po mic oscopia
(Axioskop, Ca l Zeiss). Foi ambém ecolhido o co po go do pa a análise do
silenciamen o. Fo am ealizadas 4 éplicas biológicas independen es.
2.6.5 Quan i icação da exp essão do gene aki in
O RNA o al do in es ino médio e do co po go do de cada mosqui o oi ex aído
com ecu so ao Nucleospin RNAII ki (Mache ey-Nagel, F ança) de aco do com as
ins uções do ab ican e e quan i icado po espec o o ome ia (NanoD op,The mo
Scien i ic, Ge many). Pos e io men e, oi ealizado um RT-qPCR de dois passos, no
qual p imei amen e oi sin e izado o cDNA u ilizando p ime Oligo dT (Roche,
Swi ze land) e a enzima MMLV Re e se T ansc ip ase (P omega, USA) de aco do com
as indicações do ab ican e. Num segundo passo a exp essão do gene oi quan i icada
po PCR em empo eal com a iQ™ SYBR® G een Supe mix (BioRad, USA) no
e mociclado iCycle iQ™ (BioRad, USA). Semp e que necessá io oi igualmen e
usado o ki , iSc ip One-S ep RT-PCR Ki Wi h SYBR (BioRad, USA), cuja di e ença é
as eações de ansc ição e e sa e de PCR em empo eal que oco e em num só passo.
As concen ações dos eagen es das eações do PCR em empo eal es ão nas abelas H
e I, em anexo; e as condições seguidas na ealização do mesmo es ão nas abelas C, D e
E, em anexo.
As quan i icações po RT-qPCR o am ei as em iplicado. Pa a a con i mação
do silenciamen o do gene, os p ime s u ilizados pa a ampli ica o agmen o po RT-
qPCR o am di e en es dos u ilizados pa a ampli ica o agmen o pa a p oduzi o
dsRNA, de o ma a não ha e in luência nas quan i icações do gene.
45
Os esul ados da quan i icação o am no malizados com o gene que codi ica
pa a a p o eína ibossomal S7 e o silenciamen o oi analisado pelos mé odos
CT compa a i o (ΔΔCT). Os p ime s u ilizados es ão desc i os na abela F em anexo.
Fo am ealizados 3 ensaios independen es.
2.6.6 Análise da quan idade da p o eína aki in po Ele o o ese de
p o eínas em gel de Poliac ilamida (SDS-PAGE)
2.6.6.1 SDS-PAGE
A quan idade de aki in em ex a os de mosqui os silenciados e ex a os con olo
oi analisada po densi ome ia. Nes e sen ido oi ealizada uma ele o o ese em gel de
12% (m/ ) de poliac ilamida (PAGE-GEL, P onadisa, Spain) num sis ema Mini p o ean
III (BioRad, USA), e adicionou-se o ampão de co ida (Tabela J, nos anexos). Às
amos as p o eicas oi adicionado o ampão de amos a (Tabela J, nos anexos), de modo
a ob e uma concen ação inal de 60 ng/poço. Em seguida as amos as o am sujei as a
uma empe a u a de 95oC du an e 5 minu os pa a desna u a as p o eínas, e ca egou-se
em cada poço do gel 35 uL de amos a. A sepa ação oco eu a uma ol agem cons an e
de 90V.
O gel ob ido oi co ado com comassie blue (P omega, USA) du an e 1h a
empe a u a ambien e, seguido de 3 la agens com água des ilada.
A densi ome ia das bandas oi analisada com o so wa e ImageJ e são 1.42. u ilizando
o guia do usuá io que acompanha o p og ama.
2.7 CONTAGEM DO Nº DE OVOS, MORTALIDADE, TAXA E
INTENSIDADE DE INFEÇÃO
A mo alidade em cada uma das gaiolas dos mosqui os oi egis ada dia iamen e.
A o iposição oi igualmen e egis ada com uma pe iocidade diá ia nos ensaios de
alimen ação na u al. Nos ensaios de silenciamen o oi con ado o núme o de o os no
in e io de cada êmea quando dissecadas. Ao oi a o dia pós-in eção as êmeas
p esen es nas gaiolas o am dissecadas e con ados os nº de o os no in e io do abdómen
e ecolhido o in es ino médio pa a de e mina a in ensidade de in eção (nº de oocis os /
mosqui o) po mic oscopia (Axioskop, Ca l Zeiss).
52
e ealizado mais pos u as e em maio quan idade. Todos os dados ela i os à p odução
de o os e o iposição, encon am-se esumidos na abela 3.B.
Tabela 3.B E ei o dos an ico pos an i-aki in na o iposição e na p odução de o os pelas êmeas An.gambiae s.s.
G upo
N
Mín
Máx
Média
Medi
-ana
p(1)
p(2)
%O os
a o iados(3)
O ip.(4)
%O os
eclodidos
Con olo
61
0
66
7
0
>0,05
>0,05
19
80
39
Aki in
78
0
43
5
0
12
250
41
(1) alo es de p pa a a compa ação en e os mosqui os a ados com dsAki in e o con ol usando o es e não
pa amé ico de MW; (2) alo es de p pa a a compa ação en e os mosqui os a ados com dsAki in e o con ol usando
o es e Kolmogo o -Smi no ; (3) (nºde o os com um desen ol imen o incomple o/nº o al de o os) x 100; (4)
O iposição - nº o al de o os pos os em cada g upo.
3.1.2.3 E ei os dos an ico pos an i-aki in na sob e i ência dos
mosqui os Anopheles gambiae s.s.
O e ei o dos an ico pos an i-aki in na sob e i ência dos mosqui os Anopheles
gambiae s.s. alimen ados em mu ganhos con olo e em mu ganhos imunizados oi
analisado de aco do com as me odologias já desc i as. Da obse ação da igu a 3.5 é
possí el e i ica que não exis em di e enças na mo alidade en e os mosqui os dos
dois g upos, uma ez que a pe cen agem de sob e i ência no g upo con olo é de 48% e
no g upo imunizado é de 50%. Es as di e enças não o am signi ica i as (p>0,05).
Fig. 3.5 E ei o dos an ico pos an i-aki in na sob e i ência de mosqui os An.gambiae s.s.. A linha cinzen a
ep esen a a axa de sob e i ência dos mosqui os no g upo con olo ao longo dos 8 dias dos ensaios. A linha p e a
ep esen a a axa de sob e i ência do g upo alimen ado em mu ganhos imunizados.

53
3.2 CARATERIZAÇÃO DO GENE aki in
3.2.1 E ei o do silenciamen o em Anopheles gambiae s.s.
Com o obje i o de quan i ica o e ei o do silenciamen o do gene de in e esse,
o am ealizadas qua o éplicas biológicas. No o al o am analisados 340 indi íduos
do g upo de mosqui os inje ados com dsRNA con olo, denominado po g upo con olo,
e 277 indi íduos do g upo de mosqui os inje ados com dsRNA aki in, denominado
como g upo aki in ou g upo silenciado. Os e ei os do silenciamen o o am analisados,
essencialmen e, a a és de 3 pa âme os: (i) in ensidade de in eção e axa de in eção; (ii)
p odução de o os, a a és da con agem do núme o de o os no in e io do abdómen de
cada êmea; e (iii) sob e i ência.
3.2.1.1 Quan i icação do silenciamen o po RT-qPCR
O silenciamen o oi analisado a pa i dos in es inos médios ecolhidos das
êmeas An. gambiae s.s. 4 dias após a injeção de dsRNA. As axas de silenciamen o
es ão ep esen adas na igu a 3.6, as maio es axas de silenciamen o nes e ecido
oco em nos ensaios 1 e 2, em 34% e 39% espe i amen e. A axa de silenciamen o
ob ida no ensaio 3 oi a mais baixa (5%), enquan o no 4º e úl imo ensaio oi de 16%.
Fig. 3.6 Taxas de silenciamen o do gene aki in, medidas po RT-qPCR. As ba as p e as ep esen am a
pe cen agem de silenciamen o do gene aki in no in es ino médio; as ba as cinzen as cla as ep esen am a axa de
silenciamen o no pool nº1 dos co pos go dos nas expe iências 3 e 4; as ba as cinzen as escu as ep esen am a axa de
silenciamen o no pool nº2 dos co pos go dos na expe iência 4 (es e pool e a cons i uído po mosqui os sem in eção e
sem p odução de o os).
0
10
20
30
40
50
60
70
1
2
3
4
% Silenciamen o
Expe iência
Es ômago
Co po go do pool 1
Co po go do pool2
54
Em pa alelo, o am ecolhidos os co pos go dos pa a quan i icação da axa de
silenciamen o, ambém nes e ecido. As êmeas inje adas com dsRNA aki in da
expe iência 4 o am sepa adas em 2 pools, denominados de “Aki in Co po go do pool
1” e “Aki in Co po go do pool 2”. Es a di isão pe mi iu analisa sepa adamen e a axa
de in eção de silenciamen o nos mosqui os que não inham o os, nem in eção, de o ma
a in e i se esse acon ecimen o se ia um e ei o do silenciamen o ou uma oco ência
ocasional. Como se pode obse a pelos dados p esen es na abela K em anexo, as
êmeas do 2º pool não ap esen a am qualque o o no in e io do seu abdómen e não
ap esen a am in eção.
As axas de silenciamen o e e en es a cada um dos pools do co po go do das
expe iências 3 e 4, es ão ep esen adas na igu a 3.6. É possí el obse a que a
pe cen agem de silenciamen o no único pool de co pos go dos da 3ª expe iência oi de
31% (ba a cinzen a mais cla a), enquan o na 4ª expe iência os dois pools de co pos
go dos i e am um silenciamen o de 26% e 65% (ba as cinzen a cla a e cinzen a
escu a, espe i amen e).
3.2.1.2 Compa ação dos ní eis de exp essão de mRNA do gene
aki in
A exp essão dos ní eis de mRNA do gene aki in ob idos eco endo à écnica de
PCR em empo eal, o am compa ados en e o g upo con olo e o g upo silenciado
(Figu a 3.7). Os esul ados ob idos indicam que os ní eis de mRNA no g upo silenciado
são in e io es ao do g upo con olo, que nos pools de in es inos médios (Fig. 3.7 A)
como nos pools co esponden es ao co po go do (Fig. 3.7 B), embo a essa di e ença
seja mais no ó ia no co po go do. As di e enças são es a is icamen e signi ica i as no
co po go do (p<0,0001), con udo nos in es inos médios não o são.
55
Con olo
Silenciado
0.00
0.02
0.04
0.06
0.08
0.10
Aki in ní eis de mRNA(Valo es de CT no malizados)
Fig. 3.7 Ní eis de mRNA aki in no con olo (inje ado com dsRNA B2M) e no g upo silenciado (inje ado com
dsRNA Aki in). Na igu a A es á ep esen ado os ní eis de mRNA nos in es inos médios ecolhidos an es da
alimen ação in e an e com P.be ghei. Na igu a B es á ep esen ado os ní eis de mRNA nos co pos go do ecolhidos
8 dias após a e eição in e an e com P.be ghei. Os dados es ão ep esen ados pela média com o des io pad ão. Doi
u ilizado o es e não pa amé ico MW.
3.2.1.3 Análise do silenciamen o po densi ome ia das bandas
do gel SDS-PAGE
As bandas ob idas a a és do gel SDS-PAGE ealizado a pa i dos ex a os
p o eicos de mosqui os silenciados e con olo, o am analisadas po densi ome ia pa a
a e i a quan idade de p o eína exis en e nas bandas co esponden es à aki in ( ig.3.8). A
p o eína aki in de Anopheles gambiae s.s. em um peso molecula de 22,665 kDa
( amanho da subolesin [SUB] de Ixodes scapula is 20,522 kDa).
A
B
***
Con olo
Silenciado
0.000
0.001
0.002
0.003
0.004
Aki in ní eis de mRNA(Valo es de CT no malizados)
56
Fig. 3.8 Gel SDS-PAGE ealizado com os ex a os p o eicos dos pools de co po go do dos mosqui os silenciados
e dos mosqui os con olo, pa a análise de densi ome ia. As bandas ma cadas com os e ângulos a acejado
co espondem, eo icamen e, à aki in de An.gambiae s.s., que em um peso molecula eó ico de 22,665 kDa.
Ab e ia u as:MP- Ma cado de peso molecula ; S1 – Amos as da 3ª expe iência silenciado; S2 – Amos as da 3ª
expe iência con olo; S3 – Amos as da 4ª expe iência silenciado; S4 – Amos as da 4ªexpe iência con olo; AKR –
p o eína ecombinan e Aki in con olo de Aedes albopic us p oduzida em Pichia pas o is (peso molecula eó ico
22,54 KDa); SUB – p o eína ecombinan e Subolesin de Ixodes scapula is (peso molecula eó ico 20,522 KDa).
Na abela 3.C es ão esumidos os esul ados da densi ome ia ela i amen e à
banda da aki in. Como é possí el obse a os ex a os p o eicos dos pools de co po
go do silenciado da 3ª e 4ª expe iências êm menos quan idade de p o eína do que os
espe i os con olos.
Tabela 3.C Compa ação dos esul ados da análise densi omé ica dos ex a os p o eicos de co po go do e dos
esul ados de silenciamen o ob idos a pa i dos ní eis de mRNA dos pools de co po go do.
Denominação no
gel
Amos a
Densi ome ia
Silenciamen o (RT-
qPCR)
S1
3ª expe iência
silenciado
2.6%
31%
S2
3ª expe iência
con olo
4%
-
S3
4ª expe iência
silenciado
2.5%
65%
S4
4ª expe iência
con olo
4.5%
-
57
A co elação en e o silenciamen o analisado po RT-qPCR a pa i do RNA
ex aído das amos as de mosqui os e o silenciamen o analisado po densi ome ia no
gel SDS-PAGE a pa i de ex a os p o eicos, é ele ado (Fig.3.9). Is o signi ica que
quan o maio a pe cen agem de silenciamen o, meno a pe cen agem de p o eína aki in
exis en e nos ex a os p o eicos de mosqui os silenciados.
Fig. 3.9 Co elação en e o silenciamen o analisado po RT-qPCR e o silenciamen o analisado po
densi ome ia no gel SDS-PAGE.
3.2.1.4 In ensidade de in eção po oocis os de P. be ghei
Na igu a A1 em anexo, es ão ep esen adas imagens ob idas po mic oscopia de
luo escência de in es inos médios in e ados com oocis os de P.be ghei, pe encen es a
êmeas a adas e con olo.
Os esul ados ob idos po con agem de oocis os em odos os in es inos médios
dis ibuídos pelas 4 expe iências, suge em que a in ensidade de in eção é maio nos
in es inos médios dos mosqui os do g upo aki in do que nos dos mosqui os con olo
(Figu a 3.10). A mediana da in ensidade da in eção, ep esen ada pelo aço e melho
no g á ico, é de 16 oocis os no g upo con olo e de 31 oocis os no g upo aki in. O
aumen o da in eção no g upo aki in ela i amen e ao con olo é de 39%, sendo es a
di e ença de in ensidade de in eção en e os dois g upos es a is icamen e signi ica i a
(p<0,0001), abela 3.D.
R² = 0,8681
0
0,02
0,04
0,06
0,08
0,1
0 1 2 3 4 5
Ní eis de mRNA ( alo es CT
no malizados)
% Densi ome ia

58
con olo
aki in
0
40
80
120
160
200
240
280
320
360
400 N= 340 N= 277
***
Oocis os/in es ino médio
Fig. 3.10 Análise do e ei o do silenciamen o do gene aki in na in eção com P.be ghei 8 dias após a e eição
in e an e pa a os mosqui os An. gambiae s.s.. Os ci culos ep esen am o núme o de oocis os p esen es em cada
in es ino médio, mediana es á ep esen ada pela linha ho izon al e melha. N é o nº o al de mosqui os analisados. A
dis ibuição dos oocis os oi compa ada usando o es e não pa amé ico de Mann-Whi ney, *** indica di e enças
signi ica i as (p<0,0001).
Nes a abela es ão esumidos os dados da in ensidade de in eção en e o g upo
con olo e o g upo silenciado. Na p imei a me ade da abela cons a a análise dos
esul ados com odos os mosqui os das 4 expe iências, e na me ade in e io da abela
cons a uma análise idên ica, mas sem os mosqui os que inham in ensidade de in eção
igual a ze o. Es a segunda a análise oi ealizada com o in ui o de e i ica se as
di e enças se man inham en e os dois g upos, uma ez que do o al de odos os
mosqui os analisados, os que não êm in eção são um núme o signi ica i o e êm uma
g ande in luência na análise dos dados. No en an o, como se pode e i ica os esul ados
são iguais e as di e enças en e os dois g upos con inuam a exis i .
59
Tabela 3.D E ei o do silenciamen o do gene que codi ica a aki in na in ensidade de in eção po P.be ghei.
G upo
N
Mín
Max
Média
Média
Geomé ica
Mediana
p(1)
p(2)
%Aumen o
in eção(3)
Con olo
340
0
201
33,26
-
16
<0,0001
<0,005
39%%
Aki in
277
54
385
54,64
-
31
Con olo*
226
1
201
50, 03
29,72
40,50
<0,005
<0,005
32%
Aki in*
207
1
385
73,11
40,02
55
* Não es ão incluídos os mosqui os que ap esen a am in eção nula, es a segunda análise oi e e uada pa a e i ica se
as di e enças en e os dois g upos se man inham; (1) alo es de p pa a a compa ação en e os mosqui os a ados com
dsAki in e o con ol usando o es e não pa amé ico de MW; (2) alo es de p pa a a compa ação en e os mosqui os
a ados com dsAki in e o con ol usando o es e Kolmogo o -Smi no ; (3) 100 × [(média aki in – média con olo) /
média aki in].
Se obse a mos indi idualmen e os esul ados de cada uma das expe iências
compa a i amen e ao aumen o da in ensidade de in eção en e o g upo con olo e o
g upo aki in, as pe cen agens das 4 expe iências são 51%, 14%, 18% e 53%,
espe i amen e (Tabela L, em anexo). Po an o e i ica-se que há uma endência dos
mosqui os êmeas a ados e em uma maio in ensidade de in eção.
A axa de in eção das 4 expe iências não em di e enças es a is icamen e
signi ica i as, po ém o núme o de mosqui os in e ados pe encen es ao g upo con olo
oi supe io do que no g upo aki in (Figu a 3.11).
con olo
aki in
0
20
40
60
80
100 N= 340 N= 277
% mosqui os in e ados
Fig. 3.11 Taxa de in eção 8 dias após a e eição in e an e em mosqui os silenciados (dsRNA Aki in) e
mosqui os con olo (dsRNA B2M). Compa ação en e as axas de in eção analisada pelo es e do Chi-quad ado,
p>0,05.
60
Ao co elaciona o silenciamen o no in es ino médio com a axa de in eção,
e i ica-se que exis e uma co elação mui o ele ada o que signi ica que, quan o maio a
axa de silenciamen o no in es ino médio, mais baixa é a axa de in eção, suge indo que
quan o menos exp esso es á o gene aki in no in es ino médio, meno é a axa de in eção
e, po an o, meno é o núme o de mosqui os in e ados (Fig.3.12).
Fig. 3.12 Co elação en e a axa de silenciamen o no in es ino médio e a axa de in eção nos mosqui os em
cada éplica biológica. A co elação é mui o ele ada (R2 = 0,9622), o que signi ica que quan o maio a axa de
silenciamen o, meno o núme o de mosqui os in e ados com P. be ghei.
3.2.1.5 Na p odução de o os
As e en uais consequências do silenciamen o do gene aki in o am ambém
es udadas em elação à p odução de o os do mosqui o. No inal de cada ensaio
dissecou-se o abdómen de cada êmea e con ou-se o núme o de o os exis en es. As
medianas co esponden es às 340 êmeas do g upo con olo e às 277 êmeas do g upo
silenciado (linha e melha), são de 19 o os po êmea e 3 o os po êmea,
espe i amen e (Fig. 3.13). Tal como oco e com a in ensidade de in eção, exis em
di e enças signi ica i as ambém ao ní el da e ilidade (p<0,0001).
R² = 0,9622
0
20
40
60
80
100
0 10 20 30 40 50
Taxa de in eção
% Silenciamen o
61
con olo
aki in
0
10
20
30
40
50
60
70
80
90
100
110 N= 340 N= 277
***
O os/mosqui o
Fig. 3.13 E ei o do silenciamen o na p odução de o os em mosqui os An.gambiae s.s.. Os cí culos ep esen am o
núme o de o os p esen es em cada abdómen das êmeas dissecadas, a mediana es á ep esen ada pela linha ho izon al
e melha. N é o nº o al de mosqui os analisados. A dis ibuição dos o os oi compa ada usando o es e não
pa amé ico MW, *** indica di e enças signi ica i as (p<0,0001).
No o al das 4 expe iências, o silenciamen o do gene aki in esul ou numa
inibição de 35% na p odução de o os nas êmeas do g upo silenciado
compa a i amen e ao g upo con olo. A maio inibição na p odução de o os oco eu nas
êmeas da expe iência 1 com 56% de inibição, enquan o nas expe iências 2 e 4, essa
inibição oi de 35% e 32%, espe i amen e. Na expe iência 3 e i icou-se a meno
pe cen agem de inibição, com 23% (Tabela M, em anexo).
Dado que é p incipalmen e no co po go do que oco e a exp essão dos genes
esponsá eis pela p odução de o os nas êmeas, como oi mencionado an e io men e,
elacionou-se a inibição da e ilidade com o silenciamen o quan i icado no co po go do
dos mosqui os; o esul ado ob ido suge e exis i uma co elação ele ada (R2 = 0,849),
en e es es dois pa âme os (Fig. 3.14).
68
go do e a inibição na p odução de o os, pa ece indica que a aki in é impo an e nes e
ecido uma ez que ambém é um dos genes sob eexp essos nos o á ios e no co po
go do (Ma ino i e al., 2005). Uma das hipó eses pa a es a inibição pode á se o ac o
de a aki in es a en ol ida na exp essão de genes impo an es na i elogénese, po
exemplo en ol idos na p odução das i elogeninas (lipop o eínas en ol idas na
ans e ência de ese as lipídicas pa a os oóci os) e/ou nos ece o es [Vi ellogenin
ecep o s – VgRs (Sapping on e al., 1996)] que inco po am as i elogeninas nos
oóci os (Raikhel, 1987), uma ez que começam ambos a se sin e izados pelo sinal
nu icional p o idenciado pelos aminoácidos esul an es da e eição sanguínea (Gulia e
al., 2002; Dana e al., 2005). A inibição da p odução ao ní el da oogénese é menos
p o á el, uma ez que o desen ol imen o inicial dos oóci os nos o á ios se inicia logo
após a eclosão, an e io ao silenciamen o, icando es es em ase es acioná ia a é à
alimen ação (Dana e al., 2005). Es e e ei o do silenciamen o já oi epo ado
an e io men e, em ca aças pa a o gene o ólogo subolesin (de la Fuen e e al., 2006;
Manzano-Román e al., 2011). Ou a a o que pode e con ibuído pa a es e esul ado
pode es a elacionado com uma nu ição insu icien e, is o é, apesa de as êmeas se
encon a em engo gi adas, o núme o de o os po mosqui o que ma u a no p imei o ciclo
gono ó ico depende do po encial nu icional da e eição sanguínea (Suneja e al.,
2003). O aspe o nu icional pode condiciona o desen ol imen o incomple o dos o os,
mas di icilmen e se á explicação pa a a inibição uma ez que ambos os g upos
es i e am sob as mesmas condições em e mos de alimen ação. Po úl imo, a não
ecundação dos oóci os não pa ece se uma explicação azoá el, uma ez que as êmeas
de ambos os g upos c esce am na mesma gaiola, conjun amen e com machos.
O silenciamen o de gene aki in e elou, como desc i o, epe cussões ao ní el da
sob e i ência dos mosqui os êmeas inje ados com dsRNA Aki in. Dado que o gene
aki in egula á ias unções biológicas impo an es pa a o mosqui o (Nowak, Aiha a e
al. 2012), o seu silenciamen o pode e p omo ido mo alidade do o ganismo silenciado.
Ou as si uações/causas podem, no en an o, se esponsá eis pela ob enção des es
esul ados: (i) injeção dos mosqui os e consequen e auma no local da injeção ( ó ax); a
maio ia dos mosqui os mo e de ido a es e p ocesso, no malmen e du an e os 3 dias pós
injeção, con udo exis em di e enças na sob e i ência ao longo dos 12 dias de ensaio;
(ii) o local da injeção é uma “po a de en ada” pa a bac é ias e ou os mic o ganismos

69
que acabam po debili a o mosqui o, e le indo-se ainda mais pelo ac o dos mosqui os
e em uma ia de sinalização do seu sis ema imuni á io comp ome ida de ido ao
silenciamen o; (iii) os mosqui os não esis i am aos danos p o ocados pelos oocine os e
pos e io men e pelos oocis os, uma ez que não são um e o na u al pa a o plasmódio
u ilizado nos ensaios.
A explicação que pa ece se mais plausí el, de aco do com o publicado po
ou os au o es (Go o e al., 2008; Nowak e al., 2012) apon a pa a o ac o do gene aki in
es a p o a elmen e en ol ido nou as unções essenciais ao desen ol imen o e
sob e i ência do mosqui o. Es e enómeno do aumen o da mo alidade oi ambém
epo ado pa a o gene o ólogo subolesin mas, a é ao momen o, não se conhecem
igualmen e, as azões pa a es es esul ados.
Resumindo, os enó ipos esul an es do silenciamen o no inse o e o An.
gambiae s.s.. podem, em ce a medida, e le i a e icácia de abso ção do dsRNA e
silenciamen o do gene nos di e en es ecidos e ipos de células pa a além das unções
especí icas do gene. Sendo assim, o gene aki in em ou as unções impo an es além de
assis i na unção do complexo Rel do sis ema imune no comba e ao Plasmodium spp.,
ais como na ep odução e ou as unções biológicas essenciais pa a o mosqui o
comple a o seu ciclo de ida.
Es es esul ados pa eciam indica que a aki in pode i a se po encialmen e
u ilizada como acina con a o mosqui o e o da malá ia. Assim, oi u ilizada a
p o eína ecombinan e aki in de Aedes albopic us pa a es a a sua e icácia con a o
e o An. gambiae s.s. em ensaios de acinação. Es a p o eína oi escolhida po que
possui uma homologia de 85% com a de An. gambiae s.s. e a sua p odução e os
p o ocolos de acinação já es ão pad onizados. Es a abo dagem pe mi iu ob e
in o mação sob e a ea i idade c uzada do an igénio aki in en e mosqui os de géne os
di e en es, mos ando a aplicabilidade de uma acina con a múl iplos e o es
a ópodes.
Na segunda ase des e es udo, os mosqui os o am alimen ados em hospedei os
imunizados, nes e caso em mu ganhos, com o an igénio aki in de Aedes albopic us, pa a
e i ica os e ei os da in eção em An. gambiae s.s. enquan o e o . Os esul ados
ob idos pe mi i am e i ica que a alimen ação na u al em hospedei os imunizados com
a p o eína ecombinan e aki in não pa ece e e ei os sob e nenhum dos pa âme os
70
e i icados an e io men e com o silenciamen o. Em elação à in eção, que oi um dos
pa âme os mais a e ados após silenciamen o, na alimen ação na u al não o am
obse adas di e enças en e os mosqui os alimen ados em mu ganhos imunizados e
con olo.
Rela i amen e à o iposição, as condições clima é icas ideais pa a simula as
ci cuns âncias na u ais do c escimen o e ep odução do e o An. gambiae s.s., são de
26oC e ce ca de 80% de humidade. Sob es as condições, as êmeas de An. gambiae s.s.
ealizam a pos u a no segundo dia após a alimen ação, a ingindo o pico da pos u a em
e mos de quan idade de o os ao 3º dia. Nas nossas expe iências, os mosqui os
c esce am a 20oC, pa a p opo ciona o desen ol imen o do pa asi a no e o .
P o a elmen e de ido a es e ac o, oco eu um a aso na o iposição nas expe iências
elacionadas com a alimen ação na u al, uma ez que as êmeas só começa am a ealiza
pos u as de o os ao 3º dia após a alimen ação, p olongando-se du an e os oi o dias das
expe iências. Regis ou-se ainda que só algumas êmeas ap esen a am o os no seu
in e io e com di e en es o mas de desen ol imen os ( igu a 3.15). Obse ou-se,
ambém, que quan o maio o nume o de o os pos os, meno a pe cen agem de êmeas
com o os no seu in e io , como oi o caso do g upo alimen ado nos mu ganhos
imunizados ao in és do g upo con olo. Os esul ados ob idos nos ensaios de
alimen ação na u al, pe mi em suge i que não hou e qualque e ei o da acinação na
p odução de o os ou na o iposição, nem na ge ação subsequen e, no núme o de o os
eclodidos, como epo ado em ou as espécies de inse os e ca aças (Canales e al.,
2009; de la Fuen e e al., 2011; Mo eno-Cid e al., 2011).
Os esul ados ela i os à sob e i ência, ou o dos pa âme os a aliados, suge em
que ambém não é a e ada pela inges ão dos an ico pos an i-aki in em An. gambiae s.s.,
ao con á io do e i icado no silenciamen o do gene aki in. Em ensaios semelhan es de
alimen ação na u al, ealizados ambém com inse os, oi obse ado que o maio e ei o
dos an ico pos incide essencialmen e ao ní el da ep odução, sendo menos a e ada a
sob e i ência (Mo eno-Cid e al., 2011; Suneja e al., 2003).
Os esul ados ob idos podem le a indica que a o mulação de uma acina
incluindo a p o eína ecombinan e aki in como an igénio p incipal pode não se
e icien e. No en an o, es udos an e io es demons a am esul ados posi i os como são
exemplo os esul ados ob idos em mosqui os alimen ados a i icialmen e com
71
an ico pos an i-aki in, que esul ou numa edução da sob e i ência e/ou e ilidade de
mosqui os (An. a opa us, Aedes caspius e Culex pipiens) e áca os (De manyssus
gallinae) (de la Fuen e e al., 2011); esul ados semelhan es o am igualmen e ob idos
em ensaios de alimen ação na u al en ol endo A. albopic us e lebó omos (P.
pe nicosus) nos quais se obse ou uma edução na o iposição. Nas ca aças, a
alimen ação com an ico pos deu o igem a uma diminuição da in es ação de Ixodes
scapula is e Rhipicephalus mic oplus (Canales e al., 2009; de la Fuen e e al., 2011).
As di e enças dos e ei os da acinação ob idos no nosso abalho, em An.
gambiae s.s., compa a i amen e a ou as espécies de inse os, pode de e -se a um ou à
combinação de di e sos a o es. A p imei a hipó ese é ela i a à dis ância e olu i a
en e as espécies e consequen e a iação nos epí opos an igénicos/imunogénicos, uma
ez que es a em sido apon ada como uma explicação pa a a a iação na espos a à
acinação in e -espécies e in a-espécies (Mo eno-Cid e al., 2011). É uma hipó ese
pouco p o á el, no caso do nosso es udo, uma ez que os mosqui os A. albopic us e An.
gambiae s.s. mui o p o a elmen e êm epí opos conse ados de ido à sua ele ada
homologia (85%). A mesma si uação oi epo ada com Aedes aegyp i e Aedes
albopic us que êm uma homologia de 89% (Mo eno-Cid e al., 2011), sendo assim
supe io à de ou as espécies em que a acinação em e ei os posi i os. A segunda
hipó ese, pa a uma e en ual explicação des es esul ados pode es a elacionada com as
di e enças isiológicas e no compo amen o en e espécies de inse os, ou seja, com o
amanho do abdómen e consequen emen e ao olume de e eição inge ido uma ez que
a quan idades de an ico pos inge idos pa ece es a associado à quan idade da e eição
sanguínea, le ando a di e enças nos e ei os da imunização, como já o a suge ido po
Mo eno-Cid e colegas (2011). Po ou o lado, os lebó omos inge em menos quan idade
de sangue e a acinação já demons ou e ei os posi i os (Canales e al., 2009; Mo eno-
Cid e al., 2011).
Nos ano elíneos, as enzimas diges i as a ingem o seu pico em 24-30 h, e a
maio ia das IgG dos hospedei os inge idas nas e eições sanguíneas são dige idas em
48h (Lal e al., 2001), o que pode suge i que possa e oco ido, de alguma o ma, a
deg adação de uma quan idade de an ico pos inde inida. Es a hipó ese pe de
consis ência, uma ez que a isiologia diges i a in a-espécies não de e se mui o
a iá el e já exis em abalhos publicados onde são epo ados ensaios de acinação
72
an i-aki in em An. a opa us bem sucedidos (Canales e al., 2009; de la Fuen e e al.,
2011).
A deg adação dos an ico pos pode ambém oco e no p ocesso de assimilação
da e eição sanguínea mas no momen o da passagem do es ômago pa a a hemolin a,
apesa de exis i es udos que supo am a hipó ese dos an ico pos nos a ópodes, mais
conc e amen e nas ca aças, a a essa em in a os o es ômago a é à hemolin a (Jasinskas
e al., 2000; Canales e al., 2009).
A concen ação de an ico pos assimilada pode e sido insu icien e pa a a e a as
unções da p o eína nos di e en es ecidos do mosqui o. Es a hipó ese pode se c edí el,
po que os maio es e ei os da acinação com aki in e subolesin êm sido obse ados nas
ca aças (de la Fuen e e al., 2011), que são os a ópodes que despendem mais empo
no hospedei o a alimen a -se, inge indo assim uma quan idade de olume de e eição
sanguínea e, eo icamen e, uma quan idade de an ico pos supe io . Es a hipó ese pode
se supo ada pelos esul ados ob idos em abalhos an e io es u ilizando alimen ação
a i icial, em que a quan idade de an ico pos inge idos pode á se supe io (Canales e
al., 2009; Mo eno-Cid e al., 2011).
Os mu ganhos u ilizados nos ensaios de alimen ação na u al o am da es i pe
BALB/C. Ensaios an e io es en ol endo alimen ação na u al de mosqui os em
mu ganhos imunizados demons a am que pa a condições semelhan es se ob i e am
esul ados di e en es pa a es i pes de mu ganhos BALB/C e CD1 (Mo eno-Cid e al.,
2011). Es es esul ados suge em que a es i pe BALB/C possa de algum modo não se a
melho escolha pa a es e ipo de es udos, apesa do ní el de an ico pos ob ido após
acinação e sido ele ado.
A conjugação de odos es es a o es ou de alguns deles, pode le a a que a
imunização dos hospedei os seja e icaz con a ce os e o es, mas não con a ou os.
Ou a ques ão que se coloca sob e a imunização com p o eínas in acelula es
nes e ipo de expe iências é a seguin e: Se á que é possí el a en ada dos an ico pos
den o das células e nos espe i os núcleos pa a se liga aos an igénios aí exis en es?
Uma espos a explíci a pa a es a pe gun a ainda não exis e, po ém exis em abalhos que
comp o am a en ada dos an ico pos den o das células e nos espe i os núcleos (Go o
e al., 2008; de la Fuen e e al., 2011). Ao que pa ece o mecanismo de anspo e pa ece
se independen e do amanho molecula , bem como da con o mação da p o eína e
73
possi elmen e o anspo e começa no in es ino médio com os ece o es de memb ana
en ol idos na endoci ose, e os ac os que podem co obo a es a hipó ese é a exis ência
de es udos que desc e em ece o es pa a o anspo e a a és das células epi eliais em
mamí e os e a oco ência do anspo e das IgG ma e nas do lúmen do in es ino dos
animais neona ais pa a o espaço in e s icial (Jasinskas e al., 2000).
Ou as ques ões que se colocam são sob e a au oimunidade que es e ipo de
imunizações pode despole a , de ido á conse ação des a p o eína en e in e eb ados e
e eb ados mui o p o a elmen e exis em alguns epí opos conse ados, o que pode ia
esul a em danos nos hospedei os. Toda ia é espe ado que a espos a dos an ico pos
sejam p ima iamen e di ecionada con a os epí opos non-sel eduzindo assim a
possibilidade dos e ei os cola e ais nos hospedei os imunizados, além do mais o ac o
de se uma p o eína in acelula suge e baixo isco pa a induzi espos as au oimunes
(Canales e al., 2009; Mo eno-Cid e al., 2011). O que de e ia e sido ei o pa a
melho a es e abalho de o ma a ica mais obus o e a p eenche algumas lacunas nos
esul ados, se ia o seguin e: (i) u iliza mu ganhos da es i pe CD-1 pa a e i ica se os
e ei os sob o mosqui o An.gambiae s.s.; (ii) ealiza ensaios de alimen ação a i icial, e
assim escla ece se a ausência de e ei os sob e es e e o se de e a p oblemas gené icos
elacionados com a es i pe de mu ganhos BALB/C, ou à ine icácia do an igénio usado
nas acinações; (iii) epe i o ensaio de alimen ação na u al com g upos de mosqui os
di e en es, pa a a alia in eção e o iposição,; ( ) en a exp essa a p o eína
ecombinan e em E. coli e es a di e en es o mulações pa a a acina.
Em conclusão, os nossos esul ados comp o am a impo ância do gene aki in
suge indo que a aki in es á en ol ida na egulação da espos a do sis ema imunológico
con a plasmódios. Os dados ob idos no ensaio de silenciamen o indicam que a p o eína
aki in pa ece se um bom candida o a an igénio p o e o con a o mosqui o An. gambiae
s.s., mas os esul ados ob idos nos ensaios de acinação e alimen ação na u al, não
pe mi em a alia se a p o eína aki in pode á se um bom candida o a in eg a uma
acina con a a malá ia.
No caso especi ico da malá ia, na úl ima década os eno mes a anços écnicos,
aliado ao sequenciamen o do genoma do ec o e do pa asi a e o desen ol imen o de
écnicas molecula es como RNAi, ou a manipulação gené ica do e o , em colocado a
comunidade cien í ica em posição de iden i ica não só as in e ações en e o pa asi a da

74
malá ia e o e o , mas ambém desen ol e es a égias pa a manipula essas in e ações
pa a con ola a doença. Uma dessas es a égias passa pela pesquisa de an igénios que
possam e ela -se p o e o es con a a malá ia.
As me odologias baseadas em an igénios ocul os do mosqui o êm mui as
an agens sob e as ou as acinas baseadas em an igénios do pa asi a. Tal como a
acina bem-sucedida con a as ca aças, a Bm86, as p o eínas como a aki in ou a sua
o óloga subolesin são imunologicamen e ocul os enquan o an igénios, o que suge e não
ha e seleção da a iabilidade an igénica, como exis e no caso dos pa asi as que
ci culam en e o e o e os hospedei os e eb ados (Lal e al., 2001). Alguns
in es igado es podem suge i que a aplicação da p essão imunológica nas populações
na u ais de mosqui os pode le a à seleção de mosqui os a ian es, con udo as p essões
sele i as no caso de uma acina baseada na p o eína ecombinan e aki in se iam
di igidas somen e con a os mosqui os com esses enó ipos que são susce í eis a uma
pe da do i ness mediada po an ico pos, ou seja, não se ia uma p essão sele i a con a
os pa asi as (Lal e al., 2001), não ha endo a oco ência po isso de uma esis ência à
acina.
Os es udos associados ao desen ol imen o de uma acina uni e sal baseada na
subolesin/aki in pa a o con olo de e o es e ansmissão de agen es pa ogénicos, são
ainda diminu os (de la Fuen e e al., 2011). No u u o, é impo an e di igi no as linhas
de in es igação que pe mi am po exemplo, comp eende melho a impo ância da
aki in na in e ação do plasmódio com o mosqui o e o , analisa os epí opos mais
imunogénicos des as p o eínas e es uda da di e sidade e di e gência e olu i as do
gene aki in/subolesin en e indi íduos, espécies e egiões geog á icas,
A e icácia ob ida com es as acinas pode á se melho ada a a és da u ilização
de quime as de epí opos e combinações de an igénios pa a o con olo de múl iplas
espécies de inse os/a ópodes e o es e dos agen es pa ogénicos associados.
As acinas associadas a ou o ipo de medidas in eg adas num plano de con olo
bem o ganizado, cons i ui ão um o e con ibu o pa a o con olo de in es ações de
e o es e ansmissão de agen es pa ogénicos aos hospedei os e eb ados. Pa a isso é
necessá io, ambém, o desen ol imen o de p ocessos cus o-e e i os pa a p odução de
acinas e desenho de es a égias e e i as pa a adminis ação das mesmas aos
hospedei os ese a ó ios e populações de animais em isco.
76
REFERÊNCIAS
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84
Figu a 3.8 Gel SDS-PAGE ealizado com os ex a os p o eicos dos pools de co po
go do dos mosqui os silenciados e dos mosqui os con olo, pa a análise de
densi ome ia ................................................................................................................... 56
Figu a 3.9 Co elação en e o silenciamen o analisado po RT-qPCR e o silenciamen o
analisado po densi ome ia no gel SDS-PAGE ............................................................. 57
Figu a 3.10 Análise do e ei o do silenciamen o do gene aki in na in eção com
P.be ghei 8 dias após a e eição in e an e pa a os mosqui os An. gambiae s.s. ............. 58
Figu a 3.11 Taxa de in eção 8 dias após a e eição in e an e em mosqui os silenciados
(dsRNA Aki in) e mosqui os con olo (dsRNA B2M) .................................................... 59
Figu a 3.12 Co elação en e a axa de silenciamen o no in es ino médio e a axa de
in eção nos mosqui os em cada éplica biológica ........................................................... 60
Figu a 3.13 E ei o do silenciamen o na p odução de o os em mosqui os An.gambiae
s.s. ................................................................................................................................... 61
Figu a 3.14 Co elação en e o silenciamen o no co po go do e a inibição da p odução
de o os ............................................................................................................................ 62
Figu a 3.15 O os com desen ol imen o incomple o e o os comple amen e
desen ol idos .................................................................................................................. 62
Figu a 3.16 E ei o do silenciamen o na sob e i ência de mosqui os An.gambiae s.s. . 64
Figu a A1 ....................................................................................................................... 95

85
ÍNDICE DE TABELAS
Tabela 1.A Es udos p elimina es ealizados com Aki in e subolesin, com o obje i o de
a alia a sua capacidade como acinas an i- e o es ....................................................... 32
Tabela 3.A E ei o dos an ico pos an i-aki in no desen ol imen o da in eção po
P.be ghei em An. gambiae s.s. ........................................................................................ 50
Tabela 3.B E ei o dos an ico pos an i-aki in na o iposição e na p odução de o os pelas
êmeas An.gambiae s.s .................................................................................................... 52
Tabela 3.C Compa ação dos esul ados da análise densi omé ica dos ex a os p o eicos
de co po go do e dos esul ados de silenciamen o ob idos a pa i dos ní eis de mRNA
dos pools de co po go do ................................................................................................ 56
Tabela 3.D E ei o do silenciamen o do gene que codi ica a aki in na in ensidade de
in eção po P.be ghei ...................................................................................................... 59
Tabela 3.E Resumo dos dados e e en es aos e ei os do silenciamen o na p odução de
o os das êmeas An. gambiae s.s .................................................................................... 63
Tabela 3.F Taxas de sob e i ência em cada uma das 4 éplicas biológicas, com as
espe i as pe cen agens de inibição da sob e i ência .................................................... 64
Tabela A. Soluções u ilizadas na ealização da écnica de ELISA indi e a ................... 88
Tabela B. Condições de ampli icação do gene b2m pa a PCR simples ......................... 88
Tabela C. Condições de ampli icação do gene aki in pa a PCR simples e pa a Real
Time-PCR ...................................................................................................................... 89
Tabela D. Condições de ampli icação do gene s7 pa a Real Time – PCR .................... 89
Tabela E. Condições de ampli icação dos genes aki in e s7 pa a RT – qPCR ealizado
num passo ...................................................................................................................... 90
86
Tabela F. Reagen e e espe i as concen ações u ilizadas pa a ampli ica os genes po
PCR ................................................................................................................................. 91
Tabela G. Reagen e e espe i as concen ações u ilizadas pa a ampli ica os genes po
PCR ................................................................................................................................. 92
Tabela H. Reagen es u ilizados na eação de RT-qPCR de um passo e espe i as
concen ações .................................................................................................................. 92
Tabela I. Reagen es u ilizados na eação de PCR em empo eal e as espe i as
concen ações .................................................................................................................. 93
Tabela J. Soluções u ilizadas pa a ealiza a écnica SDS-PAGE ................................. 93
Tabela K. In ensidade de in eção e p odução de o os, dos mosqui os u ilizados pa a
aze pools de co po go do .............................................................................................. 94
Tabela L. Compa ação da in eção en e o g upo con olo e o g upo silenciado, nas 4
expe iências de silenciamen o ........................................................................................ 96
Tabela M. Compa ação na p odução de o os en e o g upo con olo e o g upo
silenciado, nas 4 expe iências de silenciamen o ............................................................. 97
87
ANEXOS
88
Tabela A. Soluções u ilizadas na ealização da écnica de ELISA indi e a.
Tabela B. Condições de ampli icação do gene b2m pa a PCR simples.
Gene
Passo
Tempe a u a (oc)
Tempo
ds_b2m
Desna u ação inicial
94
4 min
Desna u ação
35
ciclos
94
30 seg
Annealing
62
45 seg
Ex ensão
72
1 min
Ex ensão inal
72
10 min
Soluções
Reagen es
Quan idade
Solução de la agem
(TBS-T)
ddH2O
-
T is
50 mM
NaCl
150 mM
Tween 20
0,05 %
Solução de Bloqueio
TBS-T
1X
Lei e em pó mag o
5%
Tampão de Diluição
do Subs a o pH 8.5
H2O
-
Bica bona o de sódio
(NaHCO3)
50 mM
Sul a o de Magnésio
(MgSO4.6H2O)
5 mM
89
Tabela C. Condições de ampli icação do gene aki in pa a PCR simples e pa a Real Time-PCR.
Gene
Passo
Tempe a u a (oc)
Tempo
ds_aki in
(ds6809)
Desna u ação inicial
94
4 min
Desna u ação
40
ciclos
94
1 min
Annealing
52
1 min
Ex ensão
72
1 min
Ex ensão inal
72
10 min
Gene
Passo
Tempe a u a (oc)
Tempo
aki in
PCR em
Tempo Real
Desna u ação inicial
95
10 min
Desna u ação
40
ciclos
95
10 seg
Annealing
63.5
45 seg
Ex ensão
80
ciclos
60
10 seg
Tabela D. Condições de ampli icação do gene s7 pa a Real Time – PCR. O il o de luo escência u ilizado oi o
adequado pa a le FAM 6.
Gene
Passo
Tempe a u a (oc)
Tempo
S7
PCR em
Tempo Real
Desna u ação inicial
95
10 min
Desna u ação
40
ciclos
95
10 seg
Annealing
62
45 seg
Ex ensão
80
ciclos
60
10 seg

90
Tabela E. Condições de ampli icação dos genes aki in e s7 pa a RT – qPCR ealizado num passo. O il o de
luo escência u ilizado oi o adequado pa a le FAM 6.
Genes
Passo
Tempe a u a (oc)
Tempo
aki in e S7
RT-qPCR (1
passo)
cDNA sin ese
50
10 min
95
5 min
Desna u ação
40
ciclos
95
10 seg
Annealing
60
30 seg
91
Tabela F. Reagen e e espe i as concen ações u ilizadas pa a ampli ica os genes po PCR.
P ime
Vec o base
(nº de acesso)
Sequência (5’ pa a 3’)
Tamanho
do
P odu o
(pb)
ds6809_Fwd
AGAP006809
TAATACGACTCACTATAGGGTACTTTGGCAGTCGTTGTAGTTGC
509
ds6809_Re
TAATACGACTCACTATAGGGTACTCACCTGCTTGAAGGTGAACA
dsb2m_Fwd
GenBank:
NM_009735
TAATACGACTCACTATAGGGAGACACCCCCACTGAGACTGATACA
447
dsb2m_Re
TAATACGACTCACTATAGGGAGACACCCCCACTGAGACTGATACA
S7_RT_Fwd
AGAP010592
GCCATCCTGGAGGATCTGGTA
132
S7_RT_Re
CGATGGTGGTCTGCTGTTCTTATCC
6809_RT_Fwd
AGAP006809
CCCTGTTCACCTTCAAGCAG
95
6809_RT_Re
GGTCAGCACGGCATCATACT
92
Tabela G. Reagen e e espe i as concen ações u ilizadas pa a ampli ica os genes po PCR.
Reagen es PCR
Concen ação inal
ddH2O
-
Tampão (P omega)
1 X
Clo e o de Magnésio (P omega)
25 mM
dNTP’s (P omega)
10 mM
P ime owa d e e e se
Taq DNA Polime ase (P omega)
5 U/uL
DNA empla e
1 uL
Volume inal 20 uL
Tabela H. Reagen es u ilizados na eação de RT-qPCR de um passo e espe i as concen ações.
Reagen es iSc ip One-S ep RT-PCR ki Wi h
SYBR G een
Concen ação inal
2x SYBR G een RT-PCR eac ion mix
1 X
P ime owa d e e e se
300 nM
ddH2O
-
RNA empla e (1 pg a 100 ng)
-
iSc ip e e se ansc ip ase o one-s ep RT-PCR
200 U/uL
Volume inal 50 uL
93
Tabela I. Reagen es u ilizados na eação de PCR em empo eal e as espe i as concen ações.
Reagen es iQ SYBR G een Supe mix
Concen ação inal
2x SYBR G een RT-PCR eac ion mix
1 X
P ime owa d e e e se
50 mM
ddH2O
-
RNA empla e (1 pg a 100 ng)
-
iSc ip e e se ansc ip ase o one-s ep RT-PCR
200 U/uL
Volume inal 20 uL
Tabela J. Soluções u ilizadas pa a ealiza a écnica SDS-PAGE.
Soluções
Reagen es
Quan idade
Tampão de co ida
ddH2O
-
T is-HCl pH 8.8
25 mM
Glicina
200 mM
SDS
0,1 % (p/ )
Tampão de amos a
Laemmli Sample
bu e (BioRad)
1X
Be a-me cap o-e anol
5%