"Neurotoxicidade da Dopamina e dos seus Conjugados. Estudos In Vitro em Neurónios Dopaminérgicos Humanos SH-SY5Y, e In Vivo em Ratos Sprague-Dawley"

I Sílvia Alexandra Moreira Monteiro Neurotoxicidade da dopamina e dos seus conjugados. Estudos in vitro em neurónios humanos dopaminérgicos SH-SY5Y e in vivo, em ratos Sprague-Dawley. Dissertação de Mestrado em Toxicologia Analítica Clínica e Forense Trabalho realizado sob a orientação do Professor Doutor João Paulo Capela E co-orientação do Professor Doutor Félix Dias Carvalho Setembro de 2010 II É autorizada a reprodução parcial desta dissertação, apenas para efeitos de investigação, mediante declaração escrita do interessado, que a tal se compromete. III “I am among those who think that science has great beauty. A scientist in his laboratory is not only a technician: he is also a child placed before natural phenomena which impress him like a fairy tale.” Marie Curie IV V Dedico este trabalho À minha família, Aos meus verdadeiros amigos, Às pessoas que me deram apoio, À família de Urbino e Ao Super Mário….. Foi mais 1UP! I dedicate this work To my Family, To my true friends, To the persons who supported me, To my family in Urbino and To Super Mario….. It’s another 1UP! VI VII RESUMOS VIII IX RESUMO A Doença de Parkinson (DP) é a segunda doença neurodegenerativa mais comum e a desordem do movimento mais frequente. É diagnosticada com base na presença dos três sintomas motores mais significativos: bradicinesia ou acinesia, rigidez muscular e tremores em repouso. A DP é caracterizada pela neurodegeneração específica da substância negra acompanhada pela diminuição significativa da dopamina em todos os componentes dos gânglios basais e pela presença de corpos de Lewi. A doença é de etiologia desconhecida mas pensa-se que a disfunção mitocondrial, a disfunção proteossomal e o stressee oxidativo possam estar envolvidos na patogénese da DP. Além disso, foram já descobertas algumas alterações genéticas que levam ao aparecimento dos sintomas. Os neurónios dopaminérgicos são sensíveis à neurodegeneração por vários motivos relacionados com a presença da dopamina, incluindo a formação de conjugados com a glutationa e a cisteína, que se consideram neurotóxicos: 5-S-glutationildopamina, 5-Scisteinildopamina e 5-S-N-acetilcisteinildopamina. O objectivo deste trabalho foi avaliar a neurotoxicidade e possíveis mecanismos de toxicidade da dopamina, do seu precursor L-DOPA, do metabolito da dopamina DOPAC, e dos seus conjugados 5-S-GSH-DA, 5-S-Cis-DA e 5-S-NAC-DA, nas concentrações de 10, 100, 500 e 1000 M e tempos de exposição de 24, 48 e 72h, na linha celular diferenciada de neurónios dopaminérgicos humanos SH-SY5Y. Além disso, foi testada a neurotoxicidade do 5-S-NAC-DA quando injectada intraestriatalmente a dose de 4,26 ng em ratos Sprague-Dawley com 7 dias, e o seu possível mecanismo de toxicidade. Esta dissertação mostrou pela primeira vez que todos os compostos estudados são neurotóxicos nas células dopaminérgicas SH-SY5Y de uma forma dependente do tempo e da concentração. Além disso avaliou-se o potencial neuroprotector da N-acetilcisteína (NAC) e verificou-se que a adição prévia de NAC às culturas celulares preveniu em larga medida a neurotoxicidade dos compostos estudados indicando que in vtiro o mecanismo de toxicidade destes inclui o stresse oxidativo. Para avaliar o papel do stresse oxidativo no processo de neurotoxicidade, os níveis de glutationa (GSH) intracelular foram determinados, assim como foi usada a butionina sulfoximina (BSO), um inibidor da enzima limitante na síntese de GSH, a γglutamilcisteína sintetase. Como resposta ao insulto de algumas das concentrações dos XVI 2.2.6. Neuroinflamação ............................................................................................... 29 3.IMPORTÂNCIA DA DOPAMINA NA GÉNESE DA DOENÇA DE PARKINSON ........... 30 3.1. Síntese da Dopamina .......................................................................................... 30 3.2. Metabolismo da Dopamina ................................................................................. 31 3.3. Relação entre a Dopamina e a α-Sinucleina na Génese da Doença de Parkinson.. .......................................................................................................... 33 3.4. Importância da Dopamina e dos seus Conjugados na Génese da Doença de Parkinson ............................................................................................................ 35 3.4.1. Conjugação da Dopamina com a Glutationa .................................................... 37 4.MODELOS PARA O ESTUDO DA DOENÇA DE PARKINSON .................................... 45 4.1. Modelos Farmacologicamente Induzidos ............................................................ 45 4.1.1. α-Metil-p-tirosina e Reserpina ........................................................................... 45 4.1.2. 6-Hidroxidopamina ............................................................................................ 46 4.1.3. MPTP ................................................................................................................ 46 4.1.4. Rotenona .......................................................................................................... 48 4.1.5. Paraquato ......................................................................................................... 49 4.1.6. Anfetaminas ...................................................................................................... 50 4.2. Modelos Celulares in vitro ................................................................................... 50 4.2.1. Cultura Primária de Neurónios Dopaminérgicos ............................................... 51 4.2.2. Cultura de Células Imortalizadas ...................................................................... 51 4.2.3. Linha Celular SH-SY5Y .................................................................................... 53 4.3. Modelos Animais ....................................................................................................................... 55 5.OBJECTIVOS ................................................................................................................ 58 CAPÍTULO II: COMPONENTE EXPERIMENTAL ............................................................ 59 MATERIAIS E MÉTODOS ................................................................................................ 61 1. Materiais ...................................................................................................................................... 61 2. Síntese dos Conjugados da Dopamina ............................................................... 61 3. Métodos in vitro ................................................................................................... 63 3.1. Cultura Celular .................................................................................................. 63 3.2. Determinação da Viabilidade Celular ................................................................ 63 3.3. Doseamento da Glutationa ............................................................................... 64 3.4. Análise Estatística ............................................................................................ 65 4. Métodos in vivo .......................................................................................................................... 65 4.1. Tratamento Animal e Administração de Iodeto de Propídio ............................. 65 XVII 4.2. Western Blotting ............................................................................................... 66 4.3. Imunohistoquímica ............................................................................................ 68 4.4. Análise Estatística ............................................................................................ 68 RESULTADOS EXPERIMENTAIS .................................................................................... 69 1. Resultados das Experiências in vitro com as Células SH-SY5Y .............................. 69 1.1. Citotoxicidade da DA, L-DOPA, DOPAC, 5-S-GSH-DA, 5-S-Cis-DA e 5-S-NACDA ..................................................................................................................... 69 1.2. Níveis de GSH Intracelular após Exposição aos Compostos DA, L-DOPA, DOPAC, 5-S-GSH-DA, 5-S-Cis-DA e 5-S-NAC-DA .......................................... 73 1.3. Efeito do Pré-tratamento com NAC e BSO na Citotoxicidade da DA, L-DOPA, DOPAC, 5-S-GSH-DA, 5-S-Cis-DA e 5-S-NAC-DA .......................................... 77 1.4. Efeito do Pré-tratamento com NAC e BSO nos Níveis de GSH Intracelular .... 81 1.5. Observação microscópica das células SH-SY5Y ............................................. 84 2. Resultados das Experiências in vivo nos Ratos Sprague-Dawley ............................ 86 2.1. Morte celular provocada pelo conjugado 5-S-NAC-DA .................................... 86 2.2. Expressão da caspase-3, p17, α-espectrina e PKCα no Estriado .................... 89 CAPÍTULO III: DISCUSSÃO E CONCLUSÕES .............................................................. 91 DISCUSSÃO ..................................................................................................................... 93 1. Discussão dos Resultados das Experiências in vitro com as Células Sh-SY5Y 93 2. Discussão os Resultados das Experiências in vivo com os Ratos SpragueDawley .............................................................................................................. 101 CONCLUSÕES ............................................................................................................... 104 REFERÊNCIAS BIBLIOGRÁFICAS .............................................................................. 105 XVIII XIX ÍNDICE DE FIGURAS FIGURA 1 - DIFERENÇAS NA ACTIVIDADE DDOS GB NUM INDÍDULO NORMAL (A) E NUM INDIVÍDUO COM DP (B).. ............................................................................................... 11 FIGURA 2 – POSSÍVEIS MECANISMOS DE INFLUÊNCIA DA DISFUNÇÃO MITOCONDRIAL NA APOPTOSE . ................................................................................................................. 20 FIGURA 3 - PRODUÇÃO DE H2O2 PELA ACTIVIDADE DA SOD (A) E DA MAO (B). ..................... 22 FIGURA 4 - REACÇÕES POSSÍVEIS PARA A ORIGEM DE ROS NOS NEURÓNIOS DOPAMINÉRGICOS. ................................................................................................................................... 23 FIGURA 5 - FACTORES QUE PODEM CONTRIBUIR PARA A NEURODEGENERAÇÃO DA DP, ENVOLVENDO O STRESSE OXIDATIVO.. ........................................................................... 24 FIGURA 6 - CONVERSÃO DA DOPAMINA EM AMINOCROMO. .................................................... 28 FIGURA 7 - ESTRUTURA QUÍMICA DA DOPAMINA. ................................................................... 30 FIGURA 8 - SÍNTESE DAS CATECOLAMINAS. .......................................................................... 31 FIGURA 9 – VIAS METABÓLICAS DA DA ................................................................................. 32 FIGURA 10 - POSSÍVEIS INTERACÇÕES ENTRE A DA E A AS NA GÉNESE DA DP . .................... 34 FIGURA 11POSSÍVEIS MECANISMOS DE TOXICIDADE DA DOPAMINA E DOS SEUS PRODUTOS QUINÓNICOS NOS NEURÓNIOS DOPAMINÉRGICOS. .......................................................... 36 FIGURA 12 - METABOLISMO DA DA PELA VAM. .................................................................... 39 FIGURA 13 - METABOLISMO DA DA E DOPAC PELA VAM. .................................................... 40 FIGURA 14 – AUTO-OXIDAÇÃO DA 6-OHDA . ........................................................................ 46 FIGURA 15 - ESTRUTURA QUÍMICA DO MPTP (A), DO IÃO MPP+ (B) E DO MPPP (C). ........... 47 FIGURA 16 - ESTRUTURA QUÍMICA DA ROTENONA. ................................................................ 48 FIGURA 17 - CICLO REDOX DO PARAQUATO . ........................................................................ 49 FIGURA 18 - ESTRUTURA QUÍMICA DA METANFETAMINA. ....................................................... 50 FIGURA 19 - NÍVEL A 4110 DO MAPA ESTEREOTÁXICO DE KÖNIG E KEPPEL, MARCADO COM OS 3 NÍVEIS CONSIDERADOS DO ESTRIADO PARA A CONTAGEM DE CÉLULAS PI-POSITIVAS (A, B E C).. ........................................................................................................................... 66 FIGURA 20 – VIABILIDADE DAS CÉLULAS SH-SY5Y APÓS EXPOSIÇÃO AOS DIFERENTES COMPOSTOS AVALIADA PELO ENSAIO MTT. OS DADOS SÃO APRESENTADOS COMO PERCENTAGEM DE CONTROLO, AO QUAL FOI ATRIBUÍDO O VALOR DE 100% (N=18 DE 3EXPERIÊNCIAS INDEPENDENTES). ................................................................................ 70 FIGURA 21 - PERCENTAGEM DE MORTALIDADE CELULAR APÓS EXPOSIÇÃO DAS CÉLULAS SHSY5Y AOS DIFERENTES COMPOSTOS. OS DADOS SÃO APRESENTADOS COMO XX PERCENTAGEM DO RÁCIO ENTRE A ACTIVIDADE DA LDH EXTRACELULAR E DA LDH TOTAL (N=18 DE 3 EXPERIÊNCIAS INDEPENDENTES). ................................................................ 72 FIGURA 22 – NÍVEIS DE GSH INTRACELULAR E CONTEÚDO PROTEICO DAS CÉLULAS SH-SY5Y, 24H APÓS A EXPOSIÇÃO ÀS CONCENTRAÇÕES DE 10, 100, 500 E 1000 µM DOS COMPOSTOS. OS DADOS DE CONCENTRAÇÃO INTRACELULAR DE GSH ENCONTRAM-SE NORMALIZADOS DE ACORDO COM O CONTEÚDO PROTEICO. OS DADOS DO CONTEÚDO PROTEICO SÃO APRESENTADOS COMO PERCENTAGEM DO RESPECTIVO CONTROLO, AO QUAL FOI ATRIBUÍDO O VALOR DE 100% (N=9 DE 3 EXPERIÊNCIAS INDEPENDENTES). ...... 76 FIGURA 23 - EFEITO DO PRÉ-TRATAMENTO COM COM NAC (1 MM) E BSO (25 µM) NA NEUROTOXICIDADE INDUZIDA PELA EXPOSIÇÃO DURANTE 24H À CONCENTTRAÇÃO DE 500 µM DOS DIVERSOS COMPOSTOS (N=9 DE 3 EXPERIÊNCIAS INDEPENDENTES). ................. 80 FIGURA 24 – CONCENTRAÇÃO DE GSH INTRACELULAR AQUANDO DA INCUBAÇÃO DOS COMPOSTOS EM ESTUDO COM O PRÉ-TRATAMENTO COM NAC E BSO (N=9 DE 3 EXPERIÊNCIAS INDEPENDENTES). .................................................................................. 83 FIGURA 25 – FOTOGRAFIAS DAS CÉLULAS SH-SY5Y OBTIDAS NO MICROSCÓPIO INVERTIDO DE CONSTRASTE DE FASE APÓS 24H DE EXPOSIÇÃO AOS COMPOSTOS NA CENCENTRAÇÃO DE 500 M (AMPLIAÇÃO 400X), SEM OU COM PRÉ-INCUBAÇÃO COM NAC (1MM). ................ 85 FIGURA 26 - MARCAÇÃO DAS SECÇÕES DO ESTRIADO COM PI VISUALIZADA EM FOTOGRAFIAS DE MICROSCOPIA DE FLUORESCÊNCIA (AMPLIAÇÃO 100X). AS SECÇÕES ESTRIATAIS DOS ANIMAIS FORAM OBTIDAS APÓS INJECÇÃO INTRA-ESTRIATAL COM 5-S-NAC-DA OU APENAS PBS.. .......................................................................................................................... 87 FIGURA 27 - NÚMERO DE CÉLULAS PI-POSITVAS NOS ANIMAIS CONTROLO (N=5) E TRATADOS COM 5-S-NAC-DA (N=5) (A) E NÚMERO DE CÉLULAS PI-POSITIVAS EM 3 DIFERENTES ÀREAS DO ESTRIADO (A. B E C) DOS ANIMAIS CONTROLO (N=5) E TRATADOS COM 5-SNAC-DA (N=5) (B). ...................................................................................................... 88 FIGURA 28 - CO-LOCALIZAÇÃO DA MARCAÇÃO COM PI (VERMELHO) E NEUN (VERDE) VISUALIZADA EM FOTOGRAFIAS DE MICROSCOPIA DE FLUORESCÊNCIA (AMPLIAÇÃO 100X). AS SECÇÕES ESTRIATAIS DOS ANIMAIS FORAM OBTIDAS APÓS INJECÇÃO INTRA-ESTRIATAL COM 5-S-NAC-DA OU APENAS PBS, NO CASO DOS OS ANIMAIS CONTROLO. .................. 88 FIGURA 30 - EXPRESSÃO DA CASPASE-3 (CPP32), CASPASE-3 CLIVADA (P17) (A), DE ΑESPECTRINA E DE PKCΑ (B) NO ESTRIADO DOS ANIMAIS CONTROLO INJECTADOS COM PBS (N=5) E ANIMAIS TRATADOS COM 5-S-NAC-DA (N=5).. .................................................. 90 XXI ÍNDICE DE TABELAS TABELA 1 - PREVALÊNCIA E INCIDÊNCIA DA DP, EM VÁRIOS ESTUDOS (N), EM VÁRIOS GRUPOS ETÁRIOS (MÉDIA±DESVIO PADRÃO) (ADAPTADO DE TABA ET AL, 2004). ............................ 7 TABELA 2 - SINTOMAS NÃO MOTORES DA DOENÇA DE PARKINSON (ADAPTADO DE CHAUDHURI ET AL, 2005). ................................................................................................................. 9 TABELA 3 - COMPONENTES DOS CL (ADAPTADO DE DICKSON, 2008). ................................... 17 TABELA 4 - ALTERAÇÕES GENÉTICAS COM RELEVÂNCIA NA DP. ............................................ 26 TABELA 5 – SISTEMAS DE CULTURA DE NEURÓNIOS DOPAMINÉRGICOS. AMP – ADENOSINA MONOFOSFATO, AS – Α-SINUCLEÍNA, BDNF – FACTOR NEUROTRÓFICO, D2R – RECEPTOR DA DA, DA – DOPAMINA, DAT – TRANSPROTADOR DA DA, GDNF – FACTOR NEUROTRÓFICO DERIVADO DAS CÉLULAS DA GLIA, METH – METANFETAMINA, RA – ÁCIDO RETINÓICO, TH – TIROSINA HIDROXILASE (ADAPTADO DE FALKENBURGER E SCHULZ, 2006). ......................................................................................................................... 52 TABELA 6 – EXEMPLOS DE ESTUDOS QUE ENVOLVEM O USO DE NEUROTÓXICOS EM ROEDORES COMO MODELO DE ESTUDO PARA A DP (ADAPTADO DE EMBORG ET AL, 2004). ............... 56 XXII XXIII LISTA DE ABREVIATURAS XXIV XXV LISTA DE ABREVIATURAS AIF – factor iniciador da apoptose ALDH – aldeído desidrogenase ALR – aldeído redutase AMPA – α-amino-3-hidroxil-5-metil-4-isoxazole-propionato AMPT – α-metil-p-tirosinase AS – α-sinucleína ATP – adenosina tri-fosfato BHE – barreira hematoencefálica BSA – albumina de soro bovino BSO – butionina sulfoximina CL – corpos de Lewi CNAT – N-acetiltransferase de conjugados de S-cisteína COMT – catecol-O-metiltransferase DA – dopamina DAT – transportador da dopamina DDC – 3,4-dihidroxifenilalanina descarboxilase DMEM – meio de Eagle modificado por Dubelcco DOPAC – ácido 3,4-dihidroxifenilacético DOPAL – 3,4-dihidroxifenilacetaldeído DOPET – 3,4-dihidrofeniletanol DP – doença de Parkinson DHBT – dihidrobenzotiazina 4 1. DOENÇA DE PARKINSON 1.1. Perspectiva Histórica Os primeiros relatos de sintomas que hoje são associados ao parkinsonismo datam de 5000 A.C. e são provenientes da Índia. A doença a que os médicos Ayurvédicos designavam de Kampavata, era tratada com Mucuna pruriens, uma planta da família das fabáceas e de nome comum “feijão aveludado”. Esta planta é a única fonte natural conhecida de levodopa (L-DOPA), o precursor directo da dopamina (DA) (3). Ao longo dos séculos foram descritos sintomas que incluem tremores involuntários e posturas não convencionais. Desde a Antiga Grécia, passando pelo Império Romano, pelos escritos bíblicos e pela Ilíada de Homero, até a um passado mais recente, onde personalidades conhecidas de várias áreas de estudo dão o seu contributo para o conhecimento do parkinsonismo, incluindo Leonardo da Vinci e William Shakespeare. Entre as personalidades mais marcantes da descrição formal dos sintomas ligados às desordens do movimento, destacam-se Franciscus de le Böe, François de la Croix e Wilhelm von Humboldt. Este último descreve nas suas cartas os seus próprios sintomas e condição clínica, uma descrição muito completa do que são os sintomas da DP (4). A primeira descrição formal da doença encontra-se na monografia “An Essay on The Shaking Palsy”, escrita por James Parkinson e publicada em 1817, um médico que descreve com rigor a história clínica e os sintomas do parkinsonismo, baseando-se somente nas suas observações (5). Foi em 1861/62, que Jean-Martin Charcot juntamente com Alfred Vulpian, descrevem pela primeira vez, de forma exaustiva, os sintomas do parkinsonismo e que a síndrome anteriormente estudada por Parkinson é formalmente reconhecida como uma condição patológica, adquirindo o nome de doença de Parkinson (6). Ao longo do tempo, Charcot discrimina a diferença entre bradicinesia e rigidez (sintomas mais frequentemente associados à DP), regista a frequência dos tremores, reconhece a micrografia como uma característica comum a todos os doentes, e prescreve os primeiros tratamentos (7). Só na década de 50 já no século XX são identificadas, por Arvid Carlsson, as primeiras alterações bioquímicas no cérebro que conduzem à doença. Carlsson demonstrou que a 5 DA é um neurotransmissor do sistema nervoso central (SNC) e não só um precursor da noradrenalina, como se pensava anteriormente. Ao usar o fármaco reserpina (que provoca a depleção das vesículas neuronais das catecolaminas) em animais de laboratório, verificou que os níveis de DA decrescem significativamente, o que provoca sintomas semelhantes aos da DP, e admite a possibilidade da administração de L-DOPA aos doentes para o controlo dos sintomas (8). Desenvolveu ainda um método que possibilita a determinação da concentração de DA no cérebro e descobre que este neurotransmissor se encontra em elevadas concentrações numa zona cerebral específica, intimamente relacionada com o movimento, os gânglios da base (GB) (9). Devido ao seu trabalho, Carlsson identificou a primeira causa fisiopatológica da DP, e recebe o Prémio Nobel da Medicina e Fisiologia em 2000. As descobertas de Arvid Carlsson levaram a que outros médicos por todo o mundo prescrevessem L-DOPA aos seus pacientes para alívio dos sintomas da doença. Nesta fase, destaca-se George C. Cotzias, que adequa a posologia da L-DOPA, com controlo significativo da sintomatologia e progressão da doença (10). Na década de 70, foi desenvolvido o primeiro medicamento constituído pela combinação de 2 fármacos: L-DOPA e carbidopa (inibidor do metabolismo periférico da L-DOPA). Esta combinação é mais eficaz no tratamento da sintomatologia, aumentando a taxa de conversão da L-DOPA em DA ao nível cerebral (11). Em 1991, este produto é aprovado pela FDA e revoluciona o tratamento sintomático da doença. 1.2. Epidemiologia A DP é considerada a desordem do movimento que afecta mais indivíduos em todo o mundo e a segunda doença neurodegenerativa mais comum (sendo a primeira a doença de Alzheimer). Estima-se a prevalência da doença entre 1 e 2% da população mundial com mais de 65 anos e 3 a 5% dos indivíduos com mais de 85 anos (12) num total de 4 milhões de pessoas em todo o mundo (13). Em 2006, a OMS estimava a incidência da DP entre 4,5 a 10 novos casos por 100.000 indivíduos; este valor ajustado para a idade da população em questão, varia entre os 9,7 e 13,8. Estimava-se a prevalência da doença entre 72 e 258,8 casos por 100.000 indivíduos (2). 6 A prevalência é influenciada pela frequência de ocorrência da doença (incidência) e pela taxa de sobrevivência dos indivíduos. Numa compilação de estudos obtidos ao longo do tempo, em vários países dos vários continentes, a prevalência bruta varia entre 31 e 201 por 100.000 indivíduos e a prevalência ajustada à idade da população varia entre 60 e 190. A incidência bruta varia entre 1,5 e 22 por 100.000 e a incidência ajustada varia entre 0,9 e 19 por 100.000 indivíduos (14). De notar que, apesar de ser uma doença global, parecem haver diferenças de incidência e prevalência entre diferentes regiões, que podem ser devidas a vários factores: idade da população em estudo, critérios de diagnóstico da doença, métodos de análise e factores genéticos e ambientais. É importante ter em contar os factores relacionados com os serviços de saúde, principalmente na estimativa da prevalência (15). Estudos recentes apontam para uma prevalência mais elevada em caucasianos, europeus e norte-americanos, média nos asiáticos da China e Japão e mais baixa nos negros africanos. Além disso, parece evidente que nos países mais desenvolvidos onde a população idosa é maior, a incidência da doença seja superior em relação aos países menos desenvolvidos (2). Ao longo do tempo, com o crescente aumento da esperança de vida e da idade da população, a incidência tem tendência a aumentar. Devido à melhoria da qualidade de vida por via da introdução e uso de fármacos que visam o controlo dos sintomas da doença, juntamente com o apoio social prestado aos doentes, a prevalência apresenta a mesma tendência. Desde o nascimento até à morte, a probabilidade de um indivíduo desenvolver PD é de 2% nos homens e 1,3% nas mulheres (a probabilidade do aparecimento dos sintomas de parkinsonismo é ligeiramente maior) e o risco aumenta ao longo da vida, com a idade (16) (Tabela 1). 7 Tabela 1 - Prevalência e incidência da DP, em vários estudos (n), em vários grupos etários (Média±desvio padrão) (adaptado de Taba et al, 2004). Grupos etários 30-39 40-49 50-59 60-69 70-79 80-89 Prevalência 9,27 12,27 (11) 37,2 35,21 (19) 131,28 78,2 (25) 385,56 182,89 (25) 787,17 456,52 (24) 1142,9 881,73 (22) Incidência 0,78 0,53 (8) 2,93 1,93 (9) 14,94 7,13 (12) 45,98 23,94 (12) 95,43 33,82 (12) 101,10 73,85 (12) Relativamente à sintomatologia, as mulheres parecem ter maior propensão para a instabilidade postural, incapacidade de desempenhar tarefas diárias e para a depressão, enquanto os homens são mais predispostos para os distúrbios do sono (17). Além disso, parecem existir diferenças de género ao nível do metabolismo na área cerebral dos GB (18). A mortalidade da DP é difícil de determinar pois a doença não é, normalmente, a causa directa da morte, mas sim os sintomas da doença que diminuem a esperança de vida (como por exemplo, a propensão para as quedas) (19). Em Portugal, um estudo de Dias e colaboradores realizado em 1992 concluiu que, num total de 219.928 indivíduos analisados, foram identificados 291 casos de DP, estimandose uma prevalência em 130 doentes por 100.000 indivíduos (20). 1.3. Sintomatologia O diagnóstico da DP é normalmente tardio, devido à inespecificidade dos sintomas inicias que incluem dores variadas, distúrbios do sono, ansiedade e depressão, movimentos mais lentos em tarefas de rotina (por exemplo, dificuldade a vestir) e marcha mais lenta. Mais tarde, com o agravamento dos sintomas, o indivíduo toma o primeiro contacto com o médico, tornando-se já evidentes os tremores, a dificuldade em virar-se e baixar-se, o passo irregular, o discurso mais lento e a micrografia, todos eles sinais característicos da DP (21). Os critérios mundialmente usados para o diagnóstico correcto da DP são aqueles descritos pelo UKBB (UK Parkinson’s Disease Society Brain Bank) e pelo NINDS 8 (National Institute of Neurological Disorders and Stroke), estimando-se que 90% dos diagnósticos baseados nestes critérios estejam correctos (12). 1.3.1. Sintomas Motores Os principais sintomas motores da DP e os mais significativos são: bradicinesia ou acinesia, rigidez muscular e tremores em repouso. Estes são frequentes entre os doentes de Parkinson e causadoras do aumento da morbilidade e mortalidade relacionada com a doença (22). Os sinais mais característicos da bradicinesia são o balancear anormal dos membros superiores durante a marcha, redução da frequência de pestanejar e a dificuldade em deglutir. Os doentes de Parkinson apresentam amimia (reduzida expressão facial) e um discurso monótono (discurso sussurrado, rápida sequência de sílabas a baixo volume) e fazem pouco uso dos braços durante a fala. Nos membros superiores, a bradicinesia é facilmente identificada pelo aparecimento da micrografia (22). Os doentes sentem dificuldade em desempenhar movimentos “finos” (por exemplo, abotoar-se), em executar movimentos de rotação corporal (por exemplo, virar-se na cama) e erguer-se de posições sentadas ou baixas. Durante a marcha, apresentam dificuldade em iniciar o movimento, lentidão e dão passos pequenos, que juntamente com a postura desequilibrada e insegura dão origem a quedas. A rigidez muscular está relacionada com o aumento do tónus muscular, juntamente com a diminuída capacidade de relaxamento, associada à resistência de movimentos imposta tanto pelos músculos flectores como extensores (21). Na DP, os tremores são mais usuais em posições de repouso, nos membros superiores, afectando também os membros inferiores e a cabeça, embora menos frequentemente. Os tremores nos membros superiores encontram-se diminuídos durante as acções voluntárias, particularmente ao esticar os braços. O fenómeno de tremor parece ter origem na alternância entre ciclos de contracção e descontracção nos músculos, por sua vez causada pela actividade oscilatória dessincronizada dos GB (22). 9 1.3.2. Sintomas Não Motores Ao contrário dos sintomas motores da DP, os sintomas não motores são pouco específicos e muitas vezes não correlacionáveis com a doença. Os sinais não motores são vários, podendo estar relacionados com o sistema nervoso autónomo ou com sistema cognitivo (Tabela 2) (23). Tabela 2 - Sintomas não motores da doença de Parkinson (adaptado de Chaudhuri et al, 2005). Sintomas Neuropsiquiátricos Depressão, apatia, ansiedade Anedonia Défices de atenção Alucinações Delírios Demência Comportamento obsessivo Desordens do sono (sonolência e/ou insónias) Sintomas do sistema autónomo Distúrbios renais Noctúria Urgência em urinar Alterações de frequência de micção Sudorese Hipotensão ortostática Quedas relacionadas com a hipotensão ortostática Dores musculares Disfunções sexuais Hipersexualidade Impotência sexual Hipossecreção de testosterona Sintomas gastrointestinais Babar Ageusia Disfagia Refluxo gastro-esofágico Vómitos Náuseas Obstipação Incontinência fecal Sintomas sensoriais Dor Parestesia Distúrbios olfactivos Outros sintomas Fadiga Diplopia Visão desfocada Seborreia Perda de peso Disartria 10 1.4. Influência da Neurotransmissão Dopaminérgica na Doença de Parkinson Além das áreas corticais cerebrais para o controlo das actividades musculares, duas outras estruturas são essenciais para a função motora: o cerebelo e os GB. Estas não funcionam isoladamente, mas interagem entre si e com outros sistemas. O cerebelo é a área cerebral que auxilia a colocação em sequência das actividades motoras e faz ajustes correctivos nessas actividades à medida que são executadas, para que sejam realizadas de acordo com os sinais enviados pelo córtex cerebral e de outras partes do cérebro. Os GB localizam-se em áreas próximas do tálamo, ocupando uma parte significativa das regiões inferiores de ambos os hemisférios cerebrais. Os GB incluem as seguintes regiões anatómicas: estriado, o globo pálido, o núcleo substalámico e a SN (24). Existe um grande número de patologias associadas a esta zona cerebral, e relacionadas com os neurónios dopaminérgicos, caracterizadas por um lado pelo excesso ou restrição do movimento, às quais a comunidade científica designa de desordens do movimento. Existem três classes de patologias deste tipo: as hipercinéticas, hipocinéticas e distonias. As doenças hipercinéticas são caracterizadas pelo excesso de movimentos incontroláveis e actos motores rápidos. Os movimentos anormais são atenuados pela administração de antagonistas dos receptores da DA e exacerbados por agonistas da DA, ou seja, um provável excesso de estimulação dopaminérgica está associado a este tipo de doenças, das quais é exemplo a doença de Huntington. As doenças hipocinéticas devem-se à perda da capacidade de neurotransmissão dopaminérgica, cujo exemplo mais conhecido é a DP. O último tipo de desordens do movimento é as distonias, cujo sintoma mais marcante é a paragem dos movimentos durante uma acção, devido a contracções musculares involuntárias, lentas e repetitivas, como na paralisia supranuclear progressiva (25). Os sintomas da DP têm origem na neurodegeneração dos neurónios dopaminérgicos (neurónios produtores do neurotransmissor DA), cujos corpos celulares se localizam na SN e os axónios libertam DA no putamen e núcleo caudado – designado corpo estriado (CS) ou nigroestriado. O CS é a principal zona de recepção da informação neuronal proveniente dos GB, por três vias diferentes: corticoestriatal, talamocortical e a nigrostriatal (aquela que é mais afectada pela neurodegeneração na DP). A via dopaminérgica nigroestriatal contém 11 neurónios dopaminérgicos cujos corpos celulares, localizados na SN (assim denominada devido à concentração elevada de neuromelanina (NM)), enviam axónios para o CS (26). A informação neuronal é processada nos circuitos dos GB, enviada para o tálamo e daí para o córtex cerebral. A informação processada no CS pode ser transmitida aos GB pela via directa ou indirecta. A via directa, ao inibir os GB, leva à inibição do tálamo e à excitação do córtex cerebral. A via indirecta, ao inibir os GB, promove a excitação de centros nervosos que conduzem estímulos à medula espinal (Figura 1A). Na DP, a inexistência de transmissão dopaminérgica proveniente da SN pode levar à inibição excessiva dos GB e do tálamo, provocando a diminuição da estimulação do córtex motor e o aparecimento de bradicinesia ou acinesia (Figura 1B) (27). Figura 1 - Diferenças na actividade ddos GB num indídulo normal (A) e num indivíduo com DP (B). Setas pretas representam estímulos excitatórios, setas cinzentas representam estímulos inibitórios. GPe - globo pálido externo, GPi - globo pálido interno, NST – núcleo subtalámico, SNc – substância negra pars compacta, SNr – substância negra pars reticulata (adaptado de Galvan et al, 2008). O parkinsonismo parece ser uma desordem complexa, na qual a actividade anormal de alguns grupos neuronais dos GB afecta grandemente a excitabilidade, a actividade oscilatória, a sincronia e as respostas sensórias do córtex cerebral envolvido no planeamento e execução do movimento, assim como no sistema sensorial (27). 12 1.5. Influência de Outros Neurotransmissores na Doença de Parkinsom A maioria dos estudos existentes relacionam a perda de neurotransmissão dopaminérgica com o aparecimento de sintomas motores, mas os sintomas não motores característicos da DP podem estar associados a outros sistemas de neurotransmissão. Os GB dependem da actividade de vários neurotransmissores, que podem contribuir para as diversas disfunções associadas à DP. De facto, os GB estão não só relacionados com a função motora mas também com as funções cognitivas e com o comportamento emocional (28). As relações neuronais existentes entre o córtex e os GB (particularmente o CS) parecem estar envolvidas na modulação da informação cognitiva (29), na aprendizagem, na memória (30), nas respostas pavlovianas (31) e no comportamento associado às drogas de abuso (32). 1.5.1. Neurotransmissão Colinérgica A função motora do CS está dependente do equilíbrio entre a concentração de DA e acetilcolina e a disfunção desse equilíbrio contribui para o aparecimento da DP (33). Além disso, a disfunção cognitiva nestes doentes está relacionada com a neurotransmissão colinérgica. Nos pacientes com DP foi detectada a perda neuronal nos núcleos basais de Meynert (localizados na substância inominata, no globo pálido) (34, 35). Estas células são ricas em colina acetiltrasnferase e neurónios colinérgicos, que projectam axónios para o córtex. Foi demonstrado que o declínio das funções cognitivas nos doentes de Parkinson está intimamente relacionado com a redução da actividade colinérgica no córtex e com a degeneração dos neurónios nos núcleos de Meynert (35, 36). Evidências clínicas demonstram que o tratamento com fármacos anticolinérgicos podem aumentar os já existentes défices de memória nos doentes com DP (37) e que o tratamento com inibidores das colinesterases (por exemplo, rivastigmina) melhora as funções cognitivas (38). Foi sugerido que a disfunção na neurotransmissão colinérgica pode ser responsável ou contribuir para o aparecimento de sintomas associados ao sistema nervoso autónomo (39). Estes sintomas incluem disfunções nos sistemas sudomotor, gastrointestinal e 13 urinário, distúrbios do sono e disfunção sexual. Este tipo de sintomas é muito comum nos doentes de Parkinson, afectando cerca de 70 a 80% dos indivíduos (40). 1.5.2. Neurotransmissão Serotoninérgica Os receptores serotoninérgicos nas células cerebrais modulam as vias dopaminérgicas de várias formas, por exemplo, a activação dos receptores da serotonina (5-HT, 5hidrotriptamina) 5-HT1A e 5-HT1B facilitam a libertação da DA, enquanto a activação dos receptores 5-HT2C inibem a sua libertação (41). Foram detectados reduções da ordem dos 50% na concentração de 5-HT no córtex e GB nos doentes de Parkinson, podendo estar relacionado com alterações de humor, depressão e alterações na arquitectura do sono (42). A dor é uma manifestação frequente da DP, afectando aproximadamente 83% dos indivíduos, sendo que a mais frequente está associada ao sistema musculo-esquelético (aproximadamente, em 70% dos casos) (43). Foi sugerido que a neurotransmissão serotoninnérgica possa estar envolvida na modulação da dor, uma vez que o tratamento deste sintoma com inibidores da recaptação de 5-HT e noradrenalina (como a duloxetina), resulta no alívio da dor em 65% dos doentes (44). A obstipação, outro dos sintomas da DP, é provocada pela diminuição da actividade do sistema gastro-intestinal. Os tratamentos com agentes dopaminérgicos (por exemplo, apomorfina e duodopa) mostraram-se benéficos no alívio da obstipação (45). No entanto, o sistema serotoninnérgico pode estar também envolvido, uma vez que evidências préclinicas sugerem que a activação dos receptores 5-HT4 localizados ao longo do tubo digestivo aumentam a mobilidade intestinal (46). 1.5.3. Neurotransmissão Noradrenérgica Os doentes de Parkinson possuem baixas concentrações de noradrenalina (47). A perda de noradrenalina parece provocar o agravamento da doença, aumentando a susceptibilidade dos neurónios dopaminérgicos, ou inibindo a reparação dos neurónios já danificados (48). 20 factores referidos anteriormente, que pode acontecer em condições de stresse oxidativo ou inibição da cadeia transportadora de electrões (105). Figura 2 – Possíveis mecanismos de influência da disfunção mitocondrial na apoptose (adaptado de Henchcliffe and Beal, 2008). Assim, a disfunção mitocondrial e a inibição da cadeia respiratória, podem estar na origem da morte celular programada. Esta situação assume particular importância na DP, uma vez que existem evidências da influência da disfunção mitocondrial na sua patogénese, em particular na inibição do complexo I da cadeia respiratória (71, 102). Recentemente, foi descoberto uma alteração proteica numa das subunidades que constituem o complexo mitocondrial I, que leva à diminuição da taxa de transferência de electrões ao longo da cadeia. Sugeriu-se que as alterações funcionais do complexo I poderiam estar na base da patogénese da DP, uma vez que estas alterações não se verificam noutras doenças que apresentam sintomas de parkinsonismo, como a atrofia sistémica múltipla (106). A excitotoxicidade parece ser um processo que pode estar relacionado com a actividade mitocondrial. A morte neuronal como resultado da excitotoxicidade deve-se à activação dos receptores NMDA pelo neurotransmissor glutamato, que provoca o influxo de cálcio (107). Em condições normais de potencial de membrana, o influxo de cálcio é bloqueado pelo transporte de magnésio, no entanto, a manutenção do potencial de membrana é 21 dependente de energia e numa situação de disfunção mitocondrial há redução do potencial membranar e dá-se o influxo de cálcio (102). O cálcio é sequestrado pela mitocôndria, o que leva à abertura dos poros mitocondriais de transição, com libertação do citocromo c e outros factores pró-apoptóticos e consequente activação da via apoptótica (105). As evidências mais claras do envolvimento da disfunção mitocondrial no desenvolvimento da DP provêm de estudos epidemiológicos que relacionam a exposição a factores ambientais com o desenvolvimento da doença. Grande parte dos estudos dentro desta matéria incide sobre a exposição a pesticidas. Virtualmente, qualquer composto que possa provocar as alterações bioquímicas acima referidas poderá ser um indutor da DP. Assim, foi estudada a potencial influência do paraquato (herbicida) administrado em simultâneo com o fungicida maneb (etilenoepistiocarbamato de manganês), da rotenona (insecticida) e pesticidas organoclorados, como a dieldrina (108). Os pesticidas referidos provocam sintomas característicos da DP, como acinesia e rigidez muscular, em diferentes animais de laboratórios, como ratos, primatas, ou ainda em insectos como a Drosophila melanogaster, entre outros. No entanto, nenhum deles consegue reproduzir na totalidade os sintomas e as suas características patofisiológicas da DP em humanos (76, 109-111). 2.2.2. Stresse Oxidativo Todas as células apresentam um nível basal de stresse oxidativo e, por esse motivo, são necessários mecanismos antioxidantes que eliminem o excesso de radicais livres, e outros que reparem e/ou substituam as moléculas danificadas. Uma falha nestes sistemas de protecção pode provocar a morte celular e, em particular a neurodegeneração, pelo aumento de espécies reactivas, incluindo as espécies reactivas de oxigénio (ROS), uma família que inclui os radicais livres de oxigénio e os seus derivados (112). O cérebro humano é especialmente sensível ao stresse oxidativo. Uma das razões é o elevado consumo de oxigénio, devido à grande necessidade de produção de ATP para a manutenção da homeostasia iónica (112). O cérebro consome 20% do oxigénio do organismo mas representa apenas 2% da massa corporal, ou seja, a potencial produção de ROS durante a fosforilação oxidativa é enorme (113). 22 As espécies reactivas podem levar à permeabilização da barreira hemato-encefálica (BHE) directamente, pela diminuição da síntese de proteínas essenciais na manutenção das junções apertadas entre as células (114), ou indirectamente, pela activação de metaloproteinases. A permeabilização da BHE permite a entrada no SNC de possíveis neurotoxinas, endotoxinas e células inflamatórias, com potencial relevância na patogénese da DP (115). O O2•- é formado por várias vias nos neurónios, in vivo. As mais importantes são a actividade da cadeia mitocondrial transportadora de electrões (116) e a auto-oxidação de moléculas com estrutura catecólica, como a adrenalina, a noradrenalina, L-DOPA, DA, 6hidroxidopamina (6-OHDA) e tióis, por exemplo, a cisteína. Estes compostos reagem com a molécula de oxigénio, produzindo-se O2•- e compostos quinónicos, que podem ligar-se e depletar a GSH intracelular e/ou ligar-se a proteínas com grupos SH (117). O metabolismo cerebral é naturalmente produtor de H2O2. As enzimas SOD utilizam o O2•- convertendo-o em H2O2 (Figura 3A) (118). Existem, no entanto, outras enzimas, por exemplo, a monoamina oxidase (MAO) que catalisa a reacção entre as monoaminas e o oxigénio, com formação de H2O2 (Figura 3B) (112). 322222 222 )( 22)( NHOHRCHOONHRCHB OHHOA Figura 3 - Produção de H2O2 pela actividade da SOD (A) e da MAO (B). A actividade da SOD, com o objectivo de remover o O2•-, é complementada com a actuação de outras enzimas que removem o H2O2. Por exemplo, o H2O2 pode ser eliminado quando ligado à GSH, via GSH peroxidase, com formação de GSH oxidada (GSSG) (Figura 4a) (119). No entanto, é de salientar que a perda de GSH detectada no cérebro de doentes de Parkinson não é acompanhada pelo aumento de GSSG, não havendo perda pela sua metabolização, nem diminuição da capacidade de síntese, uma vez que não se verificam alterações nas enzimas que a produzem (88). Estes factos conjugados podem indicar que o stresse oxidativo não é o único fenómeno inerente à perda de GSH. Nos doentes de Parkinson, existem evidências claras de stresse oxidativo, incluindo os níveis elevados de peroxidação lipídica, dano proteico (com elevação dos níveis de 23 grupos carbonilo) e dos ácidos nucleicos. O dano lipídico leva à perda da integridade da membrana celular e ao aumento da sua permeabilidade aos iões, tais como o cálcio, que por sua vez conduz à excitotoxicidade. O produto do dano lipídico 4-hidroxinonenal é citotóxico para os neurónios, promove o aumento de Ca2+ intracelular, inactiva os transportadores do glutamato e danifica os neurofilamentos (120). Foi detectado o aumento de aductos proteicos de 4-hidroxinonenal em doentes de Parkinson (121). Várias regiões anatómicas neuronais (por exemplo, SN, núcleo caudado, putamen e globo pálido) apresentam concentrações elevadas de ferro e foi já detectada a presença de concentrações anormalmente elevadas deste metal em doentes de Parkinson, com especial relevância na SN (99). O ferro, anormalmente elevado na SN dos doentes de Parkinson, pode ser um elemento que promove o stresse oxidativo, uma vez que pode estar envolvido na conversão do H2O2 em OH•, com oxidação de Fe2+ a Fe3+, na reacção de Fenton (Figura 4b) ou na reacção de Haber-Weiss (Figura 4c) (99). Esta informação é consistente com os achados patofisiológicos que descrevem o aumento de ferro total e de Fe3+ nas células da SN dos doentes de Parkinson (99). Muitos estudos relacionam também o surgimento da DP com a exposição a metais de transição, como o manganês (122, 123), quer ocupacionalmente, quer através da dieta (124). Os neurónios dopaminérgicos estão particularmente expostos ao stresse oxidativo uma vez que determinadas ROS são naturalmente produzidos durante o metabolismo da DA, incluindo O2•-, quinonas e HO- (Figura 4d e 4e). A degradação da DA pode ocorrer espontaneamente, na presença de ferro, ou enzimaticamente, através da enzima MAO-B, com formação de H2O2 (Figura 4f) (125). Parece haver uma estreita relação entre o desenvolvimento da DP e a concentração de ferro na SN, com formação de complexos de ferro e DA, que promovem o stresse oxidativo (126). 22322 22 2 22 2 2 3 222 32 22 222 ) 2) 2) ) ) 22) OHNHDOPACOHODAf OHSQHODAe HOSQODAd FeOHOHOFeOOHc FeOHOHFeOHb OHGSSGGSHOHa MAO Figura 4 - Reacções possíveis para a origem de ROS nos neurónios dopaminérgicos (adaptado de Lotharius e Brundin, 2002). 24 O stresse oxidativo desempenha um papel fundamental na neurodegeneração, especificamente na SN, é actualmente aceite como um factor fundamental para a patogénese da DP (Figura 5). Figura 5 - Factores que podem contribuir para a neurodegeneração da DP, envolvendo o stresse oxidativo. DA – dopamina, GSH – glutationa, NM – neuromelanina, UPS – sistema proteossomal da ubiquitina (adaptado de Berg et al, 2005). 2.2.3. Inibição Proteossomal da Ubiquitina A neurodegeneração dos neurónios da SN é acompanhada pela acumulação de proteínas disfuncionais não degradadas e pela sua aglomeração em inclusões citoplasmáticas, os CL. Como já foi referido, verifica-se um decréscimo da actividade proteossomal em biopsias post-mortem da SN de doentes de Parkinson, que pode atingir os 40% (98). Além disso, verifica-se que os CL têm na sua constituição ubiquitina e outras subunidades proteossomais (68). 25 O sistema proteossomal da ubiquitina (UPS) existe naturalmente em todas as células, cuja função é a degradação de proteínas anormais. Para a sua degradação, as proteínas têm que ser marcadas com resíduos proteicos de ubiquitina pelo proteossoma, um sistema proteico composto por três enzimas conjugadas, a E1, E2 e E3 ligases, que promovem a ligação da ubiquitina a uma zona específica da proteína anormal (127). A presença de AS e ubiquitina nos CL parece estar relacionada com a degradação incompleta das fibrilas de AS, após marcação com a ubiquitina pelo UPS (128). As formas monoméricas e oligoméricas (na forma de fibrilas) da AS são solúveis e ocorrem naturalmente nas células neuronais. Quando presente em grandes concentrações, as fibrilas podem formar agregados fibrilares, tornando-se insolúveis e podendo conjugar-se com a ubiquitina, formando os CL (128). Sabe-se também que as protofibrilas de AS são moléculas citotóxicas (ver capítulo 3.3), e a inibição do complexo UPS levaria à não degradação destas proteínas anormais (129). Estudos demonstram que a inibição do UPS dá origem a inclusões citoplasmáticas de AS e provoca apoptose em células dopaminérgicas in vitro (130). Foi já detectada uma mutação genética no gene que codifica a proteína Parkin, uma ligase do tipo E3 (131), e uma mutação no gene codificante da ubiquitina c-terminal hidrolase (132), que levam ao desenvolvimento de DP de origem familiar (ver capítulo 3.2.4). O sistema proteossomal 26S, responsável pela proteólise dependente da marcação pela ubiquitina é composto pelo proteossoma 20S (proteinase multicatalítica) que se conjuga com o complexo regulador 19S (133). Um estudo de McNaught e colaboradores verificou a inexistência das subunidades do sistema proteossomal 20/26S nas células dopaminérgicas e que a actividade do proteossoma 20S está diminuída nos casos esporádicos de DP. Verificaram também que a actividade dos activadores proteossomais PA700 e PA28 é reduzida e a concentração destes activadores é praticamente indetectável na SN nos doentes com DP, comparando com outras áreas cerebrais de doentes de Parkinson e ou na SN de indivíduos saudáveis (134). 2.2.4. Alterações Genéticas São conhecidos 11 loci com potencial relevância no desenvolvimento da DP, 6 deles associados a genes já conhecidos, que dão origem a proteínas com função conhecida (Tabela 4) (135). 26 Foram descobertas 3 mutações no gene SNCA, cujo produto génico é a proteína AS, em 3 famílias diferentes, com formas familiares de DP: a mutação A53T (136), A30P (137), e E46K (138). Foi também descoberta uma triplicação no gene SNCA (139). As mutações A53T e A30P promovem a formação de protofibrilas in vitro em relação à proteína em estado natural (140), e a mutação E46K acelera a formação de fibrilas, relativamente às mutações anteriores (141). Verifica-se que a sobre-expressão da proteína natural AS provoca o desenvolvimento de características de parkinsonismo e um aumento da concentração citossólica de catecolaminas (142). Tabela 4 - Alterações genéticas com relevância na DP. Gene Modo de transmissão Locus Produto génico Relevância da génese da DP Referências SNCA Autossómico dominante PARK1 α-sinucleína Formação CL, stresse oxidativo (136-138) SNCA Autossómico dominante PARK4 Triplicação genética AS wt Formação CL, stresse oxidativo (141) Parkin Autossómico recessivo PARK2 E2 ubiquitina ligase Inibição UPS (131, 134) UCHL1 Autossómico dominante PARK5 ubiquitina cterminal hidrolase Inibição UPS (132, 143) PINK1 Autossómico recessivo PARK6 Serina-trionina cinase 1 stresse oxidativo, disfunção mitocondrial (13, 144) LRRK2 Autossómico dominante PARK8 Serina-trionina cinase 2 Disfunção mitocondrial (135, 145) DJ-1 Autossómico recessivo PARK7 Proteína DJ-1 stresse oxidativo, CL (146) Foi identificada uma alteração no gene Parkin com potencial relevância na DP (131) que codifica a enzima E2 ubiquitina ligase, um dos componentes do UPS que participa na transferência na ubiquitina e na sua ligação a péptidos (147). Foi sugerido que a inactivação deste gene está envolvida na patogénese da DP devido à acumulação citoplasmática de alguns dos substratos do seu produto génico, provocada pela diminuição da actividade ligase (por exemplo, acumulação de fibrilas de AS) (68). Assim, pensa-se que a sobre-expressão da proteína Parkin seja neuroprotectora em várias situações, nomeadamente, quando há inibição do UPS, sobre-expressão e/ou acumulação de AS, no tratamento com MPTP e na toxicidade dependente da DA (135). 27 Também relacionada com a alteração do UPS está a mutação que pode ser encontrada no gene UCHL1, que leva ao desenvolvimento de DP familiar (132). Este gene codifica a enzima ubiquitina c-terminal hidrolase, um outro componente do UPS, cujas funções incluem a reciclagem da ubiquitina (143). No entanto, foi apenas identificada uma família com esta variante da doença e portanto é controverso se esta mutação é significativa para o seu desenvolvimento (148). A mutação no gene PINK1 foi descoberta em 3 famílias consanguíneas com DP (13). Células isoladas de indivíduos com a mutação no gene PINK1 apresentam reduzida actividade do complexo mitocondrial I e evidências de stresse oxidativo (144). Pensa-se que este gene possa ter um efeito neuroprotector, uma vez que se demonstrou que a proteína natural atenua algumas formas de apoptose e reduz a libertação do citocromo c quando sobre-expressa in vitro (149). A delecção no gene DJ-1, com a consequente ausência do seu produto génico, provoca DP (146). A presença da proteína DJ-1 natural protege as células contra uma grande variedade de danos, por exemplo, no modelo D. melanogaster os mutantes DJ-1 são mais sensíveis à acção da rotenona, do paraquato (150) e do MPTP (151), e apresentam níveis elevados de ROS e maior sensibilidade ao stresse oxidativo o que resulta na degeneração de neurónios dopaminérgicos (152). Além disso, verifica-se que a forma natural da proteína reduz a agregação da AS (153). As mutações no gene LRRK2 representam a causa mais comum de parkinsonismo familiar, representando 5 a 6% do parkinsonismo hereditário e 1 a 2% dos casos de parkinsonismo esporádico (13) e os doentes com esta mutação apresentam todos os sintomas representativos da DP idiopática (145). O gene LRRK2 codifica uma proteína cinase MAP (cinase activada por mitogénios), preferencialmente localizada junto à membrana externa mitocondrial. Uma vez que a mutação neste gene aumenta a actividade cinase da proteína, pensa-se que a sua hiperactividade possa afectar a função mitocondrial (135). 2.2.5. Relevância da Neuromelanina na Doença de Parkinson A SN é assim designada devido à presença de pigmentos escuros de NM nos seus neurónios. A NM é uma molécula polimérica presente no SNC humano, localizada em organelos de dupla membrana que se assemelham a lisossomas pigmentados, sendo 28 que as zonas cerebrais com maior quantidade de NM são a SN e o locus ceruleus (154). Começa a formar-se aos 2/3 anos de idade e aumenta com a idade, entre os 50-90 anos (155). A NM possui uma estrutura semelhante à melanina (156) e grande parte desta é formada a partir de quinonas e semi-quinonas, produtos da auto-oxidação da DA, noradrenalina e L-DOPA e conjugados de cisteína com a DA (157). A NM pode ser sintetizada enzimaticamente, por exemplo, via tirosinase (158), tirosina hidroxilase (TH) (159), peroxidase (160) ou prostaglandina H sintetase (161, 162), ou via auto-oxidação da DA. A síntese não enzimática da NM deve-se à auto-oxidação de catecóis a quinonas, com a subsequente adição de grupos tiol, reacção que foi demonstrada ocorrer no cérebro humano (163). Por exemplo, as quinonas formadas aquando da auto-oxidação da DA podem ciclizar e formar aminocromos, que são também precursores da NM quando polimerizados (Figura 6) (164). Figura 6 - Conversão da dopamina em aminocromo (adaptado de Paris et al, 2009). Verifica-se que na DP há perda selectiva de neurónios pigmentados na SN, todavia os neurónios não pigmentados sobrevivem (165). Pensa-se que a NM possa ter, por um lado, um papel neuroprotector, sequestrando espécies metálicas reactivas e compostos orgânicos tóxicos. Por outro lado, parece desempenhar ela própria um papel neurotóxico, podendo ser uma fonte de radicais livres ao reagir com o H2O2 (166). A NM possui grande capacidade de ligação a metais como o ferro, cobre e zinco (167). Na SN humana, a ferritina está presente nos oligodendrócitos e nos astrócitos, no entanto não é detectada nos neurónios dopaminérgicos. Assim, o único sistema de defesa contra o aumento da concentração de ferro é a sua ligação à NM. Além disso, a NM libertada por neurónios em degeneração pode levar à activação da microglia, libertando-se moléculas citotóxicas que podem danificar outros neurónios, 29 exacerbando o processo neurodegenerativo. Por outro lado, inibe a acção enzimática do proteassoma 26S, in vitro (168). A NM pode interagir com compostos relevantes na génese da DP, demonstrando mais uma vez o seu papel neuroprotector. O MPP+ (ião 1-metil-4-fenil pirídio) pode ligar-se à NM (reduzindo a toxicidade do MPTP in vivo) (169) e ao paraquato (170), no entanto, pode também levar à sua libertação gradual dos neurónios, provocando posterior neurodegeneração da SN. 2.2.6. Neuroinflamação O SNC é ele próprio capaz de desencadear uma resposta imunitária, não só contra agentes externos, mas também como resposta a um processo imune inerente ao próprio SNC. As células efectoras desta resposta são células da glia, pricipalmente as células da microglia (171). Alguns autores sugerem que o processo neuroinflamatório pode não ser gerado somente por processos gliais mas envolver a presença de células imunitárias periféricas. O significado da sua presença é desconhecido, mas poderá indicar que a barreira hemato-encefálica está de algum modo comprometida na DP (172). Verifica-se a activação das células da microglia nos doentes de Parkinson (173) e em indivíduos expostos ao MPTP (174), cuja causa é verdadeiramente desconhecida: detecta-se o aumento da concentração de citocinas e outras proteínas, por exemplo, interleucinas e TNF-α, na região nigrostriatal e no fluído cerebroespinal (175, 176). Os receptores de citocinas pró-inflamatórias, como o TNF-α, estão presentes nos corpos celulares e nas dendrites dos neurónios nigroestriatais, o que provavelmente os torna susceptíveis ao efeito citotóxico das citocinas libertadas pelas células da microglia activadas (177) e a activação destes receptores pode activar a cascata das caspases que conduz à apoptose (178). A activação da microglia pode também levar ao stresse oxidativo, com produção de óxido nítrico (NO), que ao entrar nos neurónios e conjugar-se com o O2•-, origina peroxinitrito (ONOO-), uma espécie muito reactiva (179, 180). 36 Figura 11Possíveis mecanismos de toxicidade da dopamina e dos seus produtos quinónicos nos neurónios dopaminérgicos (adaptado de Miyazaki e Asanuma, 2008). Verificou-se que as quinonas derivadas de DA podem ligar-se ao DNA, formando aductos, que poderá levar a mutações que estão na origem do desenvolvimento de DP (206). As quinonas, derivadas da auto-oxidação das catecolaminas, são muito reactivas na presença de tiolatos, formando-se catecol tioéteres. Nos sistemas biológicos, são frequentes os ligandos destes compostos à cisteína ou à GSH, pela VAM. Na DP, assume particular relevância a formação de catecol tioéteres derivados da DA e dos seus metabolitos, no entanto, a noradrenalina e a adrenalina podem sofrer reacções de autooxidação e metabolismo semelhantes. No entanto, a catecolamina com maior probabilidade de entrar em ciclo redox é a DA (147). Como já foi referido, um dos achados patofisiológicos nas células neuronais da SN em doentes de Parkinson é o aumento da razão 5-S-cis-DA/DA. Verifica-se que a degradação química da neuromelanina dá origem a produtos que sugerem que a sua composição contém resíduos indólicos e derivados de 5-S-cis-DA, sugerindo que a 5-Scis-DA é um dos precursores da neuromelanina (207). No entanto, com o aumento da concentração de 5-S-cis-DA intracelular, a produção de melanina diminui até que pára, in 37 vitro. Sugeriu-se que a presença de cisteína inibe a ciclização da DA-o-quinona em dopaminocromo (208), podendo ser um dos mecanismos que leve à despigmentação dos neurónios dopaminérgicos nos doentes de Parkinson. 3.4.1. Conjugação da Dopamina com a Glutationa A GSH é um antioxidante que reage não enzimaticamente com ROS e é um auxiliar na destoxificação de alguns xenobióticos. Possui ainda outras funções nas células, como meio de armazenamento e transporte de cisteína (209), na proliferação celular (210) e na regulação da apoptose (211). A síntese da GSH é garantida pela acção consecutiva de 2 enzimas: a -glutamilcisteína sintetase ( -GS) (que combina os aminoácidos glutamato e cisteína), seguida da acção da enzima GSH sintetase (que combina o dipéptido anterior com o aminácido glicina). Para a actividade destas 2 enzimas é necessário ATP (113), logo, se a cadeia mitocondrial respiratória estiver comprometida, a síntese de GSH encontra-se diminuída. A ligação da GSH a ROS pode ser de 2 tipos: reacção não enzimática ou enzimática, funcionando como dador de electrões na reacção da GSH peroxidase (GPx) (cuja função é reduzir o H2O2 a água). Na primeira, a GSH liga-se a ROS, por exemplo O2•- e NO (212, 213). Na segunda, a GSH é oxidada a GSSG, sendo que a sua regeneração se dá via GSH reductase (GR) (214). Nas reacções catalisadas pela GPx e GR, a GSH não é consumida mas reciclada. No entanto, durante a formação de conjugados de GSH via glutationa-S-transferase (GST) (durante a transformação de possíveis xenobióticos a compostos menos tóxicos e mais hidrossolúveis) (215), ou pela libertação de GSH das células durante a sua homeostasia (216), a concentração de GSH intracelular diminui e há necessidade de síntese de novo. Nos doentes de Parkinson, a concentração de GSH está diminuída entre 40 a 50% na SN (85, 86). A perda de GSH isoladamente não é responsável pelo dano nigroestriatal na DP, uma vez que a redução da concentração da GSH cerebral através de infusões crónicas de BSO (butionina sulfoximina) não é suficiente para reduzir o número de neurónios dopaminérgicos (217) mas pode contribuir para o aumento da susceptibilidade destas células. A BSO é responsável pela depleção de GSH através da inibição da enzima limitante da sua síntese, a -GS. 38 A via de conjugação da GSH com xenobióticos via GST é uma importante via de destoxificação nas células. Os substratos para esta reacção são electrófilos potencialmente tóxicos devido a sua capacidade de ligação a outros nucleófilos (como proteínas e ácidos nucleicos), causando danos celulares e genéticos, ou compostos que podem facilmente entrar em ciclo redox e causar stresse oxidativo. Os conjugados de GSH denominan-se tioéteres, formados aquando do ataque nucleofílico do anião tiolato da GSH (GS-) com um átomo electrofílico do xenobiótico (C, O, N ou S) (218). A conversão dos conjugados de GSH a ácido mercaptúrico, o metabolito menos tóxico e excretável do xenobiótico, envolve a remoção sequencial do ácido glutâmico pela enzima -GT, e da glicina pela alanil-aminopeptidase, seguida da N-acetilação do conjugado de cisteína a ácido mercaptúrico (Figura 12). Todavia, em alguns casos, a conjugação do xenobiótico com a GSH aumenta a sua toxicidade. Tal facto pode ocorrer de 5 formas diferentes: (1) formação de conjugados de haloalcanos, tiocianatos orgânicos e nitrosoguaninas (por exemplo, mecanismo de toxicidade do diclorometano), (2) formação de conjugados de dihaloalcanos (por exemplo, mecanismo de toxicidade do cicloroetano e do dibromoetano), (3) formação de conjugados de alcenos halogenados, degradados a metabolitos tóxicos no fígado pela enzima β-liase (por exemplo, mecanismo de toxicidade do hexacloroutadieno), (4) conjugação cíclica com a GSH, levando à sua depleção (por exemplo, mecanismo de toxicidade dos alil-, benzile fenoetil-tiocianatos) e (5) formação de conjugados de quinonas, quinoneinimas e isotiocianatos (por exemplo, mecanismo de toxicidade do bromobenzeno) (219, 220). A VAM inicia-se com a junção intracelular da GSH ao electrófilo da O-quinona da DA, quer espontaneamente, quer pela acção enzimática da GST. Os conjugados de GSH são transportados para o meio extracelular, onde são hidrolisados pela enzima -GT, juntamente com peptidases, aos seus correspondentes conjugados de cisteína. Os conjugados de cisteína reentram nas células e são metabolizados pela enzima microssomal CNAT (N-acetiltransferase de conjugados de S-cisteína) em conjugados de ácido mercaptúrico (147, 221). A concentração intracelular de conjugados de ácido mercaptúrico é mantida pelo equilíbrio entre a acção das enzimas CNAT (que levam à sua formação) e das acetilases (que favorecem a reacção de degradação do radical acetil) (183). Nos doentes de Parkinson, devido ao stresse oxidativo, a formação de conjugados de DA e L-DOPA encontra-se facilitada através da produção de quinonas (200).Tendo em conta 39 as O-quinonas derivadas da DA, na VAM dá-se a formação de 5-S-glutationildopamina (5-S-GSH-DA, o conjugado de GSH), de 5-S-cisteinildopamina (5-S-cis-DA, o conjugado de cisteína) e 5-S-N-acetilcisteinildopamina (5-S-NAC-DA, o conjugado de ácido mercaptúrico) (Figura 12) (221). A DA, ao ser metabolizada pela MAO-B leva à formação de DOPAC, que pode sofrer o mesmo processo de conjugação da VAM (Figura 13) (147). No sentido de comprovar a possibilidade da formação de todos os metabolitos dependentes da DA e envolvidos na VAM, Shen e colaboradores demonstraram que a conjugação de DA-O-quinonas com a cisteína leva à formação de 5-S-cis-DA (produto maioritário) e 2-S-cisteinilDA (produto minoritário), in vitro. Estes compostos são rapidamente oxidados, dando origem a 2,5-bis-S-cis-DA, 2,5,6-tris-S-cis-DA, DHBT-1, DHBT-5, e conjugados destes dois últimos com a cisteína, formando conjugados 6-ScisteinilDHBT (222). Figura 12 - Metabolismo da DA pela VAM (CNAT - N-acetiltransferase de conjugados de S-cisteína, DA – dopamina, DP – dipeptidase, GST – glutationa-S-transferase, -GT – -glutamiltransferase, 5-S-Cis-DA – 5-Scisteinildopamina, 5-S-GSH-DA – 5-S-glutationildopamina, 5-S-NAC-DA – 5-S-N-acetilcisteinildopamina) (adaptado de Montine et al, 2000). 40 Figura 13 - Metabolismo da DA e DOPAC pela VAM (DA (1) e formação de DA-O-quinona (2), 5-S-GSH-DA (3), 5-S-cis-DA (4) e 5-S-NAC-DA (5); metabolito da DA, DOPAC (6), DOPAC-O-quinona (7), 5-S-GSHDOPAC (8), 5-S-Cis-DOPAC (9) e 5-S-NAC-DOPAC (10). ALDH – aldeído desidrogenase, MAO – monoamina oxidase (adaptado de Zhang et al, 2000). A oxidação do metabolito 5-S-cis-DA, na presença de cisteína livre, a pH próximo de 7,4, traduz-se na formação de DHBT-1, um dos compostos da família das benzotiazinas, endotoxinas que por si só podem levar à degeneração dos neurónios dopaminérgicos, pela inibição do complexo mitocondrial I e a formação de ROS (222). 41 Estudos revelam que a VAM e a formação de conjugados de DA é compatível com os parâmetros bioquímicos encontrados na SN de animais de laboratório e em vários estudos relacionados com a DP. Verifica-se a diminuição da concentração de DA, a diminuição da concentração de GSH, pela ligação à DA e formação de conjugados, o aumento da actividade de enzima -GT, o aumento da concentração de anião O2intraneuronal e o aumento das reacções de oxidação da DA com consequente formação de O-quinonas (223). Verifica-se também um aumento da razão 5-S-cis-DA/DA (163). De notar, no entanto, que o aumento da actividade da enzima -GT pode ser um resultado adaptativo da células em resposta à diminuição da quantidade de GSH (224). Desde 1986 que é conhecida a presença de conjugados de cisteína derivados da DA, LDOPA e DOPAC em cérebros de mamíferos, em regiões cerebrais onde a DA é encontrada em maior concentração (163). Foi também já detectada a presença de 5-Scis-DA no cérebro de humanos, em zonas ricas em DA, como o núcleo caudado, o putamen, o globo pálido e a SN, mas não noutras regiões cerebrais (como o cerebelo e o córtex occipital) (225) e, em doentes de Parkinson, na SN a concentração de 5-S-cis-DA, 5-S-cis-DOPA e 5-S-cis-DOPAC é significativamente maior do que nos indivíduos controlo (117). Apesar da VAM ser basicamente uma via de destoxificação, que leva à inactivação e excreção de compostos potencialmente tóxicos, parece haver situações em que a sua existência leva à formação de metabolitos mais tóxicos que o composto original. A oxidação da DA pela VAM parece ser um desses casos (218). Spencer e colaboradores verificaram que existe uma relação clara entre a diminuição da GSH com a formação de conjugados de cisteína (117). A incubação in vitro de GSH com DA ou L-DOPA não provoca a diminuição de concentração da GSH. A incubação de apenas GSH com um sistema enzimático gerador de ROS (H2O2 e O2-) traduz-se na perda lenta de GSH. No entanto, a incubação simultânea de GSH com DA (ou L-DOPA) e ROS leva à perda significativa de GSH, de modo linear e dependente da concentração de DA, mimetizando o ambiente oxidante existente nos neurónios dopaminérgicos (117). Este estudo permitiu detectar por HPLC novos compostos, que se concluiu serem o 5-SGSH-DA, 5-S-GSH-DOPA, 5-S-cis-DA e 5-S-cis-DOPA (117). A concentração de conjugados encontrada na maioria das regiões anatómicas cerebrais analisadas nos doentes de Parkinson não foi significativamente diferente dos controlos, com excepção da SN e da substância inominata, onde se encontraram os níveis mais altos de conjugados de cisteína (5-S-cis-DA e 5-S-cis-DOPA). Pensa-se que nestas zonas grande 42 percentagem de DA e L-DOPA seja oxidada nos seus conjugados. Em teoria, pode dizerse que qualquer mecanismo que resulte na oxidação das catecolaminas pode levar à diminuição da concentração intraneuronal da GSH, pela indução da VAM, e o tratamento dos doentes com L-DOPA pode exacerbar este problema, uma vez que esta molécula também sofre processos de auto-oxidação e formação de conjugados de cisteína, potencialmente citotóxicos (117). Dependendo dos estudos e das condições experimentais, a L-DOPA pode actuar como pró-oxidante ou antioxidante. Alguns estudos demonstram que a exposição de células dopaminérgicas à DA e/ou L-DOPA origina citotoxidade mediada pela exposição ao stresse oxidativo (226-228). Pelo contrário, outros estudos apontam para um efeito neuroprotector, através do aumento dos níveis de GSH ou aumento da produção de factores neurotróficos (229-231). Os primeiros estudos realizados com o objectivo que verificar a possível neurotoxicidade dos conjugados de cisteína derivados de DA foram concretizados por Zhang e colaboradores. Este concluiu que existe uma relação dose-resposta linear entre a concentração de DA e a apoptose neuronal e que, à excepção da DA e do seu metabolito 5-S-NAC-DA, que demonstraram neurotoxicidade, não obtiveram resultados claros acerca de outros metabolitos da VAM envolvendo a DA. No entanto, neste estudo foi usado como modelo a linha celular MES, derivada de neurónios mesencefálicos de rato, cuja limitação é o facto de constituir uma população celular homogénea de neurónios não diferenciados. Ou seja, não foi possível testar a especificidade destes metabolitos em relação aos neurónios humanos dopaminérgicos (147). Picklo e colaboradores demonstraram que a oxidação dos conjugados da DA provenientes da VAM, o 5-S-cis-DA e o 5-S-NAC-DA, é mais rápida e promove maior stresse oxidativo que a própria DA livre intracelular (125). Outro estudo por Spencer e colaboradores avaliou o potencial neurotóxico dos aductos de 5-S-cisteinilcatecóis, em neurónios nigroestriatais, usando a linha celular CSM14.1. Foi estudada a viabilidade celular, o dano nucleico, a produção de ROS e a actividade das caspases-3 (232). Verificou-se que a incubação de células com DA provoca uma diminuição da redução do MTT (o que indica perda de viabilidade celular) a concentrações de DA acima de 100 M e tempo de exposição entre 24 e 48 horas. A perda de viabilidade celular é mais extensa quando as células são incubadas com 5-Scis-DA, a concentração de 100 M, mas por períodos de exposição menores, entre 12 e 48 horas. 43 Apesar de não se verificar morte neuronal em períodos de exposição de 6 horas com 5S-cis-DA, verificou-se um aumento significativo na detecção de bases purínicas e pirimidínicas oxidadas, o que é indicativo de stresse oxidativo e dano nos ácidos nucleicos. Não se detectaram bases oxidadas na incubação com L-DOPA ou DOPAC, mas foram detectadas aquando da incubação com conjugados de L-DOPA e DOPAC, apesar de ser em menor extensão do que com 5-S-cis-DA. A incubação celular com 5-Scis-DA em concentrações superiores provocou um aumento significativo da produção de ROS, quando comparado com as células expostas à DA. O mesmo acontece com a exposição aos conjugados de L-DOPA e DOPAC. O mesmo estudo avaliou a apoptose como mecanismo de morte celular. Verificou-se que a exposição a 5-S-cis-DA (10 M) durante 6 horas produziu um aumento significativo na activação das caspases-3. Este estudo permitiu concluir que os 5-S-cisteinilconjugados de DA, L-DOPA ou DOPAC são citotóxicos para os neurónios, provocando oxidação de bases azotadas e a produção de ROS. O aumento da actividade das caspases-3 indica morte celular por apoptose, possivelmente com inibição da cadeia respiratória, que pode dever-se ao aumento da produção de ROS ou ao ataque directo dos cisteinilconjugados (232). Outros estudos demonstraram que os compostos da família das benzotiazinas, que resultam da oxidação dos conjugados de cisteína em DHBT, são rapidamente acumulados nas mitocôndrias e inibem o complexo I. O mecanismo de inactivação destas enzimas pode estar relacionado com a bioactivação do DHBT por oxidação em metabolitos altamente electrofílicos que se ligam a resíduos de cisteína (223). Assim, os conjugados de cisteína podem levar à vulnerabilidade neuronal não só pela produção de neurotoxinas derivadas de benzotiazinas (que levam à inibição mitocondrial) mas também aumentando os níveis de stresse oxidativo. Estes conjugados são mais rapidamente oxidados que os seus precursores, levando à formação de conjugados mais complexos ou ao aumento dos produtos oxidantes, como o O2•-, H2O2 ou radicais hidroxilo (232). Um estudo de Mosca e colaboradores permitiu demonstrar que, na realidade, o conjugado 5-S-Cis-DA é mais citotóxico do que o seu precursor DA, na linha celular neuronal dopaminérgica SH-SY5Y. Verificaram que este composto desencadeia citotoxicidade de forma dependente do tempo e da concentração, e após o tratamento com este conjugado a 100 M, é possível verificar um aumento da produção de ROS, acompanhado de uma diminuição da detecção de grupos tiol, a partir das 24h de 44 incubação. Observa-se também uma diminuição marcada do potencial transmembranar da mitocôndria acompanhado da inibição do complexo mitocondrial I, fragmentação do DNA nuclear e aumento da actividade das caspases-3 (233). O stresse oxidativo observado aquando da incubação com este composto, pela produção de ROS e diminuição de grupos tiol pode dever-se a 2 motivos: auto-oxidação do conjugado e/ou inibição com complexo I, como já foi observado anteriormente com a utilização da rotenona, in vitro (234). Por outro lado, a inibição do complexo I pode deverse à actividade directa do 5-S-Cis-DA (235) ou à produção de benzotiazidas dele derivadas (236). O mesmo estudo descreveu várias evidências de morte apoptótica aquando da incubação com 5-S-Cis-DA, como a diminuição do potencial transmembranar mitocondrial, que poderá ser um fenómeno desencadeador da apoptose, fragmentação do DNA nuclear e aumento da actividade das caspases-3. De notar que a 5-S-Cis-DA demonstrou maior citotoxicidade que a DA em todos os parâmetros observados (233). 45 4. MODELOS PARA O ESTUDO DA DOENÇA DE PARKINSON Na generalidade, a utilidade de um modelo para o estudo de uma doença depende da forma como esse modelo reproduz a condição humana. No que toca à DP, apesar de nenhum modelo reproduzir na totalidade as características comportamentais, bioquímicas e histopatológicas da doença, permitem aprofundar o conhecimento acerca dos mecanismos inerentes ao desenvolvimento da doença e a sua possibilidade de tratamento (237). De seguida serão enumerados os principais modelos celulares e animais usados para estudar a doença de Parkinson. Além disso, serão abrodadas as moléculas que permitem obter modelos que permitem o melhor estudo da DP. 4.1. Modelos Farmacologicamente Induzidos Tanto em modelos animais como em estudo recorrendo a culturas celulares usam-se moléculas com diversos mecanismos de acção tendo como objectivo de reporduzir as características fisiopatológicas da doença. 4.1.1. α-Metil-p-tirosina e Reserpina Com o objectivo de alterar a via de neurotransmissão dopaminérgica recorre-se ao uso da reserpina ou da α-metil-p-tirosinase (AMPT). A reserpina é um fármaco que depleta as vesiculas das monoaminas. Foi testado inicialmente por Carlsson e colaboradores, levando à hipótese de que a DP se deve à perda de neurotransmissão dopaminérgica (8). A AMPT funciona como agente depletor das catecolaminas inibindo directamente a enzima TH (a síntese de DA é inibida) (238). 52 Tabela 5 – Sistemas de cultura de neurónios dopaminérgicos. AMP – adenosina monofosfato, AS – αsinucleína, BDNF – factor neurotrófico, D2R – receptor da DA, DA – dopamina, DAT – transprotador da DA, GDNF – factor neurotrófico derivado das células da glia, Meth – metanfetamina, RA – ácido retinóico, TH – tirosina hidroxilase (adaptado de Falkenburger e Schulz, 2006). Linha celular Origem Factor de diferenciação Fenótipo dopaminérgico Patologia SH-SY5Y Neuroblastoma humano RA ± TPA DAT, D2R, DA, TH, vesículas, libertação DA Inclusões eosinofílicas citoplasmáticas aquando co-expressão de AS e sinfilina-1 PC12 Neuroblastoma de rato NGF DAT, D2R, DA, TH, vesículas, libertação DA Sobre-expressão de AS após exposição ao NGF, inclusões citoplasmáticas após inibição do UPS e exposição à Meth MN9D Células mesencefálicas de rato GDNF, RA, sobre-expressão de Nurr11 DA, TH, D2R, sensível a MPTP ----- 2 CSM14.1 Células embrionárias mesencefálicas de rato 39ºC (imortalização sensível à temperatura) TH ----- 2 MESC2.10 Células mesencefálicas humanas (8 semanas de idades) Tetraciclina, GDNF, AMP TH, DAT, libertação DA, electricamente activas Expressão de inclusões de AS após exposição à Meth e sobre-expressão de AS 1 Nurr-1 – factor de transcrição que está activo nos neurónios dopaminérgicos. 2 Não encontrada bibliografia que relacione estas células com o aparecimento de características patológicas da DP 53 4.2.3. Linha Celular SH-SY5Y A linha celular SH-SY5Y é uma sublinha celular clonada a partir da linha celular SK-NSH, originalmente derivadas de um paciente com neuroblastoma (267). A linha celular SK-N-SH contém células com 3 fenótipos diferentes: neuronal (tipo N), células de Schwann (tipo S) e intermédias (tipo I), enquanto a linha SH-SY5Y contém apenas células com fenótipo tipo N, ou seja, neuronais (268). A linha celular SH-SY5Y parece ser um bom modelo de neurónios dopaminérgicos por vários motivos. Estas células possuem a capacidade de sintetizar DA e noradrenalina, pois expressam tirosina e DA-β-hidroxílase (269), e expressam o transportador DAT, expresso apenas nos neurónios dopaminérgicos (270). Apesar de possuir baixos níveis de expressão de receptores da DA, o uso de agonistas da DA, que são eles próprios neuroprotectores, pode ser avaliado nesta linha celular (271). Normalmente, e com o objectivo de obter uma linha celular com o fenótipo o mais semelhante possível ao dopaminérgico, é introduzido na cultura das células SH-SY5Y um factor diferenciador, por exemplo, ácido retinóico (RA), forbol éster de 12-Otetradecanoilforbol-13-acetato (TPA), factor de crescimento neuronal (BDNF) ou adenosina monofosfato (AMP). As desvantagens da utilização da linha celular SH-SY5Y não diferenciada como modelo para o estudo da DP são várias. Primeiro, enquanto células não diferenciadas, continuam a sua divisão celular ao longo dos ensaios experimentais, pelo que é difícil perceber se os agentes neuroprotectores ou neurotóxicos estão a influenciar a taxa de divisão ou de morte celular (272). Segundo, em cultura as células crescem assincronizadamente e nem sempre exibem os marcadores neuronais de células maduras, o que leva a incertezas no trabalho experimental. Por fim, as células SH-SY5Y não diferenciadas expressam níveis reduzidos de enzimas da síntese de DA e de transportador DAT (273). Apesar destas células expressarem a DA-β-hidroxilase e a TH, a síntese de catecolaminas (DA e noradrenalina) é limitada devido à baixa actividade da DDC (274). Deste modo, a utilização de factores de diferenciação na cultura celular das células SHSY5Y é fundamental para a aquisição do fenótipo neuronal maduro. Após diferenciação, as células param de proliferar, tornando-se uma população estável, e demonstram crescimento das neurites morfologicamente semelhantes aos neurónios do cérebro humano (275). Mais ainda, exibem uma grande variedade de marcadores neuronais: GAP-43 (proteína associada ao crescimento), receptores para compostos neurotróficos, 54 neuropeptidos, enolase específica neuronal, marcação com NeuN (marcador específico para o núcleo neuronal) e proteínas específicas do citosqueleto neuronal, incluindo os microtúbulos, Tau e neurofilamentos (272). Ou seja, as células diferenciadas possuem mais semelhanças bioquímicas, ultraestruturais, morfológicas e electrofisiológicas com neurónios do SNC (271). As células SH-SY5Y têm sido estudadas e usadas como modelo para o estudo de várias doenças degenerativas, incluindo a DP (276-278). Por exemplo, no estudo de mecanismos de toxicidade de compostos com relevância na patogénese da DP: o MPTP (279, 280), a rotenona (281-283), o paraquato (152, 284), da DA (285, 286), do seu metabolito DOPAC e do precursor L-DOPA (287). Esste modelo celular foi utilizado para estudar a influência da AS na patogénse da DP, por exemplo, como neuroprotector (288) ou como indutor de neurotoxicidade (como já foi referido anteriormente) ou para verificar a sua influência noutros mecanismos relacionados com o desenvolvimento da DP, como a actividade proteassomal (289). Este modelo tem sido largamente utilizado no estudo de mecanismos e compostos que possam ser neuroprotectores. Utilizam-se neurotóxicos que conferem neurotoxicidade específica nos neurónios dopaminérgicos e são testados compostos que confiram neuroprotecção contra o mecanismo de toxicidade. Por exemplo, são avaliados compostos que possam conferir protecção contra a neurotoxicidade do MPTP (290, 291), da 6-OHDA (292, 293), da rotenona (123, 271, 294-296) e do excesso de H2O2 (297). Estes compostos em teste poderão ser utilizados como base para o desenvolvimento de futuros fármacos usados para o tratamento da DP. Além da utilização de compostos que possam mimetizar os mecanismo que estão na origem da neurodegeneração dopaminérgica associada à DP, podem combinar-se com a indução de alterações genéticas. Os modelos genéticos têm origem na manipulação de determinados genes, cuja expressão pode ser alterada de várias formas: delecção do gene de interesse (modelo knock-out), introdução de um gene mutante (knock-in) ou alteração da expressão do gene de interesse (knock-down, null ou over-expression). Relativamente ao estudo da DP, os genes que normalmente são modificados são aqueles que se pensa terem influência directa na patogénese da doença (ver capítulo 2.2.4). Os modelos mais utilizados incluem alterações genéticas no gene SNCA (introdução de alterações da expressão da AS), Parkin, DJ-1, UCHL1, LRRK2 e PINK1 (237). 55 4.3. Modelos Animais Os modelos animais oferecem um grau de complexidade muito superior do que os diversos modelos in vitro, pelo que mais facilmente podem reproduzir as diversas características de uma doença. A utilidade de um modelo animal para o estudo de uma doença depende da proximidade com que esse modelo replica em parte ou no todo as características dessa doença. Existe uma grande variedade de modelos animais para o estudo da DP, sendo que cada um dá a sua contribuição particular para o estudo da doença. Estes modelos animais derivam de uma grande quantidade de espécies, como por exemplo, roedores, porcos e primatas não humanos. São usadas várias técnicas, incluindo manipulação farmacológica, administração de neurotóxicos e modelos genéticos. Apesar de estes modelos não serem idênticos à condição humana no que diz respeito a características comportamentais, anatomia cerebral ou progressão da doença, oferecem vantagens significativas para o conhecimento dos mecanismos e desenvolvimento de possíveis tratamentos da DP (237). Assim como foi referido para as culturas celulares, os estudos com modelos animais podem combinar a utilização de fármacos que causem alterações na transmissão dopaminérgica e alterações genéticas nos genes com relevância no desenvolvimento da DP. Estes modelos visam obter um modelo mais próximo da DP (237). Os roedores como modelo animal apresentam algumas vantagens em relação ao outros, nomeadamente a taxa de reprodução elevada, o espaço reduzido necessário para a sua sobrevivência e os regimes alimentares simples. Nestes animais, é utilizada maioritariamente a administração de neurotóxicos, principalmente a 6-OHDA e o MPTP, como tentativa de mimetização da DP. No entanto, entro os ratos e ratinhos existem diferenças de susceptibilidade aos tóxicos. Por exemplo, os ratinhos são mais susceptíveis ao MPTP do que os ratos, isto devido à maior concentração de MAO-B neuronal (Tabela 6) (298). O género, a idade e a massa corporal dos ratos usados são factores importantes a ter em conta, pois afectam a sensibilidade dos animais aos tóxicos e a reprodutibilidade das lesões neuronais. Os animais jovens (menos de 8 semanas de idade), fêmeas e com peso corporal inferior a 25 gramas são menos sensíveis e as lesões produzidas são mais variáveis. Os animais mais velhos demonstram maior sensibilidade aos efeitos dos neurotóxicos dopaminérgicos (299). 56 No entanto, no caso de lesões estereotáxicas produzidas pela 6-OHDA, é a estirpe do rato que parece afectar mais a efectividade do processo do que a sua idade. Por exemplo, para induzir uma lesão mensurável em ratos Lewis jovens ou velhos é necessária uma dose maior do que para os ratos Sprague-Dawley, provavelmente devido à menor quantidade de transportadores DAT que os ratos Lewis possuem nos seus terminais dopaminérgicos (300). Tabela 6 – Exemplos de estudos que envolvem o uso de neurotóxicos em roedores como modelo de estudo para a DP (adaptado de Emborg et al, 2004). Neurotóxico Modo de administração Espécie Referência 6-OHDA Intranigral Rato (Fischer) (301) 6-OHDA Intraventricular Rato (Sprague-Dawley) (302) 6-OHDA Intraestriatal Rato (Sprague-Dawley) (303) MPTP Sistémica aguda Ratinho (C57BL) (304) MPTP Sistémica crónica Ratinho (C57BL) (305) Paraquato/Maneb Sistémica crónica Rato (Sprague-Dawley) (306) Paraquato/Maneb Intraperitonial Rato (SpragueDawley/Wistar) (111) Anfetamina Intraestriatal Rato (Sprague-Dawley) (307) Rotenona Intranigral Rato (Sprague-Dawley) (308) Rotenona Subcutânea Rato (Inbred Lew) (254) Rotenona Sistémica crónica Rato (Sprague-Dawley) (76) Apesar da menor susceptibilidade aos neurotoxócios, o uso de animais jovens traz vantagens para o estudo da DP. Nomeadamente, é mais fácil o seu manuseamento, é mais fácil a técnica de injecção uma vez que o crânio é mais maleável e menor tempo de anestesia. Usando um mapa estereotáxico é possível seleccionar zonas cerebrais específicas. Tipicamente, as lesões são unilateriais e as injecções realizadas na SN, estriado ou no feixe proesncefálico medial (309-311). A administração de neurotóxicos efectuada no feixe proesncefálico medial ou na SN induzem uma quase completa perda neuronal dopaminérgica, comparável à DP na sua fase final. Em comparação, a injecção intraestriatal induz uma lesão grave mas não completa das células nigrais, equivalente à DP na fase sintomática. A injecção intra-estriatal é um modelo mais realista que permite 57 estudar, por exemplo, potenciais neuroprotectores. Além disso, como é induzida a morte celular dos neurónios dopaminérgicos por transporte retrógrado do neurotóxico, permite uma abertura temporal para a acção de potenciais neuroprotectores (298). Os ratos Sprague-Dawley, são um modelo animal extensivamente usado nas ciências biomédicas, nomeadamente em neurologia em diversas áreas, por exemplo, isquemia (312, 313) e neurotoxicidade (314, 315). Além disso, os ratos Sprague-Dawley têm sido usados como modelo animal no estudo da DP, por exemplo, no estudo de alterações comportamentais provocadas por determinado neurotóxico, ainda no estudo de determinados fármacos como neuroprotectores contra o efeito tóxico de compostos que são utilizados como modelo de estudo da DP e no estudo do efeito de determinados compostos no sistema de neurotransmissão dopaminérgico (316-318). Os ratos jovens são também usados como modelo para o estudo da DP. Num estudo, foram usados ratos Fisher de 5 dias com o objectivo de estudar o mecanismo de toxicidade da 6-OHDA, após injecção intra-estriatal (319). Basendos-e nos estudos que são efectuados com a rotenona, Nasut e colaboradores usaram ratos Wistar de 8 a 15 dias, expostos oralmente aos piretróides, para estudar o efeito da exposição a estes pesticidas como possível factor de susceptibilidade para o desenvolvimento da DP (320). Num outro estudo, foram usados ratos Fisher jovens de 13 dias, no sentido de criar um modelo para o estudo da DP. Foram injectados com uma estirpe de vírus causador da encefalite, uma vez que foi verificado que esta estirpe causa alterações neuronais semelhantes às encontradas na doença, nomeadamente a perda neuronal na SN e a gliose (321). Para avaliar a neurotoxicidade da L-DOPA foram usados ratos SpragueDawley de 2 dias, expostos pela via subcutânea ao fármaco, o que permite uma dose efectiva no cérebro dos animais (322). Apesar da menor susceptibilidade aos neurotoxócios, o uso de animais jovens traz vantagens para o estudo da DP. Nomeadamente, é mais fácil o seu manuseamento, é mais fácil a técnica de injecção uma vez que o crânio é mais maleável e menor tempo de anestesia. Além disso, é um modelo que permite o estudo da doença em idades jovens, pois há situações em que doença nos humanos surge em fases precoces de vida, nomeadamente no caso de algumas alterações genéticas (135). A lesão em animais jovens permite ainda estudar a evolução das características fisiopatologicas cerebrais nos adultos. 58 5. OBJECTIVOS Apesar de todos os mecanismos propostos para a neurodegeneração específica da SN, que causa o desenvolvimento da DP, ainda não se conhecem os mecanismos desencadeadores de todas as características e sintomas que a doença apresenta. A DA e o seu precursor L-DOPA parecem desempenhar um papel fundamental como geradores de stresse oxidativo, tanto pelo seu metabolismo via MAO-B e auto-oxidação com formação de ROS e O-quinonas. O metabolismo da DA, dá origem aos conjugados 5-S-GSH-DA, 5-S-Cis-DA e 5-S-NAC-DA, cujos mecanismos de neurotoxicidade não são ainda completamente conhecidos. Assim, este trabalho, usando modelos in vitro e in vivo, teve como objectivos: Determinar a neurotoxicidade dos compostos DA, L-DOPA, DOPAC, 5-S-GSHDA, 5-S-Cis-DA e 5-S-NAC-DA, usando como modelo as células dopaminérgicas diferenciadas derivadas de neuroblastoma humano, SH-SY5Y; Avaliar o envolvimento do stresse oxidativo no mecanismo de toxicidade destes compostos in vitro, avaliando o efeito neuroprotector da NAC e o envolvimento da GSH no mecanismo de protecção destas células, através do uso da BSO, na linha celular SH-SY5Y; Determinar a neurotoxicidade do composto 5-S-NAC-DA in vivo, após injecção intra-estriatal em ratos Sprague-Dawley; Determinar o tipo de células e o mecanimso de morte celular induzida pelo conjugado 5-S-NAC-DA, quando injectado no estriado de ratos Sprague-Dawley. 59 CAPÍTULO II: COMPONENTE EXPERIMENTAL 60 61 MATERIAIS E MÉTODOS 1. Materiais Os reagentes e materiais usados para a cultura celular foram obtidos aos seguintes fornecedores: meio de cultura DMEM (meio de Eagle modificado por Dubelcco), tampão fosfato salino, tripsina/EDTA, penicilina/estreptomicina, aminoácidos não essenciais (NEAA) e soro bvino fetal (FBS) à Gibco (Invitrogen, Paisley). As placas de cultura de 6 e 48 poços foram adquiridas à Corning Costar (Corning, NY, USA) e os frascos de 25 e 75 cm3 à TPP (Trasadingen, Suiça). Todos os outros reagentes foram adquiridos à Sigma-Aldrich (St. Louis, MO, USA) ou à Merck (Darmstadt, Alemanha), salvo qualquer excepção que é devidamente referenciada. Para a síntese dos conjugados de DA, a GSH, L-cisteína (Cis), N-acetilcisteína (NAC), DA (sal hidroclorido) e tirosinase (P1000 U/mg, EC 232-653-4), foram adquiridas à Sigma-Aldrich (St. Louis, MO, USA). 2. Síntese dos Conjugados da Dopamina Os conjugados de DA foram sintetizados e purificados como descrito anteriormente (323). Os espectros de infravermelhos foram obtidos num espectrofotometro Spectrum 1000 da Perkin Elmer (Beaconsfiel, UK). As amostras foram analisadas como pastilhas de brometo de potássio ou ou em filme, sem agente dispersante, em células de cloreto de sódio. Os espectros do visível foram obtidos num espectrofotómetro UV/Vis Thermo Electro Helios, entre 200 e 500 nm. Os espectros de ressonância magnética nuclear (NMR) de protão e de carbono foram obtidos num espectrómetro Brucker ARX 400, a 400 e 100,62 MHz, respectivamente. Os desvios de protões foram determinados em função do sinal do tetrametilsilano que funcionou como padrão interno, e os desvios de carbono em função do sinal residual da água (4,7 ppm) e os desvios de carbono referenciado de modo indirecto ao protão da água. 68 de nitrocelulose. Foi usado como controlador do bom carregamento do gel a marcação com o corante vermelho de Panceau, que cora de vermelho o conteúdo proteico das membranas de nitrocelulose. 4.3. Imunohistoquímica Após da lavagem das lâminas em TBS com 0,1% Triton X-100, incubou-se com 1,5% de BSA em TBS/Triton por 1h à temperatura ambiente. Os seguintes anticorpos foram usados: para a proteína nucleica neuronal (anti-NeuN, anticorpo monoclonal de rato, 1:200, Chemicon) e para a proteína associada aos microtubulos (anti-MAP2, anticorpo policlonal de rato, 1:200, DAKO). As lâminas foram inubadas com o anticorpo primário durante a noite a 4ºC e depois com anticorpo secundário (1:200, FITC IgG anti-rato de cabra) por 1 hora à temperatura ambiente. As secções foram fotografadas e analisadas recorrendo ao microscópio de fluorescência BX-51 Olympus, na ampliação de 100x. 4.4. Análise Estatística Os resultados apresentam-se sob a forma Média SEM. Para a comparação de 2 grupos (controlo vesus tratado) foi usado o teste não paramétrico de Mann-Whitney. Os valores de p inferiores a 0,05 foram aceites como estatisticamente significativos. 69 RESULTADOS EXPERIMENTAIS 1. Resultados das Experiências in vitro com as Células SH-SY5Y 1.1. Citotoxicidade da DA, L-DOPA, DOPAC, 5-S-GSH-DA, 5-S-Cis-DA e 5-S-NACDA A Figura 20 mostra os efeitos da DA, L-DOPA, DOPAC, 5-S-GSH-DA, 5-S-Cis-DA e 5-SNAC-DA em concentrações crescentes (10, 100, 500 e 1000 M) e diferentes tempos de exposição (24, 48 e 72h) na viabilidade celular da linha neuronal diferenciada SH-SY5Y através do ensaio da metabolização do MTT. Verificou-se que todos os compostos testados provocaram a diminuição da viabilidade celular de uma forma dependente da concentração e do tempo de incubação. A DA (Figura 20A) provocou diminuição da viabilidade celular estatisticamente significativa na concentração de 100 M, quando as células são incubadas durante 48h e 72h, mas para a concentração de 500 M a diminuição da viabilidade celular é já estatisticamente significativa após o período de exposição de 24h. No caso da L-DOPA (Figura 20B) e do DOPAC (Figura 20C), metabolito da DA, a viabilidade celular é reduzida para valores estatisticamente diferentes do controlo apenas a partir da concentração de 500 M, sendo que esta redução é visível a todos os tempos de incubação estudados. Ao contrário da DA, estes compostos não provocaram diminuição da viabilidade celular para a concentração de 100 M. Os compostos conjugados da DA, a 5-S-GSH-DA e a 5-S-NAC-DA (Figura 20D e 20F, respectivamente) são aqueles que mais reduziram a viabilidade celular após 24h de exposição, por comparação com o conjugado 5-S-Cis-DA (Figura 20E). Para tempos de exposição superiores a 24h estes 3 compostos reduziram a viabilidade celular de uma forma semelhante. Os compostos 5-S-GSH-DA 5-S-Cis-DA e 5-S-NAC-DA (Figura 20D, 20E e 20F, respectivamente), causaram uma diminuição da viabilidade celular estatisticamente significativa a partir da concentração de 100 M. Nesta concentração, em todos os 70 tempos de incubação, e para os 3 conjugados, a diferença obtida em relação ao controlo foi estatisticamente significativa. Figura 20 – Viabilidade das células SH-SY5Y após exposição aos diferentes compostos avaliada pelo ensaio MTT. Os dados são apresentados como percentagem de controlo, ao qual foi atribuído o valor de 100% (n=18 de 3experiências independentes). As comparações entre grupos pelo teste de Student-Newman-Keuls foram efectuadas após o teste de Kruskal-Wallis. **p<0,01 controlo vs. composto; ++p<0,01 composto 24h vs. composto 48h; ##p<0,01 composto 48h vs. composto 72h. DA – dopamina, DOPAC – ácido 3,4dihidroxifenilacético, L-DOPA – levodopa, 5-S-Cis-DA – 5-S-cisteinildopamina, 5-S-GSH-DA – 5-Sglutationildopamina, 5-S-NAC-DA – 5-S-N-acetilcisteinildopamina. 71 A Figura 21 apresenta a morte celular avaliada pela actividade da enzima LDH, aquando da incubação da linha celular SH-SY5Y com os compostos DA, L-DOPA, DOPAC, 5-SGSH-DA, 5-S-Cis-DA e 5-S-NAC-DA, a diferentes concentrações (10, 100, 500 e 1000 M) e diferentes tempos de exposição (24, 48 e 72h). Verificou-se que para todos os compostos estudados a libertação da LDH ocorre de uma forma dependente da concentração e do tempo de exposição. Verificou-se que a morte celular provocada pela exposição à DA é estatisticamente diferente relativamente ao controlo para as concentrações de 500 e 1000 M em todos os tempos de exposição (Figura 21A). Na DA na concentração de 1000 M às 24h de exposição a morte celular é já superior a 50%. No caso da L-DOPA (Figura 21B) verificou-se que na concentração de 500 M (a 24h e 48h) e de 1000 M (a 24h), a morte celular não ultrapassa os 25%, apesar de ser significativamente diferente do controlo. Tal como a DA, a exposição ao DOPAC (Figura 21C) provocou morte celular estatisticamente significativa relativamente ao controlo para as concentrações de 500 e de 1000 M, em todos os tempos de exposição, sendo que na concentração de 500 M às 72h de exposição a morte celular é já superior a 75%. Os conjugados 5-S-GSH-DA e 5-S-NAC-DA (Figura 21D e 21F, respectivamente) causaram morte celular estatisticamente significativa relativamente ao controlo para concentrações superiores a 100 M a todos os tempos de exposição. A partir da concentração de 500 M ambos os compostos provcaram aproximadamente 100% de morte celular, para todos os tempos de incubação. O composto 5-S-Cis-DA (Figura 21E) provocou a morte celular para concentrações superiores a 500 M, a todos os tempos de exposição, de modo estatisticamente significativo em relação ao controlo. Para a concentração de 1000 M nos tempos de exposição de 48 e 72h verifocu-se aproximadamente 80% de morte celular. 72 Figura 21 - Percentagem de mortalidade celular após exposição das células SH-SY5Y aos diferentes compostos. Os dados são apresentados como percentagem do rácio entre a actividade da LDH extracelular e da LDH total (n=18 de 3 experiências independentes). As comparações entre grupos pelo teste de StudentNewman-Keuls foram efectuadas após o teste de Kruskal-Wallis. **p<0,01 controlo vs. composto; ++p<0,01 composto 24h vs. composto 48h; ##p<0,01 composto 48h vs. composto 72h. DA – dopamina, DOPAC – ácido 3,4-dihidroxifenilacético, L-DOPA – levodopa, 5-S-Cis-DA – 5-S-cisteinildopamina, 5-S-GSH-DA – 5-Sglutationildopamina, 5-S-NAC-DA – 5-S-N-acetilcisteinildopamina. 73 1.2. Níveis de GSH Intracelular após Exposição aos Compostos DA, L-DOPA, DOPAC, 5-S-GSH-DA, 5-S-Cis-DA e 5-S-NAC-DA A Figura 22 apresenta a concentração de GSH intracelular e o conteúdo proteico das células SH-SY5Y, 24h após a exposição às concentrações de 10, 100, 500 e 1000 M dos diferentes compostos. Verificou-se que, na generalidade, os compostos estudados provocaram a diminuição do conteúdo proteico de uma forma dependente do aumento da concentração e do período de exposição. No entanto, houve um aumento da concentração de GSH intracelular após exposição a algumas das concentrações testadas. Verificou-se que quando as células são expostas à DA durante 24h, na concentração de 100 M, o conteúdo proteico aumentou de modo estatisticamente significativo em relação ao controlo. Pelo contrário, para concentrações mais elevadas o conteúdo proteico diminuiu, atingindo valores praticamente nulos na concentração de 1000 M. No entanto, verificou-se que a concentração de GSH intracelular aumentou de forma estatisticamente significativa em relação ao controlo para concentrações iguais ou superiores a 100 M, apesar da diminuição acentuada do conteúdo proteico. Verificou-se que a exposição à L-DOPA (Figura 22C e D) provocou uma resposta das células semelhante àquela promovida pela DA, relativamente à concentração intracelular de GSH e conteúdo proteico. No entanto, o aumento da concentração de GSH é estatisticamente diferente do controlo para concentrações iguais ou superiores a 500 M. O composto DOPAC (Figura 22E e 22F) provocou o aumento da concentração de GSH intracelular para concentrações iguais ou infereiores a 500 M. Isto apesar da diminuição estatiticamente significativa, em todas as concentrações testadas, do conteúdo proteico, de uma forma depende da concentração. Dada a reduzida quantidade de células presentes, após o período de exposição não foi possível quantificar a concentração de GSH e o conteúdo proteico para o composto DOPAC na concentração de 1000 M assim como para o conjugado 5-S-NAC-DA para as concentrações de 500 M e 1000 M. Para o conjugado 5-S-GSH-DA, não foi possível quantificar a concentração de GSH para as concentrações de 500 M e 1000 M, nem o conteúdo proteico para a concentração de 1000 M. Nestes casos, a quantidade quer de GSH quer de proteína encontrava-se abaixo do limite de detecção do método. 74 Quando as células são expostas ao conjugado 5-S-Cis-DA (Figura 22I e J), verificou-se um aumento da concentração da GSH intracelular dependente da concentração usada, apesar deste não ser estatisticamente significativo em relação ao controlo. No entanto, verificou-se uma diminuição do conteúdo proteico de uma forma dependente da concentração, cujas diferenças são estatisticamente significativas em relação ao controlo para as concentrações de 500 e 1000 M. Verificou-se que os conjugados 5-S-GSH-DA (Figura 22G e H) e 5-S-NAC-DA (Figura 22K e L) provocaram um aumento da concentração de GSH, apenas para a concentração de 100 M. Apesar de para a concentração de 500 e 1000 M não ter sido possível quantificar a concentração de GSH, para as concentrações de 10 e de 100 M houve um decréscimo do conteúdo proteico, de uma forma dependente da concentração. No entanto, esse decréscimo apenas foi estatisticamente significativo no caso do conjugado 5-S-NAC-DA na concentração de 100 M. 75 76 Figura 22 – Níveis de GSH intracelular e conteúdo proteico das células SH-SY5Y, 24h após a exposição às concentrações de 10, 100, 500 e 1000 µM dos compostos. Os dados de concentração intracelular de GSH encontram-se normalizados de acordo com o conteúdo proteico. Os dados do conteúdo proteico são apresentados como percentagem do respectivo controlo, ao qual foi atribuído o valor de 100% (n=9 de 3 experiências independentes). As comparações entre grupos pelo teste de Student-Newman-Keuls foram efectuadas após o teste de Kruskal-Wallis. *p<0,05 controlo vs. composto; **p<0,01 controlo vs. composto. DA – dopamina, DOPAC – ácido 3,4-dihidroxifenilacético, L-DOPA – levodopa, 5-S-Cis-DA – 5-Scisteinildopamina, 5-S-GSH-DA – 5-S-glutationildopamina, 5-S-NAC-DA – 5-S-N-acetilcisteinildopamina. 77 1.3. Efeito do Pré-tratamento com NAC e BSO na Citotoxicidade da DA, LDOPA, DOPAC, 5-S-GSH-DA, 5-S-Cis-DA e 5-S-NAC-DA Tal como foi referido na secção da metodologia experimental, para os ensaios com os compostos BSO e NAC, escolheu-se a concentração de 500 M e o período de exposição de 24h para todos os compostos. A Figura 23 mostra a viabilidade celular, avaliada pelo teste da metabolização do MTT, e a morte celular, avaliada ensaio da libertação da LDH, aquando da incubação das células SH-SY5Y por um período de 24h. As células foram submetidas ao pré-tratamento com NAC (1 mM), BSO (25 M) ou ambos, 30 minutos antes da exposição aos compostos em estudo. A pré-incubação apenas com NAC, BSO ou ambos, não afecta per si a viabilidade celular, na concentração e tempos de exposição estudados. Verificou-se, em todos os compostos, que a pré-incubação das células com NAC, antes da exposição ao composto em teste, evitou em larga medida a morte celular. Verificou-se, ainda, que de uma forma geral a todos os compostos a pré-incubação com BSO promoveu uma diminuirção da viabilidade celular. No caso da incubação com a DA (Figura 23A e B), verificou-se que o pré-tratamento com NAC e NAC com BSO preveniu largamente a perda de viabilidade celular. O prétratamento apenas com BSO provocou um agrafamento significativo da morte celular relativamente à condição em que as células são apenas incubadas com a DA Para os compostos L-DOPA (Figura 23C e D) e DOPAC (Figura 23E e F) o prétratamento com NAC e NAC com BSO evitou largamente a morte celular de uma forma estisticamente significativa. Por outro lado, a pré-incubação com BSO potenciou a morte celular de uma forma estisticamente significativa. Para os compostos DA, L-DOPA e DOPAC, o pré-tratamento com NAC evitou na quase totalidade a citotoxicidade dos compostos. De igual forma, a pré-incubação com NAC juntamente BSO evitou na quase totalidade a citotoxicidade dos compostos. Relativamente ao conjugado 5-S-GSH-DA (Figura 23G e H) verificou-se que o prétratamento com NAC preveniu de uma forma estatisticamente significativa a neurotoxicidade em relação ao tratamento apenas com o conjugado. O pré-tratamento com BSO provocou um aumento bastante significativo da morte celular. Além disso, 84 1.5. Observação microscópica das células SH-SY5Y A observação microscópica das células SH-SY5Y após exposição aos compostos DA, LDOPA, DOPAC, 5-S-GSH-DA, 5-S-Cis-DA e 5-S-NAC (500 M) pelo período de 24h de exposição (Figura 25) demonstra uma clara evidência de morte celular, com algumas características apoptóticas: desintegração de dendrites, fragmentação do núcleo e encolhimento do citoplasma. O pré-tratamento com NAC previne em larga medida os efeitos citotóxicos a nível morfológico no caso de DA, L-DOPA, DOPAC, 5-S-GSH-DA e 5-S-Cis-DA mas não no caso dos compostos 5-S-NAC-DA. 85 Figura 25 – Fotografias das células SH-SY5Y obtidas no microscópio invertido de constraste de fase após 24h de exposição aos compostos na cencentração de 500 M (ampliação 400x), sem ou com pré-incubação com NAC (1mM). DA – dopamina, DOPAC – ácido 3,4-dihidroxifenilacético, L-DOPA – levodopa, NAC – Nacetilcisteína, 5-S-Cis-DA – 5-S-coisteinildopamina, 5-S-GSH-DA – 5-S-glutationildopamina, 5-S-NAC-DA – 5-S-N-acetilcisteinildopamina 86 2. Resultados das Experiências in vivo nos Ratos Sprague-Dawley 2.1. Morte celular provocada pelo conjugado 5-S-NAC-DA Ratos Sprague-Dawley de 7 dias de idade foram injectados a nível estriatal com 4,26 ng de 5-S-NAC-DA. Após 24h, verificou-se a morte celular causada pela administração do conjugado da DA através do uso do corante PI, tal como descrito na secção da metodologia. As células PI-positivas foram encontradas no lado ipsilateral (direito) do estriado nos ratos administrados com 5-S-NAC-DA mas não no lado contra-lateral (esquerdo), nem no estriado dos animais controlo, injectados apenas com PBS (Figura 26). Verificou-se que a quantidade de células marcadas com PI no estriado dos animais tratados com 5-S-NAC-DA é significativamente maior que nos animais tratados com PBS (Figura 27A). Além disso, quando analisadas 3 zonas diferentes do estriados verificou-se que em todas essas zonas, a quantidade de células marcadas com PI é significativamente maior nos animais tratados do que nos animais controlo (Figura 27B). Apesar de terem sido realizados cortes histológicos até à área cerebral da SN, não se encontraram nessa área células PI-positivas. Para verificar se eram as células neuronais as mais afectadas pela toxicidade do composto, as secções previamente marcadas com PI foram submetidas a marcação imunocitoquímica com um anticorpo específico para o núcleo neuronal, NeuN. Verificouse uma forte co-localização entre os 2 marcadores, indicando que as células afectadas pela neurotoxicidade do composto são fundamentalmente neuronais (Figura 28). 87 Figura 26 - Marcação das secções do estriado com PI visualizada em fotografias de microscopia de fluorescência (ampliação 100x). As secções estriatais dos animais foram obtidas após injecção intra-estriatal com 5-S-NAC-DA ou apenas PBS. D – lado direito, ipsilateral; E – lado esquerdo, contralateral. 88 Figura 27 - Número de células PI-positvas nos animais controlo (n=5) e tratados com 5-S-NAC-DA (n=5) (A) e número de células PI-positivas em 3 diferentes àreas do estriado (A. B e C) dos animais controlo (n=5) e tratados com 5-S-NAC-DA (n=5) (B). As comparações entre grupos foram efectuadas pelo teste de MannWhitney. *p<0,05 animais controlo vs. animais tratados, teste de Mann-Whitney. CC – córtex cerebral, HC – hipocampo, ST – estriado. D – lado direito, ipsilateral; E – lado esquerdo, contralateral. Figura 28 - Co-localização da marcação com PI (vermelho) e NeuN (verde) visualizada em fotografias de microscopia de fluorescência (ampliação 100x). As secções estriatais dos animais foram obtidas após injecção intra-estriatal com 5-S-NAC-DA ou apenas PBS, no caso dos os animais controlo. 89 2.2. Expressão da caspase-3, p17, α-espectrina e PKCα no Estriado Para avaliar o tipo de morte neuronal após administração intra-estriatal do metabolito 5-SNAC-DA aos animais, verificou-se a expressão de caspase-3 (CPP32) não clivada e clivada (p17). No estriado dos animais tratados é maior a quantidade de caspase-3 do que nos animais controlo, apesar desta diferença não ser estatisticamente significativa. Não foi detectável a expressão de caspase-3 clivada nos dois tipos de tratamento (Figura 31A). Usou-se, ainda, como marcador especifico do dano neuronal, a clivagem da proteína αspectrina (ASP). A formação de fragmentos com 150/145 kDa de peso molecular daquela proteína é significativamente maior no estriado dos animais tratados com 5-S-NAC-DA do que nos animais controlo, com um fraco aumento da formação de fragmentos com 120 kDa. Verificou-se ainda uma diminuição da quantidade da subunidade α da proteína cinase C (PKCα) no estriado dos animais tratados com 5-S-NAC-DA em comparação com os animais tratados apenas com PBS, apesar de esta não ser estatisticamente significativa (Figura 31B). 90 Figura 29 - Expressão da caspase-3 (CPP32), caspase-3 clivada (p17) (A), de α-espectrina e de PKCα (B) no estriado dos animais controlo injectados com PBS (n=5) e animais tratados com 5-S-NAC-DA (n=5). As comparações entre grupos foram efectuadas pelo teste de Mann-Whitney (*p<0,05 animais controlo vs. tratados). * 91 CAPÍTULO III: DISCUSSÃO E CONCLUSÕES 92 93 DISCUSSÃO 1. Discussão dos Resultados das Experiências in vitro com as Células SHSY5Y Neste estudo foi avaliado o potencial neurotóxico da DA, do seu precursor L-DOPA, do seu metabolito DOPAC e dos seus conjugados 5-S-GSH-DA, 5-S-Cis-DA e 5-S-NAC-DA,, na linha neuronal dopaminérgica diferenciada SH-SY5Y derivada de um neuroblastoma humano. Este estudo é o primeiro a avaliar a neurotoxicidade de todos estes compostos em células humanas dopaminérgicas. Neste trabalho foi usado como factor de diferenciação da linha celular a incubação das células 6 dias com RA, de modo a aumentar o seu fenótipo dopaminérgico. Em estudos anteriores verificou-se que não há diferenças entre a expressão de DAT e TH em células diferenciadas com RA e não diferenciadas (272, 273, 329). Com outro protocolo de diferenciação, as células diferenciadas com RA/TPA exibem maior citotoxicidade e disfunção mitocondrial, como consequência do tratamento com MPTP, que poderá ser devido ao aumento da susceptibilidade das células diferenciadas deste modo, uma vez que expressam mais DAT e TH (mas menor VMAT) (273). Por outro lado, a diferenciação apenas com RA aumenta a expressão de Bcl-2 (proteína anti-apoptótica) e diminui a expressão de p53 (proteína pró-apoptótica) (330). O RA activa cascatas de sinalização que promovem a sobrevivência celular e reduzem a susceptibilidade a neurotóxicos (331). O RA é também usado com o objectivo de obter prorpiedades mais semelhantes com os neurónios maduros, como o crescimento de neurites (332). Demonstrou-se que todos os compostos estudados promovem neurotoxicidade de uma forma dependente da concentração e do tempo de exposição. Recorrendo aos ensaios de metabolização do MTT e de libertação da enzima LDH, verificou-se que os compostos que promovem maior toxicidade são os conjugados 5-S-GSH-DA e 5-S-NAC-DA, pois são aqueles que provocam maior citotoxicidade em concentrações e tempos menores. O composto 5-S-Cis-DA, revelou uma neurotoxicidade menor que os dois anteriores. Além disso, verificou-se que são aqueles que provocam uma diminuição mais acentuada do conteúdo proteico da cultura celular, chegando a valores não quantificáveis, pelo método usado, na concentração de 500 M às 24h de exposição. 100 e estando a enzima -GS inibida, a concentração de GSH poderá diminuir devido à conjugação da GSH com os compostos. Verificou-se que, aquando da exposição das células aos conjugados 5-S-GSH-DA e 5-SNAC-DA na concentração de 500 M pelo perído de 24h não foi possível a quantificação da GSH intracelular. Isto deveu-se á elevada citotoxicidade destes compostos nestas condições. No entanto, a pré-incubação com NAC, antes da exposição à 5-S-GSH-DA promoveu o aumento da GSH, inclusivamente sendo maior que em relação às células incubadas só com NAC. Neste caso, a NAC ao exercer a sua função antioxidante e dadora de cisteína, está a exercer uma função neuroprotectora contra a toxicidade do conjugado, evitando parcialmente a morte celular, tornando-se possível quantificar o conteúdo de GSH intracelular. Verificou-se que a concentração de GSH quando as células são tratadas com 5-S-Cis-DA ou com NAC e 5-S-Cis-DA não é estatisticamente diferente. Sabendo-se que o conjugado 5-S-Cis-DA é um estímulo à produção de GSH, a NAC pode estar a ser dador de cisteína e exercer a função de antioxidante e, portanto, a concentração de GSH não varia com o pré-tratamento com NAC. Verificou-se que quando as células são tratadas com 5-S-NAC-DA, apesar de préincubadas com NAC, BSO, ou ambas, não foi possível fazer quanrtifcar as proteínas retiradas do poço de cultura. A concentração de 500 M deste composto é muito citotóxica, pelo que quase a quase totalidade das células presentes na cultura celular morreram neste período de exposição. Mesmo na presença da NAC, como antioxidante e dador de cisteína, o stresse oxidativo gerado parece ser de tal ordem que a neuroprotecção conferida por este composto neste período foi insuficiente. É importante referir que o meio de cultivo usado na cultura das células SH-SY5Y, principalmente após incubação com os compostos em estudo, apresenta uma cor preta/acastanhada, mais escura após incubação com os conjugados da DA Esta coloração corresponde à formação de polímeros do tipo melanina, derivados da autooxidação dos compostos usados, nomeadamente da DA e dos seus conjugados (164). Noutros estudos publicados verifica-se que o meio de cultura escurece aquando da incubação das células em cultura com α-MeDA (α-metildopamina) e N-Me-α-MeDA (Nmetil-α-metildopamina), em consequência da sua oxidação aos correspondentes aminocromos e conjugação com GSH, é acompanhada da diminuição da sua concentração no meio. Os aminocromos podem ainda ser oxidados e conduzir à formação de um polímero do tipo melanina (346, 347). O mesmo acontece com os 101 conjugados de DA, podendo sofrer oxidação, ciclização e formarem-se aminocromos (147, 207, 222). 2. Discussão dos Resultados das Experiências in vivo com os Ratos Sprague-Dawley Para os estudos in vivo com os ratos Sprague-Dawley de 7 dias, foi seleccionado o conjugado 5-S-NAC-DA pois foi, entre todos os compostos estudados, aquele que provocou maior citotoxicidade in vitro nas células SH-SY5Y. Além disso, dado que este composto resulta da metabolização terminal via àcidos mercapturicos, a partir de outros conjugados com GSH. Importante é também referir que não existem estudos que tenham verificado a neurotoxidade deste conjugado em animais. Como já foi referido na introdução, os ratos jovens podem ser usados como modelo de estudo da DP, nomeadamente, no estudo de factores que poderão aumentar a susceptibilidade para o desenvolvimento da doença. Sabendo-se que os conjugados da DA se formam nos neurónios dopaminérgicos os animais jovens podem ser usados como modelo para o estudo da susceptibilidade que estes compostos conferem. A utilização de animais jovens revela-se ainda útil como confirmação dos resultados obtidos in vitro. Por exemplo, num estudo comprovou-se que a L-DOPA, que provocou neurotoxicidade in vitro, mas não provou ser neurotóxica quando injectada em animais de 2 dias, mesmo quando injectados previamente com BSO (322). Neste caso foi usada a injecção intra-estriatal como método de exposição ao 5-S-NACDA, pois desta forma é induzida uma lesão não completa das células nigrais, equivalente à DP na fase sintomática e inicial (298). O PI é um corante usado em estudos in vivo e in vitro para marcar células necróticas pois é incapaz de atravessar membranas não danificadas (312). Verificou-se neste trabalho que, quando o composto 5-S-NAC-DA é injectado no estriado do cérebro de rato, há morte celular em quantidade significativa. As células afectadas provaram ser fundamentalmente neurónios devido à co-localização de células PI-positivas e NeuNpositivas, uma vez que o NeuN é um anticorpo específico usado para marcação do núcleo neuronal (348). Não foram encontradas células PI-positivas na SN, provavelmente devido à não difusão do conjugado até esta zona do cérebro. A caspase-3 (CPP32 ou apopaína) é uma proteína apóptica. A presença de um sinal apoptótico provoca a clivagem desta proteína (32 kDa) para na sua forma activa, que 102 consiste em subunidades de 17 kDa (ASP175) e 12 kDa, promover a clivagem e activação de outras proteínas apoptóticas (349). Verificou-se neste estudo que o composto 5-S-NAC-DA leva ao um aumento, não estisticamente significativo, da expressão da CPP32, sem o correspondente aumento da p17, ou seja, apesar de haver morte celular esta parece ser independente da activação da capase-3. A proteína α-especctrina (ASP, também chamada α-fodrina) é uma componente estrutural da membrana celular dos neurónios, abundante nos axónios e terminais présinápticos, e pensa-se estar envolvida na libertação de neurotransmissores (350). É ainda um substrato de proteínas envolvidas da necrose, como as calpaínas, e na apoptose como a caspase-3 (351). A ASP é clivada pela calpaína em 2 fragmentos, SBDP150 (150 kDa) e SBDP145 (145 kDa), e é clivada pela caspase-3 em 2 fragmentos, SBDP150 e SBDP120 (120 kDa), sendo que este último é maioritário (351, 352). Assim, é possível distinguir uma situação de morte necrótica da apoptótica através do perfil de degradação da ASP. Verificou-se a presença destes fragmentos em modelos de dano neuronal apoptótico e necrótico in vitro (353) e in vivo em ratos (312) e em estudos de dano traumático neuronal em humanos (354, 355). Verificou-se neste estudo um aumento da detecção dos fragmentos de 145/150 kDa da ASP, sem expressão de fragmentos de tamanho 120 kDa, indicando a presença de morte neuronal do tipo necrótica, quando os animais são injectados com 5-S-NAC-DA. A detecção destes fragmentos nos animais controlo (injectados com PBS) pode dever-se ao traumatismo provocado pela punção da agulha no estriado, algo inerente ao método. A diferença entre os animais controlo e tratados é significativa, podendo admitir-se que o 5-S-NAC-DA promove morte neuronal essencialmente por necrose. A família das proteínas cinases C (PKC) está envolvida num grande número de processos celulares como o crecimento, diferenciação e secreção de citocinas (356). A isoforma α (PKCα, 82 kDa) é um substrato da calpaína (357), que numa situação em que há activação desta enzima, como na necrose, há degradação de PKCα. Verificou-se uma diminuição da expressão da PKCα nos animais tratados, apesar de não ser estatisticamente significativa. Isto mostra uma tendência evidente para a indução de necrose pelo composto 5-S-NAC-DA, conjuntamente com os dados obtidos com a ASP, ou seja, uma activação das enzimas calpaínas, que por um lado degradam a ASP nos seus fragmentos 145/150 kDA e também degradam a PKCα. Verificou-se que durante o desenvolvimento do cérebro imaturo a apoptose neuronal é um mecanismo que controla o número de neurónios e as conecções neuronais. Pensa-se que o cérebro imaturo protege-se que qualquer evento traumático desta forma, activando 103 a via apoptótica dependente das caspases (319). Este facto dá mais relevância à morte celular por necrose causada pela exposição dos animais ao conjugado, uma vez que os dados obtidos evidenciam que, apesar de haver algum aumento de actividade apoptótica (pelo aumento da actividade das caspases-3), verificou-se uma tendência evidente para a morte celular por necrose. Assim sendo, o processo promovido neurotóxico promovido pelo composto não se encontra relacionado com a activação de cascatas de morte celular decorrentes do normal processo de maturação cerebral. Os animais foram sacrificados 24h após injecção intra-estriatal de 5-S-NAC-DA porque, apesar de in vitro já se obter diminuição de viabilidade celular a concentrações mais baixas que para outros compostos em estudo, estudos anteriores permitiram verificar que a injecção intra-nigral de 6-OHDA em ratos Sprague-Dawley provocou a morte celular neuronal ao fim de 12h (358). Um outro estudo permitiu verificar que a injecção de doses subcrónicas de MPTP em ratinhos provocou a activação de caspases ao fim de 24-48h (359). Até à data, não foram encontrados outros estudos que permitam comparar os resultados obtidos in vivo com o conjugado 5-S-NAC-DA, após injecção intra-estriatal ou outro meio de administração. Este estudo revela-se de maior importância para, pela primeira vez, demonstrar que este composto causa neurotoxicidade in vivo quando ratos SpragueDawley são submetidos a injecção intra-estriatal. Os estudos in vivo em ratos Sprague-Dawley permitiram confirmar in vivo a neurotoxicidade do conjugado da DA 5-S-NAC-DA, obtida in vitro na linha celular de neurónios dopaminérgicos humanos SH-SY5Y. Além disso, este estudo em ratos confirma o perfil de morte celular predominantemente necrótica que este composto promove. Ao ser acumulado no cérebro humano, a partir do momento em que a DA esteja a ser produzida e metabolizada, quer enzimaticamente quer pela conjugação com a GSH, a formação deste conjugado pode conferir um factor de susceptibilidade importante para o futuro desenvolvimento da DP. Além disso, num indivíduo que possua outros tipos de factores de susceptibilidade, como alterações genéticas relevantes ou exposição crónica a alguns dos compostos neurotóxicos, como os pesticidas rotenona ou paraquato, pode encontrar no 5-S-NAC um factor de susceptibilidade adicinal para o desenvolvimento da doença. 104 CONCLUSÕES A doença de Parkinson é a segunda doença neurodegenerativa mais frequente. È caracterizada pela neurodegeneração específica da substância negra acompanhada pela diminuição significativa de dopamina em todos os componentes dos gânglios basais e pela presença de corpos de Lewi. A doença é de etiologia desconhecida mas pensa-se que a presença de dopamina nos neurónios dopaminérgicos poderá ser um importante factor para a neurodegeneração.Os conjugados de dopamina, cuja existência e formação se comprovou no cérebro de humanos poderão ser mais reactivos que a prórpria dopamina, contribuindo para a neurodegeneração dopaminérgica e o desenvolvimento da doença de Parkinson. Este trabalho permitiu concluir que:  Todos os compostos estudados foram neurotóxicos nas células dopaminérgicas SH-SY5Y de uma forma dependente do aumento do tempo de exposição e do aumento da concentração;  As células SH-SY5Y aumentaram a concentração de GSH intracelular como resposta ao insulto neurotóxico promovido pelos compostos estudados;  O pré-tratamento com NAC conferiu neuroprotecção significativa contra a toxicidade dos compostos, indicando que in vtiro o mecanismo de toxicidade destes inclui o stresse oxidativo;  O pré-tratamento com BSO, um inibidor da enzima limitante da síntese da GSH, aumentou a toxicidade dos compostos estudados nas células SH-SY5Y, indicando que a GSH é um mecanismo de neuroprotecção importante contra o insulto destes compostos;  O composto 5-S-NAC-DA, que revelou elevada neurotoxicidade in vitro, provocou neurotoxicidade in vivo promovendo a morte celular por necrose, quando injectado no estriado de ratos Sprague-Dawley  O mecanismo de toxicidade dos conjugados da DA, quer in vivo quer in vitro, dependeu largamente do stresse oxidativo que estes compostos promovem. 105 REFERÊNCIAS BIBLIOGRÁFICAS 106 107 REFERÊNCIAS BIBLIOGRÁFICAS 1. 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