Es udo da Glicop o eína-P em lin óci os T
humanos e em plasma de a os Cha les Ri e s
usando a TX5 como po encial indu o da sua
exp essão e ac i idade
Tese do 2º ciclo do Mes ado em Toxicologia Analí ica, Clínica e Fo ense
T abalho ealizado sob a o ien ação do P o esso Dou o Fe nando Remião e coo ien ação
da Dou o a Filipa Pon e e da Dou o a Rena a Sil a
Ana Filipa Pe ei a Fe ei a
Se emb o 2014
2014|Ana Filipa Fe ei a
2014|Ana Filipa Fe ei a
iii
É au o izada a ep odução in eg al des a disse ação apenas pa a e ei os de
in es igação, median e decla ação esc i a do in e essado, que al se comp ome e.
2014| Ana Filipa Fe ei a
i
A disse ação ap esen ada isa a ob enção do g au de mes e endo sido esc i a
segundo o an igo aco do o og á ico.
2014|Ana Filipa Fe ei a
“Tal ez não enha conseguido aze o melho , mas lu ei pa a que o melho osse ei o.
Não sou o que de e ia se , mas G aças a Deus, não sou o que e a an es”.
Ma hin Lu he King

2014| Ana Filipa Fe ei a
i
2014|Ana Filipa Fe ei a
ii
AGRADECIMENTOS
A pa e expe imen al des e abalho expe imen al oi ealizada no labo a ó io de
oxicologia da Faculdade de Fa mácia da Uni e sidade do Po o. A conclusão do mesmo
abalho, só oi possí el, g aças ao apoio e acompanhamen o que i e ao longo des a e apa.
Que o ag adece a odos po udo.
• À P o esso a Dou o a Ma ia de Lou des Bas os, pela magní ica o ien ação de odo o
cu so de Mes ado em Toxicologia Analí ica, Clínica e Fo ense;
• Ao P o esso Dou o Fe nando Remião, o ien ado do abalho ealizado no âmbi o
des a ese, pela in ini a p eocupação e incen i o ao longo des a ase;
• Em especial à Dou o a Ana Filipa Pon e pelo seu g ande apoio, en usiasmo e paciência.
Ag adeço odo o seu es o ço e dedicação em ensina udo o que ap endi sob e as
écnicas de isolamen o de lin óci os, ci ome ia de luxo e HPLC. Ag adeço ambém
pela ajuda na pa e esc i a des a ese. «Se não ossem as uas mãos segu a em as
minhas nos momen os mais di íceis, não e ia chegado aqui». Desejo odo o sucesso
den o da á ea da in es igação e desejo as maio es elicidades na sua ida pessoal;
• À Dou o a Rena a Sil a, pelo eno me apoio em odas as ases des e abalho. Mesmo
com o «pequeno e» a da pon apés, oi inc í el a sua dedicação Mui o ob igado pela
ajuda, pela in ei a disponibilidade e incen i o em odos os momen os, do undo do
co ação pois sei que nem semp e oi ácil! Felicidades pa a a no amen e u u a mãe.
Desejo-lhe mui o sucesso;
• À mes e Ma iline Mon ei o, mesmo es ando longe, oi quem me ensinou a da os
p imei os passos no Labo a ó io de oxicologia da Faculdade de Fa mácia da
Uni e sidade do Po o;
• Ao Dou o Daniel Sil a po oda a ajuda p es ada no labo a ó io de oxicologia.
Ob igado pelo g ande apoio. Espe o que o mundo seja jus o e aga udo de bom pa a a
ida p o issional e pessoal;
• À Dou o a Te esa Bal aza pela sua disponibilidade em ajuda em pa e do meu
abalho expe imen al;
• Ao P o esso Dou o Joaquim Mon ei o pela sua dedicação aos alunos e ex alunos.
Ob igado pelos seus conselhos;
• À D .ª Bá ba a e ao labo a ó io de análises clínicas da Faculdade de Fa mácia da
Uni e sidade do Po o. Semp e mui o p es á eis, ag adeço po oda a disponibilidade
em ealiza colhei as das amos as de sangue dos olun á ios;
• Ao labo a ó io de Bioquímica e de Análises Clínicas da Faculdade de Fa mácia da
Uni e sidade do Po o pela ajuda p es ada. Ag adeço em especial ao Dou o . João;
2014| Ana Filipa Fe ei a
iii
• Ao Ins i u o Nacional de Engenha ia Biomédica (INEB) po odo o apoio e ajuda,
p incipalmen e à Dou o a And eia e Dou o a Inês;
• Ag adeço à Técnica do Labo a ó io de Toxicologia, à Cá ia, pela paciência, apoio em
odo o meu abalho, especialmen e com o «nosso» HPLC! Ob igado pela
disponibilidade du an e odo o meu pe cu so nes e labo a ó io;
• Ob igado a odos os amigos do mes ado, pelo apoio e p eocupação du an e es a ase,
em especial à Ma iana, So ia, A manda, Ma ia João, Débo a e à Ma ga ida. Um dia
ainda amos aze aquela iagem…;
• Ag adeço ambém aos es an es colegas de abalho e es udan es de Dou o amen o e
Pós Dou o amen o po me e em ajudado a ul apassa as di iculdades em especial à
Má cia, Diana e Ma ia João;
• A odo o pessoal do depa amen o de Toxicologia da Faculdade de Fa mácia da
Uni e sidade do Po o, à S ª Engª Ma ia Elisa Soa es, Dou o a Helena Ca mo, Dou o a
Sónia F aga, Dou o a Paula Guedes, Dou o a Ve a Cos a e Dou o João Capela e a
odos os es an es colabo ado es des e mes ado;
• Um since o ob igado a odos os dado es de sangue pois sem eles o meu abalho não
se ia possí el;
• Ag adeço do undo do meu co ação ao meu i mão, a ó e aos es an es amilia es, pelo
incen i o e ca inho. Sem eles se ia mais di ícil chega a é aqui;
• Ob igado Helena, João, Ma lene, Joana, Dina, Sa a Félix, Inês Fe ei a, Ca a ina,
Guilhe me e Juliana, que semp e me ize am so i nos melho es e pio es momen os.
Um dia ou compensa as minhas ausências;
• Ag adeço a odos os memb os da Banda Ma cial de A noso que acompanha am-me
desde semp e e nes a ase não oi di e en e. Ob igado pela ossa comp eensão ao longo
des es anos;
• Po im, ag adeço odo o ca inho, apoio, paciência e dedicação ao José Má io que nunca
me deixa desis i . Ob igado!
Um since o ob igado a odos!
2014|Ana Filipa Fe ei a
ix
RESUMO
A glicop o eína-P (P-gp) é uma p o eína de anspo e ansmemb ana com 170
kDa pe encen e à amília adenosina i os a o binding casse e (ABC). Es a p o eína de
anspo e oi inicialmen e de ec ada em 1976 po Ling e al. (1976) em células de o á io
de hams e chinês esis en es à colchicina e oi ca ac e izada pela exp essão do gene de
esis ência a mul i- á macos 1 (MDR1) humano. Inicialmen e a sua sob e exp essão oi
associada a enómenos de esis ência em células cance ígenas, uma ez que impedia a
en ada dos á macos pa a as células de ido ao seu mecanismo de e luxo. Ac ualmen e,
sabe-se que es á p esen e an o em células cance ígenas como células no mais. Funciona
como uma ba ei a isiológica, esponsá el pelo e luxo de inúme os compos os,
expo ando xenobió icos de células de in es ino, ígado, ins, duc os panc eá icos e
bilia es, úbulos p oximais enais, placen a, es ículos, ba ei a hema oence álica (BHE)
bem como de lin óci os.
Em conclusão pode-se a i ma que a P-gp desempenha um papel mui o impo an e
na p o ecção do o ganismo e i ando a acumulação in acelula de xenobió icos. Po an o,
es udos de indu o es/ac i ado es des a bomba podem se ú eis pa a comba e enómenos
de oxicidade.
Es e abalho e e como objec i o o es udo de um indu o /ac i ado do g upo das
ioxan onas (TXs) denominado po TX5. Foi possí el e i ica que es e de i ado é capaz de
aumen a a ac i idade e induzi a exp essão da p o eína de anspo e e, des a o ma,
pode á i a se um an ído o u ilizado em si uações de in oxicações po subs a os da P-
gp.
No p esen e abalho oi possí el:
1. Es uda o mecanismo de indução e ac i ação da P-gp em lin óci os T, após exposição à
TX5 nas concen ações de 20 µM e 80 µM po um pe íodo de 24 ho as, em es u a a
37ºC e 5% CO2:
1.1 A exp essão e a ac i idade da P-gp o am a aliadas po ci ome ia de luxo, usando
um an ico po monoclonal especí ico an i-P-gp, o an ico po UIC2 conjugado com
iso iociana o de luo esceína (FITC), e a odamina 123 (RHO 123) (5 µM) como
subs a o luo escen e des a bomba de e luxo, espec i amen e;
2014| Ana Filipa Fe ei a
x i
3.2.4 Ensaio de iabilidade com MTT ............................................................................. 47
3.2.5 Análise es a ís ica ................................................................................................... 48
3.2.6 Es udo da exp essão e ac i idade da glicop o eína-P ............................................ 49
3.2.7 Es udo da exp essão ............................................................................................... 50
3.2.8 Es udo ac i idade ................................................................................................... 50
3.2.9 Es udo da ac i ação ............................................................................................... 51
3.2.10 De e minação da luo escência po ci ome ia de luxo ...................................... 52
3.2.11 Análise es a ís ica ................................................................................................. 54
3.3 Es udo in i o com a os Cha les Ri e ................................................................... 54
3.3.1 Análise ins umen al e es a ís ica .......................................................................... 56
3.4 Validação do mé odo de análise e quan i icação de TX5 em HPLC ......................... 57
3.4.1 P epa ação dos pad ões de TX5 ............................................................................. 57
3.4.2 Condições ins umen ais e c oma og á icas .......................................................... 58
3.4.3 Validação do mé odo .............................................................................................. 58
3.4.4 Análise es a ís ica................................................................................................... 61
4 ESTUDO DA EXPRESSÃO E ACTIVIDADE DA GLICOPROTEÍNA-P ...................... 65
4.1 Ensaios in i o com lin óci os T ............................................................................... 65
4.1.1 Es udo da iabilidade celula com o MTT .............................................................. 65
4.1.2 Adap ação das écnicas de de e minação da exp essão e ac i idade da glicop o eína-P
– modi icação do mé odo ................................................................................................ 67
4.1.3 Es udo da exp essão e ac i idade po ci ome ia de luxo ..................................... 68
4.1.4 Exp essão da glicop o eína-P em células CD45+ e CD3+ expos as à TX5 du an e 24 h
70
4.1.5 Exp essão da P-gp em células em P1 expos as ao TX5 du an e 24 h ...................... 71
4.1.6 Ac i idade da glicop o eína-P em células CD45+ e CD3 +expos as ao TX5 du an e 24
h 73
4.1.7 Ac i idade da glicop o eína-P em células em P1 expos as ao TX5 du an e 24 h ... 75
4.1.8 Ac i ação da glicop o eína-P em células CD45+ e CD3 +expos as ao TX5 du an e os
60 minu os na ase de e luxo da Rhodamina 123 ........................................................... 76

2014|Ana Filipa Fe ei a
x ii
4.1.9 Ac i ação da glicop o eína-P em células em P1 expos as ao TX5 du an e os 60
minu os na ase de e luxo da Rhodamina 123 ................................................................ 78
4.2 Es udo in i o com a os Cha les Ri e . De e minação da ac i idade da glicop o eína-
P em após adminis ação do indu o TX5 ...................................................................... 81
4.3 Validação do mé odo de quan i icação em HPLC .................................................... 83
4.3.1 Linea idade ............................................................................................................ 83
4.3.2 P ecisão in e -dia e exac idão do mé odo .............................................................. 86
4.3.3 P ecisão in a-dia do equipamen o ....................................................................... 88
4.3.4 P ecisão in a-dia do mé odo .............................................................................. 89
4.3.5 Es abilidade do TX5 após p ocessamen o da amos a .......................................... 90
4.3.6 Recupe ação da TX 5 ............................................................................................. 92
4.3.7 Limi e de de ecção e limi e de quan i icação ......................................................... 94
5. CONCLUSÕES ............................................................................................................ 99
6 REFERÊNCIAS BIBLIOGRÁFICAS .......................................................................... 103
2014| Ana Filipa Fe ei a
x iii
2014|Ana Filipa Fe ei a
xix
ÍNDICE DE FIGURAS
FIGURA 1:REPRESENTAÇÃO DE UM MODELO PROPOSTO DE TRANSPORTE ATRAVÉS DA
GLICOPROTEÍNA-P. (A) O SUBSTRATO (VERMELHO) DIVIDE-SE NA BICAMADA APICAL DAS
CÉLULAS ENTRANDO PARA O FOLHETO INTERNO POR LIGAÇÃO À PROTEÍNA QUE SE
ENCONTRA LIVRE (TMD). OS RESÍDUOS NO LOCAL DE OS RESÍDUOS NO LOCAL DE LIGAÇÃO
(ESFERAS AZUIS) INTERAGEM COM O SUBSTRATO. (B) O ATP (AMARELO) LIGA-SE AO
DOMÍNIO DE LIGAÇÃO AO NUCLEÓTIDO (NBD) CAUSANDO ALTERAÇÃO DE CONFORMAÇÃO E
O SUBSTRATO PASSA PARA O LOCAL EXTRACELULAR. FIGURA ADAPTADA (ALLER, YU ET AL.
2009). ............................................................................................................................. 4
FIGURA 2: REPRESENTAÇÃO DA ESTRUTURA TÍPICA DA GLICOPROTEÍNA-P PRESENTE NA
BICAMADA LIPÍDICA. A PROTEÍNA CONTÉM DOIS DOMÍNIOS TRANSMEMBRANARES (TMD) E
DOIS DOMÍNIOS DE LIGAÇÃO A NUCLEÓTIDOS (NBD). FIGURA ADAPTADA (CHOUDHURI AND
KLAASSEN 2006). ............................................................................................................ 6
FIGURA 3: O DOMÍNIO NBD DOS TRANSPORTADORES ABC CONTEM DOIS MOTIVOS: WALKER A
E WALKER B. ESTES SÃO CONSERVADOS EM TODOS OS TRANSPORTADORES DESTA FAMÍLIA.
CADA TRANSPORTADOR TEM A SUA PRÓPRIA ASSINATURA, MOTIVO C, ONDE ESTÁ A
SEQUÊNCIA DE AMINOÁCIDOS QUE O CARACTERIZA. FIGURA ADAPTADA (CHOUDHURI AND
KLAASSEN 2006). ............................................................................................................ 7
FIGURA 4: PROTEÍNA PERMEÁVEL (P-GP) EXPRESSA NA MEMBRANA APICAL NAS CÉLULAS
EPITELIAIS INTESTINAIS, NA MEMBRANA DOS CANALÍCULOS DOS HEPATÓCITOS HUMANOS E
NA MEMBRANA DOS TÚBULOS PROXIMAIS RENAIS A, B E C RESPECTIVAMENTE. FIGURA
ADAPTADA (WESSLER, GRIP ET AL. 2013). ........................................................................ 8
FIGURA 5: LOCALIZAÇÃO DA GLICOPROTEÍNA-P NA MEMBRANA APICAL EM CÉLULAS
ENDOTELIAIS DA BARREIRA HEMATOENCEFÁLICA. ESTA LOCALIZAÇÃO PERMITE O
TRANSPORTE DE XENOBIÓTICOS PARA O SANGUE. FIGURA ADAPTADA (RAO, DAHLHEIMER
ET AL. 1999) ..................................................................................................................... 9
FIGURA 6 REPRESENTAÇÃO DOS MODELOS PROPOSTOS DE TRANSPORTE PELA GLICOPROTEÍNA-
P. A MODELO CLÁSSICO OU PORO. DE ACORDO COM ESTE MODELO, A P-GP ENCONTRA O
XENOBIÓTICO NO FOLHETO DA BICAMADA LIPÍDICA E EXPULSA-OS PARA FORA DO FOLHETO
CONTRA O GRADIENTE DE CONCENTRAÇÃO. ESTE MODELO É BASEADO NA IDEIA DE QUE O
SUBSTRATO TEM ACESSO AO LOCAL DE LIGAÇÃO DE TMD PELA BICAMADA LIPÍDICA DEPOIS
DE INTERAGIR COM A MESMA MEMBRANA. B MODELO DE ASPIRAÇÃO HIDROFÓBICA (HVC)
QUE PERMITE À P-GP EXPULSAR OS SEUS SUBSTRATOS. DE ACORDO COM ESTE MODELO, OS
SUBSTRATOS PODEM SER EXPULSOS TANTO DO ESPAÇO INTRACELULAR COMO DE DENTRO
DA BICAMADA LIPÍDICA DA MEMBRANA PLASMÁTICA, ATRAVÉS DO RECONHECIMENTO
DESTES COMO XENOBIÓTICOS. C MODELO FLIPPASE COM MOVIMENTO FLIP-FLOP COM A
2014| Ana Filipa Fe ei a
xx
BICAMADA LIPÍDICA. A MUDANÇA DE CONFORMAÇÃO FAZ COM QUE A ENTRADA DO
SUBSTRATO NÃO OCORRA. FIGURA ADAPTADA (CHOUDHURI AND KLAASSEN 2006). ........ 12
FIGURA 7: REPRESENTAÇÃO DO MECANISMO DE INTERACÇÃO ENTRE A GLICOPROTEÍNA-P E O
CITOCROMO P450 (CYP3A4) NOS ENTERÓCITOS. FIGURA ADAPTADA DE FROMET AL.
(2003). .......................................................................................................................... 17
FIGURA 8: MECANISMO DE INIBIÇÃO DA GLICOPROTEÍNA-P POR UM INIBIDOR COMPETITIVO
(ESQUERDA) E POR UM NÃO COMPETITIVO (DIREITA). FIGURA ADAPTADA (AMIN 2013) ... 23
FIGURA 9: REPRESENTAÇÃO ESQUEMÁTICA DE UM DOS MECANISMOS RESPONSÁVEIS PELO
AUMENTO DE EXPRESSÃO DA GLICOPROTEÍNA-P ATRAVÉS DE FÁRMACOS
ANTICANCERÍGENOS NA MEMBRANA PLASMÁTICA. ESTÍMULO DIRECTO DA TRANSCRIÇÃO DA
MARN DE P-GP POR ALTERAÇÃO DA TRANSLOCAÇÃO NUCLEAR DE VÁRIOS FACTORES
TRANSCRIPCIONAIS. OCORRE MODULAÇÃO DE PROCESSO EPIGENÉTICOS ONDE SE INCLUEM
A METILAÇÃO DO ADN E A ACETILAÇÃO DAS HISTONAS, QUE AFECTAM A ACESSIBILIDADE DE
TODOS OS FACTORES TRANSCRIPCIONAIS, PROMOVENDO A REGIÃO DETERMINANTE DE
SÍNTESE DE MARN. CONSEQUENTEMENTE, ESTES FÁRMACOS TAMBÉM AFECTAM A POST-
TRANSCRIÇÃO ESPECIALMENTEDE UMA PROTEÍNA CUJA FUNÇÃO É FAVORECER A LIGAÇÃO
ENTRE AS MEMBRANAS PLASMÁTICAS E OS FILAMENTOS DE ACTINA,, COMO É O CASO DA
PROTEÍNA EZRINA/RADIXINA/MOESINA (ERM). FIGURA ADAPTADA (KOBORI, HARADA ET
AL. 2014). ..................................................................................................................... 28
FIGURA 10. : ESQUEMA REPRESENTATIVO DO MECANISMO PROPOSTO PARA O EFLUXO DO
PARAQUATO (PQ) PELA GLICOPROTEÍNA-P (P-GP). GR, RECEPTOR DE GLUCOCORTICÓIDES;
MDR, GENE DE RESISTÊNCIA A MULTI-FÁRMACOS; DEX, DEXAMETASONA. FIGURA
ADAPTADA (DINIS-OLIVEIRA, REMIÃO ET AL. 2006). ...................................................... 29
FIGURA 12: ESTRUTURA QUÍMICA DA TIOXANTONA TX5 (A) E DO PARAQUATO (PQ) (B). FIGURA
ADAPTADA (SILVA, SOUSA ET AL. 2014). .......................................................................... 32
FIGURA 12: IMAGEM REPRESENTATIVA DO MÉTODO DE SEPARAÇÃO DE CÉLULAS
MONONUCLEARES A PARTIR DO SANGUE E ATRAVÉS DO HISTOPAQUE® 1077. SÃO
FACILMENTE VISUALIZÁVEIS AS DIFERENTES CAMADAS DE CÉLULAS MONONUCLEARES, EM
QUE OS LINFÓCITOS REPRESENTAM A MAIORIA, O PLASMA APARECE NO TOPO E OS
ERITRÓCITOS ENCONTRAM-SE DEPOSITADOS NO FUNDO. IMAGEM RETIRADA (SIGMA-
ALDRICH 2003). ............................................................................................................ 43
FIGURA 13: TÉCNICA DE CONTAGEM CELULAR EM CÂMARA DE NEUBAUER. A. MÉTODO DE
COLOCAÇÃO DA SUSPENSÃO CELULAR PELOS BORDOS DA CÂMARA SOB A LAMELA. B.
ESQUEMAS DO INTERIOR DA CÂMARA, OS 4 QUADRADOS DOS CANTOS SÃO ONDE SE CONTAM
AS CÉLULAS. C. MÉTODO DE CONTAGEM DAS CÉLULAS. D. AS CÉLULAS EM QUE É POSSÍVEL
VER O NÚCLEO SÃO CONTADAS (CÉLULAS À ESQUERDA E NO CENTRO), CÉLULAS EM QUE NÃO
SE VISUALIZAM OS NÚCLEOS SÃO DESCARTÁVEIS. FIGURA ORIGINAL. ...............................44
2014|Ana Filipa Fe ei a
xxi
FIGURA 14: ESQUEMA DA EXPERIÊNCIA DE EXPOSIÇÃO DOS LINFÓCITOS À TX5 ....................... 46
FIGURA 15: IMAGEM DE EQUIPAMENTO BD ACCURITM C6 FLOW CYTOMETRY E DO SOFTWARE
UTILIZADO NESTE TRABALHO. FIGURA RETIRADA DE (BIOSCIENCES 2012). ...................... 53
FIGURA 16:GRÁFICO REPRESENTATIVO DA PERCENTAGEM DE VIABILIDADE CELULAR DOS
LINFÓCITOS T APÓS EXPOSIÇÃO COM TX5 NAS CONCENTRAÇÕES DE 20 µM E 80 µM.
COMPARAÇÃO ESTATÍSTICA ENTRE AS DIFERENTES CONCENTRAÇÕES FOI ESTIMADA USADO
O MÉTODO DE MÚLTIPLAS CONCENTRAÇÕES DE FRIEDMAN (ONE-WAY ANOVA ONRANKS),
SEGUIDO PELO POST-HOC TESTE DE DUNN. ..................................................................... 66
FIGURA 17: GRÁFICOS REPRESENTATIVOS DA SELECÇÃO DA POPULAÇÃO DE LINFÓCITOS T
VIÁVEIS: A-SEPARAÇÃO DA POPULAÇÃO DE LINFÓCITOS COM BASE NO SEU TAMANHO (FSC)
E GRANULOSIDADE (SSH), CIRCUNSCRITA POR UM POLÍGONO DELIMITADO A AZUL; B-
DENTRO DO GRUPO ANTERIOR, AS CÉLULAS SÃO DETECTADAS EM FL2 PARA DETERMINAR
CÉLULAS CD45+ (LEUCÓCITOS) C- DENTRO DAS CÉLULAS ANTERIORES, MARCARAM-SE
AQUELAS QUE SÃO POSITIVOS PARA O ANTICORPO CD3-APC (70,7%), OU SEJA, OS
LINFÓCITOS T DELIMITADOS PELA LINHA A VERMELHO (R2). A EXPRESSÃO DA P-GP É
DETECTADA EM FL1 ONDE SÃO SELECCIONADOS APENAS OS QUE EXPRESSAM P-GP NAS SUAS
MEMBRANAS, ATRAVÉS DO ANTICORPO ANTI-P-GP UIC2-FITC. ....................................... 69
FIGURA 18: GRÁFICO REPRESENTATIVO DA ANÁLISE DA EXPRESSÃO DE GLICOPROTEÍNA –P, NAS
CONCENTRAÇÕES DE 20 ΜM E 80 ΜM DE TX5, COM A MARCAÇÃO DE ANTICORPO ANTI P-
GP, UIC2 EM CÉLULAS CD3+ E CD45+. OS RESULTADOS SÃO EXPRESSOS COMO MÉDIA ±
DESVIO PADRÃO E SÃO PROVENIENTES DA ANÁLISE, EM DUPLICADO, DE CÉLULAS OBTIDAS
DE 10 DADORES (6 DO SEXO FEMININO E 4 DO SEXO MASCULINO). AS COMPARAÇÕES
ESTATÍSTICAS FORAM FEITAS UTILIZANDO O MÉTODO NÃO PARAMÉTRICO DE KRUSKAL-
WALLIS (ONE-WAY ANOVA ON RANKS), SEGUIDO PELO POST-HOC TESTE DE DUNN (* P
<0,05; **** P <0,0001 VERSUS CONTROLO; ## P <0,01 VERSUS TX5 20 ΜM). ................. 70
FIGURA 19 : GRÁFICO REPRESENTATIVO DA ANÁLISE DA EXPRESSÃO DE GLICOPROTEÍNA –P, NAS
CONCENTRAÇÕES DE 20 ΜM E 80 ΜM DE TX5, COM A MARCAÇÃO DE ANTICORPO ANTI P-
GP, UIC2 EM CÉLULAS SELECCIONADAS EM P1. OS RESULTADOS SÃO EXPRESSOS COMO
MÉDIA ± DESVIO PADRÃO E SÃO PROVENIENTES DA ANÁLISE, EM DUPLICADO, DE CÉLULAS
OBTIDAS DE 10 DADORES (6 DO SEXO FEMININO E 4 DO SEXO MASCULINO). AS
COMPARAÇÕES ESTATÍSTICAS FORAM FEITAS UTILIZANDO O MÉTODO NÃO PARAMÉTRICO DE
KRUSKAL-WALLIS (ONE-WAY ANOVA ON RANKS), SEGUIDO PELO POST-HOC TESTE DE
DUNN (** P <0,01; **** P <0,0001 VERSUS CONTROLO; # P <0,05 VERSUS TX5 20 ΜM).
...................................................................................................................................... 72
FIGURA 20: GRÁFICO REPRESENTATIVO DA ANÁLISE DA ACTIVIDADE DA GLICOPROTEÍNA–P,
NAS CONCENTRAÇÕES DE 20 ΜM E 80 ΜM DE TX5, COM A MARCAÇÃO DE ANTICORPOS
CD3 E CD45. OS RESULTADOS SÃO EXPRESSOS COMO MÉDIA ± DESVIO PADRÃO E SÃO

2014| Ana Filipa Fe ei a
xxii
PROVENIENTES DA ANÁLISE, EM DUPLICADO, DE CÉLULAS OBTIDAS DE 9 DADORES (5 DO
SEXO FEMININO E 4 DO SEXO MASCULINO). AS COMPARAÇÕES ESTATÍSTICAS FORAM FEITAS
UTILIZANDO O MÉTODO NÃO PARAMÉTRICO DE KRUSKAL-WALLIS (ONE-WAY ANOVA ON
RANKS), SEGUIDO PELO POST-HOC TESTE DE DUNN (** P <0,01; **** P <0,0001 VERSUS
CONTROLO). ................................................................................................................... 74
FIGURA 21: GRÁFICO REPRESENTATIVO DA ANÁLISE DA ACTIVIDADE DA GLICOPROTEÍNA –P, NAS
CONCENTRAÇÕES DE 20 ΜM E 80 ΜM DE TX5, SEM MARCAÇÃO DE ANTICORPOS. OS
RESULTADOS SÃO EXPRESSOS COMO MÉDIA ± DESVIO PADRÃO E SÃO PROVENIENTES DA
ANÁLISE, EM DUPLICADO, DE CÉLULAS OBTIDAS DE 20 DADORES (11 DO SEXO FEMININO E 9
DO SEXO MASCULINO). AS COMPARAÇÕES ESTATÍSTICAS FORAM FEITAS UTILIZANDO O
MÉTODO NÃO PARAMÉTRICO DE KRUSKAL-WALLIS (ONE-WAY ANOVA ON RANKS),
SEGUIDO PELO POST-HOC TESTE DE DUNN (**** P <0,0001 VERSUS CONTROLO) . ........... 75
FIGURA 22: GRÁFICO REPRESENTATIVO DA ANÁLISE DA ACTIVAÇÃO DE GLICOPROTEÍNA –P, NAS
CONCENTRAÇÕES DE 20 ΜM E 80 ΜM DE TX5, COM A MARCAÇÃO DE CD3 E CD45. OS
RESULTADOS SÃO EXPRESSOS COMO MÉDIA ± DESVIO PADRÃO E SÃO PROVENIENTES DA
ANÁLISE, EM DUPLICADO, DE CÉLULAS OBTIDAS DE 9 DADORES (5 DO SEXO FEMININO E 4
DO SEXO MASCULINO). AS COMPARAÇÕES ESTATÍSTICAS FORAM FEITAS UTILIZANDO O
MÉTODO NÃO PARAMÉTRICO DE KRUSKAL-WALLIS (ONE-WAY ANOVA ON RANKS),
SEGUIDO PELO POST-HOC TESTE DE DUNN (**** P <0,0001 VERSUS CONTROLO). ............ 77
FIGURA 23: GRÁFICO REPRESENTATIVO DA ANÁLISE DA ACTIVAÇÃO DE GLICOPROTEÍNA –P, NAS
CONCENTRAÇÕES DE 20 ΜM E 80 ΜM DE TX5, SEM MARCAÇÃO DE ANTICORPOS. OS
RESULTADOS SÃO EXPRESSOS COMO MÉDIA ± DESVIO PADRÃO E SÃO PROVENIENTES DA
ANÁLISE, EM DUPLICADO, DE CÉLULAS OBTIDAS DE 20 DADORES (11 DO SEXO FEMININO E 9
DO SEXO MASCULINO). AS COMPARAÇÕES ESTATÍSTICAS FORAM FEITAS UTILIZANDO O
MÉTODO NÃO PARAMÉTRICO DE KRUSKAL-WALLIS (ONE-WAY ANOVA ON RANKS),
SEGUIDO PELO POST-HOC TESTE DE DUNN (**** P <0,0001 VERSUS CONTROLO). ............ 78
FIGURA 24: GRÁFICO DO ESTUDO DA FARMACOCINÉTICA DA DIGOXINA EM ANIMAIS TRATADOS
COM DIGOXINA+TX5 (REPRESENTADA A PRETO) E ANIMAIS TRATADOS APENAS COM
DIGOXINA (CONTROLO) (REPRESENTADA A VERMELHO). CADA GRUPO É COMPOSTO POR
CINCO ANIMAIS. ANÁLISE ESTATÍSTICA FOI FEITA PELO TESTE T STUDENT E PARA CALCULAR
A ÁREA SOB A CURVA (AUC) USOU-SE O SOFTWARE WINNONLIN. .................................... 82
FIGURA 25: CROMATOGRAMA DA RESPECTIVA GAMA DE CONCENTRAÇÕES (0,5-150µM
INCLUINDO O BRANCO), APÓS OPTIMIZAÇÃO DE CONDIÇÕES CROMATOGRÁFICAS, COM
TEMPO DE RETENÇÃO DO ANALÍTO DE APROXIMADAMENTE 13 MINUTOS. A FRENTE DE
SOLVENTE APRESENTA TEMPO DE RETENÇÃO DE 4 MINUTOS, APROXIMADAMENTE. ......... 84
2014|Ana Filipa Fe ei a
xxiii
FIGURA 26: REPRESENTAÇÃO GRÁFICA DA RECTA DE CALIBRAÇÃO QUE RELACIONA A ÁREA DO
PICO (Y) EM MV/S COM A CONCENTRAÇÃO DE TX5 (X) EM µM RESULTADO NA EQUAÇÃO Y =
5,112*X + 0,7640 COM R2≥0,99. ................................................................................... 85
FIGURA 27: CROMATOGRAMA DAS RESPECTIVAS TRÊS CONCENTRAÇÕES SELECCIONADAS: UMA
BAIXA, 1 ΜM REPRESENTADA A VERMELHO, UMA MÉDIA, 10 ΜM REPRESENTADA A AZUL, E
UMA ALTA, 100 ΜM REPRESENTADA A VERDE, DE TX5. ................................................... 87
FIGURA 28: CROMATOGRAMA QUE REPRESENTA A CONCENTRAÇÃO PADRÃO DE 10 ΜM
INJECTADA NO MESMO DIA DA PREPARAÇÃO E APÓS 7 DIAS, ARMAZENADA A 4°C, AO ABRIGO
DA LUZ. NESTE CROMATOGRAMA, OS TEMPOS DE RETENÇÃO NÃO SÃO EXACTAMENTE
IGUAIS, UMA VEZ QUE FOI PREPARADA UMA NOVA FASE MÓVEL, FACTOR QUE LEVA A
LIGEIRAS ALTERAÇÕES NO TEMPO DE RETENÇÃO. ............................................................ 91
FIGURA 29: CROMATOGRAMA QUE REPRESENTA A CONCENTRAÇÃO PADRÃO DE 10 ΜM
INJECTADA QUANDO TX5 É ADICIONADO ANTES DA PRECIPITAÇÃO PROTEICA A1 (COR ROSA)
E A CONCENTRAÇÃO PADRÃO DE 10 ΜM INJECTADA QUANDO TX5 É ADICIONADO APÓS
PRECIPITAÇÃO PROTEICA COM METANOL A2 (COR VERDE). .............................................. 93
FIGURA 30: CROMATOGRAMA QUE REPRESENTA A CONCENTRAÇÃO PADRÃO DE 0 ΜM, BRANCO
(VERDE)E UMA CONCENTRAÇÃO ESCOLHIDA ALEATORIAMENTE (5 ΜM) (ROSA), SENDO
POSSÍVEL VER AS DIFERENÇAS DE SINAL DO ANALITO. ...................................................... 94
2014| Ana Filipa Fe ei a
xxi
ÍNDICE DE TABELAS
TABELA 1 EXEMPLOS DE GRUPOS DE SUBSTRATOS DA BOMBA DE EFLUXO. TABELA ADAPTADA
(AMBUDKAR, DEY ET AL. 1999, DANTZIG, DE ALWIS ET AL. 2003, DIETRICH, GEIER ET AL.
2003, FROMM 2004, HOFFMANN AND KROEMER 2004, MARZOLINI, PAUS ET AL. 2004,
CHOUDHURI AND KLAASSEN 2006). ............................................................................... 14
TABELA 2: EXEMPLO DE ALGUNS SUBSTRATOS COM CAPACIDADE PARA INDUZIR OU INIBIR A
GLICOPROTEÍNA-P (KIM 2002, PAL AND MITRA 2006). .................................................. 21
TABELA 3: GRUPO DE INIBIDORES DA GLICOPROTEÍNA-P USADOS COM FINALIDADES CLÍNICAS.
TABELA ADAPTADA (KIM 2002, VARMA, ASHOKRAJ ET AL. 2003, KUPPENS, WITTEVEEN ET
AL. 2007). ...................................................................................................................... 24
TABELA 4: SOLUÇÃO AI PREPARADA PARA OCORRER UMA ACUMULAÇÃO MÁXIMA DE SUBSTRATO.
...................................................................................................................................... 51
TABELA 5: SOLUÇÃO DE ACTIVAÇÃO PREPARADA COM O INDUTOR TX5 E RPMI. .................. 52
TABELA 6: COMPOSTOS COM CAPACIDADE DE EMITIREM COR, USADAS NOS VÁRIOS ENSAIOS COM
RESPECTIVOS CANAIS DE DETECÇÃO DE FLUORESCÊNCIA (BIOSCIENCES 2012). ............... 68
TABELA 7: VALORES MÉDIOS E VALORES COM 95% DE NÍVEL DE CONFIANÇA RESPECTIVAMENTE
À RECTA Y = 5,112*X + 0,7640 QUE APRESENTOU CORRELAÇÃO LINEAR DE R2≥0,99. ...... 85
TABELA 8: RESULTADOS OBTIDOS NA ANÁLISE DA PRECISÃO INTER-DIA E EXACTIDÃO DO
MÉTODO NAS CONCENTRAÇÕES DE 1, 10 E 100 ΜM. ......................................................... 87
TABELA 9: RESULTADOS OBTIDOS NA ANÁLISE DA PRECISÃO INTRA-DIA DO EQUIPAMENTO NAS
CONCENTRAÇÕES DE 1, 10 E 100 ΜM. ............................................................................. 88
TABELA 10: RESULTADOS OBTIDOS NA ANÁLISE DA PRECISÃO INTRA-DIA DO MÉTODO NAS
CONCENTRAÇÕES DE 1, 10 E 100 ΜM. ............................................................................. 89
TABELA 11: RESULTADOS OBTIDOS NA ANÁLISE DA ESTABILIDADE DO COMPOSTO NAS
CONCENTRAÇÕES DE 1, 10 E 100 ΜM. .............................................................................. 91
TABELA 12: RESULTADOS OBTIDOS NA ANÁLISE DA RECUPERAÇÃO DO COMPOSTO NAS
CONCENTRAÇÕES DE 1, 10 E 100 ΜM. .............................................................................. 93
2014|Ana Filipa Fe ei a
xx
ENQUADRAMENTO DO TRABALHO
A P-gp é uma p o eína de 170 kDa com ap oximadamen e 1280 aminoácidos,
pe encen e à amília adenosina i os a o binding casse e (ABC). A sua p incipal unção é
expo a xenobió icos do in e io das células, ac uando como uma ba ei a isiológica que
p o ege o o ganismo da oxicidade de di e en es agen es ex e nos (Ma, Tsunoda e al.
2010, Vilas-Boas, Sil a e al. 2013). Foi de ec ada em 1976 po Ling e al. (1976) endo sido
a p imei a bomba de e luxo da amília ABC a se descobe a, e mais a de oi isolada a
pa i de células esis en es de o á io de hams e s (Ambudka , Dey e al. 1999).
Inicialmen e, a exp essão des a p o eína es a a associada a si uações de esis ência a
mul i- á macos em células cance ígenas. No en an o, mais a de, e i icou-se que a P-gp
es a a p esen e an o em células cance ígenas como células no mais, especialmen e em
ó gãos de eliminação ou de abso ção (Choudhu i and Klaassen 2006).
A P-gp é uma p o eína de g ande in e esse clínico uma ez que se encon a exp essa
na maio ia dos ó gãos, ap esen a g ande a inidade pa a os seus subs a os, sendo capaz de
anspo a uma as a gama de compos os, mui os dos quais são compos os
a macologicamen e ac i os, ais como, inibido es das p o eáses do í us da
imunoinsu iciência humana (VIH), an aciclinas, alguns an ibió icos, imunossup esso es,
bloqueado es dos canais de cálcio, bloqueado es β-ad ené gicos, glicosídeos e ainda de
pes icidas como o pa aqua o (PQ) e do co an e odamina 123 (RHO 123) (Va ma,
Ashok aj e al. 2003).
Um dos ac o es ele an es na egulação de abso ção, dis ibuição, me abolismo e
exc eção (ADME) dos compos os es á associado à ac i idade dos anspo ado es de
memb ana, em especial a P-gp. A sua exp essão a ec a di ec amen e a biodisponibilidade
(BD) de um compos o que seja seu subs a o, esul ando numa a iá el a macociné ica
(Lin 2003, Zhang, Bachmeie e al. 2003). Es uda o mecanismo pa a induzi e aumen a
a ac i idade des a p o eína é de ex ema impo ância pa a a á ea da oxicologia clínica e
medicina, uma ez que pode e i a -se, ou aze -se diminui , as consequências de
in oxicações agudas po compos os óxicos ou a é al e a es a égias e apêu icas no
a amen o de alguns ipos de canc os. A P-gp pode se assim conside ada uma
impo an e ia de des oxi icação (Amin 2013, Sil a, Sousa e al. 2014).
No p esen e abalho es udado um conhecido indu o da P-gp, um de i ado de
xan ona, a aliando-se a sua capacidade em induzi a exp essão e aumen a a ac i idade
des a p o eína em dois modelos de es udo, in i o eco endo a lin óci os T humanos
isolados de di e en es dado es e in i o com a os Cha les Ri e . P e endeu-se ainda
alida um mé odo de análise e quan i icação des e compos o, po HPLC em ase e e sa,
com o objec i o de pos e io men e quan i ica TX5 em ma izes celula es.
2014| Ana Filipa Fe ei a
4
isolada a pa i de ecidos mamá ios com esis ência a an icance ígenos du an e
a amen o do canc o da mama (Leslie, Deeley e al. 2005, Choudhu i and Klaassen 2006,
Mo and Zhang 2012).
1.1 A glicop o eína-P
A P-gp oi a p imei a p o eína de anspo e ( igu a 1) a se de ec ada em 1976,
isolada p ima iamen e a pa i de células esis en es de o á io de hams e s chinesas. É
conside ada a p incipal bomba de e luxo, po es a p esen e na maio ia dos ecidos e po
econhece a maio ia dos compos os, sejam eles compos os a omá icos, linea es, sem
ca ga ou com ca ga, básicos ou ácidos (Go esman, H ycyna e al. 1995, an Aspe en, an
Tellingen e al. 1997, Ambudka , Dey e al. 1999, Sa kadi, Homolya e al. 2006). A P-gp é
uma p o eína de 170 kDa, localizada na egião do c omossoma 7 (7q21) com 1280
aminoácidos. Em humanos, a P-gp é codi icada po dois genes, MDR1/ABCB1 e
MDR3/ABCB4 (ou MDR2) de ido a uma duplicação de e en os adjacen es no
c omossoma 7 (Callen, Bake e al. 1987, Chin, So i e al. 1989). O enó ipo de esis ência
é associado à iso o ma MDR1, enquan o a iso o ma MDR3 unciona como uma
os a idilcolina anslocase, expo ando os olípidos pa a a bílis (Rue z and G os 1994,
Hennessy and Spie s 2007). Em oedo es o am encon ados 3 genes pa a a codi icação da
mesma bomba de e luxo: Abcb1a/Md 1a/md 3 e Abcb1b/Md 1b/md 1 que codi icam a P-
gp associada ao anspo e a a és da memb ana, e o gene md 2/Abcb4, que codi ica a
p o eína de anspo e os a idilcolina anslocase pa a a passagem de os olípidos pa a a
bílis (Sha om 2007). A sín ese da P-gp oco e no e ículo endoplasmá ico al como um
núcleo glicosilado, de peso molecula de 150 kDa, sendo que a po ção de hid a o de
ca bono é subsequen emen e modi icada no apa elho de Golgi, an es da expo ação pa a a
supe ície celula (Loo and Cla ke 1999).
Figu a 1:Rep esen ação de um modelo p opos o de anspo e
a a és da glicop o eína-P. (A) O subs a o ( e melho) di ide-
se na bicamada apical das células en ando pa a o olhe o
in e no po ligação à p o eína que se encon a li e (TMD). Os
esíduos no local de Os esíduos no local de ligação (es e as
azuis) in e agem com o subs a o. (B) O ATP (ama elo) liga-se
ao domínio de ligação ao nucleó ido (NBD) causando al e ação
de con o mação e o subs a o passa pa a o local ex acelula .
Figu a adap ada (Alle , Yu e al. 2009).

2014|Ana Filipa Fe ei a
5
O nome «p o eína de esis ência a mul i- á macos» (MDR), es á elacionado com o
ac o des a p o eína e sido de e ada inicialmen e em células cance ígenas. Conside a a-
se que o anspo ado e a al amen e exp esso nes as células pa a as p o ege dos
a amen os com quimio e ápicos. Con udo, mais a de e i icou-se que a P-gp es á
p esen e em células an o cance ígenas como no mais, especialmen e em células de ó gãos
de eliminação ou de abso ção (Choudhu i and Klaassen 2006, Vilas-Boas, Sil a e al.
2013). Encon a-se exp essa em á ias memb anas de ó gãos como no in es ino, ígado,
ins, duc os panc eá icos e bilia es, úbulos p oximais, na BHE e ainda em lin óci os.
Funciona como uma ba ei a isiológica, ac uando como um agen e de des oxi icação (Ma,
Tsunoda e al. 2010, Vilas-Boas, Sil a e al. 2013).
Com a descobe a da P-gp o nou-se e iden e que es a é esponsá el pelo aumen o
do e luxo de compos os de di e en es es u u as (Sa kadi, Homolya e al. 2006). Es e
anspo ado pode econhece uma as a gama de subs a os po se capaz de econhece
múl iplas es u u as químicas. Mui os dos seus subs a os são compos os
a macologicamen e ac i os. Reconhece á macos com peso molecula de 250 g/mol (ex:
cime idina) a 1202 g/mol (ciclospo ina A) (Sha om 2011). São exemplos de alguns
subs a os, os an icance ígenos, inibido es das p o éases (VIH), an aciclinas, alguns
an ibió icos, imunossup esso es, bloqueado es dos canais de cálcio e bloqueado es β-
ad ené gicos. O pes icida pa aqua o (PQ) e o co an e odamina 123 (RHO123) são
ambém seus subs a os (Va ma, Ashok aj e al. 2003, Vilas-Boas, Sil a e al. 2013).
T anspo a ambém moléculas en ol idas na espos a in lama ó ia. Reconhece ci oquinas,
p os aglandinas, es e óides e ac o es de ac i ação plaque á ia (PAF), sendo plausí el que
es a p o eína es eja en ol ida no e ei o p ó in lama ó io, a a és do en io de ac i ado es
da in lamação pa a o ex e io da célula (Chan, Gold e al. 2011, Kooij, Mizee e al. 2011).
A P-gp ap esen a um papel impo an e na p o ecção do o ganismo dada a sua
exp essão nos á ios ó gãos onde pa icipa ac i amen e na a macociné ica de qualque
compos o que seja seu subs a o. É esponsá el pelas al e ações na BD em adminis ações
o ais, impedindo a abso ção e eduzindo o empo de e enção de compos os no o ganismo
(Lin and Yamazaki 2003, Va ma, Ashok aj e al. 2003). O desen ol imen o de inibido es e
indu o es po en es de P-gp com baixa oxicidade êm abe o no os ho izon es na clínica
e apêu ica. A inibição das bombas de e luxo em como p incipal objec i o ealiza a
en ada de á maco nas células e com possibilidade de sucesso em a amen os, sendo de
bas an e aplicação em a amen os que esul am em esis ência a mul i- á macos. No caso
da indução ou ac i ação da p o eína, êm sido desen ol idos compos os capazes de
aumen a o e ei o isiológico da P-gp com o objec i o de limi a a oxicidade p o ocada
po subs a os da mesma (Ambudka , Dey e al. 1999, Bo s and El e ink 2002, Sil a,
Ca mo e al. 2013).
2014| Ana Filipa Fe ei a
6
Figu a 2: Rep esen ação da es u u a ípica da glicop o eína-P p esen e na bicamada lipídica. A
p o eína con ém dois domínios ansmemb ana es (TMD) e d
ois domínios de ligação a nucleó
idos
(NBD). Figu a adap ada (Choudhu i and Klaassen 2006).
1.1.1 Es u u a da glicop o eína-P
Na sua maio ia, os anspo ado es ABC ap esen am uma es u u a idên ica, com
dois domínios dis in os. O domínio hid o óbico com NH2- e minal e COOH- e minal,
designada po domínio da ligação a nucleó idos (NBD-nucleo ide binding domains) e
domínio hid o ílico ou domínio ansmemb ana (TMD- ansmemb ane domain). Es es
cons i uem no o al 12 segmen os em α-hélices ligados po uma sequência polipep ídica
lexí el (Ambudka , Dey e al. 1999, Ho mann and K oeme 2004, He, Li e al. 2011)
( igu a 2).
É no domínio NBD que oco e a ligação e subsequen e hid ólise do ATP,
esul ando em ene gia disponí el u ilizada no anspo e ansmemb ana . A uma
dis ância de 100-200 aminoácidos do domínio NBD, encon am-se duas sequências de 3
pep ídeos: Walke A e Walke B, que pa ecem se conse ados em odos os
anspo ado es ABC. Exis e ambém um mo i o C, onde cada p o eína em uma
sequência especí ica que a de ine ( ígu a 3). No mo i o Walke A es á p esen e um
esíduo de lisina que es á en ol ido na ligação do g upo os a o do ATP, assim como o
esíduo de ácido de aspa a o p esen e no mo i o Walke B pa ece in e agi com o ião
magnésio (Mg2+). O ou o domínio, TMD, é o domínio esponsá el pelo econhecimen o
do subs a o pelo anspo ado (Leslie, Deeley e al. 2005, Sa kadi, Homolya e al. 2006).
2014|Ana Filipa Fe ei a
7
Figu a 3: O domínio NBD dos anspo ado es ABC con em dois mo i os: Walke A e Walke B. Es es
são conse ados em odos os anspo ado es des a amília. Cada anspo ado em a sua p óp ia
assina u a, mo i o C, onde es á a sequência de aminoácidos que o ca ac e
iza. Figu a adap ada (
Choudhu i
and Klaassen 2006).
1.1.2 Localização da glicop o eína-P
A localização da P-gp nos di e en es ó gãos al e a signi ica i amen e a BD de
qualque compos o que seja seu subs a o. Consequen emen e oco em di e en es ases de
ADME, le ando a e ei os di e en es en e indi íduos e, mui as ezes, e ei os inespe ados
(Choudhu i and Klaassen 2006) com a oco ência, ou não, de oxicidade ou esis ência a
á macos (He, Li e al. 2011). Assim sendo, é impo an e econhece o local exac o da sua
exp essão de modo a p e e o caminho que o compos o ai segui den o do o ganismo.
O apa elho gas oin es inal é a p imei a linha de con ac o com os xenobió icos po
ia o al, e des e modo, de e se ambém a p imei a linha de de esa con a os mesmos. No
in es ino, a P-gp é exp essa p incipalmen e na supe ície apical dos en e óci os, mas
ambém nas es an es células in es inais (Choudhu i and Klaassen 2006, Zhou 2008).
Es e ó gão é di idido em 4 pa es: duodeno, jejuno, íleo e cólon. Ao longo do in es ino a
abso ção p ocessa-se de o ma dis in a, o que es á in imamen e elacionado com a
dis ibuição da P-gp no lúmen in es inal. Es a dis ibuição di e encial p e ine e modela a
passagem de ce os compos os, ou seus me aboli os, do in es ino pa a a ci culação.
Segundo Leslie e al. (2005), a exp essão da P-gp aumen a desde o duodeno a é ao cólon
(Leslie, Deeley e al. 2005) ( igu a 4A).
No ígado a P-gp encon a-se no lado apical das células das memb anas canicula es
dos hepa óci os (Choudhu i and Klaassen 2006, Zhou 2008). Es e ó gão ap esen a a
maio axa de eacções me abólicas, p incipalmen e eacções de des oxi icação. Pa a que
es as eacções oco am são necessá ios anspo ado es como a P-gp, pa a elimina os
compos os e/ou óxicos, encaminhando-os a a és dos canalículos ou sinusóides hepá icos
pa a a bílis ou ci culação sis émica, espec i amen e (Leslie, Deeley e al. 2005) ( igu a
4B). A P-gp ambém é exp essa na pa e apical das células da esícula bilia . Assim, os
xenobió icos que são subs a os des as p o eínas, mas que escapa am à eliminação e
en a am pela ci culação po al são, po encialmen e, exc e ados pela bílis (Leslie, Deeley
e al. 2005) ( igu a 4.C).
2014| Ana Filipa Fe ei a
8
Figu a 4: P o eína pe meá el (P-gp) exp essa na
memb ana apical nas células epi eliais in es inais,
na memb ana dos canalículos dos hepa óci os
humanos e na memb ana dos úbulos p oximais
enais A, B e C espec i amen e. Figu a adap ada
(Wessle , G ip e al. 2013).
Os ins êm como p incipal
unção egula a homeos asia do co po
incluindo a egulação do olume de luido
ci culan e e sín ese de ho monas mas,
além disso, ambém es ão en ol idos na
exc eção de me aboli os endógenos e
xenobió icos (Leslie, Deeley e al. 2005).
A P-gp é ambém exp essa na supe ície
apical das células epi eliais dos úbulos
p oximais (Lin and Yamazaki 2003),
mediando o e luxo de á ios xenobió icos
do sangue pa a a u ina, na sua maio ia
moléculas hid o óbicas (Schaub,
Ka enbeck e al. 1999, Mase eeuw,
No enboom e al. 2003).
Em conclusão, a localização
p i ilegiada da P-gp no apa elho
diges i o impede a passagem e,
consequen e acumulação de xenobió icos
no o ganismo, sendo es e o seu p incipal
papel isiológico (Dö ing and Pe zinge 2014). A exp essão no in es ino é esponsá el pela
limi ação da en ada/abso ção pa a os en e óci os, assim como a exp essão na supe ície
dos canalículos dos hepa óci os e nas células úbula es enais aumen am a eliminação dos
compos os pa a a bílis ou pa a a u ina, espec i amen e (Lin and Yamazaki 2003).
2014|Ana Filipa Fe ei a
9
A P-gp encon a-se ainda exp essa nou os ó gãos. Desempenha um papel mui o
impo an e na BHE, impedindo a en ada de compos os endógenos ou xenobió icos pa a o
cé eb o (Schinkel, Smi e al. 1994, Schinkel, Wagenaa e al. 1995, Schinkel, Wagenaa e
al. 1996, Schinkel 1999) ( igu a 5). A BHE é compos a po células endo eliais conec adas
en e si po pequenas es u u as, designadas de junções es ei as, o mando um endo élio
con ínuo que se e de ba ei a en e o sis ema ne oso cen al (SNC) – o cé eb o – e a
co en e sanguínea, sendo impe meá el a odas as pequenas moléculas lipídicas com o
objec i o de de ende o sis ema ne oso de agen es óxicos (Leslie, Deeley e al. 2005). A
P-gp é exp essa em mui os ipos de células do cé eb o incluindo do plexo co óide,
as óci os e mic oglia e o seu maio e ei o isiológico nes a camada é a p o ecção do
cé eb o (F icke and Mille 2004, Ma, Tsunoda e al. 2010). A p esença de
anspo ado es na BHE p o ege não só o cé eb o da acção de oxinas, mas ambém é um
obs áculo pa a a en ada de á macos com mecanismo de acção sob e o SNC, al como
a amen os pa a a epilepsia, VIH, in ecções no SNC e umo es ce eb ais (Bendayan, Lee
e al. 2002).
.
Ou os ó gãos ambém exp essam a P-gp, mediando igualmen e a en ada e
acumulação de óxicos. Nos pulmões, que são expos os a um g ande leque de agen es
óxicos po inalação di ec a, a P-gp localiza-se na supe ície apical do epi élio b onquial,
b onquiola e na memb ana plasmá ica dos mac ó agos al eola es, sendo a sua ac i idade
de e luxo um mecanismo pa a a emoção de compos os p ejudiciais ao ó gão (Sche e ,
Pijnenbo g e al. 2002). A P-gp ambém é exp essa nos duc os panc eá icos e nos
es ículos, nomeadamen e em células de Leydig, mac ó agos es icula es e em células de
se oli (Fojo, Ueda e al. 1987, Thiebau , Tsu uo e al. 1987, Chin, So i e al. 1989,
Co don-Ca do, O'B ien e al. 1989, Co don-Ca do, O'B ien e al. 1990, Schinkel 1999,
Melaine, Liena d e al. 2002). É ainda exp essa na supe ície luminal de células epi eliais
Figu a 5: Localização da glicop o eína-P na memb ana apical em células endo eliais da ba ei a
hema oence álica. Es a localização pe mi e o anspo e de xenobió icos pa a o sangue. Figu a adap ada
(
Rao, Dahlheime e al. 1999)

2014| Ana Filipa Fe ei a
10
sec e o as do endomé io, assim como na placen a, onde pa ece e um papel mui o
impo an e na p o ecção do e o con a a oxicidade de di e en es moléculas endógenas e
exógenas (A ceci, C oop e al. 1988, Gil, Sau a e al. 2005, Kalabis, Kos aki e al. 2005).
1.1.3 Exp essão da glicop o eína-P em células do sis ema imuni á io
Os anspo ado es de memb ana são exp essos em ó gãos de abso ção e exc eção
e o sis ema imunológico não é excepção. A P-gp é exp essa na medula óssea, encon ando-
se ac i a em células sanguíneas, em pa icula nas células na u al kille (NK) e nos
lin óci os T (Thiebau , Tsu uo e al. 1987, Chaudha y and Roninson 1991, Kock, G ube e
al. 2007, Manceau, Gi aud e al. 2012). Chaudha y e al. (1991) suge i am que a P-gp es á
en ol ida em p ocessos de anspo e ambém nes as células, com a inalidade de
balancea a concen ação in acelula de alguns compos os como po exemplo ci oquinas,
ho monas, aldos e ona e co isol (Chaudha y and Roninson 1991, Eck o d and Sha om
2009). O ac o de a P-gp se esponsá el pelo anspo e de ci oquinas e ho monas é um
aspec o que pode explica a sua exp essão nes as células, con udo ainda não es á bem
de inido o seu papel nes e sis ema (Thiebau , Tsu uo e al. 1987, Chaudha y and Roninson
1991, Kock, G ube e al. 2007, Manceau, Gi aud e al. 2012).
Em es udos ealizados po Klimecki e al. (1994) com células CD3+ (lin óci os T) e
mais especi icamen e com CD4+ (lin óci os T helpe ), CD8+ (lin óci os T ci o óxicos) assim
como CD56+ (células na u al kille ), a a és da a aliação do anspo e da RHO 123
(subs a o da P-gp) e i icou-se que os lin óci os T exp essam ele ados ní eis des a
p o eína de anspo e (Klimecki, Fu sche e al. 1994, Robey, Bakke e al. 1999). Nou o
es udo mais ecen e ealizado po Vilas Boas e al. (2011), em lin óci os isolados a pa i de
sangue o al de indi íduos do sexo masculino, e i icou-se que a exp essão da P-gp nes as
células aumen a em elação à idade, mas a ac i idade da p o eína mos ou não se
elaciona com o mesmo ac o . O mé odo usado nes e es udo oi ambém a inco po ação
de RHO 123, de ec ada po ní eis de luo escência e a aliada em ci ome ia de luxo. A
exp essão da P-gp oi a aliada usando o an ico po monoclonal an i-Pgp UIC2 na p esença
e ausência de imblas ina (subs a o) (Vilas-Boas, Sil a e al. 2011).
2014|Ana Filipa Fe ei a
11
1.1.4 Mecanismo de anspo e pela glicop o eína-P
O mecanismo de anspo e de compos os pela P-gp não é o almen e conhecido.
No en an o, exis em pelo menos ês modelos acei es: modelo clássico ou po o, modelo de
aspi ação hid o óbica (Hyd ophobic acuum cleane , HVC) e o modelo de lippase.
O modelo clássico ou po o, desc i o po Bo s e al. (2002), é ca ac e izado po dois
TMD o ganizados numa disposição a o á el e com capacidade de o ma po os. A P-gp
consegue e ec ua o e luxo a a és des es po os e é capaz de expulsa ac i amen e os
á macos do ci oplasma pa a o espaço ex acelula (Bo s and El e ink 2002) ( igu a 6A).
De aco do com o modelo HVC p opos o po Go esman e al. (2002), a P-gp pode
e mudanças con o macionais a a és da hid ólise de ATP e consegue bombea subs a os
neu os ou ca egados. Funciona como um aspi ado pa a o meio ex acelula , que a
pa i do compa imen o in acelula que a pa i da bicamada lipídica da memb ana
plasmá ica da célula onde es es subs a os podem acumula -se (Go esman, Fojo e al.
2002) ( igu a 6B).
Em elação ao modelo lippase, o subs a o liga-se à P-gp e é o ien ado pa a a
memb ana in e na. A po ção hid o óbica do subs a o é o ien ada na memb ana celula
pa a o lado hid o óbico da p o eína de anspo e. Oco e uma mudança con o macional
de ido à ligação que oco e en e a NBD e o ATP. Es a mudança de con o mação e i a a
en ada des es compos os, expulsando-os pa a o meio ex acelula . Es e pa ece se o
mecanismo mais bem acei e pa a o anspo e da P-gp (Choudhu i and Klaassen 2006)
( igu a 6C).
2014| Ana Filipa Fe ei a
12
1.1.5 Subs a os da glicop o eína-P
Os subs a os da P-gp não ap esen am uma es u u a ca ac e ís ica que os de ina
como al. Con udo sabe-se que a P-gp em p e e ência po moléculas ela i amen e
hid o óbicas, algumas ca iónicas e ge almen e con endo anéis a omá icos com á omos de
azo o de ca ga posi i a (Shapi o and Shea 2002, Sha om 2011).
Es udos ealizados po Seelig e al. (1998) com o objec i o de en ende o que de ine
uma molécula pa a se subs a o des a p o eína de anspo e, demons a am que um
compos o pode in e agi com a P-gp se con i e : a) g upos dado es de dois elec ões com
uma sepa ação espacial de 2,5 ± 0,3 Å; b) g upos dado es de dois elec ões com uma
sepa ação espacial de 4,6 ± 0,6 Â; c) g upos dado es de ês elec ões com uma sepa ação
espacial de 4,6 ± 0,6 Å (Seelig 1998). Pos e io men e, ambém a i ma am que a sepa ação
na memb ana lipídica é um passo limi an e na in e acção de um subs a o com a P-gp e
que a dissociação do complexo o mado en e a P-gp e o subs a o é de e minada pelo
núme o e o ça das ligações de hid ogénio o madas en e ambas (Seelig and
Figu a 6 Rep esen ação dos modelos p opos os de anspo e pela glicop o eína-P. A Modelo clássico ou
po o. De aco do com es e modelo, a P
-gp encon a o xenobió ico no olhe o da bicamada lipídica e expulsa-
os
pa a o a do olhe o con a o g adien e de concen ação. Es e modelo é baseado na ideia de que o subs a o
em acesso ao local de ligação de TMD pela bicamada lipídica depois de in e agi com a mesma memb ana. B
Modelo de aspi ação hid o óbica (HVC) que pe mi e à P
-gp expulsa os seus subs a os. De aco do co
m es e
modelo, os subs a os podem se expulsos an o do espaço in acelula como de den o da bicamada lipídica da
memb ana plasmá ica, a a és do econhecimen o des es como xenobió icos. C Modelo
lippase
com
mo imen o lip
- lop com a bicamada lipídica.
A mudança de con o mação az com que a en ada do subs a o
não oco a. Figu a adap ada
(Choudhu i and Klaassen 2006).
2014|Ana Filipa Fe ei a
13
Landwoj owicz 2000). Con udo, as ca ac e ís icas ísico-químicas do subs a o são
impo an es e de e minan es pa a que oco a in e acção en e o subs a o e a p o eína,
ais como a lipo ilicidade, a capacidade de aze ligações de hid ogénio, o peso molecula e
a á ea de supe ície (Bain, McLachlan e al. 1997, Wang, Kuo e al. 2003).
Além dos subs a os da P-gp pode em se simplesmen e subs a os e a a essa em
a memb ana plasmá ica a a és dela, podem ainda ac ua como seus inibido es ou
indu o es, a a és da al e ação da sua ac i idade e/ou exp essão (Wessle , G ip e al.
2013).
A abela 1 enume a alguns des es subs a os.
2014| Ana Filipa Fe ei a
20
signi ica i amen e a exp essão de ARN mensagei o (mARN), esul ando na ausência da
p o eína de MDR1. A depleção da exp essão de MDR1 co elacionou-se bem com o
aumen o da e enção do á maco e com o aumen o de sensibilidade das células aos
compos os (Peng, Xiao e al. 2004, Choudhu i and Klaassen 2006).
Po ou o lado, o uso de indu o es aumen a a ac i idade e exp essão da bomba de
e luxo, a P-gp, p opo cionando uma sob e i ência celula a longo p azo e em sido uma
impo an e es a égia e apêu ica a segui (Sil a, Sousa e al. 2014). São já enume ados
múl iplos mecanismos a a és dos quais a sín ese de mARN pode se egulada, sendo já
p o ados alguns mecanismos de egulação posi i a pa a o anspo e de á macos
(Sha om 2007). Uma ez que es e mecanismo de indução é econhecido como uma ia de
des oxi icação e icaz em con ac o com compos os óxicos, como o PQ, esul ando numa
edução signi ica i a nos ní eis in acelula es e, consequen emen e, numa edução
signi ica i a da sua oxicidade, a iden i icação de no os indu o es e ac i ado es da P-gp i á
pe mi i encon a no os agen es e apêu icos que pode ão unciona como no os
an ído os pa a in oxicações causadas po subs a os da P-gp (Dinis-Oli ei a, Remiao e al.
2006, Sil a, Sousa e al. 2014).
Alguns exemplos de indu o es e inibido es são ap esen ados na abela 2.

2014|Ana Filipa Fe ei a
21
Tabela 2: Exemplo de alguns subs a os com capacidade pa a induzi ou inibi a glicop o eína-P (Kim 2002,
Pal and Mi a 2006).
INIBIDOR INDUTOR
Nel ina i
Fá macos an i-VIH
Amp ena i
Ri ona i
Nel ina i
Saquina i Ri ona i
Quinidina
Fá macos do
Sis ema ca díaco
Amioda ona
Ve apamilo Dil iazem
Amioda ona Nica dipina
A o as a ina Ni edipina
Dil iazem
Ve apamilo
Fenodipina
Lidocaina
Nica dipina
Ni endipina
Te enadina
Cispla ina
Fá macos
an icance ígenos
Tamoxi eno
Dauno ubicina
Vimblas ina
Doxo ubicina
E oposido
Fluo ou acilo
Me o exa o
Tamoxi eno
Vimbla ina
Vinc is ina
Cla i omicina
An ibió icos
E i omicina
E i omicina Ri ampicina
2014| Ana Filipa Fe ei a
22
1.3.1 Mecanismo de inibição da glicop o eína-P
A inibição da P-gp é o p incipal objec i o pa a se ob e a en ada de á macos nas
células, possibili ando o sucesso dos a amen os.
Em ge al, a inibição oco e po 4 mecanismos:
1. Bloquea o local de ligação do anspo ado po mecanismo compe i i o,
não compe i i o ou no local alos é ico ( igu a8) (Va ma, Ashok aj e al.
2003);
2. In e e i com a hid ólise de ATP (Shapi o and Ling 1997);
3. Inibi da ligação ao ATP no momen o da anslocação (Amin 2013);
4. Al e a da in eg idade dos lípidos da memb ana celula (Rue z and G os
1994, Amin 2013, Wessle , G ip e al. 2013).
Co isol
Ho monas
Dexame asona
Hid oco isona Es adiol
P oges e ona Insulina
Tes os e ona
Midazolam
Seda i os
Fenoba bi al
Ne azodone
Ciclospo ina A
Imunossup esso es
Ciclospo ina
Tac olimus P ednisolona
Si olimus Si olimus
Tac olimus
Me adona
Opióides Mo ina
Ce oconazol
An i úngicos
Clo imazol
I aconazol
2014|Ana Filipa Fe ei a
23
Se o bloqueio des e anspo ado de e luxo oco e , ga an imos a en ada de
compos os pa a a célula (Sha om 2011). Des a o ma, êm sido ei os es udos com
possí eis inibido es da bomba baseados na sua especi icidade, a inidade e oxicidade e já
são conhecidas qua o ge ações de inibido es da P-gp:
o A p imei a ge ação é cons i uída po compos os a macologicamen e ac i os
usados pa a a amen os especí icos, mas que êm a agilidade de inibi a
bomba. Con udo, o uso da p imei a ge ação como inibido es é limi ado, uma
ez que são necessá ias ele adas concen ações no o ganismo pa a inibi a
bomba e nes as concen ações os inibido es são po encialmen e óxicos. Ou a
des an agem é que es es são ambém subs a os de enzimas e de ou os
anspo ado es, le ando a in e acções a macociné icas (Lomo skaya and
Bos ian 2006, Lomo skaya, Zgu skaya e al. 2007);
o A segunda ge ação não em ac i idade a macológica, po ém são óp imos
inibido es po ap esen a em mui a a inidade pa a a bomba. Nes e g upo
incluem-se os análogos não-imunossup esso es da ciclospo ina A (PSC833) e
o D-isóme o do e apamilo (dexa e apamilo). Con udo es a ge ação além de
inibi a bomba, ambém inibe a CYP 3A4 e ou os anspo ado es da amília
ABC, complicando o me abolismo no mal dos compos os;
Figu a 8: Mecanismo de inibição da glicop o eína-P po um inibido compe i i o (esque da) e po um não
compe i i o (di ei a). Figu a adap ada
(Amin 2013)
2014| Ana Filipa Fe ei a
24
o A e cei a ge ação de inibido es é ecen e e são poucos os es udos clínicos. No
en an o, sabe-se que es a ge ação em maio a inidade e meno oxicidade (ex.
GF 120918, a iquida ). Fo am desen ol idos a a és do conhecimen o da
es u u ada bomba de e luxo pa a cump i os equisi os de meno oxicidade e
maio a inidade (Maling e, Beijnen e al. 2001, Kuppens, Wi e een e al.
2007);
o A qua a ge ação, ambém ecen e, é cons i uída po compos os de o igem
na u al e sin é ica que êm sido mencionados nes a á ea. Es es podem se os
p óp ios excipien es do p incípio ac i o, ou seja, já p epa ados de indús ia e
mais a de adminis ados po ia o al num só comp imido. São exemplos, o
polie ilenoglicol (PEG), TWEN-20 e SPAN-80, gomas aniónicas, algina o de
sódio, poloxáme os, ióme os e dend íme os. O mais e icaz pa ece se o PEG
que em sido in oduzido em o mulações a macêu icas. O mecanismo de
acção inibi ó io consis e na al e ação da in eg idade dos lípidos da memb ana
po oca da es u u a secundá ia e e ciá ia. Nes e caso, a P-gp es a á al e ada
e impedida de conduzi e luxo dos seus subs a os (We le 2008, P akash
2010).
A abela 3 ap esen a exemplos das ge ações ci adas.
Tabela 3: G upo de inibido es da glicop o eína-P usados com inalidades clínicas. Tabela adap ada (Kim
2002, Va ma, Ashok aj e al. 2003, Kuppens, Wi e een e al. 2007).
Ge ação
Exemplos
Especi icidade
Limi ações
P imei a
ge ação
Ve apamilo, Ciclospo ina
A, Rese pina, Quinidina,
Yohimbine, To emi ena e
Tamoxi eno.
Não selec i a e
baixa a inidade.
São subs a os de
ou os
anspo ado es e
de ou os sis emas
enzimá icos. São
a macologicamen
e ac i os e eles
p óp ios são
subs a os da P-
gp.
2014|Ana Filipa Fe ei a
25
O enómeno de inibição en ol endo a adminis ação concomi an e de á macos
pode á le a a al e ações no me abolismo, aumen ando os ní eis plasmá icos. Po
exemplo, a adminis ação de digoxina (subs a o) e que en ol a a adminis ação
concomi an e de inibido es conhecidos, como o e apamilo ou a ciclospo ina A (inibido es
de p imei a ge ação), le a á a um aumen o de digoxina na co en e sanguínea (Kim
2002). Segundo um es udo ealizado po Sugie e . al. e Van Aspe en e . al. (1997), o
e apamilo in luencia o anspo e de digoxina po ap esen a uma acção inibi ó ia sob e
Segunda
ge ação
Dexa e apamilo,
Dexaniguldipina,
Valspoda (PSC 833) e
Do equida Fuma a e (MS-
209).
Al a
especi icidade
que a 1ª ge ação
de inibido es
mas em
in e acção com
ou os sis emas.
São subs a os da
CYP 3 A4 e de
ou os
anspo ado es.
Te cei a
Ge ação
Elac ida
(GF120918/GG918),
Ta iquida (XR9576),
Ciclop opyldibenzosube an
e
Zosuquida (LY 335979),
Laniquida (R101933);
Mi o ane (NSC-38721),
B icoda (VX-710), ONT-
093 e HM30181.
Al a
especi icidade e
po encialidade
como inibido
da P-gp.
Sem inibições ais
como oco e na 1ª
e 2ª ge ação.
Qua a
Ge ação
PEG, TWEN-20, SPAM-80,
Algina os, Gomas
Aniónicas Poloxáme os,
Tióme os e Dend íme os.
Al a
po encialidade
como inibido
da P-gp po
al e a a
in eg idade da
memb ana.
Sem inibições

2014| Ana Filipa Fe ei a
26
a P-gp mas sem in e e i com a hid ólise do ATP ( an Aspe en, an Tellingen e al. 1997,
Sugie, Asaku a e al. 2004).
Mais a de, Se al e al. (2003) es uda am a in luência do inibido e apamilo,
ciclospo ina e GF 120918 na ac i idade an imic obial com mac ólidos (e i omicina,
cla i omicina, oxi omicina, azi omicina, eli omicina) em mac ó agos de a os. O
esul ado mos ou que exis e al e ação da ex usão de mac ólidos na p esença do inibido
da bomba. O uso de inibido es aumen ou a acumulação den o da célula e bene iciou a
acção an i mic obiana (Se al, Micho e al. 2003).
Mais ecen e, Kwak e al. (2010) es uda am as ca ac e ís icas de um no o inibido
pe encen e à e cei a ge ação, HM30181, que ap esen a bons esul ados em compa ação
com a ciclospo ina A e GF120918 quando a adminis ação é po ia o al. Es e no o
inibido em mais a inidade pa a a P-gp e não inibe ou os anspo ado es pe encen es à
amília ABC. A ciclospo ina A inibe a unção anspo ado a da P-gp po in e agi an o
com os locais de econhecimen o dos subs a os, como com os NBDs sem in e agi com os
locais de ligação ao subs a o. Num ensaio in i o com células do cólon cance ígenas
humanas, uma co-adminis ação de HM30181 com pacli axel aumen ou a BD po ia o al
de pacli axel de 3,4% pa a 41,3%, e i icando-se a o ça inibi ó ia de HM30181 (Kwak, Lee
e al. 2010).
Resumindo, a inibição da bomba az um impac o pa a a a macociné ica.
Aumen a a abso ção, o empo de semi- ida do compos o e eduz a exc eção ou clea ence
nos úbulos p oximais nos ins, aumen ando o eup ake. Assim, uma ez que es a bomba
se encon a em á ios ó gãos e ecidos, a sua inibição pode á aumen a não só a sua
abso ção, mas ambém le a a di e en es ases de dis ibuição, me abolismo e eliminação
dos seus subs a os (Ba ako a, Mille e al. 2001, Va ma, Ashok aj e al. 2003).
1.3.2 Mecanismo de indução e ac i ação da glicop o eína-P
A P-gp é uma p o eína econhecida pelo seu papel c ucial na p o ecção celula ,
de ido à sua capacidade de e luxo de que esul a a diminuição da acumulação in acelula
de xenobió icos (Dinis-Oli ei a, Dua e e al. 2006, Sil a, Ca mo e al. 2011).
A indução da p o eína de anspo e em me ecido a enção em es udos
elacionados com a p o ecção celula , uma ez que exis em á ios compos os que êm
demons ado aumen a a exp essão da P-gp. É o caso da dexame asona (DEX),
i ampicina, hipe icina e hipe o ina (an idep essi os E as S . John´s) e agen es
quimio e ápicos como a doxo ubicina (DOX). Os ní eis de P-gp es ão ambém
aumen ados na p esença do ac o de nec ose umo al al a (TNFα) suge indo que es a
2014|Ana Filipa Fe ei a
27
ci oquina p o-in lama ó ia além de subs a o ambém induz a exp essão de P-gp nas
memb anas (Dinis-Oli ei a, Dua e e al. 2006, Sil a, Ca mo e al. 2011, Vilas-Boas, Sil a
e al. 2011). Não só compos os químicos são desc i os como indu o es, mas ambém o
s ess ísico como adiações UV, aios X e choque é mico induzem a P-gp (Sil a e al.,
2014; Zhou, 2008). Fac o es gené icos e ambien ais demons a am que in luenciam a
exp essão e ambém a ac i idade da P-gp. Po exemplo, a exp essão ou unção da P-gp é
al amen e al e ada po algumas condições pa ológicas, como o caso do canc o, diabe es e
Alzheime (Tada, Wada e al. 2000, Ha z, Mille e al. 2010, Nawa, Fuji a-Hamabe e al.
2011).
O mecanismo de indução da P-gp é de ido a ecep o es de ho monas nuclea es,
chamados de «xenosenso es» de ido à sua habilidade em ac ua com a as a gama de
subs a os exógenos e oxinas. O ecep o X-p egnane (PXR, NRAI2) e o ecep o
and os e ona cons i u i o (CAR, NR1I3) medeiam a espos a celula a óxicos a a és da
ansc ição de ac o es pa a componen es do sis ema de sec eção pa a des oxi icação,
onde se incluem os anspo ado es de memb ana, P-gp e enzimas me abólicas como
CYP3A4. O subs a o ac i a se e amen e os ac o es de ansc ição, incluindo o PXR, CAR
e o ac i ado de p o eínas-1 (AP1) (Handschin and Meye 2003, Bu k, A nold e al. 2005).
Uma ez que du an e a quimio e apia exis em esis ências a á macos em
consequência da acção das p o eínas de memb ana, exis em mui os es udos que
p ocu a am iden i ica os sinais molecula es que modelam a exp essão dos ní eis
ansc ipcionais du an e a quimio e apia. O a amen o con ínuo com an icance ígenos
es imula di ec amen e a ansc ição do mARN da P-gp po al e a a anslocação nuclea
de á ios ac o es ansc ipcionais. A ansc ição do mARN da P-gp é o emen e
in luenciada po mecanismos epigené icos, incluindo ace ilação de his onas e me ilação do
ADN que a ec a a acessibilidade de odos os ac o es ansc ipcionais em p omo e a
egião de e minan e de sín ese de mARN. A exp essão dos ní eis da p o eína e elou que a
sua ac i idade é ambém con olada po es es ac o es pos - ansc ipcionais que a ec am a
passagem a a és da memb ana, assim como a localização e deg adação da P-gp sem
al e ação dos ní eis de mRNA ou sín ese p o eica. Na igu a 9 es á ep esen ado um
possí el mecanismo de indução da P-gp a a és de an icance ígenos. O a amen o com
alguns des es á macos es imula di ec amen e a ansc ipção da mARN da P-gp po
a o ece a anslocação nuclea de á ios ac o es ansc ipcionais. Além disso, es es
á macos ambém modulam um p ocesso epigené ico onde se inclui a me ilação do ADN e
ace ilação das his onas, que a ec am o acesso dos ac o es ansc ipcionais ao p omo o da
egião de e minan e da sín ese de mARN. Consequen emen e, es es compos os ambém
in luenciam p ocessos de modi icação pos - ansc ipcional, especialmen e p o eínas cuja
unção é a o ece a ligação en e as memb anas plasmá icas e os ilamen os de ac ina,
2014| Ana Filipa Fe ei a
28
como é o caso da p o eína ez ina/ adixina/moesina (ERM). Es es e en os jun os
con ibuem pa a aumen a a exp essão da P-gp (Kobo i, Ha ada e al. 2014).
Num es udo ealizado po Sil a e al. (2012), es ou-se a capacidade de anspo e
de e luxo da P-gp em células caco-2, células que mime izam a ba ei a in es inal,
u ilizando a DOX como indu o e o PQ como subs a o. Es e subs a o é um he bicida
en ol ido em milhões de in oxicações em odo o mundo e é abso ido po ia in es inal.
Como esul ado, obse a am que indução da P-gp pela DOX pode se usada como um
po en e an ído o pa a in oxicações com PQ uma ez que es a aumen a o e luxo do
compos o (Sil a, Ca mo e al. 2013). Po an o, o aumen o da exp essão ou ac i idade da P-
gp esul a numa p o ecção celula con a xenobió icos (Sil a, Ca mo e al. 2011).
Figu a 9: Rep esen ação esquemá ica de um dos mecanismos esponsá eis pelo aumen o de exp essão da
glicop o eína
-
P a a és de á macos an icance ígenos na memb ana plasmá ica. Es ímulo di ec o da
ansc ição da
mARN de P-gp po al e ação
da anslocação nuclea de á ios ac o es ansc ipcionais.
Oco e modulação de p ocesso epigené icos onde se incluem a me ilação do ADN e a ace ilação das his onas,
que a ec am a
acessibilidade de odos os ac o es ansc ipcionais, p omo endo a egião d
e e minan e de
sín ese de mARN. Consequen emen e, es es á macos ambém a ec am a pos
- ansc ição
especialmen ede
uma p o eína
cuja unção é a o ece a ligação en e as memb anas plasmá icas e os ilamen os de ac ina,
,
como é o caso da p o eína ez ina/ a
dixina/moesina (ERM). Figu a adap ada (Kobo i, Ha ada e al. 2014).
2014|Ana Filipa Fe ei a
29
Adicionalmen e, o am ealizadas ou as expe iências com DEX, que pe ence ao
g upo de á macos que ap esen am acção an i-in lama ó ia com á ias aplicações clínicas
como em a amen os de asma, a i e euma óide, myas henia g a is e ambém são
mui o u ilizado como auxilia es na e apia an icance ígena. Dinis e al. (2006)
e idencia am que es e compos o aumen a a exp essão e ac i idade da P-gp nos in es inos
e pulmões e, po an o, esul a numa diminuição de PQ den o das células pulmona es,
com um consequen e aumen o da exc eção ecal, demons ando-se uma diminuição da
mo alidade e mo bilidade celula em cul u as pulmona es. As células ap esen a am uma
meno pe oxidação lipídica e meno con eúdo de g upos ca bonilos, além de uma
no malização da ac i idade da mielope oxidase, esul ando num aumen o do empo de
ida das mesmas. O mecanismo p opos o pa a o enómeno da indução e consequen e
e luxo do PQ es á ep esen ado na igu a 10 (Dinis-Oli ei a, Dua e e al. 2006, Dinis-
Oli ei a, Remiao e al. 2006).
Figu a 10. : Esquema ep esen a i o do mecanismo p opos o pa a o e luxo do pa aqua o (PQ) pela glicop o eína-
P (P-gp). GR, ecep o de glucoco icóides; MDR, gene de esis ência a mul i-
á macos; DEX, dexame asona.
Figu a adap ada (Dinis-Oli ei a, Remião e al. 2006).
2014| Ana Filipa Fe ei a
36

2014|Ana Filipa Fe ei a
37
2. OBJECTIVOS DO TRABALHO
A P-gp é uma p o eína de anspo e capaz de o igina o e luxo de xenobió icos,
onde se incluem compos os a macologicamen e ac i os e pes icidas. A exp essão des a
p o eína de e luxo nas memb anas de ó gãos que pa icipam na abso ção e eliminação
con e e uma p o ecção especial às células, nomeadamen e p o ecção na en ada e
consequen e acumulação de óxicos den o das mesmas. A indução da exp essão ou
aumen o da ac i idade da P-gp pode á se um ia de a amen o e icaz em si uações de
in oxicações po subs a os des a da p o eína de anspo e.
Po es e mo i o, a p esen e ese de mes ado e e como objec i o de e mina os
ní eis de exp essão e ac i idade da P-gp na p esença de um agen e indu o . O abalho
labo a o ial oi cons i uído po di e en es pa es, pa indo semp e do mesmo agen e
indu o , a ioxan ona TX5, e a iando-se as es an es condições ( ipo de ensaio, células,
concen ações de TX5 e exposição à TX5). Pa alelamen e oi ambém objec i o alida um
mé odo de análise e quan i icação de TX5. Fo am objec i os des a ese os seguin es:
 A aliação da exp essão da P-gp em lin óci os T de sangue pe i é ico de dado es
saudá eis expos os 24 ho as com TX5 em concen ações de 20 µM e 80 µM,
u ilizando o an ico po UIC2 conjugado com FITC;
 A aliação da ac i idade da P-gp em lin óci os T de sangue pe i é ico de dado es
saudá eis, a a és da inco po ação do subs a o luo escen e RHO 123, na
p esença e na ausência de um inibido da bomba de e luxo, o e apamilo, usando
TX5 (em duas concen ações, 20 µM e 80 µM, po 24 ho as) como agen e indu o ;
 A aliação da ac i idade da P-gp num es udo pilo o in i o com a os Cha les
Ri e , em que me ade dos animais se adminis ou, po ia o al, TX5 e digoxina e
aos es an es apenas digoxina. O pe il a macociné ico da digoxina oi a aliado
endo sido ecolhidas amos as de plasma du an e 12 ho as após a adminis ação
dos compos os. Des e modo, p e endeu-se compa a a a macociné ica da digoxina
em animais a ados com e sem o indu o TX5 e elacioná-la com o aumen o da
ac i idade da P-gp;
 Validação do mé odo analí ico de HPLC pa a análise e quan i icação do compos o
indu o da P-gp, a TX5, em so o humano.
2014| Ana Filipa Fe ei a
38
2014|Ana Filipa Fe ei a
39
Pa e III
Ma e ial e
Mé odos
2014| Ana Filipa Fe ei a
40
2014|Ana Filipa Fe ei a
41
3. MATERIAIS E MÉTODOS NO ESTUDO DA GLICOPROTEÍNA-P NA
PRESENÇA DE UM INDUTOR, TX5
Nes e capí ulo são ap esen ados odos os ma e iais necessá ios e quais as écnicas
execu adas pa a desen ol imen o des e abalho labo a o ial.
3.1 Sín ese da TX5
A TX5 oi sin e izada pelo labo a ó io de química o gânica da Faculdade de
Fa mácia da Uni e sidade do Po o. De i ado de xan ona dihid oxilada, sin e izada po
mé odos clássicos desc i os po Cas anhei o e al. (2007), TX5 ou 3, 6-dihyd oxy-9H-
xan hen-9-one oi ob ida pela ciclização de 2,2´- benzo enonas dioxigenadas a a és de
um p ocesso de desid a ação (90% de endimen o) (Ped o, Ce quei a e al. 2002,
Cas anhei o, Pin o e al. 2007). Foi ca ac e izada po mé odos espec o o ome icos e a
sua pu i icação oi de e minada po HPLC com de ec o diode-a ay onde se ob e e 95%
de pu eza (Cas anhei o, Pin o e al. 2007).
3.2 Es udo in i o com lin óci os T humanos
Es e es udo incluiu amos as de sangue o al, p o enien e de dado es saudá eis, de
ambos os sexos, en e 20-30 anos de idade. As ecolhas o am ei as no labo a ó io de
análises clínicas da Faculdade de Fa mácia da Uni e sidade do Po o. Todas as amos as
o am ecolhidas de dado es olun á ios e de idamen e in o mados.
3.2.1 Isolamen o de lin óci os
As écnicas de isolamen o e cul u a o am baseadas em p o ocolos an e io men e
es ados (Pon e, Ca alho e al. 2011, Vilas-Boas, Sil a e al. 2011). Todos os pa âme os
aqui a e idos o am p e iamen e es ados e op imizados.
Fo am colhidos ap oximadamen e 12 ml de sangue de cada dado pa a ubos com
an icoagulan e, hepa ina e lí io. O olume de sangue ecolhido oi o mínimo possí el pa a
se aze o isolamen o segundo o p o ocolo HISTOPAQUE® 1077.

2014| Ana Filipa Fe ei a
42
Todos os p ocedimen os ealizados i e am em con a condições de assepsia e
es e ilidade adequados à cul u a celula e, po an o, o am ealizados numa câma a de
luxo lamina e ical.
Reagen es:
• HISTOPAQUE® 1077 (Sigma-Ald ich, Inc., S . Louis, MO USA);
• PBS (Phos a e Bu e ed Saline solu ion – AccuGene, labo a ó ios Lanza, Bélgica);
• RPMI 1640 (Sigma) suplemen ado com 15% de so o bo ino e al (FBS) (GIBCO
In i ogen, Labo a ó ios Lenexa, KS), an ibió ico (10.000 unidades/ml de
penicilina e 10.000 µg/ml de es ep omicina) (GIBCO) e com 29 mg/ml de L-
Glu amina (Sigma);
• TX5 com concen ação s ock [TX5] 50 mM em dime ilssul óxido (DMSO;
• DMSO (Sigma-Ald ich, Inc., S . Louis, MO USA).
Ma e ial:
• Tubos de hepa ina/lí io;
• Tubos de cen í uga de undo cônca o;
• Pipe as de id o;
• Pompe e;
• Cen i uga (cen i uge 5810R);
• Câma a de luxo lamina e ical.
P ocedimen o:
 A sepa ação dos cons i uin es do sangue pelo mé odo de his opaque baseia-se no
g adien e de densidades. A solução de HISTOPAQUE® 1077 é uma solução de
polissaca ose e dia izoa o de sódio com densidade de 1,077±0,001 g/ml e pH 8.8-
9.0;
 A solução de HISTOPAQUE® 1077 de e se e i ada do io 1 ho a an es de cada
expe iência, pa a que ique à empe a u a ambien e;
2014|Ana Filipa Fe ei a
43
 Em ubos de undo cônca o, e com o máximo de cuidado, adiciona-se o mesmo
olume de sangue e HISTOPAQUE® 1077 (+/- 3 ml), de modo a que não se
mis u em (his opaque em baixo e sangue em cima);
 Cen i uga-se du an e 30 minu os, a 890xg, à empe a u a ambien e;
 Após a cen i ugação é possí el isualiza di e en es ases (imagem 12), em que a
zona dos lin óci os (e ou as células mononuclea es) co esponde a um anel b anco
bem de inido. Esse anel é ecolhido com uma pipe a de id o pa a ou o ubo de
undo cônca o;
 La am-se as células com 10 ml de PBS;
 Cen i ugam-se no amen e du an e 10 minu os, a 890xg, à empe a u a ambien e;
 Rejei a-se o sob enadan e e as células são essuspensas em 2 ml de meio RPMI
1640.
3.2.2 Viabilidade celula pelo mé odo da exclusão do azul de ipano
Reagen es:
• Azul de T ipano 0,4% (Sigma-Ald ich, Inc., S . Louis, MO USA).
Ma e ial:
• Câma a de Neubaue ;
• Mic oscópio óp ico;
Figu a 12: Imagem
ep esen a i a do mé odo de
sepa ação de células
mononuclea es a pa i do
sangue e a a és do
HISTOPAQUE® 1077. São
acilmen e isualizá eis as
di e en es camadas de células
mononuclea es, em que os
lin óci os ep esen am a maio ia,
o plasma apa ece no opo e os
e i óci os encon am
-
se
deposi ados no undo. Imagem
e i ada
(Sigma-Ald ich 2003).
2014| Ana Filipa Fe ei a
44
• Pipe a de 100 μl;
• Pipe a de 20 μl;
• Eppendo s.
P ocedimen o:
 Dilui-se 25 μL da suspensão de lin óci os ob ida no pon o an e io em 100 μl de
azul de ipano (diluição 1:5) num eppendo , homogeneizando-se bem a
suspensão esul an e com a pipe a, azendo up and down;
 Com a ajuda da pipe a de 20 μL coloca-se a suspensão celula na câma a de
Neubaue ;
 P ocede-se à con agem do núme o de células i as e mo as (células co adas a azul
são células não iá eis, uma ez que a desin eg ação da memb ana celula pe mi e
a en ada do co an e pa a o in e io das células) com ajuda do mic oscópio óp ico;
 Apenas são con adas as células que se encon am nos quad ados g andes dos
can os supe io es e in e io e az-se a média de células po quad ado. A igu a 13
ilus a o p ocedimen o e ec uado.
Figu a 13: Técnica de con agem celula em câma a de Neubaue . A. Mé odo de colocação da
suspensão celula pelos bo dos da câma a sob a lamela. B. Esquemas do in e io da câma a, os 4
quad ados dos can os são onde se con am as células. C. Mé odo de con agem das células. D. As
células em que é possí el e o núcleo são con adas (células à esque da e no cen o), células em que
não se isualizam os núcleos são desca á eis. Figu a o iginal.
2014|Ana Filipa Fe ei a
45
 Pa a se calcula o núme o de células po milili o mul iplica-se a média do núme o
de células po quad ado po 10000, endo em con a o seguin e:
- 1 ml = 1 cm3
- 1 cm3 = 1x103 mmm3 = 1000 mm3, en ão 1 ml = 1000 mm3
- o olume da câma a é de 0,1 mm3
Assim, o núme o de células po milili o é:
Nº células/ml = Média de células po quad ado x 10000
Como a suspensão celula é no malmen e diluída pa a acili a a con agem com
azul de ipano (nes e caso na p opo ção de 1:5) é necessá io en a com o ac o de
diluição pa a ob e o núme o de células. Assim:
Nº de células/ml
= Média do nº de células po quad ado × ac o de diluição ×10000
A iabilidade celula é calculada da seguin e o ma:
Viabilidade celula (%)
= Nº de células i as/ Nº de células o ais (mo as+ i as) x 100
3.2.3 Cul u a e exposição dos lin óci os ao indu o da glicop o eína-P, TX5
Reagen es
• Solução s ock de TX5 a 50 mM;
• RPMI 1640.
Ma e ial
• Tubos de cul u a com undo em ampa;
• Es u a a 37ºC e 5% CO2;
• Pipe a de 10 μL;
• Câma a de luxo lamina e ical.
2014| Ana Filipa Fe ei a
52
 Adicionam-se aos lin óci os 5 μl de cada an ico po, CD45-PE (ma cação de
leucóci os) e CD3-APC (ma cação de lin óci os T) e comple a-se o olume com PBS
com 10% de FBS a é aos 50 μl. As amos as são incubadas a 4°C du an e 30
minu os;
 Após ma cação, as células são a adas com a Solução AI - Acumulação Inibida
(igual à an e io – abela 4) e incubadas em banho-ma ia, a 37°C, com agi ação
cons an e du an e 30 minu os;
 As células são la adas com PBS com 10% de FBS apenas uma ez;
 Expõem-se as células à TX5 em RPMI pa a oco e o e luxo (AI/E) (exposição
aguda);
 A solução oi p epa ada da seguin e o ma:
(P epa ação de uma solução in e média de TX5 com concen ação 100µM em RPMI)
Tabela 5: Solução de ACTIVAÇÃO p epa ada com o indu o TX5 e RPMI.
Solução de ac i ação
Volume [TX5] 100µM
Volume RPMI
Células con olo
____________________
1 ml
Células expos as a
TX5 20µM 200µl 800µl
Células expos as a
TX5 80µM 800µl 200µl
 As amos as são incubadas em banho-ma ia, a 37°C, com agi ação po 60 minu os;
 As células são la adas duas ezes e suspensas em 500 µl de PBS com 10% de FBS e
agua dam no gelo a é à lei u a no ci óme o.
3.2.10 De e minação da luo escência po ci ome ia de luxo
O equipamen o u ilizado pa a de e minação dos ní eis de luo escência de RHO
123 e dos es an es an ico pos oi o BD Accu iTM C6 low cy ome e ( igu a15). Fo am
adqui idas ap oximadamen e 20.000 células po cada amos a. O sinal de luo escência é
ecolhido em modelo de loga i mo e os dados são analisados pelo so wa e BD Accu i.

2014|Ana Filipa Fe ei a
53
A a aliação da ac i idade da P-gp é de e minada compa ando ní eis de in ensidade
de luo escência in acelula na p esença e ausência do inibido , sendo exp essa da
seguin e o ma:
% 𝐒𝐒𝐒𝐒í𝐝𝐝𝐒𝐒 𝐑𝐑𝐑𝐑𝐑𝐑𝐑𝐑𝐑𝐑𝐑𝐑 =𝐌𝐌𝐌𝐌𝐌𝐌 Acumulação de RHO (𝐀𝐀𝐌𝐌) – 𝐌𝐌𝐌𝐌𝐌𝐌 e luxo da RHO (𝐀𝐀𝐌𝐌/𝐄𝐄)
𝐌𝐌𝐌𝐌𝐌𝐌 Acumulação de RHO (𝐀𝐀𝐌𝐌)𝑿𝑿 𝐑𝐑𝟏𝟏𝟏𝟏
A população de lin óci os oi iden i icada e sepa ada das es an es células
mononuclea es com base no seu amanho (FSC – Fo wa dsca e ) e na sua g anulosidade
(SSC – Side sca e ), a a és de um polígono seleccionado – P1. As células ma cadas com
an ico pos CD3-APC e CD45-PE o am de e minadas em FL4 e FL2, espec i amen e, sem
que nenhuma luo escência in e e isse com ou a. Inicialmen e, as células o am
a aliadas pela écnica de exclusão do iode o de p opídeo, que emi iu na in e secção do
canal FL2 com FL3 (dados não ap esen ados), pe mi indo sabe que a luo escência
de ec ada pe encia a células iá eis.
Figu a 15: Imagem de equipamen o BD Accu iTM C6 low cy ome y e do so wa e u ilizado nes e
abalho. Figu a e i ada de
(Biosciences 2012).
2014| Ana Filipa Fe ei a
54
3.2.11 Análise es a ís ica
Os dados o am adqui idos e analisados pelo so wa e de BD Accu i C6 e
pos e io men e a ados eco endo ao p og ama G aphPad P ism®, e são 6 (G aphPad
So wa e, San Diego, CA). P ocedeu-se à análise es a ís ica dos alo es da média
geomé ica da in ensidade de luo escência. As di e enças (na exp essão e na ac i idade da
P-gp) en e os g upos que o am a aliadas eco endo ao mé odo não pa amé ico de
K uskal-Wallis (one-way ANOVA on anks) seguido pelo pos -hoc es e de Dunn (* p
<0,05; **** p <0,0001 e sus con olo e ## p <0,01 e sus TX5 20 μM), conside ando
es a is icamen e di e en e um alo de p <0,05.
3.3 Es udo in i o com a os Cha les Ri e
O es udo in i o ealizado é um es udo pilo o que e e o objec i o de a alia o
e ei o do indu o da P-gp (TX5) sob e a a macociné ica da digoxina.
Es e es udo oi ei o em 10 a os Cha les Ri e , machos e adul os, com média de
peso de 288,5 g. Todos os animais ize am jejum de 12 ho as, pa a não in e e i com o
es udo da a macociné ica e o am man idos nas condições pad ão (12 /12 h de luz/escu o,
22°C, humidade de 50/60%), espei ando odos os seus di ei os, segundo Ins i u e o
Labo a o y Resea ch e a legislação po uguesa.
A me ade dos animais oi adminis ado po ia o al TX5 (12 mg/ml) e digoxina (0,1
mg/ml) a a és de uma cânula, eiculados numa solução aquosa, e aos es an es animais
apenas oi adminis ada digoxina (0,1 mg/ml). Pa a acili a a adminis ação da solução
aquosa, os animais o am colocados em exsicado com algodão embebido em iso lu ano
pa a os man e ado mecidos. Fo am colhidas amos as de sangue a a és da eia da cauda
(inicialmen e a cauda oi colocada no banho a 40°C pa a e i a a do ) pa a eppendo s
com hepa ina, du an e 12 ho as pa a a alia as di e enças en e os dois a amen os. No
inal das 12 ho as de colhei as, os animais o am sac i icados po decapi ação (Bal aza ,
Dinis-Oli ei a e al. 2014).
Reagen es:
• HBSS++ (GIBCO, Paisley UK);
• Digoxina (Sigma-Ald ich, Inc., S . Louis, MO USA);
2014|Ana Filipa Fe ei a
55
• Clo id a o de TX5 ( o necido pelo labo a ó io de química o gânica da Faculdade de
Fa mácia da Uni e sidade do Po o);
• Água des ilada;
• Iso lu ano 100% (p/p) (Abbo house, Be kshi e UK);
• Hepa ina sódica 5000 UI/ml (B aum medical, Lda, Queluz de Baixo Po ugal).
Ma e ial:
• Banho-ma ia (40°C);
• Agulhas e se ingas;
• Algodão;
• Eppendo s com 10µl de hepa ina pa a ecolha de sangue.
P epa ação das soluções: Tendo em con a que a adminis ação máxima
ecomendá el de solução é de 400 g/ml, po cada Kg de peso podemos adminis a 2,5 ml
de solução de compos os a es a :
𝑫𝑫𝑫𝑫𝑫𝑫𝑫𝑫𝑫𝑫𝑫𝑫𝑫𝑫𝑫𝑫 = (0,25 𝑚𝑚𝑚𝑚/𝑘𝑘𝑚𝑚)/(2,5 𝑚𝑚𝑚𝑚/𝑘𝑘𝑚𝑚) = 0,1𝑚𝑚𝑚𝑚/𝑚𝑚𝑚𝑚
𝑻𝑻𝑿𝑿𝑻𝑻 = (30 𝑚𝑚𝑚𝑚/𝑘𝑘𝑚𝑚)/(2,5 𝑚𝑚𝑚𝑚/𝑘𝑘𝑚𝑚) = 12 𝑚𝑚𝑚𝑚/𝑚𝑚𝑚𝑚
Pa a um olume de 1,5 ml de solução:
• Digoxina ( a os a ados apenas com digoxina)
0,1 mg/ml x 1,5 ml = 150 µl ( e i a de uma solução de concen ação in e média
[Digoxina] = 1 mg/ml) e dissol e em água des ilada ( =1,5 ml).
• TX5 ( a os a ados com os dois compos os)
12mg/ml x 1,5 ml = 18 mg
Solução pa a adminis ação: 18mg de TX5 + 150 µl de digoxina dissol ida em
HBSS+/+ ( =1,5 ml).
2014| Ana Filipa Fe ei a
56
Segundo o peso dos animais e, sabendo que a quan idade máxima admissí el de
adminis ação é de 400 g/ml, espei ou-se o seguin e:
T a amen o Peso (g) do animal
Volume da solução
(µl)
Digoxina
275
687
Digoxina
265
662
Digoxina
292
730
Digoxina
315
787
Digoxina
320
800
Digoxina+TX5
265
662
Digoxina+TX5
275
687
Digoxina+TX5
278
695
Digoxina+TX5
290
725
Digoxina+TX5
310
775
Tempo de ecolha de amos a (minu os):
0 20 40 60 90 120 180 240 360 480
No inal, o sangue é cen i ugado a 3000 pm po 10 minu os, e é a mazenado o
sob enadan e (plasma) a -20°C.
3.3.1 Análise ins umen al e es a ís ica
Todas as amos as de plasma o am analisadas em Au oAnalyze (PRESTIGE) 24i,
PZ Co may S.A. A análise de dados oi conseguida a a és do So wa e G aphPad 6.0 e o
Mic oso Excell 2010. Foi aplicado o es e s uden e os alo es de á ea sob a cu a (AUC)
oi de e minada po uma ap oximação não compa imen al usando o so wa e Winnonlin.
2014|Ana Filipa Fe ei a
57
3.4 Validação do mé odo de análise e quan i icação de TX5 em HPLC
A alidação do mé odo de quan i icação de xan onas po HPLC em sido epo ada
po alguns au o es (Teixei a, A onso e al. 2008, Pon es, Guedes de Pinho e al. 2009,
Sousa, Palmei a e al. 2013, Kuma , Tandon e al. 2014). Des a o ma, en ou-se op imiza
odas as condições pa a alida um no o mé odo de análise e quan i icação de TX5 po
HPLC pa a u u as expe iências com o compos o. Todos pa âme os usados pa a a
alidação do mé odo analí ico o am desc i os em Guidelines (ICH 1997).
Reagen es:
• Me anol HPLC-g ade ( Me ck KGaA, Alemanha);
• So o humano;
• Água ul a-pu a;
• TEA (Sigma-Ald ich, Inc., S . Louis, MO USA);
• DMSO (Sigma-Ald ich, Inc., S . Louis, MO USA).
Ma e ial:
• HPLC Gilson Dilu o 401;
• Eppendo s;
• Fil os 45µm;
• Se ingas;
• Ul a-sons ou co en e de azo o;
• Pipe as de 20, 100 e 1000 μl.
3.4.1 P epa ação dos pad ões de TX5
A. Faze soluções in e médias de TX5 em DMSO a pa i de uma solução s ock
[TX5]= 50 mM. Pa a p epa a as concen ações en e 0,5-150 µM, são necessá ias
soluções in e médias 40 ezes mais concen adas de ido ao ac o de diluição
( olume inal de 200 μl/ olume inicial de 5 μl=40x). Ou seja, as concen ações
in e médias p epa adas o am as seguin es (µM):

2014| Ana Filipa Fe ei a
58
B. P epa ação:
 195 μl de so o + 5 μl de TX 5 nas espec i as concen ações
in e médias;
 Adição 600 μl de me anol;
 Cen i ugação a 13000 pm, 10 minu os, 4°C;
 Fil a o sob enadan e com il o 45 µm e injecção no HPLC.
3.4.2 Condições ins umen ais e c oma og á icas
A análise po HPLC em ase e e sa oi ealizada com o
equipamen o Gilson Dilu o 401, com sis ema de bomba modelo 302 e com um de ec o
espec o o ome o UV Gilson. A sepa ação oi conseguida com coluna Ace 5 C18, 5 µm de
diâme o das pa ículas e 250 x 4,6 mm de dimensões. A análise de c oma og a ia líquida
oi ei a com eluição isoc á ica e as condições da ase mó el o am 90:10 ( : )
me anol/água con endo 1% de ie ilamina (TEA), com luxo de 1ml/minu o. O olume de
injecção da amos a oi de 50 µl e a de ecção oi ei a no comp imen o de onda de 255 nm.
O so wa e de análise de dados oi o so wa e Cla i y®.
3.4.3 Validação do mé odo
Linea idade
A linea idade do mé odo oi de e minada analisando e elacionando as á eas dos
picos (Y) com as espec i as concen ações de TX5 (X) nas amos as. Fo am ealizadas
B anco 0,5 1 2 5 10 20 40 80 100
150
B anco 20 40 80 200 400 800 1600 3200 4000
6000
X 40
2014|Ana Filipa Fe ei a
59
cu as de calib ação na gama de concen ações en e 0,5 e 150 μM, em duplicado (11
pad ões de concen ações di e en es: 0; 0,5; 1,0; 2,0; 5,0; 10,0; 20,0; 40,0; 80,0; 100,0 e
150,0 μM).
Os decli es o am calculados endo em con a a média de cinco cu as de calib ação
p epa adas em 5 dias consecu i os, usando o So wa e G aphPad 6.0.
P ecisão in e -dia (mé odo)
A p ecisão in e -dia do mé odo oi de e minada po injecção e análise, du an e 5
dias consecu i os, de soluções pad ão p epa adas dia iamen e com as 11 concen ações
conside adas pa a a cu a de calib ação (0;0,5; 1,0; 2,0; 5,0; 10,0; 20,0; 40,0; 80,0; 100,0
e 150,0 μM).
Exac idão
A exac idão oi calculada da seguin e o ma:
𝐸𝐸𝐸𝐸𝐸𝐸𝐸𝐸𝐸𝐸𝐸𝐸ã𝑜𝑜 (%)=(𝐶𝐶𝑜𝑜𝐶𝐶𝐶𝐶𝐶𝐶𝐶𝐶𝐸𝐸𝐶𝐶𝐸𝐸çã𝑜𝑜 𝑚𝑚é𝐸𝐸𝐸𝐸𝐸𝐸 𝐶𝐶𝐸𝐸𝑚𝑚𝐶𝐶𝑐𝑐𝑚𝑚𝐸𝐸𝐸𝐸𝐸𝐸)−(𝐶𝐶𝑜𝑜𝐶𝐶𝐶𝐶𝐶𝐶𝐶𝐶𝐸𝐸𝐶𝐶𝐸𝐸çã𝑜𝑜 𝐶𝐶𝑜𝑜𝑚𝑚𝐸𝐸𝐶𝐶𝐸𝐸𝑚𝑚)
(𝐶𝐶𝑜𝑜𝐶𝐶𝐶𝐶𝐶𝐶𝐶𝐶𝐸𝐸𝐶𝐶𝐸𝐸çã𝑜𝑜 𝐶𝐶𝑜𝑜𝑚𝑚𝐸𝐸𝐶𝐶𝐸𝐸𝑚𝑚) 𝐸𝐸 100
P ecisão in a-dia (es abilidade do equipamen o)
A p ecisão in a-dia do HPLC oi de e minada injec ando e analisando 5 ezes no
mesmo dia os 11 pad ões de uma cu a de calib ação (0;0,5; 1,0; 2,0; 5,0; 10,0; 20,0; 40,0;
80,0; 100,0 e 150,0 μM), ou seja, o am ei as 5 injecções consecu i as de uma mesma
cu a de calib ação (injecção de cada pad ão em duplicado).
P ecisão in a-dia (es abilidade do mé odo)
A p ecisão in a-dia do mé odo oi de e minada injec ando e analisando, no
mesmo dia, 5 eplicados de cada um dos 11 pad ões da cu a de calib ação (0;0,5; 1,0; 2,0;
2014| Ana Filipa Fe ei a
60
5,0; 10,0; 20,0; 40,0; 80,0; 100,0 e 150,0 μM), ou seja, injecção consecu i a e no mesmo
dia de 5 cu as de calib ação di e en es.
Es abilidade da amos a
I. P epa a amos as de TX5 em so o (1, 10 e 100 μM) em iplicado;
II. Adição de me anol numa p opo ção de 3:1 me anol/amos a
III. Cen i ugação das amos as a 13000 pm, 10 minu os, 4°C;
IV. Fil a o sob enadan e com il o de 45 μm;
V. Injecção no HPLC e a mazena no imedia o as es an es
amos as (sob enadan e) a 4ºC du an e 7 dias;
VI. Após os 7 dias, odas amos as a mazenadas a 4ºC são injec a
no amen e no HPLC.
Recupe ação
Adição de TX5 an es da
p ecipi ação p o eica A1
Adição de TX5 após a p ecipi ação
p o eica A2
Injecção no HPLC
I. 195 μL de so o + 5 μL de
TX5 40, 400 e 4000 μM
(concen ação inal: 1, 10 e
100 μM) em iplicado;
II. Adição 600 μL de me anol;
III. Cen i ugação 13000 pm,
10 minu os, 4°C;
IV. Fil a o sob enadan e.
I. 195 μL de so o. Amos as em
iplicado;
II. Adição 600 μL de me anol;
III. Cen i ugação 13000 pm, 10
minu os, 4°C;
IV. Recolha do sob enadan e e
adição de 5 μL TX5 40, 400 e
4000 μM;
2014|Ana Filipa Fe ei a
61
Limi e de de ecção (LOD) e quan i icação (LOQ)
O limi e de de ecção ou limi o de ec ion (LOD) é a meno concen ação de analí o
que pode se de ec ada pelo mé odo de análise, mas que não pode se quan i icada de
o ma ap op iada. F equen emen e de inem-se limi es de de ecção (LOD) em e mos do
des io-pad ão de medidas do b anco.
O limi e de quan i icação ou limi o quan i ica ion (LOQ) é a meno concen ação
de amos a, que pode se quan i a i amen e de ec ada com p ecisão e exa idão acei á eis,
sob as condições expe imen ais adop adas.
As ó mulas de cálculo pa a LOD e LOQ são as seguin es:
𝑳𝑳𝑳𝑳𝑫𝑫 =3.3 𝜎𝜎
𝑆𝑆 𝑳𝑳𝑳𝑳𝑳𝑳 = 10 𝜎𝜎
𝑆𝑆
Legenda:
𝜎𝜎=des io pad ão de espos a
S = decli e da cu a de calib ação
• A es ima i a do des io pad ão (σ) pode se e ec uada de di e sas o mas, po
exemplo:
 Baseada no des io pad ão do b anco: a medição da ampli ude da espos a
analí ica é ealizada pela análise de um núme o adequado de amos as em
b anco (20 amos as em duplicado) e do cálculo do espec i o des io pad ão
dessas espos as.
• O decli e S é es imado da cu a de calib ação.
3.4.4 Análise es a ís ica
Todos os dados o am a ados usando o So wa e G aphPad 6.0 e o Mic oso
Excell 2010.
2014| Ana Filipa Fe ei a
68
os esul ados o am sa is a ó ios, ob endo-se uma população de lin óci os densa e bem
de inida aquando a lei u a no ci óme o.
4.1.3 Es udo da exp essão e ac i idade po ci ome ia de luxo
A ci ome ia de luxo é uma écnica que a alia a dispe são da luz p o ocada pelas
células em suspensão em meio líquido, a a és de um luxo, em que es a dispe são é
dependen e das ca ac e ís icas ísicas e químicas de cada célula (Biosciences 2000).
Como desc i o em 3.2.6, eco eu-se ao equipamen o de ci ome ia de luxo pa a
es uda a exp essão e ac i idade da P-gp em lin óci os T, na p esença e ausência de um
indu o . Des a o ma, pa a analisa as células de in e esse no ci óme o a alia am-se os
dados ela i os ao seu amanho (FCS) e à sua g anulosidade (SSC). A de ecção da
luo escência da RHO 123 e dos an ico pos acoplados a luo oc omos u ilizados oi
ealizada de aco do com a abela 6. Os esul ados ob idos pa a a emissão de luo escência
o am analisados a a és de g á icos que elacionam a con agem de células (eixo dos Y)
com a in ensidade de luo escência emi ida (eixo dos X). Es es g á icos são designados po
his og ama (Biosciences 2012).
Tabela 6: Compos os com capacidade de emi i em co , usadas nos á ios ensaios com espec i os canais de
de ecção de luo escência (Biosciences 2012).
O p og ama de aquisição e análise de dados dos his og amas ob idos em ci ome ia
de luxo, so wa e de BD Accu i 6C, pe mi iu selecciona os lin óci os com base na sua
g anulosidade e no seu amanho como se obse a na igu a 17 – A. A pa i des e
esul ado (depois de con i ma que são células iá eis a a és de ensaio com o iode o de
p opídeo), as células o am ma cadas com o an ico po CD45-PE pa a ma ca leucóci os
(onde se incluem os lin óci os T) e a luo escência oi de ec ada em FL2. Como isí el na
Compos o com luo escência
Canal de de ecção
RHO 123
FL1
UIC2 – FITC
FL1
CD3 – APC
FL4
CD45 – PE
FL2
Iode o de p opídeo
FL2/FL3

2014|Ana Filipa Fe ei a
69
igu a 17-B, da o alidade de células isoladas
quase 100% são posi i as pa a es e an ico po. A
u ilização do an ico po UIC2-FITC ma ca a
p o eína de anspo e P-gp pe mi indo exclui
as células que no g upo an e io ( igu a 17-A)
não exp essam es a p o eína, com de ecção
oco e em FL1 (Chaudha y, Meche ne e al.
1992, Henmi, Yoshida e al. 2008, Vilas-Boas,
Sil a e al. 2011). Após es a selecção, o es udo da
ac i idade da P-gp na p esença do seu subs a o
RHO 123 e com CD3-APC (ma cado de
lin óci os T) pa a que os esul ados de
luo escência sejam es i os aos lin óci os T. Em
odas as amos as ma cadas com es es
an ico pos (CD3 e CD45), a população de
lin óci os T ep esen a pelo menos 65% da
população o al de ec ada ( igu a 17- C). Es es
esul ados comp o am que os lin óci os T
ep esen am a maio ia das células seleccionadas
segundo as condições u ilizadas, comp o ando
que o p o ocolo é adequado ao isolamen o dos
lin óci os T e a aliação da ac i idade da P-gp
nes a população celula . A ausência de
au o luo escência, in e e en e nes e es udo, oi
a aliada em células sem qualque ipo de
a amen o.
Figu a 17: G á icos ep esen a i os da selecção da
população de lin óci os T iá eis:
A-
Sepa ação da
população de lin óci os com base no seu amanho (FSC) e
g anulosidade (SSH), ci cunsc
i a po um polígono
delimi ado a azul;
B- Den o do g upo
an e io , as células
são de ec adas em FL2 pa a de e mina células CD45+
(leucóci os)
C- Den o das células an e io es, ma ca am-
se
aquela
s que são posi i os pa a o an ico po CD3-
APC
(70,7%)
, ou seja, os lin óci os T delimi ados pela linha
a
e melho
(R2). A exp essão da P-
gp é de ec ada em FL1
onde
são seleccionados apenas os que exp essam P-
gp nas
suas memb anas, a a és d
o an ico po an i-P-gp UIC2
-
FITC.
2014| Ana Filipa Fe ei a
70
4.1.4 Exp essão da glicop o eína-P em células CD45+ e CD3+ expos as à TX5
du an e 24 h
Pa a a exp essão da P-gp usou-se o an ico po an i-P-gp, UIC2- FITC, com canal de
de ecção em FL1. Es e p o ocolo, desc i o em po meno em 3.2.7, baseou-se em
p ocedimen os an e io es (Sil a, Ca mo e al. 2011). Nes e ensaio, as células o am
ma cadas com CD3 e CD45 e o am a aliadas em elação à exp essão a a és da ma cação
posi i a pa a UIC2. Os esul ados exp essos como média ± des io pad ão, são
p o enien es da análise, em duplicado, de células ob idas de 10 dado es (6 do sexo
eminino e 4 do sexo masculino), igu a 18.
Os alo es de luo escência emi idos nas células em es udo cons am da abela
seguin e:
Con olo
TX5 20 µM
TX5 80 µM
Es udo da exp essão com ma cação de an ico pos: CD45
+
e CD3
+
100%
109,203%
120,926%
Figu a 18: G á ico ep esen a i o da análise da exp essão de glicop o eína –P, nas concen ações de 20
μ
M e 80 μM de TX5, com a ma cação de an ico po an i P-gp, UIC2 em células CD3+ e CD45+. Os
esul ados
são exp essos como média ± des io pad ão e são p o enien es da análise, em duplicado, de células ob idas
de 10 dado es (6 do sexo eminino e 4 do sexo masculino). As compa ações es a ís icas o am ei as
u ilizando o mé odo não pa amé ico de K
uskal-Wallis (one-way ANOVA on anks), seguido pelo pos
-
hoc
es e de Dunn (* p <0,05; **** p <0,0001 e sus con olo; ## p <0,01 e sus TX5 20 μM).
2014|Ana Filipa Fe ei a
71
Da análise da igu a 18 conclui-se que a exp essão da P-gp em lin óci os T
induzida pela TX5 nas concen ações de 20µM e 80 µM di e em es a is icamen e do
con olo (p <0,05 e p <0,0001, espec i amen e). Além disso, a indução da exp essão pela
TX5 na concen ação de 80 µM é es a is icamen e di e en e da exp essão induzida pela
concen ação mais baixa de 20 µM (p <0,01), e mais ele ada. Assim, pode dize -se que a
concen ação mais al a de TX5 é mais e icien e em induzi a exp essão da P-gp, nas
condições es adas. No en an o, não se pode conclui que a indução da exp essão da P-gp
em lin óci os T é dependen e da concen ação de TX5, apesa des es esul ados o
suge i em. Fu u amen e, pode -se-ão ealiza mais es udos ela i os à exp essão de P-gp
es ando ou as concen ações de TX5 e a é u iliza ou os modelos celula es, no sen ido
de en ende se o mecanismo de indução é dependen e da concen ação de TX5.
Em es udos ealizados po Sil a e al. (2014) em células caco-2, com o objec i o de
e i ica o pode indu o da TX5 ela i amen e à exp essão da P-gp, expôs-se as células à
TX5 na concen ação de 20 µM, usando-se o mesmo p o ocolo que nes e abalho. Os
esul ados mos a am que a TX5 nes a concen ação induz a exp essão de uma o ma
bas an e signi ica i a em análise es a ís ica, 142,7% em compa ação com o con olo 100%.
Uma ez que nes e es udo a exp essão oi de apenas 9% (109,203%), suge e-se que
as células caco-2,possi elmen e,são mais sensí eis ao e ei o indu o da TX5 em
compa ação com os lin óci os T (Sil a, Sousa e al. 2014). De qualque o ma, mais
es udos de e ão se ei os.
4.1.5 Exp essão da P-gp em células em P1 expos as ao TX5 du an e 24 h
O es udo da exp essão oi de e minada com UIC2-FITC, como no ensaio an e io , à
excepção da incubação p é ia com an ico pos CD3-APC e CD45-PE, e nes e caso, o am
usados alo es de luo escência ob idos em P1, ou seja, odas as células que o am
seleccionadas em p imei a ase ( igu a 17-A) Es a de e minação de luo escência em
células ob idas em P1 de eu-se ao ac o das células ap esen a em alo es mais al os de
au o luo escência que a p óp ia luo escência de UIC2-FITC. Os esul ados o am
exp essos como média ± des io pad ão e são p o enien es da análise, em duplicado, de
células ob idas de 10 dado es (6 do sexo eminino e 4 do sexo masculino), como se obse a
na igu a 19.
2014| Ana Filipa Fe ei a
72
Em esumo, emos os seguin es esul ados da exp essão da P-gp com e sem
ma cação de an ico pos:
Mais uma ez, e i icou-se que não há di e enças en e a exp essão induzida com
TX5 em células ma cadas com an ico pos e a exp essão a aliada em células seleccionadas
em P1.Ve i icam-se, no amen e, di e enças signi ica i as na exp essão da P-gp induzida
pela TX5 a 20µM e a 80 µM (p <0,01 e p <0,0001, espec i amen e) em elação ao
con olo, e uma di e ença es a ís ica en e a meno e a maio concen ação es ada (p
<0,05).
Con olo
TX5 20 µM
TX5 80 µM
Es udo da exp essão com ma cação de an ico pos: CD45+ e CD3+
100%
109,203%
120,926%
Es udo da exp essão sem ma cação de an ico pos
100%
109,452%
121,16%
Figu a 19 : G á ico ep esen a i o da análise da exp essão de glicop o eína –P, nas concen ações de 20
μM e 80 μM de TX5, com a ma cação de an i
co po an i P-gp, UIC2 em células seleccionadas em P1.
Os
esul ados são exp essos como média ± d
es io pad ão e são p o enien es da análise, em duplic
ado, de
células ob idas de 10 dado es (6 do sexo eminino e 4 do sexo masculino). As compa ações es a ís icas
o am ei as u ilizando o mé odo não pa amé ico de K uskal
-Wallis (one-
way ANOVA on anks), seguido
pelo pos
-hoc es e de Dunn (** p <0,01; **** p <0,0001 e sus con olo; # p <0,05 e sus TX5 20 μM).
2014|Ana Filipa Fe ei a
73
4.1.6 Ac i idade da glicop o eína-P em células CD45+ e CD3 +expos as ao TX5
du an e 24 h
Uma o ma de a alia a ac i idade da P-gp consis e no es udo da capacidade de
e luxo da P-gp e i a um subs a o luo escen e, 5 µM RHO 123, do in e io celula . Es e
subs a o ap esen a ca ac e ís icas lipo ílicas que lhe pe mi em a en ada nas células po
di usão passi a, a a o do g adien e de concen ação, mas o seu e luxo oco e a a és da
P-gp. Nes e abalho, o e luxo da RHO 123 oi a aliado na p esença e ausência de um
inibido da ac i idade da P-gp, o e apamilo 30 µM, que sendo ambém um subs a o, é
inibido da P-gp po um mecanismo compe i i o, sem in e e i com a ligação do ATP
(Chaudha y, Meche ne e al. 1992). A ase de inibição do anspo e ambém é de ida à
azída sódica 10 mM que impede a o mação de no as moléculas de ATP, quando
adicionada na solução AI. A ó mula de cálculo con encionada pa a o es udo da ac i idade
da P-gp nos lin óci os T, desc i a em 3.2.4.4, oi baseada em es udos an e io es ealizados
po Vilas Boas e al. (2011) (Vilas-Boas, Sil a e al. 2011).
% 𝐒𝐒𝐒𝐒í𝐝𝐝𝐒𝐒 𝐑𝐑𝐑𝐑𝐑𝐑𝐑𝐑𝐑𝐑𝐑𝐑 =𝐌𝐌𝐌𝐌𝐌𝐌 Acumulação de RHO (𝐀𝐀𝐌𝐌) – 𝐌𝐌𝐌𝐌𝐌𝐌 e luxo da RHO (𝐀𝐀𝐌𝐌/𝐄𝐄)
𝐌𝐌𝐌𝐌𝐌𝐌 Acumulação de RHO (𝐀𝐀𝐌𝐌)𝑿𝑿 𝐑𝐑𝟏𝟏𝟏𝟏
Os esul ados ob idos no es udo da ac i idade em lin óci os T ma cados com os
espec i os an ico pos são exp essos como média ± des io pad ão e são p o enien es da
análise, em duplicado, de células ob idas de 9 dado es (5 do sexo eminino e 4 do sexo
masculino), como demons a a igu a 20.

2014| Ana Filipa Fe ei a
74
A a és da igu a 20 é possí el e , em p imei o luga , que a TX5 aumen a a
ac i idade da P-gp de uma o ma es a is icamen e signi ica i a, p <0,01 pa a 20 μM e p
<0,0001 pa a 80 μM. Em segundo luga , é possí el e i ica que não exis e di e ença na
ac i idade da P-gp com as di e en es concen ações, o que é con i mado pelos esul ados
ob idos em elação às médias de luo escência in acelula , que o am os seguin es:
Con olo TX5 20 µM TX5 80 µM
100% 117,479% 126,233%
Como se pode cons a a a ac i idade da P-gp aumen ou ap oximadamen e 17% na
concen ação de TX5 20 µM e ap oximadamen e 26% na concen ação de 80 µM. Assim
conclui-se que a TX5, nas concen ações es adas, induz a ac i idade da P-gp, embo a es a
não seja dependen e da concen ação do indu o pa a a a iação das concen ações
es adas.
Figu a 20: G á ico ep esen a i o da análise da ac i idade da glicop o eína–P, nas concen ações de 20
μ
M e 80 μM de TX5, com a ma cação de an ico pos CD3 e CD45. Os esul ados são exp essos como m
édia ±
d
es io
pad ão e são p o enien es da análise, em duplicado, de células ob idas de 9 dado es (5 do sexo
eminino e 4 do sexo masculino). As compa ações es a ís icas o am ei as u ilizando o mé odo não
pa amé ico de K uskal
-Wallis (one-way ANOVA on anks), seguido pelo pos -hoc
es e de Dunn (** p
<0,01; **** p <0,0001
e sus con olo).
2014|Ana Filipa Fe ei a
75
Figu a 21: G á ico ep esen a i o da análise da ac i idade da glicop o eína –P, nas concen ações de 20
μ
M e 80 μM de TX5, sem ma cação de an ico pos. Os esul ados são exp essos como média ± d
es io
pad ão e são p o enien es da análise, em duplicado, de células ob idas de 20 dado es (11 do sexo eminino
e 9 do sexo masculino). As compa ações es a ís icas o am ei as u ilizando o mé odo não pa amé ico de
K uskal
-Wallis (one-way ANOVA on anks), seguido pelo pos -hoc es e de Dunn (**** p <0,0001
e sus
con olo) .
4.1.7 Ac i idade da glicop o eína-P em células em P1 expos as ao TX5 du an e
24 h
Numa ase de op imização do mé odo, as células o am a adas con o me o
desc i o em 3.2.8, não sendo no en an o ma cadas como an ico pos especí icos. As células
analisadas nes e caso o am as células seleccionadas em P1 ( igu a 17 A). Os esul ados
o am exp essos como média ± des io pad ão e são p o enien es da análise, em duplicado,
de células ob idas de 20 dado es (11 do sexo eminino e 9 do sexo masculino) como é
possí el obse a na igu a 21.
Da análise da igu a 21 e i ica-se que, em e mos es a ís icos, os esul ados são
semelhan es aos an e io es: a ac i idade da P-gp induzida pela TX5 a 20 µM e a 80 µM
não são signi ica i amen e di e en es, mas são signi ica i amen e di e en es da ac i idade
da P-gp nas células con olo.
2014| Ana Filipa Fe ei a
76
Con olo
TX5 20 µM
TX5 80 µM
Es udo da ac i idade com ma cação de an ico pos: CD45
+
e CD3
+
100%
117,479%
126,233%
Es udo da ac i idade sem ma cação de an ico pos
100%
109,909%
122,531%
Analisando os alo es de luo escência emi idos pela RHO 123 nes as células (P1)
como cons a na abela acima e i ica-se, mais uma ez, que não pa ece ha e di e ença
signi ica i a en e células ma cadas com an ico pos e células não ma cadas com
an ico pos. Conclui-se, po an o, que a ma cação com an ico pos especí icos pa a
lin óci os T é um passo que pode se omisso, quando se p e ende es uda a indução da P-
gp segundo es e p o ocolo (as células isoladas e seleccionadas em P1 mui o p o a elmen e
são na sua maio ia lin óci os T).
4.1.8 Ac i ação da glicop o eína-P em células CD45+ e CD3 +expos as ao TX5
du an e os 60 minu os na ase de e luxo da Rhodamina 123
No es udo da ac i ação as células, lin óci os T, são incubadas 24 ho as na es u a,
não sendo expos as ao indu o . Após a ase de acumulação inibida, oco e a incubação (60
minu os) com TX5 nas concen ações de 20 µM e 80 µM em meio RPMI, sendo as células
ma cadas com os mesmos an ico pos que nos ensaios an e io es. Os esul ados são
exp essos como média ± des io pad ão e são p o enien es da análise, em duplicado, de
células ob idas de 9 dado es (5 do sexo eminino e 4 do sexo masculino), como demons a
a igu a 22.
2014|Ana Filipa Fe ei a
77
Os alo es de luo escência emi idos pela RHO 123 nas células em es udo o am os
seguin es:
A análise da igu a 22 demons a que exis e di e ença signi ica i a en e a
ac i ação com o indu o TX5 e a ac i ação nas células con olo (p <0,0001 pa a ambas as
concen ações) e que não exis em di e enças na ac i ação da P-gp pelas di e en es
concen ações de TX5 (p>0,05). A análise dos dados de luo escência indica que a TX5 na
concen ação de 20 µM esul a num aumen o da ac i idade nes e es udo de ce ca de 70% e
de 54% pa a a concen ação de 80 µM.
Con olo
TX5 20 µM
TX5 80 µM
Es udo da ac i ação com ma cação de an ico pos: CD45+ e CD3+
100%
169,928%
154,235%
Figu a
22: G á ico ep esen a i o da análise da ac i ação de glicop o eína –P, nas concen ações de 20
μ
M e 80 μM de TX5, com a ma cação de CD3 e CD45. Os esul ados são exp essos como média ± d
es io
pad ão e são p o enien es da análise, em duplicado, de células ob idas de 9 dado es (5 do sexo eminino
e 4 do sexo masculino). As compa ações es a ís icas o am ei as u ilizando o mé odo não pa amé ico de
K uskal
-Wallis (one-way ANOVA on anks), seguido pelo pos -hoc
es e de Dunn (**** p <0,0001
e sus
con olo).
2014| Ana Filipa Fe ei a
84
concen ação de TX5 (X) co esponde à gama de concen ações de 0,5 a 150 μM (11
pad ões de concen ações di e en es):
0; 0,5; 1,0; 2,0; 5,0; 10,0; 20,0; 40,0; 80,0; 100,0 e 150μM
A igu a 25 ep esen a o c oma og ama ob ido nas gamas de concen ação
u ilizadas, 0,5-150 µM de TX5 incluindo o b anco. O empo de e enção oi de
ap oximadamen e 13 minu os. A en e de sol en e apa ece com empo de e enção
di e en e, ap oximadamen e 4 minu os.
A linea idade oi calculada a a és das médias de 5 ec as de calib ação p epa adas
em 5 dias consecu i os. Es es alo es o am conside ados adequados pa a e i ica a
linea idade da eg essão que esul ou na cu a de calib ação seguin e ( igu a 26):
Y = 5,112*X + 0,7640
Figu a
25: C oma og ama da espec i a gama de concen ações (0,5-
150µM incluindo o b anco), após
op imização de condições c oma og
á icas, com empo de e enção do analí o de
ap oximadamen e 13 minu os.
A en e de sol en e ap esen a empo de e enção de 4 minu os, ap oximadamen e.

2014|Ana Filipa Fe ei a
85
Nes a análise, u iliza am-se as médias das á eas dos picos ob idas nos duplicados.
A linea idade oi alcançada com um coe icien e de co elação (R2) mínimo de 0,99 em
odo o in e alo de concen ações, indicando uma elação linea nes a gama, e o alo de
des io pad ão esidual como ac o de espos a oi de 17,02%. O alo ob ido de p <0,0001
nes a análise co esponde a uma cu a de calib ação com decli e signi ica i amen e
di e en e de ze o. Os núme os ob idos em X o am 13 e os ob idos em Y o am 20. A
abela 7 ap esen a os alo es es a ís icos da ec a ob ida e são ap esen ados com 95% de
in e alo de con iança.
Tabela 7: Valo es médios e alo es com 95% de ní el de con iança espec i amen e à ec a Y = 5,112*X +
0,7640 que ap esen ou co elação linea de R2≥0,99.
Valo es de ajus e
Decli e
5,112 ± 0,03143
In e cepção em Y quando X=0
0,7640 ± 1,695
In e cepção em X quando Y=0
-0,1495
1/Decli e
0,1956
Com 95% de in e alo de con iança
Decli e
5,050 - 5,174
In e cepção em Y quando X=0
-2,558 - 4,086
In e cepção em X quando Y=0
-0,8045 - 0,4972
Figu a 26: Rep esen ação g á ica da ec a de calib ação que elaciona a á ea do pico (Y) em
mV/s com a concen ação de TX5 (X
) em µM esul ado na equação Y = 5,112*X + 0,7640
com
R
2≥0,99.
2014| Ana Filipa Fe ei a
86
Qualidade de ajus e
R
2
0,9948
Des io pad ão esidual (Sy.x)
17,02%
É o decli e di e en e de Ze o?
F
26458
DFn, DFd
1,000, 139,0
Valo de P
<0,0001
Des io de ze o?
Signi ica i o
Valo es
Núme o de alo es
13
Núme o máximo de éplicas em Y
20
Núme o o al de alo es
141
Núme os o ais pe didos
119
Equação
Y = 5,112*X + 0,7640
4.3.2 P ecisão in e -dia e exac idão do mé odo
A p ecisão in e -dia e a exac idão do mé odo o am calculadas a a és da injecção e
análise de cinco ec as di e en es em cinco dias consecu i os de soluções pad ão
p epa adas dia iamen e com as 11 concen ações conside adas pa a a cu a de calib ação
(0; 0,5; 1,0; 2,0; 5,0; 10,0; 20,0; 40,0; 80,0; 100,0 e 150,0 μM). Pa a a alia , o am
escolhidas ês concen ações: uma baixa (1 μM), uma média (10 μM) e ou a al a (100
μM). Na igu a 27 obse a-se o c oma og ama ob ido nes as ês concen ações. O empo
de e enção é de ap oximadamen e de 13 minu os e a á ea dos picos aumen a na mesma
p opo ção que aumen a a concen ação de TX5.
2014|Ana Filipa Fe ei a
87
As amos as o am p epa adas em iplicado e injec adas em duplicado, sendo
usadas as médias des es alo es. Na abela 8 são ap esen ados os esul ados.
Tabela 8: Resul ados ob idos na análise da p ecisão in e -dia e exac idão do mé odo nas concen ações de 1,
10 e 100 μM.
Concen ação
(μM)
Á ea do Pico
(média ±SD) CV (%) Exac idão (%)
1 6,288 ± 0,495 7,87 8,07
10 49,554 ± 4,680 9,44 -4,56
100 536,905 ± 13,109 2,44 4,88
Após análise dos esul ados, e i ica-se que o coe icien e de a iação (CV) é semp e
abaixo dos 10% (2,44%-9,44%), concluindo-se que nas di e en es injecções e em
di e en es cu as p epa adas nos cinco dias consecu i os, os pad ões não se al e am. Ou
seja, o mé odo é p eciso na análise do compos o quando p epa ado e injec ado em
di e en es momen os.
Figu a 27: C oma og ama das espec i as ês concen ações seleccionadas: uma baixa, 1 μM ep esen ada a
e melho, uma média, 10
μM ep esen ada a azul, e uma al a, 100 μM ep esen ada a e de, de TX5.
2014| Ana Filipa Fe ei a
88
A exac idão a alia a pe cen agem da amos a que se dis ingue da média dos
pad ões. Nes e caso, oi calculada pela ó mula seguin e:
𝐸𝐸𝐸𝐸𝐸𝐸𝐸𝐸𝐸𝐸𝐸𝐸ã𝑜𝑜 (%)=(𝐶𝐶𝑜𝑜𝐶𝐶𝐶𝐶𝐶𝐶𝐶𝐶𝐸𝐸𝐶𝐶𝐸𝐸çã𝑜𝑜 𝑚𝑚é𝐸𝐸𝐸𝐸𝐸𝐸 𝐶𝐶𝐸𝐸𝑚𝑚𝐶𝐶𝑐𝑐𝑚𝑚𝐸𝐸𝐸𝐸𝐸𝐸)−(𝐶𝐶𝑜𝑜𝐶𝐶𝐶𝐶𝐶𝐶𝐶𝐶𝐸𝐸𝐶𝐶𝐸𝐸çã𝑜𝑜 𝐶𝐶𝑜𝑜𝑚𝑚𝐸𝐸𝐶𝐶𝐸𝐸𝑚𝑚)
(𝐶𝐶𝑜𝑜𝐶𝐶𝐶𝐶𝐶𝐶𝐶𝐶𝐸𝐸𝐶𝐶𝐸𝐸çã𝑜𝑜 𝐶𝐶𝑜𝑜𝑚𝑚𝐸𝐸𝐶𝐶𝐸𝐸𝑚𝑚) 𝐸𝐸 100
Como esul ado, ob i emos uma boa exac idão uma ez que o maio alo ob ido é
in e io a 10%. Sabendo que, quan o mais p óximo de ze o, mais exac o é o mé odo, os
esul ados ob idos con i mam que o mé odo é exac o.
4.3.3 P ecisão in a-dia do equipamen o
Não só o mé odo de e se es ado quan o à sua p ecisão, mas ambém o
equipamen o o de e se . A p ecisão in a-dia do equipamen o de HPLC oi de e minada
injec ando e analisando 5 ezes no mesmo dia os 11 pad ões de uma cu a de calib ação
(0; 0,5; 1,0; 2,0; 5,0; 10,0; 20,0; 40,0; 80,0; 100,0 e 150,0 μM), ou seja, injecções 5 ezes
consecu i as de uma mesma cu a de calib ação (injecção de cada pad ão em duplicado)
( abela 9).
 Fo am escolhidas ês concen ações ep esen a i as: 1, 10 e 100µM
Tabela 9: Resul ados ob idos na análise da p ecisão in a-dia do equipamen o nas concen ações de 1, 10 e
100 μM.
Concen ação (μM) Á ea do Pico
(média ±SD) CV (%)
1 6,688 ± 0,3709 5,55
10 51,196 ± 1,277 2,49
100 573,971 ± 3,810 0,66
2014|Ana Filipa Fe ei a
89
Nes e pa âme o, e i ica-se que o equipamen o é p eciso, uma ez que após
análise de esul ados, o coe icien e de a iação é in e io a 10%. A concen ação com maio
coe icien e de a iação é a concen ação de 1 μM que ob e e um coe icien e igual a 5,55%,
e a concen ação de meno coe icien e de a iação oi de 100 μM, com 0,66%. O ac o de o
coe icien e de a iação diminui com o aumen o da concen ação dos pad ões injec ados
explica-se po que, quan o maio a concen ação, meno são as a iações na de e minação
pelo equipamen o. Na igu a 27, é possí el e o c oma og ama que en ol eu as ês
concen ações eque idas pa a es a análise es a ís ica. Em conclusão, pode-se a i ma que
es e equipamen o é capaz de alida es e mé odo nes as condições.
4.3.4 P ecisão in a-dia do mé odo
A p ecisão in a-dia do mé odo oi de e minada injec ando e analisando, no
mesmo dia, 5 eplicados de cada um dos 11 pad ões da cu a de calib ação (0; 0,5; 1,0;
2,0; 5,0; 10,0; 20,0; 40,0; 80,0; 100,0 e 150,0 μM), ou seja, injecções consecu i as e no
mesmo dia de 5 cu as de calib ação di e en es, injec adas em duplicado. Fo am
escolhidas ês concen ações ep esen a i as: 1, 10 e 100µM ( abela 10).
Tabela 10: Resul ados ob idos na análise da p ecisão in a-dia do mé odo nas concen ações de 1, 10 e 100
μM.
No es udo da p ecisão in a-dia do mé odo, e i ica-se após análise dos esul ados,
que o coe icien e de a iação é semp e in e io a 10% (4,16%-7,97%), concluindo-se que
es e mé odo é e icien e pa a a análise e de e minação da TX5. Na igu a 27, é possí el e
o c oma og ama que en ol eu as ês concen ações eque idas pa a es a análise
es a ís ica.
Concen ação (μM)
Á ea do Pico
(média ±SD)
CV (%)
1
6,560 ± 0,485
7,39
10
50,794 ± 4,050
7,97
100
538,756 ± 22,424
4,16

2014| Ana Filipa Fe ei a
90
4.3.5 Es abilidade do TX5 após p ocessamen o da amos a
A es abilidade de um compos o é de e minada pela capacidade des e se man e
in ac o após p epa ação. Podem se es udados ac o es como: exposição à luz;
a mazenamen o a empe a u as como, 4°C, -20°C ou empe a u a ambien e; ou
a mazenamen o das amos as po um de e minado pe íodo de empo.
Na alidação des e mé odo, a es abilidade oi de e minada pela análise das
amos as que o am injec as no equipamen o após p epa ação e pos e io a mazenamen o
a 4°C po um pe íodo de se e dias, sendo no amen e injec adas no HPLC após esse
pe íodo, como ep esen a o esquema seguin e. Em expe iências ei as du an e a
op imização des e mé odo (dados não ap esen ados), o compos o mos ou não se deg ada
após o a mazenamen o à empe a u a ambien e ou à empe a u a de -20°C após ex acção
com me anol e pos e io a mazenamen o. O empo de in e alo es ipulado oi de 7 dias e a
escolha des a empe a u a oi uma opção p óp ia. O compos o es e e semp e p o egido da
luz, po ecomendações do labo a ó io de química o gânica, uma ez que a TX5 é
o ossensí el.
O es udo da es abilidade oi ealizado com as concen ações 1, 10 e 100 µM,
p epa adas em iplicado e injec adas em duplicado. Seguiu-se o esquema seguin e:
Como esul ado da injecção das amos as pa a o es udo da es abilidade, ob i e am-
se os c oma og amas que suge em que o compos o nes a ma iz é es á el. No
c oma og ama seguin e ( igu a 28), é possí el e um exemplo da análise de es abilidade
na concen ação de 10 μM: quando injec ada no mesmo dia da p epa ação (co e de);
após 7 dias a mazenada a 4°C e ao ab igo da luz (co osa). Nes e c oma og ama, os
empos de e enção não são exac amen e iguais, uma ez que oi p epa ada uma no a ase
mó el, ac o que le a a ligei as al e ações no empo de e enção.
2014|Ana Filipa Fe ei a
91
Após análise es a ís ica, os esul ados ob idos o am posi i os pa a o pa âme o da
es abilidade ( abela 11).
Tabela 11: Resul ados ob idos na análise da es abilidade do compos o nas concen ações de 1, 10 e 100 μM.
Não oi obse ado nenhum ipo de deg adação nes e es udo. A a iação ob ida
nes as ês concen ações du an e os se e dias oi mui o p óxima de 100% (98,80%-
101,71%) e elando que o compos o pe maneceu in ac o. O es udo da es abilidade nas
concen ações de 1, 10 e 100 μM p o ou que TX5, numa ma iz de so o com p ecipi ação
Concen ação
(μM)
Á ea do Pico ‒
injecção
imedia a
(média ±SD)
Á ea do Pico ‒
injecção 7 dias
após
p ocessamen o
(média ±SD)
Va iação (%)
1 6,396 ± 0,855 6,423± 0,805 100,98 ± 9,12
10 50,990 ± 2,203 51,834 ± 2,565 101,71 ± 4,37
100 500,134 ± 44,524 493,706 ± 44,140 98,80 ± 4,54
Figu a 28: C oma og ama que ep esen a a concen ação pad ão de 10 μM injec ada no mesmo dia da p epa ação e
após 7 dias, a mazenada a 4°C, ao ab igo da luz. Nes e c oma og ama, os empos de e enção não são exac amen e
iguais, uma ez que oi p
epa ada uma no a ase mó el, ac o que le a a ligei as al e ações no empo de e enção.
2014| Ana Filipa Fe ei a
92
Adição de TX 5 an es da
p ecipi ação p o eica – A1
de p o eínas po me anol, ao inal de 7 dias e a mazenados a 4°C, é es á el. Em u u as
expe iências de de e minação e análise de TX5, podem-se cump i as mesmas condições
de p epa ação e a mazenamen o de amos as.
4.3.6 Recupe ação da TX 5
A análise de ecupe ação consis e na a aliação da pe cen agem que se pe de no
manuseamen o das amos as. Nes e caso, a p ecipi ação de p o eínas p esen es no so o
com me anol pode á le a a al e ações na quan idade de TX5. Des a o ma, a ecupe ação
oi de e minada a a és do cálculo, em pe cen agem, das concen ações de cada ní el a
que co esponde à concen ação eó ica.
Po an o, a p epa ação das amos as dos pad ões de 1, 10 e 100 µM o am
p epa ados como mos a o seguin e esquema:
Após injecção das amos as com concen ação de 1, 10 e 100 µM p epa adas em
iplicado e injec adas em duplicado (usadas as médias des es alo es). No seguin e
c oma og ama ( igu a 29) é ap esen ada a concen ação de 10 µM injec ada sob e o
p o ocolo A1 (adição de TX 5 an es da p ecipi ação p o eica) (co osa) e A2 (adição de TX
5 após a p ecipi ação p o eica) (co e de).
Adição de TX 5 após a p ecipi ação
p o eica – A2
2014|Ana Filipa Fe ei a
93
A abela 12 ap esen a os alo es de ecupe ação ob idos em amos as a adas de
o ma di e en e: A1 e A2.
Tabela 12: Resul ados ob idos na análise da ecupe ação do compos o nas concen ações de 1, 10 e 100 μM.
Concen ação
(μM)
Á ea do Pico ‒
adição TX 5 an es
da p ecipi ação
p o eica
(média ±SD)
Á ea do Pico ‒
adição TX 5 após
p ecipi ação
p o eica (média
±SD)
Recupe ação
(%)
A1 x 100/ A2
1 6,396 ± 0,855 7,467 ± 0,411 85,96 ± 13,40
10 50,990 ± 2,203 73,228 ± 3,470 69,82 ± 5,36
100 500,134 ± 44,524 715,288 ± 13,384 69,91 ± 5,88
Figu a
29: C oma og ama que ep esen a a concen ação pad ão de 10 μM injec ada quando TX5 é
adicionado an es da p ecipi ação p o eica A1 (co osa) e a concen ação pad ão de 10 μM injec ada quando
TX5 é adicionado após p ecipi ação p o eica com me anol A2 (co e
de).
2014| Ana Filipa Fe ei a
100
quando é induzida de o ma aguda pelo TX5 é de g ande impo ância, mos ando se uma
an agem pa a con a ia de o ma ápida in oxicações po subs a os da P-gp.
Po ou o lado, não é possí el conclui que a exp essão da P-gp induzida pela TX5 é
dependen e da concen ação, embo a se enham ob ido esul ados signi ica i amen e
di e en es com as duas concen ações. Pode-se apenas suge i que exis e uma endência.
Po im, os dados não nos pe mi em elaciona aumen o de ac i idade com aumen o de
exp essão, ou ice- e sa.
No es udo in i o ealizado com a os Cha les Ri e , e i icou-se que a
a macociné ica da digoxina du an e 0s 420 minu os em es udo oi al e ada quando
adminis ada concomi an emen e com TX5. Pode-se assim conclui que as di e enças na
BD da digoxina se de em ao e ei o da TX5 no apa elho gas oin es inal dos animais,
possi elmen e po aumen o da ac i idade des a p o eína à supe ície dos en e óci os.
Induzi a exp essão e a ac i idade da P-gp em lin óci os T pela TX5, bem como
aumen a o mecanismo de e luxo, como demons ado no es udo in i o, pode se
ex emamen e impo an e pa a a oxicologia clínica, po exemplo como an ído o em
in oxicações po subs a os da P-gp. No en an o, é de salien a que, apesa dos esul ados
mos a em que a P-gp pode se uma ia de a amen o e icien e em casos de in oxicações
mediada po subs a os da P-gp, como a PQ, esul ando numa edução signi ica i a nos
ní eis in acelula es e, consequen emen e, numa edução signi ica i a da sua oxicidade,
ainda mui os es udos podem e de em se ei os elacionando a P-gp, a sua indução e
ac i ação como uma es a égia e apêu ica e icaz.
Po im, mas não menos impo an e, a alidação de um mé odo simples de
quan i icação de TX5 po HPLC em ase e e sa com eluição isoc á ica oi desen ol ido
com sucesso. Es e mé odo oi alidado de aco do com as di ec izes do ICH, a a és do
es udo da linea idade, ecupe ação e p ecisão do mé odo e do equipamen o. Os esul ados
ob idos mos a am, sem ma gem pa a dú idas, que es e mé odo é especí ico, linea ,
ep odu í el e p eciso no in e alo de concen ações escolhido (0,5-150 µM de TX5). Des a
o ma, o mé odo desen ol ido pode á se no u u o u ilizado como mé odo de
quan i icação e análise de TX5. É um mé odo simples e de cus os baixos podendo se
adop ado pa a a análise de o ina des e compos o num labo a ó io de análise química.

2014|Ana Filipa Fe ei a
101
Pa e VI
Re e ências
Bibliog á icas
2014| Ana Filipa Fe ei a
102
2014|Ana Filipa Fe ei a
103
6 REFERÊNCIAS BIBLIOGRÁFICAS
Akamine, Y., N. Yasui-Fu uko i, I. Iei i and T. Uno (2012). "Psycho opic d ug-d ug
in e ac ions in ol ing P-glycop o ein." CNS D ugs 26(11): 959-973.
Al-Khazaali, A. and R. A o a (2014). "P-glycop o ein: a ocus on cha ac e izing a iabili y
in ca dio ascula pha maco he apeu ics." Am J The 21(1): 2-9.
Allabi, A. C., J. L. Gala and Y. Ho smans (2005). "CYP2C9, CYP2C19, ABCB1 (MDR1)
gene ic polymo phisms and pheny oin me abolism in a Black Beninese popula ion."
Pha macogene Genomics 15(11): 779-786.
Alle , S. G., J. Yu, A. Wa d, Y. Weng, S. Chi aboina, R. Zhuo, P. M. Ha ell, Y. T. T inh, Q.
Zhang, I. L. U ba sch and G. Chang (2009). "S uc u e o P-glycop o ein e eals a
molecula basis o poly-speci ic d ug binding." Science 323(5922): 1718-1722.
Ambudka , S. V., S. Dey, C. A. H ycyna, M. Ramachand a, I. Pas an and M. M. Go esman
(1999). "Biochemical, cellula , and pha macological aspec s o he mul id ug anspo e ."
Annu Re Pha macol Toxicol 39: 361-398.
Amin, M. L. (2013). "P-glycop o ein Inhibi ion o Op imal D ug Deli e y." D ug Ta ge
Insigh s 7: 27-34.
A ceci, R. J., J. M. C oop, S. B. Ho wi z and D. Housman (1988). "The gene encoding
mul id ug esis ance is induced and exp essed a high le els du ing p egnancy in he
sec e o y epi helium o he u e us." P oc Na l Acad Sci U S A 85(12): 4350-4354.
Ay on, A. and P. Mo gan (2008). "Role o anspo p o eins in d ug disco e y and
de elopmen : a pha maceu ical pe spec i e." Xenobio ica 38(7-8): 676-708.
Bain, L. J., J. B. McLachlan and G. A. LeBlanc (1997). "S uc u e-ac i i y ela ionships o
xenobio ic anspo subs a es and inhibi o y ligands o P-glycop o ein." En i on Heal h
Pe spec 105(8): 812-818.
Bal aza , M. T., R. J. Dinis-Oli ei a, A. Ma ins, L. Bas os Mde, J. A. Dua e, L.
Guilhe mino and F. Ca alho (2014). "Lysine ace ylsalicyla e inc eases he sa e y o a
pa aqua o mula ion o eshwa e p ima y p oduce s: a case s udy wi h he mic oalga
Chlo ella ulga is." Aqua Toxicol 146: 137-143.
Ba ako a, E. V., D. W. Mille , S. Li, V. Y. Alakho , A. V. Kabano and W. F. Elmquis
(2001). "Plu onic P85 enhances he deli e y o digoxin o he b ain: in i o and in i o
s udies." J Pha macol Exp The 296(2): 551-557.
Bendayan, R., G. Lee and M. Bendayan (2002). "Func ional exp ession and localiza ion o
P-glycop o ein a he blood b ain ba ie ." Mic osc Res Tech 57(5): 365-380.
2014| Ana Filipa Fe ei a
104
Biosciences, B. (2000). "In oduc ion o Flow Cy ome y: A Lea ning Guide." Re ie ed
05 de Se emb o de 2014, om
h p://www.d.umn.edu/~biomed/ lowcy ome y/in o lowcy ome y.pd .
Biosciences, B. (2012). "BD Accu i C6 Flow cy ome e ins umen al guide." Re ie ed 18
Augus 2014, om
h ps://www.bdbiosciences.com/documen s/BD_Accu i_C6Flow_Cy o_Ins umen _Ma
nual.pd .
Bo s , P. and R. O. El e ink (2002). "Mammalian ABC anspo e s in heal h and disease."
Annu Re Biochem 71: 537-592.
Bu k, O., K. A. A nold, A. Geick, H. Tegude and M. Eichelbaum (2005). "A ole o
cons i u i e and os ane ecep o in he egula ion o human in es inal MDR1 exp ession."
Biol Chem 386(6): 503-513.
Callen, D. F., E. Bake , R. N. Simme s, R. Seshad i and I. B. Roninson (1987).
"Localiza ion o he human mul iple d ug esis ance gene, MDR1, o 7q21.1." Hum Gene
77(2): 142-144.
Cas anhei o, R. A., M. M. Pin o, A. M. Sil a, S. M. C a o, L. Gales, A. M. Damas, N.
Naza e h, M. S. Nascimen o and G. Ea on (2007). "Dihyd oxyxan hones p enyla ed
de i a i es: syn hesis, s uc u e elucida ion, and g ow h inhibi o y ac i i y on human
umo cell lines wi h imp o emen o selec i i y o MCF-7." Bioo g Med Chem 15(18):
6080-6088.
Chan, A., R. Gold and N. on Ahsen (2011). "ATP-binding casse e anspo e s in
in lamma o y b ain disease." Cu Pha m Des 17(26): 2803-2807.
Chaudha y, P. M., E. B. Meche ne and I. B. Roninson (1992). "Exp ession and ac i i y o
he mul id ug esis ance P-glycop o ein in human pe iphe al blood lymphocy es." Blood
80(11): 2735-2739.
Chaudha y, P. M. and I. B. Roninson (1991). "Exp ession and ac i i y o P-glycop o ein, a
mul id ug e lux pump, in human hema opoie ic s em cells." Cell 66(1): 85-94.
Chen, C. J., D. Cla k, K. Ueda, I. Pas an, M. M. Go esman and I. B. Roninson (1990).
"Genomic o ganiza ion o he human mul id ug esis ance (MDR1) gene and o igin o P-
glycop o eins." J Biol Chem 265(1): 506-514.
Chin, J. E., R. So i , K. E. Noonan, K. Choi and I. B. Roninson (1989). "S uc u e and
exp ession o he human MDR (P-glycop o ein) gene amily." Mol Cell Biol 9(9): 3808-
3820.
Choudhu i, S. and C. D. Klaassen (2006). "S uc u e, unc ion, exp ession, genomic
o ganiza ion, and single nucleo ide polymo phisms o human ABCB1 (MDR1), ABCC
(MRP), and ABCG2 (BCRP) e lux anspo e s." In J Toxicol 25(4): 231-259.
2014|Ana Filipa Fe ei a
105
Ch is ians, U. (2004). "T anspo p o eins and in es inal me abolism: P-glycop o ein and
cy och ome P4503A." The D ug Moni 26(2): 104-106.
Colabu o, N. A., F. Be a di, M. Con ino, M. Niso and R. Pe one (2009). "ABC pumps and
hei ole in ac i e d ug anspo ." Cu Top Med Chem 9(2): 119-129.
Co don-Ca do, C., J. P. O'B ien, J. Boccia, D. Casals, J. R. Be ino and M. R. Melamed
(1990). "Exp ession o he mul id ug esis ance gene p oduc (P-glycop o ein) in human
no mal and umo issues." J His ochem Cy ochem 38(9): 1277-1287.
Co don-Ca do, C., J. P. O'B ien, D. Casals, L. Ri man-G aue , J. L. Biedle , M. R.
Melamed and J. R. Be ino (1989). "Mul id ug- esis ance gene (P-glycop o ein) is
exp essed by endo helial cells a blood-b ain ba ie si es." P oc Na l Acad Sci U S A
86(2): 695-698.
Dan zig, A. H., D. P. de Alwis and M. Bu gess (2003). "Conside a ions in he design and
de elopmen o anspo inhibi o s as adjunc s o d ug he apy." Ad D ug Deli Re
55(1): 133-150.
DeGo e , M. K., C. Q. Xia, J. J. Yang and R. B. Kim (2012). "D ug anspo e s in d ug
e icacy and oxici y." Annu Re Pha macol Toxicol 52: 249-273.
Die ich, C. G., A. Geie and R. P. Oude El e ink (2003). "ABC o o al bioa ailabili y:
anspo e s as ga ekeepe s in he gu ." Gu 52(12): 1788-1795.
Dinis-Oli ei a, R. J., J. A. Dua e, F. Remiao, A. Sanchez-Na a o, M. L. Bas os and F.
Ca alho (2006). "Single high dose dexame hasone ea men dec eases he pa hological
sco e and inc eases he su i al a e o pa aqua -in oxica ed a s." Toxicology 227(1-2):
73-85.
Dinis-Oli ei a, R. J., F. Remiao, J. A. Dua e, R. Fe ei a, A. Sanchez Na a o, M. L.
Bas os and F. Ca alho (2006). "P-glycop o ein induc ion: an an ido al pa hway o
pa aqua -induced lung oxici y." F ee Radic Biol Med 41(8): 1213-1224.
Dö ing, B. and E. Pe zinge (2014). "Phase 0 and phase III anspo in a ious o gans:
Combined concep o phases in xenobio ic anspo and me abolism." D ug Me abolism
Re iews 0(0): 1-22.
D esse , G. K., U. I. Schwa z, G. R. Wilkinson and R. B. Kim (2003). "Coo dina e
induc ion o bo h cy och ome P4503A and MDR1 by S John's wo in heal hy subjec s."
Clin Pha macol The 73(1): 41-50.
Eck o d, P. D. and F. J. Sha om (2009). "ABC e lux pump-based esis ance o
chemo he apy d ugs." Chem Re 109(7): 2989-3011.
Fojo, A. T., K. Ueda, D. J. Slamon, D. G. Poplack, M. M. Go esman and I. Pas an (1987).
"Exp ession o a mul id ug- esis ance gene in human umo s and issues." P oc Na l Acad
Sci U S A 84(1): 265–269.

2014| Ana Filipa Fe ei a
106
F anke, R. M., E. R. Ga dne and A. Spa eboom (2010). "Pha macogene ics o d ug
anspo e s." Cu Pha m Des 16(2): 220-230.
F icke , G. and D. S. Mille (2004). "Modula ion o d ug anspo e s a he blood-b ain
ba ie ." Pha macology 70(4): 169-176.
F omm, M. F. (2003). "Impo ance o P-glycop o ein o d ug disposi ion in humans." Eu
J Clin In es 33 Suppl 2: 6-9.
F omm, M. F. (2004). "Impo ance o P-glycop o ein a blood- issue ba ie s." T ends
Pha macol Sci 25(8): 423-429.
Gil, S., R. Sau a, F. Fo es ie and R. Fa ino i (2005). "P-glycop o ein exp ession o he
human placen a du ing p egnancy." Placen a 26(2-3): 268-270.
Go esman, M. M. and S. V. Ambudka (2001). "O e iew: ABC anspo e s and human
disease." J Bioene g Biomemb 33(6): 453-458.
Go esman, M. M., T. Fojo and S. E. Ba es (2002). "Mul id ug esis ance in cance : ole o
ATP-dependen anspo e s." Na Re Cance 2(1): 48-58.
Go esman, M. M., C. A. H ycyna, P. V. Schoenlein, U. A. Ge mann and I. Pas an (1995).
"Gene ic analysis o he mul id ug anspo e ." Annu Re Gene 29: 607-649.
G eine , B., M. Eichelbaum, P. F i z, H. P. K eichgaue , O. on Rich e , J. Zundle and H.
K. K oeme (1999). "The ole o in es inal P-glycop o ein in he in e ac ion o digoxin and
i ampin." J Clin In es 104(2): 147-153.
Handschin, C. and U. A. Meye (2003). "Induc ion o d ug me abolism: he ole o nuclea
ecep o s." Pha macol Re 55(4): 649-673.
Ha z, A. M., D. S. Mille and B. Baue (2010). "Res o ing blood-b ain ba ie P-
glycop o ein educes b ain amyloid-be a in a mouse model o Alzheime 's disease." Mol
Pha macol 77(5): 715-723.
He, S. M., R. Li, J. R. Kanwa and S. F. Zhou (2011). "S uc u al and unc ional p ope ies
o human mul id ug esis ance p o ein 1 (MRP1/ABCC1)." Cu Med Chem 18(3): 439-
481.
Henmi, K., M. Yoshida, N. Yoshikawa and T. Hi ano (2008). "P-glycop o ein unc ions in
pe iphe al-blood CD4+ cells o pa ien s wi h sys emic lupus e y hema osus." Biol Pha m
Bull 31(5): 873-878.
Hennessy, M. and J. P. Spie s (2007). "A p ime on he mechanics o P-glycop o ein he
mul id ug anspo e ." Pha macological Resea ch 55(1): 1-15.
Hi ano, T., K. Onda, T. Toma, M. Miyaoka, F. Mo iyasu and K. Oka (2004). "MDR1 mRNA
exp essions in pe iphe al blood mononuclea cells o pa ien s wi h ulce a i e coli is in
ela ion o glucoco icoid adminis a ion." J Clin Pha macol 44(5): 481-486.
2014|Ana Filipa Fe ei a
107
Ho mann, U. and H. K. K oeme (2004). "The ABC anspo e s MDR1 and MRP2:
mul iple unc ions in disposi ion o xenobio ics and d ug esis ance." D ug Me ab Re
36(3-4): 669-701.
Ho meye , S., O. Bu k, O. on Rich e , H. P. A nold, J. B ockmolle , A. Johne, I. Casco bi,
T. Ge lo , I. Roo s, M. Eichelbaum and U. B inkmann (2000). "Func ional
polymo phisms o he human mul id ug- esis ance gene: mul iple sequence a ia ions
and co ela ion o one allele wi h P-glycop o ein exp ession and ac i i y in i o." P oc Na l
Acad Sci U S A 97(7): 3473-3478.
ICH, E. g. (1997). "Q2B Valida ion o analy ical p ocedu es: Me hodology."
Jones, P. M. and A. M. Geo ge (2004). "The ABC anspo e s uc u e and mechanism:
pe spec i es on ecen esea ch." Cell Mol Li e Sci 61(6): 682-699.
Kalabis, G. M., A. Kos aki, M. H. And ews, S. Pe opoulos, W. Gibb and S. G. Ma hews
(2005). "Mul id ug esis ance phosphoglycop o ein (ABCB1) in he mouse placen a: e al
p o ec ion." Biol Rep od 73(4): 591-597.
Kim, R. B. (2002). "D ugs as P-glycop o ein subs a es, inhibi o s, and induce s." D ug
Me ab Re 34(1-2): 47-54.
Kim, R. B., B. F. Leake, E. F. Choo, G. K. D esse , S. V. Kubba, U. I. Schwa z, A. Taylo , H.
G. Xie, J. McKinsey, S. Zhou, L. B. Lan, J. D. Schue z, E. G. Schue z and G. R. Wilkinson
(2001). "Iden i ica ion o unc ionally a ian MDR1 alleles among Eu opean Ame icans
and A ican Ame icans." Clin Pha macol The 70(2): 189-199.
Kimchi-Sa a y, C., J. M. Oh, I. W. Kim, Z. E. Sauna, A. M. Calcagno, S. V. Ambudka and
M. M. Go esman (2007). "A "silen " polymo phism in he MDR1 gene changes subs a e
speci ici y." Science 315(5811): 525-528.
Klein, I., B. Sa kadi and A. Va adi (1999). "An in en o y o he human ABC p o eins."
Biochim Biophys Ac a 1461(2): 237-262.
Klimecki, W. T., B. W. Fu sche , T. M. G ogan and W. S. Dal on (1994). "P-glycop o ein
exp ession and unc ion in ci cula ing blood cells om no mal olun ee s." Blood 83(9):
2451-2458.
Kobo i, T., S. Ha ada, K. Nakamo o and S. Tokuyama (2014). "Mechanisms o p-
glycop o ein al e a ion du ing an icance ea men : ole in he pha macokine ic and
pha macological e ec s o a ious subs a e d ugs." J Pha macol Sci 125(3): 242-254.
Kock, K., M. G ube, G. Jedli schky, L. Oe e mann, W. Siegmund, C. A. Ri e and H. K.
K oeme (2007). "Exp ession o adenosine iphospha e-binding casse e (ABC) d ug
anspo e s in pe iphe al blood cells: ele ance o physiology and pha maco he apy."
Clin Pha macokine 46(6): 449-470.
Kooij, G., M. R. Mizee, J. an Ho ssen, A. Reije ke k, M. E. Wi e, J. A. D exhage, S. M.
an de Pol, B. an He Ho , G. Sche e , R. Schepe , C. D. Dijks a, P. an de Valk and H.
2014| Ana Filipa Fe ei a
108
E. de V ies (2011). "Adenosine iphospha e-binding casse e anspo e s media e
chemokine (C-C mo i ) ligand 2 sec e ion om eac i e as ocy es: ele ance o mul iple
scle osis pa hogenesis." B ain 134(P 2): 555-570.
Kuma , S., S. Tandon and N. K. Sand (2014). "De e mina ion and me hod alida ion o
me ami on in soil by RP-HPLC." Bull En i on Con am Toxicol 92(2): 165-168.
Kuppens, I. E., E. O. Wi e een, R. C. Jewell, S. A. Radema, E. M. Paul, S. G. Mangum, J.
H. Beijnen, E. E. Voes and J. H. Schellens (2007). "A phase I, andomized, open-label,
pa allel-coho , dose- inding s udy o elac ida (GF120918) and o al opo ecan in cance
pa ien s." Clin Cance Res 13(11): 3276-3285.
Kwak, J. O., S. H. Lee, G. S. Lee, M. S. Kim, Y. G. Ahn, J. H. Lee, S. W. Kim, K. H. Kim and
M. G. Lee (2010). "Selec i e inhibi ion o MDR1 (ABCB1) by HM30181 inc eases o al
bioa ailabili y and he apeu ic e icacy o pacli axel." Eu J Pha macol 627(1-3): 92-98.
Leslie, E. M., R. G. Deeley and S. P. Cole (2005). "Mul id ug esis ance p o eins: ole o P-
glycop o ein, MRP1, MRP2, and BCRP (ABCG2) in issue de ense." Toxicol Appl
Pha macol 204(3): 216-237.
Lin, J. H. (2003). "D ug-d ug in e ac ion media ed by inhibi ion and induc ion o P-
glycop o ein." Ad D ug Deli Re 55(1): 53-81.
Lin, J. H. and M. Yamazaki (2003). "Clinical ele ance o P-glycop o ein in d ug he apy."
D ug Me ab Re 35(4): 417-454.
Lin, J. H. and M. Yamazaki (2003). "Role o P-glycop o ein in pha macokine ics: clinical
implica ions." Clin Pha macokine 42(1): 59-98.
Lomo skaya, O. and K. A. Bos ian (2006). "P ac ical applica ions and easibili y o e lux
pump inhibi o s in he clinic--a ision o applied use." Biochem Pha macol 71(7): 910-
918.
Lomo skaya, O., H. I. Zgu skaya, M. To o and W. J. Wa kins (2007). "Wal zing
anspo e s and ' he dance macab e' be ween humans and bac e ia." Na Re D ug Disco
6(1): 56-65.
Loo, T. W. and D. M. Cla ke (1999). "Me ck F oss Awa d Lec u e 1998. Molecula
dissec ion o he human mul id ug esis ance P-glycop o ein." Biochem Cell Biol 77(1): 11-
23.
Ma, J. D., S. M. Tsunoda, J. S. Be ino, J ., M. T i edi, K. K. Beale and A. N. Na zige
(2010). "E alua ion o in i o P-glycop o ein pheno yping p obes: a need o alida ion."
Clin Pha macokine 49(4): 223-237.
Magna in, M., M. Mo elli, A. Rosa i, F. Ba oli, L. Candussio, T. Gi aldi and G. Deco i
(2004). "Induc ion o p o eins in ol ed in mul id ug esis ance (P-glycop o ein, MRP1,
MRP2, LRP) and o CYP 3A4 by i ampicin in LLC-PK1 cells." Eu J Pha macol 483(1):
19-28.
2014|Ana Filipa Fe ei a
109
Maille e , J. F., M. Maynadie, J. G. Tebib, S. Aho, P. Walke , C. Cha a d, V. Dulieu, M.
Bou ie , P. M. Ca li and C. Ta e nie (1996). "Exp ession o he mul id ug esis ance
glycop o ein 170 in he pe iphe al blood lymphocy es o heuma oid a h i is pa ien s. The
pe cen age o lymphocy es exp essing glycop o ein 170 is inc eased in pa ien s ea ed
wi h p ednisolone." B J Rheuma ol 35(5): 430-435.
Maling e, M. M., J. H. Beijnen, H. Rosing, F. J. Koopman, R. C. Jewell, E. M. Paul, W. W.
Ten Bokkel Huinink and J. H. Schellens (2001). "Co-adminis a ion o GF120918
signi ican ly inc eases he sys emic exposu e o o al pacli axel in cance pa ien s." B J
Cance 84(1): 42-47.
Manceau, S., C. Gi aud, X. Decle es, F. Ba eux, C. Che eau, S. Chouzenoux, J. M.
Sche mann, B. Weill, J. Y. Pe o and J. M. T eluye (2012). "Exp ession and induc ion
by dexame hasone o ABC anspo e s and nuclea ecep o s in a human T-lymphocy e
cell line." J Chemo he 24(1): 48-55.
Ma in, C., G. Be idge, C. F. Higgins, P. Mis y, P. Cha l on and R. Callaghan (2000).
"Communica ion be ween mul iple d ug binding si es on P-glycop o ein." Mol Pha macol
58(3): 624-632.
Ma in, P., R. Riley, P. Thompson, D. Williams, D. Back and A. Owen (2010). "E ec o
p o o ypical induce s on ligand ac i a ed nuclea ecep o egula ed d ug disposi ion
genes in oden hepa ic and in es inal cells." Ac a Pha macol Sin 31(1): 51-65.
Ma zolini, C., E. Paus, T. Buclin and R. B. Kim (2004). "Polymo phisms in human MDR1
(P-glycop o ein): ecen ad ances and clinical ele ance." Clin Pha macol The 75(1): 13-
33.
Mase eeuw, R., S. No enboom, P. H. Smee s, A. C. Wou e se and F. G. Russel (2003).
"Impai ed enal sec e ion o subs a es o he mul id ug esis ance p o ein 2 in mu an
anspo -de icien (TR-) a s." J Am Soc Neph ol 14(11): 2741-2749.
Mas e s, K. S. and S. B ase (2012). "Xan hones om ungi, lichens, and bac e ia: he
na u al p oduc s and hei syn hesis." Chem Re 112(7): 3717-3776.
McIlle on, H., G. Mein jes, W. J. Bu man and G. Maa ens (2007). "Complica ions o
an i e o i al he apy in pa ien s wi h ube culosis: d ug in e ac ions, oxici y, and
immune econs i u ion in lamma o y synd ome." J In ec Dis 196 Suppl 1: S63-75.
Melaine, N., M. O. Liena d, I. Do al, C. Le Goascogne, H. Lejeune and B. Jegou (2002).
"Mul id ug esis ance genes and p-glycop o ein in he es is o he a , mouse, Guinea pig,
and human." Biol Rep od 67(6): 1699-1707.
Mo, W. and J. T. Zhang (2012). "Human ABCG2: s uc u e, unc ion, and i s ole in
mul id ug esis ance." In J Biochem Mol Biol 3(1): 1-27.