Hypoxis hemerocallidea (Batata Africana): Optimização da Metodologia de Preparação de Extractos e Avaliação da Actividade Antioxidante

Alberto Jequicene Chambe Hypoxis hemerocallidea (Batata Africana): Optimização da metodologia de preparação de extractos e avaliação da actividade antioxidante Dissertação elaborada no âmbito do Mestrado em Tecnologia Farmacêutica Área de especialização: Farmacotecnia Trabalho realizado sob a orientação de: Orientador: Professor Doutor Carlos Maurício Barbosa Co-orientador: Professor Doutor José Manuel Sousa Lobo Porto 2010 É AUTORIZADA A REPRODUÇÃO INTEGRAL DESTA DISSERTAÇÃO APENAS PARA EFEITOS DE INVESTIGAÇÃO, MEDIANTE DECLARAÇÃO ESCRITA DO INTERESSADO, QUE A TAL SE COMPROMETE À memória do meu pai Alberto Francisco Jequicene, que tanto me incentivou para o estudo de Farmácia. AGRADECIMENTOS Ao Professor Doutor Carlos Maurício Barbosa, orientador desta dissertação, pela orientação científica e pela amizade, apoio e incentivo com que sempre me honrou. Ao Professor Doutor José Manuel Sousa Lobo, co-orientador desta dissertação, pela orientação científica e revisão crítica deste trabalho, assim como pela amizade. À Professora Doutora Maria Fernanda Bahia pelo carinho e amizade com que me acolheu no Laboratório de Tecnologia Farmacêutica, aquando o inicio deste trabalho. À Professora Doutora Olga Maria Duarte Silva da Faculdade de Farmácia da Universidade de Lisboa pelo apoio facultado na liofilização das amostras e pela amizade e incentivo. À Professora Doutora Elsa Teixeira Gomes pelo carinho ao fornecer a amostra de Hypoxis hemerocallidea cultivada em Lisboa e pela amizade e incentivo. À Professora Doutora Maria de Fátima Alpendurada e ao Professor Doutor Carlos Gonçalves (IAREN) pela ajuda imprescindível à caracterização do hipoxósido. Ao laboratório de Bromatologia na pessoa da Professora Doutora Beatriz Oliveira por disponibilizar equipamentos necessários à realização deste trabalho; à Anabela, à Heryka, Professora Doutora Susana Casal, à Cristina e à Rita por toda a ajuda prestada. À Dra. Sara Cravo pelo apoio técnico no isolamento do hipoxósido e pela disponibilidade manifestada sempre que foi necessário. Ao Professor Doutor Carlos Afonso pela amizade, incentivo e apoio que sempre demonstrou durante todo o trabalho, em particular na análise crítica referente aos resultados obtidos, em relação ao isolamento do hipoxósido. À Professora Doutora Helena Amaral pelo carinho e pela amizade, sem esquecer a sua ajuda preciosa na validação do método HPLC. À Professora Doutora Isabel Filipa Almeida pela amizade e pelo apoio na realização do método do radical DPPH e na preparação dos extractos e pela disponibilidade manifestada sempre que foi necessário. Ao Professor Doutor Paulo Costa pela sua amizade e ajuda no tratamento estatístico dos dados. Ao Professor António Almeida, do laboratório de Tecnologia Farmacêutica da Faculdade de Farmácia da Universidade de Lisboa, por disponibilizar o liofilizador para a secagem das amostras da Batata Africana. Ao Dr. Aranda da Silva pela amizade e incentivo. Ao Dr. Sofrimento (Instituto de Investigação Agrária de Moçambique - IIAM) por fornecer a amostra de H. hemerocallidea. viii Aos colegas Inácio e Domingos pela ajuda na colheita das amostras na região da Macia – Moçambique. Ao Sr. Ernesto Nacamo, da Faculdade de Biologia da Universidade Eduardo Mondlane, pela colheita e identificação botânica da H. hemerocallidea. À comunidade de Macuiane (Macia) pela ajuda na localização de locais de colheita. Ao laboratório de Tecnologia Farmacêutica pelo acolhimento e pelas condições disponibilizadas para a realização do trabalho. Ao Joel Fonseca pela amizade, ajuda e apoio prestado durante a realização do trabalho experimental. À D. Maria Conceição Pereira agradeço a colaboração e boa vontade demonstrada. A todos os professores do Mestrado em Tecnologia Farmacêutica da FFUP pelo contributo valioso na minha formação. Aos colegas do Mestrado em Tecnologia Farmacêutica: Ana Lemos, Liliana Carvalho; Barbara Pereira, Victor Seixas, Karoll Krambeck, Suzana Oliveira, Luciana Vieira, José Carlos Ferreira, Barbara Noronha, Nathalie Santos, Miguel Matos, agradeço a amizade e apoio manifestados. À minha família, pelo apoio frequente e incondicional. Em especial o meu agradecimento à minha mãe, Clara da Cruz Simião, pela disponibilidade em partilhar os conhecimentos que tem sobre as plantas medicinais. À Márcia agradeço pelo seu amor, compreensão e palavras de incentivo. À Fundação Calouste Gulbenkian pelo suporte financeiro que me foi atribuído e ao ISCTEM por me ter autorizado a frequentar o Mestrado em Tecnologia Farmacêutica, na FFUP. A todos, que directa ou indirectamente contribuíram para a concretização deste trabalho, o meu “Kanimambo”. ix Resumo Os extractos aquosos dos cormos da Hypoxis hemerocallidea (conhecida por batata africana) são tradicionalmente usados por comunidades da África austral em diversas patologias. A preparação de extractos através da utilização de vários solventes tem sido prática industrial e laboratorial. Contudo, não está descrito nenhum estudo sistemático dedicado à avaliação da influência do solvente e da técnica de extracção adoptada nas características de qualidade dos extractos obtidos. No presente trabalho, procurou-se optimizar as metodologias de obtenção de extractos de H. hemerocallidea proveniente de várias regiões de Moçambique (Macia na Província de Gaza; Namaacha na Província de Maputo e no Instituto de Investigação Agrária de Moçambique na Cidade de Maputo), tendo em vista a padronização de extractos com potencial uso na preparação de formas farmacêuticas. No processo de extracção foi avaliado o efeito do solvente, da percentagem de água da mistura hidroalcoólica, do método de secagem do material vegetal, da temperatura de extracção, do número de etapas extractivas, da duração da etapa extractiva, da tenuidade do material a extrair e da razão planta/solvente. A avaliação foi feita em função do rendimento de extracção e do teor do extracto em hipoxósido, não menosprezando os aspectos relativos à natureza do solvente e à facilidade de preparação do extracto. Os extractos foram caracterizados quanto ao aspecto, à humidade e ao teor de hipoxósido. Na sequência dos estudos preliminares realizados, foi seleccionado como solvente o etanol a 96% V/V. Os extractos obtidos a partir de cormos da H. hemerocallidea apresentaram teores em hipoxósido superiores a 20%, com excepção de uma das amostras proveniente da região da Macia que apresentou teores inferiores a 10%. Dada a ausência de um padrão, foi efectuado o isolamento do hipoxósido por cromatografia líquida em coluna de vidro com octadecilsilano (C 18 ) em fase inversa utilizando-se como eluente acetonitrilo-água (80:20 V/V). O hipoxósido obtido apresentou uma pureza elevada, de cerca de 98,6% (m/m). Foi determinada a actividade antioxidante dos extractos pelo método do radical DPPH (1,1-difenil-2-picril-hidrazilo) e avaliou-se o efeito do solvente e da natureza da amostra na actividade antioxidante dos extractos. Todos os extractos testados apresentaram valores de IC 50 inferiores a 50 µg/ml e, em todos os casos, os valores obtidos foram inferiores ao IC 50 do extracto comercial. Em estudos anteriores, o hipoxósido não revelou actividade antioxidante e os resultados obtidos no presente trabalho reforçam a hipótese que atribui a actividade antioxidante dos extractos a outros compostos fenólicos presentes na planta. xvi 4. Actividade antioxidante de extractos secos obtidos a partir de cormos de Hypoxis hemerocallidea provenientes de diferentes regiões de Moçambique ........ 81 4.1 Introdução .................................................................................................. 81 4.2 Parte Experimental .................................................................................... 86 4.2.1 Material ............................................................................................... 86 4.2.2 Métodos .............................................................................................. 86 4.2.3 Análise estatística dos resultados ....................................................... 87 4.3 Resultados e Discussão ............................................................................ 87 4.3.1 Determinação da actividade antioxidante dos extractos obtidos com diferentes solventes ................................................................................................. 88 4.3.2 Relação entre a concentração de hipoxósido e a actividade antioxidante dos extractos ........................................................................................................... 90 4.3.3 Actividade antioxidante de extractos etanólicos de BA proveniente de diferentes regiões de Moçambique .......................................................................... 91 4.4 Conclusão .................................................................................................. 94 5. Conclusões gerais e perspectivas ....................................................................... 97 Referências bibliográficas ......................................................................................... 101 xvii Índice de figuras Figura 1. H. hemerocallidea, parte subterrânea. ................................................................ 2 Figura 2. H. hemerocallidea, parte aérea. ......................................................................... 3 Figura 3. Distribuição geográfica da H. hemerocallidea. .................................................... 3 Figura 4. Hipoxósido e a sua aglícona rooperol. ................................................................ 6 Figura 5. Estrutura do Hipoxósido. .................................................................................. 13 Figura 6. Esquema do processo de isolamento do hipoxósido a partir dos cormos da BA. ........................................................................................................................................ 18 Figura 7. Coluna cromatográfica com sílica C 18 usada para isolamento do hipoxósido. .. 19 Figura 8. Espectro Infravermelho do hipoxósido isolado no presente trabalho. ............... 23 Figura 9. Espectro Infravermelho do hipoxósido descrito na literatura. ............................ 24 Figura 10. Cromatograma do hipoxósido isolado (556 µg/ml) obtido no detector DAD. ... 25 Figura 11. Cromatograma do hipoxósido isolado (556 µg/ml) obtido no detector de fluorescência. .................................................................................................................. 25 Figura 12. Espectro UV no vértice do pico cromatográfico correspondente ao hipoxósido. ........................................................................................................................................ 26 Figura 13. Espectro UV do hipoxósido isolado: O pico cromatográfico do hipoxósido com os três pontos seleccionados (A). Os três espectros UV do hipoxósido sobrepostos (B). 26 Figura 14. Localização geográfica dos pontos de colheita das plantas............................ 38 Figura 15. Fluxograma da secagem, optimização do método de extracção, preparação e caracterização do extracto. ............................................................................................. 41 Figura 16. Cormos de H. hemerocallidea divididos.......................................................... 42 Figura 17. Liofilização dos cormos divididos da H. hemerocallidea. ................................ 42 Figura 18. Secagem em estufa de vazio dos cormos da H. hemerocallidea. ................... 43 Figura 19. Teor em hipoxósido nos cormos secos da H. hemerocallidea ........................ 57 Figura 20. Concentração do hipoxósido no extracto e quantidade de hipoxósido extraído em função do método de extracção. ............................................................................... 66 Figura 21. Rendimento da extracção e a concentração do hipoxósido no extracto em função do método de extracção. ..................................................................................... 66 Figura 22. Curva de calibração do hipoxósido. ................................................................ 67 Figura 23. Mecanismo de reacção do rooperol com radicais livres (Antioxidante). .......... 85 Figura 24. Valores de IC 50 do ácido ascórbico, dos extractos obtidos a partir dos cormos da H. hemerocallidea comprada na Macia e do extracto comercial. ................................ 89 Figura 25. Actividade antioxidante versus concentração do hipoxósido. ......................... 90 xviii Figura 26. Valores de IC 50 do ascórbico, dos extractos obtidos dos cormos da H. hemerocallidea proveniente de diferentes partes de Moçambique e do extracto comercial. ....................................................................................................................................... 93 xix Índice de tabelas Tabela 1. Principais constituintes fitoquímicos da H. hemerocallidea da África do Sul ...... 5 Tabela 2. Actividade biológica dos extractos da BA e dos seus constituintes .................... 7 Tabela 3. Métodos de isolamento do hipoxósido ............................................................. 14 Tabela 4. Gradiente da fase móvel usada ....................................................................... 21 Tabela 5. Percentagem da área do pico correspondente ao hipoxósido .......................... 27 Tabela 6. Métodos de extracção utilizados na obtenção de extractos a partir de material fresco .............................................................................................................................. 32 Tabela 7. Métodos de extracção utilizados na obtenção de extractos a partir de material seco ................................................................................................................................ 33 Tabela 8. Características das amostras utilizadas ........................................................... 39 Tabela 9. Avaliação preliminar e escolha do solvente ..................................................... 47 Tabela 10. Avaliação do efeito da tenuidade na eficiência do processo de extracção ..... 47 Tabela 11. Avaliação do efeito da temperatura na eficiência do processo de extracção . 48 Tabela 12. Avaliação do efeito da percentagem de água na mistura hidro-alcoólica ....... 48 Tabela 13. Avaliação do efeito da duração da etapa extractiva ....................................... 49 Tabela 14 Avaliação do efeito do número de etapas extractivas ..................................... 49 Tabela 15. Avaliação do efeito da razão planta/solvente ................................................. 50 Tabela 16. Condições cromatográficas ........................................................................... 51 Tabela 17. Comparação da secagem em liofilizador e em estufa de vazio ...................... 54 Tabela 18. Perda de água a partir dos cormos da H. hemerocallidea durante o processo de secagem..................................................................................................................... 55 Tabela 19. Teor em água nos cormos secos ................................................................... 56 Tabela 20. Teor em hipoxósido nos cormos secos da H. hemerocallidea ....................... 58 Tabela 21. Efeito do solvente na eficiência do processo extractivo ................................. 59 Tabela 22. Efeito da tenuidade na eficiência do processo extractivo ............................... 61 Tabela 23. Efeito da temperatura na eficiência do processo extractivo ........................... 61 Tabela 24. Efeito da percentagem de água na mistura hidroalcoólica na eficiência do processo extractivo. ........................................................................................................ 62 Tabela 25. Efeito da duração da etapa extractiva na eficiência do processo extractivo ... 63 Tabela 26. Efeito do número de etapas extractivas na eficiência do processo extractivo 64 Tabela 27. Efeito da razão planta/ solvente ..................................................................... 64 Tabela 28. Compilação dos resultados obtidos ............................................................... 65 Tabela 29. Repetibilidade e precisão intermédia ............................................................. 68 Tabela 30. Exactidão do método ..................................................................................... 68 xx Tabela 31. Rendimento e concentração do hipoxósido nos extractos obtidos em dias diferentes ........................................................................................................................ 69 Tabela 32. Rendimento e concentração do hipoxósido nos extractos obtidos no mesmo dia ................................................................................................................................... 69 Tabela 33. Rendimento e concentração do hipoxósido em todos os extractos obtidos pelo método S4 ...................................................................................................................... 70 Tabela 34. Condições do processo de extracção do método optimizado ........................ 71 Tabela 35. Rendimento de extracção de extractos obtidos a partir de cormos secos da BA de diferentes proveniências ............................................................................................ 72 Tabela 36. Aparência dos extractos ................................................................................ 73 Tabela 37. Teor em água nos extractos obtidos de cormos de H. hemerocallidea de diferentes proveniências ................................................................................................. 74 Tabela 38. Teor em hipoxósido nos extractos alcoólicos secos obtidos a partir de cormos secos da BA de diferentes proveniências ....................................................................... 75 Tabela 39. Actividade antioxidante da BA e de seus derivados ...................................... 83 Tabela 40. Efeito dos diferentes solventes usados na preparação dos extractos de H. hemerocallidea na actividade captadora do radical livre DPPH ....................................... 88 Tabela 41. Valores de IC 50 do ácido ascórbico, dos extractos obtidos dos cormos da H. hemerocallidea proveniente de diferentes partes de Moçambique e do extracto comercial ....................................................................................................................................... 91 xxi Lista de abreviaturas 13 C NMR Ressonância magnética nuclear de carbono 13 1 H NMR Ressonância magnética nuclear de hidrogénio ABTS 2,2´-azinobis [3-etilbenzotiazolin-6-sulfonato] AC Acetona ACN Acetonitrilo AcOEt Acetato de etilo AU Unidades arbitárias BA Batata Africana (Hypoxis Hemerocallidea) COX Cicloxigenase CV Coeficiente de variação DAD Detector de díodos em série (Diode array detector) DNA Ácido desoxirribonucleico (Deoxyribonucleic acid) DP Desvio padrão DPPH 1,1-difenil-1-picril-hidrazilo DSC Calorimetria diferencial de varrimento (Diferencial scanning calorymetry) dw Peso seco EMEA (EMA) European Medicines Agency EtOH Etanol EUA Estados Unidos da América Ext. AC Extractos acetónicos Ext. AcOEt Extractos em acetato de etilo Ext. C 6 H 14 Extractos em hexano Ext. EtOH Extractos em etanol Ext. H 2 O Extractos em água Ext. MeOH Extractos em metanol FRAP Capacidade antioxidante redutora do ferro (Ferric reducing actioxidant power) FTIR Espectroscopia no infravermelho por transformada de Fourier (Fourier Transform Infrared Spectroscopy) HIV Vírus de imundeficiência humana HPLC Cromatografia líquida de alta eficiência (High performance liquid chromatography) HPLC/DAD Cromatografia líquida de alta eficiência com detector de díodos em série HPLC/FLD Cromatografia líquida de alta eficiência com detector fluorimétrico xxii HPLC/UV/Vis Cromatografia líquida de alta eficiência com detector de ultravioleta/visível IC 50 Concentração que apresenta 50% de efeito ICH International Conference on Harmonization IIAM Instituto de Investigação Agrária de Moçambique IV Infravermelho LC-MS Cromatografia líquida com detecção por espectrometria de massa MCF-7 Linha celular do cancro da mama MDA Malonildialdeído MeOH Metanol NBD Azul de nitrodiformazano (Nitro blue diformazan) NBT Azul de nitrotetrazólio (Nitro blue tetrazolium) NCI National Cancer Institute ODS Octadecilsilano ORAC Capacidade de absorção de radicais de oxigénio (Oxygen radical antioxidant capacity) PF Ponto de fusão PTFE Politetrafluoroetileno (teflon) NMR Ressonância magnética nuclear SEM Microscopia electrónica de varrimento SIDA Síndrome de imunodeficiência adquirida TBA Ácido tiobarbitúrico (Thiobarbituric acid) TBARS Capacidade de captura de substâncias reactivas através do ácido tiobarbitúrico (Radical-scavenging capacity by thiobarbituric acidreactive substances) TE Equivalente de trolox TEAC Capacidade antioxidante equivalente ao trolox (Trolox equivalente antioxidant capacity) TLC Cromatografia em camada fina t R Tempo de retenção Trolox Ácido (±)-6-hidroxi-2,5,7,8-tetrametilcromano-2-carboxílico UK Reino Unido UV Ultravioleta WHO Organização mundial da saúde (World health organization) xxiii Objectivos e organização da dissertação Neste trabalho pretende-se em primeiro lugar optimizar metodologias de obtenção de extractos secos de H. hemerocallidea (proveniente de Moçambique) para incorporação em formas farmacêuticas sólidas e avaliar a sua actividade antioxidante. Entretanto, dada a falta de padrão houve necessidade de isolar o hipoxósido a partir de cormos secos de H. hemerocallidea. A dissertação está estruturada em cinco capítulos, onde o primeiro constitui a introdução geral e o último corresponde às conclusões gerais do trabalho experimental e às perspectivas de trabalhos futuros. Os capítulos restantes fazem referência à parte experimental e incluem uma pequena introdução, materiais e métodos, resultados e discussão, e uma conclusão. O capítulo 1 corresponde à introdução geral e constitui uma revisão em relação a aspectos botânicos, composição e acção biológica da planta H. hemerocallidea. O capítulo 2 refere o isolamento e a obtenção do hipoxósido a partir de cormos secos de H. hemerocallidea. O capítulo 3 descreve a optimização do método de extracção e a preparação de extractos usando amostras de H. hemerocallidea provenientes de regiões distintas de Moçambique. O capítulo 4 apresenta a avaliação da actividade antioxidante dos extractos secos de H. hemerocallidea obtidos e aborda a influência do solvente e da natureza da planta na actividade antioxidante. No capítulo 5 são apresentadas as conclusões gerais deste trabalho e as perspectivas para o futuro. Capítulo 1 Introdução Geral Introdução Geral 6 Figura 4. Hipoxósido e a sua aglícona rooperol. Têm sido realizados muitos estudos farmacológicos envolvendo o hipoxósido e, especialmente, a sua aglícona rooperol, o que levou a várias patentes destes compostos e seus derivados para diversos usos terapêuticos [Allison et al., 1996; Bouic e Albrecht, 1996; Bouic, 1999; Drewes e Liebenberg, 1987b; Drewes e Liebenberg, 1987a; Liebenberg et al., 1997]. 1.3 Actividade biológica dos extractos de H. hemerocallidea e dos seus constituintes As actividades biológicas e farmacológicas dos extractos da H. hemerocallidea têm sido extensamente estudadas, em comparação com outras espécies do género Hypoxis, designadamente com a H. obtusa, H. colchicifolia, H. nyasica, H. aurea e H. decumbens [Nair, 2006]. O estudo destas actividades contribuiu para suportar cientificamente as indicações terapêuticas atribuídas tradicionalmente a estas plantas, como se referirá ao longo do presente trabalho. A Tabela 2 apresenta as actividades biológicas da BA e dos seus constituintes referidos na literatura, sendo feita uma referência abreviada aos mecanismos envolvidos nessa actividade, sempre que se justifique. Introdução Geral 7 Tabela 2. Actividade biológica dos extractos da BA e dos seus constituintes Actividade (Mecanismo de acção/alvo/ substância responsável) Referências Antimicrobiana e antifúngica Escherichia coli (Ext. H 2 O, Ext. EtOH, Ext. AC, hipoxósido, rooperol); S.aureus (Ext. EtOH, Ext. AC, proteínas do tipo da lectina, hipoxósido, rooperol); E. faecalis (Ext. EtOH, Ext. AC) P.aeruginosa (Ext. EtOH, Ext. AC); Mycobacterium smegmatis (Ext. MeOH, Ext. EtOH, hipoxósido); moluscocida: Bulinus africanus (Ext. MeOH); Candida albicans (Ext. H 2 O, Ext. EtOH, Ext. AcOEt, Ext. C 6 H 14 ) Steenkamp et al., 2006; Katerere e Eloff, 2008; Muwanga, 2006; Gaidamashvili e van Staden, 2002; Laporta et al., 2007a; Motsei et al., 2003 Antitumoral Tumores testiculares (Ext. H 2 O); Inibição do crescimento das células MCF-7 (linha celular do cancro da mama) (Ext. H 2 O); Indução da apoptose nas células leucémicas promielocíticas humanas (HL60) (rooperol); Citotóxico para as células B16-F10-BL-6 do melanoma do ratinho (rooperol); os fitosteróis provenientes da BA são citotóxicos para várias formas de cancro, como o da mama, do cólon e da próstata; Estimulação da síntese do colagénio tipo I (rooperol), inibindo a invasão das células tumorais aos tecidos (antimetastásico) Watt e Breyer-Brandwijk, 1962; Van Wyk et al., 1997; Steenkamp e Gouws, 2006; Nicoletti et al., 1992; Albrecht et al., 1995b; Albrecht, 1996; Theron et al., 1994; Dietzsch et al., 1999; Awad e Fink, 2000; Awad et al., 1998; Rao e Janezic, 1992 Hiperplasia benigna da próstata Inibição da 5-α-redutase ou diminuição da ligação à dihidrotestosterona [combinação do β-sitoesterol e do seu glucósido (BSSG)]. Bruneton, 1995; Drewes e Khan, 2004 Anti-inflamatória Redução dos sintomas da inflamação devida à artrite reumatóide em humanos (Ext. EtOH; esteróis); Redução da inflamação em modelos animais (o Ext. MeOH foi mais activo que o Ext. H 2 O, mas ambos menos activos que o ácido acetilsalicílico ou diclofenac); Efeitos sobre a COX: o Ext. EtOH tem elevado efeito inibidor da actividade catalítica da síntese das prostaglandinas da COX-1 (88-98%) e que é superior à do Ext. H 2 O (cerca de 23%). Inibição da COX-2 (Ext. H 2 O); A actividade sobre a ciclooxigenase é atribuída às proteínas do tipo da lectina purificada a partir de extractos aquosos da BA e ao rooperol (IC 50 de 29,8±1,9 µM para a COX-1 e 56,5±5,6 µM para a COX - 2). Bach, 1978; Louw, 2002; Myers, 1998; Ojewole, 2002; Ojewole, 2006; Steenkamp et al., 2006; Gaidamashvili e van Staden, 2006; Laporta et al., 2007a Analgésica/antinociceptiva Atraso do tempo de reacção dos ratinhos à dor induzida pelo aquecimento (Ext. H2O); Redução das contorções induzidas pelo ácido acético (Ext. H 2 O); Provável efeito do hipoxósido. Ojewole, 2006; Di Giannuario et al., 1993 Antioxidante Capacidade de captação de espécies reactivas: radical hidroxilo (Ext. H2O, Ext. EtOH), radical superóxido (Ext. MeOH:H 2 O a 50%, Rooperol, Ext. H 2 O, hipoxósido), radical DPPH (Rooperol, Ext. H 2 O, Ext. AC e Ext. EtOH), radical peroxilo (Extracto de BA com 45% de hipoxósido); Inibição da peroxidação lipídica (Rooperol, Ext. MeOH:H 2 O a 50%, Extracto de BA com 45% de hipoxósido, Ext. H 2 O, hipoxósido); Capacidade de redução do [Fe(III)(TPTZ)2] 3+ em [Fe(II)(TPTZ)2] 2+ (rooperol, Ext. H 2 O); Capacidade de redução do catião ABTS •- (Rooperol, hipoxósido) Dzingirai et al., 2007; Steenkamp et al., 2006; Nair et al., 2007a; Laporta et al., 2007b; Katerere e Eloff, 2008 Extractos em etanol (Ext. EtOH), em metanol (Ext. MeOH), em acetona (Ext. AC), em água (Ext. H 2 O), em acetato de etilo (Ext. AcOEt), em hexano (Ext. C 6 H 14 ). Introdução Geral 8 Continuação da Tabela 2 Actividade (Mecanismo de acção/alvo/ substância res ponsável) Referências Cardiovascular Bradicardia e hipotensão transitória in vitro (músculo atrial e veia porta) e in vivo (no animal) em cobaias e ratos, respectivamente (Ext. H 2 O); aumentos moderados e transitórios na produção cardíaca, no volume de sangue bombeado pelo ventrículo e na pressão vascular, sem nenhum aumento da taxa cardíaca ou da pressão de enchimento (rooperol); taquicardia ventricular em humanos (Ext. H 2 O); redução do colesterol (esteróis, estanóis e esterolinas). Ojewole et al., 2006; Coetzee et al., 1996; Ker, 2005; Law, 2000; Westrate e Meijer, 1998 Antidiabética Redução dose-dependente das concentrações sanguíneas da glucose nos ratos normoglicémicos e hiperglic émicos (Ext. H 2 O e Ext. MeOH) . Zibula e Ojewole, 2000; Mahomed e Ojewole, 2003 ; Ojewole, 2006 Anticonvulsivante Atrasam o início e antagonizam as convulsões induzidas pelo pentilenotetrazol, antagonizam fortemente as convulsões induzidas pela picrotoxina e têm uma fraca resposta nas convulsões induzidas pela biculina (Ext. H 2 O). Actividade atribuída ao rooperol e ao β - sitoesterol. Ojewole, 2008 Imunoestimulante vs HIV/SIDA Estabiliza a contagem dos linfócitos CD4 e promove uma redução dos antigénios p24 HIV e uma diminuição marcada da activação da expressão do HLA-DR pelos linfócitos CD8 (Ext. MeOH); estimulação da expressão do IFN-γ (Ext. EtOH); inibe in vitro a proliferação do HIV-1 (metabolito dissulfato do rooperol); reduz a carga viral e estabiliza a contagem das células CD4 (mistura de β - sitosterol e d o seu glucósido ) . Albrecht, 1996; Muwanga, 2006; Lamprecht, 1998; Bouic et al., 1999 Uterolítica Inibem a amplitude das contracções espontâneas e rítmicas e relaxam as trompas uterinas isoladas dos ratos (fêmeas) e das cobaias grávidas, de forma dose-dependente; relaxam o tónus basal das trompas uterinas de forma dose-dependente em ratos (fêmeas) e cobaias não grávidas e estrogénio dominantes; inibem as contracções induzidas por acetilcolina, ocitocina, bradiquinina e cloreto de potássio (K + ) nas trompas uterinas isoladas do rato (fêmea) e da cobaia estrogénio dominante de forma dose-dependente. Nyinawumuntu et al., 2008 Antidiarreica Protecção dose-dependente em ratos e em ratinhos contra a diarreia induzida pelo óleo de rícino; inibição do trânsito intestinal e atraso do esvaziamento gástrico; efeito anti-motilidade e inibição da enteropooling induzida pelo óleo de rícino (semelhante à atropina); atraso do início da resposta à diarreia induzida pelo óleo de rícino, redução da frequência das defecações e da severidade da diarreia nos roedores (semelhante à loperamida); diminuição do volume dos fluidos intestinais segregados e do número, peso e humidade das fezes excretadas; inibição das contracções espontâneas e pendulares no duodeno isolado do coelho e atenuação das contracções induzidas pela acetilcolina no íleo isolado do cobaia (Ext. H 2 O). Ojewole et al., 2009b Broncorrelaxante Relaxamento das contracções espasmogénicas induzidas pela histamina, pelo carbocol e pelo potássio, de uma forma dose-dependente, e que esse efeito não se altera na presença do propranolol (Ext. H 2 O) Ojewole et al., 2009a Enteropooling: aumento dos fluidos e electrólitos no lume intestinal devido ao aumento dos níveis das prostaglandinas. Introdução Geral 9 Apesar dos vários estudos laboratoriais para fundamentar as utilizações tradicionais da BA, muitas vezes provados com as actividades dos extractos, ainda não se sabe quais são os constituintes responsáveis por todas as actividades atribuídas aos extractos. Especula-se que o rooperol contribua para as actividades anticonvulsivante [Ojewole, 2008], antidiarreica [Ojewole et al., 2009b], uterolítica e espasmogénicas [Nyinawumuntu et al., 2008] dos extractos da H. hemerocallidea. Hipotetiza-se também que os esteróis, os estanóis e as esterolinas presentes na H. hemerocallidea contribuam para a actividade antinociceptiva [Ojewole, 2006], hipoglicemiante (fitoesteróis e/ou esterolinas) [Mahomed e Ojewole, 2003; Ojewole, 2006], antidiarreica (β-sitoesterol) [Ojewole et al., 2009b] e anticonvulsivante (β-sitoesterol) [Ojewole, 2008]. Estas demonstrações conferem suporte farmacológico dos usos tradicionais dos cormos da H. hemerocallidea no tratamento e/ou na manutenção da dor e condições de artrite inflamatória [Ojewole, 2006], assim como no tratamento, manutenção e/ou controlo da diabetes mellitus em adultos [Ojewole, 2006; Mahomed e Ojewole, 2003; Zibula e Ojewole, 2000], de certas disfunções cardíacas e hipertensão essencial [Ojewole et al., 2006; Owira e Ojewole, 2009], da diarreia [Ojewole et al., 2009b], de convulsões e epilepsia na infância [Ojewole, 2008], de ameaças de aborto ou aborto prematuro [Nyinawumuntu et al., 2008] do controlo e/ou tratamento da asma brônquica e outros distúrbios respiratórios [Ojewole et al., 2009a] em algumas comunidades rurais da África Austral e, em particular, da África do Sul. 1.4 Objectivos do trabalho Como se referiu anteriormente, o presente trabalho tem os seguintes objectivos: 1. Isolar o hipoxósido a partir dos cormos de H. hemerocallidea proveniente de Moçambique, tendo em vista a obtenção de um padrão; 2. Desenvolver e optimizar um método de preparação de extractos secos a partir de cormos de H. hemerocallidea com potencial uso em preparações farmacêuticas; 3. Caracterizar os extractos preparados; 4. Avaliar a actividade antioxidante dos extractos obtidos, pelo método de DPPH. Os trabalhos anteriormente publicados sobre a H. hemerocallidea, embora apresentem metodologias para a obtenção de extractos, não fazem referência a uma análise comparativa das mesmas. No presente trabalho, propusemo-nos comparar Introdução Geral 10 diferentes metodologias de extracção a partir de cormos da H. hemerocallidea, tendo em vista a obtenção de extractos mais concentrados em hipoxósido. Capítulo 2 Isolamento e obtenção do hipoxósido a partir dos cormos de Hypoxis hemerocallidea Isolamento e obtenção do hipoxósido a partir dos cormos de Hypoxis hemerocallidea 13 2. Isolamento do hipoxósido a partir dos cormos de Hypoxis hemerocallidea 2.1 Introdução O hipoxósido (Figura 5) – um norlignano diglucosídico – encontra-se presente em algumas espécies do género Hypoxis pertencentes à família Hypoxidaceae, tais como H. hemerocallidea, H. obtusa, H. acumitata, H. nitida, H. laifolia, H. rigidula e H. angustifoila [Allison et al., 1996; Sibanda et al., 1990; Nair, 2006; Marini-Bettolo et al., 1982; Drewes et al., 1984]. Vários estudos têm sugerido que o hipoxósido é o principal constituinte responsável pelas actividades terapêuticas destas plantas [Nair, 2006; Laporta et al., 2007b; Albrecht, 1995]. Além disso, o hipoxósido é utilizado como marcador activo no controlo da qualidade de matérias-primas ou de produtos à base da BA [Nair e Kanfer, 2006]. Figura 5. Estrutura do Hipoxósido. Existem vários trabalhos publicados que tratam da extracção, isolamento e caracterização do hipoxósido a partir das plantas do género Hypoxis [Marini-Bettolo et al., 1991; Drewes et al., 1984; Vinesi et al., 1990; Betto et al., 1992; Kruger et al., 1993; Kruger et al., 1994; Nair et al., 2006; Laporta et al., 2007b]. A Tabela 3 apresenta os métodos de isolamento do hipoxósido a partir de plantas do género Hypoxis. A caracterização do hipoxósido pode ser feita por determinação do ponto de fusão (PF) [Nair e Kanfer, 2006; Drewes et al., 1984], por espectrofotometria no ultravioleta [Nair e Kanfer, 2006; Laporta et al., 2007b; Kruger et al., 1994], por espectrofotometria no infravermelho [Nair e Kanfer, 2006], por espectrofluorimetria [Laporta et al., 2007b], por microscopia electrónica de varrimento (SEM), por cromatografia líquida de alta eficiência (HPLC/DAD) [Nair e Kanfer, 2006], por cromatografia líquida com detecção por espectrometria de massa (LC-MS) utilizando ionização por “electrospray” [Nair e Kanfer, 2006], por 1 H NMR e 13 C NMR [Nair e Kanfer, 2006; Marini-Bettolo et al., 1982; Laporta et al., 2007b] ou 13 CNMR e HSQC [Laporta et al., 2007b]. Isolamento e obtenção do hipoxósido a partir dos cormos de Hypoxis hemerocallidea 14 Tabela 3. Métodos de isolamento do hipoxósido Planta/Parte usada Método de extracção/solvente Método de isolamento/purificação Referências H. obtusa (cormos) Extracção líquido-líquido de extractos metanólicos com acetato de etilo e nbutanol Distribuição contracorrente (CCD-400 transfers) entre a água:acetato de etilo:butanol (10:8:2 V/V/V) Marini-Bettolo et al., 1982 H. hemerocallidea Extracto etanólico enriquecido em HPLC preparativa com metanol:água (1:1) Coluna cromatográfica preparativa (45 mm x 600 mm) com gel de sílica (230-400 mesh) e eluição com 2butanol:benzeno:água:metanol (4:3:2:1 V/V/V/V); Cristalização com 2-butanol. Drewes et al., 1984; Drewes e Liebenberg, 1987a Hypoxis sp (cormos secos) Extracção directa com metanol Coluna HPLC preparativa C8 e fase móvel isocrática de acetonitrilo:água (15:85 V/V) num fluxo de 100 ml/minuto; Fracções relevantes separadas em coluna HPLC preparativa C 18 ; evaporação da fracção pura para obter o hipoxósido Kruger et al., 1994; Allison et al., 1996 H. hemerocallidea (cormos frescos) Extracção directa com metanol; Extracção líquido-líquido do extracto metanólico seco (dissolvido em água) com acetato de etilo e butanol. Separação do extracto butanólico em coluna de vidro (500 mm x 50 mm) com gel de sílica (60-120 mesh, 75-150 µm) e eluição com tolueno:butanol:água:metanol (6:4:2:1 V/V/V/V) seguida de tolueno:butanol:àgua:metanol (4:4:2:1 V/V/V/V) em fluxo de 0,5 ml/min; Isolamento: HPLC-UV, coluna semi-preparativa Luna C 18 (250 mm x 10 mm d.i., 5 µm); fase móvel acetonitrilo:água (20:80 V/V) em modo isocrático com em fluxo de 5 ml/min e detecção em 260 nm. Nair e Kanfer, 2006 H. hemerocallidea Extractos hidroalcoólicos HPLC-UV-Vis/DAD (260 nm) numa coluna em fase inversa LiChrospher® 100-RP-18 (15µm, 250 x 25 mm d.i.) em escala semi-preparativa, com fase móvel a 31,25 ml/min de velocidade de fluxo e constituída por KH2PO4 0,05 M (A) e acetonitrilo (B) com eluição em gradiente: 0-40 min, de 20% de B a 70%; 40-42 min, de 70 a 20% de B; 42-50 min, fixado em 20% de B; Troca de solventes nas fracções contendo hipoxósido puro com metanol puro usando um “cartucho preparativo” C18 (eliminação de sais) e secagem em evaporador rotativo. Laporta et al., 2007b Isolamento e obtenção do hipoxósido a partir dos cormos de Hypoxis hemerocallidea 15 No presente trabalho, pretendeu-se isolar o hipoxósido a partir de extractos dos cormos liofilizados de H. hemerocallidea, utilizando a cromatografia em coluna convencional e usando ODS (octadecilsilano) como fase estacionária e uma mistura ACN:H 2 O (20:80, V/V) como fase móvel. Uma vez que o padrão de hipoxósido não se encontra disponível comercialmente, o hipoxósido isolado e purificado no âmbito do trabalho apresentado no presente capítulo foi usado como padrão para monitorizar o processo de extracção e para o doseamento do hipoxósido nos cormos secos e nos extractos (trabalhos apresentados no Capítulo III). A caracterização do hipoxósido isolado efectuou-se pelo PF, por análise do espectro no IV e no UV e por HPLC/DAD. Os resultados obtidos foram comparados e confirmados com os descritos na literatura. 2.2 Parte Experimental 2.2.1 Material Reagentes e solventes: O acetonitrilo (grau HPLC) (lote: 0932697) foi adquirido à Fisher Scientific UK Limited (Fisher Scientific, Leicestershire, UK). A água foi purificada num sistema Millipore Simplicity ® UV (Millipore SAS 67120 Molsheim, França). O metanol (grau analítico) Fluka (lote: 80370) foi obtido na Sigma (Sigma-Aldrich Chemie, Seelze, Alemanha). O metanol (grau HPLC) (lote: V8E757268E) foi obtido na CARLO ERBA Reagents (Espanha). A sílica usada foi Davisil ® 633NC18E (Grace, Hesperia CA, EUA). Material biológico: Os cormos de H. hemerocallidea foram colhidos em Moçambique no mês de Agosto de 2008 (Região da Macia) e depositou-se um exemplar no herbário da Faculdade de Biologia da Universidade Eduardo Mondlane – Moçambique. Equipamento: Bomba de vácuo: Büchi Vac ® V-500 (Büchi Labortechnik AG, Suíça). Evaporador rotativo: Büchi Rotavapor RE 111 – Büchi 461 water bath (Büchi Labortechnik AG, Suíça) Vórtex: Heidolph Reax 2000 (Alemanha) Ultrassons: Bandelin Sonorex RK 100H (Bandelin Electronic, Alemanha). Isolamento e obtenção do hipoxósido a partir dos cormos de Hypoxis hemerocallidea 22 2.3 Resultados e discussão 2.3.1 Isolamento e obtenção do hipoxósido Prepararam-se extractos metanólicos da BA a partir de cormos pulverizados, tendo em vista concentrar o material vegetal para posterior isolamento e obtenção do hipoxósido. Optou-se por escolher o metanol como solvente extractor, uma vez que solubiliza facilmente o hipoxósido e as soluções resultantes apresentam-se estáveis [Nair, 2006]. O isolamento do hipoxósido a partir do extracto, com vista à obtenção do padrão, foi efectuado recorrendo à aplicação dos extractos metanólicos concentrados em duas colunas de vidro convencional com sílica Davisil ® em fase inversa, usando como eluente a mistura acetonitrilo:água (20:80 V/V). A primeira passagem pela coluna cromatográfica permitiu isolar o hipoxósido dos demais constituintes do extracto e a segunda permitiu purificá-lo. O controlo das fracções ricas em hipoxósido foi efectuado por HPLC/DAD, por confirmação do espectro no UV do pico cromatográfico correspondente ao hipoxósido, uma vez que a substância padrão não se encontra disponível comercialmente. Com este método evitámos o uso de misturas mais complexas de solventes, que seriam necessárias no caso de uma coluna convencional com sílica normal. 2.3.2 Caracterização do hipoxósido isolado O hipoxósido liofilizado apresentou-se como um pó branco e leve, tal como descrito na literatura [Nair, 2006], tendo sido caracterizado através do PF, espectro no IV e por HPLC/DAD/FLD. 2.3.2.1 Ponto de fusão O valor do intervalo de fusão obtido foi de 149-152ºC. A literatura não é uniforme no que se refere à descrição do ponto de fusão do hipoxósido, uma vez que apresenta valores relativamente diferentes. O PF determinado no presente trabalho apresentou uma grande correspondência com o descrito por Marini-Bettolo et al. (1982) (149-151 ºC) e, Isolamento e obtenção do hipoxósido a partir dos cormos de Hypoxis hemerocallidea 23 apesar de inferior ao obtido por Nair e Kanfer (2006), que foi 154,6ºC, não se afasta consideravelmente deste. Nair e Kanfer (2006) sugerem que esta diferença nos valores pode ser atribuída à presença de impurezas ou de produtos de degradação. Parece-nos razoável atribuir também estas diferenças às técnicas/aparelhos utilizados. Nair e Kanfer (2006) utilizaram a calorimetria diferencial de varrimento (DSC) enquanto Marini-Bettolo et al. (1982) utilizaram um aparelho de ponto de fusão convencional. O intervalo de fusão determinado no presente trabalho apresenta-se estreito e afasta-se pouco do valor reportado por Nair e Kanfer (2006), pelo que se poderá concluir que o hipoxósido isolado no âmbito do presente trabalho apresenta pureza elevada. 2.3.2.2 Espectro de infravermelho A espectroscopia de infravermelho é uma técnica muito útil para identificar substâncias, uma vez que duas moléculas diferentes apresentam espectros no IV diferentes. O espectro IV do hipoxósido isolado (Figura 8) foi comparado com o descrito por Nair (2006) (Figura 9), tendo-se verificado a existência de paralelismo entre ambos. Figura 8. Espectro Infravermelho do hipoxósido isolado no presente trabalho. No espectro no IV do hipoxósido isolado no presente trabalho estão bem evidentes as bandas em 3400 cm -1 , característica do grupo hidroxilo (OH) fenólico e glucosídico, em Isolamento e obtenção do hipoxósido a partir dos cormos de Hypoxis hemerocallidea 24 1507 e em 1585 cm -1 , características dos grupos aromáticos, e em 2320 e 2365 cm -1 , características da ligação tripla. Figura 9. Espectro Infravermelho do hipoxósido descrito na literatura . 2.3.2.3 HPLC/DAD/FLD Foram estudadas várias condições cromatográficas, tendo em vista obter a melhor informação sobre as impurezas que acompanhavam o hipoxósido isolado. Assim, foram testadas várias condições de eluentes, em trabalho isocrático e em gradiente. As condições que permitiram evidenciar o maior número de picos cromatográficos foram obtidas com o gradiente apresentado na Tabela 4, tendo sido, por essa razão, as adoptadas no presente estudo. Com vista a garantir que todas as impurezas presentes eram visualizadas, trabalhou-se com a maior concentração possível de amostra, tendo-se, no entanto, o cuidado de não saturar a coluna cromatográfica. Procedeu-se a um varrimento total do cromatograma, verificando-se que, para além das substâncias identificadas em 260 nm, não havia qualquer substância adicional que absorvesse no UV. A Figura 10 e a Figura 11 apresentam os cromatogramas obtidos com os detectores DAD e FLD, respectivamente. Observa-se que os cromatogramas apresentam algumas diferenças e que o obtido com o detector DAD apresenta mais picos, já que o detector FLD apenas detecta as substâncias fluorescentes. Isolamento e obtenção do hipoxósido a partir dos cormos de Hypoxis hemerocallidea 25 Figura 10. Cromatograma do hipoxósido isolado (556 µg/ml) obtido no detector DAD. Figura 11. Cromatograma do hipoxósido isolado (556 µg/ml) obtido no detector de fluorescência. O espectro no UV do pico correspondente ao hipoxósido é apresentado na Figura 12, verificando-se que é compatível com o descrito na literatura [Nair, 2006; Laporta et al., 2007b] para esta substância (máximos de absorção em 212, 258 e 298 nm). A Figura 13 apresenta os espectros obtidos em três pontos distintos do pico cromatográfico, notando-se uma equivalência expressiva entre eles, o que demonstra a homogeneidade da composição do pico cromatográfico em hipoxósido. Esta constatação foi reforçada Isolamento e obtenção do hipoxósido a partir dos cormos de Hypoxis hemerocallidea 26 através do valor do purity angle que foi sempre inferior ao do purity threshold, o que demonstra que o pico é homogéneo. AU 0,00 0,20 0,40 0,60 0,80 1,00 1,20 nm 200,00 300,00 400,00 500,00 213,0 258,9 298,1 Figura 12. Espectro UV no vértice do pico cromatográfico correspondente ao hipoxósido. Figura 13. Espectro UV do hipoxósido isolado: O pico cromatográfico do hipoxósido com os três pontos seleccionados (A). Os três espectros UV do hipoxósido sobrepostos (B). Isolamento e obtenção do hipoxósido a partir dos cormos de Hypoxis hemerocallidea 27 Na Tabela 5 apresenta-se os resultados referentes à determinação da pureza cromatográfica, por HPLC/DAD, do hipoxósido isolado dos cormos secos da H. Hemerocallidea. Tabela 5. Percentagem da área do pico correspondente ao hipoxósido Área do hipoxósido (%) Detector 1 2 3 Média DP CV DAD 98,74 98,89 98,1 98,58 0,42 0,43% FLD 98,85 98,96 98,95 98,92 0,06 0,06% Assumindo que a percentagem da área correspondente ao hipoxósido corresponde ao seu teor, verifica-se que a pureza do hipoxósido isolado no presente trabalho é de aproximadamente 98,6%. Dado que o FLD é um detector selectivo, as purezas determinadas por este detector foram sempre superiores, já que não são “contabilizadas” todas as impurezas eventualmente existentes. Assim, os valores correspondentes ao detector FLD são apresentados apenas a título indicativo do teor aproximado em hipoxósido nas amostras isoladas. 2.4 Conclusão O procedimento de extracção e isolamento desenvolvido no presente trabalho, tendo em vista o isolamento do hipoxósido a partir dos cormos de H. hemerocallidea, revelou-se eficaz e adequado para a obtenção de uma substância susceptível de ser usada como padrão de hipoxósido. O intervalo de fusão determinado apresentou-se compatível com o descrito na literatura. O espectro no IV do hipoxósido apresentou paralelismo com o descrito por Nair (2006) e foi efectuada, com base no espectro no IV, uma caracterização dos grupos funcionais presentes na estrutura do hipoxósido. O espectro no UV apresentou paralelismo com os obtidos anteriormente [Marini-Bettolo et al., 1982; Nair, 2006]. A pureza do pico cromatográfico do hipoxósido avaliado por HPLC/DAD apresentou-se homogénea e com uma quantidade reduzida de impurezas. O teor em hipoxósido na fracção isolada foi de cerca de 98,6% (m/m). Nestas circunstâncias, o hipoxósido isolado no presente trabalho reúne condições para ser usado como padrão. Capitulo 3 Optimização do método extractivo para a obtenção de extractos secos dos cormos da Hypoxis hemerocallidea Optimização do método extractivo para a obtenção de extractos secos dos cormos da Hypoxis hemerocallidea 31 3. Optimização do método extractivo para a obtenção de extractos secos dos cormos da Hypoxis hemerocallidea 3.1 Introdução Vários estudos têm proposto diversas técnicas para a obtenção de extractos secos da BA. Em muitos casos, os extractos são obtidos apenas com o objectivo de testar actividades farmacológicas da BA e noutros para identificar, isolar ou dosear os constituintes. Além disso, existem processos patenteados de preparação de extractos, isolamento de certos constituintes e sua incorporação em preparações para uso oral ou cutâneo [Allison et al., 1996; Drewes e Liebenberg, 1987a; Pegel e Liebenberg, 1976]. São usados como solventes de extracção a água, o etanol, diversas misturas hidroalcoólicas (água-metanol ou água-etanol), o metanol, o clorofórmio, a acetona e outras. Os constituintes dos cormos da BA [Bouic et al., 1996, Nair et al., 2007b; Ojewole et al., 2009b] com relevância na terapêutica são: 1. Norlignano: hipoxósido 2. Esteróis: β-sitoesterol, estigmasterol 3. Estanol: estigmastanol 4. Esterolina: glucósido de β-sitoesterol As formulações disponíveis no mercado contendo BA não mencionam, na sua grande maioria, se estão baseadas na planta seca pulverizada ou em extractos. Nos casos em que é referida a utilização de extractos, não é dada informação relativa à sua natureza e obtenção. 3.1.1 Métodos de extracção dos cormos da H. hemerocallidea Nas tabelas (Tabela 6 e Tabela 7) estão representados os métodos de extracção utilizados na preparação de extractos à base da H. hemerocallidea. Optimização do método extractivo para a obtenção de extractos secos dos cormos da Hypoxis hemerocallidea 38 3.2 Parte Experimental 3.2.1 Colheita das plantas Os cormos foram colhidos frescos, durante o mês de Agosto de 2008, em diferentes regiões de Moçambique: Macuiane (Macia – Gaza), Matianine (Namaacha – Maputo Província), no IIAM (Instituto de Investigação Agrária de Moçambique – Maputo Cidade). No mesmo período, foram também adquiridos cormos em Macuiane, que se encontravam à venda na estrada. Na Figura 14 apresenta-se a localização dos pontos de colheita. Depois de colhidos, os cormos foram transportados para Portugal, onde foram conservados durante cerca de dois meses à temperatura ambiente. Os cormos gentilmente cedidos pela Professora Doutora Elsa Gomes (da Faculdade de Farmácia da Universidade de Lisboa), foram colhidos em Portugal no mês de Fevereiro de 2009, sendo provenientes de Moçambique e tendo ocorrido a sua propagação em Portugal em vasos. Macuiane(Macia) Matianine (Namaacha) IIAM (Maputo cidade) Figura 14. Localização geográfica dos pontos de colheita das plantas. Optimização do método extractivo para a obtenção de extractos secos dos cormos da Hypoxis hemerocallidea 39 As características das amostras estudadas estão descritas na Tabela 8. Tabela 8. Características das amostras utilizadas Amostra Peso aproximado dos cormos (g) Código Método de Secagem Origem da amostra Amostra I <100 A7 Estufa de vazio Colhida na Macia Amostra I <100 A8 Liofilizador Amostra I 100-200 A23 Liofilizador Amostra I 200-300 A25 Liofilizador Amostra II <200 A4 Estufa de vazio Comprada na Macia Amostra II <200 A5 Liofilizador Amostra II 100-200 A43 Liofilizador Amostra II 200-300 A39 Liofilizador Amostra II 300-400 A38 Liofilizador Amostra II >500 A33 Liofilizador Amostra III <100 A9 Estufa de vazio Colhida em Namaacha Amostra III <100 A10 Liofilizador Amostra III 90-120 A30 Liofilizador Amostra IV 20-30 A45 Liofilizador IIAM (Dr. Sofrimento) Amostra IV <50 A24 Liofilizador Amostra V <10 A48 Liofilizador Lisboa (Profª. Doutora Elsa Gomes) Amostra V 10-20 A46 Liofilizador 3.2.2 Materiais As amostras avaliadas são de várias proveniências: Cormos de H. hemerocallidea colhidos em Macuiane, no distrito da Macia, Província de Gaza (Amostra I); Cormos de H. hemerocallidea comprados na Macia (Amostra II); Cormos de H. hemerocallidea colhidos em Matianine, no distrito de Namaacha, Província de Maputo (Amostra III); Optimização do método extractivo para a obtenção de extractos secos dos cormos da Hypoxis hemerocallidea 40 Cormos de H. hemerocallidea gentilmente oferecidas pelo Dr. Sofrimento do IIAM. A propagação das plantas efectuou-se por cultura de tecido e plantação em vaso no IIAM (Amostra IV); Cormos de H. hemerocallidea gentilmente oferecidos pela Professora Doutora Elsa Teixeira Gomes. Plantas provenientes de Moçambique cuja propagação foi espontânea, por semente, em vaso de ornamentação em Lisboa (Amostra V). Foram depositados exemplares das amostras I e III no herbário da Faculdade de Biologia da Universidade Eduardo Mondlane. Os reagentes (grau analítico) utilizados na preparação dos extractos foram: metanol Fluka (lote: 80370) e acetona Fluka (lote 51590) obtidos na Sigma (Sigma-Aldrich Chemie, Buchs, Suíça); etanol absoluto 99,5% (lote 0000090855) obtido na Panreac (Panreac Quimica SAU, Barcelona, Espanha) e etanol a 96% V/V. obtido na AGA (álcool e géneros alimentares S.A, Loures, Portugal). Os reagentes (grau HPLC) utilizados no doseamento dos extractos e da planta pulverizada foram: acetonitrilo (lote: 0932697) obtido na Fisher Scientific UK Limited (Fisher Scientific, Leicestershire, UK); metanol (lote: V8E757268E) obtido na CARLO ERBA Reagents (Espanha) e água purificada num sistema Millipore Simplicity ® UV (Millipore SAS 67120 Molsheim, França). Utilizou-se como padrão o hipoxósido isolado no nosso laboratório com uma pureza de 98,6% (m/m) (tal como descrito no Capítulo II). 3.2.3 Métodos Neste trabalho, definiu-se como “fármaco vegetal” a parte interna do cormo, rejeitando-se, portanto, a casca. Optou-se por esta metodologia, porque suspeita-se que a maior parte dos constituintes activos da H. hemerocallidea estejam mais concentradas no interior do cormo [Vinesi et al., 1990 fazem referência a esta diferença de concentrações entre o interior e a casca no caso da H. obtusa]. Para além disso, a preparação da amostra seria mais homogénea. Antes de se estudar as metodologias de preparação dos extractos, foi estudada a secagem dos cormos. Foram avaliados dois métodos de secagem dos cormos da BA, a liofilização e a secagem em estufa de vazio. A comparação dos métodos foi feita utilizando três amostras de diferente origem divididas em dois lotes cada, um para o liofilizador e outro para a estufa de vazio. As amostras I (A7 e A8), II (A4 e A5) e III (A9 e Optimização do método extractivo para a obtenção de extractos secos dos cormos da Hypoxis hemerocallidea 41 A10) foram utilizadas na comparação dos dois métodos de secagem. A amostra II (A39) foi utilizada para a avaliação dos factores que influenciam na preparação dos extractos. Contudo, depois de se estabelecer as condições de extracção, foram preparados extractos com as restantes amostras. A Figura 15 apresenta o fluxograma do trabalho realizado. Figura 15. Fluxograma da secagem, optimização do método de extracção, preparação e caracterização do extracto. Teor em hipoxósido Rendimento de extracção Massa do hipoxósido extraída Variáveis medidas: Solvente Tenuidade Granulometria Temperatura Graduação alcoólica Duração da etapa extractiva Número de etapas extractivas Razão planta/solvente Factores avaliados : Pulverização (≠ granulometria) Humidade Teor em hipoxósido Estufa de vazio Liofilizador Lisboa-Portugal IIAM – Maputo Cidade Namaacha - Maputo Macia - Gaza Colheita da amostra Secagem Optimização do método Preparação do extracto optimizado Caracterização do extracto optimizado Teor em hipoxósido Rendimento de extracção Humidade do extracto Optimização do método extractivo para a obtenção de extractos secos dos cormos da Hypoxis hemerocallidea 42 3.2.3.1 Secagem Protocolo experimental Os cormos foram previamente lavados com água corrente, secos com papel absorvente, descascados e divididos em cubos de aproximadamente 0,5 cm 3 (Figura 16). Figura 16. Cormos de H. hemerocallidea divididos. No caso da liofilização, os pedaços foram pesados, congelados a -20 ºC por um período de pelo menos 12 horas e finalmente liofilizados (Heto Lyolab 3000 - Heto-Holten A/S, Allerød, Alemanha ou CHRIST ® LOC-1m Alpha 1-4 - CHRIST, Alemanha, conforme o caso) (Figura 17) por um período superior a 24 horas. Figura 17. Liofilização dos cormos divididos da H. hemerocallidea. Optimização do método extractivo para a obtenção de extractos secos dos cormos da Hypoxis hemerocallidea 43 No caso da secagem por vazio, os pedaços foram pesados e colocados na estufa de vazio (Figura 18) até peso constante. Determinou-se a perda de água durante o processo, a humidade residual e o teor em hipoxósido. Figura 18. Secagem em estufa de vazio dos cormos da H. hemerocallidea. 3.2.3.2 Caracterização dos cormos secos 3.2.3.2.1 Determinação da humidade dos cormos secos A determinação da humidade do fármaco vegetal é indispensável uma vez que quantidades excessivas de água podem comprometer a sua qualidade, podendo facilitar o crescimento de microrganismos (bactérias e fungos) e promover a degradação das substâncias activas (hidrólises). É habitual que a secagem seja conduzida de modo a que o material vegetal (no geral) fique com uma quantidade de água de cerca de 5 %, sendo o limite descrito nas farmacopeias normalmente de 10% [Proença da Cunha et al., 2005]. A determinação da humidade dos fármacos vegetais pelo método gravimétrico ou perda por secagem é o adoptado pelas farmacopeias (Farmacopeia Europeia, Farmacopeia Portuguesa, Farmacopeia dos EUA e a Farmacopeia Britânica), mas que se utiliza uma estufa. A determinação da humidade foi efectuada com uma balança de humidade [AND Infrared Moisture Determination Balance AD-4713; (A&D Company, limited, Japão)] que, embora não seja metodologia inscrita na Farmacopeia Portuguesa, é muito utilizada na indústria farmacêutica. É um método simples e rápido. Optimização do método extractivo para a obtenção de extractos secos dos cormos da Hypoxis hemerocallidea 44 Protocolo experimental Pesou-se cerca de 1 g do material vegetal seco por um dos métodos estudados, previamente pulverizado (125 µm), directamente no aparelho e procedeu-se ao teste a 105ºC durante 30 minutos. O ensaio foi efectuado em duplicado. 3.2.3.2.2 Doseamento do hipoxósido nos cormos secos por HPLC O método usado para o doseamento baseia-se no descrito por Nair e Kanfer (2006). As condições cromatográficas, assim como os aspectos inerentes à sua validação, serão discutidos mais adiante neste capítulo. Protocolo experimental Pesou-se, exactamente, 25 mg de cada amostra previamente pulverizada e tamisada por um tamis de 125 µm (Retsch GmbH & Co, Alemanha) para um balão volumétrico de 10 ml. Adicionou-se metanol, agitou-se durante 1 minuto num vórtex (Heidolph Reax 2000; Alemanha) e levou-se ao ultra-sons (Bandelin Sonorex RK 100H; Bandelin Electronic, Alemanha) durante 20 minutos. Após o arrefecimento (5 minutos), completou-se o volume e agitou-se. Tomou-se 1 ml para um balão volumétrico de 10 ml e completou-se o volume com metanol. Agitou-se a preparação no vórtex durante 1 minuto antes de filtrar através de um filtro seringa de PTFE (0,2 µm) e injectar 10 µl no cromatógrafo (condições cromatograficas descritas na Tabela 16). 3.2.3.3 Preparação e caracterização de extractos secos da H. hemerocallidea (cormo) com potencial uso na preparação de formas farmacêuticas Pretende-se obter um extracto concentrado em hipoxósido e com um elevado rendimento, isto é, obter maior quantidade de extracto e com maior teor em hipoxósido. O método de extracção escolhido foi a maceração com agitação, pelo facto de ser simples e não necessitar de equipamento mais elaborado. Além disso, a maior parte dos métodos descritos nas tabelas (Tabela 6 e Tabela 7) eram similares ao proposto. Optimização do método extractivo para a obtenção de extractos secos dos cormos da Hypoxis hemerocallidea 45 3.2.3.3.1 Preparação das amostras Obtenção do pó A granulometria do material vegetal usado na preparação dos extractos pode influenciar o rendimento da extracção. Tendo em consideração este aspecto, prepararam-se pós com diversa granulometria. Protocolo experimental Pesou-se uma determinada quantidade de fármaco vegetal seco e triturou-se num moinho de lâminas de uso doméstico por períodos inferiores a 30 segundos. Passou-se o pó num conjunto de tamises (63, 75, 90, 125, 180, 355 e 500 µm) fixados num vibrador de tamises [Retsch AS 200 digit, (Retsch GmbH & Co, Alemanha)] durante 2 minutos e na posição 2, de modo a obter pós com as seguintes granulometrias: <63, 75/63, 90/75, 180/125, 355/180, 500/355 µm. As fracções foram colocadas em frascos de vidro âmbar e conservadas em local seco e fresco à temperatura ambiente (20-25ºC). 3.2.3.3.2 Optimização do processo extractivo Para a escolha do método de extracção foram avaliados os seguintes factores: 1. solvente; 2. tenuidade; 3. temperatura; 4. quantidade de água nas misturas hidro-alcoólicas; 5. duração da extracção 6. número de etapas extractivas 7. razão planta/solvente. Estes factores foram avaliados em função do rendimento do processo (razão extracto/planta), do teor em hipoxósido no extracto e da massa de hipoxósido extraída. 3.2.3.3.2.1 Solvente O solvente é um dos factores importantíssimos na preparação dos extractos, quer pelas características referentes ao solvente, quer pela quantidade e qualidade do extracto que se obtém. Optimização do método extractivo para a obtenção de extractos secos dos cormos da Hypoxis hemerocallidea 46 Optou-se por avaliar alguns dos solventes comummente descritos na literatura. No entanto, na eleição do solvente, para além da quantidade de extracto obtido e do teor em hipoxósido desses extractos, foram avaliados os seguintes aspectos: 1. Ser seguro e/ou não agressivo para o ambiente 2. Ser económico 3. Facilitar o processo de extracção, tornando-o menos moroso. Protocolo experimental Pesou-se, numa balança analítica (Mettler Toledo AG245), cerca de 1 g de pó da H. hemerocallidea (180/125 ou 75/63, conforme o caso). Colocou-se esta quantidade num matraz rolhado de 25 ml e adicionou-se 10 ml do solvente [metanol, etanol absoluto, etanol a 96%, mistura hidro-alcoólica: água-etanol 96% (1:2) e água-metanol (1:2)] ou 5 ml de metanol para o caso em que se utilizou pó 75/63. Submeteu-se a agitação magnética de 400 rpm [Heidolph MR Hei – Tec (Heldolph Instruments, Alemanha)] durante 15 minutos para o primeiro caso e durante 30 minutos para o segundo caso, à temperatura ambiente (20-25ºC). Extraiu-se por duas vezes com o mesmo solvente e na mesma quantidade para o primeiro caso. Filtrou-se cada extracto através de um filtro de polietileno (Isolute ® SPE Accessories; Polyethylene Frits 10 µm 25 ml; Symta, Madrid) de 10µm inserido num sistema de filtração da marca Supelco acoplado a uma bomba de vácuo Büchi Vac ® V-500 (Büchi Labortechnik AG, Suíça) e reuniu-se os filtrados num balão de fundo redondo. Adicionou-se cerca de 10 ml de água purificada em cada balão e concentrou-se as soluções extractivas num evaporador rotativo (Büchi Rotavapor RE 111 – Büchi 461 water bath), a temperatura ambiente, até cerca de 5 ml. Congelou-se a -20 ºC e liofilizou-se [Telstar cryodos Modelo Cryodos 90 (Josep Tapiolas 120, Terrassa, Espanha)] durante 48 horas. Pesou-se os extractos obtidos e conservou-se em frascos de vidro âmbar ao abrigo da luz e humidade, a -20 ºC, até à sua utilização. Avaliou-se a massa e a concentração do hipoxósido em cada extracto obtido. A Tabela 9 apresenta um resumo das condições de extracção utilizadas na avaliação deste parâmetro. Optimização do método extractivo para a obtenção de extractos secos dos cormos da Hypoxis hemerocallidea 47 Tabela 9. Avaliação preliminar e escolha do solvente Método Solvente Tenuidade (µm) Nº de etapas extractivas Razão planta/ solvente (m/V) Duração de cada etapa (min) S1 Metanol 180/125 2 1:10 15 S2 Água/metanol 96% (1:2) 180/125 2 1:10 15 S3 Água/etanol 96% (1:2) 180/125 2 1:10 15 S4 Etanol 96% 180/125 2 1:10 15 S5 Etanol absoluto 180/125 2 1:10 15 S6 a Metanol 75/63 (75µm=200 mesh) 1 1:5 30 S7 Acetona 180/125 2 1:10 15 EBA Trad.* Água 75/63 1 1:30 20 *Cozimento, 100ºC. Com este extracto pretende-se mimetizar o obtido tradicionalmente, que difere no facto de partir de um fármaco vegetal seco. a Método descrito (Tabela 7) que conduz à obtenção de extractos com elevado teor em hipoxósido. 3.2.3.3.2.2 Tenuidade A tenuidade é um parâmetro relacionado com a exposição do material a extrair ao solvente usado. Regra geral, quanto mais ténue for o material, maior será a sua área de exposição e maior será a capacidade de extrair os constituintes solúveis nesse solvente. No entanto, deve haver sempre um compromisso, pois pós mais finos podem dificultar o processo de extracção. Protocolo experimental Efectuou-se de acordo com o procedimento descrito no ponto 3.2.3.3.2.1, observando as condições inscritas na Tabela 10. Tabela 10. Avaliação do efeito da tenuidade na eficiência do processo de extracção Ensaio Solvente Tenuidade (µm) Nº de etapas extractivas Razão planta/solvente (m/V) Duração de cada etapa (min) S4 Etanol 96% 180/125 2 1:10 15 G1 Etanol 96% 75/63 2 1:10 15 G2 Etanol 96% 500/355 2 1:10 15 Optimização do método extractivo para a obtenção de extractos secos dos cormos da Hypoxis hemerocallidea 54 3.3 Resultados e discussão 3.3.1 Secagem 3.3.1.1 Comparação dos métodos de secagem A Tabela 17 apresenta os resultados da humidade e do teor em hipoxósido do material vegetal seco. Estes parâmetros não diferem muito, apesar de se notar um ligeiro aumento do teor em hipoxósido e uma diminuição da humidade nos cormos liofilizados. Estes resultados sugerem que a secagem em estufa de vazio pode ser um método adequado e alternativo à liofilização na secagem dos cormos da BA. Tabela 17. Comparação da secagem em liofilizador e em estufa de vazio Amostra Perda de água nos cromos (% m/m) Humidade do material seco (% m/m) Média ± DP [hipoxósido] (% m/m) Média ± DP Estufa de vazio Liofilizador Estufa de vazio Liofilizador Estufa de vazio Liofilizador Amostra II 68,95 68,00 8,57 ± 0,86 7,42 ± 0,07 13,59 ± 1,20 16,18 ± 0,56 Amostra I 53,22 55,38 7,07 ± 0,30 6,93 ± 0,42 17,65 ± 0,96 18,56 ± 0,24 Amostra III 42,74 44,90 8,83 ± 0,07 7,81 ± 0,41 21,05 ± 0,67 21,77 ± 0,62 A quantidade de água perdida durante o processo de secagem está apresentada na Tabela 18. Estes valores não se referem à humidade dos cormos, uma vez que ainda existe uma determinada quantidade de água residual, mas, à semelhança da Tabela 17, permite-nos sugerir que os dois processos retiraram quantidade aproximada de água nos cormos da BA. Apesar destes valores não se referirem à humidade dos cormos, podem dar uma ideia da sua humidade e, tendo em conta a origem das amostras, podemos fazer a seguinte apreciação: a amostra I (A7, A8, A23 e A25) apresenta um valor na ordem dos 50 a 60%, a amostra II (A4, A5, A33, A38, A39, A43) um valor compreendido entre 50 e 70%, e no caso da amostra III (A9, A10, A30) os valores rondam os 35 a 45%. Em relação a amostra IV (A24 e A45) este valor supera os 70% e finalmente para a amostra V (A46 e A48) os valores estão compreendidos entre 65 e 70%. Optimização do método extractivo para a obtenção de extractos secos dos cormos da Hypoxis hemerocallidea 55 Tabela 18. Perda de água a partir dos cormos da H. hemerocallidea durante o processo de secagem Origem das amostras Amostra* Perda de água (% m/m) Colhidas na Macia – Gaza (Amostra I) A7 53,22 A8 55,38 A23 58,57 A25 58,88 Compradas na Macia – Gaza (Amostra II) A4 68,95 A5 68,00 A43 61,67 A39 56,04 A38 58,47 A33 63,53 Colhidas na Namaacha-Maputo (Amostra III) A9 42,74 A10 44,90 A30 35,99 Colhidas no IIAM – Maputo (Amostra IV) A45 73,98 A24 76,18 Colhidas em Lisboa - Portugal (Amostra V) A48 66,36 A46 68,30 *Cormos divididos em cubos. Todas as amostras foram secas por liofilização, à excepção de A7, A4 e A9, que foram secas numa estufa de vazio. Assumindo que a humidade residual será aproximada para todas as amostras, estes resultados sugerem que as amostras colhidas na região da Namaacha (amostra III) têm menor humidade que as colhidas noutros pontos. É provável que a amostra da região da Namaacha tenha menor teor em água pelo facto de se desenvolver num terreno montanhoso. Optimização do método extractivo para a obtenção de extractos secos dos cormos da Hypoxis hemerocallidea 56 3.3.1.2 Características dos cormos secos 3.3.1.2.1 Aparência dos cormos A aparência dos cormos secos difere tendo em conta o método de secagem usado. Os que foram secos na estufa de vazio apresentam-se mais irregulares quando comparados com os liofilizados – que se apresentam menos deformados. 3.3.1.2.2 Determinação da humidade dos cormos secos da H. hemerocallidea Os resultados da determinação da humidade são apresentados na Tabela 19. Todas as amostras apresentam humidades inferiores a 10% (m/m) e duas amostras apresentaram valores inferiores 5% (m/m). Tabela 19. Teor em água nos cormos secos Origem das amostras Amostra* Teor em água (%) Média ± DP (n=2) Colhidas na Macia – Gaza (Amostra I) A7 7,07 ± 0,30 A8 6,93 ± 0,42 A23 6,25 ± 0,70 A25 7,50 ± 0,43 Compradas na Macia – Gaza (Amostra II) A4 8,57 ± 0,86 A5 7,42 ± 0,07 A43 5,55 ± 0,14 A39 8,97 ± 0,25 A38 6,23 ± 0,13 A33 4,55 ± 0,15 Colhidas na Namaacha-Maputo (Amostra III) A9 8,83 ± 0,07 A10 7,81 ± 0,41 A30 4,89 ± 0,05 Colhidas no IIAM – Maputo (Amostra IV) A45 8,71 ± 0,37 A24 8,68 ± 0,04 Colhidas em Lisboa – Portugal (Amostra V) A48 9,01 ± 0,37 A46 8,82 ± 0,11 *Cormos secos pulverizados. Todas as amostras foram secas por liofilização, a excepção de A7, A4 e A9, que foram secas numa estufa de vazio. Optimização do método extractivo para a obtenção de extractos secos dos cormos da Hypoxis hemerocallidea 57 3.3.1.2.3 Teor em hipoxósido nos cormos secos A determinação do teor em hipoxósido foi efectuada com base no método de HPLC descrito por Nair e Kanfer (2006). Os valores do teor em hipoxósido para as diferentes amostras encontram-se representados na Figura 19 e apresentados na Tabela 20. Figura 19. Teor em hipoxósido nos cormos secos da H. hemerocallidea As amostras A24, A45 e A48 apresentaram teores em hipoxósido inferiores a 10%. A maior parte das amostras apresentou teores de hipoxósido entre 15 e 20%. A amostra A30 é a que tem maior teor em hipoxósido, com cerca de 30%. Avaliando os teores em hipoxósido e a origem da planta nota-se alguns resultados interessantes. Observa-se uma relação entre o teor em hipoxósido e o peso dos cormos da BA para as amostras III, IV e V. Para as amostras da mesma proveniência, o teor aumenta com o aumento do peso do cormo. O mesmo não se verifica com as amostras I e II. Não encontramos justificação plausível para explicar este segundo cenário, mas o primeiro poderá estar relacionado com a idade da planta que, por sua vez, se relaciona com o peso dos cormos. É provável que o teor em hipoxosido nos cormos aumente com a idade da planta. Optimização do método extractivo para a obtenção de extractos secos dos cormos da Hypoxis hemerocallidea 58 Tabela 20. Teor em hipoxósido nos cormos secos da H. hemerocallidea Origem das amostras Amostra* Hipoxósido (%) (Média ± DP) Colhidas na Macia – Gaza (Amostra I) A7 17,65 ± 0,96 A8 18,56 ± 0,24 A23 17,98 A25 17,71 ± 1,46 Compradas na Macia – Gaza (Amostra II) A4 13,59 ± 1,20 A5 16,18 ± 0,56 A43 21,34 ± 2,03 A39 15,20 ± 1,11 A38 18,13 ± 0,99 A33 17,52 ± 1,36 Colhidas na Namaacha-Maputo (Amostra III) A9 21,05 ± 0,67 A10 21,77 ± 0,62 A30 30,70 ± 2,52 Colhidas no IIAM – Maputo (Amostra IV) A45 7,33 ± 0,81 A24 9,28 Colhidas em Lisboa – Portugal (Amostra V) A48 8,73 ± 0,60 A46 16,80 ± 1,23 *Todas as amostras foram secas por liofilização a excepção de A7, A4 e A9 que foram secas numa estufa de vazio. (n=2, excepto A23 e A24 com uma determinação) 3.3.2 Preparação dos extractos Como fizemos referência anteriormente, usou-se a amostra A39 (Amostra II - comprada na região da Macia) para avaliar os factores que influenciam o processo de extracção. Esta amostra foi escolhida por apresentar maior quantidade relativa de cormos secos da BA. Na optimização da extracção da BA, as variáveis medidas foram o rendimento da extracção (razão extracto/planta), o teor de hipoxósido no extracto e a quantidade de hipoxósido extraída. Os factores avaliados foram: solvente, tenuidade do pó, temperatura de extracção, quantidade de água nas misturas hidro-alcoólicas, número e duração de etapas extractivas e a razão planta/solvente. A avaliação foi feita medindo as variáveis do processo em função da variação do factor em análise (fixando os restantes factores). Optimização do método extractivo para a obtenção de extractos secos dos cormos da Hypoxis hemerocallidea 59 3.3.2.1 Influência do solvente Na Tabela 21 está apresentado o efeito do solvente na preparação dos extractos obtidos a partir de cormos secos da BA. Avaliou-se o efeito do metanol, água/metanol (1:2), água/etanol 96% (1:2), etanol a 96º, acetona e água a 100ºC na preparação dos extractos. No caso do metanol, para além das condições estabelecidas para outros solventes, fez-se experiências com outras condições (S6) usando um tamanho de partícula de 75/63 µm, razão planta/solvente (1:5 m/V) e duração do processo de 30 minutos com apenas uma etapa, na tentativa de replicar o método descrito por Allison et al. (1996). A preparação do EBA Trad – extracto aquoso que tenta mimetizar o extracto tradicional – também obedeceu a outras condições: temperatura da água (100ºC), tamanho da partícula (75/63 µm), razão planta/solvente (1:30 m/V) e duração do processo (20 minutos) com apenas uma etapa. Tabela 21. Efeito do solvente na eficiência do processo extractivo Método Extracto/Planta Média ± DP (%) [Hipoxósido] Média ± DP (%) Massa de hipoxósido Média ± DP (mg) S1 40,37 ± 0,18 38,10 ± 4,00 153,94 ± 16,89 S2 47,87 ± 0,97 33,75 ± 1,20 161,81 ± 9,05 S3 48,42 ± 0,31 33,70 ± 2,23 163,21 ± 9,76 S4 33,32 ± 0,34 41,46 ± 2,07 138,21 ± 5,53 S5 26,06 ± 0,90 44,13 ± 2,05 115,19 ± 9,27 S6 32,49 ± 1,80 41,06 ± 2,88 134,10 ± 17,17 S7 10,76 ± 1,56 42,66 ± 0,78 45,98 ± 7,51 EBAtradª. 46,01 26,34 121,43 ª n=1, os restantes extractos foram avaliados em duplicado (n=2). S1:metanol; S2: água/metanol (1:2); S3: água/etanol 96% (1:2); S4: etanol 96%; S6:metanol (pó 75/63 µm); S7:acetona; EBA Trad: água (100ºC) Os resultados demonstraram que o rendimento da extracção (razão extracto/planta) é influenciado pela presença de água no solvente extractivo. Isto é notório nos métodos S2 e S3 (misturas hidro-alcoólicas) e no método tradicional em que se usa apenas água. O método S7 é o que apresenta menor rendimento, o que pode estar relacionado com a baixa polaridade da acetona. É interessante notar que os solventes que apresentam bons rendimentos na extracção não apresentam, comparativamente, extractos com maior concentração. Isto pode dever-se ao facto de existirem na planta muitas substâncias polares que são extraídas maioritariamente com esses solventes. Optimização do método extractivo para a obtenção de extractos secos dos cormos da Hypoxis hemerocallidea 60 Quanto à razão extracto/planta podemos distinguir 5 grupos ordenados de maneira decrescente, o primeiro constituído por S2, S3 e EBAtrad, o segundo pelo S1, o terceiro constituído por S6 e S4, o quarto por S5 e, por último, o quinto grupo constituído por S7. Em relação ao teor em hipoxósido podemos distinguir dois grupos, onde os solventes S1, S6, S4, S7 e S5 pertencem aos dois grupos. Isto é, não se encontram diferenças significativas nestes solventes no que se refere ao efeito na concentração do hipoxósido no extracto. No que se refere à quantidade total de hipoxósido extraída, podemos distinguir três grupos, sendo o S7 pertencente ao terceiro grupo (que é o que menos extrai) e os solventes S1, S4 e S6 que pertencem simultaneamente aos restantes dois grupos. Os solventes S2 e S3 apesar de não diferirem estatisticamente dos S1, S4 e S6, são os que apresentam maior capacidade de extrair o hipoxósido. Nestas circunstâncias, tanto o metanol como etanol poderiam ser escolhidos como solventes para obter extractos concentrados em hipoxósido. Tendo em conta a segurança do solvente, optou-se por eleger o etanol a 96% V/V como solvente de referência, sendo utilizado para avaliar outros factores que influenciam a preparação de extractos. 3.3.2.2 Influência da tenuidade Nesta avaliação utilizou-se o etanol a 96% V/V como solvente e foi testado o efeito da granulometria na obtenção dos extractos. Foram avaliadas as seguintes granulometrias 180/125 (S4), 75/63 (G1) e 500/355 (G2). Os outros factores foram mantidos constantes. Na Tabela 22 estão apresentados os resultados da avaliação do efeito da tenuidade do pó na preparação dos extractos. Os resultados demonstraram que o rendimento dos extractos está relacionado com a granulometria do pó, tendo apresentado maior rendimento o pó com menor tamanho de partícula (G1) (p<0,05). No entanto, quando fazemos a avaliação em relação à concentração dos extractos, nota-se que não há diferenças significativas entre os teores em hipoxósido (p>0,5). Em relação à quantidade de hipoxósido extraído, observa-se que para granulometrias entre 63 e 180 µm não há diferenças significativas (p>0,05). No entanto, para granulometrias entre 355 e 500 µm ocorre uma redução da capacidade extractiva. G2 extrai menor quantidade (p<0,05) comparativamente com G1 e S4. Optimização do método extractivo para a obtenção de extractos secos dos cormos da Hypoxis hemerocallidea 61 Tabela 22. Efeito da tenuidade na eficiência do processo extractivo Método Extracto/Planta Média ± DP (%) [Hipoxósido] Média ± DP (%) Massa do hipoxósido Média ± DP (mg) S4 33,32 ± 0,34 a 41,46 ± 2,07 b 138,21 ± 5,53 c G1 37,87 ± 1,35 a 40,33 ± 2,34 b 153,12 ± 11,96 G2 29,81 ± 1,01 a 37,95 ± 1,96 b 113,16 ± 2,49 d a p<0,05 comparando com todos; b p>0,05 comparando com todos; c p>0,05 comparando com G1; d p<0,05 comparando com S4 e com G1. Nestas circunstâncias, não parece vantajoso trabalhar com tenuidades baixas (G1), já que, apesar de proporcionar um rendimento relativamente bom, há uma certa dificuldade em manipular pós com tenuidade baixa. Assim, o método S4 será usado para avaliar o factor seguinte. 3.3.2.3 Influência da temperatura Para avaliar o efeito da temperatura na preparação dos extractos foram avaliadas duas temperaturas, a temperatura ambiente (20-25ºC) (S4) e a 90ºC (ET3), tendo sido mantidos outros parâmetros como o solvente (etanol a 96%, V/V), o número de etapas extractivas (2), a razão planta/ solvente (1:10 m/V), a duração de cada etapa extractiva (15 minutos) e a velocidade de agitação (400 rpm). Os resultados apresentados na Tabela 23 mostram que o aumento da temperatura aumenta o rendimento da extracção, o que prejudica, de maneira não significativa a concentração do hipoxósido nos extractos e não tem efeito significativo na quantidade de hipoxósido extraído. Com o aumento da temperatura, aumenta o rendimento da extracção, mas há uma ligeira diminuição da concentração do hipoxósido no extracto. Assim, o método S4 será usado na avaliação do parâmetro seguinte. Tabela 23. Efeito da temperatura na eficiência do processo extractivo Método Extracto/Planta Média ± DP (%) [Hipoxósido] Média ± DP (%) Massa de hipoxósido Média ± DP (mg) S4 33,32 ± 0,34 a 41,46 ± 2,07 b 138,21 ± 5,53 c ET3 42,10 ± 0,81 34,69 ± 2,48 146,38 ± 13,25 a p<0,05 comparando com ET3; b p=0,055) comparado com ET3; c p>0,05 comparado com ET3. Optimização do método extractivo para a obtenção de extractos secos dos cormos da Hypoxis hemerocallidea 62 3.3.2.4 Influência da percentagem de água na mistura hidro-alcoólica Para avaliar o efeito da percentagem de água na mistura hidro-alcoólica na preparação dos extractos foram avaliadas solventes com diversas graduações: ET2 (70% de água), S3 (36% de água), S4 (4% de água) e S5 (0,5% de água). A Tabela 24 apresenta os resultados obtidos na avaliação do efeito da quantidade da água na mistura hidro-alcoólica. Tabela 24. Efeito da percentagem de água na mistura hidroalcoólica na eficiência do processo extractivo. Método Extracto/Planta Média ± DP (%) [Hipoxósido] Média ± DP (%) Massa de hipoxósido Média ± DP (mg) S3 48,42 ± 0,31 a 33,7 ± 2,23 1 163,21 ± 9,76 3,4 S4 33,32 ± 0,34 b 41,46 ± 2,07 2 138,21 ± 5,53 4 S5 26,06 ± 0,9 c 44,13 ± 2,05 115,19 ± 9,27 5 ET2 56,63 23,70 134,41 a p<0,05 comparado com S4, S5 e ET2; b p<0,05 comparado com S3 e S4 e ET2; c p<0,05 comparado com S3, S4 e ET2, 1 p<0,05 comparado com S5 e ET2; 2 p>0,05 comparado com S3 e S5; 3 p<0,05 comparado com S5 e ET2; 4 p>0,05 comparado com S4; 5 p>0,05 comparado com S4 e ET2. Os resultados mostram que há um aumento significativo (p<0,05) da quantidade de extracto obtido à medida que aumentamos a quantidade de água na mistura hidroalcoólica. Este aumento da quantidade de extracto tem a ver com o aumento da polaridade do solvente (aumento da solubilidade) o que leva ao aumento da quantidade de constituintes polares extraídos. Em relação à concentração do hipoxósido nos extractos, nota-se uma tendência de diminuição à medida que aumentamos a quantidade de água na mistura. No entanto, esta diferença é significativa de S5 para S3 ou ET2 (p<0,05), não o sendo em relação a S3 e S4 ou S4 e S5 (p>0,05). Nestas circunstâncias, parece-nos adequado continuar a incluir o método S4 na avaliação da influência do número de etapas extractivas e da razão planta/ solvente no processo extractivo. Optimização do método extractivo para a obtenção de extractos secos dos cormos da Hypoxis hemerocallidea 63 3.3.2.5 Influência da duração da etapa extractiva Para avaliar o efeito da duração da etapa extractiva na preparação dos extractos foram avaliados extractos obtidos a partir de métodos que duravam 15 minutos (ET4) e 30 minutos (ET5). Esta avaliação foi feita usando uma etapa de extracção, sendo mantida as restantes condições extractivas. Os resultados apresentados na Tabela 25 mostram que, apesar de haver uma tendência para o extracto ET4 apresentar maior rendimento, teor em hipoxósido e quantidade extraída de hipoxósido, estes valores não são significativamente diferentes dos do extracto ET5 (p>0,05). Não parece haver diferenças nos extractos no que se refere ao rendimento, teor e quantidade em hipoxósido, quando se fazem extracções durante 15 ou 30 minutos. Tabela 25. Efeito da duração da etapa extractiva na eficiência do processo extractivo Método Duração da extracção Extracto/Planta Média ± DP (%) [Hipoxósido] Média ± DP (%) Qtd hipoxósido Média ± DP (mg) ET4 15 min 24,00 ± 0,81 a 39,87 ± 0,35 b 95,84 ± 2,50 c ET5 30 min 23,88 ± 1,02 38,07 ± 1,26 91,14 ± 6,90 a, b, c p>0,05 comparando com ET5 Nestas circunstâncias, não há necessidade de usar 30 minutos nas etapas de extracção uma vez que se consegue obter resultados semelhantes em etapas de 15 minutos, o que é importante do ponto de vista económico. Optimização do método extractivo para a obtenção de extractos secos dos cormos da Hypoxis hemerocallidea 70 Tabela 33. Rendimento e concentração do hipoxósido em todos os extractos obtidos pelo método S4 [Hipoxósido] (% m/m) Razão extracto/planta (% m/m) S4 a 39,99 33,55 S4 b 42,92 33,08 S4c1 35,02 33,74 S4c2 37,06 36,49 S4c3 35,65 35,96 S4c4 36,26 36,12 Méd 37,82 34,82 DP 3,04 1,52 CV 8,04% 4,37% Fazendo uma compilação de todos os resultados (Tabela 33), observa-se que os valores do CV para o rendimento do processo, assim como para o teor em hipoxósido, são inferiores a 8,5% e 4,5%, respectivamente. Isto leva-nos a concluir que a metodologia tem consistência. 3.3.5 Extractos obtidos com cormos de H. hemerocallidea provenientes de diferentes regiões de Moçambique Avaliou-se o efeito da origem dos cormos na qualidade dos extractos. Para o efeito, foram preparados extractos com diferentes amostras provenientes de várias regiões de Moçambique (Amostra I – colhida na região da Macia, Amostra II – comprada na região da Macia, Amostra III – colhida na região da Namaacha, Amostra IV – fornecida pelo Dr. Sofrimento/IIAM) e uma colhida em Portugal (Amostra V – fornecida pela Prof. Doutora Elsa Gomes). As condições de extracção usadas, obtidas após a avaliação dos factores que influenciam a extracção, encontram-se resumidas na Tabela 34. Optimização do método extractivo para a obtenção de extractos secos dos cormos da Hypoxis hemerocallidea 71 Tabela 34. Condições do processo de extracção do método optimizado Condição Descrição Solvente: Etanol a 96% V/V Tamanho da partícula: 180/125 µ m Razão planta/solvente: 1:10 m/V Número de etapas extractivas: 2 Duração de cada etapa extractiva: 15 min Agitação: 400 rpm Temperatura 20-25ºC 3.3.5.1 Rendimento da extracção Os resultados dos rendimentos dos processos de extracção para as diferentes amostras estão apresentados na Tabela 35. Os valores mostram que há uma diferença entre os rendimentos de extracção obtidos para as diferentes amostras de cormos secos. Os valores variam de 3,52 a 5,11% para a Amostra IV, 12 a 22% para a Amostra V, cerca de 30% para amostra I, 20 a 41% para a amostra II e 25 a 42% para a amostra III. A maior parte destes extractos, tem rendimentos de extracção superiores aos descritos por Allison et al. (1996). Optimização do método extractivo para a obtenção de extractos secos dos cormos da Hypoxis hemerocallidea 72 Tabela 35. Rendimento de extracção de extractos obtidos a partir de cormos secos da BA de diferentes proveniências Origem das amostras Extracto Razão massa do extracto/Pó (% m/m) Colhidas na Macia – Gaza (Amostra I) Ext. A7 28,26 Ext. A8 29,34 Ext. A23 29,31 Ext. A25 30,94 Compradas na Macia – Gaza (Amostra II) Ext. A4 20,66 Ext. A5 19,72 Ext. A43 34,45 Ext. A39 (S4)* 33,32±0,34 Ext. A38 41,43 Ext. A33 33,57 Colhidas na NamaachaMaputo (Amostra III) Ext. A9 26,20 Ext. A10 25,44 Ext. A30 41,96 Colhidas no IIAM – Maputo (Amostra IV) Ext. A45 3,52 Ext. A24 5,11 Colhidas em Lisboa – Portugal (Amostra V) Ext. A48 12,45 Ext. A46 22,36 (*n=2, os restantes n=1) 3.3.5.2 Caracterização dos extractos Três parâmetros foram avaliados na caracterização dos extractos: o aspecto, a humidade e o teor em hipoxósido. 3.3.5.2.1 Aparência dos extractos A Tabela 36 apresenta a aparência dos extractos obtidos pelo método de extracção optimizado. Nota-se que os extractos obtidos a partir das amostras III, IV e V apresentam a mesma coloração, enquanto as obtidas com as amostras I e II apresentam cor distinta. Esta diferença de coloração dos extractos está conforme a cor dos cormos pulverizados que lhes deram origem. Optimização do método extractivo para a obtenção de extractos secos dos cormos da Hypoxis hemerocallidea 73 Tabela 36. Aparência dos extractos Amostra Descrição dos extractos Aspecto Amostra I Amarelo acastanhado Amostra II Amarelo torrado Amostra III Amarelo Amostra IV Amarelo claro Amostra V Amarelo claro 3.3.5.2.2 Humidade A humidade dos extractos foi determinada pelo método gravimétrico ou perda por secagem. A Tabela 37 apresenta os resultados das humidades determinadas nos extractos. O extracto comercial apresenta o valor de humidade mais baixo, cerca de 2,56%, e está conforme o estipulado no certificado de análise que acompanhava a amostra (<6% m/m). Os extractos preparados apresentaram humidades entre 4,61% e 7,06% (m/m). A Farmacopeia Portuguesa refere que o teor em água nos extractos secos deve ser inferior a 5% (m/m). Assim, a maior parte dos extractos excede este limite, mas encontra-se dentro do limite descrito no boletim analítico que acompanha a amostra comercial do extracto de H. hemerocallidea. Nestas circunstâncias, consideramos estes valores como aceitáveis. Optimização do método extractivo para a obtenção de extractos secos dos cormos da Hypoxis hemerocallidea 74 Tabela 37. Teor em água nos extractos obtidos de cormos de H. hemerocallidea de diferentes proveniências Extracto Humidade Média±DP (n=2)(% m/m) Ext. A7 5,16 ± 0,20 Ext. A8 4,67 ± 0,27 Ext. A23 4,61 ± 0,28 Ext. A25 6,55 ± 0,51 Ext. A4 6,94 ± 0,73 Ext. A5 5,54 ± 0,73 Ext. A43 6,38 ± 0,18 Ext. A39 (S4)* 4,71 ± 0,31 Ext. A38 6,66 ± 0,24 Ext. A33 6,62 ± 0,52 Ext. A9 7,06 ± 0,18 Ext. A10 5,45 ± 0,63 Ext. A30 5,05 ± 1,14 Ext. A45 ND Ext. A24 ND Ext. A48 5,48 ± 0,28 Ext. A46 5,99 ± 0,80 EBA com 2,56 ± 0,06 (ND= Não determinado) 3.3.5.2.3 Teor em hipoxósido A Tabela 38 apresenta os valores do teor de hipoxósido dos extractos alcoólicos secos obtidos a partir dos cormos secos da BA de diferentes proveniências. Os teores em hipoxósido nos extractos são superiores a 20 % (m/m), com excepção do extracto A23. Agrupando os resultados em função da origem dos cormos temos 9 a 37% para a amostra I (uma com 9% e as restantes superiores a 30%), 23 a 41% para a amostra II, cerca de 41% para a amostra III, cerca de 22% para a amostra IV e, finalmente, cerca de 42% para a amostra AV. Optimização do método extractivo para a obtenção de extractos secos dos cormos da Hypoxis hemerocallidea 75 Tabela 38. Teor em hipoxósido nos extractos alcoólicos secos obtidos a partir de cormos secos da BA de diferentes proveniências Origem das amostras Extracto Razão massa do extracto/Pó (% m/m) Teor de hipoxósido nos extractos Média ± DP (% m/m)* Colhidas na Macia – Gaza (Amostra I) Ext. A7 28,26 32,74 ± 0,18 Ext. A8 29,34 32,04 ± 0,28 Ext. A23 29,31 9,40 ± 0,26 Ext. A25 30,94 37,00 ± 1,20 Compradas na Macia – Gaza (Amostra II) Ext. A4 20,66 23,66 ± 0,36 Ext. A5 19,72 29,38 ± 1,14 Ext. A43 34,45 36,79 ± 0,22 Ext. A39 (S4) * 33,32±0,34 41,46 ± 2,07 Ext. A38 41,43 34,93 ± 0,35 Ext. A33 33,57 34,13 ± 1,14 Colhidas na Namaacha-Maputo (Amostra III) Ext. A9 26,20 40,51 ± 1,24 Ext. A10 25,44 40,26 ± 1,11 Ext. A30 41,96 43,77 ± 0,53 Colhidas no IIAM – Maputo (Amostra IV) Ext. A45 3,52 23,54 ± 0,42 Ext. A24 5,11 21,74 ± 0,34 Colhidas em Lisboa – Portugal (Amostra V) Ext. A48 12,45 42,20 ± 0,58 Ext. A46 22,36 43,89 ± 0,40 EBA com _ 23,87 (*n=2, n=1 para os restantes valores) Não se encontrou explicação que justificasse um teor em hipoxósido muito baixo no extracto A23, até porque extractos obtidos com cormos provenientes do mesmo local apresentaram teores superiores a 30%. De referir que os extractos obtidos de plantas fornecidas pelo IIAM, apesar de terem rendimentos de extracção inferiores a 6%, têm teores de hipoxósido superiores a 20%. Contudo, apesar de não se saber a razão do baixo rendimento, coloca-se a hipótese de estar relacionada com a natureza do cormo, uma vez que a propagação foi por cultura de tecidos. Há uma tendência para os rendimentos de extracção e o teor em hipoxósido nos extractos obtidos apresentarem valores mais elevados para os cormos com maior peso. Entretanto, a Amostra II apresenta-se um pouco fora desta tendência, o que pode estar relacionado com o facto desta amostra não ter sido colhida por nós (amostra comprada Optimização do método extractivo para a obtenção de extractos secos dos cormos da Hypoxis hemerocallidea 76 na região da Macia), resultando de uma mistura de cormos da BA provenientes da mesma região. Em relação à amostra colhida em Portugal, é de referir que a de menor massa (A48), apresenta um rendimento de extracção inferior a 20%. Contudo, ambos os extractos apresentaram teores em hipoxósido mais elevados, que podem ser explicados, em parte, pelo facto de a secagem (liofilização) destas amostras ter ocorrido imediatamente após a colheita destas. Estes resultados mostram que, apesar da maior parte dos extractos obtidos apresentarem rendimentos de extracção superiores aos descritos por Allison et al. (1996), apresentam teores em hipoxósido inferiores a 50%. É provável que isto esteja relacionado com a não liofilização dos cormos imediatamente após a colheita. Outro dado interessante tem a ver com o teor em hipoxósido do extracto comercial, que era inferior ao valor descrito no certificado de análise. Pensa-se que a amostra comercial vai perdendo o seu teor em hipoxósido com o tempo. Optimização do método extractivo para a obtenção de extractos secos dos cormos da Hypoxis hemerocallidea 77 3.4 Conclusão Comparando os dois métodos de secagem (liofilização versus secagem em estufa de vazio) nota-se não haver diferenças significativas no que se refere à humidade dos cormos de BA secos e ao seu teor em hipoxósido. Assim, podemos considerar a secagem em estufa de vazio (temperaturas inferiores a 30ºC) um método adequado e alternativo à liofilização. Os cormos frescos, à excepção dos colhidos na região da Namaacha, apresentaram humidades aproximadas ou superiores a 60% (m/m). Este valor é semelhante ao obtido por Nair e Kanfer (2006). As amostras da região da Namaacha são menos húmidas. Os cormos secos apresentaram humidades que variam entre 4,55 a 9,01% e teores em hipoxósido entre 7,33 e 30,70%. Relativamente ao teor dos cormos, as amostras colhidas no IIAM apresentam o teor mais baixo (< 10%), seguido das amostras colhidas em Lisboa (8-16,8%), das colhidas na região da Macia (17,6518,56%), das compradas na região da Macia (13,59-21,34%) e das colhidas na região da Namaacha (21,05-30,70%). Relativamente à optimização do método, constatou-se que o método S4 (Solvente: álcool a 96º; Tamanho da partícula: 180/125 µm; Razão planta/solvente: 1:10 m/V; Número de etapas extractivas:2; Duração de cada etapa extractiva: 15 minutos; Agitação: 400 rpm; Temperatura: 20-25ºC) é adequado para obter extractos mais concentrados em hipoxósido e com bom rendimento de extracção. Contudo, estas condições podem ser melhoradas com recurso a outras metodologias de avaliação, como a SRM (Response Surface Methodology), que permite avaliar de maneira interligada todos os factores que influenciam o processo. O método S4 foi validado em função do rendimento do processo e do teor de hipoxósido nos extractos, apresentando valores aceitáveis de precisão intradia (inferiores a 9,5 e 5,5%) e interdias (inferiores a 5 %), respectivamente. Parece haver uma relação entre o teor de hipoxósido nos cormos e o rendimento de extracção ou o teor de hipoxósido nos extractos. A maior parte das amostras apresentam um rendimento de extracção superior a 20%, à excepção das amostras colhidas no IIAM e uma das colhidas em Lisboa. Os teores em hipoxósido nos extractos obtidos foram superiores a 20%, à excepção de uma das amostras colhida na região da Macia, que apresentou um valor inferior a 10%. Apesar de a maior parte dos extractos obtidos apresentarem rendimentos de extracção superiores a 20%, os seus teores em hipoxósido são inferiores a 50%. Allison et al. (1996) obtiveram valores compreendidos entre 50 e Optimização do método extractivo para a obtenção de extractos secos dos cormos da Hypoxis hemerocallidea 78 55%. Em relação ao teor, isto pode estar relacionado com a natureza das matériasprimas usadas. Além disso, a secagem das amostras não foi feita imediatamente após a colheita, e houve também grande espaçamento entre a secagem e a preparação dos extractos. O teor em água nos extractos obtidos está compreendido entre 4,61% e 7,06%. Apesar de estes valores serem, na maior parte, superiores a 5%, não se distanciam muito do valor limite proposto para o extracto comercial da BA. Contudo, um possível melhoramento deste método passaria pela avaliação deste parâmetro. As variações no teor em hipoxósido e em água nos cormos podem estar relacionadas com vários factores como a origem das amostras, a colheita e a conservação das amostras. Isto também pode ser aplicado ao rendimento da extracção dos cormos e à concentração do hipoxósido nos extractos, que em certa medida podem ser influenciados pelo aspecto com que a matriz vegetal se apresenta e que pode ser influenciada pelos factores supracitados. A transposição deste método de extracção para uma escala piloto ou larga escala implica a reavaliação de alguns factores, usando uma metodologia mais robusta de avaliação como a RSM (Response Surface Methodology). De salientar que a produção em larga escala privilegia os custos inerentes, que se relacionam por exemplo com a duração do processo ou o volume de solvente usado. O trabalho, para além de propor um método de secagem alternativo à liofilização e de preparação de extractos mais concentrados em hipoxósido, apresenta o perfil do hipoxósido nas amostras de H. hemerocallidea provenientes de Moçambique. Capítulo 4 Actividade antioxidante de extractos secos obtidos a partir de cormos de Hypoxis hemerocallidea provenientes de diferentes regiões de Moçambique Actividade antioxidante de extractos secos obtidos a partir de cormos de Hypoxis hemerocallidea provenientes de diferentes regiões de Moçambique 86 4.2 Parte Experimental 4.2.1 Material O Etanol a 96 % V/V foi obtido na AGA (Álcool e géneros alimentares S.A., Loures, Portugal). O Etanol a 70% V/V foi preparado a partir do etanol a 96 % V/V. A água foi purificada num sistema Seradest SD 2000 (Seral Erich Alhäuser GmbH, Alemanha). O L- (+)-ácido ascórbico (lote: 05316HJ-508) e o DPPH (1,1 – difenil -2picrilhidrazilo, ~ 90%) (lote: 013K1351) foram obtidos na Sigma (Sigma-Aldrich inc, St. Louis, Mo EUA). Foram usados diferentes tipos de extractos da H. hemerocallidea de diversas proveniências preparados no laboratório (vide capítulo III) e um extracto comercial de H. hemerocallidea (Hypoxidermin ® lote: 0BF001) obtido na Monteloeder (Alicante, Espanha). 4.2.2 Métodos A actividade antioxidante foi avaliada pelo método do radical DPPH. Trata-se de um método simples, fácil de executar, sensível e reprodutível, que não necessita de equipamentos elaborados. O DPPH (1,1-difenil-2-picrilhidrazilo) é um radical estável, centrado no átomo de azoto que apresenta um electrão desemparelhado, responsável pela absorvência a 515517 nm e também pela cor violeta forte. Na presença de antioxidantes dadores de átomos de hidrogénio ou de electrões, o radical DPPH é reduzido originando um produto incolor – a hidrazina – com o consequente decréscimo estequiométrico da absorvência resultante da mudança de cor. O grau de descoloração do radical DPPH constitui assim uma medida da capacidade antioxidante [Blois, 1958; Nair et al., 2007a; Hasan et al., 2009]. Quanto maior for a descoloração – traduzida por menor absorvência – maior será a capacidade antioxidante da substância avaliada. A metodologia usada para determinar a actividade antioxidante pelo método de DPPH foi baseada na metodologia desenvolvida e validada no nosso laboratório [Almeida, 2009]. De referir que o método do radical DPPH foi inicialmente desenvolvido por Blois (1958), melhorado por Brand-Williams et al. [Brand-Williams et al., 1995] e adaptado para se utilizar em microplacas [Fukumoto e Mazza, 2000]. Actividade antioxidante de extractos secos obtidos a partir de cormos de Hypoxis hemerocallidea provenientes de diferentes regiões de Moçambique 87 Protocolo experimental Prepararam-se soluções de DPPH a 300 µM, de ácido ascórbico (controlo positivo) a 100 µg/ml e dos extractos liofilizados a 500 µg/ml em etanol a 96% V/V. A mistura reaccional continha, num volume total de 200 µl, DPPH (150 µM) e soluções dos extractos ou do controlo positivo (ácido ascórbico) em diferentes concentrações. As concentrações foram de 250 a 3,906 µg/ml para os extractos liofilizados e 50 a 0,781 µg/ml para o ácido ascórbico. A absorvência foi lida em 515 nm após 20 minutos de incubação à temperatura ambiente em leitor de placas (BIOTEK, modelo ELX 808, EUA). A capacidade de redução do DPPH foi calculada através da fórmula: Capacidade de redução do DPPH (%) = 100–[(A amostra –A branco1 )/(A controlo –A branco2 )] x 100 A amostra – absorvência do ensaio realizado na presença do extracto A controlo – absorvência do ensaio realizado na ausência do extracto A branco1 – absorvência do ensaio realizado na ausência do DPPH A branco2 - absorvência do ensaio realizado na ausência do extracto e do DPPH O IC 50 (concentração necessária para reduzir 50% da absorvência do DPPH) foi calculado a partir do gráfico que representa a concentração versus o efeito captador do DPPH, por regressão linear (MS EXCell 2007, Microsoft Corporation, Redmond, EUA). 4.2.3 Análise estatística dos resultados Os ensaios foram efectuados em quadruplicadas (n=4) e os resultados expressos pela média ± desvio padrão. Os resultados foram comparados por análise da variância unifactorial, bilateral (α=0,05) (ANOVA) usando o software SPSS 17 (SPSS Inc, Chicago, EUA). No caso em que as diferenças forem significativas, efectuou-se o teste de comparação múltipla à posterior Tukey HSD. 4.3 Resultados e Discussão A avaliação da actividade antioxidante dos extractos da H. hemerocallidea já foi realizada por diferentes metodologias [Steenkamp et al., 2006; Nair et al., 2007a; Laporta Actividade antioxidante de extractos secos obtidos a partir de cormos de Hypoxis hemerocallidea provenientes de diferentes regiões de Moçambique 88 et al., 2007b; Katerere e Eloff, 2008]. Avaliou-se a actividade antioxidante de cormos da H. hemerocallidea proveniente de diferentes partes de Moçambique. Estudou-se ainda, a influência do tipo de extracto (solvente usado) e o método de secagem dos cormos na actividade antioxidante. O método usado para determinar a actividade antioxidante foi o do DPPH. A avaliação da actividade antioxidante dos extractos foi feita determinando o IC 50 (µg/ml). Este parâmetro (IC 50 ), como referimos anteriormente, indica a concentração do extracto capaz de reduzir a metade a absorvência da solução de DPPH. Quanto menor for este valor, maior será a actividade antioxidante do extracto avaliado. 4.3.1 Determinação da actividade antioxidante dos extractos obtidos com diferentes solventes A Tabela 40 apresenta as capacidades dos extractos secos dos cormos da H. hemerocallidea em captar espécies reactivas, medida pelo método de DPPH. Todos os extractos obtidos apresentam uma actividade apreciável, sendo significativamente inferior à do ácido ascórbico (controlo positivo) (p <0,001). Contudo, todos os extractos preparados exibiram actividade antioxidante superior à do extracto tradicional (p <0,01). Dos extractos preparados, o extracto S7 (acetónico) apresentou a maior actividade antioxidante (p <0,05). Tabela 40. Efeito dos diferentes solventes usados na preparação dos extractos de H. hemerocallidea na actividade captadora do radical livre DPPH Solvente extractivo Amostras IC 50 (µg/ml) Média ± DP (n=4). _ Ác. ascórbico 4,69 ± 0,18 Metanol S1 20,13 ± 2,98 Água/metanol (1:2) S2 27,10 ± 1,24 Água/etanol 96% (1:2) S3 28,74 ± 1,17 Etanol 96% S4 20,81 ± 1,66 Etanol absoluto S5 18,66 ± 1,40 Metanol S6 19,61 ± 0,71 Acetona S7 14,47 ± 0,71 Água* EBA tradicional 33,04 ± 1,27 *Cozimento, 100ºC. Actividade antioxidante de extractos secos obtidos a partir de cormos de Hypoxis hemerocallidea provenientes de diferentes regiões de Moçambique 89 A Figura 24 permite visualizar as diferenças entre os extractos obtidos com os diferentes solventes. Podemos distinguir quatro grupos. Dois deles são constituídos cada um por um extracto e com diferenças significativas em relação a todos os extractos, isto é, S7 (extracto acetónico) é o mais activo de todos (IC 50 = 14,47±0,71 µg/ml; p≤0,01) e EBA Tradicional (aquoso) é o menos activo (IC 50 = 33,04±1,27 µg/ml; p<0,01). Um outro grupo é constituído pelos extractos S2 (hidro-metanólico) e S3 (hidro-etanólico), ambos com actividade apenas superior ao EBA tradicional com valores de IC 50 de 27,10±1,24 e 28,74±1,17 µg/ml, respectivamente. Estes extractos não apresentam diferenças significativas entre si no que se refere ao valor de IC 50 (p> 0,05). Os restantes extractos, S4 (etanol a 96º), S5 (etanol absoluto), S1 (metanol) e S6 (metanol, pó mais ténue) com valores de IC 50 de 20,81±1,66, 18,66±1,40, 20,13±2,98 e 19,61±0,71 µg/ml, respectivamente, pertencem ao último grupo e não apresentam diferenças estatisticamente significativas entre eles (p>0,05). O facto de os extractos obtidos por etanol absoluto, etanol a 96% e metanol não apresentarem diferenças significativas no que se refere à actividade antioxidante, reforça a opção que tomámos em utilizar o etanol a 96% como solvente para a preparação dos extractos. 0,00 5,00 10,00 15,00 20,00 25,00 30,00 35,00 40,00 Figura 24. Valores de IC 50 do ácido ascórbico, dos extractos obtidos a partir dos cormos da H. hemerocallidea comprada na Macia e do extracto comercial. Os resultados obtidos confirmam a actividade antioxidante encontrada nos extractos da BA avaliada pelo método do radical DPPH referidos por Nair et al. (2007b) (extractos aquosos) e Katerere e Eloff (2008) (extractos acetónicos). Além disso, sugerem que os extractos aquosos são menos activos que os acetónicos ou alcoólicos. Actividade antioxidante de extractos secos obtidos a partir de cormos de Hypoxis hemerocallidea provenientes de diferentes regiões de Moçambique 90 4.3.2 Relação entre a concentração de hipoxósido e a actividade antioxidante dos extractos A Figura 25 representa a relação entre a concentração do hipoxósido no extracto e o valor de IC 50 (µg/ml) do mesmo. Os extractos foram obtidos com solventes diferentes, à excepção de um que apresenta uma granulometria mais reduzida (S6), apesar de utilizar o mesmo solvente que o outro extracto (S1). Nota-se neste gráfico que, à medida que aumenta a concentração do hipoxósido no extracto, o valor de IC 50 diminui. Uma vez que valores baixos de IC 50 são inversos à actividade antioxidante, podemos referir que com o aumento da concentração do hipoxósido nos extractos se verifica um aumento da actividade do mesmo. Esta relação é descrita pela equação (y=-0,9171x + 58,58) e com um valor de r = 0,942 (R 2 =0,8882). Quer a inclinação (p=1,49 x 10 -06 ) quer a ordenada na origem (p=0,000456) são estatisticamente significativas. Figura 25. Actividade antioxidante versus concentração do hipoxósido. Apesar de o hipoxósido não apresentar actividade antioxidante, pelo menos pelo método do radical DPPH [Nair et al., 2007a], a constatação de que o aumento da actividade antioxidante dos extractos se correlaciona com o aumento da concentração do hipoxósido no mesmo sugere que o extracto contém substâncias antioxidantes, provavelmente polifenóis/compostos fenólicos [Amusan et al., 2007; Nair et al., 2007a], que são extraídas em conjunto com o hipoxósido que, por ventura, apresentam polaridade similar. Esta hipótese é reforçada pelo facto de os resultados obtidos provirem Actividade antioxidante de extractos secos obtidos a partir de cormos de Hypoxis hemerocallidea provenientes de diferentes regiões de Moçambique 91 de extractos diferentes, ou seja, obtidos com solventes diferentes ou em condições diferentes. 4.3.3 Actividade antioxidante de extractos etanólicos de BA proveniente de diferentes regiões de Moçambique A Tabela 41 e a Figura 26 apresentam os valores do IC 50 dos extractos obtidos a partir dos cormos da H. hemerocallidea de diversas proveniências. Tabela 41. Valores de IC 50 do ácido ascórbico, dos extractos obtidos dos cormos da H. hemerocallidea proveniente de diferentes partes de Moçambique e do extracto comercial Origem Amostras IC 50 (µg/ml) (Média ± DP, n=4) _ Ác. Ascórbico 4,69 ± 0,18 Colhidas na Macia – Gaza (Amostra I) Ext. A7 18,64 ± 1,46 Ext. A8 18,52 ± 0,70 Ext. A23 18,79 ± 1,31 Ext. A25 22,75 ± 0,79 Compradas na Macia – Gaza (Amostra II) Ext. A4 22,22 ± 1,71 Ext. A5 26,19 ± 1,31 Ext. A43 20,16 ± 1,79 Ext. A39 (S4) 20,81 ± 1,66 Ext. A38 16,40 ± 0,88 Ext. A33 20,67 ± 1,68 Colhidas na NamaachaMaputo (Amostra III) Ext. A9 30,46 ± 1,12 Ext. A10 27,88 ± 1,38 Ext. A30 31,08 ± 2,59 Colhidas no IIAM – Maputo (Amostra IV) Ext. A45 48,92 ± 2,13 Ext. A24 40,24 ± 1,82 Colhidas em Lisboa – Portugal (Amostra V) Ext. A48 46,12 ± 2,36 Ext. A46 42,87 ± 2,29 Monteloeder (Alicante, Espanha) EBAcom 78,48 ± 8,27 *Todas as amostras foram secas por liofilização a excepção de A7, A4 e A9 que foram secas numa estufa de vazio. Actividade antioxidante de extractos secos obtidos a partir de cormos de Hypoxis hemerocallidea provenientes de diferentes regiões de Moçambique 92 O extracto comercial apresentou a menor actividade antioxidante (elevado IC 50 ) comparada com a dos extractos preparados neste trabalho (p<0,001). Isto pode ser explicado, em parte, pelo facto de o solvente usado para preparar o extracto comercial ser hidro-alcoólico (maior quantidade de água), não tendo capacidade de extrair todos os compostos fenólicos presentes [Amaral et al., 2009]. De um modo geral, organizando em ordem decrescente da actividade antioxidante (IC 50 ), os extractos obtidos a partir da amostra I e II são mais activos (16,40 a 26,19 µg/ml), seguido das amostras III (27,88 a 31,08) e finalmente das amostras IV e V (40,24 a 48,92 µg/ml). Na maioria dos casos, os extractos preparados a partir de amostras provenientes da mesma região não apresentam diferenças significativas no que se refere a actividade antioxidante. Contudo, a actividade antioxidante dos extractos obtidos a partir da amostra IV são estatisticamente diferentes, e os extractos Ext.A5 e A38, obtidos a partir da amostra II, são estatisticamente diferentes entre si (p<0,001), mas não apresentam diferenças estatísticas significativas (p>0,05) quando comparados com os demais extractos pertencentes a esta amostra. O facto de as amostras IV e V apresentarem baixa actividade antioxidante pode estar relacionada com o facto de ambas terem sido cultivadas em vasos. Em relação ao efeito do método de secagem dos cormos da H. hemerocallidea na actividade antioxidante dos extractos, os resultados não evidenciaram diferenças significativas (p> 0,05). Actividade antioxidante de extractos secos obtidos a partir de cormos de Hypoxis hemerocallidea provenientes de diferentes regiões de Moçambique 93 AI AI AI AI AII AII AII AII AII AII AIIIAIIIAIII AIV AIV AV AV 0,00 10,00 20,00 30,00 40,00 50,00 60,00 70,00 80,00 90,00 100,00 Ác. Ascórbico Ext. A7 Ext. A8 Ext. A23 Ext. A25 Ext. A4 Ext. A5 Ext. A43 Ext. A39 (S4) Ext. A38 Ext. A33 Ext. A9 Ext. A10 Ext. A30 Ext. A45 Ext. A24 Ext. A48 Ext. A46 EBAcom IC 50 (µg/ml) AI - Colhida na Macia AII - Comprada na Macia AIII - Colhida na Namaacha AIV - Colhida no IIAM AV - Colhida em Lisboa Figura 26. Valores de IC 50 do ascórbico, dos extractos obtidos dos cormos da H. hemerocallidea proveniente de diferentes partes de Moçambique e do extracto comercial. Os resultados da actividade antioxidante obtidos com os diferentes extractos preparados a partir de amostras provenientes de pontos distintos de Moçambique não apresentam nenhuma relação entre a actividade antioxidante e a concentração em hipoxósido, como foi referido quando avaliamos a influência do solvente na actividade antioxidante. Além disso, as amostras provenientes da região da Namaacha não apresentaram a maior actividade, apesar de apresentarem concentrações mais elevadas em hipoxósido. Esta constatação reforça ainda mais a hipótese da existência de outros compostos fenólicos na planta com capacidade antioxidante, para além do hipoxósido. Pode sugerir-se que o teor desses compostos é variável de planta para planta e independente da sua contribuição em hipoxósido. Contudo, como referimos anteriormente, a capacidade de extracção desses compostos pode ser aumentada com solventes que tem maior capacidade em extrair o hipoxósido. Actividade antioxidante de extractos secos obtidos a partir de cormos de Hypoxis hemerocallidea provenientes de diferentes regiões de Moçambique 94 4.4 Conclusão A actividade antioxidante de extractos obtidos a partir da BA foi anteriormente determinada utilizando-se várias metodologias [Steenkamp et al., 2006; Laporta et al., 2007b; Nair et al., 2007a; Katerere e Eloff, 2008], incluindo o método do radical DPPH. Contudo, a avaliação da actividade antioxidante, muitas das vezes, não foi feita de maneira sistemática, o que torna difícil estabelecer comparações entre os resultados descritos na literatura. Este trabalho permitiu determinar a actividade antioxidante dos extractos etanólicos (etanol a 96% V/V) preparados a partir de cormos de BA provenientes de diferentes partes de Moçambique. Além disso, foi possível avaliar a influência dos vários solventes usados na preparação de extractos na actividade antioxidante. Foi avaliada a influência do álcool absoluto, etanol a 96%, etanol-água (2:1), metanol-água (2:1), água, metanol e acetona na actividade antioxidante. Os resultados obtidos mostram em ordem decrescente a actividade antioxidante dos extractos obtidos pelos diversos solventes: acetona > álcool absoluto = metanol = etanol 96% > metanolágua (2:1) = etanol-água (2:1). Para a mesma amostra e solventes diferentes, notou-se que o aumento da actividade estava relacionado com o aumento da concentração em hipoxósido. Entretanto, isto não se verificou quando se utilizaram amostras diferentes e o etanol 96% como solvente. Assim, admite-se a existência, nas amostras de H. hemerocallidea, de outras substâncias fenólicas com actividade antioxidante, em quantidade variável e independente da do hipoxósido, que são conjuntamente extraídas. As amostras provenientes da região da Macia foram mais activas que as da Namaacha, que por sua vez foram mais activas que as do IIAM ou as cultivadas em Lisboa. O extracto comercial foi menos activo que todas as amostras avaliadas. Relativamente à influência do método de secagem, é de referir que tanto os extractos obtidos a partir de cormos secos por liofilização como por secagem em estufa de vazio apresentaram actividade antioxidante semelhante. Este estudo avalia pela primeira vez a influência do método de secagem dos cormos e a influência do solvente usado na preparação dos extractos na actividade antioxidante. Capítulo 5 Conclusões gerais e perspectivas Referências bibliográficas 102 Awad AB, Von Holtz RL, Cone JP, Fink CS, Chen YC. beta-sitosterol inhibits the growth of HT-29 human colon cancer cells by activating the sphingomyelin cycle (vol 18, pg 471, 1998). Anticancer Res. 1998 Jul-Aug;18(4A):U14-U. Bach GI. Activity of sitosterol in prostate adenoma and inflammatory rheumatism. Euromed. 1978;8. Bandeira SO, Gaspar F, Pagula FP. African Ethnobotany and Healthcare: Emphasis on Mozambique. Pharmaceut Biol. 2001;39(Supplement):70-3. Barreiros ALBS, David JM, David JP. Estresse oxidativo: Relação entre geração de espécies reactivas e defesa do organismo. Quim Nova. 2006;29(1):113-23. Betto P, Gabriele R, Galeffi C. Determination of the norlignan glucosides of Hypoxidaceae by high-performance liquid chromatography. 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