Resposta inflamatória do pulmão na ventilação espontânea monopulmonar. Estudo experimental no coelho.

Humberto)Machado,)2015))–)Resposta(inflamatória(do(pulmão(na(ventilação(espontânea(monopulmonar.(Estudo(experimental(no(coelho.) 1 Resposta inflamatória do pulmão na ventilação espontânea monopulmonar. Estudo experimental no coelho. Humberto José da Silva Machado Dissertação de Doutoramento em Ciências Médicas 2015 Humberto)Machado,)2015))–)Resposta(inflamatória(do(pulmão(na(ventilação(espontânea(monopulmonar.(Estudo(experimental(no(coelho.) 2 Humberto)Machado,)2015))–)Resposta(inflamatória(do(pulmão(na(ventilação(espontânea(monopulmonar.(Estudo(experimental(no(coelho.) 3 Resposta inflamatória do pulmão na ventilação espontânea monopulmonar. Estudo experimental no coelho. Humberto José da Silva Machado Dissertação de Doutoramento em Ciências Médicas 2015 Tese de Candidatura ao grau de Doutor em Ciências Médicas submetida ao Instituto de Ciências Biomédicas Abel Salazar da Universidade do Porto. Orientador – Prof. Doutor Álvaro Moreira da Silva Coorientador – Prof. Doutor Artur Águas Humberto)Machado,)2015))–)Resposta(inflamatória(do(pulmão(na(ventilação(espontânea(monopulmonar.(Estudo(experimental(no(coelho.) 4 Humberto)Machado,)2015))–)Resposta(inflamatória(do(pulmão(na(ventilação(espontânea(monopulmonar.(Estudo(experimental(no(coelho.) 5 De acordo com a Lei (artigo 34º do Decreto Lei nº 115/2013), apresento de seguida a lista de artigos originais que foram publicados (ou estão em processo de publicação), e cujos conteúdos fazem parte desta dissertação de doutoramento. Artigos publicados Machado HS, Sá P, Nunes CS, Couceiro A, da Silva ÁM, Águas A. Spontaneous one-lung ventilation increases the lung inflammatory response: an experimental pilot study. J Anesth Clin Res 2014. 5:428 Machado HS, Nunes CS, Sá P, Couceiro A, da Silva ÁM, Águas A. Increased lung inflammation with oxygen supplementation in tracheotomised spontaneous breathing rabbits: an experimental prospective randomized study. BMC Anesthesiology 2014.14:86 Artigo aceite para publicação em J Anesth Clin Res Machado HS, Nunes CS, Sá P, Couceiro A, Águas A, da Silva ÁM. Oxygen increases lung inflammatory response in spontaneous onelung ventilation in rabbits: a prospective randomized experimental study Humberto)Machado,)2015))–)Resposta(inflamatória(do(pulmão(na(ventilação(espontânea(monopulmonar.(Estudo(experimental(no(coelho.) 6 Humberto)Machado,)2015))–)Resposta(inflamatória(do(pulmão(na(ventilação(espontânea(monopulmonar.(Estudo(experimental(no(coelho.) 7 Agradecimentos Institucionais • Ao Prof. Doutor Álvaro Moreira da Silva, pelo seu apoio incondicional e amizade. • Ao Prof. Doutor Artur Águas, pelo seu incentivo, ensinamentos e amizade. • À Dr.ª Paula Sá, pela sua inestimável ajuda na edição das publicações, incentivo permanente e amizade. • À Prof. Doutora Catarina Nunes, pela sua ajuda na análise estatística de resultados, edição de artigos e confiança demonstrada. • Ao Dr. António Couceiro, pela sua ajuda insubstituível e experiência na avaliação dos resultados histológicos encontrados. • Ao Prof. Doutor António Sousa Pereira, pela sua palavra de incentivo, e amizade. • À Dr.ª Fernanda Nunes, pelo seu apoio enquanto Diretora do Serviço de Anestesiologia na apresentação inicial deste projeto, incentivo e amizade. • Ao Dr. Júlio Guimarães, pelo seu incentivo inicial, apoio constante e amizade. • Ao Prof. Doutor Lafuente Carvalho, pela sua ajuda na concretização de etapas fulcrais neste trabalho. • A todos o colaboradores do Departamento de Anatomia Normal do ICBAS, que possibilitaram a execução técnica dos trabalhos, Humberto)Machado,)2015))–)Resposta(inflamatória(do(pulmão(na(ventilação(espontânea(monopulmonar.(Estudo(experimental(no(coelho.) 8 designadamente: Prof. Doutora Paula Ferreira, Prof. Doutora Maria Rodrigues, Sr. Costa e Silva, Dr.ª Madalena Costa, D. Ana Pinto e D. Manuela Silva. • Aos Colegas da Equipa de Urgência, pela ajuda na compatibilização de horários que permitiram levar a cabo este trabalho, Dr.ª Teresa Branco, Dr. Carlos Mexedo, Dr.ª Cátia Mascarenhas, Dr.ª Lara Marcelo, Dr.ª Teresa Leal, Dr. Gil Rodrigues, Dr.ª Blandina Gomes, Dr.ª Marta Araújo. • Ao Prof. Doutor Marcus Schultz, pela oportuna e fulcral ajuda na edição das publicações. • Ao Dr. António Marques, pela sua amizade, apoio e ajuda com a escrita das publicações. • À D. Ana Paula Pereira, pela ajuda administrativa e apoio no decurso deste programa de estudos. • À Eduarda Lopes e à Sofia Carvalho, pela sua ajuda, amizade e confiança ao longo do percurso deste projeto, durante a direção do Serviço de Urgência do Centro Hospitalar do Porto. • À Olga Morais, pela sua inestimável e pronta colaboração nas tarefas do Serviço de Anestesiologia do Centro Hospitalar do Porto, que permitiu o tempo necessário à efetivação do trabalho em laboratório e edição dos vários textos e publicações. • Ao Centro Hospitalar do Porto pelo apoio logístico necessário para a execução do trabalho experimental e à Associação de Apoio ao Serviço de Anestesia do Hospital Geral de Santo António (AASAHGSA) pelo apoio na publicação dos artigos. Humberto)Machado,)2015))–)Resposta(inflamatória(do(pulmão(na(ventilação(espontânea(monopulmonar.(Estudo(experimental(no(coelho.) 9 Agradecimentos pessoais À família, Maria Luísa Sousa, Nuno Vicente Sousa Machado, Diogo José Sousa Machado e Leonilde Melo, pela compreensão e apoio ao longo de todo o projeto. Humberto)Machado,)2015))–)Resposta(inflamatória(do(pulmão(na(ventilação(espontânea(monopulmonar.(Estudo(experimental(no(coelho.) 16 order to allow validation of experimental results and clinical outcomes. Our spontaneous one-lung ventilation model was used on two of the three prospective randomized case series, which addressed the questions raised. At end of procedure rabbit lungs were harvested, and prepared for optical microscopy histological evaluation. Results The first serial results showed that one-lung ventilation submitted rabbits had higher inflammatory lung response (p<0,05) when compared to the two-lung ventilation group. In the second serial study, an odds ratio of 16 (CI 1,8-142,3) was found when a supplemented oxygen group was compared to a room air bipulmonar ventilation group, regarding lung inflammatory response of a moderate grade. The third serial of results presented a significant difference (p<0,001), between the two one-lung ventilation groups, with a higher frequency of moderate inflammation in the rabbits supplemented with oxygen when compared to the group breathing room air. Moreover, the lung inflammatory response found in the three series showed a higher number of eosinophils over neutrophils, in a proportion of approximately 75-80% to 20-25%. Humberto)Machado,)2015))–)Resposta(inflamatória(do(pulmão(na(ventilação(espontânea(monopulmonar.(Estudo(experimental(no(coelho.) 17 Discussion The fact that the one-lung ventilation includes a total lung atelectasis might explain why these animals had higher lung inflammatory responses, since local hypoxic environment clearly signals and enhances inflammation. The use of supplementary oxygen might induce formation of small areas of absorption atelectasis, which in turn might be accountable for the generation or augmentation of a lung inflammatory response. The addition of a known pro-inflammatory factor (lung collapse) with oxygen supplementation was found to be major reason for the appearance of lung inflammation, raising the possibility of a continuation of inflammatory process by both triggers. The preponderance of eosinophils in the lung inflammatory response, being unexpected, is confirmed by literature, since evidence exists that links these cells to hypoxic acidic environments, namely by the modification of cell function and properties Conclusions One-lung ventilation is a relevant factor for the initiation and maintenance of lung inflammatory response with a significant expression. Humberto)Machado,)2015))–)Resposta(inflamatória(do(pulmão(na(ventilação(espontânea(monopulmonar.(Estudo(experimental(no(coelho.) 18 Oxygen supplementation, in spontaneous ventilation, either bipulmonar or one-lung ventilation, enhances the intensity of lung inflammatory response. The clinical setting of anesthesia for lung surgery, namely when one-lung ventilation is used, should include strategies that avoid known lung inflammatory triggers, in order to decrease the incidence of postoperative pulmonary complications of an inflammatory kind, such as ALI or ARDS. Humberto)Machado,)2015))–)Resposta(inflamatória(do(pulmão(na(ventilação(espontânea(monopulmonar.(Estudo(experimental(no(coelho.) 19 Lista de Abreviaturas Abreviatura Extenso Abreviatura Extenso ALI Acute lung injury MDA Malondialdeído ARDS Acute respiratory distress syndrome MPM9 Metaloproteinase matricial CPP Complicações pulmonares pós-operatórias NOSG Grupo sem suplementação de oxigénio CPAP Continuous positive airway pressure OR Odds ratio CRF Capacidade residual funcional OSG Grupo com suplementação de oxigénio DLco Difusão do monóxido de carbono PCO2 Pressão parcial de dióxido carbono arterial FELASA Federation of european laboratory animal science associations PEEP Positive end expiratory pressure FC Frequência cardíaca PO2 Pressão parcial de oxigénio arterial FEV1 Volume expiratório forçado no primeiro segundo R Coeficiente de correlação FEV1pp Volume expiratório forçado no primeiro segundo previsto pós-operatória ROS Reactive oxygen species FiO2 Fração inspirada de oxigénio SpO2 Saturação arterial de Oxigénio FR Frequência respiratória TLC Capacidade pulmonar total FVC Capacidade vital forçada TNFα Fator de necrose tumoral HCO3 Nível arterial de bicarbonato VBP Ventilação bipulmonar HIF1 Fator indutor de hipóxia VILI Ventilator induced lung injury IL 6 Interleuquina 6 VMP Ventilação monopulmonar IL 8 Interleuquina 8 VPP Ventilação por pressão positiva LPA Lesão pulmonar aguda VR Volume residual Humberto)Machado,)2015))–)Resposta(inflamatória(do(pulmão(na(ventilação(espontânea(monopulmonar.(Estudo(experimental(no(coelho.) 20 Humberto)Machado,)2015))–)Resposta(inflamatória(do(pulmão(na(ventilação(espontânea(monopulmonar.(Estudo(experimental(no(coelho.) 21 Índice de figuras e tabelas Figura Descrição Página 1 Peça T – Maplesson F 60 2 Face ventral diafragma coelho 61 3 Grau de inflamação pulmonar – série 1 82 4 Lâminas série 1 – inflamação ligeira e moderada 84 5 Resultados hemogramas – série 2 92 6 Grau de inflamação pulmonar – série 2 93 7 Lâminas série 2– inflamação ligeira e moderada 94 8 Parâmetros fisiológicos monitorizados 95 9 Resultados de gases de sangue – série 2 99 10 Resultados de gases de sangue – série 3 113 11 Lâminas série 3– inflamação ligeira e moderada 117 Tabela Descrição Página 1 Critérios de intensidade de inflamação pulmonar 67 2 Valores de parâmetros monitorizados – série 1 80 3 Mediana de parâmetros monitorizados – série 1 81 4 Resultados de gases de sangue – série 2 98 5 Evolução dos parâmetros fisiológicos – Série 3 109 6 Mediana dos parâmetros fisiológicos –Série 3 110 7 Resultados de gases de sangue – série 3 112 8 Grau de inflamação – série 3 115 9 Resultados globais – Séries 1, 2 e 3 139 Humberto)Machado,)2015))–)Resposta(inflamatória(do(pulmão(na(ventilação(espontânea(monopulmonar.(Estudo(experimental(no(coelho.) 22 Humberto)Machado,)2015))–)Resposta(inflamatória(do(pulmão(na(ventilação(espontânea(monopulmonar.(Estudo(experimental(no(coelho.) 23 Índice Título Página 1 Introdução 25 1.1 A cirurgia e a anestesiologia 25 1.2 A lesão pulmonar aguda (acute lung injury) 27 1.3 A lesão pulmonar associada à ventilação mecânica 32 1.4 Ventilação monopulmonar e inflamação 34 1.5 A atelectasia na ventilação monopulmonar 39 1.6 Complicações pulmonares pós-operatórias 42 1.7 Estratégias protetoras de ventilação controlada 45 1.8 A inflamação associada às variações de aporte de oxigénio 47 2 A investigação – o que se pretende responder 49 2.1 Da prática clínica à investigação 49 2.2 As perguntas formuladas 53 3 Materiais e métodos 54 3.1 Os animais 57 3.2 Instrumentação 58 3.3 Monitorização 63 3.4 Histologia 65 3.5 Análise estatística 67 3.6 Metodologia de divisão das séries de estudo 69 3.6.1 Série 1 – pergunta 1 70 3.6.2 Série 2 – pergunta 2 72 Humberto)Machado,)2015))–)Resposta(inflamatória(do(pulmão(na(ventilação(espontânea(monopulmonar.(Estudo(experimental(no(coelho.) 24 3.6.3 Série 3 – pergunta 3 74 4 Resultados 76 4.1 Séries de estudo 76 4.2 Resultados obtidos 77 4.2.1 Série 1 77 4.2.2 Publicação de resultados da série 1 84 4.2.3 Série 2 90 4.2.4 Publicação de resultados da série 2 99 4.2.5 Série 3 107 4.2.6 Manuscrito aceite para publicação com resultados da série 3 117 4.2.7 Resultados globais 138 5 Discussão 139 5.1 Série 1 139 5.2 Série 2 144 5.3 Série 3 148 5.4 Discussão geral 154 5.4.1 Breve revisão da anestesia para cirurgia pulmonar 154 5.4.2 Os resultados desta investigação e a anestesia para cirurgia pulmonar 165 5.4.3 Limitações dos trabalhos de investigação desta dissertação 167 6 Conclusões 169 7 Considerações finais 171 8 Bibliografia 174 Humberto)Machado,)2015))–)Resposta(inflamatória(do(pulmão(na(ventilação(espontânea(monopulmonar.(Estudo(experimental(no(coelho.) 25 1 Introdução 1.1 A cirurgia e a anestesiologia A ciência médica tem-se pautado pela crescente complexidade de atos terapêuticos que, na sua vertente cirúrgica, inclui procedimentos de risco e/ou complexidade cada vez mais elevados, em doentes com um número também crescente de co-morbilidades. A cirurgia torácica, e a pulmonar em particular, não constituem exceção; o progresso das suas técnicas cirúrgicas tem permitido avançar com sucesso no tratamento de doentes com situações clínicas cada vez mais complexas. A anestesiologia tem contribuído de sobremaneira para que novos métodos cirúrgicos mais invasivos sejam possíveis. Um dos desafios da anestesia na cirurgia pulmonar é o tipo de ventilação dos doentes durante o ato cirúrgico. A necessidade de disponibilizar à equipa cirúrgica um campo operatório com espaço que permita a sua ação, torna imprescindível a ventilação monopulmonar (VMP), em que é inerente a exclusão de um dos pulmões da atividade respiratória do doente [1]. A VMP é um desafio, tanto pelos seus riscos imediatos como pelas eventuais consequências para o doente as quais poderão ocorrer tardiamente. É de lembrar que a ventilação artificial, mesmo que de ambos os pulmões, é sempre fisiologicamente estranha ao corpo humano. A fisiologia respiratória humana não está preparada para suportar uma Humberto)Machado,)2015))–)Resposta(inflamatória(do(pulmão(na(ventilação(espontânea(monopulmonar.(Estudo(experimental(no(coelho.) 32 1.3 Lesão pulmonar associada à ventilação mecânica A lesão pulmonar associada ao ventilador (ventilator associated lung injury - VALI) é definida como uma lesão semelhante ao ARDS e que pode ocorrer em doentes sujeitos a ventilação mecânica. Em modelos animais, a lesão pulmonar induzida pelo ventilador foi bem documentada e é definida como uma lesão pulmonar diretamente causada pela ventilação mecânica (ventilator induced lung injury – VILI) [15]. Existem vários tipos de reações pró-inflamatórias e prófibrogenéticas que podem estar envolvidas na VILI. Por exemplo, a ventilação mecânica cursando com altas pressões pode causar ativação de respostas celulares mediadas por neutrófilos, que contribuem para um estado inflamatório pulmonar que estará na génese da VILI [16] [17]. A VILI causada pela ventilação com pressão positiva pode ser acentuada pela hiperóxia e pelo uso de grandes volumes correntes que, numa primeira instância, causam edema pulmonar de etiologia não cardiogénica (ARDS), com infiltração leucocitária e aumento da permeabilidade vascular. Contudo, se apenas a pressão aumentar mas o volume alveolar for mantido em valores fisiologicamente aceitáveis, poderá ser evitado o aparecimento de edema pulmonar, o que faz pensar numa etiologia mais ligada ao volutrauma do que ao barotrauma [18] [19]. Pulmões saudáveis antes da ventilação assistida podem ser acometidos de uma VILI, sendo que estão definidas Humberto)Machado,)2015))–)Resposta(inflamatória(do(pulmão(na(ventilação(espontânea(monopulmonar.(Estudo(experimental(no(coelho.) 33 estratégias protetoras na redução de VILI, tanto para doentes com ARDS [20] [21], como para indivíduos saudáveis [22]. O edema pulmonar observado na VILI aparece sempre que um volume expiratório final é elevado, seja por volume corrente alto ou por excesso de PEEP. A resposta celular ao estiramento mecânico do pulmão tem sido estudada, tanto do lado do epitélio como do lado do endotélio, sendo a presença de edema não hidrostático uma constante. É de referir que a ventilação com pressão negativa em animais, usando o iron-lung, não demonstrou ser percursora de edema pulmonar, ficando a noção de volutrauma mais próxima da realidade, uma vez que estudos em várias espécies de mamíferos (ex: rato e coelho) mostraram que os baixos volumes não induzem lesão pulmonar e, por outro lado, a lesão pulmonar pode surgir em situações de baixa pressão das vias aéreas [19] [23]. É relevante mencionar que abdicar de PEEP poderá não ser indicada na prevenção da VILI, uma vez que o seu uso previne a ocorrência de um potencial desequilíbrio na distribuição da ventilação pelo pulmão que, por si só, poderá estar ligada ao excesso de volume (ventilação) de algumas zonas do pulmão (volutrauma) [24], criando assim a possibilidade da ocorrência de VILI regional [19]. A continua distensão mecânica do epitélio alveolar contribui para uma resposta inflamatória sistémica, para a redução da sobrevida das células alveolares tipo II e para o desequilíbrio entre mediadores pro e anti-inflamatórios [25]. Humberto)Machado,)2015))–)Resposta(inflamatória(do(pulmão(na(ventilação(espontânea(monopulmonar.(Estudo(experimental(no(coelho.) 34 1.4 Ventilação monopulmonar (VMP) e inflamação Apesar de amplamente descritas as consequências fisiológicas da VMP, como por exemplo o shunt que se forma, ou a vasoconstrição pulmonar hipóxica que surge, praticamente não existem relatos explícitos de eventuais alterações histológicas causadas pela VMP [26]. Existe referência a lesão vascular com a re-insuflação após exclusão de um dos pulmões, com a respetiva congestão, assim como o aumento de peso do pulmão após ventilação com volumes correntes elevados, indicando edema pulmonar [27]. Sendo a hipóxia um dos problemas clínicos mais frequentes durante a VMP, pelas consequências clínicas e como fator iniciador de inflamação aguda [28], é relevante que a fracção inspirada de oxigénio a utilizar seja a menor possível (mas que garanta uma oxigenação efetiva), uma vez que só dessa forma se poderá minimizar o potencial de lesão oxidativa. Sabe-se que os ROS que se formam durante a VMP têm a capacidade de prolongar a resposta inflamatória pulmonar [29]. A hipóxia como fator pró-inflamatório que pode aparecer na sequência da VMP traduz-se pelas características que definem inflamação aguda, ou seja, um processo de resposta rápida por parte de um órgão ou organismo que coloca leucócitos e proteínas no local da lesão [28]. A intensidade da resposta inflamatória após VMP pode estar relacionada com o tempo de exclusão pulmonar, com o grau de resseção pulmonar e também com a extensão da manipulação Humberto)Machado,)2015))–)Resposta(inflamatória(do(pulmão(na(ventilação(espontânea(monopulmonar.(Estudo(experimental(no(coelho.) 35 mecânica do órgão durante o ato cirúrgico; ou seja, quanto maior for o tempo de VMP e o grau de resseção pulmonar, maior será a resposta inflamatória e a lesão oxidativa do pulmão [30]. Um excessivo volume corrente e o “stress” mecânico podem criar uma primeira lesão (primary-hit), ou uma lesão secundaria (secondaryhit) num doente suscetível, levando à recomendação de estratégias protetoras de ventilação, que possam reduzir a inflamação e a ALI, as quais também são válidas para a VMP [29]. O índice de hiperpressão (produto da pressão plateau inspiratória e do tempo de VMP) [11] também ilustra a potencial participação do tempo de VMP no aparecimento de ALI. Apesar de anteriormente se ter referido a possibilidade do volume ser provavelmente mais influente para o aparecimento de ALI, a pressão em VMP não pode ser descartada como etiologicamente irrelevante [29]. Em cirurgia pulmonar, com a necessidade de uso de VMP, devem ser usadas estratégias protetoras do pulmão [27]. O uso de PEEP pode ser controverso dada a pressão gerada por esta manobra, designadamente no único pulmão que se mantém ventilado. Assim, o uso protetor de volumes correntes baixos deve incluir também PEEP, porque há que evitar o colapso alveolar , sendo que a auto-PEEP não é fidedigna do arejamento pulmonar [31], devendo a noção de best-PEEP (entre 5 e 10 cm H20) ser, a este propósito, levada em consideração [32]. Humberto)Machado,)2015))–)Resposta(inflamatória(do(pulmão(na(ventilação(espontânea(monopulmonar.(Estudo(experimental(no(coelho.) 36 Sendo a LPA ou ALI expressões inflamatórias pós-operatórias do que se passa no intraoperatório [33][34], fica claro que estas estratégias protetoras intraoperatórias serão uma forma de minimizar estas consequências indesejáveis. Durante a VMP, que pressupõe a criação de uma atelectasia total do pulmão a ser intervencionado, deve evitar-se que o mesmo fenómeno ocorra no pulmão que se mantém ventilado. No fundo, trata-se de minimizar o risco do que sabemos que poderá vir a acontecer. Existem recomendações para que se seja mais amplo em termos de quantidade de volume corrente para manter o arejamento pulmonar [33]. Vários autores defendem que volumes correntes de 10 ml/kg serão necessários para minimizar a ocorrência de shunt e manter a ventilação alveolar, assumindo também que tal prática tem claras consequências inflamatórias, evidenciadas pelo aumento de marcadores, como TNFα, IL-8 e elastase de polimorfonucleares, tanto do pulmão ventilado como do pulmão excluído ou atelectasiado [33][35]. A VMP pode alterar a histologia do pulmão, particularmente porque existe insuflação após a atelectasia. A lesão vascular depois da VMP tem uma importância especialmente relevante, uma vez que, durante a VMP existe resposta fisiológica de vasoconstrição pulmonar hipóxica (para diminuir shunt decorrente da VMP), acompanhada por Humberto)Machado,)2015))–)Resposta(inflamatória(do(pulmão(na(ventilação(espontânea(monopulmonar.(Estudo(experimental(no(coelho.) 37 lesão endotelial, congestão vascular e diminuição da produção de óxido nítrico [26]. A resposta inflamatória após VMP diminuí quando são usados anti-inflamatórios potentes, como por exemplo a metilprednisolona, antes da exclusão pulmonar. Este fármaco não só reduz a resposta inflamatória, como também parece melhorar a função pulmonar em geral [36][37]. O doseamento de mediadores inflamatórios pode ser útil para avaliar o grau de lesão que estará em curso. É de notar que, existindo uma subida nos mediadores inflamatórios, pode ocorrer que os seus contrários (mediadores anti-inflamatórios) também surjam elevados [38], sabendo-se inclusivé que alguns destes mediadores têm valor de prognóstico [39]. É de referir que em ambiente peri-operatório, existe evidência de algum efeito protetor/modulador de alguns anestésicos gerais em VMP, como por exemplo, o sevoflurano [40][41]. O papel do oxigénio na VMP deve ser entendido globalmente. Na atelectasia de um pulmão na VMP, induz-se o aparecimento de hipóxia local e de um ambiente acídico, decorrente do aparecimento do já referido shunt (áreas de perfusão sem ventilação). A hipóxia e a inflamação caminham lado a lado e partilham uma relação interdependente, uma vez que a hipóxia pode gerar inflamação e vice-versa [42]. Humberto)Machado,)2015))–)Resposta(inflamatória(do(pulmão(na(ventilação(espontânea(monopulmonar.(Estudo(experimental(no(coelho.) 38 A utilização de oxigénio supranormal em VMP também tem sido associada a lesão do tecido pulmonar [43], tanto no pulmão ventilado como no pulmão excluído, lesão esta que aumenta com o tempo de exposição ao oxigénio [44]. O denominado stress oxidativo está na génese da lesão celular encontrada [7]. Existe uma relação clara entre hiperóxia e migração de polimorfonucleares para os alvéolos [18], sendo que ao potencial volutrauma associado a este facto (e no final da cirurgia pulmonar, a lesão de reperfusão) se adicionarão também os seus efeitos deletérios. Vários estudos têm constatado que existe atingimento inflamatório pulmonar bilateral quando é utilizada VMP. Contudo, em termos de lateralidade, parece haver uma preponderância de inflamação no lado excluído ou colapsado (atelectasiado) quando comparado com o pulmão ventilado [44]. Humberto)Machado,)2015))–)Resposta(inflamatória(do(pulmão(na(ventilação(espontânea(monopulmonar.(Estudo(experimental(no(coelho.) 39 1.5 Atelectasia na ventilação monopulmonar As atelectasias por compressão ocorrem quando diminui a pressão transmural que mantém o alvéolo aberto [45]. As atelectasias de absorção surgem quando são menos os gases que chegam aos alvéolos do que aqueles que são removidos pela corrente sanguínea alveolar, ou quando um determinado gás é particularmente solúvel no sangue (oxigénio). A perda de surfactante também condiciona a formação de atelectasias porque induz um aumento da tensão superficial do alvéolo [45]. São fatores que influenciam a formação de atelectasias a utilização de altas fracções de oxigénio inspirado e a existência de uma menor capacidade residual funcional (CRF) (soma entre volume de reserva expiratório e volume residual), como sucede, por exemplo, nos doentes com obesidade mórbida [45]. Quase todos os anestésicos (exceto a quetamina) diminuem o tónus muscular e, portanto, o tónus estático do pulmão a que se soma, em termos volumétricos, a diminuição da CRF em cerca de 100 ml só com o decúbito dorsal e em cerca de 400 a 500 ml com a anestesia geral [46]. Nesta gama de volumes pulmonares, as pequenas vias aéreas fecham durante a expiração com a subsequente ocorrência de shunt (baixo quociente ventilação/perfusão - V/Q). Se antes da administração de anestésicos se proceder a uma administração oxigénio a 100% (denominada pré-oxigenação) irão formar-se zonas de atelectasia, uma vez que o oxigénio, sendo muito Humberto)Machado,)2015))–)Resposta(inflamatória(do(pulmão(na(ventilação(espontânea(monopulmonar.(Estudo(experimental(no(coelho.) 40 solúvel no sangue, irá ser absorvido pela corrente sanguínea, ou seja, após esta absorção o sustentáculo gasoso dos alvéolos desapareceria, formando-se então a atelectasia. Quando são utilizadas frações inspiradas de oxigénio inferiores a 100%, existe uma componente de azoto na mistura de gases com origem no ar ambiente que, não sendo absorvido pela corrente sanguínea, mantém os alvéolos “abertos”, sendo o chamado CPAP natural, evitando deste modo o colapso alveolar e a formação de atelectasias [46]. É manifestamente importante tomar medidas para prevenir a formação de atelectasias, que podem prevalecer no pós-operatório imediato, designadamente através de utilização de fracções inspiradas de oxigénio inferiores a 100% (recomendavelmente entre 75-80%), que assegurem alguma reserva para eventual situação de dificuldade de intubação e potencial hipoxémia que possa vir a surgir [47]. As estratégias de prevenção de atelectasias devem considerar que, grandes volumes correntes, níveis excessivos de PEEP e pressões altas de ventilação se associam a uma maior percentagem de complicações pulmonares pós-operatórias (CPP), inflamação pulmonar e VILI, sendo que um dos mecanismos pelo qual as atelectasias induzem lesão pulmonar será decorrente da hipóxia local e subsequente inflamação nessas áreas [48]. As atelectasias podem exercer um efeito cumulativo nas CPP, sendo que estas e a instabilidade alveolar predispõem claramente para a ALI seguindo os seguintes mecanismos: o recrutamento alveolar, a Humberto)Machado,)2015))–)Resposta(inflamatória(do(pulmão(na(ventilação(espontânea(monopulmonar.(Estudo(experimental(no(coelho.) 41 abertura e fecho cíclicos dos alvéolos (no limite entre o colapso e o arejamento alveolar) e o stress repetitivo de cisalhamento que destrói as estruturas celulares, associados à sobredistenção de unidades pulmonares não atelectasiadas [48]. Humberto)Machado,)2015))–)Resposta(inflamatória(do(pulmão(na(ventilação(espontânea(monopulmonar.(Estudo(experimental(no(coelho.) 48 este saia dos alvéolos. Com a absorção do oxigénio, existe um colapso alveolar e são criadas regiões de shunt, ou seja, zonas de perfusão sem ventilação. O uso de oxigénio externo podendo causar a formação de atelectasias de absorção e subsequentemente áreas de shunt, conduz ao aparecimento inflamação local. A ventilação monopulmonar, adicionada à utilização de oxigénio supra fisiológico, poderá assim favorecer inflamação que poderá evoluir para uma lesão pulmonar aguda (LPA ou ALI), ou para algo mais grave, como o ARDS. Assim, na sequência da VMP, a ventilação ideal será a ventilação espontânea, já que a ventilação controlada que é potencialmente deletéria e pró-inflamatória, e idealmente sem o recurso a suplementos de oxigénio e também com o mínimo de manipulação cirúrgica do pulmão a ser operado. Humberto)Machado,)2015))–)Resposta(inflamatória(do(pulmão(na(ventilação(espontânea(monopulmonar.(Estudo(experimental(no(coelho.) 49 2 A investigação – o que se pretende responder 2.1 Da prática clínica à investigação Existe na área da anestesia para cirurgia torácica em geral e para cirurgia pulmonar em particular, um fator de incerteza apreciável. A imprevisibilidade de ocorrência de CPP após cirurgia torácica, afigurou-se-me como a questão importante que justifica a procura das suas causas. A experiência pessoal do autor têm-lhe revelado que, existindo uma metodologia anestésica e cirúrgica sistematicamente semelhante, praticada pelos mesmo profissionais, em doentes que se apresentam essencialmente como idênticos em termos de idade, comorbilidades e cirurgia realizada, merece ser investigada a razão da ocorrência de situações de insuficiência respiratória pós-operatória em alguns destes doentes sujeitos a cirurgia torácica. No inicio do presente estudo resolvemos investigar quais as consequências da ventilação monopulmonar usada durante a cirurgia torácica, tendo em conta a sua contribuição para complicações pósoperatórias, a que se junta a contribuição da ventilação mecânica, da formação de atelectasias e da oxigenoterapia supra fisiológica. A prática clínica do autor desta dissertação inclui a anestesia para cirurgia torácica, lidando com doentes com variadas morbilidades, sendo necessário responder aos desafios dos pós-operatórios inerentes aos diversos tipos de cirurgia. Humberto)Machado,)2015))–)Resposta(inflamatória(do(pulmão(na(ventilação(espontânea(monopulmonar.(Estudo(experimental(no(coelho.) 50 A constante preocupação em otimizar a situação clínica dos doentes no pré-operatório, no sentido de minimizar a possibilidade de ocorrência de eventos indesejados, junta-se o desafio levantado por abordagens cirúrgicas cada vez mais complexas e exigentes. É sempre pertinente lembrar a grande prevalência de patologia associada da área cardiovascular e respiratória na população cirúrgica sujeita a cirurgia torácica. É mandatório que os doentes propostos para resseção de tecido pulmonar tenham um estudo pré-operatório que inclua a quantificação da função mecânica pulmonar, função parenquimatosa e reserva cardiopulmonar [1]. Um dos maiores desafios, neste tipo de doentes e neste tipo de cirurgia, é a autonomização do doente em termos de ventilação após a cirurgia, ou seja, todas as intervenções médicas que contribuam para uma maior reserva respiratória e bem-estar, por exemplo analgesia adequada, contribuem para esta autonomização e, portanto, para uma extubação precoce e retorno à ventilação espontânea, logo no final da cirurgia. A ocorrência de CPP tem diminuído significativamente fruto da evolução técnica e da melhor preparação dos doentes. No entanto, a cirurgia torácica por si só, e a ventilação monopulmonar inerente, são um fator de risco conhecido para a ocorrência de CPP. Mesmo com a utilização dos recursos técnicos à disposição, será sempre possível ser surpreendido por um desfecho não desejado no pós-operatório de um doente submetido este tipo de cirurgia, Humberto)Machado,)2015))–)Resposta(inflamatória(do(pulmão(na(ventilação(espontânea(monopulmonar.(Estudo(experimental(no(coelho.) 51 especialmente se a magnitude da manipulação pulmonar for apreciável, o tempo de intervenção for longo, as quantidades de oxigénio usadas forem muito altas, a técnica de ventilação não for suficientemente protetora do pulmão que fica a ventilar durante a cirurgia, e a fluidoterapia empregue não for aquela que se pensa ser a necessária. Alguns dos doentes sujeitos a cirurgia torácica podem vir a apresentar uma insuficiência respiratória, em que a relação entre a pressão parcial de oxigénio arterial (PaO2) e a fracção inspirada de oxigénio (FiO2) está diminuída [7]. Esta fraca oxigenação traduz a definição de um processo inflamatório, inicialmente denominado ALI ou LPA que, em certos doentes, evolui favoravelmente e noutros se agrava para a situação mais grave de todas, o ARDS. A evolução dos conhecimentos veio a considerar que este espectro de patologia era mais uma evolução de uma doença única, tendo passado a ser denominado, desde a última conferência de consenso como ARDS ligeiro, moderado ou grave, conforme a gravidade da diminuição da relação PaO2/FiO2 [63] [64]. As estratégias cirúrgicas, nomeadamente o tipo de cirurgia proposta, a metodologia cirúrgica (toracotomia ou toracoscopia), ou seja, a forma como será manipulado o pulmão no intraoperatório e o tempo que acarretará de exclusão pulmonar, certamente terão consequências no resultado final da função respiratória do doente. Humberto)Machado,)2015))–)Resposta(inflamatória(do(pulmão(na(ventilação(espontânea(monopulmonar.(Estudo(experimental(no(coelho.) 52 Há que inventariar as implicações anestésicas na equação geral da intervenção cirúrgica ao tórax. O tipo de ventilação usada, que sabemos ter um importância clara nas consequências inflamatórias pulmonares que dela decorrem, a quantidade de oxigénio utilizada e as metodologias empregues no tratamento dos episódios de hipóxia sistémica intraoperatória, ou mesmo a complexidade com que a ventilação monopulmonar foi levada a efeito, poderão individualmente ou em conjunto ter influência no pulmão do doente que entregamos no recobro. Esta preocupação advém do facto de se saber que a inflamação pulmonar, que possa advir de uma intervenção cirúrgica, pode ser o fator que despoleta de uma lesão pulmonar aguda (LPA ou ALI) que, por sua vez, em certas condições, poderá evoluir desfavoravelmente para uma situação de elevada mortalidade como o ARDS. Tendo em consideração o anteriormente mencionado, adoptou-se um modelo animal que permitisse obter respostas às perguntas formuladas, com vista ao esclarecimento do papel da ventilação monopulmonar e do oxigénio nas lesões pós-operatórias do pulmão. Humberto)Machado,)2015))–)Resposta(inflamatória(do(pulmão(na(ventilação(espontânea(monopulmonar.(Estudo(experimental(no(coelho.) 53 2.2 As perguntas formuladas 1. A circunstância de se ventilar apenas um pulmão, excluindo o outro pulmão da ventilação fisiológica bilateral, através da formação de uma atelectasia total, será em si um fator de resposta inflamatória pulmonar? 2. O oxigénio pode despoletar inflamação pulmonar em animais sujeitos a ventilação espontânea? 3. Se a VMP, em modelo de ventilação espontânea, for confirmada como um fator que despoleta inflamação pulmonar, esta poderá ser agravada pela utilização de oxigénio? Respostas a estas questões foram procuradas utilizando um modelo experimental no coelho que foi escolhido para o efeito. Humberto)Machado,)2015))–)Resposta(inflamatória(do(pulmão(na(ventilação(espontânea(monopulmonar.(Estudo(experimental(no(coelho.) 54 3 Materiais e Métodos Não se pretende dizer que não seria possível estudar inflamação pulmonar em humanos, mas, metodologicamente, clinicamente e eticamente não seria possível manter as mesmas características das investigações aqui relatadas, num modelo humano. Não se trata apenas do facto de se realizar a colheita total dos pulmões no final do procedimento, mas também a circunstância de se ter criado um modelo de VMP em ventilação espontânea o que, como é sabido, é clinicamente muito complexo no homem, com eventuais consequências clínicas incomportáveis para um projeto de investigação. Assim, e tendo-se optado pelo modelo animal, foi necessário escolher o animal mais adequado. Foram aqui ponderadas questões anatómicas, metodológicas e logísticas. A escolha da espécie teria de prever a possibilidade de isolar um pulmão, podendo este ser deixado a ventilar, e excluir o outro deste processo ventilatório, pelo que, teria de ser uma espécie que inequivocamente possuísse separação pleural mediastínica (algo que está ausente em algumas espécies de mamíferos). Por outro lado, foi primariamente decidido que não se utilizaria ventilação controlada, pela inerente contribuição para o processo inflamatório pulmonar em si. O animal a ser escolhido teria também que ser logisticamente viável, não só em termos de fornecimento por parte de um criador credenciado, como também o seu transporte até Humberto)Machado,)2015))–)Resposta(inflamatória(do(pulmão(na(ventilação(espontânea(monopulmonar.(Estudo(experimental(no(coelho.) 55 ao laboratório teria de ser exequível, as condições de habitabilidade em biotério compagináveis com as instalações disponíveis, e a sua possibilidade de manutenção e conforto teriam de ser praticáveis. Tendo em conta as características atrás mencionadas, optou-se pelo coelho New Zelland (Oryctolagus cuniculus). Trata-se de uma espécie com produtores credenciados conhecidos, com possibilidade de transporte seguro e exequível até ao laboratório e que poderia ser acolhida com conforto e reprodutibilidade nas instalações disponíveis. Escolhida a espécie, e fruto da formação encetada pelo signatário da presente dissertação na área de ciência de animais de laboratório (FELASA – nível C), associada aos conhecimentos dos colaboradores do laboratório onde se desenvolveu o estudo, foi possível garantir as condições essenciais ao bem-estar animal durante a sua estadia no Departamento de Anatomia Normal do ICBAS. No âmbito geral do modelo construído, foram sistematicamente evitados os fatores de eventual variabilidade individual dos animais, como sejam: as influências externas que podem incluir o tipo de instrumentação executada, as diferenças de relacionamento com a monitorização e de resposta aos fármacos e a eventual variabilidade da diferente resposta ao stress cirúrgico. A metodologia utilizada, para assegurar reprodutibilidade experimental, incluiu a sistemática utilização do mesmo tipo de material, a execução técnica dos vários passos da experiência sempre Humberto)Machado,)2015))–)Resposta(inflamatória(do(pulmão(na(ventilação(espontânea(monopulmonar.(Estudo(experimental(no(coelho.) 56 pelos mesmos profissionais e o cumprimento metódico das várias rotinas experimentais. Humberto)Machado,)2015))–)Resposta(inflamatória(do(pulmão(na(ventilação(espontânea(monopulmonar.(Estudo(experimental(no(coelho.) 57 3.1 Animais A logística organizada para fazer face às questões de alojamento do animais, incluiu a sua recepção (coelhos New Zelland - Oryctolagus cuniculus), o seu acondicionamento nas respetivas gaiolas (individuais) e a instituição de alimentação e hidratação sem restrições, assim como condições de conforto (incluindo objetos adequados a atividades que proporcionassem ao animal o necessário relaxamento e um ambiente calmo, como por exemplo caixas ou rolos de cartão). Em todos os animais foi garantida uma semana de quarentena, nas condições atrás mencionadas, ao que se adicionou a visita diária, pelo menos duas vezes por dia, dos colaboradores e/ou investigadores, a administração de antibioterapia profilática standard (enrofloxacina, Alsir® 2.5%; 20 mg/kg) [65] e a vigilância sistemática de sinais de bem-estar, como por exemplo a ausência de automutilação, ausência de emagrecimento e consumo normal de água e alimento. As condições mencionadas e o estudo realizado, cumpriram as diretrizes europeias relativamente ao bem-estar animal, nº 63/2010/EU, tendo tido aprovação pelo Comité de Ética do ICBAS/UP. Humberto)Machado,)2015))–)Resposta(inflamatória(do(pulmão(na(ventilação(espontânea(monopulmonar.(Estudo(experimental(no(coelho.) 64 2700 Bronshoj, Denmark) para avaliação de vários parâmetros, como por exemplo a PO2 e PCO2. Da mesma amostra de sangue procedeu-se à realização de dois hemogramas, no início e no final do procedimento, para avaliação da concentração de elementos figurados no sangue periférico, nomeadamente polimorfonucleares neutrófilos e eosinófilos. Humberto)Machado,)2015))–)Resposta(inflamatória(do(pulmão(na(ventilação(espontânea(monopulmonar.(Estudo(experimental(no(coelho.) 65 3.4 Histologia O objetivo do trabalho centrou-se na ocorrência de inflamação pulmonar após ventilação monopulmonar com ou sem suplementação com oxigénio externo. Neste âmbito, foi decidido efetuar preparações para microscopia ótica com coloração de hematoxilina-eosina. Assim, foram assumidos os seguintes critérios de avaliação dos cortes histológicos: a) ausência de inflamação, b) inflamação ligeira, evidenciada por menos de 15 células inflamatórias agudas do tipo polimorfonucleares por campo de alta ampliação (40 vezes), c) inflamação moderada, de 16 a 25 células por campo, e d) inflamação intensa ou severa, se identificadas mais de 25 células por campo. Este escalonamento de grau de inflamação quantitativo foi considerado equivalente ao referenciado e atribuído a áreas de inflamação não quantitativas que atingem vários órgãos, incluindo o pulmão [68], que se traduz de forma semelhante e respetivamente por, inflamação ligeira – inflamação pouco frequente confinada a pequenas áreas, inflamação moderada – uma área de maiores dimensões ou várias áreas de inflamação, e inflamação intensa – extensas áreas multifocais com infiltrado celular inflamatório envolvendo todo o tecido pulmonar. Considerou-se que o alinhamento desta classificação correspondia ao pretendido, uma vez que Lamagna et al [68][69] quando se refere à intensidade de infiltrado inflamatório, incluiu especificamente o pulmão. Humberto)Machado,)2015))–)Resposta(inflamatória(do(pulmão(na(ventilação(espontânea(monopulmonar.(Estudo(experimental(no(coelho.) 66 A avaliação histológica foi realizada pelo mesmo anatomopatologista, em todas as séries a todas as lâminas, e de modo cego, ou seja, não sendo do seu conhecimento qual a origem da amostra. Infiltrado inflamatório agudo foi definido como sendo constituído predominantemente por granulócitos. Tabela 1 – critérios de grau de inflamação pulmonar adotados Inflamação Ligeira Moderada Intensa Lamagna et al [68][69] inflamação pouco frequente confinada a pequenas áreas uma área de maiores dimensões ou várias áreas de inflamação Extensas áreas multifocais com infiltrado celular inflamatório com quase todo o tecido afetado Critérios quantitativos equivalentes Até 15 células por campo de alta ampliação (40x) De 16 a 25 células por campo de alta ampliação (40x) Mais de 25 células por campo de alta ampliação (40x) Humberto)Machado,)2015))–)Resposta(inflamatória(do(pulmão(na(ventilação(espontânea(monopulmonar.(Estudo(experimental(no(coelho.) 67 3.5 Análise estatística Foi utilizado o método da equação de recursos [70] para calcular o tamanho das amostras para vários estudos, nomeadamente o número de animais a incluir em cada grupo de estudos, de forma a garantir uma componente de erro (df) adequada entre 10 e 20. Os animais foram distribuídos aleatoriamente pelos diferentes grupos, sendo também aleatório o local de alojamento no biotério. O Odds Ratio (OR) foi utlizado como medida de associação entre o grau de inflamação e os diferentes grupos (intervalo de confiança de 95%). O teste não paramétrico Kruskal-Wallis foi utilizado para comparar variáveis entre grupos. O teste de Friedman foi usado para analisar as variações dentro de cada grupo (ANOVA não paramétrica para amostras dependentes). Para os estudos em que foi colocada a hipótese de que a ocorrência de inflamação era independente do procedimento que estava a ser efetuado, foi utilizado o teste de Chi-quadrado. O coeficiente de correlação (R) Spearman’s rho foi utilizado para analisar a correlação entre diferentes variáveis categóricas e a intensidade de inflamação. Um valor de p< 0,05 foi considerado significativo. Os dados são apresentados como mediana (mínimo – máximo), a não ser que seja indicado o contrário. Humberto)Machado,)2015))–)Resposta(inflamatória(do(pulmão(na(ventilação(espontânea(monopulmonar.(Estudo(experimental(no(coelho.) 68 O IBM SPSS® 21, a Statistics Matlab® Toolbox da Mathworkse o Microsoft Excel® 2013 foram usados para todos os cálculos. Humberto)Machado,)2015))–)Resposta(inflamatória(do(pulmão(na(ventilação(espontânea(monopulmonar.(Estudo(experimental(no(coelho.) 69 3.6 Metodologia de divisão das séries de estudo A presente dissertação procurou responder a três questões, a saber; 1) A circunstância de se ventilar apenas um pulmão (VMP), excluindo o pulmão contralateral da ventilação fisiológica bilateral através da formação de uma atelectasia total, será em si um fator que pode desencadear uma resposta inflamatória pulmonar. 2) O oxigénio, elemento que reconhecidamente pode despoletar inflamação pulmonar em modelos de ventilação controlada, numa base de causa e efeito quantitativa, poderá fazê-lo também num modelo sem ventilação controlada? 3) As potenciais lesões causadas pela VMP, em modelo de ventilação espontânea, poderão ser agravadas pela utilização de oxigénio? Foram realizadas três séries de experiências para investigar as questões atrás listadas. Estas séries são identificadas de 1 a 3. Humberto)Machado,)2015))–)Resposta(inflamatória(do(pulmão(na(ventilação(espontânea(monopulmonar.(Estudo(experimental(no(coelho.) 70 3.6.1 Série 1 – Pergunta 1 Foram utilizados 20 coelhos New Zelland que foram divididos aleatoriamente por quatro grupos, com 5 animais por grupo. Os grupos 1 e 2 foram submetidos a VMP, e os grupos 3 e 4 submetidos a ventilação normal bipulmonar (VBP), sendo que os grupos 1 e 3 tiveram um procedimento com a duração de 20 minutos e os grupos 2 e 4, um procedimento com a duração de 75 minutos. Ao iniciar esta série existia a noção, baseada na bibliografia, que o tempo de procedimento poderia influenciar o resultado, uma vez que, como foi referido anteriormente, a duração da intervenção, e portanto do período de ventilação monopulmonar, poderia aumentar a intensidade da inflamação. Todos os animais receberam suplementação de oxigénio na mistura de gases frescos fornecidos, através de uma peça T – Maplesson F tipo Jackson-Rees, de 2 litros por minuto. Os procedimentos efetuados em termos de anestesia e analgesia dos animais, intervenção cirúrgica para criação da VMP, monitorização, eutanásia e colheitas foram descritos anteriormente. O anatomopatologista que observou as preparações histológicas (seis fragmentos por animal, sendo do três pulmão esquerdo e três do pulmão direito, intersectando respetivamente o lobo superior, médio e inferior), não tinha a informação sobre a amostra. Assim, a hipótese colocada nesta primeira série foi de que, a aparecer uma resposta inflamatória, a sua presença e intensidade não Humberto)Machado,)2015))–)Resposta(inflamatória(do(pulmão(na(ventilação(espontânea(monopulmonar.(Estudo(experimental(no(coelho.) 71 seriam atribuídas ao procedimento de ventilação monopulmonar por si só. Humberto)Machado,)2015))–)Resposta(inflamatória(do(pulmão(na(ventilação(espontânea(monopulmonar.(Estudo(experimental(no(coelho.) 72 3.6.2 Série 2 - Pergunta 2 Foram selecionados 20 coelhos New Zelland, que foram divididos aleatoriamente em 4 grupos, com 5 animais por grupo. Os grupo 1 e 2 foram submetidos a VBP com suplementação de oxigénio e os grupos 3 e 4 foram mantidos com VBP sem suplementação de oxigénio. Os grupos 1 e 3 tiveram uma duração de procedimento de 20 minutos e os grupos 2 e 4 uma duração de procedimento de 75 minutos. O estudo do fator tempo como possível elemento agravante da intensidade da inflamação pulmonar que se pudesse vir a induzir, foi também incluído. O sistema de suplementação com oxigénio foi o mesmo usado anteriormente, ou seja uma peça T – Maplesson F tipo Jackson-Rees. Contudo nesta série apenas se utilizou uma quantidade de 0,5 litros por minuto de gases frescos, no grupo que recebeu suplementação. Nos animais sem suplemento de oxigénio todo o procedimento foi idêntico, com exceção da utilização de oxigénio, ou seja foi deixada a ventilação ao ar ambiente. Nesta série não foi efetuada a técnica para VMP uma vez que todos os animais foram mantidos em VBP. As colheitas foram efetuadas como já atrás descrito, nomeadamente para as análise de gases de sangue arterial, e hemograma de sangue periférico. Humberto)Machado,)2015))–)Resposta(inflamatória(do(pulmão(na(ventilação(espontânea(monopulmonar.(Estudo(experimental(no(coelho.) 73 Estas colheitas foram efetuadas por punção da aorta abdominal, imediatamente após a conclusão de todo o set-up experimental, e imediatamente antes da efetivação da eutanásia ao animal. A técnica de anestesia, analgesia e eutanásia foram as mesmas da série 1. A metodologia de fixação, execução de moldes, corte de fragmentos (seis fragmentos por animal, sendo do três pulmão esquerdo e três do pulmão direito, intersectando respetivamente o lobo superior, médio e inferior), e respetiva coloração obedeceu aos mesmos princípios, atrás referidos. A visualização das lâminas obedeceu aos mesmos critérios e o mesmo anatomopatologista foi responsável pela sua análise, mantendo-se este, apenas, com a informação codificada das lâminas. Assim, nesta série, a hipótese colocada foi a de que o suplemento com oxigénio por si só poderia aumentar a resposta inflamatória pulmonar. Neste contexto, a hipótese estatística foi de que a intensidade da inflamação poderia estar associada à suplementação de oxigénio. Humberto)Machado,)2015))–)Resposta(inflamatória(do(pulmão(na(ventilação(espontânea(monopulmonar.(Estudo(experimental(no(coelho.) 80 A Tabela 3 mostra a mediana dos valores dos parâmetros monitorizados. Tabela 3. Mediana de valores dos parâmetros monitorizados série 1 VMP (ventilação monopulmonar) VBP (ventilação bipulmonar) 1º registo Último registo 1º registo Último registo Frequência cardíaca, batimentos por minuto 190 (120-235) 197,5 (125-235) 152,5 (125-205) 163,5 (130-225) Frequência respiratória, ciclos por minuto 85 (56-95) 92,5 (50-100) 82 (61-88) 90 (60-95) SpO2, % (saturação arterial periférica de oxigénio) 91 (79-100) 96 (91-100) 89 (68-95) 94,5 (80-99) Os valores são apresentados como mediana (mínimo – máximo). Humberto)Machado,)2015))–)Resposta(inflamatória(do(pulmão(na(ventilação(espontânea(monopulmonar.(Estudo(experimental(no(coelho.) 81 Resultados histológicos Os animais de ambos os grupos apresentaram algum grau de inflamação. O grupo de coelhos submetidos VMP continha quatro animais com uma resposta inflamatória moderada (16 a 25 células por campo de alta ampliação – 40 x) , enquanto que no grupo submetido a VBP apenas se observou uma resposta desta intensidade em dois dos animais. A figura 3 mostra a intensidade de inflamação encontrada nos 2 grupos de estudo (VMP e VBP). Figura 3 – Grau de inflamação – série 1( 0 1 2 3 4 5 6 7 8 9 Número de coelhos VMP (n=10) VBP (n=10) Resposta Inflamatória Inflamação ligeira Inflamação moderada Humberto)Machado,)2015))–)Resposta(inflamatória(do(pulmão(na(ventilação(espontânea(monopulmonar.(Estudo(experimental(no(coelho.) 82 Sendo que a nossa hipótese foi de que a ocorrência de inflamação, nomeadamente a sua intensidade, não era dependente da VMP, esta foi estatisticamente rejeitada (Chi-quadrado com p<0,05). No grupo de VMP, os resultados encontrados relativamente à intensidade da resposta inflamatória pulmonar foram comparados entre o pulmão esquerdo (excluído ou atelectasiado especifica e de forma inerente ao procedimento de VMP) e o pulmão direito que se manteve a ventilar durante o procedimento. Nesta comparação, observou-se que houve inflamação moderada em maior número de pulmões esquerdos do que direitos (Chi-quadrado com p<0,05). A análise do tipo de células inflamatórias encontradas mostrou que sendo todas leucócitos polimorfonucleares, cerca de 75% eram eosinófilos e 25% neutrófilos (figura 4). Humberto)Machado,)2015))–)Resposta(inflamatória(do(pulmão(na(ventilação(espontânea(monopulmonar.(Estudo(experimental(no(coelho.) 83 Figura 4. A - inflamação ligeira, B – inflamação moderada. Setas – polimorfonucleares eosinófilos (Série 1) Humberto)Machado,)2015))–)Resposta(inflamatória(do(pulmão(na(ventilação(espontânea(monopulmonar.(Estudo(experimental(no(coelho.) 84 4.2.2 Publicação de resultados série 1 ( Machado HS, Sá P, Nunes CS, Couceiro A, da Silva ÁM, Águas A. Spontaneous one-lung ventilation increases the lung inflammatory response: an experimental pilot study. J Anesth Clin Res 2014. 5:428 ( ( ( ( ( ( Humberto)Machado,)2015))–)Resposta(inflamatória(do(pulmão(na(ventilação(espontânea(monopulmonar.(Estudo(experimental(no(coelho.) 85 ( ( Humberto)Machado,)2015))–)Resposta(inflamatória(do(pulmão(na(ventilação(espontânea(monopulmonar.(Estudo(experimental(no(coelho.) 86 ( Citation: Machado HS, Sá P, Nunes CS, Couceiro A, da Silva ÁM, et al. (2014) Spontaneous One-Lung Ventilation Increases the Lung Inflammatory Response: An Experimental Pilot Study. J Anesth Clin Res 5: 428. doi:10.4172/2155-6148.1000428 Page 2 of 5 Volume 5 • Issue 8 • 1000428 J Anesth Clin Res ISSN:2155-6148 JACR an open access journal Study groups This study was conducted as a prospective randomized animal experiment; with four groups with five rabbits each being studied. Group 1 and 2 had spontaneous OLV during 20 and 75 minutes, respectively; Group 3 and 4 had spontaneous two-lung ventilation (TLV) during 20 and 75 minutes, respectively. All rabbits received 2 litter/minute fresh gas mixture of oxygen and air. Since the TLV group was not submitted to any thoracic instrumentation, just receiving anesthesia as the OLV group, this was assumed to represent the control group. Instrumentation The rabbits were anesthetized with intramuscular ketamine 50 mg/kg (Imalgene®, Merial Laboratorios, S.A., and Spain) and xylazine 4 mg/kg (Rompum®, Bayer, Leverkusen, Germany). Anaesthesia maintenance was attained with half the initial dose of ketamine and xylazine every 20 minutes. The anterior region of the neck and the abdomen were shaved, with a 2 cm vertical midline incision being made through the anterior cervical region; after exposing the trachea, an incision was made to allow the introduction of a 2.5 tracheal tube to be connected to a spontaneous breathing system (Jackson-Rees type) with 2 litters per minute flow of a fresh oxygen/air mixture. Monitoring During the procedure non-invasive monitoring was used to monitor heart rate (HR) and peripheral arterial saturation (SpO2) (Nellcor Oximax N600X£,Tyco Healthcare group LP, Nellcor Puritan Bennett Division, Pleasanton, CA 94588, USA); respiratory rate (RR) was monitored by direct observation. First and last measurements were obtained at five minutes after setup and five minutes before the end of the procedure. We developed an OLV model using spontaneous ventilation in order to avoid pro-inflammatory situations previously described as the multiple hit hypotheses (such as mechanical ventilation, surgical manipulations and re-expansion/reperfusion). In all rabbits, a left subcostal incision was performed; In Groups 1 and 2 air injection (10 ml/kg) was administered through the left costal-diaphragmatic recess into the intra-pleural cavity. Left lung collapse was confirmed by visual observation through the centre of diaphragm (by way of its transparency), as was right lung spontaneous ventilation (Figure 1). Groups 3 and 4 were maintained on spontaneous bilateral ventilation (control groups). The rabbit was identified as a suitable model for the study since its anatomy allows OLV due to the anatomic-physiological pleural separation of both sides of the thorax. At the end of procedure all rabbits were euthanized with ketamine (100 mg/kg) and xylazine (8 mg/kg), followed by section of abdominal aorta for exsanguination. Tissue samples The rabbits’ lungs were harvested and fixed in 10% formaldehyde and embedded in paraffin for a light microscopy (LM) study. Three micra sections from the left and right lungs (superior, middle and lower lobe) were obtained from all rabbits. Lung sections were stained in haematoxylin and eosin. Histopathology An arbitrarily defined four level inflammatory score was assigned to the lungs depending on the intensity of inflammatory infiltrates in each lung plate: no inflammation, light, moderate and severe inflammation. Infrequent inflammatory cells and/or inflammation confined to a few areas (corresponding to less than 15 cells per high magnification field of 40x) [8] were defined as a light inflammatory response. Multiple areas in the tissue or a large area of inflammatory cells (corresponding to an average of 16 to 25 cells per high magnification field 40x) [8] were defined as a moderate inflammatory response. Large multifocal areas of tissue with inflammatory cells or almost all areas of tissue affected (corresponding to more than 25 cells per high magnification field 40x) [8] were defined as severe inflammation. Thus, rabbits were classified as light, moderate or severe inflammatory responders according to the intensity of inflammation assessed by total plate visualization. Staff investigators who collected data during the procedure were aware of the group assignments. An independent and experienced pathologist (unaware of which subject was being evaluated) classified all plates accordingly to the criteria set. Statistical analysis The Resource Equation method [9] was used to determine if the sample size was appropriate for the experiment, considering a laboratory animal study with a controlled set-up. A sample size of 5 rabbits per group with a total of 4 groups (n=20) were considered adequate for the questions being asked, resulting in an adequate error component (df) between 10 and 20. Odds ratio (OR) was used as a measure of association. Kruskal-Wallis non-parametric test was used to compare variables between groups. Friedman test (Nonparametric two-way ANOVA) was used to compare variations within groups. Spearman’s rho was used as a measure of correlation between the different variables and the level of inflammation. Pearson’s chisquared test was used to test for independence in inflammation. The statistical hypothesis is that the occurrence of moderate inflammation is independent of the technique (OLV or TLV). A p-value<0.05 was considered statically significant. The Statistics Matlab® Toolbox from Mathworks, and Microsoft Excel 2013 were used for all calculations. Data is presented with median and range variables. Results All rabbits fulfilled the inclusion criteria for the study; daily visits to vivarium demonstrated animal wellbeing, with normal feeding, absence of self-mutilation, or weight loss. A B D C E A–Basal view of right hemithorax, B–Basal view of left hemithorax, C– Inflatted right lung, D– Collapsed left lung, E–left pneumotorax Figure 1: Rabbit Lung (diaphragmatic ventral aspect). D Humberto)Machado,)2015))–)Resposta(inflamatória(do(pulmão(na(ventilação(espontânea(monopulmonar.(Estudo(experimental(no(coelho.) 87 ( Citation: Machado HS, Sá P, Nunes CS, Couceiro A, da Silva ÁM, et al. (2014) Spontaneous One-Lung Ventilation Increases the Lung Inflammatory Response: An Experimental Pilot Study. J Anesth Clin Res 5: 428. doi:10.4172/2155-6148.1000428 Page 3 of 5 Volume 5 • Issue 8 • 1000428 J Anesth Clin Res ISSN:2155-6148 JACR an open access journal Weight, heart rate (HR), respiratory rate (RR), oxygenation (SpO2) The median weight was 1975 g (min 1378; max 3790) in the OLV Group and 1912.5 g (min 1400; max 2433) in the TLV Group, with no statistical difference between the two. Table 1 summarizes values for all the parameters. During the procedure SpO2 significantly increased in both groups (p<0.05). In the OLV Group, SpO2 had a median increase of 4.5% and in the TLV Group SpO2 increased by 5.2%, with no differences between the groups. Initial SpO2, HR and RR values are not correlated with the level of inflammation. When considering all rabbits, only the percentage change in RR had a negative correlation with the level of inflammation (R=-0.512, p<0.05). Lung inflammation Rabbits in Group 1 and 2 were found to be equally likely to have moderate inflammation (OR=1, Chi-square p=0.53). The same was also found in rabbits from Group 3 and 4 (OR=1, Chi-square p=0.53). Since the degree of inflammatory response was not influenced by the length of the procedure, we aggregated the rabbits in only two groups: those submitted to OLV (group 1 and 2-OLV Group, n=10) and those submitted to TLV (group 3 and 4–TLV Group, n=10), so as to analyse the influence of OLV versus TLV, independently of procedure duration. As expected, all rabbits had some degree of inflammation. The OLV Group showed moderate inflammation in 4 subjects, whereas the TLV Group only did so in 2 rabbits. Our hypothesis was that the occurrence of moderate inflammation was independent of the technique used (OLV or TLV), but this was rejected (Chi-square p<0.05). In the OLV Group, inflammation results were compared between left (collapsed) and right lungs; there was moderate inflammation in 4 of the left lungs, whereas only 2 right lungs presented moderate inflammation. This contradicts the hypotheses that the occurrence of moderate inflammation is independent of the lung being collapsed or being ventilated (Chi-square p<0.05). The inflammatory cells found in these plates were neutrophils and eosinophils; the proportion found showed approximately 75% eosinophils and 25% neutrophils (Figure 2). Discussion In our study, rabbits submitted to one-lung ventilation (OLV) had greater degree of inflammatory response than did animals submitted to two-lung ventilation (TLV); this fact was shown in more rabbits having moderate inflammation response in the OLV group. In OLV animals, the inflammatory response was more intense in the left lung (collapsed) than in the ventilated lung, suggesting that OLV is not an indifferent factor to the occurrence of more intense inflammation. However, moderate inflammation also appeared in TLV group, which may raise the possibility of a cause also present in the TLV rabbits, but to a lesser extent than in OLV, possibly implicating a systemic effect in these findings. These facts draw our attention to a physiological situation that is present in the collapsed lung without any doubt, and might be present in the ventilated lung with lower intensity, namely areas of atelectasis. Based on this assumption, we may explain why even in a non-surgical spontaneous ventilation model (without interference of mechanical ventilation and surgical manipulation) the local acidic environment induced by atelectasis might induce inflammation, this finding being more pronounced when these areas are more extensive as is the case with whole lung collapse (such as in OLV). In this regard, one might assume that a major local event, such as a collapsed lung, might have the ability to induce a systemic effect affecting both lungs. No high plateau pressures (barotrauma), no overdistension (volutrauma), nor the shear stress of repetitive opening (atelectotrauma) were present, since the model only included spontaneous ventilation with oxygen/air supplementation of 2 litters/minute. However, as demonstrated in some literature, when these factors were present the length of the procedure may be associated with a greater inflammatory response [10-12]. In all rabbits, spontaneous ventilation set up included a fixed volume of fresh gas flow of 2 litters per minute; this volume allowed visual control of spontaneous ventilation by means of JacksonRees balloon self-inflation and deflation observation. It was assumed that this fact implied that a certain degree of continuous positive airway OLV (One-lung ventilation) TLV (Two-lung ventilation) 1st recording Last recording 1st recording Last recording HR, bpm 190 (120-235) 197.5 (125-235) 152.5 (125-205) 163.5 (130-225) RR, b/m 85 (56-95) 92.5 (50-100) 82 (61-88) 90 (60-95) SpO2, % 91 (79-100) 96 (91-100) 89 (68-95) 94.5 (80-99) Values are presented as mean (range). HR: heart rate; RR: respiratory rate; SpO2: peripheral oxygen arterial saturation; bpm: beats per minute; b/m: breaths per minute; OLV-One-Lung Ventilation; TLV-Two-Lung Ventilation. There is no statistical difference between the OLV and TLV groups with respect to the 1st and last recordings, or percentage change for all three physical parameters. Table 1: Physical parameters. Legend: arrow-eosinophil Figure 2: A-Light inflammation (12 eosinophils), B-moderate inflammation (23 eosinophils). Humberto)Machado,)2015))–)Resposta(inflamatória(do(pulmão(na(ventilação(espontânea(monopulmonar.(Estudo(experimental(no(coelho.) 88 Citation: Machado HS, Sá P, Nunes CS, Couceiro A, da Silva ÁM, et al. (2014) Spontaneous One-Lung Ventilation Increases the Lung Inflammatory Response: An Experimental Pilot Study. J Anesth Clin Res 5: 428. doi:10.4172/2155-6148.1000428 Page 4 of 5 Volume 5 • Issue 8 • 1000428 J Anesth Clin Res ISSN:2155-6148 JACR an open access journal pressure (CPAP) was applied to all animals, which could hypothetically prevent local atelectasis formation. Lung surgery has a 2-6% mortality rate, according to the complexity of the surgical procedures [13]. At the present time, mortality rates have shifted away from the cardiac and surgical causes and are more related to pulmonary problems, such as infection and ALI in its most severe form, the acute respiratory distress syndrome (ARDS) [10,14]. The strongest predictors of ALI are related to the pre-operative condition of the patient, extent of lung resection, “injurious” mechanical ventilation and fluid therapy during the surgical procedure [13]. It is known that controlled OLV with higher tidal volumes (10 ml/kg) may produce a significant rise of inflammatory markers, including increased cellular infiltration [15]. Other causes of release of inflammatory mediators are hyperoxia and high levels of positive pressure at the end of inspiration [16,17]. In addition, studies showed that biochemical and histological lesions occur both in the collapsed and in the ventilated lung during OLV [18,19]. The ventilated lung may be subjected to a combination of volutrauma, hyperinflation, and hyperoxia that represents a potential source of oxidative stress and inflammatory response [20]. However, none of the situations previously described have been applied in this study. This draws attention to the possibility that the occurrence of moderate inflammatory response might be linked to the OLV status itself. Inflammation is characterized by profound changes in metabolic activity, tissue hypoxia and metabolic acidosis. These shifts in tissue metabolism are frequently associated with vasculitis and intense recruitment of various inflammatory cell types [21]. Furthermore, it is clear that oxygen supplementation in all subjects may increase the possibility of inflammation, since oxygen itself may induce the occurrence of atelectatic areas [22,23]. These areas are poorly ventilated and induce local hypoxia, with the consequent signalling of inflammatory mediators. However, both groups had oxygen supplementation, but the OLV group had higher moderate inflammation scores, implying that OLV clearly augments inflammatory response. The overall inflammatory response cell population found was composed of neutrophil and eosinophil leukocytes. However, in all plates the percentage of eosinophil leukocytes reached 75%, which was an unexpected inflammation pattern. Eosinophils are involved in several inflammatory processes that imply a certain degree of pro-fibrogenic and pro-angiogenic activity, namely in some chronic allergic conditions such as asthma. This angiogenesis is often linked to hypoxic conditions present in inflamed tissues. Since eosinophils respond to hypoxia by up-regulation and other pro-angiogenic functions, this indicates that there may be a correlation between eosinophilic inflammation and hypoxia [23,24]. In our study, we did not suspect allergic conditions since all rabbits were considered healthy by the overall clinical analysis made at arrival and during quarantine time; with no abnormal clinical signs or symptoms being detected during the whole housing period. In addition, all rabbits had an official health certificate from the producer certifying the animals’ wellbeing. Thus, eosinophilic predominance may be related to local hypoxic conditions. The results of this study show that some factors linked to the oxygen supply during OLV (and subsequent set up of oxygenation variability) may play a role not only in the occurrence of inflammatory response, but also on the type of cells encountered. Local hypoxia may have prompted inflammatory signalling, which might have been responsible for the appearance of either neutrophils and/or eosinophils. Considering all rabbits, the percentage of change in RR had a negative correlation with the level of inflammation (p<0.05); thus, it may be assumed that this increase in RR may lower systemic carbon dioxide levels and its correspondent contribution to acidity during inflammation. The main findings in this study include: • Spontaneous one-lung ventilation in a non-surgical, nonmanipulated lung, induces inflammatory changes in both lungs, with predominance in the collapsed lung. • Atelectasis is present not only in the collapsed one-lung ventilated lung, but may also be present in two-lung ventilated subjects, however, with a more pronounced inflammatory response in the first. • Inflammatory cellular infiltrates that result from a certain degree of lung atelectasis and local hipoxia, were predominantly eosinophilic in nature. The conclusion of this study is that OLV (assumed as a major factor of atelectasis) is a relevant trigger for lung inflammation and, since no controlled ventilation was used, nor surgical manipulation of the lung was performed, this inflammatory response can be a direct physiological consequence. Study limitations were identified during our work and may contribute to plan further investigation. This spontaneous ventilation animal model was created to study the histological consequences of OLV. However, no previous studies were done that established a time limit for an experiment like the one carried out. In this regard, it was assumed that a seventy-five minute limit on the length of procedure was acceptable, as it might represent some similarity to the majority of thoracic procedures; however, further studies might contribute data regarding what is the ideal procedure duration in the study of the effects of OLV. Likewise, this study setup is not comparable to clinical OLV; in which positive pressure ventilation and lung exclusion using double-lumen tracheal tubes or bronchial blockers are used. Thus, further studies should be designed to allow the extrapolation to human clinical practice in order to know how to avoid consequences of atelectasis during and after anesthesia. Acknowledgement The authors would like to thank Mr. Costa e Silva for coordinating the housing and husbandry of animals, Mrs. Manuela Silva for help in laboratory tasks, and Dr. Ana Pinto and Dr. Madalena Costa for histological assembling and preparation. The authors would like to thank Centro Hospitalar do Porto for the funding granted for the purchase of animals, animal food, and other husbandry expenses, as also the Anesthesia Department at Centro Hospitalar do Porto for funding the edition and publication of this study. Disclosures This study received funding from Centro Hospitalar do Porto (Largo Abel Salazar, 4099-001 Porto, Portugal) for logistic purposes, animal purchase, housing and husbandry. The Anesthesia Department at Centro Hospitalar do Porto (Largo Abel Salazar, 4099-001 Porto, Portugal) funded expenses regarding edition and publication. No funding was granted to any author. References 1. Licker MJ, Widikker I, Robert J, Frey JG, Spiliopoulos A, et al. (2006) Operative mortality and respiratory complications after lung resection for cancer: impact of chronic obstructive pulmonary disease and time trends. See comment in PubMed Commons below Ann Thorac Surg 81: 1830-1837. 2. Boffa DJ, Allen MS, Grab JD, Gaissert HA, Harpole DH, et al. (2008) Data from The Society of Thoracic Surgeons General Thoracic Surgery database: the surgical management of primary lung tumors. See comment in PubMed Commons below J Thorac Cardiovasc Surg 135: 247-254. 3. Licker M, Fauconnet P, Villiger Y, Tschopp JM (2009) Acute lung injury and outcomes after thoracic surgery. See comment in PubMed Commons below Curr Opin Anaesthesiol 22: 61-67. 4. Eichenbaum KD, Neustein SM (2010) Acute lung injury after thoracic surgery. See comment in PubMed Commons below J Cardiothorac Vasc Anesth 24: 681-690. 5. Dulu A, Pastores SM, Park B, Riedel E, Rusch V, et al. (2006) Prevalence and Humberto)Machado,)2015))–)Resposta(inflamatória(do(pulmão(na(ventilação(espontânea(monopulmonar.(Estudo(experimental(no(coelho.) 89 Humberto)Machado,)2015))–)Resposta(inflamatória(do(pulmão(na(ventilação(espontânea(monopulmonar.(Estudo(experimental(no(coelho.) 96 Uma diferença significativa foi encontrada entre os dois grupos na primeira medição de gases de sangue arterial, nomeadamente na pressão parcial de oxigénio arterial (pO2) e na saturação arterial de oxigénio (SpO2). No final do procedimento a mediana da pO2 aumentou 8,89% no grupo com suplementação de oxigénio (OSG), tendo aumentado 81,33% no grupo sem suplementação de oxigénio (NOSG), este aumento foi estatisticamente diferente entre grupos (p<0,05). A SpO2 não se alterou significativamente entre a primeira e a ultima medição no grupo OSG, mas aumentou significativamente em 13,36% no grupo NOSG (p< 0,05) (figura 8). Os restantes parâmetros analisados não mostraram diferenças significativas entre a primeira e ultima medição entre grupos de estudo (OSG e NOSG). Humberto)Machado,)2015))–)Resposta(inflamatória(do(pulmão(na(ventilação(espontânea(monopulmonar.(Estudo(experimental(no(coelho.) 97 Apresentam-se seguidamente os valores de gases de sangue arterial dos animais estudados na Série 2, tabela 4. Tabela 4 - Valores de gases de sangue arterial. Amostra A – inicial, Amostra B – final. pH – pH do sangue arterial, pCO2 – pressão parcial de dióxido de carbono arterial, pO2 – pressão parcial de oxigénio arterial, HCO3 – concentração arterial de bicarbonato, SatO2 – saturação arterial de oxigénio Grupo OSG Coelho 1 1 2 2 3 3 4 4 5 5 Amostra A B A B A B A B A B pH 7,36 7,25 7,28 7,414 7,312 7,291 7,385 7,485 7,348 7,375 PCo2 54,3 65,6 76,9 39 64,3 61,2 61 46,3 66,7 45,8 PO2 44,6 43,1 177 107 232 53,2 265 350 73,2 275 HCO3 30,5 28,9 37,5 24,9 32,5 26,4 36,5 34,9 33,5 26,8 Sat O2 78,2 62,7 99 99 99 87,7 99 99 98,8 99 Coelho 6 6 7 7 8 8 9 9 10 10 Amostra A B A B A B A B A B pH 7,429 7,396 7,413 7,414 7,395 7,562 7,413 7,467 7,421 7,48 PCo2 54,6 45 52,1 46,7 50,5 26,8 51,4 43,6 53,1 36,2 PO2 235 371 96,5 261 153 161 313 318 295 332 HCO3 36,1 27,6 33,2 29,9 30,9 24,1 32,8 31,5 34,5 26,9 Sat O2 99 99 99 99 99 99 99 99 99 99 ( ( ( ( ( ( ( ( ( ( ( Grupo NOSG Coelho 11 11 12 12 13 13 14 14 15 15 Amostra A B A B A B A B A B pH 7,336 7,413 7,447 7,498 7,445 7,343 7,444 7,358 7,438 7,446 PCo2 70,6 54,5 49,3 33,7 55,1 38,2 45,4 45,9 58,7 55,8 PO2 26,6 85,4 62,4 111 55,2 102 80,3 85,9 41,5 68,4 HCO3 37,7 34,8 32,8 26,1 37,8 20,8 31,1 25,8 37,1 36,7 Sat O2 40,8 99 100 99 94,4 99 99 99 72,4 93,1 ( ( ( ( ( ( ( ( ( ( ( Coelho 16 16 17 17 18 18 19 19 20 20 Amostra A B A B A B A B A B pH 7,436 7,497 7,403 7,423 7,405 7,496 7,388 7,444 7,379 7,307 PCo2 59,9 48,5 51,9 45,9 55,2 36,1 64,1 52,1 54,9 48,9 PO2 33,9 57,8 51,3 75,3 55,4 137 33,8 67,5 46,8 99,4 HCO3 37,8 36,9 30,8 29,9 34,6 27,8 35,1 34,4 32,3 24,5 Sat O2 68,7 99 89,9 99 94,9 99 62,1 99 84,9 99 Humberto)Machado,)2015))–)Resposta(inflamatória(do(pulmão(na(ventilação(espontânea(monopulmonar.(Estudo(experimental(no(coelho.) 98 A figura 9 mostra a evolução dos valores de gases de sangue arterial nos dois grupos de estudo (mediana) Figura 9 (Série 2) - OSG – A, primeira medição no grupo OSG (com suplemento de oxigénio); OSG – B, última medição no grupo OSG; NOSG – A, primeira medição no grupo NOSG (sem suplementação de oxigénio); NOSG – B, ultima medição no grupo NOSG. pO2–pressão parcial de oxigénio arterial, PCO2-pressão parcial de dióxido de carbono arterial, HCO3–concentração de bicarbonato arterial, pH–pH do sangue arterial. Humberto)Machado,)2015))–)Resposta(inflamatória(do(pulmão(na(ventilação(espontânea(monopulmonar.(Estudo(experimental(no(coelho.) 99 4.2.4 Publicação dos resultados da série 2 ( Machado HS, Nunes CS, Sá P, Couceiro A, da Silva ÁM, Águas A. Increased lung inflammation with oxygen supplementation in tracheotomised spontaneous breathing rabbits: an experimental prospective randomized study. BMC Anesthesiology 2014.14:86 ( ( ( ( ( Humberto)Machado,)2015))–)Resposta(inflamatória(do(pulmão(na(ventilação(espontânea(monopulmonar.(Estudo(experimental(no(coelho.) 100 ( ( RESEARCH ARTICLE Open Access Increased lung inflammation with oxygen supplementation in tracheotomized spontaneously breathing rabbits: an experimental prospective randomized study Humberto S Machado 1*† , Catarina S Nunes 1,2† , Paula Sá 1† , Antonio Couceiro 3† , Álvaro Moreira da Silva 4† and Artur Águas 5,6† Abstract Background: Mechanical ventilation is a well–known trigger for lung inflammation. Research focuses on tidal volume reduction to prevent ventilator-induced lung injury. Mechanical ventilation is usually applied with higher than physiological oxygen fractions. The purpose of this study was to investigate the after effect of oxygen supplementation during a spontaneous ventilation set up, in order to avoid the inflammatory response linked to mechanical ventilation. Methods: A prospective randomised study using New Zealand rabbits in a university research laboratory was carried out. Rabbits (n = 20) were randomly assigned to 4 groups (n = 5 each group). Groups 1 and 2 were submitted to 0.5 L/min oxygen supplementation, for 20 or 75 minutes, respectively; groups 3 and 4 were left at room air for 20 or 75 minutes. Ketamine/xylazine was administered for induction and maintenance of anaesthesia. Lungs were obtained for histological examination in light microscopy. Results: All animals survived the complete experiment. Procedure duration did not influence the degree of inflammatory response. The hyperoxic environment was confirmed by blood gas analyses in animals that were subjected to oxygen supplementation, and was accompanied with lower mean respiratory rates. The non-oxygen supplemented group had lower mean oxygen arterial partial pressures and higher mean respiratory rates during the procedure. All animals showed some inflammatory lung response. However, rabbits submitted to oxygen supplementation showed significant more lung inflammation (Odds ratio = 16), characterized by more infiltrates and with higher cell counts; the acute inflammatory response cells was mainly constituted by eosinophils and neutrophils, with a relative proportion of 80 to 20% respectively. This cellular observation in lung tissue did not correlate with a similar increase in peripheral blood analysis. Conclusions: Oxygen supplementation in spontaneous breathing is associated with an increased inflammatory response when compared to breathing normal room air. This inflammatory response was mainly constituted with polymorphonuclear cells (eosinophils and neutrophils). As confirmed in all animals by peripheral blood analyses, the eosinophilic inflammatory response was a local organ event. Keywords: Lung inflammation, Oxygen supplemented spontaneous breathing * Correspondence: hjs.machad[email protected] † Equal contributors 1 Serviço de Anestesiologia, Centro Hospitalar do Porto, Largo Abel Salazar, Porto 4099-001, Portugal Full list of author information is available at the end of the article © 2014 Machado et al.; licensee BioMed Central Ltd. This is an Open Access article distributed under the terms of the Creative Commons Attribution License (http://creativecommons.org/licenses/by/4.0), which permits unrestricted use, distribution, and reproduction in any medium, provided the original work is properly credited. The Creative Commons Public Domain Dedication waiver (http://creativecommons.org/publicdomain/zero/1.0/) applies to the data made available in this article, unless otherwise stated. Machado et al. BMC Anesthesiology 2014, 14:86 http://www.biomedcentral.com/1471-2253/14/86 Humberto)Machado,)2015))–)Resposta(inflamatória(do(pulmão(na(ventilação(espontânea(monopulmonar.(Estudo(experimental(no(coelho.) 101 ( ( Background Patients submitted to mechanical ventilation are at risk of developing acute respiratory distress syndrome (ARDS), either by overdistension (volutrauma) or repetitive tidal recruitment of closed lung units (atelectrauma) [1]. Overinflation of the more distal airways and alveoli is thought to be caused by high tidal volumes. The cycle of continuous opening and closing of alveolar groups also causes alveolar wall lesion and surfactant depletion, with injury by recruitment-derecruitment [2]. Continuous mechanical distension of type II alveolar cells contributes to an inflammatory response by changing the balance of pro and antiinflammatory mediators [3]. Ventilation strategies near physiological values benefit patients from these conditions [1]. Post-operative lung inflammation and ARDS may also appear in less severe forms [4,5], especially when overinflation is relevant [6]; however other pro-inflammatory factors may be present [7]. Oxygen has been characterized as a pro-inflammatory factor. Supra-physiological oxygen concentrations, as in mechanical ventilation, have been implied as a contributing factor to the development of lung injury; as described by Britt et al., newborn mice exposed to hyperoxia developed lung inflammation linked to cyclooxigenase pathways [8]. Lung injury by oxygen may occur as a result of injurious oxygen by-products (reactive oxygen species, ROS), and other key mediators (interferon-gama) secondary to hyperoxia [9,10]. The type of oxygen toxicity to the lung has been found to be due to natural killer cell’s activation and proliferation in hyperoxic environments [11]; several levels of hyperoxia may play different roles on lung inflammation [12,13]. Nevertheless, available evidence shows that hypoxia [4,14] may also play an import role in the development of lung inflammation. If high oxygen content is applied to the lung, reabsorption atelectasis may develop, with resulting local hypoxemic environments; this fact may lead to a regional acidic milieu that results in subsequent inflammatory response [4]. Furthermore, continued hypoxia leads to an increased level of circulating pro-inflammatory cytokines and vascular leakage causing lung edema [14]. We hypothesized that supplementary oxygen may lead to enhanced lung inflammation, as a sole contributing factor. Therefore, we studied an animal model based on a spontaneous ventilation mode so as to avoid any bias from mechanical ventilation. Furthermore, exposure time to supplementary oxygen was also studied. Methods Animals The experimental protocol used in this study was approved by appropriate local ethic committee (“Comité de Ética do ICBAS/UP”), and was done according to the European Union Directive n° 63/2010/EU. Twenty adult New Zealand rabbits (Oryctolagus cuniculus) were purchased from a Portuguese breeder (NORLAP –Rui M.S. Gonçalo, 4825–466 Água-Longa, Portugal) and were kept under standard housing conditions with unrestricted access to food and water, attended by veterinary doctors and inspected daily for wellbeing monitoring. Study groups This study was conducted as prospective randomized animal experiment; we studied four groups with five rabbits each. Groups 1 and 2 two had supplementary oxygen with 20 and 75 minutes procedure respectively; Groups 3 and 4 had no supplementary oxygen with the same procedure duration (20 and 75 min). No controlled ventilation was used in any group. Instrumentation All rabbits (mean weight of 2057 grams [g], std 227.19 g) were submitted to anesthesia with ketamine (100 milligrams [mg]/milliliter [ml] - Imalgene®, Bayer - Puteaux, France) and xylazine (20 mg/ml - Rompum®, Bayer HealthCare, Bayer Inc., Animal Health Division, Toronto, Canadá), with an initial dose 0.5 ml/kilogram [kg] of each of these drugs, supplemented intramuscularly with half dose every 20 minutes; animals were placed in the supine position and were kept this way during the whole procedure. Subsequently, the anterior region of the neck and abdomen were shaved and a 2 centimeter [cm] vertical midline incision was made on the anterior cervical region; after exposing the trachea, an incision was made so as to allow the introduction of a 2.5 tracheal tube to be connected to a spontaneous breathing system (Jackson-Rees type), with a fresh flow of oxygen of 0.5 liters [l] per minute in the oxygen supplemented group; no oxygen supplement was used in the non-supplemented group. Monitoring Non-invasive monitoring was used to monitor heart rate, (nellcor oximax N600X®, Covidien, Boulder, CO, USA), rectal temperature and respiratory rate; values were collected every ten minutes after finishing the experimental setup. After tracheal intubation and supplementary oxygen in groups 1 and 2, an infra-abdominal incision was performed in all rabbits to allow aortic blood sample collection; these were collected at the beginning and just before termination of the procedure; blood was further analyzed for arterial blood gas and peripheral blood cell count determination. Tissue sampling At the end of procedure all rabbits were euthanized with ketamine - xylazine 1 ml/kg of each drug, followed by section of abdominal aorta for exsanguination. Machado et al. BMC Anesthesiology 2014, 14:86 Page 2 of 7 http://www.biomedcentral.com/1471-2253/14/86 Humberto)Machado,)2015))–)Resposta(inflamatória(do(pulmão(na(ventilação(espontânea(monopulmonar.(Estudo(experimental(no(coelho.) 102 ( ( Rabbit lungs were harvested and fixed in 10% formaldehyde and embedded in paraffin, for light microscopy (LM) study. Three micra sections of each lung lobe (superior, middle and lower) were obtained from all rabbits. Lung sections were stained in hematoxylin and eosin. Histopathology An arbitrarily defined 4 level inflammatory score was used to classify the lungs according to the intensity of inflammatory infiltrates in each lung plate: no inflammation, light, moderate and severe; light inflammation indicates infrequent inflammatory cells and/or inflammation confined to a few areas [15] (corresponding to less than 15 cells per high magnification field 40×). Moderate inflammation was defined as multiple areas in the tissue or a large area of inflammatory cells [15] (corresponding to an average of 16 to 25 cells per high magnification field 40×). Large multifocal areas of tissue with inflammatory cells or almost all areas of tissue affected were defined as severe inflammation [15] (corresponding to more than 25 cells per high magnification field 40×). Figure 2 Lung inflammatory response. Moderate and mild inflammatory response in the OSG - oxygen supplemented group (n = 10) and NOSG - non-oxygen supplemented group (n = 10) (OR = 16). Figure 3 Inflammatory cells. A –Light inflammation, B–Moderate inflammation, Arrows - eosinophils. Figure 1 Peripheral white cell count. Legend: (A) first measurement, (B) final measurement at end of procedure, in OSG –oxygen supplemented group and in NOSG - non-oxygen supplemented group. Machado et al. BMC Anesthesiology 2014, 14:86 Page 3 of 7 http://www.biomedcentral.com/1471-2253/14/86 Humberto)Machado,)2015))–)Resposta(inflamatória(do(pulmão(na(ventilação(espontânea(monopulmonar.(Estudo(experimental(no(coelho.) 103 ( ( Thus, rabbits were classified as light, moderate or severe inflammatory responders according to the intensity of inflammation assessed. Staff investigators in the animal laboratory were aware of group assignments. After laboratory lung harvesting and plate preparation, these were sent to an independent pathologist for histological scoring. The pathologist was unaware of group assignments. The results founded were accepted as valid. It was also planned that if the duration of procedure did not influence the degree of inflammation, group 1 (n = 5) and group 2 (n = 5) would be joined, as oxygen supplemented group (OSG) (n = 10), and group 3 (n = 5) and group 4 (n = 5) joined in a non-oxygen supplemented group (NOSG) (n = 10) in a similar way. Statistics The Resource Equation method [16] was used to determine if the sample size was appropriate for the experiment. A sample size of 5 rabbits per group with 4 groups (total n = 20) was considered adequate for the questions being asked, resulting in an adequate error component (df) between 10 and 20. Odds ratio (OR) was used as a measure of association between the inflammatory outcome and the study groups (95% confidence interval - CI). Kruskal-Wallis non-parametric test was used to compare variables between groups. Friedman test (Nonparametric two-way ANOVA) was used to compare variations within groups. A p-value < 0.05 was considered statically significant. The IBM SPSS Statistics 21 and Statistics Matlab® Toolbox from Mathworks were used for all calculations. Data is presented with median and range variables. Results Lung inflammation All groups showed signs of moderate lung inflammation. Rabbits in Groups 1 and 2 were equally likely to have moderate inflammation (OR = 1). The same was found in group 3 and 4 (OR = 1) rabbits. Therefore, it was possible to aggregate the rabbits into two groups, those who had supplementary oxygen, (n = 10), and those who did not have supplementary oxygen (n = 10), since procedure duration did not influence the occurrence of inflammatory response. Thus, subsequent analysis was done considering only two groups, with or without oxygen supplement, OSG and NOSG, respectively. The first median values of peripheral cell count measurement are shown in Figure 1. OSG showed moderate inflammation in 8 out of 10 subjects, whereas NOSG Figure 4 Physiological parameters during procedure. Median measures of heart rate, respiratory rate and temperature in OSG - oxygen supplemented group and NOSG - non-oxygen supplemented group, during procedure. Machado et al. BMC Anesthesiology 2014, 14:86 Page 4 of 7 http://www.biomedcentral.com/1471-2253/14/86 Humberto)Machado,)2015))–)Resposta(inflamatória(do(pulmão(na(ventilação(espontânea(monopulmonar.(Estudo(experimental(no(coelho.) 104 ( ( only did so in 2 rabbits, with an OR = 16 (CI 1.8-143.2); therefore OSG is more likely to have moderate inflation than the other group (Figure 2). The inflammatory cells found in these histological plates were neutrophils and eosinophils; with a proportion of about 80% eosinophils and 20% neutrophils (Figure 3). Heart rate, ventilatory rate, temperature and oxygen levels during the experiment All animals survived the experiments and euthanasia was performed in order to collect lung samples. The median heart rate on first measurement was not different between groups (Figure 4) and did not change significantly during the procedure. The median respiratory rate (first measurement) was different between groups (Figure 1) (P = 0.028), but in both groups did not change significantly during the procedure. First measurement values for temperature were not statistically different between the two groups, but decreased significantly during procedure (P < 0.001) (Figure 4). The median rectal temperature (first measurement) was 38 degrees Celsius in the OSG and 38 degrees Celsius in the NOSG. In the OSG the median temperature decreased −3.9%, and in the NOSG the temperature decreased −2.6% (this decrease was not statistically different between groups). A significant difference was found between the two groups in the first measurement values of arterial blood gas, namely partial oxygen pressure (pO2) and peripheral arterial saturation (Sat O2). At the end of the procedure the median pO2 increased by 8.89% in the OSG, and by 81.33% in the NOSG, this change was significantly different (P = 0.041). Sat O2 did not change (between first and final measurement) for the OSG, but it increased significantly by 13.36% in the NOSG (Figure 5). Discussion Our data showed that the observed inflammatory response was more pronounced in the oxygen supplemented group, with a hyperoxic environment, a fact also found in other studies [17-19]; however it was predominantly constituted of eosinophils (80%) and to a minor extent by neutrophils (20%). This observation of the cellular content of the acute inflammatory response was unexpected; nevertheless, some evidence presented in literature might give some reasonable explanation for this occurrence. The common cells found in studies in which acute inflammatory response is observed are usually neutrophils and/or monocytes/macrophages [20-22]; however, the myeloid series implication on inflammation has been linked to a hypoxic model, with lactate accumulation and metabolic acidosis [22]. It is recognized that the eosinophil is armed with weapons able to kill helminthes and to damage tissues and cause disease [23]. In addition, eosinophils exhibit some properties that may support why we found them as the first representatives of acute Figure 5 Arterial blood gas analysis. Arterial blood gas analysis at beginning of procedure (A) and at end of procedure (B) in OSG - oxygen supplemented group and NOSG - non-oxygen supplemented group. Machado et al. BMC Anesthesiology 2014, 14:86 Page 5 of 7 http://www.biomedcentral.com/1471-2253/14/86 Humberto)Machado,)2015))–)Resposta(inflamatória(do(pulmão(na(ventilação(espontânea(monopulmonar.(Estudo(experimental(no(coelho.) 105 ( ( ( inflammatory response [23]. These characteristics include the ability to migrate through endothelial cells without degranulation and without inducing vasculitis, its remarkable adherence capacity after minimal rolling to change it’s shape, and very quick spreading on the endothelial cell monolayer [23]. Moreover, one could question the animals’initial health status, and an eventual eosinophil infiltration with a systemic expression. In regard to this, peripheral blood cell analysis was consistent with a healthy rabbit population in both groups, with special importance to the near absent peripheral eosinophil count (Figure 1). This fact draws away from the possibility of an eosinophil diseased rabbit population, which could be responsible for the lung infiltrates found. Despite the more pronounced acute inflammatory infiltrate found in the OSG, with eosinophil predominance, this might seem to conflict with data showing hypoxia as a modulator of human eosinophil function [24]. This modulation might be expressed as an up-regulation on their survival [24]. However, the local consequence of oxygen supplementation is a hypoxic acidic environment, due to alveolar collapse arising from hyperoxia reabsorption atelectasis. In our study, oxygen supplemented spontaneous ventilated animals had more pronounced inflammatory response than non-supplemented subjects, without influence from procedure duration. This fact is reasonably well documented [17-19], since oxygen is known as a possible trigger of inflammation. The association of controlled ventilation and hyperoxia are known as key synergetic factors responsible for ventilator induced lung injury (VILI) [20]. Our data in this spontaneous breathing model represents new insight in this matter, since previous known evidence (also in rabbits) shows that short term models for controlled ventilation might not trigger significant inflammatory responses [25]. As stated, we wanted to study the oxygen supplementation impact in a spontaneous model; the data presented showed that, even in this setting, oxygen itself plays one role in triggering inflammation as compared to room air ventilation. Thus, it is reasonable to assume that as long as oxygen was used (even in a reduced exposure time of 20 minutes) in this spontaneous ventilation animal model, inflammation was immediately triggered and further enhanced as a moderate response. Potential atelectasis formation due to oxygen supplementation is widely described in literature [4]. This fact might explain a more pronounced inflammatory response in this group, because atelectasis correspond to a local phenomenon that induces local hypoxia and subsequent inflammatory signaling [4], with clear modification on cells life cycles and properties [8]. Being oxygen a known induction agent of absorption atelectasis, and subsequent generator of local acid inflammation in tissues, it might be reasonable to assume that larger areas of atelectasis might be linked to higher degrees of eosinophil infiltrates. However, further studies are needed to fully establish this correlation. First measurement differences on respiratory rate that were found may be related to the fact that the OSG also had better pO2 values; thus, it is reasonably fair to assume that initial higher mean respiratory rate in NOSG may be due to extra effort in compensating transient initial lower pO2 (Figure 2). These facts were expected, and the experiment evolution proved that these higher respiratory rates from NOSG increased the pO2, a finding also confirmed (Figure 5). Conclusions Oxygen sustainably enhances eosinophil based acute inflammatory response in the rabbit lung parenchyma in spontaneous ventilation mode, this when compared to a normoxic spontaneous ventilated group. The time variable does not seem to influence the occurrence of the more pronounced inflammatory response (moderate); the main factor that appears to have influence is the presence or absence of oxygen supplementation. Competing interests No financial or non-financial competing interests are relevant to any of the authors. Thus, all the authors have no competing interests of any kind regarding the publication of this study. Authors’contributions HM elaborated the study design, experimental laboratory work, the writing of manuscript and editing work. CN performed the statistical advising and calculations, participated in writing of manuscript and editing work. PS participated in the study design, writing and editing of the manuscript. AC participated in the study design and made histological observation of lung preparations. AS participated in the study design, editing and revision of manuscript. AA participated in the study design, laboratory work, editing and revision of manuscript. All authors read and have given final approval of the version to be published; in addition, all authors agree to be accountable for all aspects of the work in ensuring that questions related to the accuracy or integrity of any part of the work are appropriately investigated and resolved. Authors’information Our multidisciplinary research group has several medical doctors with different specialties, namely anesthesiology (HM and PS), intensive care/chest medicine (AS) and pathology (AC), a mathematician (CN), and a senior research director of university laboratory (AA). Our research has a specially designed animal model and set up (rabbit - Oryctolagus cuniculus) for investigating oxygen influence on ventilation in several ventilation modes. Ventilation has been a special interest of some of the authors (HM, PS, and AS) due to their routine clinical activity in operating room and intensive care. Assuming the challenges of controlled ventilation, the authors decided to investigate some variables that may enhance its risk, namely oxygen inspired fraction. To avoid mechanical ventilation bias, a spontaneous ventilation model was developed to overcome this problem. Proficiency in histological observation was guaranteed by a pathologist (AC) with a devoted professional career to lung pathology. Other studies are being planned to research related issues. Acknowledgements The authors would like to thank Mr Costa e Silva for coordinating the housing and husbandry of animals and Mrs Manuela Silva for help in laboratory tasks, Dr. Ana Pinto and Dr. Madalena Costa for histology Machado et al. BMC Anesthesiology 2014, 14:86 Page 6 of 7 http://www.biomedcentral.com/1471-2253/14/86 Humberto)Machado,)2015))–)Resposta(inflamatória(do(pulmão(na(ventilação(espontânea(monopulmonar.(Estudo(experimental(no(coelho.) 112 A figura 10 mostra os resultados obtidos da evolução dos gases de sangue arterial no inicio e final do procedimento (mediana) série 3. Figura 10. Gases sangue arterial, primeira e última colheita, A – grupo 1 com suplementação de oxigénio, e B – grupo 2 – sem suplementação de oxigénio. pO2–pressão parcial de oxigénio arterial, PCO2-pressão parcial de dióxido de carbono arterial, HCO3–concentração de bicarbonato arterial, pH–pH do sangue arterial A – grupo 1 com suplementação de oxigénio B – grupo 2 – sem suplementação de oxigénio. 7.368 7.37 7.372 7.374 7.376 7.378 7.38 0 50 100 150 200 250 300 350 OS Group (1st sample) OS Group (2nd sample) PCo2 (mmHg) pO2 (mmHg) Sat O2 (%) HCO3 (mmol/L) PH 7.368 7.37 7.372 7.374 7.376 7.378 7.38 0 50 100 150 200 250 300 350 NOS Group (1st sample) NOS Group (2nd sample) PCo2 (mmHg) pO2 (mmHg) Sat O2 (%) HCO3 (mmol/ L) PH Humberto)Machado,)2015))–)Resposta(inflamatória(do(pulmão(na(ventilação(espontânea(monopulmonar.(Estudo(experimental(no(coelho.) 113 A pressão parcial de oxigénio arterial (pO2) e a saturação arterial de oxigénio (SatO2) foram estatisticamente diferentes (p<0,001) na primeira amostra. No final do procedimento a mediana da pO2 aumentou 116% no grupo com suplementação de oxigénio (OSG) e 65% no grupo sem suplementação, esta diferença foi estatisticamente significativa (p<0,001). A SatO2 não se modificou entre as duas colheitas no grupo OSG, mas aumentou significativamente em 15,75% no grupo NOSG. Não se observaram diferenças significativas entre grupos, nem entre as colheitas, relativamente aos parâmetros pH e bicarbonato. Humberto)Machado,)2015))–)Resposta(inflamatória(do(pulmão(na(ventilação(espontânea(monopulmonar.(Estudo(experimental(no(coelho.) 114 Resultados histológicos Em todas as amostras se observou algum grau de inflamação pulmonar (tabela 8) Tabela 8. Inflamação presente nos grupos OSG e NOSG, em ventilação monopulmonar, com e sem suplementação de oxigénio. Ventilação Monopulmonar Resposta inflamatória moderada (nº de lâminas) Resposta inflamatória ligeira (nº de lâminas) Total de lâminas Grupo OSG - coelhos n=10 (com suplemento de oxigénio) 12 68 80 Grupo NOSG - coelhos n=10 (sem suplemento de oxigénio) 6 74 80 Total 18 142 160 Nesta terceira série, procedeu-se à análise de 8 lâminas para cada animal, uma vez que, existindo já um fator pro-inflamatório envolvido (VMP), e tendo sido colocada a hipótese de que a suplementação com oxigénio não interferiria com a resposta inflamatória, pretendeu-se quantificar este resposta mais aprofundadamente em cada animal. Humberto)Machado,)2015))–)Resposta(inflamatória(do(pulmão(na(ventilação(espontânea(monopulmonar.(Estudo(experimental(no(coelho.) 115 Assim, o grupo OSG apresentou inflamação moderada em 12 das 80 lâminas analisadas, enquanto que o grupo NOSG apenas apresentou 6; deste modo, a hipótese de estudo, que admitia que a ocorrência de inflamação e sua intensidade eram independentes da suplementação com oxigénio foi rejeitada (Chi-quadrado p<0,001). Não se encontraram diferenças entre a resposta inflamatória quando comparados o pulmão direito (deixado a ventilar durante o procedimento) e o pulmão esquerdo (excluído no âmbito do procedimento efetuado). As células inflamatórias encontradas foram polimorfonucleares neutrófilos e eosinófilos, numa proporção idêntica às séries anteriores, 25% para 75%, respetivamente (figura 11). Humberto)Machado,)2015))–)Resposta(inflamatória(do(pulmão(na(ventilação(espontânea(monopulmonar.(Estudo(experimental(no(coelho.) 116 Figura 11. Inflamação pulmonar. A - ligeira e B – moderada. Setas – polimorfonucleares eosinófilos – Série 3 A B Humberto)Machado,)2015))–)Resposta(inflamatória(do(pulmão(na(ventilação(espontânea(monopulmonar.(Estudo(experimental(no(coelho.) 117 4.2.6 Manuscrito aceite para publicação com os resultados da série 3 (Journal of Anesthesia and Clinical Research) ( ( ( ( ! 1! Oxygen increases lung inflammatory response in spontaneous one-lung ventilation 1! in rabbits: a prospective randomized experimental study. 2! Humberto S Machado (M.D., MSc.)[email protected] 3! Serviço de Anestesiologia, Centro Hospitalar do Porto 4! Address: Largo Abel Salazar, 4099-001 Porto, Portugal 5! Catarina S Nunes (Lic, PhD) [email protected] 6! Universidade Aberta, Dep. Ciências e Tecnologia & Serviço de Anestesiologia, Centro 7! Hospitalar do Porto 8! Address: Largo Abel Salazar, 4099-001 Porto, Portugal 9! Paula Sá (M.D., M.Sc.) paulale[email protected] 10! Serviço de Anestesiologia, Centro Hospitalar do Porto 11! Address: Largo Abel Salazar, 4099-001 Porto, Portugal 12! António Couceiro (M.D.) acouceir[email protected] 13! Serviço de Anatomia Patológica, Centro Hospitalar Gaia/Espinho 14! Address: Rua Conceição Fernandes, 4430 Vila Nova de Gaia, Portugal 15! Álvaro Moreira da Silva (M.D., PhD) [email protected] 16! Serviço Cuidados Intensivos, Centro Hospitalar Porto 17! Address: Largo Abel Salazar, 4099-001 Porto, Portugal 18! Artur Águas (M.D., PhD) [email protected] 19! Departamento de Anatomia Normal, Instituto Ciências Biomédicas Abel Salazar - Universidade 20! do Porto & Unidade Multidisciplinar de Investigação Biomédica 21! Address: Rua Jorge Viterbo Ferreira, 228, 4050-313 Porto, Portugal 22! Corresponding Author: 23! Humberto S Machado M.D., M.Sc. [email protected] 24! (Phone +351.935848475 fax+351.220900644) 25! Serviço de Anestesiologia - Centro Hospitalar do Porto - Largo Professor Abel Salazar, 4099-26! 001 Porto, Portugal 27! 28! Humberto)Machado,)2015))–)Resposta(inflamatória(do(pulmão(na(ventilação(espontânea(monopulmonar.(Estudo(experimental(no(coelho.) 118 ( ( ! 2! Abstract 29! Study objective: The purpose of this study was to investigated if oxygen 30! supplementation would increase lung inflammatory response in a spontaneous one-lung 31! ventilation animal model, when compared to room-air oxygen fraction. 32! Design: In vivo prospective randomized animal study 33! Setting: University research laboratory 34! Subjects: New Zealand rabbits 35! Interventions: Rabbits (n=20) were randomly assigned to 2 groups (n=10 each group). 36! Groups (OS – oxygen supplemented, and NOS – non-oxygen supplemented) were 37! submitted to spontaneous one-lung ventilation (OLV) during 60 minutes; OS group had 38! a 2-liter/minute oxygen supplement, and NOS group was kept on room-air. 39! Ketamine/xylazine was administered for induction and maintenance of anesthesia. One-40! lung ventilation was achieved by administration of air into interpleural space, and left 41! lung collapse was visually confirmed through the center of diaphragm. Clinical 42! monitoring and arterial blood gas analyses were performed in all rabbits. 43! Measurements: Lung histology plates were observed under light microscopy for 44! quantification of inflammatory response (light, moderate and severe) 45! Main results: All subjects had at least light inflammatory response. However, rabbits 46! submitted to oxygen supplementation had a statistically significant value for the 47! occurrence of moderate inflammation (p<0.001). The inflammatory cells found were 48! mainly eosinophils and neutrophils in an average proportion of 80/20. Oxygen partial 49! pressure increased in both groups with a higher proportion in OS group (p< 0.001). 50! Conclusion: In this spontaneous OLV model, the use of oxygen supplementation was 51! associated with a greater inflammatory response. 52! 53! Humberto)Machado,)2015))–)Resposta(inflamatória(do(pulmão(na(ventilação(espontânea(monopulmonar.(Estudo(experimental(no(coelho.) 119 ( ( ! 3! Key words: oxygen supplement, lung inflammatory response, spontaneous one-lung 54! ventilation 55! Humberto)Machado,)2015))–)Resposta(inflamatória(do(pulmão(na(ventilação(espontânea(monopulmonar.(Estudo(experimental(no(coelho.) 120 ( ( ! 4! Introduction 56! The complex relations and interactions of volutrauma (overdistension), 57! barotrauma (increased pulmonary pressures), atelectotrauma (cyclic opening and 58! closing of alveoli) and biotrauma (inflammatory mediators) play an important role on 59! development of ventilator induced lung injury (VILI) [1][2]. Mechanical ventilation can 60! influence the extent and course of perioperative well-being [3] [4]. Even healthy 61! individuals when submitted to mechanical ventilation are prone to develop lung injuries 62! [5]. Recent studies suggest that even protective ventilatory strategies may induce 63! subclinical ventilation lung injury in previous healthy lungs, by initiation of subclinical 64! VILI, and possibly by sensitizing the lung to a second hit [4]. 65! Using near physiological tidal volumes, approximately 6 ml/kg as standard 66! mammalian spontaneous tidal volumes strategy [6] [7], may imply some atelectasis 67! formation. This condition will be present due to local alveolar collapse, with a 68! subsequent formation of shunt and hypoxia. Moreover, an augmented inspired oxygen 69! fraction will commonly be used to mitigate this condition, which will generate 70! hyperoxia in aerated lung. Hypoxia can generate inflammation [8] and hyperoxia can 71! worsen atelectasis and lead to excess of reactive oxygen species, all worsening acute 72! lung injury (ALI) [9][10][6]. 73! In the one-lung ventilation (OLV) situations, tidal volumes < 6 ml/kg, positive 74! end-expiratory pressure (PEEP) between 5 and 10 cm H2O, and the lowest possible 75! oxygen inspired fraction (FiO2) to maintain peripheral oxygen arterial saturation over 76! 90 %, are the main features for a protective ventilatory strategy [11]. The lowest FiO2 77! possible to provide adequate peripheral saturation has been accepted as the best option 78! to reduce oxidative damage and to prevent absorption atelectasis [12] [13] [11]. 79! Nevertheless, spontaneous OLV, on its own, has been observed as a condition in which 80! Humberto)Machado,)2015))–)Resposta(inflamatória(do(pulmão(na(ventilação(espontânea(monopulmonar.(Estudo(experimental(no(coelho.) 121 ( ( ! 5! inflammation is more present when compared to a spontaneous two-lung ventilation 81! mode [14]. 82! The objective of this study was to evaluate the contribution of oxygen 83! supplementation to the occurrence of acute inflammatory response in both lungs, in an 84! OLV model using a spontaneous breathing mode. In this regard, the study hypothesis is 85! that oxygen will not influence the occurrence of inflammation in this model, since OLV 86! is present, but no controlled ventilation is applied. 87! 88! 89! 90! 91! 92! 93! 94! 95! 96! 97! 98! 99! 100! 101! 102! 103! 104! 105! Humberto)Machado,)2015))–)Resposta(inflamatória(do(pulmão(na(ventilação(espontânea(monopulmonar.(Estudo(experimental(no(coelho.) 128 ( ( ! 12! Discussion 256! Both groups exhibit some degree of inflammation, evidenced by the appearance 257! of at least mild inflammation in all subjects. This fact confirms the tendency of OLV is 258! prone to the occurrence of acute lung injury in spontaneous breathing subjects [14], 259! reinforced by evidence that near physiologic tidal volumes may also be somehow 260! harmful [17]. 261! The occurrence of more pronounced inflammatory response on those animals 262! supplemented with oxygen when compared to those on room air ventilation (p< 0,001), 263! confirms that a certain degree of oxygen content might induce an enhanced population 264! of acute inflammatory cells. Hyperoxia itself might induce atelectasis formation and 265! diminish the aerated areas of the lung [4], inducing the occurrence of non ventilated 266! areas that are prone to generate local hypoxia and acidic environments. 267! In this study it is possible to observe a higher mean oxygen partial pressure 268! (PaO2) in the OS group, as expected. These higher quantities of oxygen might be 269! responsible for a greater inflammatory response on this group, on top of the effect seen 270! after atelectasis formed by the left lung collapse. Inflammatory mechanisms are 271! enhanced by local tissue hypoxia [18], and the superimposed oxygen exposure itself, 272! would trigger reactive oxygen intermediates (ROI) formation and the induction of 273! further mechanisms of inflammatory cellular response [13]. 274! Our study confirms that the use of physiological tidal volumes and room-air 275! oxygen inspired fraction, may reduce the possibility of the occurrence of significant 276! acute inflammatory response; especially in the cases in which one-lung ventilation is 277! used. 278! Our results, either in mild or moderate inflammatory plates, as expected, the 279! acute inflammatory infiltrate is composed of polymorphonuclear leucocytes, however, 280! Humberto)Machado,)2015))–)Resposta(inflamatória(do(pulmão(na(ventilação(espontânea(monopulmonar.(Estudo(experimental(no(coelho.) 129 ( ( ! 13! more than 75% of the cells found are eosinophils. Existing evidence shows that there is 281! an important link between hypoxia and eosinophil function [19]; hypoxic stress induces 282! the transcription of several factors, like the hypoxia inducible factor (HIF-1), 283! responsible for oxygen homeostasis [20][21], and changes in eosinophil cellular profile 284! enhancing its ability to migrate thru blood vessels, decreasing cellular apoptosis, and 285! prolonging its half-life [22] [23][19]. 286! First measurements of RR, SpO2 and HR were significantly different between 287! groups (p<0.05), but this is expected since the first measurement was done after the 288! setup was ready, meaning Group 1 already had oxygen supplementation. This fact 289! might explain the lower RR in the OS group, because of a lesser need to compensate 290! hypoxia; likewise the higher SpO2 was expected in the OS group, nevertheless it raise 291! from the first to last measurement in both groups. Temperature decrease in both groups 292! mainly because passive cooling was present but with no clinical significance. The 293! higher HR observed in the NOS group (4,9%, p<0.05) might be linked to a higher 294! hypoxic representation. 295! 296! Median pO2 value is higher in the OS group; this fact supports the higher 297! median respiratory rate of NOS Group, as mentioned above. NOS group oxygenation 298! was consistently sub-normal, since only room air was used for ventilation, and this is 299! confirmed by the lower pO2 values. Median pO2 increased in both groups, but in a 300! greater extent in OS group (p< 0.001), which was expected since oxygen 301! supplementation allowed a greater rise than a room-air oxygen fraction used in NOS 302! group. NOS Group had a significantly increase of Sat O2, by 15.7%, this fact might be 303! explained by the effort for normalization of the rather initial systemic hypoxic 304! conditions; nevertheless, the observed lower inflammation response in this group 305! Humberto)Machado,)2015))–)Resposta(inflamatória(do(pulmão(na(ventilação(espontânea(monopulmonar.(Estudo(experimental(no(coelho.) 130 ( ( ! 14! confirms that oxygen supplementation might not be an adequate solution of this 306! problem since it might improve oxygenation but aggravated local conditions, and 307! induce more pronounced inflammatory response. 308! These data point out that a highly oxygenated group (when compared to a rather 309! hypoxic one) exhibited a more pronounced acute inflammatory response in an OLV 310! spontaneous ventilation model; in accordance to the available evidence. Moreover, since 311! no controlled ventilation has been used, it is fare to assume that these results confirm 312! that what is known about oxygen, regarding controlled ventilation, also applies to 313! spontaneous ventilation. 314! At harvesting the lungs, the left lung was consistently collapsed and the right 315! lung aerated, and both were untouched by any means, leaving them as their stood at the 316! time of animal euthanasia. This methodology was used exactly to avoid any possible 317! bias that might occur due to the use of a ventilator or organ manipulation. 318! Mechanotransduction is the involved mechanism that transforms extreme physical lung 319! forces into cellular signaling that induces polymorphonuclear leucocyte (PMN-L) 320! recruitment, activation and apoptosis/necrosis balance [4]. These cells play a major role 321! when activated by inflammatory mediators, which can be released without evidence of 322! tissue damage; this phenomenon has been named as loss of compartmentalization [4], 323! and its major consequence is the overall spillage of inflammatory mediators (biotrauma) 324! not only locally but also systemically, aggravating eventual ongoing ALI but also 325! having consequences in distal organs [4]. 326! Since the inflammatory response impact is bilaterally present [24] [25], a 327! systemic explanation is may be involved in this process, which explains why moderate 328! inflammation plates were found in both lungs. 329! 330! Humberto)Machado,)2015))–)Resposta(inflamatória(do(pulmão(na(ventilação(espontânea(monopulmonar.(Estudo(experimental(no(coelho.) 131 ( ( ! 15! The main findings in this study include: 331! • In a spontaneous OLV, oxygen supplementation further increases the occurrence 332! of lung inflammation. 333! • In spontaneous OLV inflammation occurrence is of a bilateral nature, including 334! the ventilated and the non-ventilated lung 335! • Inflammation cellular type includes polymorphonuclear leucocytes neutrophils 336! and eosinophils, in an average of 20/80%, respectively. 337! 338! The main conclusion of this study is that during procedures prone to the 339! development of acute lung injury, namely thoracic operations with one-lung ventilation, 340! or when safety margins are tight, common biotrauma triggers, as inspired oxygen 341! fraction, should be used with extreme caution, and thoroughly monitored; thus, oxygen 342! utilization in the operative setting should be confined to the lowest inspired fraction 343! possible, even in near physiologic tidal volumes in OLV situations. 344! 345! Study limitations found during our work may be associated with the length of 346! the procedure, since a longer exposure might have enhanced the findings. Likewise, this 347! model is not similar to what is usually done in operating room for thoracic procedures; 348! thus, this model´s characteristics might be of significance for its ability to avoid 349! interpretation bias (controlled ventilation, surgical manipulation), but, at same time 350! might raise some difficulties to be compared to the classical clinical setting. Further 351! studies to allow a closer resemblance to the common clinical approach may add value to 352! the overall comprehension of this issue. 353! 354! 355! Humberto)Machado,)2015))–)Resposta(inflamatória(do(pulmão(na(ventilação(espontânea(monopulmonar.(Estudo(experimental(no(coelho.) 132 ( ( ! 16! Acknowledgements 356! The authors would like to thank Mr. Costa e Silva for coordinating the housing and 357! husbandry of animals, Mrs. Manuela Silva for help in laboratory tasks, and Dr. Ana 358! Pinto and Dr. Madalena Costa for histological assembling and preparation. 359! The authors would like to thank Centro Hospitalar do Porto for the funding granted for 360! the purchase of animals, animal food, and other husbandry expenses, as also the 361! Anesthesia Department at Centro Hospitalar do Porto for funding the edition and 362! publication of this study. 363! 364! Disclosures 365! This study received funding from Centro Hospitalar do Porto (Largo Abel Salazar, 4099-001 366! Porto, Portugal) for logistic purposes, animal purchase, housing and husbandry. The 367! Anesthesia Department at Centro Hospitalar do Porto (Largo Abel Salazar, 4099-001 Porto, 368! Portugal) funded expenses regarding edition and publication. No funding was granted to 369! any author. 370! 371! 372! 373! 374! 375! 376! 377! 378! 379! Humberto)Machado,)2015))–)Resposta(inflamatória(do(pulmão(na(ventilação(espontânea(monopulmonar.(Estudo(experimental(no(coelho.) 133 ( ( ! 17! References 380! 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OS Group (Oxygen supplemented) NOS Group (Non-oxygen supplemented) First Recording Last Recording First Recording Last recording RR, b/m 78(58-96) 79(62-96) 103(71-118) 102(74-142) HR, bpm 211.5 (170-230) 187.5(161-204) 183(150-206) 192(172-237) SpO2, % 92.5 (85-100) 99(94-100) 85(80-92) 95.5(90-98) Temperature, ºc 38 (38-38) 36(35.5-37) 38(38-40) 37(36-38) 448! In the first recording, RR, HR, and SpO2 were statistically different between groups 449! (p<0.01). In the last recording RR, SpO2 and Temperature were statically different 450! between groups (p<0.05). Between the 1st and last recording, SpO2 increased and the 451! Temperature decreased significantly in both groups (p<0.05). HR increased only in 452! Group 1 (p<0.05). Values are presented as mean (range). HR: heart rate; RR: respiratory 453! rate; SpO2: peripheral oxygen arterial saturation; bpm: beats per minute; b/m: breaths 454! per minute. 455! 456! 457! 458! 459! 460! 461! Humberto)Machado,)2015))–)Resposta(inflamatória(do(pulmão(na(ventilação(espontânea(monopulmonar.(Estudo(experimental(no(coelho.) 136 ( ( ! 20! Figure 1 - Arterial blood gas analysis 462! Arterial blood gas analysis at beginning of procedure (first sample) and at end of 463! procedure (second sample) in OS Group (oxygen supplemented) and NOS Group (non-464! oxygen supplemented).!465! 466! 467! 468! 469! 470! Humberto)Machado,)2015))–)Resposta(inflamatória(do(pulmão(na(ventilação(espontânea(monopulmonar.(Estudo(experimental(no(coelho.) 137 ( ( ! 21! Table 2 – Occurrence of moderate and mild inflammatory response in the oxygen 471! supplemented Group (OS) (n=80: 8 plates per rabbit) and non-oxygen 472! supplemented Group (NOS) (n=80: 8 plates per rabbit) groups (Chi-Square 473! p<0.001). 474! 475! Moderate inflammatory response Light inflammatory response Total OS Group 12 68 80 NOS Group 6 74 80 Total 18 142 160 476! Humberto)Machado,)2015))–)Resposta(inflamatória(do(pulmão(na(ventilação(espontânea(monopulmonar.(Estudo(experimental(no(coelho.) 144 5.2 Série 2 Os resultados nesta série de estudo mostram que a resposta inflamatória encontrada foi mais pronunciada no grupo que recebeu suplementação de oxigénio, com um ambiente hiperóxico, facto também encontrado noutros estudos [76][77][36], contudo a população celular encontrada como constituinte do infiltrado inflamatório agudo foi de polimorfonucleares neutrófilos e eosinófilos numa proporção de cerca de 20-25% para 75-80%, respetivamente. Esta observação apesar de pouco esperada pode ser explicada pela evidência que existe na literatura; as células que mais frequentemente aparecem como população preponderante numa resposta inflamatória aguda no pulmão poderão ser leucócitos polimorfonucleares neutrófilos e/ou monócitos/macrófagos [18][78][59], contudo a implicação da série mieloide na resposta inflamatória tem sido ligada ao modelo hipóxico, quando existe acumulação de lactato e acidose metabólica [59]. É reconhecido que os eosinófilos estão capacitados para fazer frente a vários organismos e habilitados a causar danos em tecidos e causar doença [60]. Além disso também exibem algumas propriedades que podem suportar o facto de terem sido as células predominantes na analise histológica que foi efetuada [60]. Estas características incluem a sua possibilidade de migrar através das células endoteliais sem desgranulação e sem induzir vasculite, a sua capacidade de Humberto)Machado,)2015))–)Resposta(inflamatória(do(pulmão(na(ventilação(espontânea(monopulmonar.(Estudo(experimental(no(coelho.) 145 aderência após enrolamento mínimo para mudar a sua forma, e a sua rápida distribuição na camada única de células endoteliais [60]. A questão que pode ser levantada relativamente ao estado de saúde dos animais utilizados no estudo, ou seja uma eosinofilia sistémica que pudesse estar subjacente, é excluída pelo resultado dos hemogramas efetuados no inicio e no fim do procedimento que mostraram valores celulares totalmente normais, com especial importância da quase ausência de eosinófilos no sangue periférico (figura 5). Este facto afasta a hipótese de poder existir uma qualquer co-morbilidade na população de animais utilizada para o estudo, que pudesse ser responsável pela preponderância eosinofílica encontrada. O facto do infiltrado inflamatório encontrado ter sido mais expressivo no grupo com suplementação com oxigénio, neste caso com predominância de eosinófilos, pode parecer conflituar com estudos que mostram que a hipóxia pode ser um modulador da função eosinofílica [62], sendo que esta pode ser expressa como uma sobre regulação da sua sobrevivência destas células [62]. Com efeito, a suplementação de oxigénio, muitas vezes necessária para combater a hipóxia sistémica, tem como efeito lateral a remoção de nitrogénio dos alvéolos, conferindo-lhes a natural tendência a colapsarem após a absorção do oxigénio, gerando-se assim pequenas áreas de atelectasias de absorção [46][47], com a consequente criação de ambientes locais hipóxicos, de baixo pH, Humberto)Machado,)2015))–)Resposta(inflamatória(do(pulmão(na(ventilação(espontânea(monopulmonar.(Estudo(experimental(no(coelho.) 146 geradores de shunt arterio-venoso (ambiente perfundido e não ventilado). Nesta série de estudo, os animais com suplementação de oxigénio tiveram inflamação mais pronunciada do que os que respiraram ar ambiente, sem que a duração do procedimento influenciasse os resultados. Este facto está bem documentado, uma vez que o oxigénio é um conhecido agente iniciador de inflamação [76][77][36]. A associação de ventilação controlada e hiperóxia é conhecida como sinérgica para o aparecimento da uma lesão pulmonar associada ao ventilador [18]. Os resultados encontrados, no nosso modelo de ventilação espontânea, representam um novo olhar sobre esta matéria, na medida em que a evidência prévia (também em coelhos), mostrava apenas, que em modelos de curta duração, em ventilação controlada, poderia não existir um despoletar de inflamação pulmonar [79]. Como anteriormente referido, o objetivo de estudo da presente série era saber qual o impacto da suplementação de oxigénio em ventilação espontânea, sendo que se verificou que quando comparado com o ar ambiente condicionou uma reposta inflamatória bastante mais expressiva. Assim, será razoável assumir que se o oxigénio for utilizado (mesmo num tempo reduzido de exposição de por exemplo 20 minutos), em ventilação espontânea, uma resposta inflamatória poderá ser despoletada e subsequentemente aumentada até uma Humberto)Machado,)2015))–)Resposta(inflamatória(do(pulmão(na(ventilação(espontânea(monopulmonar.(Estudo(experimental(no(coelho.) 147 expressão moderada, de acordo com os critérios histológicos definidos. A formação de atelectasias por exposição ao oxigénio está amplamente descrita na literatura [75][46] este facto pode explicar porque a suplementação de oxigénio pode vir a provocar um efeito local contrario (hipóxia), pela circunstância de existir uma absorção rápida do oxigénio administrado, perdendo-se o natural sustentador do alvéolo que é o azoto do ar respirável [46][47]. As modificações locais e a sinalização inflamatória modificam os ciclos celulares e a suas propriedades dando origem aos infiltrados inflamatórios que se encontram nestas condições [80][75]. As diferenças nos primeiros registos de frequência respiratória que foram observados nos animais desta série, podem dever-se ao facto de que o grupo de suplementação com oxigénio também tinha melhores valores de pO2; assim, poder-se-á assumir que a frequência respiratória inicial do grupo sem suplemento de oxigénio poderá ser devida a um esforço suplementar para compensar algum grau de hipóxia sistémica, que foi evidenciado por uma pO2 mais baixa neste grupo (figura 8 e 9). Estes factos eram esperados e a evolução do trabalho experimental provou que esta frequência respiratória mais elevada do grupo sem suplemento de oxigénio acabou por aumentar a pO2 no final do procedimento (figura 9). Humberto)Machado,)2015))–)Resposta(inflamatória(do(pulmão(na(ventilação(espontânea(monopulmonar.(Estudo(experimental(no(coelho.) 148 5.3 Série 3 Ambos os grupos de coelhos apresentaram algum grau de inflamação pulmonar, evidenciado pelo aparecimento de pelo menos inflamação ligeira em todos os animais. Este facto confirma a propensão que a VMP tem para que esta resposta inflamatória se desenvolva [71], confirmando a ideia de que valores de volume corrente próximos de valores fisiológicos podem também ser deletérios [81]. A ocorrência de uma resposta inflamatória mais pronunciada nos animais em VMP com suplemento de oxigénio, quando comparados com animais em VMP sem este suplemento (p<0,001), confirma que o oxigénio suprafisiologico, pode aumentar a resposta inflamatória em VMP espontânea. Este facto é novo, uma vez que estudos pregressos foram realizados em ventilação controlada, sendo que o mecanismo avançado seria a possibilidade do oxigénio per si, induzir o aparecimento de áreas não ventiladas, com a consequente instalação de ambientes locais hipóxicos, acídicos e com a respetiva repercussão inflamatória [75]. Nesta série de experiências, foi possível documentar uma pressão parcial de oxigénio superior no grupo de coelhos com suplementação de oxigénio, tal como esperado. Este facto poderá explicar a maior resposta inflamatória neste grupo de animais, apesar de todos os coelhos em estudo estarem a ser submetidos a VMP e Humberto)Machado,)2015))–)Resposta(inflamatória(do(pulmão(na(ventilação(espontânea(monopulmonar.(Estudo(experimental(no(coelho.) 149 portanto com uma atelectasia induzida, que se traduzia pelo colapso total de um dos pulmões, com o consequente efeito de shunt. É sabido que os mecanismos geradores de inflamação são aumentados pela hipóxia tecidular [82], sendo que a exposição a oxigénio imposta no grupo com suplementação, pode por si só induzir mecanismos de resposta celular inflamatória por produção local de ROS [83][84]. A avaliação histológica dos pulmões destes coelhos mostrou uma resposta inflamatória ligeira e moderada, composta por polimorfonucleares neutrófilos e eosinófilos, sendo estes últimos mais de 75% dos granulócitos. Sabe-se que a hipóxia estimula os eosinófilos [62], já que o ambiente hipóxico induz a transcrição de alguns fatores, como o fator indutor de hipóxia (HIF-1), responsável pela homeostasia do oxigénio [85][86], mas também é causador de alterações no perfil celular dos eosinófilos, aumentando a sua capacidade de mobilização através de vasos sanguíneos (diapedese), diminuindo ainda a apoptose celular e prolongando a sua semivida [60][61][62]. As primeiras medidas de frequência respiratória (FR), saturação arterial periférica de oxigénio (SpO2) e frequência cardíaca (FC) foram significativamente diferentes entre os dois grupos de coelhos (p<0,05), facto que era esperado uma vez que estes registos foram efetuados imediatamente após a conclusão do set-up experimental, ou seja já existindo suplementação com oxigénio ao grupo 1 de animais (OSG). Este facto pode explicar porque a FR era mais baixa neste Humberto)Machado,)2015))–)Resposta(inflamatória(do(pulmão(na(ventilação(espontânea(monopulmonar.(Estudo(experimental(no(coelho.) 150 grupo de coelhos, ou seja, seria necessário menor esforço compensatório para uma situação em que a hipóxia sistémica não estava presente. Pela mesma razão se observou uma SpO2 mais elevada no grupo com suplementação de oxigénio, sendo que, contudo, a SpO2 aumentou nos dois grupos da primeira para a última medição. A temperatura corporal diminuiu nos dois grupos de animais essencialmente devido a arrefecimento passivo fenómeno ao qual não se atribuiu relevância, não só pelo facto da diminuição não ter sido diferente entre os dois grupos, como também porque não se encontra uma ligação entre este facto com o objetivo do estudo, a resposta inflamatória pulmonar. A maior frequência cardíaca observada no grupo sem suplementação de oxigénio (4,9% com p<0,05) pode estar ligada uma maior representação hipóxica sistémica. De facto, é admissível que numa fase inicial o incremento ou o estabelecimento de um ambiente hipóxico, com acidose subsequente, possa desencadear um estímulo simpático de aumento de débito cardíaco compensatório, aqui traduzido pelo aumento de frequência cardíaca. A mediana da pO2 (pressão parcial de oxigénio arterial) foi superior no grupo com suplementação de oxigénio, este facto suporta a maior frequência respiratória inicial no grupo sem suplementação de oxigénio. A oxigenação no grupo sem suplemento de oxigénio (NOSG) foi consistentemente subnormal, uma vez que apenas foi usado ar Humberto)Machado,)2015))–)Resposta(inflamatória(do(pulmão(na(ventilação(espontânea(monopulmonar.(Estudo(experimental(no(coelho.) 151 ambiente na ventilação, sendo esta circunstância confirmada pelos valores inferiores de pO2. A mediana de valores de pO2 aumentou nos dois grupos de coelhos, mas com maior expressão no grupo de animais sujeitos a suplementação com oxigénio (OSG) (p<0,001), o que era esperado dado existir maior margem de aumento. No grupo NOSG existiu um aumento significativo da SpO2, de cerca de 15,7%, o que pode ser explicado pelo esforço de normalização da hipoxemia inicial. Contudo, o menor grau de inflamação pulmonar observada neste grupo de coelhos confirma que a suplementação de oxigénio no grupo OSG pode não ser a melhor solução para reverter hipoxemia em VMP, pelo menos numa dose que tenha como objetivo a subida da pO2 para perto de valores normais. Assim, e tendo em consideração que será benéfico que a resposta inflamatória não seja tão marcada, pode estar indicado que se admita uma certa hipóxia sistémica permissiva, com vista a que se evite o aparecimento de regiões de hipóxia focal decorrentes da suplementação com oxigénio. Apesar de aparentemente contraditório, há argumentos para se considerar a vantagem de evitar um tratamento muito intenso da hipóxia sistémica, porque a terapêutica de oxigénio a aplicar, poderá ela própria desencadear inflamação pulmonar e agravar a fisiologia pulmonar, com o subsequente risco de desenvolvimento de ALI ou de ARDS. Humberto)Machado,)2015))–)Resposta(inflamatória(do(pulmão(na(ventilação(espontânea(monopulmonar.(Estudo(experimental(no(coelho.) 152 Os nossos resultados sugerem que o grupo de coelhos com oxigenação supranormal (quando comparado com um grupo de animais que manteve a sua ventilação espontânea monopulmonar ao ar ambiente, portanto relativamente hipóxico do ponto de vista sistémico), desenvolve uma mais intensa resposta inflamatória aguda, pelo menos neste modelo VMP espontânea. Estes resultados obtidos em coelhos em VMP confirmam a ação deletéria do excesso de oxigénio já conhecida em modelos de ventilação controlada monopulmonar. A histologia mostrou que o pulmão esquerdo estava consistentemente colapsado e o direito arejado, tendo ambos sido colhidos e diretamente colocados na solução de fixação. Esta diferença não pode ser atribuída a qualquer tipo de manipulação dos pulmões, algo que especificamente não foi realizado. A não utilização de ventilação controlada, também eliminou esse potencial factor flogístico para o pulmão. Existem alguns mecanismos que podem explicar a ocorrência de uma resposta inflamatória em ambos os pulmões. De referir que no presente estudo não se encontraram diferenças entre os dois lados. A mecanotransdução e a compartimentalização são fenómenos que resultam da transformação de determinadas forças físicas em sinalização inflamatória celular, o que, num ambiente propício à sua ocorrência pode despoletar e/ou aumentar todo um processo flogístico [75]. Humberto)Machado,)2015))–)Resposta(inflamatória(do(pulmão(na(ventilação(espontânea(monopulmonar.(Estudo(experimental(no(coelho.) 153 A existência de marcadores pró-inflamatórios em circulação (biotrauma), num contexto de resposta inflamatória sistémica, pode também agravar uma lesão pulmonar aguda que esteja em evolução, apoiando a noção de agressão sistémica, que suporta a bilateralidade das alterações histológicas encontradas nesta série de animais, como em outros estudos anteriores [33][35].