Rela ó io Final de Es ágio
Mes ado In eg ado em Medicina Ve e iná ia
A aliação da oxicidade do an ibió ico doxiciclina
isoladamen e e na p esença de mic oplás icos na
mic oalga ma inha Te aselmis chuii
Joana Co eia P a a
O ien ado (es)
P o esso a Dou o a Lúcia Guilhe mino
Co-O ien ado (es)
P o esso a Dou o a Bea iz La o an e
Po o 2016
Rela ó io Final de Es ágio
Mes ado In eg ado em Medicina Ve e iná ia
A aliação da oxicidade do an ibió ico doxiciclina
isoladamen e e na p esença de mic oplás icos na
mic oalga ma inha Te aselmis chuii
Joana Co eia P a a
O ien ado (es)
P o esso a Dou o a Lúcia Guilhe mino
Co-O ien ado (es)
P o esso a Dou o a Bea iz La o an e
Po o 2016
i
Resumo
Os objec i os do es ágio cujas ac i idades se esumem no p esen e Rela ó io o am (i)
adqui i eino nos mé odos de cul u a da mic oalga ma inha Te aselmis chuii (ii) a alia a
oxicidade de dois g upos de con aminan es ambien ais eme gen es, nomeadamen e á macos
e mic oplás icos. Numa p imei a ase, o am ap endidas me odologias pa a cul u a da
mic oalga em condições labo a o iais, e ec uado um bioensaio u ilizando a subs ância de
e e ência dic oma o de po ássio pa a a aliação do es ado de saúde das cul u as, op imizada
me odologia pa a a de e minação das concen ações eais e de decaimen o e ealizada uma
ex ensa e isão bibliog á ica. De seguida, o am es adas as seguin es hipó eses: H01 – A
doxiciclina não é óxica pa a T. chuii a concen ações de exposição na o dem das pa es po
milhão (ppm); H02 – Os mic oplás icos não são óxicos pa a T. chuii a concen ações de
exposição na gama in e io das pa es po milhão (ppm); H03 – A p esença de mic oplás icos na
água não in luencia a oxicidade da doxiciclina p a T. chuii. Pa a es a as hipó eses o am
ealizados 3 bioensaios oxicológicos com T. chuii com a du ação de 96 ho as, endo como
c i é io do e ei o óxico a inibição do c escimen o. No bioensaio, a doxiciclina inibiu o
c escimen o da mic oalga com uma concen ação e ec i a mediana (CE50) de 19,52 mg/l,
ejei ando-se a hipó ese H01. Nas concen ações es adas, os mic oplás icos não ap esen a am
inibição signi ica i a das mic oalgas, acei ando-se a hipó ese H02. No bioensaio da doxiciclina
na p esença de mic oplás icos ob e e-se CE50 de 11,90 mg/l e a análise es a ís ica pe mi iu
ejei a H03. Os esul ados pe mi em suge i que a p esença de mic oplás icos no meio
in luencia a oxicidade de alguns á macos, podendo o na-los mais óxicos, como no caso da
doxiciclina. Es e e ei o pode á le a à subes imação do impac o de poluen es nos o ganismos e
ecossis emas, sendo necessá io ap o unda o conhecimen o sob e a oxicidade de ou as
subs âncias na p esença de mic oplás icos.
ii
Ag adecimen os
Que o ag adece à minha o ien ado a, a P o esso a Dou o a Lúcia Guilhe mino, pela
disponibilidade e pelos ensinamen os. E à P o esso a Dou o a Conceição B anco pelo apoio
p es ado.
À minha co-o ien ado a, a P o esso a Dou o a Bea iz La o an e, po me acompanha
no es ágio, pela sua disponibilidade e paciência que me ajuda am a desen ol e os
conhecimen os e écnicas na á ea.
Aos colegas de labo a ó io, pela simpa ia e apoio p es ado ao longo do es ágio.
Á minha amília e amigos, pela comp eensão e apoio. E ao meu namo ado, o João
Noguei a, pela mo i ação e companhia.
Es e abalho oi desen ol ido no âmbi o do p oje o “EPHEMARE – Eco oxicicological
e ec s o mic oplas ics in ma ine ecosys ems”, p oje o ap o ado no âmbi o da JPI Oceans, Call
mic oplas ics, sendo a componen e po uguesa inanciada pela Fundação pa a a Ciência e a
Tecnologia ( e e ência: JPIOCEANS/0004/2015).
iii
Índice
1. In odução ..................................................................................................................... 1
2. Mé odos ......................................................................................................................... 6
2.1. Cul u a de Te aselmis chuii ...................................................................................... 6
2.1.1. Ma e ial ....................................................................................................... 6
2.1.2. Meio En iquecido F/2 de Guilla d ................................................................ 6
2.1.3. Cul u as de manu enção de Te aselmis chuii ............................................ 7
2.2. Mé odos pa a de e minação do compo amen o das subs âncias es adas .............. 7
2.3. Condições dos Bioensaios ........................................................................................ 8
2.4. Análise es a ís ica...................................................................................................... 8
3. Resul ados e Discussão ............................................................................................. 10
3.1. Me odologia pa a cul u a da mic oalga e bioensaios ............................................... 10
3.1.1. Cul u a de Te aselmis chuii ...................................................................... 10
3.2. Tes e de e e ência com dic oma o de po ássio ...................................................... 11
3.2.1. Mé odos pa a de e minação do compo amen o das subs âncias es adas
................................................................................................................. 11
3.2.2. Bioensaio com dic oma o de po ássio ....................................................... 12
4. Bioensaios ................................................................................................................... 14
4.1. Me odologia pa a cul u a da mic oalga e bioensaios ............................................... 14
4.2. A aliação dos e ei os óxicos ................................................................................... 15
4.2.1. Bioensaio com doxiciclina ......................................................................... 16
4.2.2. Bioensaio com mic oplás icos ................................................................... 20
4.2.3. Bioensaio com doxiciclina na p esença de mic oplás icos ........................ 21
5. Conclusão .................................................................................................................... 25
6. Bibliog a ia .................................................................................................................. 26
Anexos ......................................................................................................................... 31
Anexo I: Meio en iquecido F/2 de Guilla d ............................................................... 31
Anexo II: Tabelas de pH dos bioensaios .................................................................. 32
Anexo III: Espec os de abso ção dos compos os ................................................... 34

1
1. In odução
A p esença global de con aminan es ambien ais de o igem an opogénica pode á e
impac o nega i o nos ecossis emas a longo p azo (Nunes e al. 2005). Da ele ada di e sidade de
con aminan es ambien ais, os designados con aminan es ambien ais eme gen es susci am
ac ualmen e ele ada p eocupação de ido às lacunas que ainda exis em sob e a sua oxicidade e
aos e ei os que podem causa na saúde animal e humana po exposição ambien al. Po exemplo,
os plás icos êm uma dis ibuição uni e sal nos oceanos e a sua p odução con inua a aumen a ,
sendo que em 2014 a p odução mundial oi de 311 milhões de oneladas (Plas icsEu ope 2015;
Thompson 2009). Ao so e em agmen ação o iginam pa ículas he eo ogéneas, de amanho
in e io a 5 mm, denominados mic oplás icos (de inido pela Na ional Oceanog aphic and
A mosphe ic Agency). De ido à agmen ação de de i os plás icos maio es e à sua len a
deg adação, a quan idade de mic oplás icos nos oceanos ende a aumen a , mesmo que sejam
aplicadas medidas pa a e i a a en ada de plás icos no ambien e (Thompson 2009). Os á macos
são subs âncias eme gen es de ele ada p eocupação (Milić e al. 2013). A bioac i idade ine en e,
combinada com a ele ada solubilidade em água, baixa deg adação e ele ados alo es
exc e ados sem me abolização pode ão, em alguns casos, causa e ei os ad e sos nos
ecossis emas e na saúde pública (Milić e al. 2013). O consumo de an ibió icos, á macos que
inibem o c escimen o ou eliminam bac é ias, em aumen ado anualmen e, sendo usados em
medicina humana, e e iná ia e aquacul u a (Milić e al. 2013). A p esença de an ibió icos no
ambien e aquá ico, apesa de em baixas concen ações, em sido causa de p eocupação, pois
podem o igina esis ências bac e ianas e e impac o nos ecossis emas aquá icos e saúde
humana (Milić e al. 2013).
As e aciclinas são an ibió icos de la go espec o usados em medicina humana e
e e iná ia, sendo um dos an ibió icos mais p e alen e em águas esiduais (Milić e al. 2013).
Fo am descobe as em 1948 após o isolamen o da clo e aciclina de uma cul u a de
S ep omyces au eo acien e de i ados o am ob idos po a iação dos ligandos dos ca bonos 5,
6 e 7 (Chop a e Robe s 2001; G aeme e Pollack 1996). As e aciclinas ul apassam a memb ana
de o ganismos g am nega i os como um complexo magnesio- e aciclina e a dos g am posi i os
na sua o ma lipo ilica simples (Chop a e Robe s 2001; G aeme e Pollack 1996; Ka sung e al.
2012; Riond e Ri ie e 1988). No ci oplasma, ligam-se e e si elmen e a um local de ele ada
a inidade na subunidade 30s do ibossoma bac e iano. Des a o ma, impedem a ligação do
aminoace il- RNA ao local ecep o do mRNA, p e enindo a adição de aminoácidos ao pép ido
2
em o mação, e impossibili ando a ansc ição e consequen emen e o c escimen o bac e iano
(acção bac e ios á ica) (Chop a e Robe s 2001; G aeme e Pollack 1996; Ka sung e al. 2012;
Riond e Ri ie e 1988). A o mação de complexos com ca iões bi alen es ambém pode es a
en ol ida na ac i idade an imic obiana das e aciclinas e in e e i com a sua abso ção e
dis ibuição (Campbell e Hasino 1991; Ka sung e al. 2012; Riond e Ri ie e 1988). A doxiciclina
é uma e aciclina de segunda ge ação que ap esen a maio lipo ilicidade, maio empo de semi-
ida no so o (16 a 18 ho as) e maio ac i idade an imic obiana, com menos e ei os ad e sos
quando compa ada com as es an es e aciclinas (Chop a e Robe s 2001; Ka sung e al. 2012;
Riond e Ri ie e 1988). A o ma de clo id a o pe mi e maio solubilidade e es abilidade (Chop a e
Robe s 200; Ka sung e al. 2012; Riond e Ri ie e 1988). É u ilizada no a amen o de bac é ias
g am posi i as, g am nega i as e alguns p o ozoá ios, incidindo p incipalmen e em in ecções
espi a ó ias, da pele e ecidos moles, sis ema geni ou iná io e in abdominais (G aeme e Pollack
1996; Ka sung e al. 2012; Riond e Ri ie e 1988). Em e e iná ia, é adminis ada na água de
bebida (suínos, bo inos, a es), no alimen o (suínos) ou em comp imidos (canino, elino) (Almeida
e al. 2014). Tem exc eção enal, bilia e ecal, sendo a maio ia pela úl ima a a és da di usão
pa a o lúmen do in es ino delgado (G aeme e Pollack 1996; Ka sung e al. 2012; Riond e Ri ie e
1988). As e aciclinas êm sido de ec adas com equência no ambien e aquá ico em
concen ações de μg/l em locais como os Es ados Unidos da Amé ica e China, onde são usadas
como p omo o es de c escimen o em pecuá ia (Milić e al. 2013). Pa e da dose adminis ada é
exc e ada po ia enal e ia ecal, ha endo con aminação de biossólidos e es umes que en am
no ambien e como e ilizan es ag ícolas, podendo acumula -se de ido a aplicações eco en es
(Fe nández e al. 2004). Assim oco e exposição di ec a de o ganismos e es es, p incipalmen e
das camadas supe io es do solo, e águas de lixi iação pode ão anspo a es es compos os pa a
os ecossis emas aquá icos (Fe nández e al. 2004). A adso ção à ase sólida do solo e
complexação com me ais em biossólidos le a à acumulação de e aciclinas e edução da sua
o odeg adação, man endo-se no meio po ele ados pe íodos de empo (Fe nández e al. 2004).
A exc eção ou aplicação de doses excessi as em alimen o ou água de e aciclinas nas
aquacul u as são possí eis ias de con aminação dos ambien es adjacen es a es es sis emas,
podendo oco e acumulação no sedimen o (Hi sch e al. 1999; Rico e al. 2013). A doxiciclina
es á p esen e em biossólidos onde ap esen a um empo de dissipação en e 53 a mais de 77 dias
(Fe nández e al. 2004). Em Po ugal, a sua aplicação é p incipalmen e e e iná ia, sendo que o
uso em 2011 oi de 0,247 oneladas em medicina humana e 28 273 oneladas em medicina
e e iná ia (Almeida e al. 2014). Na aquacul u a de Pangasius no Vie nam, a doxiciclina
ep esen a 34% dos an ibió icos usados (Rico e al. 2013). No meio ma inho, o am de ec adas
3
concen ações de 0,26 ng/l na água e de no 1,33 μg/kg sedimen o em Dalian, na China (Na e al.
2013). Apesa da ápida deg adação em solução, a doxiciclina pode á ap esen a pe sis ência
de ido à in odução eco en e no ambien e (B ain e al. 2004). As e aciclinas podem ac ua em
o ganelos com maquina ia de ansc ição p oca ió ica que possuam subunidades 30S, como os
clo oplas os, le ando à diminuição da e iciência o ossin é ica, e as mi ocônd ias, oco endo a
o mação de espécies de oxigénio eac i as (Wang e al. 2015). A quelação de cálcio in acelula
em consequências na unção celula , podendo in e e i com a sín ese p o eica ou induzi e ei o
óxico (Wang e al. 2015). Em o ganimos ma inhos, a oxi e aciclina e elou e impac o sob e o
c escimen o da alga Te aselmis chuii (Fe ei a e al. 2007). Pa a a mic oalga Clo ella ulga is, a
doxiciclina ap esen ou uma concen ação de e ei o 50% às 48 ho as de 15,2 mg/l (Fe nández e
al. 2004). A aplicação eco en e de doxiciclina pode á e consequência na saúde humana
a a és do consumo de alimen os con aminados, sendo que na União Eu opeia em 2014 e 2015
o am epo ados esíduos en e 3 a 224 μg/kg em cama ões p o enien es do Vie nam (RASFF
2016).
Em 2014, na Eu opa, 39,5% da p odução de plás ico des inou-se a embalagens, sendo uma
g ande po ção desca á el (And ady 2011; Plas icsEu ope 2015). A agmen ação de plás icos
u ilizados dia iamen e ou p esen es no ambien e, sujei os a acção da adiação ul a iole a, calo
e o ças ísicas, dá o igem a mic oplás icos secundá ios (And ady 2011; Thompson 2009). A
deg adação oco e po o o-oxidação de ido à exposição a luz ul a iole a, e pode á desen ol e -
se como e mo-oxida i a (And ady 2011). De ido ao ele ado peso molecula , não oco e
biodeg adação signi ica i a, apenas agmen ação em pa ículas de meno dimensão (And ady
2011). Es a oco e p incipalmen e em p aias onde, ao con á io do oceano, há exposição a
ele adas empe a u as, in ensidades luminosas e concen ações de oxigénio (And ady 2011). Os
mic oplás icos p imá ios ap esen am-se o iginalmen e como pa ículas, em ab asi os, cosmé icos
e pelle s u ilizadas na p odução de plás icos (And ady 2011; Thompson 2009). Os mic oplás icos
ap esen am uma dis ibuição mundial no ambien e ma inho, e a ingem ele adas concen ações
na água e sedimen o, p incipalmen e em zonas de maio densidade populacional ou indus iais
(F ias e al. 2014; No én 2007; Thompson 2009). Na Suécia oi de ec ada a concen ação de 102
000 nº/m3 na água do ma adjacen e a um po o indus ial onde se p oduz polie ileno (No én
2007). Em Po ugal, en e di e sos locais es udados, os mic oplás icos são pa icula men e
abundan es na Cos a Vicen ina e em Lisboa (0,033 e 0,036 nº/m3 espec i amen e, em
zooplânc on ecolhido na cos a) (F ias e al. 2014). A con aminação da Cos a Vicen ina em uma
o igem p o á el na zona indus ial e po o de Sines (F ias e al. 2014). No gi o oceânico do
4
Paci ico sul, em 2011, a concen ação média de mic oplás icos de ec ada na água oi de 26 898
pa ículas/km2, ap esen ando maio concen ação no seu cen o, onde a ingia as 396 342
pa iculas/km2 (E iksen e al. 2013). A p esença dos plás icos no ambien e pode á se lesi a aos
o ganismos de ido ao seu e ei o em isolado a a és de danos ísicos e oxicológicos ou de ido
ao aumen o do s ess p o ocado po con aminan es adicionais onde pode ão ac ua como
ec o es (Thompson 2009, Besseling e al. 2014). Os mic oplás icos podem causa inibição no
c escimen o do i oplânc on a a és do seu e ei o de somb a, diminuição dos ní eis de clo o ila e
consequen e diminuição da o ossín ese (Besseling e al. 2014; Bha acha ya e al. 2010; Sjollema
e al. 2016). A in e nalização de mic oplás icos em algas é pouco p o á el de ido às suas
ele adas dimensões, no en an o a adso ção à supe ície pode á causa dano na pa ede celula
com o mação de po os e possí el pene ação de pa ículas (Bha acha ya e al. 2010;
Da a panah e Guilhe mino 2015). Es as pa ículas pode ão ade i à celulose na supe ície da
célula a a és de pon es de hid ogénio en e es u u as a omá icas, dependendo da ca ga de
supe ície, espécie de alga e concen ação de mic oplás icos no meio (Bha acha ya e al. 2010).
A sua adso ção pode á impedi o luxo de CO2 e nu ien es, p omo e a p odução de adicais
li es de oxigénio e comp ome e a mobilidade das células a a és da adso ção ao lagelo
(Bha acha ya e al. 2010; Sjollema e al. 2016). No en an o, num es udo ealizado em Te aselmis
chuii, u ilizando concen ações de mic oplás icos a é 1,472 mg/l não oi possí el de e mina
e ei os nega i os es a is icamen e signi ica i os (Da a panah e Guilhe mino 2015). S ess em
algumas espécies de alga esul a na libe ação de exopolissaca ídeos, que coagulam e o mam
pa ículas o iginando ag egação celula , podendo oco e inco po ação aciden al e concen ação
de mic oplás icos (Long e al. 2015). A inco po ação de mic oplás icos al e a a pe meabilidade e
aumen a a densidade dos ag egados, esul ando numa es u u a menos ac al, podendo explica
a ele ada concen ação de mic oplás icos encon ada no undo oceânico (Long e al. 2015). A
biodisponibilidade dos mic oplás icos pode se al e ada de ido à sua inco po ação em ag egados
e bio ilmes e a p esença de ma é ia o gânica pode di icul a a sua de ecção (Go okho a 2015;
Long e al. 2015). Des a o ma, os mic oplás icos pode ão aca e a isco pa a os se es i os,
como po exemplo em bi al es onde já o am encon ados em células epi eliais diges i as e no
sis ema ci cula ó io (Vande mee sch e al. 2015). Em ju enis dos peixes Poma oschis us mic ops,
os mic oplás icos causa am edução na ac i idade da ace ilcolines e ase podendo e impac os
nega i os na sua isiologia e compo amen o (Oli ei a e al. 2013). A p esença de mic oplás icos
causa diminuição da e iciência p eda ó ia dos peixes, oco endo inges ão des as pa ículas em
ez de alimen o, o que pode o igina diminuição do c escimen o, meno e iciência ep odu i a e
mo alidade, endo um impac o nega i o na população (Sá e al. 2015). No ambien e, os
11
Po úl imo, segue uma ase senescen e com mo e e diminuição da densidade de algas (C eswell
2010; Nunes e al. 2008).
As cul u as o am inoculadas de o ma a ap esen a em concen ações iniciais de 104
células/ml. Nos p imei os dois dias obse ou-se um c escimen o celula eduzido suges i o da
lag- ime phase de ido ao eduzido núme o de células das cul u as e consequen emen e da sua
capacidade de mul iplicação (Figu a 1). O pe íodo de c escimen o exponencial deco eu en e o
segundo e qua o dia de cul u a. O c escimen o celula es abilizou en e o qua o dia e o sé imo
dia, sendo suges i o do pe íodo es acioná io. No pe íodo de 96 ho as, o pH a iou en e 7,8
unidades de pH no início do es e e às 9,9 unidades de pH, o que co esponde a uma a iação
de 2,1 unidades de pH. Es a a iação ine en e ao c escimen o da mic oalga ul apassa a a iação
de 1,5 unidades de pH ecomendada pa a bioensaios pela OECD (OECD 2011).
3.2. Tes e de e e ência com dic oma o de po ássio
3.2.1. Mé odos pa a de e minação do compo amen o das subs âncias es adas
O espec o de abso ção do dic oma o de po ássio em meio F/2 (Anexo III) e elou a
p esença de dois picos a 258 nm e 370 nm, em conco dância com o e e ido na li e a u a (Sena
e al. 2000). Pa a a de e minação das concen ações de dic oma o de po ássio u ilizou-se os
alo es de abso ância medidos a 370 nm (secção 2.2.). De ido aos limi es de de ecção do
espec o o óme o, apenas oi possí el ealiza uma lei u a da abso ância com exac idão de
concen ações en e 2 e 32 mg/l. Ob e e-se uma co elação posi i a signi ica i a en e a
abso ância e a concen ação e modelo de eg essão linea ajus ado (Figu a 2).

12
Figu a 2: Modelo de eg essão linea ajus ado aos dados da abso ância e concen ação do dic oma o de po ássio em
meio F/2.
3.2.2. Bioensaio com dic oma o de po ássio
Figu a 3: Média do núme o de células com o espec i o e o pad ão da média em cada a amen o às 96 ho as em
algas expos as a dic oma o de po ássio e na ausência da subs ância (con olo – 0). Sob e as ba as é ep esen ada a
pe cen agem média de inibição do c escimen o da mic oalga em cada a amen o e ela i amen e ao c escimen o médio
do con olo. Le as di e en es indicam di e enças es a is icamen e signi ica i as en e g upos (p= 0,05) de e minadas
pelo es e de compa ações múl iplas de ukey e ec uado após a ANOVA quando es a análise indicou di e enças
signi ica i as (p= 0,05) en e a amen os.
13
Os a amen os com dic oma o de po ássio com concen ações ele adas ap esen a am
uma co ama ela ca ac e ís ica da solução des e compos o. Du an e o es e, a a iação média do
pH oi de 0,94 unidades, sendo a média do alo inicial de 7,72 e a inal 8,67 unidades de pH
(Anexo II). A a iação média da concen ação do es e à nominal oi de 7,15% e o decaimen o
médio às 96 ho as de 0,97%. Es es alo es es ão de aco do com o ecomendado pela OECD e
pe mi em alida o es e.
O dic oma o de po ássio é uma subs ância de e e ência que pe mi e a alia a
ep odu ibilidade dos es es e sensibilidade dos o ganismos de labo a ó io ao longo do empo
sendo ecomendado pa a esse e ei o nas no mas da OECD pa a á ios o ganismos
(En i onmen al Science and Technology Cen e 2007; OECD 2011). Regis a am-se di e enças
signi ica i as no c escimen o das cul u as expos as a dis in as concen ações do dic oma o de
po ássio (ANOVA, F(7, 16)= 127,976, p= 0,000) endo oco ido inibição signi ica i a do mesmo a
concen ações iguais ou supe io es a 8 mg/l. A CE50 de e minado às 96 ho as oi de 5,46 mg/l
(3,71 – 7,75 mg/l) (Figu a 3 e 4, Tabela 1). Em Chlo ella ulga is ob e e-se uma CE50 às 96 ho as
de 0,39 mg/l (Bo ecka e al. 2016), o que é suges i o de maio esis ência aos xenobió icos po
Te aselmis chuii.
Dic oma o de Po ássio (mg/l)
72 ho as
96 ho as
CE10
CE20
CE50
CE10
CE20
CE50
1,24
(0,29-2,22)
1,88
(0,62-3,04)
4,17
(2,41-6,18)
1,92
(0,74-2,99)
2,75
(1,34-3,99)
5,46
(3,71 –7,75)
Tabela 1: Valo es de CE ob idos às 72 e 96 ho as na alga Te aselmis chuii expos a a á ias concen ações de
dic oma o de po ássio.
14
Figu a 4: Cu a de oxicidade loga i mo (base 10) da concen ação de dic oma o de po ássio em mg/l e sus
ans o mação p obi da pe cen agem de inibição do c escimen o de Te aselmis chuii (y= 2,827X - 2,084).
4. Bioensaios
4.1. Mé odos pa a de e minação do compo amen o das subs âncias es adas
Pa a a aliação da possí el in e e ência na lei u a da abso ância dos compos os, o
espec o do meio F/2 oi ealizado a a és da lei u a do espec o UV en e 200 e 700 nm.
Obse ou-se um pico de abso ância máxima a 222 nm, impedindo a lei u a de compos os com
picos de abso ância in e io es a 250 nm (Anexo III).
O espec o de abso ção da doxiciclina em meio F/2 (Anexo III) e elou a p esença de ês
picos a 245 nm, 272 nm, e 375 nm, em conco dância com o e e ido na li e a u a (Lo y e al.
2016). Pa a a de e minação das concen ações de doxiciclina u ilizou-se os alo es de
abso ância medidos a 375 nm (secção 2.2.). De ido aos limi es de de ecção do
espec o o óme o, apenas oi possí el ealiza uma lei u a da abso ância com exac idão de
concen ações en e 2 e 32 mg/l. Ob e e-se uma co elação posi i a signi ica i a en e a
abso ância e a concen ação e modelo de eg essão linea ajus ado (Figu a 5).
15
Figu a 5: Modelo de eg essão linea ajus ado aos dados da abso ância e concen ação doxiciclina em meio F/2.
A cu a dos mic oplás icos oi de e minada no espec o luo ime o eco endo às
ecomendações do ab ican e usando um comp imen o de onda de exci ação de 575 nm e de
emissão de 607 nm (secção 2.2.). Ob e e-se uma co elação posi i a signi ica i a en e a
luo escência e a concen ação e modelo de eg essão linea ajus ado (Figu a 6).
Figu a 6: Modelo de eg essão linea ajus ado aos dados da luo escência e concen ação dos mic oplás icos em meio
F/2.
4.2. A aliação dos e ei os óxicos
16
4.2.1. Bioensaio com doxiciclina
No es e com doxiciclina, as concen ações mais ele adas ap esen a am uma colo ação
e melho-acas anhada (Figu a 9). Du an e o es e, a a iação média do pH oi de 0,54 unidades,
sendo a média do alo inicial de 7,89 e a inal 8,42 unidades de pH (Anexo II). A a iação média
da concen ação incial do es e à nominal oi de 14,03% e o decaimen o médio às 96 ho as de
73,64%. Os alo es de pH e a iação média da concen ação de es e à nominal cump em as
indicações da OECD, pe mi indo alida o es e. O alo de decaimen o médio ul apassa os 20%,
logo de e á conside a -se o esul ado com esul an e da acção da doxiciclina e dos seus p odu os
de deg adação.
Figu a 7: Média do núme o de células com o espec i o e o pad ão da média em cada a amen o às 96 ho as em
algas expos as a doxiciclina e na ausência da subs ância (con olo – 0). Sob e as ba as é ep esen ada a pe cen agem
média de inibição do c escimen o da mic oalga em cada a amen o e ela i amen e ao c escimen o médio do con olo.
Le as di e en es indicam di e enças es a is icamen e signi ica i as en e g upos (p= 0,05) de e minadas pelo es e de
compa ações múl iplas de ukey e ec uado após a ANOVA quando es a análise indicou di e enças signi ica i as (p=
0,05) en e a amen os.
Regis a am-se di e enças signi ica i as no c escimen o das cul u as expos as a dis in as
concen ações de doxiciclina (ANOVA, F(6, 14)= 159,604, p= 0,000) endo oco ido inibição
signi ica i a do mesmo a concen ações iguais ou supe io es a 16 mg/l. A CE50 de e minado às
96 ho as oi de 19,52 mg/l (9.9 – 35.92 mg/l) (Figu a 7 e 8, Tabela 2). Em Chlo ella ulga is ob e e-
se uma CE50 às 48 ho as de 15,2 mg/l (Fe nández e al. 2004), o que suge e meno sensibilidade
po Te aselmis chuii, em conco dância com o esul ado obse ado no bioensaio do dic oma o de
po ássio.

17
Es udos ealizados em T. chuii usando oxi e aciclina oi ob ido um CE50 às 96 ho as de
11,18 mg/l, alo in e io ao ob ido no p esen e abalho (Fe ei a e al. 2007). A oxicidade da
doxiciclina é in e io à da oxi e aciclina apesa da p imei a ap esen a maio lipo ilicidade e maio
ac i idade an imic obiana (Chop a e Robe s 2001; Riond e Ri ie e 1988). Com base no CE50
ob ido no p esen e es udo e a CE50 de 316 μg/l pa a a plan a Lemna gibba, que ap esen a
sensibilidade in e média en e algas e plan as supe io es, se ia de espe a maio oxicidade na
alga (B ain e al. 2004).
Doxiciclina (mg/l)
72 ho as
96 ho as
CE10
CE20
CE50
CE10
CE20
CE50
7,71
(1,25-3,74)
10,4
(2,79-18,11)
20,83
(10,66-37,59)
6,75
(1,01-2,32)
9,72
(2,47-16,55)
19,52
(9,90-35,92)
Tabela 2: Valo es de CE ob idos às 72 e 96 ho as na alga Te aselmis chuii expos a a á ias concen ações de
doxiciclina.
Figu a 8: Cu a de oxicidade loga i mo (base 10) da concen ação da doxiciclina em mg/l e sus ans o mação p obi
da pe cen agem de inibição do c escimen o de Te aselmis chuii (y= 2,777 x – 3,584).
A colo ação e melho-acas anhado obse ada nas concen ações supe io es a 16 mg/l
(Figu a 9) pode de e -se às p op iedades do compos o ou à o mação de p odu os de deg adação
18
(Fe ei a e al. 2007; Sande son e al. 2005). Os p incipais p odu os de o odecomposição de
compos os pe encen es ao g upo das e aciclinas são 4-dedime ilamino e aciclina, 5,6-anid o-
e aciclina e quinona (Halling-Sø ensen e al. 2002). A o o-oxidação das e aciclinas, induzida
pela adiação ul a iole a, oco e a axas ela i amen e ele adas em meios alcalinos e com
ele ada concen ação de oxigénio, o mando uma quinona, que ap esen a co e melha-
acas anhada e em abso ção a 530 nm (Moo e e al. 1983). É pouco p o á el que a co se de a
ao compos o p incipal, is o que es e so eu deg adação ao longo do pe íodo de es e e a co se
man e e. As condições do ensaio e colo ação e melho-acas anhada obse ada suge em
deg adação da doxiciclina em quinona. Apesa des as semelhanças, a de e minação da quinona
às 96 ho as com pico de abso ção a 530 nm não oi possí el. Apesa de não e em sido
iden i icados, os p odu os de deg adação em conjun o com a doxiciclina, são esponsá eis pelo
e ei o óxico ob ido no ensaio. A o ólise da doxiciclina p omo e sua a deg adação, mas nem
semp e esul a na diminuição da oxicidade, uma ez que os p odu os de deg adação
in e mediá ios e elam se mais óxicos e e em maio acilidade na pene ação nas células (Yuan
e al. 2011).
Figu a 9: Bioensaio da doxiciclina às 96 ho as obse ando-se a câma a de incubação, os ascos com di e sas
concen ações e o sis ema de a . À esque da es ão p esen es os con olos e concen ações in e io es, ap esen ando
uma co e de in ensa de ido ao c escimen o das algas. Na imagem à di ei a, obse am-se as concen ações
supe io es que ap esen am uma colo ação e melho-acas anha, possi elmen e de ido à deg adação do compos o.
A diminuição da ansmissão de luz de ido à o mação da co e melho-acas anhada
pode á con ibui pa a a inibição do c escimen o de mic oalgas (Sande son e al. 2005). Po ou o
lado, a edução da ansmissão de luz pode á o igina meno mul iplicação celula , ha endo
menos impac o dos óxicos e le ando a que subs âncias de co ap esen em maio es CE50
19
(Cleu e s e Weye s 2003). O e ei o de somb a não de e á se conside ado como simples adi i o,
is o que o mo imen o e agi ação das algas pe mi em que sejam expos as a zonas iluminada
(Cleu e s e Weye s 2003). A colo ação e melho-acas anhada obse ada du an e o ensaio
pode á se em pa e esponsá el pelo e ei o óxico obse ado, po ém a sua con ibuição não pôde
se de e minada.
As e aciclinas podem inibi a sín ese p o eica do clo oplas o a a és da ligação à
subunidade ibossomal 30S, esul ando em dec éscimo do con eúdo de clo o ila e meno
e iciência o ossin é ica (Wang e al. 2015). A mi ocônd ia so e po um mecanismo semelhan e,
esul ando em pe oxidação lipídica e o mação de espécies de oxigénio eac i as (Wang e al.
2015). A doxiciclina pode en ão ac ua nos clo oplas os e mi ocônd ias da alga, diminuindo a
e iciência o ossin é ica e o iginando adicais li es de oxigénio, causando inibição do seu
c escimen o.
A o mação de complexos insolú eis com ca iões me álicos bi alen e pode o ma
p ecipi ado (B ain e al. 2004; Campbell e Hasino 1991; Ka sung e al. 2012; Riond e Ri ie e
1988). A o mação de complexos pode á es a en ol ida na oxicidade, podendo p o oca
de iciência de mine ais ou a o ma complexada ul apassa memb anas biológicas com maio
acilidade (B ain e al. 2004; Campbell e Hasino 1991; Ka sung e al. 2012; Riond e Ri ie e 1988).
A quelação de cálcio in acelula pode in e e i na unção célula a a és da inibição da sín ese
p o eica ou e ei o óxico (Wang e al. 2015). Po ou o lado, a quelação pode á eduzi a
disponibilidade de e aciclinas no meio e diminui a sua oxicidade (Halling-Sø ensen e al. 2002).
O meio F/2 é cons i uído po água de ma suplemen ada ica em ca iões sendo a o á el à
o mação de complexos, esul ando em concen ações de CE50 supe io es e meno ecupe ação
da subs ância às 96 ho as (Fe ei a e al. 2007).
Bioensaios oxicológicos em mic oalgas en ol endo a exposição a an ibió icos p esen es
no ambien e são impo an es is o que es es o ganismos ap esen am ele adas sensibilidades
de ido à sua cons i uição unicelula (Fe ei a e al. 2007). O alo da CE50 da doxiciclina pa a T.
chuii é supe io aos alo es de ec ados no ambien e ac ualmen e. Concen ações ambien ais
mais ele adas pode ão se de ec adas localmen e após adminis ação de an ibió icos em
aquacul u a ou após desca ga de biossólidos no meio aquá ico (Fe nández e al. 2004; Hi sch e
al. 1999; Rico e al. 2013) Os dados ela i os à de e minação de an ibió icos no ambien e, apesa
de es a em a aumen a em núme o, ainda são limi ados pa a uma a aliação global do impac o
des es á macos nos ecossis emas. Po ou o lado, se ia in e essan e a ealização de mais es es
20
em o ganismos ma inhos de ní eis ó icos supe io es pa a comp eende o seu impac o na cadeia
ó ica ma inha, assim como a ealização de es es em o ganismos de ou os compa imen os
ambien ais, como o solo ou o sedimen o, onde es e á maco se acumula.
4.2.2. Bioensaio com mic oplás icos
As es e as de mic oplás icos con e i am uma onalidade osa ao meio, semelhan e à sua
co , nas concen ações mais ele adas. Du an e o es e, a a iação média do pH oi de 1,54
unidades, sendo a média do alo inicial de 8,05 e a inal 9,61 unidades de pH (Anexo II). A
a iação média da concen ação inicial do es e à nominal oi de 5,67% e o decaimen o médio às
96 ho as de 41,9%. A a iação média da concen ação de es e à nominal cump e as indicações
da OECD. A a iação média de pH oi supe io às 1,5 unidades de pH ecomendadas pela OECD,
podendo de e -se ao ele ado c escimen o das algas de ido à ausência de oxicidade (secção
3.1.1.). O decaimen o médio dos mic oplás icos ul apassou os 20% ecomendados na OECD,
sendo uma p o á el causa a adso ção des e ma e ial ao id o dos ecipien es u ilizados.
Figu a 10: Média do núme o de células com o espec i o e o pad ão da média em cada a amen o às 96 ho as em
algas expos as a mic oplás icos e na ausência da subs ância (con olo – 0). Sob e as ba as é ep esen ada a
pe cen agem média de inibição do c escimen o da mic oalga em cada a amen o e ela i amen e ao c escimen o médio
do con olo.
No p esen e es udo não oi possí el de e mina a CE50 de mic oplás icos pa a a alga T.
chuii (Figu a 10), pois não se e i ica am di e enças es a is icamen e signi ica i as en e o
c escimen o das cul u as expos as a di e en es concen ações de mic oplás icos (ANOVA, F(7, 16)=
1,516, p= 0,231). Os esul ados do p esen e es udo es ão de aco do com os ob idos num es udo
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31
Anexos
Anexo I: Meio en iquecido F/2 de Guilla d
Mac onu ien es
NaNO3
75 mg/l
NaH2PO4.H2O
5 mg/l
Me ais
Na2.EDTA+
4,36 mg/l
FeCl3.6H2O+
3,15 mg/l
CuSO4.5H2O
0,01 mg/l
ZnSO4.7H2O
0,022 mg/l
CoCl2.6H2O
0,01 mg/l
MnCl2.4H2O
0,18 mg/l
Na2MoO4.2H2O
0,006 mg/l
Vi aminas
Tiamina.HCl
0,1 mg/l
Bio ina
0,5 mg/l
B12
0,5 mg/l
Tabela 1: Composição do meio F/2 ep esen ando a quan idade de nu ien es p esen es em um li o de água do ma
il ada (Guilla d 1975).
32
Anexo II: Tabelas de pH dos bioensaios
Concen ação
(mg/l)
Dic oma o de po ássio
Doxiciclina
Doxiciclina com
Mic oplás icos
0h
96h
0h
96h
0h
96h
0
8,11
9,37
8,21
8,77
8,08
9,07
0
8,1
9,27
8,11
8,87
8,27
9,75
0
8,13
9,4
8,13
8,89
8,29
9,65
2
8,06
8,88
8,11
8,77
8,38
9,7
2
8,08
9,36
8,16
8,05
8,43
9,86
2
8,19
9,31
8,14
8,97
8,28
9,94
4
8,12
9,15
8,11
8,87
8,3
9,77
4
8,08
9,14
8,17
8,94
8,37
9,77
4
8,09
9,54
8,13
8,85
8,44
9,53
8
7,99
9,22
8,06
8,84
8,37
9,21
8
7,99
9,22
8,12
8,75
8,32
9,68
8
8,01
9,06
8,07
8,73
8,37
9,75
16
7,87
9,19
8,02
8,39
8,46
8,66
16
7,88
8,22
7,99
8,35
8,17
8,83
16
7,91
8,7
8,01
8,27
8,29
8,76
32
7,89
8,08
7,82
8,23
8,15
8,35
32
7,67
8,08
7,59
8,2
8
8,15
32
7,6
8,04
7,73
8,25
8,06
8,17
64
7,12
7,97
7,54
8,04
7,64
7,84
64
7,23
7,93
7,57
8,01
7,82
7,91
64
7,15
7,93
7,52
7,96
8,03
8
128
6,7
7,34
7,28
7,78
7,21
7,68
128
6,72
7,84
7,33
7,63
6,89
6,67
128
6,69
7,73
7,37
7,72
5,61
7,21
Tabela 2: Valo es de pH ob idos no início e im dos bioensaios do dic oma o de po ássio, doxiciclina e doxiciclina com
mic oplás icos.

33
Concen ação
(mg/l)
Mic oplás icos
0h
96h
0
7,86
9,45
0
8,03
9,69
0
8,02
9,59
0,75
8,06
9,48
0,75
8,05
9,69
0,75
7,84
10
1,5
8,1
10
1,5
8,05
10,07
1,5
8,11
9,93
3
8,05
9,87
3
8,1
10,05
3
8,09
9,92
6
8,09
9,45
6
8,13
9,52
6
8,12
9,37
12
8
9,37
12
8,1
9,23
12
8,16
9,1
24
7,92
9,42
24
8,02
9,44
24
8,04
9,48
48
8,05
9,22
48
8,06
9,38
48
8,08
9,88
Tabela 3: Valo es de pH ob idos no início e im do es e com mic oplás icos.
34
Anexo III: Espec os de abso ção dos compos os
Figu a 1: Espec o de abso ção do dic oma o de po ássio em meio F/2 na concen ação de 32 mg/l. Obse am-se
picos de abso ância a 274 nm e 370 nm.
Figu a 2: Espec o de abso ção do meio F/2. Obse a-se o pico a 222 nm.
35
Figu a 3: Espec o de abso ção da doxiciclina em meio F/2 na concen ação de 32 mg/l. Obse am-se picos de
abso ância a 245 nm, 272 nm e 375 nm.