Expressão proteica diferencial das enzimas de destoxificação glutationa transferases em Mytilus Galloprovincialis após exposição a microcistinas

Expressão proteica diferencial das enzimas de destoxificação Glutationa Transferases em Mytilus galloprovincialis após exposição a microcistinas CATARINA JOÃO SOARES CAETANO DISSERTAÇÃO DE MESTRADO APRESENTADA AO INSTITUTO DE CIÊNCIAS BIOMÉDICAS ABEL SALAZAR DA UNIVERSIDADE DO PORTO EM TOXICOLOGIA E CONTAMINAÇÃO AMBIENTAIS Catarina João Soares Caetano Expressão proteica diferencial das enzimas de destoxificação Glutationa Transferases em Mytilus galloprovincialis após exposição a microcistinas Dissertação de Candidatura ao grau de Mestre em Toxicologia e Contaminação Ambientais submetida ao Instituto de Ciências Biomédicas de Abel Salazar da Universidade do Porto Orientador – Doutor José Carlos Martins Categoria – Investigador Pós-Doutorado Afiliação – Centro Interdisciplinar de Investigação Marinha e Ambiental, CIIMAR Co-Orientador – Doutor Alexandre Campos Categoria – Investigador Auxiliar Afiliação – Centro Interdisciplinar de Investigação Marinha e Ambiental, CIIMAR i Agradecimentos Para a realização desta tese contei com o apoio de muitas pessoas, sem as quais não teria sido possível. É com profundo reconhecimento que agradeço: Em primeiro lugar, por toda ajuda, inestimável disponibilidade, conhecimento partilhado e pela boa disposição sempre presente, ao meu orientador, Doutor José Carlos Martins. E também ao meu co-orientador, Doutor Alexandre Campos, por todo auxilio. A todos os membros do LEGE (Laboratório de Ecotoxicologia, Genómica e Evolução) pelo seu apoio, conselhos e bom ambiente de trabalho criado. Ao Professor Doutor Vítor Vasconcelos por me aceitar no laboratório e permitir a realização desta minha tese. À Joana Azevedo pela simpatia e pela preciosa ajuda com análise da toxina por HPLC. À Mariana Carneiro um enorme obrigada por tudo, pela impagável ajuda e pela inesgotável paciência para com as minhas dúvidas intermináveis. À Ana de Matos, Catarina Santos, Tiago Afonso, Susana Cruz e Tiago Azevedo pelas palavras inspiradoras, colaboração e animação. À Rita Mendes por me ouvir quando mais precisava, pela amizade e por me receber em sua casa quando precisei. À Joana Machado pelo companheirismo nos bons e maus momentos no decorrer destes últimos 2 anos e pela enorme ajuda sempre que foi preciso. Aos meus “mais que tudo” Cátia Ferreira, Gabriela Moreira, Catarina Oliveira e Tiago Monteiro por me animarem, por me darem força para continuar e por acreditarem em mim. Por fim, aos meus pais e irmão, a quem dedico esta tese, pelo incentivo e apoio prestado durante todo o meu percurso académico e pelo carinho e ensinamentos dispensados ao longo da vida. ii Resumo Os organismos aquáticos, nomeadamente os bivalves, estão sujeitos ao contacto mais direto e frequente com as microcistinas (MCs). Uma maior eficiência do processo de destoxificação pode influenciar a capacidade de resistência destes organismos a estas cianotoxinas. A capacidade de biotransformação e excreção de MCs tem sido demonstrada em vários bivalves, incluindo Mytilus galloprovincialis. Apesar de conhecido o envolvimento do sistema de enzimas de destoxificação GST na resposta molecular a MCs nestes moluscos, pouco se sabe ainda sobre o papel individual de cada uma das isoformas das várias classes nessa resposta. Neste trabalho foram estudadas as alterações da expressão e a atividade das GST’s citosólicas nas brânquias e hepatopâncreas do mexilhão M. galloprovincialis induzidas pela exposição a MC-LR purificada e a uma estirpe tóxica de M. aeruginosa (LEGE 91094) durante 24 horas. As frações citosólicas de ambos os órgãos sujeitas aos vários tratamentos foram purificadas recorrendo à cromatografia de afinidade em coluna GSH-agarose e posteriormente analisadas por eletroforese bidimensional (2DE) em tiras IPG de 7 cm (pH 5-8). Os pontos de interesse nos géis 2DE foram excisados e analisados por MALDI-TOF-MS/MS. Foram obtidos géis 2DE de referência para ambos os órgãos, sendo detetados 9 pontos nas brânquias e 10 pontos no hepatopâncreas, usando como corante Azul de Coomassie. Dos 19 pontos detetados apenas uma proteína foi identificada com confiança estatística. Esta proteína foi identificada nas brânquias como uma subunidade GST. Nas brânquias, a alteração quantitativa da expressão de proteínas foi detetada em 5 pontos no grupo de bivalves expostos à cultura de M. aeruginosa. Neste órgão foram detetadas as mesmas 2 diferenças qualitativas entre os grupos de exposição e o grupo controlo para a exposição a MC-LR e cultura de M. aeruginosa. No hepatopâncreas, a alteração quantitativa da expressão de proteínas foi detetada em 4 pontos no grupo de bivalves expostos a MC-LR pura e em 1 ponto no grupo de bivalves expostos a M. aeruginosa. As alterações quantitativas e qualitativas da expressão de proteínas suportam os dados obtidos para a atividade das GST’s citosólicas em ambos os órgãos. Os resultados obtidos contribuem para o aumento do conhecimento relativo aos mecanismos de destoxificação das MCs, nomeadamente ao nível das várias isoformas GST. iii Abstract Aquatic organisms, particularly bivalves, are subjected to a more direct and frequent contact with microcystins (MCs). A higher efficiency of the detoxification process can influence the tolerance of these organisms to these cyanotoxins. The ability of biotransformation and excretion of MCs has been demonstrated in several bivalves, including Mytilus galloprovincialis. Although it is known the involvement of the GST detoxification enzyme system in the molecular response to MCs in these molluscs, little is known about the individual role of each isoform of the several classes in this response. In this work, changes in expression and activity of cytosolic GST’s in the gills and gut of the mussel M. galloprovincialis induced by purified MC-LR and a toxic strain of M. aeruginosa (LEGE 91094) for 24 hours were studied. The cytosolic fractions of both organs subjected to different treatments were purified using affinity chromatography on GSHagarose column and subsequently analyzed by two-dimensional electrophoresis (2DE) in 7 cm IPG strips (pH 5-8). The spots of interest in the 2DE gels were excised and analyzed by MALDI-TOF-MS/MS. Reference 2DE gels were obtained for both organs, being resolved 9 spots in gills and 10 spots in gut, using Coomassie Blue staining. Of the 19 detected spots, only one was identified with statistical confidence. This protein was identified in the gills as a GST subunit. Altered protein expression in gills was quantitatively detected in 5 spots for the group of bivalves exposed to the M. aeruginosa strain. In this organ, 2 qualitative differences were detected between the two exposure groups and the control for both exposures. Altered protein expression in gut was quantitatively detected in 4 spots for the group of bivalves exposed to pure MC-LR and 1 spot for the group of bivalves exposed to M. aeruginosa. Quantitative and qualitative changes in protein expression support the data obtained for the activity of cytosolic GST’s in both organs. The obtained results contribute to the increase of knowledge concerning the mechanisms of detoxification of MCs, namely in what it respects to the several GST isoforms. iv Índice Agradecimentos ................................................................................................................. i Resumo ............................................................................................................................. ii Abstract ............................................................................................................................. iii Índice ............................................................................................................................... iv Índice de Figuras .............................................................................................................. vi Índice de Tabelas ............................................................................................................ viii Lista de abreviaturas ........................................................................................................ ix 1. Introdução ..................................................................................................................... 1 1.1 Cianobactérias ......................................................................................................... 1 1.2 Microcistinas ............................................................................................................ 1 1.2.1 Estrutura e mecanismo de ação ........................................................................ 2 1.2.2 Metabolização e destoxificação de MCs ............................................................ 4 1.3 Glutationa Transferases ........................................................................................... 5 1.3.1 Funções e estrutura geral .................................................................................. 5 1.3.2 Famílias de GST’s ............................................................................................. 6 1.3.3 GST’s citosólicas em bivalves ........................................................................... 7 1.4 Dinâmica de MCs em bivalves ................................................................................. 8 1.4.1 Absorção, distribuição e metabolização ............................................................. 9 1.4.2 GST’s como biomarcadores em bivalves ......................................................... 10 1.5 Proteómica aplicada à toxicidade das MCs ............................................................ 11 2. Objetivos ..................................................................................................................... 12 3. Material e Métodos ...................................................................................................... 13 3.1 Material biológico ................................................................................................... 13 3.1.1 Aclimatação dos mexilhões ............................................................................. 13 3.1.2 Cultivo da cianobactéria Microcystis aeruginosa e da alga verde Chlorella vulgaris. .................................................................................................................... 13 3.2 Preparação da MC-LR purificada e células de cultura de M. aeruginosa ............... 13 3.2.1 Quantificação celular de cultura tóxica de M. aeruginosa ................................ 13 3.2.2 Extração da MC-LR da cultura de M. aeruginosa ............................................ 14 3.2.3 Purificação da MC-LR por HPLC-PDA ............................................................. 14 3.2.4 Quantificação de MC-LR por HPLC-PDA ........................................................ 14 3.2.5 Nivelamento da toxicidade entre as duas exposições ...................................... 15 3.3 Ensaio de exposição .............................................................................................. 16 3.4 Purificação das GST’s citosólicas. ......................................................................... 16 3.4.1 Extração das GST’s ......................................................................................... 16 3.4.2 Quantificação da proteína ................................................................................ 17 3.4.3 Determinação da actividade enzimática ........................................................... 17 3.4.4 Cromatografia de afinidade .............................................................................. 17 3.5. Análise de proteínas por SDS-PAGE ....................................................................18 3.6 Eletroforese bidimensional .....................................................................................19 3.6.1 Focagem isoelétrica (IEF) ................................................................................ 19 3.6.2 SDS-PAGE ...................................................................................................... 19 3.6.3 Aquisição de imagem e análise ........................................................................ 20 3.6.4 Identificação das GST’s por espectrometria de massa..................................... 20 3.7 Análise estatística ..................................................................................................21 4. Resultados e Discussão...............................................................................................22 4.1 Purificação das GST`s citosólicas ..........................................................................22 4.2 Caracterização das GST’s citosólicas por SDS-PAGE e Electroforese Bidimensional .....................................................................................................................................24 4.3 Efeitos da exposição às MCs .................................................................................27 4.3.1 Atividade das GST’s citosólicas ....................................................................... 27 4.3.2 Expressão diferencial das GST’s citosólicas .................................................... 29 5. Conclusões e Perspetivas futuras ................................................................................32 6. Referências..................................................................................................................33 7. Anexos .........................................................................................................................41 7.1 Quantificação de MC-LR purificada por HPLC-PDA ...............................................41 7.1.1 Reta de Calibração .......................................................................................... 41 7.1.2 Cromatogramas do Sistema de HPLC ............................................................. 42 vi Índice de Figuras Figura 1Estrutura da microcistina-LR, como um exemplo da estrutura geral das MCs ( Wiegand & Pflugmacher, 2005). ........................................................................................ 3 Figura 2 - Conjugação da MC-LR com GSH via GST`s (Pflugmacher et al., 2001) ........... 5 Figura 3Equação geral da reação catalisada pelas GST’s. Neste exemplo o substrato utilizado é CDNB (1 cloro 2,4 - dinitrobenzeno) (Hayes et al., 2005). ................................ 6 Figura 4 - SDS-PAGE das frações purificadas das brânquias e hepatopâncreas. a: marcador de peso molecular; b: brânquias; c: hepatopâncreas ....................................... 25 Figura 5 - Perfil de expressão proteica em gel de eletroforese bidimensional (2-DE) obtido a partir de GST’s citosólicas purificadas de Brânquias (A) e Hepatopâncreas (B) de M. galloprovincialis. .............................................................................................................. 26 Figura 6 - Actividade das GST’s (fração Ultracentrifugada) nas brânquias e trato digestivo de M. galloprovincialis expostos a MC-LR pura e a células tóxicas de M. aeruginosa. As colunas representam a média de três réplicas. As barras representam o desvio-padrão. As diferenças significativas (p< 0,05) relativamente ao grupo de controlo estão assinaladas (*). ........................................................................................................................................ 28 Figura 7 - Proteínas diferencialmente expressas nas brânquias em relação ao grupo controlo. .......................................................................................................................... 30 Figura 8 - Proteínas diferencialmente expressas no hepatopâncreas em relação ao grupo controlo. .......................................................................................................................... 30 Figura 9 - Gráfico da reta de calibração com os valores dos padrões 1 a 7 .................... 41 Figura 10 - Cromatogramas do sistema de HPLC referente a MC-LR Purificada, Extrato Bruto de M. aeruginosa, Padrão e Branco e os seus respetivos espectrogramas de absorção na faixa de 200-300nm. ................................................................................... 42 vii Introdução decorrente da exposição crónica a MC-LR resulta numa proliferação celular descontrolada, potenciando o desenvolvimento de tumores (Dawson, 1997). No entanto, recentemente, novas evidências surgiram sugerindo que o stress oxidativo também é uma consequência toxicológica da exposição a MCs em diferentes organismos (Amado & Monserrat, 2010; Prieto et al., 2006). O stress oxidativo é tradicionalmente definido como uma perturbação no equilíbrio entre a produção de espécies reativas de oxigênio (EROS) (radicais livres) e as defesas antioxidantes, em favor das primeiras, levando a potenciais danos moleculares (Halliwell & Gutteridge, 2007). A exposição a MCs tem sido relacionada com a produção de EROS (Li et al., 2003), levando a danos no DNA (Zegura et al., 2008), aumento na peroxidação lipídica (Prieto et al., 2007), danos nas mitocondrias (Ding & Ong, 2003) e alteração do sistema de defesa antioxidante (Amado et al., 2009; Prieto et al., 2007). 1.2.2 Metabolização e destoxificação de MCs Apesar do conhecimento sobre a metabolização das MCs ser ainda limitado, vários trabalhos sugerem a conjugação da glutationa reduzida (GSH) com MCs em hepatócitos como um passo importante na via metabólica que leva à destoxificação destas toxinas (Figura 2). Estes conjugados foram inicialmente detetados em estudos in vivo com ratos e murganhos tratados com MCs (-LR, -RR) (Kondo et al., 1996; Robinson et al., 1991). A GSH tem um papel muito importante em diversas funções biológicas, nomeadamente na proteção celular. Este tripeptídeo reage com uma grande variedade de xenobióticos formando conjugados de GSH, sendo muitos deles convertidos em ácidos mercaptúricos para posteriormente serem excretados (Meister & Anderson, 1983). A conjugação das MCs com GSH é catalisada pelas enzimas de destoxificação de fase II Glutationa Transferases (GST). Estas enzimas estão envolvidas na transformação de compostos endógenos e exógenos, conjugando substâncias eletrofílicas ao grupo tiol da GSH, tornando-as mais hidrossolúveis e facilitando, deste modo, o processo de excreção. As MCs são conjugadas com GSH através do terminal metileno do aminoácido Mdha ficando desta forma o conjugado impossibilitado de se ligar covalentemente com as fosfatases (Kondo et al., 1996). No entanto, apesar de menos tóxico, pode ainda causar inibição das fosfatases visto que o aminoácido ADDA da MCs continua ainda disponível (Ito et al., 2002). Nos mamíferos, a posterior conversão do conjugado GSH a ácido mercaptúrico ocorre pela clivagem sequencial do ácido glutâmico e glicina da GSH, seguido da N-acetilação do conjugado de cisteína resultante. Finalmente os ácidos formados são excretados pela urina (Huber et al., 2008). A formação do conjugado de GSH com MC-LR mediado pelas GST’s foi também descrito em vários organismos aquáticos como plantas (Ceratophyllum demersum), Introdução invertebrados (Dreissena polymorpha, Daphnia magna), peixes e embriões de peixes (Danio rerio) (Pflugmacher et al., 1998; Wiegand et al., 2002). Nestes organismos, a capacidade de destoxificação das MCs é fundamental devido ao contacto mais direto e frequente com estas toxinas. Os sistemas enzimáticos de destoxicação como as GST’s são úteis na avaliação da resposta animal a toxinas ou outros xenobióticos porque normalmente são induzidos pela presença destes agentes tóxicos no ambiente, sendo muitas vezes usados como biomarcadores (Vasconcelos et al., 2007). Figura 2 - Conjugação da MC-LR com GSH via GST`s (Pflugmacher et al., 2001) 1.3 Glutationa Transferases 1.3.1 Funções e estrutura geral As enzimas de fase II do metabolismo de xenobióticos, como as GST’s, catalisam a conjugação de xenobióticos (ou dos seus metabolitos oriundos da fase I) com substratos endógenos (por ex. GSH) tornando-os mais solúveis em água (Huber et al., 2008). As GST’s são uma família de enzimas multifuncionais com várias funções catalíticas, estando envolvidas na destoxificação de compostos endógenos e exógenos. Estas enzimas catalisam a conjugação de uma grande variedade de compostos electrofílicos (citotóxicos Introdução e genotóxicos) ao grupo tiol do tripeptídeo GSH (Figura 3). Habitualmente o resultado desta reação é a formação de uma molécula mais polar e menos reativa, de maior facilidade de excreção (Mannervik & Jemth, 2001). Algumas das classes relativas à família de enzimas GST’s são responsáveis pela remoção de EROS, apresentando actividade de peroxidases e isomerases. As GST’s também desempenham algumas funções adicionais não ligadas à destoxificação. Estão por exemplo envolvidas na biossíntese de metabolitos fisiologicamente importantes (ex. prostaglandinas) ou no transporte de compostos endógenos (Frova, 2006). As GST’s são enzimas homodiméricas ou heterodiméricas que se encontram em diversas espécies (desde plantas a organismos superiores terrestres e aquáticos) e estão de uma maneira geral presentes em todos os órgãos, embora as suas concentrações sejam diferentes de tecido para tecido. Apesar das subunidades serem independentes cataliticamente, a estrutura dimérica é essencial para assegurar essa função (Frova, 2006). Cada subunidade é composta por dois domínios estruturalmente distintos: o domínio Nterminal, formado por alpha-hélices e folhas beta-pregueadas, e o domínio C-terminal, formado apenas por alpha-hélices (Frova, 2006). Há duas regiões de ligação por subunidade: o sítio G, específico para o tripeptídeo GSH, e o sítio H que pode acomodar uma multiplicidade de substratos de diferentes tamanhos e polaridades, dependendo da classe de GST (Clark, 1989; Vararattanavech & Ketterman, 2007). 1.3.2 Famílias de GST’s As GST’s de mamíferos podem ser divididas em três grandes famílias: citosólicas, Kappa e microssomais. As duas primeiras compreendem enzimas solúveis, enquanto as do tipo microssomal encontram-se associadas à membrana (Huber et al., 2008). No que respeita à estrutura tri-dimensional, as GST’s solúveis são bastante distintas das Figura 3 - Equação geral da reação catalisada pelas GST’ s. Neste exemplo o substrato utilizado é CDNB (1 cloro 2,4 - dinitrobenzeno) (Hayes et al., 2005). Introdução microssomais. No entanto, são características comuns a todas as famílias a actividade peroxidase e a conjugação de GSH com 1-chloro-2,4-dinitrobenzene (CDNB) (Frova, 2006). As GST’s microssomais são proteínas trans-membranares geralmente envolvidas no metabolismo de eicosanóides e GSH e por esta razão são designadas pela sigla MAPEG (Membrane-Associated Proteins in Eicosanoid and Glutathione metabolism). As GST’s Kappa são enzimas mitocondriais (também presentes nos peroxissomas) potencialmente envolvidas em processos de destoxificação dos subprodutos da betaoxidação de ácidos gordos e peróxidos lipídicos (Huber et al., 2008). As GST’s citosólicas ou GST’s solúveis representam a maior família de GST’s, ubiquamente distribuídas entre os seres vivos, sendo reconhecidas como as enzimas de destoxificação mais envolvidas na defesa celular contra a toxicidade induzida quimicamente (Frova, 2006). Estas enzimas são, de uma maneira geral, biologicamente ativas como dímeros, com subunidades de 23-30 KDa e sequências de 200-250 aminoácidos (com mais de 40% de homologia). São sete as classes de GST’s citosólicas presentes em mamíferos: alpha, mu, pi, sigma, theta, omega, e zeta. Estas classes não são exclusivas dos mamíferos, estando presentes todas elas em peixes ou moluscos. No entanto, existem classes de GST’s citosólicas adicionais específicas de alguns grupos de organismos como as classes phi (plantas), tau (plantas), rho (peixes e moluscos), delta (insetos), epsilon (insetos) e beta (bactérias) (Blanchette et al., 2007). 1.3.3 GST’s citosólicas em bivalves Existe pouca informação disponível relativamente às GST’s de invertebrados aquáticos, nomeadamente para moluscos, em comparação com os vertebrados. Surpreendentemente, isoformas de GST’s citosólicas começaram a ser isoladas e caracterizadas a partir de mexilhões há mais de duas décadas (Fitzpatrick & Sheehan, 1993). Diferentes classes de GST’s em bivalves estão identificadas e descritas no GenBank (Tabela 1), embora apenas algumas tenham sido clonadas e caracterizadas. Vários estudos sobre GST’s em bivalves têm como foco o isolamento e caracterização individual dos vários tipos de isoformas. Há um grande interesse no estudo das mesmas devido ao seu envolvimento na proteção celular contra xenobióticos. O aumento da expressão das GST’s faz parte dum mecanismo de resposta ao stress causado por tóxicos. Diferentes estudos sugerem que a indução das GST’s é um fator decisivo na determinação da tolerância das células a vários contaminantes (Pérez-López et al., 2002). Introdução Tabela 1 - Distribuição das GST’s citosólicas presentes em várias espécies de bivalves (sequências obtidas no GenBank) (Adaptado de Martins et al.(2014)). Espécies mu pi alpha sigma theta zeta omega rho Chlamys farreri x x Corbicula fluminea x Crassostrea ariakensis x x x Crassostrea gigas x x x Cristaria plicata x Dreissena polymorpha x Hyriopsis schlegelii x Lanternula elliptica x x Mercenaria mercenaria x (2) Mytilus edulis x Mytilus galloprovincialis x x x (3) Ostrea edulis x x Pinctada fucata x Ruditapes philippinarum x x x (3) x x x Saccostrea palmula x Solen grandis x Unio tumidus x ( ) – número de isoformas 1.4 Dinâmica de MCs em bivalves Os bivalves são vulgarmente usados como bioindicadores na avaliação de risco ambiental. Estes moluscos são organismos sésseis e filtradores, permitindo que acumulem rapidamente elevados níveis de contaminantes nos seus tecidos, refletindo desta forma os níveis de contaminação ambiental. Apresentam muitas respostas fisiológicas subletais, sensíveis a poluentes em diferentes níveis. A sua utilização em programas de biomonitoração por parte de instituições ligadas à vigilância sanitária é bastante comum, visto que muitas das espécies são também consumidas pelo Homem (Vasconcelos, 1995). Entre estas está o mexilhão Mytilus galloprovincialis. Este bivalve marinho é natural da costa do Mediterrâneo, do Mar Negro e do Mar Adriático, tornando-se invasora em muitas partes do mundo (Branch & Steffani, 2004; Lee & Morton, 1985). Atualmente ocorrem em zonas temperadas em ambos os hemisférios, estando ausente nos trópicos (Hilbish et al., Introdução 2000). Normalmente atingem massas densas de indivíduos na zona intertidal e subtidal de águas costeiras e estuários. São muitas vezes dominantes nos seus habitats, provavelmente devido à sua notável plasticidade em relação às mudanças ambientais, e amplamente utilizados como bioindicadores de poluição química da água (Goldberg & Bertine, 2000). A acumulação de cianotoxinas, nomeadamente de MCs foi demonstrada em vários trabalhos de campo e laboratoriais para várias espécies de bivalves, nomeadamente do género Mytilus sp. (Martins et al., 2009) 1.4.1 Absorção, distribuição e metabolização Os bivalves, como organismos sésseis e filtradores, estão entre o grupo de animais aquáticos mais sujeitos aos blooms de cianobactérias tóxicas (Martins & Vasconcelos, 2009). A intoxicação por MCs nestes moluscos pode acontecer através da ingestão de células cianobacterianas produtoras destas toxinas ou através da absorção das MCs dissolvidas na água, libertadas após lise celular. Alguns estudos sustentam que a acumulação de MCs em moluscos resulta principalmente da ingestão direta de células de cianobactérias tóxicas (Lance et al., 2010; Prepas et al., 1997). Nos bivalves, as brânquias e o manto representam os primeiros locais de interação com os contaminantes biodisponíveis a partir do meio circundante (coluna de água, sedimentos água intersticial) e/ou o alimento ingerido. Estes moluscos utilizam as brânquias para obter alimento filtrando as partículas que existem em suspensão na água (Gosling, 1992; Gosling, 2003) A água atravessa as lamelas branquiais através de movimentos ciliares, sendo as partículas transportadas até aos palpos labiais e boca. As partículas são posteriormente conduzidas para o hepatopâncreas, onde tem lugar a digestão (Gosling, 2003). Segundo alguns estudos, as quantidades de MCs nos tecidos destes invertebrados parecem depender do nível de MCs no fitoplâncton, variando de acordo com a ocorrência de cianobactérias produtoras de MCs (Lance et al., 2010; Papadimitriou et al., 2012; Poste et al., 2011). Existem vários estudos sobre a bioacumulação de MCs em bivalves, tanto em laboratório como no campo (Martins et al., 2009). Bivalves marinhos como M. galloprovincialis mostraram acumular (tecido total) até 10,7 µg de MCs /g de peso seco em experiências laboratoriais, quando alimentados com uma estirpe tóxica de M. aeruginosa ( Amorim & Vasconcelos, 1999). Os dados disponíveis confirmam que as MCs não são igualmente distribuídas entre os vários órgãos de invertebrados, com os tecidos viscerais (hepatopâncreas, intestino) a atingir as toxicidades mais elevadas (Martins et al., 2009). Os mexilhões mostram ser bastante tolerantes às toxinas, registando-se nas várias experiências laboratoriais taxas de mortalidade muito baixas ou nulas (Vasconcelos, 1995). Introdução De uma maneira geral, os mesmos estudos laboratoriais mostram que as MCs são eliminadas bifasicamente a partir dos tecidos de M. galloprovincialis, compreendendo uma fase inicial de eliminação mais rápida seguida por uma subsequente mais lenta (Amorim & Vasconcelos, 1999; Fernandes et al., 2009; Vasconcelos, 1995). A via metabólica que leva à destoxificação das MCs em bivalves parece ser semelhante à dos mamíferos. A biotransformação de MC-LR por conjugação com GSH foi demonstrada in vitro com um extrato de GST’s de Dreissena polymorpha (Pflugmacher et al., 1998). Estes conjugados foram posteriormente detetados em estudos in vivo com bivalves, nomeadamente em Cristaria plicata (J. Chen & Xie, 2005). Além disso, verificouse um aumento das atividades das GST’s em várias espécies de bivalves após exposição a extratos brutos de cianobactérias e MC-LR pura, nomeadamente em M. galloprovincialis (Fernandes et al., 2009; Vasconcelos et al., 2007). 1.4.2 GST’s como biomarcadores em bivalves São vários os parâmetros biológicos que podem ser alterados como consequência da interação entre um agente químico e o organismo. A determinação quantitativa desses parâmetros pode ser usada como indicador biológico ou biomarcador no caso de existir uma correlação com a intensidade da exposição e/ou com o efeito biológico da substância (Amorim, 2003). Desta forma, o biomarcador compreende todas as substâncias ou os seus produtos de biotransformação, assim como qualquer alteração bioquímica precoce, cuja determinação nos fluidos biológicos ou tecidos avalie a intensidade da exposição e o risco à saúde (Amorim, 2003). Os biomarcadores são cada vez mais utilizados para identificar a incidência e os efeitos de diferentes tóxicos na avaliação de risco ecológico do ecossistema (Bebianno et al.,2007). As respostas bioquímicas em moluscos bivalves têm sido empregues como biomarcadores em vários estudos que visam avaliar o impacto das atividades antrópicas no meio ambiente (Cajaraville et al., 2000). Entre os marcadores bioquímicos destacam-se os relacionados com a biotransformação de compostos orgânicos, defesas antioxidantes e stress oxidativo, como por exemplo, as enzimas GST’s. A atividade destas enzimas tem sido amplamente utilizada como um biomarcador de exposição em bivalves a vários tóxicos, tais como: hidrocarbonetos, inseticidas organoclorados, bifenilos policlorados (PCB’s) (Hoarau et al., 2001; Fitzpatrick et al., 1997), hidrocarbonetos aromáticos policíclicos (PAH’s) (Cheung, Zheng, Li, Richardson, & Lam, 2001), cloreto de mercúrio (HgCl 2 ) (Khessiba et al., 2001) e também a cianotoxinas como MCs (Pflugmacher et al., 1998) e Nodularinas (Kankaanpää et al., 2007). Para além da atividade, também a expressão dos genes relativos a várias isoformas de GST’s têm sido estudados como Introdução biomarcadores de exposição. Por exemplo, a transcrição da isoforma de classe-pi foi avaliada em M. galloprovincilalis e R. phillipinarum expostos a PAH’s (Hoarau et al., 2006; Xu et al., 2010). Relativamente às MCs, apenas estudos com peixes (Carassius auratus, Cyprinus carpio) demonstraram a alteração do padrão de transcrição de alguns genes de GST’s (Fu & Xie, 2006; Li et al., 2008). 1.5 Proteómica aplicada à toxicidade das MCs A análise proteómica comparativa é uma ferramenta importante na investigação das respostas celulares a agentes tóxicos. Em contraste com os métodos bioquímicos convencionais, esta análise oferece um grande potencial na identificação de proteínas envolvidas na resposta dos organismos a contaminantes, através da comparação de perfis de expressão proteica (Dowling & Sheehan, 2006; Wetmore & Merrick, 2004). São várias as vantagens da proteómica comparativa em relação a outras abordagens. Esta análise não exige conhecimento prévio dos mecanismos de toxicidade, avaliando em larga escala as alterações da expressão de proteínas (Apraiz et al., 2006). A proteómica pode também ajudar a identificar novos biomarcadores e a estabelecer os seus mecanismos de toxicidade, após alteração dos perfis de expressão causada pela exposição a tóxicos (Apraiz et al., 2006). No entanto, a utilização de abordagens proteómicas no âmbito da toxicologia ambiental é sobretudo limitada pela falta de informação nas bases de dados de sequências de proteínas e genes para as espécies sentinela mais populares. Os organismos com mais informação disponível (organismos modelo) como bactérias, fungos e plantas, não são tão amplamente usados em estudos ecotoxicológicos, sendo que para a maioria das espécies, a informação genética disponível é escassa ou ausente (LópezBarea & Gómez-Ariza, 2006; Monsinjon & Knigge, 2007). Os primeiros estudos ecotoxicológicos que recorreram à proteómica foram realizados em mexilhões e peixes expostos a poluentes comuns (Bradley et al., 2002; Shepard & Bradley, 2000; Shepard et al., 2000). Em relação à toxicidade de MCs, a maioria das abordagens proteómicas com esta toxina envolvem a identificação dos mecanismos de toxicidade envolvidos nos efeitos de MC-LR ou de culturas produtoras destas toxinas em mamíferos, peixes e bivalves (Chen et al., 2005; Martins et al., 2009; Mezhoud et al., 2008). 12 2. Objetivos A informação disponível sobre os mecanismos envolvidos na toxicidade e metabolismo de MCs em organismos contaminados é ainda relativamente limitada. No caso dos organismos aquáticos e mais especificamente dos bivalves, são vários os trabalhos qua avaliam a acumulação e depuração destas toxinas nestes moluscos. No entanto, são ainda escassos os estudos relativos à indução de respostas moleculares pelas MCs, nomeadamente ao nível da destoxificação destas toxinas. Apesar de conhecido o envolvimento do sistema de enzimas de destoxificação GST na resposta molecular a MCs nestes moluscos, pouco se sabe ainda sobre o papel individual de cada uma das isoformas das várias classes nessa resposta. O objetivo geral deste trabalho consistiu em avaliar as alterações da expressão de GST`s citosólicas do mexilhão Mytilus galloprovincialis induzidas por MCs, usando uma análise proteómica. Pretenderam-se alcançar os seguintes objetivos específicos: 1. Definir mapas bidimensionais e identificar as várias isoformas GST citosólicas nas brânquias e hepatopâncreas de M. galloprovincialis. 2. Avaliar as alterações da atividade total das GST’s citosólicas e da expressão das várias isoformas GST citosólicas nas brânquias e hepatopâncreas de M. galloprovincialis induzidas por uma cultura tóxica de Microcystis aeruginosa (LEGE 91094) e MC-LR pura. 13 3. Material e Métodos 3.1 Material biológico 3.1.1 Aclimatação dos mexilhões Os bivalves (Mytilus galloprovincialis) foram recolhidos no mês de Abril de 2014 na praia da Memória (Porto, Portugal), aceite como local de referência, por não se conhecerem fontes de poluição significativas (Puerto et al., 2011). Seguidamente foram aclimatados durante 5 dias em água salgada (≈33 ppt), à temperatura de 18±1ºC, em tanques de 40 litros, com arejamento. A água foi mudada de dois em dois dias e os organismos foram alimentados duas vezes por semana com Chlorella vulgaris (LEGE Z001) com uma densidades de 1 × 10 5 células/mL. 3.1.2 Cultivo da cianobactéria Microcystis aeruginosa e da alga verde Chlorella vulgaris. A cianobactéria usada nesta experiência foi uma estirpe tóxica de Microcystis aeruginosa (LEGE 91094) produtora essencialmente de MC-LR (95%) e de pequenas quantidades de MC-LA e [D-Asp 3 ]-MCYST-LR (Martins et al., 2009; Vasconcelos, 1995). A cultura tóxica de M. aeruginosa foi cultivada em frascos de 10L contendo 8L de meio Z8 num regime de luz/obscuridade de 14/10h com luz branca fluorescente (22 μEm -2 s1 ) e temperatura controlada (25 ± 1°C). A alga verde C. vulgaris cresceu em frascos de 2L contendo 1L de meio Z8, tendo sido sujeita às mesmas condições da M. aeruginosa. 3.2 Preparação da MC-LR purificada e células de cultura de M. aeruginosa 3.2.1 Quantificação celular de cultura tóxica de M. aeruginosa Esta quantificação foi determinada por contagem de células ao microscópio de luz com o auxílio de câmara de Neubauer. A câmara de Neubauer é uma câmara de contagem formada por duas grelhas. Cada uma destas grelhas tem centralmente uma subgrelha de 25 quadrículas (5 x 5), cada uma das quais também dividida em 16 subquadrículas (4 x 4). Uma amostra representativa da cultura de M. aeruginosa foi introduzida, com uma pipeta de Pasteur, entre a lamela e a câmara, de forma a cobrir a zona das grelhas. Depois Material e Métodos posteriormente para 150 V até que a linha de azul de bromofenol atingisse a parte inferior dos géis. Após a eletroforese procedeu-se à coloração dos géis com Azul de Coomassie Coloidal, de acordo com o protocolo referido no ponto 3.5. 3.6.3 Aquisição de imagem e análise As imagens dos géis 2DE (400 dpi) foram adquiridas usando um Densitómetro Calibrado GS-800 (Bio-Rad, Hercules, CA, EUA) e analisadas utilizando o software PDQuest 2-D Analysis (Bio-Rad, Hercules, CA, EUA). As intensidades dos pontos foram normalizadas em relação à densidade total do gel. Para a deteção dos pontos, primeiramente foi feito o matching automático pelo software, seguido pela verificação manual das correspondências. A análise das diferenças de expressão proteica quantitativas e qualitativas foram efetuadas com base em duas réplicas por tratamento. Nesta análise foram apenas considerados os pontos presentes nos 2 géis de qualquer tratamento que apresentassem uma diferença mínima de 10 vezes sobre a densidade base de fundo do gel. Na análise quantitativa estabeleceu-se um fator mínimo de variação de abundância de 5 vezes dos grupos de exposição em relação ao grupo controlo. Na análise qualitativa foi detetada a presença/ausência dos pontos dos grupos de exposição em relação ao grupo controlo. 3.6.4 Identificação das GST’s por espectrometria de massa. Os pontos de interesse foram excisados manualmente a partir dos géis, colocados em tubos de microcentrífuga estéreis contendo água ultra-pura e armazenados a -4°C até à digestão. Para este processo, os fragmentos de gel foram descorados procedendo-se a uma primeira lavagem com água ultrapura e duas adicionais com acetonitrilo (ACN) 50% (v/v). De seguida adicionou-se ACN (100%) e os fragmentos foram desidratados no speedvac. De seguida procedeu-se à redução e alquilação das proteínas adicionando DTT (25 mM) preparado em NH4HCO3 (50 mM), e iodoacetamida (55 mM) preparada em NH4HCO3 (100 mM) respetivamente. Posteriormente, os fragmentos foram novamente desidratados sendo expostos gradualmente a H2O ultra-pura, ACN (50%) e ACN (100%) sendo seguidamente secos no speevac. Os fragmentos de gel foram reidratados com 6,7 ng/µL de uma solução de tripsina (Promega, Madison, WI, EUA) (Campos et al., 2013) com surfactante (NH4HCO3 50 mM). A incubação durou 30 min em gelo. De seguida adicionamos o tampão de digestão (NH4HCO3, 50 mM) e as proteínas ficaram a incubar por 4 horas a 37 ºC. A solução contendo os péptidos foi recolhida para um novo eppendorf e armazenadas a -20ºC. Material e Métodos As proteínas digeridas foram depois dessalinizadas e concentradas utilizando micro-colunas C18 (Millipore, Bedford, MA, EUA), seguindo as instruções do fabricante. As colunas começaram por ser equilibradas com ACN 100% seguidas de TFA 0,1%. De seguida as amostras foram aspiradas e lavadas com TFA 0,1%. As proteínas foram eluídas com a matriz uma solução de ácido α-ciano-4-hidroxicinâmico (5-10 mg/mL) em 50% de ACN/0,1% de TFA. As amostras foram analisadas usando o espectrómetro de massa 4800 Plus MALDI TOF/TOF (AB SCIEX, Framingham, MA, EUA). Os dados das impressões digitais da massa peptídica foram recolhidos em modo refletor MS positivo, na gama de 700-4000 rácio de massa-carga (m/z), sendo calibrado internamente usando os picos da autólise da tripsina. Os picos de intensidade mais elevada foram selecionados para análise de MS em paralelo (MS/MS). Os espectros foram analisados por meio de GPS Explorer (versão 3.6; Applied Biosystems, Foster City, CA, EUA). Foram investigados os dados de MS/MS em conjunto com uma cópia armazenada localmente no NCBInr e SwissProt usando o motor de busca Mascot (Version 2.1.04) (Perkins et al., 1999). A classificação taxonómica do Mytilus galloprovincialis foi considerada para esta análise. 3.7 Análise estatística Os dados obtidos para a actividade enzimática foram analisados no software SPSS (versão 22.0 para Windows). Foi realizado o teste de Shapiro-Wilk de forma a verificar se as variáveis seguiam uma distribuição normal (p> 0,05). Quando as variáveis seguiam uma distribuição normal os dados foram sujeitos a uma análise paramétrica através do teste t para amostras independentes e as diferenças foram consideradas estatisticamente significativas a um p <0,05. Quando as variáveis não apresentaram uma distribuição normal e a sua transformação não foi possível optou-se por uma análise não paramétrica através do teste Mann-Whitney U sendo as diferenças consideradas estatisticamente significativas a um p <0,05. Todos os gráficos foram realizadas usando o software GraphPad Prism version 5.0 (GraphPad Software, Inc., San Diego, CA, EUA). 22 4. Resultados e Discussão Os organismos aquáticos estão especialmente sujeitos ao contacto mais direto e frequente com as MCs. Nestes organismos, o processo de destoxificação representa uma adaptação biológica de importância fundamental que pode influenciar a capacidade destes em sobreviver a situações de florescências de cianobactérias. A formação de conjugados de MC-LR-GSH foi demonstrada in vitro em vários organismos aquáticos, incluindo bivalves, e é sugerida como o primeiro passo na destoxificação de MCs nestes organismos (Stephan Pflugmacher et al., 1998). No entanto, as GST`s compreendem um vasto conjunto de isoformas, pouco se sabendo sobre o papel individual de cada uma no processo de destoxificação de MCs. Uma maior eficiência do processo de destoxificação pode resultar numa maior resistência dos organismos a florescências de cianobactérias tóxicas. A diversidade das isoformas GST’s e a sua promiscuidade catalítica pode ser entendida como uma vantagem em situações de stress químico. Deste modo, a identificação de isoformas específicas envolvidas, individualmente ou não, na biotransformação e biodegradação de xenobióticos é fundamental. Neste trabalho foram estudadas as alterações da expressão das GST’s citosólicas nas brânquias e hepatopâncreas do mexilhão M. galloprovincialis induzidas pela exposição a MC-LR purificada e a uma estirpe tóxica de M. aeruginosa. 4.1 Purificação das GST`s citosólicas As GST`s citosólicas das brânquias e hepatopâncreas de M. galloprovincialis submetidos a MC-LR e à estirpe de M. aeruginosa foram purificadas recorrendo à cromatografia de afinidade em coluna GSH-agarose. As Tabelas 5 e 6 mostram os resultados das várias etapas dessa purificação para cada uma das condições de exposição em ambos os órgãos. As etapas compreendem o extrato após centrifugação a 4600 xg (Extrato bruto), o extrato após centrifugação a 100000 xg (Ultracentrifugado) e por último a fração obtida após purificação com cromatografia de afinidade (Eluato de afinidade). Os resultados obtidos demonstram que o processo de purificação das GST’s citosólicas adotado neste estudo permitiu obter níveis semelhantes de rendimento e de aumento da atividade específica para cada uma das condições de exposição, em ambos os órgãos. Resultados e Discussão Tabela 5 - Processo de purificação das GST`s citosólicas das brânquias de M. galloprovincialis expostos a uma cultura de M. aeruginosa e MC-LR pura. U*: Unidades = µmol/min Os valores representam a média de três réplicas e os respetivos desvios padrão. Tabela 6 - Processo de purificação das GST`s citosólicas do hepatopâncreas de M. galloprovincialis expostos a uma cultura de M. aeruginosa e MC-LR pura. U*: Unidades = µmol/min Os valores representam a média de três réplicas e os respetivos desvios padrão. De uma maneira geral, as primeiras duas fases relativas ao processo de homogeneização e centrifugação apresentam elevado conteúdo em proteínas em relação à última etapa de purificação. O rendimento do processo variou entre 1,2 e 2,0 % nas brânquias e 1,2 e 3,4% no hepatopâncreas. Estes rendimentos foram bastante inferiores aos descritos por (Vidal et al., 2002), para as brânquias (50%) e massa visceral (44%) de Corbicula fluminea, no entanto semelhantes aos encontrados por Yang et al. (2003) no Frações Proteína Total (mg) Atividade (U*) Atividade Específica (U/mg) Fator de Purificação Rendimento (%) Não-expostos Extrato bruto 67,33 ±9,92 32,54 ±8,58 0,48 ±0,06 1 100 Ultracentrifugado 52,23 ±7,06 28,58 ±5,97 0,54 ±0,04 1,14 88 Eluato de afinidade 0,08 ±0,03 0,63 ±0,09 10,55 ±2,05 22,1 1,9 MC-LR Purificada Extrato bruto 63,50 ±3,75 35,68 ±3,51 0,84 ±0,45 1 100 Ultracentrifugado 52,97 ±2,78 35,7 ±2,21 0,95 ±0,52 1,14 100 Eluato de afinidade 0,06 ±0,00 0,70 ±0,21 11,17 ±3,49 13,3 2,0 Cultura de M. aeruginosa Extrato bruto 71,15 ±12,62 70,57 ±7,69 1,29 ±0,34 1 100 Ultra centrifugado 51,49 ±4,67 77,89 ±16,4 1,27 ±0,34 0,98 110 Eluato de afinidade 0,06 ±0,01 0,76 ±0,01 13,05 ±0,21 10,1 1,2 Frações Proteína Total (mg) Atividade (U*) Atividade Específica (U/mg) Fator de Purificação Rendimento (%) Não-expostos Extrato bruto 21,07 ±0,94 8,01 ±1,78 0,38 ±0,08 1 100 Ultracentrifugado 15,71 ±0,36 8,24 ±2,14 0,52 ±0,13 1,38 103 Eluato de afinidade 0,07 ±0,00 0,27 ±0,20 3,95 ±2,76 10,1 3,4 MC-LR Purificada Extrato bruto 23,73 ±3,50 13,26 ±3,57 0,55 ±0,07 1 100 Ultracentrifugado 13,64 ±2,09 8,86 ±1,95 0,65 ±0,05 1,17 67 Eluato de afinidade 0,06 ±0,00 0,53 ±0,53 8,44 ±8,65 15,3 2,7 Cultura de M. aeruginosa Extrato bruto 24,05 ±0,71 11,01 ±0,45 0,46 ±0,01 1 100 Ultracentrifugado 13,44 ±1,33 7,86 ±1,08 0,58 ±0,02 1,27 71 Eluato de afinidade 0,06 ±0,01 0,18 ±0,02 2,89 ±0,04 6,4 1,2 Resultados e Discussão hepatopâncreas de Atactodea striata (2,2%). Para ambos os órgãos, a atividade total diminuiu com as várias etapas do processo de purificação, enquanto a atividade específica aumentou. No caso das brânquias esse aumento variou entre 10,1 e 22,1 vezes e 6,4 e 15,3 vezes no caso do hepatopâncreas. Valores semelhantes foram obtidos por Yang et al. (2003) depois de purificar as GST’s citosólicas do hepatopâncreas do bivalve marinho Atactodea striata, encontrando um aumento da atividade específica de 6,1 vezes após a etapa de purificação por afinidade. Já em C. fluminea, os valores encontrados foram bastante superiores após a mesma etapa de purificação, nomeadamente um aumento da atividade específica de 75 vezes na massa visceral e de 120 vezes nas brânquias(Vidal et al., 2002). 4.2 Caracterização das GST’s citosólicas por SDS-PAGE e Electroforese Bidimensional Os perfis proteicos das frações purificadas relativas às brânquias e hepatopâncreas do grupo de bivalves não expostos foram analisados por eletroforese SDS-PAGE (Figura 4). As GST`s solúveis são, regra geral, dímeros biologicamente ativos de subunidades compreendidas entre 23 a 30 KDa (Frova, 2006). Foi possível observar nas nossas amostras que o peso molecular das GST’s citosólicas de ambos os órgãos se encontram neste intervalo (Figura 4). De facto, o perfil das frações purificadas de ambos os órgãos é semelhante, consistindo em quatro bandas. No entanto, estas parecem demonstrar diferentes intensidades entre elas e entre os órgãos. De referir que estas frações não apresentam contaminação, refletida pela ausência de outras bandas de proteínas com massas moleculares distintas, confirmando o grau de pureza das frações purificadas das brânquias e hepatopâncreas. Resultados e Discussão Figura 4 - SDS-PAGE das frações purificadas das brânquias e hepatopâncreas. a: marcador de peso molecular; b: brânquias; c: hepatopâncreas Os mesmos extratos proteicos purificados relativos às brânquias e ao hepatopâncreas do grupo de bivalves não-expostos foram seguidamente analisados por eletroforese bi-dimensional em tiras IPG de 7cm (pH 5-8) (Figura 5). Com base na análise proteómica foi possível detetar várias potenciais GST`s citosólicas em ambos os órgãos de M. galloprovincialis. Usando como corante Azul de Coomassie foram detetados nas brânquias 9 pontos e no hepatopâncreas 10 pontos. Estes pontos foram depois excisados e analisados por MALDI-TOF-MS/MS. Os resultados da identificação revelaram, no entanto, uma discrepância significativa entre o número de pontos visualizado nos géis e os identificados (Tabela 7). Resultados e Discussão Figura 5 - Perfil de expressão proteica em gel de eletroforese bidimensional (2-DE) obtido a partir de GST’s citosólicas purificadas de Brânquias (A) e Hepatopâncreas (B) de M. galloprovincialis. Tabela 7 - Identificação das proteínas purificadas por cromatografia de afinidade das brânquias e hepatopâncreas de M. galloprovincialis não expostos . Pontos PI/MR Teórico (10 3 ) Identificação Putativa CI (%) Homologia da proteína Atividade Molecular 2 5,4/22,9 GST 100 Mytilus galloprovincialis Transferase Dos 19 pontos detetados nas brânquias e hepatopâncreas apenas uma proteína foi identificada com um grau de confiança superior a 95%, após análise dos espectros de massa e pesquisa nas bases de dados por sequências homólogas. Essa proteína corresponde ao ponto 2 nas brânquias e foi identificado como uma putativa subunidade de GST (Tabela 7). São várias as razões que podem explicar a escassez de identificações. O uso de organismos “não-modelo”, como é o caso do molusco M. galloprovincialis, pode Resultados e Discussão levar a uma identificação limitada das proteínas devido à falta de informação nas bases de dados (NCBI, Uniprot) disponíveis (Monsinjon & Knigge, 2007). No entanto, para este bivalve e no que respeita especificamente às GST`s citosólicas existe alguma informação disponível. Apesar de não caracterizadas, GST`s das classes-alpha (1 isoforma), pi (1 isoforma) e sigma (3 isoformas) estão descritas no GenBank. Aliás, num estudo recente, a análise proteómica de GST`s purificadas por cromatografia de afinidade em coluna GSHagarose do peso total de M. galloprovincialis resultaram na identificação de várias subunidades de classe-pi_1 e classe-sigma_3 com peso molecular aparente entre 27,6 e 30,9 kDa (Martins et al., 2014). Deste modo, a não identificação de outras subunidades GST neste estudo poderá resultar de outras limitações, nomeadamente da baixa abundância de proteínas ou contaminação das amostras por manipulação durante a digestão ou presentes na própria malha de poliacrilamida (2DE). Apesar da carência de identificações, o único ponto identificado é um bom indicador de que os restantes pontos, apesar de não identificados, sejam também GST’s. Trabalhos anteriores sugerem que a maioria de GST’s expressas em moluscos bivalves pertence às classes sigma, alpha, mu e pi, esta última normalmente a mais expressa (Hoarau et al., 2002; Vidal et al., 2002; Yang et al., 2002; Yang et al., 2003). Em Martins et al. (2014) foram detetadas GST’s das classes pi e sigma em M. galloprovincialis com peso molecular compreendido entre 27,6 e 30,9 KDa. Este facto reforça a ideia de que, apesar de não identificados, os pontos obtidos neste estudo possam ser GST’s. 4.3 Efeitos da exposição às MCs 4.3.1 Atividade das GST’s citosólicas Na Figura 6 estão representados os valores para a atividade das GST’s citosólicas (fração citosólica – Ultracentrifugada) nas brânquias e hepatopâncreas de M. galloprovincialis expostos a MC-LR pura e a uma estirpe tóxica de M. aeruginosa produtora essencialmente de MC-LR. Resultados e Discussão Figura 6 - Actividade das GST’s (fração Ultracentrifugada) nas brânquias e trato digestivo de M. galloprovincialis expostos a MC-LR pura e a células tóxicas de M. aeruginosa. As colunas representam a média de três réplicas. As barras representam o desvio-padrão. As diferenças significativas (p <0,05) relativamente ao grupo de controlo estão assinaladas (*). Os dois tipos de exposição induziram um aumento da atividade das GST’s citosólicas nas brânquias, sendo este significativo na exposição à estirpe tóxica (p <0,05). Neste órgão, comparativamente ao grupo controlo, os organismos expostos a MC-LR purificada mostraram um aumento da atividade das GST’s citosólicas de 1,8 vezes e de 2,4 vezes quando expostos à cultura de M. aeruginosa. Em contraste, não se verificaram alterações significativas no hepatopâncreas decorrentes dos dois cenários de exposição. No hepatopâncreas, com o tratamento de MC-LR purificada, os organismos apresentaram um ligeiro aumento da atividade das GST’s citosólicas de 1,3 vezes relativamente ao controlo e de 1,1 vezes no caso do grupo exposto à cultura de M. aeruginosa. O facto de as brânquias estarem primeiramente expostas à toxina em relação ao hepatopâncreas pode fazer com que estas apresentem alterações mais significativas e precoces das atividades das GST’s. Fernandes et al. (2009) sugerem que a menor indução de atividade GST no hepatopâncreas em relação às brânquias por uma cultura tóxica de M. aeruginosa em mexilhões pode também estar relacionado com a produção de tóxicos intermediários no hepatopâncreas. Estes, durante o metabolismo, podem inativar as enzimas levando à redução dos níveis de atividade das GST’s neste órgão. Isto foi previamente observado por Cheung et al. (2001) em estudos realizados com Perna viridis. Resultados e Discussão Num estudo similar ao presente, Vasconcelos et al. (2007) também observaram aumentos da atividade das GST’s nas brânquias de mexilhões quando expostos a MCs puras. No entanto observaram esse mesmo aumento de atividade promovido por MCs puras no hepatopâncreas. Contrariamente a este estudo, os mesmos autores também não observaram qualquer alteração da actividade das GST’s induzida por uma cultura tóxica de M. aeruginosa (Vasconcelos et al., 2007). As diferenças de resultados entre os dois estudos podem dever-se ao uso de uma mistura de MCs puras (-LR+-YR) e a uma estirpe diferente de M. aeruginosa (M13) (Vasconcelos et al., 2007). 4.3.2 Expressão diferencial das GST’s citosólicas As diferenças de expressão proteica quantitativas e qualitativas foram analisadas nas nas brânquias e hepatopâncreas do mexilhão M. galloprovincilalis após serem submetidos 24 horas a MC-LR pura e a uma estirpe tóxica de M. aeruginosa. Na análise quantitativa só foram considerados os pontos com um factor mínimo de variação de abundância de 5 vezes dos grupos de exposição em relação ao grupo controlo. Para a análise quantitativa foi considerada a presença/ausência dos pontos dos grupos de exposição em relação ao grupo controlo. Nas brânquias, a alteração quantitativa da expressão de proteínas foi detetada em 5 pontos no grupo de bivalves expostos à cultura de M. aeruginosa. Todos os pontos foram sobre-expressos em relação ao grupo controlo, com diferenças de expressão entre 5,8 e 15,7 vezes. Entre estes está o ponto 2, identificado como uma putativa subunidade GST, com uma diferença de expressão em relação ao controlo de 11,9 vezes. Neste órgão foram detetadas 2 diferenças qualitativas entre os grupos de exposição e o grupo controlo em ambos os grupos de exposição. Os pontos 3 e 5 estão ausentes nos bivalves expostos a MC-LR e à cultura de M. aeruginosa. No hepatopâncreas, a alteração quantitativa da expressão de proteínas foi detetada em 4 pontos no grupo de bivalves expostos a MC-LR pura e em 1 ponto no grupo de bivalves expostos a M. aeruginosa. Todos os pontos foram sobre-expressos nos bivalves expostos a MC-LR em relação ao grupo controlo, com diferenças de expressão entre 6,1 e 9,2 vezes. Relativamente aos bivalves expostos a M. aeruginosa, o único ponto quantitativamente alterado foi sub-expresso em relação ao controlo, com uma diferença de expressão de 6,2 vezes. Referências Hitzfeld, B. C., Höger, S. J., & Dietrich, D. R. (2000). Cyanobacterial toxins: removal during drinking water treatment, and human risk assessment. Environmental Health Perspectives, 108, 113–122. Hoarau, P., Damiens, G., Roméo, M., Gnassia-Barelli, M., & Bebianno, M. J. (2006). Cloning and expression of a GST-pi gene in Mytilus galloprovincialis. Attempt to use the GST-pi transcript as a biomarker of pollution. Comparative Biochemistry and Physiology. Toxicology & Pharmacology : CBP, 143(2), 196–203. Hoarau, P., Garello, G., Gnassia-Barelli, M., Romeo, M., & Girard, J.-P. (2002). Purification and partial characterization of seven glutathione S -transferase isoforms from the clam Ruditapes decussatus. European Journal of Biochemistry, 269(17), 4359–4366. 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Anexos 7.1 Quantificação de MC-LR purificada por HPLC-PDA 7.1.1 Reta de Calibração Figura 9 - Gráfico da reta de calibração com os valores dos padrões 1 a 7 A equação da reta de calibração do gráfico da Figura 9, usada para o cálculo da MC-LR foi: y = 45644 × - 11514. 0 100000 200000 300000 400000 500000 0 2 4 6 8 10 12 Concentração (µg/ml) P1P2 P3 P4 P5 P6 P7 Anexos 7.1.2 Cromatogramas do Sistema de HPLC Figura 10 - Cromatogramas do sistema de HPLC referente a MC-LR Purificada, Extrato Bruto de M. aeruginosa, Padrão e Branco e os seus respetivos espectrogramas de absorção na faixa de 200-300nm. O valor obtido da concentração de MC-LR purificada foi de 9,2 µg/mL e o grau de pureza 90,31%. Este trabalho é financiado por Fundos FEDER através do Programa Operacional Factores de Competitividade – COMPETE e por Fundos Nacionais através da FCT – Fundação para a Ciência e a Tecnologia no âmbito do projeto PTDC/MAREST/4614/2012 - “The role of glutatione-S-transferase isoenzymes in bivalve’s tolerance to microcystins”.