Repositorio Institucional de Documentos

2021 124 Lourdes Soler Baigorri Desarrollo de metodologías analíticas y estudios sobre la aplicabilidad de las proteínas de fase aguda como biomarcadores de salud y bienestar animal en el perro. Caracterización de ITIH4 como nueva proteína de fase aguda canina Director/es Piñeiro Pardo, Matilde Lampreave Palacios, Fermín © Universidad de Zaragoza Servicio de Publicaciones ISSN 2254-7606 Lourdes Soler Baigorri DESARROLLO DE METODOLOGÍAS ANALÍTICAS Y ESTUDIOS SOBRE LA APLICABILIDAD DE LAS PROTEÍNAS DE FASE AGUDA COMO BIOMARCADORES DE SALUD Y BIENESTAR ANIMAL EN EL PERRO. CARACTERIZACIÓN DE ITIH4 COMO NUEVA PROTEÍNA DE FASE AGUDA CANINA Director/es Piñeiro Pardo, Matilde Lampreave Palacios, Fermín Tesis Doctoral Autor 2019 Repositorio de la Universidad de Zaragoza – Zaguan http://zaguan.unizar.es UNIVERSIDAD DE ZARAGOZA Escuela de Doctorado Programa de Doctorado en Bioquímica y Biología Molecular Tesis Doctoral Desarrollo de metodologías analíticas y estudios sobre la aplicabilidad de las proteínas de fase aguda como biomarcadores de salud y bienestar animal en el perro Caracterización de ITIH4 como nueva proteína de fase aguda canina Memoria presentada por Lourdes Soler Baigorri Para optar al Grado de Doctor en Bioquímica y Biología Molecular Zaragoza, diciembre 2018 D. Fermín Lampreave Palacios, Catedrático de Bioquímica y Biología Molecular, Departamento de Bioquímica y Biología Molecular y Celular de la Universidad de Zaragoza, Dª. Matilde Piñeiro Pardo, Doctora en Ciencias Químicas, Directora I+D de la empresa Acuvet Biotech, Zaragoza, CERTIFICAN: Que la memoria titulada “Desarrollo de metodologías analíticas y estudios sobre la aplicabilidad de las PFAs como biomarcadores de salud y bienestar animal en el perro. Caracterización de ITIH4 como nueva proteína de fase aguda canina”, presentada por la Licenciada en Bioquímica Dª Lourdes Soler Baigorri, ha sido realizada bajo su dirección cumpliendo los requisitos exigidos en la legislación vigente para optar al Grado de Doctor en Bioquímica y Biología Molecular. Zaragoza, 17 de diciembre de 2018 Fermín Lampreave Palacios Matilde Piñeiro Pardo Para la realización de esta tesis se ha recibido financiación del Programa Doctorado Industrial, Plan Estatal de Investigación Científica y Técnica y de Innovación 2013-2016. Índice 3.3 Concentración de soluciones proteicas por ultrafiltración.......................... 70 3.3.1 Concentración de muestras por presión de nitrógeno ........................ 70 3.3.2 Ultrafiltración impulsada por centrifugación ........................................ 70 3.4 Cuantificación de proteína total.................................................................. 71 3.5 Identificación de proteínas ......................................................................... 72 3.5.1 MALDI TOF MS................................................................................... 72 3.5.2 LC-MS/MS........................................................................................... 72 3.6 Métodos inmunoquímicos .......................................................................... 73 3.6.1 Preparación de antisueros .................................................................. 73 3.6.2 Preparación de columnas de inmunoafinidad..................................... 77 3.6.3 Obtención de anticuerpos ................................................................... 78 3.6.4 Técnicas de inmunoprecipitación en gel............................................. 79 3.6.5 Métodos inmunoenzimáticos............................................................... 81 3.6.6 Método inmunoturbidimétrico para la cuantificación de CRP canina.. 85 3.7 Validación de métodos analíticos............................................................... 85 3.8 Determinación de PFAs en modelos experimentales ................................ 87 3.8.1 Medida de los niveles de PFAs en muestras de cirugía mayor .......... 87 3.8.2 Caracterización de los niveles de ITIH4 en perras afectadas por piometra.......................................................................................................... 88 3.8.3 PFA en sueros e hígados de perros infectados con L. infantum. Estudio 1......................................................................................................... 90 3.8.4 Evolución de las PFAs en animales infectados con L. infantum. Estudio 2......................................................................................................... 93 3.8.5 Asignación de valores de PFAs en animales sanos ........................... 96 3.8.6 Evaluación de los niveles de PFA en perros alojados en Centros de Protección....................................................................................................... 97 Índice 4 RESULTADOS................................................................................................ 99 4.1 Purificación de proteínas y obtención de antisueros................................ 101 4.1.1 Purificación de ITIH4 canina y obtención de antisueros ................... 101 4.1.2 Purificación CRP canina y obtención de antisueros. ........................ 103 4.1.3 Purificación de haptoglobina canina y obtención de antisueros. ...... 105 4.1.4 Purificación de α1 glicoproteína ácida canina y obtención de antisueros..................................................................................................... 109 4.2 Desarrollo y validación de métodos analíticos para la cuantificación de PFAs caninas................................................................................................... 111 4.2.1 Desarrollo y validación de métodos de inmunodifusión radial para la cuantificación de ITIH4, CRP, Hp y GPA caninas........................................ 111 4.2.2 Desarrollo y validación de un ELISA para la determinación de ITIH4 canina .......................................................................................................... 118 4.2.3 Desarrollo y validación de un ELISA para la determinación de Hp canina .......................................................................................................... 121 4.2.4 Método turbidimétrico para la cuantificación de CRP canina. Adaptación para su uso en placa microtiter. ................................................ 124 4.3 Caracterización de ITIH4 como PFA en el perro. Modelos experimentales129 4.3.1 Estudio en muestras de perros sometidos a cirugía mayor.............. 129 4.3.2 Caracterización de los niveles de ITIH4 en el suero de perras afectadas por piometra................................................................................. 132 4.3.3 Proteínas de fase aguda tras infección experimental con L. infantum136 4.4 Asignación de los valores de referencia para las PFAs en animales sanos149 4.5 Evaluación de los niveles de PFAs en centros de protección.................. 156 4.5.1 Evolución de los animales en los centros ......................................... 156 4.5.2 Niveles de CRP en animales alojados en centros de protección animal. Estudio 2.......................................................................................... 170 Índice 5 DISCUSIÓN.................................................................................................. 177 5.1 Purificación de proteínas y obtención de antisueros................................ 179 5.2 Desarrollo y validación de métodos analíticos......................................... 183 5.3 Respuesta de ITIH4 durante la fase aguda ............................................. 189 5.4 Niveles de PFA en perras afectadas por piometra .................................. 195 5.5 PFAs como biomarcadores en L. infantum.............................................. 198 5.6 Niveles de referencia de las PFAs........................................................... 206 5.7 Niveles de PFA en perros alojados en centros de protección animal. PFAs en la evaluación del bienestar animal.............................................................. 208 6 CONCLUSIONES ......................................................................................... 215 7 BIBLIOGRAFÍA............................................................................................. 219 8 ANEXOS....................................................................................................... 244 9 ÍNDICE DE TABLAS..................................................................................... 253 10 ÍNDICE DE FIGURAS................................................................................... 257 11 ABREVIATURAS .......................................................................................... 263 Introducción 1 INTRODUCCIÓN Introducción Introducción 1.1 La respuesta de fase aguda. La respuesta de fase aguda (RFA) es una reacción compleja y no específica de un animal tras un daño tisular producido tanto por agentes externos como internos. Atendiendo a su naturaleza, el agente puede ser físico (traumatismos, cirugías, quemaduras…), químico (irritación por tóxicos) o biológico (infección, crecimiento tumoral, alteraciones inmunológicas…). Esta respuesta se considera parte del sistema innato de defensa del organismo y actúa como predecesora de la respuesta inmune adquirida. Se genera durante las primeras etapas del ataque y es la responsable de la supervivencia del individuo. En el sitio de lesión se genera una inflamación localizada y muy controlada ya que trata de adecuarse a la magnitud de la amenaza. (Kushner 1982; Gabay et al., 1999; Eckersall 2000). El inicio y la progresión de la RFA responden a una reacción coordinada por los mediadores de inflamación. Las citoquinas proinflamatorias, factor de necrosis tumoral (TNF), interleuquina-1 (IL-1) e interleuquina-6 (IL-6), son los mediadores más importantes en el inicio de la RFA. Estas citoquinas inducen un número de respuestas locales y sistémicas. Al inicio de la respuesta se observan cambios en el calibre, permeabilidad y flujo vasculares. Se produce la acreción de leucocitos a las zonas inflamadas y si es necesario se activan las vías de coagulación y del complemento para el desarrollo de una respuesta de defensa óptima. El tejido inflamado y el sistema vascular circundante libera una segunda oleada de citoquinas que actúan sobre los órganos diana dando lugar a una reacción sistémica en la que se producen numerosos cambios fisiológicos, metabólicos y endocrinos (Ceciliani et al., 2002) (Tabla 1). Introducción Tabla 1. Cambios neuroendocrinos, metabólicos, hematopoyéticos y hepáticos producidos en el organismo durante la respuesta de fase aguda. Cambios neuroendocrinos Fiebre, pérdida de apetito y somnolencia Aumento de la secreción de ACTH (hormona adrenocorticotrópica), cortisol y catecolaminas Cambios metabólicos Aumento del catabolismo protéico Producción hepática de las Proteínas de Fase Aguda Aumento de la lipogénesis hepática Aumento de la lipólisis del tejido adiposo Disminución de la masa ósea Aumento de la gluconeogénesis Disminución de la proteín lipasa en músculo y tejido adiposo Hipertrigliceridemia e hipocolesterolemia Cambios hematopoiéticos Anemia (en enfermedades crónicas) Leucocitosis Trombocitosis Cambios en constituyentes plasmáticos no protéicos Hipozinquemia, hipoferremia e hipercupremia Aumento de las concentraciones plasmáticas de retinol y glutatión Cecilliani et al., 2002. Protein and Peptide Letters El sistema nervioso y el sistema endocrino se ven afectados y estimulados por las citoquinas pro-inflamatorias, produciéndose alteraciones en el comportamiento, cambios fisiológicos, bioquímicos y nutricionales. La activación del eje hipotálamo-pituitario-adrenal es una de las principales características neuroendocrinas de la RFA, que se traduce en la liberación de sustancias como la hormona adrenocorticotrópica (ACTH), y el aumento en los niveles de cortisol Introducción (Borghetti et al., 2009). Una de las principales manifestaciones clínicas es la fiebre. Se cree que la fiebre puede ser una respuesta a la IL-6 mediante la producción de prostaglandinas, otros mediadores que afectan al hipotálamo (Dinarello 2004). Igualmente se observan cambios en la concentración sérica de iones como hierro y cinc, así como es su redistribución en los tejidos donde ejercen una actividad antioxidante (Borghetti et al., 2009). Figura 1. Esquema de la respuesta de fase aguda. Fecha roja representa efecto inhibición Introducción Uno de los principales cambios metabólicos que se producen en el organismo es el cambio en la síntesis de las proteínas de fase aguda (PFAs) (Gabay et al., 1999). Estas proteínas pertenecen al grupo de proteínas plasmáticas cuya concentración cambia, al menos un 25 % su concentración basal, como respuesta a estímulos internos o externos en el organismo. El hígado es el principal órgano que sintetiza PFAs, y su concentración plasmática se ve alterada como consecuencia de las alteraciones de tamaño, ultraestructura y actividad metabólica producidas en este órgano (Kushner 1982). La producción de las PFAs en el hígado viene estimulada por las citoquinas pro-inflamatorias, concretamente la inducción de la expresión de estas proteínas se produce en los hepatocitos. Además de la producción hepática, las PFAs pueden ser sintetizadas por otros tejidos como la glándula mamaria (Gronlund et al., 2003; Eckersall et al., 2006), la glándula salival (Lecchi et al., 2009), el tracto gastrointestinal (Vreugdenhil et al., 1999), los riñones y los pulmones (Ramadori et al., 1985) entre otros. Sin embargo, la aportación extra-hepática a las concentraciones plasmáticas durante la fase aguda es pequeña. 1.1.1 Regulación de los cambios de fase aguda y síntesis de las PFAs Los monocitos/macrófagos desempeñan un papel fundamental en el inicio de la cascada de eventos que se desencadenan durante la RFA. Los macrófagos presentan en su superficie receptores de patrones de reconocimiento (TLR, Toll Like Receptors), que pueden interaccionar con determinadas estructuras moleculares compartidas por los microorganismos y que se denominan PAMP (patrones moleculares asociados a patógenos). La interacción entre las secuencias PAMP y TLR produce la activación de rutas que activan al factor nuclear NF-κB, que una vez activado, migra desde el citoplasma al núcleo e induce la transcripción de citoquinas pro-inflamatorias (García De Lorenzo Y Mateos et al., 2000). La síntesis y liberación de las PFAs se atribuye al efecto de los mediadores de inflamación liberados por los monocitos, los macrófagos y células estromales Introducción activadas. Estos mediadores de inflamación pueden agruparse en cuatro categorías, citoquinas de tipo IL-6, citoquinas de tipo IL-1 (IL-1α, IL-1β, TNFα, TNFβ), glucocorticoides y factores de crecimiento. Las citoquinas actúan como estimuladoras de la expresión génica de las PFA, mientras que los glucocorticoides y los factores de crecimiento modulan la actividad de las propias citoquinas. (Baumann et al., 1994). Las primeras citoquinas liberadas tras el estímulo son el TNFα y la IL-1β, cada una de las cuales estimula la producción de la otra. La expresión de TNFα, IL-1 e INF-ɣ es crucial para la expresión de otros mediadores como prostaglandinas y leucotrienos, que a su vez inducen la expresión del factor activador de las plaquetas y otras citoquinas (IL-6, IL-8). La síntesis de la IL-6 viene estimulada por TNFα e IL-1, y a su vez la IL-6 estimula su propia producción e inhibe la síntesis de TNFα e IL-1. La liberación de citoquinas antiinflamatorias (IL-4, IL-10) también disminuye la producción de TNFα e IL-1 en los monocitos. La unión de los mediadores de inflamación a sus respectivos receptores en los hepatocitos y la transducción de esta señal, induce cambios en la expresión génica de las PFAs (Baumann et al., 1994). Según el tipo de mediadores que regulan su síntesis, se suele hablar de dos tipos de PFAs. Las PFAs de tipo I, aquellas inducidas por citoquinas de tipo IL-1, y las PFAs de tipo II, las inducidas por citoquinas del tipo IL-6. La IL-6 es capaz de estimular directamente la síntesis de la mayoría de las PFAs (Castell et al., 1989) y también puede actuar de forma sinérgica con las citoquinas de tipo IL-1 en la estimulación de las PFAs de tipo I. Las citoquinas de tipo IL-1, no son capaces de estimular directamente la síntesis de las proteínas de tipo II y si tienen algún efecto sobre su síntesis suele ser de tipo inhibitorio (Baumann et al., 1994). La GPA, el componente C3 del complemento, el SAA, la Hp de rata, la CRP y la Apo A-I son PFAs de tipo I, mientras que la ITIH4, el fibrinógeno, la Hp humana, la α1antitripsina y la ceruloplasmina son de tipo II (Piñeiro et al., 1999; GonzalezRamon et al., 2000; Haas et al., 2003; Navarro et al., 2005). Entre las citoquinas de tipo IL-6, además de la propia IL-6 se encuentran otras como la oncostatina M Introducción CRP; proteina C reactiva, SAA; amiloide A sérico, GPA; α1-glicoproteína ácida, Fb; fibrinógeno, Hp; haptoglobina, Cp; ceruloplasmina, Tf; transferrina, Apo A-I; apolipoproteína A-I. Revisado en Petersen et al., 2004; Eckersall et al., 2008; Kjelgaard-Hansen et al., 2011; GómezLaguna et al., 2011 En general, en todas las especies de mamíferos estudiadas hasta el momento, existe un incremento en la síntesis de la haptoglobina (Hp), fibrinógeno (Fb) y α1-glicoproteína ácida (GPA), con excepción del cerdo para esta última (Lampreave et al., 1994), y una reducción en la síntesis de la albúmina y la transferrina (a excepción del pollo) durante la RFA. Por el contrario la CRP y SAA muestran grandes diferencias de una especie a otra. A continuación se describen algunas de las PFAs más relevantes: Proteína C reactiva La proteína C reactiva (CRP) fue la primera PFA identificada en el suero de humanos y primates no humanos (Abernethy et al., 1941). Su presencia en los sueros infectados pudo ponerse en evidencia por ser precipitable por el polisacárido C de las bacterias del género Pneumococcus. A esta propiedad debe su nombre de proteína C reactiva (CRP). Es una pentraxina, que consta de cinco subunidades unidas de manera no covalente y combinadas en forma de estructura pentamérica (Thompson et al., 1999). El peso molecular de la CRP humana es de 118 KDa por equilibrio de sedimentación o de 120 KDa derivado de su secuencia de aminoácidos, con subunidades de 24,3 KDa (Volanakis et al., 1978). A diferencia de la mayoría de PFAs la CRP no es una glicoproteína, excepto en la especie canina donde dos de sus cinco subunidades se encuentran glicosiladas (Caspi et al., 1984). La CRP tiene la capacidad de influir en varias etapas de la inflamación. Una función importante es su capacidad de unirse a fosforilcolina en presencia de Ca2+, pudiendo así reconocer a patógenos extraños así como a fosfolípidos constituyentes de células propias dañadas (Gabay et al., 1999; Thompson et al., Introducción 1999). Los complejos formados por la CRP con células extrañas y dañadas activan la vía clásica del complemento, lo que permite la captación de dichos complejos por los macrófagos gracias a los receptores de CRP presentes en su membrana(Du Clos et al., 2001). De esta manera, la CRP puede iniciar la eliminación de patógenos extraños y también de células propias dañadas, previniendo, en este último caso, los procesos de autoinmunización. Recientemente se ha visto la que la CRP es secretada en su forma pentamérica (pCRP), pero durante la inflamación puede aparecer también en forma monomérica (mCRP) que consta de una única subunidad. Esta última se formaría mediante una disociación irreversible de la pCRP en los sitios de inflamación, daño tisular o infección y serviría, junto con las proteínas C1q y C4bp del complemento, para modular más finamente la activación de la vía clásica del complemento en células necróticas (Sproston et al., 2018). Otros efectos proinflamatorios de la CRP incluyen la inducción de citoquinas inflamatorias en monocitos (Ballou et al., 1992b) En medicina humana, la medida de la CRP es usada como un marcador clínico de inflamación. A pesar de su falta de especificidad, la concentración de CRP refleja la presencia y severidad de los procesos inflamatorios o infecciosos activos (revisado, Pepys 1981). Los niveles encontrados en adultos sanos, suelen ser inferiores a 2 mg/L, aunque niveles hasta 10 mg/L pueden encontrarse en individuos aparentemente sanos. Por encima de 10 mg/L se consideran elevaciones notables En individuos con inflamación, casi siempre debidas a infecciones severas, pueden observarse niveles de hasta 500 µg/mL (Ballou et al., 1992a). La medida de esta proteína ha sido de utilidad en la detección de enfermedades cardiovasculares, además aumentos significativos de CRP se han asociado a diferentes enfermedades como apendicitis, colecistitis, pancreatitis, meningitis y en diabetes gestacional y preclampsia entre otras (Cao et al., 2018; Sproston et al., 2018). Al igual que en humanos, la CRP es una PFA principal en perro y su concentración plasmática se ha visto aumentada en diversas patologías que Introducción afectan a esta especie (Eckersall et al., 2010). En el cerdo también se han observado incrementos en la concentración plasmática de CRP como respuesta frente a estímulos inflamatorios de diferente naturaleza, como la inyección con aceite de trementina (Lampreave et al., 1994) o ante infecciones ocasionadas por diferentes microorganismos de manera aislada (Heegaard et al., 1998) o en combinación con otros (Pomorska-Mol et al., 2013). En la especie equina se han encontrado aumentos de CRP tras diferentes procesos inflamatorios (Takiguchi et al., 1990). Por el contrario, la CRP no se considera de fase aguda en la especie bovina (Petersen et al., 2004). Sin embargo, no hay unanimidad respecto a ése comportamiento entre los investigadores, ya que se han descrito incrementos en su concentración durante infecciones normales ocurridas en granjas relacionándose su concentración con el estado de salud de los animales (Lee et al., 2003). En gato, la CRP tampoco experimenta cambios frente a inflamación (Kajikawa et al., 1999). Haptoglobina La haptoglobina (Hp) es una glicoproteína de la fracción de las α2 globulinas del plasma de muchas especies animales. La Hp humana, y la de la mayoría de los animales, estructuralmente está compuesta por dos subunidades α y dos subunidades β formando un dímero de dos cadenas αβ unidas covalentemente por un puente disulfuro, entre dos residuos Cys15 de cada cadena α. El gen humano de la Hp está formado por tres alelos estructurales, los productos de dichos alelos son los responsables de la presencia de los tres tipos de Hp presentes en la especie humana (1-1, 1-2, 2-2) de diferente estructura y tamaño (Polticelli et al., 2008). La Hp canina, que presenta similitud con el subtipo 1-1 humano, es un tetrámero formado por dos subunidades αβ de 47 KDa en las que cada subunidad contiene una cadena α de 18 KDa y una β de 34 KDa. Sin embargo, a diferencia de la Hp humana, los dímeros αβ no están unidos por puentes disulfuro debido a que la Cys15 participante en el enlace es sustituida por un residuo Leu (Kumazaki et al., 1992; Mominoki et al., 1995). Otra diferencia con la Hp humana es que la cadena α tiene una secuencia de unión a oligosacáridos y Introducción está glicosilada (Mominoki et al., 1995), a diferencia de la humana que unicamente tiene glicanos unidos a sus cadenas β. El patrón de glicosilación de esta proteína puede variar con enfermedades inflamatorias, autoinmunes y neoplasias (Andersson et al., 2001). La función biológica de la Hp, a la que debe su nombre otorgado por sus descubridores Polonowsky y Jayle (1983), se asocia a su capacidad para formar complejos estables con la hemoglobina. De esta forma es capaz de controlar la disponibilidad del hemo circulante, impidiendo la pérdidas excesivas de hierro por excreción en la orina (Giblett 1974; Yang et al., 2003). Los complejos HpHemoglobina son reconocidos por receptores específicos CD163, presentes en los macrófagos, y eliminados del organismo mediante fagocitosis lo que reduce el daño oxidativo de la hemólisis (Kristiansen et al., 2001). Otras funciones atribuidas a la Hp son: estimulación de la angiogénesis, inhibición de la catepsina, hemaglutinación viral, modulación de la función de los macrófagos, estimulación de la formación de protaglandina E2, inhibición de la producción de superóxidos y el aumento de la producción de calcio en los neutrófilos (Kohler et al., 1978; Oh et al., 1990; Frohlander et al., 1991). En el perro la Hp es una PFA moderada y responde frente a diversos estímulos inflamatorios y enfermedades infecciosas. La Hp canina es especialmente sensible al efecto de los glucocorticoides. Valores altos de Hp se han encontrado tras el tratamiento con estos y durante hiperadenocorticoidismo (Eckersall 2008). En otras especies como la porcina, aumentos de esta proteína se han visto asociados con diversos signos clínicos y situaciones inflamatorias (Lampreave et al., 1994; Sorensen et al., 2006; Saco et al., 2016). En caballos se han observado aumentos en los niveles de Hp asociados a la inflamación producida por artritis, tanto en suero como en liquido sinovial (Barrachina et al., 2016). En bovino las concentraciones de Hp en suero son muy bajas (< 20 mg/L), a diferencia de otras especies como perro, gato, caballo y cerdo cuyas concentraciones están un rango de 1 a 2 mg/mL (Eckersall 2008). Esta proteína considerada como PFA principal en el suero bovino, se ha estudiado ampliamente Introducción en suero en el diagnóstico de diferentes enfermedades (Eckersall et al., 2010) y en muestras de leche durante mastitis (Pyorala et al., 2011). La Hp también es proteína de fase aguda en el resto de especies estudiadas, como humano, rata, ratón, conejo, gato (Putnam 1975, Petersen 2004). α1-glicoproteína ácida La α1-glicoproteína ácida (GPA), también conocida como orosomucoide, (Weimer et al., 1950), es quizás la glicoproteína sérica humana mejor caracterizada estructuralmente. En el perro es una glicoproteína de 43 KDa que presenta un alto grado de glicosilación, aproximadamente el 45 % de su peso. Debido a su alto contenido en ácidos siálicos la GPA presenta un bajo punto isoeléctrico, pI muy ácido y numerosas microformas con pI comprendidos entre 2,8 y 3,8. (Dello et al., 1987; Fournier et al., 2000). Al igual que la albúmina sérica, la proteína fijadora de drogas más importante, la GPA puede unirse y transportar sustancias de origen endógeno o exógeno como heparina, histamina, serotonina y esteroides (Fournier et al., 2000). Esta capacidad de unir drogas le confiere una gran utilidad en aplicaciones terapéuticas. La GPA es considerada un antiinflamatorio e inmunomodulador natural. De esta forma, inhibe la activación de los neutrófilos y aumenta la secreción de receptores antagonistas de la IL-1 por los macrófagos (Fournier et al., 2000). Además, puede ayudar en la eliminación del lipopolisacárido (LPS) uniéndose directamente a él y neutralizando así su toxicidad (Moore et al., 1997). Inhibe también la proliferación linfocitaria inducida por mitógenos (Itoh 1989) y la actividad de las células NK (Natural Killer) (Okumura et al., 1985). Se ha mostrado también que la actividad inmunomoduladora de la GPA depende de su glicosilación (Hatton el al, 1983). Finalmente, es relevante destacar que en lechones recién nacidos la GPA puede alcanzar concentraciones de casi 13 mg/mL, que disminuyen rápidamente después del nacimiento (Lampreave et al., 1982; Lampreave et al., 1984). Dicha concentración es más de 40 veces superior a la concentración de los adultos normales y representa casi el 50 % de las Introducción proteínas totales del suero de los cerditos recién nacidos. Puede decirse que la GPA desempeña una función desconocida pero sin duda fisiológicamente importante en el periodo fetal y neonatal porcino. En la mayoría de las especies estudiadas como hombre, rata, ratón (Kushner et al., 1994) GPA es una PFA. En las especies canina y felina GPA se comporta como una PFA positiva moderada. La GPA felina es un reconocido marcador de peritonitis infecciosa y también se han visto niveles elevados en neoplasias (Eckersall et al., 2010). En cerdo por el contrario la GPA no parece comportarse como una proteína de fase aguda, ya que su concentración no se ha visto significativamente modificada significativamente durante la respuesta de fase aguda (Lampreave et al., 1994; Eckersall et al., 1996) aunque recientemente se ha postulado su comportamiento como PFA negativa debido a la disminución de su concentración en el suero de cerdos tras infección experimental con bacterias tanto Gram positivas como Gram negativas e inflamación aséptica inducida con aceite de trementina (Heegaard et al., 2013) Amiloide A sérico El término amiloide A sérico (SAA) comprende a una familia de proteínas polimórficas codificada por múltiples genes (Sipe 1999). Su secuencia está muy conservada en todos los mamíferos, así como en pájaro y otras especies animales. Presenta un número variable de isoformas dependiendo de la especie animal. Los SAA 1 y SAA 2 son PFAs principales, ya que sus concentraciones aumentan hasta 1000 veces durante la inflamación. En leche se ha visto la presencia de una isoforma de esta proteína denominada MAA diferente a la del suero y sintetizada por glándula mamaria en vacas con mastitis (Eckersall 2008). Por el contrario, la SAA 4 es inducida mínimamente durante la RFA y solo se ha encontrado en humanos y en ratones. Aunque SAA es una proteína pequeña y su secuencia y polimorfismos son conocidos los detalles de su estructura tridimensional son imprecisos debido a su carácter hidrofóbico (Sack 2018). Introducción Las SAAs son pequeñas apolipoproteínas de 12-14 KDa que se asocian rápidamente durante la RFA con la fracción de las HDL3 en las que se hacen mayoritarias, excediendo en cantidad a la Apo A-I. Esto modifica drásticamente el metabolismo del colesterol. El SAA aumenta la afinidad de las HDL3 por los macrófagos a la vez que disminuye la afinidad de las HDLs por los hepatocitos (Kisilevsky et al., 1992). Entonces, las HDLs se desplazan a los macrófagos que engullen el colesterol y los restos de lípidos en los sitios de necrosis. El colesterol podría entonces ser redistribuido para usarlo en la reparación del tejido y el exceso sería excretado (Steel and Whitehead, 1994). Además, se le han atribuido otras funciones, como la inducción de enzimas que degradan la matriz extracelular y reclutamiento quimiotáctico de células inflamatorias a los sitios de inflamación (Ye et al., 2015). El SAA 1 está potencialmente involucrado en la patogénesis de varias enfermedades inflamatorias crónicas: es el precursor de la proteína amiloide A depositada la amiloidosis y también ha sido implicada en la patogénesis de la aterosclerosis y la artritis reumatoide (Ceron et al., 2005; Eckersall 2008). El SAA se comporta como PFA principal en la mayoría de las especies de mamíferos estudiadas (Petersen et al., 2004; Ceron et al., 2005), excepto en la rata (Kushner 1988). El SAA junto con la CRP son las principales PFAs en el perro. La determinación de SAA es útil en gatos donde actúa como principal PFA frente a una amplia variedad de procesos inflamatorios e infecciosos (Eckersall et al., 2010). En vaca, aumentos en la concentración de SAA se han asociado a infecciones tanto naturales como experimentales, y junto con Hp, el SAA ha sido propuesto como biomarcador de la mastitis (Eckersall et al., 2010). Elevadas concentraciones de SAA se han encontrado en el suero de caballos sometidos a inflamación experimental (revisado en (Eckersall 2008)), además esta proteína ha sido usada para diferenciar casos infecciosos como enteritis, enterocolitis, peritonitis, o abscesos abdominales, de casos no infecciosos que causan dolor abdominal (Vandenplas et al., 2005) . En humanos SAA muestra una sensibilidad y rapidez de respuesta similar a la que presenta CRP. Niveles elevados de esta proteína se han encontrado asociados a etapas tempranas de diversos tipos de Introducción cáncer, lo que ha llevado a evaluar su papel como posible biomarcador en este tipo de patologías; además debido a su carácter lipofílico los cambios en la concentración de SAA se han asociado a cambios en la formación de HDL y a lesiones ateroscleróticas, así como también se ha visto asociada a sarcoidosis (Revisado en (Sack 2018)). Cadena pesada 4 del inhibidor de tripsina inter-α La cadena pesada 4 del inhibidor de tripsina inter-α (ITIH4) es una glicoproteína sérica, que se incluye dentro de la familia del inhibidor de tripsina inter-α (ITI), dada su homología secuencial con el resto de cadenas pesadas de esta superfamilia. La familia ITI consta de una serie de proteínas plasmáticas que resultan de la unión de una cadena ligera (bikunina) y diferentes cadenas pesadas, que se unen a través de puentes de glicosaminoglicanos (Salier et al., 1996). La familia de las cadenas pesadas consta de 5 miembros: H1, H2, H3, H4 y la última caracterizada, la H5 (Himmelfarb et al., 2004). La bikunina se encuentra unida a las cadenas H1, H2, H3 y H5, pero no a la H4. La falta de bikunina, que contiene dos dominios inhibidores de la tripsina tipo kunitz, hace que la ITIH4, a diferencia del resto de miembros de su familia, no posea capacidad inhibitoria de la tripsina (Gonzalez-Ramon et al., 1995). Inicialmente, bajo el nombre de sgp120 (serum glicoprotein 120 KDa), la ITIH4 humana fue clasificada como una proteína reguladora del complemento (Hammer et al., 1989). Casi al mismo tiempo y de manera independiente, dos grupos japoneses dedujeron la secuencia de 902 aminoácidos para la proteína madura a partir de la secuencia de cDNA (Nishimura et al., 1995; Saguchi et al., 1995). Debido a que esta proteína es sensible a la degradación mediante la calicreína, algunos autores pasaron a denominarle PK-120 (human plasma kallicrein-sensitive protein de 120 KDa) (Nishimura et al., 1995; Pu et al., 1995), mientras que otros la renombraron como IHRP (ITI heavy chain related protein) (Choi-Miura et al., 1995; Saguchi et al., 1995), debido a la homología que presentaba con las cadenas pesadas de familia ITI. Poco antes de llevarse a cabo Introducción estos estudios, la ITIH4 fue descrita como PFA por primera vez en la especie porcina, a la que se le denominó en origen Pig-MAP (major acute phase protein in pigs); esta nueva proteína porcina experimentaba los mayores aumentos de concentración en el suero, tras la inducción de la fase aguda mediante la inyección con aceite de trementina (Lampreave et al., 1994). Posteriormente esta nueva proteína porcina fue identificada como una proteína homóloga a la PK-120 humana, mostrando una homología de 85 % en la secuencia amino terminal (Gonzalez-Ramon et al., 1995). Esta proteína plasmática pasó a denominarse ITIH4 (Salier et al., 1996), aunque el término Pig-MAP es comúnmente utilizado para denominar a esta proteína en el cerdo. Gracias a los estudios de Saguchi y Nishimura, se conoce la secuencia de la ITIH4 humana. El codón de iniciación ATG en el cDNA de esta ITIH4 está flanqueado por una secuencia consenso de tipo Kozak (CCACCATGG), habitual en eucariotas superiores (Saguchi et al., 1995). La proteína se sintetiza en forma de precursor con un péptido señal de 28 aminoácidos. La proteína madura contiene cuatro sitios de glicosilación (Asn53, Asn179, Asn489, Asn549), tres residuos de cisteína (Cys386, Cys719 y Cys879) y tres sitios de reconociminto de la calicreina (Arg455, Arg633, Arg660) dentro de la secuencia (Phe-Arg-Xaa) (Nishimuna et al., 1995, Saguchi et al., 1995). Debido a la acción de la calicreína, en primer lugar se obtienen dos fragmentos, uno de 100 KDa y otro de 35 KDa, seguidamente el fragmento de 35 KDa pasa a 70 KDa y un fragmento teórico de 30 KDa que no se ha encontrado (Pu et al., 1995). Los dos residuos Cys719, Cys879 se encuentran en el fragmento de 35 KDa formando un puente disulfuro. La similitud entre ITIH4 y las cadenas pesadas de la familia ITI, está restringida a los primeros dos tercios de la secuencia amino terminal. En esta región tanto la ITIH4 como las otras cadenas pesadas poseen motivos secuenciales de interés, entre los que se encuentran un dominio Vault, un sitio de unión calcio y un dominio Von Willebrand. La región carboxilo terminal (el último tercio de la secuencia) presenta homología con proteasas dependientes de ATP (Saguchi et al., 1995). Introducción La ITIH4/Pig-MAP se ha estudiado ampliamente en la especie porcina, donde es caracterizada como principal proteína de fase aguda (Lampreave et al., 1994; Heegaard et al., 1998). Su concentración aumenta en infecciones producidas tanto por virus, como por bacterias o parásitos (Carpintero et al., 2007; Martin De La Fuente et al., 2010; Pomorska-Mol et al., 2013). La Pig-MAP también se ha visto elevada en situaciones de estrés y que comprometen al bienestar animal como el transporte (Piñeiro et al., 2007b), el hacinamiento (Marco-Ramell et al., 2011) o cambios en las pautas de alimentación (Piñeiro et al., 2007a). En el caso humano, aumentos de esta proteína han sido descritos en pacientes tras diferentes procesos inflamatorios como infarto de miocardio, angina de pecho o tras intervenciones quirúrgicas, lo que permitió caracterizarla como una PFA en esta especie (Piñeiro et al., 1999). En la especia bovina también actúa como tal y se ha visto incrementos significativos de esta proteína tanto en suero (Piñeiro et al., 2004), como en leche (Alonso-Fauste et al., 2012; Soler et al., 2018) de vacas afectadas por mastitis. En otras especies como oveja (Sendino 1988), rata (Daveau et al., 1998) o ratón (Duan et al., 2005) también se ha observado que esta proteína actúe como PFA positiva. Hasta el inicio de esta tesis no se tenían conocimientos acerca del comportamiento de la ITIH4 canina en fase aguda. Resultados sobre esta proteína y su implicación como PFA serán discutidos en este trabajo. Aunque su estructura y su implicación en la fase aguda son conocidas, la función biológica de la ITIH4 se desconoce todavía. Un posible papel podría estar relacionado con la regulación de la migración celular y la proliferación durante el desarrollo de la RFA, ya que uno de sus dominios (el dominio von Willebrand A) está implicado en la interacción con moléculas de la matriz extracelular (ECM), como el colágeno, proteoglicanos o heparina (Salier et al., 1996). También se ha descrito que inhibe la polimerización de la actina y la fagocitosis en células polimorfonucleares (Choi-Miura et al., 2000) y parece estar implicada tanto el desarrollo como en la regeneración hepática (Bhanumathy et al., 2002). Introducción Tabla 4. Métodos analíticos comerciales validados en la literatura, para la determinación de las principales PFAs en perro. PFA Tipo de ensayo Referencia comercial Especificidad Validación CRP ELISA tipo sándwich PHASE Canine CRP Assay kit, Tridelta Perro KjelgaardHansen 2003 a CRP Inmunoturbidimétrico Bayer Humano KjelgaardHansen 2003 CRP Inmunoturbidimétrico Gentian canine CRP Perro Hillström 2014; KjelgaardHansen 2014 CRP Inmunoturbidimétrico Turbovet canine CRP, Acuvet Biotech Perro Piñeiroet al., 2018 CRP Point of care LifeAssays canine CRP Perro Ibraimi et al., 2013 CRP Point of care EUROLYSER Diagnostical Perro Jasensky et al., 2015 Hp Espectrofotométrico PHASE Haptoglobin Assay kit, Tridelta Multiespecies MartinezSubiela 2005 Hp Inmunoturbidimetrico Izasa Humano Tecles 2006 SAA ELISA sandwich Tridelta Multiespecies MartinezSubiela 2005 En el caso de la Hp el método de cuantificación más ampliamente utilizado es un método espectrofotométrico basado en la medida de la actividad peroxidasa del complejo Hp-hemoglobina (Eckersall et al., 1999). Al no ser un inmunoensayo no requiere la utilización de anticuerpos específicos y por tanto se considera un método multiespecie, aunque esto no lo exime de una correcta validación para cada especie. En la literatura se ha encontrado su validación para la determinación de Hp canina (Martinez-Subiela et al., 2005). Uno de los principales problemas que presenta este método es la alta interferencia de la hemólisis en la Introducción medida. Este problema también se ha encontrado en el ensayo inmunoturbidimétrico desarrollado para la Hp humana y validado para la Hp canina (Tecles et al., 2007). 1.5 Piometra canina La piometra es la afección más común en perras que han alcanzado la madurez sexual y que se manifiesta mediante acumulación de pus en el útero. Se trata de una enfermedad grave que puede suponer una amenaza para la vida. Generalmente, afecta a perras de mediana edad, aunque también puede manifestarse en perras jóvenes desde el cuarto mes de edad, a partir del primer celo. Las perras más susceptibles son aquellas que nunca han procreado (Dabrowski et al., 2007; Hagman 2018). Se trata de una infección secundaria, no contagiosa, ocasionada por una infección bacteriana oportunista que viene favorecida por el aumento de progesterona y por los cambios morfológicos del endometrio tras el periodo de celo. E. coli es el patógeno que con mayor frecuencia se ha aislado del útero en piometra, aunque también se han encontrado otros organismos como Staphilococcus sp o Streptococcus sp entre otros. Como respuesta a los niveles de secreción de progesterona que se producen después del celo, puede darse un aumento del grosor de la pared del endometrio y la aparición de quistes (hiperplasia endometrial quística, HEQ). Además la progesterona disminuye la contractilidad del útero y aumenta la secreción de moco, facilitando el cierre del cuello del útero. Este ambiente genera unas condiciones favorables para el crecimiento bacteriano. Aunque la HEQ es un factor de predisposición, piometra y HEQ pueden desarrollarse de manera independiente (Hagman 2018) El cierre del cérvix es un factor determinante en la gravedad de la enfermedad. Si este permanece abierto las secreciones producidas por la infección pueden ser expulsadas. En cambio si se obstruye completamente, debido a la aparición de quistes en el endometrio, al no poder producirse la Introducción descarga vaginal las secreciones se acumulan dando lugar a una inflamación en el útero, que se conoce como piometra cerrada. Se trata de una situación aguda que evoluciona rápidamente a estado de gravedad. 1.5.1 Diagnóstico y tratamiento de la piometra canina Además de la acumulación de pus en el útero, la piometra se caracteriza por una serie de manifestaciones clínicas y patológicas tanto a nivel local como sistémico, causadas principalmente por las bacterias y sus productos bacterianos. La piometra se ha asociado con endotoxemia y sepsis, aunque un diagnóstico temprano y un tratamiento adecuado facilitan la supervivencia. Además de la descarga vaginal purulenta, que solo se produce en los casos de piometra abierta, entre los síntomas clásicos de piometra canina se incluyen anorexia, depresión o letargia, polidipsia (necesidad exagerada de beber), poliuria, taquicardia, taquipnea, pulso débil y color anormal en las membranas mucosas. Síntomas como fiebre, anorexia, deshidratación, vómitos, diarrea y dolor abdominal están presentes entre el 15 % al 30 % de la perras con piometra (Hagman 2018). La piometra es fácilmente diagnosticable en su versión clásica (piometra abierta), pero no lo es tanto en los casos en los que no se produce descarga vaginal (piometra cerrada). El diagnóstico de piometra ha de incluir un diagnostico preliminar basado en la historia, un examen físico y ginecológico en búsqueda de los signos clínicos de la enfermedad así como test para determinar parámetros bioquímicos y hematológicos y un diagnóstico de imagen del abdomen. La ovariohisterectomía es el tratamiento más seguro y efectivo en la piometra canina, ya que se elimina la fuente de infección y por tanto su posible recurrencia. Además la ovaristerectomía se utiliza como método de esterilización quirúrgica de elección y como método de prevención. En el postoperatorio es importante controlar los signos de infección ya que una piometra avanzada junto con un largo periodo de hospitalización puede derivar en peritonitis (Jitpean et al., 2014c). Se ha evaluado la posibilidad de un tratamiento puramente farmacológico para el tratamiento de piometra, pero esta opción solo puede administrarse en Introducción piometra abierta y tras una cuidadosa selección del paciente canino (Fieni et al., 2014). La determinación de variables inflamatorias y su seguimiento puede ser útil para la detección temprana de complicaciones y la detección del progreso de la inflamación sistémica. La determinación de los niveles de CRP, SAA y Hp se ha utilizado en la monitorización del paciente tras la ovariohisterectomía. La concentración de las PFAs disminuye de forma gradual tras la cirugía (Dabrowski et al., 2007), mientras que el aumento o la no disminución en los valores de estas pueden indicar complicación tras la cirugía (Dabrowski et al., 2009). Los niveles de estas PFAs, han sido evaluados también para el diagnóstico de piometra, mostrando variaciones en su concentración en cuanto al tipo y la gravedad de la enfermedad (Dabrowski et al., 2013). En casos que cursan con sepsis se ha visto una importante elevación de los niveles de CRP y SAA (Fransson et al., 2007; Jitpean et al., 2014b). 1.6 Leishmaniosis canina La leishmaniosis es una enfermedad parasitaria grave ocasionada por protozoos de las diferentes especies del género Leishmania. Se trata de una zoonosis que afecta a diferentes especies animales, incluido el hombre. Se considera una de las enfermedades parasitarias más importantes después de la malaria y la filariasis linfática. El género Leishmania cuenta con más de 20 especies dando lugar a las diferentes formas clínicas de la enfermendad, entre ellas, la Lesihmaniosis visceral canina (Lcan), la forma más grave de la enfermedad, que está causada por el protozoo Leishmania infantum (WHO, 2017). Los primeros casos de L. infantum en perros se descubrieron en 1908, por Nicolle y Comte, en Túnez (Rioux et al., 1980). Desde entonces se han identificado varias especies de Leishmania en perros de distintas partes del mundo, Africa, Asia y Europa (Viejo Mundo) y América (Nuevo Mundo). Hoy en Introducción día se acepta que el agente causal de la Lcan en el Viejo Mundo, L. infantum, y su homólogo en el Nuevo Mundo, L. chagasi, son la misma especie (Mauricio et al., 2000). La leishmaniosis se encuentra en regiones tropicales y subtropicales, es endémica en 98 paises y se estima una incidencia de dos millones de casos nuevos al año, de los cuales 500.000 se deben a Lcan (WHO, 2017). La infección por L. infantum en perros es endémica en más de 70 países del mundo, aunque se desconoce la prevalencia global en perros domésticos Lcan es endémica en todos los países de la cuenca mediterránea, incluyendo Portugal, España, Francia, Italia, Grecia, Croacia, Albania, Malta, Chipre y Turquía (Dujardin et al., 2008; Schallig et al., 2013). En todas estas regiones, el perro es el principal reservorio para la infección con L. infantum, tanto en perros como en humanos. 1.6.1 Ciclo de vida del parásito El ciclo natural de la infección por Leishmania implica además del protozoo un hospedador vertebrado (hombre o perro) y un vector. Los únicos vectores capaces de transmitir Leishmania son las hembras de los flebótomos, insectos voladores de dos alas, que miden entre 2 y 3 mm de longitud. Es importante la presencia de estos ya que la transmisión sostenida de Leishmania spp no suele ocurrir en ausencia de vectores. Leishmania tiene un ciclo de vida dimórfico. En estado extracelular se encuentra alojado en el tracto digestivo del flebótomo en forma de promastigote (Figura 2, 1a), en este estado presenta un cuerpo alargado (tamaño, 15-24 µm x 2-4 µm) y un único flagelo, este estado supone la forma infectiva para el hospedador vertebrado. En estado intracelular, dentro del hospedador, se encuentra como amastigote presentándose de forma redondeada con un tamaño de 2-3 µm y sin flagelo (Figura 2, 1b). La hembra del flebótomo al alimentarse de un animal vertebrado le inocula formas infectivas del parásito (Figura 2, 1c). Dentro de los macrófagos del Introducción hospedador, el parásito en forma de amastigote es englobado por una vacuola parasitófora para eliminarlo, pero Leismania evade las reacciones inmunológicas inespecíficas del huésped sobreviviendo y multiplicándose por fisión binaria. La infección se extiende cuando las células parasitadas se rompen y liberan los amastigotes, que serán fagocitados por más macrófagos donde continuarán multiplicándose. Además esta infección se extiende cuando los macrófagos infectados después de dividirse de diseminan a través de la piel o el torrente sanguíneo a órganos ricos en células macrofágicas como los linfonodos, la médula ósea, el hígado y el bazo (Solano-Gallego et al., 2011). Los parásitos que se encuentran dentro del hospedador pueden volver al tracto digestivo del flebótomo mediante la picadura de este, lugar donde el parásito madura y vuelve a hacerse infectivo, listo para repetir el ciclo. Durante la alimentación del flebótomo, las formas no infectivas del parásito de alojan en la parte posterior den intestino medio, ahí maduran durante 1-2 semanas resultando la infección transmisible con promastigores metaclíclicos localizados en la parte anterior del intestino (Moody et al., 1993). Se han descrito otras formas de transmisión de Leishmania en la que no se encuentra implicado el flebótomo (Figura 2, 2), como la transmisión vertical, la transmisión mediante transfusiones de sangre de donante que contengan el parásito y también se ha descrito la transmisión venérea. Introducción Solano-Gallego et al., 2011, Parasites & Vectors Figura 2. Ciclo de vida de L. infantum y formas de transmisión sin vector. 1, representa el ciclo de vida clásico de L. infantum; 1a, promastigote; 1b, amastigote; 1c, diseminación del parásito. 2, formas de transmisión en ausencia de vector: vertical (2a), transfusión sanguínea (2b) y transmisión venérea (2c). 1.6.2 Sintomatología y diagnóstico Lcan cursa con un amplio abanico de signos clínicos. El cuadro clínico es variable y está condicionado por la capacidad de protozoo para multiplicarse dentro de las células del hospedador, así como de su habilidad para evadir la respuesta inmunitaria, además de los numerosos mecanismos patogénicos existentes en la enfermedad, los diferentes órganos afectados y la individualidad de la respuesta inmunitaria desarrollada por el hospedador (Baneth et al., 2008). Desde la piel los parásitos se distribuyen por la sangre o la linfa a los nodos linfáticos, al bazo y de ahí a otros órganos como hígado y riñones (Alvar et al., 2004). La linfadenomegalia y la esplenomegalia son signos frecuentes en esta enfermedad, el bazo se considera órgano clave para la supervivencia del parásito, ya que su respuesta inmune es ineficaz ante la infección. Las lesiones cutáneas entre las que se encuentran diferentes tipos de dermatitis, ulceras alopecias y onicogriposis, son las manifestaciones clínicas comunes. Otras manifestaciones Introducción clínicas asociadas son las lesiones oculares (conjuntivitis y uveítis), pudiendo ser estas últimas la única manifestación clínica. Atrofia muscular, epistaxis, presencia de mucosas anémicas, hepatomegalia y daño renal, son otros síntomas a tener en cuenta (Baneth et al., 2008). El diagnóstico de la enfermedad no es sencillo, se recomienda una combinación de examen clínico-patológico con una confirmación de la enfermedad mediante diversas técnicas, tanto serológicas como moleculares. - Diagnóstico clínico. Consta de un examen físico completo que incluya examen dermatológico, oftalmológico y pruebas de rutina del laboratorio. - Diagnóstico parasitológico, para determinar la presencia del parasito, puede realzarse mediante diferentes técnicas, como histología e inmunohistoquímica, observación directa mediante microscopio a partir de frotis teñidos, o aislamiento de la especie mediante cultivo. - Diagnóstico serológico. Se realiza mediante la detección de anticuerpos específicos contra el parásito en el suero del hospedador. Entre las técnicas cuantitativas encontramos la inmunofluorescencia indirecta (IFI), técnica de aglutinación directa (DAT) y ELISA. - Diagnóstico molecular. La detección de DNA de Leishmania por PCR, proporciona un diagnóstico sensible y específico de la infección. EL DNA de Leishmania puede extraerse de diferentes tejidos, sangre o fluidos biológicos. La inmunofluorescencia indirecta (IFI), se considera el método de referencia para el diagnóstico serológico en la leishmaniosis clínica, debido a su alta especificidad y sensibilidad, aunque parece ser menos sensible en la detección de Introducción infecciones subclínicas (Maia et al., 2008). Debido a que muchos laboratorios han establecido el punto de corte de manera arbitraria, es posible encontrar diferentes titulaciones a la hora de considerar positivo a un animal, desde 1:40 a 1:80 e incluso 1:160 (Gramiccia 2011). Es importante subrayar que para un diagnóstico correcto, la información proporcionada tanto por la evaluación clínicopatológica, como serológica y los datos de PCR, debe ser tratada en conjunto (SolanoGallego et al., 2011) En los últimos años se han realizado diversos estudios con perros infectados tanto de manera natural como experimental con L. infantum, para evaluar si la medida de las PFAs podrían ayudar en el diagnóstico de la enfermedad y/o en su monitorización. (Martinez-Subiela et al., 2002; Sasanelli et al., 2007; Martinez-Subiela et al., 2011b; Martinez-Subiela et al., 2014) 1.7 Proteínas de fase aguda como marcadores de bienestar animal El termino bienestar animal hace referencia al estado físico y mental de un animal en relación a las condiciones en las que vive y muere. Para evaluar el bienestar animal se pueden plantear preguntas tales como: • ¿El animal muestra signos de sufrimiento o dolor? • ¿El animal está sano y tiene lo que quiere? • ¿El ambiente del animal cumple el principio de las cinco libertades (libertad de no tener hambre ni sed; libertad de confort; libertad de ausencia de dolor, lesiones y enfermedad; libertad de ausencia de miedo y distrés; libertad de expresar un comportamiento normal)? (Farm Animal Welfare Council, 1992) La Organización Mundial de la Salud Animal considera que un animal se encuentra en un estado satisfactorio de bienestar cuanto está sano, confortable y Introducción bien alimentado, puede expresar su comportamiento innato y no sufre dolor, miedo o distrés (WOAH, 2018). Teóricamente, un animal puede encontrarse en tres situaciones diferentes en cuanto a su grado de adaptación al ambiente. En primer lugar, si el ambiente es totalmente inadecuado, la adaptación será imposible y el animal morirá o bien sufrirá lesiones o enfermedades. En este caso la mortalidad, la incidencia de lesiones causadas por el ambiente (por ejemplo, lesiones causadas por suelo inadecuado o debidas a otros animales) y la incidencia de enfermedades causadas por el ambiente actúan como indicadores de falta de bienestar. En segundo lugar, es posible que el animal consiga adaptarse al ambiente, pero que dicha adaptación suponga un coste para el animal traducido en una respuesta de estrés. Una situación estresante intensa o prolongada puede tener efectos negativos en el animal, tales como disminución del crecimiento, inhibición de la función reproductiva o inhibición del sistema inmunitario, lo que constituyen indicadores de la falta del bienestar. Finalmente, un animal puede encontrarse en un ambiente lo suficientemente satisfactorio como para que su adaptación a él no le suponga un coste, en este caso el bienestar del animal será adecuado.(Zúñiga et al., 2011). Al no poder el animal comunicar su estado, la estimación del bienestar animal es indirecta y habitualmente se deduce de la ausencia de indicadores de malestar, sufrimiento o enfermedad, así como en el conocimiento de las necesidades fisiológicas y el comportamiento de los animales (Zúñiga et al., 2011). La evaluación del bienestar animal no es un problema resuelto y la necesidad de criterios objetivos y validados científicamente se ha puesto de manifiesto. Normalmente se considera que la evaluación del bienestar debe basarse en un conjunto de indicadores que incluyan la observación del comportamiento del animal junto con la determinación de parámetros fisiológicos. Los niveles de cortisol en plasma, saliva y/o orina, se utilizan frecuentemente para la medida del estrés, pero estos parámetros pueden no reflejar una asociación con el estado emocional (Taylor et al., 2006). Antecedentes y objetivos La CRP posee ventajas desde el punto de vista diagnóstico para el seguimiento de procesos inflamatorios, sin embargo otras PFAs pueden ser interesantes desde el punto de vista diagnóstico, bien porque su cinética es más lenta y prolongada (tardan más en aumentar pero permanecen elevadas más tiempo), o bien porque su respuesta puede ser diferente en función de la patología que afecta al animal y podrían tener interés como herramientas de diagnóstico diferencial. Por ejemplo en estudios recientes se ha visto que los perros con enfermedades nasales presentan niveles elevados de CRP y Hp, y que la concentración de esta última es diferente en los animales que presentan aspergilosis y los que presentan rinitis crónica (Sheahan et al., 2010). El uso de proteínas como la AGP, o una combinación de PFAs (Chase et al, 2012), podría ser interesante para el diagnóstico y seguimiento de diferentes tipos de cáncer, permitiendo predecir la recaída antes de que se detecte sintomatología clínica (Hann, 1999). El interés en el uso de las PFAs como biomarcadores de salud y bienestar animal ha ido incrementando progresivamente en las últimas décadas. Sin embargo la falta de metodología específica de especie, adecuadamente validada, se ha considerado como una de las principales limitaciones para la incorporación de estos parámetros en la clínica (Kjelgaard-Hansen et al., 2011). Aunque actualmente existen diferentes métodos para la cuantificación de las principales PFAs caninas, los resultados obtenidos con las diferentes metodologías pueden ser en algunos casos muy variables, debido a la falta de estandarización de las medidas analíticas. En este sentido el uso de métodos adecuadamente validados, así como de un material de referencia común al que poder referir las medidas, sería fundamental para poder obtener resultados comparables entre laboratorios. El origen de esta tesis se encuentra en los trabajos pioneros llevados a cabo en el departamento de bioquímica y biología molecular y celular, por el grupo del Profesor Lampreave, que llevaron a la caracterización de la respuesta de fase aguda en la especie porcina, y el descubrimiento de la Pig-MAP, nueva proteína sérica y PFA principal en el cerdo, también conocida como ITIH4 Antecedentes y objetivos (Lampreave et al., 1994; Gonzalez Ramón et al., 1995). La pig-MAP ha sido ampliamente estudiada por el grupo del departamento de Bioquímica de la Universidad de Zaragoza en diferentes modelos de fase aguda, incluyendo infecciones víricas, bacterianas y parasitarias, y en diferentes situaciones causantes de estrés, demostrando ser un excelente marcador de situaciones patológicas y distrés en el cerdo (Heegaard et al, 2011; Piñeiro et al., 2007). Muchos de estos trabajos fueron posibles gracias a la colaboración con varios grupos europeos en dos Acciones Concertadas y un Proyecto Europeo, dedicados al estudio de las PFAs porcinas y su posible utilización en la medicina veterinaria. Al mismo tiempo se estudió la nueva proteína ITIH4 en otras especies como la humana, bovina y ovina, donde también se comporta como PFA positiva. En esta tesis se continúan estos estudios centrados en la especie canina, El objetivo general de este trabajo ha sido caracterizar la respuesta de la ITIH4, junto con otras PFAs caninas en diferentes situaciones de fase aguda y estudiar sus posibles usos como biomarcadores en diferentes procesos inflamatorios o enfermedades caninas. Para ello se ha aislado la proteína y se han preparado anticuerpos específicos con los que se ha desarrollado metodología analítica para su cuantificación en suero. La ITIH4 se ha evaluado junto con otras de las principales PFAs caninas en diferentes modelos experimentales. Para la cuantificación de estas PFAs se ha desarrollado y validado, igualmente, metodología analítica propia, específica para la especie canina. Como se ha indicado anteriormente las PFAs pueden aumentar también en situaciones de estrés, por lo que se ha propuesto su uso como marcadores generales de bienestar animal. Como es bien sabido el bienestar animal, su evaluación y mejora, es un tema de interés creciente, no solo en animales de granja, sino también en animales de compañía. Prueba de ello es la reciente creación de la norma AENOR para la certificación de centros de protección animal, promovida por AVEM (Asociación Española de Veterinarios Municipales). La evaluación del bienestar animal es un tema complejo, y el disponer de parámetros objetivos para su evaluación resulta de gran relevancia. Por ello esta Antecedentes y objetivos tesis incluye un estudio en colaboración con AVEM para determinar los niveles de PFAs en animales alojados en centros de protección y su posible utilización como marcadores de bienestar animal. A continuación se detallan cada uno de los objetivos de esta tesis: Objetivo 1. Aislamiento y caracterización de la ITIH4 y otras PFAs principales en la especie canina. Las proteínas purificadas durante el desarrollo de este trabajo han sido: ITIH4, CRP, Hp y GPA Objetivo 2. Obtención de antisueros y anticuerpos específicos para cada una de las cuatro proteínas purificadas. Objetivo 3. Desarrollo y validación de métodos analíticos para la cuantificación de estas proteínas, mediante técnicas de inmunoprecipitación o ensayos inmuno enzimáticos. Objetivo 4. Evaluación de la ITIH4, junto con otras PFAs en la especie canina, en diferentes modelos experimentales: • cirugía mayor • animales afectados por piometra • animales infectados de forma experimental por Leishmania infantum Objetivo 5. Evaluación de niveles de las PFAs en animales acogidos en centros de protección, como posibles marcadores de bienestar animal. Materiales y métodos 3 MATERIALES Y MÉTODOS Materiales y métodos Materiales y métodos 3.1 Técnicas electroforéticas 3.1.1 Electroforesis en gel de Poliacrilamida con SDS (SDS-PAGE) La SDS-PAGE se empleó para analizar muestras proteicas de diversos orígenes. Se utilizaron geles verticales discontinuos de 0,75 mm de espesor y 8 x 7 cm, que contenían SDS al 0,1 % constituidos por un gel concentrador de 1 cm de longitud y un porcentaje de poliacrilamida del 4 % y un gel separador de 6 cm de longitud y un porcentaje de poliacrilamida que varió en el rango de 10-15 % dependiendo del tamaño molecular de las proteínas a analizar. La relación de acrilamida-bisacrilamida (Bio-Rad) en los geles fue 30:0,8. Las muestras a analizar se mezclaron en relación 2:1 con tampón de carga (TRIS/HCl 0.25M, glicerol 20%, SDS 4%, β-mercaptoetanol 2%, azul de bromofenol 0.02% pH 8.6). Se desnaturalizaron calentando a 100 ºC durante 5 min en un termo-bloque o baño seco, y se aplicaron a los pocillos situados en la parte superior del gel y sumergidos en tampón de electroforesis (TRIS/HCl 0,025M, glicina 0,192M, SDS 1%, pH 8,6). La electroforesis se llevó a cabo durante aproximadamente 1 hora 30 min a 120V, 20 mA por gel. A continuación las proteínas se tiñeron con azul de Coomasie (apartado 3.1.3) o se transfirieron a membrana (apartado 3.1.2). En todos los casos en uno de los pocillos se aplicó una solución de marcadores de pesos moleculares preteñidos (rango 10-260kDa, SpectraTM Multicolor Broad Range Protein Ladder, Fermentas). 3.1.2 Transferencia de proteínas a membranas Las proteínas separadas mediante electroforesis se transfirieron a membranas de nitrocelulosa (Hybond-C extra, Amersham Biosciences) mediante un sistema de transferencia semiseca (Trans-Blot SD semidry transfer cell, BioRad). Tras sumergir la nitrocelulosa y el gel durante 5 minutos en el tampón de transferencia (TRIS/HCl 0,048 M, glicina 0,039 M, SDS 0,037 %, metanol 20 % pH 9,2) (Bjerrum and Schafer-Nielsen, 1986) se colocó sobre el ánodo una capa de papel de filtro grueso (Whatman) humedecida con el tampón de transferencia, Materiales y métodos sobre ella la nitocelulosa, a continuación el gel y por último otra capa de papel de filtro, evitando que se formasen burbujas de aire entre las distintas capas. La transferencia se llevó a cabo a un voltaje de 20 V, 400 mA durante 1 hora. La detección de las proteínas fijadas a la nitrocelulosa se realizó utilizando anticuerpos específicos (apartado 3.6.3). 3.1.3 Tinción de proteínas La tinción de proteínas se efectuó por inmersión de los geles durante 4-6 h en una solución colorante de azul de Coomasie (Sigma) 0,5 g/L en ácido acético glacial al 6 %, metanol al 45 % y agua destilada al 49 %. La decoloración del fondo del gel se efectuó por lavado durante 12 horas y varios cambios, con una solución decolorante que contenía ácido acético glacial al 10 %, metanol al 25 %, glicerol 2 % y 63 % de agua destilada. A continuación los geles fueron tratados con una solución preservadora (70 % metanol, 3 % glicerol, 27 % agua) para evitar su rotura durante el secado. Finalmente, se secaron entre dos láminas de papel de celofán humedecidas en la solución preservadora, y sujetas a una placa de vidrio para evitar que se distorsionaran. 3.2 Purificación de proteínas Para la purificación de las diferentes proteínas séricas aisladas en este trabajo se utilizaron sueros de perro con diferentes procesos inflamatorios, que fueron proporcionados por la profesora Anna Bassols (Servicio de Bioquímica Clínica de la Universidad Autónoma de Barcelona). 3.2.1 Purificación de CRP La proteína C-reactiva se ha purificado mediante cromatografía de afinidad con una resina de agarosa a la que se ha unido covalentemente fosforilcolina (Pierce TM ρ-Amino Phosphoryl Choline Agarose, ThermoFisher). Materiales y métodos Se hizo pasar a flujo lento una cantidad de 200 mL de suero de perro a través de la columna de 5 mL de fosforilcolina-agarosa, previamente equilibrada en tampón TRIS 0,05 M, NaCl 0,15 M, CaCl2 2mM, azida sódica al 0,1%, pH 8 (Tampón TRIS-Ca). Tras lavar exhaustivamente con el mismo tampón, la proteína fijada a la columna se eluyó en fracciones de 1,5 mL utilizando como tampón de elución TRIS 0,05M, NaCl 0,15 M, EDTA 2 mM, azida sódica 0,1 % pH 8 (tampón TRIS-EDTA). La proteína obtenida se dializó frente a tampón de diálisis (TRIS 0,1 M, NaCl 0,2 M, azida sódica 0,1%, pH 7,5), se concentró mediante centrifugación en tubos Amicon 30KDa (Merck Millipore) (apartado 3.3.2) hasta alcanzar una concentración de 2 mg/mL y se almacenó a -20 ºC hasta su uso. 3.2.2 Purificación de ITIH4 La proteína ITIH4 se ha aislado a partir de suero de perro, no necesariamente de fase aguda, mediante una cromatografía de inmunoafinidad utilizando una columna que contenía anticuerpos anti Pig-MAP unidos de manera covalente a una columna HiTrap NHS-activated HP (GE Healthcare) de 1 mL (apartado 3.6.2.1). Esta etapa de inmunoafinidad aprovecha la fuerte reactividad cruzada existente entre los anticuerpos desarrollados en conejo frente a la proteína porcina Pig-MAP y su proteína homóloga canina, la ITIH4. Tras equilibrar la columna en tampón PBS-NaCl 0,5M (KH2PO4 8 mM, K2HPO4 1,7 mM, NaCl 0,5 M, pH 7,4), se hizo pasar un volumen de 15 mL de suero de perro. Tras lavar la columna con abundante PBS-NaCl 0,5 M (5 volúmenes) y comprobar que la Abs280nm del excluido era menor que 0,01, se eluyó con Glicina-HCl (Glicina 0,1 M, NaCl 0,4 M, pH 2,8) en volúmenes de 1 mL sobre tubos que contenían suficiente cantidad de K2HPO4 0,5 M para neutralizar el pH. Se recogieron todas las fracciones eluídas y se dializaron frente a PBS. La proteína se concentró mediante centrifugación en tubos Amicon de 30 KDa (apartado 3.3.2) hasta alcanzar 1 mg/mL y se almacenó a -20 ºC hasta su uso. Materiales y métodos 3.2.3 Purificación de Haptoglobina La purificación de haptoglobina (Hp) se llevó a cabo a partir de un suero de perro de fase aguda mediante un procedimiento que constaba de las siguientes etapas: precipitación fraccionada con sulfato amónico saturado, seguida de una cromatografía en Azul de Cibacron – Sheparose 4B, y una posterior filtración en Sephacryl S200. Precipitación con sulfato amónico Se realizó una precipitación de las proteínas de suero con una disolución saturada de sulfato amónico (NH4)2SO4. En primer lugar se realizó una precipitación añadiendo a 50 mL de suero el volumen necesario de solución de sulfato amónico saturado para alcanzar un 40% de saturación de sulfato amónico en la mezcla. Tras incubar durante 1 hora a 4 ºC y en agitación se centrifugó a 5000g y 4ºC durante 30 minutos. El sobrenadante se recogió con cuidado separándolo de la fracción precipitada. A este sobrenadante se le añadió más sulfato amónico hasta alcanzar una concentración de sulfato amónico equivalente al 60 % de saturación. Se incubó en agitación durante 1 hora a 4 ºC y se centrifugó a 4 ºC durante 30 minutos a 5000g. Se retiró con cuidado el sobrenadante de la fracción precipitada. El precipitado obtenido se resuspendió con un volumen de PBS igual a la mitad del volumen de suero de partida, eliminándose el sulfato amónico mediante diálisis frente a PBS. Cromatografía de Azul de Cibacron La fracción precipitada con sulfato amónico al 60 % de saturación, que contenía Hp y albúmina como componentes principales, se sometió a una cromatografía en una columna de Azul de Cibracron – Sepharose 4B, previamente equilibrada en tampón TRIS 0,02 M, NaCl 0,05M pH 7,5 (Tampón de Lavado). El tamaño de la columna de Cibracrom y el volumen del precipitado resuspendido y dializado, se adecuó en proporción 1:1 (v:v). Materiales y métodos Tras aplicar la muestra y lavar la columna con el Tampón de Lavado, se reunieron los tubos del pico principal de la fracción excluida entre los que se encontraba la Hp. La fracción obtenida fue dializada frente a PBS y se concentró 10 veces respecto del volumen inicial del suero de partida. Tras continuar el lavado de la columna de Cibacron con un volumen de tampón de lavado 5 veces mayor que el de la columna, se eluyeron las proteínas fijadas con tampón TRIS 0,05 M, NaSCN 0,2 M, pH 8,0, lo que permitió obtener albúmina de perro bastante purificada, que se guardó para otros usos. Filtración en gel (Sephacryl S200) La fracción de Hp obtenida en la etapa anterior se hizo pasar por una columna de Sephacryl S200 High Resolution (GE Healthcare). Las dimensiones de la columna fueron: 1 m de altura y 1,5 cm de diámetro. Tras equilibrar la columna en PBS, se hizo pasar por la columna 1 mL de la fracción concentrada a un flujo constante y continuo. Se recogieron fracciones de 1mL, se midió la absorbancia a 280 nm y se representó el cromatograma. Los tubos que formaban los principales picos del cromatograma se analizaron mediante electroforesis SDS-PAGE y western-blot (apartados 3.1.1 y 3.6.5.1). Las fracciones que contenían Hp se reunieron y concentraron hasta alcanzar una concentración de 2 mg/mL. Para aumentar el grado de pureza de la Hp, se realizó una segunda filtración en gel. 3.2.4 Purificación de α1-glicoproteína ácida El procedimiento utilizado para la purificación de α1-glicoproteína ácida (GPA) se basó en su propiedad de mantenerse en solución en medios con sales o disolventes en los que precipitan la mayoría de las proteínas plasmáticas. La primera etapa consistió en una precipitación del suero de partida con una solución precipitante que contenía sulfato amónico (NH4)2SO4 420 g/L y ácido tricloroacético (TCA) 24,75 g/L. La precipitación se realizó en proporción 1:1 (v:v) de suero de perro con la disolución precipitante. Esta disolución se añade poco a Materiales y métodos ayuda de un bisturí y se lavó con abundante PBS hasta que la A280nm del PBS de lavado fue menor de 0,05. Seguidamente el gel se bloqueó con etanolamina 1 M, pH 8,0 incubando durante 1 hora a temperatura ambiente y agitación rotatoria suave, o toda la noche a 4 ºC. El exceso de etanolamina se retiró con una bomba a vacío. Después el gel se lavó con glicina-HCl 0,1 M, NaCl 0,5 M, pH 2,8 durante 15 minutos a temperatura ambiente y se neutralizó rápidamente con tampón fosfato 0,5 M. Finalmente se equilibró en PBS que contenía azida sódica al 0,1 %. Inmunoadsorción de antisueros Una vez preparado el gel de inmunoadsorbente se incubó durante al menos 20 horas, a 4 ºC y con agitación suave con una solución de antisuero. La proporción de antisuero añadido al inmunoadsorbente se determinó en función del grado de inespecificidad de cada antisuero, siendo 1:1 (v:v) la proporción utilizada en la mayoría de los casos. Transcurrido el tiempo de incubación se recuperó el antisuero y se lavó el inmunoadsorbente con un volumen de PBS con azida sódica al 0,1% equivalente al volumen de inmunoadsorbente utilizaso. Los lavados con PBS se realizaron incubando durante 30 minutos a 4ºC y con agitación, hasta que la A280nm fue menor de 0,1. El inmunoadsorbente se regeneró con glicina 0,1 M, NaCl 0,4 M, pH 2,8, se neutralizó con 1 volumen de disolución K2HPO4 0,5 M y se reequilibró con PBS con azida sódica 0,1%. El antisuero obtenido, junto con los lavados cuya A280nm era superior a 0,1 se concentraron hasta el volumen inicial de antisuero mediante ultrafiltración (apartado 3.3.1). La especificidad del antisuero obtenido se comprobó mediante inmunoelectroforesis (apartado 3.6.4.2) y Western blot (apartado 3.6.5.1). El antisuero se conservó a 4 ºC para uso rutinario y a -20 ºC para su conservación a largo plazo. Materiales y métodos 3.6.2 Preparación de columnas de inmunoafinidad 3.6.2.1 Columna de anticuerpos anti Pig-MAP La columna de anticuerpos anti Pig-MAP utilizada para la purificación de la ITIH4 de perro se preparó mediante la inmovilización de 4 mg de anticuerpos anti Pig-MAP, previamente desarrollados en el laboratorio, a una columna HiTrap NHS-activated HP (GE Healthcare) de 1 mL. El acoplamiento se llevó a cabo según las indicaciones del fabricante. El isopropanol que protege los grupos NHS se eliminó haciendo pasar por la columna una solución de HCl 1 mM preenfiado, con la ayuda de una jeringa. Inmediatamente después, se añadieron a la columna los anticuerpos anti PigMAP concentrados hasta un volumen de 1 mL y dializados en tampón de acoplamiento (NaHCO3 0,2 M, NaCl 0,5 M pH 8,3). Los anticuerpos se incubaron en la columna durante 30 minutos a temperatura ambiente. A continuación, los anticuerpos no fijados se eluyeron con 3 mL de tampón de acoplamiento para calcular la eficacia de la fijación. Tras este paso intermedio, se lavó la columna con tres ciclos alternos de una solución de etanolamina 0,5 M, NaCl, 0,5 M pH 8,3 (6 mL) y de acetato de sodio 0,1 M, NaCl 0,5 M, pH 4 (6 mL). En el segundo ciclo la etanolamina se incubó durante 30 minutos para bloquear los centros activos. Finalizados los ciclos la columna se equilibró con 2 volúmenes de PBS con azida al 0,1 %. El rendimiento de la fijación se calculó a partir de la absorbancia a 280 nm de los anticuerpos aplicados a la columna de HiTrap y de los anticuerpos no fijados a dicha columna tras la incubación. El anticuerpo eluido de la columna de HiTrap contiene muchas sales que interfieren en la medida a 280 nm. Para eliminar estas sales, 0,5 mL de dichos anticuerpos fueron cromatografiados en una columna PD-10 Desalting Column (GE Healthcare) previamente equilibrada en PBS. Una vez eliminadas las sales interferentes se recalculó la absorbancia a 280 nm de la fracción no acoplada a la columna de HiTrap. Materiales y métodos 3.6.2.2 Columnas de ITIH4 y de Haptoglobina caninas Para la purificación de anticuerpos anti ITIH4 y anti Hp, fue necesario preparar dos columnas de inmunoafinidad, HiTrap NHS-activated HP (GE Heralthcare) de 1 mL, en las cuales se inmovilizaron 2 mg de ITIH4 y 3 mg de Hp, respectivamente. El acoplamiento de estas proteínas a sendas columnas, se realizó siguiendo el mismo procedimiento que se ha descrito anteriormente en la preparación de la columna de anticuerpos anti pig-MAP utilizada para la purificación de la ITIH4 de perro. 3.6.3 Obtención de anticuerpos 3.6.3.1 Purificación de anticuerpos La purificación de los anticuerpos específicos anti ITIH4 y anti Hp caninas se llevó a cabo haciendo pasar 3 mL de un antisuero anti ITIH4 o anti Hp específico (apartado 3.6.1.2) por la columna de 1mL de HiTrap-NHS a las que se habían fijado covalentemente las proteínas ITIH4 y Hp, respectivamente. La purificación de los anticuerpos con estas columnas pre-empaquetadas se realizó con la ayuda de un equipo AKTA prime plus (Amersham Biosciences). Tras lavar la columna con PBS (5 veces el volumen de la columna), los anticuerpos fijados a la columna se eluyeron con el tampón de elución (glicina 0,1 M, NaCl 0,4 M, pH 2,8). Se recogieron fracciones de 1 mL en tubos que contenían 150 µL de tampón de K2HPO4 0,5 M. Finalmente los anticuerpos se dializaron frente a PBS y se concentraron mediante presión por N2 (apartado 3.3.1) a 4 mg/mL. Se midió la A280nm y se congelaron a -20ºC hasta su uso. 3.6.3.2 Marcaje de anticuerpos con peroxidasa Parte de los anticuerpos inmunopurificados se unieron covalentemente a peroxidasa de rábano, (Peroxidase from horseradish, HPR IV, Sigma). Materiales y métodos Según el protocolo previamente descrito (Avrameas 1969) se añadieron 2 mg de peroxidasa por mg de anticuerpo inmunopurificado y se disolvió suavemente. Seguidamente se añadió 50 µL de glutaraldheído al 1 % por mL de anticuerpo. La mezcla se incubó en oscuridad durante 3 horas en agitación rotatoria. Pasado este tiempo se añadió 50 µL de glicina 1 M y se incubó durante 2 horas de la misma manera (oscuridad y agitación rotatoria). El anticuerpo marcado se dializó frente a PBS y se conservó a -20 ºC hasta su uso. 3.6.4 Técnicas de inmunoprecipitación en gel Se han utilizado diversas técnicas de inmunoprecipitación para caracterizar y cuantificar las distintas proteínas y anticuerpos generados a lo largo de este estudio. En todos los casos se prepararon geles al 1% de agarosa en agua y se aplicaron sobre placas de vidrio. Estos geles se dejaron secar hasta su completa evaporación, de manera que se formase una primera capa seca sobre el vidrio en el que luego se aplicaría el gel de agarosa sobre el que posteriormente se desarrollaron las reacciones de inmunoprecipitación. Los inmunoprecipitados formados se lavaron durante 48 horas con abundante PBS con azida sódica al 0,1 %, realizando varios cambios. Se secó el gel por completo, se tiñó con azul de Coomasie y se lavó con una solución decolorante (apartado 3.1.3). 3.6.4.1 Inmunodifusión doble Se utilizó un método basado en el de Ouchterlony (Ouchterlony 1949). Sobre portas de microscopio se preparó un gel de 2-3 mm de espesor al 1 % en agarosa en tampón PBS. En el gel se perforaron pocillos de 3 mm de diámetro en forma de roseta, separados entre sí de forma equidistante, en los que se colocaron las muestras, y en el centro también de forma equidistante otro pocillo en el que se colocó el antisuero. Materiales y métodos A continuación se muestra un esquema general para el análisis de antisueros tras las sangrías: A: Antisuero 1 y 4. Proteína purificada 2 y 5. Suero de concentración alta 3 y 6. Suero de concentración baja (o un excluido como control negativo) En el caso de la proteína purificada y del suero de concentración alta, debe realizarse una dilución para cargar de 1 a 3 µg de la proteína a estudio. El suero de baja concentración o suero usado como control negativo se utilizará a la misma dilución que el suero de concentración alta. El antisuero se añade sin hacer ninguna dilución previa. En cada pocillo se añadió un volumen de 15 µL. Tras aplicar las muestras en los pocillos se dejó difundir a temperatura ambiente y dentro de una cámara húmeda durante 12 – 24 horas. Pasado ese tiempo se comprobó si se habían producido líneas de precipitación y posteriormente se procedió al lavado y secado según se ha descrito anteriormente. 3.6.4.2 Inmunoelectroforesis Se realizó en geles de agarosa al 1 % en tampón barbiturato sódico 25 mM, pH 8,2, con un espesor de 1,8 mm, preparados sobre placas de vidrio de 9x12 o 9,5x7,5 cm (Grabar et al., 1953). Las muestras se aplicaron en pocillos de 2,5 mm de diámetro separadas 1,5 cm a una distancia 1/4 del recorrido electroforético. Se deja un pocillo libre (preferiblemente el del extremo) para cargar 3 µL de una solución de Negro Amido de manera que indique el frente de Materiales y métodos la electroforesis. Los contactos entre el gel y las cubetas que contenían el mismo tampón que el gel, se efectuaron mediante puentes de papel Whatman nº 1. La separación electroforética se realizó durante 1 hora y media a 120 V. Una vez realizada la electroforesis se practicaron unos canales de 1,5 mm, equidistantes entre los pocillos, donde se aplicaron 100 µL del antisuero correspondiente. Se dejó difundir durante 24-48 horas en cámara húmeda y el gel se lavó, secó y tiño como anteriormente se ha explicado. 3.6.4.3 Inmunodifusión radial Para valorar de forma cuantitativa y específica las proteínas de una matriz compleja como es el suero sanguíneo se realizó inmunodifusión radial (Mancini et al., 1965), utilizando geles de agarosa al 1 % en tampón barbiturato sódico 25 mM, pH 8,2, de 1,8 mm de espesor. En la preparación del gel se incluyó una proporción de antisuero, cuando la agarosa se encontraba fundida y atemperada a 56 ºC. La proporción de antisuero depende de su concentración de anticuerpos específicos y del rango de concentración de las muestras a analizar, ajustándose ambas experimentalmente. Se practicaron unos pocillos de 2,5 mm de diámetro separados 2 cm entre sí. Aplicadas las muestras (6 µL) se dejaron difundir 48 horas en cámara húmeda. Posteriormente se lavó, se secó y se tiñó de la manera habitual. La medida del diámetro de los círculos de inmunoprecipitación permite una determinación cuantitativa de la proteína que se realiza con referencia a una serie de patrones con concentraciones conocidas de la proteína a analizar. 3.6.5 Métodos inmunoenzimáticos. 3.6.5.1 Western blot. Tras la transferencia de proteínas separadas mediante SDS-PAGE a membranas de nitrocelulosa (3.1.1 y 3.1.2), la detección específica de cada proteína se realizó según el método descrito por Towibin (Towbin et al., 1979) con alguna modificación detallada a continuación. Materiales y métodos Las membranas se incubaron durante 1 hora a temperatura ambiente o toda la noche a 4 ºC con una solución de leche semidesnatada en polvo al 5% (p/v) en PBS-azida sódica. Seguidamente las membranas se lavaron 4 veces durante 2 minutos con agitación vigorosa, con una solución que contenía TRIS/HCl 0,01M, NaCl 0,2M, Tween-20 0,5% pH 8,0 (tampón B). Posteriormente se incubaron durante 1 hora con el correspondiente antisuero o anticuerpo específico disuelto en tampón B con leche en polvo al 0,17% (p/v). La dilución óptima se determinó en cada caso. Finalizada la incubación se lavó 4 veces con tampón B del mismo modo descrito anteriormente. A continuación las membranas se incubaron con un segundo anticuerpo anti-IgG de conejo, marcado con fosfatasa alcalina (Sigma) diluido en tampón B con leche al 0,17% (p/v) durante 1 hora a temperatura ambiente y agitación suave. Tras lavar con el tampón B 4 veces, los inmunocomplejos se detectaron mediante un revelado químico o un revelado quimioluminiscente. El revelado químico se efectuó sobre la membrana añadiendo una solución preparada en el momento de su utilización, que consta de: 11 mL de tampón TRIS/HCl 0,2 M, MgCl2 1 mM, pH 9,6; 0,185 mL de una solución de 4 mg/mL de 5-bromo-4-cloro-3-indolil-fosfato (BCIP) en dimetilformamida (DMF) y 1,25 mL de una disolución 1 mg/mL de nitroazul de tetrazolio (NBT) en DMF (Sigma). Las soluciones stock de BCIP y NBT se conservaron en oscuridad a -20 ºC. La reacción se detuvo eliminando la solución de revelado y lavando la membrana con abundante agua destilada. En los casos en los que se deseó conservar la membrana para un posterior revelado con otro anticuerpo, se utilizó un revelado quimioluminiscente. En este caso el anticuerpo secundario utilizado fue un anti-IgG en conejo marcado con peroxidasa. El inmunocomplejo formado fue activado con un sustrato comercial para la detección de la enzima peroxidasa (Enhanced chemiluminescent substrate for detection of HRP, PierceTM ECL Western Blotting Substrate, Thermo). Tras la exposición controlada de la peroxidasa activada del inmunocomplejo en una membrana Amersham Hyperfilm (GE Healthcare), el revelado se llevó a cabo mediante la inmersión de la membrana primero en una Materiales y métodos solución de revelado (Kodak) hasta que aparecieron las bandas de inmunocomplejo, y tras lavar con agua destilada, por inmersión en una solución de fijación. El paso de exposición y revelado se realizó en un cuarto oscuro. En ambos casos el tiempo de revelado, y en caso del revelado quimioluminniscente el tiempo de exposición, depende de la cantidad de muestra aplicada (cantidad de proteína a revelar) y de la sensibilidad del anticuerpo utilizado. 3.6.5.2 ELISA En este trabajo se han desarrollado dos ELISAS tipo sándwich para la cuantificación de las proteínas ITIH4 y Hp caninas, respectivamente. En el desarrollo de ambos ELISAS se utilizó la misma metodología. Preparación de placas tapizadas con el anticuerpo Los anticuerpos inmunopurificados (apartado 3.6.3.1) se diluyeron en PBS estéril que contenía timerosal al 0,01% y se llevaron a la concentración deseada, 4 µg/mL para el ELISA de Hp y 6 µg/mL para el ELISA de ITIH4. 100 µL de esta disolución que contenía el anticuerpo de captura, se dispensaron en cada uno de los pocillos de microplacas partibles de 96 pocillos (12 x 8) (Greiner bio-one) con ayuda de una pipeta multicanal y se incubó a 4 ºC durante un periodo de tiempo comprendido entre 16 y 18 horas. Pasado este tiempo, el anticuerpo se retiró y los pocillos se lavaron tres veces con PBS, con ayuda de un lavador de placas (Tecan). Para evitar el pegado inespecífico de otras proteínas al plástico, cada uno de los pocillos de las placas se incubaron con 300 µL de una solución de ovoalbúmina al 3 % en PBS, durante 3 horas a temperatura ambiente. Tras retirar la ovoalbúmina se lavaron los pocillos 4 veces con PBS y se dejaron secar las placas a temperatura ambiente. Una vez secas las placas se embolsaron y se sellaron con una bosa de agente desecante en su interior y se almacenaron a 4ºC hasta su uso. Materiales y métodos Cuantificación mediante ELISA Las muestras de suero de perro se diluyeron, como se indica en la Tabla 5, en un tampón que contenía PBS con ovoalbúmina al 0,05 % pH 7,4. Se aplicaron 100 µL de muestra en cada pocillo y se incubaron durante 30 minutos a temperatura ambiente. Tras lavar tres veces con PBS, los pocillos se incubaron durante 30 minutos con 100 µL de anticuerpo marcado con peroxidasa (Ab conjugado) (apartado 3.6.3.2) diluido en el mismo tampón de dilución que las muestras. Pasado ese tiempo y tras lavar tres veces con PBS se añadieron a cada pocillo 100 µL de una solución de sustrato cromógeno 3,3’,5,5’ tetrametilbencidina (TMB) (Pre-stained TMB Plus-2, KEM EN TEK Diagnostics) y se incubó durante 30 minutos a temperatura ambiente. La reacción se paró añadiendo 100 µL de una solución de ácido sulfúrico 0,5 N. Se midió la absorbancia a 450 nm de cada uno de los pocillos de la placa con un lector de placas (Sunrise, Tecan). La concentración de proteína en las muestras problema se calculó por interpolación en una curva de calibrado obtenida con una muestra de suero estándar de concentración conocida, utilizado también para la inmunodifusión radial. Aunque la metodología desarrollada fue la misma para los dos ELISAS desarrollados, la dilución de las muestras de suero y del anticuerpo conjugado tuvo que ajustarse para cada uno de los ELISAS desarrollados, así como el rango de concentraciones de la recta de calibrado. Tabla 5. Condiciones específicas de la curva de calibrado, dilución de muestra y dilución de conjugado para cada uno de los ELISAS desarrollados. ELISA ITIH4 ELISA Hp Rango curva de calibrado 21 - 700 ng/mL 4 - 130 ng/mL Dilución del suero 1/4000 1/50000 Dilución del Ab conjugado 1/6000 1/120000 Materiales y métodos 3.6.6 Método inmunoturbidimétrico para la cuantificación de CRP canina El desarrollo de un método inmunoturbidimétrico para la determinación de proteína C-reactiva en suero de perro se realizó en el contexto de un proyecto INPACTO (IPT-010000-2010-001), mediante el desarrollo de inmunoparticulas de latex asociadas de manera covalente al anticuerpo anti CRP (Piñeiro et al., 2018). El fundamento de esta técnica se basa en la turbidez producida debido a la formación de inmunoagregados que se da cuando la CRP reacciona con las inmunopartículas. La determinación de CRP se realizó de forma automática, utilizando un analizador Olympus AU400. Tres microlitros de suero de perro, se mezclan con 230 µL de tampón de reacción (R1) al que se le añaden 70 µL de inmunopartículas de latex (R2) y se mide la Abs600nm inmediatamente después de mezclar. Tras incubar a 37 ºC durante 4 minutos se realiza una segunda lectura a la misma longitud de onda. El aumento de la turbidez se determina mediante la medida de Abs a 600nm (segunda lectura menos primera), y es proporcional a la concentración de CRP en la muestra. La concentración de CRP se calcula mediante interpolación en la curva de calibrado construida a partir de las diluciones del calibrador de CRP. El analizador calcula de forma automática la concentración de CRP a partir de la curva de calibrado obtenida con los calibradores, mediante un ajuste poligonal 3.7 Validación de métodos analíticos La validación de los métodos ELISA desarrollados en esta tesis se realizó mediante la determinación de los siguientes parámetros: límites de detección y cuantificación, imprecisión (repetitividad y reproducibilidad), y veracidad. El límite de detección (LoD) y de cuantificación (LoQ) se determinó mediante la medida de muestras de blanco, compuestas por el tampón de dilución de muestra sin analito, de acuerdo a las siguientes ecuaciones: LoD = C media+3×SD; LoQ=C media+(10 ×SD) Materiales y métodos como la media geométrica de la expresión de dos genes normalizadores, gliceraldehído-3-fosfato deshidrogenasa (GADPH) y β-2-microglobulina (β2M). Tabla 6. Secuencia de los cebadores (D) directo y (R) reverso diseñada para cada gen, tamaño del producto amplificado (pb) y temperatura de anillamiento (Tm). Gen Secuencia cebadores pb Tm (ºC) CRP D: 5´ AGACCTGGACGAAAAAGCCTT 3´ R: 5´ CCTTCATCGGCTTCTGCAACT 3´ 89 60 ITIH4 D: 5´ CACATCCAATTCAAGCCGCA 3´ R: 5´ TCGATCTGAATGGAGCCTCCA 3´ 116 64 GADPH D: 5´ TGGCAAAGTGGATATTGTCG 3´ R: 5´ AGATGGACTTCCCGTTGATG 3´ 60 β2M D: 5´ TCTACATTGGGCACTGTGTCAC 3´ R: 5´ AAGAGTTCAGGTCTGACCAAG 3´ 136 60 Los cebadores utilizados para amplificar la expresión de ITIH4 y CRP (sintetizados por InvitrogenTM) fueron diseñados en el laboratorio con la ayuda del programa Primer Express (software de Applied Biosystems). Las secuencias se obtuvieron en las bases de datos del Centro Nacional para la Información Biotecnológica (NCBI), USA. Dichas secuencias se localizaron en diferentes exones para evitar la amplificación de DNA genómico. Asimismo, se realizó una búsqueda BLAST en el genoma de perro para evitar la existencia de sitios de unión inespecífica de los cebadores. Los cebadores de los genes control GADPH (Zhang et al., 2013) y β-2-microglobulina (Kisiel et al., 2012) se seleccionaron según bibliografía ya publicada. Cuantificación y análisis estadístico Materiales y métodos La cuantificación de CRP, ITIH4, Hp y GPA, se realizó mediante inmunodifusión radial, utilizando los antisueros específicos y de especie desarrollados previamente. Las diferencias en los niveles de las PFAs tanto en suero como en hígado entre el grupo de animales no infectados y el grupo de animales infectados se analizaron mediante el test estadístico Mann-Whitney. 3.8.4 Evolución de las PFAs en animales infectados con L. infantum. Estudio 2. Animales y toma de muestra En un segundo estudio, se dispuso del suero de 10 perros de raza Beagle, 5 machos y 5 hembras, todos ellos infectados experimentalmente con L. infantum de la misma forma que en el estudio anterior. La toma de muestra y el examen clínico se realizaron a diferentes tiempos a lo largo del estudio. La muestra a tiempo 0 se obtuvo antes de la infección, una vez los animales hubieron pasado un periodo de aclimatación al centro. Tras la infección se recogieron muestras a diferentes tiempos para evaluar la evolución de las PFAs. Estos tiempos fueron: 24 h y 48 horas, 1 semana, y 2, 3, 4, 6, 8 y 10 meses post infección. Diagnóstico serológico Con el fin de valorar la presencia de anticuerpos frente a Leishmania infantum en los animales, se realizaron las técnicas serológicas IFI (inmunofluorescencia indirecta) y ELISA. Por otra parte, para la determinación de la carga parasitaria se realizó una PCR en tiempo real en los tejidos considerados habitualmente como diana, los linfonodos y la médula ósea. Estas técnicas fueron realizadas por el Departamento de Patología Animal, de la universidad de Zaragoza. Materiales y métodos El ELISA comercial, CIVTEST Canis Leishmania 192 (HIPRA S.A.), se realizó de acuerdo a las instrucciones indicadas en el mismo. Las muestras de suero se analizaron por duplicado a una absorbancia de 450nm. Para la interpretación de los resultados se calculó el valor de razón (Rz) para cada muestra, de acuerdo con la siguiente ecuación: Rz=A450nm muestraA450nmcontrol positivo Una vez obtenidos los resultados, los criterios de corte para considerar a un animal como positivo, negativo o dudoso, se establecieron de acuerdo a las recomendaciones del fabricante del ELISA, en función del valor obtenido de Rz: Negativo ELISA: < 0,9 Dudoso ELISA: 0,9-1,1 Positivo ELISA: > 1,1 En los casos en los que el ELISA presentó dudas, los resultados obtenidos de la titulación de anticuerpos mediante IFI, también permitió clasificar a los animales, de acuerdo a los siguientes valores: Negativo IFI: <1/40 Positivo IFI: ≥1/40 Diagnóstico clínico El diagnóstico clínico se realizó mediante una hoja de registro de signos clínicos, individual para cada animal. En dicha hoja se registraron parámetros generales del animal como temperatura y peso, y signos clínicos específicos de leishmaniosis. Para cada animal se asignó una puntuación clínica (PC) obtenida como la suma de cada síntoma individual empleando el esquema de puntuaciones previamente descrito por Manna (Manna et al., 2009) y con las modificaciones adoptadas por el grupo de Enfermedades Metaxénicas de la Universidad de Zaragoza tal y como se muestra en la siguiente tabla. Tabla 7. Descripción de los signos clínicos establecidos en la exploración clínica para calcular la puntuación clínica de cada paciente. Materiales y métodos Signos clínicos Gradación Pérdida de peso 0; 0% de pérdida, 1; <20 %, 2; >20 % Sintomas oculares: conjuntivitis/uveitis 0; ausencia, 1; moderada, 2; grave Síntomas cutáneos: alopecias/úlceras 0; ausencia, 1; moderada, 2; grave Linfadenopatía 0 ausencia, 1 presencia Mucosas anémicas 0 ausencia, 1 presencia Onicogriposis 0 ausencia, 1 presencia Atrofia del músculo temporal 0 ausencia, 1 presencia Esplenomegalia a la palpación 0 ausencia, 1 presencia Cualquier otro síntoma relacionado con la infección 0 ausencia, 1 presencia Peris 2018 Tras registrar los signos clínicos los animales se agruparon en tres grupos en función de la cantidad de signos expresados, clasificación basada en Abranches (Abranches et al., 1991) y según las modificaciones de Molina (Molina et al., 1994). Asíntomáticos: ausencia de síntomas y signos clínicos debidos a la infección por Leishmania. En este grupo se descartó el aumento de tamaño moderado de linfonodos, así como casos de mucosas anémicas. Oligosintomáticos: síntomas moderados, incluyendo dos signos clínicos, aumento de tamaño de los linfonodos junto con onicogriposis o alopecia /dermatitis exfoliativa. Polisintomáticos: síntomas evidentes, incluyendo 3 o más signos de enfermedad. Cuantificación y análisis estadístico Materiales y métodos Las determinaciones de ITIH4 y Hp se realizaron mediante los ELISAs desarrollados, y la cuantificación de CRP mediante un ensayo inmunoturbidimétrico. Mediante los test Saphiro-Wilk y Kolmogórnov-Smirnov, se comprobó que las muestras no seguían la normalidad. Las diferencias entre los distintos tiempos para cada PFA se analizaron mediante el test no paramétrico Kruskal-Wallis, aplicando el post test Dunn. Las correlaciones entre los datos de sintomatología clínica, serología y PFAs se calcularon mediante el cálculo del valor del coeficiente de correlación Rho de Spearman. 3.8.5 Asignación de valores de PFAs en animales sanos Animales Para la asignación de valores de referencia para las PFA en animales sanos, se utilizaron 165 animales. 72 animales pertenecían a la raza Beagle de edad comprendida entre 6 y 12 meses, 37 machos y 35 hembras. El resto de animales 98, pertenecían a otras razas y también algunos de ellos eran mestizos. De estos animales 45 eran animales entregados a centros de protección (23 machos y 22 hembras) con edades comprendidas desde los 5 meses hasta los 10 años, 22 fueron donantes y el resto, fueron perras utilizadas como controles sanos en los estudios de ovariohisterectomía y piometra, con edades comprendidas desde los 5 meses hasta los 13 años. Los sueros de los perros Beagle fueron proporcionados por el grupo del profesor Juan Antonio Castillo. Cuantificación y análisis estadístico Las PFAs fueron cuantificadas por los métodos desarrollados en esta tesis, ELISA tipo sándwich para ITIH4 y Hp, IR para GPA, e inmunoturbidimetría para CRP. Materiales y métodos Se estudió la normalidad de las muestras mediante los test Saphiro-Wilk y Kolmogórnov-Smirnov. El cálculo del intervalo de referencia para cada una de las proteínas se realizó mediante los percentiles 3 – 97 %. Los análisis comparativos entre las poblaciones en función de la raza, edad y sexo se analizaron mediante el test Mann-Withney. 3.8.6 Evaluación de los niveles de PFA en perros alojados en Centros de Protección. El estudio realizado en los Centros de Protección se llevó a cabo en colaboración con la Asociación Española de Veterinarios Municipales (AVEM) Consistió en la recogida de muestras de sangre de perros que fueron alojados en diferentes centros de protección distribuidos por la geografía española. En este estudio han colaborado un total de 11 Centros de Protección de diferentes comunidades autónomas. El estudio fue aprobado por la Comisión Ética Asesora para la Experimentación Animal (PI56/15). Animales y toma de muestra Se obtuvo el suero de 61 perros de diferentes razas y edades comprendidas entre los 2 meses y los 10 años, que fueron recogidos en tres centros de protección de diferentes áreas geográficas de España. La toma de muestra se realizó a diferentes tiempos, una primera en el momento de la llegada del animal al centro, otra a los 2 ó 3 días de permanencia en el centro, una tercera a los 15 días y la última tras un mes de permanencia en el centro. En algunos casos no fue posible obtener las muestras de los últimos tiempos debido a la salida del animal del centro por causas adoptivas. En los centros en los que no fue posible la recogida de muestras seriadas, se recogieron muestras de los animales que llegaban a los centros de protección y también de otros animales que llevaban un tiempo alojados en los mismos. Para cada animal se completó una ficha con datos como edad, sexo, peso, estado sanitario y nutricional o si son animales recogidos o entregados entre Materiales y métodos otros. El modelo de la ficha a rellenar para cada animal puede verse en el Anexo Figura 1. Cuantificación y Análisis estadístico Las determinaciones de ITIH4 y Hp se realizaron mediante los ELISAs desarrollados, y la cuantificación de CRP mediante un ensayo inmunoturbidimétrico. Se comprobó que las muestras no seguían la normalidad mediante los test Saphiro-Wilk y Kolmogórnov-Smirnov para cada una de las PFAs estudiadas. Debido a que no se pudo asumir la normalidad de las muestras, las pruebas de contrasten con los valores medios de las PFAs se realizaron con el test KruskallWallis cuando el factor tiene más de dos niveles, y Mann-Withney cuando el factor tiene dos niveles, y cuando Kruskall-Wallis ha salido significativo en los factores de más de dos niveles para contrastar los grupos dos a dos. Resultados 4 RESULTADOS Resultados Resultados 4.1 Purificación de proteínas y obtención de antisueros 4.1.1 Purificación de ITIH4 canina y obtención de antisueros La purificación de la proteína ITIH4 se ha llevado a cabo de manera satisfactoria en una sola etapa, mediante cromatografía de afinidad, utilizando anticuerpos anti ITIH4 porcina/Pig-MAP que reconocen la proteína homóloga canina. En una etapa previa, se comprobó la reactividad cruzada existente entre la ITIH4 canina y los antisueros anti Pig-MAP disponibles en nuestro laboratorio (Gonzalez-Ramon et al., 1995). Para el aislamiento de anticuerpos anti Pig-MAP, se preparó una columna de afinidad que contenía Pig-MAP purificada unida covalentemente a Sepharose 4B (Sigma). Los anticuerpos anti Pig-MAP se inmovilizaron en una columna de NHS-HiTrap (apartado 3.6.2.2) para preparar la columna de afinidad, que fue utilizada para la purificación de la proteína ITIH4 canina. Figura 4. Análisis por SDS-PAGE (10 %) de las fracciones obtenidas durante la purificación de la ITIH4 canina. a) Tinción de proteínas con azul de Coomasie. M, marcadores de peso molecular (Sigma); 1, suero de perro de fase aguda utilizado como Resultados Figura 10. Análisis mediante SDS-PAGE (12 %) de las fracciones obtenidas durante las diferentes etapas del proceso de purificación de Hp de perro. 1, Suero de perro de partida; 2, Fracción seleccionada tras la precipitación fraccionada con ssa; 3, Fracción obtenida tras la cromatografía en Azul de Cibacrón – Sepharose 4B (excluido); 4, Fracción final de Hp de perro obtenida tras las dos etapas de filtración en Sephacryl S-200. La Hp purificada se utilizó para inmunizar conejos, lo que permitió obtener un antisuero que al ser enfrentado por inmunoelectroforesis al suero de perro producía una banda principal, que correspondía a la Hp, pero también otras líneas más débiles (ver Figura 11a). Para eliminar estas inespecificidades se preparó un inmunoadsorbente con las fracciones de suero de perro carentes de Hp, obtenidas durante el proceso de purificación. Después de la inmunoadsorción, el antisuero anti Hp reaccionó de manera específica con la Hp de perro mediante inmunoelectroforesis (Figura 11a), reconociendo por igual, tanto a la proteína purificada, como la Hp presente en el suero de perro. La especificidad del antisuero anti Hp obtenido puede apreciarse también al utilizarlo para el revelado de suero de perro mediante SDS-PAGE al 12 % y Western blot. Como puede apreciarse en la Figura 11 b, el antisuero reconoce una sola banda que corresponde con la cadena pesada de la Hp. Resultados Figura 11. Análisis por inmunoelectroforesis (a) y por Western blot (b) del antisuero anti Hp de perro desarrollado a) S, suero de perro; P Hp canina purificada. Canales: antisuero anti Hp canina antes (Ai) y después de adsorber (Af). b) Western blot de suero de perro, revelado con el antisuero anti Hp de perro específico (1/5000) y anti IgG de conejo unida a peroxidasa (1/20000). 4.1.4 Purificación de α1 glicoproteína ácida canina y obtención de antisueros. La purificación de la α1 glicoproteína ácida (GPA), se llevó a cabo mediante un procedimiento de dos etapas. En una primera etapa, la adición de una mezcla de sulfato amónico y ácido tricloroacético al suero de perro, permitió separar una proteína que mostró una banda de 44 KDa mediante SDS PAGE, (Figura 12 carril 2) del resto de las proteínas del suero mediante precipitación de estas últimas. Esta banda que permanece en la fracción del sobrenadante, coincide con el peso molecular descrito para la GPA de perro. En una segunda etapa se aumentó el grado de pureza de esta proteína haciendo pasar dicho sobrenadante por una columna de intercambio catiónico (columna de amberlita IRC-50) en la que la GPA debido a su bajo pI no se fija a la matriz. La proteína que no se unió a la matriz de amberlita fue dializada frente a PBS y concentrada hasta Resultados aproximadamente 2 mg/mL. Dicha proteína fue identificada como GPA de perro mediante MALDI-TOF (Tabla 1 Anexos). Figura 12. SDS-PAGE de las fracciones obtenidas en la purificación de GPA. Carril 1, suero de perro; carril 2, sobrenadante de la precipitación con ádico tricloroacético y sulfato amónico, que contiene la GPA; carril 3, excluido de la columna de amberlita que contiene la GPA de perro purificada, el número 8 de este carril indica la banda recortada y analizada mediante MALDI TOF en la tabla 1 del Anexo. M, peso molecular (Sigma). La inmunización de esta proteína purificada en conejos permitió obtener un antisuero anti GPA, que reconoce por igual a la proteína purificada y a la GPA presente en el suero de perro mediante inmunoelectroforesis (Figura 13). Estos antisueros no mostraron ninguna banda adicional al enfrentarlos al suero de perro, por lo que la especificidad mostrada por inmunoelectroforesis se consideró adecuada y no fue necesario someterlos a inmunoadsorción. Resultados Figura 13. Análisis por inmunoelectroforesis del antisuero anti GPA canino. S, suero de perro; P GPA canina purificada. En el canal, antisuero anti GPA canina (A f). 4.2 Desarrollo y validación de métodos analíticos para la cuantificación de PFAs caninas 4.2.1 Desarrollo y validación de métodos de inmunodifusión radial para la cuantificación de ITIH4, CRP, Hp y GPA caninas A partir de los antisueros específicos desarrollados, y como método de medida inicial para la cuantificación de ITIH4 canina, se puso a punto la técnica de inmunodifusión radial (IR). A su vez, también se puso a punto la misma metodología para la cuantificación de CRP, Hp y GPA, a partir de los antisueros previamente desarrollados. Las proteínas purificadas (ITIH4, CRP, Hp y GPA) se utilizaron como patrón para asignar el valor de referencia a un suero de perro, que posteriormente se utilizó como calibrador en los respectivos métodos de IR. Se realizó una validación inicial del método determinando la precisión, rango de linealidad y límite de cuantificación. En las figuras 15, 16, 17 y 18, se muestra un resumen con los principales parámetros calculados para cada uno de los métodos de IR desarrollados y validados. El rango de trabajo se seleccionó mediante la elección del rango lineal que presentó la curva dosis-respuesta del calibrador. A modo de ejemplo se muestra en la figura 14, la curva dosis-respuesta del calibrador para la cuantificación de ITIH4 canina. Como puede verse, a concentraciones por encima de 0,28 mg/mL Resultados de ITIH4 la curva del calibrador satura, mientras que por debajo de 0,017 mg/mL el diámetro del halo de precipitación es muy pequeño y no hay diferencias entre las distintas concentraciones. La selección del rango de trabajo se efectuó de la misma manera para el resto de proteínas (CRP, Hp, GPA); estos valores pueden verse en las figuras 15 a 18, rango lineal. Figura 14. Curva dosis-respuesta del calibrador para cuantificación de ITIH4 canina por IR. Se representa el diámetro al cuadrado del halo de precipitación (expresado en mm2), frente a la concentración de ITIH4 en mg/mL. Se evaluó la veracidad del ensayo comparando la curva dosis-respuesta obtenida con la proteína purificada y un suero de perro de alta concentración de la proteína de interés. Para ello se prepararon diluciones seriadas del suero canino y se comparó el valor obtenido en el ensayo con el teórico, calculado a partir del valor de la muestra sin diluir y el factor de dilución. Los valores de concentración obtenidos para cada una de las diluciones no difieren más del 10 % de los valores teóricos (datos no mostrados), sin que se observe desviación de la linealidad en el rango de trabajo del ensayo, para ninguno de los cuatro métodos de IR desarrollados (Figuras 15 a 18, Linealidad). El límite de cuantificación (LoQ) se determinó mediante la dilución de un suero de perro de baja concentración de la PFA correspondiente. Se realizaron Resultados diluciones de concentraciones decrecientes de analito y se analizaron por quintuplicado en el mismo gel. El límite de cuantificación se estableció para el mínimo valor de concentración que cumpliera con estos dos parámetros: un CV menor del 10 % y un porcentaje de error en la cuantificación inferior al 5 % respecto de su valor teórico. El límite de cuantificación utilizando el antisuero anti ITIH4 canino específico al 2% en el gel, fue de 0,022 mg/mL de ITIH4. Los sueros se aplicaron al gel diluidos 1:5, por lo que la mínima cantidad de ITIH4 en suero que puede cuantificarse en las condiciones analíticas seleccionadas es de 0,11 mg/mL. En las figuras 15, 16, 17 y 18, se recogen los LoQ determinados para las diferentes PFA. El estudio de la precisión de los métodos de IR se realizó mediante el cálculo de los coeficientes de variación (CV) intra (n=5) e inter (n=6) ensayo para tres sueros de perro con diferentes concentraciones del analito correspondiente (alta, media y baja). Los resultados de los ensayos mostraron una baja imprecisión para los métodos de IR desarrollados, siendo los CV, menores del 7 % para la ITIH4, menores del 8 % para la CRP, menores del 6 % para la Hp y del 5 % para la GPA (Figuras 15 a 18, precisión). En todos ellos, salvo para la muestra de alta concentración de CRP, el CV intra ensayo fue inferior al 5 %. Resultados Figura 15. Principales parámetros determinados en los estudios de validación del método de IR para la cuantificación de la ITIH4 canina. * Linealidad: Linealidad con la dilución, se representa el valor el valor determinado para las diferentes diluciones del suero de perro frente al valor esperado teóricamente (valor calculado a partir del valor del suero sin diluir y el factor de dilución). La línea negra representa el ajuste mediante mínimos cuadrados de los puntos y la línea roja discontinua la igualdad y=x. Resultados Figura 16. Principales parámetros determinados en los estudios de validación del método de IR para la cuantificación de la CRP canina. * Linealidad: Linealidad con la dilución, se representa el valor el valor determinado para las diferentes diluciones del suero de perro frente al valor esperado teóricamente (valor calculado a partir del valor del suero sin diluir y el factor de dilución). La línea negra representa el ajuste mediante mínimos cuadrados de los puntos y la línea roja discontinua la igualdad y=x. Resultados Figura 17.Principales parámetros determinados en los estudios de validación del método de IR para la cuantificación de la Hp canina. * Linealidad: Linealidad con la dilución, se representa el valor el valor determinado para las diferentes diluciones del suero de perro frente al valor esperado teóricamente (valor calculado a partir del valor del suero sin diluir y el factor de dilución). La línea negra representa el ajuste mediante mínimos cuadrados de los puntos y la línea roja discontinua la igualdad y=x. Resultados Figura 18. Principales parámetros determinados en los estudios de validación del método de IR para la cuantificación de la GPA canina. * Linealidad: Linealidad con la dilución, se representa el valor el valor determinado para las diferentes diluciones del suero de perro frente al valor esperado teóricamente (valor calculado a partir del valor del suero sin diluir y el factor de dilución). La línea negra representa el ajuste mediante mínimos cuadrados de los puntos y la línea roja discontinua la igualdad y=x. Resultados coeficiente de correlación (R) fue superior a 0,99, siendo la ecuación que relaciona ambos métodos la siguiente: HpELISA (mg/mL) = 0,9896 x HpIR (mg/mL) + 0,0369 El intervalo de confianza de la pendiente, calculado al 95%, estuvo comprendido entre 0,963 y 1,011 y el intervalo de confianza de la ordenada en el origen entre -0,062 y 0,136 mg/mL. Por tanto la pendiente no difiere de uno, y la ordenada en el origen no difiere de cero, por lo que existe equivalencia analítica entre ambos métodos. Figura 22. Comparativa de los valores obtenidos mediante ELISA e IR para Hp de perro. La línea negra representa el ajuste por mínimos cuadrados de los valores representados. La línea roja discontinua representa y=x. 4.2.4 Método turbidimétrico para la cuantificación de CRP canina. Adaptación para su uso en placa microtiter. Los antisueros anti CRP canina obtenidos tal y como se han descrito en esta tesis, fueron utilizados para el desarrollo de un método inmunoturbidimétrico para Resultados la determinación de CRP canina (Piñeiro et al., 2018). Este trabajo se engloba dentro del proyecto IPT-010000-2010-001. La validación del método turbidimétrico fue realizada en el Servei de Bioquímica Clinica Veterinaria, de la Universidad Autónoma de Barcelona utilizando un analizador Olympus AU400 y se describe en Piñeiro et al., 2018. A modo informativo se describen a continuación en la figura 23 los principales parámetros evaluados y los resultados obtenidos. Figura 23. Características analíticas del método inmunoturbidimétrico para la cuantificación de CRP canina. Datos procedentes de Piñeiro et al., 2018. Debido a la necesidad del uso de un analizador automático para la medida de CRP por este método y a que no es común que los laboratorios que no sean clínicos posean este tipo de aparatos, el ensayo inmunoturbidimétrico se adecuó y se validó para realizarse en microplacas y medirse con ayuda de un lector de Resultados placas microtiter. Además mediante esta adaptación de la metodología fue posible cuantificar la CRP en aquellas muestras de las que no se disponía de un volumen suficiente para realizar la cuantificación mediante un analizador automático. El volumen de los reactivos utilizados para al análisis de las muestras en microplaca fue el mismo que se describe para la cuantificación de CRP canina en analizador automático (Tabla 10). Sin embargo para adaptar el procedimiento a la lectura en placa microtiter se realizó una lectura a punto final, utilizando un único reactivo obtenido mediante la mezcla de las cantidades correspondientes de R1 (buffer) y R2 (reactivo látex), al que se restó un blanco de reactivo. Las muestras (3 µL) se aplicaron directamente en la placa microtiter, se añadió el reactivo, se mezcló y se incubó durante 10 minutos, tras los cuales se realizó una medida a 595 nm. Para la optimización del tiempo de lectura se tuvo en cuenta la cinética de la reacción. Se utilizó un tiempo en el que la reacción alcanza el equilibrio, de modo que las diferencias de tiempo de reacción entre las primeras y últimas muestras aplicadas a la placa microtiter fuera irrelevante. Tabla 10. Comparativa de las condiciones para el análisis de CRP canina del nuevo ensayo inmunoturbidimétrico en un analizador Olympus AU 400 y adaptado a microplaca.(* temperatura ambiente) Analizador Olympus AU400 Adaptado a microplaca Vol. de muestra (µL) 3 3 Vol. de tampón de reacción, R1 (µL) 230 230 Vol. de inmunopartículas de latex, R2 (µL) 70 70 Longitud de onda (nm) 600 595 Temperatura de la reacción (ºC) 37 20-25* Primera lectura (s) 216 600 Segunda lectura (s) 450 --- Tiempo en que se añaden las inmunopartículas (s) 180 Mezcla R1+R2 desde inicio Método de calibración Poligonal Polinomio orden 2 Resultados El método se validó realizando un estudio del límite de cuantificación, la precisión, linealidad, y comparativa con el método validado para Olympus AU400. EL LoQ del método adaptado a placa microtiter, se ha determinado mediante el cálculo del error total, a partir del error obtenido (bias) al medir una muestra de concentración baja y su coeficiente de variación (4 repeticiones en 4 ensayos), mediante la fórmula: %Te = %bias + 2CV. Como criterio se ha seleccionado aquella concentración cuyo Te no supere el 30 %. El LoQ del ensayo fue de 3,3 mg/L de CRP. La precisión se evaluó mediante el cálculo del CV intra e inter ensayo, para dos muestras de suero de diferente concentración. Tal y como se muestra en la tabla 11, el CV fue inferior al 6% Tabla 11. Estudio de la precisión para la determinación de CRP mediante inmunoturbidimetría en placa microtiter. Se efectuaron cálculos de los CV intra-ensayo (n=15) e inter-ensayo (n=15) para dos muestras de suero de perro son diferentes concentraciones de CRP (alta y baja). Conc (mg/mL) CV (%) intra-ensayo CV (%) inter-ensayo 21 5,6 5,4 90 3,5 4,6 La linealidad se ha evaluado a partir de diluciones, de una muestra de suero de perro de concentración conocida (113 mg/L). En la figura 24 se muestra la representación de los valores obtenidos en el ensayo para cada una de las diluciones preparadas, comparando con los valores teóricos calculados a partir de la concentración de la muestra sin diluir y del factor de dilución. Como puede verse, los valores obtenidos para cada una de las diluciones se ajustan a los valores teóricos esperados, sin que se observe desviación de la linealidad en el rango analítico. Resultados Figura 24. Estudio de la linealidad mediante dilución de un suero de perro de concentración conocida. La línea negra corresponde al ajuste por mínimos cuadrados de los valores obtenidos en el ensayo, representados frente a los valores esperados (valor calculado a partir del valor de la muestra sin diluir y el factor de dilución). La línea roja representa y=x. En la figura 25, se muestra la comparación de los valores obtenidos para las muestras de suero de perro analizadas mediante el método inmunoturbidimético en placa y con un analizador automático Olympus AU400. Se analizaron 26 muestras de sueros por duplicado, por ambos métodos. El análisis mediante regresión lineal mostró una elevada correlación entre ambos métodos. El coeficiente de correlación (R) fue superior a 0,98, siendo la ecuación que relaciona ambos métodos la siguiente: CRPplaca (mg/L) = 0,956 x CRPOlympus (mg/L) + 3,499 El intervalo de confianza de la pendiente, calculado al 95%, estuvo comprendido entre 0,882 y 1,025 y el intervalo de confianza de la ordenada en el origen entre -0,049 y 7,048 mg/L. Por tanto la pendiente no difiere de uno, y la Resultados ordenada en el origen no difiere de cero, por lo que existe equivalencia analítica entre ambos métodos. Figura 25. Comparativa de los valores obtenidos mediante el método inmunoturbidimétrico para CRP canina adaptado a placa y con el analizador Olympus AU400 para CRP de perro. La línea negra representa el ajuste por mínimos cuadrados de los valores representados. La línea roja discontinua representa y=x. 4.3 Caracterización de ITIH4 como PFA en el perro. Modelos experimentales 4.3.1 Estudio en muestras de perros sometidos a cirugía mayor. Para determinar si la ITIH4 se comporta como PFA en el perro, se han medido los niveles de esta proteína, junto con el resto de PFAs para las que se han desarrollado inmunoensayos en esta tesis (CRP, Hp y GPA), en muestras de suero de animales sometidos a cirugía mayor. La medida de dichas proteínas se realizó mediante IR. En el estudio se evaluaron 10 hembras sujetas a mastectomía (grupo Mast, figura 26), y 9 a ovariohisterectomías (grupo OVH, Resultados figura 26). Se obtuvieron muestras de sangre inmediatamente antes de la cirugía (control) y transcurridas 24 horas de la misma. Figura 26. Evolución de las PFAs caninas en perras tras cirugía mayor. Los datos están expresados como media ± SD. a) CRP, en mg/L; b) ITIH4, en mg/mL; c) Hp, en mg/mL y d) GPA, en mg/mL. Las muestras Control están tomadas antes de la cirugía y las muestras Post, 24 h después de la cirugía. Ovariohisterectomia (OVH, n = 9) y Mastectomía (Mast, n = 10).* p<0,05; ** p<0,01; *** p<0,001. Los valores de CRP en las muestras de sueros de los animales sometidos a cirugía mostraron un aumento significativo respecto del valor que presentaban Resultados estos mismos animales antes de la cirugía (Figura 26.a). Este aumento medio es más elevado en el grupo de perras a las que se practicó una mastectomía en comparación con el grupo OVH. La concentración de CRP en los animales sujetos a mastectomía experimentó un incremento superior a 32 veces el valor precirugía, alcanzando un valor promedio de 190 ± 102 mg/L de CRP (media ± SD). Los animales sujetos a OVH mostraron un incremento superior a 20 veces el valor inicial (control pre-cirugía). Los dos grupos control presentaron valores de CRP por debajo de 10 mg/L. Las muestras de suero de perro obtenidas 24 horas después de ambas cirugías (OVH y Mast), presentaron aumentos significativos en el valor de ITIH4 respecto del control, (Figura 26.b). En ambos casos el incremento fue superior a 3,5 veces, concretamente 3,7 veces para OVH y 4 veces para Mast, no observándose diferencias significativas entre las dos cirugías. La concentración de ITIH4 en los sueros de perro post cirugía alcanzó valores promedio de 0,86 ± 0,39 mg/mL tras OVH, y 0,82 ± 0,32 mg/mL tras mastectomía. Antes de la cirugía el grupo de animales que iba a ser sometido a OVH mostró un valor promedio de 0,23 ± 0,12 mg/mL de ITIH4, similar al del grupo de animales sujetos a mastectomía (0,21 ± 0,13 mg/mL de ITIH4). Los niveles medios de Hp también aumentaron tras ambas cirugías (Figura 26,c). El grupo sujeto a mastectomía mostró un incremento medio de aproximadamente 3 veces el valor inicial alcanzándose valores de 3,51 ± 1,71 mg/mL de Hp (media ± SD) 24 horas después de la mastectomía, frente a un valor inicial de 1,10 ± 0,75 mg/mL de Hp. Los animales sujetos a OVH mostraron un incremento medio de 1,8 veces el valor inicial de Hp, aumentando desde un valor promedio de 1,23 ± 0,72 mg/mL hasta 2,25 ± 1,14 mg/mL. Los sueros de los animales presentaron diferencias significativas en los valores de α1-glicoproteína ácida (GPA) antes y 24 horas tras ambas cirugías. Los animales sometidos a OVH, experimentaron un aumento desde 0,20 ± 0,19 mg/mL hasta 0,34 ± 0,20 mg/mL de GPA, respectivamente. 24 horas tras la mastectomía el valor de GPA (media ± SD) se vio aumentado de 0,20 ± 0,15 Resultados mg/mL a 0,82 ± 0,32 mg/mL de GPA, mostrando un incremento significativo de 4 veces respecto del control y superior al experimentado por los animales sometidos a OVH. Tabla 12. Correlación entre las concentraciones de las diferentes PFA determinadas en el estudio. Se muestran los valores del coeficiente de correlación Rho de Spearman entre las PFAs estudiadas (ITIH4, CRP, Hp y GPA) en el total de la población de animales del estudio (n=19). CRP Hp GPA Rho p Rho p Rho p ITIH4 0,77 <0,001 0,58 <0,001 0,57 <0,001 CRP 0,52 0,0016 0,57 <0,001 Hp 0,62 <0,001 p significación de la correlación de Spearman El cálculo de los coeficientes de correlación de Spearman, mostró una correlación significativa entre ITIH4 y el resto de las PFAs (CRP, Hp y GPA; Tabla 8), siendo la correlación entre CRP e ITIH4 la más elevada (Rho= 0,77). Las correlaciones entre ITIH4 y Hp o GPA (Rho=0,58 y Rho=0,57 respectivamente), fueron equivalentes a la mostrada entre CRP y Hp (Rho=0,52) o Hp y GPA (Rho=0,57). 4.3.2 Caracterización de los niveles de ITIH4 en el suero de perras afectadas por piometra. Para la determinación de ITIH4 como en piometra, se estudió esta proteína en muestras de suero procedentes de 11 perras afectadas por piometra cerrada Resultados (Grupo piometra) y se compararon sus valores con los encontrados en 14 perras sanas (Grupo control). La respuesta de ITIH4 se comparó con la respuesta de CRP y Hp. Los animales afectados por piometra presentaron una elevación significativa en los niveles de: temperatura corporal, recuento total de glóbulos blancos, hemoglobina, hematocrito, alanina aminotransferasa y nitrógreno uréico en sangre, respecto al grupo control (Tabla 7). Tabla 13. Parámetros clínicos en grupo control y en el grupo piometra. Control Piometra media ± SD rango media ± SD rango p valor TC (ºC) 37,6 ± 0,3 37,1-38,2 38,6 ± 0,6 37,5-39,4 0,0010 WBC (x109/L) 10,7 ± 1,9 7,7-14,2 28,7 ± 6,3 21,9-39,2 <0,0001 Neutrófilos (%) 1,1 ± 0,7 0-2 4,5 ± 1,5 4-6 <0,0001 HGB (g/dL) 15,9 ± 1,5 13,8-18,7 21,3 ± 2,0 18,9-25,4 <0,0001 Ht (%) 43,2 ±2,1 39,2-48,1 56,7 ± 1,5 54,1-58,5 <0,0001 ALT (U/L) 35,6 ± 5,6 25-45 57,0 ± 7,4 50-72 <0,0001 Bilirrubina (mg/dL) 0,14 ± 0,04 0,1-0,2 1,54 ± 0,92 0,7-3,1 <0,0001 Creatinina (mg/dL) 0,9 ± 0,2 0,54-1,2 2,0 ± 0,4 1,7-3,1 <0,0001 BUN (mg/dL) 29,6 ± 6,5 21-42 62,5 ± 19,7 44-102 <0,0001 TC: temperatura corporal, WBC: recuento total de glóbulos blancos, HGB: hemoglobina, Ht: hematocrito, ALT: Alanina aminotransferasa, BUN: Nitrógeno ureico en sangre (del inglés, Blood urea nitrogen) Resultados Evolución de las PFAs en animales infectados con L. infantum Figura 30. Evolución de la concentración de las PFA en animales infectados con L. infantum. Se representa la media ± SD para: a) CRP, b) ITIH4 y c) Hp, los asteriscos representan el nivel de significación de cada uno de los tiempos frente al tiempo inicial Resultados pre-infección (T0) *p<0,05; **p<0,01; ***p<0,001. Se representa la evolución individual de cada animal (1 a 10) para: d) CRP, e) ITIH4 y f) Hp. En la Figura 30 a y d, se muestra la evolución de la concentración de CRP durante el periodo experimental. Tras la infección experimental, a las 24 horas se produjo un aumento elevado y significativo de la CRP, que alcanzó un valor medio de 82 ± 48 mg/L (Figura 30 a), sin embargo la magnitud del aumento no fue igual en todos los animales. Tras alcanzar un pico máximo a las 24 horas, los valores de CRP disminuyeron de forma progresiva en los siguientes puntos experimentales, para volver al estado inicial a partir de 1 semana. A partir de los dos meses, los niveles de CRP aumentaron paulatinamente, observándose un aumento significativo a partir de los 8 meses, y manteniéndose la concentración de CRP elevada hasta el final del estudio. Los valores de ITIH4 comienzan a elevarse de manera moderada a partir de la infección (Figura 30 b). El pico máximo se alcanzó a las 48 horas (aumento medio de 2 veces el valor inicial), manteniéndose los niveles elevados transcurrida 1 semana. Pasado ese tiempo la concentración de ITIH4 descendió de manera gradual hasta alcanzar de forma general los niveles iniciales a los 2-3 meses. La concentración media de ITIH4 comenzó a elevarse de nuevo a partir del sexto mes, aunque el incremento no se hizo significativo hasta el décimo mes, cuando se alcanzó un valor medio de 0,39 ± 0,21 mg/mL de ITIH4, que representa un aumento de 2,7 veces el valor pre-infección. Durante los días posteriores a la infección con L. infantum los valores de Hp en el suero experimentaron un aumento moderado (Figura 30 c). A las 48 horas se observa un aumento medio de 2 veces el valor pre-infección, que se mantiene transcurrida 1 semana. Este incremento es comparable con el experimentado por la ITIH4. Al igual que la ITIH4 la concentración de Hp recupera los valores iniciales a los 2 meses post-infección. A los tres meses tras la infección se observa un aumento de Hp moderado aunque significativo (1,5 veces respecto del tiempo inicial), seguido de un aumento de 1,8 veces en el tiempo final del estudio (10 meses). Este aumento a los tres meses no se ha observado anteriormente con la CRP ni con la ITIH4. De manrea individual valores individuales de CRP, Resultados ITIH4 y Hp, obtenidos para cada animal, difieren considerablemente de unos a otros a lo largo de todo el estudio alcanzando las máximas concentraciones a diferentes tiempos, independientemente del animal y de la proteína (Fig 30 d, e, f). Correlación de sintomatología, serología y PFAs Tabla 16. Cálculo del valor del coeficiente de correlación Rho de Spearman, entre las PFAs estudiadas (ITIH4, CRP, Hp), las titulaciones de anticuerpos obtenidas mediante inmunofluorescencia indirecta (IFI) y ELISA y la puntuación clínica asignada (PC) Log IFI ELISA PC Rho p Rho p Rho p CRP 0,52 <0,0001 0,54 <0,0001 0,45 <0,0001 ITIH4 0,56 <0,0001 0,58 <0,0001 0,41 <0,0001 Hp 0,36 0,003 0,34 0,007 0,25 0,045 PC 0,69 <0,001 0,68 <0,001 p significación de correlación de Spearman Los valores del coeficiente de correlación Rho de Spearman presentados en la tabla 16, muestran una correlación moderada entre las PFAs y las técnicas de diagnóstico serológico, expresadas como log IFI y Rz del ELISA. CRP e ITIH4 presentaron valores de correlación similares tanto para IFI, como para ELISA y para la PC. En cambio, la correlación encontrada para la Hp con cada una de las técnicas serológicas y con la puntuación clínica, fue menor. Las correlaciones entre la puntuación clínica y las técnicas de diagnóstico serológico (IFI y ELISA) son más altas que las que se encontraron entre la puntuación clínica y las PFAs, indicando una relación general entre la sintomatología y la presencia de anticuerpos frente a Leishmania. Resultados Evaluación individual de cada uno de los animales A continuación, en las gráficas siguientes, se representan los valores de cada una de las PFAs (CRP, ITIH4 y Hp), junto con los valores de la puntuación clínica obtenida, y el resultado obtenido por las técnicas serológicas ELISA e IFI, de manera individual para cada animal involucrado en el estudio. Si de acuerdo con el análisis serológico, el animal dio resultado positivo frente a la infección por Leishmania infantum el color de la barra de puntuación clínica cambia de morado a naranja. Aunque en las gráficas representadas hay animales que a lo largo del estudio se muestran negativos frente a la infección con Leishmania según el criterio adoptado, hay que destacar que al final del estudio, un análisis de qPCR confirmó que todos los animales eran positivos a tiempo final. Resultados Figura 31. Representación de la evolución de los valores de CRP y la puntuación clínica de cada uno de los animales. Las barras representan el valor de puntuación clínica (PC) asignada. El color de las barras indica el resultado de los análisis serológicos frente a Leishmania infantum; naranja positivo, morado: negativo. Flecha naranja en el Resultados animal 9, representa que el animal es positivo a Leishmania en el análisis serológico, pero su PC es 0 por eso la ausencia de barra. En la figura 31, puede observarse que el tiempo de aparición de los síntomas clínicos en los animales (PC ≥ 2), así como su severidad, fue muy variable, aunque a partir de los 6 meses la mayoría de los animales fueron positivos frente a la infección con L. infantum (barra naranja). De acuerdo a los valores de CRP, puede verse que no todos los animales presentaron la misma evolución, es decir, no todos los animales muestran el pico máximo en los mismos tiempos, sino que dependiendo del animal el pico máximo se observa entre los 610 meses PI, e incluso algunos animales no presentan este aumento al final del periodo experimental. El aumento de los valores de CRP no parece anticiparse a la sintomatología clínica, pero sí se pueden asociar valores elevados de CRP a animales con un peor pronóstico: puntuación clínica alta y animales positivos frente a Leishmania. Los animales 1, 6, 7, 8 y 9 mostraron valores de CRP por encima de 11 mg/L, alcanzando algunos de ellos valores de CRP hasta 60 mg/L, antes de la aparición de sintomatología clínica (PC < 2) y también antes de que el animal fuera positivo a Leishmania según el análisis serológico. Estos aumentos moderados de CRP se produjeron al principio de la infección entre los 3 y los 6 primeros meses según el animal. Por el contrario, los animales 3 y 4, mostraron valores de CRP por debajo de 11 mg/L a lo largo de todo el estudio, independientemente de la sintomatología y de la positividad ante la infección. Solo al final del estudio, a los 10 meses tras la infección, mostraron una elevación en la concentración de CRP alcanzando valores de 28 mg/L y 45 mg/L para el animal 3 y el animal 4, respectivamente. Los animales 2, 5, 9 y 10 son los que presentan mayores valores de CRP alcanzando picos máximos por encima de 80 mg/L. En estos animales no se ve que los valores elevados de CRP se anticipen a la sintomatología clínica o al título elevado de anticuerpos. En algunos casos el aumento de CRP se produce al Resultados mismo tiempo que detectan los síntomas clínicos y anticuerpos frente a Leishmania, como es el caso de los animales 5 y 9. Resultados Figura 32. Representación de la evolución de los valores de ITIH4 y la puntuación clínica de cada uno de los animales. Las barras representan la puntuación clínica (PC) asignada. El color de las barras indica el resultado de los análisis serológicos frente a Laishmania infantum; naranja: positivo, morado: negativo. La flecha naranja en el animal 9, representa que el animal es positivo a Leishmnia en el análisis serológico, pero su PC es 0. En la figura 32 puede verse la evolución de la concentración de ITIH4 a lo largo del estudio, en cada uno de los animales que forman parte del grupo experimental. Al igual que sucede con la CRP no todos los animales alcanzaron valores máximos de ITIH4 en el mismo tiempo tras la infección con L. infantum (10 meses post-infección). Los animales 2 y 5 son los que mayor valor de concentración de ITIH4 mostraron a los seis meses tras la infección. El máximo incremento de ITIH4 lo experimentó el animal número 2 aumentando más de 6 veces su valor preinfección mientras que el animal 5 aumentó más de 2 veces su valor inicial. Es en el último mes, donde un 60 % de los animales (animal 2, 3, 5, 8, 9 y 10) presentaron valores de ITIH4 iguales o superiores a 0,42 mg/mL, valor máximo de normalidad establecido en beagles, llegando a alcanzar valores individuales próximos a 0,7 mg/mL de ITIH4. Los animales 2, 5, 8 y 10 son aquellos que además de confirmarse la infección mediante serología, mostraron los valores más altos de puntuación clínica, por encima de 3, al final del estudio. La concentración de ITIH4 obtenida para el resto de los animales fue menor, independientemente de la sintomatología clínica y del resultado serológico observados. Resultados Figura 33. Representación de la evolución de los valores de Hp y la puntuación clínica de cada uno de los animales. Las barras representan la puntuación clínica (PC) asignada. El color de las barras indica el resultado de los análisis serológicos frente a Leishmania: naranja; positivo, morado; negativo. La flecha naranja en el animal 9, Resultados representa que el animal es positivo frente a Leishmania en el análisis serológico, pero su PC es 0. Como se ha mencionado anteriormente para los valores de CRP e ITIH4, la evolución de los valores de concentración de Hp es diferente para cada animal. A los 6 meses, se produjo un aumento muy elevado del nivel de Hp en el suero de dos animales (animal 2 y 5), estos valores superaron los 5 mg/mL de Hp. Estos animales coinciden con los que presentaron valores de ITIH4 por encima de 0,52 mg/mL a los 6 meses tras la infección (Figura 36). Estableciendo el punto de corte para Hp en 2,3 mg/mL, valor por debajo del cual se considera que los animales se encuentran dentro de los valores de referencia asignados para animales sanos para esta proteína (apartado 4.4), la Hp solo se anticipa a los síntomas clínicos y a la presencia de la infección en los animales 2, 3 y 8. El resto de animales (1, 4, 6, 7, 9 y 10) presentó valores de Hp inferiores o iguales a 2,3 mg/mL y en los tiempos en los que se superó dicho valor, fue independientemente de la puntuación clínica y de si resultado serológico indicaba resultados positivos o no. 4.4 Asignación de los valores de referencia para las PFAs en animales sanos Para la asignación de valores de referencia para las PFA en animales sanos, se utilizaron 165 animales, de los cuales 72 pertenecían a la raza Beagle de edades comprendidas entre 6 y 12 meses, siendo 37 de ellos machos y 35 hembras. El resto de animales, 98, pertenecían a otras razas y también algunos de ellos eran mestizos, con edades comprendidas entre los 5 meses y los 10 años. De estos animales 23 eran machos, 49 eran hembras y del resto no se 9 ÍNDICE DE TABLAS Tabla 1. Cambios neuroendocrinos, metabólicos, hematopoyéticos y hepáticos producidos en el organismo durante la respuesta de fase aguda. ....................................................... 18 Tabla 2. Clasificación de las PFAs según la especie animal ............................................. 27 Tabla 3. Ejemplos de patologías caninas en las que se han evaluado las PFAs. ............. 39 Tabla 4. Métodos analíticos comerciales validados en la literatura, para la determinación de las principales PFAs en perro. ...................................................................................... 44 Tabla 5. Condiciones específicas de la curva de calibrado, dilución de muestra y dilución de conjugado para cada uno de los ELISAS desarrollados............................................... 84 Tabla 6. Secuencia de los cebadores (D) directo y (R) reverso diseñada para cada gen, tamaño del producto amplificado (pb) y temperatura de anillamiento (Tm)....................... 92 Tabla 7. Descripción de los signos clínicos establecidos en la exploración clínica para calcular la puntuación clínica de cada paciente. ................................................................ 94 Tabla 8. Estudio de la precisión del ELISA de la ITIH4 canina........................................ 119 Tabla 9. Estudio de la precisión del ELISA de la Hp canina.. .......................................... 122 Tabla 10. Comparativa de las condiciones para el análisis de CRP canina del nuevo ensayo inmunoturbidimétrico en un analizador Olympus AU 400 y adaptado a microplaca…………………………………………………………………………………...…...126 Tabla 11. Estudio de la precisión para la determinación de CRP mediante inmunoturbidimetría en placa microtiter.. ......................................................................... 127 Tabla 12. Correlación entre las concentraciones de las diferentes PFA determinadas en el estudio.............................................................................................................................. 132 Tabla 13. Parámetros clínicos en grupo control y en el grupo piometra.......................... 133 Tabla 14. Cálculo del valor del coeficiente de correlación Rho de Spearman, entre las PFAs estudiadas (ITIH4, CRP, y Hp) en el total de la población de animales del estudio (n=25)............................................................................................................................... 135 Tabla 15. Puntuación clínica (PC) asignada para cada animal infectado, clasificación según criterios sintomatológicos y valores de CRP (mg/L), ITIH4 (mg/mL), Hp (mg/mL) y GPA (mg/mL) cuantificados. ............................................................................................ 138 Tabla 16. Cálculo del valor del coeficiente de correlación Rho de Spearman, entre las PFAs estudiadas (ITIH4, CRP, Hp), las titulaciones de anticuerpos obtenidas mediante inmunofluorescencia indirecta (IFI) y ELISA y la puntuación clínica asignada (PC)........ 142 Tabla 17. Valores obtenidos en el cálculo del intervalo de referencia para CRP, ITIH4, Hp y GPA, en animales clínicamente sanos.......................................................................... 151 Tabla 18. Valores promedio y rangos obtenidos para ITIH4 y de GPA en Beagles y el resto de razas............................................................................................................................ 152 Tabla 19. Valores promedio y rangos obtenidos de ITIH4 en machos y hembras en la raza Beagle. ............................................................................................................................. 153 Tabla 20. Características de los centros de protección ................................................... 169 Tabla 21. Comparación ente las secuencias de aminoácidos de ITIH4 en cerdo, humano, vaca y perro............................................................................¡Error!Marcador no definido. 10 ÍNDICE DE FIGURAS Figura 1. Esquema de la respuesta de fase aguda............................................................ 19 Figura 2. Ciclo de vida de L. infantum y formas de transmisión sin vector. ....................... 50 Figura 3. Implicación de los ejes hipotalámico-pituitario-adrenocorticotrópico (HPA) y simpático-adreno-medular (SAM) en la respuesta fisiológica al estrés, a partir de la activación del sistema nervioso central (SNC) ante una señal de peligro o alarma.. ........ 55 Figura 1. Análisis por SDS-PAGE (10 %) de las fracciones obtenidas durante la purificación de la ITIH4 canina......................................................................................... 101 Figura 2. Análisis por inmunoelectroforesis de los antisueros anti ITIH4......................... 103 Figura 3. Análisis por SDS PAGE 12 % de la CRP canina.............................................. 104 Figura 4. Caracterización del antisuero anti CRP de perro desarrollado......................... 105 Figura 5. Análisis de las fracciones de suero de perro precipitadas con sulfato amónico saturado (ssa).................................................................................................................. 106 Figura 6. Cromatografía de exclusión molecular (Sephacryl S-200)................................ 107 Figura 7. Análisis mediante SDS-PAGE (12 %) de las fracciones obtenidas durante las diferentes etapas del proceso de purificación de Hp de perro......................................... 108 Figura 8. Análisis por inmunoelectroforesis (a) y por Western blot (b) del antisuero anti Hp de perro desarrollado ....................................................................................................... 109 Figura 9. SDS-PAGE de las fracciones obtenidas en la purificación de GPA.. ............... 110 Figura 10. Análisis por inmunoelectroforesis del antisuero anti GPA canino................... 111 Figura 11. Curva dosis-respuesta del calibrador para cuantificación de ITIH4 canina por IR...................................................................................................................................... 112 Figura 12. Principales parámetros determinados en los estudios de validación del método de inmunodifusión radial para la cuantificación de la ITIH4 canina mediante IR............. 114 Figura 13. Principales parámetros determinados en los estudios de validación del método de inmunodifusión radial para la cuantificación de la CRP canina mediante IR. ............. 115 Figura 14.Principales parámetros determinados en los estudios de validación del método de inmunodifusión radial para la cuantificación de la Hp canina mediante IR................. 116 Figura 15. Principales parámetros determinados en los estudios de validación del método de inmunodifusión radial para la cuantificación de la GPA canina mediante IR.............. 117 Figura 16. Estudio de la linealidad mediante dilución de un suero de perro de concentración conocida.................................................................................................... 120 Figura 17. Comparativa de los valores obtenidos mediante ELISA e inmunodifusión radial (IR).. .................................................................................................................................121 Figura 18. Estudio de la linealidad en ELISA de Hp mediante dilución de un suero de perro de concentración conocida............................................................................................... 123 Figura 19. Comparativa de los valores obtenidos mediante ELISA e IR para Hp de perro. ......................................................................................................................................... 124 Figura 20. Características analíticas del método inmunoturbidimétrico para la cuantificación de CRP canina.. ........................................................................................ 125 Figura 21. Estudio de la linealidad mediante dilución de un suero de perro de concentración conocida.................................................................................................... 128 Figura 22. Comparativa de los valores obtenidos mediante el método inmunoturbidimétrico para CRP canina adaptado a placa y con el analizador Olympus AU400 para CRP de perro................................................................................................................................. 129 Figura 24. Evolución de las PFAs caninas en perras tras cirugía mayor......................... 130 Figura 25. Comparativa de los niveles de las PFAs caninas en perros sanos y perros afectados por piometra..................................................................................................... 134 Figura 26. Representación de los valores de las PFAs en muestras de suero, para el grupo de animales no infectado y para el grupo de animales infectado.. ........................ 137 Figura 27. Representación comparativa de los niveles de expresión de mRNA en muestras hepáticas.. ........................................................................................................................ 138 Figura 28. Evolución de la concentración de las PFA en animales infectados con L. infantum............................................................................................................................ 140 Figura 29. Representación de la evolución de los valores de CRP y la puntuación clínica de cada uno de los animales............................................................................................ 144 Figura 30. Representación de la evolución de los valores de ITIH4 y la puntuación clínica de cada uno de los animales............................................................................................ 147 Figura 31. Representación de la evolución de los valores de Hp y la puntuación clínica de cada uno de los animales................................................................................................. 148 Figura 32. Distribución de los valores de PFAs en sueros de perros sanos.................... 150 Figura 33. Comparativa de los valores de PFAs en función de la raza. .......................... 152 Figura 34. Comparativa de los valores de PFA entre machos y hembras en la población de Beagles. ........................................................................................................................... 153 Figura 35. Comparativa de los valores de PFA entre machos y hembras en el grupo de animales que engloba varias razas.................................................................................. 154 Figura 36. Valores de PFA en perros agrupados según la edad: cachorros, adultos jóvenes y adultos.............................................................................................................. 155 Figura 37. Distribución de los valores de CRP en los animales en el momento de la llegada al centro............................................................................................................... 156 Figura 38. Distribución de los valores de ITIH4 en los animales en el momento de la llegada al centro............................................................................................................... 158 Figura 39. Distribución de los valores de Hp en los animales en el momento de la llegada al centro............................................................................................................................ 159 Figura 40. Evolución de los niveles de CRP durante la permanencia de los animales en los centros de protección....................................................................................................... 160 Figura 41. Comparativa de la concentración de CRP (media ± SD) entre los distintos centros de protección, para cada tiempo de toma de muestra. ....................................... 162 Figura 42. Evolución de los niveles de ITIH4 durante la permanencia de los animales en los centros de protección. ................................................................................................ 163 Figura 43. Comparativa de la concentración de ITIH4 (media ± SD) entre los distintos centros de protección, para cada tiempo de toma de muestra. ....................................... 165 Figura 44. Evolución de los niveles de Hp durante la permanencia de los animales en los centros de protección....................................................................................................... 166 Figura 45. Comparativa de la concentración de Hp (media ± SD) entre los distintos centros de protección, para cada tiempo de toma de muestra..................................................... 168 Figura 46. Comparativa de los valores de CRP en los animales entregados y recogidos en los centros de protección.. ............................................................................................... 170 Figura 47. Valores de CRP en los animales agrupados en función de su estado nutricional: Muy delgado, delgado, normal y obeso-sobrepeso. ........................................................ 172 Figura 48. Valores de CRP en los animales agrupados en función de su comportamiento: apático, equilibrado, nervioso y agresivo.. ....................................................................... 174 Figura 49. Valor promedio de CRP para los animales alojados en cada uno de los centros participantes en el estudio y características de cada centro............................................ 175 Figura 50. Valores de CRP en función de la frecuencia del paseo en toda la población y en animales sin sintomatología clínica.................................................................................. 176