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Trabajo de Fin de Grado Estudio de la preeclampsia desde un punto de vista bioquímico y puesta a punto de la técnica basada en el colorante rojo Congo para su detección en orina reciente Study of preeclampsia from a biochemical point of view and development of the technique based on Congo red dye for its detection in recent urine Autor/a: Pilar Benito Agudo Directores/as: Dra. María Santamaría González Dr. Jesús de la Osada García Grado en Biotecnología – Curso 2020/2021 1 ÍNDICE 1. RESUMEN…………………………………………………………………………………………………………………………………… 3 2. ABSTRACT………………………………………………………………………………………………………………………………….. 3 3. INTRODUCCIÓN…………………………………………………………………………………………………………………………. 4 3.1. REVISIÓN BIBLIOGRÁFICA Y PRESENTACIÓN DEL PROYECTO……………………………………………… 4 3.2. ESTUDIO DE LOS PARÁMETROS BIOQUÍMICOS EN LA GESTACIÓN…………………………………….. 6 3.2.1. TASA DE FILTRADO GLOMERULAR……………………………………………………………………………… 6 3.2.2. CREATININA Y ÁCIDO ÚRICO……………………………….....…………………………………………………. 7 3.2.3. PROTEÍNAS………………………………………………………………………………………………………………… 7 3.2.4. GLUCOSA…………………………………………………………………………………………………………………… 7 3.2.5. VOLUMEN DE LÍQUIDO CORPORAL……………………………………………………………………………. 7 3.3. TÉCNICA BASADA EN EL COLORANTE ROJO CONGO………………………………………………………….. 8 4. OBJETIVOS………………………………………………………………………………………………………………………………… 8 5. METODOLOGÍA Y MATERIALES…………………………………………………………………………………………………. 9 5.1. SELECCIÓN DE PACIENTES Y CLASIFICACIÓN INICIAL…………………………………………………………. 9 5.1.1. ENTREVISTA CON LAS VOLUNTARIAS………………………………………………………………………… 9 5.1.2. CLASIFICACIÓN DE LAS PACIENTES……………………………………………………………………………. 9 5.1.3. CRITERIOS DE EXCLUSIÓN Y CALIDAD DE LA MUESTRA……………………………………………. 10 5.1.4. TAMAÑO MUESTRAL DEL ESTUDIO…………………………………………………………………………. 10 5.2. RECOLECCIÓN Y ALMACENAMIENTO DE DATOS……………………………………………………………… 11 5.3. PROTOCOLO PARA ALMACENAR LAS MUESTRAS DE ORINA……………………………………………. 12 5.4. DISEÑO, ELABORACIÓN Y PUESTA A PUNTO DE LA TÉCNICA DE DETECCIÓN BASADA EN EL COLORANTE ROJO CONGO…………………………………………………………………………………………………………… 12 5.4.1. MATERIAL……………………………………………………………………………………………………………….. 12 5.4.2 PROCEDIMIENTO…………………………………………………………………………………………………….. 13 5.5 ANÁLISIS ESTADÍSTICO DE LOS RESULTADOS…………………………………………………………………… 14 6. RESULTADOS Y DISCUSIÓN……………………………………………………………………………………………………… 14 6.1 ANÁLISIS DESCRIPTIVO……………………………………………………………………………………………………. 14 6.2 PARÁMETROS BIOQUÍMICOS………………………………………………………………………………………….. 15 6.2.1 ESTUDIO DE LA FUNCIÓN RENAL EN EL EMBARAZO Y SUS COMPLICACIONES…………. 15 6.2.2 ESTUDIO DE LA FUNCIÓN RENAL EN LA PREECLAMPSIA SEGÚN SU GRAVEDAD………. 18 6.3 TEST DE DETECCIÓN BASADO EN EL COLORANTE ROJO CONGO……………………………………… 20 7. CONCLUSIONES………………………………………………………………………………………………………………………. 22 8. CONCLUSIONS………………………………………………………………………………………………………………………… 23 9. REFERENCIAS BIBLIOGRÁFICAS……………………………………………………………………………………………….. 24 2 ANEXO I – Recolección y almacenamiento de datos………………………………………………………………………. 26 ANEXO II – Materiales……………………………………………………………………………………………………………………. 27 ANEXO III – Análisis descriptivo……………………………………………………………………………………………………… 28 ANEXO IV – Rojo Congo en ERC……………………………………………………………………………………………………… 30 3 1. RESUMEN La preeclampsia (PE) es una complicación propia del período gestante. Su aparición tardía suele retrasar el diagnóstico, suponiendo un riesgo añadido a la gestación. La etiología no está clara, pero la teoría más aceptada defiende un origen multisistémico relacionado básicamente con una invasión trofoblástica defectuosa causante de hipoxia. La sintomatología clínica comienza con hipertensión arterial y proteinuria, pero no son los únicos síntomas presentes en la enfermedad. El mayor problema de esta patología es su rápida progresión y la inexistencia de un método de detección económico. Se ha observado que durante el embarazo se producen cambios adaptativos a la nueva situación fisiológica, que pueden ser percibidos a través de los parámetros bioquímicos, pero existen pocos estudios que expliquen los cambios bioquímicos que se producen durante un episodio de PE. Con este proyecto se pretende valorar y caracterizar las variaciones bioquímicas de la orina durante el embarazo, además de adaptar la técnica de detección de proteínas en orina basada en el colorante rojo Congo (RC) para detectar la PE en embarazadas. Para ello se han estudiado 55 voluntarias. Los resultados más relevantes de este proyecto sugieren que la PE es una enfermedad que cursa con daño renal, advirtiendo variaciones en los parámetros bioquímicos urinarios. Además, se demuestra que la técnica basada en RC se puede utilizar como test de detección rápida de proteínas en orina con bajo coste. Este estudio nos ha permitido conocer en mayor medida una enfermedad que causa miles de muertes maternas cada año. 2. ABSTRACT Preeclampsia (PE) is a complication typical of the pregnant period. Its late appearance usually delays the diagnosis, assuming an added risk to pregnancy. The etiology is not clear, but the most accepted theory defends a multisystemic origin basically related to a defective trophoblastic invasion causing hypoxia. The clinical symptoms begin with high blood pressure and proteinuria, but they are not the only symptoms present in the disease. The biggest problem with this pathology is its rapid progression and the lack of an inexpensive detection method. It has been observed that during pregnancy adaptive changes occur to the new physiological situation, which can be perceived through biochemical parameters, but there are few studies that explain the biochemical changes that occur during an episode of PE. This project aims to assess and characterize the biochemical variations of urine during pregnancy, in addition to adapting the technique for detecting proteins in urine based on Congo red dye (CR) to detect PE in pregnant women. For this, 55 volunteers have been studied. The most relevant results of this project suggest that PE is a disease that causes kidney damage, noting variations in urinary biochemical parameters. Furthermore, it has been shown that the CR-based technique can be used as a low-cost rapid urine protein detection test. This study has allowed us to better understand a disease that causes thousands of maternal deaths each year. 4 3. INTRODUCCIÓN 3.1. REVISIÓN BIBLIOGRÁFICA Y PRESENTACIÓN DEL PROYECTO Una gran parte de las gestaciones se desarrollan y concluyen sin contratiempos. Sin embargo, existen embarazos que cursan con complicaciones, poniendo en juego la vida de la madre y del futuro bebé. Éste es el caso de la preeclampsia (PE), una enfermedad cuyos síntomas clínicos pueden comenzar a manifestarse tras la semana 20 de gestación e incluso aparecer de forma tardía a partir de la semana 34. Se caracteriza por hipertensión y proteinuria, pero puede llegar a provocar disfunción de los órganos maternos (1–4). El problema actual se centra en la dificultad para distinguir la PE de otras patologías con una sintomatología similar, como la hipertensión crónica o gestacional. Se han realizado muchos intentos por encontrar una prueba bioquímica con suficiente capacidad predictiva en las primeras fases del embarazo y anticiparse a la etapa de desarrollo clínico, pero el único tratamiento eficaz hoy en día es el parto prematuro del feto y la placenta. Esta condición puede ser perjudicial para el bebé, pero si no se lleva a término, la enfermedad evoluciona a eclampsia, una forma más grave donde la madre puede sufrir convulsiones, accidente cerebrovascular, insuficiencia hepática e incluso la muerte (2,4,5). Actualmente, la fisiopatología de la PE no está clara (1), pero la hipótesis más aceptada propone que se produce por una invasión trofoblástica defectuosa con hipoperfusión uteroplacentaria asociada. Durante un embarazo sin complicaciones, el desarrollo del feto se ve favorecido por un aumento de la perfusión del flujo sanguíneo hacia el útero, gracias a la transformación fisiológica de las arterias espirales, llevada a cabo por la invasión del trofoblasto (1,5). Estudios recientes defienden que el factor de inicio en la PE sería la privación de oxígeno, generando una situación de isquemia placentaria capaz de regular la expresión del receptor 1 soluble del factor de crecimiento del endotelio vascular (sFlt-1) a través del factor 1 inducible por hipoxia (HIF-1), el cual en condiciones normales se degradaría (4,5). sFlt-1 se trata de una proteína antiangiogénica sintetizada en la placenta y liberada a la circulación materna como consecuencia de la disfunción del trofoblasto. Constituye una forma soluble del receptor de varios factores de crecimiento del endotelio vascular, como el factor de crecimiento endotelial vascular (VEGF) y el factor de crecimiento placentario (PIGF). Estos factores son glicoproteínas diméricas, cuya función es potenciar la formación de los vasos sanguíneos a partir de sus células progenitoras. VEGF es liberado por el citotrofoblasto y se considera un factor angiogénico al promover la supervivencia celular, la permeabilidad vascular y la síntesis de óxido nítrico (ON), mientras que PIGF es un homólogo de VEGF, también liberado por el trofoblasto, y aunque su función no está tan estudiada, presenta actividad angiogénica (4,5). En un embarazo sin complicaciones, la función del receptor endotelial Flt-1 es permitir la vascularización del endotelio a través del ON y modular la disponibilidad de los factores de crecimiento, para evitar los problemas causados por la acumulación de los mismos. Sin embargo, durante el embarazo preeclámpsico, existe una sobreproducción de sFlt-1, de modo que los factores de crecimiento permanecen secuestrados por el receptor soluble y reducen su disponibilidad para el receptor endotelial, sin poder ejercer sus funciones angiogénicas, y generando estrés oxidativo por la desregulación en la producción de ON (4). 5 La sobreproducción de sFlt-1 por parte de la placenta se explica por la sobreexpresión del gen Flt-1 (OMIM * 165070), que en condiciones normales se encuentra regulado por el nivel de oxígeno, favoreciéndose en condiciones de hipoxia la forma soluble, que difiere del receptor de membrana en que no se codifica la región de expansión transmembrana y los dominios de tirosina quinasa intracelulares, pero sigue presentando una gran afinidad por los factores angiogénicos VEGF y PIGF (5). Existen evidencias de que una gran concentración de PIGF es capaz de desplazar la unión de VEGF-sFlt1, de esta forma VEGF se una a su otro receptor, KDR. Actualmente, se estudia el uso del ratio sFlt1/PIGF como biomarcador prometedor en el diagnóstico clínico de PE y para predecir la gravedad de la enfermedad (1,2,5). El ratio sFlt-1/PIGF en suero ha demostrado ser clínicamente útil para el diagnóstico de PE (6), e incluso se han desarrollado ensayos automatizados para mediciones de sFlt-1 y PIGF en suero, plasma u orina (2). El principal inconveniente de estas técnicas es que requieren de equipos muy específicos que no siempre están disponibles en los laboratorios, aunque presentan abundantes ventajas como la detección de PE a mitad del embarazo o la capacidad discriminativa entre pacientes con PE y pacientes con hipertensión gestacional o crónica (1). Actualmente no existe una técnica sencilla, rápida, que no requiera recursos excesivos y con elevado rendimiento diagnóstico que permita detectar de forma rápida y precoz un episodio de preeclampsia. Sin embargo, investigaciones recientes demuestran la asociación de agregados amiloides en la orina con la PE y apuestan por el rastreo de estas proteínas como técnica de detección (2). Entre los agregados amiloides se ha identificado a la proteína serpina, también conocida como α-1-antitripsina. Se trata de una proteína plasmática abundante involucrada en la inhibición de serin proteasas, proceso que desencadena condiciones de hipoxia en el ambiente (1). Durante la PE, el trofoblasto aumenta la síntesis de serpina, con la consiguiente formación de depósitos amiloides detectables a través de la orina mediante técnicas basadas en afinidad con ciertos colorantes. Esta proteína presenta la capacidad de desplegarse y agregarse en estructuras supramoleculares durante el transcurso de la enfermedad. La consecuencia que se plantea es una disminución de los niveles de enzimas proteolíticas, además de favorecer la hipoxia característica de la PE. Aun con todo ello, no todas las pacientes de PE presentan serpina en orina, pues solo lo hacen aquellas que cursan con unas características menos favorables como mayor presión arterial y proteinuria severa. Por tanto, la detección de serpina en orina puede orientar sobre la gravedad de la preeclampsia con una especificidad muy elevada (1). Otros estudios menos recientes sugieren que los agregados amiloides se generan a consecuencia de un desequilibrio en la proteína precursora de la serpina, denominada proteína precursora amiloide (APP). Este desequilibrio se debe a la sobreexpresión de las enzimas procesadoras de la APP a nivel de la placenta (7). Existen publicaciones que demuestran que las proteínas mal plegadas se acumulan en la orina, el suero y la placenta de las mujeres con PE, siendo un posible biomarcador de la enfermedad. Por el contrario, otros estudios afirman que la producción y agregación de amiloides son consecuencia de la hipoxia, isquemia placentaria y del resto de cambios fisiológicos que ocurren en el transcurso de la enfermedad. Podemos observar que existen varias posibilidades, y si bien sabemos que los amiloides tienen un 6 papel importante en la patología, se requieren más investigaciones para conocer la causa/consecuencia (2). Con todo ello, estudios recientes concluyen que la exploración de amiloides en la orina de mujeres con PE podría ser una buena aproximación para el diagnóstico precoz de la patología, sobre todo en entornos con pocos recursos. Esto puede llevarse a cabo gracias a la afinidad que presentan las proteínas que forman parte de los agregados amiloides hacia el colorante rojo Congo (RC), lo que se conoce como congofilia. El fundamento de la congofilia se basa en la propiedad del colorante de unirse a los radicales libres de la celulosa y, a su vez, la capacidad que tiene de interaccionar con las proteínas mal plegadas de la orina que presenten estructuras similares a la hoja β, como ocurre con la serpina (1,7,8). Esta propiedad hace posible el desarrollo de un test, CR Dot test, que permite mediante una escala cromática visual determinar si la embarazada presenta o no PE (9). Esta prueba ha tenido mejor valor predictivo para la PE en comparación con el ratio sFlt-1/PIGF (7). Sin embargo, hay que tener presente que existen otras patologías que pueden desarrollar agregados de proteínas en la orina, como la diabetes, enfermedades cardiovasculares o enfermedades renales (1). Según publicaciones previas, la técnica basada en congofilia urinaria es útil en el diagnóstico precoz porque puede observarse en una etapa temprana de la fase asintomática de la PE. Una vez puesta a punto, requiere de poco tiempo, se pueden reducir costes de forma razonable y, si el resultado es claro, no requiere del uso de técnicas posteriores que lo corroboren (2). Una de las ventajas más importantes es que se trata de una técnica no invasiva que se puede realizar sobre una muestra de orina reciente (9). La diferencia entre la PE y una patología similar, como la hipertensión gestacional, se basa en la presencia/ausencia de proteinuria. La técnica gold standard para la determinación de proteinuria es la recolección de orina en 24 horas, pues evita variaciones asociadas a factores como el ejercicio, la dieta y la excreción de agua, que pueden conducir a la inexactitud en la concentración proteica de la orina recogida en una única micción. Sin embargo, esta prueba induce errores pre-analíticos por la dificultad a la hora de garantizar la recolección completa, lo que desemboca en un retraso del diagnóstico y un mal control del paciente (10). Gracias a estudios correlativos, se pueden establecer equivalencias entre el contenido proteico en orina de 24 horas y en orina reciente (3,11,12). Con este proyecto se pretende evaluar las cualidades de la orina durante el embarazo y caracterizar las variaciones bioquímicas durante episodios de preeclampsia, además de adaptar la técnica de detección de agregados de proteínas en orina basada en la congofilia para detectar de forma rápida y precoz la PE en embarazadas (13). 3.2. ESTUDIO DE LOS PARÁMETROS BIOQUÍMICOS EN LA GESTACIÓN 3.2.1. TASA DE FILTRADO GLOMERULAR Uno de los parámetros con gran relevancia para el estudio es la tasa de filtración glomerular (TFG), dependiente del flujo plasmático renal (FPR). Durante la gestación, el flujo de sangre que reciben los riñones por unidad de tiempo se ve incrementado hasta un 75% en la semana 16 del embarazo. Éste se reduce a partir de la semana 34, pero sigue siendo muy superior al FPR de una mujer no embarazada. 7 La consecuencia es una mayor filtración de sangre por parte del glomérulo, aumentando hasta un 50% el TFG al final del primer trimestre (4,14,15). Cabe destacar que el aumento de la filtración transcurre sin hiperpresión glomerular gracias a un mecanismo de adaptación donde el ON es fundamental. De no ser así, podría tener consecuencias lesivas a largo plazo para la madre. Estudios recientes defienden que en el transcurso del embarazo aparece una mayor expresión de la óxido nítrico sintasa (ONs) en los riñones, provocando una disminución de la presión arterial durante el primer trimestre de gestación y una disminución de la resistencia renal (4,14). Un fallo en este mecanismo puede conllevar la aparición de PE (14). 3.2.2. CREATININA Y ÁCIDO ÚRICO La hiperfiltración glomerular tiene consecuencias a nivel sérico en algunos parámetros, como es el caso de la creatinina y el ácido úrico. La creatinina disminuye en el tercer trimestre, mientras que el ácido úrico alcanza niveles mínimos en las 24 semanas de gestación. Sin embargo, a partir de esta semana, los niveles de ácido úrico comienzan a aumentar gracias a una mayor absorción tubular renal de urato y la producción de ácido úrico por parte del feto. Esto permite que al final del embarazo los valores de ácido úrico se estabilicen y mantengan cifras similares a las de la preconcepción (4,14–16). La hiperuricemia es uno de los signos que se encuentra asociado con las complicaciones de la preeclampsia, pero considerarla como un factor de predicción es un tema en debate (14,15). 3.2.3. PROTEÍNAS Durante el embarazo la excreción urinaria de proteínas se ve aumentada, llegando a alcanzar en situaciones patológicas, como la PE, niveles de 300 mg de proteínas en orina de 24 horas, lo que se define como proteinuria. Gracias a estudios correlativos, reflejados en guías de práctica asistencial y documentos de consenso, podemos determinar que 300 mg de proteínas en orina de 24h equivalen a 30 mg/dL de proteínas (+1 en tira) en orina reciente (3,4,14). En definitiva, estudios recientes concluyen que el aumento significativo de proteína en la orina no se observa cuando se compara entre distintos trimestres del embarazo, pero si cuando se realiza una visión global desde el principio hacia el final de la gestación (14). 3.2.4. GLUCOSA Durante el embarazo es normal la excreción aumentada de glucosa en orina, aun presentando niveles normales de glucosa en sangre. Esto se debe al aumento del TFG, pues su incremento produce una mayor carga de glucosa en los túbulos. Como consecuencia, se desencadena una adaptación del sistema renal reduciendo el umbral de reabsorción de glucosa mediante la disminución de la expresión de los transportadores de glucosa en el túbulo (4,14). 3.2.5. VOLUMEN DE LÍQUIDO CORPORAL El embarazo es una situación que concurre con un incremento constante del volumen corporal. Se debe al agua retenida por el feto, por la placenta y por el líquido amniótico; pero también al agua retenida por los tejidos de la madre. Un condicionamiento de esta expansión puede desembocar en un mayor riesgo de padecer PE (14,15). 8 Es necesario recalcar que el volumen corporal alcanzado en el embarazo está relacionado con la osmorregulación materna. Debido a las hormonas gestacionales y a un aumento en la producción de ON, la presión arterial se ve disminuida, provocando una mayor producción de aldosterona para evitar la pérdida de sodio y aumentar su reabsorción. A causa de esta disminución de la presión arterial, la ADH también ve aumentada su producción, provocando una mayor retención de agua por parte del riñón (14,16). 3.3. TÉCNICA BASADA EN EL COLORANTE ROJO CONGO La congofilia es una propiedad muy relevante que presentan algunas orinas. Es bien conocido que el RC se une a las fibras de celulosa a través de enlaces de hidrógeno con los grupos hidroxilo y, debido a su configuración molecular plana, el RC se intercala entre la celulosa. El mismo principio se aplica a las proteínas mal plegadas que, debido a la abundancia de láminas β, tienen una disposición espacial similar a la de las fibras de celulosa. Cuando se aplica una solución acuosa de RC sobre papel, el colorante forma enlaces de hidrógeno con la celulosa, lo que ralentiza su flujo a través de la superficie porosa del papel, dejando como rastro un estrecho círculo. Si una muestra contiene proteínas agregadas, como es el caso de una orina recogida durante un episodio de PE, se mezcla con el colorante y una parte de éste se intercalará entre ellas dejando poco RC disponible para la unión a la celulosa. Esto explica que las orinas de pacientes con preeclampsia se extienden en el papel formando un amplio círculo rosa homogéneo cuando se mezclan con soluciones acuosas de RC, pues todo el colorante está involucrado en los agregados amiloides y no puede interaccionar con la celulosa. Si el círculo central aún es visible, todavía existe RC libre y disponible para unirse a la celulosa (9,13). Procedemos a adaptar y poner a punto la técnica de RC, probando varias superficies celulósicas, las cuáles han sido seleccionadas para disminuir el coste inicial del método y contribuir a la sostenibilidad medio ambiental. 4. OBJETIVOS El objetivo principal de este proyecto es analizar las características bioquímicas en la orina y evaluar si existen variaciones importantes entre pacientes no gestantes, gestantes sin patologías, gestantes con HTA y gestantes con distintos grados de PE. Para ello, se establecen los siguientes objetivos secundarios: − Estudio de la función renal por medio del análisis de parámetros bioquímicos en muestras de orina. − Valoración de los cambios hemodinámicos renales. − Evaluación del grado de proteinuria en gestantes con preeclampsia. − Estudio de la homeostasis mediante la estimación del volumen hídrico corporal. − Desarrollo del test de detección rápida de RC para detectar episodios de preeclampsia. 15 6.2 PARÁMETROS BIOQUÍMICOS 6.2.1 ESTUDIO DE LA FUNCIÓN RENAL EN EL EMBARAZO Y SUS COMPLICACIONES N = tamaño muestral Media (desviación estándar) P-valor Parámetros Gestantes sin patología Gestantes con PE Gestantes con HTA Sin patología vs PE Sin patología vs HTA PE vs HTA Tasa de filtrado glomerular (TFG) (mL/min/1,73𝑚2) N = 13 127,37 (11,2) N = 13 110,75 (18,49) N = 9 119,69 (10,67) 0,011 0,123 0,208 Creatinina sérica (mg/dL) N = 14 0,53 (0,09) N = 13 0,70 (0,15) N = 9 0,57 (0,11) 0,001 0,378 0,04 Ácido úrico en sangre (mg/dL) N = 14 3,39 (0,59) N = 6 6,23 (1,3) N = 4 4,14 (1,02) 0,001 0,203 0,019 Tabla 1.- Resultados del análisis estadístico para parámetros relacionados con la función glomerular y representación del pvalor por comparación entre los grupos de gestantes, siendo el nivel de significación un 5%. − Valoración de la tasa de filtrado glomerular La tasa de filtrado glomerular (TFG) evalúa la cantidad de sangre que se filtra por minuto en el glomérulo renal y por tanto refleja el correcto funcionamiento de los riñones. Se estima a través de una fórmula matemática (ecuación CKD-EPI) que incluye entre sus factores la creatinina sérica (18). En la tabla 1 se analizan tres grupos de gestantes. Teniendo en cuenta que durante el embarazo existe hiperfiltración renal, sería esperable obtener valores similares de la TFG entre ellos (4,14,15). Sin embargo, se obtuvieron diferencias estadísticamente significativas en las medias de la TFG entre los grupos de gestantes sin patología y gestantes con PE, concluyendo que en presencia de preeclampsia la TFG se ve disminuida, coincidiendo así con otros estudios (19). Sin embargo, no hubo diferencias significativas con las pacientes que solo desarrollaron HTA durante el embarazo, y tampoco se observaron en este grupo de gestantes valores tan elevados de filtración como los que se esperarían en pacientes gestantes sin patología. Todo ello permite plantear la siguiente hipótesis. Durante un episodio de PE, dado el reclutamiento de VEGF por sFlt-1, la producción de ON disminuye, elevando la tensión arterial y la resistencia renal. Además, es de interés proponer que en gestantes con HTA, por su propia patología, surja una contribución al aumento de la resistencia renal, ya que en estos casos el sistema renina-angiotensinaaldosterona no es capaz de controlar la situación (4). Así se podrían explicar los niveles inferiores de la TFG en gestantes con HTA frente a gestantes sin patología, sin llegar a descender lo suficiente como para igualar a las gestantes con PE, ya que al cursar una gestación con HTA no ocurre el reclutamiento de VEGF. Se requiere más investigación para conocer si cabría esta posibilidad. 16 Por otro lado, se obtuvieron diferencias estadísticamente significativas en los parámetros de creatinina sérica y ácido úrico entre los grupos de gestantes sin patología y gestantes con PE, y entre gestantes con HTA y gestantes con PE, siendo mayor la media de ambos parámetros en el grupo de gestantes con PE. Estos resultados nos llevan a plantear la posibilidad de que la presencia de PE estuviera provocando una afección estructural o funcional en el riñón, explicándose así la disminución de la TFG en gestantes con PE y la acumulación de creatinina y ácido úrico en sangre, coincidiendo con otros estudios (16). Sin embargo, según los valores presentes en las guías clínicas (12,20), una TFG ≤ 90 mL/min/1,73𝑚2 es indicativo de disminución de la función renal y lesión renal. Como ya hemos mencionado, la TFG aumenta durante el embarazo y una lesión renal podría no ser correctamente valorada en embarazadas, lo que nos lleva a pensar que el punto de corte para determinar una lesión renal en gestantes no debería ser el mismo que para el resto de la población, concluyendo que sería necesario incluir un factor de corrección o modificar los puntos de corte para embarazadas. − Cuantificación de glucosa y proteínas en orina N = tamaño muestral Media (desviación estándar) P-valor Parámetros Gestantes sin PE Gestantes con PE No gestantes Gestantes vs PE Gestantes vs no gestantes PE vs no gestantes Glucosa en orina (g/L) N = 26 0,054 (0,19) N = 11 0,064 (0,21) N = 13 0,038 (0,13) 0,888 0,949 0,856 Proteínas cuantificadas en orina (g/L) N = 26 0,127 (0,08) N = 13 4,4 (4,92) N = 13 0,03 (0,07) < 0,001 0,001 0,007 Volumen hídrico corporal (%) N = 26 38,096 (6,72) N = 9 41,77 (15,27) N = 15 29,55 (3,79) 0,910 < 0,001 0,044 Sodio en orina (mEq/L) N = 20 102,45 (47,98) N = 4 60,95 (34,76) N = 15 95,36 (33,19) 0,117 0,627 0,085 Potasio en orina (mEq/L) N = 21 44,70 (28,9) N = 4 61 (39,8) N = 15 89,30 (36) 0,459 < 0,001 0,188 Cloro en orina (mEq/L) N = 21 107,18 (45,50) N = 4 77,17 (40,79) N = 15 146,56 (58,13) 0,233 0,029 0,040 Osmolalidad en orina (mOsm/kg) N = 24 826,5 (454,09) N = 5 581,80 (260,74) N = 15 831,67 (293,32) 0,386 0,644 0,108 Tabla 2.-Resultados del análisis estadístico para parámetros relacionados con la función renal y representación del p-valor por comparación entre mujeres no gestantes y dos grupos de gestantes con y sin PE, siendo el nivel de significación un 5%. 17 Tras el análisis estadístico de los resultados contenidos en la tabla 2 se observó que no aparecían diferencias significativas en la concentración de glucosa en la orina de los grupos estudiados. Según varios estudios, en gestantes se esperarían encontrar niveles aumentados de glucosa en orina a consecuencia de la hiperfiltración glomerular, provocados por una adaptación del sistema renal en la que además disminuye la expresión de los transportadores de glucosa reduciendo su captación en el túbulo renal (14,15). Con respecto a las proteínas, se observan diferencias significativas entre los tres grupos comparados. En las embarazadas aumenta la media de proteínas cuantificadas en orina en comparación con mujeres no embarazadas y este valor es muy superior en el caso de mujeres que desarrollan preeclampsia en su embarazo. Estos resultados se encuentran dentro de lo esperable según la bibliografía consultada (1–3,14,15). Por tanto, en condiciones normales no se observa proteína en orina, mientras que, en la gestación, a causa de la hiperfiltración glomerular, su concentración se ve aumentada. Además, en la PE se obtuvieron niveles de proteinuria, característicos de la misma patología, que guardarían cierta relación con el daño renal que se puede estar produciendo. − Volumen hídrico corporal Tras observar los resultados contenidos en la tabla 2, aparecían diferencias relevantes entre las no gestantes y las gestantes, independientemente de si presentaban patología o no. El embarazo consiste en una situación donde se retiene una gran cantidad de agua, produciéndose un incremento constante del volumen corporal a lo largo de los 9 meses de gestación (15). Estos resultados permitieron sugerir que la PE no interfiere en el volumen de agua que se retiene en el embarazo. − Análisis de electrolitos urinarios En nuestro estudio no se obtuvieron resultados estadísticamente significativos para los valores de sodio en orina, a pesar de que son ligeramente superiores en gestantes que en no gestantes, lo que llevaría a pensar que el embarazo es una situación donde se excreta sodio, seguramente gracias a la hiperfiltración y a la regulación hormonal de la gestación. Mientras tanto, en la PE, los niveles estaban muy disminuidos, seguramente a consecuencia del posible daño renal presente en la patología y de la probable disminución de los niveles de progesterona. Con respecto a los resultados iónicos, existen artículos que defienden que durante el embarazo los niveles de aldosterona llegan a duplicarse, contribuyendo a la reabsorción de sodio para evitar su pérdida (14). Por otro lado, hay estudios que defienden que la hormona antidiurética (ADH) presenta niveles elevados durante el embarazo, a consecuencia de la disminución inicial de la tensión arterial, contribuyendo a una mayor excreción de sodio, al igual que la progesterona se encuentra en concentraciones elevadas a consecuencia de su producción por la placenta, y tiende a inhibir la retención del sodio por la aldosterona (15). La concentración de potasio en orina presentó diferencias significativas entre las gestantes sanas y las no gestantes. De hecho, fue un resultado esperable teniendo en cuenta que durante la gestación se acumula una gran cantidad del mismo en el espacio fetal a consecuencia de los elevados niveles de progesterona, lo que explicaría su disminución en orina (14,15). Además, no se observaron resultados significativos con las gestantes con PE, pero podría explicarse por el descenso en los niveles de progesterona en la PE, que llevaría a acumular una cantidad inferior de potasio en el espacio fetal (14). Por otro lado, la concentración de cloro en orina tuvo significación entre las no gestantes y las 18 gestantes sin patología y, a su vez, entre las no gestantes y las gestantes con PE, presentando una concentración muy superior en el grupo de pacientes no gestantes. No se encontraron estudios capaces de justificar los resultados obtenidos, pero tras su interpretación se dedujo que la PE no provoca variaciones en la concentración iónica de cloro en orina más allá que las que conlleva un embarazo común. La osmolalidad urinaria mide el número de partículas disueltas en la orina, y fluctúa continuamente con el objetivo de ir corrigiendo los posibles desequilibrios hídricos. Un aumento de la diuresis con disminución de la osmolalidad urinaria puede explicarse porque el organismo está intentando eliminar el exceso de líquidos o porque existe una incapacidad para concentrar la orina. No se observaron diferencias significativas entre los tres grupos, pero el grupo con preeclampsia tiene una osmolalidad ligeramente inferior al resto, sugiriendo que la orina de estas pacientes podría estar más diluida. Los iones son responsables de la concentración y osmolalidad final de la orina, y se reabsorben principalmente en el túbulo distal, donde fisiológicamente se sitúan numerosos transportadores activos y es la parte más susceptible a la acción del sistema endocrino. En esta región se produce la reabsorción de agua mediada por la hormona ADH y en este segmento ejerce su acción la aldosterona, potenciando la acción de la bomba 𝑁𝑎+/𝐾+/𝐴𝑇𝑃𝑎𝑠𝑎 , excretando sodio y reabsorbiendo potasio desde el intersticio; el cotransportador 𝑁𝑎+/𝐶𝑙−, para promover la reabsorción de sodio a contracorriente del cloro desde el lumen; y el canal epitelial de sodio, el cuál favorece la reabsorción de sodio desde el espacio luminal (21). Una mayor actividad de la aldosterona y/o menor actividad de la ADH en esta región explicaría los niveles de iones en la orina de pacientes con PE y el consiguiente descenso en la osmolalidad. 6.2.2 ESTUDIO DE LA FUNCIÓN RENAL EN LA PREECLAMPSIA SEGÚN SU GRAVEDAD Resultó interesante comparar los resultados de cada parámetro en función de la gravedad de la patología con las gestantes sanas. De este modo, se pudo obtener información dependiente de la gravedad de la enfermedad, a pesar de lo limitada que quedó la estadística por la disminución del tamaño muestral tras desglosar el grupo de gestantes con PE. Coincidiendo con las conjeturas planteadas para la tabla 2, en la tabla 3 se encontraron diferencias significativas en la cuantificación proteica entre gestantes sin patología y gestantes con PE grave, siendo mayor el contenido proteico en estas últimas. Este resultado este avalado en varios estudios por definición de la propia enfermedad (1–3,14,15). Sin embargo, entre las consecutivas formas de gravedad de la enfermedad, o incluso entre la forma leve y las gestantes no patológicas, no se obtuvieron resultados significativos, tal vez por la limitación ya comentada del tamaño muestral en el grupo de PE leve. Tras valorar los estadísticos obtenidos para el volumen corporal, no se encontraron resultados relevantes entre las diversas formas de la patología y la gestación normal. Estos datos enfatizaron la idea de que la PE no interfiere en el desarrollo gestacional perturbando el volumen hídrico corporal de la gestante, permitiendo así el aumento de peso a lo largo del embarazo (15). Por último, no se observaron diferencias significativas a nivel iónico entre los diversos grupos, muy posiblemente debido a la limitación del tamaño muestral. 19 N = tamaño muestral Media (desviación estándar) P-valor Parámetros Gestantes sin PE Gestantes con PE leve Gestantes con PE grave PE leve vs PE grave PE leve vs gestantes PE grave vs gestantes Proteínas cuantificadas en orina (g/L) N = 26 0,127 (0,089) N = 4 1,153 (0,71) N = 9 5,88 (5,32) 0,064 0,064 < 0,001 Volumen hídrico corporal (%) N = 26 38,096 (6,72) N = 2 35,45 (2,47) N = 7 43,50 (17,16) 0,883 0,721 0,965 Sodio en orina (mEq/L) N = 20 102,45 (47,98) N = 1 Cte (22,5) N = 3 73,76 (28,76) 0,180 0,099 0,361 Potasio en orina (mEq/L) N = 21 44,77 (28,9) N = 1 Cte (113,2) N = 3 43,6 (23,67) 0,180 0,134 0,965 Cloro en orina (mEq/L) N = 21 107,18 (45,50) N = 1 Cte (34,2) N = 3 91,5 (35,5) 0,180 0,134 0,631 Tabla 3.- Resultados del análisis estadístico para los parámetros relacionados con la función renal y representación del p-valor por comparación entre la gravedad de la enfermedad, siendo el nivel de significación un 5%. N = tamaño muestral Media (desviación estándar) P-valor Parámetros Primer trimestre Segundo trimestre Tercer trimestre 1º vs 2º 1º vs 3º 2º vs 3º Proteínas cuantificadas en orina (g/L) N = 5 0,11 (0,05) N = 8 0,13 (0,11) N = 13 0,12 (0,078) 0,737 0,686 0,950 Tabla 4.- Resultados del análisis estadístico de la cuantificación proteica en orina en el grupo de gestantes sin PE y representación del p-valor por comparación entre los trimestres del embarazo, siendo el nivel de significación un 5%. Finalmente, valorando los resultados que se obtuvieron en este estudio, y que se encuentran representados en la tabla 4, se observa que no existen diferencias significativas en el contenido proteico a lo largo de los trimestres en un embarazo sin PE, contrastando la información de otros estudios, los cuáles defienden que el aumento en el contenido proteico durante el embarazo se observa al comparar el inicio y el final del mismo (14). 20 6.3 TEST DE DETECCIÓN BASADO EN EL COLORANTE ROJO CONGO La puesta a punto de la técnica se realizó con muestras de voluntarias pertenecientes a cada uno de los grupos de estudio. Estas muestras fueron tratadas mediante un proceso de congelación por gradiente y descongelación directa para minimizar la pérdida de proteína total en la muestra por afectación del proceso de congelación (22). Sin embargo, se debe tener en cuenta que estos procesos sobre muestras de orina no están bien conocidos (12). Tras realizar los cambios necesarios con respecto al protocolo inicial y adaptar el método al laboratorio de trabajo, se repitió el test con las mismas muestras, sin poder realizarse el duplicado por carencia de muestra y obteniéndose los resultados representados en la Ilustración 1. Para evaluar la eficacia de cada papel, se calculó ratio del diámetro de la muestra con respecto al del blanco, tomando como medida el mayor diámetro en cualquier dirección. Cuanto más se aproxime este valor al 1, más se asemejará al blanco, y con ello se podrá inferir la ausencia de proteínas en la muestra. Por el contrario, si está por encima de 1, pondrá de manifiesto la presencia de agregados de proteínas. Los resultados obtenidos se presentan a continuación: Ilustración 1.- Resultados obtenidos con la técnica basada en RC. Por filas descendentes encontramos: embarazo sin patología - embarazo con HTA - embarazo con PE leve - embarazo con PE grave - Blanco. Por columnas consecutivas encontramos: papel dorsan living filtration – papel Whatman – papel Trendwhite. 𝑟∅𝑚/∅𝑏= 0,95 𝑟∅𝑚/∅𝑏= 1,10 𝑟∅𝑚/∅𝑏= 1,10 𝑟∅𝑚/∅𝑏= 0,89 𝑟∅𝑚/∅𝑏= 1,14 𝑟∅𝑚/∅𝑏= 1 𝑟∅𝑚/∅𝑏= 1,42 𝑟∅𝑚/∅𝑏= 1,19 𝑟∅𝑚/∅𝑏= 1,10 𝑟∅𝑚/∅𝑏= 2,21 𝑟∅𝑚/∅𝑏= 1,48 𝑟∅𝑚/∅𝑏= 1,80 21 − Embarazo sin patología y blanco: se observa la misma distribución del colorante en el blanco que sobre la muestra de orina. Coincide con lo esperado tras conocer su diagnóstico médico. − Embarazo con HTA: no hay diferencias relevantes visualmente, pues se trata de una paciente gestante que presentó hipertensión sin proteínas en la orina. El resultado coincide con lo esperado tras conocer su diagnóstico. − Embarazo con PE leve: en este caso si había proteínas en la orina (0,952 g/L). Lo esperable sería obtener un diámetro mayor, además de una menor intensidad del color. Este incremento en el diámetro se observa principalmente en el papel dorsan living filtration, con un ratio de 1,42. Además, se aprecia una pequeña disminución en la tonalidad, aunque no se perciba de forma tan clara como en la PE grave. − Embarazo con PE grave: Esta paciente presentó una concentración proteica urinaria de 5,78 g/L. En la ilustración 1 se observa que la intensidad del color disminuyó, como era de esperar debido a la menor disponibilidad del colorante RC libre. Además, se observó que, con respecto al blanco, el papel dorsan living filtration maximiza las diferencias de diámetro, a pesar de que su distribución no es tan homogénea como ocurre con los otros papeles ensayados. Por otro lado, se observó que el papel trendwhite no queda bien definido, sino que aparece con un halo rojizo a su alrededor, que se entiende que es parte del colorante unido a las proteínas intentando avanzar, por lo que también muestra un incremento en el diámetro con respecto al blanco. Por último, el papel Whatman mantuvo la integridad de la circunferencia, desplazándose de forma equitativa alrededor de la zona en la que se había depositado la gota, a pesar de ser el que menos maximiza las diferencias de diámetro. Es una técnica que depende totalmente del contenido proteico de la muestra. Además, con los resultados obtenidos, deducimos que el papel Whatman, económicamente menos asequible, no maximiza las diferencias de diámetro con respecto al blanco tanto como el papel dorsan, de un precio mucho inferior. En este estudio se midió la distancia que es capaz de avanzar la muestra, inversamente proporcional a la cantidad de RC libre y directamente proporcional a la concentración proteica, asique podemos afirmar que el papel más apto para esta técnica es dorsan living filtration. Tras valorar los resultados visualmente, podríamos concluir que esta técnica permite diferenciar la PE en su forma más grave de un embarazo no patológico. Sin embargo, al estar ligada al contenido proteico, es una conclusión que también se puede obtener de la cuantificación proteica. Aun así, tras realizar un análisis estadístico del ratio obtenido en cada tipo de papel con respecto a cada grupo, no se obtuvieron resultados significativos. Esto pudo deberse a la principal limitación del estudio, el tamaño muestral. Por todo ello, concluimos que es una técnica de detección rápida en patologías donde el contenido proteico en orina es elevado, pero no se puede confirmar su uso para predecir episodios de PE, a falta de más investigación. A continuación, en la ilustración 2 se presentan los resultados obtenidos del análisis de 2 muestras de orina de la misma paciente, con 18,45 g/L y, 5 días más tarde, con 12,78 g/L de proteínas. Todo ello acompañado de hipertensión, por lo que el diagnóstico definitivo fue de PE grave. 22 A pesar de los cambios visuales que podemos intuir, o las diferencias en el contenido proteico que conocemos, no se observan diferencias significativas entre los ratios de ambas muestras. Esto nos permitió postular que, una vez alcanzado un límite proteico, el diámetro de la marca deja de variar al igual que la tonalidad y, por tanto, no está directamente relacionado con el aumento del contenido proteico. Finalmente, en la ilustración 3 (anexo IV) se pretende mostrar la misma técnica aplicada sobre una paciente con enfermedad renal crónica (ERC) con 6,23 g/L de proteínas en la orina. Debido a la patología que presenta, las proteínas se filtran a través del glomérulo y se detectan en orina. Como consecuencia, se observa el cambio de color hacia rosado provocado por la presencia de las proteínas en la muestra de orina. Esto permitió confirmar que padecer ERC es un factor que puede provocar interferencias en el desarrollo del test, además de proponer que la congofilia puede observarse en otras patologías que cursan con aumento de proteínas en orina, dependiendo así de la presencia de proteínas en la orina y de la conformación que tengan. 7 CONCLUSIONES Tras el análisis de los resultados obtenidos y, valorando los objetivos planteados en el comienzo del proyecto, se han alcanzado las siguientes conclusiones: 1. La PE conlleva disminución de la TFG en comparación con el embarazo sin PE, que podría estar en relación con el desarrollo de una lesión estructural/funcional renal, valorándose así la Ilustración 2.- Test RC aplicado sobre dos muestras de orina de la misma paciente. En la primera fila se encuentra la muestra con una concentración proteica de 18,45 g/L, mientras que en la segunda fila se encuentra la muestra con 12,78 g/L de proteínas, tomada 5 días más tarde. Por último, en la tercera fila se encuentra el blanco. 𝑟 ∅𝑚/∅𝑏 = 2,16 𝑟 ∅𝑚/∅𝑏 = 1,5 𝑟 ∅𝑚/∅𝑏 = 1,25 𝑟 ∅𝑚/∅𝑏 = 2 𝑟 ∅𝑚/∅𝑏 = 1,52 𝑟 ∅𝑚/∅𝑏 = 1,30 23 necesidad de ajustar los valores de la TFG en población gestante para identificar la patología renal. 2. En la PE, la disminución de la TFG conlleva el acúmulo de creatinina y ácido úrico en sangre. 3. La concentración de glucosa en la orina no presenta variaciones durante el embarazo, aún en presencia de PE. 4. Existe una situación de hiperfiltración durante el embarazo que condiciona adaptaciones de la función tubular. Se observa eficacia del equilibrio glomérulo-tubular para conservar un adecuado balance de sodio. 5. Los niveles de cloro y potasio urinarios disminuyen durante el embarazo, mientras el sodio y la osmolalidad urinaria no presentan variaciones. Durante un episodio de PE los niveles de cloro, sodio y osmolalidad urinaria son más bajos que lo esperado en un embarazo sin complicaciones, observando diferencias significativas solo en el cloro. No se observaron diferencias en el balance iónico en función de la gravedad. 6. El volumen de agua corporal no registra variaciones en el embarazo, a pesar de que el descenso de osmolalidad urinaria en PE sugiere una pérdida de agua a través de la orina. 7. La proteinuria es una característica fundamental en los fenómenos de PE, considerándose un factor indicador de gravedad. 8. La técnica basada en RC permite detectar proteínas en la orina de pacientes que presentan PE. Se puede aplicar como técnica complementaria a las rutinarias o incluso puede servir como técnica básica de detección proteica urinaria en lugares donde los recursos estén más limitados. Se requiere más investigación para conocer si es una técnica útil en diagnóstico precoz. 9. El papel dorsan living filtration es el óptimo para el desarrollo de la técnica basada en RC, debido a su precio y a la capacidad de maximizar las diferencias de diámetro con respecto a los otros papeles ensayados. 10. La técnica basada en RC presenta un umbral de saturación para la concentración proteica urinaria. Una vez alcanzado, el diámetro de la marca y la intensidad del color dejan de variar. 8 CONCLUSIONS After analyzing the results obtained and evaluating the objectives set at the beginning of the project, the following conclusions have been reached: 1. PE leads to decreased TFG compared to PE-free pregnancy, which could be in relation to the development of a renal structural/functional injury, thus rated the need to adjust the values of GFR in the pregnant population to identify renal pathology. 2. In PE, the decrease in GFR leads to the accumulation of creatinine and uric acid in the blood. 3. The glucose concentration in the urine does not show variations during pregnancy, even in the presence of PE. 4. There is a situation of hyperfiltration during pregnancy that conditions adaptations of tubular function. Glomerulo-tubular balance is effective in maintaining an adequate sodium balance. 5. Urinary chlorine and potassium levels decrease during pregnancy, while urinary sodium and osmolality do not show variations. During an episode of PE, the levels of chlorine, sodium and urinary osmolality are lower than expected in an uncomplicated pregnancy, observing 24 significant differences only in chlorine. No differences were observed in ion balance as a function of gravity. 6. The volume of body water does not register changes in pregnancy, despite the fact that the decrease in urinary osmolality in PE suggests a loss of water through the urine. 7. Proteinuria is a fundamental characteristic in PE, being considered an indicator of severity. 8. The CR-based technique allows the detection of proteins in the urine of patients with PE. It can be applied as a complementary technique to the routine ones or it can even serve as a basic urinary protein detection technique in places where resources are more limited. More research is required to know if it is a useful technique in early diagnosis. 9. The dorsan living filtration paper is optimal for the development of the RC-based technique, due to its price and the ability to maximize the differences in diameter with respect to the other papers tested. 10. The RC-based technique has a saturation threshold for urinary protein concentration. Once reached, the diameter of the mark and the intensity of the color cease to vary. 9 REFERENCIAS BIBLIOGRÁFICAS 1. Starodubtseva N, Nizyaeva N, Baev O, Bugrova A, Gapaeva M, Muminova K, et al. SERPINA1 peptides in urine as a potential marker of preeclampsia severity. Int J Mol Sci. 2020;21(3):1–15. 2. Gerasimova EM, Fedotov SA, Kachkin D V, Vashukova ES, Glotov AS, Chernoff YO, et al. Protein misfolding during pregnancy: New approaches to preeclampsia diagnostics. Int J Mol Sci. 2019;20(24):1-18. 3. Sociedad Española de Ginecología y Obstetricia. Trastornos hipertensivos del embarazo - Guía práctica asistencial. 2006;1–14. 4. Otero Gonzalez A. Embarazo y Riñon. Nefrología al día. 2020;1–52. 5. Lecarpentier E, Tsatsaris V. Angiogenic balance (sFlt-1/PlGF) and preeclampsia. Ann Endocrinol. 2016;77(2):97–100. 6. Brennecke SP et al. Predictive Value of the sFlt-1: PlGF Ratio in Women With Suspected Preeclampsia. NEJM. 2016; 374:13–22. 7. Buhimschi IA, Nayeri UA, Zhao G, Shook LL, Pensalfini A, Funai EF, et al. Defective Amyloid Processing in Preeclampsia. Sci Transl Med. 2014;6(245):245–92. 8. Bateman A. UniProt: A worldwide hub of protein knowledge. Nucleic Acids Res. 2019;47(D1):D506–15. 9. Rood KM, Buhimschi CS, Dible T, Webster S, Zhao G, Samuels P, et al. Congo Red Dot Paper Test for Antenatal Triage and Rapid Identification of Preeclampsia. EClinicalMedicine. 2019;8:47–56. 10. García de Guadiana Romualdo L, Martínez Uriarte J, González Morales M, López Pérez R, Hernández Salinas FJ, Martín García E, et al. Evaluación del índice proteina-creatinina en orina