Repositorio Institucional de Documentos

2021 63 Llipsy San iago Ga cía Rele ancia de la in lamación mediada po la g anzima A en au oinmunidad y cánce Depa amen o Di ec o /es Depa amen o de Mic obiología, Pedia ía, Radiología y Salud Pública Pa do Jimeno, Julian © Uni e sidad de Za agoza Se icio de Publicaciones ISSN 2254-7606 Llipsy San iago Ga cía RELEVANCIA DE LA INFLAMACIÓN MEDIADA POR LA GRANZIMA A EN AUTOINMUNIDAD Y CÁNCER Di ec o /es Depa amen o de Mic obiología, Pedia ía, Radiología y Salud Pública Pa do Jimeno, Julian Tesis Doc o al Au o 2020 UNIVERSIDAD DE ZARAGOZA Reposi o io de la Uni e sidad de Za agoza – Zaguan h p://zaguan.uniza .es UNIVERSIDAD DE ZARAGOZA Depa amen o de Bioquímica y Biología Molecula y Celula Facul ad de Ciencias Tesis doc o al Rele ancia de la in lamación mediada po la g anzima A en au oinmunidad y cánce Memo ia p esen ada po : Llipsy San iago Ga cía Licenciada en Fa macia pa a op a al g ado de Doc o a en Ciencias po la Uni e sidad de Za agoza 2020 D . Julián Pa do Jimeno, Doc o en Ciencias e In es igado ARAID en el Cen o de In es igaciones Biomédicas de A agón (CIBA) de la Uni e sidad de Za agoza CERTIFICA: Que la Tesis Doc o al i ulada: “Rele ancia de la in lamación mediada po la g anzima A en au oinmunidad y cánce ”, ha sido ealizada en el Depa amen o de Bioquímica y Biología Molecula y Celula de la Facul ad de Ciencias de la Uni e sidad de Za agoza y en el Cen o de In es igaciones Biomédicas de A agón bajo mi di ección, y que eúne las condiciones eque idas pa a que su au o a, la Licenciada en Fa macia Llipsy San iago Ga cía, pueda op a al G ado de Doc o en Ciencias po la Uni e sidad de Za agoza. Za agoza, 14 de eb e o de 2020 Fdo. Julián Pa do Jimeno. Es e abajo ha sido ealizado g acias a una beca Uni e sidad de Za agoza- Banco San ande pa a La inoame icanos, cu so 2012-2013, y a un con a o p edoc o al pa a la o mación de doc o es o o gada po el Minis e io de Economía y Compe i i idad (SAF2014-54763-C2-1-R). Índice 1- INTRODUCCIÓN --------------------------------------------------------------------------------------- 1 1.1 In lamación en au oinmunidad y cánce ----------------------------------------------------- 1 1.2 Mecanismos de ci o oxicidad de las células e ec o as del sis ema inmuni a io ---- 3 1.2.1 Exoci osis g anula ------------------------------------------------------------------------- 3 1.2.1.1 Pe o ina (Pe ) ---------------------------------------------------------------------- 5 1.2.1.2 G anzimas (Gzms) ----------------------------------------------------------------- 9 1.2.2 Inhibido es de Gzms: Se pinas --------------------------------------------------------- 20 1.3 A i is euma oide -------------------------------------------------------------------------------- 23 1.3.1 Epidemiología ------------------------------------------------------------------------------- 23 1.3.2 E iología -------------------------------------------------------------------------------------- 24 1.3.2.1 Fac o es gené icos ---------------------------------------------------------------- 24 1.3.3 Sis ema inmuni a io y AR ---------------------------------------------------------------- 25 1.3.3.1 Au oan icue pos en la pa ogenia de la AR ---------------------------------- 25 1.3.3.2 Fisiopa ología de la AR ---------------------------------------------------------- 26 1.3.3.3 Papel pa ogénico de las células del sis ema inmuni a io en la AR ---- 28 1.3.3.4 Ci oquinas en AR ------------------------------------------------------------------ 36 1.3.4 Modelos mu inos pa a el es udio de AR --------------------------------------------- 38 1.3.4.1 CIA ------------------------------------------------------------------------------------ 40 1.4 Cánce colo ec al -------------------------------------------------------------------------------- 44 1.4.1 Epidemiología ------------------------------------------------------------------------------- 44 1.4.2 Clasi icación --------------------------------------------------------------------------------- 45 1.4.2.1 Es adi icación ----------------------------------------------------------------------- 45 1.4.2.2 Clasi icación según los Sub ipos Molecula es de Consenso de CCR (CMSs) ----------------------------------------------------------------------------------------- 46 1.4.3 E iología. Fac o es de iesgo ------------------------------------------------------------ 47 1.4.3.1 Fac o es he edi a ios ------------------------------------------------------------- 47 1.4.3.2 Fac o es ambien ales o ac o es elacionados con el es ilo de ida --- 48 1.4.3.3 An eceden es médicos pe sonales -------------------------------------------- 49 1.4.4 Mecanismos mu acionales asociados al desa ollo de CCR -------------------- 51 1.4.4.1 Mecanismos epigené icos ------------------------------------------------------- 51 1.4.4.2 CIN ------------------------------------------------------------------------------------ 51 1.4.4.3 MSI ------------------------------------------------------------------------------------ 52 1.4.5 In lamación y cánce colo ec al --------------------------------------------------------- 52 Índice 1.4.5.1 pa ogenia molecula del CAC. Di e encias con el CCR espo ádico y he edi a io ------------------------------------------------------------------------------------- 53 1.4.5.2 In lamación en la iniciación de CAC ------------------------------------------- 54 1.4.5.3 In lamación en la p og esión de CAC ---------------------------------------- 55 1.4.5.4 In lamación en la in asión y me ás asis del CAC -------------------------- 57 1.4.5.5 Ci oquinas en CCR ---------------------------------------------------------------- 58 1.4.5.6 La ía COX-2/PGE2: in lamación y umo igénesis colo ec al ---------- 69 1.4.6 Células del sis ema inmuni a io en CCR --------------------------------------------- 70 1.4.7 Papel de la mic obio a in es inal en el desa ollo del cánce -------------------- 73 1.4.8 Modelos expe imen ales pa a el es udio de CCR ---------------------------------- 75 1.4.8.1 Modelos in i o --------------------------------------------------------------------- 75 1.4.8.2 AOM ---------------------------------------------------------------------------------- 76 1.4.8.3 Modelo de CAC. DSS/AOM ----------------------------------------------------- 77 2- ANTECEDENTES Y OBJETIVOS ---------------------------------------------------------------- 79 Obje i os ------------------------------------------------------------------------------------------------ 82 3- MATERIALES Y MÉTODOS ----------------------------------------------------------------------- 85 3.1 Expe imen os in i o ---------------------------------------------------------------------------- 85 3.1.1 Ra ones -------------------------------------------------------------------------------------- 85 3.1.1.1 De e minación del geno ipo de los a ones ---------------------------------- 85 3.1.2 A i is inducida po colágeno (CIA) --------------------------------------------------- 88 3.1.2.1 P epa ación de la emulsión ----------------------------------------------------- 88 3.1.2.2 Inmunización ------------------------------------------------------------------------ 88 3.1.2.3 Moni o ización y e aluación de la se e idad de la a i is ---------------- 89 3.1.2.4 Ana omía pa ológica e inmunohis oquímica--------------------------------- 89 3.1.2.5 Análisis de p oli e ación de células T (inco po ación de 3H- imidina) - 90 3.1.2.6 Ensayo de o mación de osas ------------------------------------------------- 91 3.1.3 Coli is y cánce asociado a coli is ------------------------------------------------------ 91 3.1.3.1 Inducción de coli is c ónica y aguda ------------------------------------------ 91 3.1.3.2 Inducción de cánce asociado a coli is (CAC) ------------------------------ 92 3.1.3.3 Pun uación clínica ----------------------------------------------------------------- 94 3.1.3.4 Pun uación del daño mac oscópico ------------------------------------------- 94 3.1.3.5 E aluación his ológica de la in lamación ------------------------------------- 95 3.1.3.6 De e minación del g ado umo al ---------------------------------------------- 95 3.1.3.7 Es udio inmunohis oquímico de ma cado es de p oli e ación y EMT - 96 Índice 3.1.3.8 Es udio de la pe meabilidad in es inal en a ones w y GzmA-/- -------- 97 3.1.3.9 Aislamien o de lin oci os in aepi eliales (IELs) ----------------------------- 98 3.1.3.10 Composición de mic obio a in es inal --------------------------------------- 98 3.2 Análisis de la exp esión de p o eínas ------------------------------------------------------- 99 3.2.1 Ex acción de p o eínas o ales a pa i del ejido congelado -------------------- 99 3.2.2 Ensayo colo imé ico B ad o d pa a es ima la concen ación de p o eínas100 3.2.3 Cuan i icación de p o eínas po ELISA --------------------------------------------- 100 3.2.3.1 Cuan i icación de Ci oquinas po ELISA ----------------------------------- 100 3.2.3.2 Cuan i icación de GzmA po ELISA ----------------------------------------- 101 3.2.3.3 Cuan i icación Telopép ido C- e minal de colágeno ipo I (ICTP) po ELISA ----------------------------------------------------------------------------------------- 102 3.2.3.4 Cuan i icación de an icue pos IgG an i colágeno ipo II po ELISA -- 102 3.2.4 Análisis de p o eínas po Wes e n-Blo --------------------------------------------- 103 3.2.4.1 Ex acción de p o eínas o ales a pa i de lisados celula es ---------- 103 3.2.4.2 Sepa ación de p o eínas celula es. Elec o o esis en gel de poliac ilamida ------------------------------------------------------------------------------- 104 3.2.4.3 T ans e encia de p o eínas a memb anas --------------------------------- 104 3.2.4.4 Análisis de p o eínas po inmunoblo (Wes e n blo ing) --------------- 104 3.2.5 Análisis de p o eínas de la supe icie celula po ci ome ía de lujo -------- 106 3.2.5.1 Análisis in acelula de GzmA po ci ome ía de lujo ------------------- 106 3.3 Sob eexp esión y pu i icación de p o eínas --------------------------------------------- 107 3.3.1 P epa ación de medios y cul i os de Esche ichia coli y Pichia pas o is ---- 107 3.3.2 Exp esión y pu i icación de GzmA en Esche ichia coli ------------------------- 108 3.3.2.1 Inducción con IPTG ------------------------------------------------------------- 108 3.3.2.2 Ob ención de cue pos de inclusión ------------------------------------------ 109 3.3.2.3 Solubilización y eplegamien o de las p o eínas con enidas en los cue pos de inclusión ---------------------------------------------------------------------- 109 3.3.2.4 Pu i icación median e c oma og a ía de in e cambio ca iónico ------- 110 3.3.2.5 Ac i ación de la p o-GzmA ---------------------------------------------------- 111 3.3.2.6 De e minación de la ac i idad enzimá ica de la p o eína GzmA ----- 111 3.3.3 Exp esión y pu i icación de Se pinb6b en Pichia pas o is. --------------------- 112 3.3.3.1 Inducción con me anol --------------------------------------------------------- 112 3.3.3.2 Lisis del pelle celula ----------------------------------------------------------- 113 3.3.3.3 Pu i icación median e c oma og a ía de a inidad po níquel ---------- 113 Índice 3.4 Cuan i icación de P os aglandina E2 po ELISA ---------------------------------------- 114 3.5 Análisis de la exp esión génica ------------------------------------------------------------- 114 3.5.1 Ex acción de RNA y de e minación de la exp esión génica median e RT- qPCR ----------------------------------------------------------------------------------------------- 114 3.6 Cul i os celula es ------------------------------------------------------------------------------ 115 3.6.1 Líneas celula es -------------------------------------------------------------------------- 116 3.6.2 Man enimien o de los cul i os celula es ------------------------------------------- 116 3.6.3 Congelación y descongelación de células ----------------------------------------- 117 3.6.4 Con aje y de e minación de la iabilidad celula --------------------------------- 118 3.6.5 Inac i ación del complemen o en el sue o e al bo ino ------------------------- 118 3.6.6 Gene ación de OCs a pa i de di e en es p ecu so es ------------------------- 118 3.6.7 Gene ación de mac ó agos M1 de i ados de la médula ósea (BMDM) ---- 120 3.6.8 Análisis de la exp esión de IL-6 inducida po GzmA ex acelula en mac ó agos M1 ---------------------------------------------------------------------------------- 121 3.6.9 Ac i ación in i o de las ías p-STAT3 y NFκB en MC-38 -------------------- 121 3.7 De e minación de la co elación en e GZMA e in lamación en mues as de CCR humano ------------------------------------------------------------------------------------------------ 122 3.8 Análisis es adís ico ---------------------------------------------------------------------------- 123 4- RESULTADOS Y DISCUSIÓN ------------------------------------------------------------------ 124 4.1 A i is inducida po colágeno. Papel de la GzmA en el modelo CIA -------------- 124 4.1.1 E aluación de la se e idad de la en e medad ------------------------------------ 124 4.1.2 Es udio de ana omía pa ológica ------------------------------------------------------ 125 4.1.3 Respues a in lama o ia in i o du an e CIA --------------------------------------- 128 4.1.4 Exp esión de GzmA du an e CIA ---------------------------------------------------- 129 4.1.5 Respues a in i o de células B al colágeno ipo II: ------------------------------ 130 4.1.6 Respues a in i o de células T al colágeno ipo II ------------------------------- 131 4.1.7 Es udio de la os eoclas ogénesis in i o du an e CIA -------------------------- 134 4.1.8 Es udio de la os eoclas ogénesis in i o ------------------------------------------- 137 4.1.9 Mecanismo de la o mación de OCs inducida po GzmA ---------------------- 143 4.1.10 Discusión --------------------------------------------------------------------------------- 147 4.2 Coli is y CAC. Papel de la GzmA en el modelo DSS y DSS/AOM. ---------------- 153 4.2.1 GzmA ac i a inc emen ada en el ejido de colon de animales a ados con DSS y DSS/AOM -------------------------------------------------------------------------------- 153 Índice 4.2.2 E aluación de la coli is ulce a i a c ónica in i o -------------------------------- 156 4.2.3 E aluación del daño mac oscópico y mic oscópico en UC c ónica in i o 157 4.2.4 Cuan i icación de ci oquinas in lama o ias en explan es de cul i o de ejido de colon de a ones w y GzmA-/- du an e coli is c ónica ------------------------------ 159 4.2.5 E aluación del papel de la GzmA du an e la coli is aguda in i o: Pun uación clínica, pé dida de peso y e aluación del daño mac oscópico ----------------------- 161 4.2.6 Cuan i icación de ci oquinas en explan es de cul i o de ejido de colon de a ones w y GzmA-/- du an e coli is aguda ----------------------------------------------- 163 4.2.7 Cánce asociado a coli is en un modelo in i o. E aluación de la se e idad de la en e medad y del daño a ni el mac oscópico ------------------------------------- 165 4.2.8 E aluación del daño his ológico, de los umo es y del g ado umo al ------- 166 4.2.9 Es udio de ma cado es de EMT y p oli e ación umo al ------------------------ 170 4.2.10 Es udio de la in lamación y la ac i idad de la COX-2 en explan es de cul i o de ejido de colon de a ones w y GzmA-/- du an e el desa ollo del CCR -------- 174 4.2.11 Papel de la mic obio a in es inal en el CCR in i o ---------------------------- 176 4.2.12 Es udio del papel de la Pe y la GzmB du an e el desa ollo del CCR inducido con DSS/AOM ------------------------------------------------------------------------ 178 4.2.13 La p oducción de IL-6 y TNF- inducida po GzmA ex acelula en mac ó agos M1 inc emen a la exp esión de p-STAT3 y p-NF-kB en la línea celula de CCR MC38 ----------------------------------------------------------------------------------- 181 4.2.14 Es udio de la inhibición in i o de la IL-6 y del TNF- du an e el CAC inducido po DSS/AOM ------------------------------------------------------------------------ 184 4.2.15 Es udio del papel de la inhibición e apéu ica in i o de la GzmA du an e el CAC inducido po DSS/AOM ----------------------------------------------------------------- 189 4.2.16 Co elación posi i a en e exp esión de GZMA e in lamación en mues as humanas de CCR ------------------------------------------------------------------------------- 190 4.2.17 Discusión --------------------------------------------------------------------------------- 193 5- CONCLUSIONES ----------------------------------------------------------------------------------- 199 6- BIBLIOGRAFÍA ------------------------------------------------------------------------------------- 201 INTRODUCCIÓN In oducción 1 1- INTRODUCCIÓN 1.1 In lamación en au oinmunidad y cánce El sis ema inmuni a io p o ege al o ganismo de las in ecciones y del desa ollo del cánce , man eniendo la ole ancia hacia los ejidos p opios sanos y las sus ancias exógenas no dañinas, e i ando eacciones au oinmunes y o os as o nos in lama o ios. Pa a lle a a cabo es e obje i o cuen a con di e sas células, ejidos y una amplia gama de moléculas solubles. El sis ema inmuni a io esponde a señales de pelig o endógenas y exógenas (1). Las señales de pelig o desencadenadas po moléculas mic obianas ex añas son conocidas como pa ones molecula es asociados a pa ógenos (PAMPs, del inglés “Pa hogen-Associa ed Molecula Pa e ns”). Po su pa e, las señales de pelig o desencadenadas po componen es celula es, libe ados as una lesión o mue e celula , son conocidos como pa ones molecula es asociados a daños (DAMPs, del inglés “Damage-Associa ed Molecula Pa e ns”) (1). Tan o los PAMPs como los DAMPs son econocidos po ecep o es de econocimien o de pa ones (PRRs, del inglés “Pa e n- Recogni ion Recep o s”) (2), exp esados po di e en es ipos celula es, lo que desencadena la exp esión de ci oquinas p oin lama o ias como IL-1/β, IL-18, IL- 6 y TNF- (3, 4). La p oducción de es as ci oquinas es imula la ac i ación y/o pe pe uación de la espues a inmuni a ia, incluidas las espues as humo ales (gene ación de an icue pos) y celula es, que en úl ima ins ancia son esponsables de elimina la célula a ec ada y/o el pa ógeno. La in lamación es pa e de una espues a biológica compleja al daño celula o a una in ección, a a és de la cual el sis ema inmuni a io in en a elimina o neu aliza los es ímulos pe judiciales, iniciando p ocesos de cu ación y egene ación en los ejidos dañados. Aunque el papel bene icioso de la in lamación es de ende al huésped y asegu a su supe i encia, una in lamación no esuel a en e a es ímulos con inuos susci a una espues a in lama o ia c ónica, que sus en a muchos as o nos como en e medad ca díaca o acciden e ce eb o ascula . También puede conduci a as o nos au oinmunes, como la a i is euma oide y el lupus, así como a la génesis y p og esión de di e en es In oducción 8 Una eo ía al e na i a sugie e que la Pe y las Gzms se unen a la memb ana de la célula diana y se in e nalizan ápidamen e en endosomas y pos e io men e la Pe o ma po os en la memb ana del endosoma, libe ándose Gzms al ci osol. Inicialmen e se p opuso que el ecep o de manosa 6 os a o pod ía se esponsable de la unión de las Gzms a la memb ana pa a su pos e io endoci osis (53). Sin emba go, se ha demos ado que en células de icien es en es e ecep o , se p oduce igualmen e la en ada de las Gzms (54).También se plan eó que la unión de las Gzms a la memb ana no depende de ecep o , sino de la ca ga ne a posi i a de es as p o easas (55, 56). Figu a 1.2 Mecanismos de acción p opues os pa a la Pe . Se indican los es ipos de mecanismos p opues os (1, 2 y 3) según lo desc i o en el ex o. Más ecien emen e, ha su gido una eo ía híb ida que sugie e que la Pe o ma po os en la memb ana plasmá ica de la célula diana, lo que pe mi e la en ada de Ca2+. Es e aumen o de Ca2+ in acelula induce mecanismos de epa ación en los que los lisosomas y endosomas se usionan con la memb ana plasmá ica con el in de sella la, p oduciéndose la endoci osis de la Pe jun o con las Gzms (57). En el ci osol se o man endosomas de g an amaño donde las Gzms son libe adas po un p oceso no conocido que equie e de la o mación de po o po la Pe (58). In oducción 9 1.2.1.2 G anzimas Las g anzimas (Gzms, enzimas asociadas a g ánulos) son una amilia de p o easas descubie as en los años 80 (59, 60), o iginalmen e iden i icadas en g ánulos ci osólicos (lisosomas sec e o es especializados o g ánulos ci o óxicos) de lin oci os Tc y células NK. La Pe , GzmA y GzmB son los cons i uyen es p edominan es de los g ánulos ci o óxicos. Sin emba go, se han desc i o o as Gzms menos abundan es, con posible signi icado uncional y con acciones biológicas no escla ecidas del odo, denominadas Gzms hué anas (12, 34, 61). Se han encon ado Gzms en células de o igen hema opoyé ico y no hema opoyé ico, undamen almen e en lin oci os T CD8+ y células NK, pe o ambién en o os g upos celula es como lin oci os Tγδ, lin oci os T CD4+, células T egulado as (T eg), mac ó agos, basó ilos, mas oci os, espe ma ozoides, células de se oli, que a inoci os, neumoci os, mac ó agos al eola es y células epi eliales al eola es (62-69). Has a la echa, se han desc i o 5 Gzms en humanos (A, B, H, K, y M) y 10 en a ón (A, B, C, D, E, F, G, K, M y N), siendo la GzmA y la GzmB las más abundan es y mejo ca ac e izadas (13). Las Gzms se clasi ican según su especi icidad de co e y su ac i idad p o eolí ica. Es as p o easas es án eguladas po miemb os de la amilia de las se pinas (inhibido es de se ina p o easas), que e i an la au olesión de la célula e ec o a (70). En la abla 1.2 se mues an las Gzms exp esadas en células de o igen humano y mu ino, así como la ac i idad p o eolí ica, la especi icidad de co e y las células que las exp esan, an o in i o como ex i o. Las Gzms son sin e izadas como zimógenos y en su ex emo N- e minal poseen una secuencia de dos aminoácidos (Gly-Glu o Glu-Glu) que deben se p o eolizados pa a se ac i adas. Pos e io men e son anspo adas del e ículo endoplasmá ico (RE) al apa a o de Golgi y de allí di igidas a los g ánulos ci o óxicos. En su in e io , la p o easa ca epsina C (dipep idil pep idasa I) deg ada su secuencia N- e minal, ac i ándolas. Las Gzms pe manecen inac i as en el in e io de los g ánulos debido al pH bajo y a la o mación de complejos con p o eoglicanos como la se glicina (GzmB) y el sul a o de hepa ina (GzmA) (71). In oducción 10 Gzm Especie Ac i idad Especi icidad de co e Tipo Celula GzmA h,m T ip asa A g, Lys Tc, T eg, NK, NKT, GMC, Pne, Mal GzmB h,m ASPasa Asp > Glu Tc, T eg, NK, NKT, Mas, MDSCs (h), Bas (h), MØ (h), CDs, GMC, B cell (h), Se , Pne, Que GzmC m Quimasa Asn o Se * NK GzmD m Quimasa Phe, Leu GMC GzmE m Quimasa Phe, Leu* GMC GzmF m Quimasa Phe, Leu* GMC GzmG m Quimasa Phe, Leu* GMC GzmH h Quimasa Phe > Ty NK GzmK h,m T ip asa A g, Lys Tc, NK, NKT (h), NK (h, CD56B igh ) GzmM h, m METasa Me > Leu NK, NKT, Tγδ. GzmN m ? ? Spe Tabla 1.2 Gzms exp esadas en células de o igen humano y mu ino.Tc: Lin oci os T ci o óxicos (CD8+ T, CD8+ T, CD8- T). NK: Células NK. NKT: Células NKT. MDSCs: Células Sup eso as de O igen Mieloide (del inglés “Myeloid-De i ed Supp esso Cells”). Mas: mas oci os. T eg: Células T CD4+ egulado as. Bas: basó ilos. MØ: mac ó agos. CDs: Células Dend í icas. Se : Células de Se oli. Spe : Espe ma oci os. GMC: Células de la glándula me ial. Pne: neumoci os. Mal : Mac ó agos al eola es. Que : que a inoci os. * Hipo é ico pe o no de e minado expe imen almen e. Una ez en el ci osol de la célula diana, las Gzms eje cen sus unciones biológicas al co a sus a os in acelula es c uciales que con olan la mue e celula (72, 73), la eplicación i al (74) o la in lamación (75). También, algunas Gzms pueden libe a se al medio ex acelula (65, 76), donde escinden p o eínas de la ma iz ex acelula (ECM, del inglés “Ex acellula Ma ix”), de la unión celula y de la supe icie celula . Es e p oceso es á implicado en la angiogénesis e in eg idad ascula , la ansmig ación lin oci a ia, la unción de ba e a, la in lamación o el en ejecimien o y cica ización de la piel, así como en las en e medades ampollosas au oinmunes (pén igo) (77-86). No obs an e, en la ac ualidad, el papel exac o de cada Gzm en la mue e celula , la in lamación, o ambas, no es á comple amen e desc i o. En la abla 1.3 se mues a una lis a de a ios de los sus a os ex acelula es iden i icados pa a GzmA y GzmB (87). In oducción 11 Tabla 1.3 Sus a os ex acelula es de GzmA y GzmB. Adap ado de (87). G anzima B La GzmB desempeña un papel ele an e en la inducción de apop osis. Es a se ín p o easa co a esiduos de ácido aspá ico, siendo la caspasa-3 y la caspasa-7 alguno de sus sus a os in acelula es. La escisión de dichas caspasas induce la mue e celula po apop osis (88). La GzmB puede induci apop osis a a és de dos mecanismos: ac i ando di ec amen e a las caspasas (89, 90) o a a és de la ía apop ó ica mi ocond ial (89, 91-94) (Figu a 1.3). En expe imen os ealizados in i o se ha obse ado que la GzmB humana mues a más a inidad po Bid, mien as que la de a ón es más a ín a la caspasa- 3 (95-97). Sus a o Función p opues a/comen a ios GzmA Fib onec ina Mig ación de lin oci os Ac i ado de plasminógeno p o- u oquinasa Mig ación de lin oci os a a és de coágulos de ib ina Colágeno IV Mig ación de lin oci os P o eína básica de mielina Pa ogénesis de la escle osis múl iple P o eoglicanos de memb ana basal Mig ación de lin oci os Libe ación del ac o básico de c ecimien o de ib oblas os Recep o simila a la ombina en neu i as Re acción de neu i as Desconocido Ac i ación de monoci os P oducción de ci oquinas po monoci os, ib oblas os y células epi eliales Recep o de ombina (PAR-1??) Desensibilización de plaque as Recep o Ac i ado po P o easa 2 (PAR-2, del inglés “P o ease- Ac i a ed Recep o 2”) Pa ogénesis de la coli is in ecciosa GzmB P o eoglicanos de ag ecano (ca ílago) Pa ogénesis de la a i is euma oide Recep o de glu ama o neu onal Gene ación de au oan ígenos en la ence ali is de Rasmussen Fib onec ina (células muscula es lisas) Mue e de células muscula es independien e de la Pe Pa ogénesis de la a e oscle osis Vi onec ina, ib onec ina, laminina Mue e de células endo eliales independien e de la Pe Inhibición de la mig ación de células umo ales, mig ación de lin oci os In oducción 12 Inicialmen e, se demos ó in i o que la GzmB pu i icada e a capaz de ac i a di ec amen e a la caspasa-3 (98). Asimismo se ha con i mado in i o, que la GzmB puede ac i a a las caspasas-7, 8 y 10 (99). También se ha desc i o que, al igual que la caspasa-3, la GzmB puede p ocesa di ec amen e, y sin la mediación de las caspasas, al inhibido de la DNAsa ac i ada po caspasas (ICAD), p o ocando la ac i ación de CAD y pos e io agmen ación del DNA (100). Recien emen e se ha desc i o que la GzmB de a ón pod ía induci apop osis al deg ada a la p o eína an iapop ó ica Mcl1, libe ándose así la p o eína p oapop ó ica Bim, que colabo a á a su ez en la ac i ación de Bax y Bak (101, 102). Se ha is o además, que es a p o easa puede induci mue e celula al se capaz de p o eoliza di ec amen e a la α- ubulina y a la ilamina, p o ocando la deso ganización del ci oesquele o (99, 103). La GzmB ambién puede ac i a la ía apop ó ica mi ocond ial, p o ocando la caída del po encial de memb ana. Se ha de e minado que la GzmB puede p o eoliza a la p o eína p oapop ó ica Bid, gene ando Bid uncado ( Bid), con pos e io ac i ación de Bak y Bax, libe ación de ci oc omo c (ci c), o mación del apop osoma y ac i ación de la caspasa-9 (89). También se ha is o que la GzmB induce la caída del po encial a a és de una ía independien e de Bid, Bak y Bax, y dependien e de las caspasas-3 y 7 (89, 104). In oducción 13 Figu a 1.3 Apop osis inducida po GzmB. O as unciones de la GzmB La GzmB, además de unciones ci o óxicas, se ha elacionado con p ocesos in lama o ios, el en ejecimien o cu áneo, la cica ización, las en e medades ca dio ascula es y ambién se le han a ibuido unciones an i i ales e inmunosup eso as (86). Se ha is o que la GzmB puede deg ada sus a os elacionados con la coagulación como el ac o on Willeb and o el ib inógeno (105). Además, la GzmB puede p o eoliza a la deco ina, ib onec ina y i onec ina (80, 106), po In oducción 14 lo que se le ha implicado en p ocesos de epa ación isula . También se ha elacionado con en e medades ca dio ascula es como a e ioescle osis o aneu ismas. Se piensa que la GzmB puede ac ua sob e componen es de la ma iz ex acelula como la ib ilina-1, p o ocando ines abilidad de las pa edes ascula es (80, 107, 108). La GzmB ambién ha demos ado ene e ec os an i i ales di ec os. Además de su papel en la inducción de apop osis en células in ec adas, se ha is o que la GzmB, conjun amen e con la GzmH, puede inhibi la eplicación de adeno i us y del i us del he pes simple, ac uando sob e p o eínas necesa ias pa a la eplicación (109, 110). Po o o lado, la GzmB puede eje ce e ec os an i i ales al p o eoliza componen es celula es necesa ios pa a eplicación i al, ansc ipción, aducción, anspo e in acelula y la encia i al (74). Se han de ec ado ni eles ele ados de GzmB en sue o de pacien es con en e medades in lama o ias c ónicas como a i is euma oide (111) y asma (66). También, se ha is o exp esión inc emen ada de GzmB en basó ilos de pacien es asmá icos (66, 73). Se ha demos ado que la GzmB es capaz de escindi a la ci oquina IL-1, aumen ando su ac i idad p oin lama o ia in i o (112), aunque aún no es á cla o si es e p oceso es á in oluc ado en la egulación de las espues as in lama o ias in i o. Se han desc i o papeles opues os pa a la GzmB, a o eciendo an o espues as p oin lama o ias (77, 113) como an iin lama o ias (114, 115), en modelos in i o de en e medades in ecciosas e in lama o ias. También se han desc i o e ec os inmunosup eso es de la GzmB en cánce (82). En los úl imos años, se ha descubie o que di e sos ipos celula es con unciones umo igénicas exp esan GzmB, po lo que es a p o easa pod ía con ibui a la p og esión umo al, inhibiendo la espues a de las células inmuni a ias con a el cánce (82). La GzmB exp esada po las células T eg a o ece la p og esión umo al en modelos de a ón (116). Hallazgos ecien es indican que una al a p opo ción de células T CD8+/T eg es un ma cado de p onós ico a o able pa a a ios ca cinomas sólidos y hema ológicos. Po lo an o, la GzmB puede ene oles In oducción 15 opues os, en e e encia al desa ollo umo al, dependiendo de la uen e celula (lin oci os Tc/células NK o T eg) y la abundancia ela i a de esas células en el mic oambien e umo al (117-119). Un subconjun o de lin oci os B humanos con unciones egulado as (B egs), ambién exp esa GzmB (120), sup imiendo las espues as an i umo ales de las células T po un mecanismo no ci o óxico que implica la escisión de la cadena ζ del ecep o de células T (121). Es as células es án p esen es en el mic oambien e de di e en es umo es sólidos y ienen un papel po encial en la apa ición y/o p og esión de los umo es (122). De mane a simila a lo que ocu e pa a las T eg, la abundancia ela i a de lin oci os B ci o óxicos GzmB+ en e a lin oci os B eg GzmB+ en el mic oambien e umo al puede es ablece el papel an i o p o umo al de las células B que exp esan GzmB. O os ipos celula es con unciones umo igénicas ambién exp esan GzmB, incluidas las células dend í icas plasmoci oides (pCDs) y las MDSCs. Las pCDs humanas que exp esan GzmB bloquean la expansión de las células T in i o (123, 124), sin emba go el papel p o umo igénico de la GzmB exp esada po las MDSCs humanas equie e un mayo es udio (125). Recien emen e se ha desc i o que las MDSCs aisladas de a ones de ipo sal aje po ado es de umo es exp esaban GzmB y Pe , y que e an capaces de p omo e mayo p og esión umo al, al compa a las con MDSCs aisladas de a ones de icien es en GzmB (126). Los mas oci os, células impo an es den o del mic oambien e umo al, ambién exp esan GzmB en ausencia de Pe (65, 76). Se ha suge ido que es e ipo de células ambién iene dos oles opues os en la p og esión del cánce (127). Po lo an o, la GzmB de los mas oci os ambién puede egula nega i amen e las espues as de las células T median e mecanismos simila es al de la GzmB de las células B eg. Algunos es udios sugie en que la GzmB de i ada de mas oci os puede p omo e la pe meabilidad ascula a a és de la escisión de cadhe inas y/o la libe ación de ac o de c ecimien o endo elial ascula (VEGF, del inglés “Vascula Endo helial G ow h Fac o ”) (65, 77, 107). In oducción 16 G anzima A La g anzima A (GzmA) es la p o easa más abundan e. Es exp esada po a ios g upos celula es. P esen a ac i idad ip asa y es sec e ada po las células ci o óxicas en o ma de homodíme o (128). Los a ones de icien es en GzmA ca ecen de de ec os pe cep ibles en la ci o oxicidad an i umo al (129). Sin emba go, se ha desc i o que la GzmA, in i o, es un mediado esencial en la ci o oxicidad (72, 130). La capacidad ci o óxica de la GzmA se demos ó in i o u ilizando modelos he e ólogos, obse ándose que, mien as que la GzmB necesi aba 4 h pa a induci mue e celula , la mue e inducida po GzmA se p oducía a las 20 h, usando concen aciones mic omola es (131, 132). Po el con a io, cuando se ensayó la GzmA en modelos au ólogos (Pe , GzmA y células diana de la misma especie), no se obse ó que la p o easa induje a mue e celula , incluso a concen aciones mic omola es, mien as que la GzmB inducía mue e celula a concen aciones nanomola es en las mismas líneas celula es (97, 133). Como se ha mencionado an e io men e, la GzmA induce mue e celula in i o, cuando se u iliza a concen aciones mic omola es jun o con Pe u o os agen es de libe ación (72, 130, 133). La ci o oxicidad mediada po GzmA se acompaña de la escisión de a ios sus a os in acelula es, incluida la p o eína del complejo mi ocond ial I, NDUFS3 (del inglés, “NADH Dehyd ogenase Fe-S p o ein 3”), gene ando caída del po encial mi ocond ial y p oducción de especies eac i as de oxígeno (ROS, del inglés “Reac i e Oxygen Species”) (130, 134). El aumen o del ni el de ROS ac i a los mecanismos de epa ación celula , incluido el complejo SET asociado al e ículo endoplasmá ico (135, 136). El complejo SET ac i ado se ansloca al núcleo, donde la GzmA escinde a ios componen es de es e complejo (Ape1, HMGB2 y SET) (135, 137, 138), lo que lle a a la libe ación de la endonucleasa, NM23-H1, que induce daño monoca ena io en el DNA, lo que p oduce mue e celula (72, 134, 139, 140). Además, la GzmA puede deja al DNA más accesible a la acción de las nucleasas al p o eoliza a la his ona H1 (130, 141, 142) (Figu a 1.4). Se ha desc i o que la GzmA de a ón es capaz de induci una o ma de mue e celula llamada a e osis. Es a se ca ac e iza po una ciné ica más len a y In oducción 17 una mo ología "simila a un gusano", o almen e di e en e a la apop osis o nec osis. La a e osis mediada po GzmA no equie e ac i ación de caspasas, dis upción mi ocond ial emp ana, gene ación de ROS o pé dida de po encial de memb ana mi ocond ial, pe o sí es imp escindible la co ec a uncionalidad del ci oesquele o de ac ina (143). Recien emen e se han a ibuido o as unciones biológicas a la GzmA du an e una espues a inmuni a ia (Figu a 1.4). Hace a ios años se demos ó que la GzmA pu i icada o las células ci o óxicas que exp esan GzmA, inducían la libe ación de IL-1β, TNF- e IL-6 en monoci os humanos y mac ó agos de a ón (133, 144). O os es udios mos a on que la GzmA ex acelula es capaz de induci la p oducción de IL-6 e IL-8 en ib oblas os, e IL-8 en células epi eliales (145). La inhibición de la caspasa-1 educe la sec eción de IL-1β y TNF- inducida po hGzmA en los monoci os, lo que indica que la p o easa pod ía se ac i ado a del in lamasoma (133). También se ha demos ado que la GzmA es á ele ada en pacien es con a ios ipos di e en es de en e medades in ecciosas y as o nos in lama o ios c ónicos, po ejemplo, en la a i is euma oide (AR), (111, 146). Se ha desc i o que la GzmA puede a ec a al c ecimien o in acelula de micobac e ias en mac ó agos humanos. En un es udio se demos ó que la GzmA p oducida po células Tγδ humanas, o la GzmA ecombinan e, inhibían el c ecimien o in acelula del pa ógeno, al induci la p oducción de TNF- en los mac ó agos (147). Es a p o easa ambién es á inc emen ada du an e la endo oxemia expe imen al y la sepsis bac e iana (148). Además, los a ones de icien es en GzmA ue on más esis en es al choque sép ico inducido po LPS (133, 149). En nues o g upo de in es igación se demos ó que la de iciencia en GzmA p o ege a los a ones con a la sepsis bac e iana in i o sin comp ome e el con ol del pa ógeno. Es a p o ección es u o acompañada po una disminución de la p oducción de IL-1/β, TNF- e IL-6 en a ones GzmA knock-ou (KO) (150). Po o o lado, los pacien es que su en in ecciones po el i us de Eps ein- Ba , el i us de inmunode iciencia humana (VIH) y en pacien es con in ecciones In oducción 24 Las muje es ienen dos o es eces más p obabilidades de e se a ec adas que los homb es. Una de cada 12 muje es y 1 de cada 20 homb es desa olla án una en e medad eumá ica au oinmune in lama o ia du an e su ida (194). 1.3.2 E iología La e iología de la AR no se conoce po comple o y se supone que se e a ec ada po causas ambien ales, p edisposición gené ica y sexo. La hipó esis p incipal es que la AR es el esul ado de una exposición ambien al o "desencadenan e" en un indi iduo gené icamen e suscep ible (194, 203). Los ac o es de iesgo ambien ales p opues os incluyen: géne o, abaquismo, exposición a sílice, agen es in ecciosos, de iciencia de i amina D, obesidad y cambios en la mic obio a, aunque los es udios pa a algunos de es os ac o es no son muy sólidos (194, 204). 1.3.2.1 Fac o es gené icos Es udios lle ados a cabo en he manos gemelos han es imado que la he edabilidad de la AR es de ap oximadamen e un 60 % (193). Di e sos es udios han demos ado una ue e co elación en e la p esencia de AR y algunos alelos del an ígeno leucoci a io humano (HLA)-DR. Los alelos HLA-DRB1*01 y HLA-DRB1*04 (que codi ican pa a la molécula DR4) son los más comúnmen e encon ados en AR y su p esencia se asocia con una en e medad más se e a y con al a mo alidad (205). Los mecanismos epigené icos, incluidos la me ilación del DNA y la ace ilación de his onas, pod ían ene un papel impo an e en el desa ollo de la AR. La me ilación del DNA p opo ciona un mecanismo a a és del cual los ac o es ambien ales pueden induci cambios en la ac i idad celula . Po ejemplo, en pacien es con AR posi i os pa a an icue pos an ip o eínas ci ulinadas (ACPAs, del inglés “An i-Ci ullina ed P o ein An ibody”), que además e an umado es, se encon a on ni eles de me ilación más ele ados cuando po aban el alelo de iesgo HLA-DRB1, en compa ación con los que no lo po aban (194, 206). In oducción 25 1.3.3 Sis ema inmuni a io y a i is euma oide 1.3.3.1 Au oan icue pos en la pa ogenia de la AR Una ca ac e ís ica des acada de la AR es la p esencia de a ios ipos de au oan icue pos di igidos hacía nume osos an ígenos. La mayo ía de esos an icue pos no son especí icos pa a AR (207). Los mismos con ibuyen a la pa ología de la AR uniéndose di ec amen e a sus an ígenos, induciendo la o mación de complejos inmunes, la ac i ación del complemen o y de ecep o es Fc, la p oducción de ac o es quimio ác icos y el eclu amien o de células polimo onuclea es. Es as pa icipan en la eacción in lama o ia median e la p oducción de p o easas que ocasionan daño isula (208, 209). El au oan icue po más conocido es el ac o euma oideo (FR). Es e bioma cado , ue incluido en los c i e ios de clasi icación del Colegio Ame icano de Reuma ología (CAR) (1987) (210, 211). El FR es una inmunoglobulina (IgM) di igida con a la po ción Fc de la IgG (211, 212). Es impo an e ene en cuen a que no en odos los casos de AR se exp esa el FR, sin emba go, aquellos con FR posi i o ienden a mani es a se con e osión ósea y peo p onós ico (213). El FR posee una g an sensibilidad pa a el diagnós ico de AR (de un 65 % a 85 %), el p oblema es su baja especi icidad (50 % a 80 %), ya que puede de ec a se en o os as o nos in lama o ios agudos y c ónicos de ipo au oinmune o in eccioso, e incluso en poblaciones sanas, p incipalmen e en mayo es de 55 años (211). La ci ulinación es una modi icación pos - aduccional que ocu e en los esiduos de a ginina con enidos en p o eínas y pép idos. Es e es un p oceso no mal, eque ido en a ias unciones isiológicas. La pep idil a ginina desaminasa ipo IV (PAD4), es la enzima esponsable de la ci ulinación pos - aduccional de los esiduos de a ginina (193, 214). En la ci ulinación ocu en p ocesos ísico-químicos, que conducen a cambios en la masa molecula del pép ido y lle an a la pé dida de la ca ga posi i a de la a ginina, adqui iendo la ca ga neu a de la ci ulina. Es a nue a es uc u a del pép ido es econocida po el sis ema inmuni a io cuando es p esen ada po moléculas del HLA de clase II (215). Los esiduos a ginina ci ulinados, con ca ga neu a, se unen con más e icacia a las moléculas HLA- In oducción 26 DR4. De es a o ma se lle a a cabo la p esen ación de an ígeno a las células T, que a su ez es imulan a las células B pa a sin e iza una gama de an icue pos que econocen au op o eínas, las p o eínas ci ulinadas (216, 217). Se han desc i o dis in as p o eínas ci ulinadas incluidas p o eínas in acelula es (como las his onas) y p o eínas de la ma iz ( ib onec ina, colágeno, ib inógeno, enolasa y imen ina) (218). La mic obio a ambién puede induci la ci ulinación. Po ejemplo, P. gingi alis, común en la en e medad pe iodon al, exp esa la enzima pep idil a ginina deiminasa (PAD) y puede induci la ci ulinación y, po lo an o, p omo e la gene ación de ACPAs (219). Los ACPAs poseen una especi icidad del 98 % y una sensibilidad del 80 % (220) y pueden de ec a se has a 15 años an es del inicio de los sín omas clínicos de AR. Es o indica una ase p eclínica de la en e medad en la que la ac i ación inmunológica ya es á en cu so, lo que les con ie e un al o alo p edic i o (212). O os an icue pos ambién se han asociado con la AR. Po ejemplo, los an icue pos con a an ígenos ca bamilados, ambién denominados an i-Ca P (221), así como, el an icue po con a que a ina K8 o an i-K8 (222), el an icue po an i-p68 y an i-Sa (223). O os an icue pos asociados con AR son an i-RA33, an i-calpas a ina, an icue pos ci oplasmá icos an i-neu ó ilos (ANCA), an icue pos con a an ígenos nuclea es (ANA), an i-colágeno ipo II, an i- ib onec ina y an i-GPI (Glucosa 6-Fos a o Isome asa) (224). La mayo ía de es os au oan icue pos no son especí icos de la AR, ya que ambién se encuen an ácilmen e en o as en e medades au oinmunes como el lupus e i ema oso sis émico (LES) y la os eoa i is (223). 1.3.3.2 Fisiopa ología de la AR Una a iculación sana es á compues a po dos ex emos óseos adyacen es cubie os po una capa de ca ílago (Figu a 1.5 izquie da). El espacio en e los ex emos se llama ca idad a icula , la cual es á delimi ada po la memb ana sino ial en ambos lados y con iene líquido sino ial. Po el con a io, en la AR (Figu a 1.5 de echa), la memb ana sino ial se uel e hipe plásica e in il ada po los leucoci os, causando in lamación c ónica de la sino ial (sino i is euma oide), lo que causa desgas e en el ca ílago y e osión ósea. In oducción 27 Figu a 1.5 Cambios a icula es en la a i is euma oide. Izquie da: a iculación sana. De echa: a iculación a í ica. La con luencia de la suscep ibilidad gené ica y los ac o es ambien ales de e minan el desa ollo de una espues a au oinmune que p ecede a la a i is clínica. Las modi icaciones pos - aduccionales, como la ci ulinación (o ca bamilación), pueden gene a neoepí opos que el sis ema inmuni a io adap a i o es capaz de econoce (193, 225, 226). Es os pép idos al e ados son p esen ados po las APCs, ac i ando así una espues a inmuni a ia adap a i a, lo que p o oca la o mación de au oan icue pos. Las células B sec e an es os au oan icue pos, como po ejemplo ACPAs, además de ci oquinas p oin lama o ias que po encian la AR. La unción p incipal de las células T es ac i a mac ó agos y ib oblas os y ans o ma los en células des uc o as del ejido óseo. El in il ado sino ial incluye células del sis ema inmuni a io inna o y adap a i o (226) y c ea un mic oambien e donde los sino ioci os simila es a ib oblas os (FLS, del inglés “Fib oblas Like Syno iocy es”) y los mac ó agos adquie en un eno ipo in asi o e in lama o io, lo que conduce a la hipe plasia del e es imien o sino ial (227, 228). Los FLS, además de ci oquinas, sec e an In oducción 28 me alop o easas (MMPs, del inglés “Ma ix Me allop o einases”) y colagenasa, p omo iendo la des ucción del ca ílago (226, 229). La in il ación de leucoci os y la sec eción de ci oquinas p oin lama o ias como TNF- o RANKL (Ligando del Recep o Ac i ado pa a el Fac o Nuclea κB) a o ecen, di ec a e indi ec amen e, la madu ación de p e-os eoclas os a os eoclas os, lo que conduce a la e osión ósea (226). Las ci oquinas y los ac o es de c ecimien o libe ados po las células in il adas, jun o con la hipoxia esul an e de la hipe plasia sino ial, desencadenan la angiogénesis (226, 230), es ableciendo un ci cui o de e oalimen ación que a o ece la in il ación cons an e de leucoci os y la in lamación c ónica (Figu a 1.6). Figu a 1.6 Fisiopa ología de la AR. Adap ado de (231). 1.3.3.3 Papel pa ogénico de las células del sis ema inmuni a io en la AR Como se ha mencionado an e io men e, en la pa ogénesis de la AR, como as o no au oinmune, pa icipan una g an a iedad de di e en es poblaciones de In oducción 29 células inmuni a ias, incluidos los lin oci os B y T, los mac ó agos, además de los FLS y los os eoclas os. Lin oci os B Las células B, en el caso de la AR, uncionan como uno de los ac o es subyacen es del inicio de la AR (232). Las células B au o eac i as iden i ican los an ígenos del huésped, desencadenando la des ucción de células o ejidos (232). En indi iduos sanos las células B au o eac i as se eliminan a a és de p ocesos que es án muy egulados po la ole ancia cen al y pe i é ica (233). En pacien es con AR, ambos pun os de con ol son gene almen e de ec uosos, lo que lle a a la g an p oducción de células B madu as au o eac i as. Se ha demos ado, que los pacien es con AR no a ados, mues an un aumen o de células B au o eac i as en la sang e pe i é ica 3,4 eces supe io en compa ación con los pacien es sin AR (234). Tal de ec o puede se causado po una mu ación en el gen PTPN22 que in e umpe la ía de señalización de BCR en el pun o de con ol cen al de ole ancia de células B (235). Po o a pa e, la mayo ecuencia de células B poli eac i as y au o eac i as en pacien es con AR, e idencian el de e io o de la ole ancia pe i é ica (234). La dis unción de la ole ancia pe i é ica p opicia el aumen o de la supe i encia y esis encia a la apop osis de las células B (236). Las células B au o eac i as ambién pueden ac ua como APCs pa a es imula la madu ación y di e enciación de las células T en células T CD4+ de memo ia (237). También se ha encon ado que la sín esis local de ci oquinas como TNF-, IL-6, IL-12, IL-23 e IL-1, inducida po células B au o eac i as, ac úa sob e o as células con ele ancia pa ológica en la AR, lo que conduce a la dis unción inmune, in lamación y daño óseo (238). Un es udio demos ó que la p oducción de RANKL es á ele ada en las células B de memo ia de sang e pe i é ica, el líquido sino ial y ejidos de pacien es con AR, en compa ación con indi iduos sanos (239, 240). El mismo es udio ambién sugi ió que las células B que exp esan RANKL es aban al amen e asociadas con la di e enciación de OCs (239). In oducción 30 Lin oci os T CD4+ Las células T CD4+ son los lin oci os más abundan es en el in il ado sino ial (241), donde egulan o os ipos de células y desempeñan un papel cen al en la espues a inmuni a ia pa ológica que conduce al daño a icula . Exis en e idencias con incen es que espaldan que las células T CD4+ con ibuyen signi ica i amen e a la espues a au oinmune c ónica du an e la AR (242). Se pensaba que las células Th1, p oduc o as de ci oquinas p oin lama o ias, e an las células p incipales en la pa ogénesis de la AR. El descub imien o del papel de o os sub ipos de células T CD4+ du an e la AR, como las células Th2, Th17 y T eg, ha dejado cla o que la pa ogénesis de la en e medad es mucho más compleja. Du an e su ac i ación, las células T CD4+ in e ac úan con HLA de clase II, así como con moléculas coes imulado as como CD28, que se exp esan en la supe icie de las APCs (243). El papel de las células T CD4+ en la in lamación c ónica du an e la AR ambién es á espaldado po su asociación con los alelos MHC-II especí icos, como el HLA-DR4. Como se mencionó an e io men e, es a in e acción conduce a una o ma más ag esi a de AR (244). Las e idencias sugie en que las células T CD4+ (Th) con ibuyen a la pa ogénesis de la AR p incipalmen e a a és de la sec eción de ci oquinas y quimioquinas (Figu a 1.7) (242). Las células T CD4+ ipo 1 (Th1) es án al amen e ac i adas en la AR y sec e an IFN-γ, IL-2 y TNF- (242). Además, las células Th1 ac i an a los mac ó agos pa a que ac úen como APCs (244). O o ipo de células T CD4+ son las de ipo 2 (Th2). Es e g upo celula p oduce IL-4 e IL-5, ci oquinas que juegan un papel cen al en la ac i ación de células B y en el cambio de iso ipo de inmunoglobulinas (Igs) a IgE (245). In oducción 31 Po o a pa e, las células Th17 con ibuyen al desa ollo de AR en cada una de las ases de la en e medad, es deci , en la iniciación, in lamación y des ucción ósea. Las células Th17 p oducen p incipalmen e IL-17, que es imula la p oducción de ci oquinas p oin lama o ias, quimioquinas y MMPs (246). Además, es imulan a los lin oci os B pa a que p oduzcan au oan icue pos, y ac i an a los FLS pa a que p oduzcan ci oquinas y MMPs (247, 248). Figu a 1.7 Células T CD4+ en la pa ogénesis de la AR. Adap ado de (249). Se ha de ec ado un mayo núme o de células Th17 y un inc emen o en los ni eles de exp esión de IL-17 en el sue o de pacien es con AR en compa ación con indi iduos sanos (250). Algunos es udios han mos ado que an o la IL-17 sé ica como las células Th17 ci culan es se co elacionan con la pun uación de ac i idad de la en e medad en 28 a iculaciones (DAS28, del inglés “Disease Ac i i y Sco e 28-join coun s”) (251), así como con ma cado es comunes de la AR, como la p o eína C eac i a (PCR) y la asa de sedimen ación e i oci a ia (TSE) (251, 252). Va ios es udios han demos ado que IL-17 con ibuye al c ecimien o del pannus, la os eoclas ogénesis y neoangiogénesis sino ial (253). In oducción 32 Además de las Th17, los mac ó agos, los mas oci os y las células Tγδ del in il ado sino ial, ambién p oducen IL-17 (254). Po o o lado, las células T eg CD4+CD25+, p e ienen la au oinmunidad al sup imi los lin oci os au o eac i os, a a és de la p oducción de IL-10 y TGF-β (255). Sin emba go, las células T eg solo ac úan en la sup esión de la p oli e ación de células T e ec o as, pe o no inhiben la sec eción de ci oquinas p oin lama o ias, como el TNF- o IL-6, p oducidas a pa i de monoci os y células T ac i adas (256). Se han de ec ado células T eg en sang e y líquido sino ial de pacien es con AR (257). Sin emba go, el po cen aje de células T eg en pacien es con AR en compa ación con indi iduos sanos es muy con o e ido. Del mismo modo, se han obse ado esul ados con adic o ios en pacien es con AR cuando el po cen aje de células T eg se co elacionó con múl iples ca ac e ís icas clínicas como DAS28, edad, sexo, TSE, PCR, FR y du ación de la en e medad (257). Las células T ambién desempeñan un papel undamen al en la es imulación de las células B y la p oducción de au oan icue pos, lo que en consecuencia, con ibuye a la pa ogénesis de la AR (258). Las células T auxilia es olicula es (T h) son la población dominan e de células T que in e ac úa con los lin oci os B, gene almen e den o de los olículos de los ó ganos lin oides secunda ios (SLOs, del inglés “Seconda y Lymphoid O gans”) y los ejidos pe i é icos in lamados (258). En gene al, las T h ienen como ca ac e ís icas undamen ales la exp esión del ecep o inducible y coes imulado de lin oci os T (ICOS), el ecep o de quimioquina 5 (CXCR5), el ecep o de inhibición de espues a de mue e celula p og amada 1 (PD-1), y el ac o de ansc ipción Bcl-6 (258, 259). Los lin oci os T h p opo cionan señales de ayuda a los lin oci os B del olículo ía CD40L, y las ci oquinas IL-21, IL-4 e IL-10 (260). Exis e o o ipo de células T auxilia es de células B en la memb ana sino ial du an e AR, conocidas como células T auxilia es pe i é icas (Tph), que no exp esan CXCR5 y solo exp esan mode adamen e Bcl-6. Las células Tph CXCR5-PD-1hi, una ez ac i adas, sec e an CXCL13 pa a eclu a células B y p oducen IL-21, lo que p opicia la supe i encia, p oli e ación y madu ación de las células B (258-260). In oducción 33 Mac ó agos Los mac ó agos son undamen ales en la isiopa ología de la AR (261, 262). Son muy abundan es en la memb ana sino ial in lamada y en la unión ca ílago- pannus. Se ha demos ado co elación en e la p og esión adiológica de la des ucción a icula y el g ado de in il ación de mac ó agos sino iales (263). Además, exis e elación en e la e icacia e apéu ica de la e apia an i eumá ica con encional con la egulación nega i a de las unciones del sis ema de agoci os mononuclea es (264, 265). También, se ha demos ado la e icacia de las e apias biológicas di igidas con a las ci oquinas p oducidas p edominan emen e po mac ó agos (266, 267). En una a iculación in lamada, los mac ó agos sec e an TNF-, IL-1β, IL-6, IL-12, IL-15, IL-18, IL-23, IL-8 y el ac o es imulan e de colonias de g anuloci os- mac ó agos (GM-CSF, del inglés “G anulocy e Mac ophage Colony-S imula ing Fac o ”) (226). Además, es án in oluc ados en la libe ación de enzimas de deg adación de la ma iz, en la p oducción de ROS y especies eac i as de ni ógeno (RNS, del inglés “Reac i e Ni ogen Species”), ambién en p ocesos de agoci osis y p esen ación de an ígeno (193), odo lo que conduce a la des ucción a icula (193, 226, 261). Es e pa ón de exp esión de ci oquinas p oin lama o ias y óxido ní ico sin e asa inducible (iNOS, del inglés “Inducible Ni ic Oxide Syn hase”) sugie e un eno ipo p edominan e de mac ó agos M1. Además, los mac ó agos ambién median múl iples p ocesos biológicos elacionados con la AR, como el eclu amien o de lin oci os, angiogénesis y p oli e ación de FLS (193, 226, 261). Simila a las células B, los mac ó agos ac úan como APCs y se ha demos ado que exp esan HLA-DR y moléculas de adhesión de leucoci os, lo que pe mi e a los mac ó agos pa icipa en la ac i ación de las células T jun o con las células B (238). La ac i ación de células T mediada po mac ó agos da como esul ado la p oducción de células T e ec o as, que a su ez exp esan mediado es p oin lama o ios como IL-1, IL-1β y MMPs, que inc emen an la pa ogénesis de la AR (268). Sino ioci os ipo ib oblas o Los FLS son un componen e impo an e de la a qui ec u a de la a iculación. En una a iculación sana, los FLS o man el e es imien o sino ial y In oducción 40 Clasi icación Modelo Agen e induc o /gen diana Dependencia del MHC A i is inducida po p o eoglicanos (PGIA) P o eoglicano de ca ílago humano Independien e de MHC A i is inducida po glucosa.6. os a o isome asa (G6PI) G6PI he e óloga Independien e de MHC Modelos gené icos Ra ones K/BxN TCR especí ico pa a pa a un epí opo de ibonucleasa de pánc eas bo ino (KRN) H2g7 Ra ones SKG Dominio SH2 del gen ZAP-70 Nd Ra ones ansgénicos pa a el gen del ac o de nec osis umo al humana (HTNFG) TNF- humano Independien e de MHC Ra ones IL-1 a-/- Recep o de IL-1 Nd Tabla 1.7 Modelos u ilizados pa a la induci AR. Nd= no de e minado 1.3.4.1 CIA Es e es el modelo de a i is inducida mejo ca ac e izado y más u ilizado. Compa e muchas ca ac e ís icas pa ológicas e inmunológicas simila es con la AR humana (Tabla 1.8) (296-298). En el modelo CIA, la espues a inmuni a ia se di ige con a el an ígeno a icula colágeno ipo II (CII) (299). La inducción de a i is en CIA es á mediada po las espues as Th1 y Th17, siendo las células Th17, al pa ece , las que desempeñan el papel pa ológico dominan e (300). También, se obse a al a de ole ancia y la gene ación de au oan icue pos con a colágeno (301). En 1977, se inmuniza on po p ime a ez a as con una emulsión de CII humana, de pollo o de a a, en adyu an e comple o de F eund (CFA, del inglés “Comple e F eund´s Adju an ”), lo que condujo al desa ollo de una polia i is e osi a asociada con una espues a au oinmune con a el ca ílago (302). Pos e io men e, o os g upos de in es igación desc ibie on p o ocolos simila es pa a la inducción de CIA en a ones (293) y p ima es no humanos (303). In oducción 41 La suscep ibilidad a CIA en a ones, al igual que en AR, es á asociada con la exp esión de moléculas de MHC de clase II especí icas. Las cepas que exp esan haplo ipo H-2q (DBA/1) o H-2 (B10.RIII) son suscep ibles a CIA (304, 305). Los DBA/1 (H-2q) esponden a CII de pollo, mu ino, bo ino, po cino y humano (306) y los B10.RIII (H-2 ) esponden exclusi amen e a CII bo ino y po cino (307, 308). No obs an e, es udios pos e io es han demos ado que es posible induci a i is en a ones C57BL/6 (H-2b), u ilizando CII de pollo (309, 310). Di e encias Simili udes CIA Comp omiso a icula no simé ico En e medad ansi o ia No mani es aciones sis émicas. En e medad polia icula Suscep ibilidad asociada al MHC-II Pa ología a icula : Hipe plasia de la memb ana sino ial In il ación inmune sino ial Neu ó ilos en el líquido sino ial Fo mación Pannus Des ucción ósea po os eoclas os Ma cado es se ológicos: FR An icue pos an i-CII ACPAs Ca ac e ís icas inmunológicas: Aumen o de la exp esión de ci oquinas Gene ación de au oan icue pos Mediado po células T AR Comp omiso a icula simé ico En e medad c ónica Mani es aciones sis émicas ex aa icula es. Tabla 1.8 Simili udes y di e encias en e la AR humana y la CIA. Papel de los lin oci os T en CIA Como se mencionó an e io men e, las células T juegan un papel impo an e en la pa ogénesis de la AR (298). Desde el pun o de is a expe imen al, las e idencias han demos ado que la adminis ación de células T especí icas de CII puede induci a i is en a ones sanos (311). Además, los a ones de icien es pa a células T CD4+ son menos suscep ibles a CIA que los a ones de ipo In oducción 42 sal aje. Se ha demos ado que la de iciencia de células T CD8 no a ec a la suscep ibilidad a CIA (312). La adminis ación de colágeno ipo II induce una ue e ac i ación de los lin oci os T, que a su ez, es imulan a los lin oci os B a p oduci an icue pos (313). An e io men e, se conside ó que las espues as inmuni a ias, an o en la AR como en CIA, es aban mediadas po células Th1. Sin emba go, los es udios sob e el papel del IFN-γ endógeno, ci oquina p o o ipo de la espues a Th1, mos a on esul ados con adic o ios. Se descub ió que los a ones que ca ecen de IFN-γR uncional no es án p o egidos sino que desa ollan una o ma más se e a de CIA (314). Recien emen e, se ha implicado a las células Th17, que p oducen IL-17 e IL-22, en la pa ogénesis de CIA (315). La di e enciación a Th17 es a mediada po TGF-β, IL-6 e IL-23, mien as que IFN-γ sup ime su di e enciación (316). La IL-17 p omue e la in lamación en el modelo CIA al a o ece la p oducción de o as ci oquinas p oin lama o ias como TNF-, IL-1β, IL-6 y RANKL (317). O os es udios han mos ado que la neu alización de la IL- 17 endógena po an icue pos (318, 319) o la eliminación del gen IL-22 (320), p o ege con a la en e medad, p opo cionando así e idencia adicional sob e el papel de las células p oduc o as de IL-17 en CIA. Papel de los lin oci os B en CIA Las células B pueden con ibui a la a i is inducida po CIA, al igual que en la pa ogénesis de RA, a a és de la p oducción de au oan icue pos, pe o ambién p omo iendo la sec eción de ci oquinas, como IL-6, o haciendo unciones de APCs pa a ac i a células T especí icas en e a, undamen almen e, CII. En el sue o de animales a í icos, se han de ec ado an icue pos con a di e en es p o eínas, además del colágeno ipo II (313). Los iso ipos de an icue pos an i-CII que se encuen an ele ados en CIA son IgG1 e IgG2a/c (309, 321) y dependen de la concen ación de Mycobac e ium ube culosis del CFA (321). En a ones C57BL/6 se equie en dosis al as de M. ube culosis pa a la ac i ación y madu ación de las CDs (322). Los an icue pos especí icos en e a CII p oducidos po las células B ac i adas inducen espues a local in lama o ia mediada po mac ó agos, g anuloci os y células T, dando luga a la des ucción de hueso y ca ílago (323). In oducción 43 Se ha demos ado que los a ones de icien es en células B son esis en es a la a i is inducida po CIA (324). También, que la ans e encia de sue o de a ones a í icos a a ones sanos induce in lamación se e a, y aunque el an icue po ya no se de ec e, la espues a in lama o ia pe sis e. Es o indica que la espues a humo al iene un papel undamen al en el es ablecimien o de la espues a au oinmune en es e modelo (325). In oducción 44 1.4 Cánce colo ec al 1.4.1 Epidemiología El cánce colo ec al (CCR) es una de las p incipales causas de mo alidad y mo bilidad en el mundo. Es el e ce cánce más comúnmen e diagnos icado a ni el mundial, con una incidencia de 1,8 millones de casos nue os en 2018. Rep esen a la cua a causa de mue es elacionadas con el cánce en odo el mundo, con ap oximadamen e 881.000 mue es (326, 327). Sin emba go, en los Es ados Unidos y en o os países desa ollados, el CCR es la segunda causa más común de mue e po cánce , a pesa de los impo an es a ances en de ección emp ana, ci ugía y a amien o de es a pa ología. Con espec o al géne o, la p e alencia de CCR se compo a de mane a muy simila en ambos sexos, aunque es lige amen e mayo en homb es (10,9 %) que en muje es (9,5 %) (327). Además, el iesgo de desa olla CCR aumen a con la edad. De hecho, más del 90 % de los pacien es diagnos icados ienen más de 50 años y la edad p omedio de diagnós ico del CCR es de 64 años. La aza es ambién un ac o que in luye en la incidencia del CCR, siendo más ele ado en pe sonas de aza neg a (327, 328). Según la Sociedad Española de Oncología Médica (SEOM) y la Asociación Española Con a el Cánce (AECC), en la población española el CCR es uno de los más ecuen emen e diagnos icado (15 % del o al), siendo de ec ados en 2017 ap oximadamen e 34.331 casos. En homb es, es el segundo más ecuen e después del cánce de p ós a a. En muje es, el cánce de mama es el más ecuen emen e diagnos icado y en segundo luga se si úa el CCR. Con espec o a mo alidad, el p ime o en ambos sexos es el cánce de pulmón, seguido del CCR, con 15.923 de unciones al año (329). In oducción 45 1.4.2 Clasi icación 1.4.2.1 Es adi icación Los ca cinomas colo ec ales son clínicamen e es adi icados u ilizando la clasi icación TNM ( umo , ganglios lin á icos, me ás asis), es ablecido po The Ame ican Join Commi ee on Cance (AJCC) (330). La ca ego ía T desc ibe la ex ensión de la p opagación a a és de las capas que o man la pa ed del colon y el ec o (Tis, T1, T2, T3, T4). La ca ego ía N indica si el cánce se ha diseminado a los ganglios lin á icos ce canos (N0, N1, N2). La ca ego ía M indica si hay me ás asis a ó ganos dis an es (MX, M0, M1). En la igu a 1.9 se esquema izan las e apas del CCR según la clasi icación TNM. Figu a 1.9 Es adios del CCR según la clasi icación TNM es ablecida po AJJC. Es adio 0: cánce en la e apa más emp ana; No ha c ecido más allá de la mucosa del colon o del ec o. Es adio I: el cánce ha c ecido a a és de la muscula is mucosa has a la submucosa o ambién puede habe c ecido en la muscula p opia. Es adio II: el cánce ha c ecido en las capas más ex e nas del colon o del ec o, o las ha a a esado, pe o no ha llegado a ganglios u ó ganos ce canos. Es adio III: el cánce ha c ecido a a és de la mucosa hacia la submucosa, y ambién puede habe c ecido hacia la muscula is p opia. Se ha diseminado a ganglios lin á icos ce canos o en á eas de g asa ce ca de los ganglios lin á icos. No se ha p opagado a si ios dis an es. Es adio IV: el cánce se ha diseminado a 1 o más ó ganos dis an es, o a un g upo dis an e de ganglios lin á icos, y puede o no, habe se diseminado a pa es dis an es del pe i oneo. In oducción 46 1.4.2.2 Clasi icación según los Sub ipos Molecula es de Consenso de CCR (CMSs) El CCR es una en e medad he e ogénea desde el pun o de is a biológico y las a iadas asas de espues a a los egímenes e apéu icos es ánda sugie en que es molecula men e he e ogéneo. En un es ue zo po elaciona el eno ipo de las células cance osas con el compo amien o clínico de la en e medad, y con el obje i o de es ablece un a amien o acional usando e apias especí icas, el conso cio de sub ipos de CCR uni icó, en un único sis ema de consenso, a seis sis emas de clasi icación molecula independien es (331, 332). Es e consenso dio luga a la con o mación de cua o g upos di e en es, conocidos como sub ipos molecula es de consenso (CMS, del inglés “Consensus Molecula Sub ypes”) (333) y su clasi icación se basa en las ca ac e ís icas epigenómicas, ansc ip ómicas, mic oambien ales, gené icas y clínicas de los umo es. Tabla 1.9 Resumen de las p incipales ca ac e ís icas de los CMSs del CCR es ablecidos en el conso cio in e nacional. MSI: ines abilidad de mic osa éli e (del inglés, “Mic osa elli e Ins abili y”). CAFs: ib oblas os asociados a cánce (del inglés, “Cance -Associa ed Fib oblas s”). CIN: ines abilidad c omosómica (del inglés, “Ch omosomal Ins abili y”). MSS: es abilidad de mic osa éli e (del inglés, “Mic osa elli e S abili y”). SCNA: al e aciones somá icas del núme o de copias (del inglés, “Soma ic Copy-Numbe Al e a ions”). EMT: ansición epi elio mesénquima (del inglés, “Epi helial Mesenchymal T ansi ion”). CMS1 CMS2 CMS3 CMS4 Nomb e al e na i o MSI, inmune canónica, epi elial me abólico Mesenquimal Ca ac e ís icas MSI Ac i ación inmunológica Hipe - me ilaciones Hipe - mu aciones Mu aciones en BRAF Bajo CAFs CIN MSS Al a SCNA Baja me ilación Ac i ación de Wn y MYC Muy bajo CAFs Poco Inmunogéni- Co CIN Baja SCNA Mode ada me ilación Mu aciones en KRAS Bajo CAFs Al amen e inmunogéni-co Des egula- ción me abólica CIN MSS Al a SCNA Baja me ilación Ac i ación de TGF-β Al o CAFs In lamación EMT In asión es omal y angiogénesis Incidencia 14 % 37 % 13 % 23 % In oducción 47 En la abla 1.9 se mues a un esumen de las p incipales ca ac e ís icas del CCR según la clasi icación de los CMSs es ablecidos en el conso cio in e nacional CRCSC (del inglés, “Colo ec al Cance Sub ypìng Conso ium”). 1.4.3 E iología. Fac o es de iesgo El CCR es una en e medad he e ogénea, con espec o a la localización ana ómica del umo , las di e encias gené icas, aciales y ambién po la in luencia del el es ilo de ida implicadas en su desa ollo. Po an o, el CCR se conside a una en e medad compleja en donde pa icipan ac o es de iesgos gené icos y ambien ales. 1.4.3.1 Fac o es he edi a ios La mayo ía de los CCR se diagnos ican en pe sonas sin an eceden es amilia es de CCR y son de o igen espo ádico, los es an es se elacionan con la his o ia amilia y/o en e medades in es inales in lama o ias (334). Ap oximadamen e una e ce a pa e de odos los casos amilia es de CCR ienen una e iología gené ica bien de inida (335). El iesgo de padece CCR en pe sonas con an eceden es amilia es a ía en unción del g ado de pa en esco con el amilia a ec ado y la edad en la que dicho amilia desa olló el cánce (336). Los p incipales sínd omes he edi a ios asociados con el CCR son: el sínd ome de Lynch (CCR he edi a io sin poliposis o HNPCC), que es la o ma más común de cánce de colon he edi a io, esponsable de ap oximadamen e un 2 % de odos los casos de CCR (337), y la poliposis adenoma osa amilia (FAP, del inglés “Familial Adenoma ous Polyposis”), causada po mu aciones en el gen APC (338). También hay o os sínd omes he edi a ios menos comunes que inc emen an el iesgo de CCR. Exis e un 20-30 % de odos los casos de CCR que se p esen a en pacien es con an eceden es amilia es de CCR, sin emba go es os no cumplen los c i e ios de CCR he edi a io, lo que indica cie a suscep ibilidad gené ica. A aquellos CCR con di e so g ado de ag egación amilia se les denomina CCR In oducción 48 amilia , y se dis ingue de los sínd omes mencionados an e io men e po no segui un pa ón de he encia an bien de inido (339). 1.4.3.2 Fac o es ambien ales o ac o es elacionados con el es ilo de ida Die a La die a con ibuye al desa ollo del CCR, jugando un papel ad e so o p o ec o en su desa ollo, independien emen e de la obesidad. La die a iene un impac o signi ica i o en el mic obioma del colon, donde las bac e ias supe an en núme o a las células huésped (10:1). Di e en es alimen os ienen e ec os a iados sob e la mic o lo a y la in lamación in es inal (340). El consumo de ca ne oja, ca ne p ocesada y ca ne cocinada muy hecha o en con ac o di ec o con el uego se ha asociado a un mayo iesgo de su i CCR (341). En 2015, la Agencia In e nacional pa a la In es igación del Cánce (IARC) o o gó a la ca ne p ocesada la ca ego ía de "ca cinógena" y la ca ne oja como "p obablemen e ca cinógena", p incipalmen e debido a su impac o en el iesgo de CCR (342). Po o o lado, una die a ica en ib a, ege ales, u as, leche u o os p oduc os lác eos (el calcio que es os alimen os con ienen) pa ece eje ce un e ec o p o ec o . Una die a ica en ib a puede educi el iesgo de CCR al disminui el pH del colon sigmoide, educi el iempo de ánsi o del colon y, po lo an o, minimiza la exposición a posibles ca cinógenos (343). Se ha demos ado asociación en e el aumen o del consumo de u as y e du as y la educción del iesgo de CCR (344). El e ec o p o ec o con a el CCR es debido a la g an can idad de ib a, ácido ólico, an ioxidan es y i aminas que poseen es os alimen os (345). Ac i idad Física y Obesidad Di e sos es udios, ealizados en di e en es poblaciones, mues an que los indi iduos ísicamen e más ac i os, especialmen e si lo son du an e la gos pe iodos de iempo, p esen an un meno iesgo de CCR, con una educción de la incidencia de has a un 50 % (346). In oducción 49 Po o o lado, un g an núme o de es udios epidemiológicos sugie en que la obesidad, es un ac o de iesgo pa a el CCR, mien as que la pé dida de peso se con ie e en un ac o p o ec o (347). Tabaquismo Es udios ecien es mues an que el consumo de abaco, es un ac o de iesgo pa a el CCR en ambos sexos, exis iendo una cla a asociación en e el abaquimo, los adenomas colo ec ales y el CCR (348). Consumo de alcohol El consumo mode ado a al o de alcohol se asocia con un mayo iesgo de CCR (348). Los mecanismos po los cuales el alcohol ac ua ía como ca cinógeno en el colon incluyen: el inc emen o de la p oli e ación mucosa, la ac i ación de sus ancias p o-ca cinógenas en el in es ino, cambios en la composición de la bilis y ele ación de la concen ación de ni osaminas (349). En la abla 1.10 se mues a un esumen de los ac o es elacionados con el es ilo de ida y que in luyen aumen ando o disminuyendo el iesgo a padece CCR. Aumen an el iesgo de CCR Disminuyen el iesgo de CCR Ca nes p ocesadas y ca nes ojas Modo de cocción. Die a ica en ib a, u as y e du as Calcio y suplemen os de calcio en la die a Ni eles adecuados de i amina D Ni eles adecuados de ácido ólico Obesidad Seden a ismo Ac i idad ísica Tabaquismo Consumo mode ado-ele ado de alcohol Tabla 1.10 Resumen de los ac o es elacionados con el es ilo de ida que in luyen en el iesgo de CCR.e igu a 1.4.3.3 An eceden es médicos pe sonales Uso de medicamen os Va ios es udios han demos ado que el uso p olongado de aspi ina, y o os á macos an iin lama o ios no es e oides (AINEs), educe el iesgo de CCR (348, 350-352), debido a que disminuyen la in lamación in es inal. Sin emba go, el In oducción 56 supe i encia, p oli e ación y c ecimien o de las células, así como la angiogénesis, la in asi idad, la mo ilidad, la p oducción de ci oquinas y quimioquinas (391, 392). Se ha de ec ado ac i ación abe an e de ambos ac o es de ansc ipción en ap oximadamen e el 50 % de los CCR y CAC (393, 394). Exis e amplia e idencia que demues a que STAT3 desempeña un papel p imo dial en la p og esión del CAC. Se ha demos ado que ci oquinas como la IL-6, IL-11 o la IL-22 y a ios ac o es que in luyen en el c ecimien o del umo , como ac o de c ecimien o epidé mico (EGF, del inglés “Epide mal G ow h Fac o ”), el ac o de c ecimien o de hepa oci os (HGF, del inglés “Hepa ocy e G ow h Fac o ”) y el ac o de c ecimien o endo elial ascula (VEGF, del inglés “Vascula Endo helial G ow h Fac o ”), di ec a o indi ec amen e causan la ac i ación de STAT3 (6, 395). La ac i ación de STAT3 induce la exp esión de genes an iapop ó icos, como Bcl-2 o Bcl-xL, además induce la exp esión de genes p oli e a i os como la ciclina D1 o c-Myc, y VEGF, que es un po en e ac o p oangiogénico (396). STAT3 ac i ado ambién puede induci una ac i ación p olongada de NF-κB, una peculia idad impo an e en la pa ogénesis del CAC, ya que es os dos ac o es de ansc ipción ac i an los genes necesa ios en cada paso del desa ollo del cánce (394, 397). Se ha encon ado que la ac i ación de NF-κB en las células mieloides (especialmen e los mac ó agos y CDs de la lámina p opia), da como esul ado la p oducción de ci oquinas que son undamen ales en el c ecimien o y p oli e ación del umo , p omo iendo la supe i encia de células epi eliales p e-malignas gene adas du an e las e apas emp anas de la umo igénesis del CAC (398). Se conoce que la ac i idad an iapop ó ica de NF-κB es á mediada po la ac i ación de Bcl-2, Bcl-xL y cFLIP, jun o con o os genes (399). La inac i ación de NF-κB en células mieloides median e la ablación de IKKβ, la quinasa eque ida pa a su ac i ación, inhibió la p oducción de mediado es in lama o ios, incluidas ci oquinas como la IL-6 y el TNF-, e impidió la p oli e ación de células epi eliales du an e la inducción de CAC. Como esul ado, la ca ga umo al se edujo debido a la apa ición de menos umo es, de meno amaño (398). In oducción 57 1.4.5.4 In lamación en la in asión y me ás asis del CAC Desde la pe spec i a clínica, la me ás asis es la si uación más c í ica del cánce , ya que más del 90 % de la mo alidad po cánce es causada po me ás asis. Es udios ecien es mues an que la me ás asis equie e una colabo ación es echa en e las células cance osas, las células inmuni a ias e in lama o ias y los elemen os del es oma. El mic oen o no in lama o io puede in lui en a ias e apas cla es de la me ás asis. El p ime paso que debe ocu i es la EMT (del inglés, “Epi helial Mesenchymal T ansi ion”), en la que las células cance osas adquie en ca ac e ís icas ib oblas oides, po an o aumen an su mo ilidad y capacidad de in asión (400, 401). Es e p oceso es á egulado po a ias ci oquinas p o- in lama o ias, incluida la IL-1, TNF-, IL-6, el ac o 1α inducible po hipoxia (HIF- 1α, del inglés “Hypoxia-Inducible Fac o 1α”) y, p incipalmen e, po TGF-β (400- 402) (Figu a 1.11C). La ac i ación de la señalización de NF-κB y/o STAT3 puede acili a la EMT al aumen a signi ica i amen e la mo ilidad de las células p eme as ásicas, a o eciendo su mig ación e in asión. Es e p oceso es á mediado po el e ec o de es os ac o es de ansc ipción sob e la exp esión de los egulado es de la EMT, y ambién po la capacidad de ambos pa a egula el ci oesquele o (400- 402). En el segundo paso hacia la me ás asis, las células cance osas se in oducen en asos sanguíneos y lin á icos. La in lamación puede p omo e es o a a és de la p oducción de mediado es que aumen an la pe meabilidad ascula . Pos e io men e, las células que inician la me ás asis sob e i en y iajan a a és de la ci culación. Po o a pa e las in eg inas pe mi en la ex a asación de células cance osas ci culan es y, inalmen e, los p ogeni o es me as ásicos indi iduales in e ac úan con las células inmuni a ias, in lama o ias y es omales y comienzan a p oli e a (403). Las quimioquinas pueden es imula di ec amen e la mig ación de las células malignas hacia los asos sanguíneos y ó ganos dis an es. El ecep o de quimioquina CXCR3 es undamen al pa a la me ás asis en los ganglios lin á icos In oducción 58 (404) y sus ni eles se inc emen an d ás icamen e du an e la malignización (404). Den o de las quimioquinas que ac i an el ecep o CXCR3 du an e la me ás asis se incluyen CXCL9, CXCL10, CXCL11 y CCL21, las cuales se egulan median e la señalización de p o eínas oncogénicas ales como Ras (405). Las señales in lama o ias, además, egulan la p oducción y ac i idad de las MMPs, y acili an la in asión y ex a asación de células cance osas (406). Los CCR humanos sob eexp esan MMPs 1, 2, 3, 7, 9 y 13. Va ias ci oquinas p o- in lama o ias pueden aumen a la exp esión de dis in as MMPs, lo que p opo ciona un es ímulo pa a el aumen o de la mig ación celula . Las ci oquinas más implicadas, aunque no las únicas, son TNF- y TGF-β (6). Figu a 1.11 Papel de la in lamación en la iniciación (A), p omoción (B) y me ás asis (C) de CCR. 1.4.5.5 Ci oquinas en CCR Las ci oquinas p oducidas po células inmuni a ias, ib oblas os, células es omales y células epi eliales cance osas ienen unciones di e sas y pleio ópicas en las di e en es e apas de la p og esión del CCR. En las p ime as e apas de la umo igénesis, a ias ci oquinas po encian las espues as In oducción 59 ci o óxicas de los lin oci os T CD8+ y las células NK. Además, pueden induci la libe ación de IFN-γ, inhibi la angiogénesis e impedi el c ecimien o y la diseminación de las células cance osas. Todos es os e ec os mediados po ci oquinas inhiben la p og esión del umo . Sin emba go, en umo es bien es ablecidos, muchas ci oquinas pueden p omo e la p og esión del umo a o eciendo la p oli e ación, inhibición de la apop osis, la angiogénesis, la eo ganización es omal, acili a EMT, así como la me ás asis y sup esión de inmunidad an i umo al. En la mayo ía de los casos, las ci oquinas p omo o as de umo es ac úan de mane a pa ac ina, aunque a ios ipos de células cance osas p oducen sus p opias ci oquinas, incluida la IL-6, pa a log a el mismo e ec o (6, 407). De o ma gene al, las ci oquinas p omo o as de umo es son p oducidas po los mac ó agos de la lámina p opia y las CDs du an e los es ados emp anos del desa ollo de la CAC o po las células T du an e la p og esión del umo y en e apa a día (6, 395). Las ci oquinas, como el TNF- e IL-6, son conside adas ascenden ales en el CCR, debido al papel que desempeñan en la ac i ación de los ac o es de ansc ipción oncogénicos NF-κB y STAT3, espec i amen e, en células epi eliales in es inales (IECs, del inglés “In es inal Epi helial Cells”), p omo iendo la p oli e ación y esis encia a la apop osis (391). Po el con a io, o as ci oquinas, como el IFN-γ y la IL-15, p omue en la inmunidad p o ec o a mediada po las células ci o óxicas. Po o a pa e la p oducción de las ci oquinas an iin lama o ias IL-10 y TGF-β, po las células T eg, son esenciales en el con ol de la in lamación in es inal. No obs an e, el papel sup eso de las células T eg puede se pe judicial debido al de e io o de las espues as inmuni a ias p o ec o as (408). En la igu a 1.12 se mues a los e ec os de las p incipales ci oquinas in oluc adas en CCR. In oducción 60 Figu a 1.12 P opiedades de las ci oquinas en la pa ogenia del CCR (adap ado de (409). TNF-  El ac o de nec osis umo al α (TNF-, del inglés “Tumo Nec osis Fac o ”) es una ci oquina p oin lama o ia, que desempeña un papel impo an e en di e sos e en os celula es, incluida la p oli e ación celula , la di e enciación y la mue e celula (410). Aunque el TNF- se iden i icó po p ime a ez como una ci oquina sup eso a de umo es, debido a su capacidad pa a induci mue e celula en cie os ipos de células, las e idencias han demos ado que ambién puede ac ua como agen e p omo o de umo es que incula la in lamación y el cánce (411, 412). Las p incipales uen es de p oducción de TNF- en p ocesos in lama o ios son de linaje monoci os/mac ó agos. Sin emba go, o os ipos de células ambién pueden p oduci TNF-, incluidos mas oci os, lin oci os T y B, células NK, neu ó ilos, células endo eliales, células muscula es lisas y ca díacas, ib oblas os y os eoclas os (413). La unión del TNF- a sus ecep o es TNFR1 y TNFR2 conduce al eclu amien o de p o eínas in acelula es que ac i an múl iples ías de In oducción 61 ansducción de señales: las señales asociadas a FAS, a a és del dominio de mue e (FADD)/caspasa 8/caspasa 3, la ía de la p o eína quinasa ac i ada po mi ógenos (MAPK, del inglés “Mi ogen Ac i a ed P o ein Kinase”), de la quinasa Jun (JNK)/p o eína de ac i ación 1 (AP-1), y la ía NF-κB (409, 410). La ac i ación de MAPK, JNK/AP-1 y NF-κB inducen la exp esión de a ias moléculas que incluyen las ci oquinas IL-1, IL-6, a ias quimioquinas, moléculas de adhesión, COX-2 y MMPs. Cuando el TNF- se une a su ecep o TNFR1 ambién puede ocu i un ipo de mue e p og amada denominada nec op osis. Que la nec op osis se desencadene depende á de di e en es ac o es como el ni el de ac i ación de la caspasa-8 y la os o ilación de p o eínas como RIPK1 (del inglés, “Recep o In e ac ing P o ein Kinase 1”), RIPK3 (del inglés, “Recep o In e ac ing P o ein Kinase 3”) y de MLKL (del inglés, “Mixed Lineage Kinase domain-Like p o ein”) (414). Se ha comp obado exp esión inc emen ada de TNF- en el colon de pacien es con UC ac i a y CCR a anzado, pe o no en la mucosa no mal. Además, los ni eles sé icos de TNF- se han co elacionado de mane a di ec a con la p og esión de CCR y la supe i encia educida de los pacien es con CCR (415, 416). El TNF- aumen a la pe meabilidad ascula , lo que acili a la in a asación y ex a asación de núcleos me as ásicos (417, 418). La señalización del TNF- ambién induce EMT, po an o a o ece me ás asis, ya que es abiliza al ac o de ansc ipción SNAIL-1, p e iniendo su deg adación (419). IL-1 La amilia de ci oquinas IL-1 comp ende 11 miemb os. Es os incluyen ci oquinas con ac i idad agonis a (IL-1, IL-1β, IL-18, IL-33, IL-36, IL-36β, IL- 36γ), miemb os con ac i idad an agonis a del ecep o (IL-1R, IL- 36R, IL-38), y con ac i idad an iin lama o ia (IL-37) (420). Las ci oquinas de la amilia IL-1 se exp esan en odo el ac o gas oin es inal (TGI), desempeñando un papel esencial en la egulación de la inmunidad de la mucosa con a los pa ógenos in es inales (420, 421). Las más es udiadas de la amilia son IL-1β, IL-1, IL-18 e IL-33. In oducción 62 IL-1 A di e encia del p ecu so de IL-1β, el p ecu so de IL-1 es comple amen e ac i o y unciona como una "ala ma" al inicia ápidamen e una espues a in lama o ia, mediando así las ases emp anas de la in lamación (422). Además del p ecu so de IL-1 libe ado po las células nec ó icas, hay una o ma de memb ana de IL-1 p esen e en los monoci os ac i ados (420). La p opia IL-1 puede ac ua como una oncop o eína, y la exp esión de la misma induce cambios neoplásicos en las células. La IL-1 de mac ó agos y CDs puede induci el eclu amien o de neu ó ilos (420, 421). La IL-1 p oducida po las células cance osas del colon puede aumen a la angiogénesis median e la modulación de las células es omales en el mic oen o no umo al (423). IL-1β Du an e la EII, las CDs y los mac ó agos de la lámina p opia sec e an ingen es can idades de ci oquinas p o-in lama o ias, como la IL-1β y la IL-18, después de se ac i adas po el in lamasoma, en espues a a la p esencia de mic obio a comensal o a la señalización de ecep o es ipo Toll (TLR, del inglés “Toll-Like Recep o s”) (424). El in lamasoma es un complejo p o eico, o mado básicamen e po una molécula senso a (gene almen e un ecep o NLR), la p o eína adap ado a ASC (del inglés, “Apop osis-Associa ed Speck-like P o ein Con aining a CARD) y la p ocaspasa-1. La ac i ación del in lamasoma posibili a la p o eólisis de la caspasa-1, que se encuen a en o ma de p ocaspasa-1 inac i a (425). Una ez ac i ada, la caspasa-1 p o eoliza a la p o-IL-1β y a la p o-IL-18, gene ándose las o mas ac i as de es as dos impo an es ci oquinas p oin lama o ias (Figu a 1.1) (425). Se han encon ado ni eles al os de IL-1β en a ios ipos de cánce y du an e la p og esión de CCR (426). Es a ci oquina es un po en e ac i ado de la ía NF-κB (427, 428). La IL-1β puede ambién ac i a la u a de Wn -β-ca enina en el CCR, inac i ando GSK3β, induciendo EMT y ca ac e ís icas de célula mad e, como la capacidad de o mación de colonias, la exp esión de genes de células mad e (BMI1 y NES) y el inc emen o a la esis encia en e a la In oducción 63 quimio e apia. En es e p oceso juega un papel p imo dial el ac o de ansc ipción p o-mesenquimal ZEB1 (426, 427). Además, se ha epo ado que los ansc i os de IL-1β es án aumen ados en las biopsias de umo es de pacien es con CCR me as ásico (429) y que polimo ismos en el an agonis a del ecep o de IL-1 (IL-1R) pueden asocia se con CCR (430). El bloqueo in i o de IL-1β usando IL-1R ecombinan e disminuyó signi ica i amen e el desa ollo de umo es en el modelo DSS/AOM (431), lo que indica un papel p o- umo igénico de IL-1β en es e con ex o. La IL-1β puede ac ua di ec amen e sob e las IECs (431) y sob e las células umo ales (427) pa a induci su p oli e ación. Asimismo, IL-1β p omue e el eclu amien o de MDSCs, lo que p omue e la p og esión de CCR (6, 391, 407, 420). La IL-1β ambién desempeña un papel impo an e en la angiogénesis del umo , ac uando indi ec amen e sob e las células endo eliales (432, 433). IL-1β a o ece la supe i encia de las células endo eliales median e la es imulación de las células del músculo liso ascula pa a sec e a VEGF (434). En esumen, la e idencia sugie e que IL-1β es un ac i ado indi ec o de las células endo eliales y la angiogénesis, a a és de la egulación de las moléculas p o-in lama o ias y angiogénicas. IL-18 Desc i a po p ime a ez en 1989 como " ac o induc o de IFN-γ", la IL-18 es á es echamen e elacionada con la IL-1β, ya que ambas se sin e izan p ime o como p ecu so es inac i os, necesi ando caspasa-1 pa a su escisión (420). Las dos pueden se p ocesadas ex acelula men e po p o einasa-3 y ambas ienen ecep o es señuelo. Simila a IL-1, el p ecu so de IL-18 se encuen a en casi odas las células mesenquimales en humanos y a ones (435). La IL-18 es un componen e impo an e de la espues a de las células Th1 y de las células NK. Es udios ecien es sugie en un e ec o p o ec o de la IL-18 en el CAC, al a o ece la espues a Th1 y la ac i ación de los CTL (436, 437). No obs an e, la IL-18 se ha implicado en a ias en e medades, incluyendo EII (420, 438). In oducción 64 IL-23 La IL-23 es una ci oquina de la amilia de la IL-12, p oducida po las APCs du an e la in lamación in es inal. Es conside ada egulado c í ico de la EII en humanos y en a ios modelos mu inos de coli is (424, 439). Los ni eles de IL-23 se ele an en el sue o de pacien es con CCR, y se co elacionan posi i amen e con la exp esión de VEGF (440). Al os ni eles de IL- 23, en ejido umo al p ima io, ue on p edic i os de una mayo asa de me ás asis del CCR (441). La IL-23 p olonga la ac i idad de las células Th17 locales (442) y posiblemen e sup ime la unción de las células T egs (443). Es posible que la IL- 23 con ole la exp esión de a ias ci oquinas p o-in lama o ias y p o- umo igénicas, como la IL-6, la IL-17 y la IL-22, y es as ci oquinas ansmi an el e ec o oncogénico de la IL-23 en el mic oambien e umo al (444, 445). Es as ci oquinas pueden a su ez ac i a la p oli e ación de células umo ales a a és de STAT3 y NF-κB. IL-17 La IL-17 es una ci oquina que une a los sis emas inmuni a ios adap a i os e inna os. La amilia de la IL-17 con iene 6 miemb os: IL-17A, IL-17B, IL-17C, IL- 17D, IL-17E e IL-17F (446). Las células Th17 desempeñan un papel impo an e en la de ensa del huésped con a los mic oo ganismos ex acelula es, pe o ambién pa icipan en pa ologías c ónicas como las en e medades in lama o ias y las en e medades au oinmunes (6, 391, 407). Los miemb os de la amilia IL-17, como IL-17A, IL-17C e IL-17F, egulan las unciones de las células epi eliales del colon en la EII y CAC. Se ha demos ado que IL-17A es á ele ada en las biopsias de ejido de pacien es con EII (6, 391, 407). IL-17A es el miemb o más ampliamen e es udiado de es a amilia en el con ex o de la EII y la umo igénesis in es inal. IL-17A pa ece se p o ec o con a la coli is, mien as que a o ece el desa ollo del cánce de colon. Po ejemplo, el bloqueo de IL-17A ue ine icaz e incluso exace bó la EII en algunos pacien es, debido al papel c í ico que desempeña IL-17A en el man enimien o de la homeos asis de la ba e a epi elial (447). Po el con a io, la exp esión de IL-17A In oducción 65 es á ele ada en CAC y CCR espo ádico y empeo a la p og esión de la en e medad (448, 449). Aunque en gene al se acep a que las células Th17 son la uen e p incipal de IL-17A en el mic oambien e umo al, los CTLs, las células T γδ y las ILCs ambién son impo an es p oduc o es de IL-17A (409). Las CDs que se in il an en el umo pueden p omo e la p oducción de IL-17 en células T γδ a a és de IL-23 y, de o ma simila a los es udios en modelos de a ón, las células T γδ in a umo ales humanas p omue en el eclu amien o y expansión de MDSCs (450, 451). Po lo an o, IL-17A puede con ibui indi ec amen e al silenciamien o inmune en el mic oen o no umo al. Además de las células hema opoyé icas, los CAFs ambién pueden exp esa IL-17A en espues a a quimio e apia en CCR humano y en modelos mu inos de xeno ansplan e (452). La IL-17A puede ac ua sob e las células del es oma umo al, p omo iendo la esis encia a e apias an iangiogénicas (453). IL-22 La IL-22 es una ci oquina de la amilia IL-10 p oducida po ILCs del g upo 3, células Th17, células Th22 y posiblemen e neu ó ilos (454, 455). La IL-22 iene un papel c ucial en la esolución del daño isula inducido po la lesión mic obiana, las ROS y o os es ímulos dañinos ya que aumen a la p oli e ación, la supe i encia y la egene ación de las IECs (454). Se c ee que las acciones mul i acé icas de la IL-22 p ese an la in eg idad del epi elio in es inal al p e eni el daño isula causado po la in ección y la in lamación (456-458). Sin emba go, es a ci oquina ambién puede p omo e coli is en algunos en o nos al a o ece la sec eción de o as ci oquinas p o-in lama o ias y pe pe ua la espues a in lama o ia (454). En humanos, se han asociado ni eles sé icos ele ados de IL-22 con la esis encia a la quimio e apia en pacien es con CCR, esis encia mediada po la sec eción au oc ina de IL-8 dependien e de STAT3 (459). K yczek e al ecien emen e demos a on que la IL-22 p omue e CCR ac i ando STAT3 (460). In oducción 72 G upo Celula Funciones an i umo ales Funciones p o umo ales CDs P esen ación an igénica a lin oci os T. Ac i ación de células T CD8+. Di e enciación de células Th1 (IL-12) (524, 525). Señales inhibi o ias de lin oci os T (PD-L1, PD-L2). Di e enciación de células Th2, células Th17 y células T eg (524, 526). Células Inmunosup eso as de o igen mieloide (MDSC) Disminución de la p oli e ación de lin oci os T. Inducción de apop osis de lin oci os T y células NK. P oducción de IL-10 y TGF-β. P oducción de MMPs y ac o es angiogénicos (505). Neu ó ilos Neu ó ilos p oin lama o ios N1. Eliminación de células umo ales. P oducción de ROS, TNF-, IL-12, CCL3. Reclu amien o y ac i ación de células T CD8+ (527, 528). Neu ó ilos an in lama o ios N2. P oducción de ROS. Quimio axis de células Th2 y células T eg (529-531). Células B P oducción de an icue pos an i umo ales. P oducción de IFN-γ o IL-12. Ci o oxicidad di ec a (516, 532). P oducción de IL-10, TGF-β. Reclu amien o de MDSCs. Pola ización a mac ó agos de eno ipo M2. Di e enciación de células T eg (533). Células NK Eliminación de células umo ales (Pe , GzmB, FasL, TRAIL). P oducción de ci oquinas (IFN-γ y TNF-). Quimio axis de CDs (CCL5 y CXCL1) (534-536). Células NKT P oducción de ci oquinas. Ac i ación de células T CD8+ (537, 538). P oducción de ci oquinas. Pola ización de mac ó agos a eno ipo M2. Aumen o de la p opo ción y ac i idad de células T eg (538, 539). ILCs Eliminación de células umo ales. P oducción de ci oquinas (IFN-γ y TNF-) (540) P oducción de ci oquinas. P oducción de A eg Pola ización de mac ó agos a eno ipo M2. Reclu amien o de MDSCs (540, 541). Tabla 1.11 Papel de las di e en es subpoblaciones del sis ema inmuni a io en la inmunidad an i umo al y en la in lamación que a o ece CCR. A eg: an i egulina, ADCC: ci o oxicidad mediada po an icue pos (del inglés, “An ibody-Dependen Cellula Cy o oxici y”). In oducción 73 1.4.7 Papel de la mic obio a in es inal en el desa ollo del cánce En el in es ino humano hay 500 ipos di e en es de mic oo ganismos y el colon con iene más de 1013 células bac e ianas (542). La mic o lo a in es inal iene impo an es unciones inmuni a ias, me abólicas y homeos á icas, a ec a la p oli e ación y supe i encia de las células epi eliales y p opo ciona p o ección con a los pa ógenos (543). La mic obio a in es inal me aboliza los ca bohid a os no abso bidos, las células epi eliales mue as y el moco. También p oduce me aboli os que in luyen en la unción de las células epi eliales, el balance de ene gía y las espues as inmuni a ias (544, 545). Además p oduce i aminas, ácidos g asos de cadena co a que egulan la espues a in lama o ia en EII y me aboliza los ácidos bilia es (546). Los es udios han demos ado que el desa ollo de CAC depende cuali a i a y cuan i a i amen e de la mic o lo a in es inal (547-549). La in e upción de la homeos asis de la mic o lo a in es inal pod ía p omo e el cánce de a ias mane as. Los pa ógenos mic obianos pueden causa in lamación in es inal a a és de la ac i ación de PRRs o po endoci osis, ambién po adhe encia y sec eción de oxinas o in asión (550). La in lamación in es inal puede se el esul ado de un equilib io abe an e en e la mic o lo a p o ec o a ( ole ogénica) y mic o lo a ag esi a (p oin lama o ia, induc o a de daño, p o umo igénica). Los cambios en el núme o, la di e sidad y la es abilidad de las bac e ias comensales (disbiosis), pa icula men e Clos idia spp, pueden al e a los p ocesos isiológicos no males y p o oca en e medades, incluido CCR (551); así que, la can idad y calidad de la mic obio a gas oin es inal a ec a el desa ollo de CAC (548). La especie Bac e oides agilis en e o oxigénica puede p omo e la umo igénesis del colon, si es capaz de induci daño isula y coli is, con la ac i ación pos e io de STAT3 y la p oducción de IL-17 (552). Es posible que solo las bac e ias que inducen una combinación de lesión isula e in lamación p omue an el cánce , mien as que la in lamación sin ciclos con inuos de lesión y epa ación es insu icien e pa a la inducción umo al. O os pa ógenos o comensales condicionales ambién con ibuyen a la umo igénesis, po ejemplo, la especie En e ococcus aecalis puede p omo e la p oducción de ROS. En el caso de S ep ococcus bo is, Bac e oides agilis y o as bac e ias p oducen In oducción 74 ci oquinas que a o ecen supe i encia y angiogénesis (IL-6, IL-8, IL-17) (553). Asimismo, se ha encon ado, en mues as de umo es colo ec ales y en ejidos adyacen es a umo es, la acumulación de muchas especies bac e ianas (547). En la abla 1.12 se mues a un esumen de los mic oo ganismos elacionados con el CCR y la EII. Mic oo ganismo Mecanismo pa ológico En CCR Bac e oides agilis en e o oxigénica Ac i ación de STAT3. Lesiones en la es uc u a y unción de IECs. P oducción de IL-17. Ac i ación de NF-κB y Wn . Bac e oides ulga es Señalización dependien e de MyD88. Ac i ación de NF-κB. Bi idobac e ium longum Clos idium bu y icium Mi suokella mul iacida Aumen o de p esencia bac e iana en umo es colo ec ales y en ejidos adyacen es a umo es. Esche ichia coli p oduc o a de colibac ina P oducen el me aboli o ca cinogénico colibac ina. Colonización in acelula . En e ococcus aecalis P oducción de ROS y daño en el DNA. S ep ococcus bo is P oducción de IL-8. Fo mación de c ip as abe an es. Aumen o de la p oli e ación de IECs. Fusobac e ium Nuclea um Aumen o de p esencia e in asi idad bac e iana en umo es colo ec ales. Lesiones en la es uc u a y unción de IECs. Ac i ación de Wn . Daños en DNA, MSI. Inhibición de la acción ci olí ica de las células NKs. Condición: lib e de gé menes Resis encia al cánce de colon. En EII Bac e oides agilis Es imulación de la p oducción de IL- 17. Bac e oides he aio aomic on Cambios de glucosilación (adhesión de ec uosa y mig ación) Clos idium di icile Aumen o de p esencia bac e iana en el ejido. Clos idium lep um y coccoides Al e ación de la di e sidad de la mic obio a con cambio a po encial p oin lama o io/p o- umo igénico. Esche ichia coli in asi a Colonización de IECs. P oducción de IL-8, IFN-γ, TNF- y de la molécula de adhesión celula elacionada con el an ígeno ca cinoemb iona io 6 (CEACAM6). Tabla 1.12 Mic oo ganismos elacionados con el CCR y EII. Adap ado de (6). In oducción 75 1.4.8 Modelos expe imen ales pa a el es udio de CCR Exis en a ios modelos, an o in i o como in i o, pa a el es udio del CCR. Es os han p opo cionado he amien as impo an es pa a in es iga el desa ollo y la pa ogénesis, los mecanismos e iológicos y isiopa ológicos, así como el a amien o del CCR humano. 1.4.8.1 Modelos in i o El es udio de la ca cinogénesis de colon en oedo es iene una la ga his o ia, que se emon a a casi 80 años (554). Es os modelos o ecen muchas en ajas: son al amen e ep oducibles, son ú iles pa a es udia la in luencia de ac o es gené icos y ambien ales que in luyen en el desa ollo del CCR y, además, ecapi ulan la pa ogénesis del CCR humano, al menos en las p ime as e apas (555). Los modelos mu inos pa a es udia la pa ogénesis del CCR son ele an es dada la al a ecuencia de umo es gene ados en la po ción dis al del colon de a ones, así como la his ogénesis de múl iples adenomas con el pos e io desa ollo de adenoca cinomas (556). O a g an en aja de los modelos mu inos es la disponibilidad de in o mación gené ica ex ensa sob e líneas indi iduales de a ones, la exis encia de paneles de a ones endogámicos ecombinan es y el núme o cada ez mayo de modelos gené icos ansgénicos, knockou y knockin, disponibles (557). Una des en aja no able de es os modelos es la al a gene al de eno ipo in asi o y me as ásico (558). Recien emen e, se ha desa ollado un modelo de CCR en a ones ansgénicos, con mu aciones en cua o genes implicados en CRC humano: APC, K- as, TGFBR2 y p53. Es os a ones desa olla on umo es in es inales me as ásicos, con ca ac e ís icas de los CCR MSS humanos, incluida la baja ca ga mu acional, in asión es omal y ac i ación de TGF-β (468). Se han desa ollado muchos modelos in i o pa a es udia el CCR:  Animales gené icamen e modi icados  Modelos de xeno ansplan es  Modelos químicamen e inducidos In oducción 76 Modelos inducidos po agen es químicos En la abla 1.13 se mues an los ca cinogénicos usados pa a induci CCR. G upo Ca cinogénico Aminas he e ocíclicas 2-amino-33-me ilimidazol [4,5- ] quinolina (IQ) 2-amino-1-me il-6- enilimidazol [4,5-b] pi idina (PhIP) Aminas a omá icas 3,2'-dime il-4-aminobi enilo (DMBA) Compues os de alquilni osamida me ilni osou ea (MNU) N-me il-N'-ni o-N-ni osoguanidina (MNNG) Dime ilhid azina y me aboli os 1,2-dime ilhid azina (DMH) Azoxime ano (AOM) Tabla 1.13 Ca cinogénicos usados en modelos expe imen ales pa a induci CCR. 1.4.8.2 AOM El AOM es el ca cinogénico más u ilizado pa a induci , y así es udia , el CCR espo ádico. Es e modelo ap o echa el o gano opismo o a inidad química que iene AOM po el colon. El AOM es un me aboli o de la DMH, y es p ecu so del ca cinógeno me ilazoxime anol (MAM). Ambos se han u ilizado pa a induci CCR en a ones y a as (558). Tan o DMH como AOM equie en a ios pasos de ac i ación me abólica pa a induci aduc os eac i os con el DNA. La hid oxilación de AOM da como esul ado la o mación del me aboli o eac i o MAM, un ion me ildiazonio, que puede alquila mac omoléculas en el hígado y el colon, incluida la adición de g upos me ilo en la posición O6 o N7 de la guanina (O6- me il-deoxiguanosina y N7-me il-deoxiguanosina) en la molécula de DNA. La me ilación en la posición O6 de la guanina ha demos ado se la p incipal lesión p omu agénica p oducida po el AOM (559). Los umo es inducidos po AOM compa en muchas de las ca ac e ís icas his opa ológicas del CCR humano. Con ecuencia ienen mu aciones en KRAS y β-ca enina, algunos mues an MIS, lo que indica un sis ema de epa ación de desajus e de ec uoso (560, 561). Sin emba go, las mu aciones de APC son In oducción 77 menos ecuen es en oedo es y a a ez se obse an mu aciones de p53 (558, 562). La endencia a hace me ás asis es baja (563). 1.4.8.3 Modelo de CAC. DSS/AOM Va ios abajos han con i mado la ele ancia del modelo DSS (Sul a o de Dex ano Sódico)/AOM en el es udio de los mecanismos de la ca cinogénesis colo ec al humana. Se ha demos ado que, debido a los e ec os siné gicos en e AOM y DSS, se aco a conside ablemen e el iempo de la encia en compa ación con el modelo clásico de CCR espon áneo, que se basa en inyecciones epe idas de AOM, o en compa ación con los modelos basados únicamen e en la adminis ación de DSS a di e en es dosis y pau as. El a amien o con DSS/AOM ep oduce la ca cinogénesis colo ec al p omo ida po una ase inicial de in lamación aguda, causando un ápido c ecimien o de múl iples umo es de colon en 8-10 semanas, mien as que en los o os modelos hay un iempo de la encia de ap oximadamen e 30 semanas (564). El modelo DSS/AOM es pa icula men e ú il cuando se es udia la iniciación y p og esión de CAC. El uso de DSS en combinación con AOM da como esul ado una incidencia del 80-100 % de umo es en el colon de cepas sensibles en compa ación con el 15–20 % cuando se adminis a DSS solo (558). Los umo es son muy ecuen es en la pa e dis al del colon, que ambién es la ubicación p edominan e del CCR humano. A menudo comienzan con un c ecimien o polipoide y p esen an ca ac e ís icas his opa ológicas simila es al CCR humano (558, 562). Vías gené icas in oluc adas en el modelo DSS/AOM Las e idencias mues an ca ac e ís icas muy simila es en e el CCR humano y el inducido en oedo es po DSS/AOM, ambién a ni el molecula . Dichos umo es p esen an des egulación de la ía de señalización de APC/β- ca enina, como po ejemplo la exp esión abe an e de APC, además de mu aciones y la localización celula al e ada de β-ca enina (565-567). También se ha demos ado que es án des egulados genes diana de la ía de señalización de APC/β-ca enina, como el oncogén cMyc, ciclina D1 y quinasa dependien e de ciclina 4 (Cdk4) (567). En conco dancia con los hallazgos encon ados en el CCR humano, los umo es inducidos po DSS/AOM ambién ienen mu aciones In oducción 78 de KRAS y mayo es ni eles de las enzimas, COX2 y la óxido ní ico sin asa inducible (iNOS) (560, 566). Las al e aciones gené icas en el gen p53, an comúnmen e encon adas en el CCR humano, no se obse an en el modelo de CAC inducido con DSS/AOM (558, 562, 568, 569). El gen p53 pe manece sin mu a , a pesa de que los animales p53-/- desa ollan más umo es si son a ados con AOM (570). ANTECEDENTES Y OBJETIVOS An eceden es y Obje i os 79 2- ANTECEDENTES Y OBJETIVOS La in lamación es un mecanismo cla e que egula la ac i idad del sis ema inmune en si uaciones isiológicas, po ejemplo, du an e la eliminación de umo es y agen es pa ógenos. Sin emba go, la in lamación c ónica ambién egula espues as isiopa ológicas du an e las en e medades in ecciosas, au oinmunes, así como en la génesis y p og esión del cánce (4-6, 193, 571, 572). Se ha ealizado un g an es ue zo pa a comp ende las ías y mecanismos molecula es que egulan la espues a in lama o ia y los elemen os cla e de es a. Va ios es udios han pe mi ido conclui que, an o la espues a in lama o ia inmune, que conducen a la eliminación de pa ógenos y umo es, como los as o nos in lama o ios c ónicos, que conducen al desa ollo de en e medades, compa en los mismo mecanismos (7-11). Es a dualidad ha di icul ado el a amien o de los as o nos asociados a in lamación c ónica sin p edispone a la apa ición de e ec os secunda ios g a es. En la mayo ía de las e apias se han u ilizado compues os inmunosup eso es de amplio espec o como es e oides o agen es que bloquean la unción de las ci oquinas, incluidos los an agonis as de los ecep o es IL-1β, IL-6 y TNF-, o an icue pos bloquean es (7, 573-576) y como e a de espe a , los e ec os secunda ios de es os compues os pueden se g a es, especialmen e, los pacien es p esen an un al o iesgo de in ección con pa ógenos que incluyen ube culosis (577) y p obablemen e lin oma y melanoma (578). Las células ci o óxicas (células NK y lin oci os T ci o óxicos) son esenciales pa a la de ensa del huésped con a pa ógenos y umo es, siendo esponsables de la eliminación de las células a ec adas, pe o ambién pueden es a implicadas en el daño asociado a in lamación c ónica po que p oducen can idades signi ica i as de ci oquinas p oin lama o ias y ambién son capaces de egula su p oducción po o os g upos celula es (12, 13). Uno de los mecanismos que u ilizan es as células pa a eje ce sus e ec os ci o óxicos es la exoci osis g anula . Es e es un p oceso de in e acción uncional en e la Pe (ci olisina o mado a de po os) y las Gzms, una amilia de se ina Ma e iales y Mé odos 85 3- MATERIALES Y MÉTODOS 3.1 Expe imen os in i o 3.1.1 Ra ones En los expe imen os in i o se siguie on los p o ocolos de expe imen ación animal ap obados po el comi é de é ica del Cen o de In es igación Biomédica de A agón (CIBA). Los expe imen os de a i is inducida po colágeno (CIA) se ealiza on según el p ocedimien o de expe imen ación PI 33/13, mien as que los de coli is y CCR asociado a coli is (CAC) se ealiza on según el p ocedimien o de expe imen ación PI 17/15. En odos los expe imen os de CIA se usa on a ones hemb a. Pa a los expe imen os de coli is y CAC se usa on a ones macho. En ambos modelos de expe imen ación animal se usa on a ones de en e 8 y 12 semanas de edad. Los animales u ilizados en los di e en es ensayos ue on los siguien es: 1. Animales con ol (wild ype -w -) • C57BL/6 (B6) p oceden es de los labo a o ios Jan ie , o de la colonia es able c iada y man enida en el animala io del CIBA. 2. Animales Knock-ou (KO): en los expe imen os se u iliza on a ones C57BL/6 de icien es en algunas p o eínas del sis ema inmune implicadas en el mecanismo de exoci osis g anula . • Ra ones de icien es en g anzima A (GzmA-/-), g anzima B (GzmB-/-) o pe o ina (Pe -/-). Es os animales ue on amablemen e p opo cionados po el D . Ma kus Simon del Ins i u o Max-Planck de Inmunobiología y Epigené ica, F ibu go, Alemania y man enidos en el animala io del CIBA. Los animales ue on c iados y man enidos en ambien e lib e de pa ógenos, con alimen ación y agua a lib e demanda. 3.1.1.1 De e minación del geno ipo de los a ones Pa a comp oba el geno ipo de los a ones u ilizados en los expe imen os, se ealizó PCR del DNA ob enido de la cola (siemp e después del sac i icio del Ma e iales y Mé odos 86 animal) o de los dedos (an es del des e e, ap o echando el ejido que se e i a pa a iden i ica a los a ones). Pa a ob ene el DNA se siguió el siguien e p o ocolo: se in odujo el agmen o de ejido seccionado en un ubo de 1,5 ml y se añadie on 50 μl de una solución 25 mM NaOH, 0,2 mM EDTA. La mezcla se incubó 1 h a 95 ºC y pos e io men e se en ió 15 min a 4 ºC. Luego se añadie on o os 50 μl de una solución 40 mM T is-HCl pa a neu aliza el NaOH. Po úl imo se elimina on los es os de ejido esiduales y el sob enadan e se u ilizó pa a la PCR o se gua dó a –20 ºC. La ampli icación del DNA se lle ó a cabo en di e en es mezclas u ilizando en cada caso los cebado es adecuados pa a de ec a los genes co espondien es a cada p o eína. Las secuencias de los oligonucleó idos usados como cebado es de la eacción (588), así como el p o ocolo u ilizado pa a ealiza la PCR ue on: P o eína Cebado Secuencia GzmA O1 Neo2A 5’-CGG AGA ACC TGC GTG CAA TC-3’ HF-I1 5’-AGG AGC AAT ATA TAC CAA TGG-3’ HF-7AS 5’-AGG TAG GTG AAG GAT AGC CAC-3’ GzmB Neo2S 5’-TTC CTC GTG CTT TAC GGT ATC-3’ ST-1S 5’-CTG CTA CTG CTG ACC TTG TCT-3’ ST-1AS 5’-TGA GGA CAG CAA TTC CAT CTA-3’ Pe O1Neo2A 5’-CGG AGA ACC TGC GTG CAA TC-3’ JT98 5’-CCA CTC CAC CTT GAC TTC AAA AAG GCG-3’ JT272 5’-TGG GCA GCA GTC CTG GTT GGT GAC CTT-3’ Tabla 3.1 Secuencias de los cebado es u ilizados pa a la PCR de geno ipado.u a Ma e iales y Mé odos 87 Mezcla de eacción ( olumen o al 25 µL) Supe Ho Mas e Mix 2X (BIORON) 12,5 µL Agua pa a PCR 9.5 µL GzmA O1 Neo2A 0.75 µL (0.3 µM) HF-I1 0.75 µL (0.3 µM) HF-7AS 1.5 µL (0.6 µM) GzmB Neo2S 0.75 µL (0.3 µM) ST-1S 0.75 µL (0.3 µM) ST-1AS 1.5 µL (0.6 µM) Pe O1Neo2A 0.75 µL (0.3 µM) JT98 0.75 µL (0.3 µM) JT272 1.5 µL (0.6 µM) Tabla 3.2 Mezcla de la eacción de la PCR de geno ipado.a Se añadió 1 μl del DNA ob enido, p e iamen e ex aído del ejido, a 25 μl de es a mezcla de eacción. Se lle ó a cabo la PCR u ilizando el siguien e p og ama: Condiciones de la eacción Calen amien o inicial 94 ºC 2 min Desna u alización 94 ºC 10 seg 35 ciclos Hib idación 55 ºC 20 seg Ex ensión 72 ºC 60 seg Ex ensión 72 ºC 5 min Tabla 3.3 Condiciones de la eacción de la PCR de geno ipado.u Los p oduc os de ampli icación ob enidos se analiza on po elec o o esis en gel de aga osa al 1 % en TBE (0,045 M T is-bo a o, 1 mM EDTA) que con enía dsG een Gel S aining Solu ion, 10.000× (Lumip obe), que se une especí icamen e al DNA, acili ando la isualización de las bandas del DNA ampli icado. Como ma cado de peso molecula se u ilizó 100 bp DNA ladde (IBIAN). La isualización se lle ó a cabo en el ansiluminado Gel Doc 2000 de BioRad Labo a o ies (Hé cules, CA). La de e minación del geno ipo de cada a ón se lle ó a cabo de la siguien e mane a: Ma e iales y Mé odos 88 Tabla 3.4 Tamaño de los p oduc os de ampli icación de la PCR de geno ipado. 3.1.2 A i is inducida po colágeno (CIA) La a i is se indujo u ilizando colágeno de pollo ipo II (Chond ex) en adyu an e comple o de F eund (CFA) (Chond ex). A los 21 días de la p ime a inmunización los a ones ue on eexpues os al colágeno, siguiendo el mismo p ocedimien o, pe o es a ez usando adyu an e incomple o de F eund (IFA) (Chond ex). A con inuación se de alla la p epa ación de la emulsión de colágeno y el p oceso inmunización: 3.1.2.1 P epa ación de la emulsión Se añadió el olumen de CFA (o IFA en el caso de la 2a inmunización) necesa io, en dependencia del núme o de animales a inmuniza , en un ecipien e de id io limpio y seco, p e iamen e en iado en hielo. Se añadió con mic opipe a, poco a poco, colágeno de pollo ipo II y se esuspendió as cada adición pa a que al mezcla se ue a o mando la emulsión. Cuando odo el olumen de colágeno de pollo ipo II había sido añadido se esuspendió de mane a con inua has a que se e minó de o ma la emulsión. Se comp obó la es abilidad de la emulsión o mada añadiendo una go a de la misma a un poco de agua, al no deshace se se conside ó que la emulsión e a es able. Du an e odo el p oceso los eac i os y la emulsión se man u ie on en hielo pa a e i a la desna u alización del colágeno de pollo ipo II. 3.1.2.2 Inmunización Se inyec a on len amen e 100 µl de la emulsión a cada a ón, a 1,5 cm de la base de la cola, po ía in adé mica. Cuando la inoculación e a co ec a había esis encia del ejido a la inyección sino, e a indica i o de una inyección subcu ánea o p o unda. P o eína Geno ipo +/+ (bp) Geno ipo -/- (bp) GzmA 450 320 GzmB 360 430 Pe 660 950 Ma e iales y Mé odos 89 El día 21 después de la inmunización p ima ia se ealizó una segunda inmunización en la que se usó la misma concen ación de colágeno de pollo ipo II, sin emba go, en es a ocasión el colágeno de pollo ipo II se emulsionó en IFA (el uso de CFA en la inmunización de e ue zo no es á pe mi ido). El p o ocolo u ilizado pa a ealiza la inducción de la a i is se mues a de o ma esquemá ica en la igu a 3.1. Figu a 3.1 P o ocolo de inducción de CIA. 3.1.2.3 Moni o ización y e aluación de la se e idad de la a i is Pa a la moni o ización mac oscópica de la a i is se es ableció un sis ema de pun uación en los que se e aluó la se e idad de la en e medad eniendo en cuen a a ios signos clínicos de a i is. Cada miemb o se alo ó indi idualmen e, lo que supuso un máximo de 16 pun os po a ón. La e aluación se ealizó semanalmen e, de la siguien e mane a: 0 = no mal 1 = e i ema e hinchazón le e con inada al mediopié (a iculaciones a sales) o a iculación del obillo 2 = e i ema e hinchazón le e que se ex iende desde el obillo has a el mediopié 3 = e i ema e hinchazón mode ada que se ex iende desde el obillo has a la a iculación me a a siana 4 = e i ema e hinchazón se e a del obillo, el pie y los dedos, con igidez a icula 3.1.2.4 Ana omía pa ológica e inmunohis oquímica Pa a la e aluación his ológica, los a ones a í icos se sac i ica on a las 2 (en e medad emp ana) o 7 (en e medad a día) semanas después del inicio de la AR. En p ime luga , las a iculaciones se ija on en una solución de Ma e iales y Mé odos 90 o maldehído 10 % en PBS du an e 24-48 h a empe a u a ambien e. Pos e io men e se descalci ica on du an e 3 semanas a 4 ºC en ampón T is- EDTA. T anscu ido es e iempo las mues as se incluye on en pa a ina, se co a on en secciones de 3 µm y se iñe on con hema oxilina-eosina. Las secciones ue on analizadas, es ableciéndose una pun uación his ológica de 0 a 4 pa a la in lamación, la e osión ósea y del ca ílago así como la hipe plasia sino ial. El análisis his ológico lo lle ó a cabo un his opa ólogo en enado, median e un es udio ciego. La inmunohis oquímica (IHQ) se ealizó en secciones de ejido embebido en pa a ina siguiendo la écnica de inción con a idina-bio ina-inmunope oxidasa, sin ecupe ación p e ia de an ígeno. B e emen e, se despa a ina on secciones de 4 µm y se bloqueó la ac i idad de pe oxidasa endógena con H2O2 al 3 %, y después se incubó du an e 30 min en sue o de conejo al 10 %. La incubación con el an icue po an i- ecep o de calci onina de conejo (LS-C42899; LSBio) se ealizó du an e 1 h a empe a u a ambien e. Pos e io men e, los po aobje os se incuba on du an e 30 min con inmunoglobulinas bio iniladas, seguido de incubación du an e 30 min con una dilución 1:25 del complejo a idina-bio ina- pe oxidasa (ambos de Vec o Labo a o ies). La diaminobencidina (DAB, Sigma) se u ilizó como c omógeno y la hema oxilina como con a inción nuclea . 3.1.2.5 Análisis de p oli e ación de células T (inco po ación de 3H- imidina) Se sac i ica on a ones a í icos en di e en es momen os después del inicio de la en e medad, se ex i pa on ganglios lin á icos inguinales, b aquiales y axila es. Se p ocesa on po mace ación has a ob ene una suspensión de células en medio RPMI (1x107 cel/ml) y se cul i a on du an e 72 h a 37 ºC y 5 % de CO2 en p esencia de 0, 50 o 100 µg/ml de colágeno de pollo ipo II. Se añadió 3H- imidina (Ame sham) a los cul i os celula es du an e las úl imas 18 h (1 µCi/pocillo, equi alen e a 1 µL po pocillo) y se cuan i icó la adioac i idad en un con ado de cen elleo líquido (Beckman). La concana alina A (1 µg/ml) se usó como con ol posi i o de la p oli e ación de células T. Ma e iales y Mé odos 91 Pa alelamen e, se cul i a on células de ganglios lin á icos en las mismas condiciones an e io men e expues as, pe o en luga de ag ega 3H- imimida, se ecupe a on los sob enadan es del cul i o celula , después de 24 h, y se cuan i ica on las ci oquinas IL-1, IL-6, IFN-, TNF- e IL-17, usando el co espondien e "Ready-Se -Go", de A yme ix (eBioscience) ( e sección 3.2.3.1). 3.1.2.6 Ensayo de o mación de osas La eabso ción ósea mediada po OCs se e aluó u ilizando co es de den ina de ballena (589). Las colonias CFU-GM se incuba on du an e 15 días en odajas de den ina p e iamen e a adas con M-CSF (25 ng/ml) (P epo ech) en p esencia o ausencia de GzmA (3,5 µg/ml) o TNF (100 ng/ml). Como con ol posi i o se u iliza on RANKL (50 ng/ml) (Bio ech) más M-CSF. Los OCs se sepa a on con ipsina, y la o mación de osas se e i icó po mic oscopía con ocal. 3.1.3 Coli is y cánce asociado a coli is La inducción de coli is aguda o c ónica se ealizó empleando Sul a o de Dex ano Sódico (DSS, del inglés “Dex an Sul a e Sodium”) (MW 36.000–50.000 de MP Biomedicals). Po o o lado, la inducción de CAC se ealizó con una combinación de DSS y azoxime ano (AOM) (Sigma Ald ich) (564, 590). 3.1.3.1 Inducción de coli is c ónica y aguda La coli is c ónica se indujo median e 3 ciclos de DSS al 2,5 %, adminis ado en el agua de bebe . Cada ciclo u o una du ación de cinco días, seguidos de 2 semanas de descanso con agua sin a amien o. Todos los a ones u ie on acceso ad libi um al agua de bebe , que con enía DSS al 2,5 % o agua sin a amien o (g upo con ol). En algunos expe imen os se indujo coli is aguda, pa a lo cual se adminis ó DSS al 2,5 % en el agua de bebe du an e cinco días (un ciclo), y los animales ue on sac i icados 10 días después de inicia el a amien o. Ma e iales y Mé odos 92 3.1.3.2 Inducción de cánce asociado a coli is (CAC) El CAC se indujo median e inyección in ape i oneal (ip) de una dosis única del agen e mu agénico AOM (10 mg/kg) el p ime día de a amien o, seguido de 3 ciclos de DSS al 2,5 % en el agua de bebe du an e cinco días, con descanso en e ciclos de dos semanas. Pa a lle a a cabo es os expe imen os, se p epa ó una solución de AOM, en solución salina iso ónica, a una concen ación de 1 mg/ml. Pa a la mayo p ecisión en la dosi icación, cada animal se pesó y se calculó el olumen a adminis a mul iplicando el peso del animal (kg) x la dosis (mg/kg) y luego se di idió po la concen ación de la solución de abajo (mg/ml). Al p epa a la solución de abajo a 1 mg/ml se ga an izó que: Volumen de AOM a adminis a (µL) = peso del a ón (g) x 10 El mismo olumen de solución iso ónica se inoculó en los g upos con ol. En la igu a 3.2 se mues a el p o ocolo u ilizado pa a induci coli is y CAC. Figu a 3.2 P o ocolo de inducción de Coli is y CAC. En es expe imen os independien es se inhibió in i o la GzmA en a ones w a ados con DSS/AOM. Pa a ello se indujo CAC, al y como se indica an e io men e. A pa i del día 35, un g upo de a ones se a ó con cinco dosis de se pinb6b, un inhibido selec i o de la GzmA de a ón. Se adminis a on 20 µg po ía in a enosa cada dos días. Como con ol se u ilizó un g upo de a ones a los cuales se les adminis ó se pinb6b p e iamen e inac i ado con ipsina. Los a ones ue on sac i icados 49 días después de inicia el expe imen o. Se analizó el daño a ni el mac oscópico en el colon, así como la incidencia, el núme o y el Ma e iales y Mé odos 93 amaño de los umo es. Una po ción de colon se cul i ó pa a de e mina el ni el de ci oquinas in lama o ias p esen es en el sob enadan e del cul i o de los explan es de ejido de colon. En algunos expe imen os se inhibió in i o la IL-6 en a ones w y en a ones de icien es en GzmA-/-, a ados con DSS/AOM. Pa a ello, se indujo CAC al y como se indica an e io men e. En dos expe imen os, a pa i del día 35 y has a el día 50, a un g upo de a ones de ambas cepas se les adminis ó un o al de 6 dosis del an icue po monoclonal an i-IL6 (MP5-20F3, BioXcell). El sac i icio se ealizó el día 56 después de iniciado el a amien o con DSS/AOM. Se adminis a on 200 µg/ a ón del an icue po po ía i.p cada 72 h. Como con ol, se u iliza on a ones a los cuales se les adminis ó un iso ipo IgG1 hecho en a a (BioXcell). En o o expe imen o se inhibió de o ma a día la IL-6, es a ez se adminis a on un o al de 5 dosis, a azón de 200 µg/ a ón del an icue po monoclonal an i-IL6, po ía ip cada 48 h, desde el día 56 has a el día 64 del a amien o. El sac i icio se ealizó el día 70. En la nec opsia se analizó el daño a ni el mac oscópico en el colon, así como la incidencia y el núme o de umo es. Una po ción de colon se cul i ó pa a de e mina el ni el de ci oquinas in lama o ias p esen es en el sob enadan e del cul i o de los explan es de ejido de colon. Se ealizó un expe imen o en el que se inhibió in i o el TNF-α, en a ones w y en a ones de icien es en GzmA-/-, a ados con DSS/AOM. Pa a ello, se indujo CAC al y como se indica an e io men e. En dicho expe imen o, a pa i del día 56 y has a el día 60, a un g upo de a ones de ambas cepas se les adminis ó un o al de 5 dosis de del an agonis a especí ico del TNF- humano, Enb el (e ane cep ) (P ize ), cedido amablemen e po la D a. Ana Ma ía O iz Ga cía del se icio de euma ología del Hospi al uni e si a io de La P incesa. El sac i icio se ealizó 67 días después de inicia el a amien o con DSS/AOM. Se adminis a on 5 mg/kg/ a ón, del an agonis a po ía ip cada 24 h. Como con ol se u iliza on a ones a los cuales se les adminis ó PBS. En la nec opsia se cuan i icó el núme o de umo es po a ón, así como la incidencia de umo es. Ma e iales y Mé odos 100 3.2.2 Ensayo colo imé ico B ad o d pa a es ima la concen ación de p o eínas Se cuan i icó la concen ación de p o eínas ecombinan es y de p o eínas o ales ex aídas de lisados celula es o de ejidos, median e el ensayo B ad o d. Pa a ello se u ilizó el ki Quick S a TM B ad o d P o ein Assay BioRad. B e emen e, se p epa ó la cu a pa ón de BSA como se indica en el manual de p ocedimien o del Ki . Se u ilizó como diluyen e el mismo ampón en el que se disol ie on las mues as a analiza . Se ca ga on 5 μl de las di e en es concen aciones de la cu a pa ón y de las mues as, po iplicado, en una placa de 96 pocillos de ondo plano y, a con inuación, se añadie on 245 μl de azul de Coomassie. Se incubó a empe a u a ambien e du an e 5 min y inalmen e se midió la abso bancia a 595 nm. Se de e minó la concen ación de la p o eína en cues ión (o de las p o eínas o ales) u ilizando la ec a de calib ado. 3.2.3 Cuan i icación de p o eínas po ELISA 3.2.3.1 Cuan i icación de Ci oquinas po ELISA Pa a cuan i ica , en los sob enadan es de cul i os de células de ganglios lin á icos, en los explan es de ejido de colon o en el sue o, las siguien es ci oquinas: IL-1, IL-6, IFN-, TNF-, IL-10 e IL-17, se u iliza on los co espondien es Ki s "Ready-Se -Go", de A yme ix (eBioscience). Pa a el caso especí ico del ejido de colon, és e se co ó en po ciones de 30 mg (dis al y p oximal) y se man u o en 2 ml de medio de cul i o (DMEM suplemen ado con SFB al 10 %, glu amina 10 mM, HEPES 10 mM (Sigma) y 100 U/ml de penicilina/es ep omicina) a 37 ºC, en una a mós e a de 5 % de CO2. Después de 24 h, se ecogie on los sob enadan es, se cen i uga on a 500 xg du an e 10 min y se almacena on alicuo adas a -80 ºC pa a pos e io men e ealiza el ELISA co espondien e. En el caso del cul i o de células de ganglios lin á icos se p ocedió según lo desc i o en la sección 3.1.2.5. De o ma gene al, se adiciona on 100 µl del an icue po de cap u a a la concen ación ecomendada, en ampón de e es imien o, a la placa de ELISA Ma e iales y Mé odos 101 de 96 pocillos (NUNC Maxiso p) y se incubó oda la noche a 4 ºC. Se la ó la placa 3 eces con 200 µl de solución de la ado (1X PBS con 0.05 % Tween-20) y seguidamen e se bloqueó con 200 µl de ampón de ensayo du an e 1 h a empe a u a ambien e. Se adicionó el pa ón y el blanco como ecomienda el ab ican e, además de las mues as diluidas en ampón de ensayo, incubándose 2 h a empe a u a ambien e. T as la a la placa 3 eces con solución de la ado, se adiciona on 100 µl del an icue po de de ección conjugado con bio ina a la concen ación ecomendada y se incubó 1 h a empe a u a ambien e. Se la ó la placa 3 eces con solución de la ado, se adiciona on 100 µl de enzima a idina- HRP (1:4000 en ampón de ensayo) y se incubó du an e 30 min. Seguidamen e, se la ó la placa 5 eces y se adiciona on 100 µl de TMB (3,3’,5,5’- Te ame ilbenzidina), as 15 min se de u o la eacción adicionando 50 µl de H2SO4 1M. Se de e minó la abso bancia en un lec o de placa (Syne gy™ HT, BioTek) a 450 nm y 570 nm y se es a on los alo es ob enidos a dichas longi udes de onda (Abs 450-Abs 570). 3.2.3.2 Cuan i icación de GzmA po ELISA Pa a cuan i ica GzmA de a ón a pa i de p o eínas o ales de ejido congelado, en los sob enadan es de cul i os de explan es de ejidos de colon o en sue o, se ealizó un ELISA ipo sándwich indi ec o usando an icue pos con a GzmA de a ón hechos en a a y conejo. Es os an icue pos ue on p e iamen e p oducidos inmunizando a as o conejos, siguiendo p o ocolos con encionales. Como an icue po de cap u a se u ilizó IgG de conejo pu i icado a 2 µg/ml, disuel os en NaHCO3, pH 9,6. Como an icue po de de ección se usó el inmunosue o policlonal de a a diluido en PBS (1: 1000). Como an icue po secunda io se usó an icue po con a IgG de a a hecho en cab a (Sigma) conjugado con HRP, diluido en PBS (1: 20000). Se de e minó la abso bancia en el lec o de placa (Syne gy™ HT, BioTek) a 405 nm y 570 nm y se es a on los alo es ob enidos a dichas longi udes de onda (Abs 450-Abs 570). Ma e iales y Mé odos 102 3.2.3.3 Cuan i icación Telopép ido C- e minal de colágeno ipo I (ICTP) po ELISA Se ob u o sue o de a ones w y de a ones GzmA-/- y se congeló a -80 ºC pa a el pos e io análisis de ICTP, con un ki de ELISA de BlueGene, siguiendo las ins ucciones del ab ican e. Pa a la de ección y cuan i icación de ICTP es e ki se basa en la écnica de inmunoensayo enzimá ico compe i i o, u ilizando un an icue po monoclonal an i- ICTP y un conjugado de ICTP-HRP. Las mues as de ensayo se incuba on con el conjugado ICTP-HRP en una placa ecubie a con el an icue po monoclonal an i-ICTP du an e 1 h. Después de es e pe íodo, la placa, p e iamen e la ada, se incubó con un sus a o pa a la enzima pe oxidasa. El p oduc o de la eacción enzima-sus a o o mó un complejo de colo azul. Finalmen e, se ag egó una solución pa a de ene la eacción. La in ensidad del colo se midió espec o o omé icamen e a 450 nm en un lec o de placa (Syne gy ™ HT, BioTek). En es e ipo de ensayo la in ensidad del colo e a in e samen e p opo cional a la concen ación de ICTP, ya que el ICTP de las mues as y el conjugado ICTP-HRP compi en po el si io de unión del an icue po an i-ICTP. Pa a e alua los esul ados en p ime luga se ealizó una cu a que elacionaba la in ensidad del colo (Abs) con la concen ación de los es ánda es. Pos e io men e se ex apoló la concen ación de ICTP en cada mues a a pa i de es a cu a es ánda . 3.2.3.4 Cuan i icación de an icue pos IgG an i colágeno ipo II po ELISA Pa a cuan i ica an icue pos o ales IgG en e a colágeno ipo II en el sue o de a ones con CIA, se u ilizó un ki de ELISA de Chond ex, siguiendo las ins ucciones del ab ican e. En es e ki de ELISA las placas es aban ecubie as con colágeno de pollo ipo II. Los es ánda es y las mues as se analiza on po duplicado. Se usa on las diluciones ecomendadas po el ab ican e y se incuba on a 4 ºC oda la noche. Como an icue po secunda io se usó una IgG an i- a ón hecha en cab a, conjugada con HRP (1:200), p opo cionada en el Ki . Se ag ega on 100 µl de solución de an icue po secunda io a cada pocillo y se Ma e iales y Mé odos 103 incubó a empe a u a ambien e du an e 2 h. Como agen e c omógeno se u ilizó el diclo hid a o de o o- enilendiamina (OPD) du an e 30 min y as de ene la eacción (H2SO4 1M) se leyó la placa a 490 y 630 nm. Pa a la de e minación de an icue pos IgG1 e IgG2c an i colágeno ipo II en el sue o se ealizó un ELISA. B e emen e, se diluyó el colágeno bo ino ipo II en T is/HCl 0,05 M a una concen ación inal de 5 µg/ml, se inmo ilizó en placas Nunc MaxiSo p pa a ELISA y se incubó a 4 ºC du an e oda la noche. Después, se bloquea on las uniones inespecí icas con PBS y 2 % de BSA, du an e 2 h a empe a u a ambien e. Pos e io men e, se incubó con diluciones se iadas de sue o de a ones w y de a ones GzmA-/- con a i is inducida po colágeno. Como an icue pos de de ección se usa on an icue pos con a IgG1 o IgG2c (Sou he n Bio ech) de a ón, hechos en cab a, conjugados con HRP, diluidos en PBS con 1 % BSA (1:500). Se añadie on 50 µl de TMB como agen e c omógeno y luego se de u o la eacción con 25 µl de H2SO4 1M an p on o como los con oles sanos se ol ie on azules. Se ealizó la lec u a de la placas en el lec o de placa (Syne gy™ HT, BioTek) a 450 y 570 nm. 3.2.4 Análisis de p o eínas po Wes e n-Blo 3.2.4.1 Ex acción de p o eínas o ales a pa i de lisados celula es Pa a ealiza los lisados celula es, se e i ó cuidadosamen e el medio de cul i o de las células adhe en es. Las células se la a on dos eces con PBS ío. Pos e io men e se añadió ampón RIPA (25mM T is-HCl pH 7.6, 150mM NaCl, 1% NP-40, 1% SDS) (The mo Fishe ) ío a las células. Se u ilizó 1 ml de ampón RIPA po cada 5 × 106 células. P e iamen e, jus o an es de se u ilizado, se adicionó al ampón RIPA cóc el de inhibido de p o easa Comple e™ (Roche) e inhibido de os a asas (Sigma). Se incubó en hielo du an e 5-10 min, gi ando la placa de ez en cuando pa a log a una dis ibución uni o me. Se ecogió el lisado con ayuda de un aspado de células y se ans i ió a un ubo de mic ocen í uga. Las mues as se cen i uga on a 14.000 xg du an e 15 min a 4 ºC, pa a sedimen a los esiduos celula es. Se ecogió el sob enadan e en un nue o ubo pa a su pos e io análisis. La concen ación de p o eínas o ales se Ma e iales y Mé odos 104 de e minó usando Quick S a TM B ad o d P o ein Assay (Bio-Rad) ( e sección 3.2.2) Una ez de e minada la concen ación de p o eínas o ales en el lisado celula se añadió ampón de ca ga 3X (T is-HCl 150 mM pH 7,4, Sigma; 3 %, SDS, Me ck; molibda o de sodio 0,3 mM, Sigma; pi o os a o de sodio 30 mM, Sigma; luo u o de sodio 30 mM, Sigma; glice ol 30 % / , Scha lau; 2-β- me cap oe anol 30 % / , Sigma y azul de b omo enol 0,06 % p/ ). Finalmen e, los lisados se incuba on du an e 5-10 min a 95 ºC en un baño seco (Selec a), se cen i uga on, y se ca ga on en un gel o bien se almacena on a -20 ºC has a su pos e io uso. 3.2.4.2 Sepa ación de p o eínas celula es. Elec o o esis en gel de poliac ilamida La sepa ación de p o eínas en unción de su peso molecula se lle ó a cabo median e elec o o esis en gel de poliac ilamida que con enía un 0,1 % de SDS. El po cen aje de poliac ilamida a ió en e el 10 y el 12 %, dependiendo del amaño de las p o eínas a analiza . La elec o o esis se ealizó a un ampe aje cons an e de 20 mA/gel y un ol aje de 180 V du an e 60-90 min. 3.2.4.3 T ans e encia de p o eínas a memb anas Finalizada la elec o o esis, las p o eínas se ans i ie on a memb anas de PVDF (del inglés, “Poly inylidene luo ide”), p e-incubadas 30 s con me anol. El p oceso se lle ó a cabo en un equipo de ans e encia semiseca de BioRad. La ans e encia se ealizó a 20 V y 400 mA du an e 55 min. 3.2.4.4 Análisis de p o eínas po inmunoblo (Wes e n blo ing) Las p o eínas celula es ijadas en las memb anas de PVDF se analiza on con an icue pos especí icos. P e iamen e, y una ez e minada la ans e encia, la memb ana se bloqueó en una solución de PBS y 5 % de leche en pol o desna ada, a pH 7,4, du an e 60 min. Seguidamen e, la memb ana se incubó du an e oda la noche, a 4 ºC con agi ación sua e, con el an icue po especí ico pa a de ec a la p o eína deseada. Los an icue pos se diluye on en PBS pH 7,4 Ma e iales y Mé odos 105 con 0,1 % de Tween-20 y leche en pol o desna ada al 2,5 % (p/ ) (solución A). Finalizada la incubación, se desechó la solución con el an icue po y la memb ana se la ó con PBS pH 7,4 que con enía 0,1 % de Tween-20 (solución B), 4 eces du an e 5 min, agi ando mode adamen e. Seguidamen e, las memb anas se incuba on en la solución A con el an icue po secunda io co espondien e (Tabla 3.6). Es a incubación se ealizó du an e 1 h a empe a u a ambien e y con agi ación sua e. T anscu ido el iempo de incubación la solución del an icue po secunda io se eliminó y se la ó 3 eces la memb ana du an e 10 min, agi ando mode adamen e, con la solución B. La de ección de los inmunocomplejos se ealizó median e cap ación de la señal in a oja. Las memb anas se escanea on en el ODYSSEY CLx (LI-COR). El análisis cuan i a i o de las bandas se ealizó po densi ome ía con la ayuda del so wa e ImageJ. De es e modo, se analizó, en unción de la in ensidad de cada banda po unidad de supe icie, el ni el de exp esión de la p o eína de in e és y de una p o eína de e e encia, conc e amen e β-ac ina o GAPDH. Los an icue pos p ima ios y secunda ios usados en es e es udio, las concen aciones a las que ue on u ilizados, así como la casa come cial de la que p ocedían, se indican en la abla 3.6. An icue po Concen ación Casa come cial An i-p-STAT3 (Ty 705) 1/1000 Cell Signaling An i-p-NF-κB p65 (Se 536) 1/1000 Cell Signaling An i-IκBα (44D4) 1/1000 Cell Signaling An i-β-Ac ina 1/5000 Sigma An i-GAPDH 1/5000 Sigma IRDye® 800CW An icue po an i- a ón hecho en cab a 1/20000 LI-COR IRDye® 680RD An icue po an i- a ón hecho en cab a 1/20000 LI-COR Tabla 3.6 An icue pos p ima ios y secunda ios usados pa a wes e n blo . GAPDH (del inglés, “Glyce aldehyde-3-Phospha e Dehyd ogenase”). Ma e iales y Mé odos 106 3.2.5 Análisis de p o eínas de la supe icie celula po ci ome ía de lujo El análisis de la p esencia de de e minadas p o eínas de memb ana median e ci ome ía de lujo se ealizó con an icue pos conjugados con luo oc omos (Tabla 3.7). Pa a ello, las IELs aisladas se incuba on en 100 µl de PBS suplemen ado con 5 % de SFB du an e 15 min a 4 ºC, con la can idad de an icue po indicada po la casa come cial. T ascu ido es e iempo, se la a on 3 eces con PBS suplemen ado con 5 % de SFB y se analiza on po ci ome ía de lujo. En los casos en los que no se hizo el análisis inmedia amen e, las células ue on ijadas con pa a o maldehido al 2 % (PFA 2 %) a 4 ºC has a 24 h después. 3.2.5.1 Análisis in acelula de GzmA po ci ome ía de lujo Las Gzms son p o eínas in acelula es con enidas en los g ánulos ci o óxicos. Pa a analiza su exp esión en IELs, las células se ija on du an e 15 min a 4 ºC con 200 µl de PFA 1 % en PBS. A con inuación se la a on 2 eces con PBS suplemen ado con 5 % de SFB y se esuspendie on en 100 µl de una solución de pe meabilización (saponina 0.1 % en PBS suplemen ado con 5 % de SFB) que con iene el an icue po que econoce a la GzmA (an i-GzmA PE; dilución 1/1000). Como con ol se usó el iso ipo IgG1 de a ón hecho en cab a conjugado con PE (dilución 1/1000). Se incuba on las células con el an icue po y el iso ipo du an e 1 h a empe a u a ambien e. Pa a inaliza , las células se la a on 2 eces con el ampón de pe meabilización y se esuspendie on en PFA 2 % pa a su análisis po ci ome ía de lujo. En la abla 3.7 se mues an los an icue pos u ilizados en el análisis de p o eínas po ci ome ía de lujo, así como la concen ación a las que ue on usados y la casa come cial de la que p ocedían. Ma e iales y Mé odos 107 An icue po Concen ación Casa come cial CD3 FITC 1/50 Mil enyi Bio ec CD8α APC 1/250 Mil enyi Bio ec CD4 APC 1/50 Mil enyi Bio ec G anzima A PE 1/1000 Mil enyi Bio ec IgG1 PE 1/1000 Mil enyi Bio ec NK1.1 APC-Vio770 1/50 Mil enyi Bio ec CD45 VioBlue 1/250 Mil enyi Bio ec CD11b FITC 1/50 Mil enyi Bio ec F4/80 APC 1/50 Mil enyi Bio ec Ly6G VioBlue 1/250 Mil enyi Bio ec Tabla 3.7 An icue pos usados pa a ci ome ía de lujo.ie de abla 3.3 Sob eexp esión y pu i icación de p o eínas 3.3.1 P epa ación de medios y cul i os de Esche ichia coli y Pichia pas o is El manejo de cul i os de E. coli y P. pas o is se ealizó den o del á ea es é il c eada po la llama de un meche o de alcohol, usando siemp e medios de cul i o au ocla ados. Pa a p epa a medio Lu ia Be ani (LB), se pesa on 10 g de ip ona (Pan eac), 5 g de ex ac o de le adu a (Pan eac) y 5 g de NaCl (Me k). Se disol ie on en 950 ml de agua des ilada, se ajus ó el pH de la solución a 7,5 y se comple ó el olumen has a 1L. Se es e ilizó la solución en au ocla e (Au es a Mod 4376, Selec a). Pa a p epa a placas de LB-aga , se pesa on 20 g de Aga (Sigma) y se disol ie on en 1 L de LB. Pa a p epa a medio YPD (del inglés, “Yeas Ex ac Pep one Dex ose Medium”) se disol ie on en 900 ml de agua: 20 g de pep ona (Pan eac) y 10 g de Ma e iales y Mé odos 108 ex ac o de le adu a (Pan eac). Se es e ilizó la solución en au ocla e y cuando se en ió la solución a ~ 60 ºC se ag ega on 100 ml de una solución de D- glucosa (Me k) 10 X, p e iamen e p epa ada y es e ilizada po il ación (20 g en 100 ml de agua). Pa a p epa a medio YPM (del inglés, “Yeas Ex ac Pep one Me hanol Medium”) se disol ie on en 900 ml de agua: 20 g de pep ona (Pan eac) y 10 g de ex ac o de le adu a (Pan eac). Se es e ilizó la solución en au ocla e y cuando se en ió la solución a ~ 60 ºC se ag ega on 100 ml de una solución de me anol (Pan eac) 10 X, p e iamen e p epa ada y es e ilizada po il ación (5 ml en 100 ml de agua). Pa a p epa a medio con bio ina y dex osa pa a la egene ación celula (RBD) p ime o se disol ie on 186 g de D-so bi ol (Sigma) y 20 g de aga bac e iológico en 790 ml de agua y se es e ilizó la solución en au ocla e. Apa e, se disol ió 134 g de base de ni ógeno de le adu a (YNB, Sigma), con sul a o de amonio, y sin aminoácidos, en 1 L de agua. Se calen ó lige amen e pa a disol e y se es e ilizó po il ación. Po o o lado, se undió el so bi ol-aga y se dejó en ia a 60 ºC. Después, se ag ega on las siguien es soluciones p ecalen adas a 45-50 ºC: 100 ml D-glucosa al 20 % (p/ ), 100 ml de YNB y 2 ml de bio ina (Sigma) a una concen ación de 0,2 g/L (p e iamen e es e ilizada po il ación). Po úl imo, se añadie on 10 ml de la solución acuosa (p e iamen e es e ilizada po il ación) de los siguien es aminoácidos: ácido L-glu ámico, L-me ionina, L- lisina, L-leucina y L-isoleucina (500 mg/L, Sigma). 3.3.2 Exp esión y pu i icación de GzmA en Esche ichia coli 3.3.2.1 Inducción con IPTG Pa a la exp esión de GzmA se u ilizó la cepa de E. coli BL21 ans o mada con el plásmido pET21a+ que con enía un inse o de la p o-GzmA de a ón. El p ime día se ealizó un p ime p e-cul i o inoculando 20 μl del s ock de es a bac e ia (congelada en 30 % de glice ol) en 10 ml de LB con 100 μl/ml de ampicilina (Sigma) y se incuba on a 37 °C du an e 12 h con agi ación cons an e. T anscu ido es e iempo, se añadie on los 10 ml del p ime cul i o a 40 ml de Ma e iales y Mé odos 109 medio LB suplemen ado con 100 μg/ml de ampicilina. Se incubó a 37 °C oda la noche con agi ación cons an e. Al día siguien e se añadie on los 50 ml del p e- cul i o a un ma az E lenmeye de 2 L, que con enía 450 ml de medio LB y se incubó a 37 °C con agi ación cons an e, has a que el cul i o alcanzó una densidad óp ica a 600 nm (DO600nm) en e 0.6 y 0.8. Una ez alcanzada la densidad óp ica deseada, se sepa ó 1 ml de cul i o, que ue u ilizado como e e encia inicial de la sob eexp esión de la p o eína. Seguidamen e se añadió IPTG (MP Biomedicals) a una concen ación inal de 1 mM y se incubó a 37 °C con agi ación cons an e du an e 3 h. T anscu ido ese iempo, en p ime luga se ese ó 1 ml del medio de cul i o pa a pos e io men e cons a a la sob eexp esión de la p o eína en un gel de poliac ilamida. Después, se cen i ugó el cul i o a 8.000 xg du an e 15 min y se eliminó el sob enadan e. Se la ó el pelle con 10-15 ml de PBS y se cen i ugó nue amen e a 8.000 xg du an e o os 15 min. Se eliminó el sob enadan e y se pasó el pelle a un ubo pa a cen í uga cónico de 50 ml. Po úl imo, se congeló a -20 °C pa a su pos e io uso. 3.3.2.2 Ob ención de cue pos de inclusión Pa a la pu i icación de GzmA, se descongeló el pelle bac e iano ob enido en el paso an e io , y se esuspendió en ampón de lisis (T is-HCl 50 mM, NaCl 100 mM, DTT 2 mM, lisozima 2 mg/ml (Sigma-Ald ich), DNAasa 1 mg/ml (Sigma- Ald ich), inhibido de p o easa 1 X y T i on X al 0,5 % (Sigma). Po cada g amo de pelle celula descongelado se u ilizó 1 ml de ampón de lisis. La mezcla se colocó en un agi ado e ical a 4 °C du an e 2 h. Después se lisa on las células median e dis upción mecánica po sonicación. Pa a ello, se pasó la suspensión a un aso de p ecipi ado en hielo y se sonicó a ¾ de ampli ud y ¾ pulso du an e 45 s, se dejó eposa du an e 2 min y se epi ió el p oceso diez eces. Una ez lisadas las células se cen i ugó a 50.000 xg du an e 15 min a 4 ºC. 3.3.2.3 Solubilización y eplegamien o de las p o eínas con enidas en los cue pos de inclusión Los cue pos de inclusión ob enidos p e iamen e se esuspendie on en ampón de desna u alización (T is-HCl 50 mM, NaCl 100 mM, clo u o de Ma e iales y Mé odos 116 Todas las manipulaciones se ealiza on en campanas de lujo lamina e ical (Tels a ) en condiciones es é iles. Los ma e iales y soluciones no es é iles ue on es e ilizados en un au ocla e du an e 21 min a 1 a mos e a de p esión y a una empe a u a de 121 ºC o il ados a a és de memb anas es é iles de 0,22 µm (Millipo e). Las células se obse a on en un mic oscopio in e ido Leica y su ecuen o se ealizó en una cáma a de Neubaue . 3.6.1 Líneas celula es En es e es udio se abajó con la línea celula MC-38, línea de i ada de un adenoca cinoma de colon que se indujo químicamen e median e la inyección subcu ánea de dime ilhid acina (DMH) en a ones hemb a C57BL/6 (595). Es a ue cedida amablemen e a nues o labo a o io po el D . Ped o Be aondo López (Cen o de In es igación médica aplicada (CIMA), Uni e sidad de Na a a). También se abajó con una sublínea de células RAW 264.7, una línea celula modelo que ac úa como un p ecu so pa a la o mación de OCs, y que esponde a es ímulos os eoclas ogénicos, incluidos RANKL y TNF-α (596). 3.6.2 Man enimien o de los cul i os celula es La línea celula CM-38 se cul i ó en medio de Eagle modi icado po Dulbecco (DMEM, Lonza) suplemen ado con 10 % ( / ) de sue o e al bo ino (SFB) y los an ibió icos penicilina (100 U/ml) y es ep omicina (100 µg/ml) (Sigma). De o ma u ina ia el cul i o se ealizó en ascos de cul i o de 25 o 75 cm2, con apón con il o (The mo Scien i ic), en un olumen de 5 y 15 ml espec i amen e. Pa a el man enimien o las células se semb a on habi ualmen e a una densidad inicial de 5x104 cel/ml. Pa a hace los expe imen os la densidad celula inicial dependió del ipo de expe imen o y los obje i os que se pe seguían. La línea celula RAW 264.7 se cul i ó en DMEM suplemen ado con L- glu amina 4 mM (Sigma), bica bona o de sodio 1,5 mg/ml (PanReac), glucosa Ma e iales y Mé odos 117 4,5 mg/ml (PanReac), pi u a o de sodio 1,0 mM (Sigma), 10 % ( / ) de FBS y 2 mM de los an ibió icos penicilina (100 U/ml) y es ep omicina (100 µg/ml). Las células se cul i a on en un incubado con egulación de lujo de CO2 a 37 ºC, en ai e sa u ado de humedad y con un 5 % de CO2. Una ez alcanzada la densidad de sa u ación en es as condiciones, se es ablecie on subcul i os de i ados de los iniciales. Pa a ello, las células MC-38 se despega on median e incubación con ipsina/EDTA (Sigma), a 37 ºC du an e 5 min. T anscu ido ese iempo se añadie on 5 ml de medio con sue o pa a inac i a la ipsina, se ans i ie on las células a ubos de ondo cónico y se cen i uga on du an e 5 min a 300 xg (20 ºC). Se eliminó el sob enadan e y se esuspendie on las células en medio esco. A con inuación se de e minó el núme o de células y su iabilidad ( inción po exclusión con azul T ypan, Sigma) con ayuda de una cáma a de Neubaue y un mic oscopio óp ico, y se ol ie on a semb a en el olumen de medio esco necesa io pa a log a las densidades celula es iniciales eque idas según los di e en es expe imen os. En el caso de la línea RAW 264.7, se eliminó el medio gas ado, se ag egó medio esco y se despega on las células usando un aspado de células (The mo Scien i ic). Inmedia amen e se ag egó 0.01 ml de la suspensión celula a 0.09 ml de medio esco en un ubo de mic ocen í uga. Se con a on las células usando un hemoci óme o, se calculó la concen ación celula y se semb a on a las densidades celula es eque idas pa a ealiza los expe imen os pos e io es. 3.6.3 Congelación y descongelación de células Las líneas celula es se almacena on congeladas en ni ógeno líquido, según el siguien e p ocedimien o: las células se cul i a on has a alcanza su densidad de sa u ación, se con a on, se cen i uga on a 300 xg du an e 5 min y, as elimina el sob enadan e, se esuspendie on en su medio de cul i o habi ual con un 10 % de dime ilsul óxido (DMSO, Sigma) a una densidad celula de 5-10 x 106 cel/ml. Rápidamen e se hicie on alícuo as en c io ubos es é iles y se Ma e iales y Mé odos 118 congela on a -80 ºC du an e 24-72 h. Finalmen e, se aslada on a un con enedo de ni ógeno líquido, has a el momen o de su u ilización. La descongelación se ealizó median e la adición g adual de medio de cul i o a empe ado a las células. A con inuación, la suspensión se cen i ugó du an e 5 min a 300 xg y luego se esuspendie on las células en 5 ml de medio suplemen ado con 10 % de SFB. 3.6.4 Con aje y de e minación de la iabilidad celula Pa a de e mina la iabilidad celula se u ilizó la inción po exclusión con azul T ypan (Sigma). Las células mue as, que han pe dido la in eg idad de su memb ana, son pe meables a es e colo an e y adquie en una onalidad azulada, mien as que en las células i as y/o apop ó icas, que oda ía man ienen su memb ana plasmá ica in ac a, no ocu e es o. Pa a el ecuen o celula se omó una alícuo a de 50 µl de la suspensión celula , y se mezcló con el mismo olumen de una solución es é il al 0,4 % de azul T ipán en NaCl 0,15 M. Es a mezcla se deposi ó sob e la cáma a Neubaue y se p ocedió a su ecuen o en un mic oscopio. La iabilidad celula se e aluó conside ando el po cen aje de células no colo eadas ( iables) espec o al núme o o al de células. Todos los expe imen os con las líneas celula es u ilizadas se ealiza on pa iendo de una iabilidad celula de al menos un 85 %. 3.6.5 Inac i ación del complemen o en el sue o e al bo ino El sue o añadido al medio de cul i o siemp e se decomplemen ó pa a e i a así la lisis de las células po el sis ema del complemen o. Pa a ello, el sue o se incubó du an e 30 min a 56 ºC en baño é mico y anscu ido es e iempo se cen i ugó 15 min a 2.000 xg. El sob enadan e se ecogió en un ubo de ondo cónico y se congeló has a su pos e io uso. 3.6.6 Gene ación de OCs a pa i de di e en es p ecu so es Las células de la médula ósea se aisla on de los huesos la gos de las ex emidades pos e io es de a ones de en e 3-4 semanas de edad. Se Ma e iales y Mé odos 119 incuba on las células ex aídas de la médula du an e 2 h a 37 ºC, pa a elimina las células adhe en es. Pos e io men e, se cul i a on 5x105 cel/pocillo de células mononuclea es no adhe en es en medio α-MEM suplemen ado con an ibió icos y 10 % de SFB, inac i ado po calo . Seguidamen e, las células se a a on con las concen aciones eque idas de GzmA ac i a, con oles posi i os o solo medio (con ol nega i o). El 50 % del medio ue eemplazado en días al e nos, has a el día 6. Pa a gene a unidades o mado as de colonias de g anuloci os/monoci os (CFU-GM), se cul i a on 5x104 células no adhe en es de médula ósea de a ón, aisladas de a ones w o TNF-α-/- de 3-4 semanas (Cha les Ri e s, Maine). Se cul i a on en p esencia de me ilcelulosa (Sigma) y GM-CSF ecombinan e (2 ng/ml) (Pep o ech), en placas de 35 mm du an e 4 días. Después, las células ue on disociadas y se semb a on 104 cel/pocillo (en placas de 96 pocillos) pa a el ensayo de o mación de OCs (589). Pa a e i a la con aminación con células acceso ias, du an e la di e enciación de OCs a pa i de p ecu so es de la médula ósea, en algunos expe imen os se u iliza on células RAW 264.7 como uen e de p ecu so es de OCs. En es e caso, una ez que las células alcanza on la con luencia, se cul i a on a la densidad eque ida en placas de 96 pocillos y se les añadie on los es ímulos necesa ios du an e 5-6 días. Pa a la medición de la o mación de OCs, en los di e en es ipos celula es p ecu so es de OCs, se u ilizó el ensayo de la ac i idad de la os a asa ácida a a o esis en e (TRAP, del inglés “Ta a e Resis an Acid Phospha ase”). Pa a ello, las células se ija on con o malina al 3 % du an e 10 min y se incuba on con el ki pa a la inción de células TRAP+ (Sigma Chemical Inc. S Louis, MO) du an e 1 h. Pos e io men e, las células se con a iñe on con una solución de hema oxilina. Se con a on y midie on el núme o de OCs mul inucleados desa ollados po pocillo, conside ando como os eoclas os a las células posi i as pa a TRAP, que enían más de es núcleos po célula (589). Como con ol posi i o, las células ue on es imuladas con 1,25-dihyd oxy i amin D3 (1,25-D3) (Calbiochem), RANKL (50 ng/ml) (Bio ech) y/o M-CSF (25 ng/ml) (Pep o ech). Ma e iales y Mé odos 120 3.6.7 Gene ación de mac ó agos M1 de i ados de la médula ósea (BMDM) Pa a la ob ención de BMDM, se u iliza on a ones de ondo gené ico C57BL/6 a los que, as se some idos a eu anasia en cáma a de CO2, se les ex aje on las ex emidades pos e io es. T as elimina cuidadosamen e la piel y el músculo, se la a on con e anol al 70 % y DMEM, se co a on asép icamen e los ex emos de los huesos, pa a deja al descubie o la médula ósea y se eluye on las células inyec ando 5 ml de medio DMEM a a és de la ca idad ósea. A con inuación, es a suspensión se homogenizó y se il ó median e un il o és e il de nylon de 100 µm. Seguidamen e se lisa on los e i oci os y la suspensión se cen i ugó a 300 xg du an e 5 min. Las células ob enidas se esuspendie on en medio RPMI 1640 suplemen ado con Glu amax, 10 % de SFB, 2 mM de penicilina (100 U/ml) y 2 mM de es ep omicina (100 µg/ml) y con 10 % de sob enadan e de la línea X- 63Ag8653 como uen e de GM-CSF (597). Pos e io men e, se ajus ó la concen ación a 1x106 cel/ml y se semb a on 10 ml en placas de cul i o es é iles de 90 mm. Al e ce día, se eliminó el sob enadan e, las placas se la a on 2 eces con PBS y se les adicionó 10 ml de medio GM-CSF esco. Es e p ocedimien o se epi ió al sex o día. El no eno día, se eliminó nue amen e el sob enadan e, se la ó dos eces con PBS y se adiciona on 3 ml de ipsina po placa. T as una incubación de 15 min a 37 ºC con 5 % de CO2, se añadie on 5 ml de medio RPMI suplemen ado con 5 % de SFB, se ecogie on las células en ubos es é iles de ondo cónico y se cen i uga on du an e 5 min a 300 xg. Una ez eliminado el sob enadan e, las células se esuspendie on nue amen e en 10 ml de RPMI suplemen ado con 5 % de SFB, se con a on, se semb a on 5x104 cel/pocillo en placas de 96 pocillos de ondo plano o 2x105 cel/pocillo en placas de 48 pocillos (Cos a ) y se incuba on a 37 ºC con 5 % de CO2 pa a se u ilizadas en los expe imen os del día siguien e. Al cabo de 10 días, los mac ó agos es aban comple amen e di e enciados, mos ando un eno ipo CD11b+ F4/80+, analizado median e ci ome ía de lujo. Ma e iales y Mé odos 121 3.6.8 Análisis de la exp esión de IL-6 inducida po GzmA ex acelula en mac ó agos M1 Los mac ó agos p oin lama o ios M1 se gene a on a pa i de la médula ósea u ilizando el p o ocolo explicado en el apa ado an e io . Al cabo de 7 días, se es imula on con GzmA ac i a (300 nM) o GzmA inac i ada con el inhibido especí ico se pinb6b (2,4 µM) y LPS de E. coli (100 ng/ml) (Sigma), como con ol posi i o. Pa a analiza el papel de la ía NF-kB en la exp esión de IL-6 inducida po GzmA, los mac ó agos se a a on con el inhibido especí ico de NF-kB, Celas ol (Sigma), du an e 1 h an es de la adición de GzmA. Los mac ó agos se incuba on du an e 24 h a 37 ºC y 5 % de CO2, anscu ido ese iempo se ecogie on los sob enadan es y se cuan i ica on los ni eles de IL-6 median e ELISA ( e sección 3.2.3.1). 3.6.9 Ac i ación in i o de las ías p-STAT3 y NFκB en MC-38 Pa a lle a a cabo es e expe imen o, las células de la línea MC-38 se semb a on (1x106 cel/pocillos) en DMEM suplemen ado con 10 % ( / ) SFB, L- glu amina 2 mM y los an ibió icos penicilina (100 U/ml) y es ep omicina (100 µg/ml). Cuando las células se adhi ie on, se eliminó el medio y se añadió DMEM sin SFB y se cul i a on du an e 16 h a 37 ºC al 5 % de CO2. Pos e io men e, se e i ó el medio a las células y se añadie on los sob enadan es de mac ó agos sin es imula y p e iamen e es imulados con GzmA ecombina e de a ón (300 nM) o 100 ng/ml de LPS. Como con ol posi i o se añadie on 50 ng/ml de IL-6 de a ón (Mil enyi). Las células se lisa on 15 min después de la adición de los es ímulos ( e sección 3.2.4.1). La concen ación de p o eínas o ales se de e minó usando Quick S a TM B ad o d P o ein Assay ( e sección 3.2.2). Pos e io men e se ealizó un wes e n-blo u ilizando los an icue pos co espondien es pa a isualiza y cuan i ica la exp esión de p-STAT3, NFκB e IkBα. La cuan i icación se ealizó po densi ome ía, con la ayuda del so wa e ImageJ ( e sección 3.2.4.4). Ma e iales y Mé odos 122 3.7 De e minación de la co elación en e GZMA e in lamación en mues as de CCR humano Se u iliza on da os de exp esión génica de un conjun o de 98 ejidos umo ales de pacien es con CCR (p oyec o Colonomics: www.colonomics.o g, NCBI BioP ojec PRJNA188519). B e emen e, el RNA ex aído de cada mues a se hib idó en chips A yme ix Genoma Humano U219 y se analizó bajo el p o ocolo es ánda (598). Tan o los da os sin p ocesa como los no malizados es án disponibles en la base de da os Omnibus de exp esión génica (GEO) a a és del núme o de acceso GSE44076. Todos los pacien es es aban en es adio II, MSS, a ados con ci ugía adical y no ecibie on quimio e apia adyu an e. Fue on eclu ados en el Hospi al Uni e si a io de Bell i ge (España) en e el año 1998 y 2002, die on su consen imien o in o mado po esc i o y el Comi é de É ica del hospi al ap obó el p o ocolo con la e e encia PR074 / 11. Los da os ansc ip ómicos se usa on pa a explo a genes cuya exp esión es aba asociada con la exp esión de GZMA y GZMB. La co elación de Spea man se calculó pa a gene a una lis a de genes clasi icados y o denados po su ni el de co-exp esión con ambos genes. Pos e io men e, se u ilizó el algo i mo GSEA (del inglés, “Gene Se En ichmen analysis) (599) en es as lis as clasi icadas pa a iden i ica el en iquecimien o en ías celula es y unciones especí icas. La co elación de Spea man se calculó pa a e alua si exis e una elación en e la pun uación in lama o ia y la exp esión GZMA/GZMB. El mismo análisis se ealizó es a i icando las mues as según la clasi icación CMSs de las mismas. Los modelos de eg esión lineal ambién se ajus a on pa a calcula los alo es de R2 y p en cada caso. Pa a alida es os esul ados, se desca gó un conjun o de da os de exp esión génica del eposi o io de GEO (GSE39582), la cual comp endía 566 mues as humanas de CCR con ca ac e ís icas clínico-pa ológicas dis in as. Es a base de da os incluye pacien es en es adio 0 a IV, an o con MSI como MSS, y que ecibie on di e en es a amien os (331). Finalmen e, los umo es se Ma e iales y Mé odos 123 clasi ica on en los cua o sub ipos molecula es de consenso, CMS1 a CMS4, usando el paque e clasi icado R de CMSs (333). 3.8 Análisis es adís ico El análisis es adís ico se ealizó u ilizando el so wa e G aphPad P ism. La di e encia en e las medias de las mues as no pa eadas se ealizó u ilizando el ANOVA de dos ías o el ANOVA de una ía con la p ueba pos e io de Bon e oni o la p ueba -s uden no pa eada. Las cu as de supe i encia se compa a on u ilizando la p ueba de log ank y la p ueba de Gehan-Wilcoxon. La incidencia de umo es se analizó u ilizando una p ueba exac a de Fishe . Los esul ados se dan como el in e alo de con ianza (p), y se conside an signi ica i os cuando p <0.05. Las éplicas biológicas se conside an como el núme o de a ones indi iduales. RESULTADOS Y DISCUSIÓN Bibliog a ía 220 252. Benede i G, Miossec P. In e leukin 17 con ibu es o he ch onici y o in lamma o y diseases such as heuma oid a h i is. Eu opean jou nal o immunology. 2014;44(2):339-47. 253. Ga en SL. The ole o in e leukin-17 in he pa hogenesis o heuma oid a h i is. Cu en heuma ology epo s. 2009;11(5):365-70. 254. Suu mond J, Do jee AL, Boon MR, Knol EF, Huizinga TW, Toes RE, e al. 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