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2021 36 Elisa Abás Benedí Complejos de Au(I) y Au (III): una posible alternativa a la quimioterapia actual Departamento Director/es Química Inorgánica Laguna Castrillo, Mariano Grasa López, Laura © Universidad de Zaragoza Servicio de Publicaciones ISSN 2254-7606 Elisa Abás Benedí COMPLEJOS DE AU(I) Y AU(III): UNA POSIBLE ALTERNATIVA A LA QUIMIOTERAPIA ACTUAL Director/es Química Inorgánica Laguna Castrillo, Mariano Grasa López, Laura Tesis Doctoral Autor 2019 UNIVERSIDAD DE ZARAGOZA Repositorio de la Universidad de Zaragoza – Zaguan http://zaguan.unizar.es Mariano Laguna Castrillo, Profesor de Investigación del Consejo Superior de Investigaciones Científicas (CSIC) del Instituto de Síntesis Química y Catálisis Homogénea (ISQCH). Laura Grasa López, Profesora Titular de la Universidad de Zaragoza del Departamento de Farmacología y Fisiología. INFORMAN FAVORABLEMENTE sobre la presente Memoria titulada “Complejos de Au(I) y Au(III): una posible alternativa a la quimioterapia actual”, presentada por Dña. Elisa Abás Benedí, y realizada en el Departamento de Química Inorgánica de Universidad de Zaragoza y en el Instituto de Síntesis Química y Catálisis Homogénea (ISQCH), bajo nuestra dirección. Así AUTORIZAN su presentación para que sea calificada como Tesis Doctoral. En Zaragoza a 19 de Noviembre de 2018 Fdo.: Prof. Mariano Laguna Castrillo Fdo.: Dra. Laura Grasa López ÍNDICE I.RESUMEN II.ABREVIATURAS INTRODUCCIÓN 1 EL APARATO DIGESTIVO Y EL COLON 2 FUNCIONES DEL APARATO DIGESTIVO 2 EL COLON: ANATOMÍA E HISTOLOGÍA 2 EPIDEMIOLOGÍA, ETIOLOGÍA Y DESARROLLO DEL CÁNCER DE COLON 4 EPIDEMIOLOGÍA DEL CÁNCER DE COLON 4 ETIOLOGÍA DEL CÁNCER DE COLON 5 DESARROLLO DEL PROCESO TUMORAL 5 CICLO CELULAR Y PROLIFERACIÓN CELULAR 8 MUERTE CELULAR PROGRAMA: APOPTOSIS 10 EXTERNALIZACIÓN DE FOSFATIDILSERINA 10 CASCADA DE LAS CASPASAS 11 ESPECIES REACTIVAS DE OXÍGENO (ROS) 13 TIORREDOXINA REDUCTASA (TRXR) 15 TRATAMIENTO DEL CÁNCER DE COLON 16 DESARROLLO DE NUEVOS FÁRMACOS BASADOS EN ORO 18 NUEVOS COMPLEJOS DE AU(I) 19 NUEVOS COMPLEJOS DE AU(III) 21 Complejos ciclometalados de Au(III) con ligandos C,N-dadores. 23 BIBLIOGRAFÍA 25 DISCUSIÓN DE RESULTADOS (I): SÍNTESIS Y CARACTERIZACIÓN 33 COMPLEJOS DE AU(III) 33 Productos de partida: [AuCl3(HL)] y [AuCl2L] 34 Síntesis de derivados ciclometalados de Au(III) 42 COMPLEJOS DE AU(I) 67 BIBLIOGRAFÍA 72 DISCUSIÓN DE RESULTADOS (II): ESTUDIOS BIOLÓGICOS 77 ESTUDIOS FARMACODINÁMICOS 77 ESTUDIOS DE VIABILIDAD CELULAR Y DETERMINACION DE IC50 79 Complejos de Au(I) 80 Complejos de Au(III) 83 ESTUDIOS DEL CICLO CELULAR Y APOPTOSIS 87 ESTUDIO DEL CICLO CELULAR Y PROLIFERACIÓN CELULAR 87 ESTUDIO DE LA MUERTE CELULAR PROGRAMADA (APOPTOSIS) 91 Estudio de mecanismos de Apoptosis: Fosfatidilserina 93 Estudio de mecanismos de apoptosis: Caspasas 95 MECANISMOS DE ACCIÓN: ESTRÉS OXIDATIVO 99 EVALUACIÓN DE LA OXIDACIÓN PROTEÍCA 101 EVALUACIÓN DE OXIDACIÓN LIPÍDICA 104 ESTUDIO DE LA ACTIVIDAD DE LA TIORREDOXINA REDUCTASA (TRXR) 106 ESTUDIOS CON CULTIVOS PRIMARIOS DE TUMORES DE RATÓN 110 BIBLIOGRAFÍA 114 ESTUDIOS FARMACOCINÉTICOS 119 COEFICIENTE DE REPARTO OCTANOL/AGUA: LOGPOW 120 ESTABILIDAD EN CONDICIONES FISIOLÓGICAS 124 INTERACCIÓN CON PROTEÍNAS DE TRANSPORTE: ASB 131 BIBLIOGRAFÍA 143 PARTE EXPERIMENTAL 147 Espectroscopia Infrarroja (IR) 147 Resonancia Magnética Nuclear (RMN) 147 Espectrometría de Masas (MS) 147 Análisis elemental cuantitativo 147 Espectrofluorímetro 147 Espectrofotometría Ultravioleta Visible 147 Difracción de rayos X 148 SÍNTESIS Y CARACTERIZACIÓN 148 PRODUCTOS DE PARTIDA DE AU(I) Y AU(III) 148 COMPLEJOS CICLOMETALADOS DE AU(III): [AUCL2L] 148 COMPLEJOS DE AU(III) CON DERIVADOS PIRIMIDÍNICOS 148 COMPLEJOS DE AU(III) CON TIOUREA 152 COMPLEJOS DE AU(III) CON ACETATOS 154 COMPLEJOS DE AU(III) CON AMINOÁCIDOS 155 COMPLEJOS DE AU(III) CON RESIDUOS ALQUINILO 157 MATERIALES Y MÉTODOS: ESTUDIOS FARMACOCINÉTICOS 160 COEFICIENTE DE DISTRIBUCIÓN (LOG P7.4) 160 ESTABILIDAD TÉRMICA EN DISOLUCIÓN 161 ESTUDIO DE LA INTERACCIÓN DE LOS COMPLEJOS CON ASB 161 MATERIALES Y MÉTODOS: ESTUDIOS FARMACODINÁMICOS 162 CULTIVO DE LA LÍNEA CELULAR CACO-2/TC7 162 EQUIPOS 162 MEDIO DE CULTIVO 163 CRIOCONSERVACIÓN Y DESCONGELACIÓN DE CÉLULAS CONGELADAS 163 MANTENIMIENTO Y SIEMBRA DE LA LÍNEA CELULAR CACO-2 163 TRATAMIENTO DE LAS CÉLULAS 165 ESTUDIO DE LA CITOTOXICIDAD DE LOS COMPUESTOS MEDIANTE MTT: CÁLCULO DE IC50. 165 ESTUDIOS DE CITOMETRÍA DE FLUJO 167 ESTUDIO DEL CICLO CELULAR 168 ESTUDIO DE APOPTOSIS: DETECCIÓN DE FOSFATIDILSERINA 169 ESTUDIO DE APOPTOSIS: DETERMINACIÓN DE LA ACTIVIDAD DE LA CASPASA 3/7. 170 ESTUDIOS DE ESTRÉS OXIDATIVO 172 PREPARACIÓN DE HOMOGENADOS CELULARES: EXTRACCIÓN DE PROTEÍNAS 172 ESTRÉS OXIDATIVO EN PROTEÍNAS: DETERMINACIÓN DE GRUPOS CARBONILOS 172 ESTRÉS OXIDATIVO EN LÍPIDOS: DETERMINACIÓN DE MDA+4-HDA 173 DETERMINACIÓN DE LA CONCENTRACIÓN DE PROTEÍNAS POR EL MÉTODO DE BRADFORD 174 ESTUDIO DE LA ACTIVIDAD ENZIMÁTICA DE LA TIORREDOXINA REDUCTASA 175 ESTUDIOS EN CULTIVOS PRIMARIOS 177 MODELO MURINO DE CÁNCER DE COLON 177 CULTIVOS PRIMARIOS DE COLON DE RATÓN 177 ANÁLISIS DE DATOS Y HERRAMIENTAS INFORMÁTICAS 179 BIBLIOGRAFÍA 180 CONCLUSIONES 181 RESUMEN Este trabajo ha buscado la síntesis de nuevos complejos de Au(III) y Au(I) capaces de actuar como fármacos antitumorales, y que mejoren las terapias actuales contra el cáncer de colon. Así, en la primera parte de esta investigación se recogen los esfuerzos realizados para desarrollar un procedimiento general para la obtención de complejos ciclometalados de Au(III) viables a nivel industrial y compatibles con el medio ambiente. Aunque este objetivo no se ha conseguido, sí se han mejorado las condiciones de reacción propuestas en la bibliografía. Así, se han sintetizado los complejos ciclometalados, [AuCl2L] con L= tolilpiridina (tpy), fenilpiridina (ppy) y bencipiridina (bzp) a partir de sus precursores [AuCl3HL] por calentamiento en estado sólido los dos primeros, y por calentamiento en MeCN/H2O el derivado con bzp. Una vez obtenidos éstos, se han sustituido los átomos de cloro por grupos S-dadores (grupos tiopirimidínicos y tioureas), grupos O-dadores (unidades acetatos y aminoácidos) y grupos C-dadores (residuos alquinilos aromáticos). Estos complejos han sido caracterizados por las técnicas habituales, incluyendo difracción de rayos X para dos de los complejos sintetizados: [Au(C≡CToliPh)(tpy)] y [AuCl(Spym)(ppy)]. Además, también se recoge la preparación de complejos de Au(I) con el fosfano soluble en agua, trisdimetilaminofosfano (HMPT), y grupos S-dadores y Cdadores. De algunos de estos derivados, también se ha conseguido resolver la estructura cristalina por difracción de rayos X: [Au(4-OMe-fenilacetileno)HMPT], [Au(Tolilacetileno)HMPT], [Au(2-Mercapto-4,6Dimetilpirimidina)HMPT] y [Au(2-Mercaptobenzotiazol)HMPT]. Una vez caracterizados los derivados de Au(I) y Au(III), se han estudiado sus propiedades anticancerígenas frente a tumores de colon. En primer lugar, se han realizado estudios de viabilidad celular por el método colorimétrico MTT, por el que se ha observado que mientras los derivados de Au(I) son bastante activos frente a las células tumorales de carcinoma de colon humano (línea celular Caco-2/TC7), solo unos pocos derivados de Au(III) tienen un limitado efecto sobre la viabilidad de estas células. Este estudio, en conjunción con otros realizados en células de la misma línea celular que se pueden considerar células epiteliales normales, ha permitido seleccionar aquellos compuestos citotóxicos y selectivos a células tumorales. Los complejos que muestran esta selectividad, son los derivados de Au(I), y por ello, han sido escogido para profundizar sobre su mecanismo de acción. En concreto, se han realizado estudios de ciclo celular, apoptosis y estrés oxidativo en células Caco-2. Los complejos de Au(I) son capaces de producir alteraciones en el ciclo de las células tumorales Caco-2. Los estudios de apoptosis han permitido concluir que los complejos son inductores de apoptosis, puesto que se ha podido detectar fosfatidilserina (PS) en la capa externa de la membrana celular; sin embargo, estos complejos no desencadenan la cascada de las caspasas para la muerte celular programa (MCP). Esta MCP no parece iniciarse por daño oxidativo en proteínas, ya que no se han encontrado proteínas carboniladas; pero sí se ha detectado daño en los lípidos de membrana a través del método de cuantificación de especies hidroxialquenales (HDA) y malondiadehído (MDA). Este estrés oxidativo podría explicarse por la inhibición de la proteína antioxidante tiorredoxina reductada (TrxR), ya que se han realizado estudios donde se comprueba como la mayoría de los complejos de Au(I) sintetizados, provocan la inhibición de esta proteína. Asimismo, y en un esfuerzo por simular de una forma más realista el cáncer de colon, se han realizado estudios en cultivos primarios de tumores de colon de ratones tratados con azoximetano y dextrano sulfato de sodio. Las células provenientes de los tumores resultantes, han sido sembradas y utilizadas para la realización de un nuevo estudio de MCP por externalización de PS, en el que se ha observado como todos los complejos de Au(I) son pro-apoptóticos. En base a todos estos estudios, se ha podido concluir que los complejos de Au(I) son más citotóxicos que los derivados de Au(III); la mayoría de los derivados de Au(I) han resultado ser selectivos a células tumorales Caco-2, especialmente los complejos con unidades acetileno. De entre los derivados estudiados de Au(I), los complejos con etinil piridina así como con Cl y Br etinil benceno han resultado ser los que tienen efecto en más dianas terapeúticas, siendo por lo tanto, los mejores candidatos para ser una alternativa a la quimioterapia actual. Capítulo I: Introducción pág. 1 INTRODUCCIÓN A lo largo de la historia, desde los primeros homínidos hasta el hombre actual, los seres humanos han demostrado una gran capacidad de adaptación y evolución. Esta propiedad no sólo se manifiesta a nivel individual, sino también a nivel colectivo. Además de estas características, al ser humano se le pueden atribuir muchas otras cualidades como la sociabilización, la curiosidad o/y la empatía. De hecho, puede ser que estos tres últimos rasgos hayan sido los que hayan impulsado al ser humano a evolucionar. El motor que ha potenciado que el hombre tenga necesidad de conocer y comprender aquello que le rodea es la curiosidad; pero el intentar aplicar lo que conoce a mejorar el estilo y calidad de vida propio y del resto de la sociedad se explican por esa empatía y evolución. Analizar, estudiar e intentar comprender un proceso, una transformación o una forma de vida es, a grandes rasgos, lo que llamamos investigación; y siempre tiene como fuerza impulsora el poder aprovechar ese conocimiento adquirido en alas del desarrollo común. Así, el hombre ha conseguido entender y controlar gran parte de la naturaleza, aunque aún quedan muchas incógnitas, principalmente en lo que a su propio cuerpo se refiere. Así pues, nuestra calidad de vida ha mejorado de forma considerable con el desarrollo de nuevos materiales, energías más eficientes e infraestructuras más resistentes. Sin embargo, en relación con el control de ciertos procesos metabólicos y enfermedades existe aún un gran camino por recorrer. Si bien es cierto que ya hemos sido capaces de desarrollar medicamentes para muchas enfermedades, todavía hay mucho trabajo no sólo en la lucha contra determinadas enfermedades sino también en el perfeccionamiento de las terapias actuales. Estas mejoras deben centrarse tanto en conseguir medicamentos más eficaces, como en que los pacientes puedan llevar una vida normal y cómoda durante el tratamiento en cuestión, puesto que, como ya se ha mencionado, una investigación necesaria es aquella que beneficia a la calidad de vida de la sociedad. Este ha sido el motivo de la investigación que aquí se recoge, diseñar nuevos fármacos que combatan el cáncer de colon de la forma más selectiva posible, para minimizar los posibles efectos secundarios. A día de hoy, cada tipo de cáncer se aborda de una forma diferente, aunque se pueden considerar básicamente tres tratamientos: cirugía, quimioterapia y/o radioterapia. Aunque estas terapias son las más extendidas, hay otros tratamientos muy prometedores, como por ejemplo la inmunoterapia. La inmunoterapia se erige como el futuro de la lucha contra el cáncer, de hecho, los investigadores James P. Allison y Tasuku Honjo, recibieron el Premio Nobel de Medicina en 2018 por sus avances en este campo. Esta alternativa busca potenciar el propio sistema inmunitario del paciente para que sea éste y no un agente externo, quien luche contra la enfermedad. Su limitación es precisamente ésta, puesto que no es aplicable a tumores que se esconden a la respuesta inmunitaria, los conocidos como tumores fríos, como el cáncer de mama, algunos de pulmón y ciertos tumores gástricos. Así pues, mientras se investiga en nuevas formas de tratamiento, la quimioterapia sigue siendo la más aplicada. En lo que se refiere al uso de quimioterápicos antitumorales, lo más habitual es el uso de un cóctel de fármacos entre los que se incluye un complejo metálico: cis-platino. No obstante, sus efectos secundarios son bien conocidos y están bien establecidos; por ello, una mejora de este cóctel o el desarrollo de un fármaco capaz por si sólo de combatir la enfermedad, sigue siendo la asignatura pendiente de la comunidad científica. El aparato digestivo y el colon pág. 2 EL APARATO DIGESTIVO Y EL COLON Como ya se ha comentado, el hombre ha conseguido entender y comprender gran parte de los procesos que le rodean, incluso los que tienen lugar en su propio cuerpo. Este hecho ha sido determinante para poder desarrollar fármacos que actúen sobre los distintos procesos del organismo, sin alterar el correcto funcionamiento del mismo. Por ello, en primer lugar, se ha creído necesario realizar una breve explicación sobre el aparato digestivo, y más concretamente sobre el colon, puesto que es el órgano en el que se va a centrar esta tesis doctoral. FUNCIONES DEL APARATO DIGESTIVO El aparato digestivo desempeña un papel fundamental en la homeostasis del organismo, ya que va ser él quien traslade agua, electrolitos y nutrientes desde el medio externo al interno. El proceso de digestión consta de cuatro partes bien diferenciadas:1 ¨ Digestión, que consiste en la obtención de unidades absorbibles de los alimentos mediante su degradación química y mecánica. ¨ Absorción, que supone la transferencia de estas unidades desde la luz intestinal al medio extracelular. ¨ Motilidad, proceso por el cual el alimento de mueve a través del tubo digestivo. ¨ Excreción, que consiste en la transferencia de sustancias y electrolitos desde el medio extracelular a la luz intestinal. Así, el alimento entra al aparato digestivo por la cavidad oral, compuesta por boca y faringe, y llega al estómago a través del esófago. En el estómago, mediante la secreción de ácidos y enzimas, tiene lugar la mayor parte de la digestión química. El resto de los procesos que conforman la digestión, así como la absorción de los productos de digestión, tienen lugar en el intestino delgado. A medida que la materia desciende por el tubo digestivo, órganos como páncreas o el hígado también secretan las enzimas pancreáticas y la bilis, respectivamente, para formar una mezcla en la luz del intestino llamada quimo. El resto del alimento no absorbido pasa al intestino grueso, donde se absorbe agua y electrolitos, y se forman las heces, para ser finalmente excretadas por el ano, mediante movimientos conocidos como movimientos en masa (defecación). EL COLON: ANATOMÍA E HISTOLOGÍA El aparato digestivo consta de varias partes: la cavidad oral, el tubo digestivo y los órganos de las glándulas accesorias. El tubo digestivo es un tubo largo que atraviesa el cuerpo y lo conforman el esófago, el estómago y los intestinos delgado y grueso. La pared de estos órganos digestivos es muy similar entre ellos, aunque con pequeñas diferencias en función de las funciones específicas que desempeña cada órgano. Así, la pared del tubo digestivo está compuesta por cuatro capas: la capa más interna es la mucosa, debajo de ésta se encuentra la submucosa, seguida una capa de músculo liso y, finalmente, la capa más externa es la serosa.1 El aparato digestivo y el colon pág. 3 La investigación que aquí se ha llevado a cabo, se ha centrado en el estudio del tratamiento del cáncer de colon, por lo que esta es la zona en la que se va a profundizar. El colon forma parte del intestino grueso, el cual presenta la siguiente estructura: ¨ Ciego, con una longitud aproximada de 6 cm, es la zona siguiente al intestino delgado. Aquí continúa el proceso de absorción de agua y nutrientes. ¨ Colon y recto, ambas partes son estructuras musculares tubulares, pero de diferente longitud, pues mientras en la edad adulta el colon mide cerca de 120 cm, el recto tan sólo 16 cm. La función principal del colon, como ya se ha comentado, es la absorción de agua y nutrientes de los alimentos ingeridos, y el resto lo convierte en heces que pasarán al recto para ser excretadas. ¨ Canal anal, la última parte del intestino grueso, con una longitud entre 4-5 cm. Éste se abre al exterior por el ano, punto de salida de la materia fecal. La pared del colon tiene las mismas capas que las mencionadas anteriormente, tal y como se puede observar en la Figura 1.1 (mucosa, submucosa, muscular y serosa), aunque presenta algunas diferencias respecto a la pared del resto de zonas del tracto gastrointestinal. Figura 1.1. Esquema del corte transversal de la pared del colon.1 ¨ La capa mucosa es la capa más interna y la más gruesa. Está formada por tejido epitelial columnar simple y presenta criptas intestinales profundas, sin las vellosidades observadas en el intestino delgado. El epitelio está formado por células caliciformes, que secretan moco; células endocrinas, que secretan hormonas; y células madre basales; así como células absortivas (colonocitos) con un borde apical en cepillo. Por debajo de la capa epitelial, se encuentra la lámina propia, formada por tejido conectivo, que mantiene el epitelio en su lugar, y contiene vasos sanguíneos y linfáticos, a los que entran los nutrientes absorbidos. En la lámina propia aparece también tejido linfoide que forma pequeños nódulos linfáticos. Por último, la muscularis mucosae o muscular de la mucosa, es una capa delgada de músculo liso, que separa la mucosa de la submucosa. Es de destacar, que es precisamente en esta capa mucosa, y en concreto en las células epiteliales, donde se desarrolla el proceso canceroso, objeto de estudio de esta tesis. Glándulas intestinales Muscularis mucosae Submucosa Nódulo linfoide Músculo circular Capa longitudinal (tenias colónicas) Muscular externa El aparato digestivo y el colon pág. 4 ¨ La submucosa es una capa compuesta por tejido conectivo con vasos sanguíneos y linfáticos más grandes y contiene el plexo submucoso o de Meissner, una de las dos redes nerviosas mayores del Sistema Nervioso Entérico, que coordina la función digestiva. ¨ La capa muscular, se encuentra por debajo de la submucosa y contiene dos capas de células musculares lisas que se contraen y permiten la función de motilidad en el intestino grueso. ▪ Capa muscular longitudinal: es la capa más externa y se organiza en tres bandas longitudinales llamadas tenias colónicas. ▪ Capa muscular circular: es la capa más interna, su engrosamiento produce los pliegues semilunares del colon. ¨ La capa serosa es la capa más externa, compuesta por una fina capa de tejido epitelial escamoso, cuya misión es la secreción del líquido seroso, y otra fina capa de tejido conjuntivo. Este líquido lubrica la superficie del intestino grueso protegiéndolo de la fricción con órganos, músculos y huesos circundantes. EPIDEMIOLOGÍA, ETIOLOGÍA Y DESARROLLO DEL CÁNCER DE COLON EPIDEMIOLOGÍA DEL CÁNCER DE COLON El cáncer colorrectal es el tercer cáncer más común entre los hombres y el segundo más común entre las mujeres en todo el mundo.2 En España, el cáncer colorrectal es el más diagnosticado, y es el segundo cáncer que más muertes provoca tanto en hombres como en mujeres (Figura 1.2). Son estos datos los que han promovido que esta tesis doctoral se centre en el estudio de nuevas alternativas para el tratamiento de este tipo de cáncer. Figura 1.2. Incidencia y mortalidad del cáncer registrada en España, según el tumor.3 El cáncer de colon pág. 5 ETIOLOGÍA DEL CÁNCER DE COLON El funcionamiento normal del colon se basa en el equilibrio preciso de la proliferación, diferenciación y muerte de las células epiteliales, donde alrededor de unas 1010 células se reemplazan diariamente en un colon humano.4 La regulación de estos procesos de proliferación y desprendimiento de células ocurre en las criptas, que se renuevan continuamente por la división de las células madre. Es precisamente esta regeneración celular continua, la que hace que el colon sea una zona vulnerable donde se pueden generar mutaciones malignas que desencadenen tumores.5 El inicio del proceso tumoral comienza por el cambio en una única célula. Este cambio puede ser debido a diferentes factores, bien externos o bien de tipo genético heredados; no obstante, la mayor parte de los cánceres diagnosticados están asociados con factores ambientales y/o nutricionales. Estos factores externos inductores de cáncer se denominan sustancias carcinógenas y pueden ser de varios tipos en función de su naturaleza: ¨ Carcinógenos físicos: como radiación ultravioleta o la radiación ionizante emitida por sustancias radiactivas. De hecho, se calcula que la radiación ultravioleta es la responsable del 90% de los cánceres en labios, del 50% de los melanomas y del 80% de los demás cánceres de la piel. ¨ Carcinógenos químicos: como cloruro de vinilo, componentes del humo del tabaco, aflatoxinas (un contaminante de los alimentos) o arsénico, entre otros. ¨ Carcinógenos biológicos: como infecciones de ciertos virus, bacterias o parásitos. El cáncer colorrectal (CCR) está estrechamente relacionado con ciertas mutaciones genéticas hereditarias, aunque sólo el 3-5% de los cánceres colorrectales diagnosticados se deben exclusivamente a estas mutaciones.6 Uno de los factores más influyentes en el desarrollo de CCR, es el estilo de vida, ya que se sabe que el consumo de tabaco, el alto consumo de alcohol, el bajo consumo de vegetales, la obesidad y la inactividad física implican un mayor riesgo de este tipo de cáncer. Asimismo, el uso de hormonas postmenopáusicas, el uso de fármacos antiinflamatorios no esteroideos y la ingesta elevada de calcio se asocian con un riesgo reducido.7 De esta forma, se puede concluir que los carcinógenos más relacionados con el CCR, son los de tipo químico a través de la mutación celular. DESARROLLO DEL PROCESO TUMORAL Cuando una célula sana realiza el proceso de división celular, su ADN se duplica utilizando el ADN original como base para generar la nueva copia (ADN replicado). En este proceso, los sistemas de reparación tienen un papel crucial, ya que son los responsables de corregir las mutaciones que se producen durante la replicación del ADN, como consecuencia de sustancias carcinógenas. 8-9 Sin embargo, cuando se dan varias mutaciones en el ADN, o incluso en los genes responsables del sistema de reparación del ADN (RMM), el daño no se subsana y esa célula, con información genética mutada, es replicada (Figura 1.3). Son estos errores los que derivan en la acumulación de múltiples mutaciones genéticas, que se traducen en una modificación de la mucosa intestinal, empezando por generar primero un pólipo adenomatoso hasta finalmente el adenocarcinoma. El cáncer de colon pág. 6 Figura 1.3. Esquema del funcionamiento del sistema RMM. La progresión del adenocarcinoma está controlada por una cascada de eventos que, en la mayoría de los tumores denominados esporádicos, comienza con la mutación del gen APC (adenomatous polyposis coli). De hecho, se asocia con la mayoría de los tumores colorrectales, siendo detectable en el 63% de los adenomas y el 60% de los carcinomas.10 El gen APC es un supresor tumoral que desencadena la degradación por fosforilación de la β-catenina, mediante la coordinación a ella. Así, la mutación en este gen inhibe este proceso, provocando que la concentración de β-catenina aumente; esto hace que se dé una mayor proliferación celular y una disminución de la muerte celular programa (apoptosis). De esta forma, las células mutadas van creciendo en número de forma exponencial, y es entonces cuando se da la transformación de una célula normal del epitelio a un adenoma temprano (Figura 1.4). Estos adenomas son pólipos que se forman cuando los procesos de renovación epitelial están alterados.11 Al ir creciendo el número de células epiteliales, se producen las ramificaciones características de los adenomas. Éstos desarrollarán características de malignidad e invadirán el tejido, y es en ese punto cuando se considerará un adenocarcinoma o tumor.12 a. Correcto funcionamiento RMM NO MUTACIÓN MUTACIONES EN CASCADA b. Mal funcionamiento RMM 3’ 5’ 3’ 5’ 3’ 5’ 3’ 5’ 3’ 5’ 3’ 5’ 3’ 5’ 3’ 5’ 3’ 5’ El cáncer de colon pág. 7 Epitelio normal Adenoma temprano y displástica de ACF Adenoma intermedio Adenoma tardío Cáncer APC KRAS Pérdida de 18q SMAD4 DPC4 Señalización Wnt BRAF KRAS DPC4 TGFBR2 BAX IGF2R TP53 Aumento de la inestabilidad cromosómica (CIN) Inactivación del MMR Tiempo de progresión adenoma-carcinoma Número de alteraciones genéticas Figura 1.4. Esquema de la evolución del proceso tumoral en el colon. El paso inicial en la tumorigénesis es el de la formación de adenoma, asociado con la supresión de la expresión del gen APC. Los adenomas más grandes y los carcinomas tempranos adquieren mutaciones en la GTPasa KRAS, seguida de la pérdida del cromosoma 18q y de los genes supresores de tumores SMAD4 (también llamado DPC4), así como mutaciones en TP53 en los carcinomas tangibles. Además del papel del gen APC, el gen TP53 también parece ser determinante, considerado incluso el más importante durante la tumorigénesis colorrectal. Este gen codifica la proteína P53 que es un factor de transcripción multifactorial, implicado en el control de la progresión del ciclo celular, integridad del ADN y supervivencia de las células expuestas a agentes que dañan al ADN.13-14 Cuando el ADN está dañado, P53 se activa para mantener la integridad de la secuencia del ADN, bien mediante la parada de la proliferación celular mientras que el daño es reparado, o alternativamente, dirigiendo a la célula hacia la apoptosis.15 Así, el correcto funcionamiento de P53 disminuye la probabilidad de poblaciones celulares mutadas y con ello, de desarrollar tumores.16 Debido a su papel fundamental en la protección de las mutaciones en el ADN, P53 se suele denominar como "guardián del genoma". La mutación en el gen TP53 está detrás del 40-50% de los tumores esporádicos, con el agravante de que este tipo de tumores suelen desarrollar una mayor resistencia a los fármacos convencionales.17 Es por esto, por lo que investigar en el desarrollo de alternativas en el tratamiento de CCR sigue siendo una prioridad. Estas alternativas no sólo deben de ser efectivas, sino también selectivas; es decir, que desempeñen su actividad citotóxica exclusivamente en células tumorales de forma que se minimicen los efectos secundarios. Para conseguir esta selectividad, se aprovechan las diferencias estructurales y metabólicas que presentan las células tumorales respecto de las células sanas. Estas diferencias son: ¨ El crecimiento y la división celular están regulados por señales a las que las células tumorales no responden; por lo tanto, la velocidad de proliferación de éstas es mucho mayor que la de las células sanas. ¨ Mientras que las células normales se especializan en una función determinada, las cancerosas carecen de esta diferenciación (anaplasia). El cáncer de colon pág. 8 ¨ Las células tumorales, debido a la falta de una estructura superficial, son capaces de separarse de otras células cercanas. Es este hecho el que permite la invasión de otros órganos o tejidos que deriva en la formación de tumores secundarios o procesos de metástasis. ¨ Asimismo, se van a formar nuevos vasos sanguíneos para abastecer de nutrientes a las células tumorales (angiogénesis tumoral). Estas características indican como las células tumorales son más demandantes de nutrientes y energía que las células normales. CICLO CELULAR Y PROLIFERACIÓN CELULAR A lo largo de este capítulo, se puede observar como el concepto de equilibrio entre regeneración (proliferación) y muerte celular es fundamental para el correcto funcionamiento, no sólo del colon sino del organismo en general. Las células que constituyen todo ser vivo, mediante un ciclo perfectamente coordinado y controlado, crecen, se reproducen y mueren de forma continua. Es de esta forma, como existe este cuidado equilibrio entre la proliferación de las células, que permiten la regeneración de los tejidos; y la muerte celular programada (apoptosis), que hace que el número de células sea constante. El proceso mediante el cual se mantiene este equilibrio se denomina ciclo celular, y consta de una serie de eventos perfectamente orquestados y controlados por numerosos genes, que hacen que la célula prolifere o muera, en caso de que presente algún daño en su información genética. Sin embargo, una célula tumoral presenta mutaciones en algunos de los diferentes genes que controlan este ciclo,18 lo que les permite alterar su ciclo celular. Las mutaciones en estos genes son variables en función del tipo del cáncer, pero independientemente del daño genético o del tipo de cáncer, todos presentan alteraciones en el ciclo celular. Este ciclo celular está formado por varias etapas bien diferenciadas durante las cuales la célula original va a aumentar de tamaño, copiar sus orgánulos y componentes moleculares (Fase G1) para la síntesis de una copia completa de su ADN (Fase S), tras la cual reorganiza su contenido y se prepara la mitosis (Fase G2). Será en la mitosis (Fase M), cuando la célula divida el ADN duplicado y su citoplasma, y genere dos nuevas células. Muerte celular programa: Apoptosis pág. 9 Fase M Punto de control G1/S G0 Apoptosis Fase G1 Fase S Fase G2 Punto de control G2/M Apoptosis a b c e d g f Figura 1.5. Etapas del ciclo celular. Fase G1: La célula crece y se prepara para sintetizar ADN; Fase S: Se produce la replicación del ADN; Fase G2: La célula se prepara para dividirse; y Fase M: Se produce la división celular. Punto de control G1/S, impide el paso a la Fase S a las células con ADN dañado; G0: Fase de parada temporal para las células con falta de nutrientes o con ADN dañado y susceptible de ser reparado; Punto de control G2/M: control de la copia correcta y total de ADN. Además de las fases G1, S, G2 y M, existen unos puntos de control, tal y como se muestran en la Figura 1.5. Se trata de etapas cruciales del ciclo celular ya que su función es controlar que la célula que se va a dividir no presenta mutaciones. En caso de que la célula contenga ADN dañado, estos puntos de control van a iniciar procesos de reparación o de muerte celular programa (apoptosis). De esta forma, en la fase G1 sólo aquellas células que hayan alcanzado el tamaño adecuado avanzarán a la fase S (Figura 1.5a). El resto de las células serán detectadas por el punto de control G1/S, pudiendo darse dos situaciones: las que no tengan el tamaño suficiente avanzarán a la fase G0 para realizar el crecimiento (Figura 1.5b); y aquellas con información genética dañada comenzarán procesos apoptóticos para ser eliminadas (Figura 1.5c). En la fase S, se produce la síntesis de una copia del ADN; no obstante, y dado que no existe un punto de control entre las fases S y G2, las células con fallos en la replicación de ese ADN (Figura 1.5d) continuarán a la fase G2 junto con las que contienen la información genética completa (Figura 1.5e). En esta fase, se va a producir la reorganización necesaria para la fase mitótica; fase a la que tan sólo entran estas últimas (Figura 1.5f), ya que las células con ADN incompleto son detectadas por el punto de control G2/M, e inducen procesos de muerte celular (Figura 1.5g). Muerte celular programa: Apoptosis pág. 10 Por ello, se puede concluir que un mal funcionamiento de los puntos de control G1/S, G2/M o del sistema RMM, produce inestabilidad genómica, acumulación de células con ADN dañado y proliferación celular no controlada, características propias de procesos tumorales.19-20 Asimismo, conviene mencionar que cuando estos puntos de control son superados, la célula va a realizar la siguiente fase de forma irreversible;21 por lo que si una célula con ADN mutado consigue superar el punto G2/M realizará la división celular produciendo dos nuevas células con esa mutación presente. Tal y como se puede entrever, las transiciones moleculares se regulan a través de tanto señales externas (p.Ej. señales moleculares), como señales internas (p.Ej. daño en el ADN). De esta forma, una compleja red reguladora controla el orden correcto del ciclo, así como de realización eventos clave como la replicación del ADN o la separación de cromosomas. Los controladores centrales de esta red son complejos de Cdk y moléculas de ciclina. Varios pares de Cdk/ciclina regulan las transiciones críticas del ciclo celular, donde inician la replicación del ADN en la transición de la fase G1 a la S. También desempeñan un papel clave en la inducción de la mitosis. Además, Cdk/ciclina inhibe los últimos pasos del ciclo; es decir, la separación de los cromosomas al final de la mitosis y la división celular. Los análisis de proliferación celular son cruciales para los estudios de crecimiento y diferenciación celular, y se usan a menudo para evaluar tanto la toxicidad de los compuestos como la inhibición del crecimiento de células tumorales durante el desarrollo de un fármaco. MUERTE CELULAR PROGRAMA: APOPTOSIS Como ya se ha comentado, cuando durante el ciclo celular se detecta una célula con ADN dañado, insuficiencia de nutrientes o falta de orgánulos o estructuras a través de estos puntos control, además del arresto de esa célula para que corrija sus defectos, se desencadena un proceso fisiológico que induce su propia muerte. Este proceso se denomina apoptosis y está mediado por la activación de una serie de moléculas (la cascada apoptótica) que produce la muerte celular programada (MCP).22-23 De esta manera, la apoptosis juega un papel importante en el desarrollo celular mediante el control y la regulación de la respuesta inmunitaria y la homeostasis tisular.24-25 La inducción de la apoptosis conduce a la formación de corpúsculos celulares, la exposición de la fosfatidilserina a la superficie celular, la reducción del tamaño celular, la contracción del núcleo celular, la condensación del ADN y la formación de cuerpos apoptóticos; lo que permite que se produzca la fagocitación de éstos sin liberación del contenido celular al medio extracelular.26-27 Esto es importante, porque es la razón por la que este tipo de muerte no provoca procesos inflamatorios asociados, en algunos casos, con carcinogénesis.28 EXTERNALIZACIÓN DE FOSFATIDILSERINA Entre las señales por las que se activan los mecanismos de apoptosis se encuentra la externalización de un fosfolípido de membrana, la fosfatidilserina. La membrana celular tiene una doble función, pues no sólo desempeña un papel estructural, sino también impide la difusión de moléculas esenciales para la célula al espacio extracelular. Esta membrana está compuesta por diferentes tipos de proteínas y lípidos. Las proteínas mantienen las condiciones químicas de la célula y ayudan en la transferencia de moléculas a través de la membrana; mientras que los lípidos, componente mayoritario de las membranas celulares, confieren flexibilidad a la membrana. Tanto en lo referente a lípidos como a las proteínas, se dan diferentes tipos en función del organismo, célula, orgánulo, etc.29 Tratamiento del cáncer de colon pág. 17 Tal y como se puede observar en la Figura 1.10, una de las combinaciones más utilizadas para el tratamiento del cáncer de colon en los últimos años es el FOLFOX, un coctel compuesto de 5Fluoracilo/Leucovorin y oxaliplatino. Éste es precisamente el único compuesto metálico que se sigue utilizando, y que conforma la segunda generación de fármacos basados en este metal, iniciada con el conocido cis-platino. Figura 1.10. Evolución de la quimioterapia moderna.59 El hecho de que actualmente sólo se utilice este derivado de Pt no se debe a problemas de efectividad, pues si bien es cierto que algunas líneas tumorales están desarrollando resistencia a este tipo de complejos, el principal inconveniente de este tipo de derivados, son sus graves efectos secundarios. El desarrollo de esta resistencia se atribuye a los siguientes factores:60 ¨ Reducción de la absorción del fármaco.61 ¨ Una mejor eliminación de los mismos por tioles.62 ¨ Aumento de la capacidad de la reparación del ADN.63 ¨ Alteraciones en la vía de señalización celular.64 No obstante, el cis-Pt y el resto de análogos de Pt conforman un gran ejemplo de cómo una molécula muy pequeña es capaz de interferir en la replicación celular de forma efectiva. Todos ellos son considerados profármacos, es decir, que estas especies evolucionan a la especie realmente activa una vez dentro del organismo. En el caso del cis-Platino, evoluciona al correspondiente diaqua complejo, de forma mayoritaria. Estas moléculas de agua se comportan como vacantes coordinativas permitiendo que el platino se enlace a las bases de ADN. Por norma general, se suele enlazar a bases vecinas de una misma cadena, aunque también hay casos de enlace intercatenario. Si bien la unión al ADN es diferente, el resultado es el mismo: iniciación del mecanismo apoptótico (Figura 1.11). 1960 1965 1970 1975 1980 1985 1990 1995 2000 2010 20152005 5-FU (Heidelberger) Potenciación del 5FU con LV (Ullman) Bolus 5-FU/LV vs. 5-FU/mCRC (Poon) 5-FU con levamisol: adyudante terápico (Moertel) 5-FU/LV: adyudante terápico (Wolmark) FOLFOX y FOLFIRI: mCRC Bevacizumab, cetuximab y panitumumab FOLFOX: adyuvante terápico (MOSAIC, Andre) Capecitabina: mCRC (Van Cutsem) Tratamiento del cáncer de colon pág. 18 Figura 1.11. Mecanismo de acción del cisplatino. Este mecanismo comprende (a) captación celular, (b) procesos de activación, (c) coordinación del Pt al ADN y (d) procesamiento celular que conduce a la apoptosis. Con base en la gran eficacia de los complejos de Pt, la comunidad científica se ha lanzado a la búsqueda de fármacos más selectivos para conseguir minimizar los efectos secundarios que sufren los pacientes que reciben quimioterapia, y que, a su vez, consigan vencer esa resistencia incipiente que algunas líneas tumorales presentan a los derivados de Pt. Entre las diferentes líneas de investigación que se han abordado, se encuentra el desarrollo de nuevos complejos de coordinación u organometálicos. Así, se están sintetizando muchos complejos basados en otros metales diferentes al platino como rutenio, osmio, cobre, paladio y oro, entre otros.65-66 Sustituir el platino por otro metal pretende que el nuevo complejo provoque la muerte celular controlada (apoptosis) por mecanismos distintos a los que realiza en platino (distintas dianas), y así vencer la creciente resistencia a estos derivados. DESARROLLO DE NUEVOS FÁRMACOS BASADOS EN ORO El uso del oro en medicina se remonta a la Antigüedad, aunque fue en 1929 a raíz de que Forestier descubriera su aplicabilidad para la artritis reumatoide, cuando experimentó un mayor crecimiento.67 A pesar de esto, la preparación de compuestos de oro con actividad citotóxica todavía se puede considerar una rama en crecimiento, y precisamente por tratarse de una vía joven, todavía hay muchas incógnitas. El principal interrogante sigue siendo el mecanismo de acción de este tipo de complejos. Sin embargo, estudios mecanísticos parecen apuntar a que el oro induce la apoptosis por alteración del equilibrio redox de la célula. La ruptuta de la homeostasis redox se produce por la coordinación del complejo de Au a la tiorredoxina reductasa (TrxR), quedando esta selenoenzima inhibida por esta unión. Esta inhibición conlleva [Cl-]=104 mM (sangre) [Cl-]=4-10 mM (citoplasma) Pt H3N H3N Cl Cl P t H3N H3N C l C l + H 2O + C l P t H3N H3N O H 2 C l + H 2O + C l P t H3N H3N O H 2 O H 2 H+H+H+H+ P t H3N H3N O H C l P t H3N H3N O H 2 O H + H 2O + C l H+H+ P t H3N H3N O H O H P t H3N H O N H 3 O H P t N H 3 H3N Especie más activa Especie menos activa Pt G G NH 3 NH 3 N N HN O O H H H N N NH N N 2eq Par de Bases C-G Átomo N al que se une el cis-Pt Apoptosis Supervivencia de la célula Ciclo celular intervenido Reparación del ADN Inhibición de la transcripción Daño ADN Necrosis Transducción de la señal Pt H 3 N H 3 N G G a b c d Tratamiento del cáncer de colon pág. 19 O OAc S AcO AcO AcO Au P a la alteración de las funciones mitocondriales y a un aumento del estrés oxidativo, causando finalmente la muerte celular vía apoptosis.68-69 El oro puede presentarse en un amplio rango de estados de oxidación, desde -1 hasta +5; sin embargo, sólo los estados de oxidación +3 y +1 parecen ser biológicamente relevantes.70 Au(I) tiene una conFiguración electrónica d10 y genera compuestos con geometría lineal, mientras que Au(III) tiene una conFiguración electrónica d8 y, por lo tanto, es isoelectrónica con Pt(II). Además, también presenta un índice de coordinación 4 con geometría plano-cuadrada que hace que los complejos Au(III) sean candidatos interesantes para su evaluación como anticancerígenos. Cabe destacar que, debido al carácter reductor del medio intracelular, en condiciones fisiológicas la reducción de Au(III) a Au(I) es muy favorable, por lo que la elección de los ligandos es muy determinante para hacer estable a este estado de oxidación.71 De hecho, una importante cantidad de complejos de Au(III) son considerados profármacos. Que las especies activas contengan centros de Au(I) o Au(III) es determinante para su química, puesto que Au(I) tiene un carácter blando y por tanto tenderá a unirse a enzimas con grupos tiol; en lo que respecta al Au(III) manifiesta un carácter fuerte siendo más susceptible a coordinarse a átomos de nitrógeno, pudiendo interaccionar con el ADN.72 NUEVOS COMPLEJOS DE Au(I) Contrariamente a lo que sucede con los derivados de Au(III), los complejos de Au(I) y su estudio como antitumorales es algo en lo que se lleva trabajando varias décadas. Además, el hecho de que los complejos de Au(I) estén aprobados para su uso como antiartrítico, supone una ventaja para las empresas farmacéuticas ya que, este tipo de derivados, ya han pasado las diferentes fases clínicas previas a la comercialización de un fármaco. En este campo, el ejemplo más notable es el auranofin (Figura 1.12), un agente antiartrítico administrado por vía oral, que a finales de la década de los 70, demostró ser capaz de inhibir la proliferación de células cancerosas, así como la síntesis de ADN, ARN y proteínas in vitro.73 Figura 1.12. Estructura del auranofin. El mecanismo de acción del auranofin se ha estudiado ampliamente, y contrariamente a lo que sucede con el cis-Pt, no actúa por interacción con el ADN. El auranofin se sabe que es un potente y selectivo inhibidor de las seleno-enzimas tiorredoxina reductasas (TrxR).74-75 El hecho de que este tipo de enzimas sea la diana principal del auranofin es algo prometedor en el campo de los antitumorales ya que, la TrxR se sobreexpresa en las células tumorales. La inhibición de los sistemas de tiorredoxina reductasa/tiorredoxina induce la permeabilización de la membrana mitocondrial permitiendo la liberación de citocromo c al citosol, lo que desencadena la apoptosis.76 Además, se ha observado como la inhibición de la TrxR por el auranofin permite superar la resistencia creciente a los derivados de Pt(II) en una línea celular de cáncer de ovario in vitro.58 Desarrollo de nuevos fármacos basados en Au pág. 20 Viendo los buenos resultados de este complejo, la química del Au(I) con residuos fosfano atrajo la atención de la comunidad científica. Este derivado no contiene enlaces Au-C como ocurría en los derivados de Au(III), ya que no se requiere de ese tipo de unión para conferirle estabilidad. Es más, se ha observado que numerosos compuestos con enlaces Au-P o Au-S tienen una elevada selectividad y citotoxicidad frente a diferentes líneas tumorales. Así pues, este complejo supuso un comienzo del auge de la química de Au(I) con ligandos fosfanos. Ott et al. en 2009, con la misma subunidad Au-PR3 pero usando N-(N’,N’- dimetilaminoetil)1,8-naftalimida como ligando, describió un complejo que actuaba como intercalante de ADN.77-78 Asimismo, en nuestro grupo de investigación se ha trabajado exhaustivamente con diferentes ligandos fosfano en unión con Au(I) para el desarrollo de nuevos fármacos.79-85 El uso de fosfanos no es trivial, ya que van a constituir la parte hidrófila del complejo permitiendo optimizar el equilibrio entre la lipo e hidrosolubilidad de nuestros complejos. Entre los fosfanos más utilizados en nuestro grupo destacan la PTA (1,3,5-triaza-7-fosfaadamantano) y HMPT (trisdimetilamino fosfano). Ambos fosfanos fueron seleccionados por su elevada solubilidad en agua: 235 y 1000 g/l respectivamente, así como por su baja demanda estérica (Figura 1.13). Figura 1.13. Estructura de los fosfanos PTA y HMPT. Con estos fosfanos se han desarrollado numerosos complejos de Au(I) con distintos residuos acetileno y tioles. Estos complejos han sido estudiados frente a distintas líneas tumorales y, se ha observado que, presentan una mejor actividad citotóxica que el cis-Pt, e incluso que el auranofin en algunos casos.79, 85 A pesar de lo extendida y establecida que es la química de Au(I) con ligandos fosfanos, este estado de oxidación permite trabajar con otros ligandos con diferentes átomos dadores que no sea el fósforo. Así se encuentran una gran variedad de ejemplos de compuestos de Au(I) con ligandos alquinilo. Sin embargo, la propiedad más estudiada de estos derivados es la luminiscencia, y otras propiedades, como las biológicas no se han estudiado tan exhaustivamente.86-87 En nuestro grupo de investigación, cabe destacar que se han preparado derivados alquinilo con Au(I) que contienen el fosfano PTA y el 3,7-diacetil1,3,7-triaza-5-fosfabiciclo [3.3.1] nonano (DAPTA), con efecto citotóxico en células tumorales (Figura 1.14). Asimismo, y aprovechando la luminiscencia intrínseca de estos complejos, se confirmó su captación mediante microscopía de fluorescencia.84 N N P N P N NN 1,3,5-triaza-7-fosfaadamantano Trisdimetilamino fosfano HMPTPTA Desarrollo de nuevos fármacos basados en Au pág. 21 Figura 1.14. Ejemplo de estructuras de complejos de Au(I) con residuos alquinilo. En los últimos años, la química de carbenos N-heterocíclicos se ha desarrollado y ha experimentado un gran auge, aplicándose también a la obtención de compuestos organometálicos de Au(I). Por ejemplo, en 2006, Berners-Price et al. sintetizaron diferentes complejos biscarbeno mononucleares de Au(I) como posibles agentes quimioterapéuticos.88-89 En estas estructuras, se han modificado los grupos unidos a los N del heterociclo para ajustar el carácter lipofílico de los complejos, un factor crítico para dirigirse a las células malignas. Estos derivados organometálicos de oro muestran fuertes efectos antimitocondriales, que pueden atribuirse tanto a su carácter catiónico como lipófilo. Más recientemente, también se ha descrito un complejo biscarbeno de Au(I) que disminuye el tamaño del tumor en ratones con melanoma sin pérdida de peso durante el tratamiento.90 La modificación de los grupos presentes en el heterociclo también juega un papel importante en las propiedades fotofísicas del complejo final, lo que como sucedía con los complejos con unidades alquinilo va a permitir el estudio de asimilación y distribución del complejo por microscopía de fluorescencia.91 Cabe mencionar que, en los casos estudiados de los aquí recogidos, el mecanismo de acción es por inhibición proteica de los sistemas Trxs.92-93 N N Au R R N N R R R= Me, Et, nPr, iPr N N Au L N N Au Cl Figura 1.15. Ejemplo de especies Au(I)-carbeno N-heterocíclico. NUEVOS COMPLEJOS DE Au(III) Como se ha comentado anteriormente, la idoneidad de los complejos de Au(III) para su uso como agente antitumoral reside en su carácter isoelectrónico e isoestructural con el Pt(II), de demostrada actividad citotóxica en una gran variedad de líneas tumorales. Sin embargo, la problemática de evolucionar a especies de Au(I) en el medio intracelular sigue siendo un obstáculo a salvar en la química de este estado N N P NAu N N P N O O Au N Desarrollo de nuevos fármacos basados en Au pág. 22 N N N Au Cl Cl Cl N N NAu Cl 2 Cl 2 + NN AuCl Cl Cl NH NH NH NH Au Cl 3+ 2 ClO4 N NN N Au de oxidación. Esta inestabilidad se atribuye a la fácil sustitución de los átomos de cloro habituales en estos complejos, por moléculas de agua a pH superiores a 2.94 Para desarrollar complejos de Au(III) estables, es común recurrir a ligandos N-dadores, especialmente a aquellos que puedan coordinarse en forma quelato para conferir mayor estabilidad. En esta línea se han desarrollado complejos con fenantrolina, terpiridina o macrociclos tal y como se recogen en la Figura 1.16. Figura 1.16. Estructuras de algunos complejos de Au(III) con ligandos N-dadores. La estabilidad de estos complejos se determinó por voltamperometría cíclica y/o espectroscopia UV-vis en presencia de agentes reductores; y se observó como el complejo con poliamina es bastante estable frente a la reducción en medio acuoso.95 Cabe mencionar, la síntesis de una familia de complejos de Au(III) con ligandos N-dadores especialmente estables a la reducción, complejos Au(III) basados en porfirinas.46, 96 Debido a las similitudes entre Au(III) y Pt(II), el ADN se concibió como la posible diana implicada en el mecanismo de acción; y aunque se ha demostrado que los compuestos de Au(III) pueden interactuar con los ácidos nucleicos mediante la coordinación a sus átomos N-dadores,97 la interacción estudiada con el ADN bovino parece ser débil y reversible, lo que no podría explicar las propiedades citotóxicas de esta clase de compuestos.98 Estudios paralelos parecen apuntar a que la vía principal por la que muestran actividad citotóxica sobre células tumorales es la interacción con proteínas. De hecho, se ha demostrado que algunos complejos de Au(III) son potentes inhibidores de la TrxR, aunque en menor grado que el auranofin.99 Por otro lado, estudios más recientes señalaron que el Au(III) es un inhibidor muy potente de la enzima poli (ADPribosa) polimerasa-1 (PARP-1) en comparación con otros fármacos basados en metales, como son el cisplatino, NAMI-A (([ImH][trans‐RuCl4(dmso‐S)(Im)] Im = imidazol), o auranofin.100 Aunque típicamente se ha relacionado el Au(III) con ligandos N-dadores, no son la única alternativa, ya que existen complejos basados en ligandos S-dadores como los sintetizados por Fregona et al. en 2005 con ditiocarbamatos. Estos complejos han resultado ser muy estables y activos frente a diversas líneas tumorales como la leucemia, adenocarcinoma de colon, cervical…101 Desarrollo de nuevos fármacos basados en Au pág. 23 Figura 1.17. Estructura de complejos de Au(III) con ligando ditiocarbamatos. Algo a destacar de estos complejos es que demostraron también una excelente toxicidad frente a líneas resistentes al cis-Pt, lo que confirma que el mecanismo de acción de estos complejos dista del cis-Pt.101 De hecho, se ha demostrado que los compuestos con unidades ditiocarbamato actúan a través de la inhibición del proteosoma tanto in vitro como in vivo.102-103 COMPLEJOS CICLOMETALADOS DE AU(III) CON LIGANDOS C,N-DADORES. La reacción de ciclometalación es la activación de un enlace C-H, mediado por un metal de transición, de una amplia gama de moléculas orgánicas que llevan átomos dadores (D) como N, O, P, S y Se. Esta reacción supone la formación de un ciclo compuesto por un enlace de coordinación D-M y un enlace covalente M-C, conocido como metalaciclo. La existencia de ese nuevo enlace C-Au dota a este tipo de complejos de mayor estabilidad redox y termodinámica, que complejos únicamente con N-dadores. Por otro lado, este tipo de complejos son muy versátiles ya que, se pueden modular fácilmente sus propiedades estéricas y electrónicas mediante la modificación de los ligandos aniónicos. Este hecho resulta especialmente importante en el campo del desarrollo de nuevos fármacos, pues es vital que dicho compuesto tenga unas características adecuadas para su metabolismo, como por ejemplo un carácter lipofílico mejorado. El descubrimiento de las propiedades antitumorales de este tipo de complejos experimentó un nuevo auge cuando Parish y colaboradores investigaron sobre complejos [Au(damp)Cl2] (damp= 2- [(dimetilamino)metil]fenil).104-105 Estos complejos mostraban un gran potencial por su elevada citotoxicidad frente a numerosas líneas tumorales, alcanzando al cis-Pt. Además de su buena actividad citotóxica, también mostraban buena selectividad. Con estos prometedores resultados, este campo comenzó a extenderse y así, en 2003, Che et al. trabajaron con un ligando quelato C^N^C como es la 2,6difenilpiridina (Figura 1.18a) que resolvía el problema de la falta de inestabilidad de los derivados de Au(III). Este tipo de complejos ciclometalados supuso un gran interés por su elevada citotoxicidad frente a distintas líneas tumorales. Asimismo, complejos como los sintetizados por Messori (Figura 1.18b) utilizando 2- (2-fenilprona-2-il)piridina mostraron además, una inactivación selectiva de la actividad de la TrxR.106-107 N S S Au X X X= Cl, Br N S S Au X X O O Desarrollo de nuevos fármacos basados en Au pág. 24 Figura 1.18. Estructuras de complejos de Au(III) con ligandos C^N^C y C^N. Los complejos recogidos en la Figura 1.18, presentan distinto número de enlaces C-Au, lo que se ha visto que modifica el carácter lipofílico del complejo; en general, un mayor número de enlaces C-Au dota de mayor lipofilidad al complejo, lo que facilita su captación intracelular. Sin embargo, también reduce la tendencia de estos complejos a interaccionar con grupos tiol o selenol presentes en las proteínas diana. Así pues, propiedades tan importantes para el desarrollo de un nuevo fármaco como la elevada estabilidad en condiciones fisiológicas, así como su versatilidad de diseño, han sido lo que ha potenciado la síntesis de nuevos complejos ciclometalados de Au(III) a lo largo de esta tesis doctoral. C N CAu N N -OTf C N CAu N -OTf C N CAu -OTf PPh3 N Au OAc OAc N Au L N -PF6 Bibliografía pág. 25 BIBLIOGRAFÍA 1. Silverthorn, D. U., El aparato digestivo. In Fisiología Humana, Un enfoque integrado, 4th ed.; Panamericana, E. M., Ed. 2008; Vol. 1. 2. Bray, F.; Ferlay, J.; Soerjomataram, I.; Siegel, R. L.; Torre, L. A.; Jemal, A., Global cancer statistics 2018: GLOBOCAN estimates of incidence and mortality worldwide for 36 cancers in 185 countries. CA CANCER J CLIN 2018, 0, 30. 3. Galceran, J.; Ameijid, A.; Carulla, A.; Mateos, J. R.; Quirós, D.; Alemán, A.; Rojas, A.; Torrella, M.; Chico, M.; Vicente, J. M.; Díaz, N.; Larrañaga, R.; Marcos-Gragera, M. J.; Sánchez, M. J.; Perucha, J.; Franch, P.; Navarro, C.; Ardanaz, E.; Bigorra, J.; Rodrigo, P.; Peris Bonet, R., Cancer incidence in Spain, 2015. Clinical and Translational Oncology 2017, 19 (7), 26. 4. Potten, C. S.; Booth, C.; Pritchard, D. M., The intestinal epithelial stem cell: the mucosal governor. Int J Exp Pathol 1997, 78 (4), 219-43. 5. Evan, G. I.; Vousden, K. H., Proliferation, cell cycle and apoptosis in cancer. Nature 2001, 411 (6835), 342-8. 6. Kaz, A. M.; Brentnall, T. A., Genetic testing for colon cancer. Nat Clin Pract Gastroenterol Hepatol 2006, 3 (12), 670-9. 7. Potter, J. D., Colorectal cancer: molecules and populations. J Natl Cancer Inst 1999, 91 (11), 91632. 8. Li, S. K. H.; Martin, A., Mismatch Repair and Colon Cancer: Mechanisms and Therapies Explored. Trends Mol Med 2016, 22 (4), 274-289. 9. Boland, C. R.; Goel, A., Microsatellite instability in colorectal cancer. Gastroenterology 2010, 138 (6), 2073-2087 e3. 10. Powell, S. M.; Zilz, N.; Beazer-Barclay, Y.; Bryan, T. M.; Hamilton, S. R.; Thibodeau, S. N.; Vogelstein, B.; Kinzler, K. W., APC mutations occur early during colorectal tumorigenesis. Nature 1992, 359 (6392), 235-7. 11. Carethers, J. M., The cellular and molecular pathogenesis of colorectal cancer. Gastroenterol Clin North Am 1996, 25 (4), 737-54. 12. ABC of colorrectal CAncer. . 2nd ed.; Wiley-Blackwell: 2011. 13. Gottlieb, T. M.; Oren, M., p53 in growth control and neoplasia. Biochim Biophys Acta 1996, 1287 (23). 14. Hollstein, M.; Sidransky, D.; Vogelstein, B.; Harris, C. C., p53 mutations in human cancers. Science 1991, 253 (5015), 49-53. 15. Brown, M. A., Tumor suppressor genes and human cancer. Adv Genet 1997, 36, 45-135. 16. Li, X. L.; Zhou, J.; Chen, Z. R.; Chng, W. J., P53 mutations in colorectal cancer - molecular pathogenesis and pharmacological reactivation. World J Gastroenterol 2015, 21 (1), 84-93. 17. Hientz, K.; Mohr, A.; Bhakta-Guha, D.; Efferth, T., The role of p53 in cancer drug resistance and targeted chemotherapy. Oncotarget 2017, 8 (5), 8921-8946. 18. Sherr, C. J., Cancer cell cycles. Science 1996, 274 (5293), 1672-7. 19. Elledge, S. J., Cell cycle checkpoints: preventing an identity crisis. Science 1996, 274 (5293), 166472. 20. Sherr, C. J., The Pezcoller lecture: cancer cell cycles revisited. Cancer Res 2000, 60 (14), 3689-95. 21. Park, M. T.; Lee, S. J., Cell cycle and cancer. J Biochem Mol Biol 2003, 36 (1), 60-5. 22. Siegel, R. M., Caspases at the crossroads of immune-cell life and death. Nat Rev Immunol 2006, 6 (4), 308-17. 23. Rowinsky, E. K., Targeted induction of apoptosis in cancer management: the emerging role of tumor necrosis factor-related apoptosis-inducing ligand receptor activating agents. J Clin Oncol 2005, 23 (36), 9394-407. Bibliografía pág. 26 24. Booy, E. P.; Kadkhoda, K.; Johar, D.; Bay, G. H.; Los, M., The immune system, involvement in neurodegenerative diseases, ageing and cancer. Curr. Med. Chem-Anti-Inflamm. Anti-Allergy Agents 2005, 4, 4. 25. Okada, H.; Mak, T. W., Pathways of apoptotic and non-apoptotic death in tumour cells. Nat Rev Cancer 2004, 4 (8), 592-603. 26. Savill, J.; Fadok, V., Corpse clearance defines the meaning of cell death. Nature 2000, 407 (6805), 784-8. 27. Kurosaka, K.; Takahashi, M.; Watanabe, N.; Kobayashi, Y., Silent cleanup of very early apoptotic cells by macrophages. J Immunol 2003, 171 (9), 4672-9. 28. Elmore, S., Apoptosis: a review of programmed cell death. Toxicol Pathol 2007, 35 (4), 495-516. 29. Harayama, T.; Riezman, H., Understanding the diversity of membrane lipid composition. Nat Rev Mol Cell Biol 2018, 19 (5), 281-296. 30. Marino, G.; Kroemer, G., Mechanisms of apoptotic phosphatidylserine exposure. Cell Res 2013, 23 (11), 1247-8. 31. Fadok, V. A.; Voelker, D. R.; Campbell, P. A.; Cohen, J. J.; Bratton, D. L.; Henson, P. M., Exposure of phosphatidylserine on the surface of apoptotic lymphocytes triggers specific recognition and removal by macrophages. J Immunol 1992, 148 (7), 2207-16. 32. Mower, D. A., Jr.; Peckham, D. W.; Illera, V. A.; Fishbaugh, J. K.; Stunz, L. L.; Ashman, R. F., Decreased membrane phospholipid packing and decreased cell size precede DNA cleavage in mature mouse B cell apoptosis. J Immunol 1994, 152 (10), 4832-42. 33. Desai, T. J.; Toombs, J. E.; Minna, J. D.; Brekken, R. A.; Udugamasooriya, D. G., Identification of lipidphosphatidylserine (PS) as the target of unbiasedly selected cancer specific peptide-peptoid hybrid PPS1. Oncotarget 2016, 7 (21), 30678-90. 34. Maddika, S.; Mendoza, F. J.; Hauff, K.; Zamzow, C. R.; Paranjothy, T.; Los, M., Cancer-selective therapy of the future: apoptin and its mechanism of action. Cancer Biol Ther 2006, 5 (1), 10-9. 35. Shi, Y., Mechanisms of caspase activation and inhibition during apoptosis. Mol Cell 2002, 9 (3), 45970. 36. Boatright, K. M.; Renatus, M.; Scott, F. L.; Sperandio, S.; Shin, H.; Pedersen, I. M.; Ricci, J. E.; Edris, W. A.; Sutherlin, D. P.; Green, D. R.; Salvesen, G. S., A unified model for apical caspase activation. Mol Cell 2003, 11 (2), 529-41. 37. Adams, J. M., Ways of dying: multiple pathways to apoptosis. Genes Dev 2003, 17 (20), 2481-95. 38. Li, P.; Nijhawan, D.; Budihardjo, I.; Srinivasula, S. M.; Ahmad, M.; Alnemri, E. S.; Wang, X., Cytochrome c and dATP-dependent formation of Apaf-1/caspase-9 complex initiates an apoptotic protease cascade. Cell 1997, 91 (4), 479-89. 39. Rodriguez, J.; Lazebnik, Y., Caspase-9 and APAF-1 form an active holoenzyme. Genes Dev 1999, 13 (24), 3179-84. 40. Zou, H.; Li, Y.; Liu, X.; Wang, X., An APAF-1.cytochrome c multimeric complex is a functional apoptosome that activates procaspase-9. J Biol Chem 1999, 274 (17), 11549-56. 41. McIlwain, D. R.; Berger, T.; Mak, T. W., Caspase functions in cell death and disease. Cold Spring Harb Perspect Biol 2013, 5 (4), a008656. 42. Martinon, F.; Burns, K.; Tschopp, J., The inflammasome: a molecular platform triggering activation of inflammatory caspases and processing of proIL-beta. Mol Cell 2002, 10 (2), 417-26. 43. Ke, Y.; Tang, H.; Ye, C.; Lei, C. T.; Wang, Y. M.; Su, H.; Zhang, C.; Jiang, H. J., Role and Association of Inflammatory and Apoptotic Caspases in Renal Tubulointerstitial Fibrosis. Kidney Blood Press Res 2016, 41 (5), 643-653. 44. Noda, N.; Wakasugi, H., Cancer and oxidative stress. JMAJ 2001, 44 (12), 4. 45. Nguyen, P.; Awwad, R. T.; Smart, D. D.; Spitz, D. R.; Gius, D., Thioredoxin reductase as a novel molecular target for cancer therapy. Cancer Lett 2006, 236 (2), 164-74. Síntesis y caracterización de derivados ciclometalados de Au(III) pág. 33 DISCUSIÓN DE RESULTADOS (I): SÍNTESIS Y CARACTERIZACIÓN La síntesis de nuevos complejos con aplicabilidad en medicina es una tarea que requiere de un diseño previo muy concreto ya que, estos nuevos compuestos, van a tener que cumplir una serie de propiedades y requisitos. Los parámetros a estudiar para que un complejo sea descartado o elegido como fármaco son su absorción, distribución, metabolismo, excreción y toxicidad; o lo que es lo mismo, sus características ADMEtox.1 Quizás, el más complejo de elucidar sea el metabolismo, por la infinidad de procesos involucrados a los que va a estar sometido el fármaco. Sin embargo, el metabolismo de un fármaco no difiere en gran medida de la digestión diaria de alimentos; por lo que conocer el sistema digestivo humano, así como su funcionamiento resulta muy útil para este tipo de investigaciones. El sistema digestivo, como se ha mencionada en el capítulo I, lleva a cabo una gran variedad de reacciones químicas distribuidas en etapas establecidas en distintos órganos. Cada órgano tiene su propio pH, que va a ser crítico para la desnaturalización o activación de las enzimas y coenzimas que llevan a cabo el proceso de transformación de los alimento, a moléculas que el organismo es capaz de asimilar. Estas condiciones van a ser las mismas a las que el fármaco va a estar expuesto: agitación mecánica a 37ºC, mismo pH y mismas enzimas. Conviene recordar que la mayoría de los medicamentos se administran en forma sólida por lo que el primer paso crítico va a ser su solubilidad. A continuación, la absorción del fármaco requiere que pueda atravesar la membrana lipídica celular, y así sucesivamente hasta que pueda realizar su acción. Como se puede observar, el diseño de la estructura de un complejo con pretensión de fármaco, no es algo trivial. A lo largo de esta investigación se han sintetizado una serie de nuevos complejos de Au con ligandos específicamente seleccionados para mejorar propiedades tales como solubilidad, citotoxicidad, biocompatibilidad, etc. Una de las herramientas que ha de demostrado ser muy útil para el diseño de nuevos fármacos es la conocida como Regla de Lipisnki, capaz de evaluar cualitativamente la adecuación de un compuesto para ser administrado por vía oral, y llevar a cabo su función farmacológica. Se conoce con este nombre a las siguientes reglas que determinan la viabilidad de un compuesto para su utilización como fármaco: ¨ El compuesto no debe contener más de 5 átomos dadores de enlace de H (expresado como la suma de OHs y NHs).2 ¨ Tampoco debe contener más de 10 átomos aceptores de enlaces de hidrógeno (la suma de Ns, Os y Flúor). ¨ Debe tener un peso molecular inferior a 500 g/mol. ¨ Y un coeficiente de reparto octanol-agua (logP) inferior a 5. COMPLEJOS DE Au(III) Como se ha comentado en la introducción, el metal escogido para la síntesis de nuevos complejos capaces de actuar como fármaco, es el oro. De entre los estados de oxidación con relevancia biológica Au(I) y Au(III), a continuación se recoge la preparación y caracterización de los complejos de Au(III) con ligandos Ndadores. Asimismo, y dado que el Au(III) suele ser fácilmente reducible a Au(I)/Au(0) en el medio fisiológico, el primer objetivo de este trabajo ha sido estabilizar el estado de oxidación III. Para ello se ha decidido trabajar con ligandos N-dadores capaces de generar, no sólo un enlace Au-N si no también un enlace Au-C. Es precisamente este enlace el que aumenta la resistencia de estos complejos a la reducción, debido a la coordinación tipo quelato. Síntesis y caracterización de derivados ciclometalados de Au(III) pág. 34 Para la síntesis de los derivados ciclometalados de Au(III) que aquí se pretende, hay ya recogidos varios protocolos sintéticos: ¨ Por reacciones de transmetalación con derivados organometálicos, como organomercuriales o complejos organoestánnicos.3-4 ¨ Por calentamiento del correspondiente precusor [AuCl3(HL)].5-6 ¨ Por reacciones de abstracción del átomo de Cl de los derivados [AuCl3(HL)] con sales inorgánicas como NaBF4, KPF6, AgBF4 …6-7 La gran variedad de procedimientos válidos para la obtención de complejos cicloauratos refleja la falta de un método general que permita obtener el derivado ciclometalado sin importar el ligando HNC utilizado con buenos rendimientos. Así, este ha sido uno de los objetivos establecidos en esta investigación. De entre los protocolos anteriormente mencionados, el uso de derivados organometálicos de mercurio y de estaño, fue rápidamente descartado como punto de partida por cuestiones medioambientales. Además, el uso de estos metales para obtener complejos cuya finalidad última es su aplicación en medicina, supone también una evidente problemática. Por otro lado, los otros dos métodos parecían sencillos y accesibles a nivel industrial, punto a tener en cuenta ya que el procedimiento sintético debe cumplir estas propiedades para que un posible fármaco sea viable. De esta forma, se sintetizaron varios complejos de Au(III) de fórmula [AuCl3(HL)] ya que se trata del producto de partida de ambos procedimientos. Productos de partida: [AuCl3(HL)] y [AuCl2L] SÍNTESIS DE LOS PRECURSORES [AuCl3(HL)] La preparación de este tipo de derivados se puede realizar en diferentes disolventes, aunque la mezcla de disolventes más extendida es acetonitrilo/agua. Como fuente de Au(III) se puede utilizar Na/K[AuCl4] o HAuCl4;6, 8 sin embargo, se ha observado que el uso de la sal sódica genera resultados más reproducibles que con el ácido, lo que se puede explicar por un exceso de HNO3 en el ácido HAuCl4. Así, se ha seguido el esquema sintético que se muestra en la siguiente Figura:9-10 NRR' Na[AuCl4]·2H2O MeCN/H2O, RT N R R' Au Cl Cl Cl NRR' : N N N N NNN tpy ppy bzp bzq dppy dmdppy pqn Figura 2.1.1. Esquema de reacción para los derivados [AuCl3HL]. Síntesis y caracterización de derivados ciclometalados de Au(III) pág. 35 La caracterización de estos complejos se ha realizado por las técnicas habituales siendo especialmente útil la espectroscopía infrarroja (IR) así como RMN. La primera de ellas permite conocer rápidamente la coordinación del ligando sobre el átomo de Au por la aparición de la banda Au-Cl. Los complejos [AuX3HL] tienen varios modos de vibración activos en IR: 4a1+3b1+2b2, de los cuales 3 son debidos a los enlaces Au-X (2a1+b1), y se registran en el rango =356-366 cm-1, aproximadamente. Los modos de vibración a1 se corresponden con ν(Au-X) trans L y con ν(Au-X) simétrica, y suelen ser bastante débiles. Sin embargo, la banda b1 ν(Au-X) asimétrica es la banda más significativa para este tipo de complejos por su elevada intensidad, siendo ésta la banda que actúa como frecuencia de grupo.11 De esta forma, es coherente que en los derivados de Au(III) sintetizados, se observe una señal intensa en torno a 350 cm-1 con varios hombros, como en el caso de la Figura 2.2. Así esta señal es la correspondiente con el modo b1 y los hombros las bandas de menor intensidad a1. Figura 2.1.2. Espectro de IR del complejo [AuCl3(Hbzp)] (P3). Inset: ampliación de la banda a 356 cm-1. En lo que se refiere a RMN, la realización de experimentos 1H-RMN confirma la coordinación al centro de Au por el cambio en el desplazamiento de las señales, especialmente notable en el caso del H adyacente al átomo de N-py (Figura 2.3). Síntesis y caracterización de derivados ciclometalados de Au(III) pág. 36 Figura 2.1.3. Espectro de 1H-RMN del complejo [AuCl3(Htpy)] (P1) (arriba) y Htpy (abajo). Una vez caracterizados estos complejos se procedió a su utilización para la síntesis de sus correspondientes ciclometalados. SÍNTESIS DE COMPLEJOS CICLOMETALADOS DE Au(III): [AuLCl2] Como se ha comentado anteriormente, la preparación de estos derivados se ha abordado desde varios procedimientos sintéticos, como son: ¨ Utilización de una base como captador de cloro: el uso de una base se contempló con una doble función, no sólo ayudar a captar un átomo de cloro para formar la sal correspondiente; si no también neutralizar el HCl que se forma durante la reacción. Entre las bases utilizadas destacan el NaOAc y AgBF4. La elección de utilizar NaOAc se justifica por su papel en la síntesis de ciclopaladatos. Ryabov et al. propusieron un mecanismo electrofílico para la ciclometalación del derivado de Pd con dimetil-bencil amina (DMBA-H).12-14 Este mecanismo implica la formación de un intermedio donde se da la transferencia de un protón al residuo acetato (Figura 2.4). De esta forma, el acetato desempeña dos funciones importantes, la activación electrófila del areno, y la desprotonación del mismo. N Au Cl Cl Cl N Ha Ha Ha Ha Síntesis y caracterización de derivados ciclometalados de Au(III) pág. 37 Figura 2.1.4. Estado de transición propuesto para la ciclometalación de [Pd(OAc)2(DMBA-H)]. ¨ Reacciones a reflujo en mezcla de MeCN/H2O: la relación de disolventes a utilizar, aunque se ha visto que resulta en muchos casos crítica,15 aún no está bien definida. ¨ Reacciones en estado sólido basadas en estudios de TGA: D.E. Janzen et al. han desarrollado un método válido para diferentes ligandos N-dadores aromáticos,16 en el que se consigue el derivado cicloaurato por calentamiento del precusor [AuCl3(HNC)]. La temperatura a utilizar se determina previamente por estudios de TGA. USO DE BASES PARA LA ABSTRACCIÓN DE CLORO Para favorecer la reacción de ciclometalación se han utilizado diferentes bases capaces de captar uno de los átomos de Cl unidos al centro metálico, de esta forma el Au(III) dispone de una vacante coordinativa que, por proximidad y estabilidad, tenderá a ocupar mediante la formación de un enlace Au-C. Las bases testadas, así como las diferentes condiciones utilizadas en la reacción de ciclometalación de [AuCl3(Htpy)] se recogen en la Tabla 2.1. Se puede observar como, salvo en el caso de la utilización de NaBF4 (entradas 3 y 4), no se consiguió obtener el derivado ciclometalado. Tabla 2.1.1. Resumen de las condiciones testadas para la ciclometalación [AuCl3(Htpy)]. El producto aislado de las reacciones 3 y 4, se caracterizó por 1H-RMN, donde se pueden ver que además de la especie ciclometalada, se dan impurezas correspondientes con la especie precursora cuando se utilizó H2O (Figura 2.5 centro). Sin embargo, viendo estos resultados se modificaron las condiciones de reacción a MeCN, dando como resultado una mejora en la pureza de la especie ciclometalada aunque todavía son apreciables resto de la especie tricloro (Figura 2.5 abajo) N Pd OAc O O H + −- Base Disolvente Temperatura Tiempo (h) Resultado 1 NaOAc MeCN/ H2O RT 6,5 No reacción 2 NaOAc CH2Cl2 RT 24 No reacción 3 NaBF4 H2O Reflujo 6,5 50% (+impurezas) 4 NaBF4 MeCN Reflujo 5 30% 5 KPF6 MeCN/ H2O RT 96 No reacción 6 AgBF4 Acetona RT 15 Descomposición 7 Tl(acac) Acetonitrilo RT 0.5 Descomposición 8 Tl(acac) Acetonitrilo RT (Atmósfera Ar) 3 Descomposición Síntesis y caracterización de derivados ciclometalados de Au(III) pág. 38 Figura 2.5. Espectro de 1H-RMN de [AuCl3(Htpy)] (P1) (arriba), producto de síntesis de la entrada 4 (centro) y el producto de la entrada 3 (abajo). Viendo que esta estrategia sintética no conseguía mejorar los resultados publicados de rendimiento para la obtención de especies ciclometaladas a través del calentamiento a reflujo en MeCN/H2O; se decidió abandonar esta vía en favor del segundo de los procedimientos arriba mencionados. REACCIONES A REFLUJO EN MEZCLA DE MeCN/H2O La obtención de cicloauratos por calentamiento en disolución MeCN/H2O ha sido descrita con anterioridad; sin embargo, todavía existe cierta controversia en la relación de disolventes a utilizar. Por ello, y en alas de obtener un procedimiento general se realizó un estudio con diferentes disolventes y estequiometrías. Síntesis y caracterización de derivados ciclometalados de Au(III) pág. 39 Tabla 2.1.2. Condiciones ensayadas para la obtención de [AuCl2(tpy)] (1). Disolvente Tiempo (h) Rto (%) 1 Acetona 3 0 2 CH2Cl2 48 0 3 H2O 24 0 Relación MeCN/H2O Tiempo (h) Rto (%) 4 1:1 6 85 5 1:2 6 4 6 1:4 6 5 Con base en los resultados recogidos en la Tabla 2.2, se observa que sólo utilizando la mezcla MeCN/H2O se consigue la especie ciclometalada. Además, viendo que utilizando únicamente agua no tiene lugar la reacción, parece que la presencia de acetonitrilo es imprescindible; este hecho se explica por la baja solubilidad de los complejos [AuCl3(Htpy)] (P1) en agua, mientras que en acetonitrilo es excelente. En algunos de los procedimientos descritos, se recoge que la relación de disolventes utilizada no parece influir en el rendimiento final;6, 17 sin embargo, esto contradice los resultados observados a lo largo de esta investigación. En la Tabla 2.3, se puede comprobar como un cambio en la estequiometría de los disolventes tiene importantes consecuencias sobre el rendimiento del producto final. El rendimiento obtenido para la síntesis de [AuCl2(tpy)] (1) es muy superior a los recogidos en la bibliografía,18 lo que hizo pensar que estas condiciones eran las adecuadas para establecer el método general que se busca con esta investigación. Sin embargo, cuando estas condiciones se aplicaron al complejo [AuCl3(Hbzp)], los resultados no fueron tan positivos. Por ello, se realizó un nuevo estudio para la optimización de la relación de la mezcla de MeCN/H2O (Tabla 2.3). Tabla 2.1.3. Estudio de la influencia de mezcla de disolvente sobre el rendimiento de [AuCl2(bzp)] (3). Reactivo Relación MeCN/agua Tiempo Rendimiento [AuCl2(bzp)] 1:1 6h 38 [AuCl2(bzp)] 1:2 6h 45 [AuCl2(bzp)] 1:4 6h 78 De esta forma, se concluyó que la estequiometría utilizada de MeCN/H2O es dependiente del ligando involucrado, haciendo que esta estrategia sintética tampoco alcance el objetivo propuesto. REACCIONES EN ESTADO SÓLIDO BASADAS EN ESTUDIOS DE TGA Este procedimiento establecido por D.E. Jansen et al. supone una revolución para la preparación de este tipo de derivados de Au(III). Este método se basa, como ya se ha anticipado, en estudios de TGA para determinar la temperatura necesaria para que se dé la eliminación de la molécula de HCl resultante en la ciclometalación. Los estudios de TGA llevados a cabo ponen de manifiesto la diferente energía necesaria para la activación del enlace C-H del anillo bencénico sobre el que tiene lugar la coordinación de Au, lo que encaja con las diferencias observadas en los estudios anteriores. Síntesis y caracterización de derivados ciclometalados de Au(III) pág. 40 Así, para determinar las condiciones de temperatura necesarias para cada complejo [AuCl3(HL)], se ha registrado el correspondiente termograma para cada uno de los complejos sintetizados. Sin embargo, y a pesar de lo esperanzador del procedimiento, la mayoría de los complejos muestran una caída progresiva pero ininterrumpida consistente con la descomposición de los mismos; haciendo imposible el establecimiento de una temperatura. A modo de ejemplo se recoge el termograma obtenido para el complejo [AuCl3(Htpy)] (P1), donde se puede establecer que la ciclometalación tiene lugar a una temperatura T=175 ºC, (Figura 2.6.). Sin embargo, esto no es posible con los complejos [AuCl3(HL)] con HL= bzp, bzq, dppy, dmdppy. Figura 2.1.6. Espectro de TGA-DTA del complejo [AuCl3(Htpy)], P1. En el espectro de TGA-DTA para [AuCl3(Hbzp)] (P3) se puede observar que la pérdida de peso del 7.7% correspondiente a la molécula de HCl que se forma como subproducto de la reacción de ciclometalación, se produce a una temperatura correspondiente con 162 ºC (Figura 2.7). Sin embargo, experimentalmente se ha comprobado que a esa temperatura no se produce la ciclometalación. Asimismo, se intentó con la misma temperatura que los análogos anteriores para determinar lo general de este método, y con temperaturas iguales o superiores 175 ºC se produce la descomposición total del complejo. 90 92 94 96 98 -0.2 0.0 0.2 0.4 0.6 150 100 50 0 200 250 300 Temperatura, ºC Deriv. Peso, %/ºC Peso, % 175 100 102 Síntesis y caracterización de derivados ciclometalados de Au(III) pág. 41 Figura 2.1.7. Espectro de TGA-DTA del complejo [AuCl3(Hbzp)] (P3). Debido a estos resultados, el complejo con L=2-bencilpiridina se ha sintetizado en disolución de MeCN/agua, según las condiciones descritas anteriormente; modificando el protocolo inicial descrito por E.C. Constable,18 donde se utiliza una relación 1:1. El cambio viene justificado por el mayor rendimiento obtenido, se ha conseguido duplicar el rendimiento final de la reacción. Figura 2.1.8. Esquema de los procedimientos sintéticos seguidos para la preparación de los productos de partida [AuCl2L]. Así, los complejos [AuCl2(tpy)] (1), [AuCl2(ppy)] (2) y [AuCl2(bzp)] (3) son los tres productos de partida utilizados en esta investigación. El éxito de la reacción se ha comprobado mediante las técnicas habituales de análisis, aunque el color del complejo ya es indicativo; puesto que mientras los derivados [AuCl3(HL)] son de colores amarillo intenso, al producirse la coordinación Au-C, el color se atenúa drásticamente hasta un color casi blanco. 60 70 80 90 100 -0.2 0.0 0.2 0.4 0.8 0.6 1.0 150 100 50 0 200 250 300 Temperatura, ºC Deriv. Peso, %/ºC Peso, % 162 N Au R Cl Cl Cl N Au R Cl Cl R= Me (tpy), H (ppy) Au N ClCl MeCN/H2O 1:4 6h, 6h, 175 ºC Sin disolvente 3 R= Me (tpy) 1, H (ppy) 2 Síntesis y caracterización de derivados ciclometalados de Au(III) pág. 42 La ciclometalación es también apreciable por 1H-RMN, ya que el H adyacente al Npy experimenta un gran desplazamiento a campo bajo. Asimismo, se produce una pérdida en la simetría del anillo bencénico generando un mayor número de señales que las observadas en el complejo [AuCl3(Htpy)], tal y como se puede observar en la Figura 2.9. Otro cambio notable resultado de la ciclometalación es el cambio en la multiplicidad del Hg, la que mientras en el complejo [AuCl3(Htpy)] hay un sistema para que genera dos dobletes; en la especie ciclometalada, Hg es un singlete como consecuencia de la desaparición del H adyacente en el producto final. Figura 2.1.9. Zona aromática del espectro de 1H-RMN de los complejos [AuCl2(tpy)] 1 (arriba) y [AuCl3(Htpy)] P1 (abajo). SÍNTESIS DE DERIVADOS CICLOMETALADOS DE Au(III) Además de la estandarización de un método para la obtención de estos complejos, la sustitución de los átomos de cloro por otras unidades de diferente naturaleza va a ser uno de los objetivos sintéticos de este trabajo. Como ya se ha comentado al inicio de este capítulo, el producto final tiene que reunir una serie de propiedades que le permitan acceder al organismo, actuar y eliminarse sin producir efectos adversos en el cuerpo humano. De esta forma, los ligandos que se han utilizado para sustituir, de forma parcial o total, los átomos de Cl presentes en el complejo ciclometalado de Au(III), han sido cuidadosamente seleccionados N Au Cl Cl Ha HeHf Hg Ha Ha Hg N Au Cl Cl Cl Ha Hg Hg Síntesis y caracterización de derivados ciclometalados de Au(III) pág. 49 La síntesis de este complejo se justifica porque al incorporar un sustituyente fosfano, los protones más cercanos al átomo de fósforo van a presentar un desdoblamiento que no van a exhibir el resto de los protones. Así, una vez obtenido el complejo, se realizó un estudio mediante técnicas de 1H{31P}-RMN y 1H-RMN. Como se puede ver en el espectro de la Figura 2.18, las señales de Ha y Hg experimentan un apantallamiento respecto del complejo [AuCl2tpy], y como consecuencia la señal se desplaza a campo alto. Este hecho se explica por la sustitución del átomo de Cl por el ligando HMPT, de marcado carácter dador. Asimismo, estas señales también experimentan, junto con Hb, un desdoblamiento que parece indicar que son los H en posiciones más próximas al ligando fosfano. Figura 2.1.18. Comparativa de los espectros de [AuCl2(tpy)] 1 (arriba), 1H{31P}-RMN (centro) y 1HRMN (abajo) de [AuCl(HMPT)tpy]. Este estudio no es concluyente, ya que el átomo de fósforo se va a acoplar en igual medida con Ha que con Hg ya que se encuentran al mismo número de enlaces (Tabla 2.5). Tabla 2.1.5. Constantes de acoplamiento 1H-31P (Hz) de [AuCl(HMPT)tpy]. Ha-P Hg-P JH-P (Hz) 6.18 6.41 Hg Hb Ha N AuCl Ha Hb Hc Hd Hf Hg He Cl N Au P Me2N NMe2 Me2NCl Ha Hb Hc Hd Hf Hg He PF6 Ha Hb Hg Síntesis y caracterización de derivados ciclometalados de Au(III) pág. 50 Así, se hace necesaria la realización de un experimento NOESY 1H-1H (Figura 2.19), con el que se puede conocer la posición relativa del ligando fosfano. Figura 2.1.19. Espectro de NOESY (1H-1H) de [AuCl(HMPT)tpy]. Según el espectro que se recoge arriba, los HHMPT correlacionan con Hg y no con Ha; este hecho permite concluir que el Cl sustituido es el de la posición trans a N-py. La formación de este isómero es coherente con otros complejos heterolepticos ciclometalados de Au(III) recogidos en la literatura, como [AuCl(PTA)(bzp)](PF6) publicado por Casini et al.,21 o [AuCl(3-thpyC1,N)(PPh3)]BF4 descrito por Mikuriya et al.6 son algunos ejemplos en los que se pone de manifiesto que el átomo sustituido es efectivamente, el de la posición trans a N-py. Au N PCl N NN PF6 NS Au Cl PPh3 BF4 Figura 2.1.20. Estructuras de los complejos descrito por Casini (izq.) y Mikuriya (drcha.). De esta forma, se propone la sustitución trans a Npy para los complejos heterolépticos con fórmula [AuCl(X)L]. Hg HMe(HMPT) Síntesis y caracterización de derivados ciclometalados de Au(III) pág. 51 COMPLEJOS DE AU(III) CON 2-TIOURACILO (2-TU) Además de los complejos de Au(III) con 2-mercapto pirimidinas, se ha trabajado con 2-tiouracilo. Su elección se justifica por ser un derivado tanto del uracilo presente en el ARN, como del potente quimioterápico 5fluoracilo (5-FU).22 N H NH O ON H NH H O O F N H NH H O S Figura 2.1.21. Estructura del uracilo (izq.), del 5-FU (centro) y 2-Tiouracilo (drcha.) El 5-FU es capaz de entrar en la célula mediante el mismo mecanismo de transporte que el uracilo, una vez allí genera diferentes metabolitos activos análogos a los que generaría el uracilo. Así, sustituye al uracilo e interrumpe la síntesis del ARN y, mediante la inhibición de la timidilato sintasa (TS),22-23 también la síntesis del ADN. De esta forma consigue frenar la proliferación celular de las células tumorales. Así, se busca que este derivado del uracilo también sea capaz de actuar mediante este mecanismo mejorando si cabe la gran efectividad del 5-FU. En el caso de que el 2-tiouracilo (2-TU) no siga esta vía de acción, también cuenta con grupos aceptores y dadores de enlace de hidrógeno que favorecen la solubilidad en agua del complejo final. Para la síntesis de este tipo de complejos se ha seguido el siguiente esquema de reacción (Figura 2.1.22): N Au Cl R N Au Cl Cl R2-Tiouracilo (1eq) KOH, Etanol S N NH O Figura 2.1.22. Esquema de reacción para la obtención de los derivados [AuCl(2-TU)L]. Como ya se puede observar en el anterior esquema de reacción, al contrario que ocurría con los anteriores grupos tiol utilizados; en este caso se da para los tres complejos ciclometalados una sustitución parcial. Para explicar este hecho, de nuevo la RMN ha resultado fundamental, puesto que en los espectros de 1H-RMN realizados para los complejos con unidades 2-TU se ha encontrado como los protones Hi y Hh integran sólo por un protón. A modo de ejemplo, se recoge en la Figura 2.23 el espectro del complejo 10, así como del R=Me (10) R=H (11) R=H ()=CH2 (12) Síntesis y caracterización de derivados ciclometalados de Au(III) pág. 52 2-TU libre; cambios en el desplazamiento de este último confirma también la coordinación al centro metálico. Figura 2.1.23. Espectro de 1H-RMN para el complejo [AuCl(2-TU)tpy] (10). Por otro lado, se realizaron estudios de análisis elemental que confirmaron que sólo se había coordinado un ligando tiouracilo, tal y como se había observado por 1H-RMN. Tabla 2.1.6. Valores de análisis elemental para el complejo 10. %C %H %N %S [Au(2-TU)2tpy] 38.78 2.60 11.31 10.35 [AuCl(2-TU)tpy] 36.61 2.08 7.96 6.08 Datos medidos 10 36.89 1.92 7.77 5.83 Como puede observarse a lo largo de este capítulo, se ha realizado un esfuerzo por determinar el grado de sustitución de los átomos de cloro. Este trabajo se justifica porque es un factor muy influyente no sólo por temas estructurales o de composición, si no por las grandes repercusiones que va a tener la estructura final de un complejo sobre su perfil farmacodinámico y cinético. De hecho, estudios sobre la constante de Ha I=1H Hi I=1H Hh I=1H Hh Hi Hi Ha Hh S H N NH O Hh Hi N Au Cl Me S NNH O Síntesis y caracterización de derivados ciclometalados de Au(III) pág. 53 lipofilicidad de un compuesto muestran como la presencia de un átomo de cloro contribuye positivamente a la hidrofobicidad del complejo respecto de un átomo de H.24 Tabla 2.7. Valores de análisis elemental para los complejos 4, 8 y 10. 4 8 10 Experimental Teórico Experimental Teórico Experimental Teórico %C 40.55 40.89 43.82 43.95 36.61 36.89 %H 2.56 2.75 3.35 3.37 2.08 1.92 %N 11.76 11.92 11.48 11.14 7.96 7.77 %S 10.63 10.92 10.36 10.20 5.83 6.08 En la síntesis de los complejos hasta ahora mencionados, se han utilizado grupos tiol pero con residuos de tipo aromático. Una sustitución total generaría la especie con dos unidades aromáticas con un peso molecular sensiblemente mayor a la especie con sólo un residuo aromático. Según Lipinski, un fármaco con buenas características no debería superar 500 g/mol de peso molecular, por lo que una sustitución parcial parece ser más ventajosa para una mejor biodistribución a través del torrente sanguíneo. Con base en los valores de peso molecular de los productos sintetizados, sí es cierto que los complejos resultantes de una sustitución parcial tienen pesos más próximos a los 500 g/mol propuestos por Lipinski. Tabla 2.8. Pesos moleculares de los complejos sintetizados. Para evaluar esta teoría, se realizaron las medidas de su solubilidad en agua de los complejos de Au(III) hasta ahora comentados (Tabla 2.9). Tabla 2.9. Solubilidad en agua de los complejos con unidades pirimidínicas. N N SH N N SH N H NH O S Complejo Peso Molecular [Au(Spym)2tpy] (4) 602.07 [Au(Spym)2ppy] (5) 588.48 [AuCl(Spym)bzp] (6) 511.78 [Au(4,6-Spym)2tpy] (7) 658.61 [Au(4,6-Spym)2ppy] (8) 644.59 [AuCl(4,6-Spym)bzp] (9) 539.83 [AuCl(2-TU)tpy] (10) 527.78 [AuCl(2-TU)ppy] (11) 513.75 [AuCl(2-TU)bzp] (12) 527.78 Síntesis y caracterización de derivados ciclometalados de Au(III) pág. 54 Compuesto 4 5 6 7 8 9 10 11 12 Sº25 (mg/l) 85 78 87 77 70 80 73 72 71 Los complejos con derivados pirimidínicos no muestran una elevada solubilidad en agua, aunque sí se observa una ligera mejoría en el carácter hidrófilo de los complejos 6 y 9 frente a los derivados análogos con dos unidades mercapto pirimidina. No obstante, la pequeña diferencia observada indica que el efecto del átomo de cloro es casi despreciable frente a la del otro grupo introducido. Con base en estos resultados, se decidió buscar otras alternativas que contribuyeran a mejorar esa solubilidad en agua. Típicamente, se ha trabajado con grupos fosfano para mejorar esta propiedad, especialmente en la química de Au(I);25 pero al tratarse de ligandos P-dadores y neutros, no son buenos candidatos para el Au(III), puesto que no estabilizan tanto este estado de oxidación frente a una posible reducción en el medio intracelular. Por ello, como alternativa, se realizó una búsqueda de una molécula pequeña que contribuyera a disminuir el peso molecular del complejo total, así como con más átomos susceptibles de realizar enlaces de hidrógeno; es decir, buscar alternativas según la Regla de Lipinski. COMPLEJOS DE Au(III) CON UNIDADES TIOUREA Los complejos hasta ahora sintetizados no son todo lo solubles en medio acuoso que se esperaba; sin embargo, sí manifiestan una buena estabilidad tanto en disolución como en estado sólido. Así pues, viendo que los ligandos S-dadores consiguen estabilizar perfectamente el estado de oxidación +III, se decidió mantener este átomo como punto de enlace al centro metálico. Al igual que se ha pretendido con el uso de derivados tiopirimidínicos, el posible carácter biomimético de la molécula a introducir, era un valor añadido para mejorar la asimilación y distribución en el organismo. Con todos estos requisitos, así como la presencia de átomos sensibles a la formación de enlaces de hidrógeno, se recurrió al uso de tiourea (Tabla 2.10). Tabla 2.10. Valores de Lipinski para la tiourea. Log P H Aceptores H Dadores Peso Molecular Tiourea -1.020±0.187 2 4 76.12 Estos valores de los factores de Lipinski mejoran los encontrados para los derivados tiopirimidínicos utilizados anteriormente. Asimismo, cabe destacar que derivados tiourea se han utilizado como fármacos antibacterianos, antialérgicos, antioxidantes, o como antiinflamatorio.26 Esto último, todavía le confiere mejores propiedades para su uso en antitumorales ya que procesos inflamatorios suelen asociarse con varios tipos de cáncer. N Au Cl Cl RN Au S S R NH H2N HN NH2 Tiourea (2eq) KPF6, Acetona R=Me (13) R=H (14) R=H ( )=CH2 (15) Síntesis y caracterización de derivados ciclometalados de Au(III) pág. 55 Figura 2.1.24. Esquema de reacción para la obtención de los derivados de Au(III) con tiourea. Para evaluar el grado de sustitución de los átomos de Cl, hasta ahora el RMN había resultado sumamente útil; sin embargo, en el caso de las unidades tiourea, se debe buscar una técnica alternativa ya que los H de la tiourea son móviles. Estos H se van a estar intercambiando con moléculas de disolventes, haciendo difícil su asignación e integración. Por ello, se ha recurrido a la técnica de análisis elemental y espectrometría de masas. Tabla 2.1.11. Análisis elemental de los complejos 13 y 15. %C %H %N %S Datos Teóricos [Au(tiourea)2L] 32.62 3.13 13.59 12.44 Datos Observados 13 32.46 3.38 13.71 12.55 Datos Observados 15 32.45 3.53 13.78 12.37 Según los resultados recogidos en la Tabla 2.1.11, los análisis elementales son consistentes con la introducción de 2 unidades de tiourea. Esta conclusión también se refuerza con la espectrometría de masas (MALDI+), donde en todos los casos se observa la señal correspondiente al ion molecular: [Au(tiourea)2L] L=tpy (13), bzp (15), PM=513 g/mol. Figura 2.1.25. Señal del ion molecular (M+) para el complejo 13 (arriba), 15 (centro) y simulación para el complejo [Au(tiourea)2L] (abajo). 513.1 514.1 515.1 0_E7\1: +MS 513.1 514.1 515.1 0_G7\1: +MS 513.0 514.0 515.0 0_G7\1: C14H14AuN5S2, M ,513.04 0 5 10 15 20 25 Intens. [%] 0 10 20 30 40 [%] 0 20 40 60 80 100 [%] 509 510 511 512 513 514 515 516 517 m/z Síntesis y caracterización de derivados ciclometalados de Au(III) pág. 56 Una vez aislados y caracterizados, se evalúo la solubilidad en agua de estos complejos, observando una mejora considerable respecto de los complejos hasta ahora sintetizados (Tabla 2.1.12). Sin embargo, los valores encontrados para estos complejos de Au(III) siguen siendo inferiores a los encontrados para fármacos antitumorales como el cis-Pt (2.5 g/l) o el oxaliplatino (4.0 g/l). Tabla 2.1.12. Solubilidad en agua de los complejos con unidades tiourea. Compuesto 13 14 15 Sº25 (mg/l) 150 160 130 COMPLEJOS DE Au(III) CON RESIDUOS ACETATO Tras el estudio de solubilidad realizado con los complejos con unidades tiourea, se comprobó como la utilización de moléculas de menor tamaño y con átomos susceptibles de formar enlaces de H, era beneficiosa para generar complejos más hidrófilos. Por ello, se decidió continuar por esta vía y trabajar con moléculas que reunieran estas dos propiedades. De esta forma, se optó por el uso de ligandos acetato. La síntesis de derivados ciclometalados de Au(III) con unidades acetato se ha explotado siempre con el mismo objetivo que el que aquí nos ocupa, dotar de solubilidad en agua a dicho complejo. Sin embargo, durante el estudio de complejos de este tipo se ha demostrado que, en algunos casos, estos compuestos se hidrolizan perdiendo un primer sustituyente acetato fácilmente, y un segundo más lentamente.7, 27 Aunque por este hecho pueda parecer que este tipo de complejos no son útiles para su aplicación como antitumorales, no es así; ya que la activación de un fármaco mediante procesos de hidrólisis es bien conocida para casos tan importantes como el del cis-Pt. A lo largo de esta tesis doctoral, no sólo se ha buscado desarrollar nuevos fármacos antitumorales, si no que éstos se puedan obtener a través de procedimientos sencillos. Así pues, simplificar y optimizar los procedimientos sintéticos utilizados ha sido también uno de los objetivos de esta investigación; no solo por cuestiones de Green Chemistry, sino también por el hecho de que todas estas reacciones han de ser económicamente viables a nivel industrial si finalmente se comprobara su aplicabilidad en el campo farmacéutico. La obtención de los derivados Au(III)-acetato se ha realizado siguiendo el esquema que se recoge en la Figura 2.1.26. Esta reacción había sido previamente descrita por J.J. Vittal et. al;28 sin embargo, utilizaba condiciones de atmósfera controlada y tiempos más largos que los aquí llevados a cabo. N Au Cl Cl R N Au OAcAcO R AgOAc (2eq) DCM Figura 2.1.26. Esquema de reacción para la síntesis de derivados [Au(OAc)2L]. R=Me (16) R=H (17) R=H ()=CH2 (18) Síntesis y caracterización de derivados ciclometalados de Au(III) pág. 57 Al igual que con el resto de los complejos comentados hasta ahora, estos derivados se han caracterizado por diferentes técnicas, estudiando de nuevo el grado de sustitución de los átomos de Cl por RMN. Mediante el estudio de los espectros de 1H-RMN realizados, se ha podido concluir que la sustitución se produce sobre los dos átomos de Cl coordinándose dos unidades acetato. Este hecho se constata por la inequivalencia observada en los grupos Me (Hi) de los residuos acetato. El origen de esta inequivalencia reside en la diferente naturaleza del átomo dador en posición trans: anillo piridínico (N) o el bencílico (C). Figura 2.1.27. Espectro de 1H-RMN del complejo [Au(OAc)2(tpy)] (16) El espectro que se recoge en la Figura 2.1.27, no sólo demuestra el grado de sustitución, sino también el modo de coordinación de los grupos acetato. El hecho de que se dé una sustitución total, indica que las dos unidades acetato se encuentran coordinadas al centro metálico a través de una unión monodentada; ya que el Au(III) tiene un índice de coordinación 4 que se superaría de darse dos unidades acetato coordinadas bidentadamente. Para confirmar este hecho, se ha recurrido a la espectroscopía IR,29 donde los grupos carboxilato muestran varias bandas intensas que van a proporcionar información estructural especialmente útil. Las bandas más características de compuestos con enlace M-carboxilato son las bandas de tensión CO2 tanto simétrica (s) como asimétrica (as). Estas bandas se dan a frecuencias distintas a las del carboxilato libre por lo que proporcionan una poderosa herramienta, e inequívoca, de caracterización; gracias a que la frecuencia de estas bandas es fuertemente dependiente de la estructura del grupo carboxilato, de la naturaleza del metal y del ligando.30 Esto es importante porque la separación entre estas bandas de tensión va a variar en función de estos mismos factores, siendo por tanto un parámetro indicativo de la estructura del carboxilato (∆). N AuOO OO Hh Hj Hi Hh Hi Hi Síntesis y caracterización de derivados ciclometalados de Au(III) pág. 58 Tabla 2.1.13. Frecuencias de tensión del grupo acetato. Complejo asimétrica (cm-1) simétrica (cm-1) ∆=as-s Tipo de coord.. AcO1578 1414 164 Iónica Si(OAc)4 1745 1290 455 Monodentada RuH(OAc)(PPh3)2 1526 1449 77 Bidentada [Au(OAc)(pmpy)(py)]ClO4 1626 1308 318 Monodentada [Au(OAc)2tpy] 16 1625 1310 315 Monodentada [Au(OAc)2ppy] 17 1633 1309 324 Monodentada [Au(OAc)2bzp] 18 1625 1304 321 Monodentada Respecto de la separación de las bandas del carboxilato libre, una coordinación monodentada suele implicar una mayor diferencia entre las frecuencias de tensión mencionadas (∆). Este hecho se explica por la ruptura en la simetría del carbonilo, que conlleva un aumento de as y una disminución de s; como ocurre con la especie de silicio.30 De darse enlaces de hidrógeno con moléculas de disolvente, la elucidación del tipo de coordinación del grupo carboxílico es más compleja ya que as decrece.31 Según lo mencionado anteriormente, y de acuerdo con los valores recogidos en la Tabla 2.1.13, se puede proponer que las dos unidades acetato están coordinadas de forma monodentada. Asimismo, el complejo ciclometalado de Au(III) descrito por Parish et al., y recogido en la Tabla 2.1.13, también se estudió por difracción de rayos X, confirmando la coordinación del grupo acetato de forma monodentada, tal y como se había predicho por espectroscopia infrarroja.20 Figura 2.1.28. Estructura del complejo [Au(OAc)(pmpy)(py)]+. El complejo cristaliza con una molécula de CH2Cl2 que se ha omitido por simplicidad. Al igual que con el resto de los complejos sintetizados, tras determinar su estructura, se realizaron los estudios de solubilidad en agua: Tabla 2.1.14. Solubilidad en agua de los complejos con unidades acetato. Compuesto 16 17 18 Sº25 (mg/l) 420 720 1200 Síntesis y caracterización de derivados ciclometalados de Au(III) pág. 65 Figura 2.1.34. Comparativa de la zona aromática de los espectros de 1H-RMN de los complejos [AuCl2(tpy)] 1 (arriba) y [Au(tolilacetileno)2tpy] 24 (abajo). La coordinación de la unidad etinilo se confirma no sólo por la modificación del espectro respecto del [AuCl2L] por la aparición de las señales de los anillos, sino también un desplazamiento a campo bajo de la señal del Hg adyacente a N-py. En lo que se refiere a la sustitución de los dos átomos de Cl, se puede demostrar por el carácter inequivalente observado para cada unidad acetiluro, ya que una se encuentra en una posición trans a piridina y la otra, trans a benceno. Este fenómeno se percibe en la zona aromática con los dos dobletes de cada Hi inequivalente; y aún más claramente en la zona alifática, con los dos singletes adicionales respecto del espectro de 1H-RMN de [AuCl2tpy], correspondientes a los dos metilos diferentes de cada unidad acetiluro. (Figura 2.1.35). Figura 2.1.35. Comparativa de la zona alifática de los espectros de 1H-RMN de los complejos [AuCl2tpy] 1 (arriba) y [Au(tolilacetileno)2tpy] 24 (abajo). Me Me Me Hh N Au Me Me Me Ha Hg Ha Ha N Au Me ClCl Ha Hg Hg Hg Hi’ Hi’ Hh Hi Hi Hh’ Hh’ Síntesis y caracterización de derivados ciclometalados de Au(III) pág. 66 La estructura propuesta por RMN fue confirmada posteriormente por estudios de difracción de rayos X sobre unos cristales obtenidos por evaporación lenta de CDCl3. Figura 2.1.36. Estructura cristalina del complejo [Au(Tolilacetileno)2tpy] (24). Los datos cristalográficos más importantes se recogen en la Tabla 2.1.21, donde se puede observar una ligera distorsión de la geometría plano cuadrada típica de Au(III) que implica ángulos de 90º. Esta distorsión se debe al anillo ciclometalado que genera una mayor tensión angular (Tabla 2.1.21b. entrada 7) que en el resto de los ángulos, que sí son más próximos a 90º (Tabla 2.1.21b. entradas 5, 6 y 8). Además de la distorsión del entorno plano cuadrado del metal, los ángulos Au-C≡C también exhiben una ligera desviación de la linealidad típica 180º, especialmente en el caso Au-C13-C14 (Tabla 2.1.21b. entrada 2), que podría explicarse por la menor distancia observada en el enlace Au-C22 (Tabla 2.1.21a. entrada 1); ya que esto indicaría que la densidad electrónica estaría más localizada en ese enlace que en el alquinilo. Tabla 2.1.21. Datos cristalográficos más relevantes del complejo [Au(Tolilacetileno)2tpy] (24). Distancias (Å) 1 2 3 4 5 6 Au-C22 Au-N1 Au-C13 Au-C7 C13-C14 C22-C23 1.953(6) 2.032(3) 2.043(6) 2.049(4) 1.209(8) 1.202(9) Ángulos (º) 1 2 3 4 5 6 7 8 Au-C22-C23 Au-C13-C14 C22-Au-N1 C13-Au-C7 C22-Au-C13 C22-Au-C7 N1-Au-C7 N1-Au-C13 177.7(6) 170.6(5) 173.7 (2) 173.7(2) 91.9(2) 92.7(2) 81.4(2) 94.1(2) a b Síntesis y caracterización de derivados ciclometalados de Au(III) pág. 67 Una vez aislados y caracterizados los complejos con unidades alquinilo, se realizó un nuevo estudio de solubilidad en agua para evaluar su aplicación como fármaco. Los resultados se recogen en la Tabla 2.1.22: Tabla 2.1.22. Solubilidad (mg/l) en agua de los complejos con unidades acetileno. Compuesto 24 25 26 27 Solubilidad 102 142 197 220 Según los valores recogidos en la Tabla 2.1.22, los complejos [Au(C≡CR)2L] son ligeramente más solubles en agua que los que incorporan los derivados pirimidínicos, pero menos que los que contienen grupos acetato. Con base en este estudio se ha concluido que no sólo átomos capaces de generar enlaces de hidrógeno son suficientes para dotar de una buena solubilidad al complejo, sino que debe ser la conjunción de esta propiedad y el tamaño. Además, se han estudiado las propiedades luminiscentes de estos derivados en disolución 5·10-3 M en CH2Cl2, y todos brillan en el color naranja. (ver anexos) COMPLEJOS DE Au(I) En la introducción ya se ha recogido que, a pesar de ser el mismo metal, el estado de oxidación tiene un marcado efecto en la química del Au. Mientras que el Au(III) es duro, el Au(I) tiene un carácter blando, por lo que tenderá a coordinarse con ligandos blandos como P-, o S-dadores. Esta tendencia se pone de manifiesto en el precursor de Au(I) utilizado generalmente: [AuCl(tht)] (tht: tetrahidrotiofeno). La elección de este complejo de Au(I) como precursor reside en dos grandes ventajas, la primera es que el ligando tht tiene un carácter lábil que permite reemplazarlo por una gran variedad de nuevos grupos. La segunda de las ventajas es el hecho que tiene H visibles por RMN, lo que permite evaluar el éxito de la reacción, así como la pureza del producto formado. Tal y como se ha comentado, la estabilización de compuestos de Au(I) mediante la coordinación de ligandos fosfano es ampliamente conocida, y se ha estudiado en el grupo mediante la realización de varias tesis doctorales, Trabajos Fin de Máster y de Grado.48-50 En ellos, se ha constatado esta estabilización, pero también se ha aprovechado para utilizar fosfanos hidrosolubles para conferir a los complejos esta propiedad. Entre los fosfanos utilizados destacan PTA, derivados PTA y HMPT. Sin embargo, la presente investigación se ha centrado en el fosfano HMPT ya que presenta una solubilidad en agua superior a la de los otros fosfanos sintetizados (Tabla 2.1.23). Tabla 2.1.23. Solubilidad en agua (25ºC ) de algunos fosfanos utilizados en el grupo.51 Fosfano PTA [PTA-CH2pCOOHC6H4]Br [PTA-CH2pCH2COOHC6H4]Br [PTA-CH2pNO2C6H4]Br [pybisPTA]Br2 [PTA-mCH2C6H4CH2PTA]Br2 HMPT Solubilidad (g/l) 235 17.1 20.7 28.2 854 810 1000 Síntesis y caracterización de derivados ciclometalados de Au(III) pág. 68 A pesar de la gran solubilidad del fosfano seleccionado, éste tiene como inconveniente la baja estabilidad al aire en su forma libre, por lo que se han requerido condiciones de atmósfera controlada para la preparación del producto de partida. Figura 2.1.37. Esquema sintético para la obtención del producto de partida [AuCl(HMPT)]. El producto [AuCl(HMPT)] ya había sido aislado y caracterizado previamente por Schmidbaur et al. en 1997,52 pero en esta tesis se han cambiado las condiciones para utilizar el derivado [AuCl(tht)] en vez del derivado con dimetilsulfuro. Este cambio se justifica por el hecho de que el tht no tiene establecido un valor límite de exposición diaria (TLV), mientras que el dimetilsulfuro sí (TLV=10ppm).53 Este complejo ha servido como producto de partida para la obtención de derivados con unidades tiol y acetiluro, mediante la desprotonación con KOH en medio etanólico. Así, los productos recogidos en la Figura 2.1.38, se sintetizaron bajo nuestra supervisión en los Trabajos Fin de Grado de R. Pena-Martinez y N. Espallargas.48-49 Figura 2.1.38. Esquema sintético para la obtención de derivados de Au(I) con el fosfano HMPT (28-41). AuCl P N N NAu P N N N R Br Cl MeO Me NN Au P N N NRS R NS N NS N NSS N S S N S S N N HN H N S O HSR KOH, Etanol KOH, Etanol S Au Cl AuCl P N N N P N N N Acetona, Ar Síntesis y caracterización de derivados ciclometalados de Au(III) pág. 69 Así se aislaron y caracterizaron los siguientes complejos, donde resulta especialmente útil la 31P{1H}-RMN para evaluar tanto la sustitución del Cl como la pureza del complejo. En todos los casos, se encontró una única señal en 31P{H}-RMN generada por el ligando HMPT, que presentaba un desplazamiento hacia campo bajo respecto del encontrado con el producto de partida. Este desapantallamiento se dio de forma más marcada para los derivados con unidades etinilo. Tabla 2.1.24. Desplazamientos (ppm) encontrados en 31P{1H} -RMN para los derivados de Au(I). COMPLEJO 31P {1H} RMN (ppm) [AuCl(HMPT) 110.87 [Au(2-Mercaptopiridina) HMPT] 28 124.05 [Au(2-Mercaptopirimidina) HMPT] 29 124.05 [Au(2-Mercapto-4,6-Dimetilpirimidina) HMPT] 30 110.86 [Au(2-Mercaptobenzotiazol) HMPT] 31 121.06 [Au(2-Mercaptotiazolina) HMPT] 32 122.80 [Au(2-Mercaptobenzimidazol) HMPT] 33 120.78 [Au(2-Tiouracil) HMPT] 34 120.88 [Au(Fenilacetileno)HMPT] 35 133.46 [Au(Tolilacetileno) HMPT] 36 133.23 [Au(4-OMe-fenilacetileno) HMPT] 37 135.24 [Au(4-Br-fenilacetileno) HMPT] 38 133.24 [Au(4-Cl-fenilacetileno) HMPT] 39 133.18 [Au(2-etinilpiridina) HMPT] 40 133.12 [Au(3-etinilpiridina) HMPT] 41 132.92 Estos complejos de Au(I) fueron también caracterizado por el resto de técnicas habituales incluyendo difracción de Rayos X para algunos de los complejos: Figura 2.1.39. Estructuras cristalinas de los complejos [Au(2-Mercapto-4,6-Dimetilpirimidina)HMPT] 30 (a), [Au(2-Mercaptobenzotiazol)HMPT] 31 (b), [Au(2-Tiouracil) HMPT] 34 (c) [Au(4-OMefenilacetileno)HMPT] 37 (d) y [Au(Tolilacetileno)HMPT] 35 (e). e d a b c Síntesis y caracterización de derivados ciclometalados de Au(III) pág. 70 Las distancias y ángulos más relevantes de estas estructuras se encuentran recogidos en la Tabla 2.1.25. De entre las distancias detalladas, merece una especial atención la distancia Au-R, puesto que, a pesar de que la distancias Au-P es bastante similar entre los complejos con acetileno y tioles, las distancias Au-R son significativamente distintas. Las distancias Au-S de los complejos coinciden con las encontradas en la bibliografía,21 así como las distancias de los derivados acetileno.38 En lo que respecta al ángulo Au-C≡C, se puede observar la ligera distorsión de la linealidad típica del Au(I), aunque el derivado con tolilacetileno presenta un ángulo de enlace muy próximo al valor ideal de 180ºC. Algo similar ocurre con el ángulo de enlace Au-S-C, donde se observa perfectamente la geometría angular impuesta por el átomo de azufre. Tabla 2.1.25. Distancias y enlaces representativos de los complejos: [Au(4-OMe-fenilacetileno)HMPT] 37, [Au(Tolilacetileno)HMPT] 35, [Au(2-Mercapto-4,6-Dimetilpirimidina)HMPT] 30, [Au(2Mercaptobenzotiazol)HMPT] 31 y [Au(2-Tiouracil) HMPT] 34. [Au(4-OMePhacetileno)HMPT] [Au(Tolilacetileno) HMPT] [Au(4,6DimetilSpym) HMPT] [Au(2-Sbenzotiazol)HMPT] [Au(2Tiouracil) HMPT] Distancias (Å) Au-P 2.2731(3) 2.272(2) 2.2623(13) 2.2655(13) 2.252(6) Au-R 2.006(6) 2.053(7) 2.3114(14) 2.3153(13) 2.319(6) C≡C 1.194(8) 1.137(12) Ángulos (º) R-Au-P 173.56(16) 179.75(18) 173.35(5) 178.03(4) 179.2(2) Au-C≡C 170.2(5) 179.3(7) C≡C-C 176.2(6) 179.9(9) Au-S-C 104.01(19) 102.93(15) 100.4(7) Una vez perfectamente caracterizados, se procedió al estudio de sus propiedades comenzando por cuantificar su solubilidad en agua. Síntesis y caracterización de derivados ciclometalados de Au(III) pág. 71 Tabla 2.1.26. Solubilidad en agua (25ºC) de los derivados de Au(I). COMPLEJO Solubilidad (mg/l) [AuCl(HMPT) 496.6 [Au(2-Mercaptopiridina) HMPT] 28 103.0 [Au(2-Mercaptopirimidina) HMPT] 29 180.2 [Au(2-Mercapto-4,6-Dimetilpirimidina) HMPT] 30 440.0 [Au(2-Mercaptobenzotiazol) HMPT] 31 141.1 [Au(2-Mercaptotiazolina) HMPT] 32 305.5 [Au(2-Mercaptobenzimidazol) HMPT] 33 184.7 [Au(2-Tiouracil) HMPT] 34 333.4 [Au(Fenilacetileno)HMPT] 35 150.6 [Au(Tolilacetileno) HMPT] 36 135.8 [Au(4-OMe-fenilacetileno) HMPT] 37 198.2 [Au(4-Br-fenilacetileno) HMPT] 38 95.6 [Au(4-Cl-fenilacetileno) HMPT] 39 101.7 [Au(2-etinilpiridina) HMPT] 40 236.4 [Au(3-etinilpiridina) HMPT] 41 280.7 Según estos valores, se comprueba que los complejos de Au(I), a pesar de introducir un fosfano tan soluble como HMPT; no presentan una solubilidad en agua mucho mayor que los derivados de Au(III). Si se compara los derivados análogos de Au(I) y Au(III) se puede observar como los complejos de Au(III) son hasta dos veces más solubles en medio acuoso, que los sintetizados con Au(I): Tabla 2.1.27. Estudio de la solubilidad en función del estado de oxidación del metal Au(I) y Au(III). Sº (mg/l) [AuXL] L: HMPT 440 333 135 [AuX2L] L: tpy 870 730 102 N N SH N H NH O S HC Me Bibliografía pág. 72 BIBLIOGRAFÍA 1. ADMET for medicinal chemists: A Practical Guide. John Wiley & Sons: 2010. 2. Lipinski, C. A.; Lombardo, F.; Dominy, B. W.; Feeney, P. J., Experimental and computational approaches to estimate solubility and permeability in drug discovery and development settings. Adv Drug Deliv Rev 2001, 46 (1-3), 3-26. 3. Fernandez-Cestau, J.; Bertrand, B.; Blaya, M.; Jones, G. A.; Penfold, T. J.; Bochmann, M., Synthesis and luminescence modulation of pyrazine-based gold(iii) pincer complexes. Chemical Communications 2015, 51 (93), 16629-16632. 4. Meyer, N.; Sivanathan, S.; Mohr, F., Transfer of organic gropus to gold using organotin compounds. Journal of organometallic chemistry 2011, 696, 3. 5. Nonoyama, M.; Nakajima, K., Direct cycloauration of 1-(2-pyridylamino and 2pyrimidinylamino)naphthalene and 2-(p-toluidino)quinoline with sodium tetrachloroaurate(III). Transition Metal Chemistry 1999, 24 (4), 449-453. 6. Fuchita, Y.; Ieda, H.; Wada, S.; Kameda, S.; Mikuriya, M., Organogold(III) complexes derived from auration reactions of thienyl-substituted pyridine derivatives. J. Chem. Soc., Dalton Trans. 1999, 0, 4. 7. Parish, R. V.; Mack, J.; Hargreaves, L.; Wright, J. P.; Buckely, R. G.; Elsome, A. M.; Fricker, S. P.; Theobald, B. R., Chemical and biological reactions of diacetato[2-(dimethylaminomethyl)-phenyl]gold(III), [Au(O2CMe)2(dmamp)]. J. Chem. Soc., Dalton Trans. 1996, 0, 5. 8. Cinellu, M. A.; Zucca, A.; Stoccoro, S.; Minghetti, G.; Manassero, M.; Sansoni, M., Synthesis and characterization of gold(III) adducts and cyclometallated derivatives with 6-benzyland 6-alkyl-2,2′- bipyridines. Journal of the Chemical Society, Dalton Transactions 1996, (22), 4217-4225. 9. Colom, E. Aplicación de derivados ortometalados de Au(III). Trabajo Fin de Master, 2015. 10. Gomez-Bachiller, M. Ligandos y complejos metálicos solubles en agua: Síntesis, estructuras y propiedades biológicas. Trabajo Fin de Grado, Universidad de Zaragoza, 2017. 11. Cattalini, L.; Clark, R. J. H.; Orio, A.; Poon, C. K., The Infrared Spectra (450-70 cm-1 ) of Square Planar Pyridine an Substituted Pyridine Complexes of Gold(III) Inorganica Chimica Acta 1968, 2, 3. 12. Ryabov, A. D.; Sakodinskaya, I. K.; Yatsimirsky, A. K., Kinetics and mechanism of ortho-palladation of ring-substituted NN-dimethylbenzylamines. Journal of the Chemical Society, Dalton Transactions 1985, (12), 2629-2638. 13. Ryabov, A. D., Mechanisms of intramolecular activation of carbon-hydrogen bonds in transition-metal complexes. Chemical Reviews 1990, 90 (2), 403-424. 14. Davies, D. L.; Donald, S. M. A.; Macgregor, S. A., Computational Study of the Mechanism of Cyclometalation by Palladium Acetate. Journal of the American Chemical Society 2005, 127 (40), 1375413755. 15. Parish, R. V., Organogold chemistry: I structure and synthesis. Gold Bulletin 1997, 30 (1), 3-12. 16. Janzen, D. E.; Doherty, S. R.; VanDerveer, D. G.; Hinkle, L. M.; Benefield, D. A.; Vashi, H. M.; Grant, J. G., Cyclometallated gold(III) complexes with a trithiacrown ligand: Solventless Au(III) cyclometallation, intramolecular goldesulfur interactions, and fluxional behavior in 1,4,7-trithiacyclononane Au(III) complexes. Journal of Organometallic Chemistry 2014, 755, 10. 17. Henderson, W.; Nicholson, B. K.; Faville, S. J.; Fan, D.; Ranford, J. D., Gold(III) thiosalicylate complexes containing cycloaurated 2-arylpyridine, 2-anilinopyridine and 2-benzylpyridine ligands. Journal of Organometallic Chemistry 2001, 631 (1-2), 5. 18. Constable, E. C.; Leese, T. A., Cycloaurated derivatives of 2-phenylpyridine. J. Organomet. Chem. 1984, 363 (3), 5. 19. Brandon, J. Síntesis de compuestos organometálicos de metales nobles con posible aplicación en química médica. Trabajo Fin de Grado, Universidade da Coruña, 2014. 20. Parish, R. V.; Wright, J. P.; Pritchard, R. G., Mercury(II) and gold(III) derivatives of 2-phenyl pyridines and 2-phenyl-4-(methylcarboxylato)quinoline. Journal of Organometallic Chemistry 2000, 596 (12), 11. 21. Bertrand, B.; Spreckelmeyer, S.; Bodio, E.; Cocco, F.; Picquet, M.; Richard, P.; Le Gendre, P.; Orvig, C.; Cinellu, M. A.; Casini, A., Exploring the potential of gold(III) cyclometallated compounds as cytotoxic agents: variations on the C^N theme. Dalton Trans 2015, 44 (26), 11911-8. 22. Longley, D. B.; Harkin, D. P.; Johnston, P. G., 5-fluorouracil: mechanisms of action and clinical strategies. Nat Rev Cancer 2003, 3 (5), 330-8. Bibliografía pág. 73 23. Rose, M. G.; Farrell, M. P.; Schmitz, J. C., Thymidylate synthase: a critical target for cancer chemotherapy. Clin Colorectal Cancer 2002, 1 (4), 220-9. 24. Thomas, G., Medicinal Chemisty, an introduction. Wiley 2000; Vol. 1, p 517. 25. Nobili, S.; Mini, E.; Landini, I.; Gabbiani, C.; Casini, A.; Messori, L., Gold compounds as anticancer agents: chemistry, cellular pharmacology, and preclinical studies. Med Res Rev 2010, 30 (3), 550-80. 26. Shakeel, A.; Altaf, A. A.; Quershi, A. M.; Badshah, A., Thiourea Derivatives in Drug Design and Medicinal Chemistry: A Short Review. Journal of Drug Design and Medicinal Chemistry 2016, 2 (1), 10. 27. Buckley, R. G.; Elsome, A. M.; Fricker, S. P.; Henderson, G. R.; Theobald, B. R.; Parish, R. V.; Howe, B. P.; Kelland, L. R., Antitumor properties of some 2-[(dimethylamino)methyl]phenylgold(III) complexes. J Med Chem 1996, 39 (26), 5208-14. 28. Fan, D.; Yang, C. T.; Ranford, J. D.; Lee, P. F.; Vittal, J. J., Chemical and biological studies of the dichloro(2-phenylpyridine) gold(III) complex and its derivatives. Dalton Trans 2003, 0, 5. 29. Palacio, E. G., Infrared spectroscopy of metal carboxylates: II. Analysis of Fe(III), Ni and Zn carboxylate solutions. Hydrometallurgy 2004, 72, 9. 30. Colthup, N.; Daly, L.; Wiberley, S., Introduction to Infrared and Raman Spectroscopy. 3rd ed.; 1990; p 547. 31. Nakamoto, K., Infrared and Raman Spectra of Inorganic and Coordination Compounds. 6th ed.; 2009; Vol. Part B: Applications in Coordination, Organometallic, and Bioinorganic Chemistry. 32. Canellos, G. P.; Pocock, S. J.; Taylor, S. G., 3rd; Sears, M. E.; Klaasen, D. J.; Band, P. R., Combination chemotherapy for metastatic breast carcinoma. Prospective comparison of multiple drug therapy with Lphenylalanine mustard. Cancer 1976, 38 (5), 1882-6. 33. Lai, H. S.; Lee, J. C.; Lee, P. H.; Wang, S. T.; Chen, W. J., Plasma free amino acid profile in cancer patients. Semin Cancer Biol 2005, 15 (4), 267-76. 34. Wiggins, T.; Kumar, S.; Markar, S. R.; Antonowicz, S.; Hanna, G. B., Tyrosine, Phenylalanine, and Tryptophan in Gastroesophageal Malignancy: A Systematic Review. Cancer Epidemiology, Biomarkers & Prevention 2015, 24 (1), 6. 35. Hoffman, R. M., Methionine dependence in cancer cells - a review. In Vitro 1982, 18 (5), 421-8. 36. Hoffman, R. M., Altered methionine metabolism, DNA methylation and oncogene expression in carcinogenesis. A review and synthesis. Biochim Biophys Acta 1984, 738 (1-2), 49-87. 37. Garg, J. A.; Blacque, O.; Venkatesan, K., Syntheses and photophysical properties of luminescent mono-cyclometalated gold(III) cis-dialkynyl complexes. Inorg Chem 2011, 50 (12), 5430-41. 38. Wong, K. M.; Hung, L. L.; Lam, W. H.; Zhu, N.; Yam, V. W., A class of luminescent cyclometalated alkynylgold(III) complexes: synthesis, characterization, and electrochemical, photophysical, and computational studies of [Au(C=N=C)(C triple bond C-R)] (C=N=C = kappa(3)C,N,C bis-cyclometalated 2,6diphenylpyridyl). J Am Chem Soc 2007, 129 (14), 4350-65. 39. Yam, V. W.; Wong, K. M.; Hung, L. L.; Zhu, N., Luminescent gold(III) alkynyl complexes: synthesis, structural characterization, and luminescence properties. Angew Chem Int Ed Engl 2005, 44 (20), 3107-10. 40. Vergara, E.; Cerrada, E.; Casini, A.; Zava, O.; Laguna, M.; Dyson, P. J., Antiproliferative Activity of Gold(I) Alkyne Complexes Containing Water-Soluble Phosphane Ligands. Organometallics 2010, 29 (11), 7. 41. Lu, W.; Mi, B. X.; Chan, M. C.; Hui, Z.; Che, C. M.; Zhu, N.; Lee, S. T., Light-emitting tridentate cyclometalated platinum(II) complexes containing sigma-alkynyl auxiliaries: tuning of photoand electrophosphorescence. J Am Chem Soc 2004, 126 (15), 4958-71. 42. Hemmert, C.; Gornitzka, H., Luminescent bioactive NHC-metal complexes to bring light into cells. Dalton Trans 2016, 45 (2), 440-7. 43. Wenzel, M.; de Almeida, A.; Bigaeva, E.; Kavanagh, P.; Picquet, M.; Le Gendre, P.; Bodio, E.; Casini, A., New Luminescent Polynuclear Metal Complexes with Anticancer Properties: Toward Structure-Activity Relationships. Inorg Chem 2016, 55 (5), 2544-57. 44. Visbal, R.; Fernandez-Moreira, V.; Marzo, I.; Laguna, A.; Gimeno, M. C., Cytotoxicity and biodistribution studies of luminescent Au(i) and Ag(i) N-heterocyclic carbenes. Searching for new biological targets. Dalton Trans 2016, 45 (38), 15026-33. 45. Zhang, J.; Fu, Y.; Conroy, C. V.; Tang, Z.; Li, G.; Zhao, R. Y.; Wang, G., Fluorescence Intensity and Lifetime Cell Imaging with Luminescent Gold Nanoclusters. J Phys Chem C Nanomater Interfaces 2012, 116 (50). 46. Reichardt, C., Solvents and Solvent Effects in Organic Chemistry. 3rd ed.; Wiley-VCH Publishers: 2003. 47. Sykes, P., Mecanismos de reacción en química orgánica. 1985. Bibliografía pág. 74 48. Espallargas, N. Diseño de ligandos y complejos metálicos solubles en agua como agentes terapéuticos contra cáncer y alzheimer. Trabajo Fin de Grado, Universidad de Zaragoza, 2017. 49. Pena-Martinez, R. Ligandos y complejos metálicos solubles en agua: Síntesis, estructura y propiedades biológicas. Trabajo Fin de Grado, Universidad de Zaragoza, 2016. 50. Atrián-Blasco, E. Síntesis dirigida de complejos de oro solubles en agua. Trabajo Fin de Máster, Universidad de Zaragoza, 2012. 51. Atrián-Blasco, E. Síntesis dirigida de compuestos metálicos solubles en agua en función de sus aplicaciones biomédicas. Universidad de Zaragoza, 2015. 52. Bauer, A.; Mitzel, N. W.; Schier, A.; Schmidbaur, H.; Rankin, D. W. H., Tris(dimethylamino)phosphane as a New Ligand in Gold(I) Chemistry: Synthesis and Crystal Structures of [(Me2N)3P]AuCl, {[(Me2N)3PAu]3O}+BF4−, {[Me2N)3PAu]3NP(NMe2)32+ {BF−4}2 and the Precursor Molecule (Me2N)3PNSiMe3. Chemische Berichte 1997, 30 (4), 5. 53. trabajo, I. n. d. s. e. h. e. e. http://www.insht.es/InshtWeb/Contenidos/Documentacion/FichasTecnicas/FISQ/Ficheros/801a900/nspn08 78.pdf (accesed June 2018). Estudios de viabilidad celular pág. 81 En la Tabla 2.2.2, se recogen los resultados de los valores de IC50 obtenidos para los complejos de Au(I) [Au(SR)(HMPT)] para los experimentos realizados sobre las Caco-2 tumorales y normales. Tabla 2.2.2. Valores de IC50 (µM) de los derivados de [Au(SR)(HMPT)]. Compuesto IC50 en células tumorales IC50 en células normales Cis-Pt 45.6±8.08 Auranofin 2.10±0.40 [Au(2-Mercaptopiridina)HMPT] 28 3.87±0.15 10.5±0.07 [Au(2-Mercaptopirimidina) HMPT] 29 3.08±0.14 5.14±0.08 [Au(2-Mercapto-4,6-Dimetilpirimidina) HMPT] 30 3.17±0.10 8.81±0.09 [Au(2-Mercaptobenzotiazol) HMPT] 31 3.16±0.20 11.3±0.08 [Au(2-Mercaptotiazolina) HMPT] 32 7.40±0.10 10.1±0.14 [Au(2-Mercaptobenzimidazol) HMPT] 33 4.50±0.10 Sin efecto [Au(2-Tiouracil) HMPT] 34 4.55±0.11 Sin efecto Los datos se expresan como la media ± EEM y n ≥ 12 experimentos. El complejo menos efectivo de los que incorporan un grupo tiol fue el [Au(2-Mercaptotiazolina) HMPT] con una IC50 de 7.40±0.10 µM, mientras que el más efectivo fue el [Au(2-Mercaptopirimidina) HMPT] con una IC50 de 3.08±0.14 µM. Por otra parte, todos los complejos testados demostraron ser menos efectivos que el auranofin con una IC50 de 2.10±0.40 µM, pero más efectivos que el cis-Pt con una IC50 de 45.6±8.08 µM. Cuando se testaron los complejos en células normales, sólo los complejos subrayados 33 y 34, no tuvieron efecto sobre la viabilidad celular. Por ello, y a pesar de que no son los más citotóxicos para las células tumorales, son éstos los compuestos que se seleccionaron para realizar estudios más exhaustivos. De la misma forma se procedió con los complejos de Au(I) unidades alquinilo, [Au(C≡CR)(HMPT)]. Sorprendentemente, se puede observar que cuando se utilizan grupos acetiluro en vez de grupos tiol, se mejora considerablemente la selectividad de los complejos, ya que todos estos complejos afectan a la viabilidad de las células tumorales (Figura 2.2.4), pero sólo el complejo 36 tiene efecto citotóxico sobre células epiteliales normales. Estudios de viabilidad celular pág. 82 Figura 2.2.4. Curvas dosis-respuesta de los complejos [Au(C≡CR)(HMPT)] en células Caco-2 tumorales (5 d). Los datos se expresan como la media ± EEM y n=16 experimentos. Se utilizó un test ANOVA de 1vía y un post-análisis de comparación múltiple Bonferroni para comparar los efectos de las diferentes concentraciones del compuesto respecto del control (***p<0.001 para 35-41) En la Tabla 2.2.3, se recogen los valores de IC50 obtenidos para los complejos con estructura [Au(C≡CR)(HMPT)]. Tabla 2.2.3. Valores de IC50 (µM) de los derivados de [Au(C≡CR)(HMPT)]. Compuesto IC50 en células tumorales IC50 en células normales cis-Pt 45.6±8.08 Auranofin 2.10±0.4 [Au(Fenilacetileno)HMPT] 35 3.72±0.08 Sin efecto [Au(Tolilacetileno) HMPT] 36 4.02±0.18 14.4±0.09 [Au(4-Br-fenilacetileno) HMPT] 38 5.25±0.21 Sin efecto [Au(4-Cl-fenilacetileno) HMPT] 39 6.14±0.14 Sin efecto [Au(2-etinilpiridina) HMPT] 40 2.33±0.10 Sin efecto [Au(3-etinilpiridina) HMPT] 41 6.26±0.15 Sin efecto Los datos se expresan como la media ± EEM y n ≥ 12 experimentos. El complejo más efectivo de este grupo fue el 40 con una IC50 de 2.33±0.10 µM, mientras que el menos efectivo fue el 41con una IC50 de 6.26±0.15 µM. Al igual que con los complejos que llevan tiol, los complejos con grupos acetiluro son más efectivos que el cis-Pt, pero menos efectivos que el auranofin, aunque el complejo 40 tiene una IC50 similar a la del auranofin. Por todo ello, para los siguientes estudios se seleccionaron todos los complejos, a excepción del [Au(Tolilacetileno)HMPT] 36, que tuvo efecto citotóxico sobre las células sanas. -6.0 -5.5 -5.0 -4.5 0 50 100 Log Concentración, [M] Viabilidad celular (% respecto Control) 35 -6.0 -5.5 -5.0 -4.5 0 50 100 Log Concentración, [M] Viabilidad celular (% respecto Control) 36 -6.0 -5.5 -5.0 -4.5 0 50 100 150 Log Concentración, [M] Viabilidad celular (% respecto Control) 38 -6.0 -5.5 -5.0 -4.5 0 50 100 Log Concentración, [M] Viabilidad celular (% respecto Control) 39 -6.0 -5.5 -5.0 -4.5 0 50 100 150 Log Concentración, [M] Viabilidad celular (% respecto Control) -6.0 -5.5 -5.0 -4.5 0 50 100 Log Concentración, [M] Viabilidad celular (% respecto Control) 4140 Estudios de viabilidad celular pág. 83 RELACIÓN ESTRUCTURA-ACTIVIDAD: ESTUDIOS SAR El hecho de que se hayan sintetizado estas familias de Au(I) y Au(III) se ha visto motivado por el intento de realizar estudios SAR con los que poder relacionar la actividad con la estructura y así, intentar elucidar la parte activa de la molécula, denominada farmacóforo. De esta forma, si se comparan los complejos [Au(fenilacetileno)HMPT] 35 y [Au(tolilacetileno)HMPT] 36, se puede observar la influencia de la estructura sobre la actividad citotóxica. No sólo el complejo con la unidad fenilacetileno resulta más activo que el que contiene tolilacetileno, sino que además es más selectivo, puesto que no presenta efecto sobre células normales. La única diferencia estructural reside en la presencia del grupo metilo, que aumenta el tamaño final del complejo y con ello su lipofilicidad. Esto se traduce en una mayor penetrabilidad en las membranas celulares,13 lo que podría favorecer el efecto inhibitorio del complejo [Au(Tolilacetileno) HMPT], en las células normales. Valorando los resultados de los estudios en células tumorales y sanas, los productos seleccionados para profundizar en el estudio de su mecanismo de acción fueron los siguientes: Tabla 2.2.4. Valores de IC50 (µM) de los derivados de [Au(X)(HMPT)] seleccionados. Compuesto IC50 en células tumorales IC50 en células normales Código [Au(Fenilacetileno)HMPT] 3.72±0.08 Sin efecto 35 [Au(4-Br-fenilacetileno)HMPT] 5.25±0.21 Sin efecto 38 [Au(4-Cl-fenilacetileno)HMPT] 6.14±0.14 Sin efecto 39 [Au(2-etinilpiridina)HMPT] 2.33±0.10 Sin efecto 40 [Au(3-etinilpiridina)HMPT] 6.26±0.15 Sin efecto 41 [Au(2-Mercaptobenzimidazol)HMPT] 4.50±0.10 Sin efecto 33 [Au(2-Tiouracil)HMPT] 4.55±0.11 Sin efecto 34 Los datos se expresan como la media ± EEM y n ≥ 12 experimentos. Según los valores de la Tabla 2.2.4, y como se ha descrito anteriormente, todos los complejos de Au(I) seleccionados presentan valores inferiores al cis-Pt para esta línea tumoral, y aunque no mejoran los valores del auranofin, la selectividad de estos complejos es buena, puesto que no son citotóxicos para las células normales incluso a concentraciones 5 veces superiores a su IC50. COMPLEJOS DE Au(III) Este mismo estudio se ha realizado con todos los cicloauratos sintetizados a lo largo de esta investigación 127; donde se pudo observar que los complejos de Au(III), 5, 10, 12, 20 y 24 tenían efecto sobre la viabilidad de las células Caco-2 tumorales (Figura 2.2.5). Sin embargo, los compuestos 1-4, 6-9, 11, 13-19, 21-23, 25-27; no mostraron efecto citotóxico sobre estas células. Estudios de viabilidad celular pág. 84 Figura 2.2.5. Curvas dosis-respuesta de los complejos [Au(X)(CN)] en células Caco-2 tumorales (5 d). Los datos se expresan como la media ± EEM y n≥12 experimentos. Se utilizó un test ANOVA de 1vía y un post-análisis de comparación múltiple Bonferroni para comparar los efectos de las diferentes concentraciones del compuesto respecto del control (***p<0.05 para 12, **p<0.05 para 5,20 y *p<0.05 para 10,24). No obstante, cabe destacar que algunos de estos complejos, también mostraron efecto citotóxico sobre células Caco-2 normales, tal y como se puede observar en sus curvas dosis-respuesta (Figura 2.2.6). En concreto, los compuestos 10, 12, 20, 23 y 26 afectaron a la viabilidad de las células Caco-2 normales, por lo que se descartaron para su aplicación como antitumorales. Por otro lado, los compuestos 1-9, 11, 13-19, 21-22, 25 y 27 no mostraron efecto sobre las células normales. -6.0 -5.5 -5.0 -4.5 40 60 80 100 Log Concentración, [M] Viabilidad celular (% respecto Control) -6.0 -5.5 -5.0 -4.5 20 40 60 80 Log Concentración, [M] Viabilidad celular (% respecto Control) 5 -6.0 -5.5 -5.0 -4.5 40 60 80 100 Log Concentración, [M] Viabilidad celular (% respecto Control) -6.0 -5.5 -5.0 -4.5 40 60 80 100 120 Log Concentración, [M] Viabilidad celular (% respecto Control) -6.0 -5.5 -5.0 -4.5 20 40 60 80 100 120 Log Concentración, [M] Viabilidad celular (% respecto Control) 10 12 24 20 Estudios de viabilidad celular pág. 85 Figura 2.2.6. Curvas dosis-respuesta de los complejos [Au(X)(CN)] en células Caco-2 normales (15 d). Los datos se expresan como la media ± EEM y n≥12 experimentos. Se utilizó un test ANOVA de 1vía y un post-análisis de comparación múltiple Bonferroni para comparar los efectos de las diferentes concentraciones del compuesto respecto del control (*p<0.01 para 10 y 20, y ***p<0.0001 para 12, 23 y 26). A partir de estas curvas dosis-respuesta, se pudo calcular el valor de IC50 (µM) para el estudio de viabilidad celular llevado a cabo en células tumorales y normales Caco-2 con los complejos de Au(III) sintetizados (Tablas 2.2.6 y 2.2.7) Tabla 2.2.6. Valores de los complejos de Au(III) sintetizados en células Caco-2 tumorales. Compuesto IC50 (µM) L=tpy Código L=ppy Código L=bzp Código AuCl2HL] P1 P2 P3 [AuCl2L] Sin efecto 1 Sin efecto 2 Sin efecto 3 [Au(Spym)2L] Sin efecto 4 13.21±0.23 5 Sin efecto 6 [Au(S(Me)2pyrim)2L] Sin efecto 7 Sin efecto 8 Sin efecto 9 [AuCl(2-Tiouracilo)L] 6.03±0.25 10 Sin efecto 11 11.07±0.15 12 [Au(tiourea)2L] Sin efecto 13 Sin efecto 14 Sin efecto 15 [Au(OAc)2L] Sin efecto 16 Sin efecto 17 Sin efecto 18 [Au(fenilalanina)L]Cl Sin efecto 19 1.32±0.12 20 Sin efecto 21 [Au(meteonina)L]Cl Sin efecto 22 Sin efecto 23 [Au(p-etinil tolueno)2L] 18.66±0.35 24 Sin efecto 25 [Au(2-etinil piridina)2L] Sin efecto 26 Sin efecto 27 Los datos se expresan como la media ± EEM y n ≥ 12 experimentos. Las casillas oscuras representan los complejos que no se han obtenido. -6.0 -5.5 -5.0 -4.5 40 60 80 100 Log Concentración, [M] Viabilidad celular (% respecto Control) -6.0 -5.5 -5.0 -4.5 50 100 150 Log Concentración, [M] Viabilidad celular (% respecto Control) -6.0 -5.5 -5.0 -4.5 70 80 90 100 110 Log Concentración, [M] Viabilidad celular (% respecto Control) 10 -6.0 -5.5 -5.0 -4.5 60 70 80 90 100 Log Concentración, [M] Viabilidad celular (% respecto Control) 12 -6.0 -5.5 -5.0 -4.5 70 80 90 100 110 Log Concentración, [M] Viabilidad celular (% respecto Control) 2326 20 Estudios de viabilidad celular pág. 86 Tabla 2.2.7. Valores de IC50 obtenidos para los complejos de Au(III) en células normales Caco-2. IC50 (µM) L=tpy Código L=ppy Código L=bzp Código [AuCl2HL] P1 P2 P3 [AuCl2L] Sin efecto 1 Sin efecto 2 Sin efecto 3 [Au(Spym)2L] Sin efecto 4 Sin efecto 5 Sin efecto 6 [Au(S(Me)2pyrim)2L] Sin efecto 7 Sin efecto 8 Sin efecto 9 [AuCl(2-Tiouracilo)L] 6.46±0.34 10 Sin efecto 11 8.67±0.15 12 [Au(tiourea)2L] Sin efecto 13 Sin efecto 14 Sin efecto 15 [Au(OAc)2L] Sin efecto 16 Sin efecto 17 Sin efecto 18 [Au(fenilalanina)L]Cl Sin efecto 19 11.96±0.23 20 Sin efecto 21 [Au(meteonina)L]Cl Sin efecto 22 12.17±0.12 23 [Au(p-etinil tolueno)2L] Sin efecto 24 Sin efecto 25 [Au(2-etinil piridina)2L] 3.08±0.19 26 Sin efecto 27 Los datos se expresan como la media ± EEM y n ≥ 12 experimentos. Las casillas oscuras representan los complejos que no se han obtenido. Como se puede observar, estos complejos quedan muy lejos de los valores de IC50 que registraban los complejos de Au(I) anteriores. En un intento de explicar la diferente citotoxicidad de estos complejos, se realizó un ensayo de MTT también a los precursores de Au(III), [AuCl3HL] P1-3. El motivo de este estudio se basa en que, aunque no está bien establecido, se cree que los complejos de Au(III) experimentan reacciones de reducción en el medio intracelular donde se genera la especie derivada de Au(I), que es la verdadera especie activa. Los complejos de Au(III) utilizados son derivados ciclometalados, por lo que la estabilidad de cara a esas posibles reducciones estaría desfavorecida, impidiendo el comportamiento de profármaco por mecanismos de reducción. Sin embargo, los estudios de viabilidad celular con los complejos [AuCl3HL] L= tpy, ppy y bzp; no mostraron efecto estadísticamente significativo sobre la viabilidad de las células tumorales Caco-2. RELACIÓN ESTRUCTURA-ACTIVIDAD: ESTUDIOS SAR Con estos resultados se intentaron realizar estudios SAR para intentar conocer la parte activa de la molécula, aunque sin éxito, ya que en los cinco complejos citotóxicos para la línea celular Caco-2, se dan los tres ligandos HNC utilizados a lo largo de esta investigación (Figura 2.2.7). Asimismo, no sólo el estudio sobre el ligando no es concluyente, sino que tampoco lo es el estudio del grupo aniónico, puesto que, aunque tres de los complejos contienen unidades tiopirimidínicas (Figura 2.2.7. a-c), también hay complejos con residuos alquenilo o fenilalanina. La influencia sobre la citotoxicidad de la presencia de uno o dos átomos de cloro, o el carácter iónico o neutro del complejo, son factores que tampoco se han podido esclarecer. Estudios de viabilidad celular pág. 87 Figura 2.2.7. Estructuras de los complejos de Au(III) con actividad citotóxica en células Caco-2. Los estudios de viabilidad celular y la determinación del IC50 han sido imprescindibles para poder realizar una primera selección de los complejos con interés biológico. Así, los complejos de Au(I) anteriormente mencionados se han seleccionado para estudiar el mecanismo de acción por el cual afectan a la viabilidad de las células tumorales Caco-2 y estos estudios se recogen a continuación. ESTUDIOS DEL CICLO CELULAR Y APOPTOSIS Un agente quimioterápico puede actuar mediante diferentes mecanismos de acción como puede ser la alquilación de ADN, la inhibición de la síntesis o acción de los ácidos nucleicos, la interferencia con metabolitos, por inhibición enzimática, o mediante la interrupción del ciclo celular, entre otros posibles procesos. Todos estos mecanismos de acción se basan en detener o, al menos ralentizar, la proliferación de las células tumorales, generalmente interrumpiendo el ciclo celular o induciendo la muerte celular programa (apoptosis). ESTUDIO DEL CICLO CELULAR Y PROLIFERACIÓN CELULAR Como se ha comentado en el capítulo 1, las células tumorales se caracterizan por su no respuesta a las señales de control de división y crecimiento celular, lo que implica una mayor velocidad de proliferación que las células sanas. Así, ser capaces de desarrollar fármacos capaces de interrumpir el ciclo celular de forma selectiva sobre las células tumorales parece una forma adecuada de controlar o incluso frenar la replicación de las mismas. Por ello, se decidió estudiar, en primer lugar, la influencia de los derivados de [Au(X)(HMPT)] seleccionados sobre el ciclo celular. El ciclo celular consiste en una secuencia de eventos que termina en la correcta duplicación de las células.14 Durante este ciclo se dan fases muy diferenciadas en función del proceso que la célula esté llevando a cabo (Figura 2.2.8.); así se distinguen: N Au N Au SS NN NN N Au S N NH O Cl Au N S N NH O Cl N Au O O H2NPh Cl 5 10 12 24 20 Estudio del ciclo celular y apoptosis pág. 88 Para que el ciclo se desarrolle correctamente hay una serie de puntos de control específicos durante las fases G1 y G2; así en el punto de control de G1, de detectarse alguna anomalía, la célula puede entrar en una fase de arresto denominada G0, asegurando que el ADN dañado no se replica. El objetivo del punto de control de G2 es la reparación de posibles daños en el ADN antes de que tenga lugar la mitosis de ese nuevo ADN anómalo.15 Todas estas etapas están controladas y reguladas por una familia de serina/treonina quinasas dependientes de ciclina, cuya misión es asegurar el orden correcto de cada uno de los eventos del ciclo celular. De esta forma, cuando el ADN se daña, el ciclo celular se detiene para proporcionar tiempo para la reparación. Un defecto en la regulación de alguno de estos mecanismos suele causar una inestabilidad genómica (adquisición y acumulación de alteraciones genéticas), que en última instancia pueden causar tumorigénesis.16 Fármacos utilizados como el cis-platino induce el arresto celular en G1 en la mayoría de los casos, aunque hay también evidencias de que actúa también en la fase S o en G2.17-19 El ciclo celular se puede estudiar mediante citometría de flujo usando el yoduro de propidio (PI), una sustancia fluorescente con tendencia a unirse al ADN. En este trabajo, se ha realizado el estudio del ciclo celular con la línea Caco-2 con células control y tratadas con los diferentes compuestos de Au durante 24 h a una concentración de 20 µM (Ver parte experimental). El PI se une específicamente al ADN, intercalándose entre las bases en una proporción de 1 molécula de PI por cada 4-5 pares de bases. Al ser impermeable a la membrana, sólo puede penetrar en células muertas o en proceso de muerte celular, bien apoptótico o necrótico (cuando la membrana se encuentra alterada). Así, se va a poder identificar a las células muertas por medida de la fluorescencia resultante de la interacción del PI con el ADN. El uso de la citometría de flujo combinada con la tinción del PI permite estimar la proliferación celular a través la cantidad cambiante de contenido de ADN celular asociado con cada una de las fases del ciclo. De esta forma, se podrían reconocer las cuatro fases distintas en una población de células en proliferación: G1, S, G2 y M. Sin embargo, y dado que el contenido en ADN en las fases G2 y M es el mismo, este parámetro no sirve para la distinción de ambas fases;20 por ello los valores de población de estas dos fases se da conjuntamente. ¨ Fase M (mitosis), fase durante la cual las dos copias de ADN se distribuyen en dos núcleos hijos. ¨ Fase S (síntesis), donde la célula va a replicar su ADN. ¨ Fases G1y G2 (gaps), son aquellas en las que la célula va a realizar la duplicación de los componentes celulares (proteínas, ribosomas, etc) entre las fases S y M. Las fases G1 y G2 se consideran fases de transición o brecha. Las fases G1-S-G2 conforman la interfase o estado de no división, que engloba casi el 90% del ciclo. G2 S G1 M G0 Ciclo celular arrestado Figura 2.2.8. Fases del ciclo celular Estudio del ciclo celular y apoptosis pág. 89 Los valores encontrados a través de estos estudios, se recogen de una gran población de células y se representan como histogramas donde la fluorescencia relativa de PI se representa en el eje x, y el número de eventos en el eje y. El histograma muestra el número de células de una población con emisión relativa de fluorescencia de PI, que es proporcional a su contenido de ADN. Para una mejor comprensión de los valores obtenidos a partir de esta técnica se va a proceder a un breve comentario sobre las partes que componen el histograma, así como sobre el contenido en ADN en cada una de las fases del ciclo celular. La fase G0/G1 es donde las células pasan la mayor parte de su vida, por lo que aproximadamente el 90% de las células de una muestra de tejido sano se encuentran en las fases G0 y/o G1. En esta fase, aparecen dos cromosomas homólogos, con una copia de ADN cada uno, en el núcleo de la célula, por lo que son células 2n. Durante la fase S se va a duplicar el ADN, ya que cuando la célula se divide, cada célula hija debe tener la misma cantidad de ADN que la célula original. Así, una vez que la célula ha terminado de sintetizar (duplicar) su ADN en cada cromosoma, tiene el doble de copias que la célula original, por lo que la célula es 4n. En la fase G2/M se produce la mitosis o, lo que es lo mismo, la división celular, en la que se separan las cromátidas hermanas de cada cromosoma, por lo que las células hijas tienen sólo una molécula de ADN en cada cromosoma homólogo, son células 2n. Conviene recordar que las células no realizan este ciclo de forma sincronizada, es decir que habrá unas células que se encuentren en G0/G1 mientras otras estén en S; de ahí que se obtenga una distribución de varios tipos de poblaciones. Para organizar y delimitar las diferentes fases, se utiliza un software especializado (The Beckman Coulter Kaluza Analysis Software) que puede calcular el porcentaje de células en cada una de las fases del ciclo celular del total de células vivas analizadas. Figura 2.2.9. Fases del ciclo celular, su relación con el contenido en el ADN celular marcado con el PI y visualización de los resultados observados en el histograma de fluorescencia. Se han estudiado las fases del ciclo celular en las que se encuentran las células Caco-2, tras ser tratadas con los compuestos sintetizados y se han comparado los datos obtenidos con los de las células sin tratar (control). G1 SG2/M 2n 2n 4n 2n 4n Estudio del ciclo celular y apoptosis pág. 90 Figura 2.2.10. Histogramas de fluorescencia obtenidos para el estudio del ciclo celular en Caco-2 sin tratar y con el tratamiento con los complejos de Au(I): 35, 38-41, 33 y 34 (20 μM, 24 h). En la Tabla 2.2.8, se muestran los porcentajes de células de la población total de Caco-2 analizada que se encuentran en cada una de las fases del ciclo celular, tras ser tratadas éstas con los compuestos de Au. Como se puede observar en la Tabla, los complejos 38, 39, 40 y 41 son significativamente distintos en relación al control. Tabla 2.2.8. Porcentaje de la población de células que se encuentran en las distintas fases del ciclo celular (GO/G1, G2/M y S) para los complejos 35, 38-41, 33 y 34 (20 μM, 24 h). Complejo G0/G1 S G2/M Control 60.25±1.53 33.02±1.25 6.73±0.55 35 60.89±4.23 30.63±3.50 8.48±1.22 38 53.82±2.11* 36.42±3.32 9.76±1.38* 39 51.47±2.17** 38.50±3.32 10.03±1.38* 40 51.58±1.87** 39.18±1.69** 9.23±1.61 41 58.54±3.52 31.19±3.63 10.27±0.17*** 33 62.49±1.19 31.82±2.37 5.68±1.22 34 59.51±4.42 34.67±4.39 5.05±0.49 Los resultados muestran los porcentajes de las distintas poblaciones celulares y se expresan como media ± EEM (n ≥ 4 experimentos). *P<0.05; **P<0.01; ***P<0.001 vs. control. Tal y como se ha comentado, las fases G0/G1 son donde las células pasan la mayor parte de su vida, envueltas en procesos de crecimiento, así como copiando su contenido intracelular (orgánulos) que Estudio del ciclo celular y apoptosis pág. 97 Figura 2.2.16. Vías de activación de la cascada de las caspasas. En la vía extrínseca se activan las caspasas -3, -6 y -7 por activación de las caspasas-2, -8 y -10, activadas previamente por la unión del TNF (tumor necrosis factor) con FADD (Fas-associated deathdomain). En la vía intrínseca, las caspasas-3, -6 y -7 se activan por acción de la caspasa-9. Ésta se moviliza por liberación de citocromo c y otros factores apoptogénicos. Así pues, y viendo que ambas vías confluyen en un mismo punto, la activación de las caspasas ejecutoras, se decidió estudiar la actividad de las caspasas-3 y -7 mediante luminiscencia. Este ensayo se basa en la reacción entre un derivado de proluciferina luminogénico, que contiene la secuencia tetrapeptídica DEVD, específica para la acción de caspasa-3 y -7. Este reactivo provoca la lisis celular, seguida de la escisión del sustrato DEVD de la proluciferina mediante la acción de las caspasas3/7, liberándolo y generando 6-amino-D-lucifereina que, en presencia de luciferasa y ATP, da como resultado la producción de luz (Figura 2.2.17). FADD Procaspasa-8, -2 (procaspasa-10) TNF Receptor de muerte Caspasa-8, -2 (caspasa-10) Caspasa-3, -6, -7 (ejecutoras) Apoptosis PI3K AKT BAD F. apoptogénicos: APAF1, Cyt c, Procaspasa-9 Caspasa-9 IAP Estrés celular Vía extrínseca Vía intrínseca Estudio del ciclo celular y apoptosis pág. 98 Figura 2.2.17. Mecanismo de reacción para la detección de la actividad de las caspasas 3/7. La intensidad de la luminiscencia es, por tanto, proporcional a la cantidad de actividad de caspasa en la muestra, pudiendo comparar la actividad de las caspasas en células Caco-2 tratadas con los compuestos de Au(I) a una concentración 20 µM tras 24 h de incubación con la de las células control. En la Figura 2.2.18, se puede observar que nuestros complejos inhiben la actividad de las caspasas 3/7, ya que los valores de actividad del control son significativamente mayores que los obtenidos con los compuestos testados. Estos resultados demuestran, por lo tanto, que la activación de las caspasas no parece ser el mecanismo apoptótico de muerte celular que está implicado en la actividad de nuestros complejos. Por otra parte, la inhibición de las caspasas se podría explicar por el hecho de que quizás los complejos de Au(I) han podido realizar algún enlace con los átomos de N o S del anillo tiazólico de las luciferasas,45-46 inhibiendo alguna de ellas e impidiendo la generación de luz a niveles similares a los del control. Control 35 38 39 40 41 33 34 0 50 100 150 * * * * * * * * * * * * * * * * * * * * * Actividad Caspasas 3/7 (% luminiscencia) Figura 2.2.18. Actividad de caspasas 3/7 para los complejos 35, 38-41, 33 y 34 (20μM, 24 h). Los resultados muestran el promedio de los valores de luminiscencia en porcentaje y las barras verticales indican los EEM (n ≥ 4 experimentos). ***P<0.001 vs. control. N S S N H NCOOH Z-DVED DEVD-Z Caspasa-3/7 N S S N H2NCOOH Luciferasa + ATP +O2 Mg2+ Mecanismo de acción: Estrés oxidativo pág. 99 MECANISMOS DE ACCIÓN: ESTRÉS OXIDATIVO Como se ha visto en el apartado anterior, los complejos de Au(I) testados parecen ser buenos candidatos para su uso como quimioterápicos contra el cáncer ya que, además de tener valores de IC50 inferiores al cisPt en la línea tumoral Caco-2, también inducen cambios en la composición de su membrana (exponen PS) para iniciar mecanismos apoptóticos. Ésta es la vía de muerte celular necesaria para la eliminación de células tumorales de forma controlada sin producir ni procesos inflamatorios ni liberación de material celular al medio extracelular. Así pues, y tras conocer el tipo de muerte celular que activan los complejos mencionados, se fijó como objetivo conocer el mecanismo de acción por el cual se activa la apoptosis en esta misma línea tumoral. Está aceptado que el Au tiene un mecanismo de acción diferente al encontrado para el cis-Pt, por lo que el ADN no es su diana. De hecho, la mayoría de derivados de Au(I) manifiestan una elevada tendencia a coordinarse con proteínas con centros de azufre (SH) o selenio (SeH) principalmente. Este tipo de proteínas son bastante abundantes en el torrente sanguíneo y, la mayoría tienen como función mantener la homeostasis redox celular. El equilibrio redox es fundamental para un correcto funcionamiento celular. Por ello, las células deben limitar la producción de especies reactivas mediante mecanismos antioxidantes para neutralizar estas especies o, mitigando el estrés oxidativo provocado por las mismas. Estas especies oxidantes se pueden clasificar en función del átomo principal implicado en las reacciones posteriores, distinguiéndose cuatro grandes grupos: ¨ ROS: especies reactivas de oxígeno. ¨ RNS: especies reactivas de nitrógeno. ¨ RSS: especies reactivas de azufre. ¨ RCS: especies reactivas de cloro. De todas estas especies, las reactivas de oxígeno (ROS) son las más abundantes. Son moléculas altamente reactivas que se forman mediante varios procesos celulares, incluido el metabolismo oxidativo en las mitocondrias.47 A niveles bajos, estas especies son beneficiosas para las células, ya que activan vías de señalización que promueven la proliferación, la supervivencia o la resistencia celular al estrés oxidativo.48 Sin embargo, a niveles más altos, las ROS pueden dañar o matar a las células al oxidar proteínas, lípidos y ácidos nucleicos.49 El daño que las ROS pueden causar a la célula no solo depende de su concentración intracelular sino también del equilibrio entre ellas y las especies antioxidantes endógenas. Es la pérdida de este equilibrio especies prooxidantes/antioxidante, la causante del denominado estrés oxidativo. Desde el punto de vista biomédico, el estrés oxidativo es importante porque está relacionado con una amplia variedad de enfermedades, como enfermedades neurodegenerativas (p. Ej. Alzheimer, Parkinson y esclerosis lateral amiotrófica), enfermedades inflamatorias (p. Ej. Artritis reumatoide), enfermedades cardiovasculares (p. Ej. distrofia muscular), alergias, disfunciones del sistema inmunitario, diabetes, envejecimiento y cáncer.50 De hecho, se sabe que las células inflamatorias liberan mediadores químicos de la inflamación, particularmente ROS, en el tejido inflamado, que también afecta a las células normales. Cuando se trata de un proceso crónico, los niveles extremadamente altos de ROS saturan los mecanismos de defensa celular (es decir, los antioxidantes endógenos) y las moléculas intracelulares se dañan gravemente, afectando a las células vecinas circundantes. El daño que ROS infringe sobre biomoléculas tan importantes como los ácidos nucleicos, ha llevado a concluir que estas especies tienen un gran efecto sobre muchos aspectos del desarrollo y la progresión tumoral, especialmente durante la proliferación celular y a través de la evasión de la apoptosis. Mecanismo de acción: Estrés oxidativo pág. 100 Para mantener el equilibrio de especies prooxidantes/antioxidantes anteriormente mencionado, entran en juego un gran número de enzimas y sistemas redox que se pueden clasificar en diferentes grupos según sus propiedades: antioxidantes endógenos, antioxidantes naturales y antioxidantes sintéticos. Entre los antioxidantes endógenos se encuentran el glutatión, el ácido alfa-lipoico, la coenzima Q, la ferritina, el ácido úrico, la bilirrubina, la metalotioneína, la L-carnitina, la melatonina y las enzimas superóxido dismutasa (SOD), catalasa (CAT), glutatión peroxidasa (GPX), tiorredoxinas (Trx) y peroxirredoxinas (PRX). Son precisamente algunas de estas enzimas las que contienen grupos tiol, por lo que el oro presenta una gran tendencia a coordinarse con ellas (Figura 2.2.19). Este es el caso de la Trx, la glutatión reductasa (GR) o la cisteína proteasa, proteínas que además se sobreexpresan en células tumorales, constituyendo objetivos potenciales contra el cáncer para la terapia con complejos de oro. Figura 2.2.19. Estructuras cristalinas de aductos de Au-proteína: a) Aducto Au(I)–GR.51 (b) Aducto Au(I)– Trx.52 La oxidación de las biomoléculas mencionadas por las ROS conlleva, en todos los casos, la alteración del correcto desarrollo celular; por ejemplo, estas especies reactivas provocan cambios en el ADN y un mal funcionamiento en el mecanismo de reparación del ADN. La oxidación del ADN por estas especies genera 8-hidroxi-2-desoxiguanosina, que es un producto capaz de generar mutaciones en el ADN en un proceso que promueve el envejecimiento y la carcinogénesis.53 El efecto sobre la membrana es distinto, puesto que en este caso son los lípidos poliinsaturados presentes los que son susceptibles a la oxidación. Las ROS desencadenan reacciones de peroxidación lipídica que aumentan la permeabilidad de la membrana celular lo que, según algunos estudios, podría conducir a la muerte celular.54 En lo que se refiere a las proteínas, éstas sufren la generación y acumulación de grupos carbonilo y grupos tiol que pueden convertirse en radicales reactivos con azufre.55 Debido a esta modificación inducida por la oxidación, hay una alteración en la estructura de la proteína y, en consecuencia, cambios o pérdida de la función de la proteína oxidada. Por tanto, todas estas alteraciones generan mutaciones (oxidación sobre ADN), inducen la muerte celular (oxidación sobre lípidos) o disfunción protéica (oxidación sobre proteínas) responsables de procesos tumorales. Por todo esto, se ha decidido evaluar el estrés oxidativo en las células tumorales Caco-2. a b Mecanismo de acción: Estrés oxidativo pág. 101 Existen diferentes métodos para evaluar el estrés oxidativo:56 ¨ Medición de las ROS ¨ Detección de ADN y lípidos o proteínas oxidados ¨ Cuantificación de antioxidantes En este trabajo se ha optado por el segundo de los métodos citados, con el fin de evaluar el efecto localizado del estrés oxidativo sobre las biomoléculas que componen las células, y cuya estructura es fundamental para el óptimo desarrollo de las funciones celulares. EVALUACIÓN DE LA OXIDACIÓN PROTEÍCA La oxidación de proteínas se define como la modificación de una proteína por las especies ROS o, de forma indirecta, por la reacción con subproductos secundarios del estrés oxidativo (Figura 2.2.20). Esta modificación puede inducirse por diferentes agentes prooxidantes, y está íntimamente relacionada con el envejecimiento celular y con ciertas enfermedades. De hecho, niveles altos de carbonilación de proteínas se han relacionado con enfermedades como el Alzheimer, la diabetes, las enfermedades autoinmunes, la artritis, la sepsis y la dificultad respiratoria.57 Figura 2.2.20. Procesos de formación de ROS implicados en la oxidación de proteínas para formar grupos carbonilos. Las proteínas son biomoléculas muy sensibles a cambios en su estructura, por tanto, cambios oxidativos en éstas conlleva importantes consecuencias funcionales, como la inhibición de las actividades enzimáticas y de unión, una mayor susceptibilidad a la agregación y la proteólisis, un aumento o disminución de la absorción por las células y una inmunogenicidad alterada. GSH reductasa GSH peroxidasa NADP+ NADPH GSH GSSG H2O + O2 H2O2 Daño ADN Fe2+ Fe3+ OH· Oxidación de proteínas Formación de carbonilos GSH sintasa Glicina Cisteína Glutamato γ-glutamil cisteína sintasa SOD O2·- ROS Metabolismo oxidativo mitocondrial Disfunción celular Muerte celular Mecanismo de acción: Estrés oxidativo pág. 102 Como se ha mencionado anteriormente, el resultado de la oxidación de proteínas suele ser la acumulación de grupos carbonilos o tiol; por ello, tal y como se puede observar en la Tabla 2.2.9, se conocen diferentes biomarcadores para cuantificar el estrés oxidativo en proteínas. Sin embargo, el indicador de oxidación de proteínas más medido en muestras biológicas son los carbonilos protéicos,58 ya que estos productos son químicamente estables, lo que es útil tanto para su detección como para su almacenamiento. Tabla 2.2.10. Biomarcadores comunes en el estudio de estrés oxidativo sobre proteínas.59 Biomarcador Indicador de… Carbonilación de proteínas Oxidación en proteínas Carbamilación de proteínas Modificación de proteínas Oxidación de grupos SH en proteínas Oxidación en proteínas Modificación de 3-nitrotirosina Nitración de proteínas Modificación de 3-clorotirosina Oxidación en proteínas Formación de ditirosina Oxidación en proteínas Acumulación de productos de glicación avanzada (AGE) Glicación de proteínas Producción de productos de oxidación proteica avanzada (AOPP) Oxidación en proteínas La carbonilación de proteínas puede detectarse y medirse a través de varios métodos directos o indirectos. Entre los métodos directos destaca la detección de carbonilos mediante el enlace de los grupos carbonilo existentes, con una molécula de detección; siendo la más común el dinitrofenol, que se detecta por reacción con un anticuerpo. En lo que se refiere a métodos indirectos, hay un amplio abanico de posibilidades entre las que cabe mencionar: ¨ Reducción del grupo carbonilo a un alcohol con borohidruro tritiado. ¨ Reacción del grupo carbonilo con 2,4-dinitrofenilhidrazina (DNPH) para formar la 2,4dinitrofenilhidrazona. ¨ Reacción del carbonilo con fluoresceína tiosemicarbazida para formar la tiosemicarbazona. ¨ Reacción del grupo carbonilo con aminofluoresceína para formar una base de Schiff, para posteriormente reducir a la amina secundaria con cianoborohidruro. El segundo de los métodos indirectos mencionados ha sido el utilizado a lo largo de este trabajo por su simplicidad, ya que la reacción entre DNPH y el carbonilo genera 2,4-dinitrofenilhidrazona (Figura 2.2.21), un producto estable que puede detectarse por una técnica tan sencilla como es la espectofotometría UV. El grupo DNP absorbe luz ultravioleta a 370 nm con un coeficiente de extinción molar de 22.000 M-1 cm-1, permitiendo calcular el contenido de carbonilo total de una proteína o mezcla de proteínas por medida de la absorbancia a 375 nm. Mecanismo de acción: Estrés oxidativo pág. 103 Figura 2.2.21. Mecanismo de reacción para la evaluación de contenido de proteína oxidada con DNPH. En la Figura 2.2.22 se muestran los niveles de proteínas carboniladas obtenidos en las células Caco-2 tratadas con los complejos de Au(I) respecto de su control. Sorprendentemente, según los análisis realizados, los valores de proteína carbonilada en las células tratadas con los derivados de Au(I) no son significativamente distintos de los valores control. Conviene recordar que valores pequeños de proteína oxidada es normal en un correcto ciclo celular, ya que también constituyen un control sobre la supervivencia y proliferación celular. Así, se puede concluir que los productos testados no aumentan el daño oxidativo sobre las proteínas, por lo que tampoco incrementan la muerte celular a través de este mecanismo. Control 35 38 39 40 41 33 34 0.00 0.05 0.10 0.15 0.20 nmol mg-1 carbonilos Figura 2.2.22. Niveles de carbonilos protéicos en células Caco-2 tras su incubación con los compuestos de Au(I) sintetizados (20 µM, 24 h). Los resultados muestran el promedio de la concentración de carbonilos (nmol mg-1 proteína) y las barras verticales indican los EEM (n ≥ 6 experimentos). Proteína Proteína oxidada Derivado DNP-proteína O N H N O 2 N O 2 N N H N O 2 N O 2 H2N H2O Mecanismo de acción: Estrés oxidativo pág. 104 EVALUACIÓN DE OXIDACIÓN LIPÍDICA Al igual que ocurría en las proteínas, la peroxidación lipídica es uno de los principales resultados del daño mediado por ROS en los tejidos. Los componentes de membrana más susceptibles de oxidación son los fosfolípidos, lo que conlleva importantes cambios en las propiedades fisicoquímicas de la bicapa lipídica.60 De hecho, según recogen estudios realizados por Nigam y Schewe, la peroxidación de los lípidos puede alterar el ensamblaje de la membrana, provocando cambios en la fluidez y la permeabilidad, alteraciones del transporte de iones e inhibición de los procesos metabólicos.61Junto con estos cambios, la oxidación de ácidos grasos de membrana presenta una problemática adicional, ya que conlleva a la formación de radicales libres responsables de la propagación del daño celular a través de reacciones en cadena.62 Entre estos radicales destaca el radical lipoperoxilo (LOO•), que reacciona con un lípido para producir un lípido radical y un hidroperóxido lipídico (LOOH). Los radicales LOOH son inestables y generan nuevos radicales peroxilo y alcoxi, que se descomponen en productos secundarios. Algunos de los radicales libres producidos durante la peroxidación lipídica tienen efectos muy locales, debido a su corta vida; pero los productos de descomposición de los peróxidos lipídicos pueden servir como "segundos mensajeros de estrés oxidativo", debido a su vida media prolongada y su capacidad de difundirse desde su sitio.63 Figura 2.2.23. Mecanismos de formación de ROS para la oxidación lipídica. Los subproductos de degradación que se forman son en su mayoría aldehídos (malonilaldehído) e hidroxiderivados (4-HDA o 4-HNE), los cuales van a poder ser utilizados como biomarcadores para evaluar la oxidación de los lípidos de membrana, tal y como se recoge en la Tabla 2.2.10. Daño mitocondrial GSH reductasa GSH peroxidasa NADP+ NADPH GSH GSSG H2O + O2 H2O2 Daño ADN Fe2+ Fe3+ OH· Peroxidación lipídica (MDA) GSH sintasa Glicina Cisteína Glutamato γ-glutamil cisteína sintasa SOD O2·- ROS Metabolismo oxidativo mitocondrial Disfunción celular Muerte celular Daño protéico ATP Apoptosis ∆Ym Mecanismo de acción: Estrés oxidativo pág. 105 Tabla 2.2.11. Biomarcadores comunes en el estudio de estrés oxidativo sobre lípidos.59 Biomarcador Indicador de… Malonilaldehído (MDA) Peroxidación lipídica 4-Hidroxinonenal (4-HNE) Peroxidación lipídica Oxidación de 8-isoprostaglandina Peroxidación lipídica 8-iso-Prostaglandina F2α (8-isoprostano) Peroxidación lipídica Especies reactivas al ácido tiobarbitúrico (TBARS) Peroxidación lipídica Lipoproteínas de alta densidad (HDL) oxidadas Oxidación lipídica Lipoproteínas de baja densidad (LDL) oxidadas Oxidación lipídica Aunque todavía hay cierta controversia, resultados experimentales demuestran que los productos de peroxidación lipídica, MDA y 4-HNE, se ven incrementados en tejidos de cáncer colorrectal.64 Asimismo, también aumentan significativamente los niveles de estas especies conforme la enfermedad evoluciona a estadios más avanzados.65 Por estos motivos, además del hecho de que el MDA constituye un factor mutagénico del ADN, se ha decidido estudiar la evaluación de la peroxidación lipídica a través de la cuantificación conjunta de MDA y 4-HDA en células de la línea Caco-2 tras su incubación con los complejos de Au(I) 20 µM durante 24 h. En lo que se refiere a la determinación de la concentración de MDA+4-HDA, se ha utilizado el método Gerard-Monnier,66 el cual se basa en la reacción de un reactivo cromógeno, N-metil-2-fenilindol, con MDA o con 4-HDA, a una temperatura de 45°C. La condensación de una molécula de MDA o 4-HDA con dos moléculas de N-metil-2-fenilindol produce un cromóforo estable que absorbe a 586 nm (ver Figura 2.2.24). O H R 2 N Ph NPh N Ph R= OH (MDA) R= 4-hidroxialquenal (4-HDA) Figura 2.2.24. Esquema de reacción para la detección de MDA y 4-HDA El empleo de esta longitud de onda y de la temperatura de incubación (45ºC), minimiza las interferencias presentes en otros métodos para determinar aldehídos derivados del proceso de peroxidación lipídica. De esta forma, la concentración de MDA y 4-HDA se determina interpolando la absorbancia medida de las muestras en la curva patrón de MDA, la cual se determina paralelamente en cada ensayo. Los resultados muestran que todos los complejos testados inducen un aumento de los niveles de MDA+4-HDA en las células, tal y como se recoge en la Figura 2.2.25. Mecanismo de acción: Estrés oxidativo pág. 106 Control 35 38 39 40 41 33 34 0 50 100 150 * * ** * * * * * * MDA + 4-HDA (nanomol mg-1 proteina) Figura 2.2.25. Niveles de MDA (malonilaldehído) + 4-HDA (hidroxialquenales) en células Caco-2 tras su incubación con los compuestos de Au(I) sintetizados (20 µM, 24 horas). Los resultados muestran el promedio de la concentración de MDA+4-HDA (nmol/mg proteína) y las barras verticales indican los EEM (n ≥ 6 experimentos). *P< 0.05; **P<0.01; ***P<0.001 vs. control. Como se ha descrito anteriormente, un aumento en los niveles de peroxidación lipídica va a producir un mal funcionamiento de los procesos celulares que conducen a una muerte celular programa. Es decir, que según este ensayo se puede concluir que los complejos testados inducen una muerte celular programa por una pérdida en la homeostasis redox en la bicapa lipídica. Asimismo, y dado que el MDA es un mutágeno comprobado del ADN, no se descarta que el proceso apoptótico se desencadene también por mutaciones en el ADN. Además, conviene recordar que no sólo el MDA puede causar modificaciones en el ADN, sino que las ROS pueden oxidar el ADN generando 8-hidroxi-2-deoxiguanosina.53 De esta forma, y con un correcto funcionamiento del sistema de reparación del ADN, se activaría la cascada apoptótica para impedir la replicación de este ADN mutado, así como la proliferación de la célula tumoral. ESTUDIO DE LA ACTIVIDAD DE LA TIORREDOXINA REDUCTASA (TrxR) Con base en los resultados obtenidos durante la evaluación de la peroxidación lipídica, en los que se constata elevados niveles de los marcadores MDA+4-HDA en los lípidos de membrana, se decidió estudiar el mecanismo por el cual se pierde ese equilibrio prooxidante/antioxidante que permite esta peroxidación. En el apartado anterior ya se ha comentado, que existen diferentes mecanismos antioxidantes para neutralizar las ROS o mitigar el estrés oxidativo. Estos mecanismos se pueden clasificar en: ¨ Antioxidantes enzimáticos:67-68 Las enzimas antioxidantes más importantes son la superóxido dismutasa (SOD), la catalasa (CAT), la glutatión peroxidasa (GPx), las tiorredoxinas (Trx) y peroxirredoxinas (PRxs). Estas enzimas trabajan juntas para neutralizar las ROS en un sistema perfectamente coordinado; por ejemplo, SOD puede convertir O2en O2 o H2O2. Ésta última se transformará en H2O y O2 por acción de la catalasa y la glutatión peroxidasa (Figura 2.2.26). Estudios con cultivos primarios pág. 113 composición de la membrana, incluidos los compuestos 35, 33 y 34, que no parecían inducir apoptosis de una manera significativamente distinta del control en el estudio con células Caco-2. Los resultados de este estudio muestran que los tumores reales, formados por varios tipos de células y con muchas interacciones moleculares entre ellas, son más sensibles a los complejos de Au(I) sintetizados que las células epiteliales de carcinoma de colon humano. Aunque son necesarios estudios adicionales, estos resultados muestran que los compuestos de Au testados podrían ser útiles en el tratamiento del cáncer de colon. Al igual que ocurría en el estudio sobre las Caco-2, también se analizaron los porcentajes de necrosis inducidos por los compuestos, y en ninguno de los casos se registraron valores superiores al 3.9%. Tabla 2.2.13. Niveles (%) de necrosis encontrados en células primarias de colon de ratón tras su tratamiento con los complejos de Au(I): 35, 38-41, 33 y 34 (20 μM, 24 h). Los resultados se expresan como la media ± EEM (n≥ 3 experimentos). Control 35 38 39 40 41 33 34 3.85±0.71 2.10±0.40 3.72±1.11 2.95±0.83 1.35±0.28 2.20±0.27 2.27±0.19 3.10±0.68 Bibliografía pág. 114 BIBLIOGRAFÍA 1. Fogh, J.; Wright, W. C.; Loveless, J. D., Absence of HeLa cell contamination in 169 cell lines derived from human tumors. J Natl Cancer Inst 1977, 58 (2), 209-14. 2. Turco, L.; Catone, T.; Caloni, F.; Di Consiglio, E.; Testai, E.; Stammati, A., Caco-2/TC7 cell line characterization for intestinal absorption: how reliable is this in vitro model for the prediction of the oral dose fraction absorbed in human? Toxicol In Vitro 2011, 25 (1), 13-20. 3. Briske-Anderson, M. J.; Finley, J. W.; Newman, S. M., The influence of culture time and passage number on the morphological and physiological development of Caco-2 cells. Proc Soc Exp Biol Med 1997, 214 (3), 248-57. 4. Delie, F.; Rubas, W., A human colonic cell line sharing similarities with enterocytes as a model to examine oral absorption: advantages and limitations of the Caco-2 model. Crit Rev Ther Drug Carrier Syst 1997, 14 (3), 221-86. 5. Pinto, M.; Robine-Leon, S.; Appay, M. D.; Kedinger, M.; Triadou, N.; Dussaulx, E.; Lacroix, B.; SimonAssmann, P.; Haffen, K.; Fogh, J.; Zweibaum, A., Enterocyte-like differentiation and polarization of the human-colon carcinoma cell-line Caco-2 in culture. Biol Cell 1983, 47, 7. 6. Pradines, B.; Lievin-Le Moal, V.; Vauthier, C.; Ponchel, G.; Loiseau, P. M.; Bouchemal, K., Cell linedependent cytotoxicity of poly(isobutylcyanoacrylate) nanoparticles coated with chitosan and thiolated chitosan: Insights from cultured human epithelial HeLa, Caco2/TC7 and HT-29/MTX cells. Int J Pharm 2015, 491 (1-2), 17-20. 7. Sambuy, Y.; De Angelis, I.; Ranaldi, G.; Scarino, M. L.; Stammati, A.; Zucco, F., The Caco-2 cell line as a model of the intestinal barrier: influence of cell and culture-related factors on Caco-2 cell functional characteristics. Cell Biol Toxicol 2005, 21 (1), 1-26. 8. Hidalgo, I. J.; Raub, T. J.; Borchardt, R. T., Characterization of the human colon carcinoma cell line (Caco-2) as a model system for intestinal epithelial permeability. Gastroenterology 1989, 96 (3), 736-49. 9. Mosmann, T., Rapid colorimetric assay for cellular growth and survival: application to proliferation and cytotoxicity assays. J Immunol Methods 1983, 65 (1-2), 55-63. 10. Berridge, M. V.; Tan, A. S., Characterization of the cellular reduction of 3-(4,5-dimethylthiazol-2-yl)- 2,5-diphenyltetrazolium bromide (MTT): subcellular localization, substrate dependence, and involvement of mitochondrial electron transport in MTT reduction. Arch Biochem Biophys 1993, 303 (2), 474-82. 11. Berners-Price, S. J.; Filipovska, A., Gold compounds as therapeutic agents for human diseases. Metallomics 2011, 3 (9), 863-73. 12. Simon, T. M.; Kunishima, D. H.; Vibert, G. J.; Lorber, A., Screening trial with the coordinated gold compound auranofin using mouse lymphocyte leukemia P388. Cancer Res 1981, 41 (1), 94-7. 13. Thomas, G., Medicinal Chemistry: An Introduction. Wiley: 2008; p 646. 14. Csikasz-Nagy, A., Computational systems biology of the cell cycle. Brief Bioinform 2009, 10 (4), 424-34. 15. DeGrendele, H., Cell-cycle inhibitors as novel therapies for lung cancer. Clin Lung Cancer 2002, 4 (2), 80-2. 16. Yao, Y.; Dai, W., Genomic Instability and Cancer. J Carcinog Mutagen 2014, 5. 17. Wang, D.; Lippard, S. J., Cellular processing of platinum anticancer drugs. Nat Rev Drug Discov 2005, 4 (4), 307-20. 18. Attardi, L. D.; de Vries, A.; Jacks, T., Activation of the p53-dependent G1 checkpoint response in mouse embryo fibroblasts depends on the specific DNA damage inducer. Oncogene 2004, 23 (4), 973-80. 19. Sorenson, C. M.; Eastman, A., Influence of cis-diamminedichloroplatinum(II) on DNA synthesis and cell cycle progression in excision repair proficient and deficient Chinese hamster ovary cells. Cancer Res 1988, 48 (23), 6703-7. 20. Nunez, R., DNA measurement and cell cycle analysis by flow cytometry. Curr Issues Mol Biol 2001, 3 (3), 67-70. Bibliografía pág. 115 21. DiPaola, R. S., To arrest or not to G(2)-M Cell-cycle arrest : commentary re: A. K. Tyagi et al., Silibinin strongly synergizes human prostate carcinoma DU145 cells to doxorubicin-induced growth inhibition, G(2)-M arrest, and apoptosis. Clin. cancer res., 8: 3512-3519, 2002. Clin Cancer Res 2002, 8 (11), 3311-4. 22. Hromas, R. A.; North, J. A.; Burns, C. P., Decreased cisplatin uptake by resistant L1210 leukemia cells. Cancer Lett 1987, 36 (2), 197-201. 23. Willis, N.; Rhind, N., Regulation of DNA replication by the S-phase DNA damage checkpoint. Cell Div 2009, 4, 13. 24. Vaux, D. L.; Korsmeyer, S. J., Cell death in development. Cell 1999, 96 (2), 245-54. 25. Kerr, J. F.; Wyllie, A. H.; Currie, A. R., Apoptosis: a basic biological phenomenon with wide-ranging implications in tissue kinetics. Br J Cancer 1972, 26 (4), 239-57. 26. Alberts, B.; Johnson, A.; Lewis, J.; Raff, M.; Roberts, K.; Walter, P., Molecular Biology of the Cell. Garland Science: 2002. 27. Klionsky, D. J., Autophagy: from phenomenology to molecular understanding in less than a decade. Nat Rev Mol Cell Biol 2007, 8 (11), 931-7. 28. Fadok, V. A.; de Cathelineau, A.; Daleke, D. L.; Henson, P. M.; Bratton, D. L., Loss of phospholipid asymmetry and surface exposure of phosphatidylserine is required for phagocytosis of apoptotic cells by macrophages and fibroblasts. J Biol Chem 2001, 276 (2), 1071-7. 29. Marino, G.; Kroemer, G., Mechanisms of apoptotic phosphatidylserine exposure. Cell Res 2013, 23 (11), 1247-8. 30. Leventis, P. A.; Grinstein, S., The distribution and function of phosphatidylserine in cellular membranes. Annu Rev Biophys 2010, 39, 407-27. 31. Fadok, V. A.; Voelker, D. R.; Campbell, P. A.; Cohen, J. J.; Bratton, D. L.; Henson, P. M., Exposure of phosphatidylserine on the surface of apoptotic lymphocytes triggers specific recognition and removal by macrophages. J Immunol 1992, 148 (7), 2207-16. 32. Mower, D. A., Jr.; Peckham, D. W.; Illera, V. A.; Fishbaugh, J. K.; Stunz, L. L.; Ashman, R. F., Decreased membrane phospholipid packing and decreased cell size precede DNA cleavage in mature mouse B cell apoptosis. J Immunol 1994, 152 (10), 4832-42. 33. Bennett, M. R.; Gibson, D. F.; Schwartz, S. M.; Tait, J. F., Binding and phagocytosis of apoptotic vascular smooth muscle cells is mediated in part by exposure of phosphatidylserine. Circ Res 1995, 77 (6), 1136-42. 34. Fadok, V. A.; Bratton, D. L.; Frasch, S. C.; Warner, M. L.; Henson, P. M., The role of phosphatidylserine in recognition of apoptotic cells by phagocytes. Cell Death Differ 1998, 5 (7), 551-62. 35. Meers, P.; Mealy, T., Calcium-dependent annexin V binding to phospholipids: stoichiometry, specificity, and the role of negative charge. Biochemistry 1993, 32 (43), 11711-21. 36. Zembruski, N. C.; Stache, V.; Haefeli, W. E.; Weiss, J., 7-Aminoactinomycin D for apoptosis staining in flow cytometry. Anal Biochem 2012, 429 (1), 79-81. 37. Modest, E. J.; Sengupta, S. K., 7-Substituted actinomycin D (NSC-3053) analogs as fluorescent DNAbinding and experimental antitumor agents. Cancer Chemother Rep 1974, 58 (1), 35-48. 38. Atrian-Blasco, E.; Gascon, S.; Rodri Guez-Yoldi, M. J.; Laguna, M.; Cerrada, E., Novel Gold(I) Thiolate Derivatives Synergistic with 5-Fluorouracil as Potential Selective Anticancer Agents in Colon Cancer. Inorg Chem 2017, 56 (14), 8562-8579. 39. Vergara, E.; Cerrada, E.; Clavel, C.; Casini, A.; Laguna, M., Thiolato gold(I) complexes containing water-soluble phosphane ligands: a characterization of their chemical and biological properties. Dalton Trans 2011, 40 (41), 10927-35. 40. Elmore, S., Apoptosis: a review of programmed cell death. Toxicol Pathol 2007, 35 (4), 495-516. 41. Martinvalet, D.; Zhu, P.; Lieberman, J., Granzyme A induces caspase-independent mitochondrial damage, a required first step for apoptosis. Immunity 2005, 22 (3), 355-70. 42. Igney, F. H.; Krammer, P. H., Death and anti-death: tumour resistance to apoptosis. Nat Rev Cancer 2002, 2 (4), 277-88. Bibliografía pág. 116 43. Launay, S.; Hermine, O.; Fontenay, M.; Kroemer, G.; Solary, E.; Garrido, C., Vital functions for lethal caspases. Oncogene 2005, 24 (33), 5137-48. 44. Kuranaga, E., Beyond apoptosis: caspase regulatory mechanisms and functions in vivo. Genes Cells 2012, 17 (2), 83-97. 45. Cronje, S.; Raubenheimer, H. G.; Spies, H. S. C.; Esterhuysen, C.; Schmidbaur, H.; Schierb, A.; Kruger, G. J., Synthesis and characterisation of N-coordinated pentafluorophenyl gold(I) thiazole-derived complexes and an unusual self-assembly to form a tetrameric gold(I) complex. Dalton Trans. 2003, 0, 7. 46. de Jongh, L.; Dobrzańska, L.; Strasser, C., Imine-coordinated 2-Aminoazole Complexes of Au(I): Complicating Reactions and Verification of Products by Crystal Structure Determination. Zeitschrift für Naturforschung B 2015, 69 (11-12), 14. 47. Gill, J. G.; Piskounova, E.; Morrison, S. J., Cancer, Oxidative Stress, and Metastasis. Cold Spring Harb Symp Quant Biol 2016, 81, 163-175. 48. Schieber, M.; Chandel, N. S., ROS function in redox signaling and oxidative stress. Curr Biol 2014, 24 (10), R453-62. 49. Veskoukis, A. S.; Tsatsakis, A. M.; Kouretas, D., Dietary oxidative stress and antioxidant defense with an emphasis on plant extract administration. Cell Stress Chaperones 2012, 17 (1), 11-21. 50. Sosa, V.; Moline, T.; Somoza, R.; Paciucci, R.; Kondoh, H.; ME, L. L., Oxidative stress and cancer: an overview. Ageing Res Rev 2013, 12 (1), 376-90. 51. Urig, S.; Fritz-Wolf, K.; Réau, R.; Herold-Mende, C.; Tóth, K.; Davioud-Charvet, E.; Becker, K., Undressing of phosphine gold(I) complexes as irreversible inhibitors of human disulfide reductases. Angew Chem Int Ed Engl. 2006, 45 (12), 5. 52. Ilari, A.; Baiocco, P.; Messori, L.; Fiorillo, A.; Boffi, A.; Gramiccia, M.; Di Muccio, T.; Colotti, G., A gold-containing drug against parasitic polyamine metabolism: the X-ray structure of trypanothione reductase from Leishmania infantum in complex with auranofin reveals a dual mechanism of enzyme inhibition. Amino Acids 2012, 42 (2-3), 803-11. 53. Matsui, A.; Ikeda, T.; Enomoto, K.; Hosoda, K.; Nakashima, H.; Omae, K.; Watanabe, M.; Hibi, T.; Kitajima, M., Increased formation of oxidative DNA damage, 8-hydroxy-2'-deoxyguanosine, in human breast cancer tissue and its relationship to GSTP1 and COMT genotypes. Cancer Lett 2000, 151 (1), 87-95. 54. Halliwell, B.; Chirico, S., Lipid peroxidation: its mechanism, measurement, and significance. Am J Clin Nutr 1993, 57 (5 Suppl), 715S-724S; discussion 724S-725S. 55. Levine, R. L., Carbonyl modified proteins in cellular regulation, aging, and disease. Free Radic Biol Med 2002, 32 (9), 790-6. 56. Noda, N.; Wakasugi, H., Cancer and Oxidative Stress. Japan Medical Association Journal 2001, 44 (12). 57. Dalle-Donne, I.; Giustarini, D.; Colombo, R.; Rossi, R.; Milzani, A., Protein carbonylation in human diseases. Trends Mol Med 2003, 9 (4), 169-76. 58. Shacter, E., Protein oxidative damage. Methods Enzymol 2000, 319, 428-36. 59. Babusikova, E.; Evinova, A.; Hatok, J.; Dobrota, D.; Jurecekova, J., Oxidative Changes and Possible Effects of Polymorphism of Antioxidant Enzymes in Neurodegenerative Disease. In Neurodegenerative Diseases, Kishore, U., Ed. 2013. 60. Dix, T. A.; Aikens, J., Mechanisms and biological relevance of lipid peroxidation initiation. Chem Res Toxicol 1993, 6 (1), 2-18. 61. Nigam, S.; Schewe, T., Phospholipase A(2)s and lipid peroxidation. Biochim Biophys Acta 2000, 1488 (1-2), 167-81. 62. Catala, A., An overview of lipid peroxidation with emphasis in outer segments of photoreceptors and the chemiluminescence assay. Int J Biochem Cell Biol 2006, 38 (9), 1482-95. 63. Barrera, G., Oxidative stress and lipid peroxidation products in cancer progression and therapy. ISRN Oncol 2012, 2012, 137289. 64. Skrzydlewska, E.; Stankiewicz, A.; Sulkowska, M.; Sulkowski, S.; Kasacka, I., Antioxidant status and lipid peroxidation in colorectal cancer. J Toxicol Environ Health A 2001, 64 (3), 213-22. Bibliografía pág. 117 65. Skrzydlewska, E.; Sulkowski, S.; Koda, M.; Zalewski, B.; Kanczuga-Koda, L.; Sulkowska, M., Lipid peroxidation and antioxidant status in colorectal cancer. World J Gastroenterol 2005, 11 (3), 403-6. 66. Gerard-Monnier, D.; Erdelmeier, I.; Regnard, K.; Moze-Henry, N.; Yadan, J. C.; Chaudiere, J., Reactions of 1-methyl-2-phenylindole with malondialdehyde and 4-hydroxyalkenals. Analytical applications to a colorimetric assay of lipid peroxidation. Chem Res Toxicol 1998, 11 (10), 1176-83. 67. He, L.; He, T.; Farrar, S.; Ji, L.; Liu, T.; Ma, X., Antioxidants Maintain Cellular Redox Homeostasis by Elimination of Reactive Oxygen Species. Cell Physiol Biochem 2017, 44 (2), 532-553. 68. Gough, D. R.; Cotter, T. G., Hydrogen peroxide: a Jekyll and Hyde signalling molecule. Cell Death Dis 2011, 2, e213. 69. Kurutas, E. B., The importance of antioxidants which play the role in cellular response against oxidative/nitrosative stress: current state. Nutr J 2016, 15 (1), 71. 70. Birben, E.; Sahiner, U. M.; Sackesen, C.; Erzurum, S.; Kalayci, O., Oxidative stress and antioxidant defense. World Allergy Organ J 2012, 5 (1), 9-19. 71. Christofidou-Solomidou, M.; Muzykantov, V. R., Antioxidant strategies in respiratory medicine. Treat Respir Med 2006, 5 (1), 47-78. 72. Lu, J.; Holmgren, A., The thioredoxin antioxidant system. Free Radic Biol Med 2014, 66, 75-87. 73. Tonissen, K. F.; Di Trapani, G., Thioredoxin system inhibitors as mediators of apoptosis for cancer therapy. Mol Nutr Food Res 2009, 53 (1), 87-103. 74. Selenius, M.; Rundlof, A. K.; Olm, E.; Fernandes, A. P.; Bjornstedt, M., Selenium and the selenoprotein thioredoxin reductase in the prevention, treatment and diagnostics of cancer. Antioxid Redox Signal 2010, 12 (7), 867-80. 75. Sannella, A. R.; Casini, A.; Gabbiani, C.; Messori, L.; Bilia, A. R.; Vincieri, F. F.; Majori, G.; Severini, C., New uses for old drugs. Auranofin, a clinically established antiarthritic metallodrug, exhibits potent antimalarial effects in vitro: Mechanistic and pharmacological implications. FEBS Lett 2008, 582 (6), 844-7. 76. Angelucci, F.; Miele, A. E.; Boumis, G.; Brunori, M.; Dimastrogiovanni, D.; Bellelli, A., Macromolecular bases of antischistosomal therapy. Curr Top Med Chem 2011, 11 (16), 2012-28. 77. Tong, W. M.; Bises, G.; Sheinin, Y.; Ellinger, A.; Genser, D.; Potzi, R.; Wrba, F.; Wenzl, E.; Roka, R.; Neuhold, N.; Peterlik, M.; Cross, H. S., Establishment of primary cultures from human colonic tissue during tumor progression: vitamin-D responses and vitamin-D-receptor expression. Int J Cancer 1998, 75 (3), 46772. 78. Welser-Alves, J. The Advantages and Difficulties of Working with Primary Cells. 79. Aldrich, S. Primary Cell Culture. https://www.sigmaaldrich.com/technicaldocuments/articles/biology/primary-cell-culture.html. 80. Pan, C.; Kumar, C.; Bohl, S.; Klingmueller, U.; Mann, M., Comparative proteomic phenotyping of cell lines and primary cells to assess preservation of cell type-specific functions. Mol Cell Proteomics 2009, 8 (3), 443-50. 81. Alge, C. S.; Hauck, S. M.; Priglinger, S. G.; Kampik, A.; Ueffing, M., Differential protein profiling of primary versus immortalized human RPE cells identifies expression patterns associated with cytoskeletal remodeling and cell survival. J Proteome Res 2006, 5 (4), 862-78. Estudios farmacocinéticos pág. 119 ESTUDIOS FARMACOCINÉTICOS La farmacocinética es la ciencia que estudia la absorción, la distribución, el metabolismo y la eliminación de los fármacos;1 estudios necesarios para confirmar la bondad de un compuesto para la aplicación en medicina. De hecho, optimizar las propiedades fisicoquímicas es uno de los retos del diseño y desarrollo de un fármaco. Hoy en día, al conjunto de propiedades a estudiar durante los ensayos farmacocinéticos es lo que se conocer como propiedades ADME-tox. Tal y como se mencionó en el Capítulo 2 (Parte I), las propiedades farmacológicas que hacen de una molécula un medicamento potencial: solubilidad, absorción, permeación y difusión; acompañado de buena estabilidad y baja toxicidad. Por ello, en esta sección se recogen los diferentes ensayos realizados para intentar conocer a qué procesos somete el organismo a los compuestos sintetizados; y así poder evaluar su idoneidad para su uso como quimioterápico. Reglas como la ya mencionada Regla de Lipinski, han favorecido la investigación sobre el desarrollo de compuestos con aplicación en medicina, gracias a la elaboración de directrices empíricas sobre los parámetros a optimizar en la elaboración de un posible fármaco. A nivel académico, ha permitido también estudiar las propiedades ADME-tox para buscar un equilibrio entre actividad y propiedades fisicoquímicas. Todos los complejos descritos en este trabajo, y cuya actividad antitumoral ya ha sido evaluada, han sido diseñados para lograr compuestos con características óptimas que los harían buenos candidatos para aplicaciones biológicas. Cada una de las partes de los complejos van a influir notablemente en las prestaciones finales del compuesto; por ello, no sólo el metal elegido es un factor clave para una buena actividad biológica, sino también es necesario elegir cuidadosamente ligandos que proporcionen estabilidad, solubilidad, un equilibrio óptimo entre hidrofilicidad y lipofilia, etc. Son precisamente en estas propiedades en las que se ha centrado esta investigación para determinar si la molécula sintetizada cumple con los requisitos necesarios para ser utilizado como fármaco. La solubilidad en agua de los diferentes complejos de Au(III) y Au(I) ya se ha recogido en el capítulo anterior, donde se observó que las solubilidades en agua no eran demasiado elevadas. Cheng y Merz establecieron la relación entre la solubilidad y la aplicación como fármacos mediante el cálculo del parámetro Log(SW).2 Tabla 2.3.1. Relación entre el LogSw del complejo y su aplicación como fármaco Ranking Valor Solubilidad Aplicabilidad del fármaco 0 Log(SW)<-8 No, imposible 1 -8< Log(SW)<-6 No, pero no imposible 2 -6< Log(SW)<-4 Si, baja 3 -4< Log(SW)<-2 Sí, buena 4 -2< Log(SW)<0 Sí, óptima 5 0< Log(SW) No, muy soluble Este estudio ha permitido comprobar que todos los complejos recogidos en este trabajo se encuentran en el rango de lo observado para una buena aplicación de fármacos, tal y como se recoge en la siguiente Tabla. Estudios farmacocinéticos pág. 120 Tabla 2.3.2. Valores de Log(SW) calculados para los complejos sintetizados. COEFICIENTE DE REPARTO OCTANOL/AGUA: LogPow Los resultados de solubilidad en agua son relevantes y un factor a tener en cuenta, ya que puede influir en la absorción y distribución de la molécula. Pero si bien es importante, más lo es aún la evaluación del coeficiente de reparto. El cálculo de este parámetro arroja información sobre el equilibrio en la lipofilicidad e hidrofilicidad del complejo; una valiosa información pues, el equilibrio de estas dos propiedades va a ser determinante para la correcta biodistribución del compuesto. La lipofilia de un compuesto está directamente relacionada con su difusión y penetración en la membrana bicapa lipídica de las células, lo que no sólo va a determinar su actividad citotóxica, sino también va a condicionar su toxicidad sobre los tejidos sanos. Además, está directamente relacionado con la unión a proteínas plasmáticas y el metabolismo del fármaco.3 Para el cálculo del coeficiente de reparto suele utilizarse el sistema agua/octanol porque es el que tiene una mayor cantidad de estudios realizados y por ello, una mayor base de datos. Sin embargo, la fase orgánica debería de elegirse en función de la zona donde el fármaco va a realizar su actividad biológica; así, el noctanol es el indicado para estudios sobre el sistema gastrointestinal, el aceite de oliva para estudios sobre la membrana sangre-cerebro, y el cloroformo para los tejidos bucales.4 De esta forma, la fase orgánica seleccionada es n-octanol. En lo referente a la fase acuosa, en un intento por simular más estrictamente las condiciones fisiológicas se ha reemplazado el agua por un tampón a pH=7.4 de naturaleza acuosa, PBS (Phosphate-buffered Saline) El coeficiente de reparto diferencia de complejos neutros donde se denomina logPpH, de moléculas ionizables donde se trata como logDpH. En ambos casos, el cálculo se ha realizado según la siguiente ecuación: Compuesto de Au(III) tpy ppy bzp [Au(Spym)2L] -3.85 -3.88 -3.77 [Au(S(Me)2pym)2L] -3.93 -3.96 -3.83 [AuCl(2-Tiouracilo)L] -3.86 -3.85 -3.87 [Au(tiourea)2L] -3.54 -3.50 -3.60 [Au(p-etinil tolueno)2L] -3.77 -3.61 [Au(2-etinil piridina)2L] -3.46 -3.40 [Au(OAc)2L] -3.06 -2.81 -2.61 [Au(fenilalanina)L]Cl -3.52 -3.59 -3.40 [Au(metionina)L]Cl -3.30 -3.33 Compuesto de Au(I) [AuCl(HMPT) -2.90 [Au(Spy) HMPT] -3.66 [Au(Spym) HMPT] -3.42 [Au(S(Me)2pym) HMPT] -3.05 [Au(2-Sbenzotiazol) HMPT] -3.57 [Au(2-Stiazolina) HMPT] -3.19 [Au(2-Sbenzimidazol) HMPT] -3.46 [Au(2-Tiouracilo) HMPT] -3.17 [Au(Fenilacetileno)HMPT] -3.49 [Au(Tolilacetileno) HMPT] -3.54 [Au(4-OMe-facetileno) HMPT] -3.39 [Au(4-Br-fenilacetileno) HMPT] -3.75 [Au(4-Cl-fenilacetileno) HMPT] -3.69 [Au(2-etinilpiridina) HMPT] -3.29 [Au(3-etinilpiridina) HMPT] -3.22 *tpy: 2-tolil piridina, ppy: 2-fenil piridina, bzp: 2bencil piridina. Los cuadros oscuros representan complejos no obtenidos Coeficiente de reparto: LogP pág. 121 Ecuación 2.3.1. Fórmula para el cálculo de LogP/DpH. A pesar de que Lipinski estableció que para un fármaco el valor del LogP debía ser inferior a 5, los rangos ideales de lipofilicidad son más restrictivos; siendo -1 ≤ logP ≤ 3 para una mayor aplicabilidad, aunque para absorción oral o intestinal el valor ideal oscila entre 1.35-1.80.5 La medida del LogP en este trabajo se realizó mediante el método shake flask, o lo que es lo mismo el método del matraz agitado; no sólo por la robustez del método sino también por su simplicidad (ver Parte Experimental: Estudios farmacocinéticos).6 De esta forma, se han calculado los valores de logP para los complejos de Au(III) y Au(I). Tabla 2.3.3. Valores de logP de los complejos de Au(I). Con estos resultados se puede concluir que, aunque todos los compuestos de Au(I) tienen valores muy adecuados de logP, cabe mencionar que los que incorporan unidades tiol muestran en general valores ligeramente más pequeños que los que poseen unidades acetiluro. Como era de esperar, los compuestos [Au(Tolilacetileno)HMPT] 36 y [Au(2-Mercapto-4,6-Dimetilpirimidina)HMPT] 30 muestran un mayor carácter lipófilo que sus análogos sin grupos metilo, pues este grupo favorece la lipofilicidad. El aumento del carácter hidrófobo se hace más evidente en el complejo 36, ya que en el caso del complejo 30 también contiene átomos de N capaces de realizar enlaces de hidrógeno capaces de compensar ese aumento de lipofilicidad (Figura 2.3.1). Compuesto Log P7.4 Código Cisplatino -0.53 Auranofin -2.53 [Au(2-Mercaptopiridina)HMPT] 0.93 28 [Au(2-Mercaptopirimidina)HMPT] 1.20 29 [Au(2-Mercapto-4,6-Dimetilpirimidina)HMPT] 1.30 30 [Au(2-Mercaptobenzotiazol)HMPT] 0.98 31 [Au(2-Mercaptotiazolina)HMPT] 0.74 32 [Au(2-Mercaptobenzimidazol)HMPT] 0.89 33 [Au(2-Tiouracil)HMPT] 0.66 34 [Au(Fenilacetileno)HMPT] 0.63 35 [Au(Tolilacetileno)HMPT] 1.33 36 [Au(4-Br-fenilacetileno)HMPT] 0.91 38 [Au(4-Cl-fenilacetileno)HMPT] 1.03 39 [Au(2-etinilpiridina)HMPT] 1.24 40 [Au(3-etinilpiridina)HMPT] 1.20 41 Coeficiente de reparto: LogP pág. 122 AuHMPT AuHMPT N NSAuHMPT H H O O H H N NSAuHMPT H H O O H H Figura 2.3.1. Estructuras sintetizadas para el estudio de la influencia de grupos Me. Sin embargo, no sólo los grupos Me disminuyen la hidrofilicidad de un compuesto, también muestran este efecto los anillos aromáticos tal y como se ha comprobado mediante la determinación de logP con las estructuras [Au(2-Mercaptobenzotiazol)HMPT] 31 y [Au(2-Mercaptotiazolina)HMPT] 32. Éste último presenta una mayor solubilidad en agua que su análogo con un anillo bencénico fusionado. Asimismo, como ya se ha mencionado en los derivados con pirimidina, la presencia de un átomo dador o aceptor de enlaces de hidrógeno también contribuye positivamente a un aumento de la solubilidad en agua, tendencia que se demuestra al reemplazar el átomo de S en la unidad benzotiazol por NH en el benzoimidazol. A pesar de que el átomo de S también puede generar enlaces de H, éstos son mucho más débiles que los que forma el N; por ello, aunque el anillo bencénico sigue aumentando la lipofilicidad, la presencia de ese grupo amina en el benzoimidazol equilibra en cierta medida el carácter lipófilo/hidrófilo. N S S AuHMPT N S S AuHMPT N NH S AuHMPT OH H OH H OH H OH Figura 2.3.3. Estructuras sintetizadas para el estudio de la influencia de anillos aromáticos y enlaces de hidrógeno. En un intento por relacionar los valores de logP medidos con los valores de IC50 para la línea tumoral Caco-2, se observa como valores más próximos a la unidad de logP, es decir un ligero predominio del carácter lipófilo es positivo para una mayor citotoxicidad. Esto podría ser debido a que esta propiedad es decisiva para la permeabilidad del complejo en la bicapa lipídica, primera de las barreras que se va a encontrar el fármaco para desempeñar su función antitumoral. Estabilidad en condiciones fisiológicas pág. 129 ESTABILIDAD DE LOS COMPLEJOS DE Au(III) Al igual que en el caso de los complejos de Au(I), las medidas de estabilidad en condiciones fisiológicas de los derivados de Au(III) se ha restringido a los complejos potencialmente aplicables a su uso en el tratamiento para el cáncer, dando especial importancia a los valores de logP calculados en el apartado anterior. De esta forma se han realizado las medidas de UV-vis siguiendo el mismo procedimiento que con los complejos de Au(I), con los complejos [AuX2L] donde X=tiourea. Estos complejos exhiben en todos los casos un efecto hipocrómico especialmente marcado tras la primera hora, aunque después de ese punto, se da poca variación en la intensidad de absorbancia. El complejo 14 presenta una menor variación con el tiempo (ver Figura 2.3.8), lo que se podría explicar por la rigidez del sistema. Mientras que los ligandos tpy y bzp contienen un grupo metilo y metileno, respectivamente; el ligando ppy genera un ciclo de 5 miembros con el átomo de Au, y no presenta ningún otro sustituyente, lo que le confiere una estabilidad extra en comparación con el resto de los derivados con unidades tiourea. Figura 2.3.8. Espectro de absorción registrado durante 24h del complejo 13 (arriba) y 14 (abajo). Estabilidad en condiciones fisiológicas pág. 130 Al igual que se ha procedido con los complejos de Au(I), se han realizado estos mismos estudios de estabilidad utilizando como disolvente PBS con medio de cultivo al 20%. En el caso del complejo 13, se observa un aumento progresivo de la intensidad de absorbancia de las bandas registradas a λ=242 y 322 nm; así como un leve desplazamiento hacia el rojo (desplazamiento batocrómico). Ese aumento de la intensidad se puede atribuir a la sustitución de los ligandos tiourea para la formación de un nuevo complejo cuyo coeficiente de extinción molar () sea mayor que el del producto con tiourea. Figura 2.3.9. Espectro de absorción registrado durante 24h del complejo 13 en PBS+20% medio completo. En lo que respecta a los análogos 14 y 15, ambos exhiben un comportamiento similar puesto que durante las primeras 11 horas de incubación muestran un ligero incremento de su intensidad de absorbancia, que se estabiliza a las 24 h. Este hecho se atribuye a la formación de un nuevo complejo resultado de la sustitución de la tiourea por ligandos O-dadores.8 Interacción con proteínas de transporte pág. 131 Figura 2.3.10. Espectros de absorbancia durante 24 h del complejo 15 en PBS+20% medio completo. INTERACCIÓN CON PROTEÍNAS DE TRANSPORTE: ASB Como se ha comentado en el apartado anterior, la estructura de un fármaco es determinante para sus propiedades ADME-tox, así se sabe que la distribución de medicamentos en el cuerpo está controlada por la permeabilidad a través de las membranas tisulares.9 Por ejemplo, el tracto gastrointestinal y la barrera hematoencefálica proporcionan barreras eficientes a la permeabilidad de los fármacos.10 Características intrínsecas del complejo, especialmente la lipofilia influyen en gran parte el grado de absorción; de hecho, la lipofilia se considera generalmente como un factor clave en el grado de absorción del fármaco, el transporte hepático y la penetración del cerebro. Sin embargo, la correcta biodistribución del compuesto no depende únicamente de sus propiedades puesto que la contribución de las proteínas de transporte es un parámetro importante en este proceso. La interacción de un fármaco con proteínas de transporte puede tener dos resultados distintos:11 ¨ Interacción sustrato-proteína con la finalidad de transporte a través de las membranas. ¨ Interacción sustrato-proteína que inhibe la proteína bloqueando el transporte y, en consecuencia, modulando la acción del transportador de proteína.12 Esta investigación se ha centrado en el primero de los casos puesto que el objetivo es la evaluación de la interacción complejo-albúmina sérica (AS); ya que cuando el complejo es administrado al organismo, éste se transporta y distribuye al líquido intersticial de los tejidos a través del plasma. El componente principal del plasma es la albúmina sérica humana (ASH), siendo aproximadamente al 60% de la masa de proteínas plasmáticas con una concentración de 0.05 g/l. Se conoce que ASH es el transportador de diversas sustancias endógenas (hormonas, vitaminas…), pero también exógenas como fármacos.13 Otro aspecto a destacar de la ASH es que se da en una mayor concentración en células tumorales, constituyendo una importante diana para Interacción con proteínas de transporte pág. 132 quimioterápicos; de hecho, medicamentos aprobados como el paclitaxel y la doxorrubicina, interactúan con ASH para transportarse de manera eficiente a las células cancerosas.14-15 Todos estos factores secundan la importancia de realizar estudios para conocer la interacción de las moléculas del fármaco con ASH para comprender el proceso de transporte del fármaco. Para estos estudios, en la mayoría de los casos se ha utilizado la albúmina sérica bovina (ASB), en parte debido a su homología estructural con la ASH (ver Figura 2.2.2.11),16 pero también por la mayor disponibilidad comercial y estabilidad de la ASB. Su estructura tiene forma de corazón y está compuesta por tres dominios homólogos específicos I, II y III,17 que están organizados linealmente. Cada dominio tiene subdominios A y B. Las principales regiones de los sitios de unión de moléculas endógenas y exógenas, con la albúmina, se localizan en las cavidades hidrofóbicas en los subdominios IIA y IIIA.18 El sitio I (ubicado en el subdominio IIA) es un sitio de unión selectivo para aniones heterocíclicos, mientras que el sitio II (ubicado en el subdominio IIIA) se selecciona mediante carboxilatos aromáticos. Asimismo, la ASB contiene un total de 583 aminoácidos con veinte residuos de tirosilo (Tyr) y dos residuos de triptófano (Trp134: que se encuentra en la superficie del subdominio IB; y Trp212: ubicado dentro del bolsillo de unión hidrofóbica del subdominio IIA).19 Son precisamente estos residuos Try y Trp, junto con unidades de fenilalanina, los que confieren a la albúmina propiedades fluorescentes. Figura 2.3.11. Estructura tridimensional de la ASH (izq.) y ASB (drcha.) con los residuos Trp en verde. Esta propiedad es importante, porque de entre otros métodos para la evaluación de la interacción proteínafármaco, las técnicas de fluorescencia son excelentes ayudas en el estudio de las interacciones entre los fármacos y la AS debido a su alta sensibilidad a cambios en el microambiente de las proteínas,20 rapidez y facilidad de implementación. Dado que el estudio se va a realizar mediante espectroscopia de fluorescencia, la ASB presenta una ventaja adicional sobre la ASH, y es que la ASH posee un sólo residuo de triptófano (Trp214), frente a los dos ya mencionados que contiene la ASB. El fundamento de este método indirecto se basa en que cuando la ASB interacciona con otro compuesto, su fluorescencia intrínseca cambia con la concentración del complejo. De esta forma se va a monitorizar el cambio de la fluorescencia de ésta (fluoróforo) en ausencia y presencia de los diferentes complejos de Au(I) y Au(II) seleccionados con base en sus propiedades farmacodinámicas y farmacocinéticas hasta ahora estudiadas (Tabla 2.3.9). Para estos estudios, se mantiene la concentración de ASB a 50 µM, y se van adicionando alícuotas de la disolución de los complejos en DMSO. Interacción con proteínas de transporte pág. 133 Tabla 2.3.9. Complejos de Au seleccionados para este estudio y sus propiedades. Complejo IC50 (µM) LogP 13 Sin efecto -0.18 14 Sin efecto -0.30 15 Sin efecto 0.005 35 3.72±0.08 0.63 38 5.25±0.21 0.91 39 6.14±0.14 1.03 40 2.33±0.10 1.24 41 6.26±0.15 1.20 33 4.50±0.10 0.87 34 4.55±0.11 0.66 En todos los casos se ha observado la misma tendencia, una disminución (quenching) de la intensidad de la fluorescencia (véase Figura 2.3.12), por lo que los complejos se comportan como quenchers. Según se encuentra recogido en la bibliografía, la mayoría de los complejos de Au(I) interaccionan con la ASB mediante la unión al residuo de cisteína Cys34 aunque, también se han dado casos donde la parte orgánica del complejo presenta afinidad por otros sitios de unión de la proteína, especialmente cuando hay restos lipófilos tales como grupos fenol.21 Figura 2.3.12. Espectro de emisión de fluorescencia de ASB con concentraciones crecientes del compuesto 40. 350 400 450 0 100000 200000 300000 8.86·10-5 M 7 0 M 7 Emission Intensity, u.a. , nm Interacción con proteínas de transporte pág. 134 Mecanismo de quenching de ASB mediado por derivados de Au Toda desactivación de la fluorescencia se produce por la interacción molecular entre el fluoróforo y el quencher. Este proceso puede ser de tipo estático, dinámico o darse ambos simultáneamente, y se van a poder distinguir por su diferente dependencia de la temperatura y la viscosidad. El quenching estático implica la formación de complejos no fluorescentes con el quencher, cuya estabilidad disminuye al aumentar la temperatura; y, por lo tanto, la constante de quenching (Kq) va a disminuir. El quenching dinámico, por otro lado, hace alusión a la difusión del quencher al fluoróforo durante la vida del estado excitado; así, por contacto con el quencher, el fluoróforo vuelve al estado fundamental sin emisión de fotones. Dado que las temperaturas más altas dan como resultado grandes coeficientes de difusión, en este tipo de quenching, la kq aumenta al aumentar la temperatura. De esta forma, y para determinar que mecanismo de desactivación opera en cada uno de los complejos, se ha realizado un análisis de los valores de intensidad de fluorescencia mediante la ecuación de Stern-Volmer (Ecuación 2.3.2). Ecuación 2.3.2. Relación de la Intensidad de fluorescencia y la concentración del quencher (Ecuación Stern-Volmer). Para poder evaluar la desactivación de la luminiscencia mediante esta ecuación, se representa el cociente de la intensidad intrínseca de ASB (F0) entre el valor alcanzado con la adición del complejo (F), frente a la concentración del quencher ([Q], M). El resultado es una recta cuya ordenada en el origen es la unidad, mientras que la pendiente equivale a KSV (constante de Stern-Volmer, M-1). Asimismo, la pendiente también permite calcular el parámetro de la constante bimolecular de quenching (kq, M-1s-1), puesto que también es equivalente al producto entre el tiempo de vida del fluoróforo (τ0), que se considera 10-8 s, y kq. En los casos de quenching estático y dinámico, la dependencia de F0/F con la concentración es lineal; pero en el caso de que no sea lineal suele indicar que ambos mecanismos operan en la desactivación de la luminiscencia. Cuando esto sucede la ecuación de Stern-Volmer se ajusta mejor a la siguiente ecuación cuadrática: Ecuación 2.3.3. Ecuación de Stern-Volmer para casos de dos tipos de quenching.22 ESTUDIOS DE QUENCHING CON DERIVADOS DE Au(I) De esta forma se analizaron los resultados de los complejos de Au(I), representando frente a [Q]. En todos los casos se han observado tendencias lineales que indican que el quenching operativo es predominantemente estático.23 Sin embargo, el complejo 40 se ajusta a una curva polinómica de segundo grado, que no lineal, lo Interacción con proteínas de transporte pág. 135 que parece indicar que con este compuesto en concreto no sólo opera un tipo de quenching, sino ambos (ver Figura 2.3.13). No obstante, sí se puede hablar de una tendencia lineal a concentraciones bajas (hasta 44 µM) pudiendo aplicar en este rango de concentraciones la Ecuación Stern-Volmer para un solo tipo de quenching, que como es lineal, en ese rango de concentraciones parece ser estático. 0 2 4 6 8 10 12 0 0,00002 0,00004 0,00006 0,00008 0,0001 0,00012 0,00014 0,00016 0,00018 F0/F [Complejo Au] 33 34 35 38 39 40 40 inicio 41 Figura 2.3.13. Representación de la ecuación de Stern-Volmer para los complejos de Au(I) seleccionados. Mediante el uso de Ecuación 2.3.2, se han calculado los valores de las constantes KSV y kq para los derivados de Au(I), lo que va a permitir conocer el tipo de quenching implicado puesto que cuando el valor de kq es mayor que el valor máximo de la constante de velocidad de difusión para el quenching dinámico (2.0·1010 M1 s-1), suele indicar que el quenching estático está implicado. Según los valores de kq calculados, todo parece indicar que el quenching estático es el operante en todos los casos. Tabla 2.3.10. Valores de las constantes KSV y kq calculadas para los complejos de Au(I) a 298K. 35 38 39 40 41 33 34 KSV (M-1) 4.21·103 1.39·104 1.50·104 7.19·104 3.32·104 9.40·104 3.10·104 kq (M-1 s-1) 4.21·1012 1.39·1012 1.50·1012 7.19·1012 3.32·1012 9.40·1012 3.10·1012 Sin embargo, el estudio de la constante biomolecular no es la única forma de elucidar qué tipo de quenching es el responsable de la disminución de la fluorescencia intrínseca de la ASB; también se puede analizar por el estudio del efecto de la temperatura (relacionado con la viscosidad), o por el estudio del tiempo de vida. En Interacción con proteínas de transporte pág. 136 lo que se refiere al tiempo de vida, éste no se va a ver alterado en casos de quenching estático, pero sí cuando se trata de quenching dinámico. El efecto de la temperatura es una forma sencilla y eficaz de conocer el quenching implicado ya que, como se ha comentado con anterioridad, un aumento de la temperatura conduce a una difusión más rápida y a más colisiones, incrementando el quenching dinámico. Por el contrario, los complejos débilmente unidos van a poder disociarse a temperaturas elevadas, con la consiguiente disminución de quenching estático (Figura 2.3.14). Figura 2.3.14. Efecto de la temperatura sobre el quenching dinámico (izq.) y estático (drcha.). De esta forma, se ha realizado el mismo estudio que el expuesto anteriormente, pero a diferentes temperaturas, 305 y 310 K. A modo de ejemplo se recoge los valores obtenidos para los complejos 33 y 34, donde se confirma el quenching estático predicho por el estudio de sus constantes kq. Tabla 2.3.11. Valores de Ksv (103, M-1) y kq (1012, M-1s-1) a diferentes temperaturas. T (K) 33 34 Ksv kq Ksv kq 298 94.0 9.40 31.0 3.10 305 34.1 3.41 22.8 2.28 310 24.6 2.46 13.6 1.36 ESTUDIOS DE QUENCHING CON DERIVADOS DE Au(III) En lo que respecta a los derivados de Au(III), los complejos seleccionados son los que incorporan las unidades tiourea puesto que son los que mejores propiedades farmacocinéticas presentan. Se ha realizado el estudio del Stern-Volmer de la misma forma que en el caso de los complejos de Au(I), observándose un comportamiento muy similar; puesto que en todos los casos se da una desactivación de la luminiscencia. De nuevo, los datos obtenidos se han estudiado por el tratamiento de Stern-Volmer: Interacción con proteínas de transporte pág. 137 0 0,5 1 1,5 2 2,5 3 0 0,00002 0,00004 0,00006 0,00008 0,0001 0,00012 0,00014 0,00016 0,00018 F0/F [Complejos de Au(III)], M 13 14 15 Figura 2.3.15. Representación de la ecuación de Stern-Volmer para los complejos de Au(III) seleccionados. Los valores de KSV y kq para los complejos de Au(III) testados son muy similares a los encontrados para los derivados de Au(I), ya que en sendos casos los valores oscilan en los mismos órdenes de magnitud. Así, y dado que el tipo de quenching se puede deducir del valor de kq; los derivados de Au(III) también quenchean la fluorescencia intrínseca de la ASB a través de un mecanismo estático. Tabla 2.3.12. Valores de las constantes KSV y kq calculados a 298K. 13 14 15 KSV (M-1) 3.35·104 2.70·104 5.09·103 kq (M-1 s-1) 3.35·1012 2.70·1012 5.09·1011 Esta conclusión es extensible a todas las temperaturas ensayadas (298, 305 y 310K), ya que también kq muestra valores superiores al valor máximo de la constante de velocidad de difusión para el quenching dinámico (2.0·1010 M-1 s-1). Ahora bien, el estudio de la influencia de la intensidad de la fluorescencia respecto de la temperatura no es concluyente ya que no se observa una tendencia al aumentar este parámetro. Tabla 2.3.13. Valores de Ksv (M-1) y kq (M-1 s-1) a diferentes temperaturas T (K) 13 14 15 Ksv kq Ksv kq Ksv kq 298 3.35·104 3.35·1012 2.70·104 2.70·1012 5.09·103 5.09·1011 305 6.98·104 6.98·1012 2.39·104 2.39·1012 5.13·103 5.13·1011 310 3.54·104 3.54·1012 2.45·104 2.45·1012 4.79·103 4.79·1011 Interacción con proteínas de transporte pág. 138 Parámetros de enlace e identificación del sitio de unión ASB-complejo Au Como ya se ha comentado, la ASB contiene tres dominios (I, II, III) con sus correspondientes subdominios con diferente composición química, por lo que la interacción observada de los complejos de Au sintetizados con la ASB no va a ser homogénea, sino que se va a dar en sitios concretos, así como con una fortaleza diferente en función del complejo involucrado. Para poder determinar la fortaleza del enlace ASB-complejo así como el número de sitios que presentan esta interacción se ha utilizado la Ecuación de Stern-Volmer modificada: Ecuación 2.3.4. Ecuación de Stern-Volmer modificada Estudio de la interacción ASB-Complejo de Au(I) Los parámetros necesarios para este estudio son los mismos que los utilizados en el caso anterior, pero ahora al representar frente a se puede calcular el parámetro Kb (constante de unión) y n (número de sitios de unión por molécula de ASB). -1,5 -1 -0,5 0 0,5 1 1,5 -5,5 -5 -4,5 -4 -3,5 -3 log (F0-F)/F log [complejo Au] 33 34 35 38 39 40 41 Figura 2.3.16. Representación de la ecuación de Stern-Volmer modificada. Aunque con alguna desviación, las tendencias pueden considerarse lineales y ser estudiadas mediante la ecuación anterior, y así obtener los siguientes resultados: