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1
TRABAJO
FIN DE
GRADO
2016
Complejos me álicos luminiscen es con
aplicaciones en e apia y bioimagen
Di ec o : Vanesa Fe nández Mo ei a
Ponen e: Ma ía Dolo es Villacampa Pé ez
Héc o Sas e Ma ín
Ag adecimien os
A odo el g upo de in es igación, un equipo ma a illoso de pe sonas que me ha
concedido la opción, los medios y la ayuda su icien e en odo momen o pa a la
consecución de es e p oyec o y, en pa icula , a mi di ec o a Vanesa Fe nández Mo ei a,
quien en su admi able dedicación a la in es igación hizo de es e un abajo más
asequible.
A And és, mi segundo p o eso , con quien compa í g andes momen os de
labo a o io.
Po úl imo, me gus a ía hace mención a mi he mano, que sin necesidad de hace
ac o de p esencia, ha sido, es y se á siemp e un modelo de compo amien o en el que
que e e se e lejado.
Índice
Ab e ia u as
Resumen
Abs ac
In oducción.......................................................................................................................1
Obje i os............................................................................................................................3
Resul ados y discusión.......................................................................................................4
P ocedimien o sin é ico y ca ac e ización.............................................................4
Di acción de ayos X............................................................................................9
Es udios espec oscópicos....................................................................................11
Ac i idad biológica y biodis ibución..................................................................14
Pa e expe imen al...........................................................................................................18
Ins umen ación y condiciones............................................................................18
Ma e iales y p ocedimien os................................................................................18
Conclusiones....................................................................................................................24
Bibliog a ía......................................................................................................................25
ANEXOS.........................................................................................................................26
Espec oscopia de RMN......................................................................................27
Espec oscopia de IR...........................................................................................41
Espec ome ía de MS..........................................................................................44
Di acción de ayos X..........................................................................................47
Luminiscencia......................................................................................................48
Ab e ia u as
bipy 2,2'-bipi idina
(CD3)2CO Ace ona deu e ada
DCM Clo u o de me ileno, diclo ome ano
DMEM Dulbecco's Modi ied Eagle's Medium
DMSO Dime ilsul óxido
DRAQ5 1,5-bis{[2-(dime ilamino)e il]amino}-4,8-dihid oxian aceno-9,10-diona
eq. Equi alen e/s
HOT Ácido í lico, ácido i luo ome ansul ónico
HSQC He e onuclea Single Quan um Cohe ence o He e onuclea Single
Quan um Co ela ion
IC Inhibi o y Concen a ion
IR Espec oscopia in a oja
LLCT Ligand o Ligand Cha ge T ans e
MLCT Me al o Ligand Cha ge T ans e
MS Espec ome ía de masas
MTT 3-(4,5-dime il iazol-2-ilo)-2,5-di enil e azol
OT T i la o, i luo ome ansul ona o
PBS Phospha e-Bu e ed Saline
py Pi idina
RMN Resonancia Magné ica Nuclea
Room empe a u e
h Te ahid o io eno
ol. Tolueno
T xR Tio edoxina educ asa
UV Ul a iole a

Resumen
Con la is a pues a en el desa ollo de especies químicas ú iles en medicina
diagnós ica y e apéu ica se ha a ado de sin e iza una se ie de compues os de
coo dinación an o monome álicos como he e obime álicos del ipo ac-
[Re(bipy)(CO)3L]+ y ac-[Re(bipy)(CO)3(L-AuPPh3)]+ espec i amen e, donde L
ep esen a a dis in os de i ados de me cap opi idina que ac ua án como ligandos
conec o es en e los agmen os me álicos de enio y o o. En ellos, el de enio apo a las
p opiedades luminiscen es, mien as que el de o o p opo ciona e ec os
an ip oli e a i os.
Los compues os ob enidos se han ca ac e izado debidamen e median e écnicas de
espec oscopia de RMN e IR, espec ome ía de masas y, cuando ha sido posible, po
di acción de ayos X. Además, se han es udiado sus p opiedades o o ísicas con obje o
de alo a su iabilidad como agen es de imagen en mic oscopía de luo escencia,
écnica cuyo ca ác e no in asi o le augu a a sí misma un u u o p ome edo , y de es a
o ma comp ende el mecanismo de ac uación median e la isualización a ni el celula .
También se han lle ado a cabo es udios de ac i idad biológica sob e una línea celula
umo al, las células cance ígenas ce icou e inas HeLa, pa a e alua el e ec o de las
a iaciones es uc u ales in oducidas en la biodis ibución, ci o oxicidad, e c.,
quedando pa en es las di e encias en e los de i ados de Re(I) y los de Re(I)/Au(I). Así,
las especies he e obime álicas p esen an alo es signi ica i amen e meno es de IC50, lo
que se aduce di ec amen e en una mayo ac i idad an icance ígena en es a línea
celula , hecho que, en pa e, puede se explicado po su apa en e en ada a las
mi ocond ias, donde desa ollan odo su po encial, y que ha sido obse ado po
mic oscopía de luo escencia.
Abs ac
Wi h he aim o de eloping new chemical species wi h po en ial adequacy in medical
diagnosis and he apy, we ha e ied o syn hesize a se ies o coo dina ion compounds,
ei he monome allic o he e obime allic, wi h he o m ac-[Re(bipy)(CO)3L]+ and ac-
[Re(bipy)(CO)3(L-AuPPh3)]+ espec i ely, whe e L s ands o dis inc me cap opy idine
de i a i es ha will ac as ligands be ween he me allic agmen s o henium and gold.
In hese compounds, while henium p o ides he luminescen p ope ies, he gold
agmen con ibu es wi h an ip oli e a i e e ec s.
The syn hesized compounds ha e been ho oughly cha ac e ized wi h NMR and IR
spec oscopy, mass spec ome y and, when easible, wi h X ay di ac ion echniques.
Mo eo e , wi h he pu pose o assess hei iabili y as luo escen mic oscopy imaging
agen s, hei pho o-physical p ope ies ha e been s udied. In ac , he applica ion in his
mic oscopic echnique, which due o i s li le in asi eness i ’s p edic ed o ha e a
p omising u u e, allow us o unde s and hei mechanisms o ac ion acking hese
compounds a he cellula le el.
Fu he mo e, we ha e pe o med biological ac i i y assays o e alua e he e ec s o
he in oduced s uc u al a ia ions on he sub-cellula dis ibu ion, cy o oxici y, e c. Fo
his pu pose, we ha e used he well-known ce ical cance cell line HeLa. Ou esul s,
indica e he exis ence o di e ences be ween he Re(I) and he Re(I)/Au(I) compounds.
Thus, he he e obime allic species signi ican ly showed educed IC50 alues, which
di ec ly means ha hei an icance ac i i y is highe in his cell line. This could be
pa ially explained by hei mi ochond ial localiza ion, assessed by luo escence
mic oscopy, and whe e i ’s p edic ed ha hey de elop all hei cy o oxic po en ial.
1
In oducción
Las in es igaciones en medicina diagnós ica se cen an en la búsqueda de écnicas no
in asi as como mé odo de de ección, e incluso de a amien o, de en e medades. En
es e sen ido, la mic oscopía de luo escencia se es á con i iendo g adualmen e en una
he amien a de uso habi ual.
Es a écnica consis e básicamen e en la ecepción de la luz emi ida po cie os g upos
denominados luo ó o os o luo oc omos al ol e a su es ado undamen al de ene gía
y, dado que pe mi e la isualización a ni el celula (Figu a 1), con o ma una g an
es a egia pa a la elucidación de la biodis ibución y las in e acciones que es ablecen los
á macos de nue a gene ación con las moléculas del o ganismo a las que a di igida su
acción a macológica.
Figu a 1.- Imagen ob enida po mic oscopía de luo escencia de células HeLa.
Ma caje de la memb ana plasmá ica en ojo, del ci oesquele o en e de y del núcleo en azul.
Sin emba go, el mayo impedimen o pa a la pues a en ma cha de es a écnica es la
escasa disponibilidad de especies químicas que p esen an las p opiedades luminiscen es
adecuadas y que a su ez ac úan como á macos en las moléculas diana, lo cual, no solo
suele implica la unión a ellas, sino ambién la ealización de una acción e icaz.
Po ello, es con enien e da comienzo a es os es udios con el diseño p e io de las
moléculas que, a p io i, p esen a án unas mejo es ca ac e ís icas de es abilidad,
solubilidad, localización, selec i idad, oxicidad, cu a dosis- espues a y demás ac o es
que hay que ene en cuen a pa a e i a en la mayo medida posible los e ec os ad e sos
que pueden ene luga en una ma iz an compleja como la de los o ganismos i os.
Po an o, se pa e de un análisis minucioso de las nume osas in es igaciones
ealizadas sob e agen es de imagen celula . Po un lado, se a a de encon a un
segmen o que, po sus p opiedades o o ísicas, pe mi a la isualización y po o o, de un
agmen o que p esen e buenas ca ac e ís icas a macológicas.
En cuan o al p ime pun o, se han es udiado especialmen e colo an es o gánicos,
compues os o ganome álicos y complejos de coo dinación an o de me ales del bloque p
como del bloque d y , siendo es os úl imos los que mejo es ca ac e ís icas p esen an
2
debido undamen almen e a su es abilidad en medio acuoso en p esencia de oxígeno y a
la ácil modulación de las longi udes de onda de emisión en unción del me al de
ansición y los ligandos empleados.1
En es e sen ido los sis emas de los que se iene un mayo conocimien o son los
complejos de me ales de ansición del bloque d, en pa icula los de Re(I), Ru(II) e
I (III) en con igu ación d6, po lo que sus p opiedades o o ísicas es án más que
epu adas y en los que la emisión suele consis i en un p oceso de ans e encia de ca ga
me al-ligando (MLCT).
Respec o al segundo pun o, los complejos de Au, y más conc e amen e los de Au(I),
es án siendo in es igados debido a sus a ac i as p opiedades biológicas2 has a al pun o
que se ha acuñado el é mino "c iso e apia" pa a e e i se a la u ilización de es os como
a amien o médico. En es e campo es digno de mención el Au ano ín (Figu a 2), un
á maco pione o que iene siendo usado pa a comba i la a i is euma oide.3
Figu a 2.- Es uc u a del Au ano ín
Di e sos es udios demues an que es e me al es capaz de inhibi la acción de la
enzima mi ocond ial io edoxina educ asa (T xR)4,5 g acias a que es a con iene un
esiduo de selenocis eína en su cen o ac i o. Dicha p o eína es á in oluc ada en la
eliminación del es és oxida i o en las células y se sob eexp esa en células umo ales, lo
que pe mi e explica la ac i idad an icance ígena del o o al induci apop osis6 sob e
ellas, y que las mi ocond ias sean una diana ex ao dina ia pa a los á macos
an i umo ales. Además, los complejos de Au mues an una buena es abilidad bajo
condiciones isiológicas.
9
Los complejos F, G, H, 4 y 6 se han ca ac e izado debidamen e median e las écnicas
espec oscópicas de 1H, 13C y 31P-RMN, IR (Tabla 1) y MS. A modo de ejemplo se
mues a en la Figu a 7 el espec o de 1H-RMN del p oduc o inal 4, donde se puede
ap ecia el pa ón ípico que exhiben es e ipo de complejos. Las señales
co espondien es a los p o ones de la bipy siguen la misma pau a que ya se mos o en la
Figu a 5, pe o en es e caso apa ecen no ablemen e más desapan alladas po e ec o de la
coo dinación del ligando de i ado de me cap opi idina al cen o me álico.
Figu a 7.- Espec o 1H-RMN del complejo 4
Tabla 1.- F ecuencias de ib ación en espec oscopia IR
Compues o
ν(C≡O) (cm-1)
ν(C–S) (cm-1)
1
2005 ( ), 1901 ( ),
1877 ( )
757 ( )
2
2002 ( ), 1878 ( )
754 ( )
3
2035 (m), 2023 (m),
1915 (m), 1886 (m)
767 ( ) (C=S)
4
2025 ( ), 1900 ( )
691 ( )
6
2014 (m), 1876 ( )
691 ( )
Código de in ensidades: ( ) ue e, (m) media, (d) débil
Di acción de ayos X
Se han ob enido monoc is ales de los compues os 2 y 3 median e di usión líquido-
líquido len a que cumplen los equisi os de o ma, amaño y pu eza pa a pode se
esuel os po di acción de ayos X (Figu as 8 y 9 espec i amen e).
6
3
4
5
2
3
1

10
Pa a ello, se ha u ilizado una mezcla de disol en es de DCM, donde dichos
complejos son pe ec amen e solubles, y é e die ílico o hexano, llamado agen e de
c is alización o p ecipi an e, po se miscible con el p ime o pe o menos denso y pola .
Es e úl imo se ie e con sumo cuidado po las pa edes del ubo de c is alización de
mane a que apa en emen e se o men dos ases. Con el paso del iempo y la di usión de
moléculas de disol en e en e sí, la meno solubilidad de las especies disuel as a
p o ocando la p og esi a c is alización.
Como e a de espe a , en ambos ipos de complejos el á omo de enio se encuen a en
un en o no de coo dinación oc aéd ico dis o sionado debido básicamen e a la limi ación
geomé ica que iene impues a po el ángulo de mo dedu a del ligando quela o
bipi idina. Los es ca bonilos p esen an una disposición acial, po lo que dos de ellos y
el ligando bipy se si úan en el plano ecua o ial quedando, po an o, el es an e ca bonilo
y el de i ado de me cap opi idina ocupando las posiciones axiales.
Sin emba go, en con a de lo espe ado se obse a que apenas hay a iación en la
longi ud del enlace S1C14 del iol y de la iona. Es e hecho se puede jus i ica en base
a la longi ud del enlace Re1–S1, que pa ece se el ealmen e a ec ado po la p esencia
de ambas o mas au óme as. Así, en el iol el azu e dispone de mayo densidad
elec ónica y po an o, de mayo capacidad pa a ac ua como -dado y o ma un
enlace coo dinado. Po el con a io, en la iona el S iene sus elec ones menos
disponibles pa a la coo dinación, po lo que se ap ecia que su enlace al cen o me álico
es más débil.
Además, en el caso conc e o del complejo 3, al se ca iónico y eque i la p esencia
de un con aión pa a man ene la neu alidad eléc ica pe mi e ap ecia que la ed
Figu a 8.- Es uc u a molecula del complejo
2. Las dis ancias (Å) y ángulos de enlace
(deg) más ele an es son: Re1-C1 =
1.921(5), Re1-C2 = 1.918(5), Re1-C3 =
1.924(6), Re1-N1 = 2.179(3), Re1-N2 =
2.170(4), Re1-S1 = 2.495(1), S1-C14 =
1.735(5), N3-C14 = 1.392(7), O2--Cl2 =
3.054(4); N1-Re1-N2 = 74.9(1), C3-Re1-S1 =
175.1(2), Re1-S1-C14 = 112.10(2).
Figu a 9.- Es uc u a molecula del complejo
3. Las dis ancias (Å) y ángulos de enlace
(deg) más ele an es son: Re1-C1 =
1.908(4), Re1-C2 = 1.935(4), Re1-C3 =
1.923(3), Re1-N1 = 2.164(3), Re1-N2 =
2.174(3), Re1-S1 = 2.543(1), S1-C14 =
1.733(4), N3-C14 = 1.358(5), H3--O2 =
1.770(4); N1-Re1-N2 = 74.8(1), C3-Re1-S1 =
176.3(1), Re1-S1-C14 = 104.80(1).
C14
C14
N3
N3
11
c is alina se o ma g acias a enlaces de hid ógeno en e á omos de oxígeno del anión
i la o y á omos de hid ógeno p opiamen e dichos p esen es en el ca ión an o en el
ligando bipi idina como en el de i ado de me cap opi idina. No obs an e, el que mayo
endencia iene a o ma lo es el unido al N de la pi idina ya que es e á omo le e i a
mucha densidad elec ónica al enlace debido a su al a elec onega i idad.
Es udios espec oscópicos
La posible u ilización de los compues os que se ha log ado sin e iza como medio
pa a la isualización a ni el celula empleando écnicas no in asi as pasa po sus
p opiedades de abso ción y emisión de luz.
Así, los espec os de abso ción (Figu a 10) se han ob enido u ilizando la écnica de
espec oscopia de abso ción UV- isible. Pa a ello, se p epa a on disoluciones de los
complejos 1, 2, 3, 4 y 6 ap oximadamen e 10-5 M en DCM que se midie on a 298 K.
Figu a 10.- Espec os de abso ción UV- isible
Todos los compues os ensayados exhiben el pa ón ípico de los complejos de Re(I)
con ligandos bisimina, es deci , ansiciones elec ónicas cen adas en los ligandos (1IL),
en es os casos an o en el ligando 2,2'-bipi idina como en los de i ados de
me cap opi idina, y de ans e encia de ca ga me al-ligando (1MLCT).8 Las p ime as
son más ene gé icas, po lo que aquellas bandas que apa ecen a  < 270 nm son las
debidas a ansiciones elec ónicas in aligando   * y, del mismo modo, las bandas
co espondien es a  < 340 nm p oceden ambién de ansiciones cen adas en los
ligandos pe o desde o bi ales n has a o bi ales *. Sin emba go, aquellas bandas que se
ap ecian a meno es ene gías, a  > 340 nm, y que posiblemen e se ex ienden has a los
500 nm se asignan a ansiciones elec ónicas de ans e encia de ca ga me al-ligando
gene almen e a ibuidas a Re(d)  L(*). Excepcionalmen e, la banda que mues a el
0,000
0,200
0,400
0,600
0,800
1,000
1,200
200,00 300,00 400,00 500,00 600,00 700,00 800,00
A
 (nm)
1
2
3
4
6
  *
n  *
Re(d)  L(*)
1IL
12
complejo 3 cen ada en 374 nm se achaca a una ansición 1IL, de ahí que el alo de su
coe icien e de ex inción mola sea más p óximo al de las an e io es ansiciones.
Consecuen emen e la ansición 1MLCT no se es á obse ando en es e caso,
p obablemen e debido a su al a in ensidad.
La azón po la que la segunda banda del complejo 4 se desplaza has a los 333 nm no
es á cla a, aunque dado que esa misma banda ambién es a mas desplazada en el
compues o 6 pod ía es a elacionada con la p esencia del agmen o de AuPPh3.
Los coe icien es de ex inción mola , , calculados pa a las dis in as bandas se
p esen an en la Tabla 2.
Tabla 2.- Bandas de abso ción y sus coe icien es de ex inción mola
Compues o
1 (nm) /
1 (x 104
M-1cm-1)
2 (nm) /
2 (x 104
M-1cm-1)
3 (nm) /
3 (x 103
M-1cm-1)
4 (nm) /
4 (x 102
M-1cm-1)
1
249/1.73
295/1.11
369/2.56
488/4.18
2
245/1.51
284/1.30
353/2.87
494/4.70
3
241/2.15
288/2.18
374/9.51
4
242/3.35
333/2.69
410/2.01
6
238/3.19
293/1.84
386/2.67
Es digno de mención el inc emen o de los coe icien es de los complejos bime álicos
en e a los de los monome álicos pa a la ansición in aligando   *, no así en las
demás, ya que el ligando i enil os ina p esen e en dichos casos puede ealiza su
apo ación a la in ensidad de la banda.
Dado que la mic oscopía de luo escencia es una écnica de localización en auge, el
conocimien o de los p ocesos luminiscen es que gene an es os complejos esul a de i al
impo ancia. En es e o den de cosas, como ya se ha comen ado, es ecuen e la
exci ación de un elec ón de un o bi al d ( 2g) del Re a o o o bi al pi an ienlazan e del
ligando 2,2'-bipi idina con su pos e io uel a al es ado undamen al median e emisión
de luz, de ahí que se hable de o oluminiscencia y más conc e amen e de os o escencia
pues o que dicha ansición iene luga en e un es ado iple e me aes able y un es ado
single e (3MLCT) ulne ando así la segunda egla de selección o de espín. Pa a ello,
p e iamen e ha de da se un en ec uzamien o de sis emas desde el es ado single e
exci ado has a el iple e desde el que iene luga la emisión, p oceso que es a
a o ecido po la na u aleza del p opio enio, que al se un me al pesado de la e ce a
se ie de ansición hace que el acoplamien o espín-ó bi a adquie a impo ancia.
Se han ob enido los espec os de exci ación y emisión de los compues os 1, 2, 3, 4 y
6 a empe a u a ambien e. A modo de ejemplo se mues a en la Figu a 11 los de uno en
conc e o.
13
Figu a 11.- Espec o de exci ación y emisión del compues o 4
Todos p esen an una amplia banda de emisión que puede se asignada a ansiciones
3MLCT, sal o el complejo 3 que mues a dos bandas di e en es, una es echa e in ensa
cen ada en 545 nm que co esponde a una ansición 1IL y o a ancha y menos in ensa y
ene gé ica a 679 nm debida a dicha ans e encia de ca ga.
A pesa de que odas las emisiones esul a on se de escasa in ensidad, se ap eció que
las de los compues os monome álicos e an menos in ensas que las de los
he e obime álicos ya que, como aquellos se han unido o mando un enlace Re–S, el
á omo de azu e p esen a mayo capacidad -dado a dado que su e ec o induc i o
a ac o es meno que el del ni ógeno. De es a o ma, el p oceso de ans e encia de un
elec ón del Re a la bipy (3MLCT) compi e con la ans e encia de o o desde el
de i ado de me cap opi idina a la p opia bipy (LLCT).9 Se puede deci que el azu e
ac úa como quenche de la ansición 3MLCT.
Además, las bandas de exci ación y emisión no se supe ponen en g an medida siendo
así de i ele an e impo ancia los p ocesos de au oabso ción o eabso ción, que se
aduci ían en la desac i ación de la emisión, a excepción, de nue o, del compues o 3,
en el que se obse a una signi ica i a disminución del desplazamien o de S okes (Tabla
3), lo que implica una meno di e encia ene gé ica en e el es ado exci ado single e y
iple e.
Tabla 3.- Valo es máximos de exci ación y emisión
Compues o
exc (nm)
em (nm)
S okes (nm)
τ (ns)
1
432
572
140
120
2
425
675
250
48
3
522
472
545
679
23
207
140
47
4
439
582
143
6
478
636
158
14
Como ya se ha comen ado, la emisión se debe a la ansición en e el Re y la bipy,
po an o, y dado que los es ligandos ca bonilos se man ienen cons an es, ha de se el
ligando axial de i ado de me cap opi idina el que module las longi udes de onda de
emisión. Así, se puede obse a como los complejos 1 y 4 p esen an alo es en o no a
577 nm, mien as que los compues os 2, 3 y 6 supe an la ba e a de los 600 nm.
Ac i idad biológica y biodis ibución
A la is a de los esul ados an e io es y pa a e alua la capacidad de ac ua como
á macos de los compues os sin e izados se p ocede a la de e minación de la iabilidad
celula en su p esencia median e el mé odo del MTT.
Pa a ello se siemb an en una placa de 96 pocillos de ondo plano 8 ilas y 11
columnas de pocillos con células cance osas HeLa (adenoca cinoma de cé ix, es deci ,
cánce de cuello de ú e o) y 100 µl de medio de cul i o DMEM y se deja incubando
du an e 24 ho as (Figu a 12).
Figu a 12.- Placa de 96 pocillos
Po o o lado, se p epa an en condiciones es é iles 5 disoluciones de dis in a
concen ación (5, 10, 50, 100 y 200 µM) de los compues os 1, 2, 3, 4 y 6 en DMSO a
pa i de o a de S ock (0.1 M). Después se añaden 100 µl de medio a cada pocillo de la
p ime a columna, 100 µl de cada una de las disoluciones de los compues os de o ma
que se ealizan po cuad uplicado y 200 µl de medio en una úl ima columna núme o 12
que ha á las eces de blanco. Así, las concen aciones en la placa son, po dilución, la
mi ad de las p epa adas inicialmen e. Se man iene la placa en cul i o du an e o as 24
ho as.
Pos e io men e, se adiciona a odos los pocillos 10 µl de b omu o de 3-(4,5-
dime il iazol-2-ilo)-2,5-di enil e azol o MTT (5 mg/ml en PBS), un compues o
o gánico de colo ama illo que en p esencia de células i as es educido po la enzima
mi ocond ial succina o-deshid ogenasa ans o mándose en o o de onalidad azul de
mane a que la can idad de c is ales de azul o mazán ob enidos se á p opo cional al

15
núme o de células i as, po ello es an impo an e que en la p ime a e apa de cul i o se
deposi en ap oximadamen e el mismo núme o de células en cada pocillo, unas 15000.
Pa a su medida se agi a la placa y se incuba 2 ho as has a que se o man dichos
c is ales. Luego se cen i uga 10 minu os a 2500 pm a empe a u a ambien e pa a que
los c is ales se adhie an al ondo de los pocillos y no se pie dan al elimina el medio de
cul i o po in e sión de la placa sob e un papel. T as es o se añade 100 µl de DMSO,
que disuel e los c is ales pa a así pode medi la abso bancia UV- isible a 550 nm en
un lec o de placas.
Tal y como e a de espe a las especies he e ome álicas p esen an un alo
conside ablemen e meno de concen ación inhibi o ia 50, IC50, es deci , de
concen ación/dosis in i o que p o oca una iabilidad celula del 50%, lo que se
aduce en una mayo ci o oxicidad en compa ación con los de i ados monome álicos
de enio (Figu a 13 y Tabla 4). Así, queda pa en e que la di e encia se debe al agmen o
de Au- os ina cuya ac i idad ya ha sido p obada. Con la in ención de dispone más
da os en e a los que pode compa a , se han epo ado alo es de IC50 pa a el
Au ano ín de 0.15 ± 0.03 µM median e es e mismo mé odo pa a idén ica línea celula
pe o con un pe iodo de incubación de 72 ho as.4
Pa ece que el ipo de sus i ución del ligando me cap opi idina a ec a de o ma muy
su il ya que ambos compues os "en pa a" ( espec o de los á omos de N y S) son
lige amen e más ci o óxicos que sus co espondien es de i ados "en o o". Además, en
base a la endencia obse ada en las cu as de los compues os 1, 2 y 3 no pa ece que la
ca ga posi i a del complejo 3 a o ezca su en ada en la célula, a pesa de ene es a una
ca ga pa cial nega i a en su ca a in e na acili ándole su acción.
Aunque es e mé odo ealmen e no pe mi e di e encia si las células han mue o o an
solo no han p oli e ado, la ac uación del o o sob e la enzima T xR inhibiéndola es á
bien de inida y su uncionamien o es esencial en la ida celula , po lo que no es
p obable que sigan in ac as as la pé dida de sus unciones, aun así pa a ce cio a se
comple amen e se ía necesa io ealiza algún o o análisis.
Figu a 13.- E olución de la oxicidad de los compues os 1, 2, 3, 4 y 6 en unción de la concen ación
0
10
20
30
40
50
60
70
80
90
100
0 20 40 60 80 100
% p oli e ación celula (%)
Concen ación (µM)
1
2
3
4
6
y = -3,4440x + 103,57
y = -3,4671x + 112,39
16
Tabla 4.- Valo es de IC50 pa a los compues os 1, 2, 3, 4 y 6
Compues o
IC50 (µM)
Compues o
IC50 (µM)
Monome álicos
1
> 100
He e ome álicos
4
12.50 ± 1.37
2
3
6
17.22 ± 1.70
Es os esul ados no son los más adecuados pa a el uso como á macos pues ninguno
p esen a la ci o oxicidad su icien e como pa a que la dosis necesa ia en su a amien o
sea baja.
Una ez llegados a es e pun o, se puede p ocede a a e igua qué capacidad
p esen an es os mismos compues os como agen es de con as e pues es án diseñados
pa a su aplicación en e apia y su co espondien e seguimien o po bioimagen. Así, se
p e ende examina simul áneamen e la emisión de los compues os y de cie os
o gánulos celula es in ados con especies luo escen es pa a, con ayuda de la
mic oscopía de luo escencia con ocal, de e mina si son capaces de pe mea la
memb ana celula y, en caso a i ma i o, en qué localización se acumulan
p e e en emen e.
Pa a ello, en una placa de 24 pocillos se ijan sob e un cub e células umo ales HeLa
en p esencia de 50 µl de cada uno de los compues os 1, 2, 3, 4 y 6 espec i amen e en
concen ación in e io a sus co espondien es IC50 (concen ación inal en placa: 10 µM)
pa a que no se induzca la mue e celula y las células conse en su uncionalidad, de
o a o ma el es udio no end ía sen ido alguno. Se ese a un pocillo sin ningún
compues o pa a que ac ué de con ol y se incuba du an e 4 ho as a 37ºC. Pos e io men e
se desecha el medio de cul i o y se añaden 50 µl de medio nue o y o os 50 µl de una
disolución 10-4 M en medio de cul i o de DRAQ5, un in e luo escen e come cial
usado como pa ón in e no que es especí ico pa a núcleo al uni se a un pa adenina-
imina (A–T) en los su cos meno es de la doble hélice simulando se his onas 2B cuyas
longi udes de onda de exci ación y emisión son 647 y 681 nm espec i amen e. Se
uel e a incuba 15 minu os a 37ºC, se e i a el medio y se ealizan dos la ados de las
células con PBS (1 ml). Se adicionan 0.5 ml de pa a o maldehído en agua al 4 %,se
incuba 15 minu os a empe a u a ambien e y se ealizan es la ados con PBS (0.5 ml).
Po úl imo, se añaden 0.5 ml de PBS a cada pocillo y se pesca el cub e, el cual se la a
con agua des ilada, se elimina su exceso y se coloca sob e un po a en el que se han
añadido p e iamen e 0.5 µl de Fluo omoun con DRAQ5 2 mM.
Así se lle a al mic oscopio empleando dos láse es de exci ación, uno a 405 nm pa a
log a la exci ación de los complejos ( éase Tabla 2 y Figu a 11) y o o a 647 nm pa a
el DRAQ5.
Respec o a los compues os 1, 2 y 3, es deci , las especies monome álicas, no se ha
conseguido obse a ninguna emisión, ni siquie a as habe aumen ado su
concen ación en un segundo in en o has a 100 µM dado que su IC50 lo pe mi e. Es e
hecho puede debe se o a que es os complejos no pene an en la célula, lo que choca un
poco con la bibliog a ía ya que en ella se desc ibe como an o compues os ca iónicos
17
como neu os de Re(I) son capaces de pe mea la memb ana celula ,10 o a que sus
débiles in ensidades de emisión imposibili an di e encia su luminiscencia de la
p oceden e de la au o luo escencia de las células.
Sin emba go, los complejos 4 y 6, que exhiben un compo amien o simila , log an
en a en la célula, aunque no así en el núcleo, dis ibuyéndose po el ci oplasma como
se puede obse a en la Figu a 14. Se ía in e esan e a e igua si se acumulan
p e e en emen e en algún o gánulo en conc e o, que a p io i, po su diana y po lo ya
epo ado, debe ía se la mi ocond ia, pe o el in e que se dispone pa a ellas, el
mi o acke , equie e u iliza un lase de exci ación a 573 nm que es á den o del ango
de longi udes de onda donde emi en los complejos, y el ins umen o es incapaz de
ealiza semejan e a ea. En es e sen ido, la limi ación impues a po la p opia
ins umen ación se puede sol en a median e el uso de un in e selec i o de
mi ocond ias ecien emen e descubie o que, al igual que el ya empleado DRAQ5,
necesi a un lase de exci ación en o no a 644 nm.
Figu a 14.- Imágenes del compues o 4 incubado con células HeLa du an e 4 h a una concen ación de 10 µM.
(a) Imagen ob enida con el lase de exci ación de 405 nm. Compues o 4.
(b) Imagen ob enida con el lase de exci ación de 647 nm. DRAQ5.
(c) Supe posición de ambas imágenes.
a)
b)
c)
18
Pa e expe imen al
Ins umen ación y condiciones
Los espec os de 1H, 13C{1H} y 31P{1H}-RMN, incluidos los expe imen os 2D-
HSQC{H-C}, se han ealizado en disolución a 298 K en un espec óme o B uke
Ad ance 400 (1H, 400 MHz; 13C, 100,6 MHz y 31P, 162 MHz). En ellos, los
desplazamien os químicos, δ (ppm), se han asignado u ilizando como e e encia los
picos esiduales del co espondien e disol en e deu e ado: ace ona, clo o o mo,
diclo ome ano.
Los espec os de IR se han elabo ado en es ado sólido a 298 K en un espec óme o
Pe kin-Elme Spec um 100 FTIR en el ango 4000 - 250 cm-1. Los análisis de masas se
lle a on a cabo en disolución en un espec óme o de masas B uke Esqui e 3000 Plus
u ilizando la écnica de ionización po elec osp ay posi i o (ESI+).
Los es udios de exci ación y emisión se ealiza on en un espec o o óme o Jobin-
Y on-Ho iba Fluo olog FL3-11, y los de abso ción en un espec o o óme o E olu ion
600 empleando cube as de cua zo de 1 cm de longi ud. En ambos casos en disolución de
diclo ome ano a 298 K. Las imágenes de biodis ibución se han ob enido en un
mic oscopio de luo escencia Olympus FV10-i Con ocal Lase Scanning usando
obje i os ×10 ó ×60 e i adiando con unas longi udes de onda de exci ación de 405, 473
y 647 nm.
Las es uc u as monoc is alinas y los da os c is alog á icos se han ob enido en un
di ac óme o de ayos X Xcalibu Ox o d Di ac ion (XRD).
Los es udios de ac i idad biológica se ealiza on en condiciones es é iles en una
campana de lujo lamina . Se u ilizó una es u a Jouan IG50 que se man u o a 37 °C y 5
% de CO2 pa a los cul i os celula es, y una cen í uga B3.11 de la misma ma ca. Las
placas se isualiza on en un lec o de placas Bio-Tek Ins umen Inc. EL800 Uni e sal
Mic opla e Reade .
Ma e iales y p ocedimien os
Pa a las es a egias de sín esis p opues as se han omado como pun o de pa ida los
siguien es eac i os come ciales: Re(CO)5Cl, 4-me cap opi idina, 2-me cap opi idina y
2-me cap o-6-me ilpi idina. Asimismo se u iliza AuCl h , el cual se sin e iza en el
labo a o io a pa i de o o me álico u ilizando p ocedimien os ya es ablecidos en el
mismo.
ac-[Re(bipy)(CO)3Cl]
Se p epa a una disolución de Re(CO)5Cl (300 mg, 0.829 mmol) en olueno seco (3-4
ml). Se añade un lige o exceso de 2,2'-bipi idina (136 mg, 0.871 mmol) bajo a mos e a
ine e de a gón. La mezcla se calien a a e lujo du an e 1 ho a, ob eniéndose po
p ecipi ación un sólido ama illo que se sepa a po il ación y se la a con olueno (327
25
Pa e de los esul ados ob enidos, aquellos que se e ie en a los complejos
monome álicos, han sido en iados a la e is a cien í ica Ino ganica Chimica Ac a y
es án pendien es de acep ación a echa de p esen ación de es e abajo.13
Bibliog a ía
1. M. P. Coogan, V. Fe nández-Mo ei a, Chem. Commun., 2014, 50, 384-399.
2. S. Nobili, E. Mini, I. Landini, C. Gabbiani, A. Casini, L. Messo i, Med. Chem.
Re ., 2010, 30 (3), 550-580.
3. E. R. T. Tiekink, In lammopha macology, 2008, 16 (3), 138-142.
4. V. Gandin, A. P. Fe nandes, M. P. Rigobello, B. Dani, F. So en ino, F. Tisa o, M.
Bjö ns ed , A. Bindoli, A. S u a o, R. Rella, C. Ma zano e al., Biochem.
Pha macol., 2010, 79 (2), 90-101.
5. L. O ego, F. Ca doso, S. Ma ins, M. F. Filla , A. Laguna, M. Mei eles, M.
Dolo es Villacampa, M. Concepción Gimeno, J. Ino g. Biochem., 2014, 130, 32-
37.
6. E. Va ghese, D. Büsselbe g, Cance s (Basel), 2014, 6 (4), 2243-2258.
7. V. Fe nández-Mo ei a, I. Ma zo, M. C. Gimeno, Chem. Sci., 2014, 5, 4434-4446.
8. Y. Kim, F. W. M. Vanhelmon , C. L. S e n, J. T. Hupp, Ino g. Chim. Ac a, 2001,
318, 53-60.
9. Y. Wang, B. T. Hause , M. M. Rooney, R. D. Bu on, K. S. Schanze, J. Am.
Chem. Soc., 1993, 115 (13), 5675-5683.
10. A. J. Amo oso, R. J. A hu , M. P. Coogan, J. B. Cou , V. Fe nández-Mo ei a, A.
J. Hayes, D. Lloyd, C. Mille , S. J. A. Pope, New J. Chem., 2008, 32, 1097-1102.
11. K. Nunokawa, S. Onaka, T. Ta ema su, M. I o, J. Sakai, Ino g. Chim. Ac a, 2001,
322, 56-64.
12. P. D. Cookson, E. R. T. Tiekink, J. Chem. Soc., Dal on T ans., 1993, 259-263.
13. V. Fe nández-Mo ei a, H. Sas e-Ma ín, Pho ophysical and bioac i i y beha io
o ac-Rhenium(I) de i a i es con aining di opic sul u py idine ligands. En iado a
Ino g. Chim. Ac a, Manusc i o ID: ICA-D-16-00660.

26
Anexos
27
Espec oscopia de RMN
 ac-[Re(bipy)(CO)3Cl]:
1H-RMN
 ac-[Re(bipy)(CO)3(CF3SO3)]:
1H-RMN
28
 [AuClPPh3]:
1H-RMN
31P-RMN
29
 Complejo 1:
1H-RMN
13C-RMN
30
HSQC
 Complejo 2:
1H-RMN

31
13C-RMN
HSQC
32
 Complejo 3:
1H-RMN
13C-RMN
33
HSQC
 [Au(PPh3)(4-Spy)]:
1H-RMN
34
31P-RMN
 [Au(PPh3)(2-Spy)]:
1H-RMN
41
Espec oscopia IR
 Complejo 1:
 Complejo 2:

42
 Complejo 3:
 Complejo 4:
43
 Complejo 6:
44
Espec ome ía de MS
 Complejo 1:
 Complejo 2:
538.1
1. +MS, 0.1-1.2min #(6-67), sub ac ed peak s a and end
0.0
0.5
1.0
1.5
7
x10
In ens.
200 400 600 800 1000 1200 1400 m/z
538.1
1. +MS, 0.1-2.0min #(5-106), sub ac ed peak s a and end
0.00
0.25
0.50
0.75
1.00
1.25
1.50
7
x10
In ens.
500 600 700 800 900 1000 m/z
45
 Complejo 3:
 Complejo 4:
552.1
1. +MS, 0.1-0.7min #(6-36), sub ac ed peak s a and end
0.0
0.5
1.0
1.5
2.0
2.5
7
x10
In ens.
200 400 600 800 1000 1200 1400 m/z
721.3
996.2
1042.2
1. +MS, 0.1-0.6min #(7-32), sub ac ed peak s a and end
0
2
4
6
8
6
x10
In ens.
400 600 800 1000 1200 1400 m/z
46
 Complejo 6:
552.1
584.2
721.3
1010.2
1042.2
1. +MS, 0.1-0.4min #(5-22), sub ac ed peak s a and end
0
2
4
6
6
x10
In ens.
300 400 500 600 700 800 900 1000 1100 1200m/z

47
Di acción de ayos X
Complex
2
3
Fo mula
C19H14Cl2N3O3
ReS SS
C20H15F3N3O6ReS
2
M
621.49
700.67
C ys al size (mm)
0.44x0.32x0.24
0.38x0.36x0.35
C ys al sys em
Monoclinic
Monoclinic
Space g oup
C2/c
Pn
Cell cons an s:
a (Å)
18.320(4)
6.9785(14)
b (Å)
15.122(3)
13.528(3)
c (Å)
16.726(3)
12.191(2)
α (°)
90
90
β (°)
114.86(3)
102.01(3)
γ (°)
90
90
V (Å3)
4204.2(15)
1125.6(4)
Z
8
2
Dx (Mg m-3)
1.964
2.067
µ(mm-1)
6.160
5.652
F(000)
2384
676
T (K)
100(2)
100(2)
2θmax
51
50.98
No. o e l.:
measu ed
17612
11035
independen
3897
4075
T ansmissions
0.0195-0.1725
0.2423-0.2226
Rin
0.0226
0.0187
Pa ame e s
260
321
Res ain s
0
2
Goodness o i
on F2
1.099
1.047
wR(F2, all Re l.)
0.0711
0.0305
R(I >2σ(I))
0.0287
0.0132
max. Δρ (e Å-3)
1.596
0.545
48
Luminiscencia
 Complejo 1:
 Complejo 2:
49
 Complejo 3:
 Complejo 4:
50
 Complejo 6: