Estudio de los mecanismos de reticulación en la obtención de microcápsulas de gelatina-goma arábiga

Estudio de los mecanismos de reticulación en la obtención de microcápsulas de gelatina-goma arábiga Estudio de los mecanismos de reticulación en la obtención de microcápsulas de gelatina-goma arábiga Estudiante:Gemma Herranz Gómez Director: Manuel-Jose Lis Arias Proyecto final de grado ESEIAAT ÍNDICE 1. OBJETIVOS ............................................................................................................................. 1 2. INTRODUCCIÓN ..................................................................................................................... 2 3. MICROENCAPSULACIÓN ........................................................................................................ 3 3.1. Definición ...................................................................................................................... 3 3.2. Materiales ..................................................................................................................... 4 3.3. Sistema encápsulado ..................................................................................................... 5 3.3.1. Partes principales .................................................................................................. 5 3.3.2. Forma .................................................................................................................... 6 3.4. Métodos de encapsulación ........................................................................................... 7 3.4.1. Procesos físico-químicos ....................................................................................... 7 3.4.2. Procesos químicos ................................................................................................. 9 3.4.3. Procesos físicos ................................................................................................... 11 3.5. Cesión del material activo ........................................................................................... 14 3.6. Aplicaciones ................................................................................................................. 15 4. MICROENCAPSULACIÓN DE FRAGANCIAS........................................................................... 17 4.1. Definición de fragancia ................................................................................................ 17 4.1.1. Notas de olor ....................................................................................................... 17 4.2. Encapsulación de fragancias ....................................................................................... 19 4.2.1. Introducción ........................................................................................................ 19 4.2.2. Encapsulación ...................................................................................................... 19 4.2.3. Materiales de recubrimiento .............................................................................. 20 5. MICROCÁPSULAS REALIZADAS ............................................................................................ 22 5.1. Materiales Utilizados ................................................................................................... 22 5.1.1. Gelatina ............................................................................................................... 22 5.1.2. Goma Arábiga ...................................................................................................... 25 5.1.3. Principio Activo .................................................................................................... 27 5.1.4. Tensioactivos ....................................................................................................... 27 5.1.5. Reticulantes ......................................................................................................... 29 5.2. Metódo ........................................................................................................................ 30 6. MICROEMULSIONES ............................................................................................................ 33 6.1. Introducción ..................................................................................................................... 33 5.2. Características ............................................................................................................. 34 7. RETICULACIÓN ..................................................................................................................... 38 7.2. Definición de polímero ................................................................................................ 38 7.3. Proceso de reticulación ............................................................................................... 39 7.4. Agentes reticulantes utilizados ................................................................................... 40 7.4.1. Glutaraldehído..................................................................................................... 40 7.4.2. Formaldehído ...................................................................................................... 42 7.4.3. Transglutaminasa ................................................................................................ 43 8. CINÉTICA DE REACCIÓN ....................................................................................................... 44 8.1. Cinética enzimática ..................................................................................................... 46 8.1.1. Representación de la ecuación de Michaelis-Menten ........................................ 48 9. CINÉTICA DE RETICULACIÓN ............................................................................................... 50 9.1. Absorbancia ................................................................................................................. 50 9.1.1. Ley de Lambert-Beer ........................................................................................... 50 9.1.2. Espectrofotometría ............................................................................................. 51 9.2. Difusión ....................................................................................................................... 52 9.3. Método de cálculo utilizado ........................................................................................ 54 10. PROCESO EXPERIMENTAL ............................................................................................... 55 10.1. Procedimiento de microencapsulación ................................................................... 55 10.1.1. Glutaraldehído..................................................................................................... 55 10.1.2. Formaldehído ...................................................................................................... 56 10.1.3. Transglutaminasa ................................................................................................ 56 11. CÁLCULOS Y RESULTADOS ............................................................................................... 57 11.1. Rectas de calibrado ................................................................................................. 57 11.1.3. Medición de la absorbancia mediante el espectrofotómetro ............................ 57 11.1.4. Glutaraldehído..................................................................................................... 58 11.1.5. Transglutaminasa ................................................................................................ 61 11.2. Tamaño de las micrócapsulas ................................................................................. 63 11.3. Cinética de reticulación ........................................................................................... 63 11.3.3. Glutaraldehído..................................................................................................... 63 11.3.4. Transglutaminasa ................................................................................................ 82 11.3.5. Formaldehído .................................................................................................... 103 11.4 Microcápsulas obtenidas........................................................................................... 120 11.4.1. Glutarladehído................................................................................................... 120 11.4.2. Transglutaminasa .............................................................................................. 123 11.4.3. Formaldehído .................................................................................................... 126 12. DISCUSIÓN DE LOS RESULTADOS EXPERIMENTALES .................................................... 129 12.1. Absorbancia y cinética de reticulación .................................................................. 129 12.1.1. Glutaraldehído................................................................................................... 129 12.1.2. Transglutaminasa .............................................................................................. 132 12.1.3. Formaldehído .................................................................................................... 135 12.1.4. Generales .......................................................................................................... 138 12.2. Tamaño de las microcápsulas ............................................................................... 140 12.2.1. Glutaraldehído................................................................................................... 140 12.2.2. Transglutaminasa .............................................................................................. 140 12.2.3. Formaldehído .................................................................................................... 141 12.2.4. General .............................................................................................................. 141 12.3. Coeficiente de difusión .......................................................................................... 142 12.3.1. Glutaraldehído................................................................................................... 142 12.3.2. Transglutaminasa .............................................................................................. 142 12.3.3. Formaldehído .................................................................................................... 142 12.3.4. General .............................................................................................................. 143 13. TGA ................................................................................................................................ 144 13.1. Glutaraldehído....................................................................................................... 145 13.2. Transglutaminasa .................................................................................................. 146 13.3. Formaldehído ........................................................................................................ 147 13.4. General .................................................................................................................. 148 14. CONCLUSIONES ............................................................................................................. 149 15. BIBLIOGRAFÍA ................................................................................................................ 151 Estudio de los mecanismos de reticulación en la obtención de microcápsulas de gelatina-goma arábiga 1 1. OBJETIVOS El objetivo principal de este proyecto es el estudio de la cinética de reticulación en el proceso de microencapsulación de fragancias. Se pretende hacer un seguimiento en el tiempo de la concentración de reticulante que va quedando en el reactor para así obtener las ecuaciones que permitan realizar este estudio. Para poder obtener la concentración en cada momento se utilizará un espectrofotómetro UVVIS, con la que podremos saber la absorbancia del reticulante de cada muestra y con una recta de calibrado podremos obtener la cantidad de reticulante que va quedando en el baño a lo largo del tiempo estudiado. Se extraerán 6 muestras del reactor en un tiempo de 90 minutos ya que ese tiempo es el que se estima que dura la reacción, pero se extraerá también una última muestra al día siguiente para asegurar que se abarca todo el tiempo de reacción y comprobar el estado de la reacción en un tiempo al que se le denominará “infinito”. Se realizará el estudio de la cinética para tres reticulantes diferentes que serán los siguientes: glutaraldehído, formaldehído y finalmente una enzima llamada transglutaminasa. Para un experimento más completo se variarán las concentraciones de estos reticulantes en cada reactor realizado, obteniendo así 5 reactores por cada uno de los reticulantes. Estudio de los mecanismos de reticulación en la obtención de microcápsulas de gelatina-goma arábiga 2 2. INTRODUCCIÓN La microencapsulación es una técnica que se viene empleando con creciente interés en diversos campos de la tecnología. La microencapsulación envasa, separa y almacena materiales a escala microscópica para su posterior liberación. Existen numerosas técnicas de encapsulación para producir partículas de tamaño y estructura requerida. Dependiendo del tamaño de estas partículas se estará hablando de microencapsulación o bien de nanoencapsulación. Se pueden distinguir de manera general en dos morfologías: microcápsulas y microesferas El término '' microcápsula '' se debe utilizar para describir partículas en el que un núcleo que contiene el fármaco está completamente rodeado por una cubierta de polímero. El núcleo puede ser sólido, líquido o gas; la cáscara es una capa polimérica continua, porosa o no porosa. Por otro lado, '' microesferas '' se definen como micropartículas donde la sustancia homogéneamente se disuelve o dispersa en la matriz polimérica. Estos sistemas de suministro monolíticos también pueden ser descritos como soluciones sólidas o dispersiones sólidas del fármaco en una matriz polimérica a microescala. Las microesferas muestran diferentes propiedades de liberación en comparación con microcápsulas verdaderas y una función adicional es que no puede haber una explosión de la sustancia debido a la ruptura de la cascara. Estas técnicas se dividen principalmente en procesos químicos, físico-químicos o mecánicos incluyendo muchas subcategorías tales como polimerización, policondensación, secado por pulverización, coacervación, evaporación del disolvente, etc. En cada uno de estos procesos hay diferentes mecanismos implicados en la formación de las microcápsulas como son la separación de fases, la precipitación, polimerización o policondensación interfacial, la reticulación, y la gelificación. La etapa principal es fundamental ya que definirá las propiedades finales y el tamaño de las microcápsulas. Otra etapa muy importante es la reticulación de las partículas es un factor a tener en cuenta ya que es lo que permite que las propiedades de las microcápsulas se mantengan en el tiempo. Las ventajas que ofrecen las microcápsulas sobre un proceso convencional pueden resumirse en la protección y enmascaramiento de la sustancia encapsulada frente a medios inestables u hostiles para su posterior liberación progresiva. Estos dos factores han hecho que diferentes sectores industriales basen algunos de sus productos de mayor innovación en estas tecnologías. Estudio de los mecanismos de reticulación en la obtención de microcápsulas de gelatina-goma arábiga 3 3. MICROENCAPSULACIÓN 3.1. Definición La microencapsulación consiste en la aplicación de una cubierta delgada sobre pequeñas partículas de sólido, gotitas de líquido o de dispersiones, con el objeto de proteger algunos materiales, separarlos o facilitar su almacenamiento y manipulación. De esta forma el material queda cubierto de manera individual y es así protegido del ambiente y de agentes externos. También puede tener por finalidad provocar la cesión de la sustancia recubierta en condiciones particulares o en forma diferida o prolongada. Estas condiciones necesarias para la cesión, pueden ser la humedad, el pH, la fuerza física o la combinación de ellas. Dentro del término de microencapsulación, se incluyen las microcápsulas y las micropartículas. La diferencia entre estos dos productos reside en la manera en la que se encuentra el material que queremos encapsular. El término '' microcápsula '' se debe utilizar para describir partículas en el que un núcleo que contiene el material está completamente rodeado por una cubierta de polímero. El núcleo puede ser sólido, liquido o gas; la cáscara es una capa polimérica continua, porosa o no porosa. Por otro lado, '' microesferas '' se definen como micropárticulas donde la sustancia homogéneamente se disuelve o dispersa en la matriz polimérica. Estos sistemas de suministromonolíticos también pueden ser descritos como soluciones sólidas o dispersiones sólidas del material en una matriz polimérica a microescala. Las microesferas muestran diferentes propiedades de liberación en comparación con microcápsulas verdaderas y una función adicional es que no puede haber una explosión de la sustancia debido a la ruptura de la cascara. Ilustración 1: Diferencia entre micrócapsulas y microesferas Estudio de los mecanismos de reticulación en la obtención de microcápsulas de gelatina-goma arábiga 4 Las partículas que se recubren en la microencapsulación tienen un tamaño que varía entre unos pocos y alrededor de 200 micrones; sin embargo, algunos autores extienden el tamaño hasta partículas del orden de los 5 000 micrones. En general todas las partículas que tengan un tamaño inferior a 1 mm serán consideradas microcápsulas, en cambio, cuando las partículas poseen un tamaño inferior a 1 μm, el producto resultante del proceso de microencapsulación recibe la denominación de “nanoesferas”, “nanoparticulas” o “nanocapsulas”. 3.2. Materiales Existen diferentes tipos de materiales utilizados para realizar las microcápsulas, además, estos se van ampliando ya que van surgiendo nuevos materiales y aplicaciones. Los materiales se dividen en diferentes grupos según la función que tengan en el proceso: - Agentes encapsulantes: Es el material del cual está hecha la cobertura de la microcápsula y el encargado de proteger al componente activo. El tipo de agente encapsulante empleado tendrá influencia sobre la estabilidad de la emulsión antes de secar, sobre el tamaño de partícula, las propiedades y sobre la vida útil del materialencapsulado deshidratado. Se pueden dividen en distintas categorías: 1. Ceras y lípidos: Parafinas, diglicéridos, monoglicéridos, aceites, grasas, ácido, trisetearina. 2. Proteínas: Gluten, caseína, albumina, gelatina. 3. Carbohidratos: Almidón, dextranos, sacarosa, jarabes de maíz. 4. Polímeros: Polipropileno, polibutadieno, poliestireno. 5. Gomas: Agar, alginato de sodio, goma arábiga. - Agentes activos: Es el material que se quiere encapsular. - Disolventes: Para disolver bien las sustancias activas empleadas y que, además, sean relativamente miscibles con agua como el acetato de etilo, la acetona o el metanol. - Emulsionantes: Encargados de facilitar el proceso de emulsión de los ingredientes. Algunos ejemplos son los coloides poliméricos hidrofóbicos, surfactantes no iónicos, alcohol polivinílico o similares. - Tensioactivos: Influyen por medio de la tensión superficial en la superficie de contacto entre dos fases. Hay diversos como el SDS o el SMA. - Reticulantes: se utilizan para mejorar las propiedades físicas de la microcápsula y actúan uniendo las diversas moléculas entre sí para mejorar la solidez y estabilidad de las microcápsulas. Algunos ejemplos son el glutaraldehído o el formaldehído. - Antiespumantes: Para evitar la generación de espuma, los más destacados urea, glicerol y propilenglicol). Estudio de los mecanismos de reticulación en la obtención de microcápsulas de gelatina-goma arábiga 5 3.3. Sistema encápsulado 3.3.1. Partes principales De forma general se puede definir como una pequeña esfera rodeada por un recubrimiento homogéneo. El material encerrado en la cápsula se puede llamar núcleo, fase interna, o encapsulado. El recubrimiento se puede denominar carcasa, funda, fase externa o bien membrana. Por tanto distinguiremos dos partes fundamentales en la microcápsula: - Núcleo: Como ya se ha comentado es el material encerrado en la cápsula y puede estar constituido por partículas sólidas o por pequeñas gotas de líquido o dispersiones. En muchas ocasiones se requiere un tratamiento previo del material. En el caso de los productos sólidos puede ser necesario seleccionar el tamaño de las partículas o efectuar transformaciones en su forma, como por ejemplo darles forma de esfera. Se puede requerir el empleo de coadyuvantes, tales como estabilizadores, antioxidantes, antisépticos, diluyentes u otras sustancias con el propósito de modificar la cesión. En el caso de los líquidos en algunas ocasiones se efectúan operaciones de dispersión o emulsificación. El tratamiento previo al cual debe someterse el núcleo, como asimismo la técnica a emplear en este tratamiento, son de mucha importancia, ya que pueden influir poderosamente en el comportamiento del producto en el preparado final. - Carcasa: En la selección de los materiales que se van a utilizar para el recubrimiento es importante considerar las características del producto final. Por ejemplo, si se trata de proteger el núcleo de la acción del vapor de agua o que la cubierta resista la acción extractiva del agua, ésta deberá ser de naturaleza hidrofóbica para que provea una adecuada barrera protectora. La película de recubrimiento tiende a seguir el contorno y la forma exterior del núcleo; por esta razón, debe adherirse firmemente a él. También son propiedades importantes de la cubierta la flexibilidad, la fuerza o resistencia, la permeabilidad y la facilidad de aplicación. Junto con el material formador de la película, suelen emplearse algunas otras sustancias, tales como colorantes, plastificantes, etc. La película de recubrimiento suele ser muy delgada ya que las partículas que se recubren son, generalmente, de pequeño tamaño. Su continuidad es un factor de mucha importancia y aun las más pequeñas alteraciones pueden hacer variar las características de cesión del material incluido en el núcleo. Estudio de los mecanismos de reticulación en la obtención de microcápsulas de gelatina-goma arábiga 12 aceites volátiles, se recomienda que el material no represente más del 20% del total de la microcápsula. Un equipo de secado por atomización se compone, esencialmente, de un sistema de alimentación del líquido, un dispositivo de atomización, que por lo general consiste en una boquilla de atomización, una cámara de secado y un sistema colector del producto seco. Ilustración 5: Proceso de secado por atomización (4) - Recubrimiento en lecho fluidizado: En este procedimiento la microencapsulación se produce al suspender las pequeñas partículas que forman el material activo en un lecho de aire, u otro gas, al mismo tiempo que se dispersa sobre ellas, en forma de fina lluvia, una disolución del material de recubrimiento. La película se forma por evaporación del disolvente el cual a su vez, es separado por el aire o el gas que abandona el 10 sistema. Este procedimiento - lo desarrolló inicialmente Würster. El aparato en que se lleva a cabo, se denomina cámara de Würster y consiste en una columna vertical, estrecha en la parte inferior y más ancha en la superior. La microencapsulación se realiza introduciendo una corriente de aire desde el fondo; la velocidad del aire en la parte más estrecha de la columna es considerable, de tal manera, que las partículas que van entrando en esta zona, son de inmediato levantadas hacia la parte superior. En la parte más ancha de la columna, la velocidad del aire disminuye notablemente haciendo que el aire no sea capaz de sostener las partículas en suspensión, provocando la caída de éstas hacia la zona central o región de trabajo (Figura 6). La velocidad de la corriente de aire en la zona de trabajo puede ser regulada mediante toberas colocadas a una cierta altura. Estudio de los mecanismos de reticulación en la obtención de microcápsulas de gelatina-goma arábiga 13 Ilustración 6: Cámara de Wüster (5) La cámara donde se desarrolla el proceso puede construirse de metal, acero inoxidable, vidrio o plástico. En su parte inferior, se encuentra una malla o tamiz inclinado, que recibe la alimentación del material a recubrir en la parte superior encontrándose el dispositivo de salida en la parte inferior de este plano inclinado. Por debajo de la malla se encuentra un sistema que inyecta aire a una determinada presión. También en la parte inferior, se encuentran algunos dispositivos de calefacción, que permiten dar al aire la temperatura deseada. El material de recubrimiento se inyecta en forma de fina atomización en el interior de la cámara y en una posición inmediatamente debajo de la región de trabajo de la columna. Sin embargo, su ubicación puede ser variada de acuerdo a las necesidades de trabajo. Para efectuar el recubrimiento, se introducen las partículas en la parte alta de la malla que se encuentra dentro de la columna; allí las toma inmediatamente la corriente de aire que viene desde el fondo y las levanta hasta la zona de trabajo, donde adquieren un movimiento de turbulencia particularmente apropiado para efectuar el recubrimiento. Se inyecta a continuación la disolución del material formador de película finamente atomizado, el cual se va depositando sobre las partículas y construyendo sobre ellas la cubierta. Cuando las partículas alcanzan un cierto grado de recubrimiento, sobrepasan el peso que soporta la columna de aire y caen sobre la malla, deslizándose en el plano inclinado hacia la zona de salida, de donde pueden retirarse. El grosor de las cubiertas de los microgránulos y las características del producto final dependen en forma importante del tamaño de las partículas de partida, de la concentración de la disolución de recubrimiento, de la naturaleza del disolvente utilizado para disolver el material que forma la película, de la velocidad de 11 atomización y de la velocidad y temperatura del aire que se aplica durante el proceso. La microencapsulación por recubrimiento en lecho fluido se aplica ampliamente como tecnología farmacéutica para producir microgránulos de acción Estudio de los mecanismos de reticulación en la obtención de microcápsulas de gelatina-goma arábiga 14 sostenida, para mejorar las características de flujo de las partículas y para el recubrimiento de numerosas sustancias en tecnología de alimentos y otras industrias relacionadas.. En muchas ocasiones, una vez obtenidas las microcápsulas por cualquier procedimiento, es necesario someterlas a un tratamiento posterior, en orden. a lograr las cualidades requeridas por el producto. En esta etapa, generalmente se logra una mayor dureza de la película y consiste en someter el producto a tratamientos químicos o físicos. Por ejemplo, microscápsulas en las que se utiliza gelatina como material de recubrimiento, se suelen tratar con solución de formaldehído en condiciones de pH y temperatura apropiadas con el objeto de conseguir el endurecimiento e la cubierta. En otras ocasiones, el uso de algunos líquidos apropiados provocan una deshidratación y la consolidación del recubrimiento. Cuando la cubierta está formada por un polímero, ésta puede endurecerse tratándola con un líquido en el que la película no se disuelva. En algunas ocasiones es necesario someter las microcápsulas a un tratamiento térmico para estabilizar y dar las características adecuadas a la película. También puede ser necesario adicionar a la cubierta algunas sustancias que actúan como antiadherentes, evitando que las partículas se junten y permitiendo el libre flujo del polvo. 3.5. Cesión del material activo Para que el material del núcleo sea cedido, es necesario que la microcápsula se someta a algunas condiciones particulares que promuevan la liberación. Estas condiciones para la cesión pueden hacerse dependientes de humedad, del pH, de la presión o la fuerza que se ejerza sobre ellas o por una combinación de estos factores. Por su parte, el mecanismo para la cesión puede depender de la extracción del principio activo desde el interior de la microcápsula por el medio líquido circundante, por la erosión de la cubierta, ruptura de ella, presión, fusión o disolución del material de recubrimiento, dependiendo del producto de que se trate y de la aplicación a que se destine. En algunas ocasiones, el material del núcleo, una vez cedido por la microcápsula, reacciona con alguna otra sustancia química que se encuentra en el medio donde se libera, para producir el efecto que se desea. Es frecuente encontrar este tipo de situación, en algunos productos de tipo industrial, como por ejemplo, en microcápsulas que contienen colorante en forma de leucoderivado que reacciona con alguna otra sustancia obteniéndose el producto coloreado. La posibilidad de producir esta reacción, in situ, permite utilizar una menor cantidad de material microencapsulado, lo que es importante, porque la microencapsulación, por lo general es un proceso tecnológicamente complicado y en relación, el costo es elevado. Estudio de los mecanismos de reticulación en la obtención de microcápsulas de gelatina-goma arábiga 15 3.6. Aplicaciones La aplicación de las microcápsulas se extiende a campos tan diversos como la alimentación, la agricultura (liberación lenta de pesticidas y fertilizantes), la industria textil, la cosmética (microcápsulas de sustancias cosméticas y perfumes) o la industria farmacéutica (liberación controlada de medicamentos), entre otras. Tiene una amplia variedad de utilidades en el sector alimentario y en el de la biotecnología, entre las que destacan: 1. Protección frente a pérdidas nutricionales o funcionales: Por ejemplo para la incorporación en alimentos, cosméticos, etc. de ingredientes naturales, aditivos volátiles, aceites esenciales, antimicrobianos, enzimas, bacterias (como acidolácticas como starters o probióticos). Mediante la microencapsulación se puede generar una barrera entre materiales muy delicados y el ambiente y así puede incrementarse el efecto de sustancias bioactivas contenidas en extractos o aceites esenciales y minimizar su impacto sensorial en los alimentos que se desea preservar. Por ejemplo, el aceite esencial de romero microencapsulado de alta actividad frente a Listeria monocytogenes en salchichas de hígado de cerdo o eugenol y carvacrol frente a este microorganismo y también a Escherichia coli O157:H7. Igualmente, puede mejorarse la estabilidad de sustancias beneficiosas para la salud como antioxidantes o polifenoles frente a factores de degradación. 2. Liberación controlada en el tiempo de nutrientes: La microencapsulación permite ralentizar el efecto de un determinado ingrediente, de manera que éste no se produzca únicamente momentos después de su consumo, si no que su efecto se atenúe y prolongue en el tiempo, de manera sostenida, a medida que las microcápsulas se van liberando. 3. Estabilidad durante el almacenamiento y disminución de la higroscopicidad (capacidad de los materiales para absorber la humedad atmosférica): La microencapsulación de ingredientes con efectos positivos permite aportar una protección extra frente a factores externos, como el oxígeno atmosférico, la temperatura y/o la humedad ambiental, el pH del alimento, radicales libres, sustancias incompatibles por contacto, garantizando su llegada al punto de absorción, con una degradación mínima. 4. Protección de células frente a ambientes desfavorables: permite su liberación en una forma viable y biológicamente activa. Por ejemplo, en el caso de los alimentos probióticos, esta liberación se desea que se produzca en el intestino. Estudio de los mecanismos de reticulación en la obtención de microcápsulas de gelatina-goma arábiga 16 5. Mejora de cualidades organolépticas (sabor, gusto, olor) y enmascaramiento sabores u olores desagradables: la microencapsulación permite la incorporación de ingredientes funcionales en alimentos sin detrimento de las características organolépticas del producto final. Como por ejemplo el caso del aceite de pescado, con elevado contenido en omega-3. 6. Modificación del estado de agregación aparente: conversión de líquidos en sólidos para facilitar la manipulación o fijación de sustancias volátiles para su liberación controlada 7. Generación de materiales de envasado: da respuesta a las necesidades para generar nuevos materiales de envasado o encasses para productos frescos de corta vida útil sin perder las cualidades de calidad o de higiene. Estudio de los mecanismos de reticulación en la obtención de microcápsulas de gelatina-goma arábiga 17 4. MICROENCAPSULACIÓN DE FRAGANCIAS 4.1. Definición de fragancia Una fragancia es una mezcla sustancias con olores, más o menos complejos. Su base casi siempre es el alcohol etílico acompañado de aceites y esencias aromáticas de origen vegetal, animal o sintético y de productos químicos para estabilizar la mezcla o darle más fuerza. Un perfume está constituido principalmente por una mezcla de sustancias odoríferas que genéricamente denominamos esencias, y disolventes. Ningún perfume tiene menos de 20 a 30 componentes. Algunos perfumes contienen más de 100 esencias diferentes. Una fragancia no es un solo material de propiedades claramente definidos, sino más bien una mezcla de productos químicos individuales, cada uno se comporta de acuerdo a sus propias características únicas. Caracterizando estos productos químicos por separado, y luego la combinación de sus efectos, permite entender el comportamiento de la completa composición de la fragancia en diversos medios. Cada componente de la fragancia interactúa con la naturaleza química y estructural del medio ambiente para determinar la estética y las características físicas del sistema final. Los disolventes más empleados son el alcohol etílico y el agua. La presentación más común de las esencias para perfumería hoy día es en forma de solución oleosa y el disolvente siempre presente es el alcohol etílico. Al aplicarse el perfume sobre la piel, el calor del cuerpo evapora el alcohol rápidamente dejando las sustancias aromáticas, que se disipan gradualmente, en función de las volatilidades relativas de cada una de ellas, durante varias horas. 4.1.1. Notas de olor Cuando nos echamos un perfume somos capaces muchas veces de reconocer algunas de las esencias que lo constituyen. A estos olores identificables de un perfume se les llaman notas de olor. Las notas no son más que los olores que percibimos cuando nos aplicamos un perfume. Los materiales de la perfumería difieren mucho en su volatilidad, los hay desde los que tan sólo se mantienen durante unos minutos en el papel secante de la muestra hasta los que permanecen en ella durante varias semanas. Por tanto, suele ser habitual dividir los materiales en tres grupos en razón de su volatilidad. Las notas básicas que son las más persistentes; las notas medias, o modificadores, que tienen una volatilidad media; y las notas altas que son las más volátiles y efímeras. Estudio de los mecanismos de reticulación en la obtención de microcápsulas de gelatina-goma arábiga 18 Las notas de olor se clasifican en: - Notas de cabeza o altas: Son aquellas que nos proporcionan un olor inmediato en el momento de aplicarnos el perfume y suelen corresponder, como es lógico, con las sustancias más volátiles. - Notas intermedias y de cuerpo: Estas notas son las que caracterizan al perfume. Después de las primeras impresiones que originan las notas de cabeza aparecen las esencias que le dan singularidad a cada perfume concreto y que lo caracteriza. - Notas de fondo o notas básicas: Formadas por aquellas sustancias que se evaporan muy lentamente, es decir, aquellas sustancias menos volátiles del perfume. Muchas de estas sustancias suelen ser algunos de los componentes fijadores del perfume como el almizcle y algunas resinas. El equilibrio entre estos tres grupos de materiales dentro de una fórmula es de vital importancia para la difusión del perfume durante la evaporación, y para su calidad. Carles representó la estructura de un perfume en un diagrama triangular dividido en tres franjas horizontales que simbolizan las notas de fondo, las notas intermedias y las notas de cabeza y que ejemplifica la composición de un perfume perfecto, como se muestra en la figura. El equilibrio entre estos tres grupos de materiales dentro de una fórmula es de vital importancia para la difusión del perfume durante la evaporación, y para su calidad. Se puede representar la estructura de un perfume en un diagrama triangular dividido en tres franjas horizontales que simbolizan las notas de fondo, las notas intermedias y las notas de cabeza y que ejemplifica la composición de un perfume perfecto. La proporción típica de una mezcla bien equilibrada es de 25% notas de cabeza, el 20% notas de cuerpo y 55% notas de fondo. Ilustración 7: Pirámide Olfativa Estudio de los mecanismos de reticulación en la obtención de microcápsulas de gelatina-goma arábiga 19 4.2. Encapsulación de fragancias 4.2.1. Introducción Ref 3. Las fragancias o productos químicos aromáticos son un aditivo esencial en los productos de consumo tales como detergentes domésticos y productos de lavandería. Proporcionan el control de olor. La búsqueda de fragancias atractivas y aromas duraderos sobre el sector textil es uno de los retos más importantes actualmente para este sector. Los investigadores están estudiando la liberación controlada de los olores con el fin de extender la longevidad de la fragancia. La encapsulación es una buena ruta para controlar la liberación de fragancia y hacer el acabado de la fragancia más duradero en los textiles. Sin embargo, la afinidad entre aromas y tejidos encapsulados sigue siendo un problema. Muchos productos de lavado contienen agentes tensioactivos, que forman micelas en el agua. Como muchas fragancias son hidrófobas tienden a migrar a las micelas, en lugar de depositarse en el sustrato. Se puede aplicar un agente de fijación con cápsulas en un tejido, pero la tela debe pasar un proceso de curado para fijar las cápsulas. Recientemente diversos detergentes se introdujeron en el mercado que contienen los aditivos que absorben olores. Actualmente, la sostenibilidad y la fabricación de productos no tóxicos y respetuosos con el medio ambiente son una necesidad en la industria de la ropa. Se buscan productos más eficientes para reducir la cantidad de productos químicos aromáticos que terminarán en el medio ambiente, por ejemplo a través de la red de alcantarillado. La microencapsulación puede ser una herramienta importante para proteger fragancias biodegradables inestables o no sustantivas de componentes detergentes agresivos. 4.2.2. Encapsulación Una de las principales áreas de aplicación es la encapsulación de productos químicos aromáticos, sabores y fragancias. En la última década la demanda de productos perfumados ha aumentado, y se piensa que va a ampliar y diversificar en el futuro. Algunos ejemplos de productos típicos de consumo perfumados serían: ambientadores de baño, aditivos, velas decorativas, cosméticos, desodorantes, antitranspirantes, perfumes, jabones, hogar, higiene bucal, el cuidado personal, afeitado, cuidado de la piel y (detergentes, suavizantes) productos de lavandería. Detergentes y productos de lavandería, en general, tienen un nivel de fragancia que varía desde 0,2 hasta 1%. Se añaden fragancias para cumplir tres tareas: - Para enmascarar los olores desagradables de productos de limpieza - Para transmitir el mensaje sobre la limpieza durante el almacenamiento y el uso - Para impartir un olor agradable a la tela Estudio de los mecanismos de reticulación en la obtención de microcápsulas de gelatina-goma arábiga 20 La encapsulación es una forma elegante de mejorar el rendimiento, como la sustantividad, tenacidad o resistencia, de perfumes en el lavado de polvos, tabletas o acondicionadores. El rendimiento de las fragancias tiende a desaparecer por evaporación, interacciones con otros componentes, la oxidación y la degradación química. La encapsulación puede ser la respuesta a varios problemas: - Reducir la reactividad de la fragancia con el entorno exterior, por ejemplo oxígeno, pH y agua - Disminuir la tasa de evaporación de la fragancia, controlar la velocidad de liberación y proporcionar una liberación sostenida - Promover la facilidad de manejo de la fragancia - Prevenir la formación de grumos - Mejorar la compatibilidad con otros componentes - Convertir un gas o líquido a un estado sólido - Promover facilitar la mezcla - Diluir el material del núcleo para lograr una dispersión uniforme en el producto - Estabilizar y proteger la fragancia durante el almacenamiento - Reducir las pérdidas (de notas de cabeza) durante la apertura repetida de los paquetes - Aumentar los niveles de uso sin afectar a la solubilidad y dispersión de la conducta - Reducir los niveles de pérdida de agua de lavado y alcantarillas - Extender la vida útil - Aumentar la deposición y la adherencia a los textiles 4.2.3. Materiales de recubrimiento Hay tres tipos principales de productos encapsulados basados en el tamaño, se dividen en: 1. Los macro-polvos recubiertos con tamaños superiores a 0,1 mm 2. Micropartículas de matriz o microcápsulas con tamaños en el rango de 0,1 a 100 micras 3. Nanopartículas o nanocápsulas con tamaños menores de 0,1 micras El macro-recubrimiento se utiliza principalmente para estabilizar fragancias o transformarlas de líquido a un flujo libre de polvo sólido. La microencapsulación o nanoencapsulación es el proceso de encerrar una sustancia dentro de una cápsula de tamaño microscópico. Estas cápsulas se conocen como microcápsulas o nanocápsulas. La sustancia dentro de la cápsula puede ser un gas, líquido o sólido. La pared de la cápsula puede consistir en diversos materiales, tales como una cera, plástico o biopolímeros como proteínas o polisacáridos. Se Estudio de los mecanismos de reticulación en la obtención de microcápsulas de gelatina-goma arábiga 21 diferencia entre la "matriz" de encapsulación y la encapsulación "verdadera". En la matriz de encapsulación las partículas resultantes se describen como agregados de activos en un material de matriz. Una porción significante del activo no está en la superficie de las partículas. La verdadera encapsulación se utiliza para los procesos que producen microcápsulas formadas por el núcleo y la carcasa. (3) Estudio de los mecanismos de reticulación en la obtención de microcápsulas de gelatina-goma arábiga 28 Las soluciones de tensioactivos resultan ser activas al colocarse en forma de capa monomolecular adsorbida en la superficie entre las fases hidrofílicas e hidrofóbicas. Esta ubicación "impide" el tráfico de moléculas que van de la superficie al interior de líquido en busca de un estado de menor energía, disminuyendo así el fenómeno de tensión superficial. Las propiedades generales y comportamiento de los agentes tensioactivos se deben al carácter dual de sus moléculas (grupo hidrófilo y lipófilo); es así como el antagonismo entre estas dos secciones de su molécula y el equilibrio entre ellas es la que da al compuesto sus propiedades activas de superficie. El grupo hidrófilo ejerce un efecto solubilizante y tiende a llevar a la molécula a disolución completa. El grupo hidrófobo, en cambio, es debido a su insolubilidad tiende a contrarrestar la tendencia del otro. Sí se logra el equilibrio adecuado entre los dos grupos se ve que la sustancia no se disuelve por completo, ni queda sin disolver del todo, concentrándose en la interfase con sus moléculas orientadas de tal forma que los grupos hidrófilos se orientan hacia la fase acuosa, mientras que los hidrófobos hacia la no acuosa o a la fase vapor. La clasificación se fundamenta en el poder de disociación del tensioactivo en presencia de un electrolito y de sus propiedades fisicoquímicas. Existen dos categorías principales: - Iónicos: Tienen fuerte afinidad por el agua, motivada por su atracción electrostática hacia los dipolos del agua puede arrastrar consigo a las soluciones de cadenas de hidrocarburos - No iónicos: Son aquellos que son ionizarse, se solubilizan mediante un efecto combinado de un cierto número de grupos solubilizantes débiles (hidrófilos) tales como enlace tipo éter ó grupos hidroxilos en su molécula. Como representantes están los alcoholes grasos o fenoles a los que se les agregan una o varias moléculas de óxido de etileno ; ejemplo de ellos el nonil fenol etoxilado o el nonanol etoxilado. En este caso se utilizó como tensioactivo para todas las pruebas realizadas el SDS. El SDS es un compuesto tensioactivo aniónico. La molécula posee una cola de 12 átomos de carbono, adosada a un grupo sulfato, dotando a la molécula de las propiedades anfifílicas requeridas para todo detergente. El SDS actúa rompiendo enlaces no covalentes en las proteínas, desnaturalizándolas, provocando que estas moléculas proteicas pierdan su conformación nativa. Esto ocurre porque el SDS se une a las zonas apolares del polipéptido. Además, la cantidad de SDS unido es similar para muchas proteínas: una molécula de SDS por cada dos residuos aminoácidos, correspondiendo a unos 1,4 g SDS/g proteína. Ello proporciona Estudio de los mecanismos de reticulación en la obtención de microcápsulas de gelatina-goma arábiga 29 al polipéptido una carga negativa que resulta proporcional a la longitud de la cadena (el número de aminoácidos) y, por tanto, a la masa molecular de la proteína. Este aporte de carga negativa es sustancialmente mayor que la carga original de la proteína. La repulsión electrostática creada por la unión del SDS a la proteína es una de las causas de que la proteína pierda su conformación nativa, eliminándose de este modo las diferencias en conformación de las diferentes proteínas que han de ser separadas en el gel. Ilustración 11: Fórmula química del SDS Ilustración 12: Estructura del SDS 5.1.5. Reticulantes La reticulación es el proceso de unión química de dos o más moléculas mediante un enlace covalente. Los reticulantes contienen extremos reactivos a grupos específicos funcionales (por ejemplo, aminas primarias o sulfhídricos) en proteínas u otras moléculas. Los agentes reticulantes se pueden distinguir en dos grandes grupos: - Reticulantes homobifuncionales: Tienen grupos reactivos idénticos en cada uno de sus extremos. En general, deben ser utilizados en procedimientos de reacción de un solo paso para fijar o polimerizar al azar las moléculas que contienen como grupo funcional. Esto es útil para la captura de una instantánea de todas las interacciones de proteínas, pero no puede proporcionar la precisión necesaria para otros tipos de aplicaciones de reticulación. - Reticulantes heterobifuncionales: Poseen diferentes grupos reactivos en cada extremo. Estos reactivos no sólo permiten una sola etapa de conjugación de moléculas que tienen el grupo funcional de destino respectivo, sino que también permiten para secuenciales (dos pasos) conjugaciones que reduzcan al mínimo la polimerización indeseable o la auto-conjugación. En los procedimientos secuenciales, los Estudio de los mecanismos de reticulación en la obtención de microcápsulas de gelatina-goma arábiga 30 reactivos hetereobifunctional reaccionan con una proteína utilizando primero el grupo más poco estable del agente de reticulación. Después de eliminar el exceso de agente de reticulación que no ha reaccionado, se añade la primera proteína modificada a una solución que contiene la segunda proteína y se produce la reacción a través del segundo grupo reactivo del agente de reticulación. En este proyecto se han utilizado tres reticulantes diferentes, los cuáles se mencionan a continuación y se explicaran más adelante. - Glutarladehído - Formaldehído - Transglutaminasa 5.2. Metódo El método por el que se han producido las microcápsulas es la coacervación entre la goma arábiga y la gelatina. El desarrollo de la microencapsulación por coacervación puede resumirse en cuatro etapas esenciales. - Preparación de un sistema en el que un vehículo liquido contiene el material de recubrimiento -una sustancia de tipo coloidalcomo fase continua y el material que va a encapsularse (núcleo), se encuentra como fase dispersa. - Modificación de las características de dispersión del coloide para producir la separación de fases. - Depósito del líquido coloidal en forma de una membrana continua sobre el material que constituye el núcleo. - Endurecimiento de la cubierta depositada sobre el material microencapsulado. La coacervación es un fenómeno que está asociado con las sustancias coloidales. Un sistema coloidal está constituido por dos fases, una líquida continua y otra altamente dispersa en el líquido, formando partículas de un tamaño entre 0.001 a 0.5 micrones. En algunas ocasiones, la modificación de algunas características en un sistema coloidal, tales como cambio en el pH o la adición de una sal, puede producir una disminución de la solubilidad de la macromolécula, provocando su separación en una nueva fase. De manera que pueden distinguirse, en este sistema, dos zonas, una rica en sustancia coloidal y la otra que contiene una baja proporción de la macromolécula. En la fase rica en coloide, la macromolécula puede quedar constituyendo una fase en forma de pequeñas gotas al estado Estudio de los mecanismos de reticulación en la obtención de microcápsulas de gelatina-goma arábiga 31 líquido. Este fenómeno se denomina coacervación y las pequeñas gotas forman el estrato líquido llamado coacervato. Cuando se forma el coacervato y en condiciones favorables, éste puede producir la microencapsulación de pequeñas partículas sólidas o gotas de líquido inmiscibles que se encuentren en la interfase. La coacervación se ha definido como la separación de un sólido liofílico en forma de gotas líquidas en vez de constituir agregados sólidos. El término se ha introducido en la química de los coloides para describir la floculación o separación de líquidos desde una solución en la cual al menos uno de los líquidos contenía un soluto coloidal. Se distinguen dos tipos de coacervación, la denominada coacervación simple y la coacervación compleja. En el caso de la goma arábiga y la gelatina se produce una coacervación compleja. Esta se obtiene cuando reaccionan dos sustancias de tipo coloidal produciendo un complejo que tiene una solubilidad menor que la de los coloides en forma separada. La goma arábiga posee carga negativa y si se encuentra en un medio con la gelatina cargada en forma positiva, se produce una interacción entre ambas, provocándose la separación de fases y formación de un coacervato. La primera etapa del procedimiento para la realización de estas microcápsulas consiste en preparar una solución de gelatina y otra de goma arábiga desde 45ºC hasta 55ºC. La sustancia se dispersa o emulsiona en la solución de gelatina por encima de los 45ºC. La suspensión o emulsión resultante se diluye por la adición de agua y la solución de goma arábiga. El pH es ajustado por debajo del punto isoeléctrico de la gelatina (3.8- 4.4), de este modo la carga se vuelve positiva mientras que la de la goma arábiga es negativa. En este punto, se permite que el sistema se enfrié a temperatura ambiente mientras se agita. Durante el proceso de enfriamiento, el líquido coacervado se deposita lentamente alrededor de las partículas formando las micropartículas. Como último paso, la mezcla se enfría por debajo de los 10ºC y se le añade un tensioactivo tanto para reticular el polímero como para endurecer la capa de polímero. Para efectuar la microencapsulación por coacervación, es necesario que, una vez producida la separación de fase, se encuentre en la interfase el material formador del núcleo para que el polímero se deposite formando una película sobre él. Esto ocurre si el polímero es capaz de adsorberse en la interfase formada entre el núcleo y la fase líquida del sistema. La separación de las fases y formación de coacervatos se puede efectuar provocando algunos cambios en el sistema coloidal. Estos pueden referirse ya sea a reducción de la solubilidad del Estudio de los mecanismos de reticulación en la obtención de microcápsulas de gelatina-goma arábiga 32 coloide en el líquido que actúa como fase continua, o bien a la introducción de algunas sustancias capaces de reaccionar con el polímero. La separación de fases puede lograrse también aprovechando la diferente solubilidad que presenta, en un solvente determinado, la sustancia coloidal que se utiliza como agente de recubrimiento. Esta situación puede ejemplificarse con la microencapsulación del n-acetil-p- aminofenol con etilcelulosa. La etilcelulosa se disuelve en ciclohexano a temperaturas relativamente elevadas, pero es insoluble a temperatura ambiente. Para producir la microencapsulación, se dispersa la etilcelulosa, por ejemplo al 2% en ciclohexano y se calienta hasta disolución completa. En esta solución se dispersa el n-acetil-p-aminofenol, finamente dividido, luego se enfría el sistema bajo agitación continua. Al disminuir la solubilidad de la etilcelulosa en el solvente, se produce la coacervación y el polímero se deposita sobre las partículas de la droga recubriéndolas con una fina película. El sistema se enfría posteriormente a temperatura ambiente produciéndose la gelación de la microcápsula y la solidificación de la cubierta. Las microcápsulas se separan y se someten después a los procesos de endurecimiento y de desecación que son comunes para este tipo de procedimiento. La separación de fases con formación de coacervatos puede conseguirse también, adicionando al sistema que contiene el material de recubrimiento disuelto, un solvente en el cual, la sustancia formadora de película sea insoluble o una sal que provoque la precipitación. Estudio de los mecanismos de reticulación en la obtención de microcápsulas de gelatina-goma arábiga 33 6. MICROEMULSIONES 6.1. Introducción Ref (5). Las microemulsiones son mezclas de dos líquidos mutuamente insolubles cuya estabilidad es debida principalmente a la presencia de un agente tensioactivo, es una sustancia que se caracteriza por tener una parte hidrófila y una parte lipófila cuya tarea consiste en disponer en el líquido hidrófilo una interfase de líquido lipófilo para reducir la tensión interfacial. Por lo tanto, se convierte en una microemulsión termodinámicamente estable y un sistema homogéneo capaz de formarse espontáneamente sin necesidad de utilizar energía externa adicional. En consecuencia, la microemulsión se puede definir como un sistema de agua, aceite y anfífilo, que es ópticamente isotrópico y la solución líquida es termodinámicamente estable. Se han desarrollado tres enfoques diferentes para explicar el mecanismo de formación y la estabilidad de las microemulsiones: - Teorías de película interfacial o mixtas - Teorías de solubilización - Enfoques termodinámicos En particular, de acuerdo con un simplificado punto de vista termodinámico, la energía libre de Gibbs (ΔG) asociada con la formación de la microemulsión sería el resultado de un equilibrio entre el aumento de energía, debido al aumento de superficie (ΔA) y la tensión superficial de aceite-agua ( ) decrece por la presencia de tensioactivo, y la disminución de energía imputable a la entropía del sistema aumenta (ΔS): ( ) La ecuación establece claramente que, para que la formación de la microemulsión sea espontanea, ΔG debe ser negativa, por lo que debe ser mayor que . Como la formación de la microemulsion implica un enorme aumento del área de interfase aceite-agua (ΔS), la tensión superficial debe disminuir considerablemente gracias al surfactante para permitir la prevalencia de la contribución entrópica. Por esta razón, muy a menudo, también para el propósito de reducir la cantidad de tensioactivo necesario, se requiere la presencia de un cotensioactivo, generalmente un alcohol. De esta forma, la tensión interfacial es generalmente baja (menos de 1 mN/m) y la formación de dominios lipófilos o hidrófilos ocupa un rango desde unos pocos a cientos de nanómetros. La contribución entrópica ΔS surge de la mezcla de una fase en la otra que tiene forma de un gran número de pequeños dominios. Sin embargo, ΔS también se mejora por otras contribuciones entrópicas favorables derivadas de Estudio de los mecanismos de reticulación en la obtención de microcápsulas de gelatina-goma arábiga 34 otros procesos dinámicos así como la difusión del tensioactivo en la capa interfacial separando el aceite del agua. Adicionalmente, el tensioactivo se intercambia entre moléculas de tensioactivo solubilizadas (monómero de tensioactivo) y micelas del tensioactivo (con una concentración suficientemente alta, las moléculas del tensioactivo pueden organizarse como pequeñas micelas en equilibrio con el monómero de tensioactivo) mejora la contribución entrópica. Obviamente, este equilibrio de energía, aunque depende estrictamente del tensioactivo, co-tensioactivo, y la clase de aceite, también puede ser afectado por la temperatura y una diferencia de tan solo 1ºC o menos puede alterar considerablemente la posición de equilibrio en términos de la concentración del componente. 5.2. Características Partiendo de la base de la temperatura, la presión, tensioactivo, co-tensioactivo, y el aceite considerado, las microemulsiones pueden asumir una gran variedad de estructuras tales como gotas de aceite en agua y viceversa, mezclas bicontínuas aleatorias, gotitas ordenadas y mezclas lamelares con una amplia gama de equilibrio de fases entre ellas y con exceso de las fases de aceite o agua. Entre estas grandes variedades, no obstante, las categorías más importantes están representadas por microemulsiones discretas y bicontínuas. Las microemulsiones discretas están constituidas por una fase continua que aloja una fase dispersa (por ejemplo en forma de gotas pequeñas) estabilizada por al menos una monocapa constituida por moléculas de tensioactivo. Esta monocapa, formando una corona de gotas que rodea el núcleo interno, por lo general tiene un grosor de 20 󰇗 a 50 de esta manera su volumen no es despreciable en comparación con el de toda la gota. De hecho, como el tamaño de la gota varía entre 100 y 1000 , el volumen de la corona representa el 14% de todo el volumen si el diámetro de gota es de 1000 y este porcentaje aumenta hasta el 88% cuando el radio de la gota es igual a 100 . En virtud de las dimensiones de gota tan pequeñas, las microemulsiones son, típicamente, transparentes. La formación de gotas depende de las propiedades del tensioactivo que se pueden representar por un balance hidrófilo-lipófilo (HLB) y el parámetro crítico de embalaje (CPP). El HLB tiene en cuenta la contribución relativa de fragmentos hidrófilos e hidrófobos de la molécula de tensioactivo. En general, un bajo HLB (3-6) favorece la formación de la microemulsión de agua-en-aceite mientras que un alto HLB (8-18) es más adecuado para la realización de microemulsiones de aceite en agua. Estudio de los mecanismos de reticulación en la obtención de microcápsulas de gelatina-goma arábiga 35 El CPP, en cambio, influye considerablemente en la forma de los dominios de la fase dispersa. Este parámetro se define por: Donde V es el volumen parcial molar de la porción hidrófoba del tensioactivo, es el área de tensioactivo óptimo (polar) en la zona de la cabeza y l es la longitud de la cola del tensioactivo (hidrófobo), por lo general se supone que es un 70% - 80% de su longitud completamente extendida. Cuando CPP < 1 = 3, las estructuras globulares aceite-en-agua son las más probables, para CPP ≈ 1 = 2, se forman estructuras cilíndricas de aceite-en-agua, para CPP≈ 1, favorecen las estructuras planas, para CPP ≈ 2 las estructuras cilíndricas agua en aceite son las más probables y para CPP> 3 gotas de aceite-en-agua. Obviamente, los cambios en la composición de la microemulsión o en la fuerza iónica alteran el microambiente del tensioactivo y esto conlleva a una variación de la CPP aparente del tensioactivo. Ilustración 13: Estructuras de microemulsión. (A) Aceite en agua. (B) Agua en aceite. (9) Las microemulsiones también pueden dar origen a diferentes equilibrios de fase implicando el equilibrio con una fase acuosa, una fase de aceite, o con una forma diferente de microemulsión estructurada. Los equilibrios más estudiados relacionados con las microemulsiones son los llamados “Winsor phases”. Básicamente existen equilibrios Winsor I, II, III, y IV. En el Winsor I, la microemulsión discreta de aceite en agua está en equilibrio con un exceso en la fase aceite, en Winsor II la microemulsión discreta agua en aceite está en equilibrio con un exceso en la fase de agua, en Winsor III la microemulsión bicontínua está en equilibrio con un exceso en la fase de aceite y agua, mientras que Winsor IV representa las microemulsiones discretas. El equilibrio Winsor III no es tan fácil de explicar, Winsor I y II se pueden teorizar suponiendo que la condición más estable de microemulsión corresponde a un valor óptimo de la curvatura gota (que, para una Estudio de los mecanismos de reticulación en la obtención de microcápsulas de gelatina-goma arábiga 36 esfera, coincide con el inverso del radio de la esfera). En consecuencia, la adición de aceite a una microemulsión de aceite/ agua se reflejara en el radio de la gota, aumentara hasta el valor optimo por encima del cual el volumen de exceso de aceite constituye a la fase de aceite en exceso. De manera análoga se puede explicar el mecanismo para el equilibrio Winsor II. Hay que recordar que la adicion de la concentración de tensioactivo o la adición de sales marca una posible una transformación continua que a partiendo de Winsor I acaba en Winsor III pasando por Winsor II. La figura 14 es una representación esquemática de un diagrama de fases ternario (agua, aceite, agente tensioactivo) donde se observan las fases más importantes que pueden ocurrir. En particular, se muestra que cerca del eje aceite/agua (zona de baja concentración de tensioactivo) hay una laguna de miscibilidad, correspondiente a una emulsión (región de dos fases). Cuando la concentración de tensioactivo aumenta, se produce una microemulsión discreta aceite-en-agua o agua-en-aceite si se considera la zona de baja concentración de aceite (cerca del eje tensioactivo/agua) o la zona de concentración de agua (cerca del eje aceite/tensioactivo). En general, la adición de aceite a una microemulsión discreta de aceite en agua permite la transformación a la correspondiente microemulsión de agua en aceite, esta transformación pasa a través de todos o algunos de los equilibrios Winsor I, II, y III. Obviamente, un comportamiento análogo se puede producir a partir de una microemulsión discreta de agua en aceite por la adición de agua. Pasando el eje agua-tensioactivo, para el aumento de concentraciones de tensioactivo a partir de cero, nos encontramos con una solución acuosa de tensioactivo, la formación de micelas de tensioactivo en equilibrio con una solución acuosa de tensioactivo y, finalmente, la organización de las micelas en estructuras de orden superior que imparten la macroscópica típica del comportamiento similar a un gel al sistema. Se puede encontrar un comportamiento similar en el eje aceite-tensioactivo con la única diferencia de que, obviamente, se producen micelas inversas. Por último, en la esquina superior del diagrama de fase (que contiene menos agua y aceite) se pueden formar estructuras laminares. (5) Estudio de los mecanismos de reticulación en la obtención de microcápsulas de gelatina-goma arábiga 37 Ilustración 14: Representación esquemática de un diagrama de fase ternario referido a un sistema de agua, aceite y tensioactivo. (10) Estudio de los mecanismos de reticulación en la obtención de microcápsulas de gelatina-goma arábiga 44 8. CINÉTICA DE REACCIÓN La cinética química es un área de la fisicoquímica que se encarga del estudio de la rapidez de reacción, cómo cambia la rapidez de reacción bajo condiciones variables y qué eventos moleculares se efectúan mediante la reacción general (Difusión, ciencia de superficies, catálisis). El objeto de la cinética química es medir la rapidez de las reacciones químicas y encontrar ecuaciones que relacionen la rapidez de una reacción con variables experimentales. Experimentalmente la velocidad de una reacción puede ser descrita a partir de la(s) [concentración(es) de las especies involucradas en la reacción y una constante k, sin embargo esta puede depender de numerosos factores (el solvente utilizado, el uso de catalizadores, fenómenos de transporte, material del reactor, etc...), haciendo muy complejo el proceso de determinación de velocidades de reacción. Se puede clasificar a las reacciones en simples o complejas dependiendo del número de pasos o de estados de transición que deben producirse para describir la reacción química, si solo un paso es necesario (un estado de transición) se dice que la velocidad de reacción es simple y el orden de la reacción corresponde a la suma de coeficientes estequiométricos de la ecuación, si no es así se debe proponer una serie de pasos (cada uno con un estado de transición) denominado mecanismo de la reacción que corresponda a la velocidad de reacción encontrada. Las reacciones también se pueden clasificar cinéticamente en homogéneas y heterogéneas. La primera ocurre en una fase y la segunda en más de una fase. La reacción heterogénea depende del área de una superficie ya sea la de las paredes del vaso o de un catalizador sólido. La velocidad de reacción es la rapidez con que se modifica la concentración de un producto o un reactivo al transcurrir el tiempo. Ilustración 20: Velocidad de reacción VS Substrato Estudio de los mecanismos de reticulación en la obtención de microcápsulas de gelatina-goma arábiga 45 La medida de la rapidez de reacción implica la medida de la concentración de uno de los reactivos o productos a lo largo del tiempo, esto es, para medir la rapidez de una reacción necesitamos medir, bien la cantidad de reactivo que desaparece por unidad de tiempo, o bien la cantidad de producto que aparece por unidad de tiempo. La rapidez de reacción se mide en unidades de concentración/tiempo, esto es, en (mol/l)/s, es decir, moles/(l·s). Para una reacción de la forma: la ley de la rapidez de formación es la siguiente: es la rapidez de la reacción, la disminución de la concentración del reactivo A en un tiempo . Esta rapidez es la rapidez media de la reacción, pues todas las moléculas necesitan tiempos distintos para reaccionar. La rapidez de aparición del producto es igual a la rapidez de desaparición del reactivo. De este modo, la ley de la rapidez se puede escribir de la siguiente forma: Esta velocidad no es constante y depende de varios factores: - Concentración de los reactivos: Uno de los factores más importantes es la concentración de los reactivos. Cuanto más partículas existan en un volumen, más colisiones hay entre las partículas por unidad de tiempo. Al principio, cuando la concentración de reactivos es mayor, también es mayor la probabilidad de que se den colisiones entre las moléculas, y la rapidez es mayor. A medida que la reacción avanza, al ir disminuyendo la concentración de los reactivos, disminuye la probabilidad de colisión y con ella la rapidez de la reacción. - Temperatura: Un incremento de la temperatura provoca un incremento en la energía cinética de las moléculas, lo que hace que sea mayor el número de moléculas que alcanza la energía de activación. - Catalizadores: Los catalizadores cambian la energía de activación de una determinada reacción, y por lo tanto varían la velocidad de reacción. Estudio de los mecanismos de reticulación en la obtención de microcápsulas de gelatina-goma arábiga 46 8.1. Cinética enzimática Cuando la reacción que se estudia es de tipo enzimática, es decir, las reacciones químicas que son catalizadas mediante enzimas, su cinética de reacción tiene un comportamiento diferente. La cinética enzimática estudia la velocidad de las reacciones catalizadas por enzimas. Estos estudios proporcionan información directa acerca del mecanismo de la reacción catalítica y de la especifidad del enzima. La velocidad de una reacción catalizada por un enzima puede medirse con relativa facilidad, ya que en muchos casos no es necesario purificar o aislar el enzima. La medida se realiza siempre en las condiciones óptimas de pH, temperatura, presencia de cofactores, etc, y se utilizan concentraciones saturantes de sustrato. En estas condiciones, la velocidad de reacción observada es la velocidad máxima (Vmax). La velocidad puede determinarse bien midiendo la aparición de los productos o la desaparición de los reactivos Ref (6). Al seguir la velocidad de aparición de producto (o de desaparición del sustrato) en función del tiempo se obtiene la llamada curva de avance de la reacción, o simplemente, la cinética de la reacción. A medida que la reacción transcurre, la velocidad de acumulación del producto va disminuyendo porque se va consumiendo el sustrato de la reacción (Figura 16). Para evitar esta complicación se procede a medir la velocidad inicial de la reacción (v0). La velocidad inicial de la reacción es igual a la pendiente de la curva de avance a tiempo cero (Figura de la derecha). De esta forma, la medida de v0 se realiza antes de que se consuma el 10% del total del sustrato, de forma que pueda considerarse la [S] como esencialmente constante a lo largo del experimento. Además, en estas condiciones no es necesario considerar la reacción inversa, ya que la cantidad de producto formada es tan pequeña que la reacción inversa apenas ocurre. De esta forma se simplifican enormemente las ecuaciones de velocidad. Ilustración 21: Velocidad de acumulación del producto (13) Estudio de los mecanismos de reticulación en la obtención de microcápsulas de gelatina-goma arábiga 47 Para estudiar la cinética enzimática se mide el efecto de la concentración inicial de sustrato sobre la velocidad inicial de la reacción, manteniendo la cantidad de enzima constante. Si representamos v0 frente a [S]0 obtenemos una gráfica como la de la Figura de la derecha. Cuando [S]0 es pequeña, la velocidad inicial es directamente proporcional a la concentración de sustrato, y por tanto, la reacción es de primer orden. A altas [S]0, el enzima se encuentra saturada por el sustrato, y la velocidad ya no depende de [S]0. En este punto, la reacción es de orden cero y la velocidad es máxima (Vmax). Ilustración 22: Gráfica velocidad de reacción vs concentración (14) Para poder estudiar el comportamiento cinético de las enzimas se utiliza el método cinético de Michaelis-Menten. Como las reacciones catalizadas por enzimas son saturables, la velocidad de catálisis no muestra un comportamiento lineal en una gráfica al aumentar la concentración de sustrato. Si la velocidad inicial de la reacción se mide a una determinada concentración de sustrato (representado como [S]), la velocidad de la reacción (representado como V) aumenta linealmente con el aumento de la [S], como se puede ver en la figura. Sin embargo, cuando aumentamos la [S], la enzima se satura de sustrato y alcanza su velocidad máxima (Vmax), que no sobrepasará en ningún caso, independientemente de la [S]. El modelo de cinética michaeliana para una reacción de único sustrato se puede ver en la figura de la izquierda. Primeramente, tiene lugar una reacción química bimolecular entre la enzima E y el sustrato S, formándose el complejo enzima-sustrato ES. Aunque el mecanismo enzimático para una reacción unimolecular de la siguiente forma: puede ser bastante complejo, existe una etapa enzimática limitante que permite que el mecanismo sea simplificado como una etapa cinética única cuya constante es k2. (Ecuación 1) Estudio de los mecanismos de reticulación en la obtención de microcápsulas de gelatina-goma arábiga 48 k2 también llamado número de recambio, hace referencia al máximo número de reacciones enzimáticas catalizadas por segundo. A bajas concentraciones de sustrato, la enzima permanece en un equilibrio constante entre la forma libre y el complejo enzima-sustrato . Aumentando la también aumentamos la a expensas de la , desplazando el equilibrio de la reacción hacia la derecha. Puesto que la velocidad de reacción depende de la , la velocidad es sensible a pequeños cambios en la . Sin embargo, a altas , la enzima se satura y solo queda la forma unida al sustrato ES. Bajo estas condiciones, la velocidad de la reacción ( ) deja de ser sensible a pequeños cambios en la [S]. En este caso, la concentración total de enzima ( ) es aproximadamente igual a la concentración del complejo : La ecuación de Michaelis-Menten8 describe cómo la velocidad de la reacción depende del equilibrio entre la [S] y la constante k2. Leonor Michaelis y Maud Menten demostraron que si k2 es mucho menor que k1(aproximación del equilibrio) se puede deducir la siguiente ecuación: (Ecuación 1) Esta famosa ecuación es la base de la mayoría de las cinéticas enzimáticas en las que esta impolicado un único sustrato.(6) 8.1.1. Representación de la ecuación de Michaelis-Menten La gráfica de velocidad frente a [S] mostrada anteriormente no es lineal. Aunque a bajas concentraciones de sustrato se mantenga lineal, se va curvando a medida que aumenta la concentración de sustrato. Antes de la llegada de los ordenadores, que permiten ajustar regresiones no lineales de forma sencilla, podía llegar a ser realmente difícil estimar los valores de la Km y la Vmax en las gráficas no lineales. Esto dio lugar a que varios investigadores concentraran sus esfuerzos en desarrollar linearizaciones de la ecuación de Michaelis-Menten, dando como resultado la gráfica de Lineweaver-Burke y el diagrama de Eadie-Hofstee. Con el siguiente tutorial de la cinética de Michaelis-Menten realizado en la Universidad de Virginia α, se puede simular el comportamiento de una enzima variando las constantes cinéticas. La gráfica de Lineweaver-Burk o representación de doble recíproco es la forma más común de mostrar los datos cinéticos. Para ello, se toman los valores inversos a ambos lados de la ecuación de Michaelis-Menten. Como se puede apreciar en la figura 17, el resultado de este Estudio de los mecanismos de reticulación en la obtención de microcápsulas de gelatina-goma arábiga 49 tipo de representación es una línea recta cuya ecuación es y = mx + c, siendo el punto de corte entre la recta y el eje de ordenadas equivalente a 1/Vmax, y el punto de corte entre la recta y el eje de abscisas equivalente a -1/Km. Ilustración 23: Gráfica de Lineweaver-Burke (15) Estudio de los mecanismos de reticulación en la obtención de microcápsulas de gelatina-goma arábiga 50 9. CINÉTICA DE RETICULACIÓN Anteriormente se ha explicado en que consiste la cinética de cualquier reacción y en el caso particular de la reacción enzimática, en este apartado se desarrollara el comportamiento químico específico que se produce en la reacción de reticulación. A pesar de que la transglutaminasa es una enzima en el estudio de su reacción no se ha considerado como tal, así que los cálculos que se han realizado no han seguido la teoría de la reacción enzimática explicada en el apartado anterior. 9.1. Absorbancia Para la finalidad de este proyecto el enfoque experimental más obvio para la determinación de la difusividad de la reacción estudiada es medir directamente la absorbancia del reticulante y así calcular la concentración de este. Cuando un haz de luz incide sobre un cuerpo traslúcido, una parte de esta luz es absorbida por el cuerpo, y el haz de luz restante atraviesa dicho cuerpo. la Absorbancia se define como la relación (logarítmica) entre la intensidad de la luz que incide sobre una muestra y la intensidad de esa misma luz que es transmitida a través de esa muestra. Cuando una luz de una longitud de onda determinada, seleccionada por un filtro, incide sobre una muestra, parte de esa luz es absorbida. A mayor cantidad de luz absorbida, mayor será la absorbancia del cuerpo, y menor cantidad de luz será transmitida por dicho cuerpo. 9.1.1. Ley de Lambert-Beer La ley de Lambert-Beer expresa la relación entre la absorbancia de luz (de longitud de onda fija) y la concentración de la disolución: Es la combinación de las dos siguientes leyes: - Ley de Lambert: dice que la cantidad de luz absorbida por un objeto depende de la distancia recorrida por la luz. Es decir que, a igual concentración, cuanto mayor sea la distancia que recorre la luz por la solución más moléculas se encontrará, por tanto la absorbancia será mayor. - Ley de Beer: la absorbancia de una solución es directamente proporcional a su concentración, es decir, a mayor número de moléculas mayor interacción de la luz con ellas. Estudio de los mecanismos de reticulación en la obtención de microcápsulas de gelatina-goma arábiga 51 Además de los dos factores comentados anteriormente, la ley de Lambert-Beer también incluye en su fórmula una constante de proporcionalidad (ε), denominada coeficiente de extinción, que es específica de cada material. 9.1.2. Espectrofotometría El instrumento utilizado en la espectrometría ultravioleta-visible se llama espectrofotómetro UV-Vis. Mide la intensidad de luz que pasa a través de una muestra (I), y la compara con la intensidad de luz antes de pasar a través de la muestra (Io). La relación I / Io se llama transmitancia, y se expresa habitualmente como un porcentaje (%T). La absorbancia (A) se basa en la transmisión: ( ) La espectrometría UV-Vis se utiliza con mayor frecuencia en forma cuantitativa para determinar las concentraciones de especies absorbentes en solución usando la Ley de Beer- Lambert comentada anteriormente o bien realizando una recta de calibrado midiendo la absorbancia de disoluciones con distintas concentraciones. En la espectrofotometría se aprovecha la absorción de radiación electromagnética en la zona del ultravioleta y visible del espectro. La muestra absorbe parte de la radiación incidente en este espectro y promueve la transición del analito hacia un estado excitado, transmitiendo un haz de menor energía radiante. En esta técnica se mide la cantidad de luz absorbida como función de la longitud de onda utilizada. La absorción de las radiaciones ultravioletas, visibles e infrarrojas depende de la estructura de las moléculas, y es característica de cada sustancia química. La espectrofotometría ultravioleta-visible utiliza haces de radiación del espectro electromagnético, en el rango UV de 180 a 380 nm, y en el de la luz visible de 380 a 780 nm, por lo que es de gran utilidad para caracterizar los materiales en la región ultravioleta y visible del espectro. Las partes básicas de un espectrofotómetro son una fuente de luz (a menudo una bombilla incandescente para las longitudes de onda visibles, o una lámpara de arco de deuterio en el ultravioleta), un soporte para la muestra, una rejilla de difracción o monocromador para separar las diferentes longitudes de onda de la luz, y un detector. Estudio de los mecanismos de reticulación en la obtención de microcápsulas de gelatina-goma arábiga 52 9.2. Difusión El reticulante es absorbido por las microcápsulas que se van formando, por tanto se produce un transporte másico entre los elementos, es decir, la reacción que se produce es de difusión. La difusión corresponde al movimiento microscópico de átomos y moléculas. Ésta es presente en todo los estados de agregación dela materia y ocurre debido a un gradiente en el potencial químico. La Difusión, en ausencia de un campo externo, es un proceso espontáneo, por lo tanto, siempre ocurre por una reducción en la energía libre de Gibbs (en dirección al equilibrio). La ley de Fick es una ley cuantitativa en forma de ecuación diferencial que describe diversos casos de difusión de materia o energía en un medio en el que inicialmente no existe equilibrio químico o térmico. En situaciones en las que existen gradientes de concentración de una sustancia, o de temperatura, se produce un flujo de partículas o de calor que tiende a homogeneizar la disolución y uniformizar la concentración o la temperatura. El flujo homogeneizador es una consecuencia estadística del movimiento azaroso de las partículas que da lugar al segundo principio de la termodinámica, conocido también como movimiento térmico casual de las partículas. Así los procesos físicos de difusión pueden ser vistos como procesos físicos o termodinámicos irreversibles. La ley de Difusión de Fick toma en cuenta ciertos parámetros para determinar el nivel de difusión de una especie dada: - Magnitud de gradiente: un mayor gradiente acelera la difusión. - Superficie de difusión. - Difusividad másica entre A y B, definida para una especie A difundiéndose en una especie B. La ley de Fick nos dice que el flujo difusivo que atraviesa una superficie es directamente proporcional al gradiente de concentración. La constante de proporcionalidad (D) se denomina coeficiente de difusión o difusividad y es característico tanto del soluto como del medio en que se difunde. El coeficiente de difusión es un valor que representa la facilidad con que cada soluto en particular se mueve en un disolvente determinado y depende de cuatro factores: - Tamaño y forma del soluto - Viscosidad del solvente Estudio de los mecanismos de reticulación en la obtención de microcápsulas de gelatina-goma arábiga 53 - Temperatura (Difusividad térmica) - De la naturaleza de la partícula que se difunde y del solvente donde difunde, siendo independiente de las concentraciones. La primera Ley de Fick determina el flujo neto de los átomos: El signo negativo indica el movimiento de los átomos de la concentración más alta a la más baja. La mayoría de las situaciones prácticas de difusión son en estado no estacionario. El flujo y el gradiente de concentración varían con el tiempo por lo que se genera acumulación o agotamiento de las substancias que difunden. La ecuación que se utiliza para describir esta situación es la segunda ley de Fick: ( ) ( ) La difusividad de los líquidos puede variar bastante con la concentración; cuando no se indica ésta hay que suponer que la difusividad está dada para disoluciones diluidas del soluto A en el disolvente B. La velocidad de difusión molecular en líquidos es mucho menor que en gases. Las moléculas de un líquido están muy cercanas entre sí en comparación con las de un gas; la densidad y la resistencia a la difusión de un líquido son mucho mayores, por tanto, las moléculas de A que se difunden chocarán con las moléculas de B con más frecuencia y se difundirán con mayor lentitud que en los gases. Debido a esta proximidad de las moléculas las fuerzas de atracción entre ellas tiene un efecto importante sobre la difusión. Estudio de los mecanismos de reticulación en la obtención de microcápsulas de gelatina-goma arábiga 60 y = 0,3524x - 5,9136 19 19,5 20 20,5 21 21,5 22 22,5 71 73 75 77 79 Absorbancia C (g/l) Recta Calibrado 15g 15 g/0,2 l C (g/l) Abs 71 19,0545 73 19,9685 75 20,41132 77 21,152 79 21,9865 Estudio de los mecanismos de reticulación en la obtención de microcápsulas de gelatina-goma arábiga 61 11.1.5. Transglutaminasa y = 2,3104x + 0,3898 0 5 10 15 20 0 2 4 6 8 10 Absorbancia C (g/l) Recta Calibrado 1g y = 0,538x + 6,1149 11 13 15 17 19 21 16 18 20 22 24 Absorbancia C (g/l) Recta Calibrado 4g 1 g/0,2 l C (g/l) Abs 0 0,0214 2 5,0425 4 9,4587 6 15,974 8 17,659 4 g/0,2 l C (g/l) Abs 16 14,715 18 15,749 20 16,984 22 17,915 24 19,012 Estudio de los mecanismos de reticulación en la obtención de microcápsulas de gelatina-goma arábiga 62 y = 0,352x + 1,7257 11 12 13 14 15 16 31 33 35 37 39 Absorbancia C (g/l) Recta Calibrado 7g y = 0,5163x - 2,2636 20 21 22 23 24 25 26 46 48 50 52 54 Absorbancia C (g/l) Recta Calibrado 10g y = 0,3532x - 0,3914 24 24,5 25 25,5 26 26,5 27 27,5 28 71 73 75 77 79 Absorbancia C (g/l) Recta Calibrado 15g 7 g/0,2 l C (g/l) Abs 31 12,755 33 13,216 35 13,977 37 14,798 39 15,484 10 g/0,2 l C (g/l) Abs 46 21,484 48 22,432 50 23,396 52 25,1548 54 25,2854 15 g/0,2 l C (g/l) Abs 71 24,67285 73 25,2654 75 26,31132 77 26,7895 79 27,4425 Estudio de los mecanismos de reticulación en la obtención de microcápsulas de gelatina-goma arábiga 63 11.2. Tamaño de las micrócapsulas Para poder realizar el estudio de la cinética de reticulación es necesario saber el tamaño que tienen las microcápsulas formadas. Para ello se ha utilizado un programa, llamado “imageJ”, que permite medir la distancia entre dos puntos según la escala que se quiera. Para cada ensayo se ha medido el diámetro de 100 microcápsulas de las imágenes obtenidas mediante el microscopio óptico y después se ha calculado el diámetro medio. Los resultados obtenidos son los siguientes: GLUTARALDEHÍDO TRANSGLUTAMINASA FORMALDEHÍDO Dm ( m) Rm( m) Dm( m) Rm( m) Dm( m) Rm( m) 1 gramo 22,58 11,29 23,69 11,85 21,41 10,71 4 gramos 22,93 11,46 21,29 10,64 26,11 13,05 7 gramos 21,88 10,94 23,10 11,55 21,89 10,95 10 gramos 25,18 12,59 38,23 19,12 26,41 13,20 15 gramos 23,01 11,50 24,87 12,44 18,34 9,17 11.3. Cinética de reticulación 11.3.3. Glutaraldehído - Reactor con 1 gramo de glutaraldehído en 200 ml de agua. Como ya se ha comentado anteriormente el objetivo de este proyecto es estudiar la cinética de reacción del reticulante en el procedimiento de formación de microcápsulas. Para ello se necesita conocer la concentración en el tiempo del reticulante que va reaccionando, así pues, se fueron cogiendo muestras del reactor cada cierto tiempo. En estudios realizados con anterioridad, se fijaba el tiempo de reacción de las micrócapsulas en hora y media, por este motivo durante esa primera hora y media de reacción las muestras se sacaban en intervalos de 20 minutos. Finalmente se sacaba una última muestra a la que se denomina muestra en tiempo infinito, que se extraía al día siguiente. Inmediatamente después de sacar la muestra se leía su absorbancia con el ultravioleta, para ello se tenía que diluir previamente, ya que así entraba dentro de los parámetros de absorbancia leídos por el aparato. Una vez con los resultados de la absorbancia experimental y sabiendo la dilución realizada a cada muestra se podía obtener la absorbancia real de cada muestra. Estudio de los mecanismos de reticulación en la obtención de microcápsulas de gelatina-goma arábiga 64 Una vez obtenida la absorbancia real de cada muestra y teniendo las rectas de calibrado para cada rango de concentración, se puede pasar de absorbancia real a concentración de una manera sencilla. ( ) Ya se pueden calcular las diferentes concentraciones en el tiempo de reticulante. Los resultados de este reactor se muestran en la siguiente tabla: t (min) Dilución Factor Abs exp Abs real C glut (g/l) 3 1 en 5 5 2,752 13,760 4,691 23 1 en 4 4 2,505 10,020 3,260 43 1 en 4 4 1,747 6,988 2,099 63 1 en 4 4 1,728 6,912 2,070 83 1 en 1 1 2,426 2,426 0,354 103 1 en 1 1 2,257 2,257 0,289 1000 1 en 1 1 1,557 1,557 0,021 Si se representa la absorbancia real en función del tiempo se obtiene una función potencial decreciente. Al saber la concentración de reticulante que hay en el baño, y al multiplicar ésta por los mililítros de agua se obtiene la masa de reticulante que queda en el baño. Para saber que cantidad de reticulante ha sido transferida a las microcápsulas sólo se tiene que restar la masa de éste que queda en el baño a la masa de reticulante que se ha añadido inicialmente. La y = 26,311x-0,425 0 2 4 6 8 10 12 14 16 18 0 200 400 600 800 1000 1200 Absorbancia Tiempo (min) Absorbancia Estudio de los mecanismos de reticulación en la obtención de microcápsulas de gelatina-goma arábiga 65 representación de estas dos gráficas serán complementarias entre sí, la primera será una función polinómica decreciente igual que la gráfica anterior donde se representaba la absorbancia en función del tiempo ya que cuanta menos concentración de reticulante haya la absorbancia será menor. La segunda, en cambio, será una polinómica creciente ya que la cantidad de reticulante en las microcápsulas va aumentando con el tiempo. t (min) M glut(g) baño Mt= Mo-Mglut 3 0,938 0,062 23 0,652 0,348 43 0,420 0,580 63 0,414 0,586 83 0,071 0,929 103 0,058 0,942 1000 0,004 0,996 y = 7,8373x-0,982 0 0,2 0,4 0,6 0,8 1 0 200 400 600 800 1000 1200 Masa (g) Tiempo (min) M glut en el baño Estudio de los mecanismos de reticulación en la obtención de microcápsulas de gelatina-goma arábiga 66 Como ya se ha comentado en el apartado donde se trataba de manera teórica la difusividad, para una partícula esférica isotérmica sometida a un cambio en la concentración del sorbato en la superficie externa en el tiempo cero , la aproximación al equilibrio , en condiciones de control de la difusión , viene dada por la siguiente ecuación: ∑ ( ) Se pueden diferenciar dos ecuaciones distintas para los tiempos cortos y los tiempos largos, pero sólo se utilizará la primera. - Tiempos cortos: Si se construye una gráfica donde se represente ∞ en función de √ se obtiene una gráfica creciente de forma logarítmica. Esto se debe a que la ecuación tiene la forma de recta lineal, por tanto se ha despejado t de los otros factores, obteniendo como Y y por otra parte √ como X. y = 0,1797ln(x) - 0,0867 0 0,2 0,4 0,6 0,8 1 1,2 1,4 0 200 400 600 800 1000 1200 Masa (g) Tiempo (min) M glut en las microcápsulas 𝑀𝑡 𝑀∞ = 6 𝑅· 𝐷𝑡 𝜋 Estudio de los mecanismos de reticulación en la obtención de microcápsulas de gelatina-goma arábiga 67 t (min) Mt/M∞ t^1/2 3 0,062 1,732 23 0,350 4,796 43 0,583 6,557 63 0,588 7,937 83 0,933 9,110 103 0,946 10,149 1000 1,000 31,623 Se considerará la primera parte de la reacción que tiene forma de recta lineal, en este caso, los seis primeros puntos de la gráfica anterior. Si se representan estos puntos se puede obtener una ecuación para la recta lineal que se busca. En este caso la ecuación es la siguiente: y = 0,361ln(x) - 0,087 0 0,2 0,4 0,6 0,8 1 1,2 1,4 0 5 10 15 20 25 30 35 Mt/Minfi t^1/2 Mt/Minfinito Estudio de los mecanismos de reticulación en la obtención de microcápsulas de gelatina-goma arábiga 68 La ecuación de la recta representada anteriomente equivale a la ecuación de los tiempos cortos, así pues, se puede hayar la pendiente de ésta, que corresopnde al factor : ∞ · √ Recordando la ecuación de la recta anterior se puede substituir el valor de la pendiente y así hayar el coeficiente de difusión. Para realizar este cálculo se necesita saber el radio medio de las microcápsulas tratatas, este dato se consigue mediante el programa jimage. En este caso el radio medio de las micrócapsulas obtenidos ha sido: Con todos estos datos se puede proceder a la realización del cálculo del coefeciente de difusión. { 6  6 √ √ 6 y = 0,0892x 0 0,1 0,2 0,3 0,4 0,5 0,6 0,7 0,8 0,9 1 0 2 4 6 8 10 12 Mt/Minfi t^1/2 Mt/Minfinito recta lineal R ( ) 11,29 Estudio de los mecanismos de reticulación en la obtención de microcápsulas de gelatina-goma arábiga 69 El método de cálculo es el mismo para los demás reactores de glutaraldehído. - Reactor con 4 gramos de glutaraldehído en 200 ml de agua. t (min) Dilución Factor Abs exp Abs real C glut (g/l) 3 1 en 5 5 1,897 9,485 19,288 23 1 en 5 5 1,793 8,965 14,332 43 1 en 4 4 1,983 7,932 10,315 63 1 en 2 2 2,937 5,874 10,214 83 1 en 2 2 2,863 5,726 4,270 103 1 en 2 2 2,245 4,490 4,046 1000 1 en 1 1 2,703 2,703 3,119 y = 12,807x-0,177 0 2 4 6 8 10 12 14 0 200 400 600 800 1000 1200 Absorbancia Tiempo (min) Absorbancia Estudio de los mecanismos de reticulación en la obtención de microcápsulas de gelatina-goma arábiga 76 t (min) M glut(g) baño Mt= Mo- Mglut 3 9,540 0,460 23 7,093 2,907 43 5,342 4,658 63 5,519 4,481 83 4,090 5,910 103 3,493 6,507 1000 0,855 9,145 y = 22,521x-0,416 0 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 0 200 400 600 800 1000 1200 Masa (g) Tiempo (min) M glut en el baño y = 1,5536ln(x) - 1,3696 0 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 0 200 400 600 800 1000 1200 Masa (g) Tiempo (min) M glut en las microcápsulas Estudio de los mecanismos de reticulación en la obtención de microcápsulas de gelatina-goma arábiga 77 t (min) Mt/M∞ t^1/2 3 0,050 1,732 23 0,318 4,796 43 0,509 6,557 63 0,490 7,937 83 0,646 9,110 103 0,712 10,149 1000 1,000 31,623 0 0,2 0,4 0,6 0,8 1 1,2 0 5 10 15 20 25 30 35 Mt/Minfi t^1/2 Mt/Minfi y = 0,069x 0 0,1 0,2 0,3 0,4 0,5 0,6 0,7 0,8 0 2 4 6 8 10 12 Mt/Minfi t^1/2 Mt/Minfi R ( ) 12,59 Estudio de los mecanismos de reticulación en la obtención de microcápsulas de gelatina-goma arábiga 78 Con todos estos datos se puede proceder a la realización del cálculo del coeficiente de difusión. { 6  6 √ √ 6 - Reactor con 15 gramos de glutaraldehído en 200 ml de agua. t (min) Dilución Factor Abs exp Abs real C glut (g/l) 3 1 en 5 5 4,039 20,195 74,088 23 1 en 5 5 2,496 12,48 52,195 43 1 en 4 4 1,765 7,06 36,815 63 1 en 4 4 1,536 6,144 34,216 83 1 en 3 3 1,772 5,316 31,866 103 1 en 2 2 2,171 4,342 29,102 1000 1 en 1 1 2,356 2,356 23,467 y = 32,31x-0,393 0 5 10 15 20 25 0 200 400 600 800 1000 1200 Absorbancia Tiempo (min) Absorbancia Estudio de los mecanismos de reticulación en la obtención de microcápsulas de gelatina-goma arábiga 79 t (min) M glut(g) baño Mt= Mo- Mglut 3 14,818 0,182 23 10,439 4,561 43 7,363 7,637 63 6,843 8,157 83 6,373 8,627 103 5,820 9,180 1000 4,693 10,307 y = 32,31x-0,393 0 2 4 6 8 10 12 14 0 200 400 600 800 1000 1200 Absorbancia Tiempo (min) M glut en el baño y = 1,8379ln(x) - 0,4278 0 2 4 6 8 10 12 14 0 200 400 600 800 1000 1200 Masa (g) Tiempo (min) M glut en las microcápsulas Estudio de los mecanismos de reticulación en la obtención de microcápsulas de gelatina-goma arábiga 80 t (min) Mt/M∞ t^1/2 3 0,018 1,732 23 0,443 4,796 43 0,741 6,557 63 0,791 7,937 83 0,837 9,110 103 0,891 10,149 1000 1,000 31,623 y = 0,3566ln(x) - 0,0415 0 0,2 0,4 0,6 0,8 1 1,2 1,4 0 5 10 15 20 25 30 35 Mt/Minfi t^1/2 Mt/Minfi y = 0,0942x 0 0,2 0,4 0,6 0,8 1 1,2 0 2 4 6 8 10 12 Mt/Minfi t^1/2 Mt/Minfi R ( ) 11,5 Estudio de los mecanismos de reticulación en la obtención de microcápsulas de gelatina-goma arábiga 81 Con todos estos datos se puede proceder a la realización del cálculo del coeficiente de difusión. { 6  6 √ √ 6 Estudio de los mecanismos de reticulación en la obtención de microcápsulas de gelatina-goma arábiga 82 11.3.4. Transglutaminasa El procedimiento en el caso de usar la transglutaminasa como reticulante es también igual al explicado anteriormente con el glutaraldehído. - Reactor con 1 gramos de transglutaminasa t (min) Dilución Factor Abs exp Abs real C tg (g/l) 1 1 en 5 5 2,357 11,785 4,932 21 1 en 5 5 1,955 9,775 4,062 41 1 en 4 4 2,304 9,216 3,820 61 1 en 4 4 2,111 8,444 3,486 81 1 en 3 3 1,683 5,049 2,017 101 1 en 2 2 2,262 4,524 1,789 1000 1 en 2 2 3,145 6,29 2,554 Al obtener los resultados para la absorbancia en el tiempo de la transglutaminasa y representarlos se observa que la tendencia de la absorbancia es ir decreciendo, como ya hemos visto en el caso del glutaraldehído. En cambio en el tiempo infinito en vez de tener un valor menor que el anterior, ese valor es más elevado. La razón por la cuál sucede esto se comentará en el apartado donde se discuten los resultados obtenidos. Para poder analizar los resultados se ha considerado que el valor de la absorbancia en el infinito será igual al valor mínimo obtenido, que en este caso es el correspondiente al minuto 101. 0 2 4 6 8 10 12 14 0 200 400 600 800 1000 1200 Absorbancia Tiempo (min) Absorbancia Estudio de los mecanismos de reticulación en la obtención de microcápsulas de gelatina-goma arábiga 83 Así pues la gráfica que relaciona la absorbancia con la concentración de translugtaminasa queda de la siguiente forma: t (min) Dilución Factor Abs exp Abs real C tg (g/l) 1 1 en 5 5 2,357 11,785 4,932 21 1 en 5 5 1,955 9,775 4,062 41 1 en 4 4 2,304 9,216 3,820 61 1 en 4 4 2,111 8,444 3,486 81 1 en 3 3 1,683 5,049 2,017 101 1 en 2 2 2,262 4,524 1,789 1000 1 en 2 2 2,262 4,524 1,789 y = 13,094x-0,159 0 2 4 6 8 10 12 14 0 200 400 600 800 1000 1200 Absorbancia Tiempo (min) Absorbancia Estudio de los mecanismos de reticulación en la obtención de microcápsulas de gelatina-goma arábiga 84 Todos los siguientes resultados se han obtenido a partir de esta modificación. t (min) M tg(g) baño Mt= Mo-Mtg 1 0,986 0,014 21 0,812 0,188 41 0,764 0,236 61 0,697 0,303 81 0,403 0,597 101 0,358 0,642 1000 0,358 0,642 y = 1,1058x-0,169 0 0,2 0,4 0,6 0,8 1 0 200 400 600 800 1000 1200 Masa (g) Tiempo (min) M tg en el baño 0 0,2 0,4 0,6 0,8 0 200 400 600 800 1000 1200 Masa (g) Tiempo (min) M tg en las microcápsulas Estudio de los mecanismos de reticulación en la obtención de microcápsulas de gelatina-goma arábiga 85 t (min) Mt/M∞ t^1/2 (s) 1 0,021 1,000 21 0,292 4,583 41 0,367 6,403 61 0,472 7,810 81 0,929 9,000 101 1,000 10,050 1000 1,000 31,623 R ( ) 11,85 0 0,2 0,4 0,6 0,8 1 1,2 0 5 10 15 20 25 30 35 Mt/Minfi t^1/2 Mt/Minfinito y = 0,044x 0 0,2 0,4 0,6 0,8 1 1,2 1,4 1,6 0 5 10 15 20 25 30 35 Mt/Minfi t^1/2 Mt/Minfinito recta lineal Estudio de los mecanismos de reticulación en la obtención de microcápsulas de gelatina-goma arábiga 92 t (min) M tg(g) baño Mt= Mo-Mtg 3 6,531 0,469 23 5,460 1,540 43 2,977 4,023 63 2,472 4,528 83 2,213 4,787 103 2,076 4,924 1000 2,076 4,924 y = 17,457x-0,237 0 1 2 3 4 5 6 7 0 200 400 600 800 1000 1200 Masa (g) Tiempo (min) M tg en el baño y = 0,8801ln(x) + 0,0666 0 1 2 3 4 5 6 7 0 200 400 600 800 1000 1200 Masa (g) Tiempo (min) M tg en las microcápsulas Estudio de los mecanismos de reticulación en la obtención de microcápsulas de gelatina-goma arábiga 93 t (min) Mt/M∞ t^1/2 (s) 3 0,0953 1,732 23 0,3128 4,796 43 0,8171 6,557 63 0,9197 7,937 83 0,9723 9,110 103 1,0000 10,149 1000 1,0000 31,623 R ( ) 11,55 y = 0,3575ln(x) + 0,0135 0 0,2 0,4 0,6 0,8 1 1,2 1,4 0 5 10 15 20 25 30 35 Mt/Minfi t^1/2 Mt/Minfi y = 0,1048x 0,0000 0,2000 0,4000 0,6000 0,8000 1,0000 1,2000 0,000 2,000 4,000 6,000 8,000 10,000 12,000 Mt/Minfi t^1/2 Mt/Minfi Estudio de los mecanismos de reticulación en la obtención de microcápsulas de gelatina-goma arábiga 94 Con todos estos datos se puede proceder a la realización del cálculo del coeficiente de difusión. { 6  6 √ √ 6 - Reactor con 10 gramos de transglutaminasa t (min) Dilución Factor Abs exp Abs real C tg (g/l) 3 1 en 7 7 2,218 15,526 49,912 23 1 en 5 5 2,931 14,655 46,505 43 1 en 5 5 2,752 13,76 43,003 63 1 en 5 5 2,144 10,72 31,110 83 1 en 4 4 2,553 10,212 29,122 103 1 en 4 4 1,952 7,808 19,717 1000 1 en 4 4 2,901 11,604 34,568 y = 16,008x-0,077 0 2 4 6 8 10 12 14 16 18 0 200 400 600 800 1000 1200 Absorbancia Tiempo (min) Absorbancia Estudio de los mecanismos de reticulación en la obtención de microcápsulas de gelatina-goma arábiga 95 Aplicando la modificación: t (min) Dilución Factor Abs exp Abs real C tg (g/l) 3 1 en 7 7 2,218 15,526 49,912 23 1 en 5 5 2,931 14,655 46,505 43 1 en 5 5 2,752 13,76 43,003 63 1 en 5 5 2,144 10,72 31,110 83 1 en 4 4 2,553 10,212 29,122 103 1 en 4 4 1,952 7,808 19,717 1000 1 en 4 4 1,952 7,808 19,717 y = 19,459x-0,14 0 2 4 6 8 10 12 14 16 18 0 200 400 600 800 1000 1200 Absorbancia Tiempo (min) Absorbancia Estudio de los mecanismos de reticulación en la obtención de microcápsulas de gelatina-goma arábiga 96 t (min) M tg(g) baño Mt= Mo-Mtg 3 9,982 0,018 23 9,301 0,699 43 8,601 1,399 63 6,222 3,778 83 5,824 4,176 103 3,943 6,057 1000 3,943 6,057 y = 13,678x-0,188 0 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 0 200 400 600 800 1000 1200 Masa (g) Tiempo (min) M tg en el baño y = 1,2279ln(x) - 1,7601 0 1 2 3 4 5 6 7 8 0 200 400 600 800 1000 1200 Masa (g) Tiempo (min) M tg en las microcápsulas Estudio de los mecanismos de reticulación en la obtención de microcápsulas de gelatina-goma arábiga 97 t (min) Mt/M∞ t^1/2 (s) 3 0,0029 1,732 23 0,1154 4,796 43 0,2310 6,557 63 0,6238 7,937 83 0,6894 9,110 103 1,0000 10,149 1000 1,0000 31,623 R ( ) 19,12 y = 0,4055ln(x) - 0,2906 0 0,2 0,4 0,6 0,8 1 1,2 0 5 10 15 20 25 30 35 Mt/Minfi t^1/2 Mt/Minfi y = 0,0738x 0 0,2 0,4 0,6 0,8 1 1,2 0 2 4 6 8 10 12 Mt/Minfi t^1/2 Mt/Minfi Estudio de los mecanismos de reticulación en la obtención de microcápsulas de gelatina-goma arábiga 98 Con todos estos datos se puede proceder a la realización del cálculo del coeficiente de difusión. { 6  6 √ √ 6 - Reactor con 15 gramos de transglutaminasa t (min) Dilución Factor Abs exp Abs real C tg (g/l) 3 1 en 5 5 2,327 11,635 73,504 23 1 en 5 5 2,004 10,02 68,341 43 1 en 4 4 2,279 9,116 63,036 63 1 en 4 4 2,007 8,028 45,016 83 1 en 4 4 1,144 4,576 42,005 103 1 en 3 3 1,523 4,569 27,755 1000 1 en 2 2 3,738 7,476 50,256 y = 32,31x-0,393 0 2 4 6 8 10 12 14 0 200 400 600 800 1000 1200 Absorbancia Tiempo (min) Absorbancia Estudio de los mecanismos de reticulación en la obtención de microcápsulas de gelatina-goma arábiga 99 Aplicando la modificación: t (min) Dilución Factor Abs exp Abs real C tg (g/l) 3 1 en 5 5 2,327 11,635 73,504 23 1 en 5 5 2,004 10,02 68,341 43 1 en 4 4 2,279 9,116 63,036 63 1 en 4 4 2,007 8,028 45,016 83 1 en 4 4 1,144 4,576 42,005 103 1 en 3 3 1,523 4,569 27,755 1000 1 en 3 3 1,523 4,569 27,755 y = 32,31x-0,393 0 2 4 6 8 10 12 14 0 200 400 600 800 1000 1200 Absorbancia Tiempo (min) Absorbancia Estudio de los mecanismos de reticulación en la obtención de microcápsulas de gelatina-goma arábiga 100 t (min) M tg(g) baño Mt= Mo-Mtg 3 14,701 0,299 23 13,668 1,332 43 12,607 2,393 63 9,003 5,997 83 8,401 6,599 103 5,551 9,449 1000 5,551 9,449 y = 32,31x-0,393 0 2 4 6 8 10 12 14 16 0 200 400 600 800 1000 1200 Absorbancia Tiempo (min) M tg en el baño y = 1,8604ln(x) - 2,3942 0 2 4 6 8 10 12 0 200 400 600 800 1000 1200 Masa (g) Tiempo (min) M tg en las microcápsulas Estudio de los mecanismos de reticulación en la obtención de microcápsulas de gelatina-goma arábiga 101 t (min) Mt/M∞ t^1/2 (s) 3 0,0317 1,732 23 0,1409 4,796 43 0,2532 6,557 63 0,6346 7,937 83 0,6984 9,110 103 1,0000 10,149 1000 1,0000 31,623 R ( ) 12,44 y = 0,3938ln(x) - 0,2534 -0,2 0 0,2 0,4 0,6 0,8 1 1,2 0 5 10 15 20 25 30 35 Mt/Minfi t^1/2 Mt/Minfi y = 0,0753x 0,0000 0,2000 0,4000 0,6000 0,8000 1,0000 1,2000 0,000 2,000 4,000 6,000 8,000 10,000 12,000 Mt/Minfi t^1/2 Mt/Minfi Estudio de los mecanismos de reticulación en la obtención de microcápsulas de gelatina-goma arábiga 108 t (min) At=Ao- Afor t^1/2 (s) 3 - 1,732 23 2,676 4,796 43 4,536 6,557 63 4,956 7,937 83 5,186 9,110 103 7,050 10,149 1000 7,575 31,623 0 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 0 200 400 600 800 1000 1200 Absorbancia t^1/2 (min) Absorbancia micrócapsulas Estudio de los mecanismos de reticulación en la obtención de microcápsulas de gelatina-goma arábiga 109 t (min) At/A∞ t^1/2 (s) 3 0 1,732 23 0,353 4,796 43 0,599 6,557 63 0,654 7,937 83 0,685 9,110 103 0,931 10,149 1000 1,000 31,623 0 0,2 0,4 0,6 0,8 1 1,2 0 5 10 15 20 25 30 35 At/Ainfinito t^1/2 (min) At/Ainfinito y = 0,0833x 0 0,1 0,2 0,3 0,4 0,5 0,6 0,7 0,8 0,9 1 0 2 4 6 8 10 12 At/Ainfinito t^1/2 (min) At/Ainfinito R ( ) 13,05 Estudio de los mecanismos de reticulación en la obtención de microcápsulas de gelatina-goma arábiga 110 Con todos estos datos se puede proceder a la realización del cálculo del coefeciente de difusión. { 6  6 √ √ 6 - Reactor con 7 gramos de formaldehído t (min) Dilución Factor Abs exp Abs real 3 1 en 5 5 2,678 13,39 23 1 en 4 4 2,251 9,004 43 1 en 4 4 1,759 7,036 63 1 en 3 3 2,211 6,633 83 1 en 2 2 2,217 4,434 103 1 en 2 2 1,758 3,516 1000 1 en 1 1 3,011 3,011 y = 18,539x-0,283 0 2 4 6 8 10 12 14 16 0 200 400 600 800 1000 1200 Absorbancia Tiempo (min) Absorbancia Estudio de los mecanismos de reticulación en la obtención de microcápsulas de gelatina-goma arábiga 111 t (min) At=Ao- Afor t^1/2 (s) 3 - 1,732 23 4,386 4,796 43 6,354 6,557 63 6,757 7,937 83 8,956 9,110 103 9,874 10,149 1000 10,379 31,623 0 2 4 6 8 10 12 14 0 200 400 600 800 1000 1200 Absorbancia t^1/2 (min) Absorbancia micrócapsulas Estudio de los mecanismos de reticulación en la obtención de microcápsulas de gelatina-goma arábiga 112 t (min) At/A∞ t^1/2 (s) 3 0 1,732 23 0,423 4,796 43 0,612 6,557 63 0,651 7,937 83 0,863 9,110 103 0,951 10,149 1000 1,000 31,623 0 0,2 0,4 0,6 0,8 1 1,2 1,4 0 5 10 15 20 25 30 35 At/Ainfinito t^1/2 (min) At/Ainfinito y = 0,0903x 0 0,1 0,2 0,3 0,4 0,5 0,6 0,7 0,8 0,9 1 0 2 4 6 8 10 12 At/Ainfinito t^1/2 (min) At/Ainfinito R ( ) 10,95 Estudio de los mecanismos de reticulación en la obtención de microcápsulas de gelatina-goma arábiga 113 Con todos estos datos se puede proceder a la realización del cálculo del coefeciente de difusión. { 6  0,0903 6 √ √ 6 - Reactor con 10 gramos de formaldehído t (min) Dilución Factor Abs exp Abs real 3 1 en 5 5 2,151 10,755 23 1 en 4 4 2,156 8,624 43 1 en 3 3 2,147 6,441 63 1 en 3 3 1,811 5,433 83 1 en 2 2 2,151 4,302 103 1 en 2 2 1,704 3,408 1000 1 en 1 1 3,137 3,137 y = 14,459x-0,241 0 2 4 6 8 10 12 0 200 400 600 800 1000 1200 Absorbancia Tiempo (min) Absorbancia Estudio de los mecanismos de reticulación en la obtención de microcápsulas de gelatina-goma arábiga 114 t (min) At=Ao- Afor t^1/2 (s) 3 - 1,732 23 2,131 4,796 43 4,314 6,557 63 5,322 7,937 83 6,453 9,110 103 7,347 10,149 1000 7,618 31,623 0 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 0 200 400 600 800 1000 1200 Absorbancia t^1/2 (min) Absorbancia micrócapsulas Estudio de los mecanismos de reticulación en la obtención de microcápsulas de gelatina-goma arábiga 115 t (min) At/A∞ t^1/2 (s) 3 0 1,732 23 0,280 4,796 43 0,566 6,557 63 0,699 7,937 83 0,847 9,110 103 0,964 10,149 1000 1,000 31,623 0 0,2 0,4 0,6 0,8 1 1,2 1,4 0 5 10 15 20 25 30 35 At/Ainfinito t^1/2 (min) At/Ainfinito y = 0,0884x 0 0,2 0,4 0,6 0,8 1 1,2 0 2 4 6 8 10 12 At/Ainfinito t^1/2 (min) At/Ainfinito R ( ) 13,20 Estudio de los mecanismos de reticulación en la obtención de microcápsulas de gelatina-goma arábiga 116 Con todos estos datos se puede proceder a la realización del cálculo del coefeciente de difusión. { 6  6 √ √ 6 - Reactor con 15 gramos de formaldehído t (min) Dilución Factor Abs exp Abs real 3 1 en 5 5 1,682 8,41 23 1 en 5 4 1,816 7,264 43 1 en 4 4 1,578 6,312 63 1 en 3 3 2,139 6,417 83 1 en 3 3 1,964 5,892 103 1 en 2 3 1,118 3,354 1000 1 en 2 1 3,127 3,127 y = 11,641x-0,187 0 1 2 3 4 5 6 7 8 9 0 200 400 600 800 1000 1200 Absorbancia Tiempo (min) Absorbancia Estudio de los mecanismos de reticulación en la obtención de microcápsulas de gelatina-goma arábiga 117 t (min) At=Ao- Afor t^1/2 (s) 3 - 1,732 23 1,146 4,796 43 2,098 6,557 63 1,993 7,937 83 2,518 9,110 103 5,056 10,149 1000 5,283 31,623 0 1 2 3 4 5 6 0 200 400 600 800 1000 1200 Absorbancia t^1/2 (min) Absorbancia micrócapsulas Estudio de los mecanismos de reticulación en la obtención de microcápsulas de gelatina-goma arábiga 124 - Reactor 7 gramos Añadiendo 7 gramos de reticulante se forman microcápsulas de tamaño similar pero poca cantidad de estas. Forma regular. - Reactor 10 gramos Con 10 gramos de translglutaminasa se forman bastantes micrócapsulas, y a pesar de que también hay una diferencia elevada entre las microcápsulas más pequeñas y las más grandes, la mayoría de estas tienen un tamaño similar. La mayoría tiene forma esférica y hay material sin reaccionar. Estudio de los mecanismos de reticulación en la obtención de microcápsulas de gelatina-goma arábiga 125 - Reactor 15 gramos En el último caso se forman muy pocas microcápsulas, dispersas entre ellas y además con un tamaño bastante irregular, aunque en la forma son bastante parecidas. Estudio de los mecanismos de reticulación en la obtención de microcápsulas de gelatina-goma arábiga 126 11.4.3. Formaldehído - Reactor 1 gramo La mayoría de microcápsulas formadas tienen una forma regular, a pesar de esto hay algunas más alargadas. Se ha formado una cantidad notable y el tamaño de estas es similar. - Reactor 4 gramos Los resultados obtenidos son iguales que anteriormente, tamaño regular, forma esférica a pesar de algunas que son más alargadas y cantidad de microcápsulas formadas considerable. Estudio de los mecanismos de reticulación en la obtención de microcápsulas de gelatina-goma arábiga 127 - Reactor 7 gramos En el reactor al que se añadió 7 gramos de formaldehído se pueden sacar las mismas conclusiones que en los dos anteriores. - Reactor 10 gramos En este caso se observa una formación mucho mayor que en los reactores anteriores, exceptuando algunos casos, la forma es esférica y regular y el tamaño de las microcápsulas es prácticamente idéntico. Estudio de los mecanismos de reticulación en la obtención de microcápsulas de gelatina-goma arábiga 128 - Reactor 15 gramos En el último caso se obtienen los mismos resultados que en el reactor que contiene 10 gramos de formaldehído, es decir, una gran cantidad de microcápsulas formadas con una distribución de tamaño y forma regular. Estudio de los mecanismos de reticulación en la obtención de microcápsulas de gelatina-goma arábiga 129 12. DISCUSIÓN DE LOS RESULTADOS EXPERIMENTALES 12.1. Absorbancia y cinética de reticulación 12.1.1. Glutaraldehído Observando los resultados obtenidos se puede concluir que, en todos los casos estudiados, la absorbancia va disminuyendo en el tiempo y que el último valor en el infinito, que correspondería al tiempo en el cual la reacción ya ha finalizado, es el valor más bajo de absorbancia. Con el glutaraldehído como reticulante se observa que la diferencia de absorbancias entre muestras consecutivas no es constante durante todo el período de tiempo estudiado. En casi todos los casos se ve como en las primeras muestras tomadas la cantidad de absorbancia se disminuye de forma mucho más elevada que en las siguientes, donde la cantidad de absorbancia entre muestras consecutivas es mucho menor y se vuelve más constante. El caso del reactor que contiene 4 gramos es en el que hay más diferencia ya que las tres primeras muestras son constantes, de la 3 a la 4 se produce una reducción mayor de absorbancia y después vuelve a ser constante. El glutaraldehído debe ir disminuyendo su concentración en el tiempo ya que va reaccionando con el sistema, esto se cumple en todos los casos ya que la absorbancia cada vez es menor. Si representamos en un gráfico los valores de las muestras que corresponden a la primera hora y media de la reacción, se obtiene una ecuación de la recta de la cual se pude analizar la velocidad de absorción del reticulante mediante la pendiente de ésta. Los resultados obtenidos son los siguientes: y = -0,0732x + 11,866 0 2 4 6 8 10 12 14 020 40 60 80 100 120 Absorbancia t Tiempo (min) 1 gramo Estudio de los mecanismos de reticulación en la obtención de microcápsulas de gelatina-goma arábiga 130 y = -0,1086x + 16,86 0 2 4 6 8 10 12 14 16 18 020 40 60 80 100 120 Absorbancia t Tiempo (min) 4 gramos y = -0,0818+12,433 0 2 4 6 8 10 12 14 010 20 30 40 50 60 70 Absrobancia t Tiempo (min) 7 gramos Estudio de los mecanismos de reticulación en la obtención de microcápsulas de gelatina-goma arábiga 131 Cantidad Pendiente 1 gramo -0,0732 4 gramos -0,1086 7 gramos -0,0818 10 gramos -0,0785 15 gramos -0,0754 No sigue una evolución constante ya que aumenta y disminuye dependiendo de los gramos de reticulante que hay en el reactor. En el reactor de 4 gramos se obtiene la recta más pequeña, por tanto la rapidez de absorción menor. A partir de este punto la rapidez aumenta y se mantiene constante. y = -0,0785x + 16,275 0 2 4 6 8 10 12 14 16 18 020 40 60 80 100 120 Absorbancia t Tiempo (min) 10 gramos y = -0,0754x + 11,985 0 2 4 6 8 10 12 14 020 40 60 80 100 120 Absorbancia Tiempo (min) 15 gramos Estudio de los mecanismos de reticulación en la obtención de microcápsulas de gelatina-goma arábiga 132 12.1.2. Transglutaminasa Observando los resultados obtenidos con las diferentes concentraciones de transglutaminasa se puede concluir que, en todos los casos estudiados, la absorbancia va disminuyendo en el tiempo a lo largo de la primera hora y media, que es cuando se produce la mayor parte de la reticulación del polímero gracias a la transglutaminasa. En cambio, la absorbancia medida en un tiempo infinito (se dejó el reactor hasta el día siguiente) no es inferior a la última muestra sacada en el día anterior, sino que es superior. El valor en el infinito, siempre es superior al valor de la quinta y sexta muestra, siendo en algunos mayor incluso que el de la cuarta muestra obtenida. Este resultado no debería ser lógico ya que la absorbancia representa la concentración de transglutaminasa que queda en el baño a medida que se produce la reacción, por tanto cada vez debería ir disminuyendo y en el tiempo infinito tener el valor más bajo. Pero como ya se ha comentado anteriormente la transglutaminasa es una enzima que actúa como catalizador de la reacción (a pesar de que a la hora de realizar los cálculos no la hemos considerado así), por tanto no reacciona de forma activa en esta. Es decir que cuando la microcápsula no admite más transglutaminasa esta se desabsorbe y vuelve al baño, por eso se obtiene un valor en la concentración de reticulante que queda en el baño superior. Al igual que en el caso anterior, representamos en un gráfico los valores de absorbancia para la primera hora y media de reacción, y se obtienen los siguientes resultados: y = -0,1148x + 13,146 0 2 4 6 8 10 12 14 16 020 40 60 80 100 120 Absorbancia Tiempo (min) 1 gramo Estudio de los mecanismos de reticulación en la obtención de microcápsulas de gelatina-goma arábiga 133 y = -0,0525x + 9,8612 0 2 4 6 8 10 12 020 40 60 80 100 120 Absorbancia Tiempo (min) 4 gramos y = -0,0715x + 11,695 0 2 4 6 8 10 12 14 020 40 60 80 100 120 Absrobancia Tiempo (min) 7 gramos y = -0,062x + 13,497 0 2 4 6 8 10 12 14 16 020 40 60 80 100 120 Absorbancia Tiempo (min) 10 gramos Estudio de los mecanismos de reticulación en la obtención de microcápsulas de gelatina-goma arábiga 140 12.2. Tamaño de las microcápsulas 12.2.1. Glutaraldehído Los resultados adquiridos de la distribución del tamaño de las microcápsulas usando diferentes concentraciones de glutaraldehído como reticulante están recogidos en la siguiente tabla: Las microcápsulas con un tamaño mayor se obtienen en el reactor que contiene 10 gramos de reticulante, y las más pequeñas en el de 7 gramos aunque la diferencia de tamaños es prácticamente nula ya que todas las microcápsulas obtenidas están en un rango de entre 11 y 12,5 m. Al realizar el radio medio de los 5 reactores se obtiene un valor final de 11,55 ( m). 12.2.2. Transglutaminasa Para el caso de la transglutaminasa los resultados son estos: Las microcápsulas con un tamaño mayor se obtienen en el reactor que contiene 10 gramos de reticulante, y las más pequeñas en el de 4 gramos aunque. En este caso hay una diferencia más elevada entre los extremos del rango ya que este oscila entre tamaños de 10,5 y 19,12. A pesar de esta diferencia sólo es un reactor, el de 10 gramos, el que se aleja más de la media ya que los otros 4 tienen un radio medio muy aproximado entre sí. Al realizar el radio medio de los 5 reactores se obtiene un valor final de 13,14 ( m). Cantidad Rm ( m) 1 gramo 11,29 4 gramos 11,46 7 gramos 10,94 10 gramos 12,59 15 gramos 11,50 Cantidad Rm ( m) 1 gramo 11,85 4 gramos 10,64 7 gramos 11,55 10 gramos 19,12 15 gramos 12,44 Estudio de los mecanismos de reticulación en la obtención de microcápsulas de gelatina-goma arábiga 141 12.2.3. Formaldehído Con formaldehído como reticulante la distribución de tamaño queda de la siguiente manera: Las microcápsulas con un tamaño mayor se obtienen en el reactor que contiene 10 gramos de reticulante, y las más pequeñas en el de 15 gramos. Aquí también se aprecia una diferencia un poco más elevada entre los extremos del rango ya que este oscila entre tamaños de 9,17 y 13,20. Los reactores de 1 gramo y de 7 gramos tienen un valor de radio medio de las microcápsulas prácticamente igual y lo mismo sucede con los reactores de 4 y 10 gramos, mientras que el reactor de 15 gramos se aleja un poco más pero aún así tiene un valor muy parecido a los de 4 y 10 gramos. Al realizar el radio medio de los 5 reactores se obtiene un valor final de 11,41 ( m). 12.2.4. General Analizando los resultados de forma general, se concluye que el glutarladehído y el formaldehído dan unos valores de tamaño de microcápsula muy similares, aunque el formaldehído es el reticulante con el cuál, dependiendo de su concentración, se obtiene el radio medio más bajo. Con la transglutaminasa, en cambio, se consigue un valor medio mayor y no tan igual que con los otros dos casos aunque la diferencia sigue siendo pequeña, solo incrementa en 2 μm. El radio máximo alcanzado es de 19,12 μm y pertenece también a las microcápsulas realizadas con transglutaminasa. Cantidad Rm ( m) 1 gramo 10,71 4 gramos 13,05 7 gramos 10,95 10 gramos 13,20 15 gramos 9,17 Glutaraldehído Transglutaminasa Formaldehído Rm ( m) 11,55 13,14 11,41 Rmáx( m) 11,29 19,12 13,20 Rmín ( m) 10,94 10,64 9,17 Estudio de los mecanismos de reticulación en la obtención de microcápsulas de gelatina-goma arábiga 142 12.3. Coeficiente de difusión 12.3.1. Glutaraldehído El coeficiente de difusión es prácticamente igual para todas las diferentes concentraciones de glutaraldehído, así que en todos los caos la rapidez de absorbancia es muy similar. 12.3.2. Transglutaminasa En el caso de la transglutaminasa, los valores de las diferentes concentraciones también son prácticamente iguales ya que a pesar de que en este caso el rango es más amplio (1,37-3,69) todos los valores están elevados a cosa que hace que esa diferencia en los decimales no sea muy significativa. 12.3.3. Formaldehído Utilizando el formaldehído como reticulante se concluye de igual forma que en el caso de la transglutaminasa, ya que el rango de valores es un poco más amplio (1,56-3,02) que con el glutaraldehído, donde no hay casi diferencia. A pesar de esto como ya se ha dicho todos los valores están elevados al mismo factor, por tanto esa desigualdad no es significativa. Cantidad D ( /min) 1 gramo 4 gramos 7 gramos 10 gramos 15 gramos Cantidad D ( /min) 1 gramo 4 gramos 7 gramos 10 gramos 15 gramos Cantidad D ( /min) 1 gramo 4 gramos 7 gramos 10 gramos 15 gramos Estudio de los mecanismos de reticulación en la obtención de microcápsulas de gelatina-goma arábiga 143 12.3.4. General Agrupando todos los resultados de los diferentes reticulantes se puede concluir que, como ya se había comentado en la parte teórica de la difusión, el coeficiente de difusión depende de la naturaleza de la partícula que se difunde y del solvente donde es difundido pero no de la concentración de estos. Si se calcula el coeficiente de difusión medio, los valores en los tres casos son iguales, por lo que se puede decir que los diferentes reticulantes en la formación de microcápsulas de gelatina y goma arábiga se difunden de la misma manera. Glutaraldehído Transglutaminasa Formaldehído D ( /min) D ( /min) D ( /min) 1 gramo 4 gramos 7 gramos 10 gramos 15 gramos D medio Estudio de los mecanismos de reticulación en la obtención de microcápsulas de gelatina-goma arábiga 144 13. TGA Bajo la denominación de análisis térmico se engloban un conjunto de técnicas analíticas que estudian el comportamiento térmico de los materiales. Cuando un material se calienta o se enfría, su estructura cristalina y su composición química pueden sufrir cambios más o menos importantes. Así, bajo la denominación de análisis térmico se agrupan una serie de técnicas en las cuales se sigue una propiedad de la muestra, en una determinada atmósfera, en función del tiempo o de la temperatura cuando dicha muestra se somete a un programa de temperatura controlado. Éste puede consistir en calentar o enfriar a una determinada velocidad, o mantener la temperatura constante, o una combinación de ambas. Hay varias técnicas de análisis térmico, en este estudio se utilizará la termogravimetría (TGA). Esta técnica está basada en la medida de la variación de la masa de una muestra cuando se la somete a un cambio de temperatura en una atmósfera controlada. Esta variación puede ser una pérdida o una ganancia de masa. El registro de estos cambios nos dará información sobre si la muestra se descompone o reacciona con otros componentes. La termogravimetría puede utilizarse conjuntamente con otras técnicas, como por ejemplo el DTGA ya que permiten obtener información complementaria sobre el comportamiento térmico de una muestra. Para realizar el TGA las muestras se han filtrado por gravedad y secado en la estufa previamente a 70ºC durante toda la noche, para así minimizar la evaporación del agua al inicio del TGA. El método que se ha utilizado para la realización del TGA consistía en un aumento de 10ºC por minuto hasta los 800 ºC. Ilustración 26: TGA Estudio de los mecanismos de reticulación en la obtención de microcápsulas de gelatina-goma arábiga 145 13.1. Glutaraldehído - 20G: Muestra a los 20 minutos - 40G: Muestra a los 40 minutos - 60G: Muestra a los 60 minutos - Infinito G: Muestra del día siguiente (tiempo infinito) Normalmente la reticulación debería provocar 2 efectos en la gráfica de TGA: - Aumento de la temperatura de degradación. - Incremento de la pendiente cuando se descompone la pared de la microcápsula debido a la liberación casi instantánea de su contenido. En este caso, ninguno de los dos efectos se produce, por tanto se puede concluir que, por un lado la concentración de gluteraldehido y, por el otro, el tiempo de exposición a este y la agitación pueden ser factores que favorecen o perjudican a la encápsulación. Por un lado parece que tiempos largos de exposición permiten al gluterandehido reaccionar, no solo con la pared de una microcápsula sino con dos microcápsulas diferentes. Esto podría llevar a un fenómeno mediante el cual el gluteraldehido provocaría tensiones entre dos paredes rompiendo las dos microcápsulas siendo él el que queda entre dos paredes. Esto, a Estudio de los mecanismos de reticulación en la obtención de microcápsulas de gelatina-goma arábiga 146 primera vista, podría intentar solucionarse con agitación, pero si esta no fue suficiente, en mi opinión, esto podría suceder. En cuanto a la concentración de gluteraldehído, esto podría afectar de la misma manera que el tiempo, obteniendo el mismo efecto comentado pero, a mayor concentración de gluteraldehído, menos tiempo para que se produzca este efecto perjudicial. 13.2. Transglutaminasa - T30/2: Muestra a los 20 minutos - T60: Muestra a los 40 minutos - T90: Muestra a los 60 minutos - Infinito TG: Muestra del día siguiente (tiempo infinito) La reticulación mediante esta encima es muy dependiente de la temperatura y el pH. El óptimo de temperatura es de 50ºC donde en unos 40 minutos se completa la reacción. Si se trabaja a temperaturas inferiores necesitamos un mayor tiempo, en cambio si el ensayo se realiza a 4ºC necesitamos unas 12 horas para que se complete la reacción. Es importante no bajar de 2ºC, ya que la reacción se para (no se inactiva, ya que la inactivación sólo se da por tratamiento térmico). En nuestro caso, la transglutaminasa se añade a unos 10ºC y a un pH 6. Aún siendo el pH de 6 óptimo, una temperatura tan baja hace que la influencia de la encima sea muy baja a tiempos cortos (30 min, 60 min, 90 min) pero latente a tiempos largos (día siguiente). Estudio de los mecanismos de reticulación en la obtención de microcápsulas de gelatina-goma arábiga 147 En los primeros tiempos no hay una estructura reticulada por lo que a (30 min, 60 min y 90) el aceite esencial se va perdiendo por difusión durante todo el rango de temperatura (no hay un efecto protector claro de la microcápsula), esto, queda demostrado porque en ninguna de las 3 curvas (30, 60, 90) hay un cambio de pendiente pronunciado (el que debería aparecer si el aceite se liberará todo al mismo tiempo por la rotura o degradación de una pared rígida). Además, solo hay un pico bien definido en el DTGA, el correspondiente a la curva de 1 día. Una buena definición de pico en la derivada indica un cambio de pendiente claro en la curva de la que proviene o lo que es lo mismo una perdida rápida de peso consecuencia de la liberación rápida del aceite esencial en un corto rango de temperatura. Cuando esto pasa solo puede significar que hasta ese punto la pared de la microcápsula cumplía bien su función protectora del aceite, que no olvidemos, si no estuviera microencapsulado se empezaría a evaporar a 40ºC, más o menos. 13.3. Formaldehído - 20F: Muestra a los 20 minutos - 40F: Muestra a los 40 minutos - 60F: Muestra a los 60 minutos - Infinito F: Muestra del día siguiente (tiempo infinito) Estudio de los mecanismos de reticulación en la obtención de microcápsulas de gelatina-goma arábiga 148 Se observa como la pérdida de peso se va haciendo mayor con el tiempo, es decir, la reticulación de las microcápsulas va aumentando a medida que el tiempo pasa. Este hecho se puede observar si se presta atención a la gráfica del DTGA, en la que, en las tres primeras curvas (20,40,60), se aprecia un pico pronunciado que va creciendo conforme el tiempo de cada muestra, el pico de los 20 minutos es el más pequeño y el de 60 el más grande. Este pico representa la pérdida de peso que se produce debido a la liberación completa del aceite por la rotura o degradación de la pared rígida de la microcápsula. Esto tiene sentido ya indica que la reacción de reticulación se va produciendo conforme con el tiempo, así pues en los primeros momentos de la reacción la pared estará menos reticulada que en los tiempos más avanzados. En cambio en el último caso que corresponde al tiempo infinito se observa como hay un pico mucho más pronunciado y después aparecen otros en gran parte de la curva, en este caso esos picos indican que la reticulación en las microcápsulas formadas ya ha finalizado y que estas se empiezan a degradar. 13.4. General En todos los demás aspectos se han visto comportamientos muy similares entre el formaldehído y el glutaraldehído, en cambio, en las pruebas realizadas mediante el TGA se obtienen claras diferencias. Esto se produce ya que aunque tengan una estructura bastante parecidas el formaldehído sólo tiene un grupo aldehído que reacciona con la gelatina y el glutaraldehído tiene dos. La transglutaminasa, como en todos los demás aspectos estudiados, también ha tenido unos resultados distintos a los otros reticulantes. Estudio de los mecanismos de reticulación en la obtención de microcápsulas de gelatina-goma arábiga 149 14. CONCLUSIONES Después de realizar el estudio completo de los sistemas de reticulación en la formación de microcápsulas de gelatina y goma arábiga utilizando tres reticulantes y diferentes concentraciones de estos se pueden sacar varias conclusiones. En primer lugar cabe destacar que la reacción de reticulación que sigue el proceso es la difusión, ya que se produce un intercambio de materia entre las microcápsulas que se van formando y el reticulante que va reaccionando con estas. Después de obtener los datos experimentales de absorbancia de reticulante en diferentes tiempos y realizar los cálculos se han determinado unos coeficientes de difusión del orden de para los tres reticulantes. Este coeficiente de difusión indica que la transferencia de materia se hace de manera muy rápida. Al comparar los coeficientes de los diferentes reactores que han sido realizados con un mismo reticulante, pero variando la concentración de este, se obtienen valores muy similares, así que se puede concluir que la concentración de reticulante en el reactor es independiente a la velocidad de transferencia másica. Esta conclusión es muy interesante ya que en un principio lo lógico es pensar que cuanta más cantidad de reticulante se añada más rápida sea la reacción de difusión ya que hay más cantidad de materia interaccionando, en cambio con los resultados experimentales se concluye que la difusión con 15 gramos de reticulante es prácticamente igual a la obtenida con tan solo 1 gramo de este. Respecto al comportamiento de los diferentes reticulantes se puede concluir que el glutaraldehído y el formaldehído tienen unas características de reticulación muy parecidas, en cambio la transglutaminasa se comporta de diferente manera. Esto se debe a que el formaldehído y el glutaraldehído provienen de la misma familia química; los aldehídos, por tanto tienen muchas similitudes en su estructura química y su comportamiento frente a un mismo sistema, en este caso frente a las microcápsulas de gelatina y goma arábiga, es prácticamente igual. En cambio la transglutaminasa es una enzima y como ya se ha ido comentando a lo largo del proyecto, esta trabaja como un enzima catalizadora de la reacción, aunque en este estudio no se haya tratado como tal y se haya trabajado bajo la premisa de que sí que se produce reacción con ella. La gran diferencia entre la transglutaminasa y los otros dos reticulantes se encuentra en que al medir la absorbancia en el baño de la última muestra, la que se sacaba un día después, se obtiene una absorbancia más elevada que la muestra anterior. Esto solo sucede en el caso de la transglutaminasa y es debido a que las microcápsulas dejaban de admitir más transglutaminasa y esta se desabsorbia y volvía al baño.