Puesta a punto "In Vivo" de un modelo de aclaramiento mucociliar mediante microCT-SPECT-TC99m con nanocoloides de albumina en cobaya

1 UNIVERSITAT POLITÈCNICA DE VALÈNCIA ESCOLA TÈCNICA SUPERIOR D’ENGINYERIA AGRONÒMICA I DEL MEDI NATURAL PUESTA A PUNTO DE DIFERENTES MODELOS "IN VIVO" DE ACLARAMIENTO MUCOCILIAR MEDIANTE microCT-SPECT UTILIZANDO Tc99m EN COBAYA TRABAJO FIN DE GRADO EN BIOTECNOLOGÍA ALUMNO: MARTÍN PÉREZ LEAL TUTOR: D. PATRICIA ALMUDÉVER FOLCH DIRECTOR DE TRABAJO: D. JAVIER MILARA PAYÁ Curso Académico: 2014-2015 VALENCIA, JULIO DE 2015 2 PUESTA A PUNTO "IN VIVO" DE DIFERENTES MODELOS DE ACLARAMIENTO MUCOCILIAR MEDIANTE microCT-SPECT UTILIZANDO Tc99m EN COBAYA RESUMEN Con este trabajo se pretende poner a punto en el laboratorio un modelo "in vivo" de aclaramiento mucociliar mediante tomografía computerizada de emisión monofotónica (SPECT) en cobaya para su uso en ensayos farmacológicos de nuevos tratamientos para enfermedades respiratorias. Para ello, se utilizarán diferentes métodos para visualizar el aclaramiento mucociliar: mediante la ventilación de DTPATc99m, mediante instilación intratraqueal de macroagragados de albúmina marcados con Tc99m, mediante instilación nasal de macroagragados de albúmina marcados con Tc99m y por último mediante la ventilación de nanocoloides de albúmina marcados con Tc99m. De los modelos de medición utilizados, se tomará el basado en la ventilación de nanocoloides de albúmina marcados con Tc99m, por ser en el que mejores resultados se obtuvieron ajustándose a la realidad clínica, para probar tres dosis de amilorida, fármaco que ha demostrado por otras técnicas su efecto en mejorar la actividad mucociliar. Este método podría ser una herramienta de diagnóstico clínico de pacientes con infecciones recurrentes de las vías respiratorias. Además, los efectos de intervenciones físicas o farmacológicos sobre el transporte mucociliar pueden ser estudiados por medio de esta técnica, siendo útil en los ensayos clínicos de nuevas terapias destinadas a aumentar el aclaramiento mucociliar. Palabras clave: Aclaramiento mucociliar, amilorida, microCT-SPECT, Tc99m Alumno: Martín Pérez Leal Valencia, julio de 2014 Tutor académico: D. Patricia Almudéver Folch Director del Trabajo: D. Javier Milara Payá Licencia: Creative Commons 3 AGRADECIMIENTOS En primer lugar, mi más sincero agradecimiento para Xavi, por la oportunidad de hacer el trabajo en la Fundación, pese a todo siempre ha sabido encontrar un hueco para ayudarme. A Julio Cortijo, y a todo el equipo del laboratorio en general por hacer de los días más largos los más amenos, con vosotros y vosotras da gusto trabajar. A Patri, porque a pesar del poco tiempo trabajado juntos se hizo cargo de mi proyecto en la universidad, gracias por tus consejos. No puedo olvidarme de dar las gracias también a mi familia, porque es por ella por la que hoy todo esto es posible, sin su ayuda no lo habría logrado. Gracias por saber compartir conmigo los peores momentos, pero sobre todo por saber celebrar los mejores. En especial destacar a mi tía Rosa, que es quién ha vivido estos años de carrera y este trabajo como si fueran suyos. Gracias por todo. I ÍNDICE DE CONTENIDOS 1. INTRODUCCIÓN ..................................................................................................................... 1 1.1. Importancia del aclaramiento mucociliar ..................................................................... 1 1.2. Fisiopatología y aspectos clínicos del aclaramiento mucociliar .................................... 2 1.3. Medición del aclaramiento mucociliar .......................................................................... 4 1.4. Terapia farmacológica para mejorar el aclaramiento mucociliar ................................. 5 2. OBJETIVO ............................................................................................................................... 7 3. MATERIALES Y MÉTODOS ...................................................................................................... 7 3.1. Animales ........................................................................................................................ 7 3.2. Aclaramiento mucociliar bronquial mediante ventilación DTPA-Tc99m. ..................... 8 3.3. Aclaramiento mucociliar bronquial mediante instilación intratraqueal de macroagregados de albúmina marcados con Tc99m. ............................................................ 10 3.4. Aclaramiento mucociliar nasal mediante instilación nasal de macroagregados de albúmina marcados con Tc99m. ............................................................................................. 10 3.5. Aclaramiento mucociliar bronquial mediante ventilación de nanocoloides de albúmina asociados a Tc99m. ................................................................................................. 11 3.6. Aclaramiento mucociliar bronquial mediante ventilación de nanocoloides de albúmina asociados a Tc99m bajo la acción del fármaco amilorida. ...................................... 12 3.6.1. Grupos experimentales ....................................................................................... 13 3.7. Análisis de los resultados ............................................................................................ 14 4. RESULTADOS ....................................................................................................................... 14 4.1. Aclaramiento mucociliar bronquial mediante ventilación DTPA-Tc99m. ................... 14 4.2. Aclaramiento mucociliar bronquial mediante instilación intratraqueal de macroagregados de albúmina marcados con Tc99m. ............................................................ 15 4.3. Aclaramiento mucociliar nasal mediante instilación nasal de macroagregados de albúmina marcados con Tc99m. ............................................................................................. 17 4.4. Aclaramiento mucociliar bronquial mediante ventilación de nanocoloides de albúmina asociados a Tc99m. ................................................................................................. 17 4.5. Aclaramiento mucociliar bronquial mediante ventilación de nanocoloides de albúmina asociados a Tc99m bajo la acción del fármaco amilorida. ...................................... 19 5. DISCUSIÓN DE LOS RESULTADOS ........................................................................................ 21 6. CONCLUSIONES ................................................................................................................... 24 7. BIBLIOGRAFÍA ...................................................................................................................... 25 II ÍNDICE DE FIGURAS Figura 1. Estructura básica del epitelio de las vías respiratorias. ................................................. 1 Figura 2. Mecanismos de acción de diferentes compuestos que despolarizan la membrana celular. ........................................................................................................................................... 6 Figura 3. Equipo de ventilación par animales pequeños. ............................................................. 8 Figura 4. Imágenes representativas capturadas a tiempo 0 después de la ventilación de los nanocoloides de albúmina asociados a Tc99m en cobaya. Las imágenes se analizaron en este laboratorio................................................................................................................................... 13 Figura 5. Imágenes capturadas a diferentes tiempos, siendo cada tiempo tomado cada 4min, después de la ventilación del DTPA asociada a Tc99m en cobaya.............................................. 14 Figura 6. Imagen representativa obtenida mediante tecnología micro-CT después de la ventilación del DTPA asociada a Tc99m en cobaya. ................................................................... 14 Figura 7. Representación de los resultados obtenidos mediante técnicas de imagen de la actividad frente al tiempo (min). ................................................................................................ 15 Figura 8. Imágenes capturadas a diferentes tiempos después de la instilación intratraqueal de macroagregados de albúmina asociados a Tc99m en cobaya mediante SPECT. ........................ 15 Figura 9. Imagen representativa obtenida mediante tecnología micro-CT después de la instilación intratraqueal de macroagregados de albúmina asociados a Tc99m en cobaya. ....... 15 Figura 10. Imagen obtenida tras la instilación instratraqueal de macroagrgados de albúmina asociados a Tc99m mediante la tecnología microCT-SPECT donde se observa en verde la zona de actividad del Tc99m. .............................................................................................................. 16 Figura 11. Representación de los resultados obtenidos mediante técnicas de imagen de la actividad frente al tiempo (min). ................................................................................................ 16 Figura 12. Imágenes capturadas al inicio y final de la instilación nasal de macroagregados de albúmina asociados a Tc99m en cobaya. Las imágenes se analizaron en este laboratorio. ...... 17 Figura 13. Imagen obtenida tras la ventilación de nanocoloides de albúmina asociados a Tc99m mediante la tecnología microCT-SPECT ...................................................................................... 18 Figura 14. Media ± Desviación estándar del % de la señal basal. Representados el control y los tratados con cloroquina. ............................................................................................................. 18 Figura 15. Imagen superpuesta de los cortes axial, sagital y coronal de una sección de la reconstrucción de la información obtenida por la técnica microCT-SPECT de un sujeto experimental sin sumunistro de fármaco a diferentes tiempos (2, 4 y 6h). ............................... 19 Figura 16. Imagen superpuesta de los cortes axial, sagital y coronal de una sección de la reconstrucción de la información obtenida por la técnica microCT-SPECT de un sujeto experimental a diferentes tiempos (2, 4 y 6h) habiendo suministrado amilorida 10mM. ......... 20 Figura 17. Representación del porcentaje de señal detectado en función del tiempo a las diferentes concentraciones de fármaco y el control. Ampliado el tramo inicial (0-120min) para su correcta visualización. ............................................................................................................ 20 Figura 18. Representación del porcentaje de señal detectado en función del tiempo a las diferentes concentraciones de fármaco y el control. ................................................................. 21 III ÍNDICE DE TABLAS Tabla 1. Dosis de anestesia a administrar por individuo en función del peso del animal. ........... 9 Tabla 2. Grupos de experimentación en la prueba del fármaco, tratamiento a suministrar y número de muestras. .................................................................................................................. 13 1 1. INTRODUCCIÓN 1.1. Importancia del aclaramiento mucociliar Con la respiración, las partículas inhaladas, como el polvo y las bacterias llegan inevitablemente a las vías respiratorias. Como respuesta a esta constante amenaza de la inflamación y la infección de las vías respiratorias se han desarrollado diferentes mecanismos de defensa innatos [1]. Se tiene constancia de que el aclaramiento mucociliar es de particular importancia en esta primera línea de defensa, que se vuelve evidente en pacientes con anomalías relacionadas con este sistema, como los pacientes con fibrosis quística o la discinesia ciliar primaria, ya que estos suelen presentarse con infecciones recurrentes de las vías respiratorias [2-4]. En los últimos años, nuestra comprensión de la estructura y la función de este importante mecanismo de defensa ha ido creciendo, además las posibles formas de evaluar, así como mejorar el aclaramiento mucociliar son foco de investigación actualmente [5-7]. Aparte de las numerosas células ciliadas, el revestimiento epitelial de las vías respiratorias intrapulmonares se compone principalmente de células secretoras. Estas células liberan diferentes moléculas antimicrobianas, como son defensinas, lisozima e IgA, moléculas inmunomoduladoras (por ejemplo, citoquinas) y grandes glicoproteínas llamadas mucinas que se unen a cantidades considerables de agua generando un gel deformable conocido como moco [8]. El moco es transportado y separado de los cilios por la capa de líquido periciliar, que tiene dos funciones principales; debido a su baja viscosidad, permite que los cilios lo transporten rápidamente, y evita que las glicoproteínas de la capa de moco se adhieran al glicocálix de la membrana apical del epitelio [2]: Ver Figura 1. Figura 1. Estructura básica del epitelio de las vías respiratorias. En individuos sanos, la mucosidad de las vías respiratorias contiene alrededor del 97% de agua y sólo un 3% de sólidos del cual solo el 30% está constituido por mucinas (el resto son proteínas no-mucinas, lípidos, sales y restos celulares). Con esta composición, el moco tendrá una consistencia parecida a la clara de huevo y puede ser 2 fácilmente limpiado de las vías respiratorias por el batido ciliar. Sin embargo, este equilibrio de hidratación puede ser interrumpido, ya sea por la hipersecreción de mucina o la desregulación del volumen de líquido de la superficie, que dará lugar a un moco más denso y más elástico, que será más difícil de eliminar de las vías respiratorias. Debido a la gran cantidad de agua contenida en la capa de moco, éste sirve como tampón para la capa de líquido periciliar, de modo que esta capa puede mantener su volumen durante variaciones fisiológicas de hidratación de las vías respiratorias. Recientemente, Button y col. [9] han propuesto una explicación más detallada de la composición de la capa de líquido periciliar de la que anteriomente se venía pensando que consistía principalmente en agua. De acuerdo con esta nueva teoría, la capa de líquido periciliar está ocupada por gran cantidad de mucinas y glicoproteínas grandes, ambas son atadas a los cilios creando así una fina red. Esto evita que las moléculas más grandes tales como partículas inhaladas y mucinas de la capa de moco, entren en la capa de líquido periciliar. Por lo tanto, en comparación con el modelo anterior llamado “gel-en-agua”, esta nueva teoría (modelo “gel-en-cepillo”) puede explicar por qué la capa de moco y la capa de líquido periciliar pueden existir en tal proximidad sin mezclarse. Además, esta teoría explica mejor los cambios observados en las dos capas en relación a la deshidratación o el exceso de hidratación de la superficie de las vías respiratorias. Para una explicación más detallada del modelo “gel-en-cepillo”, se recomienda al estudiar el artículo de Button y col. [9]. 1.2. Fisiopatología y aspectos clínicos del aclaramiento mucociliar Hay dos razones principales por las que el aclaramiento mucociliar podría verse obstaculizado. Cualquier movimiento ciliar puede ser obstaculizado directamente, por ejemplo por defectos genéticos en proteínas centrales del axonema o por disfunción temporal causada por una infección o influencias ambientales [10-12]; la capa de moco puede constituir el principal problema cuando la deshidratación de la mucosa conduce a un aumento de la viscosidad, mediante el cual el aclaramiento ciliar se vuelve ineficaz. Además, dicha deshidratación puede provocar que la capa de líquido periciliar se encoja, haciendo que los cilios se compriman por debajo de la capa de moco impidiendo así su movimiento. Si la capa de líquido periciliar se va haciendo cada vez más delgada, las glicoproteínas de mucina de la mucosa se unirán a los glicocálices epiteliales como velcro, impidiendo tanto el aclaramiento ciliar como la tos [2, 13, 14]. Aparte de discinesia ciliar primaria y secundaria (PCD, SCD) que afectan a los cilios, muchas otras enfermedades tienen como parte central de su patogénesis un aclaramiento mucociliar anormal. Por ejemplo, esto se aplica a la fibrosis quística, que 3 es causada por mutaciones en el gen que codifica para el canal de Clconocido como CFTR. Este defecto conduce a la deshidratación de la capa de moco y la contracción de la capa de líquido periciliar, lo cual impide la eliminación del moco tanto por batido ciliar como mediante la tos como ya se ha descrito anteriormente [14]. El deterioro del aclaramiento mucociliar también se observa en pacientes con asma y enfermedad pulmonar obstructiva crónica (EPOC). Una parte importante de su patogénesis se cree que es debida a la hipersecreción de mucina, la cual conduce a cantidades excesivas de moco con un aumento de la viscosidad. Este moco elástico es difícil de eliminar de las vías respiratorias y en casos severos puede llegar a la formación de tapones de moco siendo probable que desemboque en infección o una atelectasia localizada [14, 15]. Los principales síntomas del deterioro del aclaramiento mucociliar se manifiestan en forma de tos y disnea. La disnea es resultado de la mucosidad que obstruye flujo de aire en numerosas vías respiratorias, que en los casos de obstrucción total pueden conducir a atelectasia [14, 16, 17]. La tos puede ser hasta cierto punto sustituta en casos de aclaramiento ciliar impedido. Esto puede ayudar a explicar por qué las enfermedades en las que sólo los cilios están involucrados (como PCD) tienden a ser menos graves que las causadas principalmente por deshidratación de la mucosa (por ejemplo, la fibrosis quística) ya que esto impedirá tanto el aclaramiento ciliar como la tos [2, 14]. Infecciones sinopulmonares recurrentes a partir de la primera infancia son casi universales en los pacientes con defectos sustanciales y permanentes de aclaramiento mucociliar [4]. En parte, se cree que esto es resultado de tapones de moco que bloquean las vías respiratorias más pequeñas creándose así un entorno local que promueve el crecimiento bacteriano. Dicha infección localizada a largo plazo conduce a la hipertrofia de las glándulas mucosas y a daño epitelial perjudicando aún más el aclaramiento mucociliar de esa zona. Eventualmente, la inflamación puede conducir a bronquiectasia que se caracteriza por la dilatación permanente de las vías aéreas y engrosamiento de la pared bronquial. Sin embargo, todas las enfermedades crónicas graves que implican un aclaramiento mucociliar defectuoso tienen como resultado morbidez sustancial en términos de disnea, infecciones recurrentes sinopulmonares y tos frecuente. La cantidad, la frecuencia y la aparición del esputo variarán de acuerdo a la enfermedad, pero en general con un aumento de la infección, la cantidad aumenta y se vuelve más viscoso y purulento como se ve a menudo en pacientes con fibrosis quística. La estrecha relación con la infección también es evidente en los pacientes con exacerbación infecciosa aguda de la enfermedad pulmonar obstructiva crónica (EPOC), donde se producen grandes cantidades de esputo oscuro/verde y viscoso [14]. 10 3.3. Aclaramiento mucociliar bronquial mediante instilación intratraqueal de macroagregados de albúmina marcados con Tc99m. Número de sujetos: 3 Se utiliza una solución con partículas de macroagregados de albúmina marcada con Tecnecio 99 metaestable para ser instilado vía intratraqueal a los bronquios de los animales, diámetro de la partícula entre 5 y 90µm. En primer lugar se anestesia a las cobayas administrando una solución de Ketamina y Metomidina (Ketolar, oficina de farmacia) vía intraperitoneal a los sujetos cuyas dosis se adaptaron a cada uno de ellos en función a su peso en el momento de la inyección siguiendo las cantidades estándar que se presenta en la Tabla 1. Para el procedimiento de instilación se realizó una pequeña incisión en la piel del cuello para separar los músculos cervicales y exponer la tráquea. La solución de macroagregados fue inyectada mediante una aguja. Los animales serán introducidos en el micro-CT-SPECT (Albira, Oncovision™) en posición prono para las capturas dinámicas de imágenes. Se tomarán las imágenes pulmonares siguientes: la gammagrafía planar anterior (A), posterior (P), laterales a izquierda y derecha (LL y RL), y posterior oblicuas a izquierda y derecha (LPO y RPO) con el sistema de análisis microCT-SPECT. Se adquiere una imagen cada 4 minutos durante alrededor de 70 min. 3.4. Aclaramiento mucociliar nasal mediante instilación nasal de macroagregados de albúmina marcados con Tc99m. Número de sujetos: 3 Se utiliza una solución con partículas de macroagregados de albúmina marcada con Tecnecio 99 metaestable para ser instilado vía intranasal, diámetro de la partícula entre 5 y 90µm. En primer lugar se anestesia a las cobayas administrando una solución de Ketamina y Metomidina (Ketolar, oficina de farmacia) vía intraperitoneal a los sujetos cuyas dosis se adaptaron a cada uno de ellos en función a su peso en el momento de la inyección siguiendo las cantidades estándar que se presenta en la Tabla 1. La instilación se realizó con la ayuda de una micropipeta, depositando el contenido en la parte interna del meato medio del animal. Los macroagregados tienen un diámetro de entre 60-80 μm. 11 Los animales serán introducidos en el micro-CT-SPECT (Albira, Oncovision™) en posición prono para las capturas dinámicas de imágenes. Se tomarán las imágenes pulmonares siguientes: la gammagrafía planar anterior (A), posterior (P), laterales a izquierda y derecha (LL y RL), y posterior oblicuas a izquierda y derecha (LPO y RPO) con el sistema de análisis microCT-SPECT. Se adquiere una imagen cada 4 minutos durante alrededor de 70 min. Se analiza la distancia recorrida por el macroagregado mediante tecnología microCT-SPECT. Se monitoriza el tiempo y la distancia recorrida por el macroagregado, es decir, se controla la velocidad (distancia/tiempo) a la que se mueve el macroagregado. 3.5. Aclaramiento mucociliar bronquial mediante ventilación de nanocoloides de albúmina asociados a Tc99m. Número de sujetos: 3 Se obtiene una solución con partículas de nanocoloides de albúmina (diámetro ≤ 80 nm) marcada con Tecnecio 99 metaestable para ser nebulizada e inhalada por el animal. Las partículas se distribuyen por el pulmón. Se deben monitorizar las imágenes mediante tecnología microCT-SPECT durante una 1h. Para anestesiar a las cobayas se les administró una solución de Ketamina y Metomidina (Ketolar, oficina de farmacia) vía intraperitoneal a los sujetos cuyas dosis se adaptaron a cada uno de ellos en función a su peso en el momento de la inyección siguiendo las cantidades estándar que se presenta en la Tabla 1. Tras la espera de 10min, se procede a la nebulización de la solución de nanocoloides de albúmina asociados a Tc99m. Los animales serán introducidos en el micro-CT-SPECT (Albira, Oncovision™) en posición prono para las capturas dinámicas de imágenes. Se tomarán las imágenes pulmonares siguientes: la gammagrafía planar anterior (A), posterior (P), laterales a izquierda y derecha (LL y RL), y posterior oblicuas a izquierda y derecha (LPO y RPO) con el sistema de análisis microCT-SPECT. Se adquiere una imagen cada 4 minutos durante alrededor de 70 min. 12 3.6. Aclaramiento mucociliar bronquial mediante ventilación de nanocoloides de albúmina asociados a Tc99m bajo la acción del fármaco amilorida. Fase 1 del estudio: Control. Análisis de imágenes SPECT a los 0, 30min, 1h, 1’5h, 2h, 4h y 6h después de la ventilación de nanocoloides de albúmina asociados a Tc99m; análisis en todo el pulmón y tráquea. Fase 2 del estudio: Análisis de imágenes de SPECT a los 0, 30min, 1h, 1,5h, 2h, 4h y 6h después de la ventilación del fármaco y ventilación de nanocoloides de albúmina asociados a Tc99m; análisis en todo el pulmón y tráquea. Procedimiento: Para anestesiar a las cobayas se les administró una solución de Ketamina y Metomidina (Ketolar, oficina de farmacia) vía intraperitoneal a los sujetos cuyas dosis se adaptaron a cada uno de ellos en función a su peso en el momento de la inyección siguiendo las cantidades estándar que se presenta en la Tabla 1. Después de un período de 10 minutos, los animales serán sometidos a la ventilación del fármaco en un volumen final de 300μl con concentraciones indicadas (3 mM). Después de otros 10 minutos, una suspensión de Tc99m nanocoloides albúmina (Molipharma, Valencia España; ≤80nm diámetro de partícula; 10 mCi) será ventilada. Los animales serán introducidos en el micro-CT-SPECT (Albira, Oncovision™) en posición prono y las capturas dinámicas de imágenes micro-CT y micro-SPECT serán implementadas durante 30 min, seguido de capturas estáticas a 1’5h, 1h, 2h, 4h y 6h. Durante la captura dinámica los animales se anestesiaron y fueron re-anestesiados puntualmente a las 1’5h, 1h, 2h, 4h y 6h. Se tomarán las imágenes pulmonares siguientes: la gammagrafía planar anterior (A), posterior (P), laterales a izquierda y derecha (LL y RL), y posterior oblicuas a izquierda y derecha (LPO y RPO). Cada fotograma será escaneado por el protocolo hasta obtener 300.000 en el recuento, con 252 secciones de imágenes por cada captura. Todos los escaneos se realizaron con cámaras gamma con detectores de campo de visión, equipados con colimadores generales de baja energía. El análisis de aclaramiento mucociliar se realizó con el software PMOD seleccionando la totalidad del VOI (Volumen de Interés) tras la inhalación de los nanocoloides se vuelve a medir en diferentes momentos (dinámicos, 2h, 4h, 6h) aplicando el mismo VOI. La cuantificación se realizó mediante el análisis del recuento con el mismo VOI aplicado a cada imagen. Las imágenes de tomografía computarizada (TC) serán capturadas para 13 visualizar la localización anatómica de las imágenes SPECT como se representa en la Figura 4. Figura 4. Imágenes representativas capturadas a tiempo 0 después de la ventilación de los nanocoloides de albúmina asociados a Tc99m en cobaya. Las imágenes se analizaron en este laboratorio. 3.6.1. Grupos experimentales En los grupos experimentales se definirá un grupo control (ventilación vehicular; n=6), grupos con el fármaco a diferentes concentraciones (amilorida 1mM; 3mM, 10mM; n=6) como se muestra en la Tabla 2. GRUPO TRATAMIENTO MUESTRA CONTROL Inhalación vehicular (agua 300µl) N=6 Amilorida 1 Inhalación amilorida 1mM en un volumen final de 300 µl N=6 Amilorida 3 Inhalación amilorida 3mM en un volumen final de 300 µl N=6 Amilorida 10 Inhalación amilorida 10mM en un volumen final de 300 µl N=6 Tabla 2. Grupos de experimentación en la prueba del fármaco, tratamiento a suministrar y número de muestras. 14 3.7. Análisis de los resultados Los datos se presentan como media ± SEM de los recuentos de radiación en cada momento. El análisis estadístico de los resultados se llevó a cabo mediante análisis de varianza (ANOVA) seguido de la prueba de Bonferroni, mediante la prueba t de Student, según procede (GraphPad Software Inc, San Diego, CA, EE.UU.). Los datos serán significativos cuando P <0,05. 4. RESULTADOS 4.1. Aclaramiento mucociliar bronquial mediante ventilación DTPATc99m. La Figura 5 corresponde a imágenes obtenidas mediante SPECT, mientras que la Figura 4 ha sido obtenida por micro-CT. Las partes en coloreadas muestran la zona invadida por el DTPA asociado a Tc99m. Las imágenes fueron analizadas en este laboratorio. Figura 5. Imágenes capturadas a diferentes tiempos, siendo cada tiempo tomado cada 4min, después de la ventilación del DTPA asociada a Tc99m en cobaya. Figura 6. Imagen representativa obtenida mediante tecnología micro-CT después de la ventilación del DTPA asociada a Tc99m en cobaya. En la Figura 7, quedan representados los datos obtenidos tras el análisis de los resultados anteriores mediante técnicas de imagen, a lo largo de 70min aproximadamente. 15 Figura 7. Representación de los resultados obtenidos mediante técnicas de imagen de la actividad frente al tiempo (min). 4.2. Aclaramiento mucociliar bronquial mediante instilación intratraqueal de macroagregados de albúmina marcados con Tc99m. En las Figuras 8 se muestran imágenes obtenidas mediante SPECT y en la Figura 9 las correspondientes a microCT. Las partes coloreadas muestran la zona invadida por los macroagregados asociados a Tc99m. Figura 8. Imágenes capturadas a diferentes tiempos después de la instilación intratraqueal de macroagregados de albúmina asociados a Tc99m en cobaya mediante SPECT. Figura 9. Imagen representativa obtenida mediante tecnología micro-CT después de la instilación intratraqueal de macroagregados de albúmina asociados a Tc99m en cobaya. 16 En la Figura 10 se pueden observar las imágenes obtenidas mediante SPECT y micro-CT, además, en la parte superior ambas han sido superpuestas para su correcto análisis. En la Figura 11 lo que se representa son los valores analizados mediantes técnicas de imagen. Figura 10. Imagen obtenida tras la instilación instratraqueal de macroagrgados de albúmina asociados a Tc99m mediante la tecnología microCT-SPECT donde se observa en verde la zona de actividad del Tc99m. Figura 11. Representación de los resultados obtenidos mediante técnicas de imagen de la actividad frente al tiempo (min). 17 4.3. Aclaramiento mucociliar nasal mediante instilación nasal de macroagregados de albúmina marcados con Tc99m. En la Figura 12 se pueden observar las imágenes obtenidas mediante SPECT y micro-CT, además, en la parte superior ambos resultados han sido superpuestos para su correcto análisis. En la Figura 11 lo que se representa son los valores analizados mediantes técnicas de imagen. Se determinó la distancia recorrida por los macroagregados, así como el tiempo; la velocidad de aclaramiento mucociliar alcanzada fue de 2,95cm/h. Figura 12. Imágenes capturadas al inicio y final de la instilación nasal de macroagregados de albúmina asociados a Tc99m en cobaya. Las imágenes se analizaron en este laboratorio. 4.4. Aclaramiento mucociliar bronquial mediante ventilación de nanocoloides de albúmina asociados a Tc99m. Los resultados obtenidos en esta parte del trabajo son los extraídos de los individuos control, es decir sin tratar, y los individuos tratados con cloroquina. Los resultados obtenidos se presentan en las figuras 13 y 14. En la Figura 13 encontramos las imágenes obtenidas por el micro-CT y las obtenidas mediante SPECT, además de ambas superpuestas para su mejor observación. Coloreadas en verde las partes que corresponden a la presencia de Tc99m. Por lo que respecta a la Figura 14 se muestra el % de señal de radiación basal (tiempo 0) de todos los cortes que permite el software a lo largo del tiempo. Los puntos han sido situados en la media de los individuos analizados. 18 Figura 13. Imagen obtenida tras la ventilación de nanocoloides de albúmina asociados a Tc99m mediante la tecnología microCT-SPECT Figura 14. Media ± Desviación estándar del % de la señal basal. Representados el control y los tratados con cloroquina. 19 4.5. Aclaramiento mucociliar bronquial mediante ventilación de nanocoloides de albúmina asociados a Tc99m bajo la acción del fármaco amilorida. Resultados correspondientes a la prueba del fármaco amilorida en individuos sanos, siguiendo los métodos ya expuestos así como los grupos de experimentación anteriormente propuestos. Las imágenes obtenidas mediante microSPECT-CT y han sido superpuestas para su correcta examinación, Figuras 15 y 16. Las áreas en color verde nos permiten saber qué zona se encuentra invadida por los nanocoloides de albúmina asociados a Tc99m. Además, mediante técnicas de imagen se ha cuentificado el porcentaje de señal, pudiendo realizar una gráfica en la cual analizar los resultados como se puede observar en las Figuras 17 y 18. Figura 15. Imagen superpuesta de los cortes axial, sagital y coronal de una sección de la reconstrucción de la información obtenida por la técnica microCT-SPECT de un sujeto experimental sin sumunistro de fármaco a diferentes tiempos (2, 4 y 6h). 26 14. Fahy JV, Dickey BF: Airway mucus function and dysfunction. N Engl J Med 2010;363:2233-2247. 15. Randell SH, Boucher RC: Effective mucus clearance is essential for respiratory health. Am J Respir Cell Mol Biol 2006;35:20-28. 16. Bosse Y, Riesenfeld EP, Pare PD, Irvin CG: It's not all smooth muscle: Nonsmooth-muscle elements in control of resistance to airflow. Annu Rev Physiol 2010;72:437-462. 17. Hogg JC: Pathophysiology of airflow limitation in chronic obstructive pulmonary disease. Lancet 2004;364:709-721. 18. Kaya E, Fidan F, Unlü M, Sezer M, Tetik L, Acar M. “Evaluation of alveolar clearance by Tc-99m DTPA radioaerosol inhalation scintigraphy in welders.” Ann Nucl Med. 2006 Oct;20(8): 503-10. 19. 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