Caracterización molecular de la resistencia antimicrobiana en cepas de E. coli aisladas de broilers y huevos de distintos orígenes y estudio de su transferencia a microorganismos intestinales

UNIVERSITAT POLITÈCNICA DE VALÈNCIA ESCOLA TÈCNICA SUPERIOR D´ENGINYERIA AGRONÒMICA I DEL MEDI NATURAL Caracterización molecular de la resistencia antimicrobiana en cepas de E. coli aisladas de broilers y huevos de distintos orígenes y estudio de su transferencia a microorganismos intestinales. TRABAJO FIN DE GRADO EN BIOTECNOLOGÍA ALUMNO/A: Alejandro Prats Luján TUTOR/A: Ana Isabel Jiménez Belenguer COTUTOR/A: Alejandro Fenollar Penadés Curso Académico: 2014-2015 VALENCIA, JULIO 2015 Licencia Creative Commons “Reconocimiento no Comercial –Sin Obra Derivada”. Caracterización molecular de la resistencia antimicrobiana en cepas de E. coli aisladas de broilers y huevos de distintos orígenes y estudio de su transferencia a microorganismos intestinales. The usage of extended-spectrum antimicrobials generates the selection of multiresistant strains that are hard to treat. Resistant bacteria may be present in ingested aliments and if these are not processed properly, they can originate severe infections. Different studies have proved the existence of resistance transmission between animals, food and humans, showing that the transference of resistance genes between bacteria is possible. Besides, it has been confirmed the existence of resistance transference between bacterial strains present in chickens towards human strains in diverse studies. If food is contaminated with ESBLs producing E. coli and it is not processed adequately, people can ingest these resistant strains and could produce the transfer of said resistance unto endogenous strains. For this, it will be developed an essay of determination of antimicrobial resistance genes to beta-lactams and tetracycline with isolated E. coli strains from broiler's gut and egg shell from different origins. It will be performed a previous bibliographic research to determine which resistance genes among the beta-lactams and tetracycline are the most frequent and select the most suitable primers and PCR conditions for this study. With the result obtained it will be studied the prevalence of those genes both eggs and broiler's gut and the association with its origin. It also will be made conjugation essays to prove the possibility of horizontal genetic transference between resistant strains (donor) and sensitive (recipient). El uso de antimicrobianos de amplio espectro propicia la selección de cepas multirresistentes difíciles de tratar. Las bacterias resistentes pueden estar presentes en los alimentos que se consumen y si estos no se procesan adecuadamente, pueden originar infecciones graves. Diversos estudios han demostrado la existencia de transmisión de resistencias antimicrobianas entre animales, alimentos y humanos, demostrando que la transferencia de genes de resistencia entre bacterias es posible. Además, se ha confirmado la existencia de la transferencia de resistencias entre cepas bacterianas presentes en pollos a cepas humanas en diferentes estudios. Si los alimentos están contaminados con E. coli productores de ESBLs y no se procesan adecuadamente, las personas pueden ingerir las cepas resistentes y podría darse la transferencia de dichas resistencias hacia cepas endógenas. Para ello se realizará un ensayo de determinación de genes de resistencia antimicrobiana a betalactámicos y tetraciclinas con cepas de E. coli aisladas tanto en intestinos de broilers y en cáscara de huevo de diversos orígenes. Se realizará una búsqueda bibliográfica previa para determinar qué genes de resistencia entre los betalactámicos y tetraciclinas se encuentran más frecuentemente y seleccionar los primers y condiciones de PCR más adecuados a nuestro estudio. A partir de los datos obtenidos se estudiará la prevalencia de éstos genes tanto en huevos como en broilers y su relación con los distintos orígenes. Se realizarán también ensayos de conjugación para demostrar la posibilidad de transferencia genética horizontal entre cepas resistentes (donadoras) y sensibles (receptoras). Antimicrobial resistance, broilers, eggs, E. coli, beta-lactams, tetracycline, resistance genes, blaTEM, blaSHV, blaCTX-M, tet(A), tet(B), horizontal genetic transference Resistencia antimicrobiana, broilers, huevos, E. coli, Betalactámicos, tetraciclinas, genes de resistencia, blaTEM, blaSHV, blaCTX-M, tet(A), tet(B), transferencia genética horizontal Alumno: D. Alejandro Prats Luján Valencia, Julio de 2015 Prof. Dña. Ana Isabel Jiménez Belenguer D. Alejandro Fenollar Penadés AGRADECIMIENTOS Me gustaría dar las gracias a todos aquellos que han contribuido y hecho posible la realización de este trabajo con todas las ganas y la ilusión posible: En primer lugar a mi directora, Ana Isabel Jiménez Belenguer, por darme la oportunidad de poder trabajar en el ámbito de la microbiología y en concreto en la interesante disciplina de las resistencias bacterianas a antibióticos. Además, agradecerle toda la dedicación y esfuerzo depositado, proporcionándome los conocimientos y medios necesarios para la realización de dicho proyecto. Del mismo modo, agradecer a mi tutor, Alejandro Fenollar Penadés, toda la ayuda y la compañía proporcionada a lo largo del ensayo, en especial por servir de guía en el laboratorio y por sus consejos ante cualquier duda del día a día. También, quería agradecer a todos los compañeros de laboratorio, que han hecho esta experiencia más amena y didáctica al compartir las experiencias y los conocimientos de nuestros variados campos docentes. Por supuesto, agradecer tanto a mis amigos de siempre como a mis amigos de la facultad, los cuales han demostrado un gran apoyo e interés por el desarrollo de este trabajo. Finalmente agradecer a aquellas personas más cercanas: a mis padres y a mi hermano, los cuales han hecho posible y han alentado el camino que me ha llevado a estar donde me encuentro ahora mismo, siendo un motivo de orgullo y satisfacción poder contar con todo este apoyo. Sin nada más que añadir, agradecer a todos el haber formado parte de una de las mejores etapas de mi vida. ÍNDICE 1. Introducción 1 1.1. La resistencia a antibióticos 1 1.2. Tipos de resistencia 3 1.2.1. Inactivación enzimática 4 1.2.2. Modificación de las moléculas diana 4 1.2.3. Alteraciones en la permeabilidad 5 1.2.4. Biopelículas 6 1.3. Administración de los antibióticos y normativa 7 1.4. Ecología de la transmisión de resistencias 8 2. Objetivos 9 3. Materiales y métodos 10 3.1. Aislamiento de las cepas de Escherichia coli 10 3.2. Selección de cepas de Escherichia coli 11 3.3. Extracción del ADN de Escherichia coli 11 3.4. Estudio de la susceptibilidad a antimicrobianos 11 3.5. Conservación de cepas de Escherichia coli 12 3.6. Amplificación del ADN mediante PCR 12 3.6.1. Detección de los genes de β-lactamasas tipo CTX-M 12 3.6.2. Detección de los genes de β-lactamasas tipo CMY 13 3.6.3. Detección de los genes para tetraciclinas tipo tet(A), tet(B) y tet(C) 14 3.7. Comprobación de presencia/ausencia de amplificado por electroforesis 15 3.8. Conjugación de cepas resistentes (donadoras) y sensibles (receptoras) 15 3.8.1. Conjugación de cepas de Escherichia coli con Salmonella spp. 15 3.9. Análisis estadístico de los datos 16 3.10. Análisis de los primers de PCR 17 3.11. Identificación bacteriana 17 4. Resultados y Discusión 18 4.1. Susceptibilidad a antimicrobianos 18 4.1.1. Influencia del origen de la cepa frente a susceptibilidad a antimicrobianos 18 4.1.2. Influencia del origen de la cepa frente a resistencia al antibiótico 21 4.2. Detección de β-lactamasas tipo CTX-M 23 4.3. Detección de β-lactamasas tipo CMY 27 4.4. Detección de genes de resistencia a tetraciclina tipo tet(A), tet(B) y tet(C) 28 4.5. Presencia/ausencia de genes de resistencia en función del origen del huevo 30 4.6. Transferencia de genes de resistencia mediante conjugación 31 5. Conclusiones 33 6. Bibliografía 35 ÍNDICE DE ABREVIATURAS ADN: Ácido desoxirribonucleico ARN: Ácido ribonucleico bp: Pares de bases PBP: ‘’Penicillin Binding Protein’’ BE: Bombas de eflujo CMI: Concentración minima inhibitoria kD: kiloDaltons CEE: Comunidad Económica Europea EFSA: ‘’European Food and Safety Authority’’ ESBL: ‘’Extended Spectrum Beta-Lactamase’’ PCR: ‘’Polymerase Chain Reaction’’ CTX-M: gen de β-lactamasa de clase A tet(): gen de resistencia a tetraciclina CMY: gen de β-lactamasa de clase AmpC APT: Agua de peptona tamponada 1 1. INTRODUCCIÓN En la actualidad, la presencia y la rápida difusión de patógenos resistentes a antibióticos de uso en clínica constituye uno de los problemas más importantes tanto en el ámbito de la salud pública como en el de la medicina veterinaria y la ganadería. La presión selectiva derivada de las aplicaciones clínicas de antibióticos y su empleo en ganadería como promotores del crecimiento, supone una de las principales razones de que dicho problema esté alcanzando unos niveles críticos en estos tiempos (Casewell et al., 2003; Tenover y McGowan, 1996). A pesar de ello, un supuesto caso donde se produjera una limitación en el empleo de estos antibióticos, podría suponer un riesgo y un aumento de infecciones bacterianas tanto en humanos como en animales, lo que conllevaría a un problema de salud pública y a elevadas pérdidas económicas en el sector agropecuario o de producción primaria. El tracto digestivo constituye uno de los reservorios más importantes de microbiota bacteriana para los animales, teniendo un importante rol nutricional al encontrarse este microbioma en simbiosis con el organismo hospedante. En concreto, las bacterias anaeróbicas intestinales y específicamente los microorganismos pertenecientes al género Bacteroides spp. son el residente más habitual en dicha microbiota bacteriana, de acuerdo con los estudios metagenómicos realizados sobre el microbioma intestinal (Arumugam et al., 2011). Se piensa que esta microbiota anaerobia actúa como uno de los principales reservorios para genes de resistencia, los cuales pueden ser transferidos hacia otras especies incluyendo aquellas que poseen un potencial patogénico, y hacia diferentes especies aeróbicas (Salyers et al. 2004). 1.1. LA RESISTENCIA A ANTIBIÓTICOS Un antibiótico es aquella sustancia química derivada o producida por un ser vivo, capaz de paralizar el desarrollo de ciertos microorganismos patógenos, debido a su acción bacteriostática, o de ocasionar la muerte de estos, por su acción bactericida, incluso a concentraciones mínimas (Korolkovas y Burckhalter, 1983). En la década de 1950, con la aparición de una gama importante de antimicrobianos, se pensaba que virtualmente todas las infecciones bacterianas eran tratables con éxito. Sin embargo, durante las décadas de los años 60 y 70 se empezaron a observar y desarrollar resistencias a antibióticos por parte de microorganismos patógenos, esta situación ha puesto en entredicho, pese a que los antibióticos han ayudado a combatir las infecciones bacterianas durante los últimos 80 años, que la idea inicial era incorrecta e imprecisa, debido a la aparición de dichas resistencias a antibióticos. En la actualidad se pueden encontrar más de 3000 antibióticos descritos, pero solamente un pequeño porcentaje de ellos se emplea en la práctica clínica y veterinaria debido a que algunos de ellos pueden presentar efectos nocivos o tóxicos sobre el organismo (Kinch et al., 2014). Dichos antibióticos han sido ampliamente usados con el fin de proteger la salud humana y animal, así como promotores del crecimiento en ganadería. Los antibióticos se pueden clasificar en función de su estructura química, y por tanto, en relación con su mecanismo de acción. Los antibióticos más empleados son: β-lactámicos, quinolonas, tetracilcinas, aminoglucósidos, glucopéptidos, macrólidos y cloranfenicol, 2 destacando el grupo de los β-lactámicos y las tetracilcinas al ser empleados por su amplio espectro de acción (Daza, 1998). Hay casos donde se han originado complicaciones a la hora de tratar infecciones ocasionadas por cepas resistentes a antibióticos, como es el caso de la salmonelosis, infección tratada con cefalosporinas de amplio espectro y fluoroquinolonas. Debido a este uso y abuso de los antibióticos se ha venido produciendo una presión selectiva sobre las comunidades bacterianas, resultando en la generación de resistencias (American Academy of Microbiology, 2009; Hawkey y Jones, 2009). Muchos de los antibióticos empleados para los tratamientos son producidos por microorganismos ambientales, los cuales son hospedadores naturales de los genes de resistencia a dichos antibióticos, esto se cree que es una medida tomada como defensa frente a los compuestos producidos por ellos mismos (Davies, 1994; Vila y Martínez, 2008). Un ejemplo de estos microorganismos que han desarrollado resistencia a antibióticos son los patógenos que poseen β-lactamasas de amplio espectro o ESBL según sus siglas en inglés, suponiendo un problema clínico y veterinario a nivel mundial (Wiedemann et al., 1989). Estas βlactamasas de amplio espectro tienen la habilidad de hidrolizar diversos tipos de antibióticos, incluso a las cefalosporinas de amplio espectro de tercera y cuarta generación (p.e. cefotaxima, ceftriaxona o ceftazidima), antibióticos clasificados como antimicrobianos de crítica importancia por la Organización Mundial de la Salud. Esto ocasiona un impedimento a la hora de realizar un tratamiento efectivo frente a muchas enfermedades infecciosas moderadas o graves (Organización Mundial de la Salud, 2011). Muchas de estas cepas de bacterias productoras de ESBL son aisladas en muestras de humanos (Carattoli, 2008), y no de animales, pero este hecho está cambiando, ya que algunas cepas de E. coli con estos genes de resistencia están empezando a detectarse e incrementarse en animales (Hunter et al., 2010). Dichas resistencias a antibióticos son adquiridas por las bacterias mediante la transferencia de elementos móviles (plásmidos y elementos integrativos o conjugativos) a través de la transformación del ADN desnudo o por medio de bacteriófagos (Carattoli, 2008; Daly y Fanning, 2000). Actualmente las familias de β-lactamasas de amplio espectro predominantes encontradas en cepas resistentes son la familia de CTX-M, TEM y SHV (Poirel et al., 2012; Bush et al., 2015). Hasta ahora se han encontrado 223 familias diferentes pertenecientes a TEM, así como 191 respecto a la familia de SHV (Bush et al., 2015). Mientras que estas dos familias son prácticamente homólogas exceptuando unas pocas mutaciones en el loci, las familias de las CTXM presentan un amplio rango de variabilidad. Hasta ahora se conocen 157 variantes descritas para CTX-M, pudiendo dividirse en cinco grupos principales en función de las variaciones de identidad de sus cadenas de aminoácidos. Estos grupos se clasifican como: grupo CTX-M-1, grupo CTX-M-2, grupo CTX-M-8, grupo CTX-M-9 y grupo CTX-M-25. Entre estos destacan los grupos CTX-M-1, CTX-M-2 y CTX-M-9 como los más predominantes (Bradford, 2001). Respecto a los genes de resistencia a tetraciclinas, se clasifican en función de su mecanismo de acción, encontrándose los genes que generan proteínas de eflujo activo, de protección ribosomal y de enzima inactivadora. Entre estos grupos destaca el de genes que producen proteínas de eflujo activo asociadas a membranas que expulsan tetraciclinas de la célula, disminuyendo la concentración intracelular del antibiótico (Michalova et al., 2004). Aquí se encuentran los genes hallados en plásmidos y transposones, tet(A), tet(B), tet(C), tet(D), 3 tet(E), tet(L) entre otros, siendo predominantes en las bacterias gram-negativas (Kojima et al., 2005). Se conoce que la aparición de estas resistencias afecta al mantenimiento del microorganismo ya que implica un coste energético extra que puede comprometer la viabilidad del microorganismo. Se han realizado estudios donde se ha observado que dicho coste afecta a procesos de elevada relevancia como el mantenimiento de la pared celular o la síntesis de ARN mensajero entre otros. Esto ha llevado a un interés por la forma de evolución de estas bacterias de modo que sean capaces de mantener la resistencia y esto no conlleve un detrimento de su supervivencia (Schenk y Visser, 2013). La conclusión sacada de los diferentes estudios ha llevado al descubrimiento de dos factores clave en la evolución de las resistencias: la epistasia y la pleiotropía (Rodríguez-Verdugo et al., 2013). La pleiotropía es aquel fenómeno producido cuando un mismo gen, y por tanto las mutaciones en el mismo, afectan a diversos rasgos fenotípicos. En este caso hay cierta restricción ya que el efecto positivo o negativo dependerá del fenotipo y las condiciones del entorno. Además, tiene elevada probabilidad de ser seleccionada una misma mutación en diferentes poblaciones si el beneficio es extremadamente alto. Por su parte, la epistasia se produce cuando se da una interacción entre mutaciones de diferentes loci de manera no aditiva afectando a un mismo rasgo fenotípico, hecho que supone la combinación de diferentes mutaciones sobre la resistencia, y por lo tanto la determinación de qué vía mutacional será preferente por la evolución, cuando se necesitan varias mutaciones para la resistencia completa. 1.2. TIPOS DE RESISTENCIA La resistencia por parte de los microorganismos a los antibióticos puede manifestarse de dos formas diferentes: de forma natural o intrínseca, o de forma adquirida. La resistencia natural es aquella que es propia de cada familia, especie o grupo bacteriano. Por ejemplo, todas las bacterias gram-negativas son resistentes a la vancomicina, debido a que las porinas que forman los canales en la pared bacteriana son demasiado pequeñas como para dejar pasar las moléculas de gran tamaño de vancomicina, siendo una situación invariable. Por su parte, la resistencia adquirida es variable y es obtenida por una cepa de una especie bacteriana (Medeiros, 1997). De este modo, existen cepas de E. coli que son resistentes por ejemplo a la ampicilina, fluoroquinolonas o cefalosporinas de tercera generación, llegando a niveles elevados de resistencia en determinadas regiones mundiales (Kozak et al., 2008). Otro modo de catalogar los mecanismos de resistencia se basa en el efecto producido por un organismo simple o por una población de organismos. La resistencia individual se refiere a aquella interacción molecular entre una célula bacteriana con su arsenal genético y metabólico, y un antibiótico concreto. Los estudios aquí se centran en las herramientas con las que cuenta la bacteria para evitar la acción del antibiótico en cuestión (Jones, 2001). Dicho arsenal genético y metabólico no es suficiente sólo con que posea un gen de resistencia, ha de tener unos niveles de expresión suficientes y encontrarse regulado de forma apropiada y efectiva para que pueda alcanzar la supervivencia bacteriana (Suzuki et al., 2015). Respecto a la resistencia poblacional, hace referencia al comportamiento in vitro del inóculo o población bacteriana que se enfrenta a una determinada concentración de antibiótico, por un periodo de tiempo concreto. Los estudios llevados a cabo para esta causa son los que proporcionan la 4 información sobre sensibilidad o resistencia, muy importantes en la orientación terapéutica y sobre el conocimiento de la resistencia. En este caso interviene el sitio de infección, las propiedades farmacocinéticas del antibiótico, el estado inmunológico del organismo, el tamaño del inóculo bacteriano, etc (Jones, 2001). La aparición de resistencias en los microorganismos se debe principalmente a uno o la combinación de varios mecanismos (siendo esta la más habitual) de resistencia bacteriana a los antibióticos, siendo más o menos efectivos en función del antibiótico administrado y del contacto con el microorganismo. A continuación se proporcionará una breve descripción de los mecanismos de resistencia más habituales, siendo estos la inactivación enzimática, la modificación de las moléculas diana, las alteraciones en la permeabilidad y la producción de biopelículas. 1.2.1. Inactivación enzimática La inactivación enzimática del antibiótico es el principal mecanismo responsable del aumento de las tasas de resistencia encontradas en terapia clínica y veterinaria. El principal mecanismo implicado es la hidrólisis, como sucede con las β-lactamasas y los β-lactámicos, pero también pueden ocurrir modificaciones no hidrolíticas tales como acetilaciones, adenilaciones o fosforilaciones inactivantes de otros grupos de antibióticos como los aminoglucósidos (Livermore, 1991). Estas enzimas son un claro ejemplo de la plasticidad de la genética bacteriana. Las enzimas responsables de proporcionar resistencia contra los β-lactámicos son las β-lactamasas, que hidrolizan en enlace amida del anillo penicilánico o cefalosporánico produciendo derivados ácidos sin ninguna propiedad antimicrobiana. Las familias más representativas de β-lactamasas son: de tipo C o AmpC, ESBL (a las cuales pertenecen TEM, SHV y CTX-M (Livermore, 1995)) y carbapenemasas. Las bacterias que expresan estas enzimas poseen un mecanismo de resistencia muy efectivo, ya que diversas mutaciones en la secuencia génica y a nivel de cadena peptídica otorga variantes enzimáticas o isoformas capaces de degradar diferentes antibióticos como penicilinas, cefalosporinas y carbapenemes (Rasmussen y Bush, 1997). Mediante diferentes estudios se ha llegado a la conclusión de que provienen de un grupo reducido de enzimas cromosómicas, que a día de hoy han evolucionado hasta constituir un grupo muy numeroso y variado de enzimas. Las evidencias disponibles tienden a asignarle en su comienzo una función en la síntesis de la pared, sobre todo en las bacterias gram-negativas. Esta hipótesis proviene de los experimentos realizados con Salmonella spp., la cual no codifica en su cromosoma para las β-lactamasas de clase C o cefaminasas. Cuando se le introdujo un plásmido que codificaba para una β-lactamasa de tipo C se observaba en el microorganismo alteraciones morfológicas a nivel de pared, así como retardo en la velocidad de crecimiento y una disminución de su virulencia como consecuencia de estas modificaciones. 1.2.2. Modificación de las moléculas diana Por lo general, los antibióticos actúan uniéndose a moléculas que forman parte de un proceso relevante en la funcionalidad del organismo. Con dicha unión, el proceso se ve impedido en alguno de los pasos que lo constituyen, con el consiguiente efecto bacteriostático o bactericida. El organismo posee diversas estrategias para imposibilitar este objetivo, como: las modificaciones en el gen que codifica el blanco del antibiótico, como por ejemplo las 11 3.2. Selección de cepas de Escherichia coli Para todos los muestreos realizados, tanto para las muestras procedentes de pollos como aquellas provenientes de huevos, se les realizó una selección de colonias en medio selectivo y diferencial para E. coli. En el caso de los huevos se introdujo la cáscara de huevo fragmentada en agua de peptona tamponada (APT), se agitó en vórtex al menos 2 minutos para desprender las posibles bacterias adheridas a la cáscara y se dejaron incubar durante 24h a 37±1ºC. La obtención de las cepas bacterianas se efectuó mediante la selección de aquellas colonias típicas de E. coli para el medio TBX, siendo colonias con bordes definidos de color verde o verde azulado, y se realizó un pase en triple estría a placas de PCA (Scharlau Plate Count Agar) dejándolas incubar a 37±1ºC durante 24h. La confirmación bioquímica de estas colonias se realizó mediante la prueba del Indol, para ello se resuspendió una colonia aislada de las placas de PCA en 10 ml de caldo de triptófano (Merck Microbiology DEV Tryptophan Broth) y se dejó incubar a 37±1ºC durante 24h. Posteriormente se adicionaron dos gotas de reactivo de Kovacs y se seleccionaron aquellas cepas en las que apareció un anillo rojo en la superficie del tubo. En los casos en que no se obtuvo un crecimiento en las placas de TBX sembradas para los recuentos, se volvió a sembrar en triple estría desde el preenriquecimiento en APT a una placa de TBX y se incubó a 44±1ºC durante 24h y se prosiguió según lo ya descrito para confirmar la colonia como E. coli. En aquellas colonias que el Indol dio negativo, se procedió al aislamiento de otra colonia sospechosa de ser E. coli desde la placa de TBX y se repitió el mismo proceso. 3.3. Extracción del ADN de Escherichia coli La extracción del material genético de las cepas se realizó mediante el empleo de un kit comercial de extracción de ADN (Signa GenEluteTM Bacterial Genomic DNA kit), con un volumen de muestra 1,5mL procedente de caldo de cultivo con crecimiento de 24h, y siguiendo las instrucciones del fabricante. También se realizó un método de extracción alternativo, basado en el ‘’método de Holmes y Quigley’’ o ‘’boiling’’ (Holmes y Quigley, 1981), que consiste en el hervido de pequeños volúmenes de muestra a unos 95-100ºC durante 10 minutos, sin la necesidad de una purificación posterior. La calidad del material genético obtenido por este método es inferior que el del kit comercial previo, pero es un procedimiento rápido y de bajo coste con el que se puede obtener suficiente muestra de ADN y de calidad óptima para el objetivo de este estudio. 3.4. Estudio de la susceptibilidad a antimicrobianos Para la realización de los estudios de susceptibilidad a antimicrobianos se empleó el método del antibiograma disco-placa del Clinical and Laboratory Standards Institute (CLSI) el cual detalla el método para el estudio de las susceptibilidades bacterianas a los agentes antimicrobianos. Se fundamenta en la difusión radial del antimicrobiano presente en un disco de celulosa a través del agar, formándose un gradiente de concentración en la que, transcurrido el periodo de incubación (24 horas), se observa un halo de inhibición en el crecimiento de la bacteria. 12 Los once antibióticos en disco que fueron testados y sus concentraciones de uso fueron: gentamicina CN 10μg, amoxicilina/ácido clavulánico AMC 3μg, ampicilina AMP 10μg, amikacina AK 30μg, kanamicina K 30μg, cloranfenicol C 30μg, cefalotina KF 30μg, ciprofloxacino CIP 5μg, ceftriaxona CRO 30μg, tetraciclina TE 30μg, ácido nalidíxico NA 30μg y estreptomicina S 10μg (OXOID antimicrobial susceptibility test disc). Se dispusieron seis y seis discos en cada placa mediante un dispensador de discos (OXOID antimicrobial susceptibility testing disc dispenser). Las placas sembradas y con los discos, se incubaron a una temperatura de 37±1ºC durante 24h. Cada antimicrobiano posee unos diámetros de inhibición estandarizados (CLSI, 2012), siendo éstos expresados en mm. La lectura de los halos de inhibición se interpretó como sensible (S), intermedia (I) o resistente (R) según las categorías establecidas por el CLSI, en referencia comparativa con la cepa E. coli ATCC 25922 como control de calidad. El intervalo de diámetro de los halos para considerarse como S, I o R para cada antibiótico medidos en mm fueron: CN (R: ≤12mm; S: ≥15mm; I: 13-14mm), AMC (R: ≤13mm; S: ≥15mm; I: 14-17mm), AMP (R: ≤13mm; S: ≥17mm; I: 14-16mm), AK (R: ≤14mm; S: ≥17mm; I: 1416mm), K (R: ≤13mm; S: ≥18mm; I: 14-17mm), C (R: ≤12mm; S: ≥18mm; I: 13-17mm), KF (R: ≤14mm; S: ≥18mm; I: 15-17mm), CIP (R: ≤15mm; S: ≥21mm; I: 16-20mm), CRO (R: ≤13mm; S: ≥21mm; I: 14-20mm), TE (R:≤14mm; S: ≥19mm; I: 15-18mm), NA (R: ≤13mm; S: 19mm; I: 1418mm) y S (R: ≤8mm; S: ≥10; I: 7-9mm). 3.5. Conservación de cepas de Escherichia coli Las cepas de Escherichia coli de los diferentes muestreos se mantuvieron en crioviales (Pro-lab Diagnostics MicrobankTM) a una temperatura de -20ºC para estudios posteriores, a partir de cultivos en PCA de 24 h de incubación a 37±1ºC. 3.6. Amplificación del ADN mediante PCR Se realizaron diversas PCR para cada gen de resistencia a antibióticos a partir de las extracciones de ADN. Para su realización se emplearon primers de β–lactamasas pertenecientes a CTX-M (Dallenne et al., 2010), CMY (Kojima et al., 2005) y tetraciclinas pertenecientes a tet(A), tet(B) y tet(C) (Kozak et al., 2008). Todas la reacciones de PCR fueron llevadas a cabo en un termociclador modelo PTC-100 Peltier Thermal Cycler (MJ Research). 3.6.1. Detección de los genes de β–lactamasas tipo CTX-M La reacción de PCR se llevó a cabo en un volumen final de 25µL (17µL de mix y 8µL de ADN). Se incluyó un control negativo (se reemplazó el ADN por agua miliQ estéril) y un control positivo (se empleó ADN procedente de una muestra control, 4.2b). La concentración de los reactivos usados para la generación del mix queda reflejada en la Tabla 3, con un volumen final de 25µL. Las secuencias empleadas en la reacción de PCR quedan descritas en la Tabla 4, junto con el tamaño de amplicón para cada una. 13 TABLA 3. Condiciones de la PCR para CTX-M multiplex Reactivo Volumen (µL) Concentración Agua MiliQ 10,05 - Buffer 2,5 1x MgCl2 1,5 1,5mM Primer CTX-M-1-f 0,5 0,4 pmol/µL Primer CTX-M-1,2-r (x2) 0,25 (x2) 0,2 pmol/µL Primer CTX-M-2-f 0,25 0,2 pmol/µL Primer CTX-M-9-f 0,5 0,4 pmol/µL Primer CTX-M-9-r 0,5 0,4 pmol/µL dNTP’s 0,2 0,5 mM/nt TaqPol 0,5 2U Muestra ADN 8 - Las condiciones de la PCR fueron: un primer ciclo de desnaturalización inicial a 94ºC durante 10 minutos, posteriormente 30 ciclos formados por una primera fase de 94ºC durante 40s, otra fase de 60ºC durante 40s y una fase final de 72ºC durante 1 minuto. La etapa final fue a 72ºC durante 7 minutos. TABLA 4. Primers de dideoxinucleótidos empleados para la PCR multiplex de CTX-M Secuencia del primer (5’ a 3’) Gen de resistencia Forward Reverse Amplicón (bp) CTX-M-1 TTAGGAAATGTGCCGCTGCA CGATATCGTTGGTGGTGCCAT 688 CTX-M-2 CGTTAACGGCACGATGAC CGATATCGTTGGTGGTGCCAT 404 CTX-M-9 TCAAGCCTGCCGATCTGGT TGATTCTCGCCGCTGAAG 561 3.6.2. Detección de los genes de β–lactamasas tipo CMY La reacción de PCR se llevó a cabo en un volumen final de 25µL (17µL de mix y 8µL de ADN). Se incluyó un control negativo (se reemplazó el ADN por agua miliQ estéril), no hubo control positivo al no obtener una cepa control que presentara la banda característica del gen. La concentración de los reactivos usados para la generación del mix está presente en la Tabla 5. Las secuencias de los primers empleados en la reacción se encuentran en la Tabla 6. TABLA 5. Condiciones de la PCR para CMY-2 Reactivo Volumen (µL) Concentración Agua MiliQ 10,8 - Buffer 2,5 1x MgCl2 1 1,5mM Primer CMY-f 1 0,4 pmol/µL Primer CMY-r 1 0,4 pmol/µL dNTP’s 0,2 0,5mM/nt TaqPol 0,5 2U Muestra ADN 8 - 14 Las condiciones de PCR fueron: un primer ciclo de desnaturalización a 94°C durante 3 minutos, 30 ciclos de desnaturalización a 94°C durante 30s, de hibridación del primer al ADN a 60°C durante 30s, de extensión a 72°C durante 1 minuto. Para terminar un ciclo de 7 minutos a una temperatura de 72°C. TABLA 6. Primers de dideoxinucleótidos empleados para la PCR de CMY-2 Secuencia del primer (5’ a 3’) Gen de resistencia Forward Reverse Amplicón (bp) CMY-2 ATGATGAAAAAATCGTTATGCT TTATTGCAGCTTTTCAAGAATGCG 1100 3.6.3. Detección de los genes para tetraciclinas tipo tet(A), tet(B) y tet(C) La reacción de PCR se llevó a cabo en un volumen final de 25µL (17µL de mix y 8µL de ADN). Se incluyó un control negativo (se reemplazó el ADN por agua miliQ estéril) y un control positivo para los genes tet(A) y tet(B), para el gen tet(C) no se pudo obtener cepa con resultado positivo (se empleó ADN procedente de una muestra control, 5.3a). La concentración de los reactivos usados para la generación del mix queda reflejada en la Tabla 7. Las secuencias de los primers empleados en la reacción están anotadas en la Tabla 8. TABLA 7. Condiciones de la PCR multiplex para tet Reactivo Volumen (µL) Concentración Agua MiliQ 6,26 - Buffer 2,5 1x MgCl2 1,5 1,5mM Primer tet(A)-f 1 0,1 pmol/µL Primer tet(A)-r 1 0,1 pmol/µL Primer tet(B)-f 1 0,2 pmol/µL Primer tet(B)-r 1 0,2 pmol/µL Primer tet(C)-f 1 0,5 pmol/µL Primer tet(C)-r 1 0,5 pmol/µL dNTP’s 0,2 0,5mM/nt TaqPol 0,54 2,7U Muestra ADN 8 - Las condiciones con las que se llevó a cabo la reacción fueron: un primer ciclo de desnaturalización de 15 minutos a 94ºC, 30 ciclos constituidos por una fase de 1 minuto a 94ºC, otra fase de 1 minuto a 63ºC y una fase final de 1 minuto a 72ºC. Para terminar un ciclo final de 10 minutos a 72ºC. TABLA 8. Primers de dideoxinucleótidos empleados para tet(A), tet(B) y tet(C) Secuencia del primer (5’ a 3’) Gen de resistencia Forward Reverse Amplicón (bp) tet(A) GGCGGTCTTCTTCATCATGC CGGCAGGCAGAGCAAGTAGA 502 tet(B) CGCCCAGTGCTGTTGTTGTC CGCGTTGAGAAGCTGAGGTG 173 tet(C) GCTGTAGGCATAGGCTTGGT GCCGGAAGCGAGAAGAATCA 888 15 3.7. Comprobación de presencia/ausencia de amplificado por electroforesis Todas y cada una de las reacciones de PCR, con independencia del protocolo empleado previamente, fueron sometidas a su detección mediante gel de electroforesis de agarosa. De este modo se pudo determinar el funcionamiento de la reacción y observar la amplificación del material genético apropiado y su tamaño. Se visualizó la presencia de bandeo gracias al empleo de Red Safe (iNtRON biotechnology) al 5%, un agente intercalante de menor toxicidad que el bromuro de etidio y por tanto, más seguro. Se realizó la mezcla de 5µL de muestra procedente de la PCR con 2µL de tampón de carga para la carga del gel. El tamaño de los amplicones fue confirmado mediante comparación con el marcador molecular GeneRuler 100-bp DNA Ladder Plus (MBI, Fermentas, Burlington). Las muestras se corrieron en un del gel de agarosa de 1,2% de concentración (Agarose, Roche) en tampón TAE 1x, durante unos 45 minutos y a un voltaje de 100V. Los geles se visualizaron mediante un transiluminador Vilber Lourmat (09 200272) con luz UV. 3.8. Conjugación de cepas resistentes (donadoras) y sensibles (receptoras) 3.8.1. Conjugación de cepas de Escherichia coli con Salmonella spp. El proceso de conjugación se llevó a cabo mediante un protocolo predeterminado (Gervers et al., 2003) con unas modificaciones oportunas para el ensayo que nos concierne. Para el inóculo inicial se resuspendieron 3-4 colonias de una variedad de cepas bacterianas receptoras de Salmonella spp. en 10mL de TSB (BactoTM Tryptic Soy Broth) durante 24h a 37±1ºC. Dichas cepas eran procedentes de estudios anteriores aisladas de heces de pollo, quedando anotadas en la Tabla 8. Dichas cepas receptoras habían pasado por un ensayo de susceptibilidad a antimicrobianos, resultando sensibles a todos ellos, lo que las convierte en aptas para el ensayo. Finalmente se escogieron aleatoriamente dos de las cepas para la realización del ensayo, siendo la cepa 179 y la 188. TABLA 8. Cepas de Salmonella spp. empleadas como cepas receptoras Cepa Sensibilidad Salmonella spp. 179 A los 12 antibióticos Salmonella spp. 182 A los 12 antibióticos Salmonella spp. 186 A los 12 antibióticos Salmonella spp. 188 A los 12 antibióticos Se procedió del mismo modo con las cepas de bacterias donadoras de E. coli, inoculando 3-4 colonias en 10mL de TSB (BactoTM Tryptic Soy Broth) durante 24h a 37±1ºC. Las cepas se escogieron en función de los resultados obtenidos por los ensayos de susceptibilidad a antimicrobianos, escogiendo aquellas que presentaran multirresistencia, quedando anotadas en la Tabla 9. 16 TABLA 9. Cepas de E. coli. empleadas como cepas donadoras Cepa Resistencia M2EII4 C, AMP, KF, AMC, TE, NA M2B3 AMC, TE M3E2 CN, AMP, AMC, TE, NA, S, CIP M8D2 AMC, TE, NA A continuación se transfirieron 10 μL de cada una de las cepas, receptoras y donadoras (el equivalente a 1 en la escala McFarland, procedente de un tubo de medio de cultivo con valor 4 en la escala McFarland) a otro tubo con 10mL de TSB, dejando crecer durante 4h a 37±1ºC. Posteriormente se cogió 1mL, tanto del medio de cepas donadoras como del medio de receptoras (equivalente a 104 céls/mL) y se dispuso en un tubo nuevo, mezclando 1mL de cepa donadora y 1mL de cepa receptora, haciendo un total de 2mL. La mezcla de cepas queda anotada en la Tabla 10. TABLA 10. Mezcla de cepas de E. coli donadoras con Salmonella spp. receptoras Cepas de Salmonella spp. 179 Cepas de Salmonella spp. 188 Salmonella spp. 179 + Escherichia coli M2EII4 Salmonella spp. 188 + Escherichia coli M2EII4 Salmonella spp. 179 + Escherichia coli M2B3 Salmonella spp. 188 + Escherichia coli M2B3 Salmonella spp. 179 + Escherichia coli M3E2 Salmonella spp. 188 + Escherichia coli M3E2 Salmonella spp. 179 + Escherichia coli M8D2 Salmonella spp. 188 + Escherichia coli M8D2 A partir de aquí se procedió con el protocolo predeterminado. En lugar de emplear Peptone Physiological Saline Solution se usó APT. Como medio no selectivo líquido se usó el TSB. Para la selección de las cepas receptoras de Salmonella spp. se empleó el medio cromógeno (Oxoid Salmonella Chromogenic Agar Base + Oxoid Salmonella Selective Supplement) y TBX para E. coli. La selección de las cepas se produjo mediante la adición de antibiótico en el medio TSB que contenía las dos cepas conjuntamente, siendo los 5 antibióticos seleccionados y con concentración: AMP 64μg/mL (Guinama ampicilina trihidrato), Amox 32μg/mL (Sigma Amoxicillin), S 32μg/mL (Guinama estreptomicina sulfato), NA 32μg/mL (AppliChem Nalidixic Acid) y C 32μg/mL (Panreac Chloramphenicol). Estos medios se realizaron con antibióticos a la concentración mínima inhibitoria equivalente para la concentración de los discos usados en el antibiograma, según indica “Performance Standards for Antimicrobial Susceptibility Testing; Seventeeth Informational Supplement. January 2007” para las Enterobacteriaceae. Con esto, se seleccionaron las cepas de Salmonella que conjugaron con E. coli y que obtuvieron resistencia a algunos de estos antibióticos mediante conjugación bacteriana. 3.9. Análisis estadístico de los datos Para el análisis estadístico se empleó el programa informático ‘’Statgraphics Centurion XVI’’. Se realizó un análisis de los datos empleando un análisis de correlación mediante una tabla de contingencia, específicamente una tabulación cruzada con el fin de analizar la relación entre dos o más variables. Se consideró como estadísticamente significativos aquellos análisis con un p-valor inferior a 0,05. 17 3.10. Análisis de los primers de PCR Las secuencias de los primers, procedentes de bibliografía, fueron comprobadas mediante el método de alineamiento contra la secuencia génica del microorganismo, en este caso Escherichia coli. Esto se produjo mediante el empleo del programa informático nucleotide BLAST, conseguido vía online por el NCBI. Se procedió al alineamiento de las secuencias de todos los primers empleados en las PCR de CTX-M multiplex, tet multiplex y CMY-2 contra el genoma bacteriano de Escherichia coli (taxid:562) con el fin de comprobar su validez. Del mismo modo se realizó un alineamiento similar entre las secuencias de los primers y el genoma bacteriano, empleando otra herramienta informática de la base de datos europea ENSEMBL. 3.11. Identificación bacteriana Ante algunos casos donde el crecimiento en placa de las cepas no se correspondía con el característico de Escherichia coli, se realizó una identificación bacteriana mediante una tinción de gram. El procedimiento se realizó empleando un protocolo estandarizado de tinción Gram (Bergey et al., 1994). 18 4. RESULTADOS Y DISCUSIÓN 4.1. Susceptibilidad a antimicrobianos Los datos obtenidos de los análisis de susceptibilidad a los 12 antimicrobianos (AK, AMP, AMC, K, CRO, CIP, NA, CN, TE, S, KF y C) de las 80 cepas en total de Escherichia coli, procedentes tanto de los meconios (15 cepas) como de los huevos (65 cepas), presentaron unos valores homogéneos exceptuando el caso de determinadas cepas que presentaron resistencias a un elevado número de antibióticos. 4.1.1. Influencia del origen de la cepa frente a susceptibilidad a antimicrobianos En el caso de las cepas de Escherichia coli procedentes de los meconios se comparó la prevalencia de los niveles de sensibilidad mostrados, ya sea sensible, intermedia o resistente, a los antibióticos, tal y como se muestra en la Figura 4.1. Los resultados obtenidos de dichas muestras presentan una mayor predominancia de las cepas bacterianas sensibles a dichos antimicrobianos, con unos valores medios de sensibilidad en torno al 69,44%. Las cepas con mayor valor fueron la cepas 605 (a-b) y la 612 (a-b) con valores de un 83,33%. Los resultados de sensibilidad a antimicrobianos por parte de Escherichia coli obtenidos en este estudio, se muestran acordes con la situación observada en otros estudios previos similares (Van den Bogaar et al., 2001; Iqbal et al., 2008; Dierikx et al., 2010), con un valor medio de sensibilidad a antibióticos superior al 60%. Respecto a los valores de resistencia a antimicrobianos, los valores medios son de un 25,56%, encontrándonos con unos valores de resistencia en torno al 25% en la mayoría de casos y con valores elevados en algunas cepas determinadas como la 604 (a-b) y la 617 (a-b), siendo en estas la prevalencia de resistencia de un 58,33% y 37,50% respectivamente. A diferencia de los valores de sensibilidad, en los valores de resistencia se encuentra una mayor disparidad, debido a que encontramos en algunas cepas valores cercanos al 8% y 12%, y en otros casos valores del 25% y 33%. Estos valores de resistencia, pese a ser elevados en determinadas cepas, concuerdan con los valores obtenidos en otros estudios de susceptibilidad a antimicrobianos en E. coli (Sánchez et al., 2008). En cuanto a los valores de sensibilidad intermedia, los datos muestran una prevalencia escasa, con un valor medio de un 5%. En la mayoría de los casos, los valores de resistencia intermedia presentan valores del 8% mientras que en otros casos, los valores están en torno al 4% y determinados casos como en las cepas 605 (a-b) y la 616 (a-b) son del 0%. Para determinar la validez del análisis realizado, se realizó la prueba de hipótesis con la que poder determinar si dichos valores se podían aceptar o rechazar en función de si el intervalo de confianza era superior al 95%, quedando probado que eran válidas al presentar un p-valor de 0,0089, inferior al valor de corte establecido en el 0,05. 19 Figura 4.1. Diagrama de barras de Muestra vs. Susceptibilidad en cepas procedentes de meconios. En la gráfica se muestran los valores de susceptibilidad a los 12 antimicrobianos por parte de cada una de las cepas. Al haber dos variantes por cepa el análisis muestra los resultados en 24 antimicrobianos por cepa, con valor sensible (S), intermedio (I) o resistente (R), de las 15 cepas procedentes de los meconios. Se procedió con el mismo método de análisis para el caso de las cepas de Escherichia coli procedentes de las cáscaras de huevos. En este caso se realizó la comparativa entre los diferentes grupos de huevos en función de su origen comercial, doméstico y ecológico, con una comparativa individual entre todos y posteriormente de forma general, frente a la susceptibilidad ante los 12 antimicrobianos. Los datos obtenidos para las cepas de huevos de origen comercial, mostraron una mayor prevalencia de cepas sensibles a los antibióticos, con un valor medio del 76,67%. Este valor es similar al obtenido en los meconios, ligeramente mayor, puesto que los huevos en su salida quedan expuestos a la microbiota presente en la cloaca del ave, siendo además, muy parejos a los obtenidos en otro estudio (Musgrove et al., 2006). Por lo que respecta a los valores de susceptibilidad intermedia y resistencia, ambos poseen unos valores idénticos, de un 11,67% en los dos casos. Los valores de resistencia obtenidos en las cepas de los huevos comerciales son ligeramente superiores en comparación con los que se postulan en otro estudio (Musgrove et al., 2006), quizás poniendo en manifiesto el aumento de las resistencias a antibióticos con el paso del tiempo. En este caso, la obtención de cepas procedentes de los huevos comerciales resultó improductiva puesto que en la mayoría de los casos el crecimiento fue negativo. Debido a esto, para obtener unos datos analizables con una mayor fiabilidad, se deberían conseguir aislar un número más elevado de cepas. La teoría postulada para explicar la ausencia de crecimiento de cepas procedentes de los huevos comerciales, se basa en que esta ausencia puede venir ocasionada por el deterioro de las cepas al permanecer un mayor tiempo en unas condiciones no óptimas para su supervivencia, al pasar por las etapas de transporte y almacenamiento típicos de un producto alimenticio comercial. A consecuencia de esta situación, los datos obtenidos de las cepas de huevos comerciales son reducidos, representando el 8,33% del total de las muestras obtenidas y se deben analizar teniendo en cuenta esta reducida representación. Muestra vs. Susceptibilidad 0246810 12 14 16 18 20 22 24 frecuencia Muestra 601 602 604 605 607 610 611 612 614 615 616 617 619 620 622 Susceptibilidad S I R 20 En el caso de las cepas provenientes de los huevos de origen doméstico, con una representación del 41,67%, los resultados mostraron unos valores generales similares a las obtenidas de huevos comerciales. Esto concuerda con lo preestablecido debido a que tanto los huevos comerciales como los domésticos proceden de la misma estirpe de aves con origen comercial (no ecológico), con lo que la variabilidad en los valores de susceptibilidad a antimicrobianos de las cepas deben ser mínimos. Para los valores de sensibilidad fueron ligeramente mayores que los comerciales, siendo estos muy elevados, del 84%, este dato fue previsible puesto que estas cepas mantienen un menor contacto con moléculas antimicrobianas que las cepas de huevos comerciales. En cuanto a los valores de susceptibilidad intermedia y resistencia, los datos difirieron entre sí, a diferencia de los huevos comerciales. Para la sensibilidad intermedia el valor fue inapreciable, del 4,67%, mientras que para el caso de cepas con resistencia fue del 11,33%, prácticamente idéntico al de las cepas de origen comercial, debido a que comparten el mismo origen de aves progenitoras. Respecto a los resultados obtenidos para las cepas de huevos de origen ecológico, los valores no correspondieron con la idea preconcebida por estudios previos (Sapkota et al., 2011) de que éstos por su origen tendrían menos cepas resistentes. La prevalencia de cepas sensibles a antimicrobianos ha resultado inferior a la obtenida por los huevos comerciales y domésticos, con un valor del 69,17%. En cuanto a la susceptibilidad intermedia, el valor se situó en un 8,89%, dentro de la media general. Por su parte, la prevalencia de las cepas resistentes a los antibióticos ha sido la más elevada de todas, llegando a ser aproximadamente el doble que en el caso de los huevos comerciales y domésticos, con un valor del 21,94%. La explicación a estos valores de sensibilidad y resistencia obtenidos puede deberse a que pese a que las aves ecológicas no poseen ninguna clase de contacto a antibióticos durante varias generaciones, la posible explicación de esta reducida sensibilidad radica en el contacto de dichas aves en libertad con las bacterias del ecosistema que si puedan haber desarrollado la resistencia, transfiriéndose de este modo a su microbiota. La diferencia entre las cepas de los tres orígenes se puede observar en la Figura 4.2. Figura 4.2. Diagrama de barras de Origen de cepas de E. coli de los huevos vs. Susceptibilidad. En la gráfica se muestran los valores de frecuencia de susceptibilidad frente a los 12 antimicrobianos de las 60 cepas procedentes de los huevos frente a antimicrobianos, bien sensibles (S), intermedios (I) o resistentes (R), en función de su origen comercial (sobre 60 resultados), doméstico (sobre 300 resultados) o ecológico (sobre 360 resultados). Origen vs. Susceptibilidad 030 60 90 120 150 180 210 240 270 300 330 360 frecuencia Origen comercial doméstico ecológico Susceptibilidad S I R 27 4.3. Detección de β-lactamasas de amplio espectro de tipo CMY Con el fin de analizar la presencia del gen para la β-lactamasa de amplio espectro de tipo CMY-2 se siguió el mismo procedimiento que en el caso de las enzimas tipo CTX-M mediante la realización de una PCR específica y posterior visualización del amplificado con un gel de electroforesis. Los resultados obtenidos en las cepas procedentes de los meconios, demostraron un 100% de ausencia, suponiendo 30 negativos de los 30 posibles, tal y como se observa en la Figura 4.8. Frente a la ausencia de cualquier positivo se procedió a la repetición del proceso, obteniendo el mismo resultado en 3 ocasiones. Además, para comprobar que el error no se basaba en si había material genético tras la purificación, se realizó un gel de electroforesis con una muestra de dicho material, observando una banda que verificaba su presencia. Para determinar si los resultados obtenidos en la amplificación eran válidos, se procedió con una búsqueda bibliográfica donde, además de la original donde se extraen las secuencias de los primers (Kojima et al., 2005), se observó que otros autores empleaban los mismos primers y las condiciones establecidas por éste para la realización de sus estudios (Randall et al., 2011; Shahada et al., 2013; Baron et al., 2014) mostrando resultados positivos para la presencia del gen. Así mismo, se empleó el programa informático de algoritmos de alineamientos de secuencias BLAST nucleotide, para observar las regiones de alineamiento de los primers empleados frente al genoma bacteriano de la Escherichia coli, observando resultados válidos al mostrar las secuencias del gen blaCMY-2. Tras los análisis realizados a fin de verificar la validez de la metodología empleada, y pese a no poseer una cepa control positiva con la que ratificar resultados, se toma como válida la prueba de amplificación por PCR, donde se concluye que las cepas procedentes de los meconios no han mostrado la presencia del gen de β-lactamasas tipo CMY-2 al dar negativo en todas las cepas analizadas. Figura 4.8. Electroforesis tras la amplificación por PCR del gen para β-lactamasas de amplio espectro de tipo CMY-2. En la imagen se puede observar la ausencia de cualquier banda indicativa de la presencia del gen, siendo esta característica a un peso molecular de 1100Kb. En el caso de las cepas obtenidas de los huevos de diferente origen, el resultado en la determinación de la presencia del gen fue idéntico al conseguido en las cepas de los meconios, dando valores negativos para todas las cepas analizadas. De nuevo, se realizó el proceso por triplicado a fin de corroborar los datos y se procedió con las comprobaciones previamente comentadas del mismo modo que con las cepas de los meconios. 28 4.4. Detección de genes para resistencia a tetraciclina tipo tet(A), tet(B) y tet(C) Como ocurre con los genes de β-lactamasas de amplio espectro de tipo CTX-M, los genes para enzimas de resistencia a tetraciclinas son muy numerosas, por ello, en este estudio nos hemos centrado en el análisis de aquellas más prevalentes en el entorno agropecuario, siendo la tet(A), tet(B) y tet(C) las escogidas para el estudio. Los resultados analizados, obtenidos mediante amplificación de las cepas procedentes de los meconios, muestran que en el 33,33% de los casos dieron un resultado positivo para el gen de tet(A), suponiendo 5 de las 15 cepas analizadas, correspondiendo con las cepas 601 (ab), 602 (a-b), 616 (a-b), 617(a-b) y 619 (a-b) las que dieron positivo para la presencia del gen. En cuanto al gen de tet(B), los resultados muestran que en el 20% de las cepas se dio positivo para la presencia del gen, siendo la 604 (a-b), 617 (a-b) y la 619 (a-b) las 3 cepas con dichos resultados. Por lo que respecta al gen tet(C), ninguna de las 30 cepas proporcionó un valor positivo. Al no disponer de un control positivo válido para el gen tet(C), se realizó el mismo análisis de los primers mediante el programa de alineamiento BLAST, así como las pertinentes repeticiones de la prueba de amplificación, del mismo modo que se procedió con el gen de las β-lactamasas CMY-2. Finalmente se obtuvieron resultados positivos para el gen en las pruebas realizadas para las muestras de los huevos. Con esto se confirmó que el proceso de amplificación era válido y que en las cepas procedentes de los meconios no se mostró la presencia del gen tet(C). A nivel de prevalencia general, el gen que presenta mayor presencia es el tet(A), suponiendo un 62,50% de los casos de positivos, frente al 37,50% de presencia del gen tet(B), valores demostrados en la Figura 4.9. Dichos valores corresponden con los mostrados en estudios previos (Bryan et al., 2004; Chopra y Roberts, 2001) donde se demuestra la mayor prevalencia de los genes tet(A) y tet(B) en Escherichia coli y muestras procedentes de animales. Figura 4.9. Diagrama de barras de Meconios vs. Resistencia en genes de tetraciclinas. En la gráfica se muestra el número de cepas, de las 15 analizadas, que han dado positivo para la presencia de los genes de resistencia a tetraciclinas. Meconios vs. Resistencia tetraciclinas 0 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14 15 frecuencia Meconios GEN tet(A) tet(B) 29 En cuanto a los resultados de las cepas provenientes de los huevos, los análisis por amplificación del gen mostrados en la Figura 4.10, se observó un mayor nivel de presencia del gen tet(A) que en los meconios, en el caso de los huevos comerciales y ecológicos, el 100% de las cepas han dado resultado positivo, con 5 y 25 cepas respectivamente, mientras que para los huevos domésticos, el valor fue inferior, situándose en un 65% con 13 cepas positivas de las 20 cepas analizadas. Figura 4.10. Electroforesis tras la amplificación por PCR de los genes de resistencia a tetraciclinas tipo tet(A), tet(B) y tet(C). En la imagen se observa la amplificación de las regiones específicas para los genes, señalados por flechas, de las cepas M3E (ecológicos) analizadas. Para el gen de tet(B), los resultados indican que en los huevos comerciales de nuevo hay un 100% de positivos, contrastando con el 20% de positivos obtenido en el caso de los huevos de origen doméstico, suponiendo en este solo 4 de las 20 cepas analizadas. En cuanto a los huevos ecológicos, 15 cepas de las 25 han dado valor positivo, suponiendo el 60 % de ellas. En cuanto a la presencia del gen tet(C), tan sólo 5 cepas de huevos de origen ecológico presentaron un valor positivo para la presencia del gen, suponiendo el 20% de las cepas de origen ecológico. La prevalencia de cada gen en función del origen, demuestra que para las cepas de huevos comerciales, los genes tet(A) y tet(B) poseen el mismo valor, con el 50% de positivos para cada uno. Por su parte, en el origen doméstico, es el gen tet(A) el que obtiene la mayor presencia, con un 76,47% de los positivos, frente al 23,53% del gen tet(B). Finalmente para el origen ecológico, la prevalencia sigue el patrón general, dominando el gen tet(A) con un 59,72%, seguido del gen tet(B) con un 33,33% y del gen tet(C) con un inapreciable 6,94%. Los datos quedan reflejados gráficamente en la Figura 4.11. A nivel general, los datos muestran que el gen tet(A) es que el que consigue una mayor prevalencia en las cepas procedentes de los huevos, con un valor del 59,72%, frente al 33,33% de prevalencia que se ha obtenido para la presencia del gen tet(B). Finalmente el gen tet(C) es el que menor presencia ha demostrado, con tan solo un 6,94% de los casos. Los datos alcanzados en este estudio se ajustan a los obtenidos en estudios anteriores sobre la prevalencia de las resistencias a tetraciclinas en muestras animales (Bryan et al., 2004; Chopra y Roberts, 2001), donde los gen de resistencia tet(A) y tet(B) se encuentran entre los de mayor prevalencia. 30 Figura 4.11. Diagrama de barras de Origen de cepas de E. coli de los huevos vs. Resistencia en genes de tetraciclinas. En la gráfica se muestran las cepas que han presentado valor positivo para la presencia de los genes de resistencia a tetraciclinas, en función de su origen comercial (5 cepas analizadas), doméstico (20 cepas analizadas) o ecológico (25 cepas analizadas). Por lo que respecta a la prevalencia general de las resistencias en función del origen, los huevos domésticos supusieron el 13,89% de los positivos obtenidos, frente al 23,61% de los huevos domésticos. Esto indica que los huevos ecológicos fueron los que obtienen el mayor índice de presencia de genes de resistencia a tetraciclinas, suponiendo un valor del 62,50% de positivos obtenidos tras el análisis de las cepas. Estos datos muestran un resultado similar a los obtenidos en la amplificación de los genes de β-lactamasas tipo CTX-M. Como se observa en la Figura 4.11, los huevos comerciales poseen una distribución homogénea de los genes, mientras que en domésticos y ecológicos hay mayor variabilidad. De nuevo los ecológicos poseen el mayor índice de resistencias, posible consecuencia del mayor contacto con un microbioma más variado que le pueda transmitir las resistencias. 4.5. Presencia/ausencia de genes de resistencia en función del origen del huevo En términos generales de presencia o ausencia de genes de resistencia a antibióticos, los resultados obtenidos tras el análisis han demostrado que los huevos ecológicos son los que mayor presencia de genes de resistencia contienen, suponiendo el 54,23% de todos los positivos obtenidos en las cepas de los huevos. Por su parte los huevos domésticos han sido los segundos, suponiendo el 33,33% de positivos obtenidos a nivel general, frente a los huevos comerciales con un 12,44%, siendo estos últimos los que contienen las cepas con menor presencia de genes de resistencia han presentado, tal y como se demuestra gráficamente en la Figura 4.12. Estos datos se explican con la teoría postulada con anterioridad frente a las resistencias obtenidas en los genes de β-lactamasa tipo CTX-M y tetraciclinas, donde se observa una homogeneidad en los huevos comerciales, y mayor variabilidad en los domésticos y ecológicos, suponiendo estos últimos los que mayor presencia de genes de resistencia poseen en todos los genes analizados. 0 5 10 15 20 25 frecuencia ORIGEN Origen de los huevos vs. Resistencia tetraciclinas Comercial Doméstico Ecológico GEN tet(A) tet(B) tet(C) 31 Figura 4.12. Diagrama de barras de Origen de cepas de E. coli de los huevos vs. Presencia de positivos y negativos a genes de resistencia. En la gráfica se muestran los positivos y negativos a nivel general para la presencia de genes de resistencia de los 7 genes examinados, obtenidos del análisis de las cepas de huevos comerciales (5 cepas analizadas, 35 datos obtenidos), domésticos (20 cepas analizadas, 140 datos obtenidos) y ecológicos (25 cepas analizadas, 175 datos obtenidos). 4.6. Transferencia de genes de resistencia mediante conjugación Los resultados obtenidos tras la conjugación de las 8 mezclas de cepas donadoras de Escherichia coli, poseedoras de genes de resistencia, tal y como se muestra en la Tabla 9, con las cepas receptoras de Salmonella spp. sensibles a los antibióticos tal y como se muestra en la Tabla 8, han demostrado la transferencia de genes de resistencia en un total de 6 mezclas. Las 2 cepas 178 y 188 de Salmonella spp. empleadas, mostraron sensibilidad a los 12 antibióticos testados, manifestando que no poseían ningún mecanismo de resistencia frente a antimicrobianos. Tras la conjugación de estas cepas con las de Escherichia coli resistentes, los resultados mostraron una adquisición por parte de las cepas de Salmonella spp. de resistencias frente a algunos antimicrobianos, quedando anotados en la Tabla 11 y demostrados gráficamente en la Figura 4.13. TABLA 11. Cepas de Salmonella spp. receptoras que han mostrado resistencia tras la conjugación Cepa de Salmonella Cepa de E. coli Antibiótico selectivo Resistencias mostradas 179 M2B3 Ampicilina 2 179 M2B3 Ácido Nalidíxico 1 179 M3E2 Amoxicilina 7 188 M2B3 Cloranfenicol 1 188 M3E2 Amoxicilina 7 188 M3E2 Ácido Nalidíxico 7 Origen de los huevos vs. Susceptibilidad general 025 50 75 100 125 150 175 frecuencia ORIGEN Comercial Doméstico Ecológico RESULTADO + - 32 Figura 4.13. Diagrama de barras de Cepas conjugadas vs. Susceptibilidad al antimicrobiano. En la gráfica se muestran los valores obtenidos para los 12 antimicrobianos analizados de sensibilidad (S), susceptibilidad intermedia (I) y resistencia (R) obtenidos por las cepas de Salmonella spp. conjugadas con las de Escherichia coli. En cuanto a la resistencia en función del antibiótico, de las cepas de Salmonella spp. procedentes de las 6 mezclas positivas para resistencia, los resultados obtenidos muestran que el mayor nivel de transferencia de resistencia a antibiótico ha sido frente a la tetraciclina (TE) suponiendo el 24% de los positivos (positivo en 6/6 cepas), seguido de la amoxicilina (AMC) con valor del 16% frente al total de positivos (positivo en 4/6 cepas). Finalmente se ha obtenido resistencia en 3/6 cepas para los antibióticos ampicilina (AMP), ciprofloxacino (CIP), gentamicina (CN), estreptomicina (S) y ácido nalidíxico (NA), suponiendo cada uno de ellos el 12% de positivos del total. Los resultados obtenidos quedan gráficamente demostrados en la Figura 4.14. Estos resultados muestran similitud con otros estudios de transferencia de genes (San Martín et al., 2008) donde se observó un mayor nivel de transferencia de los genes de resistencia a tetraciclinas y β-lactámicos. Figura 4.14. Diagrama de barras de Antibióticos vs. Positivos mostrados. En la gráfica se muestran los antibióticos frente a los que se ha mostrado resistencia, en las 6 mezclas de conjugación que presentaban resistencias, por parte de las cepas de Salmonella spp. 012345678910 11 12 frecuencia CEPA Cepa vs. Susceptibilidad a antimicrobiano 179+M2B3(AMP) 179+M2B3(NA) 179+M2EII4(S) 179+M3E2(AMOX) 179+M8D2(C) 188+M2B3(C) 188+M2EII4(S) 188+M3E2(AMOX) 188+M3E2(NA) RESULTADO S I R Antibiótico vs. Positivos para resistencia 0 1 2 3 4 5 6 frecuencia ANTIBIÓTICO AMC AMP CIP CN NA S TE RESULTADO R 33 5. CONCLUSIONES  Las bacterias procedentes de los meconios muestran unos niveles de resistencia elevados. Pese a poseer unos valores de sensibilidad a antimicrobianos superiores al 60%, en todas las cepas se presentaron resistencias a 1 o más agentes antimicrobianos. Esto pone de manifiesto que las resistencias están presentes desde el inicio de vida del pollo, puesto que éstos son portadores de las cepas resistentes transmitidas por los progenitores.  Los huevos de origen comercial tienen un menor desarrollo de colonias bacterianas. Las condiciones a las que se ven sometidos los huevos comerciales, de transporte, refrigeración y almacenamiento, hace que las bacterias que se encuentren en su cáscara no puedan tener un desarrollo apropiado, afectando a su supervivencia. Los domésticos y ecológicos por su parte, tienen un menor procesado, o nulo, por lo que las bacterias poseen un mayor nivel de supervivencia.  Los huevos ecológicos poseen el mayor índice de resistencias, por su parte los comerciales poseen una mayor homogeneidad. Los huevos ecológicos proceden de aves ecológicas que se encuentran en libertad, hecho que las permite estar en contacto con un microbioma muy diverso, donde el desarrollo de las resistencias y su transferencia es más variada. Los huevos comerciales provienen de aves comerciales sujetas a una presión antibiótica que promueve una distribución homogénea de las resistencias.  Las cepas obtenidas de los meconios poseen resistencia a una gran diversidad de antibióticos. Los broilers son portadores de resistencias mayoritariamente a ácido nalidíxico, ampicilina, amoxicilina-clavulánico y tetraciclinas, siendo todos antibióticos ampliamente usados en clínica humana y veterinaria, un hecho que supondría la disminución de la eficacia por parte de los tratamientos administrados en caso de infecciones.  La distribución de resistencias en los huevos sigue un patrón similar al de los meconios, habiendo un mayor número en los huevos ecológicos. Los huevos comerciales y domésticos presentan resistencias similares a la de los meconios, pero en el caso de los ecológicos, presentan además resistencia a antibióticos como la ciprofloxacina y la estreptomicina. Este hecho supone un gran riesgo de transmisión de éstas resistencias, siendo estos antibióticos empleados en clínica para el tratamiento de infecciones graves, pudiendo suponer un problema sanitario.  Los genes de resistencia a β-lactámicos tipo CTX-M se encuentran entre los de mayor dispersión en Escherichia coli. Este hecho expone que la resistencia frente a β-lactámicos se encuentra ampliamente extendida, puesto que tanto en las cepas de meconios como en los huevos se encontró una o varias de las variantes del gen de las β-lactamasas tipo CTX-M. 34  Las β-lactamasas tipo AmpC (CMY) no se encuentran representadas en las muestras de broilers y huevos en esta región. Las pruebas de amplificación han demostrado que ninguna de las cepas bacterianas poseía el gen de la β-lactamasa CMY, con lo que pone de manifiesto que en la región analizada para el estudio este mecanismo de resistencia no se encuentra presente.  La mayoría de cepas bacterianas obtenidas de meconios y huevos presentan uno o varios genes de resistencia a tetraciclina. El gen tet(A) y tet(B) se encuentran en la mayoría de las cepas analizadas para huevos comerciales y domésticos, y en el caso de los ecológicos se ha observado presencia para los tres genes analizados, quedando expuesto la amplia dispersión de los genes de resistencia de un antibiótico con gran uso en veterinaria.  Las resistencias observadas en Escherichia coli se han transmitido mediante conjugación a Salmonella spp. Esto confirma la disponibilidad de elementos genéticos móviles y de mecanismos de conjugación, con los cuales poder transmitir la resistencia a antimicrobianos.  Los genes con mayor índice de transmisión son frente a tetraciclina y amoxicilinaclavulánico. Estos dos antibióticos se encuentran entre los de mayor uso en clínica, con lo que su transmisión y dispersión es un riesgo sanitario de elevada importancia.  Mediante el empleo de un protocolo simple de amplificación por PCR se puede realizar un análisis de las resistencias a antibióticos presentes y poder determinar el estado de éstas, lo cual supondría en veterinaria la posibilidad de utilizar tratamientos antibióticos más efectivos. 35 6. BIBLIOGRAFÍA American Academy of Microbiology. 2009. Antibiotic resistance: an ecological perspective on an old problem. Report of a colloquium, 12 to 14 October 2008, Annecy, France. American Academy of Microbiology, Washington, DC. Anderl J.N, Franklin M.J & Stewart P.S. 2000. Role of antibiotic penetration limitation in Klebsiella pneumoniae biofilm resistance to ampicillin and ciprofloxacin. Antimicrob. Agents Chemother., 44:1818-1824. Arumugam M, Raes J, Pelletier E, Le Paslier D, Yamada T, Mende DR, et al. 2011. 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