Caracterización del mecanismo molecular de activación de TLR4 por etanol: papel de la proteína HMGB1

UNIVERSITAT POLITÈCNICA DE VALÈNCIA ESCOLA TÈCNICA SUPERIOR D´ENGINYERIA AGRONÒMICA I DEL MEDI NATURAL Caracterización del mecanismo molecular de activación de TLR4 por etanol: papel de la proteína HMGB1 TRABAJO FIN DE GRADO EN BIOTECNOLOGÍA ALUMNO/A: Luis Gómez Saiz DIRIGIDO POR: Consuelo Guerri Sirera TUTOR/A: José Salvador Vicente Antón Curso Académico: 2014-2015 VALENCIA, Julio de 2015 ESCOLA TÈCNICA SUPERIOR D'ENGINYERIA AGRONÒMICA I DEL MEDI NATURAL Datos personales Nombre y apellidos: Luis Gómez Saiz Datos del trabajo fin de grado Título: Caracterización del mecanismo molecular de activación de TLR4 por etanol: papel de la proteína HMGB1. Titulación: Grado en Biotecnología Tutor/a: José Salvador Vicente Antón Cotutor/a: Consuelo Guerri Sirera Fecha de lectura: Julio 2015 Resumen Resultados recientes del laboratorio de Patología Celular del CIPF demuestran que el etanol, a concentraciones con relevancia fisiológica de etanol (10-50 mM), es capaz de activar la señalización y respuesta del receptor del sistema innato inmunitario, TLR4, en células gliales (microglia y astroglia) desencadenado una respuesta inflamatoria en cerebro que causa neuroinflamación y daño neural. De hecho, la eliminación genética de TLR4 protege contra el daño neuroinflamatorio causado por el etanol. Datos recientes postulan que la activación del TLR4 se produciría por la HMGB1 (high-mobility group box 1), proteína que se libera por las células neurales ante un insulto de daño tisular o inflamatorio. En base a estos últimos resultados, el objetivo de este trabajo es esclarecer el mecanismo molecular de la activación del TLR4 por parte del etanol y/o la proteína HMGB1 en la respuesta neuroinflamatoria causada por el etanol. Este objetivo se abordara en cultivos primarios corticales de neuronas y astrocitos procedentes de animales silvestres y se evaluará el mecanismo de liberación de HMGB1 en los diferentes tipos células neurales en presencia y ausencia de varias concentraciones de etanol (10, 25 y 50 mM). Palabras clave etanol, neuroinflamación, astrocitos, neuronas, inmunidad ESCOLA TÈCNICA SUPERIOR D'ENGINYERIA AGRONÒMICA I DEL MEDI NATURAL Abstract Recent results from the CIPF Cellular Pathology Laboratory demonstrate that ethanol, at physiologically relevant concentrations of ethanol (10-50 mM), is able to activate the response and signaling of the innate immune system toll-like 4 (TLR4) in glial cells (microglia and astroglial cells) triggering a neuroinflammatory response that leads to neural damage. Indeed, TLR4 genetic deletion protects against neuroinflammatory damage caused by ethanol. Recent data postulate that activation of TLR4 is produced by HMGB1 (high-mobility group box 1), a protein released by neural cells due to an insult or inflammatory damage. Following this line of thinking, the aim of this study is to elucidate the molecular mechanism of activation of TLR4 by ethanol and/or HMGB1 protein in neuroinflammatory response caused by ethanol. This objective is approached by using murine primary cultures of cortical neurons and astrocytes and HMGB1 release will be evaluated in both cell types after stimulation with various concentrations of ethanol (10, 25 and 50 mM). Key words Ethanol, neuroinflammation, astrocytes, neurons, immunity AGRADECIMIENTOS Pues parece que esto ha sido todo, hasta aquí han llegado los cuatro años de carrera, cuatro años que han dado para mucho… En este tiempo he notado como mi familia ha ido creciendo poco a poco hasta llegar a lo que es ahora. Esa familia que hace que eches la vista atrás y te salga una sonrisa en la cara de forma casi inconsciente. Sinceramente, no me puedo imaginar cómo habría sido todo esto sin tener a toda esa gente al lado haciendo todo mucho más sencillo, llevadero y sobre todo más divertido. Madrugar cada mañana para ir a clase me habría resultado aún más difícil de no ser porque sabía que nada más llegar iba a haber alguien preparado para soltar la primera gracia de la mañana. Si empiezo por el principio, me vienen a la mente esas tardes en las salas de estudio del Gali con Pablo y Miguel en las que se nos hacía de noche con todos esos problemas de física, química, estadística… Pero, aquí me falta alguien más imprescindible para los trabajos de grupos de cuatro, Manu. Y ahora sí, los Chachos al completo han sido un pilar básico de mi vida en estos años, esas comidas en el dominos hasta reventar, esos chinacos, y esa foto Chachos que no podía faltar en cada fiesta importante. Y como no podía ser de otra forma, tengo que nombrar a Mendi y Prats, con los que he pasado los mejores momentos de las prácticas en toda la carrera. Creo que no se salva ninguna en la que no nos hayamos reído, y en la que no me lo haya pasado bien. Todo esto con la inestimable ayuda de Edgar, que siempre recordará el momento tapón, y Pablo, ese socarrat que me inició en el mundo del valenciano. Y hablando de valencianos, no puede faltar Joan, que me ha enseñado todo su vocabulario de puro tete valenciano y gracias al cual jugamos todos esos partidos de futbol que nos han unido tanto a las dos clases. Pero ya he nombrado muchos chicos, es el turno de las Chachis, ese grupillo de mujeres que nos hacía a los chicos ser los más envidiados de la discoteca, y que han sido las que han animado todo desde el principio hasta el final. Me he dejado para el final a ese grupillo tan unido que conocí más tarde de lo que me hubiera gustado y que me acogió como uno más, la Xixofamily. Cada uno ha sido para mí un auténtico miembro más de mi familia, y sentirme parte ello me ha hecho muy feliz. Y por supuesto, todos aquellos que han estado conmigo desde siempre, mis padres, mi hermana preferida, y toda mi familia que siempre me han dado lo mejor. Tampoco me olvido de mis amigos de Almansa, los de toda la vida, los de siempre y para siempre. Y por último, quiero dar las gracias a Chelo, por aceptarme en su laboratorio y a toda la gente que ha estado conmigo en él, ayudándome y guiándome cuando me encontraba un poco perdido: Silvia, Toni, María, Majo y sobre todo Jorge, el que más me ha enseñado, mas paciencia ha tenido y sobre todo el que más me ha ayudado con este trabajo. Gracias a todos por lo que habéis hecho y sido, la carrera ha terminado, pero todo lo demás continúa… I ÍNDICE 1. INTRODUCCIÓN ......................................................................................................................... 1 1.1 El etanol y sus efectos ......................................................................................................... 1 1.1.1 Efectos generales e incidencia del alcohol ................................................................... 1 1.1.2 Sistema neuroinmunitario y alcohol ............................................................................ 2 1.2 Componentes celulares del sistema neuroinmunitario ...................................................... 3 1.2.1 Microglía ....................................................................................................................... 5 1.2.2 Astrocitos ..................................................................................................................... 5 1.2.3 Neuronas ...................................................................................................................... 6 1.3 TLR4, neuroinflamación y alcohol ....................................................................................... 7 1.3.1 Receptores tipo Toll. .................................................................................................... 7 1.3.2 TLR4 y su relación con el alcohol .................................................................................. 9 1.4. HMGB1 y su función inflamatoria .................................................................................... 10 2. Objetivos ................................................................................................................................. 13 3. MATERIALES Y MÉTODOS ........................................................................................................ 14 3.1 Animales de experimentación ........................................................................................... 14 3.2 Cultivo primario de astrocitos ........................................................................................... 14 3.3 Cultivo primario de neuronas ............................................................................................ 15 3.4 Estimulación con etanol de las células .............................................................................. 15 3.5 Precipitación de la proteína a partir del medio de cultivo. ............................................... 15 3.5.1 Separación de fases .................................................................................................... 16 3.5.2 Precipitación ............................................................................................................... 16 3.6 Extracción de proteína de las células ................................................................................ 17 3.7 Electroforesis e inmunotransferencia ............................................................................... 17 4. Resultados ............................................................................................................................... 20 4.1 Astrocitos y neuronas en cultivo primario responden frente a etanol liberando HMGB1 20 4.2 El estimulación con etanol desencadena un proceso inflamatorio en las células mediado por TLR4 .................................................................................................................................. 23 4.3 Análisis de la apoptosis inducida por el etanol en las células. .......................................... 26 5. DISCUSIÓN Y CONCLUSIONES ................................................................................................. 30 5.1 Liberación de HMGB1 en cultivos de astrocitos y neuronas estimulados con etanol ...... 30 5.2 Vía de liberación de HMGB1: activa o pasiva. ................................................................... 31 II 5.3 El etanol induce un aumento de la muerte celular por apoptosis. ................................... 32 5.4 Papel de TLR4 en la respuesta al alcohol .......................................................................... 32 5.5 Perspectivas futuras .......................................................................................................... 34 5.5 Conclusiones...................................................................................................................... 35 6. BIBLIOGRAFÍA .......................................................................................................................... 36 III ÍNDICE DE TABLAS Y FIGURAS Tabla I. Relación de anticuerpos y diluciones utilizadas en la detección de proteínas mediante inmunotransferencia ................................................................................................................... 19 Tabla II. Relación de anticuerpos secundarios utilizados ............................................................ 19 Figura 1. Distribución global de todas las causas de muerte atribuibles al alcohol...................... 1 Figura 2. Esquema general de la cascada de señalización intracelular de la estimulación de TLRs (dependiente de la proteína de diferenciación mieloide 88 - MyD88). ........................................ 8 Figura 3. Vías de liberación de HMGB1 ....................................................................................... 11 Figura 4. Proceso seguido para la precipitación de la proteína extracelular a partir del medio de cultivo .......................................................................................................................................... 16 Figura 5. La enzima fosfatasa alcalina cataliza la reacción de eliminación del grupo fosfato de BCIP, cuyo producto reacciona con NBT formando un precipitado con coloración ................... 18 Figura 6. La estimulación de astrocitos con etanol induce la liberación de HMGB1 al medio extracelular ................................................................................................................................. 21 Figura 7. La estimulación con etanol induce la liberación de HMGB1 al medio extracelular en neuronas ..................................................................................................................................... 22 Figura 8. El etanol aumenta los niveles de expresión de la subunidad p65 fosforilada de NFκB en astrocitos ................................................................................................................................ 24 Figura 9. El etanol aumenta los niveles de expresión de la subunidad p65 fosforilada de NFκB en neuronas ................................................................................................................................ 25 Figura 10. El tratamiento con etanol aumenta la expresión de Caspasa3 activa en astrocitos.. 27 Figura 11. Expresión de la enzima Caspasa3 activa en neuronas tratadas con etanol ............... 28 IV ÍNDICE DE ABREVIATURAS ADN: ácido dosoxirribonucleico AP-1: proteína activadora tipo 1 ARN: ácido ribonucleico BCA: ácido bicinconínico BCIP: Sal p-toluidina de 5-bromo-4-cloro-3’-indolislfosfato BSA: álbúmina sérica bovina C3: caspasa3 COX2: ciclooxigenasa 2 DAMP: patrones moleculares asociados al daño DMEM: medio Eagle modificado por Dulbecco ECL: ElectroChemiLuminescence ET: etanol GABA: ácido gamma-aminobutírico GAPDH: gliceraldehído-3-fosfato deshidrogenasa HMGB1: high mobility group box-1 IFN: interferónβ IKK: quinasa de IκB IL: interleucina IL-1R: receptor de la IL-1 iNOS: óxido nítrico sintasa inducible IRAK: quinasa asociada a IL-1R iRNA: RNA interferente IκB: inhibidor del factor κB LPC: lisofosfatidilcolina LPS: lipopolisacárido bacteriano MAPK: proteínas quinasas activadas por mitógenos V MHC: moléculas del complejo mayor de histocompatibilidad MyD88:factor de diferenciación mieloide 88 NFκB: factor nuclear kappa B NMDA: N-metil D-aspartato NO: óxido nítrico PAGE: electroforesis en geles de poliacrilamida PAMP: patrones moleculares asociados a patógenos PBS: tampón fosfato salino PM: peso molecular PRR: receptoes de reconocimiento de patrones PVDF: fluoruro de polivinilideno RAGE: receptor para productos de glicosilación avanzada SBF: suero bobino fetal SDS: dodecilsulfato sódico siRNA: RNA interferente pequeño SNC: sistema nervioso central SNC: sistema nervioso central SPF: libre de patógenos TBS: tampón Tris salino TBS-T: tampón Tris salino con Tween 20 TIR: dominio Toll/IL-1R TLR: receptores tipo toll TNF: factor de necrosis tumoral TRAF: factor asociado al receptor del factor de necrosis tumoral TRIF: proteína adaptadora asociada al dominio TIR Tris: Trisaminometano WT: fenotipo silvestre Introducción 6 desarrollo, funcionamiento y supervivencia neuronal. Están estrechamente relacionados con el control de la homeostasis iónica y molecular del cerebro, detoxificiación, neuroprotección y mantienen la integridad de la barrera hemato-encefálica (Markiewicz y Lukomska, 2006). En estudios recientes se ha descubierto que los astrocitos producen y liberan varios mediadores moleculares, como prostaglandinas, óxido nítrico (NO) y ácido araquidónico, que incrementan o disminuyen el diámetro de los vasos y el flujo sanguíneo en el cerebro (Koehler et al., 2009). Los astrocitos son células dinámicas que responden de forma rápida ante un daño, y juegan un papel relevante en la regulación de la inflamación cerebral (Dietrich et al., 2005). También expresan numerosos receptores que les permiten responder a varios compuestos neuroactivos, incluyendo neurotransmisores, neuropéptidos, factores de crecimiento, citoquinas, moléculas pequeñas y toxinas (Barbeito et al. 2004). En cuanto a la respuesta a etanol, en el laboratorio de la Dra. Guerri se han realizado estudios que demuestran que los astrocitos liberan citoquinas y otros mediadores inflamatorios, contribuyendo a la generación de un ambiente neuroinflamatorio (Blanco et al. 2004). De hecho, se ha demostrado que el etanol a concentraciones fisiológicas relevantes (10-50 mM) es capaz de actuar como un agonista de los receptores TLR4/IL-1R y activar su vía de señalización de forma parecida a como ocurre cuando estos astrocitos son estimulados con sus ligandos, lipopolisacárido bacteriano (LPS) y IL-1β. Tras la estimulación de los astrocitos con etanol, se observa una rápida fosforilación de los factores de transcripción factor nuclear kappa B (NF-κB) y proteína activadora tipo 1 (AP-1), y el aumento de la expresión de óxido nítrico sintasa inducible (iNOS) y ciclooxigenasa 2 (COX-2) tras 30 minutos. Finalmente, a las 3h se observa un aumento en la muerte celular (Blanco et al. 2005) 1.2.3 Neuronas Las neuronas son las responsables de transmitir las señales del sistema nervioso. Su estructura se divide en cuerpo neural o soma y dos tipos de prolongaciones, las dendritas y los axones. El soma es el centro metabólico donde se encuentra el núcleo y los demás componentes celulares. Las múltiples prolongaciones citoplasmáticas del soma dan lugar a las dendritas cuya función es recibir información de las demás neuronas y el medio externo. Por último, el axón conduce los impulsos nerviosos a otras neuronas o células musculares. Las neuronas se caracterizan por su capacidad para responder a los estímulos con una descarga eléctrica, un impulso nervioso, y, además, por su conducción rápida del impulso nervioso a través de largas distancias. De esta manera, las señales se pueden transmitir en Introducción 7 milisegundos de un lugar a otro, ya sea dentro SNC o entre éste y órganos en otros sistemas del organismo. Cuando el impulso nervioso llega a la sinapsis, una sustancia llamada neurotransmisor se libera de la terminal del axón que transmite una señal química de una neurona a la siguiente. Los mecanismos por los que el etanol es capaz de generar cambios en neuronas son complejos. Por una parte el etanol inhibe la función del receptor para glutamato, NMDA (Nmetil D-aspartato), receptor asociado a un canal de Ca2+, lo que conllevaría a una menor entrada de calcio en la célula y a una disminución de la actividad glutamatérgica. Al mismo tiempo, el etanol activa al receptor ácido gamma-aminobutírico (GABA), principal receptor inhibitorio en el SNC. Las neuronas no participan directamente en la inflamación, ya que no se consideran células del sistema inmunitario, sin embargo si son capaces de liberar HMGB1 como respuesta al estímulo generado por el alcohol (Crews et al. 2014). Otras acciones del etanol en el cerebro incluyen: disminución de los factores tróficos y ácido fólico, aumento de la degeneración neuronal, que se relaciona con un fallo en la reparación del ácido desoxirribonucleico (ADN), alteraciones en el proceso de mielinización, deficiencias en tiamina que altera el metabolismo de la glucosa, la función mitocondrial y el metabolismo oxidativo (Harper y Matsumoto, 2005; Guerrini et al., 2009). 1.3 TLR4, neuroinflamación y alcohol 1.3.1 Receptores tipo Toll. Los receptores de tipo Toll (Toll-like receptors, TLR) son una familia de receptores de reconocimiento de patrones (Pattern Recognition Receptors, PRR) que reconocen amplios grupos de patrones moleculares asociados a patógenos (Pathogen Associated Molecular Patterns, PAMPs) como los LPS, las flagelinas, los mananos o los ácidos nucléicos de virus y bacterias. Actualmente se han identificado 11 receptores TLRs en el genoma humano, mientras que en el genoma del ratón se han descrito 13 TLRs, cada uno de ellos codificado por un gen diferente (Dunne y O'Neill, 2003). El TLR4, cuyo ligando específico es la endotoxina bacteriana LPS, es el miembro de la familia TLR que primero se descubrió en mamíferos y el que mejor se ha caracterizado (Beutler, 2000). Medzhitov lo identificó y demostró que activaba NFκB y la síntesis de citoquinas pro-inflamatorias (Medzhitov et al., 1997). Actualmente se conoce que la familia de los TLR desempeña un papel crucial en la inmunidad innata. Introducción 8 Existen dos vías distintas de señalización asociadas con los TLRs: la que requiere el factor de diferenciación mieloide 88(MyD88), y la MyD88-independiente. Todos los TLRs menos TLR-3 señalan por la vía dependiente de MyD88 (Kawai y Akira, 2007). En la figura 2, se muestra un esquema de la ruta: 1) Se presenta el reconocimiento de PAMPs o estímulos externos por un TLR o una combinación de TLRs que genera una cascada de señalización intracelular, 2) bajo estimulación, la MyD88 recluta la kinasa asociada al receptor de interleukina 1 (IRAK) a través de la interacción de los dominios de muerte de ambas moléculas. El IRAK es activado por la fosforilación y se asocia con el factor asociado al receptor del factor de necrosis (TRAF), el TRAF6; 3) la oligomerización del TRAF6 activan la proteína kinasa activada por mitógeno (MAP3K), la cual indirectamente genera la activación de la kinasa IkB (IKK) 4) la IKK es capaz de fosforilar los residudos de serina de la IkB (inhibidor de NF-κB) para su degradación, provocando la liberación NFkB y 5) La activación del NFkB provoca la fosforilación de p65. La proteína p65 forma parte del complejo NF-κB, cuando es fosforilada, p65 se trasloca al núcleo para hacer efectiva la respuesta, estimulando la expresión de genes de moléculas proinflamatorias (citoquinas). La vía MyD88-independiente, empleada en la señalización de TLR-3 y TLR-4, involucra el adaptador TRIF, que contiene un dominio TIR. Como MyD88, la proteína adaptadora asociada al dominio TIR (TRIF) activa TRAF-6 y promueve la producción de NFκB (Kawai y Akira, 2007). Figura 2. Esquema general de la cascada de señalización intracelular de la estimulación de TLRs (dependiente de la proteína de diferenciación mieloide 88 - MyD88). (Rondón-Barragán, 2009) Introducción 9 Todos los receptores TLR se expresan en el SNC, principalmente en células gliales. Los astrocitos en cultivo expresan todos los miembros de los TLR, exceptuando el TLR7 (Jack et al., 2005). La microglía expresa los TLR 1-9, mientras que los oligodendriocitos expresan predominantemente el TLR2 y TLR3 (Okun et al., 2008). En el caso de las neuronas, los TLR expresados son 2, 3, 4 y 8 (Tang et al., 2007). La estimulación de los TLR en las células gliales activa funciones que son importantes para la eliminación de patógenos, pero que también pueden ser tóxicas para otras células que tienen limitada su capacidad regenerativa (Rivest, 2009). Se ha propuesto que la activación del TLR4 incrementa la apoptosis de células microgliales a través de la producción de interferón-β (IFNβ) (Jung et al., 2005). La señalización de TLR inducida por el alcohol culmina en una mayor expresión de genes inmunes pro-inflamatorios a través de NF-κB (Mao et al., 2009). 1.3.2 TLR4 y su relación con el alcohol Respecto a los mecanismos moleculares por los que el etanol induce la neuroinflamación, se ha demostrado que el etanol estimula una respuesta inmune innata específicamente a través del receptor TLR4 y de IL-1R de la membrana de las células gliales (Blanco y Guerri, 2007; Blanco et al., 2005; Fernandez-Lizarbe et al., 2008). La activación de los TLR4 activa a NF-κB y la inducción de genes que codifican moléculas asociadas a la inflamación y citoquinas (Akira y Takeda, 2004). Los hallazgos más relevantes han sido la demostración de que el alcohol es capaz de activar las rutas de señalización mediadas por TLR4 en cultivos de astrocitos (Blanco et al., 2008; Blanco et al., 2005), en microglía y en macrófagos murinos (Fernandez-Lizarbe et al., 2008; FernandezLizarbe et al., 2009). Esta activación desencadena una liberación de citoquinas que no sólo se ha detectado en cerebro, sino también en hígado de animales tratados con alcohol (Qin et al., 2008). La relevancia de la activación de los receptores TLR4 por el etanol y su respuesta inflamatoria y neuroinflamación se demostró bloqueando el receptor TLR4 con anticuerpos específicos (Blanco y Guerri, 2007), con ARN de interfencia en cultivo de astrocitos (Alfonso-Loeches, 2010) o aislando atrocitos o microglía de ratones deficiente en el TLR4 -/- (Alfonso-Loeches et al.,2010; Fernandez-Lizarbe et al., 2008). De esta forma se observó que ratones deficientes en TLR4 estaban protegidos frente al daño ocasionado por el consumo crónico de alcohol. Además se observó un incremento de la expresión de las proteínas TLR2, TLR3 y TLR4 en cerebro alcohólico post-mortem y cerebro de ratón después del tratamiento con etanol (Crews Introducción 10 et al., 2012). También hay evidencia en humanos para la participación del sistema de NF-kB en la corteza prefrontal de los alcohólicos (Okvist et al., 2007). Estos resultados sugieren que la activación de este tipo de los receptores TLR4 por parte del etanol podría constituir un mecanismo fundamental en la producción de citoquinas y en la aparición de daño inflamatorio. 1.4. HMGB1 y su función inflamatoria High mobility group box 1 (HMGB1), es el primer miembro de la familia de proteínas HMGB. Es una proteína nuclear implicada en varios aspectos de de la inmunidad innata, como patrón molecular del daño y posterior mediador de la inflamación, interviniendo en la autofagia o también en la apoptosis. Esta proteína suele permanecer en el núcleo de las células eucariotas, donde desempeña el papel de chaperona de ADN, facilitando la replicación, transcripción y reparación de ADN, así como estabilizando la estructura de doble hélice del DNA (Stros, 2010; Min et al., 2013). Cuando HMGB1 es liberada al citoplasma debido a una señal de daño o infección, muestra actividad como citoquina, participando en la activación de la inflamación, regulando la autofagia y manteniendo el equilibrio entre la autofagia y la apoptosis (Lee et al. 2014). La liberación de HMGB1 por parte de las células en proceso de muerte se piensa que dirige la respuesta inflamatoria a necrosis (Yang et al., 2010). Existen dos maneras principales de liberación de HMGB1 (Figura 3). La liberación pasiva, que engloba la secreción instantánea por células infectadas por un patógeno o a la liberación proveniente de células necróticas (Scaffidi, 2002). Esta liberación se produce por una rotura de las membranas de la célula, tanto la plasmática como la nuclear. Por otro lado, la secreción activa de HMGB1 se inicia a través de una señal de transducción mediante la interacción de los receptores de membrana plasmática con productos extracelulares, como LPC, esta liberación se realiza de una forma más lenta y el HMGB1 liberado esta en forma acetilada (Gardella, 2002). Esta liberación de HMGB1 celular activa implica la migración desde el núcleo a vesículas-lisosoma que protegen HMGB1 de la proteólisis en el citoplasma (Evankovich et al., 2010). Los estímulos para la secreción de HMGB1 por parte de las células inmunes son diversos e incluyen PAMPs, citoquinas y ciertos estreses moleculares. Introducción 11 Figura 3. Vías de liberación de HMGB1. (A) HMGB1 es secretado activamente en respuesta a estímulos inflamatorios exógenos o endógenos. (B) HMGB1 es liberada pasivamente por células muertas por necrosis o apoptosis causada por el daño. (Imagen modificada de Kwak y Shin, 2013) Cuando HMGB1 no está acetilada, ésta permanece en el núcleo y no es secretada ni liberada como durante la apoptosis (Scaffidi, 2002). En otros estudios, concretamente con el factor de necrosis tumoral (TNF-α) de macrófagos activados, la secreción de HMGB1 es dependiente de fosforilación mediada por la kinasa C (Youn y Shin, 2006). La liberación activa de HMGB1 implica la señalización del receptor sin muerte celular y se ha estudiado principalmente en las células inmunes, como los monocitos (Gardella et al., 2002; Lotze y Tracey, 2005) y en los hepatocitos (Evankovich et al., 2010). Estudios recientes sugieren que HMGB1 en cerebro es altamente expresado en neuronas y es liberada por ellas (Kim et al., 2008; Maroso et al., 2010). HMGB1 extracelular funciona como una citoquina proinflamatoria, activando la microglía, y por lo tanto estimulando la liberación de otras citoquinas, agravando la lesión cerebral (Kim et al., 2006). HMGB1 puede unirse a varios receptores de superficie incluyendo TLR2, TLR4, TLR9, RAGE, y también interactúa con CXCL12, que se une al receptor CXCR4 (Lee et al., 2014). Introducción 12 Estos resultados son consistentes con que la liberación en el cerebro HMGB1 afecta a la señalización neuronal. Las dosis altas de HMGB1 provocan diferentes efectos, entre las que se incluyen fiebre, la pérdida de peso, anorexia, la lesión pulmonar aguda, disfunción de la barrera epitelial, la artritis pudiendo provocar la muerte (Harris et al., 2012; Yang et al., 2005). El tratamiento crónico con etanol en cultivos de cerebro de ratón induce un aumento de HMGB1 en el medio de cultivo y la expresión de TLRs. Este incremento de la expresión de la proteína y TLRs también se ha observado in vivo en cerebro de ratón después del tratamiento con etanol y en cerebro de alcohólicos post mortem (Crews et al., 2012). El aumento de HMGB1, TLR3 y TLR4 es también observado en ratas expuestas al alcohol de forma intermitente utilizando un modelo de consumo masivo ocasional (Vetreno y Crews, 2012). La exposición al etanol provoca la liberación de HMGB1 en los medios de cultivo y la HMGB1 liberada lo hace principalmente de forma acetilada, es decir, a través de un mecanismo activo. (Zou y Crews, 2014). Otros estudios corroboran la liberación de HMGB1 por neuronas en proceso de muerte en cultivos tratados con LPS (Gao et al., 2011), demostrando que la activación de TLR4 provoca la liberación de HMGB1. Ese HMGB1 puede ser un importante mediador para la degeneración de neuronas, manteniendo una inflamación prolongada que induce neurodegeneración crónica. A través de un bucle formado entre las neuronas dañadas y la neuroinflamación no regulada, la neurodegeneración continúa progresando incluso después de que se retiren los desencadenantes tóxicos iniciales (Gao et al., 2011). Objetivos 13 2. Objetivos Datos anteriores del laboratorio de Patología Celular del CIPF indican que el alcohol promueve procesos inflamatorios en hígado y en cerebro y sugieren que el alcohol estimula la respuesta innata inmunitario y, en particular a los receptores TLR4 (Blanco et al., 2004; Valles et al., 2004). Estudios recientes han demostrado que el tratamiento con etanol induce la liberación de HMGB1 en el cerebro e hígado, que contribuye a patología inducida por el alcohol en ambos órganos (Ge et al., 2014; Vetreno et al., 2013). En el presente trabajo se pretende evaluar los mecanismos moleculares y celulares de la liberación de la citoquina proinflamatoria HMGB1 tras la estimulación con etanol en cultivos primarios de astrocitos y neuronas. En concreto, los objetivos que se plantean son: • Estudiar y comparar la cinética de liberación de HMGB1 en neuronas y astrocitos a distintas dosis de etanol con relevancia fisiológica (10, 25, 50 mM).  Analizar la activación de la vía de señalización de TLR4 midiendo la fosforilación de p65-NF-κB en neuronas y astrocitos y su papel en la liberación de HMGB1.  Evaluar la implicación de la muerte celular por apoptosis en la liberación de HMGB1, tanto en neuronas como astrocitos. Materiales y métodos 14 3. MATERIALES Y MÉTODOS 3.1 Animales de experimentación Para el desarrollo de este proyecto de investigación, se utilizaron crías de ratones C57BL/6 silvestres o wild type (WT) (Harlan Ibérica, Barcelona, España). Todos los animales han sido criados bajo condiciones controladas SPF (libres de gérmenes y patógenos), con fotoperiodo de 12 horas de duración, temperatura de 23 ºC y humedad del 60%. Para la obtención de crías, las hembras preñadas se separaron y se mantuvieron en jaulas aisladas durante el periodo de gestación. Todos los experimentos animales se realizaron de acuerdo a las directrices establecidas por la Directiva Europea (2010/63/UE) y por el Real Decreto 53/2013. 3.2 Cultivo primario de astrocitos Los cultivos primarios de astrocitos se prepararon a partir de corteza cerebral. Por cada cultivo se usó una camada de crías recién nacidas, dentro de las 24 horas tras su nacimiento. En una cabina de flujo laminar vertical (Master Bio48), las crías se sacrificaron, y tras extraer los cerebros en condiciones estériles, las cortezas cerebrales se diseccionaron, eliminando las meninges y otras partes de cerebro, y las células se disgregaron mediante aspiración con una pipeta de 10 mL en medio DMEM (Dulbecco’s Modified Eagle’s Medium, medio Eagle modificado por Dulbecco). El extracto celular se agitó en un vórtex a máxima velocidad durante un minuto, para eliminar las neuronas, y se filtró a través de una malla de nylon con un tamaño de poro de 90 µm, para eliminar los agregados celulares. El extracto se mezcló con medio de proliferación (DMEM conteniendo 20% de suero bovino fetal (SBF), 1% de penicilina/estreptomicina (concentración final: 1000 unidades/mL), 1% de fungizona (2.5 µg/mL), 1% de glutamina (2 mM) (Invitrogen-Gibco) y 1 g/L de glucosa extra), y se sembró en placas de 100 y 60 cm de diámetro. Los cultivos se mantuvieron en un incubador Heracell (Heraeus) a 37 ºC, al 5% de CO2/95% aire. El medio de cultivo se cambió dos veces por semana, y tras 7 días de crecimiento, el medio de cultivo se cambió a medio de diferenciación [DMEM con 10% SBF, 1% de penicilina/estreptomicina (concentración final: 1000 unidades/mL), 1% de fungizona (2.5 µg/mL) y 1% de glutamina (2 mM)]. Los astrocitos se dejaron crecer hasta su confluencia, aproximadamente hasta día 10. Materiales y métodos 15 3.3 Cultivo primario de neuronas El cultivo primario de neuronas de ratón se preparó a partir de fetos en el día 16 de gestación. Tras la obtención del útero, se extraen los fetos y se lavan con PBS a 37 ºC. Las crías se sacrificaron, y tras extraer los cerebros en condiciones estériles las cortezas se disgregaron mecánicamente y se pasaron por una malla de 90 μm. La suspensión se centrifugó a 200 g durante 3 min, a 25 ºC. El pellet obtenido se resuspendió en medio de cultivo Neurobasal suplementado con glutamato 25 µM, GlutaMAXTM (1:100), B-27R (1:50) y 50 µg/mL de penicilina; estreptocimicina, a 37 ºC. Este medio favorece el crecimiento de las neuronas e inhibe el crecimiento de otros tipos celulares como los astrocitos. Las células se sembraron en placas previamente tratadas con poli-D-lisina (12,5 μg/mL) y se mantuvieron hasta 7 y 14 días en una atmósfera húmeda con CO2 al 5% y aire 95%, a 37 ºC. Se cambió parte del medio cada 3 días 3.4 Estimulación con etanol de las células Los cultivos de astrocitos y neuronas se estimularon con diferentes concentraciones de etanol (10, 25 y 50 mM). En el caso de los astrocitos, es necesario que hayan permanecido previamente un mínimo de 16h en medio idéntico al de diferenciación pero sin SBF y con BSA 1mg/mL. Para la estimulación, el medio empleado fue DMEM sin SBF para evitar la precipitación de proteínas del medio, suplementado con L-glutamina 2 mM, fungizona al 1% (v/v) y antibiótico (AST). Una vez estimuladas las células con el nuevo medio de cultivo con etanol se incubaron a 37 ºC durante diferentes tiempos Tras permanecer en el incubador el tiempo correspondiente se transfirió el medio a un tubo eppendorf, se realizó una centrifugación a 3000 rpm durante 5 min para eliminar la posible debris, se transfirió el sobrenadante a un eppendorf nuevo, se congeló en nitrógeno líquido y se mantuvo a –80 ºC hasta su uso. También se recogieron las células de las placas raspando con PBS a 4 ºC, se centrifugaron a 3000 rpm 5 min y se congeló el pellet en nitrógeno líquido. 3.5 Precipitación de la proteína a partir del medio de cultivo. El medio que ha sido congelado en nitrógeno líquido y mantenido a -80Cº se deja descongelar en hielo para evitar la desnaturalización de las proteínas. Resultados 22 Figura 7. La estimulación con etanol induce la liberación de HMGB1 al medio extracelular en neuronas. Las neuronas fueron analizadas tras una incubación con etanol (10, 25 y 50 mM), a diversos tiempos y se evaluaron los cambios en la liberación de HMGB1 al medio extracelular mediante inmunotransferencia. Se muestra una inmunotransferencia representativa de los experimentos. La cuantificación corresponde a la media ± S.E.M. (p * <0.05 y p ** <0.01 respecto al valor control con un ttest). A partir de estos resultados, se puede deducir que la liberación de HMGB1 se produce de forma más rápida en neuronas que en astrocitos, ya que para las primeras se observa un aumento con respecto al nivel basal tras la primera hora posterior a la estimulación, y a partir de ahí, la presencia de HMGB1 extracelular se mantiene hasta tiempos largos. Sin embargo, en Resultados 23 el caso de los astrocitos, se aprecian cambios poco significativos a tiempos cortos, que se ven aumentados conforme avanza la duración de la estimulación con el etanol, dándose a las 24 h la máxima concentración de HMGB1 liberada al medio extracelular. Estas diferencias detectadas entre las neuronas y los astrocitos podrían deberse a una mayor sensibilidad de las neuronas frente al etanol, lo que desencadena una respuesta mucho más rápida de éstas al mismo activando el proceso de inflamación de una forma más inmediata. Además, la cinética de liberación de HMGB1 se ve influenciada por la dosis de etanol empleada, ya que dependiendo de la concentración adicionada, varían los tiempos a los que se produce la liberación al medio extracelular. Los resultados obtenidos sugieren que la activación de la liberación de HMGB1 en neuronas ocurre con dosis de etanol inferiores que en astrocitos. Pues en todas las dosis utilizadas (10, 25, 50 mM) encontramos liberación de HMGB1 en neuronas a tiempos cortos. Por el contrario, a tiempos cortos en astrocitos, sólo a 50mM es capaz de inducir la liberación de HGMB1. Sin embargo, también es importante comentar que a tiempos largos, tanto en astrocitos como neuronas, observamos liberación de HMGB1. Esto podría deberse a una mayor susceptibilidad de las neuronas a los efectos del etanol. 4.2 El estimulación con etanol desencadena un proceso inflamatorio en las células mediado por TLR4 Tras el tratamiento de los astrocitos con las distintas concentraciones de etanol y las medidas a diferentes tiempos de incubación, se aislaron dichas células para la detección de p65 fosforilado (Figura 8) ya que la presencia de p65 fosforilado es indicativa de que se está produciendo una respuesta inflamatoria, a través de NF-κB Los astrocitos responden de forma casi inmediata a la presencia de etanol en el medio, ya que a tiempos cortos de exposición comienzan a activarse las rutas de activación de la inflamación. Se observa un máximo cuando ha transcurrido una hora de la exposición. Para las concentraciones de 25 y 50 mM, este pico va seguido de un ligero descenso tras el cual, los valores de p-p65 se estabilizan entorno a un 50% por encima de su nivel habitual. . La cinética seguida en la que se registra una subida inicial, seguida de un descenso tras el cual los niveles de p-p65 se vuelven a incrementar, podría estar relacionado con la naturaleza cíclica de estos procesos inflamatorios. Por otro lado, cuando la concentración de etanol utilizada fue menor, Resultados 24 se produce una recuperación de los astrocitos hasta casi el nivel basal a tiempos más largos. Estos resultados sugieren que a bajas concentraciones de etanol, los astrocitos son capaces de recuperarse y restaurar las condiciones previas al daño. Figura 8. El etanol aumenta los niveles de expresión de la subunidad p65 fosforilada de NFκB en astrocitos. La presencia de la subunidad p65 de NFκB se evaluó en extractos celulares. El tratamiento con etanol produce un aumento en la fosforilación de p65 en astrocitos. Se muestra una inmunotransferencia representativa de los experimentos. Los resultados de la cuantificación reflejan la media ± S.E.M. (* p <0.05 respecto al valor del control respecto al valor control). Resultados 25 En el caso de las neuronas (Figura 9), para las tres concentraciones se apreció un progresivo incremento en la fosforilación de p65 que se hizo notable en las neuronas a partir de las 3 h de incubación con el etanol. Alcanzado ese tiempo, el aumento de p-p65 continúa hasta las 24 h donde se observó la máxima presencia. Figura 9. El etanol aumenta los niveles de expresión de la subunidad p65 fosforilada de NFκB en neuronas. La presencia de la subunidad p65 de NFκB se evaluó en extractos celulares. El tratamiento con etanol produce un aumento en la fosforilación de p65 en neuronas. Se muestra una inmunotransferencia representativa de los experimentos. Los resultados de la cuantificación reflejan la media ± S.E.M. Resultados 26 4.3 Análisis de la apoptosis inducida por el etanol en las células. Tras incubar los cultivos de astrocitos y neuronas con medios en el que se les añade el etanol, las células son sometidas a un estrés que desemboca en un aumento de la caspasa3 activa. La caspasa3 activada sufre una modificación estructural de la que se escinden dos subunidades, p17 y p12, de las cuales mediremos p17. La presencia de esta enzima tiene un importante efecto en la supervivencia de las células debido a su relación con el proceso de la apoptosis. Los astrocitos sometidos al estrés del alcohol (Figura 10) presentan un aumento de la presencia de caspasa3 activa a tiempos cortos siendo perceptibles a tiempos de una hora. Este incremento es significativo para las 3 h en el caso de las concentraciones 10 y 50 mM. Una vez superadas las 3 h tras la estimulación los niveles de caspasa3 activa vuelven a decrecer aunque no se llegan a recuperar los niveles basales. Para las tres concentraciones, los niveles alcanzados de caspasa3 activa en los astrocitos son bastante similares, por lo que no se observa una relación directa entre la cantidad de etanol utilizado con la caspasa3 activa detectada. En el caso de las neuronas (Figura 11), la respuesta al tratamiento con etanol sigue una tendencia muy similar. Los cambios en la concentración de caspasa3 activa en la célula se aprecian también a tiempos cortos. La activación de la caspasa3 se hace menos notable para tiempos más largos, pero estos resultados pueden verse influenciados por el efecto de otras circunstancias simultáneas, como puede ser la necrosis. Del mismo modo, cuando la estimulación de las neuronas se realiza con una concentración de etanol de 50 mM, las neuronas podrían haber sufrido en mayor medida los efectos de la necrosis afectando a las señales que generarían las neuronas apoptóticas. Resultados 27 Figura 10. El tratamiento con etanol aumenta la expresión de Caspasa3 activa en astrocitos. Las neuronas se incubaron con etanol (10, 25 y 50 mM) y se determinaron los niveles de caspasa3 activa en el intracelular mediante inmunotransferencia y las mismas membranas se reincubaron para detectar GAPDH como control de carga. Se muestra una inmunotransferencia representativa de los experimentos. Los resultados se presentan como la media ± S.E.M. (* p <0.05 respecto al valor del control). Resultados 28 Figura 11. Expresión de la enzima Caspasa3 activa en neuronas tratadas con etanol. Las neuronas se incubaron con etanol (10, 25 y 50 mM) y se determinaron los niveles de caspasa3 activa en el intracelular mediante inmunotransferencia y las mismas membranas se reincubaron para detectar GAPDH como control de carga. Se muestra una inmunotransferencia representativa de los experimentos. Los resultados se presentan como la media ± S.E.M. Teniendo en cuenta todas las alteraciones inducidas por el etanol, se puede inferir una relación entre el proceso de apoptosis, la cascada inflamatoria y la liberación de HMGB1. En el caso de las neuronas, se observa que a tiempos cortos se produce un aumento de la presencia de caspasa3 activa en la célula. Puesto que esta enzima está relacionada con procesos apoptóticos, esta respuesta puede desencadenar que se produzcan otras respuestas Resultados 29 a tiempos largos. De hecho, la activación de la caspasa3 se acompaña de la liberación de la proteína HMGB1 a la que se relaciona con la inflamación, aunque también tiene un papel en la regulación de la apoptosis. La liberación activa de HMGB1 es la que se inicia debido a la interacción de los receptores de membrana con productos como el etanol, pero esta liberación se realiza de forma lenta. Una aparición tan rápida en el medio extracelular de HMGB1 sería más propia de células necróticas que secretan esta proteína de forma pasiva. Además, la liberación de HMGB1 también es anterior a la activación de p-p65, lo cual podría explicarse por una liberación no controlada de HMGB1 que puede deberse a que se está produciendo necrosis y la salida al medio HMGB1 de forma pasiva. En relación a los astrocitos, los primeros cambios detectados tienen que ver con un aumento de la proteína p65 fosforilada que ocurre de forma simultánea a la aparición de caspasa3 activa a niveles superiores a los detectados en condiciones basales. Estas proteínas contribuirían a desencadenar reacciones inflamatorias dando lugar a la liberación de HMGB1 que se observa en mayor medida a las 24 h. Ello sugiere que la liberación de HMGB1 en astrocitos esté mediada por la activación de TLR4, es decir, una liberación de HMGB1 controlada (activa). Discusión y conclusiones 30 5. DISCUSIÓN Y CONCLUSIONES 5.1 Liberación de HMGB1 en cultivos de astrocitos y neuronas estimulados con etanol La proteína HMGB1 es tanto un factor nuclear como una proteína secretada. En el núcleo de la célula actúa como un factor de unión de la cromatina, en cambio, fuera de la célula, HMGB1 es un potente mediador de la inflamación (Scaffidi et al., 2002). La exposición al etanol en cerebro desencadena un proceso mediante el cual se produce una liberación de la proteína HMGB1. Dicha liberación se produce como respuesta al daño generado por el etanol en las células y se puede dar de dos maneras, como resultado de un proceso activo estimulado por procesos de señalización celular o como resultado de la muerte celular. La liberación de HMGB1 al medio extracelular, que forma parte de los conocidos como patrones moleculares asociados al daño (DAMP), por parte de células necróticas favorece la neuroinflamación (Andersson y Tracey, 2011). Algunos estudios actuales señalan que la expresión y liberación de HMGB1 en el cerebro inducida por la exposición al etanol están mediados principalmente por las neuronas (Kim et al., 2008; Crews et al., 2012). En base a estos estudios, se propuso estudiar si estos procesos se daban únicamente en neuronas, o si por el contrario también podían apreciarse estos cambios en astrocitos. Nuestros resultados realizados en cultivos primarios de neuronas y astrocitos de embriones de ratones demuestran que la exposición etanol en ambos tipos celulares desencadena la activación de un proceso que desemboca en la liberación al medio extracelular de la proteína HMGB1. Existen diferencias reseñables entre ambos tipos celulares, como la concentración necesaria para producir una respuesta apreciable o el tiempo de exposición necesario tras la estimulación con el etanol para la liberación de HMGB1. Estas diferencias sugieren una mayor sensibilidad de las neuronas al etanol que a tiempos cortos de exposición ya muestran una liberación al medio extracelular de HMGB1. Por tanto, nuestros resultados demuestran que la liberación de HMGB1 no se restringe únicamente a las neuronas, sino que los astrocitos también participan activamente en esta Discusión y conclusiones 31 liberación y pueden tener un papel esencial los procesos neuroinflamatorios generados por el alcohol. 5.2 Vía de liberación de HMGB1: activa o pasiva. La vía de liberación seguida por la célula, que lleva a la presencia de HMGB1 extracelular, aporta información relativa acerca de la presencia de necrosis y/o de restos celulares en las células estudiadas. La liberación pasiva se inicia con el daño a la integridad de la célula, y se produce de forma rápida. La secreción activa se inicia con una señal de transducción a través de interacción con un receptor de la membrana plasmática, esta secreción es más lenta y la proteína HMGB1 liberada se encuentra acetilada, lo que puede facilitar su diferenciación respecto a la liberada pasivamente (Andersson y Tracey, 2011). Estudios recientes muestran que la principal ruta de liberación de HMGB1 tras la estimulación con etanol es la vía activa (Quin et al., 2008; Crews et al., 2012). La secreción activa de la proteína implica que no se está produciendo necrosis neuronal, es decir, que la liberación es independiente de la muerte celular. Sin embargo, a concentraciones elevadas de etanol de 100 mM, con una escasa relevancia fisiológica, es difícil pensar que no se produzca muerte neuronal. De hecho en el presente estudio solo se utilizan concentraciones de 50 mM, con mayor relevancia a nivel fisiológica, aunque no se ha determinado si se produce necrosis durante el proceso tras la estimulación con etanol. Otros experimentos anteriores muestran la presencia de esta necrosis neuronal in vitro e in vivo a concentraciones de etanol de 10, 50 y 100 mM (Alfonso-Loeches et al., 2014; Narashiman et al., 2011). La realización de experimentos que permitan esclarecer si se da o no necrosis en nuestras células sería de interés en estudios futuros. A partir de los resultados obtenidos mediante la realización de las cinéticas de liberación de HMGB1, observamos que para concentraciones de etanol 50 mM, la liberación se produce a tiempos cortos tanto para astrocitos como para neuronas. En el caso de las neuronas, la liberación al medio se aprecia de manera casi inmediata a la estimulación incluso a bajas concentraciones de etanol. Esta liberación de HMGB1 se produce anteriormente a la detección del aumento de la caspasa3 activa, lo que sugiere que la forma de liberación ha sido de forma pasiva, es decir, se ha producido necrosis neuronal. La hipótesis de una liberación de HMGB1 Bibliografía 38 Guzzo-Merello G, Cobo-Marcos M, Gallego-Delgado M, Garcia-Pavia P. (2014) Alcoholic cardiomyopathy. World J Cardiol 6(8): 771-781 Hanisch, U.K. and Kettenmann, H. (2007) Microglia: active sensor and versatile effector cells in the normal and pathologic brain. Nat Neurosci, 10, 1387-1394. Harper, C. and Matsumoto, I. (2005) Ethanol and brain damage. Curr Opin Pharmacol, 5, 73-78. Harris HE, Andersson U, Pisetsky DS (2012) HMGB1: a multifunctional alarmin driving autoimmune and inflammatory disease. Nat Rev Rheumatol 8: 195–202. Jack, C.S., Arbour, N., Manusow, J., Montgrain, V., Blain, M., McCrea, E., Shapiro, A. and Antel, J.P. (2005) TLR signaling tailors innate immune responses in human microglia and astrocytes. J Immunol, 175, 4320-4330. Jung, D.Y., Lee, H., Jung, B.Y., Ock, J., Lee, M.S., Lee, W.H. and Suk, K. (2005) TLR4, but not TLR2, signals autoregulatory apoptosis of cultured microglia: a critical role of IFN-beta as a decision maker. J Immunol, 174, 6467-6476. Kaufman SE, Kaye MD. (1978) Induction of gastrooesophageal reflux by alcohol. Gut 19:336-338. Kawai, T. and Akira, S. (2007) Signaling to NF-kappaB by Toll-like receptors. Trends Mol Med, 13, 460469. Kim JB, Lim CM, Yu YM, Lee JK (2008) Induction and subcellular localization of high-mobility group box-1 (HMGB1) in the postischemic rat brain. J Neurosci Res 86: 1125–1131 Kim JB, Sig CJ, Yu YM, Nam K, Piao CS (2006) HMGB1, a novel cytokine-like mediator linking acute neuronal death and delayed neuroinflammation in the postischemic brain. J. Neurosci. 26:6413–21 Kim, S.U. and de Vellis, J. (2005) Microglia in health and disease. J Neurosci Res, 81, 302-313. Koehler RC, Roman RJ, Harder DR (2009) Astrocytes and the regulation of cerebral blood flow. Trends Neurosci 32:160–169 Kothakota S, Azuma T, Reinhard C, Klippel A, Tang J, Chu K, McGarry TJ, Kirschner MW, Koths K, Kwiatkowski DJ, Williams LT (1997) Caspase3-generated fragment of gelsolin: effector of morphological change in apoptosis. Sci 278:294 –298. Krajewska M, Wang HG, Krajewski S, Zapata JM, Shabaik A, Gascoyne R, Reed JC (1997) Immunohistochemical analysis of in vivo patterns of expression of CPP32 (Caspase-3), a cell death protease. Cancer Res 57:1605–1613 Kril JJ, Halliday GM (1999) Brain shrinkage in alcoholics: a decade on and what have we learned? Prog Neurobiol 58:381-387. Kwak M., Shin J. (2013) Current Understanding of HMGB1-mediated Autophagy. J Bacteriol Virol. 43 (2):148-154. Lau, A.H., Abe, M. and Thomson, A.W. (2006) Ethanol affects the generation, cosignaling molecule expression, and function of plasmacytoid and myeloid dendritic cell subsets in vitro and in vivo. J Leukoc Biol, 79, 941-953. Lee S., Kwak M., Kim S., Shin J (2014) The Role of High Mobility Group Box 1 in Innate Immunity. Yonsei Med J 55(5):1165-1176 Lotze MT, Tracey KJ (2005) High-mobility group box 1 protein (HMGB1): nuclear weapon in the immune arsenal. Nat Rev Immun 5: 331–342 Bibliografía 39 Mandrekar, P., Dolganiuc, A., Bellerose, G., Kodys, K., Romics, L., Nizamani, R. and Szabo, G. (2002) Acute alcohol inhibits the induction of nuclear regulatory factor kappa B activation through CD14/tolllike receptor 4, interleukin-1, and tumor necrosis factor receptors: a common mechanism independent of inhibitory kappa B alpha degradation? Alcohol Clin Exp Res, 26, 1609-1614. Mao XR, Moerman-Herzog AM, Chen Y, Barger SW (2009) Unique aspects of transcriptional regulation in neurons--nuances in nfkappab and sp1-related factors. J Neuroinflammation 6:16. Markiewicz I, Lukomska B (2006) The role of astrocytes and pathology of the central nervous system. Neurobiol 66: 343-358 Maroso M, Balosso S, Ravizza T, Liu J, Aronica E, et al. (2010) Toll-like receptor 4 and high-mobility group box-1 are involved in ictogenesis and can be targeted to reduce seizures. Nat Med 16: 413–419] Medzhitov, R., Preston-Hurlburt, P. and Janeway, C.A., Jr. (1997) A human homologue of the Drosophila Toll protein signals activation of adaptive immunity. Nature, 388, 394-397. Min HJ, Ko EA, Wu J, Kim ES, Kwon MK, Kwak MS (2013) Chaperone-like activity of high-mobility group box 1 protein and its role in reducing the formation of polyglutamine aggregates. J Immunol 190:1797806 Montesinos J, Pascual M, Pla A, Maldonado C, Rodríguez-Arias M, Miñarro J, Guerri C. (2015) TLR4 elimination prevents synaptic and myelin alterations and long-term cognitive dysfunctions in adolescent mice with intermittent ethanol treatment. Brain Behav Immun. 45:233-44 Narasimhan M, Mahimainathan L, Rathinam ML, Riar AK, Henderson GI (2011) Overexpression of Nrf2 protects cerebral cortical neurons from ethanol-induced apoptotic death. Mol Pharmacol 80:988–999. Okun, E., Griffioen, K.J., Lathia, J.D., Tang, S.C., Mattson, M.P. and Arumugam, T.V. (2009) Toll-like receptors in neurodegeneration. Brain Res Rev, 59, 278-292. Okvist A, Johansson S, Kuzmin A, Bazov I, Merino-Martinez R, Ponomarev I, Mayfield RD, Harris RA, Sheedy D, Garrick T, Harper C (2007) Neuroadaptations in human chronic alcoholics: Dysregulation of the nf-kappab system. PLoS One 2 (9):e930. Owens T, Babcock AA, Millward JM, Toft-Hansen H (2005) Cytokine and chemokine inter-regulation in the inflamed or injured CNS. Brain Res Brain Res Rev 48:178-184. Pfrieger FW. Role of glia in synapse development. Curr Opin Neurobiol. 2002;12:486-490 Qin L, He J, Hanes RN, Pluzarev O, Hong JS, Crews FT (2008): Increased systemic and brain cytokine production and neuroinflammation by endotoxin following ethanol treatment. J Neuroinflammtion 5:10. Quinton, L.J., Nelson, S., Zhang, P., Happel, K.I., Gamble, L. and Bagby, G.J. (2005) Effects of systemic and local CXC chemokine administration on the ethanol-induced suppression of pulmonary neutrophil recruitment. Alcohol Clin Exp Res, 29, 1198-1205. Rao MS, Noble M, Mayer-Pröschel M. A tripotential glial precursor cell is present in the developing spinal cord. Proc Natl Acad Sci U S A. 1998;95:3996-4001. Rivest S (2009) Regulation of innate immune responses in the brain. Nat Rev Immunol 9:429-439 Rondón-Barragán (2009) Toll-like receptors in fish: the beginning divergence. InVet 11(1): 15-30 Saeed, R.W., Varma, S., Peng, T., Tracey, K.J., Sherry, B. and Metz, C.N. (2004) Ethanol blocks leukocyte recruitment and endothelial cell activation in vivo and in vitro. J Immunol, 173, 6376-6383. Scaffidi P, Misteli T, Bianchi ME (2002) Release of chromatin protein HMGB1 by necrotic cells triggers inflammation. Nature 418:191–195 Bibliografía 40 Shin-Ae Lee,1 Man Sup Kwak,1 Sol Kim,1 and Jeon-Soo Shin (2014) The Role of High Mobility Group Box 1 in Innate Immunity. Yonsei Med J. 55(5):1165-76. Sims GP, Rowe DC, Rietdijk ST, Herbst R, Coyle AJ (2010): HMGB1 and RAGE in inflammation and cancer. Annu Rev Immunol 28:367–388. Song, K., Coleman, R.A., Zhu, X., Alber, C., Ballas, Z.K., Waldschmidt, T.J. and Cook, R.T. (2002) Chronic ethanol consumption by mice results in activated splenic T cells. J Leukoc Biol, 72, 1109-1116. Stoll G, Jander S, Schroeter M (2002) Detrimental and beneficial effects of injury-induced inflammation and cytokine expression in the nervous system. Adv Exp Med Biol 513:87113. Streit, W.J., Mrak, R.E. and Griffin, W.S. (2004) Microglia and neuroinflammation: a pathological perspective. J Neuroinflammation, 1, 14. Stros M. (2010) HMGB proteins: interactions with DNA and chromatin. Biochim Biophys Acta 1799:10113 Szabo, G. (1999) Consequences of alcohol consumption on host defence. Alcohol Alcohol, 34, 830-841. Szabo, G. and Mandrekar, P. (2009) A recent perspective on alcohol, immunity, and host defense. Alcohol Clin Exp Res, 33, 220-232. Szabo, G., Dolganiuc, A., Mandrekar, P. and White, B. (2004) Inhibition of antigen-presenting cell functions by alcohol: implications for hepatitis C virus infection. Alcohol, 33, 241249. Tang SC, Lathia JD, Selvaraj PK, Jo DG, Mughal MR, Cheng A, Siler DA, Markesbery WR, Arumugam TV, Mattson MP (2008) Toll-like receptor-4 mediates neuronal apoptosis induced by amyloid beta-peptide and the membrane lipid peroxidation product 4-hydroxynonenal. Exp Neurol 213:114 –121. Trendelenburg G (2008) Acute neurodegeneration and the inflammasome: Central processor for danger signals and the inflammatory response. J Cereb Blood Flow Metab 28:867–881. Urbano-Márquez A, Estruch R, Navarro-López F, Grau JM, Mont Ll, Rubin E. (1989) The effects of alcoholism on skeletal and cardiac muscle. N Engl J Med 320: 409 – 415 Valles, S.L., Blanco, A.M., Pascual, M. and Guerri, C. (2004) Chronic ethanol treatment enhances inflammatory mediators and cell death in the brain and in astrocytes. Brain Pathol, 14, 365-371. Vetreno RP, Crews FT (2012). Adolescent binge drinking increases expression of the danger signal receptor agonist hmgb1 and toll-like receptors in the adult prefrontal cortex. Neurosci 226:475–488. Wang, G. J., Volkow, N. D., Franceschi, D., Fowler, J. S., Thanos, P. K., Scherbaum, N., Felder, C. A. (2000). Regional brain metabolism during alcohol intoxication. Alcohol Clin Exp Res. (6):822-9. Yang H, Rivera Z, Jube S, Nasu M, Bertino P (2010) Programmed necrosis induced by asbestos in human mesothelial cells causes high-mobility group box 1 protein release and resultant inflammation. Proc Natl Acad Sci U S A 107(28):12611-6 Yang H, Wang H, Czura CJ, Tracey KJ (2005) The cytokine activity of HMGB1. J Leukoc Biol 78: 1–8. Yang M, Min K, Joe E (2007) Multiple mechanisms that prevent excessive brain inflammation. JNeurosci Res 85(11):2298-305 Youn JH, Shin JS. (2006) Nucleocytoplasmic shuttling of HMGB1 is regulated by phosphorylation that redirects it toward secretion. J. Immunol. 177:7889–97 Zou J, Crews F (2014) Release of Neuronal HMGB1 by Ethanol through Decreased HDAC Activity Activates Brain Neuroimmune Signaling. PLoS One. 9(2): 234-254