Mejora genética de la "Tomaca Valenciana d'El Perelló" para la resistencia al virus del mosaico del tomate (Tomato mosaic virus, ToMV)

UNIVERSITAT POLITÈCNICA DE VALÈNCIA INSTITUT DE CONSERVACIÓ I MILLORA DE L’AGRODIVERSITAT VALENCIANA UNIVERSIDAD POLITÉCNICA DE MADRID UNIVERSITAT POLITÈCNICA DE CATALUNYA MÀSTER INTERUNIVERSITARI OFICIAL EN MILLORA GENÈTICA VEGETAL MILLORA GENÈTICA DE LA “TOMACA VALENCIANA D’EL PERELLÓ” PER A LA RESISTÈNCIA AL VIRUS DEL MOSAIC DE LA TOMACA (TOMATO MOSAIC VIRUS, ToMV). TREBALL DE FI DE MÀSTER EN MILLORA GENÈTICA VEGETAL ALUMNE: DIONÍS BORRÀS PALOMARES TUTOR: SALVADOR SOLER ALEIXANDRE DIR. EXPERIMENTAL: Mª DEL ROSARIO FIGAS MORENO CURS ACADÈMIC: 2015-2016 VALÈNCIA, 1 DE JULIOL DE 2016 MILLORA GENÈTICA DE LA “TOMACA VALENCIANA D’EL PERELLÓ” PER A LA RESISTÈNCIA AL VIRUS DEL MOSAIC DE LA TOMACA (TOMATO MOSAIC VIRUS, ToMV). Abstract The traditional valencian tomato is appreciated due to its organoleptic properties which confer to this tomato a high commercial interest. Specifically the “Tomaca Valenciana d’El Perelló” is increasingly appreciated by superstores. This tomato presents some agronomical and quality traits that make it very attractive for the farmer and the consumer. However, it sometimes shows production uniformity problems as well as other important problems. Moreover, this variety presents high susceptibility to the Tomato Mosaic Virus (ToMV). So, a very interesting way to maximize this crop is to obtain varieties of valencian tomato more uniform and with resistance to ToMV. In this study a selection program and a plant breeding program are made through Back Crosses Method in which the intension is to increase the uniformity on the production and other morphological traits and at the same time to introgress the Tm22 gene. The selection of resistance carrier is made by Molecular Assisted Selection and checked by inoculation and ELISA analysis. In these moments the fourth self-crossing generation coming from the selection program is available. Furthermore the Second Backcross is available and the third backcross is being generated. Resum La tomaca tradicional valenciana és apreciada per les seues propietats organolèptiques que li atorguen un alt interès comercial. En concret la ‘Tomaca Valenciana d’El Perelló’ és cada vegada més apreciada en les superfícies comercials. Aquesta tomaca presenta diferents trets agronòmics i de qualitat que la fan atractiva per al llaurador i per al consumidor. No obstant, de vegades presenta problemes de uniformitat de producció així com d’altres característiques importants. D’altra banda, aquesta varietat presenta una elevada susceptibilitat al virus del mosaic de la tomaca (ToMV). Així, una forma molt interessant de potenciar aquest cultiu és obtenir varietats de tomaca valenciana més uniformes així com resistents a ToMV. En aquest treball és du a terme tant un programa de selecció així com un programa millora genètica mitjançant el Mètode de Retrocreuaments amb el qual es pretén per una banda augmentar la uniformitat de producció i la presència de trets morfològics distintius d’aquesta varietat, a la vegada que s’introgressa el gen de resistència a ToMV (Tm22). La selecció dels individus portadors de la resistència es realitza mitjançant Selecció Assistida per Marcadors i es comprova mitjançant inoculació i anàlisi ELISA. En aquests moments es disposa de la quarta generació d’autofecundació en el programa de selecció així com del segon Retrocreuament (RC2). Al mateix temps s’està duent a terme el tercer Retrocreuament (RC3). Resumen El tomate tradicional valenciano es apreciado por sus propiedades organolépticas que le otorgan un alto interés comercial. En concreto el “Tomate Valenciano d’El Perelló” es cada vez más apreciado en las superficies comerciales. Este tomate presenta diferentes rasgos agronómicos y de calidad que lo hacen atractivo para el agricultor y para el consumidor. No obstante, a veces presenta problemas de uniformidad de producción así como de otras características importantes. Por otra parte, esta variedad presenta una elevada susceptibilidad al virus del mosaico del tomate (ToMV). Así, una forma muy interesante de potenciar este cultivo es obtener variedades de tomate valenciano más uniforme así como resistentes a ToMV. En este trabajo se lleva a cabo un programa de selección así como un programa de mejora genética mediante el Método de Retrocruzamientos con el que se pretende por una parte aumentar la uniformidad de producción así como la presencia de rasgos morfológicos característicos de esta variedad, a la vez que se introgresa el gen de resistencia a ToMV (Tm22). La selección de los individuos portadores de la resistencia se realiza mediante la Selección Asistida por Marcadores y se comprueba mediante inoculación y análisis ELISA. En estos momentos se dispone de la cuarta generación de autofecundación en el programa de selección si como del segundo Retrocruzamiento (RC2). Al mismo tiempo se está llevando a cabo el tercer Retrocruzamiento (RC3). Key words: Tomato, Solanum lycopersicum, ToMV, Tm22, SNPs, Backcross, High Resolution Melting Paraules clau: Tomaca, Solanum lycopersicum, ToMV, Tm22, SNPs, Retrocreuament, High Resolution Melting Alumne: Dionís Borràs Palomares Tutor: Salvador Soler Aleixandre Dir. Experimental: Mª Del Rosario Figàs Moreno València, Juliol 2016 AGRAÏMENTS Com tot en aquesta vida, allò que comença tard o prompte ha d’acabar. Hi ha coses que t’agradaria que duraren per sempre i d’altres, en canvi, que desitges que acaben tant prompte com siga possible. El cert és que a hores d’ara no sé ben bé on s’encaixa aquesta etapa, el que sí que tinc clar és que en aquest viatge pel coneixement m’han acompanyat moltes persones sense les quals no haguera pogut ser possible. També com tot en aquesta vida, hi ha persones que et marquen un abans i un després, i d’altres, que passen més discretament pel teu costat. Si haguera d’elegir em quedaria en “L’Alegria de l’horta” que tot i ser al·lèrgica a les solanàcies, et contagia amb les seues bones vibracions. També em quedaria amb “La viquipèdia personalitzada” que m’ha fet de consultoria personal les 24h. També em quedaria amb “ La persona més maniàtica per l’ordre d’Espanya i part de l’estranger”. Una altra peça clau en aquesta història és “El patriarca que cuida de tots” amb el qual també em quedaria. D’altres persones, encara que d’incorporació més recent en aquesta història, també han aportat el seu gra. És curiós agrair que proven de sal la paella que tu has cuinat. Però una cosa és clara i és que sense els ingredients adequats cap paella es pot cuinar. En definitiva, gràcies a tot el món, que en major o menor implicació, ha participat activament per fer possible tot això. Nota per al Dionís del futur: No oblides que tota experiència és enriquidora. No oblides a cap persona que no haja de ser oblidada. Pensa que quasi tot és possible. I que encara que vages sense direcció, sense brúixola ni timó, el teu camí serà el que tu t’obrigues. ÍNDEX 1. INTRODUCCIÓ....................................................................................................... 1 1.1 CULTIU DE LA TOMACA.................................................................................... 1 1.1.1 ORIGEN, DOMESTICACIÓ I DIFUSIÓ ..................................................... 1 1.1.2 SITUACIÓ ACTUAL DEL CULTIU DE LA TOMACA................................... 1 1.2 PERSPECTIVA HISTÒRICA DEL POBLE VALENCIÀ COM A AGRICULTOR............ 3 1.3 VARIETATS TRADICIONALS DE TOMACA.......................................................... 4 1.3.1 VARIETATS TRADICIONALS VALENCIANES............................................ 5 1.3.1.1 TOMACA TIPUS “BORSETA”............................................................ 7 1.3.1.2 TOMACA TIPUS “DE PENJAR”.............................................. ........... 7 1.3.1.3 TOMACA TIPUS “DE PRUNA”.......................................................... 7 1.3.1.4 TOMACA TIPUS “MUTXAMEL”........................................................8 1.3.1.5 TOMACA TIPUS “DEL PEBRE”......................................................... 8 1.3.1.6 TOMACA TIPUS “VALENCIANA”...................................................... 8 1.4 POSADA EN VALOR DE LES VARIETATS TRADICIONALS................................... 12 1.4.1 VARIETATS TRADICIONALS COM A ALTERNATIVA RENTABLE.............13 1.4.2 LA TOMACA “VALENCIANA” COM A ALTERNATIVA RENTABLE...........14 1.4.2.1 CARACTERÍSTIQUES GENERALS.....................................................14 1.4.2.2 IMPORTÀNCIA ECONÒMICA..........................................................15 1.4.2.3 POSADAA EN VALOR DE LA TOMACA TIPUS “VALENCIANA”..........15 1.4.2.3.1 POSADA EN VALOR A TRAVÉS DE LA “SELECCIÓ”..............16 1.4.2.3.2 POSADA EN VALOR A TRAVÉS DE LA “MILLORA”...............16 2. OBJECTIUS.............................................................................................................17 3. MATERIAL I MÈTODES...........................................................................................18 3.1 MATERIAL VEGETAL.........................................................................................18 3.1.1 EN EL PROGRAMA DE “SELECCIÓ”.......................................................18 3.1.2 EN EL PROGRAMA DE “MILLORA”....................................................... 18 3.2 DESINFECCIÓ DE LLAVORS I REALITZACIÓ DE PLANTERS................................ 18 3.3 CONDICIONS DE CULTIU..................................................................................19 3.4 REALITZACIÓ DELS CREUAMENTS...................................................................20 3.4.1 RECOL·LECCIÓ DE POL·LEN DEL PARENTAL MASCULÍ......................... 20 3.4.2 EMASCULACIÓ I POL·LINITZACIÓ DE LES FLORS DEL PARENTAL FEMENÍ................................................................................................ 20 3.5 DESCRIPCIÓ DEL PROGRAMA DE MILLORA REALITZAT....................................21 3.5.1 EN EL PROGRAMA DE “SELECCIÓ”........................................................21 3.5.2 EN EL PROGRAMA DE “RETROCREUAMENTS”......................................21 3.6 MARCADOR MOLECULAR ASSOCIAT AL GEN DE RESISTÈNCIA Tm22 ...............25 3.7 DISSENY D’ENCEBADORS..................................................................................25 3.8 EXTRACCIÓ D’ADN...........................................................................................25 3.9 ANÀLISI D’SNPS MITJANÇANT “HIGH RESOLUTION MELTING”.......................26 3.10 INOCULACIÓ MECÀNICA DE ToMV PER A VALIDAR LA RESISTÈNCIA.........26 3.10.1 PREPARACIÓ DE L’INÒCUL I INOCULACIÓ........................................... 26 3.10.2 ANÀLISI SEROLÒGIC DE LES MOSTRES.................................................26 4. RESULTATS I DISCUSSIÓ........................................................................................19 4.1 GENERACIONS OBTINGUDES...........................................................................19 4.1.1 EN EL PROGRAMA DE SELECCIÓ..........................................................19 4.1.2 EN EL PROGRAMA DE RETROCREUAMENTS........................................19 4.2 GENOTIPAT D’HETEROZIGOTS: ANÀLISI DE L’SNP ASSOCIAT A L’AL·LEL DE RESISTÈNCIA....................................................................................................22 4.3 VALIDACIÓ DE LA RESISTÈNCIA A ToMV MITJANÇANT LA INOCULACIÓ MECÀNICA DEL VIRUS.....................................................................................23 5. CONCLUSIONS.......................................................................................................25 6. BIBLIOGRAFIA.......................................................................................................26 ÍNDEX DE TAULES Taula 1. Superfície de cultiu, volum de producció i Rendiment al territori valencià especificat per províncies en 2013. Taula 2. Estudis de caracterització de varietats tradicionals de tomaca duts a terme a València. Taula 3. Encebadors emprats per a dur a terme el genotipat per al gen Tm22 Taula 4. Característiques morfològiques dels llinatges seleccionats en el programa de selecció. Taula 5. Informació de les plantes procedents del creuament inicial (C1) de les plantes de les seleccions per l’híbrid Euphrates. Taula 6. Informació de les plantes procedents del Primer Retro-creuament (RC1). Taula 7. Informació de les plantes procedents del RC2 Taula 8. Caracterització morfològica dels individus heterozigots procedents del RC1 llinatge COOP 886-54 ÍNDEX DE GRÀFICS I FIGURES Gràfic 1. Producció de tomaca a la Unió Europea en 2014 expressada en milions de tones. Gràfic 2. Producció de tomaca en Espanya en 2014 expressada en Tones. Figura 1. Tribunal de les Aigües de València Figura 2. Imatge de fruits del tipus varietal “De Borseta”. Figura 3. Imatge de fruits del tipus varietal “Del Pebre”. Figura 4. Imatge de fruits del tipus varietal “De Penjar” Figura 5. Imatge de fruits del tipus varietal “De Pruna”. Figura 6. Imatges de fruits del tipus varietal “ Mutxamel”. Figura 7. Imatge de fruites del tipus varietal “Valenciana” morfologia “Masclet” Figura 8. Imatge de fruites del tipus varietal Valenciana, morfologia “ Femella”. Figura 9. Imatge d’una fruita del tipus varietal “Valenciana” morfologia “Rotllo”. Figura 10. Tomaca de Penjar. Presentació al consumidor d’un ramell. Figura 11. Tomaca “Valenciana d’El Perelló” a un supermercat valencià. Figura 12. Procés de desinfecció de llavor. Figura 13. Procés de recol·lecció de pol·len. Figura 14. Procés d’emasculació i pol·linització de la flor del parental femení. Figura 15. Esquema del programa Selecció utilitzat. Figura 16. Esquema del programa de Retrocreuaments a partir de la selecció massal COOP 767. Figura 17. Esquema del programa de Retrocreuaments a partir de la selecció massal COOP 886. Figura 18. Anàlisi de corbes d’HRM. Figura 19. Planta heterozigòtica i planta homozigòtica recessiva en el cicle on va haver el brot de ToMV. ABREVIACIONS ADN: Àcid desoxiribonucleic bp: Parells de bases C1: Creuament inicial DAS-ELISA: Double Antibody Sandwich-Enzyme linked Inmunosorbent Assay FAO: Food and Agriculture Organization GEVES: Groupe d’Etude et de cotrôle des Variétés Et des Semences HRM: High Resolution Melting MAGRAMA : Ministeri d’Agricultura, Alimentació i Medi Ambient RC1: Primer Retrocreuament RC2: Segon Retrocreuament RC3: Tercer Retrocreuament SNP: Single Nucleotid Polimorphism ssRNA: Single Strand Ribonucleic Acid Tm: Temperatura d’annealing ToMV: Tomato Mosaic Virus TSP: Trifosfat de Sodi TSWV: Tomato spotted wilt virus, TYLCV: Tomato yellow leaf curl virus USDA: United States Department of Agriculture 1. INTRODUCCIÓ 6 Per un altre costat, en altres estudis com ara el realitzat per Cebolla et al. (2013) i el treball realitzat per Figàs et al. (2015a) també parlen de les varietats “ Valenciana”, “De Penjar” o “Mutxamel”. Aquests estudis han permès conèixer quines són les varietats més genuïnes del camp valencià, que tenen una implantació més forta i quina distribució presenten als distints territoris valencians. Taula 2. Estudis de caracterització de varietats tradicionals de tomaca duts a terme a València. S’inclou el nombre d’entrades i la referència corresponent. Comunitat Autònoma Nombre d’entrades estudiades Referència València 8 Domínguez, 1998 València 103 Cebolla-Cornejo, 2005 València 16 García-Martínez et al., 2013 València 103 Cebolla-Cornejo et al., 2013 València 70 Figàs et al., 2015a València 166 Cortés-Olmos et al., 2015 València 58 Cerdán, 2015 Com ja hem dit abans, la tasca de classificació i identificació no és gens fàcil, a més a més, aquest esforç es veu accentuat a causa de l’existència de varietats no estandarditzades i que reben noms dispars atenent a la forma, ús o procedència geogràfica. D’açò se’n fan ressò els estudis realitzats a València. Així, Cebolla et al. (2013), Figàs et al. (2015a) o Cerdán (2015) classifiquen certes entrades com tipus “ Plana”, “Redona” o tipus “Cor”. Aquestes segons indiquen, presenten alguns trets morfològics característics però manquen d’una associació concreta a una àrea geogràfica o d’un nom propi genuí associat a unes característiques morfològiques, agronòmiques o de sabor inconfusible. No obstant això, aquestes varietats continuen presentant unes característiques de qualitat molt bones. És el cas de moltes entrades de tomaca plana roja o rosada presents a molt pobles i molt apreciades. De cara a posar en valor les varietats tradicionals valencianes, les primeres que cal tindre en compte son aquelles varietats amb més tradició i prestigi. Així doncs, les principals varietats tradicionals de tomaca, que es descriuen a continuació són: “De Borseta”, “Del Pebre”, “De Penjar”, “De Pruna”, “Mutxamel”, “Valenciana” (Cebolla, 2005; Cebolla et al., 2013; Figàs et al., 2015a i Cerdán, 2015). 1. INTRODUCCIÓ 7 1.3.1.1 TOMACA TIPUS “DE BORSETA” Aquest tipus varietal és típic de les comarques del sud d’Alacant com ara al Baix Segura, la zona d’Oriola o Almoradí. Són tomaques amb tendència a ser confoses amb el tipus varietal “De Pruna” però amb trets característics com ara la forma lleugerament aperada cosa que fa que reben també el nom de “De la Pera” (Figura 2). És tracten de tomaques un poc allargades amb secció rectangular i que solen consumir-se quan comencen a canviar de color. Tenen dos o tres lòculs, separats per un gros envà. El pericarpi també és gros i es manté ferm durant molt de temps. Es tracta d’una varietat que té espatlla verda, una cicatriu peduncular petita i no solen presentar problemes d’esquerdat (Cebolla, 2005; Cebolla et al., 2013; Figàs et al., 2015a i Cerdán, 2015). Figura 2. Imatge de fruits del tipus varietal “De Borseta”. A l’esquerra es veu una imatge d’un ramell en una planta, mentre que a la dreta es veu un tall longitudinal de dues tomaques. 1.3.1.2 TOMACA TIPUS “DEL PEBRE” La tomaca tipus “Pebre” és el tipus més fàcilment identificable ja que es tracten de tomaques molt allargades que d’alguna manera recorden a un pebre “italià”. Aquest tipus varietal també presenta espatlles verdes persistents i freqüentment presenta un esquerdat radial moderat, que de vegades pot ser greu fent inviable la comercialització d’aquestes tomaques. (Figura 3). Tenen de dos a quatre lòculs difícils de diferenciar ja que moltes vegades les parets loculars acaben fusionant-se amb el pericarpi. Pot presentar buidat moderat de vegades. Es tracta d’una tomaca amb poques llavors la qual cosa pot comprometre la conservació d’aquest tipus varietal (Cebolla, 2005; Cebolla et al., 2013; Figàs et al., 2015a i Cerdán, 2015). 1. INTRODUCCIÓ 8 Figura 3. Imatges de fruits del tipus varietal “ Del pebre”. A l’esquerra es veu una imatge d’un ramell en una planta, mentre que a la dreta es veu un tall longitudinal de dues tomaques. 1.3.1.3 TOMACA TIPUS “DE PENJAR” Aquest tipus de tomaca té una característica molt específica i és la seva llarga longevitat. Poden ser conservades durant molts mesos. En general presenten tomaques petites i rodones, amb pell transparent o groga (Figura 4). En el cas de les varietats amb pell transparent, la tomaca adquireix una tonalitat roja-groguenca i en el cas de tindre la pell groga, es queda en tonalitats ataronjades o roges. Tenen un pericarpi gros i dur i dos o tres lòculs normalment (Cebolla, 2005; Cebolla et al., 2013; Figàs et al., 2015a i Cerdán, 2015). Figura 4. Imatge de fruits del tipus varietal “De Penjar”. A l’esquerra es veu una imatge d’un ramell en una planta, mentre que a la dreta es veu un tall longitudinal de dues tomaques. 1. INTRODUCCIÓ 9 1.3.1.4 TOMACA TIPUS “DE PRUNA” Aquest tipus de tomaca és el que normalment s’utilitza per a cuinar o per a fer conserva. Són de forma oblonga, petits i fàcils de pelar. El problema amb estes varietats radica en que no és gens fàcil diferenciar les varietats actuals de les varietats tradicionals cosa que ha posat en perill aquest tipus de varietats tradicionals fins el punt que una gran quantitat de varietats d’aquest tipus s’hagen perdut (Figura 5) (Cebolla, 2005; Cebolla et al., 2013; Figàs et al., 2015a i Cerdán, 2015). Figura 5. Imatge de fruits del tipus varietal “De Pruna”. A l’esquerra es veu una imatge d’un ramell en una planta, mentre que a la dreta es veu un tall longitudinal de dues tomaques. 1.3.1.5 TOMACA TIPUS “MUTXAMEL” Aquest tipus de tomaca es troba principalment en zones Alacantines i és especialment identificable en la localitat de Mutxamel d’on rep el nom. Es tracta d’una tomaca aplanada, amb acostellat variable i amb presència persistent d’espatlles verdes. Aquestes espatlles verdes a mesura que va madurant el fruit, van difuminant-se i es barregen amb taronges i rojos que li donen una aparença molt cridanera. Aquestes tomaques presenten altres característiques clau com ara el gran nombre de lòculs que es distribueixen bastant regularment, alguns d’aquests de gran mida i un cor que ocupa la major part del fruit. Hi ha vegades que s’observen lòculs inclús dins del cor. Per un altre costat, el pericarpi sol ser gros i dur. La cicatriu peduncular és gran i amb una zona surosa. El fruit pot tindre un esquerdat moderat radial. El acostellat típic d’aquesta tomaca va lligat freqüentment a un lleuger buidat (Figura 6) (Cebolla, 2005; Cebolla et al., 2013; Figàs et al., 2015a i Cerdán, 2015). 1. INTRODUCCIÓ 10 Figura 6. Imatge de fruits del tipus varietal “Mutxamel”. A l’esquerra es veu una imatge d’un ramell en una planta, mentre que a la dreta es veu un tall longitudinal de dues tomaques. 1.3.1.6 TOMACA TIPUS “VALENCIANA” Aquest tipus de tomaca té un conjunt de característiques molt específiques i identificables que permeten classificar-la com a tomaca valenciana. El problema ací radica en que l’adjectiu “Valenciana” s’ha utilitzat amb molta lleugeresa fora dels territoris valencians per a fer referència a qualsevol varietat originada als diferents territoris valencians. Però la realitat és que aquest tipus varietal és genuí de la denominada “Plana de València” que inclou les riberes dels rius Xúquer, Túria i Palància i molt específicament a la zona de l’horta de la ciutat de València. Aquest tipus varietal presenta tres tipus de fruit en una mateixa planta. La principal forma de fruit és la tipus “masclet” i és la morfologia que identifica el tipus varietal. Consisteix en fruits amb forma de cor, que s’allarguen en la zona pistil·lar cosa que fa que tinguen una forma apuntada, típic d’aquesta varietat (Figura 7). Són els fruits que major preu poden arribar a tindre en el mercat. Figura 7. Imatge de fruites del tipus varietal “Valenciana” morfologia “Masclet”. A l’esquerra es veu una imatge d’un ramell en una planta, mentre que a la dreta es veu un tall longitudinal d’una tomaca. 1. INTRODUCCIÓ 11 El segon tipus de fruit que podem trobar en aquest tipus varietal és el tipus “ femella”. Aquest consisteix en fruits lleugerament aplanats i en forma de cor, amb la regió pistil·lar indentada i amb cicatriu pistil·lar oberta (Figura 8). El fet de que no posseeixen la morfologia típica de tomaca valenciana fa que no tinguen preus tan elevats com el tipus masclet, tot i tindre les mateixes propietats nutricionals i organolèptiques. Figura 8. Imatge de fruites del tipus varietal Valenciana, morfologia “ Femella”. Imatge presa al Mercat Central de València. Per últim, el tercer tipus de fruit que podem trobar es el tipus “rotllo”. Consisteix en tomaques aplanades, deformes i que solen produir-se a partir de la primera flor de cada ramell floral i que es desenvolupen irregularment a causa d’una fasciació de la flor. Açò sol ser especialment important en el primer ramell de la planta (Figura 9). Aquest tipus de tomaca, al tractar-se de tomaca valenciana, pot vendre’s en el mercat, cosa que en altres varietats seria impensable. Independentment de la morfologia del fruit, els fruits presenten espatlla verda persistent i són de color rogenc menys intens que les varietats comercials. En general tenen lòculs petits distribuïts de forma irregular al voltant del cor de secció circular i de gran mida. És freqüent trobar lòculs en l’interior del cor. Figura 9. Imatge d’una fruita del tipus varietal “Valenciana” morfologia “Rotllo”. 1. INTRODUCCIÓ 12 1.4 POSADA EN VALOR DE LES VARIETATS TRADICIONALS La tomaca és una espècie a la qual se li han dedicat molts esforços tant econòmics com científics pel que fa a la millora genètica vegetal. Tant ha sigut l’atenció que se li ha pres que a dia d’avui disposem en el mercat de nombroses varietats amb característiques excel·lents. Podem trobar varietats amb nombroses resistències, amb rendiments desorbitats així com varietats amb una gran capacitat d’adaptació a diferents ambients. No obstant, en els últims anys el consumidor ha canviat de gustos i ara busca tomaques amb propietats diferents. Es podria dir que el consumidor del segle XXI busca tomaques amb unes propietats organolèptiques i nutricionals superiors. És ací on les varietats tradicionals poden presentar-se com a una alternativa per a pal·liar aquesta necessitat del mercat. El principal problema el trobem en que la majoria d’aquestes varietats tenen un caràcter marcadament local la qual cosa fa que tinguen un risc molt elevat de desaparició. Cal destacar que moltes vegades la seua conservació depèn d’uns pocs agricultors que tenen l’agricultura com una alternativa però no com a mitjà de vida. Es este un dels principals motius que accentuen la potencial pèrdua d’aquests materials. Per fer front a la desprotecció a què de vegades es veuen sotmeses les varietats tradicionals, el que s’ha de aconseguir és la posta en valor d’aquestes varietats per a que d’aquesta manera siguen atractives tant per a l’agricultor com per al consumidor. D’aquesta forma l’agricultor les cultivarà, i a través del seu cultiu les conservarà. Per a posar en valor les varietats tradicionals de tomaca, el primer que s’ha de fer és una caracterització tant agronòmica, morfològica, nutricional com sensorial dels materials prospectats al camp. En aquest sentit en diferents regions europees s’està apostant per les varietats tradicionals. Es generen així catàlegs de varietats locals com és el cas del País Basc (Fantova i Gómez, 2005), Aragó (Carravedo, 2006) o Canàries (Amador et al., 2012) entre d’altres. Així doncs, disposar d’aquesta informació ens permetrà fer-nos una idea global de la situació en una regió concreta per a poder focalitzar l’atenció i els recursos allà on les prospeccions siguen deficients o inexistents i així poder identificar materials de tomaca tradicionals amb els quals dur a terme programes de valorització. Tot i això, hi ha diferents trets que entrebanquen la recuperació i promoció de les varietats tradicionals. Aquests són la menor producció i la incidència de malalties. Pel que fa a la producció, els majors preus que poden arribar a tindre en el mercat fa que la venta de les varietats tradicionals compense la menor productivitat. No obstant això, com ja hem dit, les varietats tradicionals són de vegades heterogènies cosa que permetria dur a terme programes de selecció destinades a augmentar el rendiment en una determinada varietat tradicional. Freqüentment s’ha qüestionat la competitivitat de les varietats tradicionals, atenent a la seua baixa productivitat i la falta d’adaptació a distints sistemes de cultiu moderns. La primera crítica és matisable, sobre tot si tenim en compte el millor preu de venta. La segona, en canvi, és totalment errònia, ja que moltes empreses valencianes estant produint tomaques de tipus “Valenciana” i “De Penjar”, en cultiu a hivernacle i amb sistemes de degoteig, amb molt bona qualitat i molts bons resultats als mercats valencians i catalans (comunicació personal Jose 1. INTRODUCCIÓ 13 Herrero i José Herrera). Per últim, l’entrebanc més greu si cap és l’elevada susceptibilitat a malalties que presenten aquest tipus de varietats. Principalment presenten susceptibilitat a malalties d’origen fúngic i especialment a malalties d’etiologia viral (Soler et al., 2010). És per això que la realització de programes de millora per a la introducció de gens de resistència a malalties és una bona manera de valoritzar les varietats tradicionals i fer-les explotables comercialment, dit d’una altra manera, fer-les atractives per a l’agricultor. 1.4.1 VARIETATS TRADICIONALS COM A ALTERNATIVA RENTABLE Si d’alguna manera es pot dur a terme la posta en valor d’una varietat tradicional, sens dubte la millor forma és plantejar-la com una alternativa rentable. A tot el territori espanyol existeixen diferents varietats tradicionals que s’estan presentant com a una altra opció de negoci. Algunes d’aquestes tenen ja inclòs el seu propi nínxol de mercat consolidat. Si ens centrem en les varietats tradicionals de tomaca, existeixen diferents exemples de varietats que són amplament acceptades pels agricultors ja que han demostrat ser una bona elecció quant a rendibilitat econòmica es refereix. Per exemple a Aragó trobem el cas de la tomaca “Rosa de Barbastro” (Pascual i Lavilla, 2014). A Catalunya per exemple trobem la tomaca “ Pera de Girona” (Casals J., 2012) o la tomaca “ Montserrat” (Casals et al., 2010). Per un altre costat a València trobem diferents exemples com ara la tomaca “ Valenciana d’El Perelló”, la “Tomaca de Penjar d’Alcalà del Xivert”, la tomaca “ De la Pera” o la tomaca tipus “Mutxamel” (Figàs et al., 2015a). El tipus varietal “ De penjar” (Figura 10) per exemple, presenta certes característiques que la fan atractiva i motiu pel qual s’ha consolidat com a alternativa rentable per als agricultors valencians. El fet de tractar-se de tomaques amb una llarga vida postcollita junt amb l’elaboració artesanal i les peculiaritats úniques tant geològiques com climatològiques del terme d’Alcalà del Xivert, ha aconseguit diferenciar aquest producte de la resta dels que es produeixen en el nostre país. Figura 10. Tomaca de Penjar. Presentació al consumidor d’un ramell. 1. INTRODUCCIÓ 14 Un altre cas una mica diferent és el de la tomaca tipus “Mutxamel” (Figura 6) o la tomaca “ De la Pera” (Figura 2). Aquestes són varietats molt apreciades al territori valencià d’Alacant i la Comunitat Autònoma de Múrcia pels seus atributs organolèptics però tenen un greu problema, i és el que anteriorment hem mencionat, l’alta susceptibilitat a virosis. Així, els agricultors es mostren reticents a cultivar-les per aquest problema. En aquest sentit, La Universitat Miguel Hernández en 1998 va començar un programa de millora per a la introducció dels tres gens de resistència que fan front a les tres virosis més importants que afecten a la tomaca. Aquestes virosis són les causades per: el virus del mosaic de la tomaca (Tomato mosaic virus, ToMV), el virus del rissat groc de la tomaca (Tomato yellow leaf curl virus, TYLCV) i el virus del bronzejat de la tomaca (Tomato spotted wilt virus, TSWV). Aquest grup mitjançant la millora assistida per marcadors moleculars ha aconseguit obtenir línies que presenten resistències a cadascuna de estes virosis tant en la tomaca tipus “Mutxamel” com el tipus “De la Pera”(García et al., 2015; López, 2015). 1.4.2 LA TOMACA “VALENCIANA” COM A ALTERNATIVA RENTABLE 1.4.2.1 CARACTERÍSTIQUES GENERALS Sens dubte, la tomaca “Valenciana” es una varietat tradicional que compleix els requisits per a consolidar-se com a producte de qualitat excepcional. Aquesta posseeix un conjunt de trets que la converteixen en una tomaca amb una gran qualitat interna i una aparença externa singular. A més a més, aquest tipus de tomaca es pot collir en estat pintó sense que això afecte a la maduració del fruit i que arribe a atènyer els atributs organolèptics desitjats. Això permet comercialitzar aquesta tomaca en zones allunyades de València com a Barcelona, Saragossa o Madrid. Tot açò està permetent que any rere any aquest tipus de tomaca assolisca preus de venta raonables si comparem amb els preus de les tomaques comercials (Figura 11). De fet, ja existeixen diverses associacions de productors com ara la Cooperativa Unió Protectora del Perelló que des d’uns anys cap ací han apostat per l’autogestió i explotació comercial de la tomaca tipus varietal “Valenciana” per a així ser sobirans de la producció, comercialització i fixació de preus de la tomaca que comercialitzen com “Valenciana d’El Perelló”. Així doncs, aquesta tomaca s’està consolidant com a alternativa rentable per a molts agricultors de la comarca valenciana de la Ribera Baixa. Figura 11. Tomaca “Valenciana d’El Perelló” a un supermercat valencià 1. INTRODUCCIÓ 15 Malgrat tot açò, com ocorria amb la tomaca tipus “Mutxamel” o “De la Pera”, la tomaca “Valenciana d’El Perelló” és altament susceptible a diferents malalties; sent les malalties causades per virus les que majors pèrdues generen als agricultors. A València concretament un del virus que major incidència té i que més estralls causa a la producció és el Virus del Mosaic de Tomaca (ToMV). Aquest fet juntament amb l’elevada susceptibilitat que presenta la tomaca valenciana fa que hi hagen greus pèrdues de producció. Això a la vegada fa que molts agricultors es plantegen abandonar el cultiu de tomaca tradicional o ni tan sols plantejar-se el cultiu d’aquesta. És per això que per a donar valor a aquest tipus de varietats, no sols s’ha de dur a terme la selecció agronòmica dels materials disponibles sinó que s’ha de dur a terme la millora front a malalties que posen en perill la producció. Així, la incorporació de gens de resistència en les varietats tradicionals permetran estimular el cultiu d’aquest tipus de varietats i popularitzar el seu consum. 1.4.2.2 IMPORTÀNCIA ECONÒMICA Com ja hem dit anteriorment els majors preus que poden arribar a tindre en el mercat, fa que la venta de les varietats de tomaca “valenciana” compense la menor productivitat que assoleixen. En aquest sentit la Cooperativa Unió Protectora del Perelló cada any bat rècords de producció i actualment obté una producció mitjana anual al voltant de 800.000 Kg de tomaca “Valenciana d’El Perelló”. Un altre fet que cal tindre en compte és que el llaurador rep 1,5-1,8 € per Kg de tomaca produïda (El Mundo, 2013), mentre que el preu de la tomaca comercial millorada oscil·la entre 0,30 i 0,6 €/ Kg. Aquest preu fa que la manca de productivitat siga compensada pels preus raonables que obté. Cal destacar doncs que una producció anual d’aquestes magnituds està generant entre 1,2 i 1,44 milions d’Euros per als llauradors mentre que si es tractara de tomaca comercial millorada, la mateixa producció estaria generant al voltant de 240.000 i 480.000 Euros. 1.4.2.3 POSTA EN VALOR DE LA TOMACA TIPUS “VALENCIANA” Amb la tomaca “Valenciana” les xifres justifiquen la rendibilitat d’aquests tipus de varietats. És obvi doncs, que el cultiu de tomaca “Valenciana” s’està consolidant com a alternativa rentable per als llauradors plantejant-se així com a cultiu prometedor amb un potencial de comercialització lluny d’haver-se explotat al màxim. Tot hi això, com ja hem dit abans aquest tipus varietal és altament susceptible a diferents malalties sent a València el Virus del Mosaic de Tomaca (ToMV) el principal problema. Per un altre costat la falta d’uniformitat i quallat fan que de vegades els llauradors tinguen problemes a l’hora de comercialitzar la seua tomaca com a “Valenciana”. És per això que són necessaris programes tant de selecció com de millora per a posar en valor aquestes varietats. 3. MATERIAL I MÈTODES 20 El sòl tenia una textura sorra-argilosa. Aquest sòl, segons la USDA (United States Department of Agriculture), presenta partícules d’argila menors a 0.002 mm (8.85%), llims amb una mida entre 0.02 i 0.05 mm (5%) i la resta de sorra de 0.05 a 2 mm de mida (86.15%). Té un contingut en matèria orgànica del 2.3% i un pH de 8.11. La conductivitat del sòl és de 0.35 dS/m. Les característiques d’aquest sòl fan que una fertilització addicional siga necessària. En aquest sentit, les fertilitzacions d’aquest sòl foren mitjançant l’ús de N, P2O5 i K2O amb una quantitat de 220 Kg/ha, 50 Kg/ha i 280Kg/ha respectivament. I les males herbes s’arrancaven a ma i el tractament de fitosanitaris s’utilitzava quan era necessari. 3.4 REALITZACIÓ DE CREUAMENTS 3.4.1 RECOL·LECCIÓ DE POL·LEN DEL PARENTAL MASCULÓ Per a dur a terme els creuaments pertinents es va recol·lectar pol·len de flors madures emprant una placa petri de plàstic i unes pinces metàl·liques esterilitzades. D’aquesta manera colpejant la flor sobre la placa petri es desprenia el pol·len que posteriorment es va utilitzar per a realitzar els creuaments dirigits (Figura 13). Figura 13. Procés de recol·lecció de pol·len. A l’esquerra es veu la flor madura de la qual s’extrau el pol·len. A la imatge central es mostra com colpejant es desprèn el pol·len. A la imatge de la dreta s’observa la placa petri amb el pol·len preparat per a ser utilitzat. 3.4.2 EMASCULACIÓ I POL·LINITZACIÓ DE LES FLORS DEL PARENTAL FEMENÍ Les flors que actuaven com a femenines havien de ser emasculades, és a dir, s’havia d’eliminar l’androceu de la flor abans que el gineceu fóra receptiu per a així assegurar el creuament dirigit i evitar l’autopol·linització. Es van elegir flors immadures per a realitzar els creuaments. A aquestes flors se’ls va eliminar el con d’anteres emprant unes pinces metàl·liques i amb cura per a no danyar l’ovari i l’estil de la flor. A continuació es fregava la placa petri amb l’estigma de la flor i posteriorment es cobria la flor amb una bossa de paper i s’indicava el creuament i el dia en què s’havia realitzat (Figura 14). 3. MATERIAL I MÈTODES 21 Figura 14. Procés d’emasculació i pol·linització de la flor del parental femení. A l’esquerra es veu una flor ja emasculada on es preserva només la part femenina de la flor. A la imatge del centre es mostra com es du a terme la pol·linització. A la imatge de la dreta es mostra com es protegeixen les flors acabades de pol·linitzar per a assegurar el creuament desitjat. 3.5 DESCRIPCIÓ DEL PROGRAMA DE MILLORA REALITZAT 3.5.1 EN EL PROGRAMA DE “SELECCIÓ” Per a dur a terme aquest programa de selecció es va aplicar la “Selecció individual en varietats heterogènies”, en el qual a partir de dues seleccions massals (COOP 767 i COOP 886) es van realitzar seleccions en les successives generacions d’autofecundació. Cadascun dels individus seleccionats el primer cicle de cultiu es van convertir en progenitors d’una família en la pròxima generació a partir de la qual es va elegir el millor individu de cada família. Aquest individu seleccionat en aquesta generació a la vegada es va convertir en el progenitor d’una nova família en la següent generació. D’aquesta manera el procés es va repetir durant 4 cicles de cultiu (Figura 15). 3.5.2 EN EL PROGRAMA DE “RETROCREUAMENTS” Per a dur a terme el programa de retrocreuaments es va partir de l’híbrid “Euphrates”, el qual va actuar com a parental donador, i de les plantes seleccionades de COOP 767 i COOP 886 com s’indica a l’apartat 3.5.1. El primer cicle de cultiu (Abril-Juny 2014) es van realitzar els creuaments entre aquestes plantes seleccionades i “Euphrates” per a generar el creuament inicial (C1). Al segon cicle (Abril-Juny 2015) es va dur a terme el primer retrocreuament (RC1) emprant com a mares les plantes procedents de l’autofecundació de les plantes seleccionades el primer cicle de cultiu. Com a pares es van utilitzar només aquells individus C1 heterozigots portadors de l’al·lel de resistència (Tm22). Per a identificar aquests individus es va emprar un marcador molecular associat a l’al·lel de resistència com s’indica a l’apartat 3.6. Cal destacar que, per a assegurar el següent cicle, els retrocreuaments no només es van fer sobre els individus seleccionats en el programa de selecció (3.5.1) sinó també sobre aquells individus que més flors presentaven. A més a més, també es va fer una selecció d’aquells individus heterozigots procedents del RC1 i RC2, que sent heterozigots, eren fenotípicament més semblants a la “Tomaca Valenciana d’El Perelló”. Per a dur a terme aquesta selecció es van seguir els següents criteris: “Aparença Valenciana” (0=Euphrates, 10= Valenciana), “Espatlla” (Baixa intensitat/Alta intensitat), “Forma apuntada del fruit” (Baixa intensitat/Alta intensitat), “Acostellat del fruit” (Baixa intensitat/Alta intensitat), “Quallat” (Baix/Alt). 3. MATERIAL I MÈTODES 22 D’aquesta manera, es va repetir el mateix procés de selecció i creuaments, realitzant el RC2 el cicle tercer (Setembre-Desembre 2015) i el RC3 el cicle quart (AbrilJuny 2016) ( Figura 16 i 17). Figura 15. Esquema del programa de selecció utilitzat. Els cercles verds indiquen quina planta s’ha seleccionat i per tant serà progenitora d’una nova família en el següent cicle. Les línies rectes paral·leles representen solcs composats per un nombre diferent de plantes depenent de l’any que ens trobem. Les fletxes indiquen que es conserva la identitat de cada llinatge. 3. MATERIAL I MÈTODES 23 Figura 16. Esquema del programa de retrocreuaments a partir de la selecció massal COOP 767. Els cercles verds indiquen quina planta s’ha seleccionat. Les creus roges fan referència als llinatges de retrocreuaments que s’han perdut. Les línies rectes paral·leles representen solcs composats per un nombre diferent de plantes depenent de l’any i el llinatge en el qual trobem. Els retrocreuaments es fan respectant els llinatges, és a dir, les plantes heterozigòtiques procedents del C1 es creuen en les plantes procedents d’autofecundació del llinatge corresponent. Per exemple les plantes heterozigòtiques C1-22 es creuaran amb plantes 22 procedents de l’autofecundació de la planta 22 seleccionada l’any anterior. 3. MATERIAL I MÈTODES 24 Figura 17. Esquema del programa de retrocreuaments a partir de la selecció massal COOP 886. Els cercles verds indiquen quina planta s’ha seleccionat. Les línies rectes paral·leles representen solcs composats per un nombre diferent de plantes depenent de l’any i el llinatge en el qual ens trobem. Els retrocreuaments es fan respectant els llinatges, és a dir, les plantes heterozigòtiques procedents del C1 es creuen en les plantes procedents d’autofecundació del llinatge corresponent. Per exemple les plantes heterozigòtiques C1-41 es creuaran amb plantes 41 procedents de l’autofecundació de la planta 41 seleccionada inicialment. 3. MATERIAL I MÈTODES 25 CODI Seqüència d’encebador (5’3’) SNP Tm2-2-F CAAGCATGTAACAGTTGCTTTTC SNP Tm2-2-R CAGGTATCCACATCAAGGTTTG 3.6 MARCADOR MOLECULAR ASSOCIAT AL GEN DE RESISTÈNCIA Tm22 Els marcadors SNPs han sorgit recentment com a uns dels marcadors moleculars més prometedors que existeixen. En aquest treball es va emprar un marcador SNP per a realitzar el genotipat d’aquelles plantes procedents del C1, RC1 i RC2. Per a poder dur a terme el programa de retrocreuaments mitjançant la selecció assistida per marcadors ens vam basar en la publicació de Shi et al., (2011) i amb dos seqüències disponibles en “GenBank” (FJ817600.1 i FJ817602.1) corresponents a l’al·lel susceptible “tm2” i a l’al·lel resistent “Tm22” per a desenvolupar encebadors que ens permeteren identificar els SNPs associats a l’al·lel susceptible i l’al·lel resistent. D’aquesta manera érem capaços de discernir aquelles plantes heterozigòtiques (C/T) portadores de l’al·lel dominant Tm22 que confereix resistència al virus del ToMV d’aquelles susceptibles (C/C). 3.7 DISSENY D’ENCEBADORS A partir de la informació proporcionada per (Shi et. al, 2011) es van desenvolupar encebadors mitjançant l’ús del programa “Primer 3” (Untergasser et al., 2012), fixant com a encebadors òptims aquells amb una temperatura d’annealing (Tm) de 60ºC i una mida de 20 parells de bases (bp). Es va restringir la mida de l’amplicó a 90-150 bp ja que per a l’anàlisi d’SNPs mitjançant “High Resolution Melting” (HRM) es requereixen fragments com més petits millors. A la Taula 3 es mostren els encebadors emprats. Taula 3. Encebadors emprats per a dur a terme el genotipat per al gen Tm22 3.8 EXTRACCIÓ D’ADN L’ADN genòmic es va extraure a partir de fulles joves dels individus a genotipar. De cadascuna de les plantes es van prendre aproximadament 75 mg de teixit vegetal. El protocol seguit per a l’obtenció del material genòmic va ser el mètode CTAB (Doyle, 1987). La quantificació de l’ADN es va realitzar amb un espectrofotòmetre Nanodrop ND-1000 (Nanodrop Technologies, Wilminton, DE) i la qualitat de l’ADN es va avaluar mitjançant les relacions d’absorbància a 260/280 nm i 260/230 nm. L’anàlisi d’integritat de l’ADN es va realitzar mitjançant electroforesi en gel d’agarosa al 0,8%, utilitzant tinció amb GelRed i revelat amb llum UV en un analitzador d’imatges Gel Doc (BioRad) mitjançant el software Quantity One (BioRad). 3. MATERIAL I MÈTODES 26 3.9 ANÀLISI D’SNPS MITJANÇANT “HIGH RESOLUTION MELTING” Per a efectuar el genotipat de les plantes es va dur a terme un anàlisi d’SNPs mitjançant la tècnica del “High Resolution Melting”. L’instrument que es va utilitzar va ser el LightCycler 480 (Roche). El Mix de reacció va consistir en MgCl2 1.8 mM; encebadors directe i revers (SNP Tm2-2-F i SNP Tm2-2-R) a 0.3μM, MàsterMix 1X (Kit LightCycler 480 High Resolution Melting Master, Roche), 60ng d’ADN i aigua fins completar un volum final de reacció de 10 μM. Les condicions de reacció van consistir en una primera etapa de preincubació a 95ºC durant 10 minuts; Una segona etapa d’amplificació constituïda per 55 cicles d’amplificació a 95ºC 10 s, 55ºC durant 15 s i 72ºC durant 15 s; Una tercera etapa de fusió a 95ºC durant 1 minut, 40ºC durant 1 minut i 60ºC durant 1 s seguit d’una rampa de temperatura on es va partir de 60ºC i es va augmentar la temperatura fins a 95ºC incrementant la temperatura 0.02 ºC per segon. Per últim una quarta etapa de refredament de 10 minuts a 40ºC. Finalitzada la reacció d’amplificació, l’amplificació era avaluada emprant el software “LightCycler 480 Software 1.5” mitjançant dos anàlisis: “Tm calling” i “Gene scanning”. A través del primer anàlisi es verificava l’absència d’amplificacions inespecífiques. Mitjançant el segon anàlisi es verificava el control negatiu i les corbes de fusió eren normalitzades a través dels paràmetres “melt slider” i “threshold” per a l’òptima diferenciació dels genotips. D’aquesta manera érem capaços de diferenciar les plantes homozigòtiques recessives (tm22tm22) o (C/C) d’aquelles heterozigòtiques (Tm22 tm22) o (C/T) les quals ens interessaven per a seguir amb el programa de retro-creuaments. 3.10 INOCULACIÓ MECÀNICA DE ToMV PER A VALIDAR LA RESISTÈNCIA 3.10.1 PREPARACIÓ DE L’INÒCUL I INOCULACIÓ En cada cicle de cultiu es va dur a terme un petit assaig per a validar la resistència d’aquelles plantes portadores de l’al·lel de resistència “Tm22”. El mètode de preparació de l’inòcul i inoculació va consistir en triturar el teixit vegetal amb ToMV procedent del “Groupe d’Etude et de cotrôle des Variétés Et des Semences” (GEVES). A continuació la pasta obtinguda es va filtrar a través d’un teixit de muselina i es va recollir el filtrat en un got de precipitat. L’extracte obtingut es va diluir en aigua destil·lada en una proporció 1:10 (pes : volum) i es va mantenir en un ambient refrigerat per a evitar la degradació del virus. A l’inòcul se li va incorporar l’agent abrasiu carborúndum de tamís ASTM nº 600 a l’1% i carbó actiu a l’1%. A partir de les plantes portadores de l’al·lel de resistència “Tm22”, es van obtenir esqueixos. Aquests, una volta arrelats varen ser inoculats de forma mecànica mitjançant un aplicador de cotó. L’inòcul es va distribuir per tota la superfície foliar. El procés de preparació d’inòcul i inoculació es va repetir uns 7-15 dies després per a prevenir possibles escapes. 3.10.2 ANÀLISI SEROLÒGIC DE LES MOSTRES Es van prendre mostres de les fulles apicals no inoculades de cada planta als 15, 30 i 45 dies. Les mostres es van analitzar mitjançant la tècnica “Double Antibody Sandwich-Enzyme linked Inmunosorbent Assay” (DAS-ELISA), seguint el protocol de (Clark i Adams, 1977) amb modificacions especificades pels proveïdors dels anticossos (Loewe biochemica). 3. MATERIAL I MÈTODES 27 L’absorbància de la reacció DAS-ELISA va ser mesurada a 405 nm en un fotòmetre “Microplate Reader Model 550” (BioRad Laboratories, Hercules, EEUU). Aquest paràmetre es va considerar una mesura relativa de l’acumulació viral (Ding et al., 1995). Es considerava que la mostra era positiva, és a dir, que hi havia presència del virus quan l’absorbància era major que la mitjana de les absorbàncies de les respectives plantes control més tres vegades la seva desviació típica. 4. RESULTATS I DISCUSSIÓ 4. RESULTATS I DISCUSSIÓ 28 Selecció Espatlla Forma apuntada Acostellat Quallat COOP 767-22 MI MI BI M COOP 767-27 AI AI BI M COOP 767-38 MI MI BI M COOP 767-50 AI MI BI M COOP 767-53 AI MI BI M COOP 767-63 AI MI MI M COOP 767-68 MI AI MI M COOP 767-89 AI BI BI M COOP 886-41 BI MI BI B COOP 886-42 MI MI BI M COOP 886-54 AI AI BI M COOP 886-55 AI BI BI M COOP 886-81 AI MI BI M 4.1 GENERACIONS OBTINGUDES 4.1.1 PROGRAMA DE “SELECCIÓ” De les 95 plantes de cadascuna de les dos 2 seleccions massals (COOP-767 i COOP-886) de les quals es va partir, es van seleccionar 11 plantes de la selecció COOP-767 (COOP-767 22, 27, 38, 44, 50, 53, 54, 57, 63, 68 i 89) i 5 plantes de la selecció COOP-886 (COOP-886 41, 42, 54, 55 i 81) que es van autofecundar per a constituir les mares del següent cicle en el programa de retrocreuaments. En el següent cicle (Abril-Juny 2015) es va repetir el procés, és a dir, es van seleccionar les millors plantes de cada llinatge i es va recollir llavor d’autofecundació per a poder així generar les mares del següent cicle en el programa de Retrocreuaments. Aquest procés es va repetir cicle rere cicle i actualment es disposa de la quarta generació d’autofecundació d’aquells llinatges seleccionats (Taula 4). Taula 4. Característiques morfològiques dels llinatges seleccionats en el programa de selecció. Espatlla (BI=Baixa intensitat, MI= Mitjana intensitat, AI= Alta intensitat), Forma apuntada (BI=Baixa intensitat, MI= Mitjana intensitat, AI= Alta intensitat), Acostellat (BI=Baixa intensitat, MI= Mitjana intensitat, AI= Alta intensitat) i Quallat (A=Alt, M=Mitjà, B=Baix). 4.1.2 PROGRAMA DE “RETROCREUAMENTS” Les 11 plantes seleccionades de COOP 767 i les 5 de COOP 886 es van utilitzar com a mares en el C1 amb “Euphrates” (Abril-Juny 2014). D’aquestes 16 seleccions es va obtenir llavor del C1. D’altra banda, d’aquests creuaments es van obtenir diferent nombre de plantes total i nombre de plantes heterozigòtiques (Taula 5). 5. CONCLUSIONS 34 1. S’han seleccionat tomaques valencianes per a diferents característiques morfològiques i agronòmiques com ara “Aparença Valenciana”, “Espatlla”, “Forma apuntada del fruit”, “Acostellat del fruit” i “Quallat”. Així doncs es disposa de 13 llinatges de tomaca “valenciana” amb diferents característiques. 2. S’ha dut a terme un programa de retrocreuaments on es disposa de material procedent del RC2, per a 12 llinatges, amb fenotips avançats de valenciana així com amb resistència efectiva a ToMV. 3. El marcador molecular associat a l’al·lel de resistència “Tm22” ha mostrat ser eficaç per a seleccionar aquells individus portadors de dit al·lel. Aquesta eficàcia de selecció s’ha comprovat amb inoculacions mecàniques en cada cicle de cultiu així com en condicions d’infecció en camp. 4. L’al·lel de resistència “Tm22” ha mostrat ser efectiu front al virus ToMV cosa que ens permetrà obtenir una varietat fenotípicament valenciana i amb resistència a aquest virus. 5. La consecució d’aquest programa de millora, una vegada s’obtinguen el RC3 i l’ RC4 i les posteriors autofecundacions amb les quals quedarà fixat el gen de resistència, permetrà posar a disposició del llaurador una varietat de “Tomaca Valenciana d’ El Perelló”, resistent al ToMV i amb bones característiques agronòmiques i morfològiques. 6. BIBLIOGRAFIA 6. BIBLIOGRAFIA 35 Amador, L., Santos, B., Ríos, D. (2012). Variedades tradicionales de tomates de Canarias. Tenerife. ISBN. Obtingut en: http://sechaging-madrid2013.org/geystiona/adjs/comunicaciones/272/C06450001.pdf Blanca, J., Cañizares, J., Cordero, L., Pascual, L., Diez, M. (2012). Variation revealed by SNP genotyping and morphology provides insight into the origin of the tomato. PloS One. Obtingut en: http://journals.plos.org/plosone/article?id=10.1371/journal.pone.0048198 Carravedo, M. (2006). Variedades autóctonas de tomates de Aragón. De Tecnología Agroalimentaria de Aragón. Retrived from: http://www.sidalc.net/cgibin/wxis.exe/?IsisScript=INIA.xismethod=postformato=2cantida d=1expresion=mfn=018629 Casals, J. (2012). Filogènia i variabilitat genètica de les varietats tradicionals de tomàquet (Solanum lycopersicum L.) Montserrat/Pera de Girona i Penjar. Estratègies per a la millora de la seva qualitat organolèptica. Universitat Politècnica de Catalunya. Casals, J., Bosch, L., Casañas, F., Cebolla, J. (2010). Montgrí, a cultivar within the Montserrat tomato type. Obtingut en: http://hortsci.ashspublications.org/content/45/12/1885.short Cebolla-Cornejo, J. (2005). Recuperación de variedades tradicionales de tomate y pimiento. Caracterización y mejora genética. Fernando Nuez. Universitat Politècnica de València. Cebolla-Cornejo, J., Roselló, S., Nuez, F. (2013). Phenotypic and genetic diversity of Spanish tomato landraces. Scientia Horticulturae. Obtingut en: http://www.sciencedirect.com/science/article/pii/S030442381300407X Cerdan, J. (2015). Caracterización morfológica y agronómica de una colección de variedades tradicionales de tomate de Valencia. Salvador Soler. Universitat Politècnica de València. Disponible en : riunet.upv.es Clark, M., Adams, A. (1977). Characteristics of the microplate method of enzyme-linked immunosorbent assay for the detection of plant viruses. Journal of General Virology. Obtingut en: http://jgv.microbiologyresearch.org/content/journal/jgv/10.1099/0022-1317-34-3-475 Cortés-Olmos, C, Valcárcer JV, Roselló J, Díez MJ, Cebolla-Cornejo J. 2015. Tradicional Eastern Spanish varieties of tomato. Scientia Agricola, 5:420-431 Cuartero, J. (2001). Tomate para consumo en fresco. Sociedad Española de Ciencias Hortícolas. Ding, X., Shintaku, M., Arnold, S. (1995). Accumulation of mild and severe strains of tobacco mosaic virus in minor veins of tobacco. MPMI-Molecular Plant. Obtingut en: http://www.apsnet.org/publications/mpmi/BackIssues/Documents/1995Articles/Microb e08-32.pdf 6. BIBLIOGRAFIA 36 Doré, C., Varoquaux, F. (2006). Histoire et amélioration de cinquante plantes cultivées. Obtingut en: https://books.google.es/books?hl=eslr=id=6pbtFya2zy8Coi=fndpg=PA17dq=histoire+et+a melioration+des+cinquante+plantes+cultiveesots=qvTWbf1eMEsig=VtBLBIJMVkZwNIoPhj U3pnafzYo Dominguez, A. 1998. Conservación, caracterización y redistribución de variedades hortícolas tradicionales. Experiencias con agricultores ecológicos en Valencia. Doyle, J. (1987). A rapid DNA isolation procedure for small quantities of fresh leaf tissue. Phytochem Bull. Obtingut en: http://ci.nii.ac.jp/naid/10021087108/ Esquinas-Alcázar, J. y Nuez, F. (1995). Situación taxónomica, domesticación y difusión del tomate. Mundi-Prensa. El Mundo (2013). Los secretos del mejor tomate. Visto el 20 de Mayo de 2015 en: http://www.elmundo.es/elmundo/2013/07/06/valencia/1373137440.html Fantova, M., Gómez, J. de G. (2005). Variedades autóctonas de tomate del País Vasco. Obtingut en: http://germoplasma.net/wp-content/uploads/2013/04/Variedades-detomate-1.pdf FAO. (1996). The state of world’s plant genetic resource for food and agriculture. FAO. (2011). El estado de los recursos fitogenéticos para la alimentación y la agricultura en el mundo. Segundo informe. FAO. (2014). Buscador de datos estadísticos de la FAO. Figàs, M. R., Prohens, J., Raigón, M. D., Fernández-de-Córdova, P., Fita, A., Soler, S. (2015a). Characterization of a collection of local varieties of tomato (Solanum lycopersicum L.) using conventional descriptors and the high-throughput phenomics tool Tomato analyzer. Genetic Resource and Crop Evolution, 62(2), 189-204. Obtingut en: http://doi.org/10.1007/s10722-014-0142-1 Figàs, M. R., Prohens, J., Raigón, M. D., Fita, A., García-Martínez, M. D., Casanova, C., Soler, S. (2015b). Characterization of composition traits related to organoleptic and functional quality for the differentiation, selection and enhancement of local varieties of tomato from different cultivar groups. Food Chemistry, 187, 517-524. Obtingut en: http://doi.org/10.1016/j.foodchem.2015.04.083 García-Martínez, S., Grau, A., Alonso, A. (2015). UMH 916, UMH 972, UMH 1093, UMH 1127, and UMH 1139: Four Fresh-market Breeding Lines Resistant to Viruses Within the Muchamiel Tomato Type. Obtingut en: https://hortsci.ashspublications.org/content/50/6/927.full Hall, T. (1980). Resistance at the Tm-2 locus in the tomato to tomato mosaic virus. Euphytica. Retrieved from http://link.springer.com/article/10.1007/BF00037266 Harlan, J. R., Jack R. (1975). Crops amp; man. American Society of Agronomy. Junta consultiva agrícola. (1914). Avance estadístico de la riqueza en España representa la producción media anual de las plantas hortícolas y plantas industriales. Ministerio de Fomento. 6. BIBLIOGRAFIA 37 López, F. R. (2015). Efecto de la introducción de genes de resistencia a virosis en tomate sobre caracteres agronómicos y de calidad organoléptica de variedades localmente. Retrieved from :http://dspace.umh.es/handle/11000/2070 Mackay, J., Wright, C. (2008). A new approach to varietal identification in plants by microsatellite high resolution melting analysis: application to the verification of grapevine and olive.Plant. Obtingut en: http://plantmethods.biomedcentral.com/articles/10.1186/1746-4811-4-8 Ministerio de Agricultura, Alimentación y Medio Ambiente. 2016. Estadísticas agricultura. Superficie y producción anuales de cultivo. Disponible en: www.magrama.org.es Nuez, F., Rodríguez del Rincón, A. (1995). El cultivo del tomate. Mundi-Prensa. Paran, I., Knaap, E. van der. (2007). Genetic and molecular regulation of fruit and plant domestication traits in tomato and pepper. Journal of Experimental Botany. Retrieved from http://jxb.oxfordjournals.org/content/58/14/3841.short Pascual, J. A., Lavilla, P. B. (2014). Evaluación de material vegetal seleccionado de tomate rosa de Barbastro (Solanum lycopersicum L.). Obtingut en: http://citarea.citaaragon.es/citarea/handle/10532/2703 Shi, A., Vierling, R., Grazzini, R., Chen, P. (2011). Molecular markers for Tm-2 alleles of tomato mosaic virus resistance in tomato. American Journal of plant science. Retrieved from http://file.scirp.org/Html/5712.html Soler, S., Prohens, J., López, C., Aramburu, J. (2010). Viruses infecting tomato in Valencia, Spain: Occurrence, distribution and effect of seed origin. Journal of phytopathology. Obtingut en: http://onlinelibrary.wiley.com/doi/10.1111/j.1439-0434.2010.01706.x/full Untergasser, A., Cutcutache, I., Koressaar, T., Ye, J., Faircloth, B. C., Remm, M., Rozen, S. G. (2012). Primer3--new capabilities and interfaces. Nucleic Acids Research, 40(15), e115. Obtingut en: http://doi.org/10.1093/nar/gks596 Wittwer, C., Reed, G., Gundry, C. (2003). High-resolution genotyping by amplicon melting analysis using LCGreen. Clinical chemistry. Retrieved from Obtingut en: http://www.clinchem.org/content/49/6/853.short ANNEXE I 1 2 BI BI BI B 2 8 AI MI AI B 3 8 AI MI BI A Acostellat Quallat Individu Aparença valenciana Forma apuntada Espatlla 1 6 MI MI BI A 2 8 MI MI MI A 3 8 AI BI MI A 4 6 AI BI BI A 5 2 BI BI BI A 6 2 BI BI BI A 7 6 MI BI BI A 8 2 AI BI BI B Individu Espatlla Acostellat Quallat Aparença valenciana Forma apuntada 1 9 AI AI BI A 2 8 AI AI MI A 3 4 MI BI MI A 4 4 MI BI MI A 5 5 MI BI BI A 6 9 AI BI AI A 7 4 AI BI MI A Individu Espatlla Acostellat Quallat Aparença valenciana Forma apuntada 1 2 BI BI MI B 2 2 BI BI BI B 3 4 MI BI MI B 4 6 AI BI MI B 5 7 AI BI MI B Aparença valenciana Forma apuntada Individu Espatlla Acostellat Quallat Caracterització dels individus heterozigots procedents del RC1. L’aparença valenciana (0=Euphrates, 10= Valenciana), Espatlla (BI=Baixa intensitat, MI= Mitjana intensitat, AI= Alta intensitat), Forma apuntada (BI=Baixa intensitat, MI= Mitjana intensitat, AI= Alta intensitat), Acostellat (BI=Baixa intensitat, MI= Mitjana intensitat, AI= Alta intensitat) i Quallat (A=Alta, B=Baix). Llinatge COOP 886-41: Llinatge COOP 886-42: Llinatge COOP 886-54: Llinatge COOP 886-55 Fr1: 1 4 MI BI MI A 2 9 AI MI MI A 3 4 MI BI MI M 4 4 MI BI MI B Individu Espatlla Acostellat Quallat Aparença valenciana Forma apuntada 1 6 AI BI MI A Individu Espatlla Acostellat Quallat Aparença valenciana Forma apuntada 1 9 AI MI MI A 2 4 MI BI MI B 3 7 AI BI MI M 4 6 AI BI MI A 5 4 AI BI AI B 6 6 MI BI MI B 7 8 AI MI MI A Individu Espatlla Acostellat Quallat Aparença valenciana Forma apuntada 1 9 BI BI MI A 2 4 BI BI MI M 3 6 MI BI MI A 4 4 MI AI MI M Individu Espatlla Acostellat Quallat Aparença valenciana Forma apuntada 1 6 MI BI MI B 2 6 AI BI MI B 3 4 MI BI MI B Individu Espatlla Acostellat Quallat Aparença valenciana Forma apuntada 1 6 MI BI AI M 2 6 MI BI AI M 3 6 AI BI AI B 4 2 MI BI MI B Individu Espatlla Acostellat Quallat Aparença valenciana Forma apuntada Llinatge COOP 886-55 Fr2: Llinatge COOP 886-81: Llinatge COOP 767-89: Llinatge COOP 767-38: Llinatge COOP 767-22 Fr1: Llinatge COOP 767-22 Fr2: 1 3 MI BI MI B 2 4 BI BI MI B 3 4 MI MI MI M 4 8 AI MI MI A 5 6 MI MI MI A 6 2 MI BI BI A 7 7 MI MI MI M 8 2 MI BI BI M 9 9 AI AI MI M 10 6MI AI AI A 11 4BI BI MI M 12 5MI BI BI M 13 2MI BI BI B 14 6AI BI MI A 15 7AI BI MI A 16 7AI BI MI A 17 6MI BI MI B 18 6AI MI AI M 19 4MI BI MI M Aparença valenciana Forma apuntada Individu Espatlla Acostellat Quallat 1 2 AI BI MI A 2 2 AI BI MI A 3 7 AI AI MI A Aparença valenciana Forma apuntada Individu Espatlla Acostellat Quallat Llinatge COOP 767-50: Llinatge COOP 767-53: Llinatge COOP 767-68 Fr1: Llinatge COOP 767-68 Fr2: 1 4 BI BI MI B 2 6 AI MI MI A 3 6 AI BI MI A Individu Espatlla Acostellat Quallat Aparença valenciana Forma apuntada 1 2 AI BI MI M 2 7 AI BI MI M Individu Espatlla Acostellat Quallat Aparença valenciana Forma apuntada Llinatge COOP 767-63: Caracterització dels individus heterozigots procedents del RC2. L’aparença valenciana (0=Euphrates, 10= Valenciana), Espatlla (BI=Baixa intensitat, MI= Mitjana intensitat, AI= Alta intensitat), Forma apuntada (BI=Baixa intensitat, MI= Mitjana intensitat, AI= Alta intensitat), Acostellat (BI=Baixa intensitat, MI= Mitjana intensitat, AI= Alta intensitat) i Quallat (A=Alta, B=Baix). Llinatge COOP 88641: Llinatge COOP 886-42: Llinatge COOP 886-54: 1 2 MI BI MI B 2 6 AI BI MI M 3 8 AI BI MI A Individu Espatlla Acostellat Quallat Aparença valenciana Forma apuntada 1 7 AI AI BI A 2 6 AI MI MI B 3 6 AI MI MI A 4 7 AI MI MI A 5 8 AI AI BI M 6 8 AI AI BI M 7 7 AI MI MI M 8 9 AI AI BI A Quallat Individu Aparença valenciana Espatlla Forma apuntada Acostellat 1 8 AI MI MI M 2 8 AI BI BI A 3 7 AI MI MI M 4 7 AI BI BI M 5 7 AI BI BI B Individu Aparença valenciana Espatlla Forma apuntada Acostellat Quallat