Detección por hibridación molecular de virus en cultivos de tomate con manejo convencional, integrado y ecológico

UNIVERSITAT POLITÈCNICA DE VALÈNCIA ESCOLA TÈCNICA SUPERIOR D’ENGINYERIA AGRONÒMICA I DEL MEDI NATURAL Detección por hibridación molecular de virus en cultivos de tomate con manejo convencional, integrado y ecológico TRABAJO FIN DE GRADO EN BIOTECNOLOGÍA ALUMNO: Ferran Salavert Pamblanco DIRECTORES: Dr. Luis Rubio Miguélez y Dr. Luis Galipienso Torregrosa TUTOR: Carmelo López del Rincón Curso Académico 2015-2016 VALENCIA, Julio de 2016 ALUMNO: Ferran Salavert Pamblanco DIRECTORES: Luis Rubio Miguélez y Luis Galipienso Torregrosa TUTOR: Carmelo López del Rincón FECHA: Valencia, Julio de 2016 TÍTULO: Detección por hibridación molecular de virus en cultivos de tomate con manejo convencional, integrado y ecológico RESUMEN El creciente interés por llevar a cabo prácticas sostenibles con el medio ambiente, también ha llegado a la agricultura, produciéndose un incremento de las prácticas ecológicas u orgánicas en las últimas décadas. Las enfermedades virales causan graves daños y pérdidas económicas en cultivos de tomate de todo el mundo, lo que supone una reducción en la producción. Entre los virus más importantes están los virus del mosaico del tomate (ToMV), del mosaico del pepino (CMV), del bronceado del tomate (TSWV), del mosaico del pepino dulce (PepMV), del moteado de la parietaria (PMoV) y del rizado amarillo del tomate (TYLCV). Resulta crucial disponer de un método de detección preciso y rápido, para evaluar la incidencia de estos virus y poder aplicar los correspondientes métodos de control de la enfermedad. En este trabajo se puso a punto la hibridación molecular para detectar estos virus, y se aplicó para estimar cómo varía la incidencia de los mismos durante el cultivo de tomate en campos con un manejo convencional, integrado y ecológico. PALABRAS CLAVE: diagnóstico, hibridación, virus, tomate, cultivo ecológico. AUTHOR: Ferran Salavert Pamblanco DIRECTORS: Luis Rubio Miguélez y Luis Galipienso Torregrosa TUTOR: Carmelo López del Rincón DATE: Valencia, July 2016 TITLE: Detection by molecular hybridization of viruses in tomato crops under conventional, integrated and organic management ABSTRACT The growing interest in carrying out sustainable practices with the environment has also come to agriculture, resulting in an increase on the ecological or organic practices in the last decades. The viral diseases cause serious damage and economical loses in tomato crops all over the world, which is translated into a reduction of the production. Among the most important viruses is it possible to find the Tomato Mosaic Virus (ToMV), the Cucumber Mosaic Virus (CMV), the Tomato Spotted Wilt Virus (TSWV), the Pepino Mosaic Virus (PepMV), the Parietaria Mottle Virus (PMoV) or the Tomato Yellow Leaf Curl Virus (TYLCV). It is crucial to have a precise and fast detection method, in order to evaluate the incidence of these viruses and to apply the most suitable control methods for the disease. In this project, the molecular hybridization has been set-up for detecting these viruses, and has been applied to analyze the variations on the viral incidence during the tomato crop in fields under conventional, integrated and organic managements. KEYWORDS: diagnosis, hybridization, virus, tomato, organic culture. AGRADECIMIENTOS En primer lugar me gustaría dedicarles este trabajo a mis padres, hermanas y tía; que me han impedido salirme del camino y me han animado para seguir y poder estar ahora mismo escribiendo estas palabras. También agradecer todo el apoyo que he tenido por parte de amigos y amigas más cercanos, que me han dado el último empujón que necesitaba. Para poder llevar a cabo los ensayos de campo, se han establecido distintas colaboraciones con particulares e instituciones. Mención especial me gustaría hacer a una persona que generosamente cedió su parcela particular de Vinalesa y se encargó del manejo del cultivo siguiendo las directrices de este estudio: Vicente Lloris, muchas gracias. También agradecer a la Fundación Cajamar Valencia, y más en particular a Carlos Baixauli, director del Centro de Experiencias de la fundación, por adjudicar una parcela en Paiporta para este estudio y llevar a cabo los manejos estipulados del cultivo de tomate. Finalmente, agradecer a José Serra y Josep Roselló, de la Estación Experimental de Carcaixent del Instituto Valenciano de Investigaciones Agrarias, por realizar el diseño y seguimiento de los ensayos de Vinalesa, Paiporta y Carcaixent y encargarse del cultivo y manejo de la parcela de Carcaixent. Destacar tabién al Dr. Alberto Urbaneja y a su equipo, por su participación y asesoramiento en el control biológico Por último, aunque no menos importante, agradecer al Instituto Valenciano de Investigaciones Agrarias (IVIA) y a todas aquellas personas del laboratorio que me han ayudado en la realización del proyecto. Gracias a Andrés Puchades, que me ha aconsejado durante todo el desarrollo experimental. Finalmente, agradecer a mis dos directores, Luis Rubio y Luis Galipienso, gracias a los cuales ha sido posible la realización de este proyecto. ÍNDICE 1. INTRODUCCIÓN ............................................................................................................................................. 1 1.1. El modelo de cultivo ecológico .............................................................................................................. 1 1.2. Cultivo de tomate en la Comunidad Valenciana y la importancia de los virus ................. 3 1.3. Información básica acerca de los virus del estudio ....................................................................... 4 1.3.1. CMV ................................................................................................................................................. 4 1.3.2. PepMV............................................................................................................................................ 5 1.3.3. PMoV .............................................................................................................................................. 6 1.3.4. ToMV .............................................................................................................................................. 7 1.3.5. TSWV .............................................................................................................................................. 8 1.3.6. TYLCV ............................................................................................................................................ 9 1.4. Detección y diagnóstico de virus ....................................................................................................... 10 2. OBJETIVOS .................................................................................................................................................... 12 3. MATERIALES Y MÉTODOS .................................................................................................................... 13 3.1. Diseño experimental y muestreo ....................................................................................................... 13 3.2. Purificación de ácidos nucleicos ........................................................................................................ 14 3.3. Detección de los virus por hibridación molecular ...................................................................... 15 4. RESULTADOS Y DISCUSIÓN .................................................................................................................. 19 4.1. Incidencia viral tras la hibridación molecular.............................................................................. 19 4.2. Particularidades de la infección viral ................................................................................................ 20 4.2.1. Ensayo 1: Paiporta................................................................................................................. 20 4.2.2. Ensayo 2: Carcaixent ............................................................................................................ 22 4.2.3. Ensayo 3: Vinalesa ................................................................................................................ 22 5. CONCLUSIONES ........................................................................................................................................... 23 6. REFERENCIAS BIBLIOGRÁFICAS ....................................................................................................... 24 ÍNDICE DE TABLAS Tabla 1. Composición de las diferentes soluciones utilizadas .......................................................... 18 ÍNDICE DE FIGURAS Figura 1. Evolución del consumo anual de fertilizante en España .................................................... 2 Figura 2. Evolución de la superficie destinada a agricultura ecológica en España..................... 2 Figura 3. Producción de hortalizas en España media de 2008 a 2012 ............................................ 3 Figura 4. Representación de la partícula viral o virión de CMV ......................................................... 5 Figura 5. Representación de la estructura del genoma de los virus del género Cucumovirus ............................................................................................................................................................ 5 Figura 6. Representación del virión de PepMV ......................................................................................... 6 Figura 7. Representación de la estructura del genoma de PepMV .................................................... 6 Figura 8. Representación de la partícula viral de PMoV ........................................................................ 7 Figura 9. Representación de la estructura del genoma de los virus del género Ilarvirus ....... 7 Figura 10. Representación del virión de ToMV ......................................................................................... 8 Figura 11. Representación de la estructura del genoma de ToMV .................................................... 8 Figura 12. Representación del virión de TSWV ......................................................................................... 9 Figura 13. Representación de la estructura del genoma de TSWV ................................................... 9 Figura 14. Representación del virión de TYLCV .................................................................................... 10 Figura 15. Representación de la la estructura del genoma de TYLCV .......................................... 10 Figura 16. Esquema del proceso de la hibridación molecular de ácidos nucleicos ................. 11 Figura 17. Esquema de las plantaciones de tomate usado en los tres ensayos localizados en Paiporta, Carcaixent y Vinalesa ..................................................................................................................... 14 Figura 18. Representación de la membrana de hibridación ............................................................. 16 Figura 19. Resultados de las pruebas de reacción cruzada entre las diferentes sondas ...... 16 Figura 20. Resultados de incidencia tras llevar a cabo la hibridación molecular de los seis virus de estudio ................................................................................................................................................... 20 Figura 21. Evolución de la incidencia de ToMV a lo largo del tiempo en la parcela bajo manejo intensivo y ecológico en las variedades de tomate Valenciano y Óptima ................... 21 LISTADO DE ABREVIATURAS ADN Ácido Desoxirribonucleico AMV Alfalfa Mosaic Virus ARN Ácido Ribonucleico CMV Cucumber Mosaic Virus CP Proteína de cápside CSPD Quimioluminiscente CTAB Bromuro de hexadeciltrimetilamonio EDTA Ácido etilendiaminotetraacético F:Cl:AI Fenol:Cloroformo:Alcohol isoamílico h hora(s) M Molar mJ miliJulio(s) MP Proteína de movimiento NaCl Cloruro de sodio N. tenuis Nesidiocoris tenuis ORF Open Reading Frame PCR Reacción en cadena de la polimerasa PepMVPepino Mosaic Virus PMoV Parietaria Mottle Virus PTGS Silenciamiento Génico Post-Transcripcional PVY Potato Virus Y RdRp ARN polimerasa dependidente de ARN rpm Revoluciones/minuto RT-PCR Reacción en cadena de la polimerasa con transcriptasa reversa SDS Dodecilsulfato sódico SSC Tampón SSC TCES Tris, NaCl, EDTA, SDS (Tampón extracción ARN) TMV Tobacco Mosaic Virus ToMV Tomato Mosaic Virus TSWV Tomato Spotted Wilt Virus TYLCD Tomato Yellow Leaf Curl Disease TYLCV Tomato Yellow Leaf Curl Virus l Microlitro(s) 1 1. INTRODUCCIÓN 1.1. El modelo de cultivo ecológico La agricultura es vital para nuestra sociedad ya que, de la misma, depende en gran medida la alimentación de la población mundial, la cual está en constante crecimiento. Debido a la creciente demanda de alimentos, han emergido múltiples innovaciones y avances tecnológicos, con el fin de aumentar la productividad (Pretty et al., 2010). El modelo agrícola establecido, conocido como convencional, está basado en el monocultivo de variedades vegetales de alto rendimiento, y depende de un uso elevado de productos agroquímicos. Pese a que los resultados a nivel de producción que se obtienen de su utilización son muy altos, también lo son los efectos negativos que derivan de su puesta en práctica: contaminación del medio ambiente por la utilización de los agroquímicos, aumento de la resistencia de las plagas y las enfermedades, erosión y disminución progresiva de la fertilidad del suelo, riesgos para la salud humana y animal, etc. Es en este marco, es cuando empieza a tomar importancia la agricultura ecológica, también conocida como orgánica. La agricultura ecológica se puede definir como la puesta en práctica de un conjunto de técnicas de conservación y mejora de la calidad del suelo, que favorecen al ecosistema, y que permiten la obtención de productos de máxima calidad nutritiva, sin la utilización de productos químicos de síntesis, lo que permite mantener la sostenibilidad del medio ambiente. En los últimos veinte años se ha producido un incremento de su popularidad en todo el mundo (De Ponti et al., 2012). La demanda, por parte de los consumidores, de productos “amigables” con el medio ambiente, que estuvieran producidos siguiendo unas pautas determinadas y estuvieran libres de productos químicos, ha permitido la expansión de este modelo de cultivo (Rigby y Cáceres, 2001). Pese a este incremento en su popularidad, todavía sigue siendo bajo el porcentaje de terreno de cultivo destinado al cultivo ecológico. Se vislumbran razones, tanto por parte de la perspectiva del consumidor, como de la del productor, que condicionan la puesta en práctica de estas técnicas. Por una parte, aquellos productos generados utilizando estas técnicas, suelen ir acompañados de precios más elevados y, por otra parte, se suelen obtener menores y más variables rendimientos, a la vez que la demanda de estos tipos de productos suele ser más limitada (De Ponti et al,. 2012). Como beneficio de la utilización de este tipo de manejo, se encuentra el enriquecimiento del suelo. Las prácticas llevadas a cabo, como son la rotación de cultivos, el cultivo mixto, la utilización de cultivos de cubierta, etc; benefician a la fauna y flora del suelo, al mismo tiempo que a la formación y estructuración del mismo, propiciando sistemas más estables. A su vez, se produce una mejora de la capacidad de retención de nutrientes y agua, incrementándose también la circulación de los mismos y de energía, lo que confluye en una independencia de la utilización de fertilizantes minerales. Gracias a esta mejor capacidad de retención de nutrientes se reduce el peligro de contaminación de aguas subterráneas, un problema muy acusado en el manejo convencional, debido a la utilización de fertilizantes y plaguicidas sintéticos. Otro aspecto destacable es la mayor fijación de carbono en el suelo, fruto de las prácticas llevadas a cabo en este manejo, lo cual aumenta la productividad y también contribuye a mitigar el efecto invernadero. Por último, se genera un aumento de la biodiversidad, ya que se proporcionan estructuras que ofrecen sustento y no se emplean plaguicidas. Se favorece el establecimiento de diversas especies de insectos y artrópodos y de organismos beneficiosos para el sistema orgánico, como pueden ser polinizadores o depredadores de plagas, generándose un control biológico natural (Altieri, 1995). 2 En el caso de España, la introducción de este manejo está siendo progresiva, quedando patente en la evolución en el consumo anual de fertilizantes (Figura 1) y, por otra parte, la evolución de la superficie destinada a la agricultura orgánica (Figura 2): Figura 1. Evolución del consumo anual de fertilizante en España (Martínez et al., 2013) Figura 2. Evolución de la superficie destinada a agricultura ecológica en España (Martínez et al., 2013) Un sistema de producción agraria a medio camino entre la agricultura convencional y la ecológica es la producción integrada. Este tipo de agricultura permite el uso de productos agroquímicos de síntesis (abonos, pesticidas., etc.), aunque restringiéndolos todo lo posible y combinándolos con otros más respetuosos con el medio ambiente, como los métodos biológicos. 9 Figura 12. Representación del virión de TSWV (http://viralzone.expasy.org) Figura 13. Representación de la estructura del genoma de TSWV (http://viralzone.expasy.org) 1.3.6. TYLCV El virus del rizado amarillo del tomate, también conocido como “virus de la cuchara”, pertenece al género Begomovirus. Fue detectado por primera vez en Israel en 1959 y es el causante de una de las enfermedades de plantas más devastadoras en todo el mundo, la enfermedad del rizado amarillo del tomate (Tomato yellow leaf curl disease, TYLCD) (Glick et al., 2009). El virus provoca pérdidas en la productividad muy altas, dependiendo del estado fenológico de la planta en el momento de la infección, pudiendo llegar hasta un 100%. En el área del Mediterráneo, este virus se ha convertido en un factor limitante tanto para la producción en campo abierto como para los cultivos bajo cubierta. Aunque se trata de un patógeno mayoritariamente de tomate, se ha reportado que induce enfermedades en otros cultivos, como las judías (Loebenstein y Lecoq, 2012). Este virus es transmitido por la mosca blanca Bemicia tabaci (Loebenstein y Lecoq, 2012). Los viriones están formado por dos icosaédros incompletos (Figura 14) y encapsida el genoma formado por una única molécula de ADN circular de simple cadena (Figura 15) (Glick et al., 2009) que contienen los siguientes genes: 10 1. C1 codifica la proteína Rep, involucrada en la regulación de replicación y transcripción. 2. C2 codifica TrAP que induce un incremento de la expresión de la CP, a la vez que participa tanto en la supresión de defensas del huésped como en la infección viral sistémica. 3. C3 codifica REn, que interactúa con Rep y también aumenta la acumulación del ADN viral en la planta infectada. 4. C4 codifica productos implicados en el movimiento del virus y en la patogenicidad. 5. V1 codifica la CP. 6. V2 codifica productos implicados en el movimiento viral. Figura 14. Representación del virión de TYLCV (http://viralzone.expasy.org) Figura 15. Representación de la la estructura del genoma de TYLCV. Los ORFs están designados como V (orientación viral) o C (orientación sentido complementario) (Glick et al., 2009) 1.4. Detección y diagnóstico de virus Resulta vital poder disponer de un método que sea eficaz y preciso para la detección e identificación de los virus, ya que una pronta detección de la presencia de los mismos en una planta constituye una de las mejores herramientas para frenar su avance (Pallás et al., 1998). Por otra parte, el control de la calidad fitosanitaria de la semilla, también es un aspecto muy a tener en cuenta para el control de las enfermedades virales, puesto que una certificación de que el material de propagación vegetativo está exento de virus, permite una producción de plantas libres de los mismos y de las enfermedades que 11 estos producen (Rangel et al., 2006). También resulta muy importante tener una herramienta para detectar la presencia viral, para evaluar la capacidad de resistencia y tolerancia al virus de variedades de distintos cultivos obtenidas por mejora genética. Los principales métodos de diagnóstico o detección son: la caracterización biológica, la observación al microscopio, el análisis serológico, el análisis de ARN bicatenario, la hibridación molecular, la reacción en cadena de la polimerasa (PCR), la amplificación isotérmica, la diferenciación de variantes genéticas y la secuenciación nucleotídica (Rangel, 2015). La hibridación de ácidos nucleicos (Figura 16) es la técnica seleccionada para este estudio, tratándose de una de las más fiables y sensitivas a la hora de llevar a cabo un diagnóstico de virus en plantas, y tiene la ventaja añadida de que permite analizar simultáneamente un gran número de muestras. Esta técnica molecular se basa en la capacidad de apareamiento específico entre dos cadenas sencillas de ARN, ADN o ARN – ADN que tengan secuencias complementarias formando una estructura de doble cadena más estable. La síntesis de una molécula de ARN o ADN monocatenario complementaria al genoma del virus (sonda) marcada con isótopos radioactivos (como el 32P) o con marcajes no-radioactivos (como la molécula digoxigenina o diferentes fluoróforos) y su posterior hibridación con ácidos nucleicos (dot-blot) de la planta fijados en un soporte sólido (generalmente una membrana) permite detectar la presencia del virus (Ferriol et al., 2015) Figura 16. Esquema del proceso de la hibridación molecular de ácidos nucleicos (http://andrus-dna-tech-project-2012.wikispaces.com) 12 2. OBJETIVOS El aumento de la concienciación por la sostenibilidad del medio ambiente es una realidad en nuestra sociedad. Esto se refleja en la horticultura, en la que se está produciendo un cambio de mentalidad en los últimos tiempos, lo que ha hecho emerger a la agricultura orgánica. Sin embargo, esta no queda exenta de las enfermedades virales, las cuales suponen un gran impedimento para la producción. Por ello, resulta muy importante el estudio de la incidencia viral en las plantas cultivadas bajo este tipo de manejo, para poder adoptar medidas, siempre bajo la regulación de este tipo de cultivos; o para tratar de seguir determinadas directrices durante el proceso de cultivo, que permitan tener bajo control la gran cantidad de enfermedades virales que afectan a los cultivos de tomate. El principal objetivo de este trabajo es comprobar si existen diferencias en la incidencia viral en plantas cultivadas bajo los manejos convencional, integrado y ecológico, al mismo tiempo que analizar las razones que han llevado a esa posible diferencia en la tasa de infección. Para ello, se establecen unos objetivos concretos: 1. Llevar a cabo el diseño experimental de los diferentes ensayos 2. Llevar a cabo la detección de los diferentes virus mediante hibridación molecular 3. Analizar los resultados de incidencia viral obtenidos 13 3. MATERIALES Y MÉTODOS 3.1. Diseño experimental y muestreo Para llevar a cabo el estudio, en el verano de 2015 se llevaron a cabo tres ensayos independientes en las localidades valencianas de Paiporta, Carcaixent y Vinalesa (Figura 17). En cada uno de ellos, se demarcaron dos parcelas contiguas, cada una de ellas siendo destinada a un tipo de manejo agrícola, pero intentando que fueran lo mas similares posibles para que fueran más comparables. Cada parcela se dividió en seis subparcelas, en tres se cultivaron plantas de tomate de la variedad Optima y en las otras tres la variedad Tomate Valenciano. Optima es un hibrido comercial al que se ha incorporado uno o más de un genes de resistencia a ToMV y el tomate Valenciano es una variedad local sin ningún tipo de resistencias. Ensayo 1. En Paiporta se comparó un sistema de producción integrada con uno ecológico a los que se los que se hicieron un tratamiento de control biológico basado en la suelta de ejemplares de Nesidiocoris tenuis. Se trata de un chinche de la familia de los míridos, que un depredador generalista que se alimenta de mosca blanca, lepidópteros (incluida la Tuta absoluta que es una plaga para tomate), trips y araña roja. Cuando no dispone de presas se puede alimentar del cultivo. Tanto en el cultivo integrado como en el ecológico se utilizó un sistema de semiforzado que consistió en acolchado negro y microtúnel de polipropileno térmico de baja densidad (17g/m2). El objetivo era mejorar las condiciones ambientales en las primeras fases de desarrollo del cultivo y actuar de barrera física impidiendo la llegada de insectos transmisores de virosis. Ensayo 2. En Carcaixent se comparó un cultivo de tomate convencional con uno ecológico, llevándose también a cabo un tratamiento de control biológico basado en la suelta de ejemplares de N. tenuis. No se utilizó ningún sistema de semiforzado. Ensayo 3. En Vinalesa, se comparó un cultivo de tomate convencional con uno ecológico. No se realizó ningún tratamiento de control biológico, ni se empleó ningún sistema de semiforzado. El manejo integrado se realizó siguiendo las directrices del Real Decreto 1201/2002, de 20 de noviembre (BOE núm. 287 de sábado 30 noviembre 2002), y el manejo ecológico según una normativa europea, el Reglamento CE 834/2007 sobre producción y etiquetaje de los productos ecológicos, cuyas disposiciones de aplicación (incluyendo el sistema de control) están establecidas por el Reglamento CE 889/2008.rol) están establecidas por el Reglamento CE 889/2008. 14 Paiporta Integrado + control biológico Ecológico + control biológico Carcaixent Ecológico +Control biológico Convencional + control biológico Vinalesa EcológicoConvencional Variedad Valenciano Variedad Optima Figura 17. Esquema de las plantaciones de tomate usado en los tres ensayos localizados en Paiporta, Carcaixent y Vinalesa. Cada cuadrado representa una planta de tomate. Se realizaron seis tomas de muestra cada dos semanas, excepto para el último muestreo, el cual se llevó a cabo tres semanas después. En el primer muestreo (27 mayo de 2015) se seleccionaron aleatoriamente dos plantas por cada subparcela, llegando a un total de 72 plantas entre las tres localidades. Estas mismas plantas se utilizaron en los siguientes muestreos para llevar a cabo un análisis longitudinal. De cada una de las plantas seleccionadas se recogieron 0,2 g de hojas del meristemo apical, que fueron almacenadas en tubos eppendorf de 1,5 ml. Estos tubos eppendorf, con el fin de preservar la integridad del posible material genético viral presente en el material vegetal, fueron guardados en un recipiente que contenía nitrógeno líquido. Posteriormente, todas las muestras obtenidas tras cada muestreo se almacenaron en un congelador a -80 C. 3.2. Purificación de ácidos nucleicos Para poder obtener el material genético del virus, se llevó a cabo la purificación de ácidos nucleicos. Para los virus de genoma de ARN (CMV, PepMV, PMoV, ToMV y TSWV) se siguió el método de Fenol/Clorofomo (Ferriol et al., 2011). Este consiste en: 1. Triturado de la muestra en nitrógeno líquido en un aparato “tissuelyser”, hasta que el material quede completamente homogéneo. 2. Adición de 500 l de tampón TCES, 500 l de fenol:cloroformo:alcohol isoamílico (F:Cl:AI) y 2.5 l de 2-mercaptoetanol. Homogeneización, empleando un agitador vórtex, durante 1 minuto aproximadamente. Centrifugación a 13000 rpm durante 10 minutos. 3. Recogida de la fase acuosa superior, evitando la fase orgánica. Adición de 450 l de F:Cl:AI. Homogeneización, empleando el vórtex, durante 1 minuto. Centrifugación a 13000 rpm durante 5 minutos. 15 4. Recogida de la fase acuosa y posterior adición de 0,1 volúmenes de acetato sódico 3M a pH 5,5 y 2 volúmenes de etanol al 95%. 5. Incubación a -20 ºC, durante un día, para conseguir una buena precipitación del material genético. 6. Centrifugación de las muestras precipitadas a una temperatura de 4ºC y a una velocidad de 13000 rpm, durante 30 minutos. 7. Eliminación del sobrenadante y lavado del sedimento con 400 l de etanol al 70%. Centrifugación a una temperatura de 4 ºC y a una velocidad de 13000 rpm, durante 10 minutos. 8. Finalmente, secado del sedimento, mediante tiras de papel Whatman 3MM, y posterior resuspensión del mismo en 20 l de H2O estéril. Para obtener el material genético de TYLCV, el cual se trata de un virus de ADN, se llevó a cabo el método de CTAB: 1. Triturado de la muestra en nitrógeno líquido en un aparato “tissuelyser”, hasta que el material quede completamente homogéneo. 2. Añadir 400 l de CTAB y 5 ml de 2-mercaptoetanol. Agitar y vórtex. 3. Calentar 1 hora a 60 ºC agitando cada 10 min. 4. Añadir 400 l cloroformo: isoamílico (24:1). Agitar en vórtex. 5. Centrifugar 5 minutos a 12000 rpm a temperatura ambiente. 6. Recoger fase acuosa superior. 7. Añadir el mismo volumen de isopropanol. Agitar volteando la gradilla. 8. Dejar a -20 ºC durante 15 minutos. 9. Centrifugar 10 min. a 12.000 rpm a una temperatura de 4 ºC. 10. Lavar el pellet con etanol 70%. 11. Centrifugar 5 minutos a una velocidad de 10000 rpm a una temperatura de 4 ºC. 12. Secar el sedimento al aire y resuspender con 50 l de H2O estéril. Tras llevar a cabo todos estos pasos, se almacenan las muestras en un congelador a una temperatura de -80 C. 3.3. Detección de los virus por hibridación molecular Por cada virus analizado se preparó una membrana de hibridación. Para la elaboración de la misma se empleó membrana de nylon cargada positivamente (Roche), dejando alrededor de 0,5 cm2 para cada muestra, de la cual se puso de 1l de extracto de material genético. Al finalizar la colocación de muestras en la membrana, esta se fija mediante radiación ultravioleta a 120 mJ/cm2, para la preservación de la integridad del material genético de cada una de las muestras. La disposición de las muestras en cada membrana se muestra en la Figura 18, donde cada columna hace referencia a cada una de las 24 muestras, y cada fila a un muestreo, quedando separados los diferentes ensayos por una fila sin muestras. La disposición de los controles positivo y negativo, quedan representados en la membrana por los signos “+” y “-”, respectivamente. 16 Figura 18. Representación de la membrana de hibridación. En la membrana quedan separadas las diferentes muestras de los diferentes ensayos, perteneciendo las 24 primeras al ensayo de Carcaixent, de la 25-48 al de Vinalesa y, por último, de la 49-72 al ensayo de Paiporta. Las letras A, B, C, D, E y F corresponden a los muestreos del 1 al 6, respectivamente. Las sondas empleadas para llevar a cabo la hibridación, las cuales estaban disponibles en el laboratorio, fueron diseñadas a partir de la secuencia de la CP de cada virus y se sintetizaron a partir de RT-PCR o PCR. Se llevó a cabo un ensayo de reactividad cruzada (Figura 19), para comprobar que las sondas hibridaban únicamente con controles positivos del virus para el que habían sido diseñadas. Los resultados del ensayo de reactividad cruzada indicaron que las diferentes sondas eran específicas únicamente para el virus para el que habían sido diseñadas. Figura 19. Resultados de las pruebas de reacción cruzada entre las diferentes sondas, junto con el esquema, en la parte derecha, de la disposición de los diferentes controles positivos para cada virus en la membrana. En las subfiguras A, B, C, D E y F; se muestran los resultados de la hibridación con las sondas de PMoV, PepMV, TYLCV, ToMV, CMV y TSWV, respectivamente, las cuales reaccionaron únicamente con el control positivo del virus para el que habían sido diseñadas. 17 El protocolo seguido para llevar a cabo la hibridación molecular, consta de tres partes: 1. Prehibridación: Se lleva a cabo (con solución de hibridación ) durante un mínimo de 1 h y un máximo de 3 h, a la temperatura de hibridación, la cual es de 50 C para sondas de ADN (TYLCV) y 68 C para sondas de ARN (CMV, PepMV, PMoV, ToMV y TSWV). 2. Hibridación: Si la sonda no ha sido previamente utilizada, se debe desnaturalizar a una temperatura de 95 C, durante 10 minutos. Sin embargo , si esta ya ha sido utilizada previamente , solo es necesaria una desnaturalización previa a 68 C, también durante 10 minutos. Finalmente, se añade la sonda al tubo de hibridación, junto con solución de hibridación, y el proceso se extiende durante un periodo de tiempo entre 12 y 14 h (overnight). 3. Lavados. Consta de los siguientes pasos: a) Lavado 1: Dos lavados de 15 minutos a temperatura de hibridación con solución de lavado 1. b) Lavado 2: Dos lavados de 15 minutos a temperatura de de hibridación con solución de lavado 2. c) Maleato-Tween: Dos lavados de 5 minutos a temperatura ambiente con tampón maleato-tween. d) Maleato: Dos lavados de 5 minutos a temperatura ambiente con tampón maleato. e) Bloqueo: Un lavado de 60 minutos a temperatura ambiente con solución bloqueante al 2%. f) Bloqueo-Anticuerpo: Un lavado de 30 minutos a temperatura ambiente con una dilución 1:10.000 del anticuerpo en solución bloqueante al 2 %. g) Maleato-Tween: Dos lavados de 5 minutos a temperatura ambiente con tampón maleato-tween. h) Maleato: Dos lavados de 5 minutos a temperatura ambiente con tampón maleato. i) Incubación en tampón de detección: Se extrae la membrana del tubo de hibridación y se mantiene durante 2-3 minutos en un recipiente con tampón de detección. En la Tabla 1 quedan resumidas las composiciones de las diferentes soluciones utilizadas durante todo el proceso. Por último, queda el proceso de revelado de la membrana. Para ello, se toma la membrana, se deposita en el interior de una funda de plástico, y se elimina el exceso de tampón de detección. El siguiente paso consiste en añadir un volumen suficiente de la dilución de CSPD (dilución 1:100 en tampón de detección), y se incuba en oscuridad durante 5 minutos. Seguidamente, se elimina el exceso de CSPD, para evitar una reacción excesiva, que favorecería la presencia de ruido de fondo. Se ella la funda y se introduce en un casette, junto con papel fotográfico. Este se incuba a 37 C en la estufa, para aumentar la cinética de la reacción, durante 20 minutos si se trata de sondas de ADN, y 40 minutos para las de ARN. Finalmente, se revelan en un cuarto oscuro mediante la utilización de revelador, agua y fijador, en este orden. 18 Tabla 1. Composición de las diferentes soluciones utilizadas Solución Composición TCES 0.2M Tris-HCl 1M pH 8 0,1M EDTA 0,5M pH 8 0.2 M NaCl 0,2 M SDS 10% F:Cl:IA 50 % fenol saturado 48% cloroformo 2% alcohol isoamílico Solución de prehibridación 25 % SSC x 20 0,02 % SDS 10% 0,1 % sal sódica N-laryl 10% 2% reactivo bloqueante 50 % formamida Lavado 1 10 % SSC x 20 1 % SDS 10% Lavado 2 0,5 % SSC x 20 1 % SDS 10% Tampón Maleato 100 mM Ácido Maleico 150 mM NaCl pH 7,5 Tampón Maleato-Tween 100 mM Ácido Maleico 150 mM NaCl pH 7,5 0,3 % Tween 20 Solución de reactivo bloqueante 10% Disolución del reactivo bloqueante en tampón maleato a una concentración 10g/100mL Tampón de detección 100 mM Tris-HCl 100 mM NaCl 25 Meshi T, Motoyoshi F, Adachi A, Watanabe Y, Takamatsu N, Okada Y (1988) Two concomitant base substitutions in the putative replicase genes of tobacco mosaic virus confer the ability to overcome the effects of a tomato resistance gene, Tm-1. The EMBO journal, 7, 1575-1581. Pallás V, Más P, Sánchez-Navarro JA (1998) Detection of plant RNA viruses by nonisotopic dot-blot hybridization. Plant Virology Protocols: From Virus Isolation to Transgenic Resistance, 461-468. Palukaitis P (2011) The Road to RNA Silencing is Paved with Plant-Virus Interactions. Plant Pathology Journal , 27, 197-206. Panattoni A, Luvisi A, Triolo E (2013) Review. Elimination of viruses in plants: twenty years of progress. Spanish Journal of Agricultural Research, 11, 173-188. Panno S, Davino S, Rubio L, Rangel E, Davino M, García-Hernández J, Olmos A (2012) Simultaneous detection of the seven main tomato-infecting RNA viruses by two multiplex reverse transcription polymerase chain reactions. Journal of virological methods, 186, 152156. Pretty J, Sutherland WJ, Ashby J, Auburn J, Baulcombe D, Bell M, Bentley J, Bickersteth S, Brown K, Burke J (2010) The top 100 questions of importance to the future of global agriculture. International journal of agricultural sustainability, 8, 219-236. Aranguren E (2015) Desarrollo de métodos moleculares de detección de virus de RNA de cultivos hortícolas. Tesis Doctoral en Virología. Universidad Politècnica de València. Rangel E, Schmidt A, Centeno F (2006) Implementación de la técnica de ELISA para la detención de virus y otros Patógenos en plantas de Venezuela. Revista Digital del CENIAP (Venezuela). Rigby D, Cáceres D (2001) Organic farming and the sustainability of agricultural systems. Agricultural systems, 68, 21-40. Sherwood J, German T, Moyer J, Ullman D (2009) Tomato spotted wilt. The Plant Health Instructor DOI: 101094, visto el 20 de junio de 2016 http://www.apsnet.org/edcenter/intropp/lessons/viruses/Pages/TomatoSpottedWilt.as px Soler S, Prohens J, López C, Aramburu J, Galipienso L, Nuez F (2010) Viruses Infecting Tomato in València, Spain: Occurrence, Distribution and Effect of Seed Origin. Journal of Phytopathology, 158, 797-805. Soler-Aleixandre S, Nuez F (2016) Control genético de la tolerancia a los aislados del ToMV que superan la resistencia del gen Tm-2 2 en tomate, visto el 22 de junio de 2016 http://www.sech.info/ACTAS/index.php?d=./Acta%20n%C2%BA%2054.%20VI%20Cong reso%20Ib%C3%A9rico%20de%20Ciencias%20Hort%C3%ADcolas.%20XII%20Congres o%20Nacional%20de%20Ciencias%20Hort%C3%ADcolas/Comunicaciones/ Van Regenmortel MH, Fraenkel-Conrat H (2013) The Plant Viruses: The Rod-shaped Plant Viruses. Springer Science & Business Media. Plenum Press. New York: 181-197. Wintermantel WM, Cortez AA, Anchieta AG, Gulati-Sakhuja A, Hladky LL (2008) Coinfection by two criniviruses alters accumulation of each virus in a host-specific manner and influences efficiency of virus transmission. Phytopathology, 98, 1340-1345.