Efecto de carbovir-trifosfato sobre la función plaquetaria

! ! UNIVERSITAT*POLITÈCNICA*DE*VALÈNCIA* * ESCOLA!TÈCNICA!SUPERIOR!D’ENGINYERIA! AGRONÒMICA!I!DEL!MEDI!NATURAL! ! ! ! ! Efecto!de!carbovir.trifosfato! sobre!la!función!plaquetaria! ! ! TRABAJO!FIN!DE!GRADO!EN!BIOTECNOLOGÍA! ! María*Amparo*Blanch*Ruiz* ! Tutores:!Dra.!Ángeles!Álvarez!Ribelles,! Dr.!Juan!Vicente!Esplugues!Mota! ! Tutor!académico:!María!Pilar!López!Gresa! ! Curso!Académico:!2015/2016! ! Valencia,!Julio!de!2016! * * ! ! Alumno:!María!Amparo!Blanch!Ruiz! Tutores:!Dra.!Ángeles!Álvarez!Ribelles!y!Dr.!Juan!V.!Esplugues!Mota! Fecha:!Valencia,!Julio!2016!! Título:!Efecto!de!carbovir\trifosfato!sobre!la!función!plaquetaria! ! Resumen:! Abacavir!es!un!fármaco!antirretroviral!ampliamente!utilizado!en!el!tratamiento!del! SIDA.!Se!metaboliza!en!el!citoplasma!de!las!células!para!dar!lugar!a!carbovir\trifosfato,!su! metabolito!activo.!Se!ha!observado!que!el!uso!de!abacavir!está!asociado!con!la!aparición! de!efectos!adversos!a!nivel!cardiovascular,!en!particular!con!un!mayor!riesgo!de!sufrir! infarto! de! miocardio.! Sin! embargo,! se! desconoce! si! estos! efectos! están! producidos! por! abacavir!o!por!carbovir\trifosfato,!o!cuales!son!los!mecanismos!responsables.!! ! La! plaqueta! tiene! un! papel! fundamental! en! la! patofisiología! del! infarto! de! miocardio,!siendo!fundamental!en!el!desarrollo!del!trombo!que!conduce!a!la!isquemia!y!al! infarto.!En! este! sentido,! recientemente! se! ha! demostrado! que! abacavir! induce! tanto! interacción! plaqueta\endotelio! como!interacción! plaqueta\leucocito! sin! producir! la! activación!plaquetaria.! ! ! Por! tanto,! el! objetivo! del! presente! trabajo! fue! analizar! el! efecto! de! carbovir\ trifosfato!en!la!función!plaquetaria,!en!particular!sobre:! • la! interacción! plaqueta\endotelio:! empleando!un! sistema! de! cámara! paralela! de! flujo!que!reproduce!la!velocidad!a!la!que!viaja!la!sangre!por!el!torrente!sanguíneo,! • la! interacción! plaqueta! leucocito:! utilizando!la! citometría! de! flujo! que! permite! separar! las! diferentes! poblaciones! leucocitarias! y! mediante! un! anticuerpo! específico!para!plaquetas!(CD41),!determinar!la!presencia!de!plaquetas!en!cada! población!de!leucocitos,! • la!activación!plaquetaria:!determinando!la!expresión!de!P\selectina!en!la!población! de!plaquetas,!mediante!la!citometría!de!flujo.! ! Esto!nos!permitirá!dilucidar!si!los!efectos!de!abacavir!sobre!la!función!plaquetaria! podrían!ser!o!no!provocados!por!carbovir\trifosfato!y!ayudaría!a!explicar!el!mecanismo! por!el!cual!abacavir!puede!producir!toxicidad!vascular.!! ! Del! mismo! modo! que! abacavir,! carbovir\trifosfato! induce! interacción! plaqueta\ endotelio!y!plaqueta\leucocito!y!no!induce!un!incremento!en!la!expresión!de!P\selectina,! por! tanto,! no! activa! las! plaquetas.! La! única! diferencia! entre! los! efectos! de! estos! dos! compuestos!es!el!tipo!celular!implicado!en!la!interacción!plaqueta\endotelio:!en!el!caso!de! la! interacción! inducida! por! abacavir!el! compuesto! esta!ejerciendo! un! efecto! sobre! las! células!endoteliales!mientras!que!en!la!inducida!por!carbovir\trifosfato,!éste!ejerce!una! acción!tanto!sobre!células!endoteliales!como!sobre!plaquetas.! ! Palabras! clave:! Abacavir,! carbovir\trifosfato,! plaqueta,! leucocito,! endotelio,! interacción! plaqueta\leucocito,!interacción!plaqueta\endotelio.! ! ! Student:!María!Amparo!Blanch!Ruiz! Professors:!Dra.!Ángeles!Álvarez!Ribelles!y!Dr.!Juan!V.!Esplugues!Mota! Date:!July!2016,!Valencia!! Title:!Effect!of!carbovir\triphosphate!on!platelet!function! ! Abstract:!! Abacavir! is! an! antiretroviral! drug! widely! used! in! the! treatment! of! AIDS.! It! is! metabolized! in! the! citoplasm! of! the! cells! to! lead! to! carbovir\triphosphate,! its! active! metabolite.!Several!studies!have! shown!the! association! of! abacavir!with! cardiovascular! adverse!effects,!particularly!with!an!increased!risk!of!myocardial!infarction.!However,!it!is! unknown! whether! these! effects! are! caused! by! abacavir! or! by! carbovir\triphosphate,! neither!the!mechanisms!involved.!! ! Platelet!plays!a!major!role!in!the!pathophysiology!of!myocardial!infarction,!being! important!in!the!thrombus!development!leading!to!ischemia!and!infarction.!In!this!regard,! it!has!recently!demonstrated!that!abacavir!induces!both!platelet\endothelium!and!platelet\ leukocyte!interactions,!but!doesn’t!induce!platelet!activation.! ! Therefore!the!aim!of!this!study!was!to!analyze!the!effects!of!carbovir\triphosphate! on!platelet!function!by!characterizing!its!effect!on:! • platelet\endothelium!interaction:!employing!a!flow!chamber!that!reproduces!the! flow!shear!rate!present!on!the!vessel!wall,! • platelet\leukocyte! interaction:! using! flow! cytometry! that! will! differentiate! leukocyte! subpopulations! and! will! analyze! by! an! specific! antibody! for! platelets! (CD41),!the!presence!of!platelets!in!each!subpopulation,!! • platelet! activation:! measuring! the! expression! of! P\selectin! in! the! population! of! platelets,!by!flow!cytometry.! ! This!will!allow!us!to!determine!whether!the!effects!of!abacavir!on!platelet!function! coul!be!induced!or!not!by!carbovir\triphosphate!and!will!help!to!explain!the!mechanism!by! which!abacavir!would!cause!vascular!toxicity.! ! In!the!same!way!of!abacavir,!carbovir!triphosphate!induces!platelet\endothelium! and! platelet\leukocyte! interactions,! and! doesn´t! induce! an! increase! on! P\selectin! expression,!so!it!doesn´t!activate!platelets.!The!only!one!difference!between!the!effects!of! these!two!compounds!is!the!cell!type!involved!on!!platelet\endothelium!interaction:!in!the! case! of! the! interaction! induced! by! abacavir!this! compound! is! exerting! an! effect! on! endothelial!cells!whereas!on!the!interaction!induced!by!carbovir\triphosphate,!this!exerts! an!effect!on!both!endothelial!cells!and!platelets.! ! ! Keywords:! Abacavir,! carbovir\triphosphate,! platelet,! leukocyte,! endothelium,! platelet\ leukocyte!interaction,!platelet\endothelium!interaction.! ! ! ! ! Agradecimientos! En!primer!lugar,!me!gustaría!agradecer!a!Ángeles!Álvarez!Ribelles!y!Juan!Vicente! Esplugues!Mota!por!haberme!permitido!realizar!este!trabajo!bajo!su!dirección!y!por!su! confianza! en! mí.! Especialmente! agradecer! a! Ángeles! por! su! ayuda,! su! tiempo! y! por! su! interés!en!mi!formación!científica.! ! Dar!las!gracias!también!a!toda!la!gente!del!laboratorio!por!haberme!acogido!desde! el!primer!día,!por!el!ambiente!que!hay!en!el!laboratorio!y!por!la!compañía!que!han!hecho! que! estos! últimos! meses! hayan! sido! toda! una! experiencia.! Sobre! todo,! a! Samu! por! haberme!enseñado!cómo!funciona!el!trabajo!en!el!laboratorio,!por!su!ayuda,!sus!consejos!y! su!apoyo,!a!Nicole!por! haberme! guiado!en!el! laboratorio!cuando!llegué,!y!a! Víctor,!por! estar!siempre!pendiente!y!dispuesto!a!ayudarme.! ! Aunque!estos!últimos!meses!no!nos!hayamos!visto!demasiado,!así!somos!nosotras,! también!quería!dar!las!gracias!a!mis!amigas!“biotecs”!porque!después!de!haber!estado! juntas!estos!cuatro!años!puedo!decir!que!sin!vosotras!este!viaje!no!hubiera!sido!lo!mismo,! y! aunque! ahora! nuestros! caminos! se! separan! siempre! recordaremos! que! esto! lo! empezamos!juntas.! ! A!mi!familia,!agradecer!que!cada!uno!a!su!modo!también!me!hayan!ayudado!en! todo!lo!que!ha!estado!en!sus!manos,!por!su!apoyo,!y!su!ánimo,!y!por!escucharme!aunque!la! mayoría!de!veces!no!supieran!de!que!estaba!hablando.! Muchas'gracias'a'todos…' ! * * * * ! ! ÍNDICE* * I. INTRODUCCIÓN*............................................................................................................*1! 1. INFECCIÓN!Y!CICLO!BIOLÓGICO!DEL!VIH!..........................................................................................!1! 2. FÁRMACOS!ANTIRRETROVIRALES!.....................................................................................................!3! ! !! 2.1!Abacavir!(ABC)!.......................................................................................................................!6! ! ! 2.2!!Carbovir9trifosfato!(CBV9TP)!...........................................................................................!7! 3. EFECTOS!DE!LA!TERAPIA!ANTIRRETROVIRAL!EN!EL!SISTEMA!CARDIOVASCULAR!....................!8! 4. PROCESO!INFLAMATORIO:!FUNCIÓN!PLAQUETARIA!.......................................................................!9! ! !! 4.1!Interacción!plaqueta9endotelio!...................................................................................!10! ! !! 4.2!Interacción!plaqueta9plaqueta:!agregación!..........................................................!11! ! ! 4.3!!Interacción!plaqueta9leucocito!....................................................................................!12! II. OBJETIVOS*..................................................................................................................*14! III. MATERIALES*Y*MÉTODOS*.....................................................................................*15! 1. MÉTODOS!............................................................................................................................................!15! ! !! 1.1!Aislamiento!y!cultivo!de!células!endoteliales!.........................................................!15! ! ! 1.2!!Extracción!de!plasma!rico!en!plaquetas!(PRP)!y!preparación!de!plaquetas! lavadas!humanas!................................................................................................................!16! ! ! 1.3!!Protocolo!experimental!de!tratamiento!...................................................................!16! ! ! 1.4!!Ensayo!de!adhesión!en!cámara!paralela!de!flujo!.................................................!17! ! ! 1.5!!Análisis!de!la!interacción!plaqueta9leucocito!........................................................!19! ! ! 1.6!!Determinación!de!la!activación!plaquetaria!mediante!el!análisis!de!la! expresión!de!la!molécula!de!adhesión!P9selectina!...............................................!20! 2. MATERIALES!......................................................................................................................................!21! 3. COMITÉ!ÉTICO!....................................................................................................................................!21! 4. ANÁLISIS!ESTADÍSTICO!.....................................................................................................................!21! IV. RESULTADOS*.............................................................................................................*22! 1. ESTUDIO!DEL!EFECTO!DE!CBV\TP!SOBRE!LA!INTERACCIÓN!PLAQUETA\ENDOTELIO!..........!22! ! ! 1.1!!!Interacción!plaqueta9endotelio!...................................................................................!22! ! ! 1.2!!!Determinación!del!tipo!celular!implicado!en!la!interacción! ! ! ! plaqueta9endotelio!inducida!por!CBV9TP!................................................................!23! 2. ANÁLISIS!DEL!EFECTO!DE!CBV\TP!SOBRE!LA!INTERACCIÓN!PLAQUETA\LEUCOCITO!..........!24! ! !! 2.1!Interacción!plaqueta9neutrófilo!..................................................................................!24! ! !! 2.2!Interacción!plaqueta9monocito!...................................................................................!25! ! !! 2.3!Interacción!plaqueta9linfocito!......................................................................................!25! 3. DETERMINACIÓN!DEL!EFECTO!DE!CBV\TP!SOBRE!LA!ACTIVACIÓN!PLAQUETARIA!..............!26! ! ! 3.1!!!Análisis!de!la!expresión!de!P9selectina!en!PRP!......................................................!26! V. DISCUSIÓN*..................................................................................................................*27! VI. CONCLUSIONES*..........................................................................................................*30! VII. BIBLIOGAFÍA*..............................................................................................................*31! * * * ! ! ÍNDICE*DE*TABLAS* * Tabla*1.*Combinaciones!de!tratamiento!para!determinar!el!tipo!celular!implicado!en!la! interacción!..............................................................................................................................................................!18! ! Tabla*2.*Reactivos,!anticuerpos!y!fármacos!antirretrovirales!........................................................!21* * ÍNDICE*DE*FIGURAS* * Figura*1.*Ciclo!biológico!del!VIH!.....................................................................................................................!2! ! Figura*2.*Ciclo!biológico!del!VIH!que!muestra!los!diferentes!sitios!de!acción!sobre!los!que! pueden!actuar!los!diferentes!fármacos!antirretrovirales!......................................................................!3! ! Figura*3.*Fármacos!ITIAN!.....................................................................................................................!5* * Figura*4.*Estructura!química!de!abacavir,!guanosina!y!carbovir\trifosfato!.................................!6! * Figura*5.*Representación!esquemática!del!metabolismo!de!abacavir!y!el!mecanismo!de! acción!de!carbovir\trifosfato!sobre!la!replicación!del!VIH!....................................................................!7! * Figura*6.*Etapas!de!la!adhesión!plaquetaria!sobre!el!endotelio!y!las!moléculas!de!adhesión! que!participan!en!cada!una!de!ellas!.............................................................................................................!10! * Figura*7.!Receptores,!moléculas!de!adhesión!y!mecanismos!moleculares!implicados!en!la! agregación!plaquetaria!......................................................................................................................................!12* * Figura*8.*Moléculas!de!adhesión!implicadas!en!la!interacción!plaqueta\leucocito!...............!13! * Figura*9.*Cordón!umbilical!humano!completo!cuya!vena!se!encuentra!llena!de!! colagenasa!...............................................................................................................................................................!15! * Figura*10.*Montaje!de!la!cámara!paralela!de!flujo!...............................................................................!17! * Figura*11.*Montaje!del!sistema!de!cámara!paralela!de!flujo!en!microscopio!...........................!18! * Figura*12.*Citómetro!de!flujo!FACS!Calibur!.............................................................................................!19! ! Figura*13.*Identificación!de!las!diferentes!subpoblaciones!leucocitarias!y!de!la!población! de!plaquetas!a!través!del!citómetro!de!flujo!............................................................................................!20! * Figura*14.*Efecto!de!abacavir!y!carbovir\trifosfato!sobre!la!adhesión!de!plaquetas!sobre! células!endoteliales!!..................................................................................................................!22! * Figura*15.*Determinación!del!tipo!celular!implicado!en!la!adhesión!de!plaquetas!al! endotelio!inducida!por!abacavir!o!carbovir\trifosfato!.........................................................................!23! * Figura*16.*Efecto!de!abacavir!y!carbovir\trifosfato!sobre!la!adhesión!de!plaquetas!! sobre!neutrófilos!..................................................................................................................................................!24! ! Figura*17.*Efecto!de!abacavir!y!carbovir\trifosfato!sobre!la!adhesión!de!plaquetas!! sobre!monocitos!...................................................................................................................................................!25! ! Figura*18.*Efecto!de!abacavir!y!carbovir\trifosfato!sobre!la!expresión!de!CD62P!! (P\selectina)!en!plaquetas!de!PRP!................................................................................................................!26! ! ! ABREVIATURAS* ! ABC:!Abacavir! ADH:!Alcohol!deshidrogenasa* ADK:!“Adenosine!kinase”! ADN:!Ácido!desoxirribonucleico! ADNc:!Ácido!desoxirribonucleico!complementario! ADP:!Adenosina!difosfato! AMP:!Adenosina!monofosfato! ARN:!Ácido!ribonucleico! ARNm:!Ácido!ribonucleico!mensajero! ATP:!Adenosina!trifosfato! AZT:!Zidovudina! cART:!Terapia!antirretroviral!combinada! CBV]TP:!Carbovir!trifosfato! CCR5:!“C\C!Chemokine!C\C!Ligand!5”! CD11b/CD18:!“Macrophage!1!Antigen”! CD4:!“cluster!of!cuadruple!differentiation”! CD41:!“Integrin!alpha!chain!2b”! CD62P:!P\selectina! Cmax:!Concentración!plásmatica!máxima! CXCR4:!“C\X\C!Chemokine!Receptor!Type\4”! ddI:!Didanosina! dNTP:!Desoxirribonucleótido!trifosfato! d4T:!Estavudina! E.E.M.:!Error!estándar!de!la!media* EBM]2:!“Endothelial!cell!basal!medium\2”! eNOS:!Óxido!nítrico!sintasa!endotelial! ERO:!Especies!reactivas!de!oxígeno! FDA:!“Food!and!Drug!Administration”! FITC:!Fluoresceína!isotiocianato! FTC:!Emtricitabina! GA:!“Gentamicine!sulfate!amphotericine!B”! gp41:!“Glycoprotein!41”! GPIbA:!“Glycoprotein!Ib!platelet!alpha!subunit”! GPIIb]IIIa:!“Glycoprotein!IIb\IIIa”! ! ! GUK1:!Guanilato!quinasa! HBSS:!“Hanks!Balanced!Salt!Solution”! hFGF]B:!“Human!fibroblast!growth!factor\basic”! HUVEC:!“Human!Umbilical!Vein!Endothelial!Cell”! ICAM]1:!“Intercellular!Cell!Adhesion!Molecule\1”! ICAM]2:!“Intercellular!Cell!Adhesion!Molecule\2”! IF:!Inhibidores!de!fusión! InInt:!Inhibidores!de!la!integrasa! IP:!Inhibidores!de!proteasa! ITIAN:!Inhibidores!de!la!transcriptasa!inversa!análogos!de!nucleós(t)ido! ITINAN:!Inhibidores!de!la!transcriptasa!inversa!no!análogos!de!nucleósido! JAM]3:!“Junctional!adhesion!molecule\3”! Mac]1:!“Macrophage!1!Antigen”! PAF:!“Platelet!Activating!factor”! PBS:!“Phosphate!buffered!saline”! PCK1:!Fosfoenolpiruvato!carboxilasa!1! PE:!Ficoeritrina! PGK1:!Fosfoglicerato!quinasa!1! PPP:!Plasma!pobre!en!plaquetas! PRP:!Plasma!rico!en!plaquetas! PSGL]1:!“P\selectin!glycoprotein!ligand\1”! R3]IGF]1:”Recombinant!long!R3!Insuline\like!growth!factor\1”! rhEGF:”Recombinant!human!epidermal!growth!factor”! SIDA:!Síndrome!de!la!inmunodeficiencia!adquirida! TDF:!Tenofovir! TNF]α:!“Tumor!Necrosis!Factor\!α”! UGT:!uridina!difosfato!glucuronosiltransferasa! VEGF:!“Vascular!endothelial!growth!factor”! VIH:!Virus!de!la!inmunodeficiencia!humana! 3TC:!Lamivudina ! ! 1! I. INTRODUCCIÓN* * 1. Infección*y*ciclo*biológico*del*VIH* ! El! Virus! de! la! Inmunodeficiencia! Humana! (VIH)! pertenece! a! la! familia! de! los! retrovirus!y!es!el!agente!causante!del!Síndrome!de!la!Inmunodeficiencia!Adquirida!(SIDA),! una!de!las!pandemias!virales!más!importantes!en!la!actualidad!(Freed,!2015).!Este!virus! infecta!a!los!linfocitos!T!CD4+,!debido!a!que!la!entrada!del!virus!a!las!células!está!mediada! por! la! unión! de! la! glicoproteína! Env! viral! a! CD4! y! al! co\rreceptor! CCR5! o!CXCR4,! dos! proteínas!de!superficie!de!la!célula!hospedadora!(Choe!et!al.,!1996;!Feng!et!al.,!1996).!! ! El!ciclo!biológico!del!VIH!consta!de!las!siguientes!fases!(Fig.!1)!(Laskey!&!Siliciano,!2014):! ! • Fijación:! es! la! primera! etapa! en! la! infección! de! las! células.! Se! basa! en! el! reconocimiento! y! acoplamiento! de! las! proteínas! de! la! envoltura! del! virión,! la! proteína!Env!con!sus!receptores!presentes!en!los!linfocitos!T!CD4+,!los!CD4.!Este! reconocimiento! se! produce! gracias! a! los! co\receptores! propios! de! las! células! susceptibles!de!ser!infectadas,!CCR5!y!CXCR4!que!interaccionan!con!las!proteínas! superficiales!del!virus.!Por!tanto,!únicamente!van!a!ser!sensibles!a!la!infección! aquellas! células! que! expresen!estos! receptores,! siendo! este! reconocimiento! imprescindible!para!que!el!virus!llegue!a!penetrar!en!la!célula!y!continúe!con!el! proceso!de!infección.! ! • Fusión:!la!envoltura!lipídica!del!virus!se!fusiona!con!la!membrana!plasmática!de! la!célula!y!se!libera!el!contenido!del!virión!en!el!interior!de!la!célula!hospedadora.! Se!eliminan!las!cubiertas!proteicas,!la!cápside!y!la!nucleocápside!que!protegen!el! ARN,!que!constituye!el!genoma!viral,!y!sus!proteínas!asociadas.!De!esta!forma,!el! ARN! viral! queda! libre! en! el! citoplasma! de! la! célula! estando! listo! para! ser! procesado.! ! • Transcripción* inversa* del* ARN* viral:! el! genoma! viral! se! transcribe! a! ADNc! (ADN! complementario)! monocatenario.! Finalmente,! dos! moléculas! de! ADNc! se! asocian!para!formar!una!molécula!de!ADN.! ! • Integración:!la!cadena!de!ADN!se!transporta!al!núcleo!de!la!célula!hospedadora!y! gracias!a!la!enzima!integrasa,!que!procede!del!virión,!se!integra!en!el!ADN!celular! donde! se! puede! replicar! de! forma! masiva,! de! forma! controlada! o! permanecer! latente.* * • Transcripción*del*ADN*vírico:!se!produce!por!los!mecanismos!normales!de!la! célula.! El! resultado! es! un! ARNm! (ARN! mensajero)! complejo! que! debe! ser! procesado!antes!de!que!la!información!que!contiene!pueda!servir!para!producir! las!proteínas!virales!correspondientes.!Una!vez!procesado,!el!ARNm!puede!salir! del!núcleo!hacia!el!citoplasma!a!través!de!los!poros!nucleares.* ! ! 8! Este! compuesto! emergió! como! el! más! activo! de! una! serie! de! nucleósidos! carbólicos,!caracterizado!por!tener!un!grupo!metileno!en!lugar!del!anillo!unido!a!un!grupo! alcohol,!natural!de!los!nucleósidos.!Esta!sustitución!le!hace!resistente!a!la!hidrólisis!del! enlace! glicosídico! conservando! su! potencial! como! inhibidor! de! la! transcriptasa! inversa! (Anderson!&!Chiang,!1990).! ! Carbovir\trifosfato! (CBV\TP)! es! un! sustrato! en! la! síntesis! de! ADN! de! la! transcriptasa!inversa!del!VIH!ya!sea!de!una!hebra!de!ARN!o!de!una!hebra!de!ADN!y!la! incorporación! de! carbovir! 5’! monofosfato! en! una! cadena! de!ADN! por! la! transcriptasa! inversa!del!VIH!resulta!en!la!terminación!de!la!síntesis!de!la!hebra!(Fig.!5C)!(Parker!et!al.,! 1991).!Una!característica!importante!de!CBV\TP!es!la!ausencia!de!actividad!frente!a!ADN! polimerasas!humanas!α,!β,!ϒ!(Parker!et!al.,!1991;!White!et!al.,!1989).! ! ! 3. Efectos*de*la*terapia*antirretroviral*en*el*sistema* cardiovascular* ! Aunque!la!esperanza!de!vida!de!las!personas!infectadas!con!VIH!ha!aumentado! desde!que!se!introdujo!la!cART,!la!supervivencia!aún!está!lejos!de!la!población!general! ("The! Antiretroviral! Therapy! Cohort! Collaboration",! 2008).! En! la! práctica,! los! prometedores!avances!que!se!esperaban!de!cART!han!sido!difíciles!de!conseguir!debido!a! los!efectos!adversos!de!los!fármacos!en!órganos!como!el!corazón!y!el!riñón!(Choi!et!al.,! 2011).! ! La! mortalidad! en! pacientes! con! VIH! no! asociada! a! SIDA! está! causada! principalmente! por! cáncer! (23,5%),! enfermedades! cardiovasculares! (15,7%)! y! enfermedades! hepáticas! (14,1%)! (Maartens! et! al.,! 2014).! Por! tanto,! la! enfermedad! cardiovascular!es!una!de!las!principales!causas!de!muerte!entre!los!pacientes!infectados! con!VIH!(Hooshyar!et!al.,!2007).!El!aumento!del!riesgo!de!enfermedad!cardiovascular!en! pacientes!con!VIH!ha!sido!comúnmente!atribuido!a!una!mayor!prevalencia!de!factores!de! riesgo! tradicionales! y! a! efectos! inflamatorios! del! propio! virus! (Grinspoon! et! al.,! 2008;! Triant,!2012).!Sin!embargo,!dado!que!la!administración!de!la!terapia!antirretroviral!es!de! por!vida!y!el!progresivo!aumento!de!la!esperanza!de!vida!de!la!población!infectada!con! VIH,!existe!un!creciente!interés!en!esclarecer!el!impacto!de!los!fármacos!empleados!en!el! tratamiento! de! la! infección! por! VIH! en! el! sistema! cardiovascular.! El!debate! principal! involucra! a! ABC,! análogo! de! guanosina,! perteneciente!a! la! familia! de! los! ITIAN,! ampliamente! empleado! en! la! terapia! antirretroviral.! En! 2005,! empezaron! a! aparecer! estudios!que! asociaban!el!uso! de! este!fármaco! con! una! mayor! incidencia! de! infarto! de! miocardio.!Sin!embargo,!fue!después!de!la!publicación!en!2008!por!“The!Data!collection! and! Adverse! events! of! anti\HIV! Drugs! study! group”!(D:A:D)! cuando! se! relacionó! directamente!la!exposición!a!ABC!con!un!aumento!en!la!incidencia!de!infarto!de!miocardio,! de!forma!que!el!riesgo!se!reconoció!y!se!amplió!incluyendo!la!ddI!(otro!ITIAN!análogo!de! purina! que! comparte! una! estrecha! semejanza! química! con! ABC)!como! otro! fármaco! causante.! Estudios! posteriores! confirmaron! esta! relación! (Friis\Moller! et! al.,! 2003;! Lundgren!et!al.,!2008;!Sabin!et!al.,!2016),!mientras!que!otros!no!lo!hicieron!(!Cutrell!et!al.,! 2008;!Brothers!et!al.,!2009;!Bedimo!et!al.,!2011;!Cruciani!et!al.,!2011;!Ribaudo!et!al.,!2011).! ! ! 9! Sin! embargo,! y! a! pesar! de! la! ausencia! de! un! consenso,! las! principales! guías! clínicas! actualmente! descartan!el! uso! de! ABC! cuando! hay! cualquier! posibilidad! de! enfermedad! cardiovascular!(Panel! de! expertos! de! GeSIDA! y! Plan! Nacional! sobre! el! Sida,! 2015).! El! debate! anteriormente! mencionado! ha! sido! fuertemente! impulsado! por! la! falta! de! un! mecanismo!de!acción!que!pueda!explicar!la!toxicidad!cardiovascular!que!produce!ABC.!! ! Se! ha! demostrado! también! que! ABC! produce! disminución! en! la! expresión! de! la! enzima!óxido!nítrico!sintasa!endotelial!(eNOS)!y!un!aumento!de!la!producción!de!especies! reactivas! de! oxígeno! (ERO)! en! células! endoteliales! pulmonares! humanas! (Wang! et! al.,! 2009).!Estas!situaciones!pueden!dar!lugar!a!disfunción!vascular!y!acumulación!linfocitaria.! El!aumento!de!ERO!inicia!y!amplifica!la!respuesta!inflamatoria!a!través!del!reclutamiento! de!leucocitos!y!del!aumento!de!la!expresión!de!P\selectina!y!de!β2!integrinas,!así!como!del! aumento! de! la! liberación! del! factor! activador! de! plaquetas! (PAF)! (Álvarez! et!al.,! 2002;! Álvarez!&!Sanz,!2001).! ! Nuestro! grupo! de! investigación! ha! demostrado! tanto! in! vitro!como! in! vivo!la! capacidad!de!ABC!para!provocar!la!acumulación!de!leucocitos!sobre!el!endotelio!venular!y! arterial,!acción!reproducida!por!ddI,!pero!no!por!los!ITIAN!análogos!de!pirimidína!(3TC,! AZT,!FTC)!o!por!TDF!(De!Pablo!et!al.,!2010,!De!Pablo!et!al.,!2012,!De!Pablo!et!al.,!2013).! Mediadores!purinérgicos!tales!como!ATP!y!algunos!de!sus!metabolitos!(ADP,!AMP,!etc.)! son! las! principales! moléculas! de! señalización! paracrina! capaces! de! desencadenar! mecanismos! vasculares! protrombóticos! y! proinflamatorios,! que! implican! el! tráfico! de! leucocitos,!la!activación!plaquetaria!y!la!formación!de!la!placa!aterosclerótica,!mediante!la! interacción! con! receptores! de! nucleótidos! P2\! situados! en! las! células! endoteliales,! leucocitos!y!plaquetas.!Dada!la!similitud!estructural!entre!ABC!y!purinas!endógenas,!se! sugirió!que!la!interferencia!con!las!vías!de!señalización!de!purinas!a!través!de!receptores! de! ATP\P2X7,! situados! principalmente! en! los! leucocitos,! podría! ser! responsable! de! los! efectos!vasculares!de!ABC!(Esplugues!et!al.,!2016).! ! Las! interacciones! leucocito\endotelio! son! el! primer! paso! en! la! inflamación! vascular,!aunque!las!plaquetas!son!necesarias!para!la!inducción!de!la!trombosis.!Por!lo! tanto,!las!plaquetas!pueden!ser!clave!en!el!mecanismo!por!el!cual!ABC!produce!toxicidad! vascular!y!aumenta!el!riesgo!de!padecer!una!enfermedad!cardiovascular.!! ! ! 4. Proceso*inflamatorio:*función*plaquetaria* ! La! formación! de! trombos! dependiente! de! plaquetas! es! un! evento! clave! en! la! patogénesis!del!infarto!de!miocardio.!Las! plaquetas! circulantes!no!interaccionan!con!la! superficie! intacta! de! los! vasos,! sin! embargo! éstas! se! adhieren! rápidamente! a! células! endoteliales! dañadas,! y! rápidamente! reclutan! nuevas! plaquetas,! produciéndose! la! agregación,! y! diferentes! tipos! leucocitarios.! De! esta! forma! se! inicia! el! proceso! de! obstrucción!trombótico!que!conduce!a!la!isquemia!e!infarto!de!miocardio!(Gawaz,!2004).! ! Además!de!su! papel!en!la!trombosis!las!plaquetas!tienen!un! papel!crítico!en!la! inflamación! (Klinger! &! Jelkmann,! 2002).! La! quimiotaxis! es! un! mecanismo! central! para! ! ! 10! reclutar! células! inflamatorias! a! los! sitios! de! daño! tisular! o! de! reparación.! Durante!la! adhesión! las! plaquetas! se! activan!y! liberan! en! el! citoplasma! una! variedad! de! factores! quimiotácticos!que!se!encuentran!almacenados!en!sus!gránulos!o!que!se!han!sintetizado! después!de!la!estimulación!de!las!plaquetas!(Rendu!&!Brohard\Bohn,!2001).!De!esta!forma! se!estimula!la!expresión!de!moléculas!de!adhesión!en!la!superficie!de!las!plaquetas,!que! son!capaces!de! atraer!a! otras!células!sanguíneas! en!circulación,!y!también!modular!las! propiedades!quimiotácticas!de!otras!células!incluyendo!leucocitos!(Weyrich!et!al.,!1996)!y! endotelio!(Gawaz!et!al.,!1998;!Henn!et!al.,!1998).!! ! * 4.1 Interacción*plaqueta]endotelio* ! El! endotelio! normal! en! reposo! tiene! una! superficie! no! adherente! y! no! trombogénica! que! previene! la! extravasación! de! las! células! sanguíneas! en! circulación.,! mientras! que! las! células! del! endotelio! activadas! son! pro\adhesivas! y! promueven! la! adhesión!de!las!plaquetas!circulantes.!La!adhesión!de!las!plaquetas!al!endotelio!intacto! pero! activado! implica! que! en! la! superficie!de! las! células! haya! unos! receptores! dependientes! del! proceso! que! permiten! capturar! las! plaquetas! en! circulación! hacia! la! pared! de! los! vasos! incluso! bajo! un! alto! estrés! debido! a! la! circulación! sanguínea.! La! adhesión! de! las! plaquetas! a! la! superficie! del! endotelio! vascular! es! un! proceso! con! diferentes!pasos,!en!los!que!las!plaquetas!se!sitúan!sobre!la!pared!vascular,!seguido!del! rodamiento!de!las!plaquetas!y!la!subsiguiente!adhesión!firme!al!endotelio!(Fig.!6)!(Gawaz,! 2004).!!! ! El!contacto!débil!inicial!entre!las!plaquetas!circulantes!y!el!endotelio!esta!mediado! por!selectinas,!presentes!tanto!en!las!células!endoteliales!como!en!las!plaquetas!(Johnson! et!al.,!1995).!P\selectina!(CD62P)!se!expresa!rápidamente!en!la!superficie!endotelial!en! respuesta! a! un! estímulo! inflamatorio! por! translocación! desde! las! membranas! de! los! gránulos! de! almacenaje! (cuerpos! Weibel\Palade)! a! la! membrana! plasmática.! Además,!!!!!!! P\selectina! se! almacena! en! los! gránulos\α! de! las! plaquetas! y! puede! rápidamente! translocarse!a!la!superficie!de!las!plaquetas!bajo!activación!de!las!mismas!(Gawaz,!2004).! Figura'6.!Etapas!de!la!adhesión!plaquetaria!sobre!el!endotelio!y!moléculas!de!adhesión!que!participan! en!cada!una!de!ellas.! ! ! 11! La!glicoproteína!que!se!asocia!con!P\selectina,!PSGL\1!(“P\selectin!glycoprotein!ligan\1”),! está! presente! tanto! en! células! endoteliales! como! en! plaquetas! y! leucocitos,! por! lo! que! media! las! interacciones! plaqueta\endotelio,! plaqueta\leucocito! y! también!leucocito\ endotelio!in!vitro!e!in!vivo!(Frenette!et!al.,!2000,!Wagner!&!Frenette,!2008).! ! Las!interacciones!selectina\ligando!no!son!suficientes!para!promover!la!adhesión! firme!de!las!plaquetas!en!el!torrente!sanguíneo.!Esto!implica!que!durante!el!rodamiento,! se!tienen!que!formar!nuevas!uniones!que!se!caractericen!por!tener!tasas!de!disociación! bajas!para!promover!la!adhesión!irreversible.!Estas!interacciones!más!estrechas!entre!las! plaquetas!y!la!pared!vascular!implican!la!interacción!con!las!integrinas!del!endotelio,!como! ICAM\1!(“Intercellular!Cell!Adhesion!Molecule\1”)!(Gawaz,!2004).! ! ! 4.2 Interacción*plaqueta]plaqueta:*agregación* ! La! agregación! implica! la! adhesión! plaqueta\plaqueta.! Tras! la! adhesión,! las! plaquetas! se! activan! por! una! serie! de! agonistas! como! ADP,! colágeno,! tromboxano,! trombina!y!epinefrina!presentes!en!los!sitios!de!daño!vascular.!! ! La! acción! de! esos! agonistas,! mediada! por! sus! respectivos! receptores! con! la! consecuente! activación! de! sus! mecanismos! moleculares! específicos! termina! desencadenando,!si!el!estímulo!es!importante!y/o!múltiple,!un!único!conjunto!de!sucesos;! incremento!de!calcio!intracelular,!liberación!del!contenido!de!los!gránulos!y!el!cambio!de! forma!de!las!plaquetas,!en!resumen!la!agregación!plaquetaria! ! La!molécula! de! adhesión! principal! implicada! en! la! agregación! plaquetaria! es! la! proteína!de!membrana!denominada! complejo!glicoproteína!IIb\IIIa! (GPIIb\IIIa)!(Fig.! 7).! GPIIb\IIIa!es!un!receptor!de!integrina!presente!en!alta!densidad!en!las!plaquetas,!tanto!en! la!membrana!plasmática!como!en!los!gránulos\α!(Niiya!et!al.,!1987).!El!fibrinógeno!actúa! como!un!puente!de!unión!entre!dos!moléculas!de!GPIIb\IIIa!en!las!plaquetas!adyacentes! (Varga\Szabo!et!al.,!2008).!Esta!es!la!vía!final!común!de!la!agregación!plaquetaria!inducida! por!agonistas!químicos!de!plaquetas.! ! El! ADP! es! un! mediador! plaquetario! que! bien! de! forma! externa! a! la! plaqueta! o! interna! como! parte! del! contenido! de! los! gánulos! densos! tiene! un! papael! clave! en! la! activación!plaquetaria!y!consecuente!agregación.!Se!conocen!dos!receptores!para!el!ADP! en!la!plaqueta,!uno!acoplado!a!la!proteína!Gq!(P2Y1)!y!otro!acoplado!a!Gi!(P2Y12),!que!es! esencial!para!la!hemostasia!primaria!(Kahner!et!al.,!2006).!Ambos!receptores!actúan!de! modo!sinérgico!en!la!activación!de!las!plaquetas!(Fig.!7).!! ! ! ! ! ! ! ! ! ! 12! ! ! 4.3** Interacción*plaqueta]leucocito* ! La! adhesión! de! las! plaquetas! al! endotelio! o! a! la! matriz! subendotelial!induce! la! activación!plaquetaria!y!la!liberación!de!sustancias!que!son!capaces!de!causar!quimiotaxis! y! migración! de! leucocitos! en! circulación! hacia! el! lugar! donde! se! ha! producido! la! acumulación!plaquetaria!(Springer,!1994).!! ! La!adhesión!de!los!leucocitos!a!las!plaquetas!implica!la!expresión!en!la!superficie! de!P\selectina!en!las!plaquetas!activadas!y!su!unión!a!PSGL\1,!presente!en!neutrófilos!y! monocitos! (Gardiner! et! al.,! 2001).! Se! ha! demostrado! que!la! unión! de! los! leucocitos,! y! posteriormente! la! adhesión! de! los! leucocitos! sobre! monocapas! de! plaquetas! activadas! (Fig.!7)!se!produce!a!través!de!la!acción!secuencial!de!P\selectina!e!ICAM\2!(“Intercellular! Cell!Adhesion!Molecule\2”)!!de!las!plaquetas!por!la!unión!a!sus!ligandos!en!los!leucocitos,! PSGL\1!y!“Macrophage!1!Antigen”!(Mac\1,!CD11b/CD18)!respectivamente!(Diacovo!et!al.,! 1996).! Esto! sugiere! que! las! plaquetas! ancladas! a! la! pared! de! los! vasos! pueden! estar! promoviendo!el!reclutamiento!de!los!leucocitos.!Además,!la!interacción!plaqueta\leucocito! dependiente!de!P\selectina/PSGL\1!lleva!a!las!plaquetas!a!estar!en!contacto!estrecho!con! los! neutrófilos! y! puede! estar! facilitando! su! activación! por! los! mediadores! pro\ inflamatorios!liberados!de!las!plaquetas!(Gawaz,!2004).! ! ! ! ! Figura' 7.!Receptores,! moléculas! de!adhesión!y! mecanismos! moleculares! implicados! en! la! agregación! plaquetaria.!(Adapatado(de(PLATELETS(|(PLATELETS.SE,(2016).! ! ! 13! Por!lo!tanto,!las!plaquetas!ya!sea!inmovilizadas!en!una!superficie!o!activadas!en! suspensión!expresan!una!maquinaria!completa!para!reclutar!leucocitos!(Gawaz,!2004):! ! a) P\selectina!de!plaquetas!es!un!mediador!del!contacto!inicial!(débil)! b) La! interacción! de! P\selectina!de! plaquetas! con! su! ligando! PSGL\1! en! los! leucocitos!induce!eventos!relevantes!para!la!activación!de!Mac\1.! c) Mac\1!activado!en!los!leucocitos!permite!la!señalización!y!refuerza!la!adhesión! firme! plaqueta\leucocito! mediante! la! unión! de! los! ligandos! (ICAM\2,! fibrinógeno!unido!a!GPIIb\IIIa,!glicoproteína!IbA!(GPIbA),!JAM\3)!presentes!en! la!superficie!de!las!plaquetas!(Fig.!8).! ! ! ! ! ! ! Figura'8.!Moléculas!de!adhesión!en!la!interacción!plaqueta\leucocito.!( ! ! ! 14! II. OBJETIVOS* ! Nuestro!grupo!de!investigación!ha!caracterizado!los!efectos!de!ABC!sobre!la!función! plaquetaria,! es! decir,! la! acción! del! fármaco! en! las! diferentes! fases! de! la! formación! del! trombo! que! dependen! de! plaquetas.! Así,! se! ha! observado! que! el! tratamiento! con! ABC!!!!!!!! (5! μg/mL)! induce! la! interacción! plaqueta\endotelio! y! que! el! tipo! celular! sobre! el! que! actuaría!ABC!son!las!células!endoteliales.!También!se!ha!observado!que!ABC!produce!la! interacción! de! plaquetas! a! neutrófilos! y! a! monocitos.! Sin! embargo,! ABC! no! induce! activación!plaquetaria!(no!produce!aumento!de!la!expresión!de!P\selectina).! !Una!posibilidad!es!que!estos!efectos!sean!debidos!a!la!acción!del!metabolito!activo! de! ABC,! CBV\TP.! Por! tanto,! el! objetivo! general! del! presente! trabajo! es! caracterizar! los! efectos!de!CBV\TP!sobre!las!diferentes!fases!de!la!función!plaquetaria!con!la!finalidad!de! dilucidar!si!los!efectos!que!se!ha!observado!que!provoca!ABC!sobre!la!función!plaquetaria! podrían!ser!debidos!a!CBV\TP,!lo!que!ayudaría!a!explicar!el!mecanismo!por!el!cual!ABC! puede!producir!toxicidad!vascular.! En!particular,!se!abordan!los!siguientes!objetivos!específicos:! 1. Evaluar!los!efectos!de!CBV\TP!sobre!la!interacción!plaqueta\endotelio!in!vitro,!así! como!el!tipo!celular!implicado!en!dicho!proceso.!! ! 2. Estudiar!las!acciones!de!CBV\TP!sobre!la!interacción!plaqueta\leucocito!in!vitro.!! ! 3. Analizar!los!efectos!de!CBV\TP!sobre!la!activación!plaquetaria!in!vitro.!En!concreto,! sobre!la!expresión!de!P\selectina!(CD62P)!en!plaquetas.! ! ! ! ! ! ! ! ! ! ! ! ! 15! III. MATERIALES*Y*MÉTODOS* ! 1. Métodos* 1.1 Aislamiento*y*cultivo*de*células*endoteliales** ! Se!emplean!células!de!venas!de!cordón!umbilical!humano!(HUVEC).!!Las!HUVEC!se! extraen! de! venas! de! cordones! umbilicales! humanos! frescos! procedentes! de! donantes! sanos!del!Hospital!Clínico!Universitario!de!Valencia.! ! !Para!la!extracción!de!estas!células!se!trabaja!con!el!cordón!umbilical!completo!(Fig.! 9)!y!se!obtienen!por!tratamiento!con!colagenasa,!como!se!ha!descrito!previamente!(Orden! et!al.,!2013).!Se!lavan!los!vasos!para!eliminar!los!restos!de!sangre!mediante!una!solución! caliente!de!tampón!de!fosfato!salino!(PBS).!Se!introduce!en!la!vena!del!cordón!colagenasa! (1! mg/mL)! y! se! mantiene! en! el! incubador! a! 37ºC! durante! 17! minutos.! Una! vez! ha! transcurrido!este!período!de!tiempo,!los!cordones!se!masajean!suavemente!para!separar! las!células!endoteliales!de!la!pared!del!vaso!y!el!contenido!se!recoge!y!se!centrifuga.!El! precipitado! obtenido! se! resuspende! en! “Endotelial!Cell! Basal! Medium\2”! (EBM\2)! [suplementado! con! Suero! Fetal! Bovino! (2%! v/v),! Hidrocortisona! (0,4%! v/v),! “Human! Fibroblast!Growth!Factor\Basic”!(hFGF\B,!0,4%!v/v),!“Vascular!Endotelial!Growth!Factor”! (VEGF,!0,1%!v/v),!“Recombinant!Long!R3!Insulin\Like!Growth!Factor\1”!(R3\IGF\1,!0,1%! v/v),! Ácido! ascórbico! (0,1%! v/v),! “Human! Recombinant! Epidermal! Growth! Factor”! (rhEGF,!0,1%!v/v),!“Gentamicine!Sulfate!Amphotericine!B”!(GA\1000,!0,1%!v/v),!Heparina! (0,1%! v/v),! Penicilina! (50! unidades/mL),! Estreptomicina! (50! μg/mL)! y! Fungizona!!!!!!!!!!!! (2,5!μg/mL)]!y!se!deposita!en!un!frasco!de!cultivo!celular!T25!donde!las!HUVEC!se!cultivan! hasta!alcanzar!el!100%!de!confluencia.! Los!cultivos!primarios!se!despegan!con!tripsina!y!se!transfieren!a!placas!de!cultivo! de!6!pocillos!con!cubre\objetos!de!cristal!de!25!mm!con!un!revestimiento!de!fibronectina! (5!μg/mL)!donde!se!cultivan!hasta!alcanzar!el!100%!de!confluencia!(~48!horas)!para!los! experimentos!de!adhesión!in!vitro!en!cámara!paralela!de!flujo!(Ver!1.4!Ensayo!de!adhesión! en!cámara!paralela!de!flujo).! ! Las! células! se! mantienen! en! el! incubador! de! cultivo! celular! a! 37ºC,! en! una! atmósfera!húmeda!de!95%!aire/!5%!CO2.! Figura'9.!Cordón!umbilical!humano!completo!cuya!vena!se!encuentra!llena!de!colagenasa. ! ! 16! 1.2**Extracción*de*plasma*rico*en*plaquetas*(PRP)*y* preparación*de*plaquetas*lavadas*humanas* ! Se!emplea!sangre!de!donantes!sanos!procedente!del!Hospital!Clínico!Universitario! de! Valencia! que! no! han! tomado! ningún! fármaco! conocido! que! afecte! a! la! función! plaquetaria!en!los!14!días!anteriores!a!la!donación.!!! ! El!plasma!rico!en!plaquetas!(PRP)!y!las!plaquetas!lavadas!se!preparan!a!partir!de!la! sangre!entera!recogida!en!tubos!con!citrato!de!sodio!como!anticoagulante,!mediante!un! método!de!extracción!con!prostaciclina!(Radomski!&!Moncada,!1983).!! Estos! tubos! se! centrifugan! a! 220! g! durante! 10! minutos! (con! aceleración! y! desaceleración!suave)!para!obtener!el!PRP.!Para!obtener!las!plaquetas!lavadas,!el!PRP!se! centrifuga!a!700!g!durante!10!min!y!el!plasma!pobre!en!plaquetas!(PPP)!se!elimina.!El! precipitado! de! plaquetas,! después! de! lavar! 2! veces! con! tampón! salino,! se! resuspende! suavemente! con! tampón! salino! hasta! alcanzar! una! concentración! final! de!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!! 1x107!plaquetas/mL.! ! Todos!los!pasos!de!la!extracción!se!llevan!acabo!en!presencia!de!prostaciclina!para! evitar!la!activación!mecánica!de!las!plaquetas.! ! ! 1.3**Protocolo*experimental*de*tratamiento* ! En!pacientes!adultos!la!pauta!posológica!de!ABC!es!de!300!mg/12h!o!600!mg/24h,! originándose!una!concentración!plásmatica!máxima!(Cmax)!de!4,85!μg/mL.!Debido!a!esto! se!seleccionó!una!concentración!de!ABC!de!5!μg/mL!y!concentraciones!de!CBV\TP!entre!!!! 1!–!25!μg/mL,!valores!que!mimetizan!las!concentraciones!de!ABC!y!CBV\TP!en!pacientes! que!reciben!este!tratamiento!(Piliero,!2004;!Yuen!et!al.,!2008).!Teniendo!en!cuenta!que!la! conversión!de!ABC!a!CBV\TP!es!inferior!al!100%!la!concentración!comparable!con!ABC!!!!!! 5!μg/mL!sería!CBV\TP!10!μg/mL.! Se!tratan!los!diferentes!tipos!celulares!(HUVEC,!leucocitos!y/o!plaquetas)!de!forma! independiente! con! ABC! (5! μg/mL),! con! concentraciones! crecientes! de! CBV\TP! (1! –! 25! μg/mL),!o!con!el!vehículo!control!(agua!estéril)!durante!4!h!(HUVEC)!y!1!h!(plaquetas!y! leucocitos),!a!37ºC.!Como!control!positivo!se!empleó!TNF\α!(25!ng/mL,!4h)!para!células! endoteliales!y!ADP!(5!μmol/L,!1h)!para!plaquetas!y!leucocitos.!En!el!caso!de!los!leucocitos! se!trata!la!sangre!entera!y!en!el!caso!de!las!plaquetas!se!trata!el!PRP!o!la!sangre!entera.! ! ! ! ! ! 17! 1.4** Ensayo*de*adhesión*en*cámara*paralela*de*flujo* ! Se! emplean! células! HUVEC! sembradas! en! cubre\objetos! de! cristal! circulares! de!!!! 25!mm!de!diámetro!pretratados!con!fibronectina!(5!μg/mL)!y!plaquetas!lavadas!extraídas! de!sangre!de!donantes!sanos.! ! El! modelo! in! vitro!de! cámara! paralela! de! flujo! ya! ha! sido! descrito! en! detalle! (Lagadec! et! al.,! 2003;! Orden! et! al.,! 2013).! Los! cubre\objetos! de! vidrio! que! contienen! monocapas!confluentes!de!HUVEC!se!colocan!en!un!hueco!circular!en!la!placa!inferior!de!la! cámara! de! flujo! (mantenido! a! 37ºC)! donde! una! parte! de! la! monocapa! (5! x! 25! mm)! se! expone! al! flujo! (Fig.! 10).! La! cámara! entera! se! monta! sobre! un! microscopio! invertido! (Nikon!Eclipse!TE!2000\S)!equipado!con!un!sistema!de!Epi\Fluorescencia!y!conectado!a! una! cámara! de! vídeo! (Sony! Exware! HAD)! (Fig.! 11).! Los! experimentos! se! llevan!a! cabo! empleando!el!objetivo!x40,!pudiéndose!así!observar!el!flujo!de!plaquetas!y!su!interacción! con!la!monocapa!endotelial.! ! Para!la!visualización!directa!de!las!interacciones!de!las!plaquetas!con!las!células! endoteliales,! las! plaquetas! lavadas! se! incuban! durante! 30! minutos! a! 37ºC! con! un! anticuerpo! anti\CD41! (que! marca! específicamente! las! plaquetas)! conjugado! con! Alexa®488! siguiendo! las! instrucciones! del! fabricante! y! se! resuspenden! para! conseguir! una!concentración!final!de!2,5!x!106!plaquetas/mL.!Las!plaquetas!lavadas!se!perfunden! sobre! la! monocapa! de! HUVEC! a! una!velocidad! controlada! de! 0,36! mL/min! (con! una! tensión!de!cizalla!estimada!de!0,7!dinas/cm2).!Una!ventana!de!cristal!en!la!placa!superior! de!la!cámara!permite!el!examen!microscópico!directo!de!la!monocapa!expuesta!al!flujo.! Pasados! 5! minutos! de! perfusión! de! plaquetas,! los!cubre\objetos! se! lavan! con! 4! mL!de! tampón! de! solución! salina! para! eliminar! las! plaquetas! no! adheridas! de! la! cámara.! Se! registran!las!imágenes!de!al!menos!5!campos!independientes!por!experimento,!en!campo! claro! y! en! fluorescencia!y! se! analizan! mediante! el! recuento! del! número! de! plaquetas! unidas!a!la!superficie!del!endotelio.!! ! ! ! ! ! A B Figura' 10.! Montaje!de!la!cámara!paralela!de!flujo,!A:!cámara!abierta,!B:!cámara!cerrada.!La!cámara! posee!una!hendidura!circular!en!la!que!se!inserta!el!cubre\objetos!circular!con!las!células!endoteliales.! Las!conexiones!permiten!que!se!perfundan!las!plaquetas!a!través!de!la!cámara!de!flujo. ! ! 24! 2. Análisis*del*efecto*de*CBV]TP*sobre*la*interacción*plaqueta] leucocito* * Se!evaluó!el!efecto!de!CBV\TP!sobre!la!interacción!plaqueta\leucocito,!como!uno!de! los! pasos! implicados! en! el! desarrollo! de! enfermedades! cardiovasculares.! Se! empleó! la! citometría!de!flujo!para!evaluar!la!adhesión!de!plaquetas!a!leucocitos!en!sangre!entera!de! donantes!sanos!y!se!identificaron!las!diferentes!subpoblaciones!de!leucocitos!(neutrófilo,! monocitos! y! linfocitos)! gracias!a! sus! características! diferenciales! en!tamaño! y! granulosidad.! La! presencia! de! plaquetas! en! cada! subpoblación! celular! se! determinó! analizando!la!expresión!de!CD41!(marcador!específico!de!plaquetas)!en!cada!una!de!ellas.! * 2.1*Interacción*plaqueta]neutrófilo* ! ABC! (5! μg/mL)! produjo! un! aumento! significativo! en! la! cantidad! de! plaquetas! adheridas!a!neutrófilos.!Del!mismo!modo!se!observó!esta!respuesta!con!concentraciones! crecientes!de!CBV\TP!(1!–!25!μg/mL)!(Fig.!16).* * * * * * * * * * * * * * * * * Figura' 16.!Efecto! de! abacavir! y! carbovir! trifosfato!sobre! la! adhesión! de! plaquetas! sobre! neutrófilos.! La! sangre! humana! fue! tratada! con! vehículo,! abacavir!(5! μg/mL),! carbovir\ trifosfato! (1! \! 25! μg/mL)! o! el! control! positivo! (ADP! 5! μmol/L)! (1! h).! Los! valores! de! fluorescencia! (PE)! representan! el! %! de! la! mediana! de! la! intensidad! de! la! fluorescencia! respecto! del! 100%! del! grupo! control! (vehículo).! Los! resultados! fueron! expresados! como! media!±!E.E.M.!(n!=!10).!*p<0,05,!**p<0,01,!***p<0,001!respecto!del!valor!correspondiente! al!grupo!control.!Análisis!de!varianza!ANOVA!seguido!del!post\test!Newman\Keuls.!! ! ! 25! 2.2*Interacción*plaqueta]monocito* * ABC! (5! μg/mL)! produjo! un! incremento! significativo! del! número! de! plaquetas! adheridas!a!monocitos.!Esta!respuesta!también!se!observó!con!concentraciones!crecientes! de!CBV\TP!(1!–!25!μg/mL)!(Fig.!17).* * * 2.3*Interacción*plaqueta]linfocito* * Tanto! el! tratamiento! con! ABC! (5! μg/mL)! como! el! tratamiento! con! CBV\TP!!!!!!!!!!!!!!! (1! \! 25! μg/mL)! no! estimularon! la! adhesión! de! plaquetas! a! linfocitos,! ya! que! no! se! observaron!incrementos!significativos!respecto!al!control!(datos!no!mostrados).* * * * * * * Figura'17.!Efecto! de! abacavir! y! carbovir! trifosfato!sobre! la! adhesión! de! plaquetas! sobre! monocitos.! La! sangre! humana! fue! tratada! con! vehículo,! abacavir! (5! μg/mL),! carbovir\ trifosfato! (1! \! 25! μg/mL)! o! el! control! positivo! (ADP! 5! μmol/L)! (1! h).! Los! valores! de! fluorescencia! (PE)! representan! el! %! de! la! mediana! de! la! intensidad! de! la! fluorescencia! respecto! del! 100%! del! grupo! control! (vehículo).! Los! resultados! fueron! expresados! como! media!±!E.E.M.!(n!=!10).!*p<0,05,!**p<0,01,!***p<0,001!respecto!del!valor!correspondiente! al!grupo!control.!Análisis!de!varianza!ANOVA!seguido!del!post\test!Newman\Keuls.!! ! ! 26! 3. Determinación*del*efecto*de*CBV]TP*sobre*la*activación* plaquetaria* ! El! efecto! de! CBV\TP! sobre! la! activación! plaquetaria! se! evaluó! analizando! la! expresión!de!la!molécula!de!adhesión!P\selectina!en!PRP!extraído!de!sangre!de!donantes! sanos.!Mediante!la!citometría!de!flujo!se!identificó!la!población!de!plaquetas!gracias!a!sus! características!de!tamaño!y!granulosidad!y!empleando!el!anticuerpo!CD62P!se!analizó!la! expresión!de!P\selectina.! ! 3.1***Análisis*de*la*expresión*de*P]selectina*en*PRP* ! ! Se!puede!observar!que!el!tratamiento!de!PRP!con!ABC!(5!μg/mL)!o!con!CBV\TP!!!! (1!\!25!μg/mL)!no!indujo!la!expresión!de!P\selectina!(CD62P)!en!plaquetas!(Fig.!18),!es! decir,!no!se!observaron!aumentos!significativos!respecto!al!control.! ! ! ! ! ! ! ! ! * * * * * * * ! ! ! ! ! ! ! ! Figura'18.!Efecto!de!abacavir!y!carbovir=trifosfato!sobre!la!expresión!de!CD62P!(P=selectina)! en!plaquetas!de!PRP.!El!PRP!fue!tratado!con!vehículo,!abacavir!(5!μg/mL),!carbovir\trifosfato! (1!\!25!μg/mL)!o!el!control!positivo!(ADP!5!μmol/L)!(1!h).!Los!valores!de!fluorescencia!(FITC)! representan!el!%!de!la!mediana!de!la!intensidad!de!la!fluorescencia!respecto!del!100%!del! grupo!control!(vehículo).! Los! resultados! fueron! expresados!como! media!±! E.E.M.! (n! =!10).! ***p<0,001!respecto!del!valor!correspondiente!al!grupo!control.!Análisis!de!varianza!ANOVA! seguido!del!post\test!Newman\Keuls.!! ! ! 27! V. DISCUSIÓN* ! La!terapia!antirretroviral!se! desarrolló!en! 1980!y! permitió!que! la!esperanza! de! vida!de!las!personas!infectadas!con!VIH!y!con!SIDA!incrementara!considerablemente.!Sin! embargo,! actualmente! esta! cobrando! especial! importancia! el! estudio! de! los! efectos! adversos! asociados! al! uso! de! esta! terapia.! Los! diferentes! tipos! de! fármacos! antirretrovirales!se!han!asociado!con!diversos!efectos!adversos.!Entre!los!efectos!que!se! pueden! desarrollar! a! corto! plazo! aparecen! alteraciones! cutáneas,! hipersensibilidad,! trastornos! gastrointestinales! y! neurosiquiátricos! (Reust,! 2011).! A! largo! plazo,! los! pacientes!pueden!sufrir!alteraciones!metabólicas,!anomalías!en!la!distribución!de!la!grasa! corporal! y! lipidodistrofia,! daño! mitocondrial,! nefrotoxicidad! e! insuficiencia! renal,! osteopenia,!osteoporosis,!necrosis!ósea!(Montessori!et!al.,!2004;!Reust,!2011)!y!también! infarto!de!miocardio!(Friis\Moller!et!al.,!2003;!Sabin!et!al.,!2016;!Sabin!et!al.,!2008).!! ! Entre! las! causas! de! mortalidad! en! pacientes! infectados! con! VIH! no! asociados! a! SIDA! se! encuentra! el! cáncer! (23,5%),! las! enfermedades! cardiovasculares! (15,7%)! y! las! enfermedades! hepáticas! (14,1%)! (Maartens! et! al.,! 2014).! Las! enfermedades! cardiovasculares! se! han! asociado! al! uso! prolongado! de! la! terapia! antirretroviral.! Sin! embargo,!no!se!conoce!si!esto!se!debe!al!aumento!de!la!esperanza!de!vida!de!los!pacientes,! a!la! infección! del! VIH,!por! si!misma,! ya! que! se!han! aportado!diversos!argumentos! que! indican!que!el!VIH!incrementa! el!riesgo!cardiovascular!(Aberg,!2009;! Triant,!2012)!o!a! posibles! efectos! adversos! de! esta! terapia! antirretroviral! (Friis\Moller! et! al.,! 2003).! Diversos! estudios! han! asociado! la! terapia! antirretroviral! con! la! enfermedad! cardiovascular.!Inicialmente!se!apuntaba!a!los!IP!ya!que!aumentan!los!niveles!de!lípidos,! pero!el!resto!de!grupos!no!se!descartaron!ya!que!se!administran!en!combinación.! ! ABC!es!uno!de!los!fármacos!más!empleados!en!la!terapia!antirretroviral.!Existen! evidencias! crecientes! que! correlacionan! el! uso! de! los! ITIAN! análogos! de! purina,! y! más! concretamente!ABC!y!ddI,!con!la!aparición!de!efectos!cardiovasculares!(Friis\Moller!et!al.,! 2003;!Sabin!et!al.,!2016).!Sin!embargo,!ha!habido!mucha!controversia!con!respecto!a!la! asociación!o!no!de!ABC!con!enfermedades!cardiovasculares,!debido!entre!otras!cosas!a! que!a!día!de!hoy!no!hay!ninguna!evidencia!clara!sobre!cual!podría!ser!el!mecanismo!por!el! que!produce!esta!toxicidad!cardiovascular.! ! Algunos!estudios!clínicos!indican!que!el!mecanismo!podría!deberse!a!un!proceso! de!inflamación!vascular!(Sabin!et!al.,!2008).! En! nuestro! laboratorio! hemos! analizado!el! efecto!de!ABC! sobre!la!interacción!leucocito\endotelio,!primer!paso! en! el!desarrollo!de! enfermedades!cardiovasculares!que!cursan!con!componente!inflamatorio.!Así,!ABC!indujo! un!aumento!significativo!en!las!interacciones!leucocito\endotelio!tanto!in!vitro!como! in! vivo!(De!Pablo!et!al.,!2013).! ! Sin! embargo,! la! plaqueta! es! necesaria! para! que! este! proceso! inflamatorio! desemboque!en!la!formación!de!un!trombo.!Las!plaquetas!se!activan!y!en!consecuencia! pueden! formar! agregados! plaquetarios! y! trombos! que! pueden! llevar! a! ocluir! la! arteria! coronaria!resultando!en!isquemia!e!infarto!de!miocardio!(Davì!&!Patrono,!2007;!Hansson,! 2005).!En!este!sentido,!en!estudios!previos!se!ha!observado!que!el!tratamiento!con!ABC! ! ! 28! induce! la! interacción! plaqueta\endotelio,! interacción! plaqueta\neutrófilo! e! interacción! plaqueta\monocito,! sin! causar! activación! plaquetaria! (aumento! de! P\selectina).! El! mecanismo!por!el!cual!ABC!posee!estos!efectos!no!se!conoce.!Una!posibilidad!sería!que!el! responsable!fuera!CBV\TP!ya!que!tiene!gran!analogía!estructural!con!ATP!y!ADP.! ! ABC! se! metaboliza! en! el! organismo! para! dar! lugar! a! su! metabolito! farmacológicamente! activo,! CBV\TP! que! interfiere! en! el! ciclo! del! virus! actuando! como! sustrato! en! la! síntesis! del! ADN! viral! mediante! la! transcriptasa! inversa! de! forma! que! provoca!la!terminación!de!la!síntesis!de!la!hebra!de!ADN!(Barbarino!et!al.,!2014;!Parker!et! al.,!1991).! ! Por! tanto,! el! objetivo! de! este! trabajo! consiste! en! caracterizar! los! efectos! y! los! mecanismos!pro\inflamatorios!de!CBV\TP!sobre!la!función!plaquetaria.!Es!decir,!estudiar! el!efecto!de!este!fármaco!en!la!interacción!plaqueta\endotelio,!en!la!interacción!plaqueta\ leucocito!y!sobre!la!expresión!de!P\selectina,!empleada!como!marcador!de!la!activación! plaquetaria.! ! En!pacientes!adultos!la!pauta!posológica!de!ABC!es!de!300!mg/12h!o!600!mg/24h,! originándose!una!concentración!plasmática!máxima!(Cmax)!de!4,85!μg/mL.!Teniendo!en! cuenta! las! concentraciones! plasmáticas! de! ABC! anteriormente! citadas! obtenidas! en! pacientes!seleccionamos!la!concentración!de!ABC!5!μg/mL!y!concentraciones!de!CBV\TP! entre! 1! \! 25! μg/mL,! valores! que! mimetizan! las! concentraciones! de! ABC! y! CBV\TP! alcanzadas!en!pacientes!que!reciben!este!tratamiento!(Yuen!et!al.,!2008).! ! En!primer!lugar,!para!evaluar!la!interacción!plaqueta\endotelio!hemos!empleado! un!modelo!in!vitro!de!adhesión!dinámica,!mediante!un!sistema!de!cámara!paralela!de!flujo! en! el! que! las! plaquetas! fluyen! sobre! la! monocapa! endotelial! con! un! flujo! similar! al! observado! in! vivo.! Así,! concentraciones! clínicas! de! CBV\TP! (5! \! 25! μg/mL)! inducen! adhesión! de! plaquetas! al! endotelio,! mientras! que! CBV\TP! 1! μg/mL! no! induce! esta! adhesión.! Tanto! ABC! como! CBV\TP!son! capaces! de! inducir! la! adhesión! de! plaquetas! al! endotelio!y!con!ello!podrían!promover!el!inicio!de!la!formación!del!trombo.! ! Una! vez! establecido! que! CBV\TP! induce! interacción! plaqueta\endotelio! se! determinó!el!tipo!celular!implicado!en!la!adhesión!de!plaquetas!al!endotelio!inducida!por! ABC!y!CBV\TP.!En!el!caso!de!ABC,!únicamente!hay!efecto!cuando!se!tratan!los!dos!tipos! celulares!o!cuando!se!tratan!sólo!las!células!endoteliales.!En!el!caso!de!CBV\TP,!el!efecto!se! observó!en!todos!los!casos,!cuando!se!trataron!los!dos!tipos!celulares,!sólo!las!plaquetas!o! sólo!las!células!endoteliales.! ! Por! otro! lado,! se! ha! evaluado! la! interacción! plaqueta\leucocito,! mediante! citometría!de!flujo,!de!forma!que!empleando!un!anticuerpo!que!reconoce!específicamente! plaquetas! (CD41)! se! ha! analizado! su! expresión! en! las! poblaciones! de! leucocitos,! concretamente! en! neutrófilos,! monocitos!y! linfocitos.! Se! ha! observado! que! concentraciones!clínicamente!relevantes!de!CBV\TP!estimulan!la!adhesión!de!plaquetas! tanto!a!neutrófilos!como!a!monocitos!tal!y!como!se!había!observado!con!el!efecto!de!ABC! en!los!estudios!realizados!previamente.! ! ! ! 29! También! se! ha! evaluado! la! expresión! de! moléculas! de! adhesión! empleando! la! técnica!de!citometría!de!flujo.!La!molécula!de!adhesión!analizada!fue!P\selectina!(CD62P)! implicada! en! la! interacción! plaqueta\endotelio,! plaqueta\leucocito! e! indicadora! de! la! activación! plaquetaria.! Sin! embargo,! tal! y! como! se! había! observado! previamente! en! el! tratamiento!de!PRP!con!ABC,!CBV\TP!tampoco!induce!ningún!aumento!en!la!expresión!de! este! marcador,! y! por! tanto! podemos! afirmar! que! CBV\TP! no! estimula! la! activación! plaquetaria.! ! En!conclusión,!se!ha!observado!que!CBV\TP!estimula!la!adhesión!de!plaquetas!al! endotelio,!también!la!interacción!plaqueta\leucocito,!en!concreto!la!adhesión!de!plaquetas! a! neutrófilos! y! monocitos,! pero! no! tiene! efecto! sobre! el! aumento! de! la! expresión! de!!!!!!!!!!!!!!!!!!!! P\selectina!y!por!tanto,!sobre!la!activación!plaquetaria.!Al!comparar!los!efectos!de!los!dos! compuestos!sobre!la!función!plaquetaria!observamos!que!ambos!tienen!efectos!similares.! Sin! embargo,! sí! que! se! ha! observado! una! diferencia! entre! los! efectos! de! estos! dos! compuestos.!Esta!diferencia!indica!que!ABC!está!ejerciendo!un!efecto!únicamente!sobre! células!endoteliales!mientras!que!CBV\TP!ejerce!su!acción!tanto!sobre!células!endoteliales! como! sobre! plaquetas.! No! obstante,! esto! no! es! suficiente! para! poder! afirmar! que! los! efectos!observados!asociados!a!ABC!estén!debidos!a!su!metabolito!activo,!CBV\TP!y!harían! falta!experimentos!adicionales!que!permitieran!alcanzar!una!conclusión!de!forma!directa! administrando!ABC!e!inhibiendo!su!transformación!a!CBV\TP.! ! Dada! la! importancia! de! estos! fármacos! en! la! terapia! antirretroviral! actual,! la! controversia! generada! en! torno! a! ellos! y! teniendo! en! cuenta! la! limitación! que! supone! haber! utilizado! células! de! pacientes! sin! VIH,! las! diferencias! observadas! en! el! perfil! de! toxicidad!cardiovascular!apoyan!la!asociación!clínica!tanto!entre!ABC!y!el!desarrollo!de! enfermedades!cardiovasculares!como!entre!CBV\TP!y!la!enfermedad!cardiovascular.! !* ! ! 30! VI. CONCLUSIONES* * Concentraciones!clínicamente!relevantes!de!CBV\TP:! ! 1. Inducen! interacción! plaqueta\endotelio! in! vitro.!La! estimulación! selectiva! de! plaquetas!o!de!células!endoteliales!por!parte!de!CBV\TP!es!suficiente!para!que!se! de!esta!interacción.! ! 2. Inducen! interacción! plaqueta\leucocito! in! vitro,! específicamente! plaqueta\ neutrófilo!y!plaqueta\monocito,!no!produciendo!interacción!plaqueta\linfocito.! ! 3. No! inducen! un! aumento! de! la! expresión! de! P\selectina,! es! decir,! no! causan! activación!plaquetaria!in!vitro.! ! ! ! ! 31! VII. BIBLIOGAFÍA* ! ABERG,!J.!A.!(2009).!Cardiovascular!complications!in!HIV!management:!Past,!present,!and! future.!Journal!of!Acquired!Immune!Deficiency!Syndromes,!50(1):!54–64.!! ! ÁLVAREZ,!Á.,!HERMENEGILDO,!C.,!ISSEKUTZ,!A.!C.,!ESPLUGUES,!J.!V.!&!SANZ,!M.!J.!(2002).! Estrogens! inhibit! angiotensin! II\induced! leukocyte\endothelial! cell! interactions! in! vivo! via! rapid! endothelial! nitric! oxide! synthase! and! cyclooxygenase! activation.! Circulation!Research,!91(12):!1142–1150.! ! 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