Estudio del sistema de autoincompatibilidad en pepino dulce (Solanum muricatum) y especies relacionadas

Escola Tècnica Superior d’Engeniería Agronòmica i del Medi Natural (ETSIAMN) GRADO EN BIOTECNOLOGÍA Estudio del sistema de autoincompatibilidad en pepino dulce (Solanum muricatum) y especies relacionadas CURSO ACADÉMICO 2015-2016 Autor: Camilo Perales Morales Tutor académico: Santiago Vilanova Navarro Co-tutor externo: Carlos Romero Salvador Director experimental: Francisco Javier Herraiz García València, Julio de 2016 Datos personales Datos del Trabajo de Fin de Grado Resumen Los sistemas de auto-incompatibilidad (SI) en angiospermas evitan la autofecundación promoviendo la polinización cruzada y favoreciendo la generación de diversidad genética. En Solanáceas, Rosáceas y Plantagináceas la SI está controlada por un sistema gametofítico controlado por la interacción entre un determinante masculino (SFL) y un determinante femenino (S-RNasa). Se sabe que los dos genes que codifican para estas proteínas se encuentran en un locus hipervariable llamado locus-S. En Solanáceas, las S-RNasas presentan cinco dominios conservados, dos regiones hipervariables y un intrón. Se ha descrito que estos genes presentan un amplio número de alelos que varían tanto en sus regiones hipervariables como en el tamaño del intrón. La detección de estos alelos permite conocer de antemano qué plantas van a ser compatibles entre sí, permitiendo una mejor planificación de los programas de mejora. Se ha visto en especies como tomate que la transición de la auto-incompatibilidad a la autocompatibilidad es un rasgo característico de la domesticación, pues una planta auto-compatible facilita enormemente la fijación de caracteres de interés. Esto suele ser debido a la selección de individuos que presentan mutaciones en alguno de los dos determinantes, permitiendo así saltarse el control de rechazo del polen. En el marco de los programas de mejora es común el uso de especies silvestres que aporten nuevos caracteres de interés en las especies cultivadas. Sin embargo, estas especies suelen ser auto-incompatibles, lo que dificulta su uso para el desarrollo de nuevos materiales. El pepino dulce (Solanum muricatum Aiton) es un cultivo herbáceo de origen andino que se cultiva por sus frutos comestibles, jugosos y aromáticos. Pertenece a la familia de las Solanáceas, siendo filogenéticamente cercano a otras especies importantes como el tomate y la patata. El pepino dulce es auto-compatible pero dentro la sección Basarthrum a la que pertenece, encontramos tanto especies auto-incompatibles como especies auto-compatibles. El objetivo principal de este trabajo fue determinar diferentes alelos de incompatibilidad amplificando regiones de las S-RNasas tanto en la especie cultivada (Solanum muricatum), como en diversas especies silvestres de la sección Basarthrum (S. caripense, S. tabanoense, S. catilliflorum, S. Trachycarpum y S. perlongistylum). Por otra parte, se intentó identificar si existe alguna alteración en las S-RNasas en la especie cultivada que pudiera ser responsable de la auto-compatibilidad. También se realizaron diferentes cruces dirigidos en invernadero para poder establecer los niveles de compatibilidad de las diferentes especies, así como para confirmar la relación entre los alelos de las SRNasas y la compatibilidad cruzada de las plantas. Se pudieron determinar distintos alelos de Título: Estudio del sistema de autoincompatibilidad en pepino dulce (Solanum muricatum) y especies relacionadas Tutor académico: Santiago Vilanova Navarro Co-tutor externo: Carlos Romero Salvador Director experimental: Francisco Javier Herraiz García Localidad y fecha: València, Julio de 2016 Nombre y apellidos: Camilo Perales Morales Palabras clave El objetivo principal de este trabajo fue determinar diferentes alelos de incompatibilidad amplificando regiones de las S-RNasas tanto en la especie cultivada (Solanum muricatum), como en diversas especies silvestres de la sección Basarthrum (S. caripense, S. tabanoense, S. catilliflorum, S. Trachycarpum y S. perlongistylum). Por otra parte, se intentó identificar si existe alguna alteración en las S-RNasas en la especie cultivada que pudiera ser responsable de la auto-compatibilidad. También se realizaron diferentes cruces dirigidos en invernadero para poder establecer los niveles de compatibilidad de las diferentes especies, así como para confirmar la relación entre los alelos de las SRNasas y la compatibilidad cruzada de las plantas. Se pudieron determinar distintos alelos de incompatibilidad para el conjunto de las especies estudiadas, aunque no se pudo obtener la secuencia de las S-RNasas de todas las especies, incluyendo en la especie cultivada. Los cruzamientos en el invernadero sugirieron que no se pudieron caracterizar todos los alelos de incompatibilidad presentes en las especies. Pepino dulce, Solanum muricatum, Sistema de auto-incompatibilidad gametofítica, S-RNasa Title Abstract Key words Study of the self-incompatibility system in Pepino dulce (Solanum muricatum) and related species The self-incompatibility (SI) systems in angiosperms avoid selfing, promoting cross-pollination and the generation of genetic diversity. In Solanaceae, Rosaceae and Plantaginaceae self-incompatibility is controlled by a gametophytic system controlled by the interaction between a male determinant (SFL) and a female determinant (S-RNase). It is known that both genes codifying these proteins are located in a hipervariable locus named the S-locus. In Solanaceae, S-RNases comprise five conserved domains, two hipervariable regions and an intron. It has been described that these gens show a wide number of alleles that vary in their hipervariable regions as well as in the size of their intron. The detection of these alleles allows to know beforehand which plants are going to be incompatible, allowing for a better planning of breeding programs. It has been observed in species such as tomato that transition from self-incompatibility to selfcompatibility is a characteristic trait of domestication, as a self-compatible plant makes the fixation of interesting traits much easier. This is usually due to the selection of plants that have mutations in one of the two determinants, allowing them to bypass the rejection of pollen control. In breeding programs is common to use wild species that contribute with new interesting traits for the cultivated species. However, these species usually are self-incompatible, which makes their use in the development of new materials difficult. Pepino (Solanum muricatum Aiton) is a species of shrub of Andean origin cultivated for its edible, juicy and aromatic fruits. It belongs to the Solanaceae family, and is phylogenetically close to other relevant species such as tomato and potato. The pepino is self-compatible, but inside the section Basarthrum, to which it belongs, there are self-incompatible species as well as self-compatible species. The main objective of this work was to determine different incompatibility alleles by amplifying regions in the S-RNases of the cultivated species (Solanum muricatum) and of different wild species of section Basarthrum (S. caripense, S. tabanoense, S. catilliflorum, S. Trachycarpum y S. perlongistylum). Moreover, it was tried to identify if there is any alteration in the S-RNases of the cultivated species that might be the cause of self-compatibility. Different directed cross-pollinations were made in the greenhouse to assess the level of incompatibility in the different species, and as to confirm the relation between the alleles of of the S-RNases and the cross-compatibility between plants. Diverse alleles of incompatibility could be determined for the studied species, although the sequence of the S-RNase of all species could not be obtained, including that of the cultivated species. The greenhouse crosses suggested that not all of the alleles present in the species could be determined. Pepino, Solanum muricatum, Gametophytic self-incompatibility system, S-RNase AGRADECIMIENTOS Este trabajo no hubiera sido posible sin toda la gente del laboratorio, que siempre ha estado ahí para ayudarme con cualquier cosa. Muchísimas gracias, por contestar a mis preguntas, por enseñarme todo lo que no sabía y simplemente por estar ahí, a Cris, a Mariola, a Pietro, a Jaume, a Ramsés, a Francesco, a Dionís, a Sileia y a todo el resto. Muchísimas gracias a Santi y a Javi, por encaminarme y ayudarme en prácticamente todo, y porque sin ellos esto no hubiera salido adelante ni la mitad de bien. Moltíssimes gràcies també a la meua família, que encara que no entengueren res del que estava fent, sempre m’han donat tot el seu suport i m’han aguantat setmanes i setmanes de aparèixer com un zombi per casa. D’ací poc menjarem pepinos dolços. Y, como no podía ser menos, a todos los amigos que he hecho a lo largo de este bonito infierno que llaman grado en biotecnología. El cómo he podido conocer a tanta gente tan especial nunca lo entenderé. Y, sobre todo, gracias a los limones, por los cientos de horas de biblioteca y por los cientos de horas de simplemente ser nosotros. YMJ. ÍNDICE 1. INTRODUCCIÓN ........................................................................................................ 1-9 1.1. El pepino dulce ....................................................................................................... 1 1.2. Barreras de cruzabilidad ........................................................................................ 4 1.3. La auto-incompatibilidad gametofítica basada en S-RNasas ................................. 5 1.4. Ejemplos de auto-compatibilidad .......................................................................... 8 2. OBJETIVOS .................................................................................................................. 10 3. MATERIALES Y MÉTODOS ...................................................................................... 11-14 3.1. Material vegetal ................................................................................................... 11 3.2. Extracción de DNA ............................................................................................... 11 3.3. Diseño de cebadores ............................................................................................ 12 3.4. Amplificación de las S-RNasas.............................................................................. 12 3.5. Caracterización de los alelos de las S-RNasas ...................................................... 13 3.6. Polinizaciones controladas................................................................................... 13 4. RESULTADOS Y DISCUSIÓN .................................................................................... 15-31 4.1. Diseño de cebadores ............................................................................................ 15 4.2. Optimización de la amplificación de las S-RNasas ............................................... 16 4.3. Secuenciación de las S-RNasas ............................................................................ 18 4.4. Caracterización de los alelos de las S-RNasas ...................................................... 21 4.5. Evaluación de la auto-incompatibilidad de las entradas ..................................... 25 4.6. Cruzamientos ....................................................................................................... 27 4.6.1 Auto-compatibles ......................................................................................... 27 4.6.2 Auto-incompatibles ...................................................................................... 28 4.7. Discusión general ................................................................................................. 30 5. CONCLUSIONES ........................................................................................................... 32 6. BIBLIOGRAFÍA ....................................................................................................... 33-36 7. ANEXOS ................................................................................................................. 37-39 7.1. Anexo 1 ................................................................................................................ 37 7.2. Anexo 2 ................................................................................................................ 38 7.3. Anexo 3 ................................................................................................................ 39 ÍNDICE DE FIGURAS Figura 1. Pepino dulce de la variedad El Camino. ......................................................................... 1 Figura 2. Representación cerámica de frutos del pepino dulce de la cultura Moche. ................. 3 Figura 3. Frutos de S. muricatum maduros. .................................................................................. 4 Figura 4. Modelo esquemático del Collaborative Non-Self Recognition Model en Petunia. Los SLFs de cada haplotipo-S aparecen conectados por flechas a las S-RNasas con las que interactúan. Los SLFs de la derecha todavía no se han descrito. Fuente: Kubo et al., 2010. ....... 7 Figura 5. Preparación de una flor de S. muricatum para una polinización manual. a) Racimo con flores cerradas en su extremo. b) Flor aislada y abierta. c) Flor emasculada, preparada para recibir polen en el estigma. ......................................................................................................... 14 Figura 6. Alineamiento de las secuencias de la S8-RNasa de tomate (Solyc01g055200.1.1) y la SF11-RNasa de patata (XM_006347185.1). Los nucleótidos conservados se indican con un asterisco (*). Los cebadores seleccionados están resaltados con colores según la leyenda. ..... 15 Figura 7. Electroforesis en gel de agarosa de la PCR para optimizar la combinación de cebadores. Cada carril corresponde a, de izquierda a derecha, 37-A pl. 1, El Camino pl. 3, E-34 pl. 3, P-80 pl. 5, EC-40 pl. 6, E-7 pl. 7, E-257 pl. 8, EC-26 y P-62 pl. 4. Se incluyen un marcador de peso molecular y controles negativos. ................................................................................................................. 17 Figura 8. Combinación de temperatura de annealing (Tm, ºC) y concentración de cloruro de magnesio ([MgCl2], mM) de las distintas PCRs. El DNA de cada carril corresponde a, de izquierda a derecha, 37-A pl. 1, El Camino pl. 3, E-34 pl. 3, P-80 pl. 5, EC-40 pl. 6, E-7 pl. 7, E-257 pl. 8 y P62 pl. 4. ........................................................................................................................................ 18 Figura 9. Arriba: Cromatograma de la secuenciación de P-80 pl. 5. Se puede observar el desfase y el alto fondo de la secuenciación. Abajo: Cromatograma de la secuenciación de EC-40 pl. 6, donde se puede apreciar la calidad de la lectura. ...................................................................... 19 Figura 10. a) Resultado de los mejores alineamientos del BLASTn con la secuencia de la S-RNasa de EC-40 (S. caripense). El resultado de la entrada E-7 fue muy similar. b) Los cinco alineamientos encontrados en el BLASTn de la secuencia obtenida de E-257 (S. tabanoense). ........................ 20 Figura 11. Zona de hibridación de los cebadores FI y RI con los genes de las S-RNasas secuenciadas. Los nucleótidos que coinciden entre secuencia y cebador aparecen en azul, y los nucleótidos que no coinciden se resaltan en rojo. ..................................................................... 20 Figura 12. Alineamiento múltiple de las proteínas traducidas a partir de las secuencias obtenidas y las secuencias de tomate y patata utilizadas para el diseño de cebadores. Se indican las regiones conservadas (C2, C3 y C4) y las hipervariables (Hva y Hvb). Los corchetes en azul indican la zona donde hibridan los cebadores internos en la secuencia nucleotídica, los aminoácidos resaltados en azul delimitan el principio y el final del intrón y las histidinas catalíticas conservadas están resaltadas en gris. También se incluye un árbol de distancia genética entre las secuencias. ............................................................................................................................. 21 Figura 13. Nested PCR de las entradas 37-A y El Camino (S. muricatum). 37-A pl. 1 y pl. 2, El Camino pl. 1 y pl. 2, E-34 pl. 1 y pl. 2, P-80 pl. 1 y pl. 2, EC-40 pl. 1 y pl. 2, E-7 pl. 1 y pl. 2, E-257 pl. 1 y pl. 2, P-62 pl. 1 y EC-26. Aunque la cantidad de producto amplificado fue variable, en todas las entradas se consiguió amplificar la banda deseada. ............................................................. 22 Figura 14. a. Electroferograma de los fragmentos amplificados (intensidad de fluorescencia (u.a.) respecto a tamaño de fragmento (bp)). b. Diferencia entre los electroferogramas de individuos homocigotos y heterocigotos. c. Muestra del desfase de unas pocas bases entre distintos análisis de los mismos individuos. ................................................................................ 23 ÍNDICE DE TABLAS Tabla 1. Auto-incompatibilidad (SI) o auto-compatibilidad (SC) del pepino dulce y especies relacionadas de la serie Caripensa (Anderson y Bernardello, 1991; Anderson et al., 2006; Anderson, 1975, 1977). ................................................................................................................. 2 Tabla 2. Relación de accesiones empleadas. .............................................................................. 11 Tabla 3. Componentes y programa térmico de la reacción de PCR. La concentración de MgCl2 y la Tm variaron en cada reacción entre los rangos indicados.. .................................................... 12 Tabla 4. Cebadores seleccionados, su tamaño y su Tm. ............................................................ 16 Tabla 5. Alelos-S identificados según su tamaño en las plantas descritas auto-compatibles (a) y auto-incompatibles (b). De las plantas E-34 pl. 8, El Camino pl. 7 y P-62 pl. 6 no se obtuvieron picos claros en los electroferogramas. **: P-62 aparece descrita como auto-incompatible, pero en este trabajo los resultados indicaron que era auto-compatible. .......................................... 24 Tabla 6. Resultado de las auto-fecundaciones en el conjunto de plantas de cada entrada y número de flores cuajadas sin intervención manual. *No se obtuvieron datos de autopolinizaciones de las plantas de las entradas El Camino y EC-26. ** S. perlongistylum aparece descrita como SI, pero los resultados indican que es SC. ........................................................... 26 Tabla 7. Cruzamientos de las entradas de S. muricatum. ........................................................... 27 Tabla 8. Cruzamientos de las entradas de S. trachycarpum, S. catilliflorum y S. perlongistylum ..................................................................................................................................................... 28 Tabla 9. Cruzamientos de la entrada EC-40 de S. caripense. ..................................................... 29 Tabla 10. Cruzamientos de la entrada E-7 de S. caripense. ....................................................... 29 Tabla 11. Cruzamientos de la entrada E-257 de S. tabanoense. ................................................ 30 Introducción 5 la interacción de dos determinantes de distinto haplotipo permite el avance de la polinización (Franklin et al., 1995). Los mecanismos de SI se dividen comúnmente en SI gametofíca (GSI) y SI esporofítica (SSI), según si el fenotipo SI del polen está determinado por el gametofito o el esporofito. Se han descrito otros mecanismos de SI, como la GSI controlada por 2 loci o la SI heteromórfica, pero están limitados a taxones concretos y están mucho menos estudiados (de Nettancourt, 2001). La GSI está presente en familias muy alejadas filogenéticamente como las Solanáceas, Rosáceas, Plantagináceas y Rubiáceas. En este mecanismo el fenotipo SI del polen (el gametofito masculino) lo determina su genotipo haploide. En estas familias el producto del determinante femenino es una RNasa, denominada S-RNasa, mientras que el producto del locus-S masculino es una proteína con un motivo F-box en su extremo N-terminal (Sijacic et al., 2004). La interacción entre determinantes masculinos y femeninos del mismo alelo de SI activa la S-RNasa, degradando el RNA ribosómico del tubo polínico (Franklin-Tong y Franklin, 2003). Aunque es el mecanismo más extendido, la GSI basada en S-RNasas no es el único tipo de GSI. En las Papaveráceas el mecanismo se incluye dentro de la GSI pero a nivel bioquímico es completamente distinto (Franklin-Tong y Franklin, 2003). 1.3. La auto-incompatibilidad gametofítica basada en S-RNasas La GSI basada en S-RNasas fue descrita por primera vez por Bredemeijer y Blaas (1981), y en subsiguientes estudios se observó que familias distintas conservaban el patrón del mecanismo, con dos genes multialélicos, pero con genes S completamente distintos entre sí (Foote et al., 1994), lo que sugiere que los sistemas de GSI evolucionaron de forma independiente más de una vez. De hecho, algunos autores proponen la GSI y otros mecanismos de SI como factores cruciales en el éxito evolutivo de las angiospermas (Olmstead, 1989; Zavada, 1984). En Solanáceas la GSI actúa mediante el mecanismo de la S-RNasa, que es el determinante femenino. La S-RNasa se expresa exclusivamente en el pistilo, fundamentalmente en el segmento superior del estilo. Al reconocer un grano de polen con un determinante masculino del mismo haplotipo-S la S-RNasa degrada el RNA del tubo polínico, impidiendo la autofecundación. Las secuencias de las S-RNasas de distintas Solanáceas son considerablemente variables entre sí, con una identidad de secuencia de aminoácidos variable entre el 38% y el 98%, pero contienen cinco regiones altamente conservadas que tienen función catalítica. Dos de ellas, C2 y C3, son muy similares a la RNasa fúngica T2 y contienen residuos de histidina catalíticos. En las S-RNasas de Solanáceas hay también dos regiones hipervariables, HVa y HVb, que en la conformación nativa de la proteína se encuentran espacialmente cercanas y localizadas en la superficie molecular (Ida et al., 2001), lo que sugiere su participación en la interacción con el determinante masculino. La importancia de las regiones hipervariables en la determinación de la especificidad de cada haplotipo-S se comprobó con experimentos de intercambio de dominios en S. chacoense, donde el intercambio de las regiones HVa y HVb de plantas S11-RNasa por los de plantas S13-RNasa, que diferían en solo 4 aminoácidos, resultaba en que las plantas transformada adquirían fenotipo S13, rechazando polen S13 pero no polen S11 (Matton et al., 1997). Introducción 6 Los genes de las S-RNasas de Solanáceas presentan un intrón en la región HVa. Este intrón también es una zona muy variable, y es habitual que los intrones de S-RNasas de distintos alelosS tengan distinto tamaño. Esto se ha aprovechado para desarrollar estrategias de genotipado de alto rendimiento de alelos de incompatibilidad, basadas en la medida del tamaño del intrón, tanto en Rosáceas (Romero et al., 2004; Sonneveld et al., 2006) como en Solanáceas (Miller y Kostyun, 2011). La identificación del determinante masculino de la GSI en Solanáceas presentó numerosas dificultades, ya que la estructura de la región del locus-S, en la región subcentromérica y rodeada por numerosas secuencias repetitivas, dificultó su análisis genómico. Finalmente el determinante masculino se identificó mediante el análisis de una región de 328 kb de Petunia inflata clonada en un clon BAC (Bacterial Artificial Chromosome) que contenía la secuencia codificante de una S2-RNasa. A 161 kb aguas abajo de la S-RNasa se encontró un ORF que denominaron PiSLF2, cuya proteína predicha contenía un motivo F-box que cumplía todas las condiciones para ser el determinante masculino: estaba localizada en la región del locus-S, presentaba una diversidad específica de haplotipo elevada y se expresaba específicamente en polen. La hipótesis se demostró mediante experimentos de transformación, transformando plantas S1S1, S1S2 y S2S3 con el alelo S2 de PiSLF2. Por el fenómeno conocido como “interacción competitiva”, que ocurre cuando una planta SI posee dos haplotipos-S (bien por una duplicación o bien porque se hayan convertido en tetraploides), los granos de polen que contienen dos alelos-S distintos superan la barrera de la SI, mientras que los que tienen dos alelos-S iguales no la superan. Al autopolinizarse las plantas transformadas, el polen que portaba el transgén con el alelo S2 de PiSLF2 superaba la barrera de la SI, y las plantas pasaban a ser auto-compatibles. Además, se observó que solo los granos de polen S1 y S3 con el transgén PiSLF2, pero no los granos de polen S2 con el transgén PiSLF2, se convertían en SC. Este experimento demostró que SLF/SFB (S-Locus F-box/S-haplotype-specific F-Box), más tarde rebautizado como SLF1, es el determinante masculino de la GSI en Solanáceas (Sijacic et al., 2004). No obstante, resultados posteriores confirmaron que SLF1 es, efectivamente, el determinante masculino, pero que no es el único que actúa en el reconocimiento entre polen y pistilo. Por una parte, la diversidad de secuencia entre distintos alelos de SLF1 es mucho menor que la presente en los mismos alelos de la S-RNasa, algo sorprendente debido a que alelos de SI nuevos tienden a aumentar de frecuencia en una población y, por tanto, la diversidad de alelos de ambos determinantes debería ser alta. Además, en experimentos de transformación similares a los de Sijacic et al. (2004) también en P. inflata, la transformación de S3-SLF1 en plantas S2S3 no rompía la auto-incompatibilidad del polen S2, y la transformación con S7-SLF1 rompía la SI en algunos alelos pero no en otros. Adicionalmente, se observó que la secuencia de aminoácidos de los alelos S7-SLF1 y S19-SLF1 era idéntica, siendo las secuencias aminoacídicas de las S7y S19-RNasas eran solo un 45 % idénticas y comprobando mediante cruzamientos que los haplotipos S7 y S19 son distintos en cuanto a control genético de la SI (Kubo et al., 2010). Estos resultados por una parte confirman la implicación de SLF1 en la SI pero por otra parte indican que no es el único determinante masculino. Este modelo denominado Collaborative Non-Self Recognition Model propone la participación de distintas proteínas SLF en la especificidad SI del polen: para un haplotipo-S determinado, cada tipo de proteína SLF reconoce un subconjunto de S-RNasas, mediando su ubiquitinación y Introducción 7 degradación, y se requieren distintos tipos de proteínas SLF para reconocer todas las S-RNasas no-propias. Además, ninguna de las proteínas SLF de un haplotipo-S interactúa con ninguna SRNasa propia (Figura 4). Se demostró experimentalmente que una proteína SLF determinada reconoce un subconjunto concreto de S-RNasas no-propias, mediante la expresión de una proteína de fusión S7-SLF2:FLAG en polen transgénico y co-inmunoprecipitación con un anticuerpo anti-FLAG. Se observó que S7-SLF2:FLAG co-precipitaba con la S9-RNasa y la S11RNasa, pero no con la S5-RNasa ni la S7-RNasa. También se comprobó que la expresión de S7SLF2 rompía la SI en polen S9 y S11, pero no en polen S5 ni S7. Esto explica, por ejemplo, porqué la expresión de S3-SLF1 en plantas S2S3 no rompe la SI del polen S2, y porqué las secuencias de las SLF no son tan divergentes como las de las S-RNasas, ya que el reconocimiento colaborativo hace que cada proteína SLF solo tenga que interactuar con unas pocas S-RNasas (Kubo et al., 2010; Sun et al., 2014). Figura 4. Modelo esquemático del Collaborative Non-Self Recognition Model en Petunia. Los SLFs de cada haplotipo-S aparecen conectados por flechas a las S-RNasas con las que interactúan. Los SLFs de la derecha todavía no se han descrito. Fuente: Kubo et al., 2010. En cuanto al mecanismo de actuación de las proteínas SLF, las proteínas F-box promueven la degradación de otras proteínas por la vía de degradación mediada por ubiquitina y por el proteosoma 26S (Craig y Tyers, 1999), sugiriendo que al reconocer e interactuar una proteína SLF con una S-RNasa no-propia se produce la degradación de esta última, permitiendo el avance del tubo polínico. A día de hoy aún quedan muchos aspectos por dilucidar en la SI basada en S-RNasas. Por ejemplo, el mecanismo de entrada de las S-RNasas al tubo polínico para que puedan ejercer su efecto citotóxico, un paso crucial en el sistema, sigue sin conocerse. En el crecimiento del tubo polínico participan numerosos eventos de endocitosis, exocitosis y transportadores de membrana, como en la toma de SCA (stigma/stylecysteine-richadhesin), una proteína que guía el crecimiento del tubo polínico hasta el ovario y que se internaliza mediante endocitosis dependiente de clatrina (Chae et al., 2007; Kim et al., 2006). Los principales candidatos para la Introducción 8 introducción de las S-RNasas en el tubo polínico son los transportadores ABC (ATP-Binding Cassete), transportadores activos que consumen ATP y que participan en procesos muy diversos tanto como exportadores o importadores. Recientemente, se demostró en manzana (Malus doméstica), perteneciente a la familia de las Rosáceas, que uno de estos transportadores, MdABCF, participa de forma clave en la importación de las S-RNasas. MdABCF se localiza en la membrana del tubo polínico, interacciona con las S-RNasas tanto propias como no-propias y su silenciamiento impedía la entrada de las S-RNasas al tubo polínico (Meng et al., 2014). Otros aspectos todavía por estudiar en profundidad son la formación de complejos entre distintas proteínas SLF o la ruta de degradación exacta de las S-RNasas no-propias en el tubo polínico (Williams et al., 2015). 1.4. Ejemplos de auto-compatibilidad La transición de auto-incompatibilidad a auto-compatibilidad (la ruptura de la SI) es una de las transiciones evolucionarias más comunes en angiospermas, documentada en muchas especies diferentes. Esta transición es habitual en las poblaciones localizadas en los límites del rango geográfico de la especie o en islas oceánicas (Busch, 2005). En estas condiciones, en ausencia de polinizadores o con dificultad para la polinización cruzada, una mutación que rompa la SI se extenderá eventualmente a toda la población. Un ejemplo de pérdida de la SI en Solanáceas es el de las nueve especies de la sección Lycopersicon, que incluye el tomate cultivado (S. lycopersicum) y especies silvestres relacionadas. Cinco de estas especies son SC, incluyendo el tomate cultivado, mientras que las otras cuatro son SI (Bretó et al., 1993). La pérdida de la SI parece haber evolucionado de forma independiente entre las especies, pues la SC tiene un origen molecular distinto en especies distintas. Por ejemplo, en S. peruvianum la secuencia de la S-RNasa del alelo SC presenta una mutación puntual que da lugar a la sustitución de la histidina de la posición 33 de la proteína por asparagina. Esta histidina es una de los dos histidinas catalíticas conservadas entre todas RNasas de la familia T2, entre las que se incluyen las S-RNasas (Royo et al., 1994). En cambio, en S. lycopersicum la pérdida de la SI está asociada a cambios tanto en la S-RNasa como en la proteína HT, accesoria al mecanismo de SI (Kondo et al., 2002). El cultivar siciliano “Kronio” de cerezo dulce (Prunus avium), de la familia de las Rosáceas, presenta el genotipo de incompatibilidad S5S6, que se ha descrito como auto-compatible de forma natural. El grupo de Marchese et al. (2007) caracterizó la causa de la auto-compatibilidad de este genotipo mediante cruces controlados, análisis de S-RNasas, y análisis molecular y secuenciación de los alelos de SI. La auto-fecundación del cultivar “Kronio” fue exitosa en 157 de 400 flores (~39%), mientras que la polinización con el cultivar “Colney”, también de genotipo S5S6, no fue compatible en ninguno de los casos. En cambio, el cruce “Colney”×”Kronio”, utilizando polen de “Kronio”, dio lugar a 6 frutos de 100 flores. El análisis por PCR de los alelos de la progenie de la auto-fecundación de “Kronio” reveló que la segregación de alelos era aproximadamente 1:1 S5S5 y S5S6, lo que indica que el alelo S5 está mutado. Dado que el cruzamiento “Kronio”×”Colney” es incompatible y el cruzamiento “Colney”×”Kronio” es compatible, la mutación debe encontrarse en el determinante masculino. La clonación y secuenciación de la S5-RNasa y la S6-RNasa y su comparación con las S-RNasas de “Colney” Introducción 9 mostró una ligera variación entre las secuencias, pero solo en el intrón, mientras que la clonación y secuenciación de S5-SFB y S6-SFB reveló un codón de stop prematuro en la secuencia de la S5-SFB, debido a una mutación puntual A:G en la posición 972 de la secuencia nucleotídica, que produce la pérdida de 80 aminoácidos en S5-SFB (Marchese et al., 2007). Este mecanismo entra en conflicto con el modelo colaborativo, debido a que este no es aplicable al género Prunus: en Prunus solo existe un determinante masculino (el SFB), mientras que en el género Solanum hay varios genes SFL en el locus-S, cada uno con especificidades diferentes. La pérdida de la SI también puede deberse a cambios fuera del locus-S, como es el caso del cultivar “Cristobalina” de Prunus avium. Todos los análisis moleculares y cruzamientos realizados apuntaban a que ambos determinantes del locus-S eran funcionales en todos los genotipos auto-compatibles. Aunque todavía no se han sugerido genes candidatos responsables de la pérdida de la SI en este caso, sí se ha encontrado un microsatélite ligado a la SC, que delimita la zona responsable a la parte baja del grupo de ligamiento LG3 del mapa genético disponible para Prunus avium. Esta zona del genoma es sinténica con regiones de otras especies donde se localizan locus de SI (Cachi y Wünsch, 2011; Wang et al., 2015). Como se ha visto, la pérdida de la SI puede tener orígenes muy distintos y que afectan a distintos componentes del sistema. 2. Objetivos Objetivos 10 El propósito general de este trabajo es dar una primera aproximación al mecanismo de autoincompatibilidad del pepino dulce y las especies relacionadas, algo que todavía no se ha estudiado. Con este fin, los objetivos de este trabajo son: 1. Amplificar y secuenciar las S-RNasas de S. muricatum y especies relacionadas de la sección Basarthrum. 2. Caracterizar y diferenciar los diferentes alelos de las S-RNasas de una selección de individuos de cada especie en base a las diferencias de tamaño del intrón de las S-RNasas. 3. Intentar relacionar el genotipo del locus-S de cada individuo con la compatibilidad o incompatibilidad de cruzamientos dirigidos y auto-fecundaciones realizadas en invernadero. 3. Materiales y Métodos Materiales y Métodos 11 3.1. Material vegetal Las 64 plantas utilizadas para los ensayos moleculares y los cruzamientos provienen de 9 accesiones del banco de germoplasma del Instituto de Conservación y Mejora de la Agrodiversidad Valenciana (COMAV) de la Universitat Politècnica de València y de la colección de la University of Connecticut (UCONN). Las 9 accesiones corresponden a especies distintas de la serie Caripensa, incluyendo pepino dulce (Solanum muricatum) y especies relacionadas (Solanum caripense, Solanum tabanoense, Solanum perlongistylum, Solanum catilliflorum y Solanum trachycarpum). Las plantas se obtuvieron de colecciones de semillas conservadas en bancos de germoplasma (Tabla 2). Para cada entrada se germinaron 15-20 semillas al azar en sustrato húmedo. Se seleccionaron 8 plantas de cada entrada y se trasplantaron en los invernaderos del COMAV en la UPV, con arena como sustrato. Las plantas se condujeron por entutorado con hilos verticales. El riego fue por goteo con fertirrigación. El ciclo de cultivo fue de primavera/verano. Durante el crecimiento, las planta 37-A pl. 3 y EC-40 pl. 4 se secaron y murieron, mientras que de la entrada EC-26 solamente se obtuvo una planta. Tabla 2. Relación de accesiones empleadas. 3.2. Extracción de DNA El DNA genómico para los ensayos moleculares se extrajo a partir de hoja joven antes de trasladar las plantas al invernadero. Se tomaron 50-70 g de material vegetal por planta. El protocolo de extracción utilizado fue el del método CTAB (Doyle y Doyle, 1987). Mediante un espectrofotómetro Nanodrop ND-1000 (Nanodrop Technologies) se cuantificó la cantidad de DNA extraído y se evaluó su calidad mediante las relaciones de absorbancia a 260/280 nm y 260/230 nm. En aquellos casos en que la cantidad de DNA lo permitió, la concentración se ajustó a 50 ng/µL. La integridad del DNA se comprobó mediante electroforesis en gel de agarosa al 0.8% tiñendo el DNA con GelRed (Biotium) y revelando el gel con luz UV Especie Accesión Colector Nº Plantas Auto-Comp.* Solanum muricatum 37-Aa F. Nuez 7 SC Solanum muricatum El Caminoa Variedad Comercial 8 SC Solanum trachycarpum E-34a F. Nuez y J. Prohens 8 SC Solanum catiliflorum P-80a F. Nuez y J. Prohens 8 SC Solanum caripense EC-40b F. Nuez y J. Prohens 8 SI Solanum caripense E-7a F. Nuez y J. Prohens 8 SI Solanum tabanoense E-257a F. Nuez y J. Prohens 8 SI Solanum tabanoense EC-26a F. Nuez y J. Prohens 1 SI Solanum perlongistylum P-62a F. Nuez y J. Prohens 8 SI a: Accesiones de la colección de J. Prohens. Semillas conservadas en el banco de germoplasma del COMAV. b: Accesiones de la colección de G.J. Anderson. Semillas conservadas en el banco de germoplasma de la UCONN. * La auto-compatibilidad o auto-incompatibilidad se muestra según lo descrito en la bibliografía (Anderson et al., 2006; Anderson, 1975, 1977). Materiales y Métodos 12 mediante un captador de imágenes Gel Doc (BioRad) utilizando el software Quantity One (BioRad). 3.3. Diseño de cebadores Al no disponer de secuencia genómica, los cebadores se diseñaron a partir de alineamientos de genes de S-RNasas de especies relacionadas, que se obtuvieron de las bases de datos NCBI RefSeq (accesión XM_006347185.1) y Sol Genomics Network (accesión Solyc01g055200.1.1). El software utilizado para los alineamientos fue el Clustal Omega (EMBL-EBI). Los cebadores se diseñaron con bases degeneradas, con una longitud de unas 20 bp y que tuvieran una temperatura de annealing (Tm) de entre 50 y 60 ºC, utilizando el software Primer3 (Rozen y Skaletsky, 2000). Se diseñaron cebadores a distintas alturas. Los más externos permitieron amplificar y secuenciar parte del gen, mientras que los más internos que se utilizaron para la amplificación del intrón. 3.4. Amplificación de las S-RNasas Los genes de las S-RNasas se amplificaron a partir del DNA genómico extraído mediante una reacción de PCR. Los componentes que se utilizaron fueron buffer de PCR (Kapa Biosystems), MgCl2 (Kapa Biosystems), dNTPs (Roche), cebador directo (Integrated DNA Technologies), cebador reverso (Integrated DNA Technologies), KAPA Taq polimerasa (Kapa Biosystems) y agua MilliQ, con los volúmenes y concentraciones indicados en la Tabla 3. Se utilizó un termociclador (Eppendorf Mastercycler) con el programa térmico que también se incluye en la Tabla 3. Tabla 3. Componentes y programa térmico de la reacción de PCR. La concentración de MgCl2 y la Tm variaron en cada reacción entre los rangos indicados. Los resultados de la PCR se comprobaron mediante una electroforesis en gel de agarosa al 1.5%, tiñendo el DNA con GelRed (Biotium) y revelando el gel con luz UV mediante un captador de imágenes Gel Doc (BioRad) utilizando el software Quantity One (BioRad). Se incluyó un marcador peso molecular de 100 bp DNA ladder (NIPPON Genetics) y un control negativo con agua MilliQ en lugar de DNA. Componente Volumen (µL) Concentración final Temperatura (ºC) Duración Agua MilliQ 94 3 min Buffer PCR 2 1X 94 30 s MgCl2 x 1.5-2.5 mM 52-58 30 s 30 ciclos dNTPs 0.4 0.2 mM 72 40 s Cebador directo 0.8 0.4 µM 72 10 min Cebador reverso 0.8 0.4 µM 12 ∞ Taq polimerasa 0.08 1 U DNA 2 ~ 100 ng/µL Total 20 Resultados y Discusión 18 Se observó que en general la amplificación de las S-RNasas fue mucho menor en las entradas descritas como SC (37-A pl. 1, El Camino pl. 3, P-80 pl. 5) y en la previamente descrita como SI S. perlongistylum (P-62 pl. 4), que en las entradas SI (EC-40 pl. 6, E-7 pl. 7 y E-257 pl. 8). Esto sugiere que la causa de la auto-compatibilidad en las especies SC podría deberse a algún cambio en los genes de las S-RNasas de las especies. 4.3. Secuenciación de las S-RNasas Para comprobar que la secuencia que se amplificó se trataba realmente de la S-RNasa se secuenciaron los productos de la PCR con las condiciones seleccionadas. Las secuencias se leyeron en las dos direcciones, utilizando los cebadores FE y R3, para obtener una secuencia consenso. El distinto tamaño del intrón de los alelos hizo que hubiera un desfase en la secuenciación a partir de la zona en que sus longitudes difieren. La lectura por ambos extremos permitió obtener una secuencia fiable de las zonas codificantes. Los individuos que se secuenciaron fueron P-80 pl. 5, EC-40 pl. 6, E-7 pl. 7, E-257 pl. 8 y P-62 pl. 4. Solo se pudieron secuenciar con éxito los individuos EC-40 pl. 6, E-7 pl. 7 y E-257 pl. 8. El resto de los cromatogramas que se obtuvieron no tenían calidad suficiente para proporcionar una secuencia fiable, probablemente debido a un bajo éxito en la amplificación (Figura 9). Tm 52ºC 54ºC 56ºC 58ºC [MgCl2] 1.5 mM 2 mM 2.5 mM Figura 8. Combinación de temperatura de annealing (Tm, ºC) y concentración de cloruro de magnesio ([MgCl2], mM) de las distintas PCRs. El DNA de cada carril corresponde a, de izquierda a derecha, 37-A pl. 1, El Camino pl. 3, E-34 pl. 3, P-80 pl. 5, EC-40 pl. 6, E-7 pl. 7, E-257 pl. 8 y P-62 pl. 4. Resultados y Discusión 19 Figura 9. Arriba: Cromatograma de la secuenciación de P-80 pl. 5. Se puede observar el desfase y el alto fondo de la secuenciación. Abajo: Cromatograma de la secuenciación de EC-40 pl. 6, donde se puede apreciar la calidad de la lectura. Las secuencias obtenidas de las entradas EC-40, E-7 (S. caripense) y E-257 (S. tabanoense) se incluyen en el Anexo 1. Una búsqueda de alineamiento con el software BLASTn (NCBI) contra la base de datos no redundante del NCBI confirmó que se estaban amplificando las S-RNasas. Para las dos entradas de S. caripense los mejores alineamientos fueron con S-RNasas de S. phureja, S. chacoense y S. stenotomum, tres especies relacionadas con la patata (S. tuberosum), y con las secuencias más similares hubo homología incluso en la zona del intrón. La secuencia obtenida de S. tabanoense alineó con solo cinco accesiones de la base de datos, todas ellas S-RNasas de especies de la sección Lycopersicon, relacionadas con el tomate, y los alineamientos solo incluyeron el exón 2 (Figura 10). a Resultados y Discusión 20 Figura 10. a) Resultado de los mejores alineamientos del BLASTn con la secuencia de la S-RNasa de EC-40 (S. caripense). El resultado de la entrada E-7 fue muy similar. b) Los cinco alineamientos encontrados en el BLASTn de la secuencia obtenida de E-257 (S. tabanoense). En las secuencias obtenidas se incluía la zona de hibridación de los cebadores internos que se utilizaron más adelante en la nested PCR. Como se observa en la Figura 11, los cebadores, aun siendo degenerados, no hibridan con las S-RNasas con total complementariedad, sino que presentan múltiples desapareamientos. La secuencia obtenida para la entrada E-257 de S. tabanoense es especialmente divergente respecto a los cebadores, con 6 nucleótidos diferentes en el cebador interno directo y 4 en el cebador interno reverso. Esto fue probablemente un factor decisivo en la dificultad de la amplificación de las S-RNasas. Figura 11. Zona de hibridación de los cebadores FI y RI con los genes de las S-RNasas secuenciadas. Los nucleótidos que coinciden entre secuencia y cebador aparecen en azul, y los nucleótidos que no coinciden se resaltan en rojo. Alineando las S-RNasas traducidas a proteína a partir de las secuencias obtenidas con las secuencias de tomate y patata utilizadas para el diseño de cebadores, y basándose en los alineamientos de un gran número de S-RNasas de distintas especies del género Solanum realizados por Brisolara-Corrêa et al. (2015), se pudieron delimitar las características estructurales de los fragmentos amplificados (Figura 12). b Resultados y Discusión 21 Figura 12. Alineamiento múltiple de las proteínas traducidas a partir de las secuencias obtenidas y las secuencias de tomate y patata utilizadas para el diseño de cebadores. Se indican las regiones conservadas (C2, C3 y C4) y las hipervariables (Hva y Hvb). Los corchetes en azul indican la zona donde hibridan los cebadores internos en la secuencia nucleotídica, los aminoácidos resaltados en azul delimitan el principio y el final del intrón y las histidinas catalíticas conservadas están resaltadas en gris. También se incluye un árbol de distancia genética entre las secuencias. 4.4. Caracterización de los alelos de las S-RNasas Una vez optimizadas las condiciones de la primera amplificación, se realizó una PCR de las 64 plantas con los cebadores FE-R3, a una Tm de 52ºC y con una concentración de MgCl2 de 2 mM. El producto de esta reacción se diluyó 1:100 con agua MilliQ y se utilizó como DNA molde para realizar la nested PCR. La reacción se comprobó mediante una electroforesis en gel de agarosa, con los resultados esperados. En primer lugar se probó la reacción con los cebadores FI-RI con 16 individuos representativos de todas las entradas, con una concentración de MgCl2 de 2 mM y a una Tm de 56ºC. Además, se incluyó el oligo complementario a la cola M13 marcado con el fluoróforo FAM, para que las condiciones fueran las mismas que en la PCR de marcaje final. Se corrió un gel de electroforesis para comprobar que la amplificación con los cebadores internos hubiera funcionado, con resultados positivos (Figura 13). Resultados y Discusión 22 Figura 13. Nested PCR de las entradas, de izquierda a derecha, 37-A pl. 1 y pl. 2, El Camino pl. 1 y pl. 2, E34 pl. 1 y pl. 2, P-80 pl. 1 y pl. 2, EC-40 pl. 1 y pl. 2, E-7 pl. 1 y pl. 2, E-257 pl. 1 y pl. 2, P-62 pl. 1 y EC-26. Aunque la cantidad de producto amplificado fue variable, en todas las entradas se consiguió amplificar la banda deseada. Para caracterizar los alelos de las S-RNasas de cada planta se utilizó la metodología descrita por Schuelke (2000). Se hizo una nested PCR con todas las plantas para marcar con fluorescencia los productos de amplificación, aprovechando la cola M13 del cebador FI. Cada PCR individual se marcó con uno de los fluoróforos disponibles (FAM, PET, VIC o NED). Esto permitió medir la longitud de fragmentos amplificados de hasta cuatro plantas distintas por pocillo en una electroforesis capilar mediante un analizador de fragmentos. Tras un primer análisis de fragmentos, en aquellas plantas en las que la intensidad de fluorescencia era demasiado baja o en aquellas en las que hubiera dudas sobre qué picos del electroferograma eran los correctos se repitió el análisis, marcándolas con un fluoróforo distinto. Los resultados del segundo análisis se ajustaron a los de la primera utilizando repeticiones como control interno, pues puede haber un pequeño desfase de unas pocas bases entre análisis (Figura 14). Resultados y Discusión 23 a b c Figura 14. a. Electroferograma de los fragmentos amplificados (intensidad de fluorescencia (u.a.) respecto a tamaño de fragmento (bp)). b. Diferencia entre los electroferogramas de individuos homocigotos y heterocigotos. c. Muestra del desfase de unas pocas bases entre distintos análisis de los mismos individuos. Resultados y Discusión 24 En la Tabla 5 se muestran los alelos-S identificados para cada planta según el tamaño del fragmento amplificado. En general, en otras especies SI, se mantiene una amplia diversidad de alelos-S debido a la selección negativa dependiente de la frecuencia en las poblaciones. Los individuos con alelos poco frecuentes tienen una ventaja reproductiva, por lo que en una población en equilibrio se Tabla 5. Alelos-S identificados según su tamaño en las plantas descritas auto-compatibles (a) y autoincompatibles (b). De las plantas E-34 pl. 8, El Camino pl. 7 y P-62 pl. 6 no se obtuvieron picos claros en los electroferogramas. **: P-62 aparece descrita como auto-incompatible, pero en este trabajo los resultados indicaron que era auto-compatible. a. Auto-compatibles Línea Planta Alelos-S Línea Planta Alelos-S 37-A Solanum muricatum E-34 Solanum trachycarpum 1 342 360 1 342 2 342 2 342 363 4 339 3 342 363 5 339 360 4 342 363 6 339 360 5 342 363 7 342 6 342 363 8 339 360 7 342 363 8 El Camino Solanum muricatum P-80 Solanum catilliflorum 1 339 1 342 363 2 339 2 342 363 3 339 360 3 342 4 339 360 4 342 363 5 339 360 5 342 363 6 339 360 6 342 363 7 7 342 362 8 339 360 8 342 b. Auto-incompatibles Línea Planta Alelos Línea Planta Alelos EC-40 Solanum caripense E-257 Solanum tabanoense 1 340 361 1 342 2 340 2 342 3 350 360 3 342 363 4 360 4 342 363 5 340 5 342 363 6 340 6 342 363 7 360 7 342 8 340 8 342 363 E-7 Solanum caripense P-62 Solanum perlongistylum ** 1 356 379 1 342 363 2 356 361 2 342 363 3 356 361 3 342 4 361 4 342 363 5 356 361 5 342 6 356 379 6 7 356 361 7 342 363 8 356 361 8 342 363 EC-26 Solanum tabanoense 1 339 342 Resultados y Discusión 25 mantienen la diversidad alélica (Miller y Kostyun, 2011). En primera instancia, si la causa de la pérdida de la SI en las especies auto-compatibles fuera una S-RNasa mutada la presión de selección de los alelos poco frecuentes se perdería, y sería de esperar una baja variabilidad de alelos-S en las especies SC. Efectivamente, se observó que en los 36 individuos de las cinco entradas SC solo aparecían 5 alelos distintos, los alelos 339, 342, 360, 363 y 362. Sin embargo, lo contrario no se cumplió: aunque en las especies SI la variabilidad alélica fue mayor, el número de alelos-S fue menor de lo esperado. Solo se identificaron 9 alelos en 25 individuos de cuatro entradas. En un experimento similar, en un conjunto de 30 individuos de una población SI de Solanum peruvianum se identificaron 14 alelos de S-RNasas distintos (Miller y Kostyun, 2011). Además, en dicho estudio todos los individuos eran heterocigotos, que es lo que cabría esperar puesto que el sistema de GSI impide que un alelo-S esté en homocigosis. En este trabajo, en cambio, de las 25 plantas SI analizadas 12 fueron homocigotas para el alelo-S. En una población representativa de una generación proveniente de unos pocos cruzamientos debe haber, como mínimo, tres alelos de auto-incompatibilidad, ya que si hubiera solo dos alelos implicaría que todos los parentales tenían el mismo genotipo-S, por lo que serían incompatibles entre sí y el cruzamiento no podría darse. Por este motivo, la baja diversidad de alelos caracterizados en las plantas auto-incompatibles fue inesperada. Estos resultados se discuten más adelante, después de presentar los datos de las auto-fecundaciones y cruzamientos. Un alelo que apareció muy frecuentemente en homocigosis tanto en entradas SC como en entradas SI es el 342. Apareció en todas las entradas excepto en El Camino y en las entradas de S. caripense, y todas las plantas analizadas de S. trachycarpum, S. catilliflorum, S. tabanoense y S. perlongistylum lo poseían. Llamó la atención el hecho de que de las 35 veces que apareció, 10 veces estuviera en homocigosis. Debido a esto, el alelo 342 es un buen candidato a estudiar en más profundidad. No obstante, el que estuviera ausente en El Camino podría indicar que no se trate de un alelo responsable de la SC. En 37-A sí estuvo presente, pero 37-A parece provenir de un cruzamiento con alguna especie silvestre, ya que presenta características morfológicas y moleculares a medio camino entre el pepino dulce y especies silvestres (Herráiz, 2016). Estos resultados son acordes con la idea del origen silvestre, en parte, de 37-A. Que el alelo 342 apareciera en homocigosis con frecuencia pudo deberse a que este alelo tuviera una secuencia especialmente similar a los cebadores diseñados en este trabajo en comparación con otros alelos, que podrían quedar enmascarados en la amplificación. 4.5. Evaluación de la auto-incompatibilidad de las entradas Las auto-fecundaciones de las plantas se realizaron para comprobar la auto-incompatibilidad o auto-compatibilidad de las entradas. En la bibliografía, S. muricatum, S. trachycarpum y S. catilliflorum aparecen como especies SC, mientras que S. caripense, S. tabanoense y S. perlongistylum están descritas como especies SI (Anderson et al., 2006; Anderson, 1975, 1977). En la Tabla 6 se recogen los resultados de las auto-fecundaciones. Las 4 entradas SC presentaron unos porcentajes de cuajado dentro de lo esperable, excepto la entrada El Camino, en la cual no se pudieron hacer auto-fecundaciones debido a la floración tardía de las plantas. En las entradas de S. caripense no cuajó ninguna flor, confirmando su SI. Las entradas de S. tabanoense Resultados y Discusión 26 presentaron un desarrollo considerablemente menor al resto de entradas, y la floración fue muy tardía. Para la entrada EC-26 no se pudo realizar ninguna auto-fecundación por falta de flores, aunque sí para la entrada E-257, de las cuales no cuajó ninguna, lo que parece confirmar su SI. Los resultados de la entrada P-62 de S. perlongistylum contradicen los de la bibliografía. Según la descripción original de S. perlongistylum (Anderson et al., 2006), “esta especie de estilo largo nunca cuajó ningún fruto tras la auto-polinización de más de 100 flores (en Valencia)”. En este trabajo cuajaron 29 flores sin polinización controlada y un 14.6% de las auto-fecundaciones controladas. Aunque este porcentaje de cuajado no se considera como un claro fenotipo de auto-compatibilidad según algunos autores (Alonso y Company, 2005), difiere mucho de lo descrito originalmente, teniendo en cuenta que cuajaron 35 flores en 8 plantas. Además, en la descripción de S. perlongistylum se incluye que la longitud de su estilo es mayor que la de las otras especies registradas de la sección Basarthrum, cuando las especies SC de dicha sección se caracterizan por poseer estilos cortos en relación a los estambres. Aun así, en la Tabla 5 se observa que las plantas de P-62 presentaron los mismos alelos que algunas entradas SC y en los geles de las electroforesis se observa que la amplificación de las S-RNasas de P-62 es más similar a la de las entradas SC que a la de las entradas SI (Figuras 7 y 8). Estos resultados sugieren que la entrada de S. perlongistylum es auto-compatible, lo que podría indicar que existe variación dentro de la especie para la auto-incompatibilidad. Se requerirían más estudios para confirmar este aspecto. Cabe destacar que el desarrollo vegetativo de las plantas limitó los resultados obtenidos. El desarrollo de las entradas de pepino dulce fue considerablemente menor al de las entradas silvestres, especialmente el de El Camino. Lo mismo sucedió en las entradas de S. tabanoense. Debido a esto, no se pudo confirmar con certeza la auto-incompatibilidad de E-257 y EC-26, ya que el no-cuajado del fruto pudo deberse a factores no relacionados con el sistema de SI, sino a las condiciones de cultivo. El ciclo de cultivo fue el de primavera/verano, mientras que el ciclo Especie Entrada Flores autofecundadas Flores cuajadas % Cuajado Flores cuajadas sin polinización manual SC S. muricatum 37-A 19 8 42,1 18 El Camino* - - - - S. trachycarpum E-34 5 3 60,0 12 S. catilliflorum P-80 28 10 35,7 27 SI ** S. caripense E-7 50 0 0,0 2 EC-40 47 0 0,0 1 S. tabanoense E-257 16 0 0,0 0 EC-26* - - - - S. perlongistylum P-62 41 6 14,6 29 Tabla 6. Resultado de las auto-fecundaciones en las plantas de cada entrada y número de flores cuajadas sin intervención manual. *No se obtuvieron resultados de auto-polinizaciones de las plantas de las entradas El Camino y EC-26. ** S. perlongistylum aparece descrita como SI, pero los resultados indican que es SC. Resultados y Discusión 27 de cultivo óptimo para el pepino dulce, que es más sensible a las condiciones de cultivo que las especies silvestres, es el de otoño/invierno (Prohens et al., 2000). 4.6. Cruzamientos dirigidos Se realizaron cruzamientos entre distintas plantas de la misma entrada para comprobar si la compatibilidad o incompatibilidad cruzada entre plantas se correspondía con los resultados obtenidos en la caracterización de alelos. En el Anexo 2 se muestran los resultados completos de los cruzamientos realizados, y en el Anexo 3 se muestra un resumen de los resultados junto con los alelos caracterizados en cada planta. Un aspecto a tener en cuenta es que el pequeño tamaño de las flores (que dificulta su manipulación) y la fragilidad del estilo pudieron afectar negativamente al cuajado del fruto, aunque el cruzamiento fuera compatible. El embolsado del racimo también influye negativamente en la viabilidad del cruzamiento. Por este motivo, los resultados negativos no son completamente fiables. Debido al mecanismo de la GSI, los cruzamientos de plantas con el mismo genotipo-S deben ser incompatibles. Sin embargo, esto no se cumple en el caso de las plantas SC, cuando está presente un alelo que confiere auto-compatibilidad. 4.6.1 Auto-compatibles En las dos entradas de pepino dulce, a diferencia de lo esperado, ninguno de los cruzamientos funcionó (Tabla 7). Sin embargo, esto se podría atribuir con toda probabilidad a una combinación del efecto de la polinización manual, la mayor fragilidad de las plantas en comparación con las especies silvestres y las condiciones de cultivo no idóneas. Por ejemplo, en la planta 37-A pl. 6, con genotipo 339/360, cuajaron flores auto-fecundadas, mientras que en el cruce 37-A pl.6 × pl. 5, ambas con el mismo genotipo 339/360, no cuajó ninguna flor. Tabla 7. Cruzamientos de las entradas de S. muricatum. Línea Planta × Parental ♂ Cuajados (%) 37-A Solanum muricatum 1 8 0,0 2 1 0,0 5 8 0,0 6 5 0,0 7 6 0,0 8 6 0,0 EC Solanum muricatum 1 6 0,0 2 1 0,0 4 2 0,0 5 4 0,0 7 6 0,0 8 5 0,0 6. Bibliografía Bibliografía 33 AITON, W. (1813). Hortus kewensis, or, A catalogue of the plants cultivated in the Royal Botanic Garden at Kew (Vol. v.5 (1813)). London :Longman, Hurst, Rees, Orme, and Brown,. ALONSO, J. M., Y COMPANY, R. S. (2005). Identification of the S3 self-incompatibility allele in almond by specific primers. Spanish Journal of Agricultural Research 3(3), 296-303. ANDERSON, G. J. (1975). The variation and evolution of selected species of Solanum section Basarthrum. Brittonia, 27(3), 209–222. ANDERSON, G. J. (1977). The Variation and Evolution of Selected Species of Solanum Section Basarthrum (Solanaceae). II. Brittonia, 29(1), 116. ANDERSON, G. J., Y BERNARDELLO, L. M. (1991). The Relationships of Solanum cochoae (Solanaceae), a New Species from Peru. Novon, 1(3), 127. ANDERSON, G. J., MARTINE, C. T., PROHENS, J., Y NUEZ, F. (2006). Solanum perlongistylum and S. catilliflorum, New Endemic Peruvian Species of Solanum, Section Basarthrum, Are Close Relatives of the Domesticated Pepino, S. muricatum. Novon, 16(2), 161–167. BERNARDELLO, L. M., Y ANDERSON, G. J. (1990). Karyotypic Studies in Solanum Section Basarthrum (Solanaceae). American Journal of Botany, 77(3), 420. BLANCA, J. M., PROHENS, J., ANDERSON, G. J., ZURIAGA, E., CAÑIZARES, J., Y NUEZ, F. (2007). AFLP and DNA sequence variation in an Andean domesticate, pepino (Solanum muricatum, Solanaceae): implications for evolution and domestication. American Journal of Botany, 94(7), 1219–29. BREDEMEIJER, G., Y BLAAS, J. (1981). S-specific proteins in styles of self-incompatible Nicotiana alata. Theoretical and Applied Genetics, 59, 185-190. BRETÓ, M. P., ASINS, M. J., Y CARBONELL, E. A. (1993). Genetic variability in Lycopersicon species and their genetic relationships. Theoretical and Applied Genetics, 86(1), 113–120. BRISOLARA-CORRÊA, L., THOMPSON, C. E., FERNANDES, C. L., Y DE FREITAS, L. B. (2015). Diversification and distinctive structural features of S-RNase alleles in the genus Solanum. Molecular Genetics and Genomics, 290(3), 987–1002. BUSCH, J. W. (2005). The evolution of self-compatibility in geographically peripheral populations of Leavenworthia alabamica (Brassicaceae). American Journal of Botany, 92(9), 1503–12. CACHI, A. M., Y WÜNSCH, A. (2011). Characterization and mapping of non-S gametophytic selfcompatibility in sweet cherry (Prunus avium L.). Journal of Experimental Botany, 62(6), 1847– 1856. CHAE, K., ZHANG, K., ZHANG, L., MORIKIS, D., KIM, S. T., MOLLET, J.-C., … LORD, E. M. (2007). Two SCA (stigma/style cysteine-rich adhesin) isoforms show structural differences that correlate with their levels of in vitro pollen tube adhesion activity. The Journal of Biological Chemistry, 282(46), 33845–58. CRAIG, K. L., Y TYERS, M. (1999). The F-box: a new motif for ubiquitin dependent proteolysis in cell cycle regulation and signal transduction. Progress in Biophysics y Molecular Biology, 72, 299– 328. DE NETTANCOURT, D. (2001). Breakdown of the Self-Incompatibility Character, S Mutations and the Evolution of Self-Incompatible Systems. In Incompatibility and Incongruity in Wild and Bibliografía 34 Cultivated Plants (pp. 151–215). Berlin, Heidelberg: Springer Berlin Heidelberg. DI SCALA, K., VEGA-GÁLVEZ, A., URIBE, E., OYANADEL, R., MIRANDA, M., VERGARA, J., … LEMUSMONDACA, R. (2011). Changes of quality characteristics of pepino fruit (Solanum muricatum Ait) during convective drying. International Journal of Food Science y Technology, 46(4), 746–753. DOYLE, J., Y DOYLE, J. L. (1987). Genomic plant DNA preparation from fresh tissue-CTAB method. Phytochem Bull, 19(11), 11–15. FOOTE, H. C. C., RIDE, J. P., FRANKLIN-TONG, V. E., WALKER, E. A., LAWRENCE, M. J., CHRISTOPHER, F., … HESLOP-HARRISON, J. (1994). Cloning and expression of a distinctive class of self-incompatibility (S) gene from Papaver rhoeas L, 91, 2265–2269. FRANKLIN, F. C. H., LAWRENCE, M. J., Y FRANKLIN-TONG, V. E. (1995). Cell and Molecular Biology of Self-Incompatibility in Flowering Plants. International Review of Cytology, 158, 1–64. FRANKLIN-TONG, V. E., Y FRANKLIN, F. C. H. (2003). The different mechanisms of gametophytic self-incompatibility. Philosophical Transactions of the Royal Society of London. Series B, Biological Sciences, 358(1434), 1025–32. GOMBEROFF, I. (1991). Pepino plant, Cascade Gold. Plant patent - United States Patent and Trademark Office (USA). HERRÁIZ, F. J. (2016). Desarrollo de herramientas morfológicas y genómicas para el estudio del pepino dulce (Solanum muricatum) y especies relacionadas. Caracterización de su valor nutracéutico. Universitat Politècnica de València. HERRAIZ, F. J., BLANCA, J., ZIARSOLO, P., GRAMAZIO, P., PLAZAS, M., ANDERSON, G. J., … VILANOVA, S. (2016). The first de novo transcriptome of pepino (Solanum muricatum): assembly, comprehensive analysis and comparison with the closely related species S. caripense, potato and tomato. BMC Genomics, 17(1), 321. HSU, C., GUO, Y., WANG, Z., Y YIN, M. (2011). Protective effects of an aqueous extract from pepino (Solanum muricatum Ait.) in diabetic mice. Journal of the Science of Food and Agriculture, 91(8), 1517–22. IDA, K., NORIOKA, S., YAMAMOTO, M., KUMASAKA, T., YAMASHITA, E., NEWBIGIN, E., … SATO, M. (2001). The 1.55 Å resolution structure of Nicotiana alata SF11-RNase associated with gametophytic self-incompatibility. Journal of Molecular Biology, 314(1), 103–112. KIM, S. T., ZHANG, K., DONG, J., Y LORD, E. M. (2006). Exogenous free ubiquitin enhances lily pollen tube adhesion to an in vitro stylar matrix and may facilitate endocytosis of SCA. Plant Physiology, 142(4), 1397–411. KONDO, K., YAMAMOTO, M., MATTON, D. P., SATO, T., HIRAI, M., NORIOKA, S., … KOWYAMA, Y. (2002). Cultivated tomato has defects in both S-RNase and HT genes required for stylar function of self-incompatibility. Plant Journal, 29(5), 627–636. KUBO, K., ENTANI, T., TAKARA, A., WANG, N., FIELDS, A. M., HUA, Z., … TAKAYAMA, S. (2010). Collaborative Non-Self Recognition System in S-RNase-Based Self-Incompatibility. Science, 330(6005), 796–799. MARCHESE, A., BOŜKOVIĆ, R. I., CARUSO, T., RAIMONDO, A., CUTULI, M., Y TOBUTT, K. R. (2007). A new self-compatibility haplotype in the sweet cherry “Kronio”, S5’, attributable to a pollenpart mutation in the SFB gene. Journal of Experimental Botany, 58(15-16), 4347–4356. Bibliografía 35 MATTON, D. P., MAES, O., LAUBLIN, G., XIKE, Q., BERTRAND, C., MORSE, D., Y CAPPADOCIA ’, M. (1997). Hypervariable Domains of Self-Incompatibility RNases Mediate Allele-Specific Pollen Recognition. The Plant Cell American Society of Plant Physiologists, 9, 1757–1766. MENG, D., GU, Z., LI, W., WANG, A., YUAN, H., YANG, Q., Y LI, T. (2014). Apple MdABCF assists in the transportation of S-RNase into pollen tubes. The Plant Journal : For Cell and Molecular Biology, 78(6), 990–1002. MILLER, J. S., Y KOSTYUN, J. L. (2011). Functional gametophytic self-incompatibility in a peripheral population of Solanum peruvianum (Solanaceae). Heredity, 107(1), 30–39. NUEZ, F., Y RUIZ, J. J. (1996). El pepino dulce y su cultivo. FAO, Roma (Italia). OLMSTEAD, R. G. (1989). The origin and function of self-incompatibility in flowering plants. Sexual Plant Reproduction, 2(3), 127–136. ORHAN, N., ORHAN, D. D., ASLAN, M., Y ERGUN, F. (2014). Effect of Exotic Fruit “Pepino” (Solanum muricatum Aiton.) on Blood Glucose Level. Turkish Journal of Pharmaceutical Sciences, 11(2), 196–202. PROHENS, J. (1997). Mejora Del Cuajado y De La Precocidad En Pepino Dulce (Solanum muricatum Aiton). Universitat Politècnica de València. PROHENS, J., ANDERSON, G. J., BLANCA, J. M., CAÑIZARES, J., ZURIAGA, E., Y NUEZ, F. (2006). The Implications of AFLP Data for the Systematics of the Wild Species of Solanum Section Basarthrum. Systematic Botany, 31(1), 208–216. PROHENS, J., RUIZ, J. J., Y NUEZ, F. (1996). The Pepino (Solanum muricatum, Solanaceae): A “New” Crop with a History. Economic Botany, 50(4), 355–368. PROHENS, J., RUIZ, J. J., Y NUEZ, F. (2000). Growing cycles for a new crop, the pepino, in the Spanish mediterranean. Acta Horticulturae, 523(523), 53–60. RODRÍGUEZ-BURRUEZO, A., PROHENS, J., Y FITA, A. M. (2011). Breeding strategies for improving the performance and fruit quality of the pepino (Solanum muricatum): A model for the enhancement of underutilized exotic fruits. Food Research International, 44(7), 1927–1935. ROMERO, C., VILANOVA, S., BURGOS, L., VICENTE, M., LLA, G., Y BADENES, M. L. (2004). Analysis of the S -locus structure in Prunus armeniaca L . Identification of S -haplotype specific S-RNase and F-box genes, 145–157. ROYO, J., KUNZT, C., KOWYAMAI, Y., ANDERSON, M., CLARKE, A. E., Y NEWBIGIN, E. (1994). Loss of a histidine residue at the active site of S-locus ribonuclease is associated with selfcompatibility in Lycopersicon peruvianum. Cell Biology, 91, 6511–6514. SCHUELKE, M. (2000). An economic method for the fluorescent labeling of PCR fragments. Nature Biotechnology, 18(2), 233–234. SIJACIC, P., WANG, X., SKIRPAN, A. L., WANG, Y., DOWD, P. E., MCCUBBIN, A. G., … KAO, T. (2004). Identification of the pollen determinant of S-RNase-mediated self-incompatibility. Nature, 429(6989), 302–305. SONNEVELD, T., ROBBINS, T. P., Y TOBUTT, K. R. (2006). Improved discrimination of selfincompatibility S-RNase alleles in cherry and high throughput genotyping by automated sizing of first intron polymerase chain reaction products. Plant Breeding, 125(3), 305–307. Bibliografía 36 SUDHA, G., PRIYA, M. S., SHREE, R. B. I., Y VADIVUKKARASI, S. (2012). Antioxidant activity of ripe and unripe pepino fruit (Solanum muricatum Aiton). Journal of Food Science, 77(11), C1131–5. SUN, P., WILLIAMS, J. S., LI, S., Y KAO, T. (2014). Sexual Reproduction in Animals and Plants. In H. Sawada, N. Inoue, y M. Iwano (Eds.) (pp. 289–303). Tokyo: Springer Japan. VARGAS, C. (1962). Phytomorphic Representations of the Ancient Peruvians. Economic Botany, 16(2), 106–115. VILANOVA, S., BADENES, M. L., BURGOS, L., MARTINEZ-CALVO, J., LLACER, G., Y ROMERO, C. (2006). Self-Compatibility of Two Apricot Selections Is Associated with Two Pollen-Part Mutations of Different Nature. PLANT PHYSIOLOGY, 142(2), 629–641. WANG, J., ZHANG, K., ZHANG, X., YAN, G., ZHOU, Y., FENG, L., … MCCURDY, D. (2015). Construction of Commercial Sweet Cherry Linkage Maps and QTL Analysis for Trunk Diameter. PLOS ONE, 10(10), e0141261. WILLIAMS, J. S., WU, L., LI, S., SUN, P., Y KAO, T.-H. (2015). Insight into S-RNase-based selfincompatibility in Petunia: recent findings and future directions. Frontiers in Plant Science, 6, 41. ZAVADA, M. S. (1984). The Relation Between Pollen Exine Sculpturing and Self-Incompatibility Mechanisms. Plant Systematics and Evolution, 147, 63–78. 7. Anexos Anexos 37 ANEXO 1 Secuencias parciales de las S-RNasas obtenidas >E-7_7, S. Caripense. Exon1: 1-113, Intron:114-201, Exon2:202-489 CATTGTCAACGCATAGTTCAAAAAACTTTACGATCCACGGTCTTTGGCCGGATAAGGAGG GACCACAGCTGCTGCAGTACTGCAAGCCAAAACTTACCTATAAATATTTCAGTGTAAACA GCTTTATTATTTTCTCCAGAACCTAATCCTTTTTTTGTTCTGTTAAATTTACTGAAACGA TTATTTTTGAATTGCTTTCAGGATAAGATGCTCAATGATCTTGACAAACACTGGATTCAG TTGAAGGTTGATCAAGCTTCTGCTCTAAAGGACCAACGAGCATGGAAATATCAATATCTA AAGCATGGATCCTGTTGTCAGAAAATCTACAATCAAAGTACGTATTTTAGTTTAGCCTTG GGCTTAAAAGATAGGTTTGATCTGCTGAGAACTCTCCAAATACATCGAATTGTTCCTGGA TCAAGTTATACATTTGAYGAAATCTTTGAGGCCGTAAAGACAGTTACTCAGACGGATCCT GACATCAAGTG >E-257_8, S. Tabanoense. Exon1:1-105, Intron:106-192, Exon2:193-465 CCAAATCTAGTTCCGAAAAATTTCACCATCCATGGGCTATGGCCTGATAAACAGGGAATA ATGCCGATTGACTGCCCGACCAAAGAAACCTATAAAAGTATTACGGTAATACTATTTCTT CTTCTTTTCAGCAATTTTTTCTTTTTCAATTTTGACCTTTTACTAATTGGAGTATCATCC TAACGTTCACAGGACCCCCAAAAAATCAAACGACTGGAGTATCACTGGCCCGATTTGACC TCCCAAGAAGGTGATGGTAGTGCAGGTTTCTGGAGATATCAATTCAATAAGCATGGAACG TGTAGTGTGGAACTATACAATCAAGAAGAATATTTTGATTTAGCTGTGGACTTAAAAGAG AAGTTTGATCTTTTGAAAACCCTCAAAAATCACGGAATTACTCCATCAAAAATTATTACA GCTACAGATGTCGAAAAAGCCATCAAGGCAGTGACTAAAGAGGTCCC >EC-40_6, S. Caripense. Exon1: 1-100, Intron: 101-189, Exon2: 190-483 GCGAATAGCTCCAAACAACTTTACGATTCACGGGCTTTGGCCGGATAAAGAGGGAACACT GCTGCAGAACTGCAAGCCAAAACCTACGTATAGACATTTCAGGGTAAACAACAGCATTAT TTTCTGCAGAACCTATACCTCTTCTATCTGTTCAATCTACTTAATAGGTTCTTTTCGAAA TGCTTACAGGATAAGATGCTCAATGATCTTGACAAAAACTGGATTCAGTTGAAGTATCCA GAACGTTATGCTCGAAAGGAACAACCTTTATGGCTTTATCAATATCTAAAGCATGGATCC TGTTGTCAGAAAGTCTACGATCAAAACACATATTTTAGTTTAGCTTTGCGCTTGAAAGAC AGGTTTGATCTTCTGAGAACTCTCCAAATACATGGAATTGTTCCTGGATCAAGTTATACA TTTAAAGAAATCTTTGATGCCGTCAAGACAGTTACTCAAACAGATCCTGATGTCAAGTGT ACA Anexos 38 ANEXO 2 Resultados completos de los cruzamientos y autofecundaciones Parental ♂Nº Flores Cuajadas % Nº Flores Cuajadas % 18 3 0 0,0 7 5 71,4 21 3 0 0,0 6 0 0,0 5 EC-26 46 3 50,0 58 4 0 0,0 3 65 3 0 0,0 4 76 2 0 0,0 6 86 3 0 0,0 0 16 3 0 0,0 21 3 0 0,0 3 42 3 0 0,0 54 3 0 0,0 6 76 3 0 0,0 85 3 0 0,0 18 2 2 100,0 2 2 100,0 0 20 36 40 57 2 2 100,0 0 61 71 83 0 0,0 4 12 3 2 2 100,0 6 26 2 1 50,0 4 4 100,0 37 2 0 0,0 6 0 0,0 0 41/2 3/1 1/0 33.3/0.0 2 2 100,0 4 52 3 1 33,3 3 1 33,3 1 65 3 2 66,7 3 0 0,0 6 72 2 0 0,0 4 0 0,0 10 84 3 1 33,3 4 1 25,0 16 2 2 100,0 8/4 0/0 0.0 23 2 2 100,0 2 0 0,0 37 1 0 0,0 4 0 0,0 41 1 1 100,0 6 0 0,0 56 3 3 100,0 8 0 0,0 1 64 2 0 0,0 4 0 0,0 71 2 2 100,0 5 0 0,0 82 3 1 33,3 6 0 0,0 14 3 2 66,7 4 0 0,0 23 3 0 0,0 5 0 0,0 35 3 0 0,0 10 0 0,0 2 47 4 0 0,0 6 0 0,0 52 2 1 50,0 7 0 0,0 61 3 0 0,0 7 0 0,0 76 4 2 50,0 5 0 0,0 83 3 0 0,0 6 0 0,0 15 0 0,0 23 1 0 0,0 2 0 0,0 3 46 1 0 0,0 5 0 0,0 56 1 0 0,0 6 74 0 0,0 8 15 2 1 50,0 2 1 50,0 8 21 2 1 50,0 6 0 0,0 9 32 3 2 66,7 3 0 0,0 0 43 3 1 33,3 4 0 0,0 4 54 3 1 33,3 5 4 80,0 8 67 2 1 50,0 7 1 14,3 78 2 0 0,0 7 0 0,0 0 81 1 0 0,0 0 E-7 E-257 P-62 37-A EC E-34 P-80 EC-40 Línea Planta Cruces Autofecundación Sin manipulación Anexos 39 ANEXO 3 Resumen de los resultados de los cruzamientos, auto-fecundaciones y alelos caracterizados Autofecundación Línea Planta Parental ♂Cuajados (%) % 1342 360 18 0,0 71,4 2342 21 0,0 0,0 5 EC-26 339 342 EC-26 4339 450,0 5339 360 58 0,0 3 6339 360 65 0,0 4 7342 76 0,0 6 8339 360 86 0,0 0 1339 16 0,0 2339 21 0,0 3339 360 3 4339 360 42 0,0 5339 360 54 0,0 6339 360 6 7 7 6 0,0 8339 360 85 0,0 1342 18 100,0 100,0 0 2342 363 20 3342 363 36 4342 363 40 5342 363 57 100,0 0 6342 363 61 7342 363 71 8 8 0,0 4 1342 363 12 100,0 100,0 6 2342 363 26 50,0 100,0 3342 37 0,0 0,0 0 4342 363 41/2 33.3/0.0 100,0 4 5342 363 52 33,3 33,3 1 6342 363 65 66,7 0,0 6 7342 362 72 0,0 0,0 10 8342 84 33,3 25,0 1340 361 16 100,0 0,0 2340 23 100,0 0,0 3350 360 37 0,0 0,0 4360 41 100,0 0,0 5340 56 100,0 0,0 1 6340 64 0,0 0,0 7360 71 100,0 0,0 8340 82 33,3 0,0 1356 379 14 66,7 0,0 2356 361 23 0,0 0,0 3356 361 35 0,0 0,0 2 4361 47 0,0 0,0 5356 361 52 50,0 0,0 6356 379 61 0,0 0,0 7356 361 76 50,0 0,0 8356 361 83 0,0 0,0 1342 10,0 2342 23 0,0 0,0 3342 363 3 4342 363 46 0,0 0,0 5342 363 56 0,0 6342 363 6 7342 70,0 8342 363 8 1342 363 15 50,0 50,0 8 2342 363 21 50,0 0,0 9 3342 32 66,7 0,0 0 4342 363 43 33,3 0,0 4 5342 54 33,3 80,0 8 6 6 7 50,0 14,3 7342 363 78 0,0 0,0 0 8342 363 81 0,0 0 P-80 P-80 P-62 P-62 EC-40 EC-40 E-7 E-7 E-257 E-257 Sin manipulación Alelos EC EC E-34 E-34 37-A 37-A Línea Planta Cruces