Efectos del envejecimiento en la fertilización y desarrollo embrionario temprano utilizando como modelo el pez cebra

UNIVERSITAT POLITÈCNICA DE VALENCIA ESCOLA TÈCNICA SUPERIOR D ENGINYERIA AGRONÒMICA I DEL MEDI NATURAL Efectos del envejecimiento en la fertilización y el desarrollo embrionario temprano utilizando como modelo el pez cebra Colaboradores: Research Center - UPV TRABAJO FIN DE GRADO EN BIOTECNOLOGÍA ALUMNA: PALOMA FERNÁNDEZ PÉREZ TUTORA: MARÍA INMACULADA MOLINA BOTELLA COTUTOR EXTERNO: FERNANDO GARCÍA XIMÉNEZ Curso Académico: 2015-2016 VALENCIA, 23 de mayo de 2016 Efectos del envejecimiento en la fertilización y el desarrollo embrionario temprano utilizando como modelo el pez cebra RESUMEN La evolución de las sociedades desarrolladas está implicando un retraso en la edad de la maternidad. Frente a este hecho, se constata como fundamental el desarrollo de técnicas reproductivas que palien los efectos del envejecimiento sobre la reproducción y así mismo proporcionen un conocimiento más profundo de tales efectos. Una forma de abordar tal tipo de estudios está siendo llevada a cabo mediante el uso de organismos modelo mamíferos, peces e incluso invertebrados. En este contexto, la utilización del pez cebra supone ciertas ventajas: una vida relativamente corta (3 años), la disponibilidad de técnicas de recuperación de ovocitos y espermatozoides, así como de fecundación in vitro y, además, un desarrollo embrionario muy rápido, de forma que a los 5 días las larvas ya son autónomas. En el presente trabajo se evaluó el pez cebra como modelo para estudiar el posible efecto de la edad en las capacidades reproductivas de hembras y machos de diferentes edades (especímenes jóvenes y maduros). Con este fin, se analizaron cuatro parámetros: tasa de supervivencia, tasa de anormalidad, tasa de eclosión y tasa de fertilidad, en cuatro grupos mezclando hembras y machos de diferentes edades (Joven x Joven, Maduro x Madura, Joven x Madura y Maduro x Joven). Los datos recogidos revelaron que cuando las hembras maduras estaban implicadas, se obtenían las mejores tasas de desarrollo (tasas de supervivencia y eclosión de las larvas) y de reproducción (tasa de fertilidad), lo cual significa que, al contrario que en los humanos, la calidad de los ovocitos aumenta conforme lo hace la edad de las hembras. Por otro lado, en cuanto a los resultados derivados de las tasas de anormalidad, no se encontraron diferencias significativas entre los grupos por lo que no se pudo extraer ninguna conclusión de los efectos que tiene la edad al respecto. En consecuencia, a pesar de que el pez cebra es un modelo adecuado para estudiar la senescencia como un fenómeno general, parece no ser el modelo correcto para evaluar el efecto del envejecimiento en la reproducción, al menos si se quiere sacar conclusiones que puedan extrapolarse a los seres humanos. Palabras clave: envejecimiento, reproducción, organismo modelo, pez cebra ABSTRACT The evolution of developed societies is entailing a delay in childbearing age. Faced with this fact, it is observed as fundamental the development of reproductive techniques that alleviate the effects of aging on reproduction and, likewise, provide a deeper knowledge of such effects. One way to address this type of study is being carried out by using mammals, fish, and even invertebrates model organisms. In this context, the use of zebrafish involves certain advantages: a relatively short life (3 years), the availability of techniques to recover oocytes and sperm and to perform in vitro fertilization, and also very fast embryonic development, so that at 5 days the larvae are already autonomous. In this paper, the zebrafish was evaluated as a model to study the possible effect of age on the reproductive capacity of males and females. To this end, four parameters were analyzed: survival rate, abnormality rate, hatchability and fertility rate, in four groups by mixing males and females of different ages (Young x Young, Mature x Mature, Young x Mature and Mature x Young). The data collected show that when the mature females were involved, the best growth rates (rates of survival and larvae hatch) and reproduction (fertility rate) were obtained, which means that, unlike humans, oocyte quality increases with the increasing age of the females. On the other hand, as to the results derived from abnormality rates, no significant differences between groups were found so it could not be drawn any conclusions from the effects of age on the matter. Consequently, despite the zebrafish is suitable model to study senescence as a general phenomenon, it doesn’t seem to be a correct model to assess the effect of aging on reproduction, at least if we want to draw conclusions that can be extrapolated to the human beings. Keywords: aging, reproduction, model organism, zebrafish Titulación: Grado en Biotecnología Alumna: Dña. Paloma Fernández Pérez Tutora: Prof. Dña. María Inmaculada Molina Botella Cotutor colaborador: D. Fernando García Ximénez Valencia, 23 de mayo de 2016 AGRADECIMIENTOS Dicen que lo bueno, si breve, dos veces bueno así que, simplemente agradecer a todos los que han estado apoyándome durante los años de carrera y a los que sé que seguirán ahí cuando todo haya acabado, con una mención especial a mis queridas chachis y por supuesto a mi familia, sin vosotros esto no habría sido posible. Let’s get the party started! I ÍNDICE DE CONTENIDO 1. INTRODUCCIÓN……………………………………………………………………………… 1 1.1. Retraso en la edad de maternidad en el ser humano……………………….. 1 1.2. Problemas derivados del retraso en el momento reproductivo………… 1 1.3. El uso de modelos animales para el estudio de procesos biológicos…. 2 humanos. 1.3.1. Escherichia coli………………………………………………………………………………… 3 1.3.2. Saccharomyces cerevisiae………………………………………………………………… 4 1.3.3. Caenorhabditis elegans……………………………………………………………………. 5 1.3.4. Drosophila melanogaster…………………………………………………………………. 6 1.3.5. Mus musculus…………………………………………………………………………………… 6 1.4. El pez cebra (Danio rerio) como organismo modelo para el estudio de los efectos del envejecimiento en la reproducción……………………………. 7 2. OBJETIVOS………………………………………………………………………………………. 9 3. MATERIAL Y MÉTODOS………………………………………………………………….. 10 3.1. Diseño experimental………………………………………………………………….……. 10 3.2. Mantenimiento del pez cebra…………………………………………………………. 10 3.3. Obtención de gametos inactivos……………………………………………………… 10 3.3.1. Recolección de huevos……………………………………………………………………. 11 3.3.2. Recolección de semen……………………………………………………………………. 11 3.4. Fecundación in vitro (FIV) ………………………………………………………………. 11 3.5. Procedimiento de recogida de datos para las distintas tasas a evaluar12 3.6. Análisis estadístico…………………………………………………………………………… 14 4. RESULTADOS Y DISCUSIÓN DE LOS RESULTADOS…………………………… 15 4.1. Tasa de fecundación……………………………………………………………………….. 15 4.2. Tasa de eclosión……………………………………………………………………………… 16 4.3. Tasa de supervivencia……………………………………………………………………... 18 4.4. Tasa de anormalidad……………………………………………………………………….. 19 5. CONCLUSIONES……………………………………………………………………………… 23 6. REFERENCIAS BIBLIOGRÁFICAS………………………………………………………. 24 7. ANEXOS…………………………………………………………………………………………. 28 7.1. Análisis estadístico (versión extendida)……………………………………….. 29 7.2. Índice de fuentes de las figuras……………………………………………………….. 31 II ÍNDICE DE FIGURAS Figura 1. Escherichia Coli………………………………………………………………………………………………………… 4 Figura 2. Saccharomyces cerevisiae………………………………………………………………………………………… 5 Figura 3. Caenorhabditis elegans……………………………………………………………………………………………. 5 Figura 4. Drosophila melanogaster…………………………………………………………………………………………. 6 Figura 5. Mus musculus………………………………………………………………………………………………………….. 7 Figura 6. Imágenes del ciclo de vida del pez cebra…………………………………………………………………. 8 Figura 7. Esponjas para la inmovilización de los peces durante la recolección. A la izquierda, esponja curvada para las hembras. A la derecha, esponja con una hendidura en el medio para los machos……………………………………………………………………………………………………………………………. 11 Figura 8. No fecundados vs Fecundados (MBT)…………………………………………………………………….. 13 Figura 9. Anormalidades morfológicas del pez cebra evaluadas. a) control b) curvatura espinal c) curvatura de la cola (curly) d) edema en el saco pericárdico……………………………………………… 13 Figura 10. Curva de crecimiento parabólico………………………………………………………………………….. 22 Figura 11. Edad Media Nacional a la Maternidad por orden del nacimiento según nacionalidad (española/extranjera) de la madre………………………………………………………………………………………… 28 ÍNDICE DE TABLAS Tabla 1. Datos recogidos para el cálculo de la tasa de fecundación de los grupos de la misma edad………………..………………………………………………………………………………………………………….…………15 Tabla 2. Datos recogidos para el cálculo de la tasa de fecundación de los grupos de distintas edades.……………………………………………………………………………………………………………………………….….15 Tabla 3. Tasas de fecundación para cada grupo de edad………………………………………………….….…16 Tabla 4. Datos recogidos para el cálculo de la tasa de eclosión (72 hpf) de los grupos de la misma edad.………………………………………………………………………………………………………………………..…16 Tabla 5. Datos recogidos para el cálculo de la tasa de eclosión (72 hpf) de los grupos de distintas edades.………………………………………………………………………………………………………………….…17 Tabla 6. Tasas de eclosión a las 72 hpf para cada grupo de edad……………………………………………17 Tabla 7. Datos recogidos para el cálculo de la tasa de supervivencia (5 dpf) de los grupos de la misma edad.…………………………………………………………………………………………………………………………..18 Tabla 8. Datos recogidos para el cálculo de la tasa de supervivencia (5 dpf) de los grupos de distintas edades……………………………………………………………………………………………………………………..18 III Tabla 9. Tasas de supervivencia a los 5 dpf para cada grupo de edad…………………………………....19 Tabla 10. Datos recogidos para el cálculo de la tasa de anormalidad (5 dpf) de los grupos de la misma edad……………………………………………………………………………………………………………………………19 Tabla 11. Datos recogidos para el cálculo de la tasa de anormalidad (5 dpf) de los grupos de distintas edades……………………………………………………………………………………………………………………..20 Tabla 12. Tasas de anormalidad a los 5 dpf para cada grupo de edad…………………………………….21 Tabla 13. Datos de las tasas de fecundación para análisis estadístico. 1  fecundados; 0  no fecundados…………………………………………………………………………………………………………………………… 29 Tabla 14. Datos de las tasas de supervivencia para análisis estadístico. 1  vivos; 0  no vivos……………………………………………………………………………………………………………………………………… 29 Tabla 15. Datos de las tasas de anormalidad para análisis estadístico. 1  anormales; 0  no anormales…………………………………………………………………………………………………………………………….. 30 Tabla 16. Datos de las tasas de eclosión para análisis estadístico. 1  eclosionados; 0  no eclosionados…………………………………………………………………………………………………………………………. 30 IV ABREVIATURAS IA Inseminación artificial FIV Fecundación in vitro ICSI Inyección intracitoplásmica de espermatozoides RAE Real Academia Española E. coli Escherichia coli Mb megabases D. melanogaster Drosophila melanogaster J x J macho joven cruzado con hembra joven M x M macho maduro cruzado con hembra madura J x M macho joven cruzado con hembra madura M x J macho maduro cruzado con hembra joven mpf meses post-fecundación TF Tasa de fecundación MBT mid blastula transition TE Tasa de eclosión hpf horas post-fecundación TS Tasa de supervivencia TA Tasa de anormalidad dpf días post-fecundación h horas agua de sistema agua declorada y descalcificada μL microlitros L litro mm milímetros v/v volumen por volumen BSA albúmina de suero bovino g gramos NaCl cloruro sódico cc centímetros cúbicos F1 solución para mantener la osmolaridad de los gametos mOsm miliosmol ºC grados centígrados min minutos V Ov. Fec. Ovocitos fecundados Ov. Rec. Ovocitos recogidos -. No se recogieron datos del grupo ese día Fec. In. Fecundados iniciales Embr. Ecl. Embriones eclosionados a las 72 hpf * Se evaluó la eclosión a las 96 hpf por lo que fueron descartados del estudio Vivas 5dpf Larvas vivas a los 5 dpf Anormales Larvas anormales a los 5 dpf 7 la existencia de unas 3000 Mb que albergan aproximadamente 25000 genes, un número muy similar al de los seres humanos (CSIC, 2015). Los ratones y los humanos comparten la mayoría de sus funciones fisiológicas y patológicas, de hecho, han sido documentadas numerosas similitudes en sistemas como el cardiovascular, el endocrino, el nervioso, el músculo-esquelético e incluso en el sistema inmunológico (Rosenthal and Brown, 2007). En efecto, en este pequeño animal se reproducen gran variedad de enfermedades humanas, además de posibles terapias para el futuro y ensayos de toxicidad. Inicialmente los estudios con este animal se realizaban generando mutantes naturales mediante cruces endogámicos, pero a partir de la década de los 80, los avances de las técnicas de manipulación genética permitieron la construcción de los primeros ratones genomutados (knock outs) y de los ratones transgénicos (que incorporan genes no propios de su especie)(CSIC,2015), promoviendo el desarrollo de numerosos modelos de patologías humanas para un estudio más exacto de dichas enfermedades, como por ejemplo la diabetes, el cáncer o enfermedades inmunodeficientes como el SIDA. La cercanía con el ser humano, tanto a nivel fisiológico como genético (más del 95% de sus genes tiene un homólogo humano), unido al fácil manejo en el laboratorio, el rápido tiempo de generación, su corta vida media y la abundante descendencia que engendra, han convertido a este animal en el organismo modelo por excelencia. Figura 5. Mus musculus. 1.4. El pez cebra (Danio rerio) como organismo modelo para el estudio de los efectos del envejecimiento en la reproducción Los peces cebra son animales vertebrados y representan un modelo más cercano al hombre que los modelos invertebrados como podría ser D. melanogaster, ya que comparten más características con los humanos a nivel genético, de procesos de desarrollo, anatomía, fisiología o comportamiento. Sin embargo, no son mamíferos y no están tan relacionados a los humanos como lo está el ratón. A pesar de ello, el pez cebra posee unas características que han hecho que haya sido altamente utilizado como modelo para investigar, entre otras cosas, los mecanismos subyacentes de la senescencia gradual en los seres humanos (De Groef et al., 2015; Donnini et al., 2013; Kishi, 2014). Asimismo, también podría ser adecuado para estudiar el efecto de la edad sobre la reproducción ya que además de dar lugar a abundantes puestas de huevos (unos 200300 por semana, alcanza la madurez sexual alrededor de los 3 a 4 meses de edad (Westerfield, 2007) y su promedio de vida se encuentra entre los 31 y 45 meses, lo que hace que puedan ser estudiados en un período de tiempo relativamente corto (Herrera and Jagadeeswaran, 2004). 8 En cuanto a su reproducción, el pez cebra se reproduce mediante fecundación externa, que permite la recopilación sencilla de espermatozoides y óvulos para una fecundación in vitro controlada. Además, los huevos son claros y transparentes, lo que posibilita seguir fácilmente su desarrollo bajo el microscopio, tal y como se observa en la Figura 6, de forma que se pueden separar los huevos fecundados de los que no lo están antes de las 24 horas posteriores a la fecundación (Kimmel et al., 1995). Figura 6. Imágenes del ciclo de vida del pez cebra. Precisamente, el fácil análisis de la viabilidad de la descendencia ha sido uno de los factores determinantes para elegir este animal como posible modelo apropiado para el estudio que se va a llevar a cabo de los cruzamientos entre especímenes de diferentes edades, en comparación a lo que supondría realizar este trabajo en otros modelos animales en los que el análisis sería más costoso y consumiría mucho más tiempo, o en los seres humanos, donde a parte del tiempo y las implicaciones éticas que conlleva, la principal dificultad sería encontrar participantes para el estudio, dada la tendencia natural que tienen los seres humanos a emparejarse con individuos de edad similar. Estas, y otras dificultades, son las que provocan que la mayoría de la literatura publicada en relación a esta problemática esté basada en datos obtenidos a partir de estudios retrospectivos que incluyen factores difíciles de controlar como, por ejemplo, el hecho de que la recopilación de estos datos esté sujeta a la memoria de los participantes respecto a su estilo de vida o historia reproductiva. 9 2. OBJETIVOS Tal como se ha comentado en la introducción, la edad juega un papel de gran importancia a la hora de tener un éxito reproductivo, por ello, en el presente trabajo se tratará de evaluar la influencia de la misma en las capacidades reproductivas utilizando el pez cebra como modelo de estudio. Así, como objetivos principales se encuentran los siguientes:  Por un lado, obtener una mejor comprensión de los efectos que supone la edad de los progenitores sobre la fertilización y el desarrollo embrionario temprano. Para lo cual se procederá al análisis de las tasas de fecundación, eclosión, supervivencia y anormalidad de las crías resultantes de cruzamientos entre peces cebra de diferentes edades.  Por otro, comprobar si es posible extrapolar los resultados obtenidos con el pez cebra a los seres humanos, es decir, determinar si el pez cebra sería un modelo correcto para conseguir la información que se busca, dado que, a priori, las características propias de este animal parecen indicar que lo es. La hipótesis de partida para esta comprobación sería que el rendimiento reproductivo y la calidad de la descendencia sería mayor en los cruzamientos de peces jóvenes en comparación con lo logrado por los peces más maduros. 10 3. MATERIAL Y MÉTODOS 3.1. Diseño experimental Para evaluar los efectos del envejecimiento en la fertilización y el desarrollo embrionario se procedió a la fecundación in vitro de 4 grupos de peces de distintas edades: Macho Joven x Hembra Joven (J x J), Macho Maduro x Hembra Madura (M x M), Macho Joven x Hembra Madura (J x M) y Macho Maduro x Hembra Joven (M x J). La edad de los especímenes jóvenes era de 7 meses post-fecundación, mientras que la de los maduros estaba entre 29 y 31 mpf (aproximadamente 2 años y medio). En cada una de estas combinaciones se analizó la tasa de fecundación (TF) a las 3-4 horas post-fecundación, en la etapa MBT (mid blastula transition), la tasa de eclosión (TE) a las 72 hpf y las tasas de supervivencia (TS) y la de anormalidad (TA), ambas a los 5 días post-fecundación. 3.2. Mantenimiento del pez cebra La colonia de peces cebra fue criada en el laboratorio siguiendo el protocolo descrito en Westerfield (2007). Brevemente, los sujetos de estudio se mantuvieron en tanques de 20 L a 28’5ºC, en una proporción de 3:2 (hembras:machos). Se alimentaron dos veces al día con comida granular suplementada con yema de huevo de gallina y carne de camarón ambas recién descongeladas (Francisco‐Simão et al., 2010) y el ciclo de luz se reguló en 14h de luz / 10 h de oscuridad (Brand et al., 2002; Matthews et al., 2002). Todos los acuarios fueron equipados con un sistema de recirculación de agua con filtros de carbón activo 2 . Además, el agua del grifo se decloró y descalcificó antes de su uso (convirtiéndose en agua de sistema de aquí en adelante). Por último, y de nuevo según las recomendaciones de Westerfield (2007), una cuarta parte del total de agua del acuario se eliminó semanalmente y se reemplazó por agua limpia para evitar concentraciones altas de amonio 3 . Es preciso señalar que todas las condiciones ambientales fueron idénticas en todos los acuarios. Los procedimientos experimentales y de cuidado de los animales en el presente trabajo cumplen plenamente con las normas para el uso de animales establecidas por el Comité Ético de la Universidad Politécnica de Valencia, las directivas de la Comunidad Europea (86/609/EEC y 2003/65/EC) y la legislación española (RD 1201/2005, BOE 252/34367-91, 2005). 3.3. Obtención de gametos inactivos Los peces se reproducen por fecundación externa, cuando aparece el primer estímulo luminoso tras el ciclo de oscuridad, lo que se conoce como “hora del amanecer”, se desencadena la liberación de los gametos al exterior. Primero los peces descienden al fondo de la pecera y posteriormente el macho comienza a perseguir a la hembra en círculos iniciando el ritual de cortejo. Esta persecución recibe el nombre de “bola” y segundos después se produce la expulsión de ovocitos por parte de la hembra y de semen por parte del macho, que se activan al 2 Se trata de un material poroso que sirve para purificar el agua. 3 Las concentraciones altas de amonio causan daño en las membranas de las branquias e inhiben el sistema inmunológico desencadenando enfermedades que pueden causar la muerte de los peces. Aparece a través de la orina y las heces, también como consecuencia de la respiración de los peces. 11 entrar en contacto con el agua de sistema produciéndose la fecundación de los ovocitos al encontrarse con los espermatozoides. Dado que se pretendía realizar una fecundación in vitro, era necesario evitar la liberación de los gametos, puesto que la activación y la fecundación de los mismos se realizaría posteriormente en el laboratorio. Es por ello que la extracción de los gametos se llevó a cabo siguiendo el método descrito por Westerfield (2007), según el cual se recogieron los peces evaluando aquellos que mostraron conducta sexual, teniendo la precaución de capturarlos con el salobre mientras estaban en “bola”. Previamente a la extracción, se sedaron los peces introduciéndolos en una solución de aceite de clavo (100 μL de aceite en 1L de agua de sistema) durante unos minutos, luego se procedió a la extracción. 3.3.1. Recolección de huevos Las hembras se colocaron en una hoja de papel secante y se inmovilizaron con ayuda de la esponja que aparece en la Figura 7. A continuación, se ejerció una presión suave pero firme en el vientre para provocar la salida de los ovocitos al exterior y éstos se recogieron con la ayuda de una cuchara de plástico, teniendo especial cuidado de mantener los ovocitos fuera del alcance de las húmedas escamas de la hembra, ya que el contacto podría provocar la activación de los mismos antes de lo deseado. Figura 7. Esponjas para la inmovilización de los peces durante la recolección. A la izquierda, esponja curvada para las hembras. A la derecha, esponja con una hendidura en el medio para los machos. Solamente los huevos de buena calidad (color amarillo y translúcidos) fueron seleccionados. Se depositaron en una placa Petri de 35 mm con medio F1 4 y se mantuvieron a 8ºC hasta su uso para la fecundación (1h 30 min como tiempo máximo). 4 Medio F1: solución salina tamponada que simula la osmolaridad del interior de la hembra, está suplementada con 1,5% (v / v) de BSA (albúmina de suero bovino) y 0,1 g de NaCl / 100 cc de medio Hanks; ph: 7,4; osmolaridad: 310 a 320 mOsm. 12 3.3.2. Recolección de semen. Para los machos, el procedimiento de recogida de la pecera y sedación fue idéntico, pero a la hora de extraer el semen lo que se hizo fue colocarlos boca arriba en la hendidura de la esponja que aparece en la Figura 7. Primero, el poro genital se secó suavemente para evitar la activación de los espermatozoides y posteriormente, con una mano se presionaron, de forma suave pero firme, los laterales de los peces con unas pinzas para inducir la salida del semen mientras que con la otra mano se sostenía un microcapilar (1 x 90 mm, Narishige Scientific Instrument Lab) pegado al poro genital para recoger el semen expulsado. El esperma de 2-3 machos de la misma edad (unos 0.5-2 μL/macho) se diluyó en 100 μl de F1 en una placa de Petri de 35 mm para mantenerlo inactivo y a continuación la dilución se almacenó como los ovocitos, a 8ºC hasta su uso. Tras la extracción de gametos, los peces se devolvieron a los tanques, no sin antes introducirlos en agua libre de aceite de clavo para que pudieran recuperar la completa movilidad después de haber sido anestesiados. 3.4. Fecundación in vitro En el pez cebra, los ovocitos pierden rápidamente su capacidad de ser fecundados y, además, el tiempo entre la activación completa y la fecundación in vivo son extremadamente cortos (segundos) por lo que se recomienda que no pasen más de 90 min tras la extracción de los gametos para llevar a cabo la fecundación in vitro (Nusslein-Volhard y Dahm 2002). Lo primero que se hizo fue sacar los huevos y el semen inactivos de la nevera. A continuación, se depositaron unas gotas de agua de sistema en las placas que contenían el esperma para ir activando los espermatozoides mientras que, con ayuda de una punta de vidrio y un chupete, se absorbió el F1 de las placas que contenían los huevos, con la precaución de colocar la punta de vidrio de forma perpendicular a la placa para prevenir la absorción accidental de los mismos. Posteriormente, y formando 4 grupos en función de la edad de los peces de los cuales se habían extraído los gametos (Macho Joven x Hembra Joven (J x J), Macho Maduro x Hembra Madura (M x M), Macho Joven x Hembra Madura (J x M) y Macho Maduro x Hembra Joven (M x J)), se fue añadiendo la dilución de espermatozoides a la placa con los huevos libres de F1. Finalmente, para activar los gametos por completo, se añadió a la mezcla huevosesperma de los diferentes grupos de edad 1 mL 5 de agua de sistema a temperatura ambiente. Pasados 2-3 min, el tiempo requerido para que se produzca la fecundación en el pez cebra, las placas se llenaron completamente con agua de sistema y se introdujeron en la incubadora a una temperatura de 28,5ºC. 3.5. Procedimiento de recogida de datos para las distintas tasas a evaluar Las placas se dejaron incubar durante 3-4 horas, tras las cuales se evaluó la tasa de fecundación que había habido, considerando que habían fecundado aquellos cigotos que, 5 Inicialmente se añade sólo 1 mL para aumentar la probabilidad de encuentro entre los gametos. 13 pasado este tiempo, se encontraban en estado de MBT 6 (Figura 8). Los embriones fecundados se trasladaron a placas Petri de 100 mm de diámetro colocando un máximo de 25 embriones por placa. Después, las placas se volvieron a colocar en la incubadora a 28,5ºC. Figura 8. No fecundados vs Fecundados (MBT). Los embriones no se sacaron de la incubadora de nuevo hasta pasadas 72 hpf, momento en el que se evaluó el número de embriones que había eclosionado, ya que lo normal es que en este punto la gran mayoría hubieran eclosionado si hubieran seguido un desarrollo normal. La última valoración se llevó a cabo a los 5 dpf, cuando se procedió a evaluar cuántas larvas seguían vivas y de ellas, cuántas poseían alguna anormalidad, considerándose anormales aquellas con columna vertebral irregular, curly o pericarditis (Figura 9). Figura 9. Anormalidades morfológicas del pez cebra evaluadas. a) control b) curvatura espinal c) curvatura de la cola (curly) d) edema en el saco pericárdico. 6 A partir de este momento la división celular se convierte en asíncrona, el embrión comienza la transcripción de su propio ADN y comienza la expresión diferencial de los genes paternos. 14 3.6. Análisis estadístico Los resultados se analizaron mediante la prueba de Chi-cuadrado (Statgraphics Plus 5.1). Se utilizó la corrección de Yates para continuidad cuando estaba implicado un solo grado de libertad y se consideró que los valores eran estadísticamente diferentes si P < 0,05. La versión extendida del análisis se encuentra en los Anexos. 15 4. RESULTADOS Y DISCUSIÓN DE LOS RESULTADOS 4.1. Tasa de fecundación La tasa de fecundación se calculó dividiendo el total de ovocitos fecundados entre aquellos que fueron recogidos inicialmente, para cada uno de los grupos de estudio. Tabla 1. Datos recogidos para el cálculo de la tasa de fecundación de los grupos de la misma edad. Fecha Ov. Fec. Ov. Rec. Ov. Fec. Ov. Rec. GRUPO Joven x Joven Maduro x Madura 13/01/15 - - 0 35 14/01/15 0 46 73 156 15/01/15 121 252 0 147 16/01/15 - - 0 197 19/01/15 19 181 276 385 20/01/15 - - 53 81 30/01/15 0 90 - - 16/02/15 96 239 - - 17/02/15 18 160 - - 26/02/15 255 369 - - TOTAL 509 1337 402 1001 Tabla 2. Datos recogidos para el cálculo de la tasa de fecundación de los grupos de distintas edades. Fecha Ov. Fec. Ov. Rec. Ov. Fec. Ov. Rec. GRUPO Joven x Madura Maduro x Joven 15/01/15 91 203 - - 20/01/15 35 181 - - 23/01/15 - - 108 445 27/01/15 3 147 114 495 30/01/15 4 95 62 122 02/02/15 23 74 59 90 16/02/15 170 352 - - 17/02/15 - - 20 151 16 19/02/15 - - 3 7 09/03/15 - - 11 202 10/03/15 35 71 - - TOTAL 361 1123 377 1512 Tabla 3. Tasas de fecundación para cada grupo de edad. GRUPO J X J M X M J X M M X J 𝑭𝑬𝑪𝑼𝑵𝑫𝑨𝑫𝑶𝑺 𝑹𝑬𝑪𝑶𝑮𝑰𝑫𝑶𝑺 509 1337 402 1001 361 1123 377 1512 TASA DE FECUNDACIÓN 38’07 %b 7 40’16 %a 32’14 %c 24’93 %d Con los datos obtenidos lo primero que cabe destacar es que las tasas de fecundación fueron bastante bajas en comparación con los resultados obtenidos en otros estudios realizados por el grupo ACUMA (Martínez-Sales et al., 2015), pudiendo ser el agua utilizada (filtro de resinas de intercambio) el motivo de este descenso. Los resultados muestran diferencias estadísticamente significativas entre todos los grupos habiéndose obtenido el mejor resultado en el grupo M x M (40,16%) seguido por el grupo J x J (38,07%). El peor resultado se obtuvo en el grupo M x J (25%) (Véase la tabla 3). A la vista de estos resultados y puesto que las mejores tasas de fecundación se obtuvieron en los grupos de la misma edad, cabría proponer la existencia de una interacción negativa en los grupos en los que macho y hembra eran de distintas edades. 4.2. Tasa de eclosión a las 72 hpf La tasa de eclosión obtenida a las 72 hpf se calculó dividiendo el total de larvas que habían eclosionado entre el total de ovocitos que fueron fecundados inicialmente, para cada uno de los grupos de estudio. Tabla 4. Datos recogidos para el cálculo de la tasa de eclosión (72 hpf) de los grupos de la misma edad. Fecha Embr. Ecl. Fec. In. Embr. Ecl. Fec. In. GRUPO Joven x Joven Maduro x Madura 13/01/15 - - 0 0 14/01/15 0 0 61 73 15/01/15 * * 0 0 7 Diferentes superíndices indican diferencias significativas entre los resultados obtenidos en los distintos grupos de estudio. 23 5. CONCLUSIONES Teniendo en cuenta los resultados globales obtenidos, es posible concluir que las hembras maduras alcanzaron los mejores resultados a través del desarrollo (tasas de supervivencia y de larvas de la eclosión) y la reproducción (tasa de fecundación), lo que significa que no disminuye la calidad de los ovocitos sino que aumenta con la madurez en las hembras de pez cebra, pudiendo ser debido al crecimiento parabólico de reptiles y peces que difiere del crecimiento sigmoide que experimentan los mamíferos (Balinsky, 1960). Estos resultados contrastan con los de los seres humanos, donde la edad avanzada en las mujeres es un factor limitante de la viabilidad de la descendencia (Aitken, 2014). En los seres humanos, el declive reproductivo es diferente en machos y hembras. En cuanto a la hembra, la fertilidad desciende precipitadamente entre las edades de 31 y 42 años (Fertilización Humana y Embriología, 2010) y finaliza con la pérdida de la menstruación, mientras que en la masculina no hay pérdida abrupta de la fertilidad, aunque la calidad de sus gametos se deteriora (Das et al., 2013). Ciertamente, el proceso de maduración y envejecimiento está más limitado en las hembras humanas que en los peces, o incluso que en otros mamíferos, donde las hembras maduras son capaces de reproducirse en edades avanzadas (Jones et al., 2014). Por lo tanto, y en resumen, a pesar de que el pez cebra puede ser utilizado ampliamente en la búsqueda de los orígenes evolutivos y de desarrollo del fenómeno del envejecimiento común en los vertebrados (Kishi, 2014), teniendo en cuenta los resultados dispares obtenidos en el trabajo actual y por otros autores, el pez cebra no parece ser un modelo adecuado para estudiar el efecto del envejecimiento sobre la reproducción para poder extraer conclusiones aplicables a los seres humanos, especialmente en las hembras. Más estudios son necesarios en esta temática en relación al pez cebra. Al respecto, una posible línea de investigación que debería seguir a la ya comenzada sería un estudio más exhaustivo de la viabilidad de las crías, puesto que en el presente trabajo debido al tiempo se valoraron sólo parámetros tras 5 días post fecundación, pero sería muy interesante por ejemplo haber podido estudiar las capacidades reproductivas de esta generación, así como de una segunda generación de peces. 24 6. REFERENCIAS BIBLIOGRÁFICAS ADAMS, M. D., CELNIKER, S. E., HOLT, R. A., EVANS, C. A., GOCAYNE, J. D., AMANATIDES, P. G., ... and GEORGE, R. A. (2000). The genome sequence of Drosophila melanogaster. Science, 287(5461), 2185-2195. AMERICAN COLLEGE OF OBSTETRICIANS AND GYNECOLOGISTS, 2014. Female age-related fertility decline. Committee Opinion No. 589. Fertil Steril, 101(3), 633-634. ARIAS, A. M. (2008). Drosophila melanogaster and the development of biology in the 20th century. Drosophila: Methods and Protocols, 1-25. BAILEY, M.J. 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Datos de las tasas de fecundación para análisis estadístico. 1  fecundados; 0  no fecundados TF 1 0 J x J (A) 509 1137*100 = 38.07% 509 628 J x V (B) 361 1123*100 = 32.14% 361 762 V x J (C) 377 1512*100 = 24.93% 377 1135 V x V (D) 402 1001*100 = 40.16% 402 599 Primero se comparan todos los grupos y luego se van comparando de dos en dos si el resultado es que son estadísticamente diferentes entre sí. A – B – C – D  P < 0.05 (Diferentes significativamente), a partir de ahora se hablará de Dif. o No dif. dependiendo de si son o no estadísticamente distintos. A – B  Dif. (0.0003) B – C  Dif. (0.0015) C – D  Dif. (0.0001) A – C  Dif. (0.0026) B – D  Dif. (0.0028) A – D  Dif. (0.0350) Ab Bc Cd Da 38.07% 32.14% 24.93% 40.16% Tabla 14. Datos de las tasas de supervivencia para análisis estadístico. 1  vivos; 0  no vivos TS 1 0 J x J (A) 328 509*100 = 64.44% 328 181 J x V (B) 307 361*100 = 85.04% 307 54 V x J (C) 294 377*100 = 77.98% 294 83 V x V (D) 342 402*100 = 85.07% 342 60 A – B – C – D  P < 0.05 (Diferentes significativamente) A – B  Dif. (0.0002) B – C  Dif. (0.0033) C – D  Dif. (0.0032) 30 A – C  Dif. (0.0028) B – D  No Dif. (0.4130) A – D  Dif. (0.0001) Ac Ba Cb Da 64.44% 85.04% 77.98% 85.07% Tabla 15. Datos de las tasas de anormalidad para análisis estadístico. 1  anormales; 0  no anormales TA 1 0 J x J (A) 166 509*100 = 32.61% 166 343 J x V (B) 105 361*100 = 29.08% 105 256 V x J (C) 151 377*100 = 40.05% 151 226 V x V (D) 137 402*100 = 34.08% 137 256 A – B – C – D  P < 0.05 (Diferentes significativamente) A – B  No dif. (0.3010) B – C  Dif. (0.023) C – D  No Dif. (0.1573) A – C  Dif. (0.0260) B – D  No Dif. (0.1055) A – D  No Dif. (0.5230) Ab Bb Ca Dab 32.61% 29.08% 40.05% 34.08% Tabla 16. Datos de las tasas de eclosión para análisis estadístico. 1  eclosionados; 0  no eclosionados TE 1 0 J x J (A) 199 369*100 = 53.92% 199 170 J x V (B) 222 270*100 = 82.22% 222 48 V x J (C) 290 377*100 = 76.92% 290 87 V x V (D) 338 402*100 = 84.08% 338 64 A – B – C – D  P < 0.05 (Diferentes significativamente) A – B  Dif. (0.0056) B – C  No dif. (0.1241) C – D  Dif. (0.0149) 31 A – C  Dif. (0.0048) B – D  No dif. (0.5976) A – D  Dif. (0.0013) Ab Ba Cab Da 53.92% 82.22% 76.92% 84.05% 7.2. Índice de fuentes de las figuras Figura 1. Pixabay. https://pixabay.com/es/koli-bacterias-escherichia-coli-123081/ Figura 2. Wikipedia. https://es.wikipedia.org/wiki/Saccharomyces_cerevisiae Figura 3. Wikipedia. https://en.wikipedia.org/wiki/Caenorhabditis_elegans Figura 4. Shutterstock: http://www.yourgenome.org/stories/fruit-flies-in-the-laboratory Figura 5. http://larasplagas.es/raton-comun.php Figura 6. Imagen de Rojas-Muñoz et al., 2007. Figura 7. Imagen de modificación propia obtenida de Gardiner, 2014. Figura 8. Elaboración propia. Figura 9. Imagen de modificación propia obtenida de Fogelgren et al. 2011 y Si et al., 2013. Figura 10. Emaze. https://www.emaze.com/@ACFRLOZI/FOTO-DE-PORTADA Figura 11. INSTITUTO NACIONAL DE ESTADÍSTICA.http://www.ine.es/jaxiT3/Datos.htm?t=1579