El nucléolo como sensor de estrés oxidativo. Implicaciones en patologías progeroides

UNIVERSITAT POLITÈCNICA DE VALÈNCIA Escuela Técnica Superior de Ingeniería Agronómica y del Medio Natural (ETSIAMN) Departamento de Biotecnología El Nucléolo como Sensor de Estrés Oxidativo. Implicaciones en Patologías Progeroides TRABAJO FIN DE MÁSTER EN BIOTECNOLOGÍA BIOMÉDICA ALUMNO/A: Carmen Mª Picher Latorre DIRECTOR/A: Gisselle Pérez Machado TUTOR/A UPV: María Adelaida García Gimeno Curso Académico: 2016-2017 VALENCIA, 7 de julio de 2017 2 Agradecimientos Quiero agradecer al Dr. Federico Pallardó y al grupo de investigación del Centro de Investigaciones Biomédicas en Red de enfermedades raras (CIBERER) de la Facultad de Medicina por haberme permitido participar en el Proyecto FIS (Fondo de investigación en Salud) sobre “Respuestas epigenéticas a cambios en el entorno redox nuclear. Posibles dianas terapéuticas en enfermedades raras”. Sobre todo, quiero dar las gracias a mi directora del TFM, la Dra. Gisselle Pérez. Confió en mí y me ayudó a sacar adelante con creces este trabajo. Tuvo la paciencia suficiente para enseñarme cuando estaba perdida y a la hora de trabajar siempre consiguió transmitirme su buen humor y sus ganas de hacer las cosas bien. Porque contigo Gisselle, he aprendido mucho más de lo que se aprende leyendo un protocolo o un libro de texto. Gracias por confiar en mí y por ser tan meticulosa, porque las cosas o se hacen bien o no se hacen. Contigo no solo he ganado a una mentora y compañera de trabajo, sino también a una gran amiga. Por todo esto y más, millones de gracias, y aun así me quedo corta expresando toda mi gratitud. A mi tutora de la UPV, la Dra. Ada García, gracias también por resolverme siempre las dudas que me iban surgiendo. A los que han sido mis compañeros de laboratorio durante estos meses, a Ester por ayudarme en los primeros días, contigo también encontré una amiga; a Guillermin porque siempre logra sacarme una sonrisa y estuvo dispuesto a ayudar en todo momento; a Santi porque me ayudó en la aventura del silenciamiento, y he comprendido que “el camino a todas las cosas grandes pasa por el silencio” (Friedrich Nietzsche), Marta, a Carlos y a Pili, porque también me ayudaron cuando lo necesitaba, y a Jesús y Laura por hacer más divertida la estancia en el laboratorio. Espero que, aunque ya no esté rondando por ahí se sigan haciendo torradas y alguna que otra cena de celebración. Por cierto, tenemos pendiente una paella. También quiero agradecer a Diana por haber tenido la paciencia y las ganas de enseñarme aun cuando estaba en la recta final de su doctorado. Gracias a ti he descubierto el mundo de la microscopia y confío en seguir formándome en él. Espero que disfrutes mucho esta nueva etapa de tu vida en Holanda. Y por supuesto, de nuevo, al jefe de grupo, el Dr. Federico Pallardó que también confió en mí y me permitió realizar este trabajo poniendo a mi disposición los medios necesarios para llevarlo a cabo. A todos, gracias. 3 El Nucléolo como Sensor de Estrés Oxidativo. Implicaciones en Patologías Progeroides Resumen El nucléolo es un compartimento muy especializado dentro del núcleo, cuya función principal es la biogénesis de ribosomas. Pero en los últimos años se ha observado que éste participa en otros procesos biológicos, destacándose su respuesta a distintos tipos de estrés celular. La disrupción de la integridad nucleolar se ha asociado con estrés oxidativo nucleolar y con la aparición de varias patologías, sin embargo, esta relación no ha sido muy explorada en las enfermedades raras progeroides. El objetivo del trabajo fue evaluar si, el silenciamiento de genes del complejo telomerasa (DKC1 y NOP10) y telosoma (TINF2), mutados en disqueratosis congénita, producen un estrés oxidativo que sea detectable por cambios morfológicos, o en los niveles de expresión y distribución de proteínas nucleolares. Los modelos con DKC1 y NOP10 silenciados presentaron niveles bajos de expresión de las subunidades ribosomales 45s y 18s, co-localización de la proteína NPM1 con GSTP en el núcleo y translocación de NPM1 al nucleoplasma. No apreciamos estos eventos en células silenciadas para TINF2. Los resultados obtenidos parecen indicar que los genes DKC1 y NOP10 producen un estrés nucleolar por estrés oxidativo además de por fallos en la biogénesis ribosomal. Abstract The nucleolus is a very specialized compartment inside the nucleus which its main function is the ribosomal biogenesis. However, in recent years it has been observed to attend in other biological processes, highlighting the response to different types of cellular stress. Nucleolar disruption has been associated with nucleolar oxidative stress and with the appearance of several pathologies, nevertheless, this relationship has not been explored in rare progeroid diseases. This work aims to evaluate whether the silencing of genes of telomerase complex (DKC1 and NOP10) and telosome (TINF2), mutated in dyskeratosis congenita, produce an oxidative stress detectable by nucleolar morphological changes and by alterations in the expression and distribution of its proteins. Models with silenced DKC1 and NOP10 showed low expression levels for the ribosomal subunits 45s and 18s, co-localization of NPM1 and GSTP in the nucleus and translocation of NPM1 to the nucleoplasm. These events were not appreciated in the TINF2 depleted cells. The results suggested that DKC1 and NOP10 genes produce a nucleolar oxidative stress in addition to ribosomal biogenesis failures. Palabras clave: nucléolo, NPM1, GSH, GSTP, disqueratosis congénita, ribosomopatía, progeroide Keywords: nucleolus, NPM1, GSH, GSTP, dyskeratosis congenita, ribosomopathy, progeroid 4 Índice 1. Abreviaturas .......................................................................................................... 5 2. Introducción ................................................................................................................ 7 Nucléolo.................................................................................................................................... 7 Estructura nucleolar y transcripción de genes ribosómicos .................................................. 8 Proteínas nucleolares ............................................................................................................ 9 El nucléolo como sensor de estrés ...................................................................................... 10 Implicaciones en enfermedades .......................................................................................... 12 Disqueratosis congénita ........................................................................................................ 12 Sistemas antioxidantes. Implicaciones del glutatión y GSTP ........................................... 15 Glutatión (GSH) ................................................................................................................. 15 Glutatión S-transferasa pi (GSTP) ...................................................................................... 16 Papel de los sistemas antioxidantes en el estrés nucleolar ................................................. 17 3. Hipótesis .................................................................................................................... 18 4. Objetivos .................................................................................................................... 18 5. Materiales y Métodos ............................................................................................... 19 Cultivo celular ....................................................................................................................... 19 Silenciamiento génico mediante ARNi ................................................................................ 19 Cuantificación de expresión génica ..................................................................................... 21 Tratamientos ......................................................................................................................... 23 Estudio de viabilidad celular (método de tinción por exclusión) ...................................... 24 Ensayo citotóxico. Sulforodamina B ................................................................................... 24 Determinación de niveles de GSH y del cociente GSSG/GSH .......................................... 25 Estudio de la morfología nucleolar ...................................................................................... 26 Inmunofluorescencia ............................................................................................................ 27 Obtención de extractos proteicos ......................................................................................... 27 Cuantificación de proteínas por el método Bradford ........................................................ 28 Análisis de expresión de proteínas por Western-Blot ........................................................ 29 Análisis estadistico ................................................................................................................ 30 6. Resultados ................................................................................................................. 31 Caracterización de los modelos celulares ........................................................................... 31 Estudio de los niveles de expresión de 45s y 18s en las células silenciadas ...................... 32 Estudio de la morfología nucleolar ...................................................................................... 32 Localización mediante microscopía confocal de GSTP y NPM1 en los modelos de silenciamiento ........................................................................................................................ 34 Estudio de viabilidad y citotoxicidad de Diamida y H2O2 en células HeLa ..................... 36 Evaluación de los niveles de GSH y del cociente GSSG/GSH en las células silenciadas tratadas con Diamida y H2O2 ............................................................................................... 37 Estudio de la expresión proteica de GSTP y NPM1 en los extractos nucleolares ........... 38 7. Discusión .................................................................................................................... 41 8. Conclusiones .............................................................................................................. 48 9. Limitaciones .............................................................................................................. 49 10. Perspectivas futuras .............................................................................................. 49 11. Bibliografía .............................................................................................................. 50 5 1. Abreviaturas Act. D: actinomicina D ADN: Ácido desoxirribonucleico ADNc: ADN complementario ADNr: ADN ribosomal ARF: Alternative Reading frame protein ARN: Ácido ribonucleico ARNi: ácido ribonucleico interferente ARNm: Ácido ribonucleico mensajero ARNr: ARN ribosomal BSA: Seroalbúmina bovina CF: centro fibrilar CFD: componente fibrilar denso CG: componente granular CIBERER: Centro de Investigaciones Biomédicas en Red de Enfermedades Raras CI50: concentración inhibitoria 50 CT: cycle threshold DC: Disqueratosis congénita DKC1: gen que codifica para la proteína disquerina DMEM: Medio Mínimo Esencial de Eagle EROs: Especies Reactivas de Oxígeno FBL: fibrilarina Gpx: Glutatión peroxidasa GR: glutatión reductasa GSH: Glutatión GST: glutatión S-transferasas GSTP: glutatión S-transferasa pi GSSG: Disulfuro de glutatión HPGS: Hutchinson-Gilford progeria syndrome HeLa: línea celular de adenocarcinoma cérvico-uterino HPLC: cromatografía líquida de alta eficacia hTERC: componente de ARN de la telomerasa humana hTERT: componente catalítico de la telomerasa humana H2O2: Peróxido de hidrógeno IFI: inmunofluorescencia indirecta ITS2: segundo espaciador interno transcrito MDM2: murine doble minute 2 NCL: nucleolina NOP10: Gen que codifica para la proteína NOP10 NORs: regiones organizadoras nucleolares NPM1: nucleofosmina PBS: Tampón fosfato salino PMSF: fenilmetilsulfonilo 6 qPCR: Reacción en cadena de la polimerasa a tiempo real RISC: RNA-induced silencing complex RNPs: ribonucleoproteínas RT: retrotranscripción RT-qPCR: Reacción en cadena de la polimerasa con transcritasa reversa RRMs: motivos de reconocimiento de ARN SDS: Dodecilsulfato sódico SDS-PAGE: Electroforesis en gel de poliacrilamida con SDS SFB: Suero fetal bovino siDKC1: Población celular con el gen DKC1 silenciado siNOP10: Población celular con el gen NOP10 silenciado siTIN2: Población celular con el gen TINF2 silenciado snARNs: ARNs pequeños nucleares snoRNP: pequeñas ribonucleoproteinas nucleolares SRB: sulforodamina B SSA: ácido 5-sulfosalicílico TBS-Tween: Tampón fosfato salino con Tween TCA: ácido tricloroacético TEMED: Tetrametiletildiamina TERC: Gen que codifica para la proteína hTERC de la telomerasa TERT: Gen que codifica para la proteína hTERT de la telomerasa TIN2: TRF1-interacting nuclear factor 2 TINF2: Gen que codifica para la proteína TIN2 TRIS: Hidoximetilaminoetano UV: ultravioleta 7 2. Introducción Las células están sometidas de forma continua a condiciones de estrés que desencadenan respuestas compensadoras. La naturaleza y gravedad del estrés celular determina que vías de señalización se activan y el tipo de respuesta (detención del ciclo celular, apoptosis o reorganización de la arquitectura nuclear, etc.). El nucléolo es un orgánulo nuclear que destaca por su alto dinamismo estructural y funcional; lo que se traduce en un intercambio permanente con el nucleoplasma y con otros cuerpos nucleares en función de los diversos estados de la célula y los cambios extracelulares 1–3. Es ese papel en la coordinación de la respuesta rápida al estrés celular el que lo reposiciona en el epicentro de atención de los estudios moleculares 4. Nucléolo El nucléolo es una estructura supramolecular densa no membranosa localizada en el núcleo de las células eucariotas. Esta estructura puede variar en tamaño, forma y número en diferentes tejidos dentro del mismo organismo. Su compleja arquitectura es una consecuencia de su participación en la síntesis de ARN ribosomal (ARNr), y en el procesamiento y ensamblaje de las subunidades ribosomales 1,2. La biogénesis ribosomal es la principal función del nucléolo, pero no la única. Análisis proteómicos han permitido identificar muchas proteínas nucleolares que participan en diversos procesos celulares, tales como: replicación vírica, modificación de ARNs pequeños nucleares (snARN), ensamblaje de ribonucleoproteínas (RNPs) 4, apoptosis, actividad telomerasa, estabilidad de p53 3, envejecimiento, regulación del ciclo celular, secuestro de moléculas reguladoras, y como sensor de estrés celular 5. Se localiza alrededor de regiones cromosómicas que contienen repeticiones en tándem de genes de ADN ribosomal (ADNr), denominadas regiones organizadoras nucleolares (NORs) 1,3. Estas regiones se encuentran en los brazos cortos de los cromosomas acrocéntricos (en humanos en los cromosomas 13, 14, 15, 21 y 22) 1 y codifican para el pre-ARNr 45s 6. Solo la mitad de las repeticiones de ADNr se transcriben activamente durante la interfase mientras que el resto se encuentra transcripcionalmente inactivo, pero todas residen dentro del nucléolo. Estas dos clases de clusters de ADNr difieren entre ellas por su organización de la cromatina, por las marcas epigenéticas y por las proteínas asociadas 1. 8 Estructura nucleolar y transcripción de genes ribosómicos El nucléolo humano en interfase presenta una estructura tripartita que refleja la compartimentación de las diferentes etapas de la biogénesis ribosomal (Fig. 1). Las partes que lo componen son: los centros fibrilares (CF), el componente fibrilar denso (CFD) y el componente granular (CG) 1,2. Cada uno de estos compartimentos está relacionado con un paso especifico de la biogénesis de las subunidades ribosomales. La transcripción del ADNr ocurre en loci activos de ADNr dentro de los CF o en el borde de la región CF/CFD en repeticiones en tándem de genes que surgen como bucles radiales de ADNr más condensado dentro de esta región, dando lugar al pre-ARNr 45s 7. Este pre-ARNr puede ser procesado y modificado de diferentes formas por las ribonucleoproteínas nucleolares pequeñas (snoRNPs) y por factores de procesamiento proteico en la región CFD, para generar las ARNr 28S, 18S y 5.8S 1, que junto con el ARNr 5s constituyen el core catalítico de los ribosomas 6. Estas modificaciones mediadas por los snoRNPs incluyen la 2’-O-metilación de la ribosa y la pseudouridilación 1. Figura 1. Ilustración de la biogénesis de las subunidades ribosomales en el nucléolo de mamíferos 1. 9 Posteriormente, los ARNr 28S, 18S y 5,8S se ensamblan con RNPs para dar lugar a las subunidades ribosomales pre-40s (subunidad menor) y pre-60s (subunidad mayor) que maduran y se ensamblan en las regiones CFD y CG antes de ser liberadas del nucléolo. Los últimos pasos de la biogénesis ribosomal ocurren en el nucleoplasma antes de ser transportados al citoplasma 1,4. El nucléolo va sufriendo modificaciones a lo largo de toda la interfase. Durante la fase G1 es pequeño y presenta pocos CF y abundante CFD con una actividad moderada, mientras que en la fase G2 empiezan a aparecer múltiples y pequeños CF y abundante CG, lo que conlleva también un aumento en su tamaño y actividad. Pero, durante la transición G2/M, el nucléolo comienza a desensamblarse progresivamente hasta desaparecer cesando los procesos de transcripción y procesamiento ribosómico 5. Proteínas nucleolares Aproximadamente unas 250 proteínas nucleolares no ribosomales controlan las diferentes etapas de la biogénesis ribosomal actuando como factores de ensamblaje ribosomal, pero se encuentran ausentes en el ribosoma ya maduro. Específicamente, actúan como nucleasas, helicasas o chaperonas para mediar los numerosos eventos de ensamblaje y procesamiento 7. Además, actúan de diana de otros factores que participan en el control y regulación de la actividad celular 5. Nucleolina (NCL)/C23 Es de las proteínas más abundantes dentro del nucléolo, puede llegar a representar hasta el 10% de las proteínas nucleolares3,8. Es una fosfoproteína multifuncional codificada por el gen NCL humano, localizado en el cromosoma 2 9. Contiene cuatro motivos de reconocimiento de ARN (RRMs) que permiten su unión a las estructuras de stem-loop dentro del pre-ARNr, actuando así como chaperona tanto para el correcto plegamiento del ARN como para el ensamblaje de los ribosomas 7. Por todo ello, la nucleolina está muy asociada con la proliferación y el crecimiento celular 10. Además, diversos estudios indican que se une a la cromatina nucleolar, participando en la transcripción de la ARN pol I, y que transporta al citoplasma las partículas ribosómicas 5,11. La actividad de la nucleolina se regula normalmente por su localización intracelular y las modificaciones post-traduccionales, incluyendo la fosforilación, la metilación y la ADPribosilación 10. Se localiza principalmente en la región CFD del nucléolo. Aunque una pequeña porción también ha sido detectada en la región CG de los eucariotas 9,12. 16 El GSH no solo participa en la detoxificación de compuestos, también puede participar en las señales de transducción, en la maduración espermática, en la expresión génica o en la apoptosis, además de en otra plétora de reacciones celulares 34. Glutatión S-transferasa Pi (GSTP) El glutatión S-transferasa Pi (GSTP) fue inicialmente aislado de la placenta, se encuentra en todos los mamíferos y se expresa en altos niveles especialmente en ciertos cánceres y en células tumorales resistentes a fármacos. En un principio se consideró a GSTP citosólica, pero también se ha descrito su presencia en el núcleo o la mitocondria 35. Se describió originalmente como una enzima de detoxificación de fase II, pero también presenta funciones de chaperona no catalíticas que regula varias quinasas. También puede actuar como una glutationilasa en la S-glutationilación post-traduccional de las proteínas. La reacción de Sglutationilación se produce en los residuos de cisteínas de las proteínas en ambientes de bajos pKa, formando un enlace disulfuro con el GSH, en un ciclo reversible y dinámico que actúa como un segundo nivel de regulación en varios procesos celulares (Fig. 5B). Cuando las células se ven expuestas a un estrés celular como el originado por los EROs, la S-glutationilación es capaz de proteger a las células contra el daño oxidativo irreversible, una posterior de-glutationilación puede restaurar la proteína a su estado nativo 35. Figura 5. (A) Ciclo redox del glutatión. (B) Papel del glutatión S-transferasa en la s-glutationilación. 17 Papel de los sistemas antioxidantes en el estrés nucleolar Se ha observado que en situaciones de estrés nucleolar se desencadena diferentes mecanismos redox en los que participa el GSH y la GSTP para compensar esta situación. En un estudio llevado a cabo en 2016 por investigadores de la escuela de medicina Shanghai Jiao Tong, se demostró que durante la oxidación nucleolar se produce la s-glutationilación de la proteína nucleolar NPM1, y uno de los factores que podrían actuar como glutationilasa en esa reacción sería la GSTP (Fig. 6). Estos datos permiten relacionar la oxidación nucleolar con enzimas detoxificadoras, haciendo patente también el papel que juega el GSH y el GSTP en los diferentes procesos de estrés nucleolar para mantener la homeostasis celular. Figura 6. Detección del estrés nucleolar por NPM1. La oxidación nucleolar es una respuesta general a varios tipos de estrés celular. Durante la oxidación nucleolar, la NPM1 sufre una s-glutationilación en la cisteína 275, provocando que esta se disocie de los ácidos nucleicos nucleolares. De esta forma, NPM1 permite la activación de p53 inducida por estrés nucleolar 14. 18 3. Hipótesis La principal y más reconocida función del nucléolo es su papel en la biogénesis de ribosomas. Sin embargo, recientemente se ha aceptado que la oxidación nucleolar es una respuesta al estrés celular. La disfunción nucleolar se posiciona en la fisiopatología de varias enfermedades, como es el caso de DC, no obstante, queda por dilucidar si mutaciones en genes nucleolares relevantes en DC también contribuyen al desequilibrio redox y si el nucléolo puede ser un sensor del estrés oxidativo en esta patología. Por todo esto, nos planteamos la siguiente hipótesis: El estudio de parámetros nucleolares morfológicos y funcionales permite detectar la presencia de estrés oxidativo y dilucidar si los genes DKC1, NOP10 y TINF2 están asociados al desequilibrio redox. 4. Objetivos En el grupo de investigación del Centro de Investigaciones Biomédicas en Red de enfermedades raras (CIBERER) se estudia la fisiopatología de enfermedades raras progeroides y en particular los eventos relacionados con el estrés oxidativo. DC figura entre las patologías de interés, por lo cual se han generado modelos celulares de silenciamiento transitorio para los genes DKC1, NOP10 y TINF2 (siDKC1, siNOP10 y siTIN2) implicados en DC. Basándonos en estos precedentes, nos planteamos como objetivo general: Evaluar varios parámetros nucleolares en los modelos celulares siDKC1, siNOP10 y siTIN2 en diferentes condiciones de estrés oxidativo. De forma específica • Optimizar el silenciamiento para los modelos siDKC1, siNOP10 y siTIN2 en varias escalas. • Evaluar la morfología nucleolar en células NIH3T3, HeLa y en modelos siDKC1, siNOP10 y siTIN2 a través del kit “CytoPainter Nucleolar Staining”. • Estudiar expresión de proteínas ribosomales y patrón de distribución de proteínas nucleolares no ribosomales en los modelos silenciados. • Estudiar niveles de GSH en los modelos siDKC1, siNOP10 y siTIN2 tratados con Diamida y H2O2. • Obtener extractos nucleolares para estudiar expresión proteica de GSTP y NPM1. 19 5. Materiales y Métodos Cultivo celular Las células utilizadas en este estudio corresponden a la línea celular de adenocarcinoma cérvicouterino (HeLa) y a fibroblastos de ratón (NIH 3T3). Estas líneas estables de tipo adherente fueron cultivadas en frascos de 75 cm2 (cultivo de mantenimiento) a una densidad de siembra de 2,1x106 o (28,000 células/cm2) en medio de cultivo Dulbecco’s modified Eagle Medium (DMEM) (Biowest, Riverside, MO, EE.UU.) suplementado con 10% de suero bovino fetal (SBF) (Biowest, Riverside, MO, EE.UU.), 1% de penicilina/estreptomicina (Biowest, Riverside, MO, EE.UU.) y 1% de L-Glutamina (Biowest, Riverside, MO, EE.UU.). Los cultivos se mantuvieron a 37ºC en una atmósfera de CO2 al 5% humidificada (Incubadora NUAIRE, NU-4750E CO2). Tanto la preparación de los medios como la manipulación de las células se realizaron en condiciones de asepsia utilizando cabinas de flujo laminar vertical de seguridad biológica tipo II (Telstar®). Se comprobó por técnica de PCR que las células estaban libres de contaminación por micoplasma. Las células se resembraron al alcanzar un 80-90% de confluencia, para ello la monocapa se despegó por tripsinización con 1,5 ml de tripsina (0,25 % tripsina - EDTA 1 mM en HBSS pH 8,0 con Rojo Fenol; Biowest, Riverside, MO, EE.UU.) 2 minutos a 37°C. Después se recogieron con 8 ml de DMEM completo (10% SBF, 1% glutamina, 1% P/S), se centrifugaron a 750 rpm durante 3 min y se resuspendió el botón celular en 1 ml de medio de cultivo para su conteo en cámara de Neubauer. Todos los experimentos se realizaron en las instalaciones del Servicio de Cultivos Celulares del Laboratorio CIBER de la Universidad de Valencia. Silenciamiento génico mediante ARNi Para llevar a cabo el silenciamiento se empleó la tecnología del ARN de interferencia (ARNi), específicamente se realizó una transfección directa usando la lipofectamina RNAiMAX (Invitrogen, Ref: 13778-150), como agente transfectante. La lipofectamina es un reactivo que permite la formación de liposomas gracias a los lípidos catiónicos que se unen con el ARNi con cargas aniónicas. Los liposomas se fusionan con la membrana plasmática de la célula, permitiendo así la entrada del ARNi al interior celular. Las proteínas Argonautas del complejo RISC (siglas en inglés RNA-induced silencing complex) se ensamblan con el ARNi se usa como guía para identificar el ARN mensajero complementario y cataliza el corte del mensajero en dos mitades ocasionando su degradación nucleolítica, bloqueando la expresión génica. Se diseñó el experimento con cinco grupos: 20 • Grupos 1-3 (siGen interés): siARN validados para los genes de interés siDKC1 (ID: s4111, Ambion, CO), siNOP10 (ID: 215701, Ambion, CO) y siTINF2 (ID: s25355, Ambion, CO). • Grupo 4 (siCONTROL): siARN no diana (Cat: AM4635, Silencer Negative Control siARN #1, Ambion). Como control del procedimiento de transfección. • Grupo 5 (MOCK): lipofectamina, como control del agente de transfección. Para conseguir el silenciamiento tanto a nivel génico como proteico se empleó un método de silenciamiento secuencial de dos días consecutivos. Cultivo de las células El silenciamiento se llevó a cabo en placas multipocillos de tres formatos (8, 6 y 12 pocillos), según la finalidad del experimento. La densidad celular de siembra fue de 50.000 en placas de 8 pocillos, 100.000 células en las placas de 12 pocillos y 200.000 en las de 6 pocillos. Silenciamiento génico (24 h de cultivo) Preparación de reactivos de transfección Se preparó la lipofectamina y luego las soluciones stock siARN correspondientes a los grupos de tratamiento (concentración 20 µM). De cada grupo se prepararon 2 réplicas. Tabla 1: Preparación de los reactivos de transfección. Formato de 12 pocillos Grupo 1-3 siGen de interés Grupo 4 siCONTROL Grupo 5 MOCK Lipofectamina 123 µl DMEM s/ suplem. y 2 µl lipofectamina Tratamientos 118,75 µl DMEM s/suplem. y 6,25 µl de siDCK1 siNOP10 y siTIN2 (1 µM) 122.5 µl DMEM s/suplem. y 2,5 µl de siCONTROL 125 µl DMEM s/suplem. Formato de 8 pocillos Lipofectamina 61,5 µl DMEM s/ suplem. y 1 µl lipofectamina Tratamientos 178,13 µl DMEM s/suplem. y 9,38 µl de siDCK1 siNOP10 y siTIN2 183,75 µl DMEM s/ suplem. y 3,75 µl siCONTROL 187,5 µl DMEM s/suplem. Formato de 6 pocillos Lipofectamina 246 µl DMEM s/ suplem. y 4 µl lipofectamina Tratamientos 238 µl DMEM s/suplem. y 12,4 µl de siDCK1 siNOP10 y siTIN2 244 µl DMEM s/ suplem. y 6,2µl siCONTROL 250 µl DMEM s/suplem. 21 Tras 5 minutos de reposo la mezcla de silenciamiento se obtuvo vertiendo la lipofectamina, con ayuda de la micropipeta, sobre los tubos de soluciones stock de ARNi, y se resuspendió suavemente. La mezcla se dejó reposar durante 20 minutos a temperatura ambiente para conseguir la formación de los liposomas (con ARNi a concentración de 0,5 µM). Silenciamiento A las 24 h de cultivo los pocillos se lavaron dos veces con DMEM sin suplementar y finalmente se añadió 2 ml de medio DMEM sin suplementar por pocillo en la placa de 6, 1 ml para la de 12 pocillos y 500 µl de DMEM sin suplementar en la placa de 8 pocillos. Pasados los 20 minutos, se goteó el contenido de la mezcla de silenciamiento sobre su correspondiente pocillo (concentración final de ARNi en pocillo de 100 nM). Las placas se incubaron a 37ºC y 5% de CO2 durante 5 horas. Posteriormente, se eliminó el medio y se añadió DMEM con 10% de SBF. 2º Silenciamiento génico (48 h cultivo) Tras las 24h de la primera transfección, se llevó a cabo el segundo silenciamiento. Se siguió el mismo protocolo que el día anterior, a excepción de que, tras las 5 horas de incubación con la mezcla de silenciamiento, se añadió el medio DMEM suplementado con 10% de SBF y 1% de Penicilina/Estreptomicina. Cuantificación de expresión génica La cuantificación de la expresión génica se realizó por reacción de PCR de transcripción inversa cuantitativa (siglas en inglés RT-qPCR), usando la técnica de sondas taqman (Taqman Gene expresssion assays (Life Technologies, Carlsbad, CA, EE. UU)) en unos casos y el método de SYBR Green para otros. Para ambos casos se extrajo ARN empleando el kit NucleoSpin® ARN/Protein, (Macherey-Nagel, Düren) a partir de células cultivadas en placas de 12 pocillos y 24 h posteriores a la última transfección. Se procedió según las instrucciones proporcionadas por el fabricante. El ARN purificado se cuantificó con el Nanodrop 2000 spectrophotometer (Thermo Fisher Scientific, Waltham, MA, EE.UU.). Se utilizó como blanco 1 µL de agua libre de ARNsas, igual volumen se usó para medir la absorbancia a 260 nm. Las muestras fueron conservadas a -80°C. A partir de este ARN se obtuvo el ADN complementario (ADNc) por retrotranscripción (RT). 22 Técnica Taqman La reacción se realizó en placa de 96 pocillos, y se añadió a cada uno 10 μL de la muestra de ARN (200 ng) y 10 μL de mezcla de PCR (10xRT buffer (2 μL), 25x dNTP Mix 100mM (2 μL), 10x Random primers (0,8 μL), multiscribe reverse transcriptasa (1 μL) y agua libre de nucleasas (4,2 μL)) (HighCapacity cADN Archive kit, Applied Biosystems, Foster City, CA, EE.UU.). Se programó en el Termociclador 9800 Fast Termal Cycle (Applied Biosystems) un primer paso de incubación a 25°C durante 10 minutos, seguido de un periodo de 120 minutos a 37°C, y una fase final de inactivación a 95°C durante 5 minutos. PCR cuantitativa (siglas en inglés q-PCR) Las muestras (1 μL) se adicionaron a los pocillos de una placa de 384 pocillos y se añadieron 3,5 μL de agua libre de ARNasas, 1 μL TaqMan® Gene Expression Assays (Life Technologies), 5 μL TaqManH Universal PCR Master Mix (Applied Biosystems, P/N 4304437, Foster City, CA. EE.UU.) y 0,5 μL la mezcla de los cebadores específicos (1,5X) para DKC1 (Hs00154737_m1), NOP10 (Hs00430282_m1), TINF2 (Hs01554309_g1), TERC (Hs03454202_s1). Las muestras se colocaron por triplicado para cada uno de los genes y se cuantificó en el termociclador ABI Prism 7900 HT Fast Real-Time PCR System (Applied Biosystems, Foster City, CA. EE.UU.). Se mantuvo durante 10 minutos a 95°C para activar el enzima, seguido de 40 ciclos en los que se mantuvo la temperatura a 95°C durante 15 segundos para disminuirla a 60°C durante un minuto. Técnica SYBR Green La reacción se realizó en placa de 96 pocillos, y se añadió a cada uno 17 μL de la muestra de ARN (200 ng) y 3 μL de mix de PCR (5x Reaction Mix (2 μL), Maxime Enzime Mix (3 μL), (Thermo Fisher Scientific, Waltham, MA, EE.UU.). Se introdujeron en el Termociclador 9800 Fast Termal Cycle (Applied Biosystems) y se dejaron en un primer paso de incubación a 25°C durante 10 minutos, seguido de un periodo de 15 minutos a 50°C y una fase final de inactivación a 85°C durante 5 minutos. qPCR Una vez obtenido el ADNc se procedió a la cuantificación mediante qPCR empleando el kit Maxima SYBR Green/ROX qPCR Master Mix (Thermo Fisher Scientific, Waltham, MA, EE.UU.). Para llevar a cabo esta PCR se colocó 1 μL de cada una de las muestras de ADNc en los pocillos correspondientes de una placa de 384 pocillos y 9 μL del mix de qPCR (Master Mix (5 μL), Primers específicos para cada gen (0,5 μL para F y 0,5 μL para R), agua libre de ARNasas (3 μL) (Thermo Fisher Scientific, Waltham, MA, EE.UU.), obteniendo un volumen total por pocillo de 10 μL. Los primers empleados fueron 5’-CTCCGTTATGGTAGCGCTGC y 5’-GCGGAACCCTCGCTTCTC para 45S 23 (Sigma Aldrich, St. Louis, EE.UU.), 5’-CGACGACCCATTCGAACGTCT y 5’- CTCTCCGGAATCGAACCCTGA para 18S (Sigma Aldrich, St. Louis, EE.UU.), y 5’- GCTGGCTTCGGCAGCACATATAC y 5’-TATCGAACGCTTCACGAATTTGC para TERC DNA (Sigma Aldrich, St. Louis, EE.UU.). Las muestras se colocaron por triplicado para cada uno de los genes y se cuantificó en el termociclador ABI Prism 7900 HT Fast Real-Time PCR System (Applied Biosystems, Foster City, CA. EE.UU.). Se mantuvo durante 2 minutos a 50°C, seguido de 40 ciclos en los que se mantuvo la temperatura a 95°C durante 10 minutos para disminuirla a 60°C durante un minuto. Se empleó la cuantificación relativa según el método de 2-ΔΔCT 36, usando los valores correspondiente al número de ciclos de PCR en el cual la fluorescencia detectada se diferencia del ruido de fondo (por siglas en inglés CT (cycle threshold)). Este valor es inversamente proporcional a la cantidad de ADN inicial y es característico de cada una de las reacciones. El método 2-ΔΔCT cuantifica en base a la CT de un gen de referencia. En este caso se empleó GAPDH como gen de referencia: ΔΔCT= (𝐶t𝑔𝑒𝑛 interés − 𝐶t𝑔𝑒𝑛 referencia) silenciado – (𝐶t 𝑔𝑒𝑛 interés − 𝐶t 𝑔𝑒𝑛 referencia) siControl Para poder aplicar esta fórmula es necesario que la eficiencia de la reacción de PCR (E) en ambos genes sea aproximadamente igual. Para comprobarlo se construyó una curva para cada gen a partir de diluciones seriadas 1:10 de una muestra de ARN de concentración conocida obtenida de células HeLa. La E se calculó a partir de las pendientes obtenidas luego de representar el logaritmo de la concentración (eje x) frente al CT (eje y) y según la ecuación: E = 10(-1/pendiente) - 1 × 100 donde E = 100 corresponde a 100% eficiencia. La eficiencia para genes ribosomales y TERC fue de 1,8 y 1,9, respectivamente. Tratamientos Para disminuir los niveles de GSH y generar estrés oxidativo se emplearon dos reactivos. La diamida (Sigma-Aldrich St. Louis, EE.UU.) es el agente oxidante de tioles que se empleó para reducir, de forma rápida los niveles de GSH al oxidarlo a GSSG. El rango de concentraciones empleadas de este reactivo para el tratamiento de células se encuentra en torno a 0,05-0,5 mM 37. También se empleó el H2O2 (Sigma-Aldrich St. Louis, EE.UU.), una ERO que produce daños en el ADN y otras alteraciones celulares que conducen a un estado de estrés oxidativo. En este caso el rango de concentraciones empleadas de este reactivo se encuentra alrededor de 0,001-0,5 mM. 24 • Se preparó una disolución stock de 20 mM de diamida en H2O MQ. Se realizó un filtrado de 0,22 µm. Para los tratamientos se preparó en DMEM sin suplementar. La concentración a emplear del compuesto se determinó mediante el ensayo de sulforodamina B (SRB). • Se preparó una disolución stock de 0,979 M de H2O2 en H2O MQ. Para los tratamientos, el compuesto se preparó en DMEM sin suplementar a una concentración de 500 µM y se trató a las células durante 30 minutos, a 37ºC y 5% de CO2 como había descrito anteriormente Yang et al., (2016). Estudio de viabilidad celular (método de tinción por exclusión) Se determinó la viabilidad celular para el tratamiento con H2O2 y diamida mediante el método de exclusión con azul tripán. Este es un colorante azoico que permite diferenciar las células vivas de las muertas. En las células que son viables, su membrana se encuentra intacta y por tanto no son capaces de incorporar el colorante. En cambio, las células muertas sí que presentan comprometida la integridad de la membrana, por lo que el azul tripán es capaz de atravesar la membrana y teñir las células. Se sembraron 200.000 células en placas de 6 pocillos, y tras 24 horas se trataron con los tratamientos anteriormente descritos. Se procedió a recoger las células a los 30 minutos del tratamiento y el pellet celular se resuspendió en 1 ml de medio sin SFB, de esta mezcla se tomaron 20 μL y se le adicionaron 20 μL de azul tripán; dejándose 3 min a temperatura ambiente. A continuación, se transfirieron 10 μL de la suspensión celular a la cámara de Neubauer y se procedió al contaje directo en el microscopio invertido (Leica Microsystems, DFC450 C). Se contaron el número de células teñidas (muertas) y las no teñidas (vivas) y se calculó el porcentaje viabilidad (número de células vivas/número de células totales multiplicado por 100). Ensayo citotóxico. Sulforodamina B Para determinar la inhibición del crecimiento celular producido por los distintos tratamientos, se empleó el ensayo de SRB. Es un ensayo colorimétrico basado en la tinción de proteínas para células que crecen tanto en monocapa como en suspensión. El SRB es un colorante minoxanteno brillante de color rosa con dos grupos sulfónicos que se unen a los residuos de los aminoácidos básicos de las proteínas celulares en condiciones acídicas suaves; y se disocia en condiciones básicas. Como la unión de SRB es estequiométrica, la cantidad de colorante extraído de las células teñidas es directamente proporcional a la masa celular 38. 25 Este análisis fue realizado en placas de 96 pocillos sembrando 10.000 células HeLa por pocillo en 200 µl de DMEM completo. A las 24h post-siembra, se añadió el tratamiento a diferentes concentraciones (0,01 mM; 0,03 mM, 0,06 mM; 0,12 mM; 0,25 mM, 0,5 mM; 1 mM; 2 mM) disueltos en 200 µl de DMEM sin suplementar durante 24h. Se realizaron triplicados por cada condición. Pasado el tiempo del tratamiento, las células se fijaron con 50 µL ácido tricloroacético (TCA) al 10% (Sigma-Aldrich, St Louis, EEUU). Se incubó la placa durante 1 hora a 4ºC. Se eliminó el sobrenadante y se lavó la placa 5 veces con agua y se dejaron secar. A continuación, se añadió 100 µL de SRB (Sigma-Aldrich, St Louis, EEUU) al 0,4% (p/v) disuelto en ácido acético al 1% en cada pocillo y se incubó durante 20 minutos a temperatura ambiente. Pasado este tiempo se eliminó el exceso de tinción con lavados de ácido acético al 1%. El colorante fijado se solubilizó con 100 µl de tampón Trizma Base (Sigma-Aldrich, St Louis, EEUU) a 10 mM y se dejó reposar durante 30 minutos a temperatura ambiente en agitación suave. Finalmente, se realizó una medición de la absorbancia en el espectrofotómetro (SpectraMax Plus 384, Molecular Devices) a longitudes de onda de 570 nm y se le restó el ruido de fondo medido a 620 nm para cada pocillo. Se calculó el porcentaje de viabilidad y de inhibición celular mediante las fórmulas: %𝑠𝑢𝑝𝑒𝑟𝑣𝑖𝑣𝑒𝑛𝑐𝑖𝑎 𝑐𝑒𝑙𝑢𝑙𝑎𝑟 = 𝑂𝐷𝑚𝑢𝑒𝑠𝑡𝑟𝑎 − 𝑂𝐷𝑏𝑙𝑎𝑛𝑐𝑜 𝑂𝐷𝑛𝑒𝑔 𝑐𝑜𝑛𝑡𝑟𝑜𝑙 − 𝑂𝐷𝑏𝑙𝑎𝑛𝑐𝑜 𝑥100 %𝑖𝑛ℎ𝑖𝑏𝑖𝑐𝑖ó𝑛 𝑐𝑒𝑙𝑢𝑙𝑎𝑟 = 100 − %𝑠𝑢𝑝𝑒𝑟𝑣𝑖𝑣𝑒𝑛𝑐𝑖𝑎 𝑐𝑒𝑙𝑢𝑙𝑎𝑟 Estos valores se usaron para calcular la concentración que produce el 50% de inhibición del crecimiento celular (CI50). Se construyó la curva dosis respuesta ploteando el % de viabilidad celular en la ordenada y, el logaritmo de las concentraciones en la abscisa. La CI50 se determinó por regresión no lineal (modelo sigmoide) y con ayuda del programa GraphPad PRISM versión 6.0 y también se utilizó el programa Excel de Microsoft, linealizando los datos para obtener la siguiente representación y ecuación: % supervivencia = f (log [sustancia de ensayo ]) y CI= 10(50−𝑏 𝑎) Donde: a: es la pendiente de la recta resultante de la representación indicada anteriormente. b: es el valor de la intersección de la recta con el eje de ordenadas (% de actividad). Determinación de niveles de GSH y del cociente GSSG/GSH Este experimento se realizó en formato de placa de 12 pocillos. A las 24 h post-transfección los niveles de GSSG/GSH se estudiaron utilizando el kit “The DetectX Glutathione kit” (Arbor Assays, 32 También se llevó a cabo un análisis Western-blot en los tres modelos de silenciamiento, y se observó una disminución en los niveles proteicos de DKC1, NOP10 y TIN2, aunque esta reducción fue de menor magnitud (50%) que a nivel de ARNm (Fig. 7.B), tal vez por tratarse de proteínas que presentan un tiempo de vida media mayor. Estudio de los niveles de expresión de 45s y 18s en las células silenciadas Se determinó también la expresión relativa de las subunidades ribosomales 45s y 18s. La medida se llevó a cabo mediante una RT-qPCR por la técnica de SYBR Green. Se observó una disminución en su expresión en las poblaciones siDKC1, y siNOP10 respecto a la población siCONTROL (Fig. 8). El silenciamiento de TINF2 produjo un descenso no significativo en la expresión de ambas subunidades ribosomales. Figura 8. Expresión relativa de 45s y 18s. (A) Representación gráfica de la expresión relativa de 45s para las diferentes poblaciones silenciadas y sus controles (B) Representación gráfica de la expresión relativa de 18s para las diferentes poblaciones silenciadas y sus controles. Obtenido por RT-qPCR y calculados mediante el método de 2-ΔΔCt. Los resultados de la expresión relativa están representados por la media y la SD de tres experimentos independientes. “*” corresponde a diferencias significativas respecto al siCONTROL. (p < 0,001). Estudio de la morfología nucleolar La validez del kit comercial “CytoPainter Nucleolar Staining KitGreen Fluorescence” (Abcam, Cambridge, UK) para estudiar morfología nucleolar se evaluó en un principio en líneas celulares que suelen ser modelos empleados para estudiar el estrés oxidativo en el laboratorio CIBERER: células NIH 3T3, 3T3-L1 y HeLa. El número de nucléolos fue el único parámetro que se pudo medir mediante el kit, ya que el autoblanqueo impidió cuantificar el área como otro parámetro morfométrico. Las células 3T3 (tanto la línea NIH como la L1) presentaron una media de 10 nucléolos (Fig. 9), mientras que las HeLa presentaron una media de 2 a 3 nucléolos (Fig 11). De 33 lo cual concluimos que las líneas de fibroblastos de ratón disponibles en el laboratorio no eran adecuadas para proseguir experimentos con este kit. Figura 9. Morfología nucleolar en diferentes líneas celulares. Imágenes del microscopio de fluorescencia donde se muestra la morfología nucleolar en (A) NIH 3T3 y (B) 3T3-L1. Ambas teñidas empleando el CytoPainter Nucleolar Staining Kit. Los resultados con células silenciadas para los genes DKC1, NOP10 y TINF2 no revelaron diferencias en el número de nucléolos (Fig. 10) respecto al control. Sin embargo, la perdida de fluorescencia imposibilitó estudiar otro índice morfométrico. Figura 10. Estudio de la morfología nucleolar. (A-D) Imágenes de microscopía confocal donde se muestra la morfología del nucléolo en las diferentes poblaciones silenciadas y sus controles. Se utilizó un kit comercial para su marcaje. 34 Figura 11. Contaje de nucléolos. Contaje del número de nucléolos en las diferentes poblaciones silenciadas. Los resultados de la expresión relativa están representados por la media y la SD de tres experimentos independientes (n=30 células). Localización mediante microscopía confocal de GSTP y NPM1 en los modelos de silenciamiento Los resultados de la IFI mediante microscopía confocal permitieron confirmar los resultados obtenidos con el kit para la tinción fluorescente del nucléolo. El número promedio de nucléolos en la línea siControl fue de 2,7 nucléolos. Tampoco se observaron diferencias en este parámetro entre los modelos de silenciamiento en relación a los controles. Otro resultado obtenido con ese ensayo fue comprobar la localización nuclear de GSTP (Fig. 12.E-H) y nucleolar de NPM1 (Fig. 12.I-L). Este hallazgo se confirmó por la tinción del núcleo con fluoromont DAPI como control nuclear. En estas imágenes podemos observar que existe un importante descenso en la fluorescencia de NPM1 en los modelos siDKC1 y siNOP10 en comparación con la población siControl, sin embargo, en siTIN2 se aprecia incremento de la tinción nucleolar. En los controles la tinción del nucléolo fue uniforme, en tanto en las células siDKC1 y siNOP10 se redujo la tinción en la zona central, o se limitó a la región perinucleolar y se hizo más aparente su localización en nucleoplasma (Fig. 13). La cuantificación de la fluorescencia confirmo estos hallazgos. La fluorescencia de GSTP se distribuyó homogéneamente en el núcleo y fue similar en todas los modelos silenciados y el control. Las imágenes de solapamiento (MERGE) confirman la presencia de GSTP en la región nuclear. 35 Figura 12. Estudio de la localización de GSTP y NPM1 en células HeLa silenciadas. Imágenes de microscopía confocal donde se muestra la localización de GSTP (E, F, G, H) y NPM1 (I, J, K, L) en las diferentes poblaciones de células silenciadas. Se utilizó el marcador fluoromont DAPI como control (A, B, C, D). Figura 13. Inmunolocalización de NPM1 en células HeLa silenciadas. Imágenes de microscopía confocal y procesadas en ImageJ en formato 8-bits. 36 Por otro lado, el procesamiento de las imágenes de IFI con programa ImageJ mediante un plugin de colocalización permitió detectar que en las imágenes fusionadas (MERGE) de los modelos celulares siDKC1 y siNOP10 la NPM1 co-localiza con GSTP en el núcleo (Fig. 14.B y C). Respecto a siControl y siTIN2 se puede observar que ambas proteínas co-localizan en la zona perinucleolar. (Fig. 14.A y D). En las cuatro condiciones (siControl, siDKC1, siNOP10, siTIN2) la co-localizacion en las imágenes se muestra de color blanco (Fig. 14). Figura 14. Estudio de la co-localización de GSTP y NPM1 en células HeLa silenciadas. Imágenes de microscopía confocal y procesadas en ImageJ empleando el plugin “Colocalization”. En blanco se muestran las zonas donde co-localizan GSTP y NPM1. Estudio de viabilidad y citotoxicidad de Diamida y H2O2 en células HeLa Con el fin de producir estrés oxidativo utilizamos diamida como agente que disminuye los niveles de GSH y H2O2 como agente oxidante. La diamida se emplea usualmente en concentraciones de 0,05-0,5 mM ; en cambio el H2O2 puede usarse en tratamientos prolongados en concentraciones de nanomoles a 10 µM para producir efectos crónicos o en tratamientos cortos a concentraciones por encima de 100 µM para generar efectos agudos14. Sin embargo, las diferencias en la sensibilidad de cada tipo celular nos motivaron a ensayarlos con SRB40,41. Los resultados obtenidos de este ensayo tras el tratamiento durante 24h con diferentes concentraciones de estas sustancias mostraron que se produce una disminución del porcentaje de supervivencia celular conforme se aumenta la dosis (Fig. 15.A y B). Esta relación inversa de la concentración frente a la supervivencia celular siguió un modelo sigmoideo a partir del cual se obtuvo una CI50 de 0,25 mM para la diamida y de 0,07 mM para el H2O2. Con estos resultados seleccionamos 0,2 mM y 0,5 mM, como concentraciones de ensayo para la diamida y el H2O2, respectivamente, a fin de en tratamientos de 30 min generar un estrés oxidativo agudo41. Los estudios de viabilidad celular obtenidos por el ensayo del azul de tripano mostraron que estos tratamientos no disminuyeron la viabilidad celular (Fig. 15.C y D). 37 Figura 15. Estudio de citotoxicidad y viabilidad de células Hela tratadas con diamida y H2O2. (A) Curva de supervivencia celular (%) mediante el ensayo de SRB de las células HeLa tratadas con diferentes concentraciones de diamida (0,01 mM; 0,03 mM; 0,06 mM; 0,12 mM; 0,25 mM; 0,5 mM; 1 mM; 2 mM). La CI50 obtenida para esta curva fue de 0,2480 mM. (B) Curva de supervivencia celular (%) mediante el ensayo de sulforodamina B de las células HeLa tratadas con diferentes concentraciones de H2O2 (0,01 mM; 0,03 mM; 0,06 mM; 0,12 mM; 0,25 mM; 0,5 mM; 1 mM; 2 mM). La CI50 obtenida para esta curva fue de 0,0635 mM. (C-D) Representación gráfica de los resultados del ensayo con azul de tripano de las células HeLa tratadas con 0,2 mM de diamida y 0,5 mM de H2O2 durante 30 minutos. Los resultados se representan como la media y la desviación estándar de tres experimentos independientes. Evaluación de los niveles de GSH y del cociente GSSG/GSH en las células silenciadas tratadas con Diamida y H2O2 Los niveles de GSH libre y GSSG, así como su cociente GSSG/GSH se estudiaron como indicadores de estrés oxidativo en los modelos celulares de silenciamiento sin ningún tratamiento y expuestas por 30 min a 0,2 mM de diamida y 0,5 mM de H2O214. En las células siDKC1 y siNOP10 se detectaron altos niveles de oxidación del GSH y del cociente GSSG/GSH demostrando estrés oxidativo en estas células. En siTIN2 no se apreció este efecto (Fig. 16.A). En las células siDKC1, tratadas con diamida el cociente GSSG/GSH se incrementó respecto a siControl, sin embargo, este disminuyó en siNOP10 y siTIN2, aunque las diferencias no fueron 38 de significación estadística (Fig. 16.B). En cambio, en las células tratadas con H2O2 el cociente GSSG/GSH solo aumentó en la población siDKC1 y siTIN2, pero tampoco estas diferencias alcanzaron significación estadística (Fig. 16.C). Figura 16. Cociente GSSG/GSH en las poblaciones silenciadas. (A) Representación gráfica del cociente GSSG/GSH en las poblaciones silenciadas no tratadas. (Trabajo final de grado de Fuster et al, 2016). (B) Representación gráfica del cociente GSSG/GSH de las poblaciones silenciadas tratadas con 0,2 mM de diamida durante 30 minutos (C) Representación gráfica del cociente GSSG/GSH de las poblaciones silenciadas tratadas con 0,5 mM de H2O2 durante 30 minutos. Los resultados están representados por la media y la desviación estándar de tres experimentos independientes por triplicado. “*” indica diferencias significativas respecto a siCONTROL. Estudio de la expresión proteica de GSTP y NMP1 en los extractos nucleolares Otro de los objetivos que se propuso para este trabajo fue obtener diferentes fracciones celulares para analizar los niveles de expresión de NPM1 y GSTP en extractos citoplasmáticos, nucleares y nucleolares de células HeLa y NIH 3T3. El rendimiento de la extracción a partir de células NIH 3T3 fue bajo, tanto partiendo de frascos de T75 como de células cultivadas en frascos T150, donde en confluencia se contabilizaron 39 18,4x106 células aproximadamente (Tabla 2). La extracción partir de células HeLa tuvo mejor rendimiento, así que nos planteamos estudiar NMP1 y GSTP en los extractos proteicos de las diferentes fracciones subcelulares de esta línea celular. Tabla 2: Rendimiento de las extracciones nucleolares. NIH 3T3 Fracción citoplasma/núcleo Fracción nucleolar T150 0,0763 µg/µl 0,8632 µg/µl T75 0,28146 µg/µl 0,35640 µg/µl HeLa Fracción citoplasma/núcleo Fracción nucleolar T75 0,55016 µg/µl 1,03942 µg/µl 0,53453 µg/µl 1,43365 µg/µl 0,70473 µg/µl 1,62565 µg/µl Los resultados del Western-blot de las fracciones: citoplasma/núcleo y nucléolo nos permiten apreciar la proteína NPMI en la fracción nucleolar y GSTP en la fracción citoplasma/núcleo, y en menor proporción en nucléolo. La Histona H3 solo se detectó en la fracción nucleolar y no en la fracción citoplasma/núcleo, en cambio la actina aparece en ambos sub-compartimentos celulares (Fig.17). Este resultado nos demostró que no logramos obtener extractos puros de nucléolo y solo logramos separar extractos citoplasmáticos de nucleares. 40 Figura 17. Estudio de la purificación de las diferentes fracciones celulares. Separación por Western blot de los diferentes extractos obtenidos mediante el protocolo de purificación nucleolar descrito39. Se determinó la GSTP y NPM1 en todos los extractos y se empleó la actina y la H3 como controles de carga. 41 7. Discusión Hasta hace muy poco la principal función que se le atribuía al nucléolo era la de su papel en la biogénesis ribosomal 1. Sin embargo, en la última década se han ido revelando otras funciones no ribosomales para el nucléolo, como la de mantener la estabilidad del ADN, la remodelación de la cromatina y la homeostasis redox , que a día de hoy son objeto de investigación14,15. El nucléolo es capaz de detectar el estrés celular y gracias a su plasticidad y dinamismo morfofuncional puede coordinar diferentes respuestas y mantener la homeostasis celular20,42. El nucléolo se ha relacionado con múltiples patologías humanas, en las que probablemente se encuentran implicados diferentes mecanismos. Los errores en la biogénesis ribosomal, ya sea por mutaciones en genes ribosomales o en proteínas que participan en el procesamiento del ARNr, suelen ser el fallo descrito más común para un conjunto de patologías catalogadas como ribosomopatías43. Además, la disfunción nucleolar puede desempeñar un papel en patologías degenerativas del sistema nervioso o del corazón, así como en enfermedades virales y oncológicas16,44,45. Por último, pero no menos importante, la función y distribución de algunas proteínas nucleolares también se encuentra afectado en ciertas enfermedades progeroides 46,47. La comprensión mecanicista de la participación nucleolar en toda esta gama de patologías ha expandido el reciente campo de las “nucleolopatías” y su estudio continua siendo un reto48. La DC, modelo de ribosomopatía en la que se centra este trabajo, cursa con mutaciones en genes que codifican para snoRNP esenciales en el procesamiento ribosomal y en el mantenimiento de la longitud telomérica. La alteración en la respuesta de daño al ADN y el estrés oxidativo son otros rasgos distinguibles en la etiopatogenia de DC, aunque son interpretados como eventos secundarios 49. En este trabajo se han empleado modelos celulares en los que se silenciaron de forma transitoria, por tecnología del ARNi, los genes DKC1, NOP10 y TINF2, que se encuentran mutados en distintos patrones de herencia de DC50. Los genes DKC1 y NOP10, además de su función en el complejo telomerasa, se unen con ARN con motivos H/ACA participando así en la reacción de pseudouridilación de ARNrs y snARNs 51, la biogénesis ribosomal y funciones del esplicesoma52. TINF2, además de su papel en el telosoma, también localiza en la mitocondria donde regula el metabolismo intermediario y la producción de EROs53. Con estos precedentes se desarrolló un diseño experimental que permitiera dilucidar si las mutaciones en estos genes afectan al equilibro redox y este puede ser detectado como estrés nucleolar. 48 8. Conclusiones parciales • La disminución aguda de los niveles de DKC1 y NOP10, ambos implicados en la etiopatogenia de la DC, afecta al equilibrio redox y a la biogénesis ribosomal, tanto a nivel de síntesis del pre-ARNr como al procesamiento de las subunidades ribosomales. • La translocación de NPM1 es un marcador de estrés nucleolar relacionado con la acción de GSTP y la activación de la vía de p53. • La disminución aguda de los niveles de TIN2 no produce un estrés oxidativo detectable por parámetros nucleolares. 49 9. Limitaciones Muchas de las técnicas descritas no se habían realizado anteriormente en el laboratorio, por lo que se requirió de tiempo para su puesta a punto. Por limitaciones técnicas no se logró el fraccionamiento celular que permitiera estudiar la expresión de las proteínas de interés en citoplasma núcleo y nucléolo. Esto hubiese permitido abordar el estudio de la expresión de GSTP y NPM1 en estos subcompartimentos en los modelos silenciados y bajo diferentes estados redox, así como su correlación con los niveles de GSH. Otra limitación fue no incluir un control positivo, como la Actinomicina D, en el ensayo de morfología nucleolar con los modelos silenciados y analizadas por el Kit Cytopainter Nucleolar. Por lo tanto, para obtener unos resultados más fiables en relación al número de nucléolos como marcador debiera replicarse este ensayo. 10. Perspectivas futuras Dado que es de gran importancia el estudio de la dinámica nucleolar para comprender mejor todos los mecanismos moleculares que acontecen en la célula, sería interesante evaluar otras proteínas nucleolares como marcadores, así como estudiar diversos modelos celulares en los que se silencien otros genes implicados en enfermedades raras, para determinar si se produce un estrés nucleolar que pueda ser empleado como un marcador de enfermedad. Además, sería interesante estudiar en nuestros modelos de silenciamiento la s-glutationilacion de NMP1 y la expresión de otras proteínas que participan en la cascada de activación de p53 dependiente de NPM1, como son la ARF y la MDM2. Otro aspecto, sería estudiar, en un modelo de transfección estable para TIN2, el estrés oxidativo y la validez de parámetros nucleolares para detectarlo en este modelo. 50 11. Bibliografía 1. Lamond, A. I., Ly, T., Hutten, S. & Nicolas, A. The Nucleolus. Encycl. Cell Biol. 3, 254–269 (2016). 2. Sirri, V., Urcuqui-Inchima, S., Roussel, P. & Hernandez-Verdun, D. Nucleolus: The fascinating nuclear body. Histochem. Cell Biol. 129, 13–31 (2008). 3. Su, H., Kodiha, M., Lee, S. & Stochaj, U. Identification of Novel Markers That Demarcate the Nucleolus during Severe Stress and Chemotherapeutic Treatment. PLoS One 8, e80237 (2013). 4. Boulon, S. et al. The nucleolus under stress. Mol. Cell 40, 216–27 (2010). 5. Jurado, I. M. 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