COVER
AUTOR: I ene Na a o Loba o
h p://o cid.o g/0000-0002-7866-3192
EDITA: Publicaciones y Di ulgación Cien í ica. Uni e sidad de Málaga
Es a ob a es á bajo una licencia de C ea i e Commons Reconocimien o-NoCome cial-
SinOb aDe i ada 4.0 In e nacional:
Cualquie pa e de es a ob a se puede ep oduci sin au o ización
pe o con el econocimien o y a ibución de los au o es.
No se puede hace uso come cial de la ob a y no se puede al e a , ans o ma o hace
ob as de i adas.
h p://c ea i ecommons.o g/licenses/by-nc-nd/4.0/legalcode
Es a Tesis Doc o al es á deposi ada en el Reposi o io Ins i ucional de la Uni e sidad de
Málaga (RIUMA): iuma.uma.es
FACULTAD DE MEDICINA
COVER
Ph.D. Thesis
P og ama de Doc o ado: Neu ociencia y sus Aplicaciones Clínicas
RGS14414-media ed p e en ion o an episodic
memo y loss: a s udy o molecula mechanism
I ene Na a o Loba o
Lab. Neu obiología, CIMES, UMA
Thesis supe iso : D . Za a uddin Khan
Málaga, 2015
SUPERVISOR CERTIFICATE
D . Za a uddin Khan, Di ec o del labo a o io de Neu obiología del Cen o de In es igaciones
Médico Sani a ias y P o eso del depa amen o de Medicina y De ma ología en la acul ad de
Medicina de la Uni e sidad de Málaga,
INFORMA
Que Doña I ene Na a o Loba o, Licenciada en Biología po la Uni e sidad de Málaga, ha
ealizado bajo su di ección el abajo expe imen al que ha lle ado a la edacción de la
p esen e memo ia de Tesis Doc o al, i ulada “RGS14414-media ed p e en ion o an episodic
memo y loss: a s udy o molecula mechanism”. Conside ando que cons i uye abajo de
Tesis Doc o al, se au o iza su p esen ación pa a op a al G ado de Doc o .
Y pa a que así cons e y su a los e ec os opo unos, se i ma el p esen e documen o en
Málaga, a 20 de oc ub e de 2015.
Fdo: Za a uddin Khan

AGRADECIMIENTOSAC
ACKNOWLEDGEMENTS
Los años de o mación que he i ido culiminan con es e manusc i o que sin qui a le
impo ancia, an sólo es una pa e de odo el abajo que encie an sus páginas, de muchos consejos y
la magní ica y ú il ayuda de muchas pe sonas que han sido imp escindibles en odo su desa ollo y en
el mío pe sonal. En es e pequeño espacio mi in ención no es ag adece , sino deja bien cla o que son
ellos ambién sus dueños. Todo lo que me habéis apo ado a dis in os ni eles es mi más p eciado
eso o que me ha ayudado a c ece y madu a como p o esional y como pe sona, po que somos lo que
somos po la gen e que nos odea. Yo he enido la sue e de c uza me con ‘GRANDES’.
En p ime luga , quie o ag adece a mi di ec o de esis, el D . Za a uddin Khan, po su
con ianza en mí a la ho a de acoge me en su labo a o io y da me la opo unidad de sume gi me en
es e mundo sac i icado, y a eces no an uc í e o como desea íamos, que en el ondo nos apo a más
de lo que se íamos capaces de pe cibi . G acias po guia mis pasos y pe mi i que llegase al des ino.
Espe o habe es ado a la al u a.
En segundo luga , mos a mi más since a g a i ud a los g upos con los que ealicé mis
es ancias p edoc o ales po habe hecho hecho muy uc í e o el impo que pasé con oso os
apo ando esul ados impo an es en es e abajo de esis:
-A la D a. Diana F echilla y al D . Albe o Media illa del CIMA (Pamplona) y sus miemb os
(Es he , Ma ía y Ana Ma ía) cuya colabo ación en el abajo de Alzheime ha sido c ucial. Quie o
ag adece muy especialmen e a Ana Ma ía, una g an amiga, el dedica me su iempo enseñándome las
écnicas de ORT de a ón, las inmunos, el habe me hecho sen i como en casa, sus aliosos consejos
sob e el mundo de la ciencia y de la ida en gene al y el habe me enseñado algunos incones de
Pamplona y San Sebas ian.
-A la D a. An onia Vlahou y al D . Ie onymos-Je ome Zoidakis,“Makis”, así como a odo su
g upo Manoussos, Alexande , Vassiliki, Ma ia F an zi, Anggeliki y al D . Kons an inos Vougas del
Biomedical Resea ch Founda ion o A hens; u ie on mucha paciencia con aquella inexpe a en
p o eómica que se p esen ó en su labo a o io. G acias a ues a magní ica expe iencia y buen hace
ap endí muchísimo en an sólo 5 meses y odo el abajo salió a adelan e. Quie o hace una mención
especial a Makis, que me dedicó an as ho as, g acias po u op imismo y posi i ismo y po posee esa
“locu a” pa icula que me amenizó odo el p oceso de ap endizaje. También a Idili que sin se pa e
de es e g upo compa ió labo a o io conmigo especialmen e aquel agos o en A enas. E es una amiga
muy especial a la que engo que ag adece muchísimo, uis e mi apoyo donde no enía a nadie más y
me ab is e las pue as de u casa y de u ma a illosa amilia sin más. E e namen e e es a é
ag adecida.
Mi ag adecimien o ambién al depa amen o de Fisiología Humana y de la Educanción Físico
Depo i a y en especial a su di ec o , el D . Ma c S e an, u o de mi DEA, que siemp e se ha
mos ado muy se icial y amable cuando lo he necesi ado en oda la bu oc acia que supone la
de ensa de una esis doc o al.
Mil g acias a los miemb os de dis in os g upos de in es igación con los que hemos
colabo ado o nos han apo ado su conocimien o, su ayuda, sus consejos, así como ma e ial necesa io
du an e la ealización de expe imen os. Sois odos g andísimos p o esionales y mejo es pe sonas con
las que ha sido y es un lujo con a :
A la D a. An onia Gu ié ez y a su equipo, Eli, Raquel, Vanessa, Me cedes y en especial a mi casi
paisana Lau a, un g upo con el que compa imos muchos lazos y que siemp e es á dispues o a hace e
un a o ; g acias po lo que me habéis apo ado en el mundo de la inmunohis oquímica y po ues a
amis ad. A la D a. Alicia Ri e a y a su g upo, mi que ida Alejand a y a Jose, siemp e dispues os a
p es a nos su ma e ial de es e eo axia; g acias po ues a aliosa amis ad. Al D . An onio González
po cede nos el es e eo áxico de a ón cada ez que lo hemos necesi ado. Al D . Luis San ín y su
g upo (Ca men Ped aza, Es ela, C is ina, Jo ge,...) po sus apo anciones en el campo de la condu a.
A Ma ía José y José Rioja, “los del ondo”, g acias po pe mi i nos amablemen e usa ues os
equipos y po ues os consejos.También debo ag adece a esos g upos ue a de la Uni e sidad de
Málaga que me han acogido an amablemen e en su labo a o io pa a ealiza p oyec os de
in es igación en colabo ación. G acias al D . Juan José Canales y sus discípulos, Toni y Cla a po
acoge me en Valencia e in oduci me en el es udio de la memo ia de miedo, apo ando siemp e muy
buenas ideas pa a con inua . Muchas g acias al D . Juan Ca los López y a Espe anza de la
Uni e sidad de Se illa po enseña nos la écnica de a e sión condicionada al sabo .
Mi ag adecimien o ambién a odos aquellos que a dia io nos allanáis el camino, el pe sonal
del es abula io (nues o p eciado e imp escindible e e ina io, Rica do, a Ana, E a, Isa, Conchi,
Ma i i, Vanessa, Sole, Loli y nues a que ida So aya), los écnicos de cul i os celula es y de biología
molecula del SCAI (Casimi o y Reme), los bedeles y miemb os de segu idad del CIMES (Miguel,
Ma ía Jesús, An onio, Jaime, Cá denas, Raquel, Gue a, Rica do…). A Gema que siemp e es á
pendien e de Ma iam y de mí y se aleg a mucho de e nos e mina po in es a e apa.
Ag adece p o undamen e a aquellos con los que día a día a lo la go de es a e apa he
compa ido labo a o io, g acias po en mayo o en meno medida deja una huella en mí:
A Manuel, po enseña me en e isas al p incipio de los iempos, po u me iculosidad en la
ealización de los expe imen os, po sen a las bases de es e abajo y enseña me las écnicas de ORT
y es e eo axia en a a, así como po u pa icipación en el p oyec o de aging y Alzheime .
A Edua do, po u humo i ónico y po lo que me has apo ado en el campo de la psicología y del
es udio conduc ual con animales.
A Elisa po enseña me la écnica de Mo is aunque, po se una buena p o esional, que pesa de odo
lo que lle a pa a adelan e siemp e sabe busca e un hueco cuando lo necesi as. Además, ag adece e
las ho as que has dedicado a la co ección de es e manusc i o y a la p epa ación de la p esen ación.
Tu minuciosidad me ha sido de g an ayuda.
A Sin o iano, po compa i con noso os su expe iencia en qRT-PCR y ayuda me con los
expe imen os elacionados con ese ema, ambién po inicia me en las écnicas de epigené ica que
e oma é segu o más adelan e.
A mi que idísima Glo ia, g acias po u buen abajo y ayuda con el es udio de a bo ización
neu onal, u paciencia y el ca iño que le pones a odo incluyendo a las pe sonas que e odeamos es lo
que e hace única y lo que hace que e ado emos. G acias po u amis ad, us consejos y u
p eocupación, amiga.
A Juan, al que debo an o, ese “he mano mayo ” al que conside o me ha enseñado la mayo pa e de
lo que soy p o esionalmen e, desde mis inicios en el labo como alumna in e na has a mis
conocimien os en las dis in as ecnologías que conozco, biología molecula , cul i os,
inmunohis oquímica, Wes e n blo ... Con u g an expe iencia y sabidu ía has sabido disminui mi
“pe a dismo” pa icula . G acias po odo, po se como e es y po p eocupa e siemp e. Sin i las
cosas hubiesen sido mucho más di íciles o imposibles.
A Ma iam, mi mejo amiga, abaja codo con codo con igo ha sido un e dade o place ; sin i no sé
si hubiese llegado a la me a. G acias po no sólo po u p o esionalidad y u minuciosidad, sino
ambién po u bondad y gene osidad, siemp e has es ado cuando e he necesi ado, ¿quién me iba a
en ende mejo que ú? Te admi o como amiga y como colega, y lo sabes. Sé que llega ás muy al o
po que sabes pelea y no e con o mas con un po que sí, al igual que cualquie GRANDE ha ía.
Compañe a de iaje, al inal nues o apoyo mu uo ha me ecido la pena, y lo mejo de odo es que he
ganado la mejo amiga que hubiese podido imagina .Y con igo ambién a Zouhi , sois magní icos y
se éis muy elices, amigos.
También a las chicas que llega on al labo a o io en la ase inal del abajo, Inma, Lucía y Ma ía
Elena, g acias po ues o apoyo mo al, po hace os ca go del labo mien as Ma iam y yo
esc ibíamos pa a e i a nues a dis acción; g acias po los momen os de isa y po escucha me. Así
como a odos los demás, Ma ía, Ma a, Ca los y José.
A Mª Jesús, una miemb o no o icial del g upo, que se ha con e ido en una g an y aliosa
amiga. Lo mejo de us la gos días de es abula io y de los míos, ue on sin duda conoce e.
Muchísimas g acias po escucha me y po se como e es. Me aleg o an o de u nue o b illo de ojos…
La úl ima pa e de es e apa ado de ag adecimien os lo ese o pa a aquellos que o man
pa e de mi ida po ci cuns ancias ajenas a la ealización de mi esis, pe o que ambién me
acompaña on du an e el iaje y han sido y son muy impo an es pa a mí:
A mis amigas de oda la ida (Ana, Eli y Rosa) y a mis ‘amigos polí icos’ (Ósca , G ajales, Bu a,
Ángel, Pepi, Beli, Pa i, Sand a) que siemp e se aleg an de cada paso y con los que me lo paso muy
bien celeb ándolo; enésis el don de es a siemp e que se os necesi a. También, a mis amigas de la
“ lacu”: Ca men, Ma ía Vic o ia y en especial a Isa y And ea.
In ini as g acias a esa pe sona que sabe disimula muy muy bien la moles ia que supone aguan a mi
mal humo y mis quejas, mis a danzas y mis ausencias. Ped o, muchas g acias po apoya me en
odo, y es a ahí siemp e que e necesi o sin espe a nada más que mi elicidad. Tu ab azo es la mejo
e apia pa a los malos momen os y han sido imp escidibles pa a segui día a día.
Y po supues o ag adece a mi amilia, mis pad es, mi he mani a, con la que ni con igo ni sin i, mis
abuelos, íos y p imos, esa g an amilia que e lo da odo sin espe a nada a cambio po que e quie en
de co azón. Esos que po el simple hecho de sabe que se sen i án o gullosos de í me ece la pena
le an a se cada mañana. G acias po ues o ca iño y ues a con ianza en mí ¡Qué ha ía sin
oso os! A C is obal, ese cuñado an apañado que engo que siemp e me ayuda con el pho oshop y
con oda su paciencia y p o esionalidad me ha p epa ado la po ada de es e abajo. No obs an e,
quie o ag adece le especialmen e a mi mad e, muchas g acias mamá po odo lo que haces no sólo
po mí sino po odos, u ca ác e lleno de amo nos conduce po el buen camino. Es e abajo a
dedicado especialmen e a i, po que sé la ilusión que e hace.
Pa a e mina sólo me que me queda pedi disculpas si ha al ado alguien que debiese es a ,
deja es e apa ado pa a el inal y esc ibi lo bajo la p esión del iempo que se ago a no ue una buena
idea.
PLP: Pe ioda e-lysine-pa a o maldehyde
PRh: Pe i hinal co ex
Pu o : Pu omycin esis ance gene
p- alue: E o p obabili y alue
PVDF: Poly inylidene di luo ide
qRT-PCR: Quan i a i e e e se
ansc ip ion PCR
: Co ela ion coe icien
RACK1: Ac i a ed p o ein kinase 1
RBD domain: Ra -like Ras binding
domains
RGS: Regula o o G p o ein signaling
RNA: Ribonucleic acid
Rpl19: Ribosomal p o ein L19
RT: Re e se ansc ip ion eac ion
SDS-PAGE: Sodium dodecyl sul a e
polyac ylamide gel elec opho esis
ssDNA: Single-s anded DNA
STM: Sho - e m memo y
TGS: T is-glycine-SDS bu e
TBE: T is-bo ic acid-EDTA bu e
T kA ecep o : T opomyosin ecep o
kinase A
T kB ecep o : T opomyosin ecep o
kinase B
Tukey's HSD es : Tukey’s hones
signi ican di e ence es
V2: Seconda y isual co ex
WB: Wes e n blo
2-DE: Two-dimensional elec opho esis

TABLE OF CONTENTS
I. INTRODUCTION ............................................................................................................. 1
1 Regula o o G p o ein signaling 14 (RGS14) ............................................................ 3
1.1 RGS14414, a spliced a ian o RGS14 ..................................................................... 4
2 Objec ecogni ion memo y and RGS14414 ................................................................. 6
2.1 Objec ecogni ion memo y (ORM) ......................................................................... 6
2.2 RGS14414 in ORM enhancemen .............................................................................. 6
3 Memo y loss in aging and Alzheime ´s disease .......................................................... 7
3.1 Aging ........................................................................................................................ 7
3.2 Alzheime ’s disease .................................................................................................. 7
4 Memo y p ocessing in b ain ........................................................................................ 8
4.1 Neu onal s uc u al emodeling ................................................................................ 8
4.2 Neu o ophic ac o s ................................................................................................. 9
4.2.1 Fib oblas g ow h ac o 2 (FGF2) .................................................................. 9
4.2.2 Ne e g ow h ac o (NGF) ........................................................................... 10
4.2.3 B ain-de i ed neu o ophic ac o (BDNF) ................................................... 10
4.3 14-3-3ζ p o ein ....................................................................................................... 11
II. OBJECTIVES .................................................................................................................. 13
III. MATERIALS & METHODS .................................................................................... 17
1 Fi s block o expe imen s. E ec o RGS14414 gene ea men on p e en ion o
an episodic memo y loss in aging and Alzheime ’s disease .................................... 19
1.1 Expe imen al design ............................................................................................... 19
1.1.1 E ec o RGS14414 on memo y loss in aging ................................................ 20
1.1.2 E ec o RGS14414 on memo y loss in Alzheime ’s disease ........................ 20
1.2 Me hods .................................................................................................................. 21
1.2.1 P epa a ion o RGS14-len i i us ................................................................... 21
1.2.2 P oduc ion o len i i us ................................................................................. 30
1.2.3 Animals .......................................................................................................... 33
1.2.4 S e eo axic su ge y ........................................................................................ 34
1.2.5 Tes o ORM .................................................................................................. 36
1.2.6 Da a analysis .................................................................................................. 37
1.2.7 Immunohis ochemis y .................................................................................. 38
2 Second block o expe imen s. De e mina ion o a co ela ion be ween RGS-
media ed enhanced objec ecogni ion memo y and neu onal a bo iza ion ........ 38
2.1 Expe imen al design ............................................................................................... 39
2.2 Me hods .................................................................................................................. 39
2.2.1 RGS14414 ea men and b ain dissec ion ....................................................... 39
2.2.2 Golgi-Cox s aining ........................................................................................ 39
2.2.3 Coun ing o neu i es, neu i es b anching and dend i ic b anching ................ 40
2.2.4 Da a analysis .................................................................................................. 41
3 Thi d block o expe imen s. De e mining a ela ionship o RGS-media ed
enhanced memo y wi h neu o ophic ac o s .......................................................... 42
3.1 Expe imen al design ............................................................................................... 42
3.2 Me hods .................................................................................................................. 43
3.2.1 B ain ex ac ion ............................................................................................. 43
3.2.2 qRT-PCR ....................................................................................................... 43
3.2.3 De e mina ion o BDNF p o ein le el by Wes e n blo ................................ 47
3.2.4 Da a analysis .................................................................................................. 49
4 Fou h block o expe imen s. Iden i ica ion o p o eins implica ed in RGS-
media ed enhanced memo y p ocessing ................................................................... 50
4.1 Expe imen al design ............................................................................................... 50
4.2 Me hods .................................................................................................................. 51
4.2.1 Tissue homogeniza ion and p o ein es ima ion ............................................. 51
4.2.2 Two-dimensional elec opho esis (2-DE) ..................................................... 51
4.2.3 Blue sil e gel s aining and analysis o p o ein spo s .................................... 53
4.2.4 Iden i ica ion o p o eins ............................................................................... 53
4.2.5 Wes e n blo analysis o elucida e a ela ionship o 14-3-3 ζ p o ein wi h
RGS-media ed memo y enhancemen ........................................................... 54
4.2.6 Da a analysis .................................................................................................. 54
IV. RESULTS .................................................................................................................... 55
1 RGS14414 gene ea men p e en s memo y loss in aging and Alzheime ’s
disease .......................................................................................................................... 57
1.1 S udy in aging a s .................................................................................................. 57
1.2 S udy in Alzheime ´s disease mice ........................................................................ 58
2 RGS14414 gene ea men p omo es co ical neu onal a bo iza ion ...................... 60
3 RGS14414 gene ea men boos s exp ession o b ain de i ed neu o ophic
ac o (BDNF) .............................................................................................................. 64
3.1 A selec i e inc ease in bo h mRNA and p o ein le els o BDNF .......................... 64
3.2 A dynamic BDNF p o ein exp ession du ing ORM p ocessing ............................ 65
4 An implica ion o 14-3-3ζ p o ein in RGS-media ed memo y enhancemen ........ 67
4.1 P o eomic p o iling e ealed an ele a ed exp ession o 14-3-3ζ in RGS- ea ed
animals ................................................................................................................... 67
4.2 Pa icipa ion o 14-3-3ζ p o ein in ORM p ocessing ............................................. 69
V. DISCUSSION ................................................................................................................... 71
1 P e en ion o memo y loss ......................................................................................... 73
2 BDNF in neu onal a bo iza ion and ORM .............................................................. 74
3 Regula ion o BDNF le els by 14-3-3ζ ....................................................................... 76
4 RGS-14-3-3ζ-BDNF pa hway in aging and Alzheime ´s disease ............................ 78
VI. CONCLUSIONS ......................................................................................................... 79
VII. RESUMEN .................................................................................................................. 83
1 INTRODUCCIÓN Y OBJETIVOS .......................................................................... 85
1.1 Regulado de la señalización de la p o eína G 14 (RGS14) y su implicación en
la memo ia ............................................................................................................. 85
1.2 Impo ancia de la plas icidad es uc u al y los ac o es neu o ó icos en la
o mación de la memo ia ....................................................................................... 88
2 MATERIALES Y MÉTODOS .................................................................................. 91
2.1 P ime bloque expe imen al. E ec o del a amien o del gen RGS14414 sob e la
p e ención de la pé dida de memo ia episódica que apa ece en la en e medad
de Alzheime y en el en ejecimien o ..................................................................... 91
2.2 Segundo bloque expe imen al. De e minación de la co elación en e la mejo a
de la ORM mediada po la p o eína RGS14414 y la a bo ización neu onal ........... 96
2.3 Te ce bloque expe imen al. De e minación de la elación en e la mejo a de la
memo ia mediada po RGS14414 y los ac o es neu o ó icos. .............................. 98
2.4 Cua o bloque expe imen al. Iden i icación de p o eínas implicadas en el
p ocesamien o de la mejo a de la memo ia mediada po el a amien o con
RGS14414.............................................................................................................. 103
3 RESULTADOS ......................................................................................................... 107
3.1 El a amien o con el gen RGS14414 p e iene la pé dida de memo ia asociada al
en ejecimien o y a la en e medad de Alzheime ................................................. 107
3.2 El a amien o con el gen RGS14414 p omue e la a bo ización dend í ica de
neu onas co icales ............................................................................................... 109
3.3 El a amien o con el gen RGS14414 aumen a la exp esión de BDNF .................. 110
3.4 Implicación de la p o eína 14-3-3ζ en la po enciación de la memo ia mediada
po RGS14414 ....................................................................................................... 112
4 DISCUSIÓN .............................................................................................................. 115
4.1 P e ención de la pé dida de memo ia. ................................................................. 115
4.2 Papel de la p o eína BDNF en la a bo ización neu onal y en la ORM en el
modelo RGS......................................................................................................... 116
4.3 Regulación de los ni eles de la p o eína BDNF median e la p o eína 14-3-3ζ ... 119
4.4 Vía de RGS-14-3-3ζ-BDNF en el en ejecimien o y en la en e medad de
Alzheime ............................................................................................................ 120
VIII. REFERENCES .......................................................................................................... 123
IX. APPENDICES ........................................................................................................... 137
1 Appendix 1. Molecula Biology ............................................................................... 139
2 Appendix 2. Cell Cul u e.......................................................................................... 142
3 Appendix 3. ORM Tes s ........................................................................................... 144
4 Appendix 4. His ology ............................................................................................... 145
5 Appendix 5. P o eomics ............................................................................................ 147
I. INTRODUCTION

I. In oduc ion
3
1 Regula o o G p o ein signaling 14 (RGS14)
RGS14 is a p o ein ha belongs o a amily o mo e han 30 membe s (Ishii & Ku achi
2003; Koelle 1997). All RGS p o eins sha e a 120-130 amino acids long RGS domain a N-
e minal. RGS domain binds GTP-bound G subuni o ac i a ed he e o ime ic G p o eins
and ac s as a GTPase-ac i a ing p o ein (GAP) o ca alyze GTP hyd olysis and dis up G-
p o ein-coupled ecep o (GPCR) signaling (De V ies e al 2000; Hollinge & Heple 2002;
Ross & Wilkie 2000; Wooda d e al 2015) ( igu e 1). A selec i e a enua ion in GPCR
signaling is accomplished h ough binding wi h dis inc iso o ms o G subuni s (A sha sky
& Pugh 1998; Be man & Gilman 1998; Be man e al 1996; De V ies & Fa quha 2002;
Heple 1999; Hollinge & Heple 2002; Neubig & Side o ski 2002; Ross & Wilkie 2000;
Tesme e al 1997). In con as o o he RGS, RGS14 engages wi h Gi/o sub amily o
p omo e GTP hyd olysis (Cho e al 2000; Hollinge e al 2001; T a e e al 2000; T a e e al
2004).
Gβ
Gγ
L
GTP GDP
Gα
Gα
GDP Gβ
Gγ
1. Basal s a e
L
2. Associa ion
E ec o s
Gβ
Gγ
E ec o s
Gα
GTP
3. Dissocia ion
RGS14
(GAP)
GDP
GTP
Gα
+
Figu e 1. He e o ime ic G-p o ein signaling. Classically de ined G p o ein signaling begins wi h a
he e o ime ic G p o ein (Gαβγ) bound o a G p o ein-coupled ecep o (GPCR). GPCR ac i a ion p omo es
GDP elease and subsequen GTP binding o ac i a ed Gα. Ac i a ion o Gα leads o dissocia ion o he
he e o ime ic complex and allows Gα and Gβγ o in e ac wi h downs eam e ec o s. As a GTPase, he α-
subuni hen apidly ini ia es i s own inac i a ion h ough GTP-hyd olysis and e u ns o i s basal s a e (Gα-
GDP), which leads he eassocia ion o he h ee subuni s wi h a GPCR. RGS p o eins wi h GAP ac i i y
accele a es GTP hyd olysis o Gα subuni egula ing he G p o ein signaling (Oldham & Hamm 2008).
RGS14 is a mul idomain p o ein, which apa om RGS domain con ains a C- e minal G
p o ein egula o y (GPR; also known as GoLoco) mo i o ≈ 20 amino acids, and wo cen al
andem Ra -like Ras binding domains (RBD), RBD1 and RBD2. (Kimple e al 2001;
Side o ski e al 1999) ( igu e 2). Th ough GPR mo i , RGS14 selec i ely binds inac i e
iso o ms o Gαi1-GDP o Gαi3-GDP o inhibi GDP dissocia ion (GDI). This ac i i y leads o
I. In oduc ion
4
a e ion o i s ac i a ion and a ge ing o he plasma memb ane (Kimple e al 2001; Kimple e
al 2002; Mi al & Linde 2004; Shu e al 2007; Willa d e al 2004). Phospho yla ion o
RGS14 a h eonine 497 by p o ein kinase A (PKA) enhances i s GDI ac i i y (Hollinge e al
2003). In addi ion, h ough i s RBD1 domain, RGS14 binds ac i a ed o ms o H-Ras and
Rap2 allowing RGS14 o engage H-Ras signaling pa hways such as Ras/Ra /MAP kinase
(Fo ms eche e al 2005; Kiel e al 2005; Mi al & Linde 2006; Shu e al 2010; T a e e al
2000; Willa d e al 2009; Wohlgemu h e al 2005). A p esen , binding pa ne s o RBD2 a e
unknown. Due o he p esence o se e al binding domains, RGS14 has been conside ed as a
sca old p o ein wi h mul iple unc ions. This idea is u he s eng hened by a dynamic
spa ial and empo al dis ibu ion pa e n o RGS14 ac oss he whole b ain and e en in
di e en cellula compa men s (E ans e al 2014; Lopez-A anda e al 2006; Shu e al 2007).
No he n blo expe imen s (Snow e al 1997), in si u hyb idiza ion s udies (G a s ein-Dunn e
al 2001), and quan i a i e polyme ase chain eac ion (qPCR) (La minie e al 2004) ha e
independen ly epo ed ha RGS14 mRNA is p esen in a and human b ain issue. Simila ly,
immunohis ochemical s udies (Lopez-A anda e al 2006) and immunoblo expe imen s
(Hollinge e al 2001) ha e shown ha RGS14 p o ein is en iched in a and monkey b ain.
1.1 RGS14414, a spliced a ian o RGS14
A human RGS14 gene spliced a ian o 1245 base pai s (GenBank, AY987041) ha
encodes a RGS14 p o ein o 414 amino acids (RGS14414) (Unip o , O43566-5) was cloned in
ou labo a o y om co ical b ain cDNA lib a y (see igu e 2). In he cu en hesis wo k, we
will ocus on his gene because o i s demons a ed ole in ecogni ion memo y (Lopez-
A anda e al 2009). In con as o comple e human (GenBank, NP_006471.2) and a
(GenBank, NC_005116.4) genes, RGS14414 ep esen s a dele ion o 153 amino acids a N-
e minal wi hin RGS domain. This dele ion causes emo al o GTPase ac i i y, a p ocess ha
is media ed h ough RGS domain. Apa om human, oden RGS14 gene, which encodes a
p o ein o 544 amino acids (RGS14544), has o en been used in s udies (Lee e al 2010).
Howe e , conside ing no only he absence o c ucial RGS domain o GTPase ac i i y bu
also he p esence o signi ican di e ences h oughou he whole sequence ( igu e 3), we
belie e ha ma u e p o ein o human RGS14414 is e y dis inc om a RGS14544, and human
RGS14414 migh be exclusi ely in ol ed in b ain unc ions ha a e no associa ed wi h GTP
hyd olysis.
I. In oduc ion
5
NH3COOH
RGS RBD1 RBD2
GoLoco
1-31 149-220 222-292 346-368
67-184 302-373 375-445
NH3COOH
RGS RBD1 RBD2
GoLoco
498-521
RGS14566 p o ein
RGS14414 p o ein
Figu e 2. A g aphic ep esen a ion o human RGS14 p o ein.
RGS
RGS14544 MPGKPKHLGVPNGRMVLAVSDGELTSTSGSQAQGEGRGSSLSIHSLPSGPSSPFSTDEQPVAS
RGS14414 ---------------------------------------------------------------
RGS14544 WAQSFERLLQDPRGLAYFTEFLKKEFSAENVTFWQACERFQQIPASDTKQLAQEAHNIYHEF
RGS14414 --------------------------------------------------------------
RGS14544 LSSQALSPVNIDRQAWLSEEVLAQPRPDMFRAQQLQIFNLMKFDSYARFVKSPLYQECLLAE
RGS14414 ----------------------------MFRAQQLQIFNLMKFDSYARFVKSPLYRECLLAE
RGS14544 AEGRPLREPGSSHLGSPDTARKKPKLKPGKSLPLGVEELGQLPLAEG---RPLRKSFRREMPG
RGS14414 AEGRPLREPGSSRLGSPDATRKKPKLKPGKSLPLGVEELGQLPPVEGPGGRPLRKSFRREL-G
RBD1
RGS14544 GTASVNSALRRESQGSLNSSASLDLGFLAFVSSKSESHRKSLGSGEGESESRPGKYCCVYLPD
RGS14414 GTA--NAALRRESQGSLNSSASLDLGFLAFVSSKSESHRKSLGSTEGESESRPGKYCCVYLPD
RGS14544 GTASLALARPGLTIRDMLAGICEKRGLSLPDIKVYLVGKEQKALVLDQDCTVLADQEVRLENR
RGS14414 GTASLALARPGLTIRDMLAGICEKRGLSLPDIKVYLVGNEQKALVLDQDCTVLADQEVRLENR
RBD2
RGS14544 ITFQLELVGLERVVRISAKPTKRLQEALQPILAKHGLSLDQVVLHRPGEKQLVDLENLVSSVA
RGS14414 ITFELELTALERVVRISAKPTKRLQEALQPILEKHGLSPLEVALHRPGEKQPLDLGKLVSSVA
RGS14544 SQTLVLDTLPDAKTREASSIPPCRSQGCLPRTQTKDSHLPPLSSSLSVEDASGSTGKRQTCDI
RGS14414 AQRLVLDTLPGVKISKARDKSPCRSQGCPPRTQDKATHPPPASPSSLVKVPSSATGKRQTCDI
GoLoco
RGS14544 EGLVELLNRVQSSGAHDQRGLLRKEDLVLPEFLQLPSQRPGSQEAPP----------------
RGS14414 EGLVELLNRVQSSGAHDQRGLLRKEDLVLPEFLQLPAQGPSSEETPPQTKSAAQPIGGSLNST
RGS14544 -----
RGS14414 TDSAL
Figu e 3. Compa ison o human RGS14414 wi h a RGS14544 p o ein.
I. In oduc ion
12
Fi s e idence ha ela ed 14-3-3ζ wi h memo y was done in D osophila melanogas e
whe e leona do gene, a homologous o e eb a e 14-3-3ζ, is abundan ly exp essed in
mush oom body neu ons. Mu an D osophila ha lacked leona do gene, showed signi ican
dec ease in capaci y o ol ac o y memo y bu no o ol ac o y senso y (Philip e al 2001;
Skoulakis & Da is 1996; 1998). Simila ly, a s udy using mu an mice wi h dele ion o 14-3-
3ζ, displayed ema kably educed capaci y o spa ial memo y and ORM compa ed o hei
wild- ype siblings (Cheah e al 2012). Fu he mo e, unc ional knockou mice o 14-3-3 in
hippocampus p esen ed impai men s in associa i e memo y and a de ici in LTP (Qiao e al
2014).

II. OBJECTIVES
II. Objec i es
15
P e iously, we ha e shown ha RGS14414 is a obus memo y enhance and i
p oduces an endu ing e ec on memo y. We ound ha RGS14414 gene ea men in a ea V2
o isual co ex led o a memo y enhancemen o such ex en ha i con e ed an objec
ecogni ion memo y no mally las ing o 45 min in o long- e m memo y ha could be aced
e en a e many mon hs (Lopez-A anda e al 2009). The e o e, conside ing his long-las ing
e ec o RGS14414 on memo y, we plan ed o s udy whe he memo y loss obse ed in oden
models o aging and Alzheime ´s disease can be p e en ed by RGS14414 gene ea men o
no . Nex , we explo ed h ough a ious biological p ocesses in b ain o p o ide explana ion o
RGS-media ed memo y enhancemen in oden s. Following objec i es we e conside ed:
Objec i e 1: Examine he e ec o RGS14414 gene ea men on p e en ion
o an episodic memo y loss in aging and Alzheime ’s disease.
A numbe o psychia ic and neu ological diso de s a e associa ed wi h memo y
impai men s; howe e Alzheime ’s disease and aging ela ed cogni i e decline a e he mos
s udied examples o i . Wi h he use o no mal aging a s and ansgenic mice o Alzheime ´s
disease, we ha e e alua ed whe he RGS14 gene ea men in o a ea V2 could se e as a
he apeu ic ool in p e en ion o episodic memo y loss seen in aging and in many
neu ological and neu odegene a i e diseases.
Objec i e 2: De e mina ion o ela ionship be ween neu onal a bo iza ion
and RGS14-media ed enhancemen in ORM.
Conside ing he endu ing e ec o RGS14414 p o ein on memo y enhancemen , we
belie e ha his long-las ing e ec a e due o pe manen s uc u al change caused by su ge in
neu onal connec ions and enhanced neu onal emodeling. The e o e, in his objec i e, b ains
o RGS-animals we e subjec ed o analysis o cell body neu i es ou g ow h in bo h py amidal
and non-py amidal neu ons and o p oli e a ion in dend i ic b anching in py amidal neu ons.
Objec i e 3: S udy o neu o ophic ac o s in RGS14-media ed memo y
enhancemen .
Pe manen s uc u al plas ici y ha causes a long- e m change in memo y unc ions,
such as seen in RGS14414- ea ed animals, has o en been associa ed wi h neu o ophic
II. Objec i es
16
ac o s. Thus, in his objec i e, we ha e s udied he e ec o RGS14 ea men on FGF2, NGF
and BDNF, neu o ophic ac o s ha a e abundan in b ain and a e ela ed wi h s uc u al
plas ici y and memo y.
Objec i e 4: Explo e he implica ion o 14-3-3ζ in acili a ion o RGS-
media ed memo y enhancemen .
This objec i e was designed o explo e in o he egula ion o neu o ophic ac o s and
hei ela ionship wi h s uc u al plas ici y and memo y enhancemen in RGS-animals. 14-3-
3ζ was iden i ied in p o eomics analysis and in his objec i e we ha e ocused on he ole o
his p o ein in RGS-media ed memo y enhancemen .
III. MATERIALS &
METHODS

III. Ma e ials & Me hods
19
1 Fi s block o expe imen s. E ec o RGS14414 gene ea men on
p e en ion o an episodic memo y loss in aging and Alzheime ’s
disease
In his block, we ha e explo ed whe he RGS14414 gene ea men can p e en
memo y loss in aging and Alzheime ´s disease, because hey a e wo mos s udied condi ions
whe e memo y loss has consis en ly been obse ed (D ag & Bieliauskas 2010).
1.1 Expe imen al design
To achie e he objec i e, we ha e used oden models o aging a s and ansgenic
mice o Alzheime ´s disease. A summa y o me hodological app oach o his block o
expe imen s is desc ibed in igu e 4:
Len i i us
p oduc ion
(RGS14 o
ehicle)
Da a
collec ion
(DI)
S a is ical analysis
(RGS14 s ehicle g oup)
B. E ec o RGS14414 on memo y loss in Alzehime ’s disease.
S e eo axic su ge y
(RGS/ ehicle ea men in
a ea V2)
10 min
10 min
10 min 10 min
24 h
Tes o ORM
4
27
Age in mon hs
A. E ec o RGS14 on memo y loss in aging.
Delay
3 min 3 min
Tes o ORM
Delay
5
318 20 22
45 min 45 min and 24h 24 h
Age in mon hs
24 h
S e eo axic su ge y
(RGS/ ehicle ea men in
a ea V2)
Figu e 4. Scheme o expe imen al design (age o appea ance o memo y loss shown in ed).
III. Ma e ials & Me hods
20
1.1.1 E ec o RGS14414 on memo y loss in aging
Male Wis a Han a s o 3 mon hs and olde we e ob ained om Cha les Ri e o be
used in his s udy.
(i) One g oup o 12 a s was moni o ed o hei ORM s a uses om he age o 3
o 18 mon hs o e alua e he age when memo y loss eme ges.
(ii) Fo he s udy o p e en ion o memo y loss, 15 a s o 3 mon hs old we e
ea ed wi h RGS14-len i i us and 7 a s wi h ehicle-len i i us and we e u he es ed o
ORM a ages o 5, 18, 20 and 22 mon hs ( igu e 4.A).
1.1.2 E ec o RGS14414 on memo y loss in Alzheime ’s disease
T ansgenic mice wi h Alzheime ’s disease o J20 line (AD-mice) we e ob ained om
Jackson Labo a o y. These mice o e exp ess human β-amyloid p ecu so p o ein (hAPP) wi h
Swedish (K670N/M671L) and Indiana (V717F) amilial AD mu a ions unde con ol o
pla ele -de i ed g ow h ac o B chain p omo e (PDGF) (Mucke e al 2000). The mice we e
on an inb ed C57BL/6J gene ic backg ound. Fo cu en s udy, in addi ion o AD-mice, we
ha e used wild- ype mice o C57BL/6J s ain as con ol.
(i) 12 wild- ype mice (C57BL/6J s ain) and 8 AD-mice we e es ed o ORM
s a us a ages o 2 and 4 mon hs o moni o he age o appea nace o ORM loss.
(ii) Fo p e en ion s udy, wel e 2-mon h old AD-mice ea ed wi h RGS-
len i i us, 8 AD-mice ea ed wi h ehicle-len i i us and 10 wild- ype mice wi h no ea men
we e es ed o ORM a ages o 4 and 7 mon hs ( igu e 4.B).
III. Ma e ials & Me hods
21
1.2 Me hods
1.2.1 P epa a ion o RGS14-len i i us
A low cha o he p epa a ion o len i i us is shown below:
RGS14414 ecombinan DNA
p oduc ion
PCR o add es ic ion si es
a bo h e mini o RGS14414
gene
Pu i ica ion o PCR p oduc
Vec o and inse es ic ion
eac ions
Liga ion eac ion be ween
RGS14414 and ec o
Ampli ica ion and pu i ica ion
o RGS14414 ecombinan
DNA
P oduc ion and i a ion o
len i i us
T ans ec ion and p oduc ion
(293T cell line)
Concen a ion o len i i us
solu ion
(Cen i uga ion)
Ti a ion
(HT1080 cell line)
Figu e 5. Scheme o he p oduc ion o len i i us con aining RGS14414 ecombinan DNA.
1.2.1.1 Cons uc ion o ecombinan RGS14414
1.2.1.1.1 RGS14414 gene
A 1245 base pai (bp) RGS14414 gene was o iginally cloned om human b ain
(GenBank, AY987041) (Lopez-A anda e al 2006), which ansla es o a p o ein o 414 amino
acids (Unip o , O43566-5).
1.2.1.1.2 Len i i al plasmid
The plasmid pLVX-DsRed-Monome -C1 was ob ained om Clon ech (Ca . No.,
632153) o inse ion o RGS14414 gene ( igu e 6.A). This ec o is based on len i i us HIV-1
III. Ma e ials & Me hods
28
(Li e Technologies, Ca . No. C8540-03) by hea shock acco ding o he manu ac u e ’s
p o ocol. In summa y, 4 µl o he liga ion p oduc dilu ed 1:20, we e added o a ial
con aining 50 µl o compe en cells and gen ly mixed. The mix u e was incuba e on ice o 30
min and cells we e hea -shocked o 30 s a 42 °C wi hou shaking a he he mos a ic ba h
SW22 (Julabo) o acili a e he en ance o DNA in o E. coli. The ial was immedia ely
e u ned o ice o 2 min and 250 µl o p e-wa med SOC medium was added o he
ans o med bac e ia. This ial was incuba ed o 90 min a 37 ºC wi h shaking a 225 pm in
an o bi al shake incuba o (Op ic I ymen Sys em).
Aliquo s o ans o med bac e ia (20, 50 and 200 µl) we e sp ead on LB-Aga pla es
p epa ed wi h 100 µg/ml ampicillin (appendix 1.B.1) and we e incuba ed o 18 h a 37 °C a
an incuba o (Incudigi , J.P Selec a). The ampicillin esis an colonies we e hen p ocessed o
minip ep o iden i y colonies exp essing co ec size o gene inse .
1.2.1.2.3.2 Minip ep
Among he g own colonies, ou (Col. 1-4) we e selec ed o he es o gene inse .
Each colony was inocula ed in 2 ml o LB liquid medium wi h 100 µg/ml ampicillin o 16 h
a 37 ºC while shaking a 225 pm in an o bi al shake incuba o (Op ic I ymen Sys em). An
aliquo o each bac e ial cul u e was sp ead on 90 mm diame e Pe i pla e o LB-aga wi h
ampicillin. The pla es we e incuba ed o 24 h a 37 ºC and s o ed a 4 ºC as s ock o u he
maxip ep p epa a ions.
The es o bac e ial cul u e was p ocessed o ex ac and pu i y ecombinan DNA by
using S a aP ep plasmid minip ep ki (Agilen echnologies, Ca . No. 400761), ollowing
manu ac u e ’s p o ocol wi h some modi ica ions (appendix 1.C.2).
To es gene inse size in all 4 colonies, es ic ion eac ions wi h XhoI and EcoRI
enzymes we e pe o med in each elu ed ecombinan DNA (see able 6). The es ic ion
eac ions ook place o 16 h a 37 ºC. Then, 15 U o each enzyme was added and incuba ed a
37 ºC o addi ional 2 hou s. Finally, he eac ion was s opped by hea ing a 65 ºC o 20 min.

III. Ma e ials & Me hods
29
Table 6. Res ic ion eac ion wi h XhoI and EcoRI endonucleases o DNA om minip ep.
REAGENT
VOLUME
( o each colony)
DNA pu i ied om Minip ep
5 µl
XhoI (20000 U/ml)
(New England Biolabs, Ca . No. R0146S)
1.5 µl
(30U/μg DNA)
EcoRI (20000 U/ml)
(New England Biolabs, Ca . No. R0101S)
1.5 µl
(30U/μg DNA)
NEBu e 2.1 (10X)
(New England Biolabs, Ca . No. B7202S)
2 µl
Nuclease-F ee wa e
(Gibco, Ca . No. 10977)
10 µl
TOTAL VOLUME
20 μl
The es ic ion p oduc s we e loaded in a 1 % aga ose gel (appendix 1.A.2) o isualize he
esul ( igu e 9.A), simila o as desc ibed in p e ious sec ion (see III.1.2.1.2.1). As shown in
igu e 9.A, colonies 2 and 3 p esen ed wo main bands o 8.8 and 1.28 kbp, which
co esponds o he ec o pLVX and he RGS14414 gene espec i ely. These esul s indica e
ha a leas , colonies 2 and 3 e ain he cha ac e is ics o ec o as well as o RGS gene inse .
Fo ou u u e expe imen s, colony 2 was selec ed o p oceed wi h he maxip ep and ob ain a
bigge amoun o RGS14414 ecombinan DNA.
1.2.1.2.3.3 Maxip ep
S o ed s ock o bac e ia o colony 2 was inocula ed in 5 ml o LB liquid medium wi h
100 µg/ml ampicillin (appendix 1.B.1) o 8 h a 37 ºC wi h shaking a 225 pm and hen, his
cul u e was added in o a lask con aining 300 ml o LB medium wi h ampicillin and u he
incuba ed a 37 ºC o 15 h, shaking a 225 pm. A s ock o bac e ia wi h RGS14414
ecombinan DNA was p epa ed a his s age and s o ed a -80 ºC (appendix 1.B.2) o long-
e m use.
Maxip ep was done by using Wiza d ® Plus Maxip ep DNA Pu i ica ion Sys em ki
(P omega, Ca . No. A7270), ollowing he manu ac u e ’s p o ocol (appendix 1.C.3). A e
maxip ep, esul an RGS14414 ecombinan DNA concen a ion was 635 ng/μl. Aliquo s o 20
μl o DNA solu ion we e done in 20 in DNAase ee ubes and s o ed a -80 ºC un il hei use.
The in eg i y o RGS gene inse in o ec o was u he examined by XhoI and EcoRI
III. Ma e ials & Me hods
30
es ic ion eac ion as desc ibed p e iously (sec ion III.1.2.1.2.3.2, able 6) ( igu e 9.B) and
addi ionally by 5´and 3´ sequencing. The ecombinan DNA ob ained om colony 2 showed
co ec size and o ien a ion o RGS gene inse . In addi ion, whole sequence was in ac and
showed no mu a ion (DNA sequencing was done by STAB VIDA; h p://www.s ab ida.ne ).
* *
1 2 3
Colony
1 2 3 4
4072 bp
12216 bp
1636 bp
1018 bp
A1 2 3
*
Col.
2
B
1.2.2 P oduc ion o len i i us
1.2.2.1 T ans ec ion o 293T cells and len i i us collec ion
The len i i us s ock was p oduced in he 293T cell line (Clon ech, Ca . No. 632180), a
subclone o he ans o med human emb yonic kidney cell line, HEK 293, wi h ype-5 human
adeno i us. These euka yo ic cells a e highly ans ec able and suppo high le els o
len i i al p o ein exp ession (Pea e al 1993). A c yogenic ube (Nunc, Ca . No. 375418)
con aining 2.0 x 106 293T cells was hawed (appendix 2.C) and seeded in a 75-cm2 cul u e
lask (Nunc, Ca . No. 156499) wi h 10 ml o comple e cul u e medium composed o : (i) 90 %
Dulbecco’s Modi ied Eagle’s Medium (DMEM) wi h high glucose (4.5 g/L), 4 mM L-
glu amine, 0.1 mM non-essen ial amino acids, 3.7 g/L sodium bica bona e (Sigma-Ald ich,
Figu e 9. XhoI and EcoRI es ic ion eac ion o DNA esul ing o minip ep and maxip ep o p o e he
p esence o RGS14414 ecombinan DNA. (A) Res ic ion eac ion o minip ep om colonies 1-4,
demons a ed ha only, colonies 2 and 3 had included RGS14414 ecombinan . Thus, he es ic ion eac ion
gene a ed wo main bands o 8.8 and 1.280 kbp which co espond o he ec o pLVX and he RGS14414 gene
espec i ely. Colonies 1 and 4 only had included he ec o wi hou he inse . (B) Res ic ion eac ion o
maxip ep om colony 2. A ows indica e he ec o pLVX and as e isks he RGS14414 gene. Numbe s 1, 2 and 3
indica e he molecula weigh ladde , RGS14414 as posi i e con ol and pLVX ec o wi hou endonucleases
cu ing espec i ely.
III. Ma e ials & Me hods
31
Ca . No. D5796) and 1 mM sodium py u a e (Sigma-Ald ich, Ca . No. S8636); (ii) 10 %
Fe al Bo ine Se um (Te Sys em App o ed FBS); (iii) 1 % penicillin-s ep omycin an ibio ic
(appendix 2.A.1). To acili a e cell a achmen , lasks we e p e- ea ed wi h a 0.3 % (w/ )
gela in solu ion (appendix 2.B). Cells we e main ained in a 37 °C humidi y incuba o (5 %
CO2 and 21 % O2). Comple e cul u e medium was exchanged e e y 2 days and subcul u es
we e pe o med when cells eached 80 %-90 % con luence (abou 3-4 days; see appendix
2.E). A s ock o 293T cell was p epa ed a e i s subcul u e and s o ed in liquid ni ogen o
u u e use (appendix 2.D).
A he six h subcul u e, 293T cells we e seeded in wo T175-cm2 cul u e lasks (Nunc, Ca .
No. 159910) wi h 25 ml o comple e medium, wi h goal o ob ain enough amoun s o cells
equi ed o ans ec ion wi h ecombinan DNA. Bo h RGS-len i i us and ehicle-len i i us
o emp y ec o we e p epa ed by using Len i-XTM Packaging Sys em (Clon ech, Ca . No.
631247) acco ding o manu ac u e ’s p o ocol. All s eps we e ca ied ou acco ding o
biosa e y le el 2 ins uc ions. In b ie , 4.5 x 106 cells pe pla e we e seeded in wel e 100-mm
Pe i pla es (Co ning, 734-1815) con aining 10 ml o comple e medium bu wi hou an ibio ic.
He e 6 pla es we e o con ol and o he 6 we e o RGS14. Cells we e incuba ed in 5 % CO2
incuba o a 37 ºC o 24 h. T ans ec ion solu ions we e p epa ed as shown in able 7. The
polyme solu ion ( ube 2) was mixed wi h he DNA solu ion ( ube 1) and incuba ed o 10
min a oom empe a u e o allow complex o ma ion. Mixed solu ion o 1200 µl was added
d opwise o cell cul u e pla e and hen, was gen ly ocked be o e incuba ing a 37 ºC in 5 %
CO2.
Table 7. P epa a ion o ans ec ion solu ions ( olume pe pla e).
No e: I is c ucial ha he X ec Polyme does no emain in aqueous solu ion o longe han 30 min
a oom empe a u e.
Tube 1 (DNA solu ion)
Tube 2 (polyme solu ion)
557µl X ec Reac ion Bu e
(Clon ech, 631317)
592.5µl X ec Reac ion Bu e
(Clon ech, 631317)
36 µl Len i-X HTX Packaging Mix
(Clon ech, 631260)
7.5µl X ec Polyme
(Clon ech, 631317)
11 µl RGS14414-pLVX (0.635 μg/µl)
o
14 µl ec o pLVX DsRed Monome C1
0.5 μg/µl (Clon ech, 632153)
---------
TOTAL
VOLUME
600 µl
TOTAL VOLUME
600 µl
III. Ma e ials & Me hods
32
A e 24 h, ans ec ion medium was eplaced wi h 10 ml esh comple e cell cul u e
medium and cell cul u e pla es we e incuba ed a 37 °C o an addi ional 48 h. Du ing his
pe iod, ans ec ed cells p oduce and elease non- eplican len i i us o medium. The e o e,
len i i al supe na an s we e ha es ed and pooled. Cellula deb is was emo ed by
cen i uga ion a 500 x g o 15 min a 4 ºC in CS15R Beckman cen i uge, ollowed by
il a ion o supe na an s h ough 0.45 µm polysul onic il e (Sa s ed , 831826). The len i i al
supe na an s we e main ained on ice du ing all he p ocedu e.
Finally, o concen a e, len i i al solu ions we e ul acen i uged (Ichim & Wells 2011;
Reise 2000) a 25,000 pm o 90 min a 4 ºC in Ul a-Clea ubes (Beckman Coul e ,
344058) using Beckman XL-90 ul acen i uge and SW29 o o . Supe na an s we e disca ded
and 150 μl o s e ile saline se um was added o pelle and placed a 4 ºC o o e nigh o
acili a e he esuspension o len i i us. Aliquo s o 3.5 μl we e p epa ed and s o ed a -80 ºC.
1.2.2.2 De e mina ion o len i i us i e in HT1080 cell line
The len i i us i e was de e mined using HT1080 cells (ATCC, CCL-121), a cell line
de i ed om human ib osa coma cell line. A c yogenic ube con aining 1.1 x 106 HT1080
cells was hawed (appendix 2.C) and seeded in a 75-cm2 cul u e lask (Nunc, Ca . No.
156499) wi h 10 ml o comple e cul u e medium composed o : (i) 90 % ( / ) Eagle's
Minimum Essen ial Medium supplemen ed wi h 1.5 g/L sodium bica bona e (Sigma-Ald ich,
Ca . No. D5796) and 1 mM sodium py u a e (Sigma-Ald ich, Ca . No. S8636); (ii) 10 % ( / )
Fe al Bo ine Se um; and 1 % ( / ) penicillin-s ep omycin an ibio ic (appendix 2.A.2). Cells
we e main ained in a CO2 incuba o a 37 °C. Comple e medium was exchanged e e y 2 days
and subcul u es we e pe o med when cells we e 80 %-90 % o con luence (usually e e y 3
days) (appendix 2.E). A he second subcul u e, a s ock o HT1080 cells was p epa ed and
s o ed in liquid ni ogen o u u e use (appendix 2.D).
A ou h subcul u e, 2 x 105 cells we e seeded in 2 ml pe well o a 6-well pla e (Nunc,
Ca . No. 140675) and we e incuba ed in CO2 incuba o o 24 h. Fo in ec ion o HT1080
cells wi h concen a ed len i i us, 10x se ial dilu ions anging om 10-3 o 10-7 we e p epa ed
in 1 ml comple e medium and hey we e added in each well o 6-well pla e oge he wi h one
well as mock con ol, whe e len i i us was eplaced by comple e medium. Cells we e
incuba ed in CO2 incuba o o 48 h. Fo he selec ion o ans ec ed cells, cul u e medium
III. Ma e ials & Me hods
33
om 6-well pla e was emo ed and eplaced by 2 ml o comple e HT1080 g ow h medium
con aining 1 μg/μl pu omycin (Clon ech, Ca . No. 631306). Since ec o pLVX con ains Pu o
gene, ans ec ed cells exp essing his gene a e expec ed o show esis ance agains his d ug.
In con inua ion, cells we e incuba ed in his d ug o 10 days wi h change o cul u e medium
e e y wo days. Su i ed cell colonies we e s ained in 1 % (w/ ) c ys al iole (Sigma
Ald ich, Ca . No. C3886), 10 % ( / ) e hanol (JT Bake , Ca . No. 8025) solu ion. Cells we e
insed wice o 1 min in 1 ml o phospha e bu e ed saline (PBS) pH 7.4 (Gibco, Ca . No.
10010) o elimina e cellula deb is, and hen incuba ed in he s ain solu ion o 10 min a oom
empe a u e. To emo e s aining solu ion, 3 washes o 1 min in PBS we e done.
The i e in e ms o colony- o ming uni s (CFU) o len i i us s ock was es ima ed by
calcula ing mean o he numbe o colonies gene a ed by wo leas concen a ed dilu ions,
mul iplied by he dilu ion ac o . As shown in igu e 10, RGS-len i i us i e was 1.75 x 107
CFU/ml, because 15 colonies we e obse ed in well o 10-6 dilu ion and 2 colonies in 10-7
dilu ion. In con as o RGS-len i i us, ehicle-len i i us i e was 2.75 x 106 CFU/ml.
Mock 10-3 10-4
10-5 10-6 10-7
B.Vehicle-Len i i us
A.RGS14414-Len i i us
Mock 10-3 10-4
10-5 10-6 10-7
Figu e 10. Ti a ion o len i i us s ocks. (A) RGS14414-len i i us shows a i e o 1.75 x
107 CFU/ml and (B) ehicle-len i i us p esen s a i e o 2.75 x 106 CFU/ml.
1.2.3 Animals
Roden s used in his s udy (see expe imen al design subsec ion o de ails, III.1.1)
we e housed indi idually in eu os anda d cage wi h ee access o ood and wa e . Animals
we e housed in a empe a u e-con olled (20 ± 2 ºC) oom on a 12 h ligh /da k cycle. All
expe imen al p ocedu es in animals we e ca ied ou in acco dance wi h Eu opean and
Spanish egula ions (2010/63/EU, and RD53/2013). Resea ch s udy pe o med in his hesis
was app o ed by Commi ee o E hics on Animals Use o Uni e si y o Malaga ( o a s) and
Uni e si y o Na a a ( o ansgenic mice).

III. Ma e ials & Me hods
34
1.2.4 S e eo axic su ge y
App oxima ely 4000 CFU in 2 µl ( o a s) o 2000 CFU in 1 µl ( o mice) o RGS-
len i i us o ehicle-len i i us we e deli e ed in o a ea V2 o isual co ex by s e eo axic
su ge y (Ce in e al 2006; Cooley & Vande wol 2005; Fo na i e al 2012), Be o e
p oceeding, animals we e deeply anes he ized by adminis e ing in ape i oneally 75 mg/kg
ke amine (Imalgene 1000; Me ial Labo a o ios) and 1 mg/kg ( a s) o 0.5 mg/Kg (mice) o
mede omidine (Dom o , P ize ).
Du ing su ge y, animal body empe a u e was main ained wi h an elec ic blanke . Animals
head was placed on he s e eo axic appa a us (S oel ing) as indica ed in igu e 11. Fo he
su ge y o mice, an adap o (Cunningham mouse, Ha a d Appa a us) was coupled.
The coo dina es o injec ion in a ea V2 (see able 8) we e aken om The Mouse B ain in
S e eo axic Coo dina es (Paxinos & F anklin 2001) and The Ra B ain in S e eo axic
Coo dina es (Paxinos & Wa son 1998). In ou expe imen s, an e opos e io (AP) and
mediola e al (ML) coo dina es a e om b egma and do so en al (DV) om du a ma e . To
access he du a ma e , he skull was pe o a ed using a d ill (D emel), and he du a ma e was
punc u ed o p e en he ca pule de ia ion.
Table 8. Roden injec ion coo dina es o a ea V2.
Roden
An e opos e io
(AP)
Mediola e al
(ML)
Do so en al
(DV)
RAT
+ 4.3
- 2.1
- 1.9
MOUSE
- 2.3
-1.3
-0.7
III. Ma e ials & Me hods
35
Figu e 11. Illus a ion o he expe imen al se up o in ac aneal len i i us mic oinjec ion in oden s. (A)
A pic u e ep esen ing a a placed in he s e eo ac ic ame. (B) A pic u e showing he b egma posi ion
(indica ed by an a ow) in he a skull. (C) A pic u e ep esen ing a mouse placed in he s e eo ac ic ame. 1:
s e eo axic appa a us; 2: in usion sys em; 3: d ill; 4: anes hesia; 5: su gical ins umen s; 6: elec ic blanke ; 7:
cold ligh ; 8: d y hea s e ilize ; 9: den al ca pule; 10: mouse s e eo axic adap o .
The injec ion was ca ied ou by a 30 G den al ca pule (He aeus Kulze Ibe ia) connec ed
o a 10 µl Hamil on sy inge (Mic oli e TM 701, Ha a d Appa a us) h ough a plas ic ube
connec o (Plas ic One). Len i i us was in used in o a ea V2 a he a e o 10 μl/h using an
in usion pump (11 Plus, Ha a d Appa a us). Once he len i i us injec ion was inished he
ca pule was main ained in o he b ain a ea o i e mo e minu es o acili a e comple e
di usion.
A e s e eo axic su ge y, animals we e ea ed daily o 5 days wi h local an ibio ic
(De mocan, Fa o) applica ion on he incision and 150 µl in ape i oneal injec ion o
Meloxicam analgesic (Me acam 5 mg/ml, Boeh inge Ingelheim). A e 21 days o injec ion
and o al eco e y om he su ge y, beha io al es s we e pe o med in hese animals.
III. Ma e ials & Me hods
36
1.2.5 Tes o ORM
ORM es was used in ou expe imen s o e alua e s a us o objec memo y in bo h
oden models. This es is based on spon aneous explo a ion and disc imina ion be ween
no el and amilia objec s (Ennaceu & Delacou 1988).
1.2.5.1 In a s
The p o ocol used o his s udy has been desc ibed p e iously (Lopez-A anda e al
2009). In b ie , p io o he ask, a s we e handled o 8 min du ing 5 consecu i e days. This
p ocess included placing animals on a m, gen ly ca essing on head and body wi h inge s, and
mo ing up and down e e y 2 o 3 min by holding he whole body. Following his, a s we e
habi ua ed wi h open ield box, a black home-made squa e o 100 x 100 x 50 cm, whe e ORM
es was going o ake place. They we e allowed o eely explo e he open ield o 12 min
daily o 3 consecu i e days. The day o ORM es , animals we e le i s o accommoda e
wi h es oom o 1 h and hen, es was pe o med in wo s eps as desc ibed below ( igu e
12):
Delay
3 min 3 min
Figu e 12. ORM es in a s.
(i) Exposu e o objec s. Two iden ical objec s we e placed a 30 cm dis ance
om walls o open ield box and animals we e eleased in o he box acing hei nose owa ds
he wall and opposi e o he objec s. They we e allowed o explo e he objec s o 3 min.
(ii) Disc imina ion o objec s. A e a delay o 45 min o 24 h, animals we e
exposed o one amilia objec ( om abo e) and a no el objec o 3 min. No el and amilia
objec s we e andomly placed on bo h sides o elimina e possible place p e e ence.
Bo h s eps we e eco ded wi h ideo came a and la e we e analyzed o explo a ion ime.
Open ield box and objec s we e cleaned wi h 70 % ( / ) e hanol be ween each animal o
elimina e in e e ing odo ails. Objec s included in his s udy (appendix 3.A) showed no
di e ence in p e ious objec p e e ence es .
III. Ma e ials & Me hods
37
1.2.5.2 In mice
We ha e ollowed he p o ocol o his wo k ha has been done p e iously (Esc ibano
e al 2009; Schiappa elli e al 2006). The handling and habi ua ion o mice a e simila o
desc ibed be o e o a s excep ha he open ield box was smalle (50 x 35 x 50 cm; Ha ad
Appa a us). Simila o a s, ORM es was done in wo s eps, bu ime o explo a ion o bo h
s eps was di e en ( igu e 13):
10 min
10 min
10 min 10 min
24 h
Figu e 13. ORM es in AD-mice model.
(i) Exposu e o objec s. Two acquisi ion sessions o 10 min we e done wi h 10
min apa . Du ing each session, animals we e allowed o explo e wo iden ical objec s.
(ii) Disc imina ion o objec s. A e a delay o 24 h, animals we e exposed o
10 min o one amilia objec and a no el objec .
The objec s included in mice s udies a e shown in appendix 3.B.
1.2.6 Da a analysis
Reco ded ideos we e analyzed by in es iga o s wi hou any knowledge o which
animal belongs o which g oup. Explo a ion ime was compu ed by using he c i e ia o
du a ion when animal ouches he objec wi h nose. Conside ing he da a on ime spen in
explo a ion o each objec , disc imina ion index (DI) was calcula ed as ollowing, whe e N is
explo a ion ime o no el objec and F is explo a ion ime o amilia objec :
DI= N/ (N + F)
DI alue o 0.5 eflec s equal explo a ion ime o bo h amilia and no el objec s and
u he sugges s ha animals we e unable o keep he objec in o ma ion in memo y. Howe e
a DI alue abo e o 0.66 was conside ed ha animals could e ain he in o ma ion in memo y
a e a delay pe iod.
III. Ma e ials & Me hods
44
ki (Quiagen, 74124) ollowing manu ac u e s’ p o ocol (appendix 1.D). RNA pu i y and
concen a ion we e de e mined by measu ing abso bance a 260 and 280 nm in
Nanod op1000, 3.7 (The mo Scien i ic). The concen a ion o RNA was de e mined using
he o mula o one uni a A260 is equal o 40 μg/ml o o al RNA. A260/A280 a io o RNA
samples was be ween 1.8 and 2, indica ing a good pu i y g ade o RNA.
3.2.2.2 Re e se ansc ip ion (RT) o ex ac ed RNA
Fo emo al o genomic DNA, ex ac ed RNA samples we e incuba ed wi h DNase I
enzyme a 37 ºC o 30 min ( able 9) and hen, enzyme was inac i a ed by hea ing a 75 ºC o
10 min. RNA samples we e s o ed a 4 ºC.
Table 9. Reac ion o emo e he genomic DNA.
REAGENT
AMOUNT
10X DNAase Bu e
( Ambion, AM2235)
1.4 µl
DNase I (2 U/μl)
(Ambion, AM2235)
0.2 U
RNA sample
1µg
Nuclease-F ee wa e
(Gibco, 10977)
Up o 14 µl
TOTAL VOLUME
14 μl
The RT eac ion was pe o med wi h he High Capaci y RNA- o-cDNA ki (Applied
Biosys ems, 4387406) as shown in able 10. The eac ion was pe o med a 37 ºC o 30 min
and e e se ansc ip ase was inac i a ed by hea ing a 95 ºC o 5 min. The cDNAs we e
s o ed a -20 ºC.
Table 10. Re e se ansc ip ion (RT).
REAGENT
AMOUNT
2X RT Bu e Mix
16 µl
20X RT Enzyme Mix
1.6 µl
RNA sample
( esul ing om genomic DNA diges ion)
14 µl
Nuclease-F ee wa e
(Gibco, 10977)
0.4 µl
TOTAL VOLUME
32 μl

III. Ma e ials & Me hods
45
The cDNA concen a ion was es ima ed as abo e (in RNA ex ac ion, III.3.2.2.1) using
o mula o one uni a A260 is equal o 33 μg/ml o ssDNA and A260/A280 a io o DNA
samples was be ween 1.8 and 2.
3.2.2.3 P ime s design
Fo wa d and e e se p ime s ( able 11) we e designed wi h he use o so wa e P ime
Exp ess, 2.0 (Applied Biosys ems). Speci ici y o p ime s was checked by he so wa e
P ime -Blas (NCBI) (Ye e al 2012) and inally a qRT-PCR simula ion was done by he
so wa e Ampli y 1.2 (Uni e si y o Wisconsin).
Table 11. qRT-PCR p ime sequences.
GENE
GENBANK
CODE
1SEQUENCE (5’3’)
AMPLICON
LENGTH
(bp)
BDNF
NC_005102.4
Fo wa d:
AAGCAATATTTCTACGAGACCAAGTG
110
Re e se:
TACGATTGGGTAGTTCGGCATT
FGF-2
NM_019305.2
Fo wa d:
GACGGCTGCTGGCTTCTAAGT
90
Re e se:
TCCGTGACCGGTAAGTGTTG
NGF
NM_001277055.1
Fo wa d:
GCAGACCCGCAACATCACT
90
Re e se: GGTGGAGGCTGGGTGCTAA
*
Ribosomal
p o ein L19
(Rpl19)
NM_031103.1
Fo wa d:
ATGCCAACTCTCGTCAACAG
102
Re e se:
AGGTGTTCTTCCGGCATCG
*Housekeeping gene.
1P ime s we e syn hesized by Sigma-Ald ich Company.
3.2.2.4 De e mina ion o op imal p ime concen a ion o qRT-PCR
Th ee di e en concen a ions o p ime s (0.45, 0.225 and 0.1125 µM) we e es ed in a
qRT-PCR eac ion (see sec ion III.3.2.2.6 below) whe e each p ime concen a ion was used
wi h 3 di e en amoun s o cDNA (640, 320 o 160 ng) om ehicle g oup as empla e.
Op imal p ime concen a ion was selec ed o qRT-PCR expe imen s based on ollowing wo
c i e ia:
III. Ma e ials & Me hods
46
i) P ime s concen a ion ha ep esen lowes cycle h eshold (C ) alues.
ii) Va ia ions in C alue be ween one concen a ion o cDNA o o he a e
main ained o 1. The e o e, applying hese c i e ia, we ound ha 0.45 µM p ime
concen a ion was op imum o all ou genes ha we e subjec o s udy.
3.2.2.5 C ea ing s anda d cu es
Using op imal p ime concen a ion, i e se ial dilu ions o he DNA anging 10-4 o
10-9 we e p ocessed o qRT-PCR o gene a e s anda d cu e whe e DNA concen a ion was
ep esen ed on X axis and co esponding C alue on Y axis. A good linea ela ionship
be ween C and he loga i hm o DNA was conside ed when co ela ion coe icien ( )
eached o e 0.99. Fu he mo e, slope alues (m) ha e lec ampli ica ion coe icien , we e
e y simila ac oss he genes s udied (F=1.01; p = 0.34). Figu e 18 shows ep esen a i e
s anda d cu es o BDNF and Rpl19.
y = -2,8456x + 22,56
R² = 0,9974
E= 124.61%
0
5
10
15
20
25
01234
CT
Log ( g cDNA)
BDNF
y = -3,9024x + 32,129
R² = 0,9961
E= 80.41%
0
5
10
15
20
25
30
02468
CT
Log ( g cDNA)
Rpl19
3.2.2.6 qRT-PCR eac ion
A e p ime op imiza ion and s anda d cu e analysis, we se ou o pe o m qRT-
PCR o he e alua ion o di e en ial gene exp ession be ween he b ain issues ob ained
om con ol and RGS14 ea ed a s. The qRT-PCR eac ions we e pe o med in
he mocycle 7500 Real-Time PCR Sys ems (Applied Biosys ems), using he Powe SYBR®
G een PCR Mas e Mix ki (Applied Biosys ems, Ca . No. 4367659) as i is de ailed in able
12. T iplica es we e un o each cDNA sample in a Mic oAmp®Op ical 96-Well Reac ion
Figu e 18. S anda d cu es.
III. Ma e ials & Me hods
47
Pla e wi h Ba code (Applied Biosys ems, Ca . No. 4306737). In addi ion o housekeeping
gene, nega i e con ol wi hou cDNA was un a he same ime. Once all eac i e we e added,
pla es we e sealed wi h qPCR Adhesi e Clea Seals (4 i ude, Ca . No. 4 i-0560) and
cen i uged a 1000 pm o 1 min a 4 ºC in he Cen i uge 5810R (Eppendo ) using he A-
462 o o , be o e placing i on he qRT-PCR he mocycle . The quan i a i e ampli ica ion
condi ions a e shown in able 13.
Table 12. qRT-PCR eac ion.
REAGENT
AMOUNT
CONCENTRATION
Powe SYBR® G een PCR Mas e Mix (2X)
12 µl
1X
Re e se p ime
8 µl
0.45 µM
Fo wa d p ime
8 µl
cDNA
4 µl
640 ng
TOTAL VOLUME
24 μl
Table 13. qRT-PCR ampli ica ion cycles and empe a u es.
STEP
TEMPERATURE
TIME
Polyme ase ac i a ion
95 ºC
10 min
40 cycles
Dena u a ion
95 ºC
15 s
P ime annealing
and ex ension
60 ºC
1 min
Dissocia ion eac ion
(1 cycle)
95 ºC
15 s
60 ºC
1 min
95 ºC
30 s
60 ºC
15 s
3.2.3 De e mina ion o BDNF p o ein le el by Wes e n blo
3.2.3.1 B ain homogeniza ion and p o ein es ima ion
B ain punches o injec ion a ea V2 we e dissec ed ou (see III.3.2.1) and ozen
immedia ely in d y ice and s o ed a -80 ºC. B ain issues we e hawed, weigh ed and
homogenized in 2 ml o 0.01 M T is-HCl bu e pH 7.4 (appendix 5.A.1) which included 1 %
( / ) p o ease inhibi o cock ail (Sigma-Ald ich, P8340) and 1 % ( / ) phospha ase inhibi o
III. Ma e ials & Me hods
48
cock ail (Sigma-Ald ich, P0044), using issue homogenizing sys em (Glas col) and a 10 ml
glass-Te lon homogenize (Glas col). The homogeniza ion was done in 3 cycles o 10 sho
s eps, main aining he homogena e in ice o 1 min be ween cycles o p e en hea ing. P o ein
concen a ion o homogenized samples was de e mined by Low y me hod (Low y e al 1951)
(appendix 5.A.2). 50 μl aliquo s we e hen lyophilized in SPD1010 SpeedVac Sys em
(The mo Sa an ) o 45 min wi hou hea ing and s o ed a -80 ºC un il used.
3.2.3.2 Dena u ing polyac ylamide gel elec opho esis (SDS-PAGE) and p o ein
ans e o memb ane
Loading bu e (Laemmli 1970); see appendix 5.A.3) was added o lyophilized
samples o ob ain 1 μg/μl p o ein concen a ion. The samples we e hea ed a 95 ºC o 10 min
wice in a he mos a ic block hea e TDB-100 (Boeco) o dena u e and dissol e he p o eins.
2.5 μg and 5 μg o samples we e un in 4–20 % Mini-PROTEAN® TGX™ p ecas
polyac ylamide gels (Bio-Rad, 456-1096) using elec opho esis uni (Mini-PROTEAN 3 Cell,
Bio-Rad). Sodium dodecyl sul a e polyac ylamide gel elec opho esis (SDS-PAGE) was un
a 150 V (Powe -Pac 300, Bio-Rad) wi h 1X T is-Glycine-SDS 1X (TGS) unning bu e
(appendix 5.A.4). A 5 μl o p o ein ladde anging be ween 10-250 kDa (P ecision Plus
P o ein TM Dual Colo S35 om Bio-Rad, 161-0374), we e also loaded in gel. Sepa a ed
p o eins on polyac ylamide gel we e ans e ed o a poly inylidene di luo ide (PVDF)
memb ane (Bio-Rad, 1704156) using he Tu bo T ans-Blo appa a us (Bio-Rad) o 7 min a
25 V/ 3 A.
3.2.3.3 Immunode ec ion
Memb anes we e incuba ed wi h blocking solu ion p epa ed wi h 10 % (w/ )
powde ed skimmed milk and 2 % (w/ ) BSA (Sigma-Ald ich, A3059) in PBS wi h Tween-20
(PBST) pH 7.4 (appendix 5.A.6) o 3 h a oom empe a u e by gen le shaking. Memb anes
we e washed 4 imes in PBST o 5 min each and incuba ed o e nigh a 4 ºC wi h p ima y
an ibody, goa an i-BDNF (San a C uz Bio echnology Inc., sc-33904) (dilu ion 1:250) and as
con ol o p o ein loading, monoclonal mouse α- ubulin an ibody (Sigma Ald ich, T8203)
(dilu ion 1:7500). Bio inyla ed seconda y an ibodies we e om ho se an i-goa (Vec o Lab.,
BA9500) and goa an i-mouse (Vec o Lab., BA-9200). Bo h p ima y and seconda y
an ibodies we e p epa ed in 5 % (w/ ) powde ed skimmed milk, 2 % (w/ ) BSA and 0.1 %
(w/ ) sodium azide (Sigma Ald ich, S2002) in PBST. A e incuba ion wi h p ima y an ibody,
III. Ma e ials & Me hods
49
memb anes we e washed 4 imes and incuba ed in seconda y an ibody a oom empe a u e
o 75 min. A e washing, memb anes we e incuba ed wi h ex a idin-pe oxidase conjuga e
(Sigma-Ald ich, Ca . No. E2886) (dilu ion 1:2000 in PBST) o 50 min a oom empe a u e.
Finally, polypep ide bands co esponding o BDNF o α- ubulin we e de eloped by 3,3’-
diaminobenzidine (DAB) Enhanced liquid subs a e sys em (Sigma-Ald ich, D3939) as a
b own p ecipi a e. High esolu ion images o d ied blo s we e acqui ed wi h scanne Epson
pe ec ion V750 P o. Densi ome y analysis o bands was pe o med using Quan i y One
e sion 4.3.6 so wa e (Bio-Rad) and O.D. alues we e no malized wi h α- ubulin.
3.2.4 Da a analysis
3.2.4.1 Analysis o qRT-PCR da a
cDNA alues co esponding o genes we e no malized wi h housekeeping Rpl19 and
pe cen age o change be ween ehicle and RGS g oups we e calcula ed as ollowing:
[(Qgene no RGS - Qgene no Vehicle) x 100 / Qgene no Vehicle]
The Qno we e p esen ed as he mean ±SEM and signi ican di e ence be ween RGS and
ehicle we e es ed by pai ed - es (SigmaS a 3.5 so wa e, Jandel Scien i ic), accep ing a
con idence in e al o 95 % (p ≤ 0.05).
3.2.4.2 Analysis o Wes e n blo da a
The op ical densi y o BDNF p o ein (RGS o ehicle) was no malized wi h α- ubulin
(O.DBDNF / O.Dα- ubulin). Subsequen ly, he pe cen age change o BDNF p o ein in RGS14
g oup ela ed o he ehicle was calcula ed o each day pos - ea men o each ime pos -
objec acquisi ion using he O.D no malized alues (ODno ) as ollowing:
[(O.DBNFno RGS – O.DBDNFno Vehicle) x 100/ O.DBDNFno Vehicle]
The alues we e exp essed as mean ±SEM. S uden ’s pai ed - es s (SigmaS a 3.5; Jandel
Scien i ic) compa ing no malized O.D alues o bo h ea men we e ca ied ou o iden i y
Signi ican di e ences (p ≤ 0.05).

III. Ma e ials & Me hods
50
4 Fou h block o expe imen s. Iden i ica ion o p o eins implica ed in
RGS-media ed enhanced memo y p ocessing
This sec ion was designed o unco e molecula componen s implica ed in RGS-
media ed memo y enhance e ec . The e o e, a p o eomic s udy was pe o med wi h he idea
o shed ligh on p o ile o p o eins ha a e changing du ing his p ocess.
4.1 Expe imen al design
B ain punches o a ea V2 we e ob ained a 4, 7 and 21 days a e RGS o ehicle
ea men and we e p ocessed o p o eomic analysis. Di e en ially exp essed p o eins we e
iden i ied and sea ched o co ela ion wi h memo y. In pa icula , we ha e ocused on 14-3-
3ζ, a p o ein known o be in ol ed in memo y p ocessing. Gene and p o ein le els we e
es ima ed by qRT-PCR and WB, espec i ely. An implica ion o his p o ein in ORM
p ocessing was also in es iga ed. A summa y o he expe imen al design is in igu e 19.
Len i i us p oduc ion
(RGS14 o ehicle)
S e eo axic
su ge y
(RGS/ ehicle
ea men in a ea
V2)
3-mon h a s
S a is ical analysis
(RGS14 s ehicle)
B. E ec o RGS14414 gene ea men on 14-3-3ζp o ein le els.
C. Implica ion o 14-3-3ζp o ein du ing memo y p ocessing.
21 days
3 min
20 min
40 min
60 min
24 h
Delay a e objec exposi ion
Sac i ice and a ea V2 ex ac ion
A. Iden i ica ion o p o eins implica ed in RGS-media ed memo y enhancemen .
Tissue
p ocessing
o p o ein
ex ac ion
Da a
collec ion
(O.D alues)
P o eins
sepa a ion
(2-DE)
Sac i ice and a ea V2 ex ac ion
21
Days pos - ea men
7
4
P o eins
s aining
(Blue Sil e
s aining)
Di e en ial-
exp essed p o eins
iden i ica ion
(Mass spec ome y)
Da a collec ion
(O.D alue o 14-3-
3ζp o ein)
14-3-3ζp o ein
quan i ica ion
(Wes e n blo )
Tissue p ocessing o
p o ein ex ac ion
(samples om he 3 d
block o expe imen s)
Sac i ice and
a ea V2
ex ac ion
21 days
Figu e 19. Scheme o expe imen al design.
III. Ma e ials & Me hods
51
4.2 Me hods
4.2.1 Tissue homogeniza ion and p o ein es ima ion
12 Wis a Han a s weighing 280-320 g we e ea ed wi h RGS o ehicle-len i i us
( om subsec ion III.1.2.2) by s e eo axic su ge y (see o de ails in subsec ion III.1.2.4).
These animals we e housed and main ained as desc ibed in i s block o expe imen s
(subsec ion III.1.2.3).
Animals we e sac i iced a 4, 7 o 21 days a e he injec ion and punches o a ea V2 we e
dissec ed ou . Fo homogeniza ion, b ain issues (app oxima ely 100 mg) we e hawed,
weigh ed and homogenized in 100 μl o ice cold sample solubiliza ion bu e (7 M u ea, 2 M
hiou ea, 4 % CHAPS, 1 % di hioe y h i ol; see appendix 5.B.1) using 1 ml glass-Te lon
homogenize . Samples we e hen sonica ed h ee imes o 1 min a 4 ºC and lea ing on ice
o one minu e be ween each sonica ion. Samples we e cen i uged wice a 13,000 pm o 15
min a 4 ºC (Beckman CS-15R, o o F2402H), collec ing he supe na an in a new clea 1.5
ml ube and disca ding he pelle be ween each cen i uga ion. P o ein concen a ion o
supe na an s we e de e mined by B ad o d me hod (B ad o d 1976) (appendix 5.B.3) and
aliquo ed samples o 150 μg we e s o ed a -80 ºC.
4.2.2 Two-dimensional elec opho esis (2-DE)
P o eins o samples we e sepa a ed by wo-dimensional elec opho esis (Bjellq is e
al 1982; Go g e al 2009; O'Fa ell 1975). Du ing he i s dimension, p o eins a e sepa a ed
ho izon ally acco ding o hei isoelec ic poin s (pI) using immobilized pH g adien (IPG)
and applying an elec ic cu en . Du ing he second dimension, p o eins wi h same pI we e
u he sepa a ed wi h SDS-PAGE acco ding o hei molecula weigh .
4.2.2.1 Isoelec ic Focusing: Fi s dimension elec opho esis
Be o e p oceeding, s o ed samples we e hawed, gen ly o ex, sonica ed o 1 min
and cen i uged a 13,000 pm (Beckman CS-15R, o o F2402H) o 10 min a 4 ºC. Pelle s
we e disca ded, in case i was obse ed. Fi s dimension o 2-DE was done using 7 cm IPG
s ips o an immobilized nonlinea g adien gel o pH 3-10 (Bio-Rad, Ca . No. 163-2002). A
o al o 100 μg o p o ein in 125 μl o 0.4 % ampholy es sample solubiliza ion bu e
(appendix 5.B.1) was applied in iplica es on o ocusing ays (P o ean IEF Cell ay om
Bio-Rad) and hen, IPG gel s ips we e ca e ully laid on he ay. A e se ing he co e ,
III. Ma e ials & Me hods
52
ocusing ays we e placed on he P o ean IEF Cell (Bio-Rad) o un isoelec o ocusing
p og am ( able 14). Be o e s a ing he isoelec o ocusing, we ed pape wicks (Bio-Rad, 165-
4071) we e placed on bo h elec odes a he end o each s ip. To imp o e en y o highe
molecula weigh p o eins in o IPG gel ma ix, an ac i e ehyd a ion was pe o med by
applying 50 V low cu en o 14 h. The gel s ips we e co e ed wi h pa a in oil (Fishe
Scien i ic, 0121-1) du ing ehyd a ion.
Table 14. IEF p og am.
STEP
VOLTAGE
TIME
Ac i e ehyd a ion
50 V apid
14 h
Isoelec ic
Focusing
S ep 2
250 V apid
30 min
S ep 3
4000 V linea
1 h
S ep 4
4000 V apid
11000 Vh s
S o age
100 V apid
20 h
(s opped a
30 min-2h)
To al Vh s
13900-14200
4.2.2.2 IPG gel s ips equilib a ion
An equilib a ion p o ocol ( educ ion/alkyla ion eac ion) was pe o med a e i s
dimension o acili a e p o eins ans e o second dimension (Go g e al 1988). A he end o
isoelec ic ocusing, s ips we e incuba ed in 10 ml o equilib a ion s ock bu e (appendix
5.B.2) wi h 0.03 M di hioe y h i ol (Fluka, Ca . No. 43794) o 20 min wi h shaking a oom
empe a u e. The educ ion eac ion wi h di hioe y h i ol was ollowed by incuba ion in 10 ml
o equilib a ion s ock bu e wi h 0.136 M iodoace amide (AppliChem Ca . No. A1666, 0100)
o 20 min wi h shaking in da kness a oom empe a u e, o alkyla e sul hyd yl g oups o
a oiding poin -s eaking in SDS-PAGE.
4.2.2.3 SDS-PAGE: Second dimension elec opho esis
A e equilib a ion s ep, s ips we e embedded on o 12 % polyac ylamide minigels
(appendix 5.B.4). To ix he s ip, suppo space on op o gel was illed wi h 0.5 % aga ose
and 0.05 % b omophenol blue in 1X TGS bu e (BioRad 161-0772). A hole on he uppe le
co ne was made o load 3 μl o BenchMa kTM P e-s ained P o ein ladde (Bio-Rad,
10748010). Gel elec opho esis was ca ied ou a 40 V o 15 min in Mini-P o ean Sys em
(Bio-Rad) using 1X TGS bu e . The ol age was hen inc eased o 120 V o 1 h 7 min.
III. Ma e ials & Me hods
53
4.2.3 Blue sil e gel s aining and analysis o p o ein spo s
A e second dimensional elec opho esis, each gel was incuba ed wice in 50 ml
ixa ion solu ion p epa ed wi h 30 % ( / ) me hanol and 10 % ( / ) ace ic acid, o 30 min
each ime on ocke , and hen once o 24 h. A e insing 4 imes wi h deionized wa e o 15
min, gels we e s ained in 0.12 % B illian Blue G-Colloidal dye solu ion (Candiano e al
2004);appendix 5.C.1) o o e nigh a oom empe a u e. Excess o dye was emo ed by
insing he gels 4 imes in deionized wa e o 5 min. Finally, Gels we e scanned wi h
Calib a ed Imaging Densi ome e Model GS-800 (Bio-Rad) and s o ed a 4 ºC in he mo
sealed plas ic bags wi h 0.02 % sodium azide solu ion. Acqui ed images we e analyzed by
using PDQues Ad anced 7.1.1 so wa e (Bio-Rad). O.D. alues o each spo we e
no malized and au oma ic spo densi y ma ching was hen pe o med o ini ial e alua ion.
Fu he mo e, iden i ied spo s we e con i med by manual ma ching. Spo s e lec ing a leas 2-
old change be ween RGS- ea ed and con ol animals we e conside ed o u he analysis
and p o ein iden i ica ion.
4.2.4 Iden i ica ion o p o eins
P o eins om excised gel spo s a e diges ed enzyma ically o pep ides and subjec ed o
MALDI TOF-TOF Mass Spec ome e (Aebe sold & Mann 2003). Ob ained esul s a e
ma ched agains p o ein sequence da abases o iden i y he p o eins.
4.2.4.1 Excision o spo s and des ainig
Iden i ied p o ein spo s we e ca e ully and manually excised om gels and s o ed a 4
ºC. Fo elimina ion o Coomassie blue dye, excised gel spo s we e ea ed wi h 150 μl o
des ainig solu ion p epa ed wi h 30 % ( / ) ace oni ile and 50 mM ammonium bica bona e
(appendix 5.C.2) o 15 min a oom empe a u e on ocke . This s ep was epea ed un il spo s
we e comple ely anspa en . Then, gel pieces we e washed wice wi h 150 μl o deionized
wa e . Finally, a e emo al o wa e , spo s we e d ied in a SPD1010 Speed Vac Sys em
(The mo Sa an ) o 1 h wi hou hea ing.
4.2.4.2 T yp ic diges ion and pep ide ex ac ion
P o eins in d ied gels we e diges ed wi h ypsin o gene a e small size polypep ides
ha can be iden i ied by MALDI-TOF. The eac ion was ca ied ou by incuba ion o d ied
spo wi h 3 μl o 10 ng/μl ypsin (Sigma Ald ich, T6567) in 10 mM ammonium bica bona e
(NH4HCO3) bu e , pH 8.5 (appendix 5.D.1) o o e nigh in a we a mosphe e. A e
IV. Resul s
60
2 RGS14414 gene ea men p omo es co ical neu onal a bo iza ion
In i s pa o s udy, i was shown ha he e ec o RGS14414 ea men on memo y
pe sis ed o li e ime o a s. The e o e, we posi ha his long-las ing e ec is due o he
pe manen s uc u al change in b ain, which in u n acili a es in o ma ion p ocessing and
memo y o ma ion. Hence, in his pa o he s udy, b ains o RGS14- ea ed a s we e s ained
wi h Golgi-Cox sil e s aining and an analysis o neu onal a bo iza ion was done in ea ed
a ea by coun ing neu i es and dend i ic b anching.
An ini ial s udy o neu onal d awing o bo h py amidal and non-py amidal neu ons o
RGS- ea ed animals demons a ed a signi ican inc ease in o e all neu onal a bo iza ion and
ha could be app ecia ed by jus a isual examina ion ( igu e 22). RGS14 ea men p oduced
a signi ican inc ease in neu i es o igina ing om cell body o py amidal neu ons (RGS 4.595
± 0.190 e sus ehicle 3.643 ± 0.181, p≤0.001) (py amidal neu ons, neu i es in igu e 23),
whe eas his e ec was mo e p onounced in neu i es o non-py amidal neu ons (RGS 6.069 ±
0.211 e sus ehicle 3.673 ± 0.248 neu i es pe neu on, p≤0.001) (non-py amidal neu ons,
neu i es in igu e 23). In con as o neu i es, RGS ea men caused a obus inc ease in
dend i ic b anching o py amidal neu ons, leading o almos wice he numbe o ehicle
ea ed con ol animals (RGS 6.646 ± 0.342 e sus ehicle 3.357 ± 0.314, p≤0.001). The
analysis o b anching in neu i es showed no di e ence in py amidal neu ons (RGS 1.494 ±
0.185 e sus ehicle 1.714 ± 0.286, p=0.5) as well as in non-py amidal neu ons (RGS
1.914±0.249 e sus ehicle 1.491±0.226, p=0.212). The e o e, hese esul s sugges ha RGS
ea men poses p ominen e ec on dend i ic b anching o py amidal neu ons and on cell
body neu i es o non-py amidal neu ons ( igu e 23).

IV. Resul s
61
A.Py amidal neu ons
Con ol RGS14
B.Non-py amidal neu ons
Con ol RGS14
Figu e 22. D awings show examples o py amidal neu ons (A) and non-py amidal neu ons (B) om a ea
V2 o RGS14 o ehicle ea ed animals. Neu ons we e d awn wi h he use o came a lucida and 10X objec i e.
IV. Resul s
62
0
1
2
3
4
5
6
7
8
Neu i es
Neu i e
B anching
Dend i ic
B anching
Neu i es
Neu i e
B anching
Numbe o b anching pe neu on
Con ol
RGS14
Py amidal neu on
Non-Py amidal neu on
*
**
* P< 0,001
Figu e 23. A d ama ic inc ease in neu onal a bo iza ion a e RGS14414 gene ea men . Py amidal neu ons
o ea ed animals showed a obus inc ease in numbe o neu i es and o dend i ic b anching. Howe e , he
e ec was mo e p ominen in dend i ic b anching. In con as o py amidal neu ons, he e ec was mo e
dominan in neu i es o non-py amidal neu ons. * e lec s a signi ican change om con ol (p ≤ 0.001).
The e ec o RGS14414 gene ea men on dend i ic b anching o py amidal neu ons and
neu i es o non-py amidal neu ons we e u he analyzed o demons a e he dimension o
e ec on neu onal a bo iza ion (Figu e 24). The e o e, o al numbe o py amidal and non-
py amidal neu ons s udied was classi ied on he basis o hei b anching numbe s. The plo s
in Figu e 24 show ha he e was a big shi in numbe o b anching o bo h dend i es o
py amidal neu ons and neu i es o non-py amidal neu ons. In ehicle- ea ed con ol animals,
dend i ic b anching pe neu on anged be ween 0-8, howe e his jumped o 1-15 in RGS14-
ea ed a s (Figu e 24.A). A 50 % o o al py amidal neu ons om con ol g oup ep esen ed
be ween 3-4 b anching and only 18 % showed mo e han 4 dend i ic b anching, whe eas in
RGS-animals, one o e e y wo py amidal neu ons showed 6-9 dend i ic b anching and mo e
han 62 % p esen ed mo e han 6 b anching. On he o he hand, non-py amidal neu ons o
RGS g oup showed g ea e a bo iza ion in neu i es. Because mo e han 90 % o hese neu ons
IV. Resul s
63
ep esen ed 4-8 neu i es pe neu on and only 42 % in con ol g oup animals. A 56 % o non-
py amidal neu ons om con ol g oup had 3 o less neu i es ( igu e 24.B).
0
5
10
15
20
25
30
35
0
1
2
3
4
5
6
7
8
9
10
11
12
13
14
15
% o o al py amidal neu ons
Numbe o dend i ic b anching
Con ol
RGS14
A
0
5
10
15
20
25
30
35
1
2
3
4
5
6
7
8
9
10
% o o al non-py amidal neu ons
Numbe o neu i es
B
Figu e 24. RGS14414 gene ea men led o high neu onal a bo iza ion in bo h py amidal and non-
py amidal neu ons. In (A), e ec o RGS ea men was so d as ic ha i led o a big shi in dend i ic
b anching. This boos in dend i ic b anching eached om 0-8 neu i e pe neu on in con ol g oup o 1-15 in
RGS g oup. (B) shows he ex en o e ec o ea men on neu i es o non-py amidal neu ons whe e mo e han
90 % was seen be ween 4-8 neu i es as compa ed o 2-4 neu i es in con ol.
IV. Resul s
64
3 RGS14414 gene ea men boos s exp ession o b ain de i ed
neu o ophic ac o (BDNF)
The ole o neu o ophic ac o s in memo y and neu onal p oli e a ion is well known.
The e o e, he e, wi h he goal o ind a possible mechanism ha migh p o ide an explana ion
o his massi e neu onal a bo iza ion seen in RGS- ea ed animals, we i s e alua ed mRNA
le els o neu o ophic ac o s, such as BDNF, FGF and NGF, shown o be implica ed in
episodic memo y and neu onal g ow h (Kopec & Ca ew 2013), and hen was u he
con i med a p o ein le el by Wes e n blo me hod. In addi ion, we ha e also explo ed
whe he RGS14- egula ed BDNF pa icipa es du ing ORM p ocessing o no .
3.1 A selec i e inc ease in bo h mRNA and p o ein le els o BDNF
qRT-PCR analysis e ealed ha mRNA le els o BDNF in RGS- ea ed animals was
2.4 old highe compa ed o ehicle- ea ed con ol animals (RGS14, 0.340 ± 0.015 s.
ehicle, 0.147 ± 0.006, p≤ 0.001) ( igu e 25). Howe e in con as o BDNF, he e was no
e ec on mRNA le els o o he wo neu o ophic ac o s: NGF and FGF-2. The e o e, i
seems ha RGS ea men p oduces a s ong bu selec i e e ec on mRNA le els o BDNF.
-20
0
20
40
60
80
100
120
140
160
180
BDNF
FGF
NGF
% Change om con ol (mRNA)
*
Figu e 25. RGS14414 gene ea men induced a selec i e inc ease in BDNF mRNA. qRT-PCR analysis shows
ha RGS14 gene ea men boos ed BDNF mRNA le els bu no o FGF and NGF mRNAs. Da a p esen ed a e
om 5 expe imen s. * indica es signi ican di e ence (p< 0.001).
Conside ing he e ec o RGS ea men on BDNF mRNA le els, we nex examined he
e ec o his ea men on BDNF p o ein le els. To his pu pose, we ex ac ed b ains a 7, 14
and 21 days a e RGS14 gene ea men and p ocessed hem o Wes e n blo analysis.
IV. Resul s
65
Housekeeping p o ein, α- ubulin, was used as loading con ol o no maliza ion o BDNF
alues. Plo o O.D. alues o p o ein bands om igu e 26.A shows a sligh inc emen in
BDNF a e 7 (19.96 ± 2.72 %) and 14 (24.81 ± 3.17 %) days o RGS14 ea men ( igu e
26.B). Howe e , he e ec was mo e p ominen a e 21 days o ea men when BDNF
p o ein was 71.25 ± 7.77 % highe han ehicle- ea ed con ol (pai ed S uden ’s - es ,
0.025.2=5.142; p=0.036) ( igu e 26.B). This he y inc ease in BDNF p o ein a e 21 days o
ea men coincides well wi h he pe iod when eme gence o enhancemen in ORM has been
obse ed in RGS-animals (Lopez-A anda e al, 2009).
BDNF
(32 kDa)
α- ubulin
(50 kDa)
Con ol RGS14
21d 7d 14d 21d
AB
0
10
20
30
40
50
60
70
80
90
100
7
14
21
% Change om con ol
(BDNF p o ein)
Days pos - ea men
*
Figu e 26. RGS14414 gene ea men induced a no iceable inc ease in BDNF p o ein. (A) is an example o
Wes e n blo showing exp ession o BDNF p o ein a e 7, 14 and 21 days o RGS14 gene ea men . (B)
ep esen s an analysis o no malized O.D. alues o Wes e n blo . Resul s sugges an inc ease in BDNF p o ein
exp ession a e RGS14 ea men ha eached o maximum le el a e 21 days o ea men . Da a p esen ed a e
om 3 expe imen s. * indica es signi ican di e ence o no malized O.D. alues om con ol g oup (p=0.036).
3.2 A dynamic BDNF p o ein exp ession du ing ORM p ocessing
The coincidence o inc ease in BDNF p o ein and enhancemen in ORM a e 21 days
o ea men sugges s an in ol emen o his neu o ophic ac o in ORM p ocessing.
The e o e, a s a e 21 days o ea men we e exposed o an objec o 3 min and hei b ains
we e ex ac ed a e delay o 20, 40, 60 minu es and 24 h, wi h he idea o in es iga e a
co ela ion be ween bo h. No malized O.D. alues o BDNF in igu e 27.A a e g aphically
ep esen ed in igu e 27.B. An inc ease o 71.43 ± 7.89 % in BDNF p o ein le els was seen

IV. Resul s
66
a e 20 min o objec exposi ion (pai ed S uden ’s - es , 0.025, 3=-8.887; p=0.003), and his
le el was simila o animals o 21 days a e ea men bu wi hou objec exposu e ( igu e
26.B). These da a indica e ha exp ession o BDNF emains unchanged in i s 20 min o
objec in o ma ion p ocessing in b ain. Howe e , his neu o ophic ac o appea s o be
signi ican ly down- egula ed a e 40 (23.51 ± 5.99 %, p=0.012) and 60 (37.12 ± 3.49 %,
p=0.009) minu es o objec exposu e. Mo eo e , a e 24 h o objec exposu e, BDNF p o ein
le el s a ed o no malize, howe e i s ill emained lowe han unexposed RGS-animals. This
dynamic BDNF p o ein exp ession obse ed du ing ORM p ocessing indica es an implica ion
o his neu o ophic ac o in he o ma ion o memo y in ou RGS-animals.
A
BDNF
(32 kDa)
α- ubulin
(50 kDa)
20 min
60 min 24 h
BDNF
(32kDa)
α- ubulin
(50kDa)
40 min
Con ol
(µg)
5 10
RGS14
(µg)
5 10
Con ol
(µg)
5 10
RGS14
(µg)
5 10
B
-50
-20
10
40
70
100
20 min
40 min
60 min
24h
% Change om con ol (BDNF p o ein)
Delay a e objec exposi ion
*
**
Figu e 27. A dynamic BDNF p o ein exp ession pa e n du ing ORM p ocessing. (A) is an example o
BDNF p o ein Wes e n blo om RGS and con ol animals who we e exposed o an objec and hei b ains we e
p ocessed a e 20, 40, 60 min and 24 h. 5 µg and 10 µg o o al p o ein we e loaded om each ime poin . In
(B), a highe le el o BDNF was obse ed a e 20 min o objec exposu e and ha was down- egula ed a e 40
and 60 min. Howe e a e 24 h, he e was no maliza ion in he le el o his p o ein. Da a p esen ed a e om 4
expe imen s. * e lec signi ican change om con ol (p< 0.05).
IV. Resul s
67
4 An implica ion o 14-3-3ζ p o ein in RGS-media ed memo y
enhancemen
I emains unknown how BDNF exp ession is up- egula ed in RGS-animals, a s ep
ha we belie e is p ima ily esponsible o neu onal a bo iza ion and enhanced memo y
p ocessing. He e, we se ou o in es iga e p o eins ha a e esponding o he RGS14 gene
ea men wi h a goal o shed ligh on unde lying mechanism o RGS-media ed memo y
enhancemen . The e o e, we used p o eomic analysis o iden i y p o eins ha eac o RGS
ea men and a e associa ed wi h ORM.
4.1 P o eomic p o iling e ealed an ele a ed exp ession o 14-3-3ζ in RGS-
ea ed animals
The di e en ial exp ession analysis be ween RGS and ehicle ea ed animals was
pe o med a 4, 7 and 21 days a e he ea men , and he esul s o some p o eins ha ha e
shown a s ong ela ion o ea men a e summa ized in able 15. A e e alua ion, we ound
ha one p o ein named 14-3-3ζ (indica ed in bold in able 15) was esponding o he ea men
in a e y di e en manne han o he s. The e was a p og essi e and consis en inc ease in 14-
3-3ζ p o ein le els ( igu e 28.B). This inc ease was e en e iden a he isual analysis o
p o ein spo s in 2-DE gel image ( igu e 28.A). A e 7 days o ea men , his p o ein le el
was 2.8 old highe han ehicle con ol and a e 21 days, i eached o 3.7 old ( able 15 and
igu e 28.B). This ime ame o ele a ed exp ession o 14-3-3ζ coincides e y well wi h he
appea ance o memo y enhancemen seen in RGS-animals.
Table 15. Di e en ial p o ein exp ession a e RGS14 ea men .
P o ein name
Accession name /
numbe
Ra io
4d
7d
21d
14-3-3ζ
1433Z_RAT / P63102
0.75
2.83
3.74
ATP syn hase subuni alpha
ATPA_RAT / P15999
0.96
1.27
0.73
ATP syn hase subuni be a
ATPB_RAT / P10719
1.62
6.63
3.36
Dihyd opy imidinase- ela ed p o ein 2
DPYL2_RAT / P47942
0.80
1.07
0.68
Glyce aldehyde-3-phospha e dehyd ogenase
G3P_RAT / P04797
1.12
0.71
0.75
Neu o ilamen ligh polypep ide
NFL_RAT / P19527
0.87
1.03
0.59
Py u a e kinase isoensymes M1/M2
KPYM_RAT / P11980
0.78
1.40
1.20
T opomyosin alpha-3-chain
TPM3_RAT / Q63610
6.52
0.57
0.60
Tubulin β-2A chain + ubulin β-2B chain
TBB2A_RAT / P85108
TBB2B_RAT /
Q3KRE8
0.33
0.85
0.42
IV. Resul s
68
RGS14
64
180
82
49
37
26
19
15
6
115
MW (kDa)
3 10pI
Con ol
A
0,0
0,5
1,0
1,5
2,0
2,5
3,0
3,5
4,0
4
7
21
Ra io RGS14 / Con ol
(14-3-3ζp o ein)
Days pos - ea men
B
Figu e 28. RGS14414 gene ea men induces an inc ease in 14-3-3ζ p o ein. (A) is a ep esen a i e 2-DE gel
om a p o eomic s udy showing spo co esponding o 14-3-3ζ p o ein (blue ci cle) whe e high exp ession o
his p o ein is e iden . (B) is no malized O.D. om 2-DE gel showing a p og essi e inc ease in 14-3-3ζ p o ein
a e 4, 7 and 21 days o RGS ea men , which coincided wi h BDNF exp ession. Da a p esen ed a e om 4
expe imen s.
This RGS14-media ed inc ease in 14-3-3ζ p o ein le el obse ed by 2-DE echnique and
p o ein spo analysis, was u he con i med by Wes e n blo in wo independen expe imen s
a 21 days a e ea men ( igu e 29). An example o Wes e n blo and co esponding
no malized O.D. alues o 14-3-3ζ immuno eac i e bands as pe cen age o change om
IV. Resul s
69
ehicle con ol is ep esen ed in igu e 29.B (g ey ba s indica e he alues o each expe imen
and he black ba is mean o bo h). When 2.5 µg o o al p o ein was loaded on an ac ylamide
gel, a 191 % inc ease in 14-3-3ζ p o ein exp ession was obse ed and when o al p o ein
loaded was 5 µg, inc ease in his p o ein exp ession was 117 %. Howe e , a e age o bo h
concen a ions was 154 ± 52 % om ehicle con ol ( igu e 29.B). Al hough he esul s o 2-
DE analysis was sligh ly highe (3.74 ± 0.04 old change om con ol) han Wes e n blo
(2.55 ± 0.37 old-change om con ol), i is impo an o unde line ha a no iceable ise in 14-
3-3ζ p o ein was obse ed in RGS- a s by bo h me hods.
14-3-3 ζ
(37 KDa)
α- ubulin
(50 Kda)
Con ol
(µg)
2.5 5
RGS14
(µg)
2.5 5
A
0
50
100
150
200
250
2,5
5
% Change om con ol (14-3-3 ζp o ein)
Amoun o o al p o ein (μg)
B
Figu e 29. RGS14 ea men induces he exp ession o 14-3-3ζ p o ein. (A) shows a ep esen a i e Wes e n
blo . Simila o 2-DE gels, an inc ease in 14-3-3ζ p o ein exp ession was also obse ed. (B) is a plo o esul s
ob ained om (A). An up egula ion o 14-3-3ζ p o ein exp ession was obse ed a e a ea men wi h RGS14
gene. G ey ba s show he esul s om 2.5 and 5 µg o o al p o ein ha was loaded in 2 expe imen s, and black
ba is mean o bo h.
4.2 Pa icipa ion o 14-3-3ζ p o ein in ORM p ocessing
Coincidence o ele a ed 14-3-3ζ p o ein exp ession wi h he eme gence o
enhancemen in ORM o RGS-animals led us o hink ha his p o ein simila o BDNF is
in ol ed in he mechanism ha acili a e memo y enhancemen seen in RGS- ea ed animals.
To unde s and he implica ion in ORM, b ain samples o RGS- ea ed animals we e collec ed
a e 20, 40, 60 minu es and 24 h o objec exposu e and we e analyzed by Wes e n blo o
he de e mina ion o 14-3-3ζ p o ein le els. Figu e 30.A shows an example o Wes e n blo
V. Discussion
76
3 Regula ion o BDNF le els by 14-3-3ζ
Conside ing ha BDNF is a key o RGS-media ed memo y enhancemen as well as o
p e en ion o memo y loss, we nex in es iga ed how BDNF concen a ion is go e ned in
RGS-animals. In s udies o exp ession p o iling o RGS- ea ed animals, 14-3-3ζ p o ein
displayed a ela ionship cohe en o RGS-media ed ORM enhancemen . We ha e de e mined
ha a memo y enhancemen in RGS-animals gene ally appea s be ween 17-20 days a e he
ea men (Lopez-A anda e al 2009), a ime pe iod when highes le el o 14-3-3ζ p o ein was
obse ed in hese animals. The 14-3-3ζ p o ein is a sca old p o ein and has been ound
abundan in b ain. I in e ac s wi h many p o eins, in e cedes in se e al signaling pa hways
and pa icipa es in lea ning and memo y (see(Ai ken 2006) o e iew). Mu a ion in leona do
gene o D osophila, which is a homologous o e eb a e 14-3-3ζ, showed signi ican
dec ease in ol ac o y lea ning (Philip e al 2001; Skoulakis & Da is 1996; 1998) and
subs an ial impai men in synap ic plas ici y (B oadie e al 1997). Mo e ecen ly, a s udy
using mu an mice wi h dele ion o 14-3-3ζ displayed educed spa ial memo y and ORM
(Cheah e al 2012; Qiao e al 2014).
Recen s udies ha e demons a ed ha in e ac ion o ecep o o ac i a ed p o ein
kinase 1 (RACK1) wi h 14-3-3ζ is essen ial o i s nuclea ansloca ion (Neas a e al 2012)
whe e RACK1-14-3-3ζ complex binds a p omo e IV egion o BDNF and p omo es an
inc ease in BDNF gene ansc ip ion (He e al 2010; Yaka e al 2003) ( igu e 31). These
obse a ions sugges ha 14-3-3ζ migh egula e he ele a ed le el o BDNF seen in
RGS14414 gene ea ed animals. Addi ionally, boos in BDNF exp ession by o e exp ession o
14-3-3ζ u he suppo his idea. The e o e, i seems ha RGS-media ed su ge in 14-3-3ζ
causes ele a ed BDNF syn hesis needed o neu onal a bo iza ion and enhanced ORM.

V. Discussion
77
RACK1 14-3-3ζ
Exon IV bdn
ansc ip ion
BDNF
14-3-3ζ
RACK1 14-3-3ζ
Figu e 31. A model showing RGS14414-media ed inc ease in BDNF. 14-3-3ζ binds RACK1 and help o
shu le om cy oplasm o nucleus, whe e 14-3-3ζ-RACK1 complex in e ac s wi h exon IV o BDNF and
p omo es i s ansc ip ion. RGS-media ed inc ease in 14-3-3ζ plays a c ucial ole in up egula ed syn hesis o
BDNF.
An e alua ion o exp ession pa e n o bo h BDNF and 14-3-3ζ a di e en ime in e als
o ORM p ocessing showed a complemen a y exp ession in such manne ha when he e was
lowe le el o BDNF, a su ge in 14-3-3ζ p o ein was obse ed ( igu e 32). These indings
indica e he implica ion o 14-3-3ζ in egula ion o BDNF exp ession du ing memo y
p ocessing in RGS- a s.
-60
-40
-20
0
20
40
60
80
100
20 min
40 min
60 min
24 h
% Change om con ol
Delay a e objec exposi ion
14-3-3ζ
BDNF
Figu e 32. . Syne gic exp ession o 14-3-3ζ and BDNF du ing ORM p ocessing in RGS-animals. A ela i e
exp ession pa e n analysis o hese wo p o eins sugges s ha 14-3-3ζ migh be in ol ed in egula ion o BDNF
in RGS14- ea ed animals.
V. Discussion
78
4 RGS-14-3-3ζ-BDNF pa hway in aging and Alzheime ´s disease
I is well documen ed in li e a u e ha BDNF a bo h mRNA and p o ein le els a e
signi ican ly educed in no mal aging and in AD (Conno e al 1997; Hock e al 2000;
Michalski & Fahnes ock 2003; Na isawa-Sai o e al 1996; Peng e al 2005) (Caccamo e al
2010; Ch is ensen e al 2008; F ancis e al 2012; Peng e al 2009; Shin e al 2014). In ac ,
many he apeu ic s a egies a ge ing o amelio a e cogni i e impai men a e associa ed wi h
BDNF up- egula ion (Blu on-Jones e al 2009; Caccamo e al 2010; Iwasaki e al 2012).
Recen s udies showed ha di ec BDNF in usion o gene deli e y in o en o hinal co ex o
demen ia models e e sed synap ic loss, pa ially no malized abe an gene exp ession,
imp o ed cell signaling, and es o ed lea ning and memo y (Iwasaki e al 2012; Nagaha a e
al 2013; Nagaha a e al 2009). Addi ionally, ea men wi h o he na u al p oduc s and small
molecules ha can induce endogenous BDNF exp ession has been disco e ed o amelio a e
cogni i e dys unc ion (Li e al 2015; Shin e al 2014; Teng e al 2014; Zucca o & Ca aneo
2009). In addi ion o BDNF, di e en ial gene exp ession s udies ha e demons a ed a
subs an ial dec ease in 14-3-3ζ in no mal aging and in AD (Mille e al 2008). Ou esul s
demons a ing p e en ion o memo y loss in oden models o aging and AD by RGS14414
gene ea men migh be media ed h ough es o a ion in BDNF and 14-3-3ζ p o ein le els
and no maliza ion in 14-3-3ζ–BDNF pa hway. Though how RGS14 causes an inc ease in 14-
3-3ζ p o ein le els emains an issue o cu en in es iga ion o his labo a o y, we ha e
demons a ed om cu en wo k ha RGS14414 gene ea men is a iable s a egy agains
memo y loss.
VI. CONCLUSIONS
VI. Conclusions
81
1. A single ea men o RGS14414 gene in oden models o aging and Alzheime ´s disease
no only p e en ed a memo y loss bu also main ained he memo y le el long a e he
ea men .
2. RGS14414 ea men induced obus neu onal a bo iza ion and pe manen s uc u al
change. This s uc u al eo ganiza ion in b ain o e ides he aul y unc ions esponsible
o memo y loss and u he acili a es enhanced memo y in o ma ion p ocessing.
3. The exp ession pa e n o BDNF du ing ORM p ocessing o e lapped wi h he ime
ame obse ed o memo y consolida ion. The e o e, high BDNF le els in RGS-
animals may be key o RGS-media ed memo y enhancemen .
4. A syne gic exp ession pa e n o bo h BDNF and 14-3-3ζ du ing memo y p ocessing in
b ain sugges he implica ion o 14-3-3ζ-BDNF pa hway. Thus, high le el o 14-3-3ζ in
RGS-animals may induce high exp ession o BDNF needed o neu onal a bo iza ion,
i s main enance and enhanced memo y p ocessing in RGS-animals.
5. Ou da a sugges ha RGS14414 gene ea men could se e as a he apeu ic s a egy o
he ea men o episodic memo y loss in pa ien s.

VI. Conclusions
83
VII. RESUMEN
VII. Resumen
85
1 INTRODUCCIÓN Y OBJETIVOS
1.1 Regulado de la señalización de la p o eína G 14 (RGS14) y su implicación
en la memo ia
La señalización de las p o eínas G comienza con la unión del ligando a un ecep o
acoplado a dicha p o eína G he e o imé ica (GPCR) (Albe & Robilla d 2002; Ne es e al
2002). La ac i ación de GPCR p omue e la libe ación de guanosín di os a o (GDP) y la
consiguien e unión de guanosín i os a o (GTP) pa a la ac i ación de la subunidad Gα. Es a
ac i ación modula la disociación/ eo ganización del complejo he e o imé ico pe mi iendo la
in e acción de las subunidades Gα y Gβγ con sus e ec o es y desencadenando así las cascadas
de señalización in acelula co espondien es. La subunidad Gα que p esen a una ac i idad
GTPasa, ápidamen e inicia su p opia inac i ación a a és de la hid ólisis de GTP ol iendo
así a su es ado de eposo (Gα-GDP), uniéndose a la subunidad Gβγ y easociándose con
GPCR (Gilman 1987; Hamm 1998; Heple & Gilman 1992; Oldham & Hamm 2008) ( e
igu e 1, pág. 3). Es e ciclo GTPasa de ac i ación/desac i ación de las p o eínas G es á
egulado po los más de 30 miemb os que cons i uyen la amilia de egulado es de la
señalización de las p o eínas G (RGS) (Ishii & Ku achi 2003; Koelle 1997). RGS14 pe enece
a es a amilia de p o eínas que compa en un dominio RGS de 120-130 aminoácidos en el
ex emo amino e minal. Es e dominio les con ie e ac i idad GTPasa (ac i idad GAP) sob e
la subunidad Gα ac i ada (Gα-GTP) de las p o eínas G he e o imé icas acele ando e
in e umpiendo la señalización in acelula mediada po GPCR (De V ies e al 2000;
Hollinge & Heple 2002; Ross & Wilkie 2000; Wooda d e al 2015). Dado que las p o eínas
RGS se unen selec i amen e a dis in as iso o mas de las subunidades G, pueden modula de
mane a especí ica la señalización de dis in os ecep o es GPCR (A sha sky & Pugh 1998;
Be man & Gilman 1998; Be man e al 1996; De V ies & Fa quha 2002; Heple 1999;
Hollinge & Heple 2002; Neubig & Side o ski 2002; Ross & Wilkie 2000; Tesme e al
1997). Conc e amen e, la p o eína RGS14 se une a la sub amilia de Gi/o pa a p omo e la
hid ólisis del GTP (Cho e al 2000; Hollinge e al 2001; T a e e al 2000; T a e e al 2004).
No obs an e, la p o eína RGS14 cuen a con o os dominios uncionales además del
dominio RGS: un dominio C- e minal egulado de p o eínas G (GPR; ambién conocido
como GoLoco) de ≈ 20 aa y dos dominios cen ales en ándem de unión a Ras (RBD), RBD1
y RBD2 de ≈ 70 aa cada uno (Kimple e al 2001; Side o ski e al 1999) ( e igu e 2, pág. 5).
VIII. Ma e iales y Mé odos
92
P e iamen e al es udio de en ejecimien o, se es ableció en nues o modelo la edad de
apa ición del dé ici de memo ia como consecuencia del p opio paso del iempo, some iendo a
un g upo de 12 a as a la p ueba de econocimien o de obje os a dis in as edades. Una ez
demos ado que nues o modelo expe imen al p esen aba una pé dida signi ica i a de la
memo ia a los 18 meses, se p ocedió a a a a los animales an es de la apa ición del dé ici
cogni i o con el gen de RGS14414. Pa a ello se pe undió una solución de len i i us que
con enían el gen RGS14414 o el ec o acío ( ehículo, indi iduos con oles) en el á ea V2 de
a as de 3 meses de edad median e la écnica de ci ugía es e eo áxica. Pos e io men e, su
ORM se e aluó a las edades de 5, 18, 20 y 22 meses ( igu a 1.A).
En el es udio sob e la pé dida de memo ia en un modelo de la en e medad de Alzheime ,
u ilizamos a ones ansgénicos de la línea J20 que sob eexp esan la p o eína p ecu so a de β-
amiloide humana con las mu aciones sueca (K670N/M671L) e indiana (V717F) bajo el
con ol del p omo o de la cadena B del ac o de c ecimien o de i ado de plaque as (PDGF-
β) (Mucke e al 2000); esponsables ambas mu aciones de la a ian e amilia de la
en e medad de Alzheime en humanos. Median e un es udio p e io y en base a abajos
an e io es (Esc ibano e al 2009; Schiappa elli e al 2006), con i mamos la edad a la que es e
modelo comenzaba a p esen a un dé ici cogni i o. Pa a ello, se emplea on 12 animales wild-
ype de la cepa C57BL/6J y 8 a ones ansgénicos, cuya ORM se e aluó a los 2 y 4 meses de
edad. Seguidamen e, a ones ansgénicos de 2 meses de edad, se a a on con len i i us del
gen RGS14 o con len i i us ehículo en el á ea V2 median e ci ugía es e eo áxica y su
capacidad mnemónica se e aluó median e el es de econocimien o de obje os a las edades de
4 y 7 meses ( igu a 1.B).
P oducción de len i i us
El gen de RGS14414 (GenBank, AY987041) se clonó en el plásmido come cial pLVX-
DsRed-Monome -C1 (Clon ech, 632153) ap o echando las secuencias diana de es icción
pa a las endonucleasas EcoRI y XhoI. Es e ec o pe mi e la coexp esión cons i u i a de
nues o gen de in e és con la p o eína luo escen e DsRed-Monome , acili ando así su
pos e io iden i icación. Las secuencias diana de co e pa a ambas endonucleasas se añadie on
a los ex emos del gen RGS14414 median e una eacción en cadena de la polime asa (PCR)
( e able 1,2,3, págs. 23, 24) y pos e io men e as con i ma la p esencia del agmen o de
DNA con el amaño adecuado median e un gel de aga osa és e se pu i icó po gel usando el
ki Wiza d® SV gel and PCR Clean-Up Sys em (P omega, A9281). Se lle ó a cabo una

VII. Resumen
93
eacción de es icción con las endonucleasas XhoI y EcoRI de New England Biolab an o del
gen como del ec o pa a gene a ex emos cohesi os en e ambos que acili asen su unión
( e able 4, pág. 26). El DNA del gen se inse ó en el del ec o , ambos p e iamen e
pu i icados po gel, median e una eacción de ligación usando la enzima ligasa T4 (Li e
Technologies, 1524) de acue do con el p o ocolo del ab ican e ( e able 5, pág. 26).
Finalmen e, el DNA ecombinan e se ampli icó po ans o mación median e shock é mico
en bac e ias compe en es (One Sho ® Omni MaxTM 2 T1® Chemically Compe en E.coli;
Li e Technologies, C8540-03) de acue do con el p o ocolo del ki . Las bac e ias que
inco po a on con éxi o el DNA se selecciona on en medio LB-aga con ampicilina a una
concen ación de 100 µg/ml. El DNA de cua o colonias se pu i icó po la écnica de minip ep
usando el ki S a P ep plasmid minip ep (Agilen echnologies, 4007661) (appendix 1.C.2) y
median e una eacción de es icción con las enzimas XhoI y EcoRI, se comp obó la
exis encia no sólo del ec o , sino ambién del inse o de in e és ( igu e 9.A, pág. 30).
Median e la eacción de maxip ep usando el ki de P omega Wiza d® Plus Maxip ep DNA
Pu i ica ion Sys em (A7270) (appendix 1.C.3) se gene ó una mayo can idad de nues o DNA
ecombinan e de in e és que nue amen e ue e aluado median e una eacción de es icción
con las enzimas XhoI y EcoRI ( igu e 9.B, pág. 30). Células de la línea 293T (Clon ech,
632180) ( e appendix 2) en su sex o subcul i o se ans ec a on con el DNA del plásmido
acío (pa a gene a len i i us ehículo) y con el DNA ecombinan e de RGS14414 (len i i us
RGS14414) median e el Len i-XTM Packaging Sys em (Clon ech, 631247) de acue do con el
p o ocolo apo ado po el ab ican e ( able 7, pág. 31). Las células se incuba on du an e 48 h
pa a a o ece la p oducción de len i i us cambiando el medio a las 24 h. El medio que
con enía los len i i us an o del s ock RGS14 como de ehículo, se ecogió cuidadosamen e y
se cen i ugó a 500 x g du an e 15 min a 4 ºC y el sob enadan e esul an e se il ó a a és de
un il o polisul ónico de 0,45 µm de amaño de po o, con el in de elimina cualquie es o
celula .
La solución de len i i us se concen ó median e ul acen i ugación (Ichim & Wells 2011)
a 25.000 pm du an e 90 min a 4 ºC en ubos Ul a-Clea (Beckman Coul e , 344058) en una
ul acen í uga XL-90, o o SW29. El sob enadan e se desca ó y el pelle donde se
encon aban los len i i us se esuspendió cuidadosamen e en 150 µl de sue o salino es é il.
Finalmen e, se hicie on alícuo as de 3,5 µl de las soluciones s ock de len i i us que se
almacena on a -80 ºC has a su uso.
VIII. Ma e iales y Mé odos
94
Pa a de e mina , el í ulo de las soluciones de len i i us, se u iliza on las células HT1080
(ATCC, CCL-121) ( e appendix 2) una línea celula come cial de i ada de ib osa coma
humano. 2 x 105 células en su cua o subcul i o, se semb a on en cada uno de los pocillos de
una placa de 6 pocillos y se deja on eposa du an e 24 h pa a a o ece su adhesión.
En onces, diluciones se iadas en base 10 en un ango en e 10-3 a 10-7 de las soluciones de
len i i us se añadie on a cada uno de los pocillos, ag egando medio sin len i i us como
con ol a uno de ellos. T as incuba las células du an e 48 h en la solución de len i i us, las
células ans ec adas se selecciona on añadiendo al medio el an ibió ico pu omicina
(Clon ech, 631306) a una concen ación de 1 µg/µl ya que el ec o pLVX con iene el gen de
esis encia a dicho an ibió ico (Pu o ). Las células se man u ie on du an e 10 días eno ando
el medio cada 48 h. Finalmen e, las colonias supe i ien es se iñe on con c is al iole a al 1
%. El í ulo de len i i us en é minos de unidades o mado as de colonias (CFU) se es imó
median e el ecuen o de las colonias supe i ien es en el pocillo some ido a la solución de
len i i us más diluida en la que pudie on isualiza se colonias ( igu e 10, pág. 33). El í ulo
de los s ocks de len i i us RGS14414 y ehículo ue de 1,75 x 107 CFU/ml y 2,75 x 106
CFU/ml espec i amen e.
Ci ugía es e eo áxica
4000 CFU en 2 µl (en el caso de a as) o 2000 CFU en 1 µl (en el caso de a ón) de la
solución de len i i us RGS14 se pe undie on in ac anealmen e median e ci ugía
es e eo áxica (Ce in e al 2006; Cooley & Vande wol 2005; Fo na i e al 2012) usando el
es e eo áxico de a a (S oel ing), al cual se le acopló un adap ado pa a el caso de a ón
(Cunningham mouse, Ha a d Appa a us) y una bomba de in usión (11 Plus, Ha a d
Appa a us) a un lujo de 10 µl/h. Las coo denadas del á ea V2 ( e able 8, pág. 34) se
oma on de The Ra B ain in S e eo axic Coo dina es (Paxinos & Wa son 1998) y del The
Mouse B ain in S e eo axic Coo dina es (Paxinos & F anklin 2001). An es de p ocede con la
ci ugía los animales se anes esia on p o undamen e median e inyección in ape i oneal (i.p)
de una dosis de ke amina de 75 mg/kg (Imagelne 1000; Me ial Labo a o ios) y mede omidina
(Dom o ; P ize ) a una dosis de 1 mg/kg en el caso de a a y de 0,5 mg/kg en el caso de a ón.
Du an e el p oceso, los animales se man u ie on sob e una man a eléc ica pa a e i a la
hipo e mia y sus ojos se man u ie on lub icados. Después del p ocedimien o qui ú gico,
du an e 5 días consecu i os los animales se a a on con an ibió ico (De mocan, Fa o) ía
ópica y con 150 µl del analgésico Meloxicam i.p (Me acam 5 mg/ml, Boeh inge Ingelheim).
VII. Resumen
95
Tes de econocimien o de obje os
Pa a e alua la memo ia episódica de los oedo es se lle ó a cabo la p ueba de
econocimien o de obje os ( igu a 2). El es de ORM se basa en la endencia na u al de los
oedo es po explo a la no edad (Ennaceu & Delacou 1988), de mane a que la a ea
consis e en una p ime a ase de adquisición, en la que los animales se exponen a dos obje os
idén icos y anscu ido un iempo de demo a, se exponen a un obje o comple amen e nue o
en con aposición con el amilia . Si el animal ecue da el obje o amilia explo a á más el
obje o nue o, mien as que si no lo ecue da dedica á un iempo simila a la explo ación de
ambos obje os. El p o ocolo del es de ORM pa a a a ( igu a 2.A) ue desc i o p e iamen e
po López-A anda y col. (Lopez-A anda e al 2009) y la a ea de ORM pa a a ón ( igu a
2.B) po o os g upos (Esc ibano e al 2009; Schiappa elli e al 2006).
Demo a
3 min 3 min
A
10 min
10 min
10 min 10 min
24 h
B
Figu a 2. Tes de ORM pa a a a (A) y pa a a ón (B).
An es de lle a a cabo la a ea, con el in de elimina el es és de los animales y po
consiguien e a o ece la explo ación a los obje os du an e la p ueba, se lle ó a cabo un
p o ocolo de manipulación sob e el b azo del in es igado du an e 8 min, 5 días consecu i os.
Seguidamen e y du an e 3 días consecu i os, los animales se habi ua on al campo abie o
acío donde se ealiza el es (una caja neg a cuad ada de made a de 100 x 100 x 50 cm en el
caso de la a a, y una caja g is cuad ada de 50 x 35 x 50 cm de Ha a d Appa a us pa a a ón);
12 min en el caso de las a as y 10 min en el caso de los a ones. Los obje os usados pa a la
p ueba se mues an en el appendix 3 y el iempo de explo ación de los obje os se es imó como
el iempo que el animal pe manecía con la na iz pegada a ellos. El índice de disc iminación
(DI) se calculó como: DI=N/(N+F), donde N indica el iempo de explo ación del obje o nue o
y F el iempo de explo ación del obje o amilia . En nues o expe imen o, conside amos que
VIII. Ma e iales y Mé odos
96
alo es de DI po encima de 0,66 indican que el animal es capaz de e ene la in o mación del
obje o amilia en su memo ia. Los alo es de DI se p esen a on como la media ± SEM y
median e un análisis es adís ico a a és del p og ama SigmaS a 3.5 (Jandel Scien i ic) en e
los dis in os g upos, se de ec a on las posibles di e encias signi ica i as in e o in a g upos
acep ando una p obabilidad de e o del 5%. En el caso del es udio de en ejecimien o los
g upos se compa a on median e la p ueba de S uden , mien as que pa a el es udio de
Alzheime se usó el ANOVA de una ía con la consiguien e p ueba pos -hoc HSD de Tukey.
Inmunohis oquímica
La exp esión de la p o eína RGS14414 en el á ea V2 del ce eb o de oedo es se
con i mó median e la écnica de inmunohis oquímica ( igu e 14, pág. 38) u ilizando un
an icue po especí ico pa a nues a p o eína p oducido en conejo (NBP1-31174, dilución
1:500; No us biological). T as la pe usión ansca díaca del animal, el ce eb o la ado y
ijado con PLP se ex ajo, se c iop o egió en una solución de saca osa al 30 % y se congeló
pa a la ob ención de secciones co onales de 30 µm de g oso del á ea a ada. Sob e las
secciones se lle ó a cabo la inmunohis oquímica de luo escencia siguiendo un p o ocolo
simila al desc i o p e iamen e en (Lopez-A anda e al 2009). El an icue po secunda io an i-
conejo usado ue p oducido en cab a y conjugado con el luo oc omo Alexa luo ® 488 (Li e
echnologies, A11008; dilución 1:1000). Pa a conoce más de alle de la écnica consul a el
appendix 4.
2.2 Segundo bloque expe imen al. De e minación de la co elación en e la
mejo a de la ORM mediada po la p o eína RGS14414 y la a bo ización neu onal
Dado que el e ec o po enciado de la memo ia mediado po la p o eína RGS14414
pe du a en el iempo, pensamos que es a p o eína pod ía es a p o ocando cambios
es uc u ales pe manen es, conc e amen e un aumen o en la a bo ización neu onal, que
a o ezca la conexión en el ce eb o y acili e el p ocesamien o de la in o mación en el mismo.
Con la inalidad de comp oba es a hipó esis, diseñamos es e bloque expe imen al en el que se
isualizó y analizó el g ado de a bo ización de neu onas pi amidales y no pi amidales del á ea
V2 a ada con RGS14414 en con aposición de aquellas en animales a ados con ehículo
( igu a 3).
VII. Resumen
97
P oducción de len i i us
(RGS14 o ehículo)
Ci ugía es e eo áxica
(T a amein o con
RGS/ ehículo en el á ea V2)
Ra as de 3 meses de edad
Sac i icio del
animal y
p ocesamien o del
ce eb o pa a la
inción de Golgi
Recogida de da os
Análisis
es adís ico
(RGS14 s ehículo)
21 días Congelación del
ce eb o y
ealización de
secciones (180 µm)
Tinción de Golgi
Recuen o de las p oyecciones
de neu onas pi amidales y no
pi amidales bajo el
mic oscopio
Figu a 3. Esquema esumen del 2º bloque de expe imen os.
Ra as de la cepa Wis a Han de 3-4 meses se a a on con la solución de len i i us de
RGS14414 y de ehículo en el á ea V2 median e ci ugía es e eo áxica ( e p ime bloque
expe imen al apa ado VII.2.1) incluyendo 4 animales po g upo. T anscu idos 21 días desde
el a amien o, los animales p o undamen e anes esiados se decapi a on, ob eniéndose y
p ocesándose el á ea V2 pa a la inción de Golgi-Cox que se lle ó a cabo usando el ki Rapid
GolgiS ain (FD Neu o echnologies, Inc, PK401), de acue do con el p o ocolo suminis ado
po el ab ican e. Una ez p ocesado el ejido, se sume gió du an e 1 min en una solución de
isopen ano p e-en iado a -70 ºC (Sigma Ald ich, M32631) y se congeló ápidamen e a -80ºC.
T as ealiza secciones de 180 µm de g oso al c ios a o y mon a las sob e el po aobje os, las
odajas se iñe on y deshid a a on po inme sión en una ba e ía de soluciones de e anol en
g adación c ecien e:50 %, 75 %, 95 %, 100 % ( / ) y se cub ie on con cub eobje os usando
unas go as de medio de mon aje Pe moun (Fishe Scien i ic, SP15-100).Finalmen e, usando
el mic oscopio DM IRE2 (Leica Micosys ems) y el p og ama Leica MM AF e sión 1.6.0
(Leica Mic osys ems) se ealizó un ecuen o de las neu i as, así como de las p oyecciones que
eme gían desde las neu i as an o de neu onas pi amidales como de células no pi amidales del
á ea a ada. Además, en el caso de las neu onas pi amidales, ambién se analizó el núme o de
ami icaciones que se p oyec aban desde la dend i a apical ( igu e 16, pág. 41). Un o al de 55
y 56 neu onas pi amidales y no pi amidales espec i amen e se con a on en las secciones de
los animales a ados con ehículo; mien as que de las secciones p oceden es de animales
a ados con RGS14 se con a on 79 y 56 espec i amen e. El núme o de neu i as, de
ami icaciones neu í icas o de ami icaciones en la dend i a apical po cada neu ona pi amidal
o no pi amidal se p esen ó como la media ± SEM y median e un análisis es adís ico de

VIII. Ma e iales y Mé odos
98
S uden (SigmaS a 3.5, Jandel Scien i ic) se iden i ica on las posibles di e encias
signi ica i as en e el a amien o con RGS14414 y el a amien o con ol con ehículo
acep ando una p obabilidad de e o igual o in e io al 5 % (p<0,05).
2.3 Te ce bloque expe imen al. De e minación de la elación en e la mejo a
de la memo ia mediada po RGS14414 y los ac o es neu o ó icos.
Conside ando que los ac o es neu o ó icos juegan un papel cla e en la a bo ización
dend í ica, así como en el desa ollo de los ci cui os neu onales y en los p ocesos de
ap endizaje y memo ia, diseñamos es e bloque expe imen al con el in de es udia la posible
implicación de es as moléculas en el mecanismo que subyace a la mejo a de la ORM mediada
po la p o eína RGS14 ( igu a 4).
Ra as de la cepa Wis a Han de 3 meses de edad se a a on con la solución de len i i us
que con enían el gen de RGS14414 o el ehículo ( e apa adoVII.2.1) median e ci ugía
es e eo áxica ( e apa adoVII.2.1). Los animales a ados se di idie on en 3 g upos:
(i) Es udio de los ac o es neu o ó icos en los animales RGS. T anscu idos 21 días
desde el a amien o 2 animales po g upo ( ehículo o RGS) se sac i ica on pa a
de e mina los ni eles de mRNA de los ac o es neu o ó icos FGF-2, NGF y
BDNF median e qRT-PCR.
(ii) Es udio del e ec o de RGS14414 sob e los ni eles p o eicos de BDNF. Los
animales a ados se sac i ica on a los 4, 7, 14 y 21 días (2 animales po g upo
pa a cada día pos - a amien o) y sus ce eb os se p ocesa on pa a medi los
ni eles de BDNF median e la écnica de Wes e n blo (WB).
(iii) Es udio del pa ón de exp esión del gen bdn du an e el p ocesamien o de la
memo ia de econocimien o de obje os en el modelo animal RGS. Después de 21
días desde el a amien o, 8 animales po a amien o se expusie on a dos obje os
idén icos du an e 3 min como se de alla en el apa ado VII.2.1. Los animales se
sac i ica on a los 20, 40, 60 min y 24 h desde el momen o de la adquisición pa a
analiza los ni eles de BDNF en cada in e alo median e WB.
VII. Resumen
99
P oducción de len i i us
(RGS14 o ehículo)
Ci ugía
es e eo áxica
(T a amien o con
RGS/ ehículo en el
á ea V2)
Ra as de 3
meses
Análisis
es adís ico
(RGS14 s
ehículo)
B. E ec o del a amien o con RGS14414 sob e los ni eles
de la p o eína BDNF.
Sac i icio del animal y ex acción del á ea V2
Días pos - a amien o 21
14
7
4
C. Pa ón de exp esión del gen de BDNF du an e el
p ocesamien o de la ORM.
21 días
3 min
20 min
40 min
60 min
24 h
Tiempo as la exposición de obje os
Sac i icio y ex acción del á ea V2
A. Fac o es neu o ó icos en los animales RGS.
Sac i icio del
animal y
ex acción del
á ea V2
P ocesamien o
del ejido pa a
la ex acción
del mRNA
Recogida de da os
(Can idad de
mRNA de los
ac o es
neu o ó icos)
Cuan i icación de
mRNA de los
ac o es
neu o ó icos
(qRT-PCR)
21 días
Recogida de
da os
(Valo es de O.D de
la p o eína BDNF)
P ocesamien o
del ejido pa a la
ex acción de
p o eínas
Cuan i icación
de la p o eína
BDNF
(Wes e n blo )
Figu a 4. Esquema del diseño expe imen al.
Pa a la ex acción del á ea V2 empleada en los expe imen os a iba mencionados, los
animales se anes esia on p o undamen e usando ke amina y mede omidina ( e sección
VII.2.1) y se decapi a on. Una ez ex aído cuidadosamen e el ce eb o en esco, se
diseccionó el á ea V2 con un punch de 4 mm (DH Ma e ial Médico, 94158BP-40F).
qRT-PCR
Las mues as se almacena on en 10 µl de RNAla e ® RNA S abiliza ion Reagen
(Quiagen, 1018087) po cada mg de ejido en ubos de 1,5 ml a empe a u a ambien e has a su
uso. El RNA o al de los ejidos se aisló u ilizando el RNeasy Tissue Mini ki (Quiagen,
74124) de acue do con el p o ocolo p opo cionado po el ab ican e ( e appendix 1.D) y se
cuan i icó midiendo la abso bancia a una longi ud de onda de 260 nm en el
espec o o óme o Nanod op1000, 3.7 (The mo Scien i ic). Con el in de elimina cualquie
es o de DNA genómico, las mues as de RNA se some ie on a la enzima DNasa I (Ambion,
VIII. Ma e iales y Mé odos
100
AM235) siguiendo las ecomendaciones del ab ican e ( able 9, pág. 44). Una ez inac i ada
la endonucleasa, se p ocedió con la eacción de ansc ipción in e sa pa a con e i el RNA
en un o ma o más es able, cDNA. La e o ansc ipción se lle ó a cabo median e el ki High
Capaci y RNA- o-cDNA (Applied Biosys ems, 4387406) du an e 30 min a 37 ºC ( able 10,
pág. 44). Al inal de la eacción, la enzima se inac i ó a 95 ºC du an e 5 min, y la
concen ación de cDNA se es imó de nue o espec o o omé icamen e.
Los cebado es usados en la eacción de qRT-PCR ( e secuencia en la abla 1) se
diseña on median e el p og ama P ime Exp ess, .2.0 (Applied Biosys ems) y su
especi icidad se comp obó u ilizando el p og ama P ime -Blas (NCBI) (Ye e al 2012).
Finalmen e, se lle ó a cabo una simulación de la eacción de qRT-PCR usando es a pa eja de
cebado es con el p og ama Ampli y 1.2 (Uni e si y o Wisconsin).
Tabla 1. Secuencia de los cebado es empleados en las eacciones de qRT-PCR.
GEN
CÓDIGO
(GENBANK)
1SECUENCIA (5’3’)
TAMAÑO
AMPLICÓN (bp)
BDNF
NC_005102.4
Sen ido:
AAGCAATATTTCTACGAGACCAAGTG
110
An isen ido:
TACGATTGGGTAGTTCGGCATT
FGF-2
NM_019305.2
Sen ido:
GACGGCTGCTGGCTTCTAAGT
90
An isen ido:
TCCGTGACCGGTAAGTGTTG
NGF
NM_001277055.1
Fo wa d:
GCAGACCCGCAACATCACT
90
An isen ido:
GGTGGAGGCTGGGTGCTAA
*P o eína
ibosomal
L19
(Rpl19)
NM_031103.1
Sen ido:
ATGCCAACTCTCGTCAACAG
102
An isen ido:
AGGTGTTCTTCCGGCATCG
*Gen de e e encia “Housekeeping”. 1 Los p ime s se sin e iza on po la emp esa Sigma-Ald ich.
Una ez seleccionadas las pa ejas de cebado es, se de e minó su concen ación óp ima de
uso ealizando una eacción de qRT-PCR al y como se explica á más adelan e. Se p oba on
es concen aciones dis in as de cebado es (0,45; 0,225 y 0,1125 µM), con es can idades
dis in as de cDNA con ol (640, 320 y 160 ng). La concen ación de 0,45 µM ue
seleccionada pa a odas las pa ejas de cebado es ya que además de man ene una di e encia en
el alo de C de uno en e las dis in as can idades de cDNA p obadas, ue la que p esen ó un
meno alo de C .
VII. Resumen
101
Pa a la ob ención de las cu as es ánda , se usó una solución de cDNA de concen ación
conocida, sob e la que se ealiza on 5 diluciones se iadas en base 10 ( ango en e 10-4 y 10-9).
Se lle ó a cabo una eacción qRT-PCR usando la concen ación óp ima de los cebado es. Los
alo es de C se ep esen a on en e al loga i mo de la can idad de cDNA en em og amos
( igu e 18, pág. 46), eniendo en conside ación sólo aquellos alo es de C que man u ie on
un co elación de 3,3 ciclos en e dos diluciones 1:10 consecu i as. Se admi ie on los alo es
de cu a es ánda lineal con un R2 > 0,99 y la e iciencia de ampli icación pa a cada eacción
(E) se calculó según la pendien e de la cu a median e la ó mula: E = 10-1/pendien e
Elabo adas las cu as es ánda pa a cada gen a es udia , se ealizó la eacción de qRT-PCR
de las mues as p oblema u ilizando el ki Powe SYBR® G een PCR Mas e Mix (Applied
Biosys ems, 4367659). Se p epa a on iplicados de cada una de las mues as, incluyendo
con oles nega i os (sin mues a) en placas de 96 pocillos pa a eacciones óp icas
Mic oAmp® Op ical 96-Well Reac ion Pla e wi h Ba code (Applied Biosys ems, 4306737).
Cada eacción se lle ó a cabo en un olumen o al de 24 µl incluyendo la concen ación
óp ima de cebado es y 640 ng de cDNA usando el e mociclado 7500 Real-Time PCR
Sys ems (Applied Biosys ems) ( able 12, pág. 47). Las condiciones é micas de la
ampli icación y de la ob ención de las cu as de disociación se de allan en la able 13 (pág.
47). Las cu as de disociación obse adas median e el p og ama 7500 V.2.0.6 demos a on
que la ampli icación había sido especí ica.
Pa a de e mina la can idad de RNA (cDNA) en las mues as se in e pola on los alo es C
ob enidos pa a cada gen en las cu as es ánda co espondien es. La can idad de RNA de los
dis in os genes (FGF-2, NGF y BDNF) ob enidas an o pa a el g upo-RGS14 como pa a el
g upo- ehículo se no maliza on con espec o a las alcanzadas pa a el gen Rpl19 (gen de
e e encia, “housekeeping”) (Can idadgen / Can idadRpl19). Pos e io men e, los alo es
no malizados pa a cada gen (Can idadgen no ) en ambos g upos, se usa on pa a de e mina el
po cen aje de cambio que p esen aban es os genes a consecuencia del a amien o con
RGS14414 con espec o al con ol ( a amien o ehículo) median e la ó mula siguien e:
[(Can idadgen no RGS – Can idadgen no Vehículo)/ Can idadgen no Vehículo] X 100
Finalmen e, pa a de ec a posibles di e encias signi ica i as en e los alo es no malizados
de RNA de ambos a amien os (RGS e sus ehículo) se ealizó la p ueba es adís ica de
S uden pa a mues as apa eadas usando el p og ama es adís ico SigmaS a 3.5 (Jandel
Scien i ic) y acep ándose un ni el de con ianza del 95 %.
VII. Resul ados
108
22 meses de edad. Como e a de espe a , a los 2 meses del a amien o, cuando los animales se
encon aban aún en edad adul a, no se obse a on di e encias signi ica i as en e el g upo
RGS y el g upo ehículo en un es de ORM de 45 min, mos ando un compo amien o
simila al g upo de a as de 3 meses sin a a (g upo RGS, 0,750 ± 0,016 e sus g upo
ehículo, 0,719 ± 0,022; p=0,297; g upo RGS de 5 meses e sus g upo con ol de 3 meses,
p=0,194). Sin emba go, cuando los animales a ados alcanza on los 18 meses de edad, se
obse ó que mien as que el g upo ehículo mos ó una pé dida signi ica i a de la ORM
(0,507 ± 0,035), el g upo a ado con RGS14 no p esen ó es e dé ici cogni i o (0,750 ±
0,022; RGS e sus ehículo p≤0,001). Además del e ec o p e en i o sob e el dé ici de
memo ia, RGS14 mani es ó una impo an e po enciación de la capacidad mnemónica. Así, el
g upo RGS14 a los 18 meses de edad mos ó la capacidad de econoce un obje o después de
24 h (0,744 ± 0,023), mien as que ni el g upo ehículo de la misma edad (0,490 ± 0,035;
p≤0,001), ni el g upo de a as jó enes de 3 meses exp esa on dicha capacidad (0,495 ±0,014)
( e en igu e 20, pág. 58). Es e aumen o del iempo de e ención de la in o mación obse ado
a los 18 meses de edad en el g upo RGS14, pe sis ió en el iempo incluso a los 20 (0,716 ±
0,018, p≤0,001) y a los 22 meses (0,688 ± 0.015, p≤0.001), edad has a la cual los animales
ue on capaces de lle a a cabo el es de ORM de mane a ac i a.
Es udio en el modelo de la en e medad de Alzheime
T abajos p e ios han demos ado que los a ones ansgénicos J20 modelo de la
en e medad de Alzheime ( a ones AD) u ilizados en es e es udio p esen an una pé dida de la
ORM a pa i de los 4 meses de edad (Esc ibano e al 2009), lo cual se man iene en
conco dancia con los esul ados ob enidos en es e abajo ( e igu e 21, pág.59). De mane a
que a los 2 meses de edad, a ones del g upo wild- ype con ol y del g upo ansgénico AD se
compo a on de mane a simila , p esen ando alo es de DI supe io es a 0,66 y po an o
mos ando la capacidad de econoce un obje o amilia (WT 0,768 ± 0,039 e sus AD 0,754
± 0,039; one-way ANOVA F1,18=0,057; p=0,814). Sin emba go, cuando el g upo AD alcanzó
los 4 meses de edad, la capacidad mnemónica de es os animales disminuyó de mane a
d ás ica con espec o al g upo wild- ype, que man u o su ni el de ORM (AD 0,480 ± 0,039
e sus WT 0,780 ± 0,033; one-way ANOVA F1,36=34,943, p<0,001). De mane a simila al
es udio de en ejecimien o, pa a p oba el e ec o p e en i o de la p o eína RGS14 sob e la
pé dida de memo ia asociada a la en e medad de Alzheime , a ones AD de 2 meses de edad
(an es de la apa ición del dé ici cogni i o) se a a on con el gen RGS14414 (AD-RGS) o con

VII. Resumen
109
ehículo (AD- ehículo) en el á ea co ical V2. La ORM de ambos g upos se e aluó a los 4 y
a los 7 meses de edad jun o a un g upo de animales wild- ype (con ol posi i o) y un g upo de
a ones ansgénicos sin a a (con ol nega i o) ( e igu e 21, pág.59). El g upo de animales
AD-RGS no p esen ó mues as de dé ici en la ORM ni a los 4 meses (0,771 ± 0,020) ni a los
7 meses de edad (0,696 ± 0,035) a di e encia de lo que ocu ió en el g upo de animales
ansgénicos sin a a (0,561 ± 0,021, p<0.001 a los 4 meses; 0,421 ± 0,0754, p=0,01 a los 7
meses) y en el g upo AD- ehículo (0,558 ± 0,065; p<0,001 a los 4 meses; 0,429 ± 0,076,
p=0,013 a los 7 meses), los cuales al y como e a de espe a se mos a on incapaces de e ene
in o mación en el ce eb o a la go plazo en nues as condiciones expe imen ales. El e ec o
p e en i o de RGS14 sob e la apa ición del dé ici de memo ia en los a ones AD se man u o
en el iempo, de o ma que es os animales p esen a on un ni el de la ORM simila al g upo
con ol wild- ype (Tukey HSD pos -hoc es , p=0,811 a los 4 meses y p=0,993 a los 7 meses).
3.2 El a amien o con el gen RGS14414 p omue e la a bo ización dend í ica de
neu onas co icales
Como se ha demos ado p e iamen e en nues o labo a o io (Lopez-A anda e al 2009)
e incluso en el p ime bloque de esul ados de es a esis doc o al, un único a amien o con el
gen de RGS14414 p oduce un e ec o po enciado sob e la memo ia, el cual puede llega a
man ene se a los la go de oda la ida de las a as. Po lo an o, pos ulamos que es e e ec o
pe du able pod ía se debido a cambios es uc u ales que acili asen el p ocesamien o de la
in o mación y la o mación de la memo ia como consecuencia del a amien o. Pa a p oba
dicha hipó esis, los ce eb os de a as a adas con el gen RGS14 o con ehículo se some ie on
a la inción de Golgi pa a analiza la a bo ización neu onal dend í ica en el á ea V2 (zona
a ada) a los 21 días del a amien o, es deci , cuando se obse a el e ec o sob e la memo ia.
El esul ado se mues a en la igu e 23, pág. 62.
Tan o las neu onas pi amidales como las no pi amidales de los animales a ados con
RGS14414 p esen a on un inc emen o en la a bo ización neu onal con espec o al a amien o
con ehículo, ap eciable incluso en un simple examen isual de neu onas dibujadas usando la
cáma a lúcida ( igu e 22, pág. 61). El a amien o con RGS14 p odujo un aumen o
signi ica i o en el núme o de neu i as que eme gen de cada célula pi amidal (RGS 4,595 ±
0,190 e sus ehículo 3,643 ± 0,181; p≤0,001), mien as que su e ec o ue más p onunciado
sob e el núme o de neu i as de células no pi amidales (RGS 6,069 ± 0,211 e sus ehículo
3,673 ± 0,248 neu i as po neu ona; p≤0,001). No obs an e, el a amien o con RGS14414
VII. Resul ados
110
p o ocó un mayo e ec o en el ni el de ami icación de la dend i a apical de neu onas
pi amidales, en las cuales se obse an el doble de p olongaciones que en los animales a ados
con ehículo (RGS 6,646 ± 0,342 e sus ehículo 3,357 ± 0,314; p≤0.001). Sin emba go, no
se encon a on di e encias signi ica i as en el g ado de ami icación de las neu i as de
neu onas pi amidales (RGS 1,494 ± 0,185 e sus ehículo 1,714 ± 0,286; p=0,5), ni de
células no pi amidales (RGS 1,914 ± 0.249 e sus ehículo 1,491 ± 0,226; p=0,212). En
esumen, es os esul ados sugie en que el a amien o con el gen RGS14414 es á implicado en
la a bo ización neu onal, a o eciendo especialmen e la a bo ización de la dend i a apical en
las neu onas pi amidales, así como aumen ando el núme o de neu i as an o de células
pi amidales como de las no pi amidales ( igu e 23, pág. 62). El e ec o p oducido po la
p o eína RGS14 in i o ue analizado con mayo de alle en la caso de la a bo ización de la
dend i a apical de las neu onas pi amidales y en el núme o de neu i as de las células no
pi amidales, ca ego ías en las que el a amien o p o ocó un e ec o más p ominen e. De es e
modo, el núme o o al de neu onas pi amidales y no pi amidales es udiadas se clasi ica on en
base a su g ado de ami icación den o de las ca ego ías an e io men e mencionadas. Las
g á icas de la igu e 24 (pág. 63) mues an que se p odujo un aumen o en el po cen aje de
neu onas an o pi amidales como no pi amidales con un mayo g ado de ami icación. En los
animales con oles a ados con ehículo, la dend i a apical de neu onas pi amidales
analizadas p esen ó en e 0-8 p olongaciones dend í icas, sin emba go, se obse ó un ango de
en e 1-15 en el caso de neu onas pi amidales de a as a adas con RGS14414 ( igu e 24.A).
Además, el po cen aje de neu onas con un mayo g ado de ami icación ue más al o en el
caso del a amien o con RGS14. Así, mien as que el 50 % del o al de las células pi amidales
analizadas en el g upo con ol p esen ó 3-4 p oyecciones desde su dend i a apical y sólo el 18
% mos ó más de 4; en los animales a ados con RGS14, una de cada dos neu onas
pi amidales p esen ó en e 6-9 dend i as de es a ca ego ía y más del 62% mos a on más de 6
ami icaciones. Po o o lado, el 90 % de las neu onas no pi amidales del g upo RGS
exp esa on en e 4-8 neu i as po neu ona, unos alo es que supusie on an sólo el 42 % en el
g upo con ol; de hecho el 56 % de las neu onas no pi amidales del g upo con ol p esen a on
3 o un núme o in e io de p olongaciones en sus somas ( igu e 24.B).
3.3 El a amien o con el gen RGS14414 aumen a la exp esión de BDNF
Conside ando el e ec o po enciado de la memo ia mediado po RGS14414 a a és del
aumen o de la a bo ización dend í ica, y el impo an e papel que juegan los ac o es
VII. Resumen
111
neu o ó icos en ambos p ocesos ( e apa ados VII.3.1 y VII.3.2), pensamos que es os
ac o es de c ecimien o pod ían es a implicados en el mecanismo molecula que subyace a la
p o eína RGS14414. De es e modo, decidimos comp oba los ni eles de mRNA y p o eína de
dis in os ac o es neu o ó icos FGF2, NGF y BDNF en nues o modelo RGS. Además,
es udiamos la implicación de BDNF en el p ocesamien o de la ORM.
Inc emen o selec i o en los ni eles de mRNA y p o eína BDNF
El análisis de qRT-PCR e eló que a los 21 días as el a amien o, la can idad de
mRNA de BDNF en los animales a ados con RGS14414 ue 2,4 eces mayo que en los
animales con oles a ados con ehículo (can idades de mRNA en g no malizadas con el gen
housekeeping Rlp-19; RGS14, 0,340 ± 0,015 e sus ehículo, 0,147 ± 0,006; p≤ 0,001) . Sin
emba go, no se obse ó ningún cambio signi ica i o con espe o al con ol en el caso de los
o os dos ac o es neu o ó icos analizados, NGF y FGF-2 ( igu e 25, pág. 64). Po lo an o,
pod íamos deci que el a amien o con RGS14 p oduce de mane a selec i a un aumen o en
los ni eles de mRNA del ac o de c ecimien o BDNF.
Conside ando el e ec o del a amien o con RGS14 sob e los ni eles de mRNA de BDNF,
e aluamos si el aumen o en mRNA se adujo en un aumen o de su exp esión p o eica
u ilizando pa a ello un an icue po especí ico. T as 7, 14 y 21 días desde el a amien o con
RGS14 o ehículo, los ce eb os de los animales se p ocesa on pa a el análisis po Wes e n
blo . Los ni eles de la p o eína α- ubulina se usa on como con ol de ca ga pa a la
no malización de los da os. En la igu e 26.A (pág., 65) se mues a un ejemplo de las bandas
esul an es de la inmunode ección de BDNF. Los alo es de densidad óp ica (O.D)
no malizados an o del a amien o RGS14 como del con ol demos a on un lige o aumen o
no signi ica i o en la p o eína BDNF a los 7 (19,96 ± 2,72 %) y a los 14 días (24,81 ± 3,17 %)
as el a amien o. Sin emba go, el e ec o en la exp esión se acen uó a los 21 días, cuando los
animales a ados con RGS14 p esen a on un 71,25 ± 7,77 % más de p o eína BDNF que el
g upo con ol (p ueba de S uden pa a mues as dependien es, 0,025;2=5,142; p=0,036) ( igu e
26.B, pág. 65). Es e conside able aumen o en los ni eles de BDNF a los 21 días desde el
a amien o con RGS14 coincide con el momen o en el cual se obse a la apa ición del e ec o
po enciado de la ORM en animales RGS (López-A anda e al, 2009); igu e 20, pág. 58,
igu e 21, pág. 59).
VII. Resul ados
112
Exp esión dinámica de la p o eína BDNF du an e el p ocesamien o de la ORM
La coincidencia empo al del inc emen o de BDNF y del e ec o de la po enciación de
la ORM a los 21 días as el a amien o sugie e que es a neu o o ina pod ía es a
desempeñando un papel en el p ocesamien o de la memo ia de econocimien o de obje os.
Pa a es udia la posible co elación en e ambos sucesos, 21 días después del a amien o, las
a as se expusie on a dos obje os idén icos du an e 3 minu os y anscu idos 20, 40, 60 min
así como 24 h desde la adquisición se es ima on los ni eles de la p o eína BDNF median e
WB ( igu e 27.A, pág. 66). El po cen aje de cambio con espec o al con ol se calculó según
los alo es de O.D. no malizados ( e igu e 27.B). A los 20 min, se obse ó un inc emen o
signi ica i o del 71,43 ± 7,89 % (p ueba de S uden pa a mues as dependien es, 0,025;3=-
8,887; p=0,003), simila a la mos ada a los 21 días as el a amien o sin nue as
exposiciones a los obje os ( igu e 26.B, pág. 65). Es os da os pa ecen indica que los ni eles
de BDNF pe manecen sin cambios du an e los p ime os 20 min del p ocesamien o de la
ORM. Sin emba go, la exp esión se eguló a la baja de mane a signi ica i a con espec o al
con ol a los 40 min (23,51 ± 5,99 %, p=0,012) y a los 60 min (37,12 ± 3,49 %, p=0,009)
desde el momen o de la adquisición. Después de 24 h, los ni eles de la p o eína BDNF
pa ecían comenza a no maliza se sin mos a di e encias signi ica i as con espec o al
con ol (p=0,436). Es a dinámica en los ni eles de exp esión de la p o eína BDNF du an e el
p ocesamien o de la ORM indica su implicación en la o mación de la memo ia en los
animales RGS.
3.4 Implicación de la p o eína 14-3-3ζ en la po enciación de la memo ia
mediada po RGS14414
Finalmen e, en el in en o de escla ece el mecanismo in acelula que conlle a al
aumen o de BDNF mediado po RGS14414, se plan eó un es udio de p o eómica que nos
pe mi iese iden i ica nue as p o eínas implicadas en el p oceso.
El pe il del análisis de p o eínas e eló un aumen o en la exp esión de la p o eína 14-3-3ζ
en los animales a ados con RGS14
Se ealizó un minucioso análisis de las p o eínas di e encialmen e exp esadas como
consecuencia del a amien o con RGS14 con espec o al con ol ( ehículo) a los 4, 7 y 21
días desde la inyección. En la able 15 (pág. 67) se esumen algunas p o eínas que pa ecie on
p esen a una ue e elación con el a amien o. Después de e alua con más de alle los
VII. Resumen
113
esul ados, encon amos que la p o eína 14-3-3ζ (indicada en neg i a en la able 15)
p esen aba una dinámica de exp esión en conco dancia empo al con el aumen o de la
memo ia mediada po RGS14414. Así, 7 días después del a amien o con RGS14414 los
animales p esen a on unos ni eles de la p o eína 14-3-3ζ 2,8 eces supe io a los a ados con
ehículo, alcanzando su máximo ni el a los 21 días as la inyección, cuando los ni eles de
14-3-3 ζ llega on a se has a 3,7 eces el alo del con ol ( able 15; igu e 28.B, pág. 68).
Es e acusado inc emen o a los 21 días desde el a amien o, isible incluso sob e el gel 2-DE
( igu e 28.A), coincidió no sólo con el aumen o de BDNF ( igu e 25, pág. 64; igu e 26, pág.
65), sino ambién con el momen o de apa ición de la po enciación de la memo ia en los
animales RGS14 (Lopez-A anda e al 2009); igu e 20, igu e 21 del p esen e abajo).
El acusado inc emen o de la p o eína 14-3-3ζ mediado po RGS14414 obse ado median e
la écnica de 2-DE a los 21 días desde el a amien o se con i mó median e Wes e n blo
( igu e 29, pág. 69). Los alo es de O.D. no malizados co espondien es a las bandas
inmuno eac i as pa a 14-3-3ζ (ejemplo de las bandas en la igu e 29.A) se ep esen an en la
igu e 29.B como el po cen aje de cambio con espec o al con ol (las ba as en g is mues an
los alo es de 2 expe imen os y la ba a neg a la media de ambos). Cuando en el gel se
ca ga on 2,5 µg de p o eína o al, se obse ó un aumen o del 191 % en los ni eles de la
p o eína 14-3-3 ζ de animales RGS con espec o al con ol siendo dicho inc emen o algo
meno (117%) cuando se ca ga on 5 µg. Sin emba go, la media de ambos expe imen os
mues a un aumen o del 154 ± 52 % con espec o al con ol. Aunque los esul ados ob enidos
po la écnica 2-DE ue on lige amen e más ele ados (3,74 ± 0,04 eces mayo que el con ol)
que los ob enidos po la écnica de Wes e n blo (2,55 ± 0,37 cambio con espec o al con ol),
es impo an e sub aya un no able aumen o de la p o eína 14-3-3ζ de más del doble en las
a as RGS po ambos mé odos.
Pa icipación de la p o eína 14-3-3ζ en el p ocesamien o de la ORM
La coincidencia empo al del e ec o de la p o eína RGS14 sob e el aumen o de la
ORM y del inc emen o de la p o eína 14-3-3ζ, nos condujo a pensa que es a p o eína que
su gió en nues o es udio pod ía es a in oluc ada en el mecanismo molecula que conlle a a
una acili ación en el almacenamien o de la in o mación en el ce eb o desencadenado po la
p o eína RGS14. Pa a comp ende la implicación de la p o eína 14-3-3ζ en el p ocesamien o
de la ORM, se lle ó a cabo un expe imen o simila al empleado pa a el es udio de BDNF.
T as 21 días desde el a amien o con el gen RGS14 o con ehículo, los animales se

VII. Resul ados
114
expusie on a dos obje os idén icos du an e 3 min y a los 20, 40, 60 min y a las 24 h de la ase
de adquisición se ex ajo el á ea V2, donde se analiza on los ni eles de la p o eína 14-3-3ζ
median e Wes e n blo . En la igu e 30.A (pág 70) se mues a un ejemplo de las bandas
ob enidas al usa un an icue po especí ico pa a la p o eína; y en la igu e 30.B se ep esen an
los alo es de O.D. no malizados como el po cen aje de cambio con espec o al con ol. El
esul ado de cua o expe imen os independien es demos ó la exis encia de un pa ón de
exp esión dinámico de la p o eína 14-3-3ζ du an e el p ocesamien o de la ORM. A los 20 min
de la adquisición, no se obse a on cambios en los ni eles de 14-3-3ζ con espec o al con ol.
Sin emba go, se obse ó un 43,19 ± 12,86 % y un 37,66 ± 4,04 % más de la p o eína 14-3-3ζ
en los animales RGS que en el con ol a los 40 y a los 60 min desde la exposición a los
obje os espec i amen e. A las 24 h, los ni eles de 14-3-3ζ endie on a no maliza se. El pico
de exp esión de la p o eína 14-3-3ζ en los animales a ados con RGS14 pa ece indica la
implicación de es a p o eína en el p ocesamien o de la ORM.
So p enden emen e, al solapa el pe il de exp esión de la p o eína BDNF ( igu e 27.B) y de
la p o eína 14-3-3ζ ( igu e 30.B) du an e el p ocesamien o de la ORM, encon amos que
ambas p o eínas pa ecen p esen a una ac i idad siné gica en e ellas igu e 32, pág. 77). En
es e sen ido, cuando los ni eles de BNDF se mos a on bajos (a los 40 y 60 min desde la
adquisición), los ni eles de la p o eína 14-3-3ζ se mos a on al os; y cuando los alo es de
BDNF e an al os, la exp esión de 14-3-3ζ se man u o igual en los animales RGS con
espec o a los a ados con ehículo. No obs an e, a las 24 h no se obse a on di e encias con
espec o al ehículo de ninguna de las dos p o eínas. Es os da os conjun amen e sugie en que
14-3-3ζ y BDNF pod ían es a in oluc adas en la egulación de la exp esión de una p o eína
sob e la o a p o eína de una mane a di ec a o indi ec a como consecuencia del a amien o
con el gen RGS14414.
VII. Resumen
115
4 DISCUSIÓN
La pé dida de memo ia es un as o no men al que a ec an a una g an p opo ción de la
población humana. Fallos en la memo ia se han is o asociados al en ejecimien o, así como a
di e sas en e medades neu ológicas y neu odegene a i as, en e las que se incluyen la
esquizo enia, la en e medad de Pa kinson y la en e medad de Alzheime . El cos e asociado a
la cu a y el cuidado de es e ipo de pacien es con un al o g ado de dependencia ha supues o
una impo an e ca ga económica y social. Además, se es ima que en el u u o el núme o de
pe sonas con es e p oblema se inc emen e de mane a d ás ica debido al aumen o de la
espe anza de ida con el consiguien e en ejecimien o de la población. De acue do con el
in o me Wo ld Popla ion Ageing 2013 de las Naciones Unidas, más del 30 % de la población
en los países desa ollados end á 65 años o más pa a el año 2040. Además, el Alzheime
Repo 2014 indicó que la demencia asociada con la pé dida de memo ia es una de las
p incipales causas de dependencia e incapacidad en los indi iduos de a anzada edad. Po lo
an o, exis e una necesidad inminen e de encon a un emedio con a el dé ici de memo ia.
En es e sen ido el hallazgo de po enciado es de la memo ia pod ía se una buena solución pa a
es e p oblema. Sin emba go, los po enciado es de la memo ia u o os compues os es ados
has a aho a han allado en las ases clínicas y p eclínicas a pesa de sus espe anzado es
esul ados en animales de expe imen ación (Kna o & Vene o 2015).
Es e abajo de esis ha sido diseñado pa a con a es a es e p oblema, in es igando si la
pé dida de memo ia se puede p e eni an es de su apa ición. Nues os esul ados han
demos ado que la p e ención de la pé dida de memo ia episódica pod ía se iable median e
el a amien o con el gen RGS14414 en dos modelos de oedo es que p esen an dicho dé ici ,
a a en ejecida y a ón ansgénico de la en e medad de Alzheime . Además mues an que la
ac i idad asociada con la p e ención de la pé dida de la ORM es á egulada po la ía de 14-
3-3ζ-BDNF.
4.1 P e ención de la pé dida de memo ia.
RGS14414 es un po en e po enciado de la memo ia y el a amien o con es e gen en el
á ea V2 p oduce la con e sión de una ORM no mal de 45 min, en una memo ia a la go plazo
de más de 24 h (Lopez-A anda e al 2009) que puede man ene se du an e oda la ida de los
animales. Ra as no males, así como aquellas a adas con ehículo p esen a on una pé dida
signi ica i a de la ORM a los 18 meses de edad; sin emba go, los animales a ados con el gen
VII. Discusión
116
RGS14414 a los 3 meses de edad no mos a on es a pé dida a los 18 meses y su memo ia
pe maneció in ac a has a los 22 meses de edad, pe íodo has a el cual los animales ue on
capaces de lle a a cabo el es de ORM.
Además, el a amien o con el gen RGS14414 ambién ue e ec i o sob e la pé dida de
memo ia asociada a la en e medad de Alzheime que p esen a un modelo de a ón ansgénico
de la en e medad. Los a ones AD mos a on una pé dida de la ORM a pa i de los 4 meses
de edad. Así el a amien o con el gen RGS14414 a la edad de 2 meses, an es de la apa ición
del dé ici cogni i o, no sólo e i ó la apa ición de la pé dida de memo ia a los 4 meses de
edad, sino que además, pe mi ió que es os animales mos asen un ni el de memo ia simila al
wild- ype después de los 6 meses de edad.
Conjun amen e, los esul ados ob enidos en ambos modelos sugie en que el a amien o
con RGS14414 p oduce un e ec o pe manen e que pod ía se ac ible como un emedio
p e en i o con a la apa ición de los allos de memo ia episódica, un ipo de memo ia que se
e p incipalmen e a ec ada du an e el en ejecimien o y en muchas en e medades neu ológicas
(Dicke son & Eichenbaum 2010; T omp e al 2015). A pesa de que nues os esul ados son a
un ni el de in es igación básica y equie en se alidados en humanos con ensayos clínicos,
con i man que la molécula RGS14414 pod ía se un á maco po encial con a la pé dida de
memo ia en humanos.
4.2 Papel de la p o eína BDNF en la a bo ización neu onal y en la ORM en el
modelo RGS
P e iamen e, se ha mos ado que el a amien o con RGS14414 acili a la o mación de
la memo ia a la go plazo (Lopez-A anda e al 2009) y es e e ec o ha quedado pa en e en los
esul ados ob enidos en los expe imen os de p e ención de la pé dida de ORM ealizados en
es e abajo de esis. El a amien o con RGS no sólo p e ino el dé ici cogni i o, sino que
además su e ec o se man u o en el iempo, man eniendo una ORM in ac a a edades más
a anzadas. La in e p e ación inicial de es os esul ados nos lle ó a pensa que el e ec o
du ade o del a amien o con el gen RGS14414 pod ía debe se a una mayo plas icidad
es uc u al como consecuencia de la apa ición de cambios es uc u ales y pe manen es en las
neu onas. De es e modo, el análisis de la a bo ización an o de neu onas pi amidales como de
neu onas no pi amidales de la zona del ce eb o a ada con RGS14414 exhibió un impo an e
aumen o en la a bo ización dend í ica en ambos ipos neu onales. Lo que esul ó aún más
so p enden e ue el inc emen o en el núme o de ami icaciones dend í icas que se p oyec aban
VII. Resumen
117
desde la dend i a apical en las neu onas pi amidales, casi iplicando el núme o que mos a on
es as neu onas de animales con oles. Las dend i as apicales de las neu onas pi amidales son
undamen ales en la o mación de las conexiones con o as capas co icales e incluso con
o as á eas del ce eb o. De es e modo, pensamos que el a amien o con RGS14414 p o ocó un
inc emen o en las conexiones neu onales que condujo a acili a el lujo y el p ocesamien o de
la in o mación (Eyal e al 2014), lo que consecuen emen e causó una mejo a en la memo ia.
No obs an e, con el in de comp ende el mecanismo po el cual la p o eína RGS14414
es aba induciendo dicha a bo ización dend í ica, in es igamos los ni eles de ac o es
neu o ó icos en el á ea V2 de animales a ados; ya que un g an núme o de e idencias en la
li e a u a ha demos ado el papel de es os ac o es de c ecimien o en la supe i encia
neu onal, en el c ecimien o axonal y dend í ico dependien e de ac i idad, así como en la
a bo ización ( e (Pa k & Poo 2013)pa a una e isión). Obse amos que el a amien o con
RGS14414 indujo un inc emen o selec i o en los ni eles de la p o eína BDNF, pe o no de
o os ac o es neu o ó icos es ados (NGF o FGF2).
BNDF, jun o a su ecep o , es uno de los ac o es de c ecimien o más abundan es en el
sis ema ne ioso cen al an o en oedo es como en humanos (Aid e al 2007; Maisonpie e e
al 1990; Timmusk e al 1994; Webs e e al 2002). De hecho, es a neu o o ina es esencial
pa a el desa ollo neu onal y la plas icidad sináp ica (Hong e al 2008; Poo 2001). Has a el
momen o se ha esc i o su papel en la a bo ización neu onal, o en la egulación del c ecimien o
y a bo ización dend í ica de neu onas pi amidales y no pi amidales (Ho ch 2004; Ho ch e al
1999; Jin e al 2003; Wi h e al 2003). Además, la exp esión de BNDF es necesa ia pa a el
man enimien o de la es uc u a y el amaño de las dend i as de neu onas co icales a los 3
meses de edad, cuando los ni eles de la p o eína BDNF aumen an de mane a d ás ica (Go ski
e al 2003). Es a neu o o ina pa icipa en la emodelación de la ed dend í ica median e el
inc emen o de los ni eles de cipina. De mane a que BDNF ae la ac i ación de la ía de
señalización de las p o eínas quinasas y las ías de señalización dependien es de la
ansc ipción que p omue en la unión de CREB al elemen o de espues a al cAMP (CRE)
p esen e en el p omo o de la cipina (Kwon e al 2011). La p o eína cipina es á elacionada
con el inc emen o de la a bo ización dend í ica de las neu onas hipocampales (Akum e al
2004). Todas es as e idencias indican que el aumen o de la p o eína BDNF mediado po la
p o eína RGS14414 pod ía no sólo causa un aumen o en la a bo ización neu onal, sino
ambién en su man enimien o. Nume osos abajos han a gumen ado que los cambios
es uc u ales pe manen es elacionados con el inc emen o de la a bo ización neu onal,
con ibuyen consecuen emen e a la o mación de nue as conexiones sináp icas (Bailey &

VIII. Re e ences
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