Relación de los polimorfismos genéticos OPRM1 y COMT con la eficacia y seguridad del tratamiento con opiáceos en dolor crónico

Área de Farmacología Facultad de Medicina Universidad de Málaga TESIS DOCTORAL RELACIÓN DE LOS POLIMORFISMOS GENÉTICOS OPRM1 Y COMT CON LA EFICACIA Y SEGURIDAD DEL TRATAMIENTO CON OPIÁCEOS EN DOLOR CRÓNICO José Manuel González Mesa 13 de Noviembre, 2015 Directora: Inmaculada Bellido Estevez AUTOR: José Manuel González Mesa http://orcid.org/0000-0003-0608-3970 EDITA: Publicaciones y Divulgación Científica. Universidad de Málaga Esta obra está bajo una licencia de Creative Commons Reconocimiento-NoComercialSinObraDerivada 4.0 Internacional: http://creativecommons.org/licenses/by-nc-nd/4.0/legalcode Cualquier parte de esta obra se puede reproducir sin autorización pero con el reconocimiento y atribución de los autores. No se puede hacer uso comercial de la obra y no se puede alterar, transformar o hacer obras derivadas. Esta Tesis Doctoral está depositada en el Repositorio Institucional de la Universidad de Málaga (RIUMA): riuma.uma.es Inmaculada Bellido Estevez, Profesora Titular de Farmacología y Terapéutica Clínica del Área de Farmacología de la Facultad de Medicina de la Universidad de Málaga. Certifican que: D. José Manuel González Mesa ha realizado los trabajos correspondientes a su Tesis Doctoral titulada “Relación de los polimorfismos genéticos OPRM1 y COMT con la eficacia y seguridad del tratamiento con opiáceos en dolor crónico”, y su preparación para su lectura y defensa bajo nuestra dirección, planificación y supervisión. Lo que firmo en Málaga a 13 de Noviembre de 2015. Profa. Dra. Inmaculada Bellido Estevez I Es imposible, en la mayoría de las ocasiones, atribuir un logro a úna única persona, por eso quiero dedicar este trabajo al grupo de personas que han hecho posible este trabajo y a mi familia. “El arte de la vida es el arte de evitar el dolor” Thomas Jefferson II III AGRADECIMIENTOS Merece una mención muy especial la persona que ha dirigido esta tesis,la Dra Inmaculada Bellido, sín su paciencia, dedicación e interés este trabajo no habría visto nunca la luz. Ha sabido marcar el camino a seguir en con un desarrollo ágil y dinámico.Trabajar con ella es una experiencia enriquecedora que espero poder repetir. La presente tesis se basa en el estudio de un grupo muy especial, pacientes con dolor crónico de alta intensidad, a los que desde aquí quiero agradecer su solícita colaboración para esta y cualquier otra iniciativa generada en la Unidad del Dolor. Del Mismo modo ha sido de gran ayuda la colaboración de AFIBROMA vehiculizada a través de su presidenta Dª María Jesús Romero. A gradecer a Patricia Vergara de la fundación Fibmabis toda la información y ayuda recibida. Una pieza clave de este proyecto ha sido D Juan Carlos Zumaquero Miguel (ECAI de Genómica del IBIMA ), su labor ha sido de gran eficiencia y relevancia. La Unidad del Dolor se encuentra adscrita al servicio de Anestesiología y Reanimación quisiera reconocer la labor del Jefe de Servicio del Hospital Clínico Universitario Virgen de la Victoria, DR J Cruz Mañas . Ha sabido crear desde una moderna gestíon el ambiente propicio para que se desarrollen las vías de investigación clínica actuales. Para realizar este trabajo ha sido necesario la colaboración del personal de CMA del Hospital Clínico Virgen de la Victoria. Para Cristina Narbona y al resto del equipo de Enfermería mi más profundo agradecimiento especialmente a Gloria e Ignacio. El equipo de la Unidad del Dolor ha jugado un papel fundamental colaborando en la recogida de casos merecen un agradecimiento muy especial Maria de los Angeles Nieto, Antonio Mañas y Maria del Carmen Cali y el personal facultativo M Rivera,M del Valle, E Otero y los residentes Mª J Rodríguez Capitán y Juanjo Escalona. En resumen quisiera expresar que para realizar el presente trabajo ha sido necesaria la colaboración de un amplio grupo de profesionales, instituciones e infraestructuras públicas a los que dirijo mi más sincera gratitud. A cada una de las personas que han participado de forma directa o indirecta en este proyecto, gracias. José Manuel González Mesa IV Resumen V RESUMEN En el momento actual,los opioides se han incorporado al tratamiento del dolor crónico no oncológico de intensidad moderada o grave. Sin embargo el uso de opioides no está exento de efectos adversos, especialmente gastrointestinales lo que limita de forma importante la adherencia al tratamiento. El conocimiento de la contribución relativa de marcadores farmacogenéticos y su influencia en la respuesta individual a opioides es un tema de gran actualidad. El análisis farmacogenético y la historia clínica tienen el potencial para determinar si se van a producir estos efectos. La farmacogenética relaciona la acción de un fármaco y la influencia de factores genéticos,mediante la asociación de una respuesta farmacológica . El presente trabajo se centra en una población de personas afectadas por dolor crónico de características nociceptivas, mixtas o neuropáticas que han iniciado tratamiento con opioides en el último año, y valora la respuesta al tratamiento opioide (perfil de eficacia y seguridad) en virtud a las características genéticas individuales o polimorfismos de un único nucleótido (SNP). Nos hemos centrado en dos SNP muy relevantes en la percepción del dolor y la eficacia de los analgésicos opiáceos al poder ambos afectar a la sensibilidad al dolor de los pacientes. Uno afecta al gen del receptor opioide µ1 (OPRM1) y otro afecta al gen de la catecol-oxy metil transferasa (COMT). El polimorfismo (SNP) A118G / dbSNP rs1799971 (G) se ha implicado en la funcionalidad del receptor opioide mu1 (µ1). Y el polimorfismo SNP G472A / db SNP rs4680 (A) interviene en la actividad de la enzima COMT (catecol-oxy metil transferasa). El polimorfismo de un único nucleótido (SNP) A118G / dbSNP rs1799971 (G) en el gen del receptor opioide µ1 (OPRM1) ha constituido hasta el momento actual la variable farmacogenética de los receptores opioides µ1 más estudiada. En este caso el alelo ancestral A (existente en condiciones de normalidad) es sustituido por el alelo G. La aparición del alelo G en el exón 1 del receptor OPRM1, conocida también como A118G (N40D, o Asn40Asp), origina la sustitución de la asparagina (Asn) que normalmente aparece en el residuo 40 del aminoácido por ácido aspártico (Asp). El polimorfismo A118G, tiene una frecuencia del 11 al 17% en la población caucásica. En este polimorfismo, los portadores del alelo rs1799971 (G) se han relacionado con una mayor sesibilidad al dolor, la necesidad de mayores requerimientos de opioides para conseguir el efecto analgésico, un posible desarrollo de menos efectos adversos y una mayor predisposición al desarrollo de comportamientos compulsivos y desarrollo de dependencia al alcohol y opiáceos que los portadores de los dos alelos rs1799971 (A) ancestrales. El polimorfismo SNP del gen de la encima COMT de mayor relevancia está constituido por la variante SNP G472A / db SNP rs4680 (A) (conocido también como (polimorfismo Val158Met). En este caso el alelo ancestral G (existente en condiciones de normalidad) es sustituido por el alelo A. El alelo G, es la primera base del triplete GTG, codificante para el aminoácido valina (Val), mientras que el alelo A forma el triplete ATG que codifica para metionina (Met). Dado que el gen presenta procesamiento alternativo, el aminoácido correspondiente al codón del ARNm se sitúa en el residuo 108 (forma soluble S-COMT) o en el 158 (forma unida a membrana (MBCOMT) de la proteína. La aparición del alelo A, induce, por tanto, un cambio de Valina por Metionina en el codón 108 del receptor COMT. El polimorfismo G472A, tiene una frecuencia del 14% en la población caucásica. Este polimorfismo es de tipo funcional, estando tanto el alelo ancestral G como el alelo alternativo A en amplia distribución en casi todas las poblaciones en las que ha sido estudiado. La existencia del alelo A (Met) supone una menor tasa de atividad (al menos una reducción de 4 veces) junto a una mayor tasa de degradación para la enzima COMT respecto a la considerada actividad basal normal correspondiente al alelo ancestral G (Val). El polimorfismo A (Met) supone por tanto una menor capacidad para metabolizar monoaminas y, por tanto, niveles más elevados de dopamina, un menor umbral del dolor que Introducción 2 Introducción 3 Introducción En la sociedad actual el dolor constituye constituye un auténtico problema de Salud pública. El dolor crónico de intensidad moderada o severa afecta al 19 % de la población adulta europea, repercutiendo gravemente en el marco social y laboral comunitario .La calidad de vida de las personas afectadas sufre una disminución importante a la que aún, no hemos sabido dar respuesta, a pesar de disponer de un amplio arsenal de recursos terapéuticos (Breivik H., 2006). El dolor es un síntoma altamente subjetivo .La percepción interpretada por algunos individuos como dolor, en ocasiones puede ser integrada por otros como poco molesta o no dolorosa. Incluso en un mismo individuo el dolor puede ser interpretado en función de la amenaza que supone individuo y el contexto en el que se presenta. Existe una gran variabilidad individual que impide que la solución se pueda ajustar a un patrón único de terapia. Es es imprescindible desarrollar estrategias que conduzcan al alivio del dolor en cada individuo con un alto grado de tolerabilidad y eficacia junto con un bajo perfil de efectos adversos . Los opioides son los analgésicos más potentes disponibles y sin embargo, hasta hace unas décadas su empleo estaba limitado a dolor causado por cáncer . La opiofobia es una realidad, el temor a la depresión respiratoria, la adicción y dependencia limitaban el uso de estas sustancias. La O.M.S considera el alivio del dolor persistente, independientemente de su origen, como un derecho humano, estableciendo el consumo de opioides como un indicador de tratamiento adecuado. En este sentido desde 1986 con la publicación y desarrollo de la escalera analgésica por la O.M.S y posteriormente en 2002 con la concepción del ascensor analgésico (Torres L.M.,2002), trás extenderse la práctica clínica de evaluación y medición continua del dolor, comienza el desarrollo de estrategias racionales centradas en el abordaje de este problema) (Meldrum M.,2006). El tratamiento a a largo plazo con opioides implica una selección apropiada de cada fármaco y una correcta dosificación y aunque la valoración clínica es imprecindible no podemos olvidar las características farmacocinéticas y farmacodinámicas de cada opioide concreto, del mismo modo que la variabilidad genética individual. La experiencia dolorosa es un proceso de gran complejidad en la que se implican mútiples procesos bioquímicos además de otros de integración cortical no del todo bien conocidos. La variabilidad individual en la respuesta al estímulo doloroso es un hecho constatado que sugiere qué factores genéticos pueden estar implicados en la modulación de la respuesta a estímulos dolorosos (Armero P., 2004). El presente trabajo trata de valorar en una población de personas afectadas por dolor crónico de características nociceptivas, mixtas o neuropáticas la respuesta al tratamiento opioide en virtud a características genéticas individuales (Walter C., 2013). Estudiamos un polimorfismo genético implicado en la funcionalidad del receptor opioide mu1, SNP A118G / dbSNP rs1799971 (G) y otro que interviene en la vía inhibitoria descendente noradrenérgica de la enzima catecol O metil tranferasa (COMT) el polimorfismo SNP G472A / db SNP rs4680 (A) (Kambur O., 2010). Introducción 4 1. Dolor Conceptos generales 1.1.Definición El dolor se define como una experiencia emocional y sensorial compleja que se asocia a daño tisular presente o potencial (Asociación Internacional para el Estudio del Dolor -1986). Está presente de forma transversal durante toda la vida del individuo, afecta la calidad de vida de las personas afectadas y su entorno. Implica un importante consumo de recursos sanitarios. Dado el carácter multidimensional, la experiencia de dolor se ve afectada tanto por la interacción de factores cognitivos, afectivos y sensitivos, como por otros factores psicológicos y contextuales (Turk DC.,1996, González-Escalada L., 2006). 1.2.Clasificación Desde un punto de vista funcional podemos clasificar al dolor en: 1.2.1. Dolor agudo. El dolor agudo es el que aparece como consecuencia de una lesión traumática o un proceso que amenaza la vida. El dolor agudo es generalmente de corta duración (horas o, a veces, días) y se asocia a hiperactividad del sistema nervioso simpático, soliendo acompañarse de ansiedad. Suele ser temporal e intenso, y disminuye al cesar la causa que lo ha originado.Se asocia a hechos que han producido o generado daño en un tejido blando, una infección y/o una inflamación. Es preceptivo eliminar la causa y controlar la sensación dolorosa. Si el dolor agudo no se trata adecuadamente, en algunos casos puede degenerar en dolor crónico (Bonica JJ., 1990) 1.2.2. Dolor Crónico El dolor crónico se puede dividir según su etiología en: Dolor crónico no oncológico. Persiste después de la lesión, sin naturaleza defensiva y carente de propiedades fisiológicas reparadoras. Aparece en cualquier localización con duración superior a tres meses e intensidad moderada en las escalas de medida.Sin embargo el deterioro funcional y al merma en la calidad de vida son constantes. El dolor crónico no oncológico presenta carácter contínuo o al menos con una persistencia mínima de cinco días a la semana. Se acompaña de ansiedad, depresión y trastornos del Introducción 5 sueño (Català E 2002; Breivik H,2013). Los resultados de la muestra española del estudio epidemiológico Pain Europe muestran las siguientes características:  Predominio femenino (52%),  un 22% considera el dolor como intenso y el 19% como insoportable.  La fuente principal de dolor es osteomuscular, el 22% tardó entre 5 y 10 años en alcanzar un nivel de alivio adecuado y un 29% ha consultado a más de tres especialistas  Solo un 1% de los encuestados estaba en tratamiento con opioides mayores. Dolor oncológico. La O.M.S lo define como un dolor crónico con características propias ya que el sufrimiento y la desesperanza condicionan la conducta dolorosa por el fuerte componente afectivo. Su prevalencia es del 50% en cualquier tipo de neoplásia con valores mayores del 70% en tumores de cabeza y cuello. Dependiendo del origen etiopatológico del dolor se puede clasificar en nociceptivo y neuropático.Existe un dolor mixto que participa de ambas características. Dolor nociceptivo : Es el dolor fisiológico ante una agresíon o traumatismo. Las vías del dolor están integras. Por tanto los descriptores verbales serán abundantes y señalaran la lesión. Es un dolor que responde bien a analgésicos habituales y opioides. Ante un estímulo nociceptivo existen estructuras sensibles en la periferia son denominados nociceptores, para estímulos químicos,térmicos o de presión. Son terminaciones nerviosas libres que presentan una serie de proteínas que actúan como receptores de información y la conducen al SNC através de fibras Aδ y C . Los receptores son canales ionicos o receptores metabotrópicos, que generan cambio en la síntesis de proteínas intracitoplasmáticas. El dolor nociceptivo puede dividirse, a su vez, en dos tipos (que constituirían una clasificación del dolor en función de su localización): - Dolor somático: originado al estimularse los nociceptores por lesión de tejidos, y transmitido por el sistema nervioso periférico, y que aparece con el comienzo de un estímulo definido, estando vinculado al tiempo y al lugar de la zona dañada. - Dolor visceral: es un dolor más profundo y mal localizado, siendo su transmisión por fibras vegetativas, preferentemente del sistema nervioso simpático. Dolor neuropático Ha sido definido por el NeuPSIG como el dolor que aparece como causa directa de una lesión que afecta al sistema somatosensorial. Puede afectar tanto al sistema nervioso central como al periférico.Con frecuencia el paciente estará desconcertado pues las sensaciones percibidas de calor, parestesias, alodinia o hiperpatía son difíciles de verbalizar. Existe un modelo de dolor mixto que aúna componentes del dolor neuropático y del dolor nociceptivo (Pedrajas Navas, JM.,2008). Introducción 6 2. Neurobiología del dolor La percepción del dolor es un fenómeno complejo resultado de un conjunto de sistemas en los que participan los siguientes mecanismos: la transdución del estímulo, la transmisión nerviosa hasta el sistema nervioso central o la modulación de la sensación dolorosa. En el dolor crónico también juega un importante papel los fenómenos de sensibilización central y periférica (Azkue J.J., 2008) 2.1. Transducción del estímulo nervioso Las estructuras específicas a nivel periférico capaces de convertir estímulos nociceptivos en señales capaces de ser transmitidas por el sistema nervioso son denominadas nociceptores polimodales, para estímulos químicos,térmicos o de presión. Se describen receptores del tipo TPRV-1 (Receptor de potencial transitorio de tipo valinoide) y receptores sensoriales de la familia TRP(Transient Receptor Potential). Los receptores son canales ionicos o receptores metabotrópicos, que generan cambio en la síntesis de proteínas intracitoplasmáticas. Son terminaciones nerviosas libres que presentan una serie de proteínas que actúan como receptores de información y la proyectan hacia al SNC a través de fibras Aδ y C. 2.2. Transmisión del estímulo nervioso al Sistema Nervioso Central Estas fibras pertenecen a la primera neurona de la vía sensitiva cuyo cuerpo se encuentra en el ganglio de la raíz dorsal o en los ganglios sensoriales de los pares craneales V,VII,IX y X. Las fibras aferentes se diferencian en virtud del grosor de la capa de mielina que las recubre y condiciona la velocidad de conducción del estímulo. Las fibras C están costituidasds por axones desmielinizados y responden a estímulos intensos de tipo quimico y mecánico, las fibras A δ son fibras parcialmente mielinizadas que transmiten la información a mayor velocidad (5-30 m/sg frente a los 0,5-2 m/sg de C ) . Este es el mecanismo que subyace a la percepción bifásica del dolor agudo o fenómeno del segundo dolor. Figura 1. Vías del dolor http://www.medwave.cl/link.cgi/Medwave Introducción 7 Figura 2. Láminas de Rexed Tomada de Afifi K . Adel. Neuroanatomía funcional. Texto y atlas. 2ª Edición. Editorial Mac Graw Hill. Y Tomada de https://en.wikipedia.org/wiki/Rexed_laminae La sustancia gris de la médula espinal está topográficamente dividida en X láminas , según los criterios de Rexed (1952) de la I a la VI se localizan el asta posterior. La mayoría de las fibras nociceptivas terminan en la denominada área marginal o zona más superficial del la lámina I, en la sustancia gelatinosa lámina II y lámina V. Las aferencias nociceptivas viscerales se integran en áreas más profundas como lámina X. La información táctil no dolorosa trasmitida por las fibras Aβ se proyecta en láminas de la III a la V y la propioceptiva. Existen neuronas de amplia gama dinámica (WDR, por wide dynamic range) que responden de manera progresiva, primero a estímulos no nocivos de baja intensidad, que se convierten en nocivos cuando la intensidad aumenta. a las láminas VI, VII y IX. Como hecho diferencial podemos decir que la información nociva está perfectamente delimitada y separada de la información inocua. La vía ascendente está compuesta por los axones de las segundas neuronas. La información nociceptiva va canalizada por el sistema espinotalámico anerolateral el resto de la información se conduce através de la columna dorsal. Introducción 8 Figura 3. Leucotopografía medular. El sistema espinotalámico se diferencia en dos tractos el neoespinotalámico o lateral y el medial o paleoespinotalámico. El neo espinotalámico esta constituido por axones mielinizados de las segundas neuronas que se localizan fundamentalmente en la lámina I del asta dorsal,que tras alcanzar la sustancia blanca del lado contrario forma el funiculus lateral y proyectan en los núcleos talámicos ventroposterolateral(VPL) y en la parte medial del tálamo posterior. Aquí se realiza sinapsis con la tercera neurona del vía que proyecta el dolor y la temperatura a la corteza somatosensorial. El sistema paleoespinotalámico está formado por los axones de las neuronas más profundas, láminas V y VII. Proyecta información a la sustancia gris periacueductual, formación reticular,bulbo,protuberancia y cerebro medio,hipotálamo y núcleos talámicos medial e intralaminar. La información transmitida por esta vía provoca respuestas reflejas que afectan de forma importante y amplia la percepción del dolor. Fenómenos como el aumento de ventilación,redistribución del flujo sanguíneo, alerta y efectos emocionales se deben a la activación de este sistema. El sistema de la columna dorsal esta formado por los axones de la segunda neurona de las láminas IV-VI y X que ascienden ipsilateralmente proyectan en los nucleos dorsales del bulbo,nucleos gracilis y cuneatus desde donde cruzan al lado contraleteral y ascienden mediante el lemniscus interno hasta conectar con el núcleo VPL, este sistema juega un papel importante en el dolor visceral. Introducción 9 Figura 4. Vía ascendente. Haz espinotalámico En la percepción del dolor se encuentran implicadas las siguientes áreas cerebrales: corteza somatosensorial, circunvolución cingulada anterior, ínsula, corteza prefrontal y parietal inferior,donde se encontraría el cuarto nivel en el procesamiento del dolor (Pedrajas Navas JM., y Molino González AM., 2009). En las estructuras subcorticales y corticales del encéfalo se origina la percepción consciente del dolor, actividades subconscientes y respuestas neuromoduladoras efectoras (motoras), endocrinas y emocionales, iniciadas consciente o inconscientemente (Sosnowski, Lebran y Fodderie, 1992). Introducción 10 3. Neuromodulación del dolor Head y Holmes en 1911 s e ñ a l a r o n l a e x i s t e n c i a de influencias moduladoras en el dolor, s e ñ a l a n d o l a e x i s t e n c i a d e un control córtico−talámico inhibidor. Hagbarth y Kerr en 1954 proporcionaron la primera evidencia directa de un control supraespinal y Carpenten 1965 demostraron un control descendente de las vías nociceptivas clásicas. Melzack y Wall en 1965 articularon la existencia dé un sistema modulador específico del dolor con la “ Teoría de la puerta de entrada (Costigan M., 2000), (Cerveró F, Laird J., 2002). 3.1. Sustrato morfológico y funcional. El sustrato anatómico de este sistema se encuentra en las estructuras mediales del tronco cerebral, desde el diencéfalo medial hasta la región rostral y ventromedial del bulbo (Herbert H,1992). La sustancia gris periventricular(SGPV) que se prolonga al mesencéfalo como la sustancia gris peri acueductal (SGPA); a nivel ponto mesencefálico tenemos el área dorsolateral del tegmento ponto−mesencefálico (ADLTPM) y en el bulbo tenemos la región rostral ventromedial del bulbo (RRVMB). El locus coeruleus es la principal fuente de vías noradrenérgicas hacia la SGP. Por su parte, ésta también está conectada a aquellas estructuras de la RRVMB que dan origen al grueso de las fibras descendentes. El ADLTPM constituye un área crítica del control modulador noradrenérgico del dolor en intima relación con la SGPA y la RRVMB. La SGPA se proyecta a la RRVMB y de éste al núcleo espinal del trigémino en tronco cerebral y el asta posterior de médula espinal (APME). Tanto la SGPA como el RRVMB reciben además colaterales de las vías nociceptivas ascendentes que discurren por el cordón antero lateral de la médula. La vía moduladora descendente se origina en la corteza cerebral del lóbulo frontal, en hipotálamo y estructutas del sistema límbico(núcleos acumbes y amígdala) proyecta a nivel mesencefálico a nivel de la sustancia gris periacuecutal, de donde se proyecta a la médula rostral o ventromedial, localizada en el bulbo raquídeo que comprende los núcleos del rafe magno y núcleos de la formación reticular (Azkue J.J., 2008). Desde aquí la transmisión nociceptiva puede sufrir una modulación excitadora o inhibidora. Introducción 11 Figura 5. Vía inhibitoria descendente. Tomada de http://www.medwave.cl/link.cgi/Medwave Figura 6. Modulación Dolor. Tomada de http://www.catedradeldolor.com Introducción 18 Tras, la unión del agonista al receptor, la subunidad α, que posee actividad GTPásica, libera GDP y une GTP, en presencia de Mg2+, lo que origina su disociación del dímero G-βϒ y la regulación, por parte de la Gα-GTP y Gβϒ, de uno o más de los enzimas transductores de señal y canales iónicos. La Gα-GTP, al metabolizar el GTP en GDP, cesa la activación del efector correspondiente, volviendo a agruparse con las Gβϒ para constituir la proteína G capaz de acoplarse en un nuevo ciclo al receptor (Figura 5). Figura 5. Receptores acoplados a la proteína G Tomada de Gillen, C., M. Haurand, D. J. Kobelt, and S. Wnendt, 2000, "Affinity, potency and efficacy of tramadol Las proteínas G son piezas claves para la duración y amplificación de la señal, pues presentan cinéticas de inactivación particulares y su actividad puede ser regulada por otras proteínas, como las RGS (Regulator of G-protein Signaling) que constituyen una familia de gran diversidad funcional, ligadas directamente a la inactivación de las subunidades Gα, al acelerar la función GTPásica de estas proteínas . En otros casos, la regulación es a nivel de los dímeros Gβϒ. Las acciones celulares de la activación del receptor opioide son globalmente inhibitorias. En la neurona presináptica antes de la activación del receptor los canales iónicos para el calcio están abiertos y los canales de K están cerrados. Tras la activación estos hechos se invierten condicionando la hiperpolarización celular que por una parte hace a la neurona presináptica menos excitable y por otra disminuirá la liberación de neurotransmisores exitadores a la hendidura sináptica. La subunidaα tras su activación se inhibirá a la adenilciclasa disminuyendo el AMPc intracelular, lo que lleva a una menor de la fosforilación d proteínas por cinasas y de su unión a la arrestina que puede internalizar el receptor, disminuyendo el numero de receptores en la membrana. Introducción 19 4.2.2. Polimorfismos OPRM1. SNP A118G / dbSNP rs1799971 (G) Hay varias isoformas del receptor µ a nivel protéico por alternancia del splicing del rna mensajero generado por el gen OPRM1,o por la existencia de un polimorfismo concreto de un solo nucleotido. El polimorfismo de un único nucleótido (SNP) A118G/rs179971 en el gen del receptor opioide µ ha constituido hasta el momento actual la variable farmacogenética que implica al receptor µ más estudiada.Este SNP se localiza en el exón 1 del gen y consite en la sustitución de una adenina(A) por una guanina(G) lo que una vez transcrito se convierte en el receptor opioide en la sustitución de asparagina(N) por ácido aspártico(D)en la posición 40 de la proteína(N40D) con la consiguiente pérdida de N-glicosilación en la zona extracelular del receptor.El alelo (118G) tiene una frecuencia del 11 al 17% en la población caucásica. En la especie humana el polimofismo más frecuente es la sustitución de la adenina en la posición 118 por guanina(A118G). Este SNP condiciona la sustitución asparginina por aspartato en la posición 40,que se localiza en el exon 1 localizado en region extracellular antes del primer lazo transmenbrana, El receptor µ así codificado se denomina microreceptor opioide N40D(Mura E, 2013). A nivel molecular se han descrito diferencia de afinidad, potencia, y de los efectos derivados de la activación de la cascada intracellular disparada or la activacion del receptor mu opioide. Debido a la localización extracellular de la sustitución N40D, presumiblemente deben existir diferencias en la union de agonistas al receptor y en la eficacia concreta de cada sustancia.De hecho ligandos como la beta endorfina tiene tres veces más afinidad por este subtipo de receptor. Sin embargo para otros opioides como encefalina,dinorfinas y DAMGO la afinidad se mantiene constante. Existen otros polimorfismos menos frecuentes en los receptore κy δ de significado aun incierto. El SNP 36G>T (dbSNP105051660,Pro12Pro) en el exon 2 se asocia con abuso de sustancias y el SNP 80T>G(dbSNP rs 1042114; Cys porPhe en el codon 27) disminuye la sensibilidad al dolor por calor. 4.2.3. Modulación farmacocinética. Enzimas metabolizantes El mecanismo fundamental de metabolismo opioide la oxidacíon y conjugación con glucurónido. La desmetilación mediante el sistema enzimático P 450 , 2D6 es relevante sobre todo en el metabolismo de tramadol,tapentadol,codeína y dextrometorfano. Entre el 5-10% de los caucásicos poseen variantes en el gen CYP2D6 que implica una disminución de aclaramiento de fármacos.Las personas homocigotas para esa variante deben ser considerados metabolizadores lentos,si solo poseen un alelo serían metabolizadores intermedios y si poseen multiples copias del alelo functional son metabolizadores ultrarrápidos. Los polimorfimos del gen UGT2B7,que afecta la glucuronoconjugación, también provocan cambios en la concentración plamática de opioids. La presencia del alelo T en posición 802 induce una glucuronización 10 veces mayor para la buprenorfina que el alelo salvaje.Existen al menos dos variantes alélicas(UGT2B7-840G y 79) que reducen sustancialmente la glucuronización de la morfina con acumulación de sus metabolitos. Introducción 20 4.2.4. Modulación farmacocinética. Transportadores de membrana El gen ABCB1 posee más de 50SNP,el más estudiado es el C3435T que interfiere con la expresión y función de la glicoproetina P, lo que supone un aumento de concentración de opioide en el SNC y unas menores necesidades analgésicas. 4.3. Modulación genética de la nocicepción Los mecanismos genéticos implicados en la nocicepción son de gran complejidad se imbrican diversas vías y multitud de sustancias pueden modular la percepción del dolor, produciendo cambios en la expresión de receptores por cambios transcripcionales como en el caso de receptores valinoides o n los canales de Na específicos de neuronas sensoriales,la expresión de sustancia P y factores neurotróficos . La intensidad del dolor dependerá de la vía nociceptiva activada dando lugar a su atenuación (OPRM1,TRPV1,Guanosín clorhidrolasa) o a su aumento como la amida hidrosilasa del ácido graso, COMTo receptores adrenérgicos. Entre ellos destaca especialmente por su frecuencia y repercusión clínica los polimorfismos que afectan los genes reguladores de la COMT que modula la transmisión neuronal dopaminérgica,adrenérgica y noradrenérgica (Peiró A M., 2010). 4.3.1. El gen COMT, Polimorfismo SNP G472A / db SNP rs4680 (A) El gen COMT se localiza en la región 11.2 del brazo largo del cromosoma 22. Se compone de seis exones, de los que solo son codificantes los 4 últimos. El gen codifica dos transcritos a partir de dos de 1.5 Kb y 1.3Kb respectivamente. Por tanto se originan dos aloenzimas, una forma soluble (S-COMT) y otra unida a membrana (MB-COMT). Figura 6. El gen COMT y sus transcritos. Los asteriscos marcan la posición de varios polimorfismos conocidos. Tomada de Tunbridge EM, Harrison PJ, Weinberger DR. Catechol-o-methyltransferase, cognition, and psychosis: Val158Met and beyond. Biol Psychiatry. 2006 Jul;60(2):14151. Introducción 21 Aunque los tejidos humanos expresan las dos formas, en el cerebro humano solo se ha identificado hasta el momento la forma MB-COMT. El gen COMT está regulado por diversos factores uno de ellos sería la presencia de estrógenos que reducen su expresión. La enzima COMT(Catecoloximetiltransferasa)se identificó en los años 50 como enzima relacionada con el metabolismo de las monoaminas. En el SNC la única forma aislada es la unida a proteínas. Existe evidencia de una mayor concentración del ARN mensajero de MBCOMT en neuronas del cortex prefrontal,láminas II,III, IV,menor en estriado y my baja en área tegmental ventral y sustancia negra. La función de la COMT consiste en transferir el grupo metilo de s-adenosil-Lmetionina al sustrato corresponiente, en presencia de Magnesio. Su sustrato incluye catecolaminas y Catecol-estrógenos. El papel de la enzima en el SNC ha sido considerado de menor importancia que la enzima Mono amino oxidasa(MAO),quedando cicunscrita a la conversión del ácido dihidrooxifenilacético(DOPAC) a ácido homovanílico, sin embargo sabemos qe el papel de la COMT es vital en la degradación de la dopamina en el cortex prefrontal. COM (Chen J., 2004), (Tammimäki A., 2012). La impotancia de esta enzima en el catabolismo cerebral de la dopamina y noradrenalina se pone de manifiesto en estudios con ratones knock out para el gen COMT, en los que aumentan los niveles de Dopamina intracerebral. COMT y polimorfismos (SNP) Gen COMT Polimorfismo La presencia de la variante 472G>A en el exón 4 (dbSNP rs4680) induce un cambio de Valina por Metionina en el codón 108 implica un aumento de percepción de dolor de 1,5 veces en voluntarios sanos al inducir una forma enzimática de actividad reducida. Esto implica una reducción en la degradación de catecolaminas (Diatchenko L, 2006). Dado el importante papel de la COMT en la degradación prefrontal de dopamina, se cree que el polimorfismo Val158Met ejerce sus efectos cognitivos modulando la señalización dopaminérgica en los lóbulos frontales. Aunque los fenotipos conductuales expresan el resultado de múltiples interacciones hay una creciente evidencia de que unas variantes concretas pueden interactuar en circuitos neuronales específicos y ejercerciendo una clara influencia cognitivo afectiva en el fenotipo. Los portadores del alelo (A) tienen una baja actividad enzimática, por tanto altos niveles de dopamina, más exploradores, bajo umbral del dolor, aumento de la vulnerabilidad al stress y un buen procesamiento de la información en la mayoría de las ocasiones. Los portadores del alelo (G) en cambio son menos exploradores, tiene un menor nivel de dopamina, un mayor umbral al dolor, y un buen manejo del estrés aunque presentan una modesta reducción en la ejecución del desarrollo cognitivo. En referencia al gen de la COMT cuando estudiamos el SNP. 5. Marcadores farmacogenéticos y dolor El conocimiento de la contribución relativa de marcadores farmacogenéticosy su influiencia en la respuesta indivdual a opioides está en continua evolución. El análisis farmacogenético y la historia clínica tienen el potencial para determinar si se van a producir eventos adversos en pacientes en tratamiento con dosis terapéuticas de opioides. En el presente trabajo se estudian el polimorfismo genético en los genes OPRM1 y COMT en la población de pacientes con dolor Introducción 22 crónico que han iniciado tratamiento con opioides en el último año y el perfil de eficacia y seguridad (Martínez-Jauand M, 2013). Figura -7 Consecuencias del polimorfismo OPRM1 a nivel molecular y clínico Tomada de http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pmc/articles/PMC3645947/pdf/jpr-6-331.pdf Existen estudios que evalúan el efecto del SNP118A.G SNP sobre la eficacia analgésica de los opioides y sus efectos secundarios. Particularmente se centran en los efectos gastrointestinales y en la aparición de depresión respiratoria. Los resultados son, en principio discordantes, probablemente por la falta de uniformidad en los criterios de selección y medida utilizados han arrojado en un reciente metaanalisis la presencia del SNP como protectora para náuseas y vómitos (Walter C., 2009). Con respecto al estreñimiento no se ha encontrado asociación con el SNP 118A>G. En un contexto postoperatorio los pacientes portadores del SNP 118A>G precisan mayor dosis de morfina o fentanilo para alcanzar un nivel óptimo de analgesia sin embargo no parece haber asociación entre el SNP 118A>G. En relación con la hyperalgesia inducida por opioids no existen estudios farmacogenéticos, sin embargo se ha asosociado el SNP con hiperalgesia mediada por opioides endógenos (Ballina LE., 2013). El polimorfismo COMT Val158Met o SNP rs4680 se ha relacionado con una variabilidad individual del dolor (Martínez-Jauand M., 2013). La prensa sensacionalista lo llamó “el gen de la tolerancia al dolor”. En 2003 se demostró que este SNP podía predecir un aumento de la intensidad al dolor y la respuesta emocional al stress inducido por el mismo. Con este polimorfismo se correlacionó también el sistema opioide, que en los individuos homocigotos para el alelo Met158 Met presentan una baja activación de respuesta analgésica opioide (Zubieta J.K., 2003). Bajos niveles de actividad de la COMT se han relacionado con aumento del dolor agudo postoperatorio y varias causas tipos de dolor crónico como son la migraña,dolor musculoesquelético, dolor en esclerosis múltiple y dolor crónico postherniorrafia. En un reciente metaanalisis asocia una baja actividad enzimática por un SNP rs4680 con el dolor en la fibromyalgia (Tammimäki A.,2012). Introducción 23 6. Hipótesis de trabajo Sugerimos que conocer los polimorfismos de un único nucleótido (SNP) SNP A118G / dbSNP rs1799971 (G) en el gen del receptor opioide µ1 (OPRM1) y SNP G472A / db SNP rs4680 (A) en el gen de la enzima COMT que presentan los pacientes con dolor crónico de larga evolución y tratados con opioides y relacionar estos polimorfismos con posibles diferencias de la eficacia de los opiáceos usados en estos pacientes, con la necesidad de rotación de opioides ante la falta de eficacia de los opiáceos utilizados y con el perfil de seguridad de estos fármacos, nos puede llevar a caracterizar estos alelos de los genes OPRM1 y COMT como posibles biomarcadores farmacogenéticos de eficacia y/o seguridad del uso de estos fármacos, que nos permitan una mejor selección y uso del fármaco analgésico a utilizar en este tipo de pacientes. Igualmente poder identificar el verdadero papel como biomarcadores de estos polimorfismos de un único nucleótido de los genes OPRM1 y COMT podría ser útil en otros aspectos de la fisiopatología del dolor como el riesgo y la predisposición a presentar determinadas patologías que cursan con dolor crónico tanto oncológico como no oncológico, elacionado la conocer y uso de estos fármacos. Introducción 24 Objetivos 25 OBJETIVOS Objetivos 26 Objetivos 27 OBJETIVOS 1. Caracterizar los polimorfismos de un único nucleótido (SNP) SNP A118G / dbSNP rs1799971 (G) del gen del receptor opioide µ1 (OPRM1) y SNP G472A / db SNP rs4680 (A) del gen de la enzima COMT de los pacientes incluidos en el estudio. 2. Determinar la influencia de los SNPs estudiados en la intensidad y afrontamiento del dolor, desarrollo de ansiedad, depresión y en la calidad de vida de los pacientes. 3. Determinar si la presencia de los distintos fenotipos inducidos por ambos SNPs condiciona: a. El consumo de opiáceos y analgesia de rescate b. La necesidad de rotación c. Empleo de técnicas intervencionistas. d. La aparición de reacciones adversas 4. En base a los datos obtenidos indicar el gen y cual o cuales alelos de estos genes se pueden considerar biomarcadores para el uso de estos fármacos con alta eficacia y seguridad en los pacientes. Material y Métodos 34 - El cuestionario Escala Hospitalaria de Ansiedad y Depresión (Hospital Anxiety and Depression Scale, HADS) La Escala Hospitalaria de Ansiedad y Depresión (HAD) de A. S. Zigmuod y R. P. Snaith, R.P. (1983) es uno de los instrumentos más utilizados para evaluar ansiedad y depresión en enfermos físicos y mentales, y también en población general. Con esta escala se han registrado las respuestas emocionales de ansiedad y depresión en amplias muestras de población sana adolescente, de estudiantes universitarios, de adultos y personas de tercera edad. En su inicio fue diseñada para la evaluación de los síntomas cognitivos y conductuales de ansiedad y depresión Ha sido aplicada en pacientes que acuden con regularidad a ambientes hospitalarios, no psiquiátricos, con lo cual resulta una mejor herramienta para la detección de distrés psicológico, como el sufrido por pacientes con dolor crónico de cualquier etiología. De este modo se utiliza para discriminar alteraciones del estado del ánimo atribuidos cuando se aplica a individuos con algún tipo de enfermedad. Desde su publicación, el HADS ha sido traducido a más de 25 idiomas y varias poblaciones (Hermann, 1977). La traducción al español y su validación fue realizada por Tejero, Guimerá, Farré & Peri (1986). Posteriormente una revisión demostró que (Bjelland I,2002) que el HADS posee altos niveles de confiabilidad y validez en su uso con pacientes en varias condiciones médicas (López-Alveranga l., 2002) demostrando adecuadas propiedades psicométricas (Zigmond, AS.,1983) Ha sido utilizado ampliamente en poblaciones de pacientes con artrosis, cáncer, mujeres con depresión puerperal y pacientes con lesiones cerebrales traumáticas. Entre los cuestionarios para evaluar la depresión y la ansiedad, el HADS es el cuestionario considerado más útil y sensible para detectar depresión y ansiedad en la evaluación de pacientes con dolor crónico, pues esta escala se centra en la evaluación de los aspectos cognitivos de la ansiedad y la depresión. Los factores psicológicos, como la ansiedad y la depresión, deben compararse con algunos criterios de gravedad y desarrollo en el dolor crónico. Los criterios objetivos no forman parte de cuestionarios respondidos por el propio paciente y facilitan la claridad de la comparación. El HADS es un cuestionario de autoaplicación de 14 items, distribuidos en dos subescalas de siete items cada una, una de ansiedad (items impares) y otra de depresión (items pares). Los autores de la versión original en inglés (Zigmund & Snaith, 1983) se propusieron, desde el inicio del proceso de desarrollo del instrumento, definir cuidadosamente y distinguir claramente entre los conceptos de ansiedad y depresión. Los ocho items de la subescala de ansiedad están seleccionados a partir del análisis y la revisión de la escala Present State Examination (pse), así como de la investigación acerca de las manifestaciones psíquicas de la ansiedad (Zigmund & Snaith, 1983). Por tanto, los items evaluan si la persona ha estado tensa, preocupada o ha tenido sensaciones de temor. La subescala de depresión se centran en el área de la anhedonia, puesto que es probablemente el rasgo psicopatológico central de la depresión (Zigmund & Snaith, 1983). Así, la subescala de depresión indaga, básicamente, cuestiones como la pérdida de interés en las actividades cotdianas, tener pensamientos pesimistas o la capacidad de reír. El tiempo total de respuesta es de aproximadamente 10 minutos. En las instrucciones se pide al paciente que describa cómo se ha sentido durante la última semana incluyendo el día de hoy. Las opciones de respuesta son tipo Likert que oscilan del cero al tres, dando un puntaje mínimo de cero y un puntaje máximo de 21 para cada subescala. Material y Métodos 35 Originalmente, los intervalos de puntos de corte considerados (Snaith RP, 2003) (Andersson G,2003) son:  0 a 7 implican la ausencia de ansiedad y/o depresión clínicamente relevante,  de 8 a 10 que requiere consideración  de 11 al 21 la presencia de sintomatología relevante y un probable caso de ansiedad y/o depresión - Cuestionario EeuroQol (EQ-5D) El EQ-5D, desarrollado por el Grupo EuroQol (www.euroqol.org), es un instrumento genérico y estandarizado elaborado para describir y valorar la calidad de vida relacionada con la salud (CVRS) (Ministerio de Sanidad y Política Social, 2009)(Ministerio de Sanidad, Servicios Sociales e Igualdad. 2014). El propósito original del EQ-5D es obtener un índice cardinal de salud, lo cual tiene un considerable potencial para su uso en evaluación económica. Este índice ha sido recomendado para ser utilizado en análisis coste-utilidad de tecnologías sanitarias por el National Institute for Health and Clinical Excellence (NICE, http://www.nice.org.uk/). Además, el EQ-5D ha probado su utilidad como medida de salud de la población, pudiendo mostrar las diferencias entre comunidades o grupos de población de diferentes características socioeconómicas, tanto de los estados de salud como de la valoración que los individuos hacen de esos estados de salud. La inclusión del EQ-5D en las encuestas de salud poblacionales posibilita estas aplicaciones al permitir contar con una norma de referencia de la percepción de la salud de la población general (Velázquez Rivera I., 2014). El EQ-5D nació para tratar de ofrecer una medida de salud autopercibida que incorporase las preferencias individuales (utilidades) sobre los estados de salud y que sirviera como medida de efectividad en la evaluación económica de las tecnologías sanitarias y las políticas en materia de salud. s posible así contar con una unidad de salud, el Año de Vida Ajustado por Calidad (AVAC) o, en su versión más conocida en inglés, Quality Adjusted Life Year (QALY). Se utiliza en diferentes momentos en el tiempo, por ejemplo, derivación, admisión, alta, y seguimiento de pacientes ambulatorios, mediante la medición de cambios en el estado de salud de pacientes individuales y de grupos de pacientes. Este cuestionario mide la calidad de vida relacionada con la salud. Ampliamente validado en España.Se compone de dos partes: el sistema descriptivo y la Escala Análoga Visual (EAV). El sistema descriptivo mide la salud en cinco dimensiones (movilidad, cuidado personal, actividades cotidianas, dolor/malestar y ansiedad/depresión), cada una de las cuales tiene tres grados de gravedad (“no hay problemas”, “algunos problemas de carácter moderado”, “problemas graves”). En la segunda parte del EQ-5D, los encuestados evalúan su estado de salud general según una EAV vertical de 20 cm. con los límites marcados según unos valores de referencia de 0 (el peor estado de salud imaginable) y 100 (el mejor estado de salud imaginable). El estado de salud se puede convertir en un índice único mediante la aplicación de una fórmula que pondera cada uno de los niveles en cada dimensión. Cada estado de salud recibe un valor de acuerdo con un conjunto particular de pesos o conjuntos de valores que miden los estados de salud en una escala anclada en 1 = salud completa y 0 = muerte. El conjunto de valores o utilidades se basa en la valoración de estados de salud del EQ-5D a partir de muestras de población general. Muchos países cuentan con un índice de salud obtenido a partir de diferentes técnicas de medida de preferencias sobre los estados de salud del EQ-5D-3L. Recientemente, el grupo EuroQol ha desarrollado un protocolo de estudio de obtención de preferencias a partir de los resultados de una serie de estudios piloto llevados a cabo por Material y Métodos 36 equipos de investigación de todo el mundo para la obtención de utilidades de los estados de salud del EQ-5D-5L, que combina dos técnicas de medición de preferencias sobre estados de salud: Equivalencia Temporal (Time Trade Off -TTO-) y el método de Elección Discreta (Discrete Choice -DC-). Este protocolo común ha sido ya aplicado con carácter pionero en España a una muestra representativa de la población general. (http://www.msssi.gob.es/estadEstudios/estadisticas/encuestaNacional/encuestaNac2011/infor mesMonograficos/CVRS_adultos_EQ_5D_5L.pdf.) - Efectos adversos Se recoge la aparición o no de los siguientes síntomas, todos ellos indicadores de efectos adversos secundarios a opioides:  Náuseas  Vómitos  Estreñimiento  Insomnio  Prurito  Sedación  Alucinaciones  Depresión respiratoria  Eventos hemodiámicos - Necesidad de Rotación Se ha recogido la existencia o no de rotación de opioides. Esto indica el intercambio de fármacos de este grupo. La rotación se indicaba a las 8 semanas de iniciar el tratamiento opioide si la tolerancia era mala con presencia de efectos adversos,fundamentalmente gastrointestinales, y se consideraba imprescindible mantener el tratamiento opioide. - Necesidad de visita a Urgencias Bajo este epígrafe hemos registrado la necesidad o no visitas efectuadas a Urgencias originadas por reagudizacíon, falta de control de dolor basal. 6. Genotipado de los polimorfismos de un único nucleótido (SNP) SNP A118G / dbSNP rs1799971 (G) en el gen del receptor opioide µ1 (OPRM1) y SNP G472A / db SNP rs4680 (A) en el gen de la enzima COMT de los pacientes de la muestra - Extracción del ADN o Obtención de células mononucleadas de sangre periférica Se utilizaron muestras de sangre periférica recogida en tubos de EDTA, en lascuales se aislaron las células nucleadas mediante centrifugación durante 15 min a 1500 rpm a 4 º de temperatura. Tras este proceso, se consiguió la aparición de tres fases: la correspondiente al plasma, la interfase que contiene las células nucleadas de la sangre, y la fase eritrocitaria. Material y Métodos 37 Se recuperó la interfase de células nucleadas, y tras la lisis de los glóbulos rojos que hubieran podido arrastrarse con agua destilada en una nueva centrifugación,se lavaron las células mononucleadas en tampón Fornace (0,25 M Sacarosa; 50 mM Tris-HCl pH: 7,5; 25 mM KCl; 5 mM MgCl2) el cual proporciona la osmolaridad necesaria para no romper los leucocitos. Posteriormente se precipitaron mediante centrifugación a 1500 rpm durante 10 min. o Aislamiento del ADN total de alto peso molecular El botón de células nucleadas de la sangre se resuspendió en tampón Fornace a una concentración estimada de 5 x 106 células/mL, con la adición de EDTA 0,5 M pH 8 (concentración final 10 mM), quelante de iones divalentes que posibilita la inactivación de las nucleasas; SDS (concentración final 1%), para romper las membranas celulares; y proteinasa K (concentración final 50 μg/mL), para degradar las proteínas. La mezcla resultante se incubó en baño a 55 ºC durante 8-16 h. o Purificación del ADN Tras la incubación, se procedió a la extracción y purificación del ADN. Para ellose añadió al producto obtenido un volumen igual al suyo de la mezcla:fenol+cloroformo+alcohol isoamílico (25:24:1). Se mezcló y centrifugó durante 10 min a 1800 rpm a 20 ºC, y se recoge la fase sobrenadante que contiene el ADN en solución. A esta fase se le añadió un volumen de CIAA (cloroformo + alcohol isoamílico 24:1), y se centrifugó de nuevo con las mismas condiciones que en el paso previo. Se recuperó de nuevo la fase acuosa, y se introdujo en un tubo con 2,5 volúmenes de etanol absoluto frío, mezclándose por inversión hasta que apareció ADN, ya que el etanol absoluto hace que precipite. Se retiró y mezcló en un tubo Eppendorf con 500 μl de etanol, se centrifugó a 13000 rpm durante 5 min y se decantó. Por último, se lavó el ADN mediante la adición de etanol al 70% y una nueva centrifugación, y finalmente se resuspendió en ddH2O estéril. El DNA se extrajo a partir de sangre perisférica entera mediante el FLEXIGENE DNA KIT de QUIAGENE según el manual del fabricante. - Genotipado de los de los polimorfismos de un único nucleótido (SNP) SNP A118G / dbSNP rs1799971 (G) en el gen del receptor opioide µ1 (OPRM1) y SNP G472A / db SNP rs4680 (A) en el gen de la enzima COMT de los pacientes de la muestra La amplificación del ADN se llevó a cabo mediante reacción en cadena de la polimerasa (PCR) a tiempo real. Esta técnica se fundamenta en la adaptación de un termociclador a un lector de fluorescencia, y presenta la ventaja de que los procesos de amplificación y detección se producen de manera simultánea, sin necesidad de ninguna acción posterior. Además, durante el proceso de amplificación se puede medir la cantidad de ADN sintetizado en todo momento, ya que es proporcional a la emisión de fluorescencia producida en la reacción, pudiendo así registrarse la cinética del proceso (Costa J, 2004). Básicamente, la PCR emula en un tubo de ensayo el proceso de síntesis de ADN que tiene lugar en la naturaleza amplificando fragmentos de ácidos nucleicos de forma exponencial. El proceso se lleva a cabo de forma cíclica en un termociclador y cada uno de los ciclos constade tres fases. En la primera denominada de desnaturalización, se calienta el ADN extraído de la muestra biológica a 95-98ºC, ya que a esas temperaturas se rompen los puentes de hidrógeno Material y Métodos 38 que mantienen unidas las dos hebras del ADN y éstas se separan. A continuación, en la fase de hibridación se produce el acoplamiento de los cebadores o primers, que son moléculas de ADN monocatenario previamente diseñadas,que se unen al lugar complementario de la hebra del ADN diana previamente desnaturalizado. Esta fase se produce a 45-65ºC durante 30-90 segundos, dependiendo de la longitud y secuencia de las bases de los cebadores que oscilan de 18 a30pb. Los cebadores son necesarios porque todas las polimerasas necesitan un fragmento de cadena doble de ADN que les indique dónde comenzar a incorporar nucleótidos. Finalmente, una vez acoplados los cebadores al ADN, la polimerasa comienza a actuar incorporando los nucleótidos presentes en la mezcla y sintetizando así una copia de cada una de las dos hebras del ADN diana. Esta última fase tiene lugar a 70-75ºC durante 30-180 segundos. Así pues, este proceso se repite n veces, de tal modo que en condiciones ideales se obtendrían 2 copias (Diazaraque R, 2002) de la región adyacente a la zona complementaria a los cebadores. Una vez terminada la serie de ciclos es preciso detectar e identificar el ADN producto de la reacción (Pang D, 2015). El genotipado de los SNPs rs4680 y rs1799971 se realizó mediante curvas de disociación en el equipo LightCycler 480® Instrument de Roche. Para ello se realizó un amplificación con la mezcla LightCycler 480® FastStart DNA Master HybProbe; optimizando la reacción con: Reagent Mix 0.5µl, FastStart DNA Master 1µl, MgCl2 (25mM) 0.8µl, H2O calidad biología molecular 5.2µl y 2.5µl de DNA molde. Los parámetros de amplificación y su hibridación con la sonda fueron los que aparecen por defecto en el LightCycler 480® Instrument. 7. Método estadístico. Inicialmente se realizó un análisis descriptivo de la población estudiada. Y posteriormente se analizaron todas las varibles en función de diferentes parámetros de comparación entre los que cabe destacar: el género de los pacientes, el alelo expresado tanto en relación con el gen OPRM1 como COMT, el tipo de opiáceo consumido, diferentes intervalizaciones en las escalas de valoracion del dolor, la ansiedad, y la calidad de vida en función de la percepción del estado de salud. Se determinó la eficacia y seguridad de la analgesia utilizada y la necesidad de rotación de opiáceos en función del alelo expresado tanto en relación con el SNP A118G / dbSNP rs1799971 (G) en el gen del receptor opioide µ1 (OPRM1) como con el SNP G472A / db SNP rs4680 (A) en el gen de la enzima COMT. Todos los datos aparecen expresados como los valores medios más/menos el error estándar de la media (media±sem) o como los valores medios más/menos la desviación estándar de la media (media ± DE) de N valores, en el caso de las variables cuantitativas. En el caso de las variables cualitativas los valores aparecen expresados como la frecuencia de N casos y como el porcentaje de incidencia de N casos. La comparación entre grupos se realizó aplicando los test de: - Test de “t” de Student - Análisis de la varianza ANOVA de una y de varias vías - Análisis de medidas repetidas - Test de Chi cuadrado (χ2) - Correlaciones bivariadas - Regresiones lineales y logísticas Material y Métodos 39 Para evaluar la influencia que las características epidemiológicas (edad, género, estudios), clínicas (tipo dolor, patología, intensidad de dolor, existencia ansiedad, depresión, alteraciones de la calidad de vida y de reacciones adversas a medicamentos) y genéticas (existencia de las diferentes combinaciones de alelos homo y heterocigóticas de los SNP A118G / dbSNP rs1799971 (G) en el gen del receptor opioide µ1 (OPRM1) y G472A / db SNP rs4680 (A) en el gen de la enzima COMT) de los pacientes, tenían en la eficacia y seguridad del tratamiento con opiáceos, se llevó a cabo un análisis multivariante de regresión logística dicotómica para el cálculo de la medida del efecto como Odds Ratio (OR). La variable resultado fue la existencia de eficacia, la necesidad de rotación, la necesidad de tratamiento intenrvencionistay la aparición de cada una de las reacciones adversas (presente/ausente) de los opioides, y las variables predictoras las distintas características referidas (analizadas como factores o covariables según su escala de medida), especialmente las variables genéticas (existencia de las diferentes combinaciones de alelos homo (AA o GG) y heterocigóticas (AG) de los SNP A118G / dbSNP rs1799971 (G) en el gen del receptor opioide µ1 (OPRM1) y G472A / db SNP rs4680 (A) en el gen de la enzima COMT). En este modelo multivariante se incluyeron como variables predictoras aquellas que inicialmente presentaron asociación estadística significativa con p <0,05 en el análisis univariante; para el análisis multivariante se introdujeron las variables predictoras en una secuencia “hacia atrás”, con p de inclusión <0,10 y p exclusión <0,15, con independencia de los cambios producidos en la OR. No se evaluaron interacciones porque eltamaño muestral no lo permitía. Se consideró en todos los casos la existencia de diferencias estadísticamente significativas cuando la p < 0,05. Para el análisis se utilizó el paquete estadístico SPSS 11.5.1, SPSS Inc., 1989-2002. 8. Anexos de Material y Métodos ANEXO 1: Hoja de información al paciente. En un documento anexo se adjunta el consentimiento para el tratamiento e inclusión de muestras biológicas en el biobanco. ANEXO 2: Consentimiento informado del paciente y consentimiento para muestras genéticas y biobanco ANEXO 3: Escala Visual Analógica (EVA) ANEXO 4: Cuestionario Breve de Dolor (BPI) ANEXO 5: Escala Hospitalaria de Ansiedad y Depresión (HADS) ANEXO 6. Cuestionario EeuroQol (EQ-5D) ANEXO 7: Índice comorbilidad de Charlson. ANEXO 8: Curvas de disociación en el equipo LightCycler 480® Instrument de Roche. ANEXO 9 : Cuestionario recogida de datos ANEXO 10: Aprobación Comité de Ética Provincial Material y Métodos 40 ANEXO 1: HOJA DE INFORMACIÓN AL PACIENTE Título del estudio: POLIMORFISMO GENETICO (EN LOS GENES OPRM1 Y COMT) CORRELACIÓN CON LA EFICACIA Y SEGURIDAD DEL TRATAMIENTO OPIOIDE EN PACIENTES CON DOLOR CRÓNICO MUSCULO ESQUELETICO,NEUROPÁTICO O VISCERAL . Se le ofrece la posibilidad de participar en el proyecto de investigación titulado: “POLIMORFISMO GENETICO (EN LOS GENES OPRM1 Y COMT) CORRELACIÓN CON LA EFICACIA Y SEGURIDAD DEL TRATAMIENTO OPIOIDE EN PACIENTES CON DOLOR CRÓNICO MUSCULO ESQUELETICO,NEUROPÁTICO O VISCERAL”. que está siendo realizado en el Hospital Universitario virgen de la Victoria de Málaga y que ha sido ya evaluado y aprobado por el Comité Ético de Investigación Clínica de este Hospital. INTRODUCCIÓN Y OBJETIVO: El dolor crónico es una situación que afecta en gran medida la calidad de vida de las personas. Disponemos de potentes analgésicos capaces teóricamente de tratar este problema. Sin embargo hasta la cuarta parte de los pacientes tratados con opioides abandonan el tratamiento por distintos motivos. Este hecho nos lleva a estudiar factores individuales que afecten la acción y metabolismo de estos fármacos de forma que en un futuro sea posible mediante determinadas pruebas saber de antemano como funcionará cada fármaco en cada persona concreta. Se trataría de correlacionar los resultados obtenidos en el tratamiento del dolor con fármacos opioides en cada individuo con unas características concretas en unos determinantes genéticos específicos. DESCRIPCIÓN DEL ESTUDIO: • Se le pide su permiso para recoger datos de su historia clínica. Para la realización del estudio es necesario recoger datos que se encuentran ya en su historia clínica y que hacen referencia a su enfermedad, por lo que usted no deberá hacer nada. Los datos que recoja el médico del estudio únicamente serán utilizados si usted, como paciente, da su consentimiento expreso para recogerlos. • Pediremos su consentimiento para una extracción de 5 ml de sangre de una vena del brazo con la cual se analizaran los polimorfismos de los genes COMT y OPRM1. • La participación en el presente proyecto no supone ninguna alteración del tratamiento que está llevando (si lo tiene), a parte de las que su médico considere oportunas para el manejo de su enfermedad, de forma independiente al estudio. RIESGOS DEL ESTUDIO: • En el siguiente estudio no se llevará ninguna alteración en su tratamiento y la única intervención será una extracción de sangre de una vena con el riesgos que ello supone principalmente la formación de un hematoma en el área de punción. BENEFICIOS DEL ESTUDIO: • Usted no recibirá ningún tipo de beneficio inmediato por su participación en el estudio, ni en cuanto a su tratamiento ni de otra naturaleza. Usted continuará siendo tratado por su médico de acuerdo a su práctica habitual. Material y Métodos 41 OBLIGACIONES: • Su participación es voluntaria. Si decide participar en este estudio, el médico recogerá información de su historia clínica. Usted puede, en cualquier momento, decidir no seguir participando, diciéndoselo al médico sin tener que manifestar razón alguna para ello. El médico también podrá retirarlo del estudio si así lo creyera conveniente. AVANCES EN EL CONOCIMIENTO: • Los datos obtenidos a partir de este estudio serán difundidos en comunicaciones y publicaciones de ámbito científico, por lo que cualquier avance o nuevo descubrimiento que se realice durante el curso del estudio será facilitado. Su identidad no será desvelada en ningún momento. DISPOSICIONES LEGALES VIGENTES: • Todo el estudio se llevará a cabo de acuerdo con los requerimientos éticos de las declaraciones de Helsinki, revisión de Seúl, Corea (Octubre 2008) para la investigación con seres humanos, así como de acuerdo a las normas de buena práctica clínica. De acuerdo a las disposiciones legales vigentes, el estudio ha sido aprobado por un Comité Ético de Investigación Clínica. CONFIDENCIALIDAD: • De acuerdo con la Ley Orgánica 15/1999, de 13 de diciembre, de Protección de Datos de Carácter Personal (LOPD), los datos personales y de salud que se recojan con motivo de este estudio son los necesarios para cubrir los objetivos del mismo. Estos datos serán identificados por medio de un código para garantizar la confidencialidad de tu identidad. Únicamente el médico tendrá acceso a esta información. También podrán acceder a estos datos las Autoridades Sanitarias y el Comité Ético de Investigación Clínica. Todos ellos mantendrán en todo momento la confidencialidad de esta información. • Los datos que se recojan con motivo de este estudio serán procesados y analizados por el promotor del estudio, con la finalidad de evaluarlos científicamente. Si decide participar en este estudio estará consintiendo expresamente en el tratamiento de sus datos personales y de salud para que se evalúen científicamente. Todo ello de conformidad con la LOPD y con la normativa que la desarrolla. Como paciente, podrá ejercitar en cualquier momento sus derechos de acceso, rectificación, cancelación y oposición dirigiéndose al médico del estudio. Si tiene alguna duda ahora o en algún momento del estudio, por favor contacte con: Dr………………………………………………………………………………………… Dirección:…………………………………………………………………………...... Teléfono:…………………………….. En caso que esté de acuerdo en participar en el presente estudio, por favor, rellene y firma el formulario de consentimiento informado adjunto. Material y Métodos 42 ANEXO 2: CONSENTIMIENTO INFORMADO DEL PACIENTE Título del estudio: POLIMORFISMO GENETICO (EN LOS GENES OPRM1 Y COMT) CORRELACIÓN CON EFICACIA Y SEGURIDAD EN PACIENTES CON DOLOR CRÓNICO MUSCULO ESQUELETICO,NEUROPÁTICO O VISCERAL TRATADOS CON OPIOIDES. Código de estudio: Por favor, si está de acuerdo en participar en el estudio, cumplimente el siguiente consentimiento: Yo (NOMBRE Y APELLIDOS), • He leído esta hoja de información • He podido hacer preguntas sobre el estudio • He recibido suficiente información sobre el estudio • He hablado con (NOMBRE DEL INVESTIGADOR): Dr./ Dra. Comprendo que la participación en el estudio es voluntaria, y que puedo decidir retirarme del estudio: • Cuando quiera • Sin tener que dar explicaciones • Sin que esto repercuta en mis cuidados médicos Presto libremente mi conformidad para participar en el estudio (RECIBO COPIA DEL PRESENTE DOCUMENTO) En ..........…………………….., a ……… de …………………... de 20.... Firma del paciente Firma del investigador Atención: Este documento contiene información confidencial del paciente, por lo que debe ser custodiado por el investigador junto al resto de la documentación del estudio. El paciente recibirá copia del mismo tras su firma. Material y Métodos 43 ANEXO 3: ESCALA ANALÓGICA VISUAL. (EVA) Escala Analógica Visual Material y Métodos 50 ANEXO 8: CURVAS DE DISOCIACIÓN EN EL EQUIPO LIGHTCYCLER 480® INSTRUMENT DE ROCHE. Curva genotipado para el SNP A118G / dbSNP rs1799971 (G) en el gen del receptor opioide µ1 (OPRM1) Para el caso del el SNP A118G / dbSNP rs1799971 (G) en el gen del receptor opioide µ1 (OPRM1) las:  curvas celestes denotan el alelo mayoritario homocigosis (AA)-referencia  curvas verdes el alelo minoritario en homocigosis (GG)  curvas rojas los heterocigotos (AG) Material y Métodos 51 Curva genotipado para el SNP G472A / db SNP rs4680 (A) en el gen de la enzima COMT Para el caso del SNP G472A / db SNP rs4680 (A) en el gen de la enzima COMT las:  curvas rojas denotan el alelo mayoritario homocigotos (GG)-referencia  curvas verdes el alelo minoritario en homocigosis (AA)  curvas celestes los heterocigotos (AG) Material y Métodos 52 ANEXO 9: CUADERNO RECOGIDA DATOS Material y Métodos 53 ANEXO 10: APROBACION COMITÉ DE ETICA DE LA INVESTIGACION PROVINCIAL DE MALAGA Material y Métodos 54 Resultados y Discusión 55 RESULTADOS y DISCUSIÓN Resultados y Discusión 56 Resultados y Discusión 57 Resultados y Discusión Resumiremos y discutiremos a continuación los principales resultados obtenidos en el estudio. 1. Discusión General. Las variaciones genómicas condicionan el dolor, entendiendo por él su concepto total. Así, influyen no sólo en la respuesta a la analgesia sino también en la sensibilidad al dolor basal y en el desarrollo de la patología de dolor crónico. En la actualidad se siguen varias líneas de investigación, cuyos genes candidatos son el receptor de la melanocortina-1, la guanosina trifosfato ciclohidrolasa, la superfamilia uridín difosfato glucuronosil transferasa (UGT), la catecol-O-metil transferasa, el receptor opioide mu y algunas isoformas del CYP 450, como CYP2D6, CYP3A5 y CYP2B6. No obstante, se sabe que el dolor crónico es una afección tan compleja, como, por ejemplo, la diabetes, y que el impacto genético total en él involucra a múltiples genes, aunque la investigación se haya centrado en genes único, simplemente, por ser mas fácil obtener conclusiones fiables. Revisando muy brevemente los genes implicados en mecanismos de producción/recepción del dolor y que condicionan la eficacia de fármacos analgésicos, especialmente los opiáceos, destacar los siguientes hallazgos. Se sabe que el receptor de la melanocortina-1(MC1R) presenta algunas variantes alélicas no funcionales. Este receptor tiene un papel fundamental en el tipo de melanina producida por los melanocitos, y en cierta manera explica el tipo de color cutáneo. El fenotipo de piel clara y pelirrojo probablemente se debe a una pérdida de función del gen para este receptor. De hecho, un alto porcentaje de los pelirrojos presentan dos o más variantes alélicas inactivas de MC1R. Además, este receptor está involucrado en la inmunomodulación. El MC1R media en la sensibilidad inducida a través del receptor opioide ƙ, y se sabe que los agonistas de este receptor tipo pentazocina producen una analgesia importante en las mujeres, pero no en los hombres. Así, se ha observado que las mujeres portadoras de dos alelos mutados inactivos del MC1R muestran una gran respuesta a la pentazocina, en contraposición con las mujeres que presentan un solo alelo mutado o ninguna mutación. Esta modulación del dolor específica del sexo sólo se ha observado en el sistema opioide ƙ. La investigación farmacogenómica de la analgesia ha conducido a importantes hallazgos, como el del papel de la enzima guanosina trifosfato ciclohidrolasa (GCH1) en el dolor neuropático y en el dolor inflamatorio (Tegeder I, 2006). Esta enzima controla la velocidad de síntesis de la tetrahidrobiopterina (BH4), que es un cofactor esencial que regula el metabo lismo de las tres hidrolasas de aminoácidos aromáticos: la fenilalanina-4 hidroxilasa, la tirosina-3-hidroxilasa y la triptófano-5-hidroxilasa. También regula la producción de óxido nítrico. Los polimorfismos que afectan a la enzima GCH1, en concreto un haplotipo del gen GCH1, se asocian a una disminución en el dolor tras una discectomía radicular por dolor lumbar persistente. Este efecto protector del haplotipo se observó en un 15,4% de la población caucásica analizada (n=168) (Tegeder I, 2006). Los individuos sanos que son homocigotos para este haplotipo muestran una menor sensibilidad al dolor experimental, ya que expresan el GCH1 menos que los controles. Por tanto, la tetrahidrobiopterina (BH4) es un regulador intrínseco de la sensibilidad y la cronicidad del dolor, y la enzima GCH1 es un marcador de estos rasgos. Resultados y Discusión 58 No podemos olvidar los estudios realizados con algunas isoformas del CYP 450, en especial con CYP2D6. Esta isoforma es altamente polimórfica (se conocen más de 80 variantes alélicas) y participa en el metabolismo de algunos analgésicos como la codeína, el tramadol, la oxicodona y el dextrometorfano. Los individuos que presentan dos alelos funcionantes normales o wild-type se denominan metabolizadores extensivos. En contraste, los portadores de dos alelos no funcionantes (8-10% de los caucásicos) se denominan metabolizadores pobres y presentan un mayor riesgo de efectos adversos con algunos fármacos, como los antiarrítmicos, y de fallo terapéutico de aquellas moléculas que son profármacos de metabolitos activos (p. ej. la codeína y el tramadol). A su vez, algunas variantes alélicas llevan a la duplicación o multiplicación de la enzima, y sus portadores son denominados metabolizadores ultrarrápidos. Aproximadamente el 3% al 5% de la población caucásica son metabolizadores ultrarrápidos. La codeína es un profármaco que tiene mucha menor afinidad por los receptores opioides µ que la morfina, cuya O-desmetilación por CYP2D6 origina la morfina. En la práctica clínica se observa una gran variabilidad interindividual en la respuesta a la codeína, y en torno aun 10% de la población caucásica no obtiene beneficio del tratamiento, o sólo mínimo. Por otro lado, los portadores de una duplicación o multiplicación del gen pueden presentar toxicidad importante tras una dosis normal de codeína. Así, se ha observado que el genotipo CYP2D6 ultrarrápido conduce a concentraciones plasmáticas de morfina y sus glucurónidos que son un 50% de las que presentan a igualdad de dosis los metabolizadores extensivos (Kircheheiner J, 2007). En cuanto al tramadol, hay que considerar que su actividad analgésica es el resultado de la acción sinérgica de sus dos enantiómeros y de sus metabolites activos. Los metabolizadores pobres prácticamente no muestran concentraciones del metabolito activo, en comparación con los individuos heterocigotos, los metabolizadores extensivos y los ultrarrápidos. En los metabolizadores pobres, la probabilidad de no obtener respuesta aumenta más de cuatro veces. En cuanto a la analgesia mediada por fármacos no opioides, hay que considerar que varios de los antiinflamatorios no esteroideos, como el ibruprofeno, el diclofenaco, el naproxeno y el piroxicam, se metabolizan mediante la isoforma CYP2C9. Esta isoforma es polimórfica, presentando los alelos *2 y *3 menor actividad que el alelo salvaje *1. De hecho, se ha observado que los pacientes que presentan los dos alelos CYP2C9*3 muestran un aclaramiento reducido de la forma racémica S-ibuprofeno, y esta reducción en el parámetro farmacocinético se acompaña de un aumento en la actividad farmacodinámica. Debido a esta complejidad genética el conocimiento en este campo es todavía aún muy pequeño. A pesar de esta falta de conocimiento, hoy por hoy, se considera que las mutaciones del gen OPRM1, que codifica para el receptor opiode µ, y COMT que codifica la enzima catecol-O-metil transferasa, son las únicas con repercusión clínica relevante y en vías de ser demostradas con claridad. Por este motivo nos hemos centrado sólo en dos polimorfismos de un único nucleótido (SNP) el SNP A118G / dbSNP rs1799971 (G) en el gen del receptor opioide µ1 (OPRM1) y el SNP G472A / db SNP rs4680 (A) en el gen de la enzima COMT. A continuación intentaremos resumir de forma sistemática los principales hallazgos de este estudio, comentando y discutiendo los resultados obtenidos para facilitar el seguimiento de esta memoria. Resultados y Discusión 59 1.2. SNP A118G / dbSNP rs1799971 (G) en el gen del receptor opioide µ1 (OPRM1) y SNP G472A / db SNP rs4680 (A) en el gen de la enzima COMT. Aproximadamente de un 10% a un 15% de la población caucásica son polimórficos para la mutación A118G situada en el exón 1 del gen OPRM1. Este polimorfismo modifica la activación cortical nociceptiva (Lötsch J, 2006), pero no la no nociceptiva, de manera que contribuye de manera significativa a la variabilidad en la sensibilidad al dolor. El polimorfismo de un único nucleótido (SNP) A118G / dbSNP rs1799971 (G) en el gen del receptor opioide µ1 (OPRM1) ha constituido hasta el momento actual la variable farmacogenética de los receptores opioides µ1 más estudiada. En este caso el alelo ancestral (wild type) A (existente en condiciones de normalidad) es sustituido por el alelo G. La aparición del alelo G en el exón 1 del receptor OPRM1, conocida también como A118G (N40D, o Asn40Asp), origina la sustitución de la asparagina (Asn) que normalmente aparece en el residuo 40 del aminoácido por ácido aspártico (Asp), con la consiguiente pérdida de N-glicosilación en la zona extracelular del receptor. El polimorfismo A118G, tiene una frecuencia del 11 al 17% en la población caucásica. Existen estudios que evaluan el efecto del SNP A118G / dbSNP rs1799971 (G) sobre la eficacia analgésica de los opioides y sus efectos secundarios. En este polimorfismo, los portadores del alelo rs1799971 (G) se han relacionado con una mayor sensibilidad al dolor y la necesidad de mayores requerimientos de opioides para conseguir el efecto analgésico (http://www.snpedia.com/index.php/Rs1799971). Podríamos explicar este efecto por que el SNP A118G / dbSNP rs1799971 (G), induce un cambio en el receptor opioide (debido a la pérdida de N-glicosilación en la zona extracelular del receptor) que conlleva a nivel molecular el desarrollo de una afinidad para la β endorfina, una menor actividad para los ligandos exógenos y la alteración en la transducción una vez activado el receptor con producción alterada de RNAm, esto es, una dificultad/retraso en la transmisión del reporte de activación de los receptores µ, lo que se puede traducir en una falta de la sensación de analgesia mediada por la activacion opioide µ1. A nivel clínico la presencia de este receptor mutado (“defectuoso”) aporta una mayor sensibilidad al dolor, que supone la necesidad de dosis mayores de opioides para alcanzar analgesia. Por ejemplo, en un contexto postoperatorio (intenso dolor agudo) se ha descrito que los pacientes portadores del SNP A118G / dbSNP rs1799971 (G) precisan mayores dosis de morfina o de fentanilo para alcanzar un nivel óptimo de analgesia. Además, los homocigotos (GG) para el alelo A118G responden menos a la morfina 6glucurónido (el principal metabolito activo de la morfina) respecto a los heterocigotos (AG) y los homocigotos para la forma natural-salvaje (wild type) del gen (AA). Se han realizado diversos trabajos (Stamer UM, 2007), algunos de ellos en mujeres histerectomizadas y en pacientes con artoplastia de rodilla, que han confirmado la menor sensibilidad a la respuesta opioide en los sujetos homocigotos 118GG. Sin embargo, no hay una traslación rápida y directa de este tipo de datos a la práctica clínica, ya que los resultados en cuanto a la conversión de la disminución en la respuesta a un aumento en el requerimiento de dosis son controvertidos. De hecho, este polimorfismo no sólo influye sobre la respuesta a la morfina y a su metabolito 6-glucurónido, sino que también interviene en la respuesta a la oxicodona y al alfentanilo, entre otros (http://www.snpedia.com/index.php/Rs1799971). En un estudio (Oertel BG, 2006) se observó que los pacientes homocigotos para la mutación (GG) requirieron concentraciones de alfentanilo entre 2 y 4 veces mayores para mostrar una analgesia similar a los individuos wild-type (AA). Resultados y Discusión 66 Figura 6. Síndromes dolorosos principales. Tabla 1. EVA medio de toda la población y en función del genotipo OPRM1 y COMT. A. Genotipo OPRM1 Intervalo de confianza para la media al 95% Genotipo OPRM1 N Media ±sem Límite inferior Límite superior EVA basal AA 113 6,35 0,14 6,08 6,63 AG 69 6,58 0,19 6,21 6,95 GG 7 7,29 0,57 5,90 8,67 Total 189 6,47 0,11 6,26 6,69 EVA al año AA 113 6,37 0,18 6,02 6,72 AG 69 6,39 0,22 5,95 6,84 GG 7 6,71 0,87 4,60 8,83 Total 189 6,39 0,14 6,12 6,66 B. Genotipo COMT Intervalo de confianza para la media al 95% Genotipo COMT N Media ±sem Límite inferior Límite superior EVA basal AA 29 6,45 0,26 5,91 6,98 AG 90 6,43 0,15 6,13 6,74 GG 70 6,53 0,19 6,15 6,90 Total 189 6,47 0,11 6,26 6,69 EVA al año AA 29 6,69 0,37 5,94 7,44 AG 90 6,22 0,21 5,80 6,64 GG 70 6,49 0,20 6,08 6,89 Total 189 6,39 0,14 6,12 6,66 27% 68% 5% TIPO DE SÍNDROME DOLOROSO NOCICEPTIVO MIXTO NEUROPATICO Resultados y Discusión 67 Figura 7. EVA medio de toda la población y en función del genotipo OPMR1 y COMT. Figura 8. EVA medio de toda la población y en función del genotipo OPMR1 y COMT. Figura 9. Distribución de genotipos OPRM1 y COMT en toda la población. 6,47 6,35 6,58 7,29 6,45 6,43 6,53 0,11 0,14 0,19 0,57 0,26 0,15 0,19 0 2 4 6 8 10 EVA Total OPMR1-AA OPMR1-AG OPMR1-GG COMT-AA COMT-AG COMT-GG EVA medio basal/inicio Edad media sem 6,39 6,37 6,39 6,71 6,69 6,22 6,49 0,14 0,18 0,22 0,87 0,37 0,21 0,2 0 2 4 6 8 EVA Total OPMR1-AA OPMR1-AG OPMR1-GG COMT-AA COMT-AG COMT-GG EVA medio al año EVA media sem AA; 114; 60,3% AG; 69; 36,5% GG ; 6; 3,2% OPRM1 (%) AA; 28; 14,8% AG; 94; 49,7% GG; 67; 35,4% COMT (%) Resultados y Discusión 68 2.5. Edad, Género, Equilibrio Hardy-Weinberg y genotipos esperados en base a HapMap. En el lenguaje de genética de poblaciones, la ley de Hardy-Weinberg afirma que, bajo ciertas condiciones, tras una generación de apareamiento al azar, las frecuencias de los genotipos de un locus individual se fijarán en un valor de equilibrio particular. La comprobación de la desviación del principio de Hardy–Weinberg (PHW) se suele llevar a cabo utilizando la prueba χ² de Pearson, utilizando las frecuencias genotípicas observadas que se han obtenido de los datos y las frecuencias genotípicas esperadas obtenidas mediante el PHW. La hipótesis nula es que la población tiene proporciones de Hardy-Weinberg, y la hipótesis alternativa es que la población no tiene proporciones de Hardy-Weinberg. Tabla 2. Equilibrio Hardy-Weinberg en la población estudiada OPRM1 Frecuencias Observadas Frecuencias Esperadas 2 p-valor AA 114 (60,32%) 116,68 (61,73%) AG 69 (36,51%) 63,64 (33,67%) 1,34 0,5119 GG 6 (3,17%) 8,68 (4,59%) COMT Frecuencias Observadas Frecuencias Esperadas 2 p-valor AA 28 (14,8%) 29,76 (15,75%) AG 94 (49,7%) 90,48 (47,87%) 0,29 0,8665 GG 67 (35,4%) 68,76 (36,38%) En ambos genotipos no se rechaza la hipótesis nula, y por lo tanto, se cumple el equilibrio de Hardy-Weinberg (tabla 2). Existe una distribución característica de cada SNP en función del género, este hecho parece ser un elemento determinante en la respuesta al dolor. Un mismo polimorfismo puede tener distintas consecuencias en función del género. En nuestra población para el polimorfismo SNP A118G / dbSNP rs1799971 (G) en el gen del receptor opioide µ1 (OPRM1), los individuos que presentan el polimorfismo (*G) son para cada género respectivamente 68,0% en las mujeres y 32% en hombres (figura 10). En el caso del polimorfismo SNP G472A / db SNP rs4680 (A) en el gen de la enzima COMT los individuos que presentan el polimorfismo (*A) son para cada género respectivamente 68,9% en las mujeres y 31,1% en hombres (figura 10). Existen estudios observacionales que apoyan la distinta respuesta al trauma en función del sexo. Ante una liberación masiva de endorfinas se puede desarrollar como efecto secundario un síndrome de dolor musculoesquelético (SDME) generalizado. Los individuos *G para el SNP A118G / dbSNP rs1799971 (G) en el gen del receptor opioide µ1 (OPRM1) poseen un receptor µ disfuncional (N40D) que induce una menor respuesta a los opioides, teóricamente deberían desarrollar menos síndrome de dolor musculo-esquelético, pero además se ha observado que el desarrollo del síndrome es menor en mujeres y mayor en hombres, los mecanismos que subyacen a este hecho deben aún ser dilucidados (Linnstaedt SD,2015). Resultados y Discusión 69 El SNP G472A / db SNP rs4680 (A) en el gen de la enzima COMT va a configurar un mapa cerebral en el que la concentración de dopamina sufre variaciones ostensibles. Este hecho hace que sobre las diferencias atribuibles al sexo se añadan las derivadas de la concentración de neurotransmisores y que en ocasiones varíen los resultados en función del género. Aunque la actividad cognitiva en individuos sanos se asocia con diferencias de género, cuando estamos en presencia del SNP G472A / db SNP rs4680 (A) en el gen de la enzima COMT tendremos una enzima COMT disfuncionante y por tanto un nivel mayor de dopamina en el cortex prefrontral. Este hecho mejorará algunas funciones cognitivas, como la fluidez verbal. En este caso concreto se ha descrito que mejora la fluidez verbal en hombres ya que aumenta el neurotransmisor en un área menos desarrollada en el sexo masculino (Soeiro-De-Souza MG, 2013). A pesar de no observar diferencias estadísticamente significativas entre ambos géneros es interesante considerar la influencia del sexo en las manifestaciones del SNP G472A / db SNP rs4680 (A) en el gen de la enzima COMT. Las variaciones genéticas de la COMT contribuyen al desarrollo de conductas distintas de afrontación al dolor en animales de laboratorio y en medidas objetivas de la intensidad del dolor cuando nos trasladamos al terreno de la práctica clínica humana. Sabemos que la variante primitiva de la COMT o enzima normo-funcionante se asocia con una mayor sensibilidad a la capsaicina en ratones hembras y de igual modo en humanos. La enzima COMT disfuncionante, resultado del SNP, originaria una mayor percepción del dolor inducida por capsaicina en mujeres, pero no en hombres. Estos hallazgos señalan la colaboración y participación de la COMT en el proceso de percepción dolorosa y la importancia del género en el contexto de distintas variantes genéticas (Belfer I,2013). Figura 10. Distribución de genotipos OPRM1 y COMT en toda la población en función del sexo. SNP A118G / dbSNP rs1799971 (G) en el gen del receptor opioide µ1 (OPRM1): *G: 68,0% Mujeres y 32% Hombres SNP G472A / db SNP rs4680 (A) en el gen de la enzima COMT: *A: 68,9% Mujeres y 31,1% Hombres AA 59,5% *G 40,5% Mujer OPRM1 AA 61,9% *G 38,1% Hombre OPRM1 *A 66,7% GG 33,3% Mujer COMT *A 60,3% GG 39,7% Hombre COMT Resultados y Discusión 70 Genotipos observados y esperados de los polimorfismos de un único nucleótido SNP A118G / dbSNP rs1799971 (G) en el gen del receptor opioide µ1 (OPRM1) y SNP G472A / db SNP rs4680 (A) en el gen de la enzima COMT Se conoce como HapMap el catálogo de variaciones genéticas comunes (también llamadas polimorfismos) que están presentes en la especie humana. Su contenido describe en qué consisten dichas variaciones, en qué sitios del genoma suceden y cómo se distribuyen en las diferentes poblaciones. Las variaciones más comunes son los polimorfismos de nucleótido simple o SNPs (del inglés "Single Nucleotide Polymorphism"), que consisten en una variación de un único nucleótido de la secuencia Hapmap es la abreviatura de mapa de haplotipos, esto es un proyecto que comenzó a desarrollarse entre los años 2003 y 2006 para permitir la determinación de como la variación en el genoma humano se mueve por vecindarios, como estos vecindarios tienen límites y como esto ocurre de forma distinta en Europa, Asia o América. En el proyecto se caracterizaron con gran detalle 270 muestras de ADN y entender cómo estos vecindarios a veces tan pequeños como un millar de bases y otras tan grandes como cien mil bases y que se extienden por varios cromosomas que los polimorfismos de un solo nucleótido se muevan de forma conjunta. Esto es lo que se denomina desequilibrio de ligamento, y es extremadamente valioso para intentar conocer las relaciones existentes entre variaciones y la efermedad. En la tabla 3 se muestran las diferencias entre las frecuencia esperadas en la población europea y la obtenida en nuestra muestra. Aunque la diferencias son mínimas, indicar la ligera mayor frecuencia de aparición de los alelos mutantes AG y GG del SNP A118G / dbSNP rs1799971 (G) en el gen del receptor opioide µ1 (OPRM1). Y la ligera mayor frecuencia de aparición de los alelos mutantes homocigótivos AA del SNP G472A / db SNP rs4680 (A) en el gen de la enzima COMT. Es preciso aumentar el tamaño muestral para poder concluir que realmente en nuestro medio estasdiferencias existen y son de relevancia clínica. Tabla 3. Frecuencia en % de genotipos observados y HapMap-CEU Genotipo AA AG GG HapMapCEU Observadas HapMapCEU Observadas HapMapCEU Observadas OPRM1 rs 11799971 70.8 60 27.4 36.3 1.8 3.7 COMT rs4680 24.8 15.5 46.0 47.6 29.2 36.9 2.3. Características educacionales y laborales La población de referencia corresponde a la provincia de Málaga, Valle del Guadhalorce y Costa del sol oriental. En el grupo de pacientes estudiados el nivel de estudios era mayoritariamente de estudios primerios o secundarios, y eran escasos los pacientes con estudios superiores (figuras 3 y 11). Y no observamos hechos destacables en relación con el nivelde estudios de los pacientes observándose un patrón de distribución de nivel de estudios similar en la población (figura 11). En relación con el estado laboral en toda la población, la mayor proporción de la población atendida está integrada en el mundo laboral a pesar de padecer dolor crónico de alta intensidad y seguir tratamiento opioide regularmente. El 67,6% de la población estudiada se encuentra activa lo cual es concordante con la edad media de la poblaciónde 57,74 años. Es Resultados y Discusión 71 destacable la baja proporción de individuos en situación de incapacidad laboral transitoria y de baja laboral. El conocimiento de otros factores como el índice de absentismo laboral sería interesante a al hora de valorar el impacto real del dolor crónico y su tratamiento en nuestra población. No se obsevan diferencias estadísticamentes significativas entre los genotipos y el estado laboral en relación con ninguno de los polimorfismos SNP A118G / dbSNP rs1799971 (G) en el gen del receptor opioide µ1 (OPRM1) (figura 12). Con respecto al SNP G472A / db SNP rs4680 (A) en el gen de la enzima COMT, entre los pacientes en situación de baja laboral no existe ningún homocigoto para el par de alelos salvajes GG, con enzima normo-funcionante. El 85,7% del grupo GG (homocigotos para el alelo salvaje) están en situación activa y el 14,3% restante pertenece al grupo de pensionistas (figura 12). Esto se podría deber a la buena respuesta al tratamiento opioide recibido por estos pacientes y a la preservación de los mecanismos neuromoduladores implicados. Los pacientes portadores del polimorfismo del gen de la COMT en situación de baja laboral constituyen el 11,1% de los casos. En términos estadísticos no se obsevan diferencias significativas entre los distintos genotipos y el estado laboral (figura 12). Se ha descrito que la actividad de la enzima COMT muestra una correlación inversa con la intensidad y percepción del dolor. En el tratamiento de una causa frecuente de baja laboral, como es la lumbalgia inespecífica, con variaciones interindividuales tanto en el grado de dolor alcanzado cono en la incapacidad posterior, han sido realizados estudios que indican que los individuos portadores de alelos salvajes (GG) que codificaran una enzima normo funcionante presentan un mayor nivel de actividad que los que presentan SNP (AG y AA) (Omair A, 2015). Figura 11. Distribución de genotipos OPRM1 y COMT en toda la población en función del nivel de estudios. 14 26 73 1 7 21 13 20 36 13 22 55 0 3 4 13 20 37 020 40 60 80 Superiores Secundarios Primarios Superiores Secundarios Primarios GG AG AA OPRM1 COMT Resultados y Discusión 72 Figura 12. Distribución de genotipos OPRM1 y COMT en toda la población en función del estado laboral. AA AG GG 0,00% 20,00% 40,00% 60,00% 80,00% Activo Baja Pensionista 62,10% 10,30% 27,60% 67,00% 2,30% 30,70% 65,20% 7,20% 27,50% AA AG GG OPRM1 AA AG GG 0,00% 20,00% 40,00% 60,00% 80,00% 100,00% Activo Baja Pensionista 67,30% 5,30% 27,40% 60,90% 5,80% 33,30% 85,70% 0,00% 14,30% AA AG GG COMT Resultados y Discusión 73 2.4. Antecedentes personales de interés en toda la población en función del genotipo de los pacientes. Desde hace mucho tiempo los estudios de dependencias de sustancias se han centrado en el receptor µ opioide. El polimorfismo SNP A118G / dbSNP rs1799971 (G) en el gen del receptor opioide µ1 (OPRM1) ha sido profusamente estudiado, sin embargo su papel hasta ahora no había sido aclarado, ya que los resultados eran discordantes. Un reciente metaanálisis realizado con población europea y la combinación de más de 25 bases equivalente a un tamaño muestral de 28000 sujetos, indica que el alelo G tiene un efecto protector sobre la dependencia de las sustancias estudiadas (alcohol, opioides, cocaína, cannabis y nicotina) (Schwantes-An, 2015). En nuestra población probablemente debido al pequeño tamaño muestral no hemos encontrado datos significativos en este sentido al considerar el polimorfismo SNP A118G / dbSNP rs1799971 (G) en el gen del receptor opioide µ1 (OPRM1) (figura 13 y tabla 4). La tablas 4 resume los resultados de la relación entre el polimorfismo SNP A118G / dbSNP rs1799971 (G) en el gen del receptor opioide µ1 (OPRM1) y la incidencia de comorbilidades comparando dos grupos de individuos, los homocigotos para el gen salvaje del polimorfismo OPRM1 (AA) y el resto de la población homocigota y heterocigota para este SNP (*G), observándose la ausencia de diferencias entre ambos grupos (tabla 4). En lo que se refiere al polimorfismo SNP G472A / db SNP rs4680 (A) en el gen de la enzima COMT aunque no observamos tampoco relación ninguna entre los sujetos portadores de las diferentes combinaciones de alelos, tanto el consumo de alcohol como el de tabaco fueron ligeramente mayores en los pacientes portadores de los alelos salvaje-natural o wild type GG (figura 13). En este caso nuestros resultados difieren de algunos estudios que vinculan el hábito tabáquico y el polimorfismo SNP G472A / db SNP rs4680 (A) del gen COMT en varones (Tochigi M,2007). No hemos observado patrones o tendencias significativas que vinculen la comorbilidad y el polimorfismo SNP A118G / dbSNP rs1799971 (G) en el gen del receptor opioide µ1 (OPRM1). El grupo exento de comorbilidad está constituido por 1,5 veces más individuos que presentan el par de alelos ancestral (AA) (figura 14A). En relación con el polimorfismo SNP G472A / db SNP rs4680 (A) en el gen de la enzima COMT la tabla 5 expresa la relación entre el polimorfismo SNP G472A / db SNP rs4680 (A) en el gen de la enzima COMT categorizada en los dos grupos antes mencionados los individuos homocigotos (GG) para el gen salvaje y para el polimorfismo (*A= AG y AA). Observamos que la presencia del alelo salvaje homocigoto GG se relacionaba de forma significativa con la menor ausencia de morbilidad y una mayor incidencia, sobre todo, de comorbilidad alta, por lo que parece que presentar el SNP G472A / db SNP rs4680 (A) protegería de la existencia de comorbilidades (figura 14B y tabla 5A). El riesgo atribuible para los homocigotos (GG) del gen COMT de padecer comorbilidad es del 14.95% (tabla 5B). En nuestra población hemos encontrado un nivel de significación estadística suficiente para vincular a los individuos homocigotos para los alelos GG Naturales del gen COMT con la hipertensión arterial. En este sentido se ha descrito que patologías, como la arteriosclerosis, que constituye un importante problema de salud pública en los pacientes de edad avanzada, surge de una compleja interacción entre factores ambientales y genéticos. Un reciente estudio realizado en la población Japonesa señala que los individuos homocigotos GG para el SNP rs4680 muestran un alto grado de índice de aterosclerosis (PAI), la asociación tras realizar los ajustes necesarios aparece sobre todo en el sexo femenino (Ko MK, 2012). En la enfermedad Resultados y Discusión 74 de parkinson la denervación del núcleo estriado varía en función del SNP del gen de la COMT Val 158 Met, según demuestra un estudio realizado para dilucidar la influencia de los polimorfismos de la COMT y los movimientos involuntarios, la presencia del genotipo GG con enzima normo-funcionante constituye un factor de riesgo para la aparición de fenómenos de Wearing-off final de dosis al relacionarse con niveles reducidos de dopamina. La disfunción enzimática del gen COMT con las formas polimórficas AA y AG podría ejercer un efecto compensatorio que reduzca la actividad de los síntomas (Habert MO, 2015). Con respecto a los hábitos tóxicos, especialmente en la ingesta de alcohol se observa una tendencia que asocia la presencia del hábito con el polimorfismo RS 1799971 del gen OPRM1. En el terreno de las adicciones se ha intentado correlacionar este SNP con el desarrollo de hábito enólico. La baja expresión del receptor observada en los portadores del SNP junto el aumento de consumo en portadores del polimorfismo llevó a diseñar la teoría del receptor opioide deficitario. De este modo se aumentaría la ingesta de alcohol con fines compensatorios. Entre los mecanismos moleculares implicados destaca la baja afinidad del receptor y su respuesta de menor magnitud. Recientes estudios sugieren que este polimorfismo se asocia con consumo de tabaco y alcohol en la población española (Francès F, 2015). Figura 13. Hábitos tóxicos y polimorfismos de los genes estudiados. Presencia (A) o ausencia de alcohol (NA) y presencia (T) o ausencia de tabaco (/NT). 7,00% 93,00% 22,80% 77,20% 5,30% 94,70% 20% 80% 4,10% 95,90% 17,20% 82,80% 10,40% 89,60% 29,90% 70,10% 0% 20% 40% 60% 80% 100% 120% A/OPRM1 NA/OPRM1 T/OPRM1 NT/OPRM1 A/COMT NACOMT T/COMT NT/COMT AA *G *A GG Resultados y Discusión 75 Figura 14. Relación del polimorfismo OPRM1 y COMT y la existencia de comorbilidad. A. OPRM1 B. COMT 78,10% 14,90% 7% 78,70% 10,70% 10,70% 0% 10% 20% 30% 40% 50% 60% 70% 80% 90% AUSENCIA DE COMORBILIDAD BAJA COMORBILIDAD ALTA COMORBILIDAD AA *G 83,60% 11,50% 5% 68,70% 16,40% 14,90% 0% 10% 20% 30% 40% 50% 60% 70% 80% 90% AUSENCIA DE COMORBILIDAD BAJA COMORBILIDAD ALTA COMORBILIDAD *A GG Resultados y Discusión 82 el SNP (AA) presentan mayor intensidad dolorosa y recuperación más lenta tras reagudizaciones. Esto sugiere que los homocigotos para el SNP COMT (AA) tendrán una clínica marcada por el dolor y una peor evolución. Este polimorfismo contribuiría a padecer dolor lumbar crónico y ciáticas invalidantes en presencia de hernia de disco (Jacobsen LM, 2012). Hasta el momento, una baja actividad en la enzima COMT ha sido asociada con migraña, dolor musculo-esquelético generalizado, gonartrosis, etc. Pero hasta ahora solo hemos encontrado una asociación entre el polimorfismo SNP G472A / db SNP rs4680 (A) en el gen de la enzima COMT y la fibromialgia (figura 20). La baja actividad de la enzima generada aumenta el número de receptores opioides y consecuentemente sus efectos secundarios. A partir de modelos de experimentación animal sabemos que los inhibidores de la COMT son sustancias propionociceptivas, excepto para modelos de dolor neuropático donde tendrían efecto antialodínico. La compleja interacción de efectos al aumentar la adrenalina y dopamina en distintas áreas del sistema nociceptivo sería la responsable de los efectos que se derivan de este SNP (Tammimaki A, 2012). En un total de 32 pacientes diagnosticados de fibromialgia el 38% eran homocigotos para el alelo ancestral (GG) y en el 62% de los casos eran portadores del SNP G472A / db SNP rs4680 (A) del gen COMT (figura 20). El polimorfismo de la COMT juega también un papel fundamental en la sensibilidad al dolor en pacientes con fibromialgia. Los individuos homocigotos (AA) para el SNP G472A / db SNP rs4680 (A) muestran una mayor sensibilidad a la presión y la temperatura que los individuos heterocigotos (AG) o portadores de alelo salvaje (GG) (Martínez-Jauand M, 2012). Figura 18. Distribución de síndromes dolorosos y el polimorfismo del gen OPRM1 NOCICEPTIVO MIXTO NEUROPATICO 28 135 4 25 51 5 SINDROMES DOLOROSOS Y SNP OPRM1 AA *G Resultados y Discusión 83 Tabla 6. Síndromes dolorosos principales y polimorfismos OPRM1. OPRM1 Total AA *G P-valor M.ESQUELETICO 47 (25,0%) 26 (23,0%) 21 (28,0%) 0,4928 (a) MIOPATIA TIROIDEA 1 (0,5%) 0 (0,0%) 1 (1,3%) 0,3989 (a) S.MIOFASCIAL 1 (0,5%) 0 (0,0%) 1 (1,3%) 0,3989 (a) BURSITIS 1 (0,5%) 1 (0,9%) 0 (0,0%) 1,0000 (a) ANGINA 1 (0,5%) 0 (0,0%) 1 (1,3%) 0,3989 (a) D. PELVICO CRONICO 1 (0,5%) 1 (0,9%) 0 (0,0%) 1,0000 (a) GONARTROSIS 1 (0,5%) 0 (0,0%) 1 (1,3%) 0,3989 (a) ESPONDILOARTROSIS 2 (1,1%) 0 (0,0%) 2 (2,7%) 0,1579 (a) CEFALEAS 3 (1,5%) 1 (0,9%) 1 (1,3%) 1,0000 (a) N.POSTQUIRURGICA 3 (1,5%) 2 (1,8%) 0 (0,0%) 0,5179 (a) N DIABETICA 1 (0,5%) 0 (0,0%) 1 (1,3%) 0,3989 (a) E.CANAL 49 (27,1%) 31 (27,2%) 20 (26,6%) 1,0000 (a) HERNIA DISCAL 46 (24,5%) 26 (23,0%) 20 (26,7%) 0,6056 (a) FIBROMIALGIA 32 (17,0%) 21 (18,6%) 11 (14,7%) 0,5553 (a) S. POSTLAMINECTOMIA 7 (3,7%) 5 (4,4%) 2 (2,7%) 0,7044 (a) Figura 19. Distribución de las características de los síndromes dolorosos y el polimorfismo COMT 6 23 0 45 78 4 NOCICEPTIVO MIXTO NEUROPATICO SINDROMES DOLOROSOS Y SNP COMT GG *A Resultados y Discusión 84 Figura 20. Fibromialgia y polimorfismo COMT 2.6. Análisis de la intensidad del dolor. Para valorar la eficacia del tratamiento opioide en función de los polimorfismos estudiados cuantificados la intensidad del dolor utilizando la escala EVA y el cuestionario breve del dolor (CBD). Escala analógica visual EVA No observamos diferencias en la intensidad de dolor asociadas a los polimorfismos OPRM1 y COMT (figuras 21 y 22 y tablas 7 y 8), aunque los individuos que presentan una ligera mayor intensidad dolorosa cuantificada según la escala EVA han sido los individuos homocigotos para el SNP G472A / db SNP rs4680 (A) en el gen de la enzima COMT (GG). La enzima catecol-o-metil transferasa metaboliza a las catecolaminas en diferentes tejidos. El polimorfismo del gen que codifica esta enzima induce una enzima disfuncional que condiciona un pobre metabolismo de las catecolaminas. Los compuestos inhibidores de esta enzima son pronociceptivos en modelos de dolor agudo y crónico. Las acciones derivadas de una baja actividad de la enzima COMT se pueden deber a la amplificación del efecto de la actividad adrenérgica y dopaminérgica y los resultados dependerán del lugar concreto donde se desarrolle la acción de la enzima. Por ejemplo la acciones antinociceptivas son debidas a la activación periférica de receptores β2 y β3. Otras propiedades analgésicas como el efecto antialodínico se debe a la acción de scavenging de radicales nitrógeno y oxígeno. El aumento del efecto opioide observado en situaciones de COMT disfuncionante se puede deber al aumento de receptores µ en determinadas áreas cerebrales como mecanismo compensador. En estudios de dolor humano se asocia una baja actividad de la COMT con un aumento de la sensibilidad al dolor. 62% 38% FIBROMIALGIA Y SNP 4680 COMT *A GG Resultados y Discusión 85 En dolor musculo-esquelético crónico y migraña se ha comprobado que una baja actividad de la COMT aumenta la incidencia de síntomas. La baja actividad de la COMT aumenta la disponibilidad de receptores opioides y sus efectos por tanto pueden hacer más susceptibles a esta población y aumentar por tanto los efectos de los analgésicos. La baja actividad de la COMT en numerosas ocasiones es el sumatorio de varios polimorfismos, entre los que destaca la sustitución de Valina por Metionina en posición 158 de la enzima (Kambur O, 2010). Figura 21. EVA medio final de toda la población y en función del genotipo OPRM1 y COMT. Figura 22. Intensidad de dolor Moderado Severo (EVA > 5) en función del genotipo OPRM1 y COMT. 6,44 6,44 6,39 6,5 6,35 6,57 7,28 0,1 0,26 0,15 0,18 0,13 0,18 0,56 0 2 4 6 8 10 Edad Total OPMR1-AA OPMR1-AG OPMR1-GG COMT-GG COMT-AG COMT-AA EVA medio EVA medio sem 76,3% 76,0% 75,5% 77,7% 0% 10% 20% 30% 40% 50% 60% 70% 80% 90% OPRM1 COMT AA *G *A GG EVA >5 Resultados y Discusión 86 Tabla 7. EVA basal en basa a los polimorfismos OPRM1. Tabla 8. EVA basal en basa a los polimorfismos COMT. Resultados y Discusión 87 Cuestionario Breve del Dolor (CBD) Resumimos a continuación los principales datos obtenidos del cuestionario CBD. Recordemos que el Cuestionario Breve de Dolor (Brief Pain Inventory, BPI) consta de dos dimensiones: “Intensidad del dolor” (formada por 4 ítems) e “interferencia en las actividades” (formada por 7 ítems). Cada uno de los ítems se puntúa mediante una escala numérica que va de 0 (ningún dolor/no me ha afectado) a 10 (peor dolor imaginable/me ha afectado por completo) La mayoría de los pacientes afirmó que había sentido dolor diferente a los dolores comunes. En relación con los polimorfismos los pacientes que dieron respuesta afirmativa a esta fueron en un 15,4% homocigotos AA del gen OPRM1 y en un 84,6% hetero y homocigotos (*G) del SNP A118G / dbSNP rs1799971 (G) en el gen del receptor opioide µ1 (OPRM1). Y en relación con el gen de la COMT, en un 96,3% homocigotos GG del gen COMT y sólo un 3,7% eran hetero y homocigotos (*A) del SNP G472A / db SNP rs4680 (A) en el gen de la enzima COMT (figura 23). Aunque esperábamos encontrar diferencias mayores en los portadores de los diferentes genotivos en las preguntas del test CBD en relación con los polimorfismos OPRM1 y COMT, solo hemos encontrado las siguientes, la existencia de un significativo menor grado de afectación en la capacidad de realizar las Actividades en general de la vida diaria, Trabajo habitual (incluye tanto el trabajo fuera de casa como las tareas domésticas) y Disfrutar de la vida (ítems 9A, 9D y 9G, respectivamente)), en los homocigóticos salvaje-natural (wild type) AA del SNP A118G / dbSNP rs1799971 (G) del gen del receptor opioide µ1 (OPRM1) frente a los SNP AG y GG del gen OPRM1 (figura 23 y tabla 9). Y que los mutantes hetero y homocigotos (AG y GG) del SNP G472A / db SNP rs4680 (A) en el gen de la enzima COMT presentan un significativo menor grado de alivio en las últimas 24 horas, con los tratamientos o la medicación analgésica (ítem 8), respecto a los homocigóticos salvaje-natural (wild type) GG del gen COMT (figura 23 y tabla 10), lo que coincide con la mayor sensibilidadal dolor y por tanto menor grado de alivio de los portadores mutantes hetero y homocigotos (AG y GG) del SNP G472A / db SNP rs4680 (A) y la menor respuesta al dolor de los homocigóticos salvajenatural (wild type) GG del gen COMT referida en la literatura. Los pacientes homocigotos y heterocigotos para el polimorfismo SNP Rs 1799971 del gen OPRM1 obtienen menor alivio que los portadores homocigotos del alelo salvaje. En la suma conjunta del test CBD también se observa esta asociación. Los pacientes con dolor crónico en tratamiento con opioides que no presentan el polimorfismo SNP 118 A>G /(db rs 1799971) del gen OPRM1, o dicho de otra forma son homocigotos para el alelo ancestral (AA) presentan mayor afectación de la actividad general que los portadores del polimorfismo. El sistema opioides endógenos regula el distress social y conducta de recompensa según se ha comprobado en diversos modelos animales. El mecanismo concreto causante está aún por dilucidar. En modelos murinos se ha estudiado un polimorfismo de un único nucleótido equivalente al humano OPRM1 A118, el Oprm1 A112G SNP. El alelo G se asocia con dominancia y aumento de interacción social no agresiva. Cuando los individuos son desafiados, los portadores del alelo G expresan una conducta menos sumisa y una mayor resistencia a la derrota social expresado como la falta subsiguiente de conducta de evitación social y reducción de la anhedonia (Briand LA, 2015). Existen diferencias significativas en el CBD, en la sección que valora la interferencia de actividades. Concretamente los individuos homocigotos para el alelo salvaje presentan una menor interferencia con el trabajo habitual o tareas domésticas. Esto estaría en consonancia con una mayor intensidad de dolor en los individuos portadores del polimorfismo Rs4680. Resultados y Discusión 88 La interferencia de actividades es significativamente mayor en los pacientes portadores del polimorfismo Rs4680. Este hecho se pone de manifiesto en la suma total del Item 9 del CBD y en sus apartados G y D. La capacidad de desarrollar el trabajo habitual y capacidad de disfrutar de la vida son menores de forma estadísticamente significativa en los portadores del polimorfismo Rs 4680. En relación con la calidad de vida expresada por los pacientes (EQ5), observamos que los pacientes que con el alelo constituyente del polimorfismo Rs1799971 (*G) presentaban presentan menos problemas de movilidad, en el cuidado personal, en la realización de las actividades cotidianas que los y los portadores de alelo salvaje (AA). Y los portadores de alelo salvaje (AA) presentaban mayor intensidad de dolor y de ansiedad que los portadores del alelo constituyente del polimorfismo Rs1799971 (*G). Podemos afirmar, al menos en lo que se refiere a la eficacia en función del grado de intensidad de dolor percibido por el paciente, que:  La presencia de los alelos homocigóticos salvaje-natural (wild type) AA del SNP A118G / dbSNP rs1799971 (G) del gen del receptor opioide µ1 (OPRM1) protege de la percepción del dolor.  Mientras que los portadores mutantes hetero y homocigotos (AG y GG) del SNP del gen OPRM1 al ser más sensibles al dolor ven más afectada su vida diaria.  Y que los homocigóticos salvaje-natural (wild type) GG del gen COMT responden mejor a la medicación analgésica.  Mientras que los portadores mutantes hetero y homocigotos (AG y AA) del SNP G472A / db SNP rs4680 (A) son más sensibles al dolor y al responder menos a los analgésicos experimentan menor grado de alivio con los tratamientos por lo que precisarían de un mayor grado de analgesia. Figura 23. Respuesta a la cuestión 1 del cuestionario CBD [Todos hemos tenido dolor alguna vez en nuestra vida (por ejemplo, dolor de cabeza, contusiones, dolores de dientes). ¿En la actualidad, ha sentido un dolor distinto a estos dolores comunes?] en toda la población y en función de los polimorfismos OPRM1 y COMT. 15,40% 0,00% 84,60% 100,00% 3,70% 0,00% 96,30% 100,00% 0% 20% 40% 60% 80% 100% 120% OPRM1-SI OPRM1-NO COMT-SI COMT-NO AA *G *A GG N=1 N=1 Resultados y Discusión 89 Tabla 9. Respuesta a las cuestiones CBD item 3 a 9 en toda la población y en función de los polimorfismos OPRM1. Resultados y Discusión 90 Resultados y Discusión 91 *Mayor que *G, p<0,05 Resultados y Discusión 98 Resultados y Discusión 99 Resultados y Discusión 100 Tabla 12. Respuesta a las cuestiones de la escala de Ansiedad Depresión Hospitalaria en función del genotipo COMT de los pacientes. Resultados y Discusión 101 Resultados y Discusión 102 Resultados y Discusión 103 Figura 23. Incidencia de depresión (valorada mediante la escala HAD) en función de los polimorfismos OPRM1 y COMT. 0,90% 14,00% 85,10% 1,30% 12,00% 86,70% 1,60% 11,50% 86,90% 0,00% 16,40% 83,60% 0% 10% 20% 30% 40% 50% 60% 70% 80% 90% 100% AA *G *A GG Resultados y Discusión 104 Euroq5D Con este test pretendemos tener una visión global de cómo se afecta la calidad de vida de los pacientes en base a su experiencia y vivencia del dolor que padece. Contamos con dos valoraciones de este índice, previo al inicio del tratamiento y un año después. Se valoraron los siguientes aspectos: la movilidad, el cuidado personal, las actividades cotidianas, el dolor y la ansiedad. Todos estos parámetros son valorados según una escala de Likert del 1 al 3, donde 1 es ningún problema y 2 algún problema y 3 un problema importante (como ya indicamos en material y métodos). Esta valoración se completa el índice de salud global. En las tablas 13 y 14 y figuras 24 y 25 se resume la relación entre el genotipo para cada polimorfismo y los distintos aspectos relacionados con la calidad de vida cotidiana del cuestionario EQD5 global y categorizados en relación con ambos polimorfismos SNP A118G / dbSNP rs1799971 (G) en el gen del receptor opioide µ1 (OPRM1) y SNP G472A / db SNP rs4680 (A) en el gen de la enzima COMT. Aunque en ninguno de los casos observamos diferencias estadísticamente significativas es reseñable comentar algunos aspectos. En relación con el polimorfismo SNP A118G / dbSNP rs1799971 (G) en el gen del receptor opioide µ1 (OPRM1) observamos que un año después del inicio de tratamiento opioide se ha incrementado el número de pacientes con algún problema de movilidad (> en *G) y en la realización de las actividades cotidianas en los pacientes portadores de forma homocigota de los alelos ancestrales o naturales AA. Pero también se ha reducido el número de pacientes con problemas de autocuidarse y con problemas relacionados con la percepción del dolor en estos pacientes (AA), lo que probablemente ha contribuido a que el incremento de los problemas derivados de la ansiedad sean menores también en los pacientes portadores de forma homocigota de los alelo ancestrales o no naturales (AA). Todos estos datos en conjunto parece apuntar a un efecto protector frente al efecto del dolor y sus consecuencias en estos pacientes en los portadores homocigotos del alelo natural ancestral (AA), que permitiría, al reducir los problemas derivados de la percepción del dolor, conservar la movilidad, mejorar el autocuidado y reducir los problemas relacionados con la ansiedad de los pacientes, los cuales, al incrementar sus posibilidades de realizar las actividades de la vida cotidiana, encontrarían algunos problemas de más a este nivel (http://www.snpedia.com/index.php/Rs1799971). Por el contrario los pacientes portadores de la mutación SNP A118G / dbSNP rs1799971 (G), tanto AG como GG, presentarían una peor evolución a este nivel. En relación con el polimorfismo SNP G472A / db SNP rs4680 (A) en el gen de la enzima COMT observamos que un año después del inicio de tratamiento opioide se ha incrementado el número de pacientes con algún problema de movilidad y en la realización de las actividades cotidianas en los pacientes con el polimorfismo (> en *A). Como han sido los pacientes portadores de forma homocigota de los alelo ancestrales o naturales (GG) los que han presentado una mayor reducción en el número de pacientes con problemas de autocuidado en y los problemas relacionados con la percepción del dolor, parece que, en este caso también la presencia de homocigocis en el alelo natural ancestral (GG), realizaría un efecto protector frente al efecto del dolor y sus consecuencias en estos pacientes frente a los portadores del polimorfismo (posiblemente en este caso, por la insensibilidad al dolor, que permitiría, al reducir los problemas derivados de la percepción del dolor, conservar la movilidad, la capacidad de realizar las actividades de la vida cotidiana y mejorar el autocuidado (http://www.snpedia.com/index.php/Rs4680). Por el contrario los pacientes portadores de la mutación SNP G472A / db SNP rs4680 (A) en el gen de la enzima COMT, tanto AA como AG, presentarían una peor evolución a este nivel. Resultados y Discusión 105 En relación con la ansiedad, nuestros resultados difieren de los referidos en la literatura dado que en nuestra población la presencia de los alelos GG se relaciona con mayor desarrollo de problemas relacionados con la depresión y la ansiedad, cuando, como ya comentamos con anterioridad, ha sido el alelo A-Met (esto es, los polimorfismo AA y AG del gen COMT) el que se ha relacionado con el desarrollo de ansiedad (http://www.snpedia.com/index.php/Rs4680). Tabla 13. Respuesta a las cuestiones del cuestionario EuroQol 5D en función del genotipo OPRM1 de los pacientes. A. GLOBAL Resultados y Discusión 106 Resultados y Discusión 107 B. CATEGORIZADA Resultados y Discusión 114 D. DOLOR E. ANSIEDAD 2.7. Tratamientos con Opioides y otros analgésicos en la muestra de pacientes estudiados. Las tablas 15 a 17 y la figuras 26 (A, B y C), resumen el consumo de analgésicos por parte de los pacientes. El fármaco las usado ha sido Tramadol seguido de Oxicodona / Naloxona, Tapentadol y Fentanilo. Este patrón se repite en relación con los dos genotipos OPRM1 y COMT estudiados (figura 26). No hemos conseguido encontrar asociación ninguna entre los opiáceos prescritos y los polimorfismos de ambos genes. La distribución del consumo de opioides no está significativamente asociada a los polimorfismos genéticos estudiados en ningún caso (tablas 16 y 17). Tampoco hemos conseguido encontrar, hasta ahora, un tipo concreto de polimorfismo que se asocie con una clara mayor necesidad de consumo de opiáceos en general o con un fármaco en concreto, con la excepción de Tapentadol que presentó un significativo mayor uso en los portadores de los alelos ancestrales o naturales AA del gen del receptor opioide µ1 (OPRM1) 97,50% 95,10% -2,50% 100,00% 94% -6,00% PREVIO ACTUAL DIFERENCIA EQ5D-DOLOR-Algún problema POLIMORFISMO COMT GG *A 76,20% 81,10% 4,90% 74,60% 85% 10,40% PREVIO ACTUAL DIFERENCIA EQ5D-ANSIEDAD-Algún problema POLIMORFISMO COMT GG *A Resultados y Discusión 115 (29,8%) frente a los polimorfismos AG y GG del polimorfismo SNP A118G / dbSNP rs1799971 (G) en el gen del receptor opioide µ1 (OPRM1) (tabla 16). Consideramos que esto es debido a que la prescripción se hace fundamentalmente en base a la intensidad de dolor de los pacientes y de su tolerancia al tratamiento. Tabla 15. Consumo de analgésicos en el total de la población estudiada. Grupo terapéutico N % Opiáceos N=149, 78,8% OXICODONA 15 7,9 OXICODONA_NALOXONA 32 16,9 HIDROMORFONA 4 2,1 MORFINA 2 1,1 TRAMADOL 51 27 FENTANILO 19 10,1 BUPRENORFINA 2 1,1 RESCAT.EMORF -- --- RESCAT_EFF 17 9 RESCAT_ABS 2 1,1 RESCATPCFENT -- --- RESCMORF -- --- RESCTRAM 1 0,5 TAPENTADOL 46 24,3 Anticonvulsivantes N=88, 46,6% GABAPENTINA 27 14,3 PREGABALINA 61 32,3 CARBAMACEPINA 1 0,5 TOPIRAMATO 2 1,1 BZD CLONACEPAN 45 23,8 Antidepresivos N=40, 21,2% DULOXETINA 27 14,3 AMITRIPTILINA 8 4,2 OTROSIRS 8 4,2 OTROSTC 1 0,5 BLOQUEOS 64 33,9 IESTEROIDES 25 13,2 INFUSION 9 4,8 ESTIMULACION 3 1,6 AINES 117 61,9 AnL N=13, 6,9% Lidocaina-5 8 4,2 Capsaicina-8 7 3,7 Resultados y Discusión 116 Figura 26. Distribución de opioides en el total de la población y en relación con los polimorfismos SNPs OPRM1 y COMT. A. GLOBAL B. OPRM1 47 15 32 4 45 2 51 2 010 20 30 40 50 60 OXICODONA /NALOXONA OXICODONA FENTANILO HIDROMORFONA TAPENTADOL MORFINA TRAMADOL BUPRENORFINA DISTRIBUCIÓN DELCONSUMO DE OPIOIDES TOTAL 47 15 32 4 45 2 51 2 38 9 19 2 32 2 32 1 19 6 13 2 11 0 19 1 0 10 20 30 40 50 60 DISTRIBUCIÓN DEL CONSUMO DE OPIOIDES POLIMORFISMO OPRM1 TOTAL AA *G Resultados y Discusión 117 C. COMT 47 15 32 4 45 2 51 2 30 20 2 32 1 37 2 17 12 2 13 1 14 0 10 20 30 40 50 60 DISTRIBUCIÓN DEL CONSUMO DE OPIOIDES POLIMORFISMO COMT TOTAL *A GG Resultados y Discusión 118 Tabla 16. Comparación en el uso de Opioides en la población y en relación con el polimorfismo SNPs OPRM1. P<0,05 Resultados y Discusión 119 Tabla 17. Comparación en el uso de Opioides en la población y en relación con el polimorfismo SNPs COMT. Resultados y Discusión 120 2.8. Necesidades suplementarias de analgesia en la población estudiada en función de los polimorfismos OPRM1 y COMT. La figura 26 muestra las necesidades de analgesia de rescate en función de los polimorfismos SNP A118G / dbSNP rs1799971 (G) en el gen del receptor opioide µ1 (OPRM1) y SNP G472A / db SNP rs4680 (A) en el gen de la enzima COMT de los pacientes incluidos en el estudio. Aunque no se observaron diferencias estadísticamente significativas, indicar que se precisó medicación de rescate en un 14,04% de los pacientes portadores del alelo salvaje-natural (wild type) AA del gen del receptor opioide µ1 (OPRM1), y en un 6,67% de los pacientes portadores de los alelos polimórficos AG y GG del gen del receptor opioide µ1 (OPRM1). En relación con el gen de la COMT, precisó medicación de rescate un 13,43% de los pacientes portadores del alelo salvaje-natural (wild type) GG del gen de la COMT, y un 9,84% de los pacientes portadores de los alelos polimórficos AG y AA del gen de la COMT. Y, de los 21 pacientes que precisaron analgesia de rescate, en los portadores del alelo salvaje-natural (wild type) AA del gen del receptor opioide µ1 (OPRM1) la necesidad de usar analgesia de rescate fue casi tres veces mayor (un 53,09% mayor) que en individuos hetero y homocigotos para el alelo polimórfico (AG y GG) del SNP A118G / dbSNP rs1799971 (G) del receptor opioide µ1 (OPRM1). Y que en los portadores del alelo salvaje-natural (wild type) GG del gen de la COMT la necesidad de usar analgesia de rescate fue menor (un 14,28% menor) que en individuos hetero y homocigotos para el alelo polimórfico (AG y AA) del SNP G472A / db SNP rs4680 (A) en el gen de la enzima COMT. En la muestra estudiada solo precisaron rescate de forma habitual y carácter continuo 21 pacientes lo que supone un 11,11% del total, realmente muy pocos pacientes. Estos pacientes que de forma sistemática necesitan suplementos analgésicos en situaciones concretas y que en bastantes ocasiones implican un aumento de actividad, es lo que se define como dolor irruptivo incidental. El dolor irruptivo fue definido en principio para el dolor oncológico posteriormente se ha identificado en pacientes no oncológicos, la diferencia fundamental en este grupo de pacientes es que la frecuencia de dolor incidental es mayor. Entre los pacientes con dolor crónico no oncológico el dolor musculoesquelético es una de las causas más prevalentes. Los pacientes con dolor músculo-esquelético y relacionado con sus actividades suponen en nuestro estudio el 63% de los casos. Por el contrario, los pacientes con dolor oncológico tienden a tener más dolor irruptivo de carácter espontáneo. La fisiopatología del dolor es bastante similar en los dos grupos de pacientes: elevada incidencia de dolor somático, también dolor neuropático, y muchos pacientes con dolor mixto, en particular en el grupo de dolor no oncológico, con frecuente asociación dolor nociceptivo y neuropático (Sabato A, 2010). En nuestro estudio la prevalencia de dolor irruptivo es bastante menor, debido en parte a que el tratamiento opioide basal de los pacientes ha sido diseñado en función de la necesidad de tratamiento de rescate. Los pacientes portadores del polimorfismo SNP A118G / dbSNP rs1799971 (G) en el gen del receptor opioide µ1 (OPRM1) necesitaron complementar el tratamiento en un 23,81% de los casos con opioides para el dolor irruptivo, en cambio los pacientes homocigoto para el alelo salvaje-natural (wild type) (AA) necesitaron complementar la analgesia en un 76,19% de los casos. Este dato difiere del referido en la literatura, en la que se refiere, como ya se ha mencionado, que a nivel clínico la presencia del receptor mutado (“defectuoso”) existente en los portadores del polimorfismo SNP A118G / dbSNP rs1799971 (G) en el gen del receptor opioide µ1 (OPRM1) (sujetos AG y GG) aporta una mayor sensibilidad al dolor, con la Resultados y Discusión 121 consiguiente necesidad de dosis mayores de opioides para alcanzar analgesia. Estos datos proceden habitualmente de estudios realizados en pacientes con intenso dolor agudo, por ejemplo, en un contexto postoperatorio, mujeres histerectomizadas y en pacientes con artoplastia de rodilla, los pacientes portadores del SNP A118G / dbSNP rs1799971 (G) precisan mayores dosis de morfina, fentanilo, oxicodona y alfentanilo, para alcanzar un nivel óptimo de analgesia porque los homocigotos (GG) para el alelo A118G presentan una menor sensibilidad a la respuesta opioide y, por tanto, responden menos a la morfina 6-glucurónido respecto a los heterocigotos (AG) y los homocigotos para la forma natural-salvaje (wild type) del gen (AA) (Stamer UM, 2007). En nuestro caso, sólo 6 pacientes de 189 son homocigotos GG para el SNP A118G / dbSNP rs1799971 (G) del gen del receptor OPRM1, y 69 de 189 son heterocito AG para el SNP A118G / dbSNP rs1799971 (G) del gen del receptor OPRM1. Probablemente, si tuviéramos una muestra mayor nuestros resultados se hubieran aproximado más a los de la literatura. En cualquier caso, la mayor sensibilidad al dolor, con la consiguiente necesidad de dosis mayores de opioides para alcanzar analgesia descrita para la presencia del receptor mutado (“defectuoso”) existente en los portadores del polimorfismo SNP A118G / dbSNP rs1799971 (G) en el gen del receptor opioide µ1 (OPRM1) (sujetos AG y GG) guarda relación con las características moleculares del receptor opioide inducido por el SNP. Este nuevo receptor presenta una mayor necesidad de opioides para alcanzar el efecto terapéutico. Los individuos con los alelos polimórficos deben recibir una mayor cantidad de analgésico opioide que los homocigotos para el alelo salvaje. El polimorfismo 118A>G está localizado en el exón 1 del gen OPRM1 y consiste en la sustitución de una adenina por una guanina, esto e traduce en la sustitución de asparagina (N) por acido aspártico(D) en la posición 40 extracelular del receptor mu (N40D). Esto supone la pérdida de la N-glicosilación de la región extracelular del receptor. Este cambio ( N40D) a nivel proteico se traduce en dos subtipos de receptor µ 1 (hMOR-N o hMOR-D) . Los efectos biológicos de este cambio en el receptor se hacen patentes en regiones cerebrales relacionadas con el procesamiento de la intensidad dolorosa como el área somato-sensorial secundaria(SII) y la región ventro-posterolateral del tálamo. El principal efecto de esta nueva conformación es la disminución de eficacia por la pérdida de señalización inducida por agonistas sobre receptor. Los receptores opioides humanos inhiben los canales de calcio en los nociceptores presinápticos del asta dorsal de la médula espinal reduciendo la entrada de calcio en la célula, e inhibiendo la síntesis de neurotransmisores que amplifiquen la señal nociceptiva. Se distinguen dos isoformas de canales de calcio (V)2 implicadas en el proceso generadas por el splicing alternativo del exón e37a, la isoforma Ca(V)2.2e37a es más sensible al bloqueo necesitando hasta 4 veces menos estímulo que la forma ubiqua o salvaje Ca(V)2.2e37b (Oertel BG, 2009) (Lopez Soto EJ, 2013). La presencia del alelo G en este polimorfismo reduce la amplificación de la señal dolorosa aumentando el umbral de dolor. En relación con el gen de la COMT, nuestros datos si son coincidentes con la literatura, en este sentido, observamos que en los portadores del alelo salvaje-natural (wild type) GG del gen de la COMT la necesidad de usar analgesia de rescate fue menor (un 14,28% menor) que en los individuos hetero y homocigotos para el alelo polimórfico (AG y AA) del SNP G472A / db SNP rs4680 (A) en el gen de la enzima COMT. En este polimorfismo se ha descrito que los individuos homocigotos para el alelo Met158 Met (polimorfismo AA) presentan una baja activación del sistema de respuesta analgésica opioide (Zubieta J.K., 2003). Por ello el polimorfismo SNP G472A / db SNP rs4680 (A) (denominado también COMT Val158Met) se ha relacionado con la variabilidad individual del dolor (MartínezJauand M., 2013). Observamos como en los pacientes portadores del polimorfismo met/met y met/val del polimorfismo rs 4680 del gen de la COMT constituyen la mitad de los pacientes que Resultados y Discusión 122 precisan rescate. Esto quiere decir que los pacientes con menor actividad de la enzima COMT tienen mayores requerimientos de opioides, debido a un complejo sistema de interacciones entre el sistema catecolaminérgico y opioide a nivel central. Hay estudios que confirman la hipótesis de que las variaciones en los niveles de catecolaminas inducidos por el polimorfismo Comt met 158 val se asocian con alteraciones funcionales en la ruta de la neurotransmisión opioide. En estudios de captación dinámica como el realizado por Zubieta se combina la tomografía de emisión de positrones con el empleo de carfentanil,un radio trazador selectivo para receptores µ-opioides. Se comprueba que existen cambios en el número ,la distribución y afinidad de receptores µ-opioides en el circuito pálido estriado que reciben básicamente aferencias dopaminérgicas. La actividad del sistema de neurotransmisión opioide es inversamente proporcional a la actividad de la enzima COMT, por tanto las isoformas generadas por el polimorfismo estudiado se corresponderán con una menor activación de la respuesta analgésica endógena. En los ganglios basales la metabolización de dopamina y noradrenalina es vital para el normal funcionamiento de las vías moduladoras de la nocicepción. La activación crónica de los receptores dopaminérgicos induce una disminución de encefalinas y concentración de ligandos en los receptores µ opioides. Los receptores µ opioides de los núcleos Ventral y Pálido juegan un importante papel en la regulación motivacional afectiva y cognitiva. El polimorfismo estudiado en el gen COMT influye en la respuesta opioide en muchas otras regiones del sistema nervioso central como el área antero-dorsal del cíngulo, en el tálamo anterior, amígdala y vermis cerebeloso. La corteza cingular anterior y el tálamo anterior se vinculan con la modulación afectiva de la experiencia dolorosa. El cíngulo ha sido asociado con los efectos cognitivos del dolor y con los mecanismos que median en el efecto placebo. Este estudio muestra como el polimorfismo genético de la enzima COMT causa diferencias en la percepción individual a estímulos dolorosos y en la respuesta psicológica secundaria . Los individuos que presentan menor umbral para el estímulo doloroso son los portadores del polimorfismo con alelos MET/MET que generan una enzima completamente disfuncional que no permitirá la metabolización de Dopamina en asociación con reducción de opioides endógenos y de receptores (Zubieta JK,2013). Figura 26. Necesidades de analgesia de rescate en función de los polimorfismos OPRM1 y COMT. SNP RESCATE 76,19 23,81 42,86 57,14 NECESIDAD DE ANALGESIA DE RESCATE EN FUNCIÓN DE LOS POLIMORFISMOS ESTUDIADOS total n= 21, 11,11% AA OPRM1 *G OPRM1 GG COMT *A COMT Resultados y Discusión 123 2.9. Uso de técnicas invasivas en la población estudiada en función de los polimorfismos OPRM1 y COMT. Las figuras 27 a 29 y la tabla recogen la necesidad de uso de técnicas intervencionistas en la población estudiada en función de los polimorfismos OPRM1 y COMT. Un total de 104 pacientes recibieron este tipo de tratamientos que se recogen en la figura 27, siendo la más frecuente los bloqueos neurolíticos. Las técnicas se pueden categorizar en bloqueos diagnósticos y neurolíticos mediante agentes químicos o radiofrecuencia convencional, infiltraciones de esteroides en el neuroeje, infusión espinal de fármacos o neuromodulación de cordones posteriores. La selección se realizó teniendo en cuenta en primer lugar la relación riesgo beneficio, el nivel de evidencia para cada técnica y la intensidad del dolor. En este grupo de pacientes el mayor número de sujetos que han recibido técnicas intervencionistas para el tratamiento del dolor son los portadores del alelo salvaje-natural AA del gen OPRM1. Han sido tratados 68 pacientes homocigotos para el alelo salvaje (AA), un 65,38%, frente a 36 portadores del polimorfismo OPRM1 (AG y GG), un 34,62%. Los pacientes con los alelos ancestrales han recibido 1,58 veces más tratamiento intervencionista (casi el doble) que los que poseen los alelos polimórficos (figura 28), lo cual está en sintonía con la mayor necesidad de analgesia de rescate observada en estos pacientes y descrita con anterioridad. La figura 29 muestra como las técnicas intervencionistas son más frecuentes para el polimorfismo A118G del gen OPRM1 en presencia del alelo ancestral (AA), en cambio para el SNPG158A del gen COMT son más frecuentes cuando aparecen los alelos polimórficos (AG y AA) (figura 29). En relación con el gen de la COMT, el comportamiento de la población es el opuesto, así el mayor número de sujetos que han recibido técnicas intervencionistas para el tratamiento del dolor son los 68 portadores del portadores del polimorfismo COMT (AG y AA), un 65,38%, frente a los 36 portadores del alelo salvaje-natural GG del gen COMT. Podemos decir, coincidiendo con otros autores que los individuos que poseen un alelo polimórfico reciben este tratamiento 1,85 veces más que los pacientes que no lo poseen (figura 28) (Lopez Soto EJ, 2013). Figura 27. Tipos de técnicas intervencionistas usadas en el total de la población. BLOQUEOS NO NEUROLITICOS; 65 IE NEEUROEJE; 25 INFUSIÓN; 10 ESTIMULACION; 4 TECNICAS INTERVENCIONISTAS Resultados y Discusión 130 Figura 32. Reacciones adversas detectadas en toda la población. Tabla 20. Reacciones adversas detectadas en toda la población y en función del genotipo OPRM1 de los pacientes. rs1799971 Total AA *G P-Valor ALGÚN EVENTO ADVERSO 89 (47,1%) 55 (48,2%) 34 (45,3%) 0,7663 (a) NAUSEAS 44 (23,3%) 29 (25,4%) 15 (20,0%) 0,4821 (a) VOMITOS 23 (12,2%) 18 (15,8%) 5 (6,7%) 0,0708 (a) ESTRENIMIENTO 56 (29,6%) 37 (32,5%) 19 (25,3%) 0,3311 (a) MAREOS 50 (26,5%) 31 (27,2%) 19 (25,3%) 0,8666 (a) INSOMNIO 37 (19,6%) 18 (15,8%) 19 (25,3%) 0,1338 (a) SEDACION 15 (7,9%) 10 (8,8%) 5 (6,7%) 0,7848 (a) ALUCINACIONES 4 (2,1%) 0 (0,0%) 4 (5,3%) 0,0236 (a) DEPRESION RESP 8 (4,2%) 5 (4,4%) 3 (4,0%) 1,0000 (a) PRURITO 11 (5,8%) 7 (6,1%) 4 (5,3%) 1,0000 (a) URGENCIAS 48 (25,4%) 29 (25,4%) 19 (25,3%) 1,0000 (a) 22,8 25,4 11,6 28,6 19 5,8 2,1 7,9 3,7 0 5 10 15 20 25 30 35 Incidencia y tipo de reacciones adversas (%) Resultados y Discusión 131 Tabla 21. Reacciones adversas detectadas en toda la población y en función del genotipo COMT de los pacientes. rs4680 A* GG P-Valor Algún Evento Adverso 56 (45,9%) 33 (49,6%) 0,7608 (a) NAUSEAS 30 (24,6%) 14 (20,9%) 0,5950 (a) VOMITOS 15 (12,3%) 8 (11,9%) 1,0000 (a) ESTRENIMIENTO 36 (29,5%) 20 (29,9%) 1,0000 (a) MAREOS 34 (27,9%) 16 (23,9%) 0,6078 (a) INSOMNIO 27 (22,1%) 10 (14,9%) 0,2564 (a) SEDACION 10 (8,2%) 5 (7,5%) 1,0000 (a) ALUCINACIONES 3 (2,5%) 1 (1,5%) 1,0000 (a) DEPRESION RESP 5 (4,1%) 3 (4,5%) 1,0000 (a) PRURITO 6 (4,9%) 5 (7,5%) 0,5239 (a) URGENCIAS 35 (28,7%) 13 (19,4%) 0,2211 (a) Figura 33. Reacciones adversas gastrointestinales detectadas en función de los polimorfismos OPRM1. 25,4% 15,8% 32,5% 20% 6,7% 25,3% NAUSEAS VOMITOS ESTREÑIMIENTO SNP OPRM1 EFECTOS SECUNDARIOS GASTROINTESTINALES AA *G Resultados y Discusión 132 Tabla 22. Estimación del riesgo de náuseas y vómito en portadores del alelo (*G) del SNP OPRM1 (AA/*G). Riesgo individual en los expuestos 26.67 %Riesgo individual en los no expuestos 52.63 %Test de homogeneidad (Chi cuadrado) 11.45 Significación estadística del test de homogeneidad p < 0.01 Riesgo relativo (estimación puntual) 0.51 Riesgo relativo (estimación por intervalo de confianza, int. de conf. al 95 %) 0.75,o.35 Riesgo atribuible (estimación puntual) -25.96 % Riesgo atribuible (estimación por intervalo de confianza, int. de conf. al 95 %) -10.91,-41.01 % Fracción etiológica del riesgo (fracción atribuible) en expuestos (estimación puntual) -97.34 % Fracción etiol. del riesgo en exp. (estimación por intervalo de confianza, int. de conf. al 95 %) -33.05,-192 % Fracción etiológica del riesgo (fracción atribuible) en la población diana (estimación puntual) -24.34 % Fracción etiol. del riesgo en la pob. diana (est. por intervalo de confianza, int. de conf. al 95 %) -9.58,-41.08 Figura 34. Reacciones adversas gastrointestinales detectadas en función de los polimorfismos COMT. 24,6% 12,3% 29,5% 20,9% 11,9% 29,9% NAUSEAS VOMITOS ESTREÑIMIENTO SNP COMT EFECTOS SECUNDARIOS GASTROINTESTINALES *A GG Resultados y Discusión 133 Tabla 23. Estimación riesgo de vómitos y náuseas en portadores del alelo ancestral del gen COMT (GG/*A) Riesgo individual en los expuestos 9.94 %Riesgo individual en los no expuestos 42.86 %Test de homogeneidad (Chi cuadrado) 17.96 Significación estadística del test de homogeneidad p < 0.01 Riesgo relativo (estimación puntual) 0.23 Riesgo relativo (estimación por intervalo de confianza, int. de conf. al 95 %) 0.45,0.12 Riesgo atribuible (estimación puntual) -32.92 % Riesgo atribuible (estimación por intervalo de confianza, int. de conf. al 95 %) -17.7,-4814 % Fracción etiológica del riesgo (fracción atribuible) en expuestos (estimación puntual) -331.19 % Fracción etiol. del riesgo en exp. (estimación por intervalo de confianza, int. de conf. al 95 %) -119.42,-74733 % Fracción etiológica del riesgo (fracción atribuible) en la población diana (estimación puntual) -189.29 % Fracción etiol. del riesgo en la pob. diana (est. por intervalo de confianza, int. de conf. al 95 %) -77.04,-372.71 Figura 35. Reacciones adversas centrales detectadas en función de los polimorfismos OPRM1. 27,2% 15,8% 8,8% 0 4,4% 6,1% 25,3% 25,3% 6,7% 5,3% 4% 5,3% MAREOS INSOMNIO SEDACION ALUCINACIONES DEPRESION RESPIRATORIA PRURITO EFECTOS SECUNDARIOS CENTRALES SNP OPRM1 AA *G Resultados y Discusión 134 Figura 36. Reacciones adversas centrales detectadas en función de los polimorfismos OPRM1. Figura 37. Aparición de alucinaciones detectadas en función de los polimorfismos OPRM1 y COMT. *La incidencia de alucinaciones OPRM1 AA vs. OPRM1 AG y GG, p<0,05 27,90% 22,10% 8,20% 2,50% 4,10% 4,90% 23,90% 14,90% 7,50% 1,50% 4,50% 7,50% MAREOS INSOMNIO SEDACION ALUCINACIONES DEPRESION RESP PRURITO EFECTOS SECUNDARIOS CENTRALES SNP COMT *A GG 0% 1% 2% 3% 4% 5% 6% OPMR1 AA OPMR *G COMT *A COMT GG Alucinaciones Resultados y Discusión 135 Figura 38. Aparición de depresión respiratoria detectada en función de los polimorfismos OPRM1 y COMT. 2.12. Necesidad de demande de atención urgente detectada en toda la población y en función del genotipo OPRM1 y COMT de los pacientes. En este apartado se valora la calidad de vida de los pacientes en función de la demanda atención urgente tanto domiciliaria como hospitalaria. Esta variable nos informa de si el paciente ha necesitado acudir a urgencias, independientemente de la causa. La demanda de atención urgente media fue del 24,9%. No observamos diferencias entre los pacientes en base sus diferentes genes y alelos. El único grupo que no demandó esta atención urgente fueron los pacientes homocigotos ancestrales-salvajes (wild type) GG para el SNP G472A / db SNP rs4680 (A) en el gen de la enzima COMT tratados con opioides. Esto puede ser indicativo de una mejor respuesta al tratamiento que implica mayor calidad de vida. Por otro lado los individuos con alelo ancestral poseen un manejo mejor de situaciones de stress con y bajos índices de neuroticismo y altos de extroversión (Stein MB, 2005) (figura 39 y tabla 24) 4% 4% 4% 4% 4% 4% 4% 4% 5% OPMR1 AA OPMR *G COMT *A COMT GG 4,40% 4% 4,10% 4,50% Depresión respiratoria Resultados y Discusión 136 Figura 39. Demanda de atención urgente en función de los polimorfismos OPRM1 y COMT. Tabla 24. Estimación del riesgo para acudir a urgencias para los portadores homocigotos del alelo ancestral del gen COMT (GG) Riesgo individual en los expuestos 19.4 %Riesgo individual en los no expuestos 36.89 %Test de homogeneidad (Chi cuadrado) 5.42 Significación estadística del test de homogeneidad p < 0.05 Riesgo relativo (estimación puntual) 0.53 Riesgo relativo (estimación por intervalo de confianza, int. de conf. al 95 %) 0.9 , 0.31 Riesgo atribuible (estimación puntual) -17.49 % Riesgo atribuible (estimación por intervalo de confianza, int. de conf. al 95 %) -2.78,-32.2 % Fracción etiológica del riesgo (fracción atribuible) en expuestos (estimación puntual) -90.15 % Fracción etiol. del riesgo en exp. (estimación por intervalo de confianza, int. de conf. al 95 %) -10.74.-226.49 % Fracción etiológica del riesgo (fracción atribuible) en la población diana (estimación puntual) -20.2 % Fracción etiol. del riesgo en la pob. diana (est. por intervalo de confianza, int. de conf. al 95 %) -2.96,-40.32 total AA AG GG AA-1 AG-1 GG-1 0% 20% 40% 60% 80% 100% No Si 74,6% 24,9% 79,3% 20,7% 70,5% 29,5% 78,3% 20,3% 76,1% 23,9% 69,6% 29,0% 100,0% 0,0% total AA AG GG AA-1 AG-1 GG-1 COMT OPRM1 Resultados y Discusión 137 3. Limitaciones del estudio Aunque pesamos que los resultados obtenidos son fiables, consideramos dos la principales limitaciones de este estudio:  El reducido tamaño muestral.  Que el estudio se ha producido solo en un centro.  Que sólo hemos hechos dos valoraciones de la intensidad y características del dolor.  Que no hemos valorado la totalidad de la reaciones adversas ni la intensidad de las mismas. 4. Posibilidades de futuro Nuestro grupo planea como posibilidades inmediatas de continuación de este trabajo:  Ampliar la población y el ambito de trabajo a otros centros para conseguir una población más amplia.  Ampliar los genes y polimorfismos a determinar con objeto de identificar los mejores biomarcadores para el control y seguimiento del dolor crónico.  Ampliar el estudio a otros tiposde dolor. En definitiva, existen numerosas evidencias de la influencia de la genética en la sensibilidad al dolor, la predisposición al dolor crónico y la respuesta a los fármacos analgésicos. Ahora bien, la complejidad del circuito del dolor y los condicionantes de la respuesta analgésica hacen difícil, por el momento, trasladar los hallazgos a la práctica clínica asistencial, y se necesitan más avances técnicos para que la investigación se traduzca en una mejor atención a los pacientes. Resultados y Discusión 138 Conclusiones 139 CONCLUSIONES