Detección de micoplasmas hemotrópicos en perros con sospecha de hemopatógenos de Galicia: factores de riesgo y efecto en el hematocrito

Detección de micoplasmas hemotrópicos en perros con sospecha de hemopatógenos de Galicia: factores de riesgo y efecto en el hematocrito. Xiana Pérez García Facultad de Veterinaria Grado en Veterinaria Año 2024 Modalidad del Trabajo: Experimental Trabajo de Fin de Grado Licencia Excepto donde se haga constar explícitamente, esta obra pertenece a Xiana Pérez García y está bajo una licencia de “Creative Commons Reconocimiento 4.0 Internacional. Detección de micoplasmas hemotrópicos en perros con sospecha de hemopatógenos de Galicia: factores de riesgo y efecto en el hematocrito. © 2024 by Xiana Pérez García is licensed under Creative Commons Attribution 4.0 International. To view a copy of this license, visit https://creativecommons.org/licenses/by/4.0/ RESUMEN Los micoplasmas hemotrópicos (hemoplasmas) son bacterias epicelulares obligadas que infectan los glóbulos rojos de una amplia variedad de mamíferos, pudiendo causar anemia hemolítica de gravedad variable. En el perro se describen dos especies: Mycoplasma haemocanis y “Candidatus Mycoplasma haematoparvum”. En ellos, la infección suele tener un curso crónico asintomático, pero la esplenectomía y la inmunosupresión favorecen el desarrollo de una infección aguda manifiesta. Los objetivos de este trabajo fueron determinar la presencia de micoplasmas hemotrópicos en perros con sospecha clínica de infección por hemopatógenos, identificar las especies detectadas molecularmente y determinar si ciertos factores influyen en la presencia de estos patógenos. Además, se evaluó el efecto de los micoplasmas hemotrópicos sobre el valor del hematocrito en infecciones únicas y en coinfección con Babesia spp. Para ello se analizaron 60 extracciones de ADN obtenidas de muestras de sangre de perros de Galicia con sospecha clínica de infección por hemopatógenos mediante PCR convencional para la detección de hemoplasmas. Posteriormente, las muestras positivas se secuenciaron y se estudió su variabilidad genética mediante la construcción de un árbol filogenético. A continuación, con los datos recogidos de cada animal (edad, sexo, aptitud, infección por Babesia spp., hematocrito), se realizó un análisis estadístico para valorar los posibles factores de riesgo y el efecto de la infección sobre el hematocrito en infecciones únicas o mixtas con Babesia spp. Un total de 14 muestras (23,3%) resultaron positivas, y las especies encontradas fueron: “Ca. M. haematoparvum” (20%) y M. haemocanis (3%). El análisis estadístico no mostró una asociación significativa entre la edad, el sexo y la coinfección con Babesia spp. respecto a la positividad por hemoplasmas; sin embargo, la aptitud de caza se asoció significativamente con una mayor tasa de infección. Además, se determinó que los micoplasmas hemotrópicos, solos o en coinfección con Babesia spp., no muestran un efecto significativo sobre el valor del hematocrito. Este trabajo representa el primer estudio molecular de la ocurrencia de estas infecciones en perros de Galicia, y en él se detectaron las dos especies de micoplasmas hemotrópicos consideradas propias de la especie canina. Además, el análisis estadístico refuerza la idea de que la transmisión de estos patógenos se produce a través de vectores, ya que los perros de hábitat rural, como los de caza, presentaron una mayor tasa de infección. Sin embargo, los micoplasmas hemotrópicos no parecen tener una gran capacidad patógena, ya que su presencia no se asoció con un menor valor de hematocrito, tanto en infecciones únicas como en coinfecciones con Babesia spp. Palabras clave: micoplasmas hemotrópicos, perros, PCR, factores de riesgo, hematocrito, coinfección. RESUMO Os micoplasmas hemotrópicos (hemoplasmas) son bacterias epicelulares obrigadas que infectan os glóbulos vermellos dunha ampla variedade de mamíferos, podendo causar anemia hemolítica de gravidade variable. No can descríbense dúas especies: Mycoplasma haemocanis e “Candidatus Mycoplasma haematoparvum”. Neles, a infección adoita ter un curso crónico asintomático, pero a esplenectomía e a inmunosupresión favorecen o desenvolvemento dunha infección aguda manifesta. Os obxectivos deste traballo foron determinar a presenza de micoplasmas hemotrópicos en cans con sospeita clínica de infección por hemopatóxenos, identificar as especies detectadas molecularmente e determinar se certos factores inflúen na presenza destes patóxenos. Ademais, avaliouse o efecto dos micoplasmas hemotrópicos sobre o valor do hematocrito en infeccións únicas e en coinfección con Babesia spp. Para iso analizáronse 60 extraccións de ADN obtidas de mostras de sangue de cans de Galicia con sospeita clínica de infección por hemopatóxenos mediante PCR convencional para a detección de hemoplasmas. Posteriormente, as mostras positivas secuenciáronse e estudouse a súa variabilidade xenética mediante a construción dunha árbore filoxenética. A continuación, cos datos recollidos de cada animal (idade, sexo, aptitude, infección por Babesia spp., hematocrito), realizouse unha análise estatística para valorar os posibles factores de risco e o efecto da infección sobre o hematocrito en infeccións únicas ou mixtas con Babesia spp. Un total de 14 mostras (23,3%) resultaron positivas, e as especies atopadas foron: “Ca. M. haematoparvum” (20%) e M. haemocanis (3%). A análise estatística non mostrou unha asociación significativa entre a idade, o sexo e a coinfección con Babesia spp. respecto á positividade por hemoplasmas; con todo, a aptitude de caza asociouse significativamente cunha maior taxa de infección. Ademais, determinouse que os micoplasmas hemotrópicos, sós ou en coinfección con Babesia spp., non mostran un efecto significativo sobre o valor do hematocrito. Este traballo representa o primeiro estudo molecular da ocorrencia destas infeccións en cans de Galicia, e nel detectáronse as dúas especies de micoplasmas hemotrópicos consideradas propias da especie canina. Ademais, a análise estatística reforza a idea de que a transmisión destes patóxenos prodúcese a través de vectores, xa que os cans de hábitat rural, como os de caza, presentaron unha maior taxa de infección. Con todo, os micoplasmas hemotrópicos non parecen ter unha gran capacidade patóxena, xa que a súa presenza non se asociou cun menor valor de hematocrito, tanto en infeccións únicas como en coinfecciones con Babesia spp. Palabras chave: micoplasmas hemotrópicos, cans, PCR, factores de risco, hematocrito, coinfección. ABSTRACT Hemotropic mycoplasmas (hemoplasmas) are obligate epicellular bacteria that infect the red blood cells of a wide variety of mammals, potentially causing hemolytic anemia of varying severity. In dogs, two species are described: Mycoplasma haemocanis and “Candidatus Mycoplasma haematoparvum.” In these animals, the infection usually has a chronic asymptomatic course, but splenectomy and immunosuppression favor the development of an acute manifest infection. The objectives of this study were to determine the presence of hemotropic mycoplasmas in dogs with clinical suspicion of hemopathogen infection, identify the molecularly detected species, and determine if certain factors influence the presence of these pathogens. Additionally, the effect of hemotropic mycoplasmas on hematocrit levels was evaluated in single infections and coinfections with Babesia spp. To this end, 60 DNA extractions obtained from blood samples of dogs from Galicia with clinical suspicion of hemopathogen infection were analyzed using conventional PCR for the detection of hemoplasmas. Subsequently, positive samples were sequenced, and their genetic variability was studied by constructing a phylogenetic tree. Then, with the data collected from each animal (age, sex, aptitude, infection with Babesia spp., hematocrit), a statistical analysis was performed to assess possible risk factors and the effect of the infection on hematocrit in single or mixed infections with Babesia spp. A total of 14 samples (23.3%) tested positive, and the species found were: “Ca. M. haematoparvum” (20%) and M. haemocanis (3%). Statistical analysis did not show a significant association between age, sex, and coinfection with Babesia spp. concerning hemoplasma positivity; however, hunting aptitude was significantly associated with a higher infection rate. Furthermore, it was determined that hemotropic mycoplasmas, alone or in coinfection with Babesia spp., do not show a significant effect on hematocrit levels. This study represents the first molecular investigation of the occurrence of these infections in dogs from Galicia, detecting the two species of hemotropic mycoplasmas considered characteristic of the canine species. Additionally, the statistical analysis reinforces the idea that the transmission of these pathogens occurs through vectors, as rural habitat dogs, such as hunting dogs, showed a higher infection rate. However, hemotropic mycoplasmas do not seem to have a high pathogenic capacity, as their presence was not associated with lower hematocrit levels, both in single infections and coinfections with Babesia spp. Keywords: hemotropic mycoplasmas, dogs, PCR, risk factors, hematocrit, coinfection. ÍNDICE 1. INTRODUCCIÓN .............................................................................................................. 8 1.1 Etiología ........................................................................................................................... 8 1.2 Epidemiología .................................................................................................................. 9 1.2.1 Distribución geográfica ........................................................................................... 9 1.2.2 Hospedadores ........................................................................................................ 10 1.2.3 Transmisión ........................................................................................................... 11 1.2.4 Factores de riesgo ................................................................................................. 12 1.3 Patogenia ........................................................................................................................ 14 1.4 Signos clínicos ................................................................................................................ 15 1.5 Diagnóstico ..................................................................................................................... 15 1.5.1 Hemograma y bioquímica ..................................................................................... 15 1.5.2 Examen citológico ................................................................................................. 16 1.5.3 PCR ...................................................................................................................... 17 1.6 Tratamiento .................................................................................................................... 17 1.7 Prevención y control ...................................................................................................... 18 2. OBJETIVOS ..................................................................................................................... 19 3. MATERIAL Y MÉTODOS ............................................................................................. 20 3.1 Origen y características de las muestras incluidas.......................................................... 20 3.2 Análisis de laboratorio .................................................................................................... 21 3.2.1 PCR convencional ................................................................................................. 21 3.2.2 Secuenciación del ADN ....................................................................................... 23 3.3 Análisis filogenético ...................................................................................................... 24 3.3.1 Identificación de las especies de micoplasmas hemotrópicos ............................... 24 3.3.2 Alineamiento y construcción del árbol filogenético .............................................. 24 3.4 Análisis estadístico ........................................................................................................ 26 4. RESULTADOS Y DISCUSIÓN ...................................................................................... 27 4.1 Características de la población muestreada ................................................................... 27 4.2 Presencia de micoplasmas hemotrópicos ....................................................................... 27 4.3 Especies de micoplasmas hemotrópicos y análisis filogenético ..................................... 29 4.4 Características de la población positiva a micoplasmas hemotrópicos y análisis de los factores de riesgo asociados .......................................................................................... 31 4.5 Efecto de los micoplasmas hemotrópicos sobre el hematocrito y análisis del efecto de la coinfección con Babesia spp. ......................................................................................... 35 5. CONCLUSIONES ........................................................................................................... 38 6. BIBLIOGRAFÍA .............................................................................................................. 39 ADN: Ácido desoxirribonucleico. AIC: Akaike Information Criterion. ARN: Ácido ribonucleico. ARNr: Ácido ribonucleico ribossomal. BLAST: Basic Local Alignment Search Tool. Ca.:“Candidatus”. CMhp: “Candidatus Mycoplasma haematoparvum”. EDTA: Ácido etilendiaminotetraacético. EE.UU.: Estados Unidos. F: forward. HCT: hematocrito. INVESAGA: Investigación en Sanidade Animal de Galicia. Mhc: Mycoplasma haemocanis. Mhf: Mycoplasma haemofelis. NCBI: National Center for Biotechnology Information. pb: par de bases. PCR: reacción en cadena de la polimerasa. qPCR: PCR en tiempo real. R: reverse. rpm: revoluciones por minuto. TAE: Tris, acetato y EDTA. TR + I + G: General Time Reversible + Invariant sites + Gamma-distributed. UI: unidades internacionales. ÍNDICE DE ABREVIATURAS 1. INTRODUCCIÓN Los micoplasmas hemotrópicos, comúnmente conocidos como hemoplasmas, son un grupo de bacterias gramnegativas de pequeño tamaño, no cultivables y sin pared celular que infectan los glóbulos rojos de una amplia variedad de mamíferos, pudiendo causar en ellos una anemia hemolítica de gravedad variable (Barker y Tasker, 2022). Las principales especies que infectan a los animales de compañía son Mycoplasma haemocanis y “Candidatus Mycoplasma haematoparvum” en el perro, y Mycoplasma haemofelis, “Candidatus Mycoplasma haemominutum” y “Candidatus Mycoplasma turicensis” en el gato. En esta especie, M. haemofelis se considera el agente causal de la anemia infecciosa felina (Sykes y Tasker, 2014), mientras que la mayoría de perros infectados por hemoplasmas presentan infecciones crónicas asintomáticas (Willi et al., 2010). 1.1 Etiología Los micoplasmas hemotrópicos fueron descritos por primera vez en 1921 por M. Mayer, quien propuso el término Bartonella muris para referirse a los cuerpos de inclusión observados en los glóbulos rojos de una rata de laboratorio afectada por anemia severa (Mayer, 1921; revisado por Neitz, 1938). Años más tarde, W. Kikuth (1928) identificó un patógeno similar en un perro esplenectomizado, que denominó Bartonella canis, y R. Clark (1942) designó como Eperythrozoon felis al patógeno causante de un cuadro anémico fulminante en un gato. Originalmente, los hemoplasmas fueron clasificados dentro de los géneros Haemobartonella y Eperythrozoon (orden Rickettsiales, familia Anaplasmataceae) debido a su tropismo eritrocitario, pequeño tamaño y presunta transmisión por artrópodos (Kreier y Ristic, 1984, revisado por Willi et al., 2007). Sin embargo, análisis filogenéticos posteriores basados en la secuenciación del gen que codifica el ARN ribosomal 16 S (ARNr 16S) revelaron que, en realidad, estos organismos estaban más estrechamente relacionados con los micoplasmas, con los que compartían características fenotípicas como su pequeño tamaño, la ausencia de pared celular y los exigentes requisitos de crecimiento (Neimark y Kocan, 1997; Rikihisa et al., 1997). Esto condujo a su reclasificación dentro del género Mycoplasma (orden Mycoplasmatales, familia Mycoplasmataceae) (Neimark et al., 2001). Sin embargo, este género se caracterizaba por albergar especies bacterianas como M. pneumoniae o M. genitalium, que colonizan epitelios mucosos, presentando un tropismo muy diferente en comparación con los hemoplasmas (Barker y Tasker, 2022). Un estudio filogenético posterior basado en los genes gapA y dnaK sugirió que, aunque los hemoplasmas pertenecen a la familia Mycoplasmataceae, estos deberían conformar un género separado (Hicks et al., 2014). Debido a sus exigentes características de crecimiento, los micoplasmas hemotrópicos no pueden ser cultivados in vitro. Esto limita su caracterización fenotípica completa, lo que hace necesario que el prefijo "Candidatus" se aplique a los hemoplasmas recién descritos hasta que se disponga de más información que respalde su clasificación (Neimark et al.; 2001, 2002). En el caso del perro, objeto de este trabajo, se han descrito principalmente dos especies de hemoplasmas: Mycoplasma haemocanis (Mhc) y “Ca. M. haematoparvum” (CMhp) (Kikuth, 1928; Sykes et al., 2005). De manera análoga a lo descrito para otros hemoplasmas, se trata de organismos gramnegativos, sin pared celular y pleomórficos. Estos patógenos son epieritrocitarios obligados y se encuentran adheridos a la superficie del eritrocito, donde pueden encontrarse individualmente o agrupados en cadenas (Messik, 2004). Mhc es un hemoplasma relativamente grande, con un diámetro de 0,3 a 2 µm, y se caracteriza por agruparse formando largas cadenas de organismos en la superficie de los eritrocitos, aunque también puede aparecer individualmente (Messick et al., 2002; Venable y Ewing, 1968). Presenta grandes similitudes genéticas respecto a M. haemofelis (Mhf), habiéndose hipotetizado que fuesen una misma especie (Brinson y Messick, 2001), pero estudios posteriores basados en el análisis de secuencias genéticas parciales y del genoma completo permitieron diferenciarlos como especies distintas (Birkenheuer et al., 2002; Do Nascimento et al., 2012). Por otra parte, CMhp se asemeja a “Ca. M. haemominutum” tanto morfológica como genéticamente, presentando un tamaño uniformemente pequeño de aproximadamente 0,3 µm de diámetro y no agrupándose en cadenas. De manera similar a lo descrito para Mhc y Mhf, a pesar de sus similitudes, los análisis filogenéticos permitieron distinguirlas como especies distintas (Sykes et al., 2005). 1.2 Epidemiología 1.2.1 Distribución geográfica Los micoplasmas hemotrópicos, incluyendo M. haemocanis y “Ca. M. haematoparvum”, presentan distribución mundial, habiéndose descrito casos en todos los continentes. De forma general, M. haemocanis es la especie más prevalente (Barker y Tasker, 2016). En los diferentes estudios epidemiológicos basados en la reacción en cadena de la polimerasa (PCR), la prevalencia notificada para la hemoplasmosis canina varía ampliamente, con rangos que oscilan entre el 1,2% (Wengi et al., 2008) y el 56,7 % (Beus et al., 2024). Esta variabilidad podría atribuirse a distintos factores, como la diferente climatología de las áreas estudiadas, las características de la población muestreada (estado clínico, aptitud o exposición a ectoparásitos) y las diferencias en la sensibilidad diagnóstica de los ensayos de PCR utilizados (Aquino et al., 1.5.2 Examen citológico La identificación de micoplasmas hemotrópicos mediante microscopía óptica en frotis sanguíneos es posible, pero presenta una sensibilidad baja (0-37%), ya que para lograr su visualización es necesario que estén presentes en sangre una gran cantidad de microorganismos. Su especificidad también es limitada, ya que es necesario distinguir los hemoplasmas de posibles precipitados de tinción, artefactos de desecación y pequeños cuerpos de Howell-Jolly. Desde un punto de vista técnico, para llevar a cabo este método diagnóstico debe emplearse sangre fresca, ya que las bacterias tienden a desprenderse de los eritrocitos a las pocas horas de la extracción. Asimismo, la muestra debe teñirse de forma cuidadosa para evitar la aparición de falsos positivos asociados a artefactos de tinción. Las tinciones de tipo Romanowsky son las más utilizadas para este propósito (Sykes y Tasker, 2014). Típicamente, los micoplasmas se visualizan en la superficie de los glóbulos rojos, de forma individual, en pares, o agrupados formando cadenas. En relación con esto, M. haemocanis tiene cierta tendencia a agruparse en cadenas (Figura 1), por lo que la identificación de figuras compatibles es relativamente más sencilla; en cambio, “Ca. M. haematoparvum”, con su menor tamaño (0,3 µm) y una disposición típicamente individual o en pares, tiende a pasar desapercibido con mayor facilidad (Barker y Tasker, 2022; Messick y Harvey, 2012). Además de la visualización del patógeno, en el examen citológico también se pueden observar hallazgos típicos de la enfermedad, como anisocitosis, policromasia, visualización de cuerpos de Howell – Jolly y presencia de autoaglutinación (Sykes y Tasker, 2014). Figura 1. Frotis de procedente de un paciente canino infectado por M. haemocanis. Tinción Diff-Quick, 100X. Las flechas negras señalan la disposición individual de los microorganismos a lo largo de la superficie eritrocitaria, mientras que las flechas rojas muestran su agrupación característica en cadenas. Extraído de Kim et al. (2020). 1.5.3 PCR La reacción en cadena de la polimerasa es la prueba de elección para el diagnóstico de la infección por micoplasmas hemotrópicos en el perro, ya que presenta una sensibilidad muy superior a la citología. Sin embargo, es importante tener en cuenta que la PCR podría no detectar organismos en estados de infección subclínica, donde el animal presenta un bajo número de microorganismos en la sangre (Barker y Tasker, 2022; Criado – Fornelio et al., 2003; Jensen et al., 2001). Se pueden emplear tanto la PCR convencional como la PCR en tiempo real (qPCR) (Barker et al., 2010; Criado – Fornelio et al., 2003; Sharifiyazdi et al., 2016; Willi et al., 2009). En su mayoría, los ensayos se basan en la detección de segmentos del gen ARNr 16S específicos, pero, mientras que la PCR convencional sólo informa sobre la presencia del patógeno, la qPCR aporta además información cuantitativa, permitiendo realizar un seguimiento de la infección y evaluar la respuesta al tratamiento (Pitorri et al., 2020). No obstante, debido al frecuente carácter subclínico de la hemoplasmosis en perros, un resultado positivo de PCR debe interpretarse con cautela, considerando siempre los signos clínicos, el historial del paciente y la posible presencia de enfermedades concurrentes o estados de inmunosupresión (Barker y Tasker, 2022). 1.6 Tratamiento En cuanto a la terapia antimicrobiana específica, el empleo de tetraciclinas (doxiciclina, oxitetraciclina) o fluoroquinolonas (enrofloxacina, marbofloxacina) durante 3 – 4 semanas se asocia de manera general con una mejoría clínica, aunque no siempre logra la eliminación completa de la infección (Barker y Tasker, 2022; Hulme – Moir et al., 2010; Kim et al., 2020; Lapsina et al., 2023; Pitori et al., 2012). Normalmente, la doxiciclina es el fármaco de primera elección, y se administra a una dosis de 5 - 10 mg/kg cada 24 horas por vía oral (Messick, 2003; Zobba et al., 2020). En algunos casos, los tratamientos se extienden durante 6 – 8 semanas para incrementar la probabilidad de erradicar la infección; sin embargo, no existe ningún plan terapéutico que garantice la eliminación completa de la infección por micoplasmas hemotrópicos en ninguna especie. Dado que la respuesta al tratamiento no puede predecirse de manera empírica, idealmente debería monitorizarse mediante qPCR para asegurar que el número de microorganismos está disminuyendo. No obstante, esto puede no ser necesario si el animal muestra una respuesta rápida favorable al tratamiento (Barker y Tasker, 2022). Además de la terapia específica, en algunos casos puede ser necesario un tratamiento de soporte. Por ejemplo, el empleo de glucocorticoides se ha sugerido para abordar el posible componente inmunomediado de la anemia; no obstante, su uso genera controversia, ya que, por un lado, su administración a dosis inmunosupresoras ha demostrado inducir un aumento en el número de hemoplasmas (Tasker, 2020) y, por otro, la mayoría de perros no suelen mostrar dicho componente inmunomediado (Barker y Tasker, 2016; Warman et al., 2010). Por lo tanto, su utilización rutinaria no está recomendada, reservándose para aquellos casos en los que el animal no responde a la terapia antimicrobiana o presenta evidencia de anemia inmunomediada. El tratamiento de soporte también incluye la administración de fluidoterapia intravenosa para corregir la deshidratación, así como la transfusión de sangre o de concentrado de hematíes en aquellos animales que presenten signos de anemia descompensada (taquicardia, debilidad, taquipnea, acidosis metabólica) (Barker y Tasker, 2022). En general, si se instaura el tratamiento adecuado, el pronóstico de la hemoplasmosis en perros suele ser favorable, mostrando una mejoría clínica en 2 -3 días (Tasker, 2020). En algunos casos, los animales son refractarios a la terapia antimicrobiana inicial, lo cual puede requerir el cambio de antibiótico o la adición de un segundo antimicrobiano (Hulme – Moir et al., 2010). Sin embargo, a pesar de lograr la remisión de la enfermedad, en muchos casos los animales continúan infectados como portadores crónicos (Barker y Tasker, 2022; Zobba et al. 2020). 1.7 Prevención y control En la actualidad no existen vacunas comerciales específicas disponibles para prevenir las infecciones por micoplasmas hemotrópicos en ninguna especie. Por tanto, se debe considerar como medida preventiva principal el control de los vectores mediante la desparasitación regular contra ectoparásitos (Barker y Tasker, 2016; 2022). Se recomienda especialmente el uso de ectoparasiticidas del grupo de las isoxazolinas como fluralaner y lotilaner, ya que, además de ser efectivos frente a pulgas y garrapatas, también lo son contra los ácaros de la sarna, que han sido asociados como un factor de riesgo para la hemoplasmosis canina (Novacco et al., 2010; Zhou et al., 2022). Asimismo, en los colectivos donde la infección sea endémica, se recomienda evitar las interacciones agresivas entre perros, dado que estas pueden facilitar la transmisión del patógeno (Huggings et al., 2023). Por otra parte, dada la posibilidad de transmisión iatrogénica, es recomendable realizar pruebas de detección de hemoplasmas mediante PCR en perros que actúen como donantes de sangre (Sykes y Tasker, 2014), especialmente en países con altas tasas de prevalencia, si el donante tiene un historial de exposición a vectores artrópodos o si el perro receptor ha sido esplenectomizado (Wengi et al., 2008). De igual manera, se debería considerar la realización rutinaria de PCR para la detección de hemoplasmas en pacientes que vayan a ser esplenectomizados o que estén bajo tratamiento con fármacos inmunosupresores, con el fin de prevenir el recrudecimiento de una posible infección crónica (Brinson y Messick, 2001). 2. OBJETIVOS Con lo que se ha descrito anteriormente, los objetivos propuestos en el presente Trabajo de Fin de Grado fueron los siguientes: - Estudiar la presencia de diferentes especies de micoplasmas hemotrópicos en perros de Galicia con sospecha clínica de infección por hemopatógenos. - Determinar la influencia de la edad, el sexo, la aptitud y la coinfección con Babesia spp. sobre la presencia de micoplasmas hemotrópicos en perros. - Evaluar la relación entre la infección simple por micoplasmas hemotrópicos y la coinfección con Babesia spp. con respecto al valor de hematocrito en perros con sospecha de infección por hemopatógenos. 3. MATERIAL Y MÉTODOS 3.1 Origen y características de las muestras incluidas El presente estudio se llevó a cabo entre diciembre de 2023 y marzo de 2024. Durante este periodo, se analizaron un total de 60 muestras de sangre de perros procedentes de diferentes municipios de Galicia, en su mayoría de la provincia de Lugo (Figura 2). Las muestras de sangre incluidas en este trabajo habían sido recolectadas previamente, entre los años 2021 y 2022, gracias a la colaboración de dos clínicas veterinarias ubicadas en el área de Lugo. En estas clínicas, se seleccionaron aquellos animales que acudían a consulta con sospecha de infección por hemopatógenos, basándose en la presencia de signos clínicos compatibles (mucosas pálidas, anorexia, decaimiento) e historial de exposición a ambientes con presencia de vectores. Las muestras se obtuvieron mediante punción venosa y se enviaron en refrigeración al laboratorio del grupo INVESAGA de la Facultad de Veterinaria de Lugo en tubos con anticoagulante EDTA. Las clínicas de origen registraron la edad, sexo y aptitud de cada animal muestreado, y esta información fue recogida en una base de datos. Adicionalmente, se adjuntó el hemograma de cada animal, obtenido en ambas clínicas con el analizador hematológico ProCyte Dx, IDEXX. Se registró el valor de hematocrito en esta misma base de datos datos, y se consideraron anémicos aquellos animales con un valor inferior al 37,3% de acuerdo con los valores de referencia indicados por el fabricante. En seis animales no fue posible recoger esta información. A Coruña A Fonsagrada Castro de Rei Guntín Paradela Ribeira de Piquín A Pastoriza Becerreá Castroverde Friol Sarria Outeiro de Rei O Corgo Lugo Figura 2. Mapa de Galicia mostrando la localización de los municipios de procedencia de los perros muestreados. Los diferentes tonos de azul/ gris y su número correspondiente indican la cantidad de muestras recolectadas en cada municipio. Una vez en el laboratorio y siempre en las 48 horas posteriores a la recogida, las muestras de ADN se sometieron a una extracción de ADN con un kit comercial (High Pure PCR Template Preparation Kit, Roche Diagnostics GmbH, Mannheim, Alemania), y posteriormente se analizaron para la presencia de Babesia spp. mediante PCR convencional dentro del marco de otro proyecto de investigación, caracterizando aquellas muestras positivas hasta el nivel de especie. De esta manera, para el presente estudio se dispuso de dichas extracciones de ADN, que se encontraban almacenadas a -20 ºC, así como del resultado de la presencia de Babesia spp. en las mismas y su identificación a nivel de especie. 3.2 Análisis de laboratorio 3.2.1 PCR convencional Las muestras de ADN obtenidas previamente se analizaron mediante PCR convencional para la detección de micoplasmas hemotrópicos. Para ello, se emplearon cebadores previamente descritos que emplean como diana el gen ARNr 16S y que permiten amplificar cualquier especie de hemoplasma (Criado – Fornelio et al., 2003). Los reactivos empleados para la realización de la PCR y la concentración de cada uno pueden observarse en la tabla 2. El procedimiento completo de PCR se llevó a cabo de la siguiente manera: 1. Preparación de la mezcla maestra (Master Mix). Se preparó una mezcla maestra con los reactivos necesarios para la reacción de PCR. Cada reactivo se añadió en un tubo de microcentrífuga de 1,5 ml, utilizando las concentraciones finales que se detallan en la Tabla 2. A continuación, la mezcla se homogeneizó en un agitador de tubos y se centrifugó a 13000 rpm durante 10 s. 2. Preparación de los tubos de reacción. Se rotuló un número de microtubos de 0,2 ml equivalente al número de muestras a procesar, y a continuación se añadieron 47 µl de la Master Mix a cada uno de ellos. Posteriormente, se agregaron 3 µl de muestra de ADN o control positivo/negativo a su tubo correspondiente, para un volumen final por muestra de 50 µl. Como control negativo se empleó agua bidestilada estéril (MO BIO Laboratories Inc., Carlsbad, EE.UU.), y como control positivo se utilizó una muestra positiva a Mycoplasma wenyonii previamente identificada mediante secuenciación. Una vez preparados, los tubos se centrifugaron a 1600 rpm durante 1 minuto. 3. Amplificación por PCR. Los tubos de reacción se introdujeron en un termociclador BioRad T100 (Bio-Rad Laboratories Inc., Hercules, EE.UU.) para llevar a cabo la amplificación del ADN presente en las muestras. El protocolo térmico empleado se detalla en la Tabla 3. Tabla 2. Listado de reactivos empleados para la preparación de la Master Mix. 1 Suministrados por NZYTech Lda. (Lisboa, Portugal). 2 Descritos por Criado-Fornelio et al., 2003. Suministrados por Roche Diagnostics GmbH (Mannheim, Alemania). 3 Suministrado por MO BIO Laboratories Inc. (Carlsbad, EE. UU). Tabla 3. Protocolo térmico empleado para la amplificación de ADN. 4. Electroforesis en gel de agarosa. Una vez completada la amplificación, se realizó una electroforesis visualizar los productos de PCR. El procedimiento empleado fue el siguiente: − Preparación del gel de agarosa. Se utilizaron geles de agarosa al 1%, preparados mezclando 60 ml de tampón TAE 1x (Tris-Acetato-EDTA, PanReac-AppliChem, Barcelona, España) con 0,6 g de agarosa (Agarose electrophoresis grade, NZYTech Lda., Lisboa, Portugal). La mezcla se calentó y homogeneizó hasta estar completamente transparente, y a continuación se enfrió bajo agua fría y se añadieron 3 µl de RedSafeTM (iNtRON Biotechnology Inc., Seúl, Corea del Sur), un colorante que se une de manera inespecífica a las cadenas de ADN permitiendo su visualización después de excitarlo bajo luz ultravioleta. La mezcla se vertió en un soporte nivelado con un peine colocado previamente, y se dejó solidificar durante 40 minutos. Reactivo Concentración inicial Concentración final Volumen final / reacción Cl2Mg1 50 mM 1,5 mM 1,5 µl Tampón Tris – HCl1 10 x 1 x 5 µl Desoxirribonucleótidos-trifosfato (dNTPs) NZYMix1 2 mM 200 mM 5 µl Cebador Forward: ATACGGCCCATATTCCTACG2 10 µM 1 µM 5 µl Cebador Reverse: TGCTCCACCACTTGTTCA2 10 µM 1 µM 5 µl Taq polimerasa NZYTaq DNA Polymerase1 5 U/ µl 2,5 U 0,5 µl Agua bidestilada estéril3 - - 25 µl TOTAL 47 µl Temperatura Tiempo Ciclos 95 ºC 5 min 1 95 ºC 30 s 40 60 ºC 45 s 72 ºC 45 s 72 ºC 10 min 1 − Carga de muestras. Una vez solidificado el gel, se retiró el peine, formándose así los pocillos. El gel se colocó en una cubeta de electroforesis y se cubrió con una solución TAE 1x. Se cargaron 5 µl del marcador de peso molecular (NZYDNA Ladder V, 1001000 bp, NZYTech Lda., Lisboa, Portugal) en el primer pocillo del gel. En una placa de microtitulación, se añadieron 2 µl de tampón de carga (6x NZYDNA loading dye, NZYTech Lda., Lisboa, Portugal) y 10 µl de cada producto de PCR, y luego se cargó todo el volumen en los pocillos correspondientes del gel de agarosa. − Electroforesis. Una vez cargadas todas las muestras, se cerró la cubeta y se configuraron los parámetros de electroforesis: 100 V, 400 mA, 37 min. − Visualización y análisis de resultados. El gel de agar se reveló en el analizador de imagen GelDoc Go (Bio-Rad Laboratories Inc., Hercules, EE.UU.) para visualizar las bandas de ADN. Se consideraron positivas aquellas muestras con bandas a la misma altura que el control positivo y que correspondían aproximadamente con un peso de 600700 pares de bases (pb) según el marcador de peso molecular (Figura 3). 3.2.2 Secuenciación del ADN Una vez completado el análisis de las muestras, aquellas que resultaron positivas se remitieron a un laboratorio externo (STAB Vida Lda., Caparica, Portugal) donde fueron purificadas y secuenciadas mediante el método Sanger. Una vez procesadas, este laboratorio proporcionó dos cromatogramas para cada muestra, uno forward y otro reverse. Un cromatograma es una representación gráfica de una secuencia de ADN, en la que cada pico y su color correspondiente indican el nucleótido identificado para cada posición. Figura 3. Electroforesis en gel de agarosa al 1% de los productos de PCR amplificados con cebadores específicos para Mycoplasma spp. Primer y último carril: marcador de peso molecular de 100 a 1000 pb; C+: control positivo; C. NEG: control negativo; MP01 – MP23: muestras problema. A continuación, se empleó el programa ChromasPro 2.1.4 (Technelysium, Brisbane, Australia) para ensamblar los dos cromatogramas obtenidos para cada producto de PCR, generando así una única secuencia consenso (Figura 4). Estas secuencias se revisaron manualmente para corregir ambigüedades en la asignación de bases y eliminar las regiones de baja calidad presentes al inicio y final de estas. Las secuencias consenso editadas se guardaron en formato FASTA. 3.3 Análisis filogenético 3.3.1 Identificación de las especies de micoplasmas hemotrópicos Cada secuencia consenso obtenida se comparó con secuencias de referencia previamente descritas y publicadas en la base de datos GenBank del National Center for Biotechnology Information (NCBI), utilizando la herramienta BLAST (Basic Local Alignment Search Tool; https://blast.ncbi.nlm.nih.gov/Blast.cgi). Cada una de las secuencias del estudio se identificó como la especie de Mycoplasma spp. más próxima según el porcentaje de homología obtenido. 3.3.2 Alineamiento y construcción del árbol filogenético Para la construcción del árbol filogenético, primero se realizó el alineamiento de las secuencias consenso obtenidas. Se utilizó el programa Molecular Evolutionary Genetic Analysis X (MEGA X) (Kumar et al., 2018), seleccionando el algoritmo de alineamiento ClustalW. Las secuencias fueron revisadas y recortadas manualmente para asegurar que todas tuviesen la misma longitud (628 pb). Figura 4. Vista del ensamblaje de los cromatogramas mediante el programa ChromasPro 2.1.4. Además de las secuencias obtenidas en este trabajo, también se incluyeron en el alineamiento diferentes secuencias nucleotídicas de referencia de la base de datos GenBank (https://www.ncbi.nlm.nih.gov/genbank/), correspondientes a diferentes especies de micoplasmas hemotrópicos. Adicionalmente, se incluyó la secuencia de una especie de micoplasma no hemotrópico (Mycoplasma bovis), filogenéticamente más distante del grupo de interés, para emplearla como raíz del árbol filogenético. La información de estas secuencias se describe en la Tabla 4. Tabla 4. Secuencias de referencia empleadas para la construcción del árbol filogenético, obtenidas de la base de datos GenBank. A continuación, el alineamiento fue importado al programa jModel Test 2.1.10 (Darriba et al., 2012) para seleccionar el modelo de sustitución de nucleótidos más adecuado para la construcción del árbol filogenético. La selección del modelo se realizó en base al criterio estadístico AIC Mycoplasma spp. Secuencia empleada Código de acceso GenBank Mycoplasma haemocanis Isolate cupsd254 16S ribosomal RNA gene partial sequence MZ221174 Mycoplasma haemofelis 16S ribosomal RNA gene partial sequence EU145745 Mycoplasma wenyonii 16S ribosomal RNA gene partial sequence AY946266 Mycoplasma ovis Isolate TA5 16S ribosomal RNA gene partial sequence JF931135 Mycoplasma parvum Gene for 16S ribosomal RNA partial sequence strain: Morioka9 AB610850 Mycoplasma suis Strain HLJ/2010 16S ribosomal RNA gene partial sequence KF740480 Candidatus Mycoplasma haematoparvum Isolate cupsd243 16S ribosomal RNA gene partial sequence MZ221181 Candidatus Mycoplasma haemominutum 16S ribosomal RNA gene partial sequence AY297712 Candidatus Mycoplasma turicensis Isolate D9 16S ribosomal RNA gene partial sequence DQ464425 Candidatus Mycoplasma haemobos Isolate cattle no. 18 16S ribosomal RNA gene partial sequence EU367965 Mycoplasma bovis (outgroup) Strain GDZJMbovis2014-1 16S ribosomal RNA gene partial sequence KM576849 Candidatus Mycoplasma haemovis Isolate TA3 16S ribosomal RNA gene partial sequence JF931133 Tabla 6. Características de los animales positivos a la PCR para la detección de hemoplasmas. Se muestra también la identificación a nivel de especie de las secuencias nucleotídicas obtenidas. 1 : : macho / : hembra 2 : Casos en lo que existía coinfección con Babesia spp. Entre paréntesis se describe la especie/s a las que resultaron positivos. 3: CMhp: “Candidatus Mycoplasma haematoparvum”; Mhc: Mycoplasma haemocanis. Código muestra Edad (meses) Sexo1 Aptitud Babesia spp.2 % HCT Especie hemoplasma4 M10 86 ♂ Caza Sí (B. vulpes) 17 CMhp M11 50 ♂ Caza Sí (B. vulpes) 19 CMhp M21 23 ♂ Compañía No 27 CMhp M26 64 ♂ Caza No 28 CMhp M37 78 ♂ Compañía Sí (B. vulpes) 32 CMhp M38 82 ♀ Caza No 18 CMhp M43 67 ♂ Compañía Sí (B. canis) 28 CMhp M44 75 ♂ Compañía Sí (B. canis) 25 CMhp M48 91 ♀ Caza No 21 CMhp M49 108 ♂ Caza Sí (B. vulpes) 27 Mhc M50 120 ♂ Caza Sí (B. vulpes) 25 CMhp M52 87 ♂ Caza No 44 CMhp M53 24 ♂ Caza Sí (B. vulpes, B. canis) 30 Mhc M55 62 ♀ Caza Sí (B. vulpes) 25 CMhp 3/21 11/33 0% 10% 20% 30% 40% Hembras Machos Sexo 9/36 5/24 18% 20% 22% 24% 26% Coinfección No coinfección Babesia spp. 10/16 4/38 0% 20% 40% 60% 80% Caza Compañía Aptitud 2/8 12/46 24% 25% 25% 26% 26% 27% ≤2 años > 2 años Edad (A) (B) (D) (C) Figura 6. Diagramas de barras que representan el porcentaje de perros positivos a micoplasmas hemotrópicos en relación con diferentes factores epidemiológicos. (A) Porcentaje de animales positivos distribuidos por grupos de edad. (B) Porcentaje de animales positivos segregados por sexo. (C) Porcentaje de animales positivos según su aptitud. (D) Porcentaje de animales positivos en relación con la coinfección por Babesia spp. Estos datos son meramente descriptivos y relativos a la población estudiada, por lo que no pueden ser interpretados como un reflejo de la prevalencia de infección por hemoplasmas en los distintos sectores de la población canina descritos. Así, con el fin de determinar si las diferencias encontradas entre los diferentes grupos eran significativas, se realizó un análisis estadístico univariante para cada una de estas variables (Tabla 7). Dado que solo 2 animales resultaron positivos a CMhp, el análisis estadístico se realizó para el conjunto de micoplasmas hemotrópicos, y no para cada una de las especies. De acuerdo con el análisis de regresión, las variables “edad”, “sexo” e “infección con Babesia spp.” no mostraron una influencia significativa sobre la presencia de micoplasmas hemotrópicos en la población estudiada (p-valor > 0,05). Sin embargo, la variable “aptitud” sí presentó una asociación significativa con la positividad a micoplasmas hemotrópicos (p-valor < 0,05). Tabla 7. Modelo de regresión logística univariable de los factores de riesgo (edad, sexo, aptitud, infección con Babesia spp.) asociados a la infección por hemoplasma. *Categoría de referencia. OR, Odds Ratio; 95% CI, Intervalo de confianza al 95 %; El análisis de regresión no encontró diferencias significativas entre la prevalencia de micoplasmas hemotrópicos y la edad (p-valor > 0,05). La asociación de la exposición con hemoplasmas y la edad no está clara en la bibliografía. Los resultados de este este estudio concuerdan con otros en los que tampoco se encontró esta asociación estadística (Barker et al., 2010; Happi et al., 2018; Ravagnan et al., 2017; Roura et al., 2010; Wengi et al., 2008). Sin embargo, investigaciones de otros autores determinaron que los animales de mayor edad tenían una mayor probabilidad de infección por micoplasmas hemotrópicos (Aktas y Ozubek, 2018; Beus et al., 2024; Soto et al., 2016), lo que podría atribuirse al mayor tiempo de exposición al patógeno a lo largo de la vida o a una posible infección crónica, ya que muchos de los animales infectados permanecen como portadores a largo plazo (Soto et al., 2016). Por otra parte, Novacco et al. (2010) encontraron mayor prevalencia en jóvenes, y lo atribuyeron a una mayor tasa de exposición de estos animales Variable Total animales Positiva Negativa OR 95% CI p-valor Edad (n = 54) ≤24 meses >24 meses 8 46 2 12 6 34 * 1,05 0,2-7,9 0,948 Sexo (n = 54) Hembra Macho 21 33 3 11 18 23 * 3,00 0,8-14,8 0,130 Aptitud (n = 54) Compañía Caza 38 16 4 10 34 6 * 14,17 3,667,7 <0,001 Babesia spp. (n = 60) No Sí 24 36 5 9 19 27 * 1,27 0,4 - 4,7 0,709 PCR hemoplasma a las garrapatas, debido bien a su mayor actividad o a que la mayor parte de los jóvenes incluidos en su estudio procedían de colectividades. En cuanto al sexo, aunque hubo un mayor porcentaje de positivos en machos, no se encontró ninguna asociación significativa entre el sexo y la positividad a hemoplasmas (p-valor > 0,05), lo cual concuerda con lo descrito por Hasiri et al. (2016), Novacco et al. (2010), Roura et al. (2010) y Wengi et al. (2008), entre otros. En nuestro estudio, el mayor número de machos positivos podría deberse a que la mayoría de los perros de caza eran machos (11 de los 16), y esta aptitud se relacionó estadísticamente con una mayor positividad. Aunque es común no observar esta asociación, algunos estudios encontraron que los perros machos tenían una mayor probabilidad de ser positivos a micoplasmas hemotrópicos (Barker et al. 2010; Sasaki et al. 2008; Soto et al., 2016). Esta mayor positividad en los machos se atribuyó a un mayor contacto agresivo entre animales, más frecuente en este sexo, durante el cual se podría transmitir la infección por micoplasmas (Aktas y Ozubek, 2017; de Faria Valle et al., 2014). El análisis estadístico mostró una asociación significativa entre la aptitud y la positividad a hemoplasmas (p-valor <0,05; OR =14,17), indicando que los perros de caza se infectan con mayor frecuencia. Este hallazgo se explica probablemente por la mayor exposición a ectoparásitos en este tipo de animales, que están más en contacto con el medio ambiente. Esto es consistente con otros estudios en los que se observó una asociación estadística significativa entre la positividad a hemoplasmas y la infestación por garrapatas (Happi et al., 2018), y garrapatas y pulgas (de Faria Valle et al., 2014). De forma similar, también se ha observado una mayor exposición en perros vagabundos, más expuestos a vectores y por tanto a la infección (Aktas y Ozubek, 2018; Ravagnan et al., 2017). El único vector demostrado experimentalmente es Rhipicephalus sanguineus (Seneviratna et al., 1973), respaldado adicionalmente por evidencia indirecta en diversos estudios epidemiológicos que asociaron una mayor prevalencia de hemoplasmosis en áreas donde este vector está presente (Inokuma et al., 2006; Novacco et al., 2010; Roura et al., 2010; Wengi et al., 2008). Sin embargo, en el noroeste de España la especie de garrapata predominante es Ixodes ricinus y, aunque también se ha detectado la presencia de R. sanguineus en esta región (71% I. ricinus vs. 15% R. sanguineus) (Peña López, 2019), de acuerdo con lo que defienden algunos autores (Beus et al., 2024; Millán et al., 2018; Suh et al., 2017), parece probable que otros vectores estén implicados en la transmisión de los hemoplasmas caninos. La mayor positividad en animales de caza también puede estar relacionada con que estos animales conviven más frecuentemente con otros perros en caniles. En este sentido, algunos estudios han encontrado asociación entre la positividad a hemoplasmas y la residencia en protectoras u otras colectividades (Aktas y Ozubek, 2018; Kemming et al., 2004a; Novacco et al., 2010; Ravagnan et al., 2017). Esto podría ser debido a que en estos ambientes se favorezca una mayor densidad de garrapatas, aunque cabe mencionar que en colectivos también pueden ser más frecuentes las interacciones agresivas, que se han sugerido como una posible forma de transmisión de micoplasmas hemotrópicos (de Faria Valle et al., 2014; Huggings et al., 2023; Sasaki et al., 2008). No se encontró relación entre la infección con Babesia spp. y la presencia de micoplasmas hemotrópicos (p-valor > 0,05). Esta falta de asociación estadística es consistente con los hallazgos de Andersson et al. (2017) y Happi et al. (2018), quienes tampoco encontraron una relación significativa entre estas infecciones en sus estudios. Contrariamente, otras investigaciones (Aktas y Ozubek, 2018; Cannon et al., 2016) demostraron una asociación significativa entre la infección con Babesia spp. y micoplasmas hemotrópicos, sugiriendo una transmisión común a través de vectores artrópodos, lo que indirectamente sugiere una exposición compartida a estos patógenos en las poblaciones estudiadas. Sin embargo, los resultados de este estudio no son consistentes con esta hipótesis. 4.5 Efecto de los micoplasmas hemotrópicos sobre el hematocrito y análisis del efecto de la coinfección con Babesia spp. No se observaron diferencias notables en cuanto a los valores de HCT descritos en perros infectados con micoplasmas hemotrópicos en relación con los observados en perros libres de esta infección (26 % y 30,7 % respectivamente) (Figura 7.A). Al considerar las coinfecciones con Babesia spp. (Figura 7.B), se observó que la mediana del hematocrito tampoco fue notoriamente inferior en las infecciones mixtas con hemoplasmas (25,1 % frente a 26,9 %). Cuando se analizaron todas las posibles combinaciones de coinfección (Figura 8), la mediana del hematocrito más baja se encontró en la infección única por Babesia vulpes (19,1 %), seguida de la coinfección entre B. vulpes y micoplamas hemotrópicos (25,1 %). No se observó un patrón que indicase que la coinfección entre micoplasmas hemotrópicos y Babesia spp. llevase a una reducción mayor del hematocrito debido a un posible efecto sinérgico de estos microorganismos. Neg Myc % HCT Neg Myc Myc + B (A) (B) Figura 7. Valores de hematocrito (HCT) en perros con y sin infecciones por micoplasmas hemotrópicos (A) e incluyendo la coinfección simultánea con Babesia spp. (B). Neg, negativo; Myc, micoplasma hemotrópico; B, Babesia spp. Se llevó a cabo un análisis estadístico de regresión lineal para evaluar el efecto de estas infecciones sobre el hematocrito (Tabla 8). El resultado del modelo no mostró que se produjese una disminución significativa el HCT en infecciones simples con micoplasmas hemotrópicos respecto al resto de animales estudiados (p-valor > 0,05). Sin embargo, infecciones simples con B. vulpes sí se asociaron a una mayor bajada del hematocrito (p-valor < 0,05). Finalmente, las coinfecciones con hemoplasmas no se asociaron a una mayor bajada del HCT en ningún caso (p– valor > 0,05). Tabla 8. Resultados del análisis de regresión entre el hematocrito (%) y la presencia de infecciones simples y mixtas con Mycoplasma spp. y Babesia spp. * Categoría de referencia n: nº animales; Coef.: coeficiente; CI95%: intervalo de confianza al 95% del coeficiente. En el presente estudio, debido a las características de la población incluida, es difícil evaluar el impacto clínico de los micoplasmas hemotrópicos en perros. Nueve de los 14 perros que resultaron positivos estaban coinfectados con Babesia spp., además de que el 77 % de los animales incluidos mostraban un HCT inferior al rango fisiológico y no se habían explorado otras causas de anemia. Los hemoplasmas en perros suelen cursar de forma asintomática (Messick, 2004). No obstante, recientemente se comunicó en el País Vasco el caso de un perro inmunocompetente con historial de infestación por garrapatas que desarrolló una infección aguda por M. haemocanis (García Luccioni y Rodríguez López, 2018), y esto también fue reportado por Sharifiyazdi et al. (2014) en Irán. Además, se ha demostrado que en animales esplenectomizados o inmunodeprimidos Mycoplasma spp. Babesia vulpes Babesia canis n Coef. (CI95%) p-valor n Coef. (CI95%) pvalor n Coef (CI95%) p-valor Negativo 46 * * 48 * * 35 * * Inf. simple 5 -1,9 (-10,4 – 6,5) 0,648 5 -10,1 (-19,0 – (-1,1)) 0.028 22 5,1 (0,1 – 10,1) 0.050 Inf. mixta 9 -4,2 (-10,8 – 2,4) 0,204 7 -4,9 (-11,9 – 2,0) 0.160 3 0,9 (-9,7 – 11,4) 0,871 Myc+Bc+Bv Myc+Bc Neg Myc Bv+ Myc Bv Bc % HCT Figura 8. Valores de hematocrito (HCT) en perros para cada combinación de infección micoplasmas hemotrópicos y Babesia spp. Neg, negativo; Myc, micoplasma hemotrópico; Bv, Babesia vulpes; Bc, Babesia canis. puede cursar de forma aguda (Hulme-Moir et al., 2010; Kemming et al., 2004b; Kim et al., 2020; Lapsina et al., 2023; Pitorri et al., 2012; Zobba et al., 2020). Esto sugiere que esta patología debería considerarse en el diagnóstico diferencial de pacientes caninos anémicos con historial de exposición a ectoparásitos. La presencia de micoplasmas hemotrópicos en animales con sospecha de hemopatógenos puede sugerir su implicación en la clínica observada, aunque esto no se puede confirmar en este estudio debido a su diseño. Además, los resultados obtenidos muestran que las infecciones con hemoplasmas no parecen estar asociados con valores de hematocrito más bajos en la especie canina. Esto concuerda con los hallazgos de Aquino et al. (2016), Barker et al. (2010), Hasiri et al., (2016), Happi et al. (2018), Roura et al. (2010) y Wengi et al. (2008). Tampoco se encontraron valores de HCT más bajo cuando se presentaron en coinfección con Babesia spp. Un posible efecto sinérgico entre hemoplasmas y Babesia spp. fue propuesto por Sonoda et al. (1978) (revisado por Sasaki et al. 2008). Sin embargo, otras publicaciones en las que se incluyeron animales positivos a ambos patógenos no observaron un agravamiento de la sintomatología clínica, de forma similar a lo que se observa en este estudio (Cannon et al., 2016; Happi et al., 2018). Así, a pesar de que ambos patógenos infectan los eritrocitos, la coinfección entre ellos no parece implicar un peor curso clínico. Por último, este estudio cuenta con ciertas limitaciones debido al número relativamente pequeño de casos analizados (n = 60), a que se realizó mediante un muestreo dirigido con el fin de maximizar el número de animales positivos a hemopatógenos y a que el limitado número de animales positivos impidió realizar un análisis individual para las diferentes especies de micoplasmas hemotrópicos encontradas. No obstante, estos resultados contribuyen a ampliar el conocimiento de los hemoplasmas caninos, y, hasta donde alcanza el conocimiento de la autora, constituyen el primer estudio molecular de la ocurrencia de infecciones causadas por M. haemocanis y “Ca. M. haematoparvum” en perros de Galicia. 5. CONCLUSIONES 1. En el presente estudio, el 23,3% de perros con sospecha clínica de infección por hemopatógenos estaban infectados con micoplasmas hemotrópicos. 2. Se identificaron molecularmente las dos especies de micoplasmas hemotrópicos consideradas propias de la especie canina: Mycoplasma haemocanis y “Candidatus Mycoplasma haematoparvum”. M. haemocanis resultó ser la especie más frecuente (12/14 animales). 3. La aptitud del perro fue identificada como un factor de riesgo para la infección con micoplasmas hemotrópicos; así, los animales de caza presentaron una mayor probabilidad de estar infectados en comparación con los de compañía. En cambio, no se encontraron diferencias significativas en función del sexo, la edad y la coinfección con Babesia spp. 4. La infección por micoplasmas hemotrópicos no demostró estar asociada a los valores más bajos de hematocrito en perros con sospecha de infección por hemopatógenos, lo que refuerza la idea de que estas infecciones no suelen tener un curso grave en los perros. 5. No se observó una disminución significativa en los valores de hematocrito en los perros coinfectados con micoplasmas hemotrópicos y Babesia spp. en comparación con aquellos infectados únicamente con micoplasmas, lo que parece descartar en principio un efecto sinérgico de estas infecciones en relación con este parámetro. 6. BIBLIOGRAFÍA Aktas, M., y Ozubek, S. (2017). Molecular survey of haemoplasmas in shelter dogs and associations with Rhipicephalus sanguineus sensu lato. Medical and Veterinary Entomology, 31(4), 457-461. https://doi.org/10.1111/mve.12244 Aktas, M., y Ozubek, S. (2018). 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