Hidrogeles biodegradables de polisacáridos para la liberación colónica de fármacos

ESCUELA DE DOCTORADO INTERNACIONAL DE LA USC Manuel Gago Guillán Tesis doctoral HIDROGELES BIODEGRADABLES DE POLISACÁRIDOS PARA LA LIBERACIÓN COLÓNICA DE FÁRMACOS Santiago de Compostela, 2023 Programa de doctorado en Investigación y Desarrollo de Medicamentos TESIS DE DOCTORADO HIDROGELES BIODEGRADABLES DE POLISACÁRIDOS PARA LA LIBERACIÓN COLÓNICA DE FÁRMACOS Autor Manuel Gago Guillán Director: Francisco Javier Otero Espinar Tutor/a: Francisco Javier Otero Espinar PROGRAMA DE DOUTORAMENTO EN INVESTIGACIÓN E DESENVOLVEMENTO DE MEDICAMENTOS SANTIAGO DE COMPOSTELA 2023 AGRADECIMIENTOS AGRADECIMIENTOS Quisiera expresar mi más sincero agradecimiento a todas las personas e instituciones que han contribuido de manera significativa a la realización de esta tesis doctoral. Este trabajo no habría sido posible sin su valiosa colaboración, apoyo y estímulo. En primer lugar, deseo agradecer a mi director de tesis, Francisco Javier Otero Espinar, por su orientación experta, paciencia y dedicación. Sus valiosos comentarios y sugerencias han sido fundamentales para dar forma a este trabajo y conseguir que finalmente haya llegado a buen puerto. Gracias por todo lo que me has enseñado, que no ha sido poco. Agradezco también a los profesores y compañeros del Departamento de Farmacia y Tecnología Farmacéutica de la Universidad de Santiago de Compostela, cuyos conocimientos y experiencias compartidas han enriquecido mi comprensión del tema y han contribuido al desarrollo, no solo de esta investigación, si no de mis conocimientos galénicos en general. Además, deseo extender mi más sincero agradecimiento al Departamento de Farmacia y Tecnología Farmacéutica de la Universidad de Valencia, por brindarme la oportunidad de realizar una estancia en sus instalaciones que, aunque corta, ha sido también muy enriquecedora. Agradezco a Virginia Merino Sanjuan y al equipo del centro por su cálida bienvenida, orientación y generosidad al compartir sus conocimientos. Gracias por la inestimable oportunidad de aprender y crecer dentro de un entorno científico tan estimulante. No puedo dejar de expresar mi gratitud a mis amigos y familiares, quienes han brindado un apoyo incondicional a lo largo de este viaje académico. Sus ánimos y comprensión han sido mi fuerza motriz en momentos desafiantes. Finalmente, agradezco a todas las personas que, directa o indirectamente, de alguna manera colaboraron en los trabajos realizados. Su participación ha sido esencial para el éxito de esta investigación. Este trabajo es el resultado de un esfuerzo colectivo, y estoy agradecido/a por la contribución de cada individuo que ha sido parte de este proceso. ¡Gracias a todos! Manuel Gago Guillán RESUMEN 1 OBJETIVOS Y ORGANIZACIÓN 2 3 OBJETIVOS Y ORGANIZACIÓN Son numerosas las patologías que afectan a la última porción do tracto gastrointestinal. Entre las que podemos destacar las enfermedades inflamatorias, del tipo de la colitis ulcerosa o la Enfermedad de Crohn, así como enfermedades infecciosas provocadas por diferentes microorganismos. En los últimos años se ha avanzado mucho en el conocimiento relacionado con la liberación selectiva de fármacos en el colon con el fin de mejorar el tratamiento de estas patologías. Se han desarrollado distintas estrategias con el fin de alcanzar una mayor concentración del fármaco en la zona dañada, con el consiguiente aumento del efecto, y la disminución de la absorción sistémica del fármaco en las primeras porciones del tracto digestivo, reduciendo de esta forma gran parte de los efectos secundarios. Una de las alternativas más interesantes es el desarrollo de formas farmacéuticas de liberación programada basadas en la actividad enzimática mediada por las enzimas procedentes de la microflora colónica. El principal objetivo del proyecto de tesis será el diseño y evaluación de formulaciones para la liberación colónica de fármacos basadas en esta alternativa. La investigación se orienta hacia dos metas fundamentales: primero, el desarrollo de hidrogeles capaces de liberar de manera controlada y efectiva principios activos como el acetónido de triamcinolona y el ciprofloxacino, y segundo, 4 comprender y aprovechar las propiedades fisiológicas y bioquímicas del colon para optimizar la liberación de estos fármacos. La introducción de la tesis sienta las bases para el estudio, proporcionando una visión detallada del colon humano, su estructura, función y relevancia en el proceso digestivo y en la salud general. Se destaca cómo su papel va más allá de la simple absorción de agua y electrolitos, resaltando su importancia en la inmunidad y en el mantenimiento de una microbiota intestinal saludable. Esta comprensión del colon no solo es crucial para el diseño de sistemas de liberación colónica eficientes sino también para identificar desafíos y oportunidades en el tratamiento de enfermedades específicas del colon. La siguiente sección de la introducción discute los sistemas de liberación colónica de fármacos. Aquí se examinan los avances recientes en esta área, resaltando cómo estas tecnologías ofrecen un enfoque más dirigido y menos invasivo para el tratamiento de enfermedades del colon, como la colitis ulcerosa y la enfermedad de Crohn, además de ciertas enfermedades sistémicas. La discusión se centra en la importancia de una liberación precisa de fármacos en el colon, lo que puede mejorar la eficacia del tratamiento y minimizar los efectos secundarios. Se examinan varias estrategias de diseño de sistemas de liberación, incluyendo el uso de recubrimientos sensibles al pH, profármacos y polímeros bioadhesivos, proporcionando un panorama integral de las metodologías actuales y sus limitaciones. El núcleo de la introducción se centra en los hidrogeles de polisacáridos. Estos materiales, por su alta capacidad de hidratación y porosidad, representan una plataforma prometedora para la liberación controlada de fármacos. Se profundiza en cómo estos hidrogeles pueden ser diseñados para responder a estímulos específicos del colon, como cambios en el pH o la temperatura, permitiendo así una liberación más específica y eficiente de los medicamentos. Se discuten las aplicaciones potenciales de los hidrogeles en diversas formas de administración, desde sistemas orales hasta tópicos y transdérmicos, resaltando su versatilidad y eficacia. Finalmente, la parte final de la introducción se dedica a las gomas naturales y su papel en la formulación de sistemas de liberación de fármacos. Se examina cómo estas gomas, debido a sus propiedades de gelificación, viscosidad y biocompatibilidad, son esenciales en la mejora de la eficacia, estabilidad y aceptabilidad de los medicamentos. Además, se analiza su biodegradabilidad, lo 5 que las convierte en opciones atractivas y seguras para aplicaciones farmacéuticas. El objetivo principal de esta tesis ha sido desarrollar hidrogeles de polisacáridos con la capacidad de liberar diversos fármacos a nivel del colon para el tratamiento de patologías locales. El trabajo se ha dividido en cuatro secciones o capítulos con objetivos específicos. En el primer capítulo, nos enfocamos en el desarrollo de los hidrogeles de polisacáridos para la liberación local de fármacos en el colon. Se seleccionaron la goma xantana y la goma garrofina como principales componentes, el acetónido de triamcinolona y el ciprofloxacino como principios activos, y se utilizó el método de formación de xerogeles mediante un procedimiento de compresión. Este capítulo aborda el estudio de las interacciones entre los diferentes componentes y su impacto sobre la liberación de los principios activos. En el segundo capítulo, se examina la capacidad bioadhesiva en mucosas de los xerogeles de polisacáridos. Aunque esta propiedad no es esencial para su uso en la liberación colónica de fármacos, podría abrir la posibilidad de emplearlos en la liberación de fármacos en mucosas como la vaginal o la oral. El tercer capítulo evalúa el efecto de un tercer excipiente, las ciclodextrinas, en las propiedades de liberación de los hidrogeles. Se estudia su impacto en la difusión de los principios activos a través de los hidrogeles y en su liberación. Finalmente, en el capítulo 4 se evalúa la efectividad de los hidrogeles de polisacáridos que contienen acetónido de triamcinolona en un modelo animal de colitis inducida mediante TNBS. Se describe el modelo y se compara el efecto sobre la patología de la administración oral de los hidrogeles con una disolución acuosa del corticoide y con una espuma rectal comercial. La tesis concluye con una evaluación de los resultados obtenidos y su impacto en el campo de la farmacología. Se discuten las implicaciones de estos sistemas de liberación colónica en el tratamiento de enfermedades del colon y cómo pueden ofrecer soluciones más eficientes y menos invasivas que los métodos tradicionales. Además, se plantean futuras direcciones de investigación, incluyendo el desarrollo de hidrogeles inteligentes y la exploración de nuevas aplicaciones terapéuticas. 6 En resumen, esta investigación no solo proporciona una visión valiosos sobre la liberación colónica de fármacos, sino que también abre caminos para innovaciones futuras en el tratamiento de enfermedades del colon y otras afecciones relacionadas, marcando un avance significativo en la farmacología moderna y en la mejora de la calidad de vida de los pacientes. 7 INTRODUCCIÓN 8 9 INTRODUCCIÓN 1 EL COLON El colon, también conocido como intestino grueso, es la parte final del sistema digestivo, que se extiende desde el intestino delgado hasta el recto. Es un órgano tubular de aproximadamente 1,5 metros de longitud que desempeña un papel esencial en la digestión y la salud humana. Funcionalmente, el colon desempeña roles fundamentales en el proceso digestivo. En comparación con el intestino delgado, el colon no tiene un rol principal en la absorción de alimentos y nutrientes. Las funciones principales del colon son la reabsorción de agua y electrolitos (1–3), así como la fermentación de materiales no absorbidos (4,5). El colon también desempeña un papel importante en el sistema inmunitario (6). Las células del colon producen anticuerpos y otros factores que ayudan a proteger al cuerpo de infecciones. A medida que los materiales no digeridos avanzan por el colon, el agua se reabsorbe a través de la pared intestinal. Este proceso es necesario para evitar la deshidratación y para formar heces sólidas. Los electrolitos también se 16 evolucionar a cáncer. Los síntomas incluyen cambios en los hábitos intestinales, presencia de sangre en las heces, dolor abdominal continuo, anemia y pérdida de peso inexplicada. La detección precoz mediante colonoscopia es vital para un tratamiento efectivo. - Diverticulitis: Se refiere a la inflamación de los divertículos en las paredes del colon. Puede manifestarse con dolor abdominal, fiebre y cambios en los hábitos intestinales. Aunque su causa exacta es incierta, se asocia con dietas bajas en fibra. - Enfermedades infecciosas del colon: Incluyen colitis infecciosa causada por bacterias, virus y parásitos, que pueden provocar inflamación y diarrea. Ejemplos destacados son la infección por Clostridium difficile, la gastroenteritis viral y la amebiasis. Estas condiciones requieren diagnóstico y tratamiento rápidos para evitar complicaciones. - Colitis isquémica: Ocurre por una disminución del flujo sanguíneo al colon, causando inflamación y daño. Es más frecuente en adultos mayores y puede deberse a aterosclerosis u otras condiciones que afectan la circulación. - Colitis microscópica: Caracterizada por diarrea crónica y cambios inflamatorios en el colon visibles solo bajo el microscopio. Se divide en colitis colágena y colitis linfocítica. El tratamiento varía según la enfermedad específica e incluye cambios dietéticos y de estilo de vida, medicación (antiinflamatorios, antibióticos, inmunosupresores) y, en algunos casos, cirugía. Se adopta un enfoque terapéutico personalizado, basado en la gravedad de la enfermedad, los síntomas del paciente y su respuesta al tratamiento previo. 17 Tabla 1 - Familias farmacológicas de uso más frecuente en el tratamiento de enfermedades colónicas. Enfermedad colónica Tratamientos farmacológicos más frecuentes Enfermedad inflamatoria intestinal Aminosalicilatos, corticoides y antibióticos entre otros (16–20) Síndrome del intestino irritable Agentes antidiarreicos entre otros (21) Cáncer de colon Quimioterápicos entre otros (22) Diverticulitis Antibióticos y aminosalicilatos entre otros (23) Enfermedades infecciosas del colon Antivirales y antibióticos entre otros (24,25) Colitis isquémica Antibióticos entre otros (26) Colitis microscópica Corticoides y agentes antidiarreicos entre otros (27,28) En conclusión, las enfermedades del colon abarcan un amplio espectro de condiciones que requieren una evaluación cuidadosa y un enfoque de manejo multidisciplinario. Los avances continuos en la comprensión de la fisiopatología del colon están mejorando las estrategias de prevención, diagnóstico y tratamiento de estas enfermedades. Aunque existen variedad de fármacos para el tratamiento o mitigación de los síntomas de las enfermedades colónicas, muchos de ellos poseen efectos adversos no deseados cuando se administran a nivel sistémico. Por ello, el desarrollo de sistemas de liberación colónica de fármacos ha suscitado un gran interés. Estos sistemas tienen el objetivo de liberar el principio activo específicamente en el lugar de acción, consiguiendo de esta forma aumentar el efecto farmacológico a nivel local reduciendo, a su vez, la exposición sistémica y, por tanto, la aparición de efectos adversos (29–33). 2 SISTEMAS DE LIBERACIÓN COLÓNICA DE FÁRMACOS Los sistemas de liberación colónica de fármacos son una tecnología emergente ya que son herramientas prometedoras para el tratamiento de enfermedades inflamatorias del intestino, como la colitis ulcerosa, la enfermedad de Crohn, el cáncer de colon y la amebiasis, tanto por administración sistémica como tópica. 18 Se destaca la importancia de la vía oral para la administración de fármacos, siendo el colon un sitio potencial para la liberación de medicamentos, especialmente para tratar enfermedades del colon, aunque también para el tratamiento de determinadas enfermedades sistémicas al proporcionar el colon un ambiente favorable que ofrece ventajas terapéuticas. El objetivo principal de los sistemas de liberación colónica de fármacos es la entrega precisa y controlada de medicamentos al colon, aprovechando sus características fisiológicas y bioquímicas únicas de éste. Esto asegura un tratamiento directo en el sitio de la enfermedad, permite una menor dosificación de principio activo y reduce los efectos secundarios (32–35). A continuación, se enumeran las principales características y ventajas de los sistemas de liberación colónica de fármacos. - Target específico: En el tratamiento de enfermedades colónicas como la colitis ulcerosa, el cáncer colorrectal y la enfermedad de Crohn, los sistemas de liberación colónica de fármacos ayudan a mejorar la eficacia de los tratamientos al conseguir mayores concentraciones de principio activo en el lugar de acción. Esto también ayuda a minimizar los efectos secundarios, al reducir la exposición sistémica al principio activo. - Entorno favorable para péptidos y proteínas: El colon ofrece un entorno más amigable para los péptidos y proteínas en comparación con el tracto gastrointestinal superior, lo cual es beneficioso para su estabilidad y eficacia y puede favorecer la biodisponibilidad de estos tras su administración oral (36,37). - Minimización del metabolismo de primer paso de esteroides: Los sistemas de liberación colónica de fármacos permiten evitar en gran medida el metabolismo de primer paso de los esteroides, mejorando su biodisponibilidad (34,38). - Prevención de la irritación gástrica: Al evitar, tras la administración oral, una liberación significativa de principio activo en el tracto intestinal superior. De esta forma, los sistemas de liberación colónica de fármacos previenen la irritación gástrica que podrían causar algunos medicamentos, como los antiinflamatorios no esteroideos (AINEs). - Liberación retardada de fármacos: Los sistemas de liberación colónica de fármacos también pueden ser utilizados para la liberación retardada de fármacos en el tratamiento de afecciones como la angina, el asma y la artritis reumatoide (34). 19 Existen varios métodos para diseñar sistemas de liberación colónica de fármacos, cada uno con sus propias ventajas y desventajas. Los métodos más comunes incluyen: - Síntesis de profármacos: El objetivo es sintetizar un compuesto inactivo a través de enlaces no degradables por el cuerpo humano. Una vez los profármacos alcanzan el colon, la presencia de enzimas específicas provenientes de la microflora colónica, consiguen romper estos enlaces liberando el fármaco con actividad. Hay varios métodos descritos para la síntesis de profármacos para su liberación en el colon: conjugaciones a través de enlaces azoicos, glicosídicos, o glucurónicos entre otros (38,39). - Recubrimientos con polímeros sensibles al pH: Utiliza polímeros sensibles al pH para revestir formas de dosificación de forma que liberan el fármaco únicamente en el pH más alto del colon (40). - Formulación de hidrogeles sensibles al pH: Emplea hidrogeles que se hinchan en el ambiente de pH elevado del colon, liberando el fármaco. - Uso de polímeros bioadhesivos: Utiliza polímeros bioadhesivos que se adhieren a la membrana mucosa del colon, mejorando la retención y la liberación localizada del fármaco. - Uso de sistemas basados en polisacáridos: Estos sistemas utilizan polisacáridos que son degradados por la microflora colónica, lo que permite la liberación del fármaco en el colon (41–45). - Sistemas basados en tiempo: El uso de sistemas de liberación pulsátil que presentan un retraso predeterminado antes de liberar rápidamente el fármaco en el colon, teniendo en cuenta el tiempo de tránsito gastrointestinal (46). - Sistemas de liberación osmótica: Sistemas que, a través del uso de membranas semipermeables, utilizan la presión osmótica generada dentro de un dispositivo para liberar el fármaco a través de un orificio en el colon (47). El desarrollo de sistemas de liberación colónica de fármacos no está exento de una serie de desafíos, entre los que se pueden destacar: - Dificultad para acceder al colon: El colon es una región del tracto gastrointestinal que es relativamente difícil de alcanzar en comparación con otras partes del sistema digestivo. - Variabilidad en el tiempo de tránsito a través del tracto gastrointestinal: El tiempo de tránsito a través del colon es altamente variable y puede verse 20 influenciado por numerosos factores, como la dieta, el estrés, las condiciones de la enfermedad y los medicamentos. Estas diferencias podrían afectar a la eficacia de los sistemas de liberación. - Requisitos de solubilidad del fármaco: El contenido de fluido en el colon es más bajo y viscoso que en el tracto gastrointestinal superior, lo que podría ser un factor limitante para la absorción de fármacos poco solubles. - Superficie menor y uniones estrechas en el colon: La menor área superficial y la mayor densidad de las uniones estrechas en el colon comparado con otras regiones del tracto gastrointestinal podrían restringir el transporte de fármacos a través de la mucosa hacia la circulación sistémica. - Interacción con la microbiota: La variabilidad en la composición de la microbiota colónica puede influir en la efectividad del sistema de liberación basados en este principio. Como se ha descrito anteriormente, la liberación colónica de fármacos está emergiendo como una estrategia prometedora en el tratamiento de enfermedades locales y sistémicas. La investigación continua en el campo se centra en mejorar la precisión de la liberación, aumentar la estabilidad de los fármacos y explorar nuevas aplicaciones terapéuticas. Con el avance de la tecnología y una mejor comprensión de la fisiología del colon y la microbiota, se espera que estos sistemas ofrezcan soluciones innovadoras y más eficientes para el tratamiento de diversas enfermedades. En la actualidad, los sistemas de liberación colónica de fármacos se están investigando para una variedad de aplicaciones clínicas, incluyendo: - Enfermedades inflamatorias intestinales: Los sistemas de liberación colónica de fármacos se utilizan para el tratamiento de la colitis ulcerosa y la enfermedad de Crohn. Estos sistemas de liberación pueden liberar fármacos de manera efectiva directamente en el sitio de inflamación en el colon. - Cáncer de colon: Los sistemas de liberación colónica de fármacos se utilizan para la administración de fármacos quimioterapéuticos para el cáncer de colon buscando también una liberación localizada. - Amebiasis: Esta es una infección parasitaria que afecta principalmente al intestino grueso, y los sistemas de liberación colónica de fármacos pueden ser útiles para entregar fármacos directamente al colon para tratar esta enfermedad. 21 - Diversas enfermedades intestinales: Incluyendo diarrea y condiciones asociadas con la inflamación intestinal y el daño a la mucosa. - Otras enfermedades: Los sistemas de liberación colónica de fármacos se están investigando para el tratamiento de una variedad de otras enfermedades para las que se necesita una absorción sistémica de los fármacos administrados. Entre ellas se encuentran enfermedades como la diabetes, la osteoporosis, la angina de pecho, el asma, la artritis reumatoide o la obesidad. 3 HIDROGELES PARA LIBERACIÓN DE FÁRMACOS Los hidrogeles, dentro del campo de la tecnología farmacéutica y la ingeniería biomédica, representan un avance significativo como sistemas de liberación de fármacos. Los hidrogeles. son redes poliméricas tridimensionales e hidrofílicas que tienen la capacidad de absorber y retener grandes cantidades de agua o fluidos biológicos. Estas redes están compuestas de homopolímeros o copolímeros y son insolubles debido a la presencia de enlaces cruzados químicos o físicos, como entrelazamientos. Los hidrogeles son notablemente compatibles con el agua, permitiendo que se hinchen en medios acuosos. Además, su alta concentración de agua y consistencia suave los hace parecidos a los tejidos biológicos naturales, contribuyendo a su biocompatibilidad (48). Los hidrogeles poseen unas características únicas para ser utilizados en la modulación de la liberación de fármacos: - Alta capacidad de hidratación e hinchamiento: Los hidrogeles tienen una estructura de red tridimensional que les permite absorber grandes cantidades de agua o fluidos biológicos. Pueden hincharse en respuesta a varios estímulos ambientales y fisiológicos como el pH, la temperatura y la fuerza iónica, lo que es esencial para su uso en sistemas de liberación de fármacos sensibles a estímulos. - Biocompatibilidad: Su alta concentración de agua y su consistencia suave similar a los tejidos naturales les confieren una excelente biocompatibilidad, lo que es fundamental para aplicaciones biomédicas. - Sensibilidad a estímulos ambientales: Los hidrogeles pueden ser diseñados para responder a cambios específicos en su entorno, como 22 variaciones en la temperatura, el pH y otros factores, lo que permite una liberación controlada y específica de fármacos. - Diversidad en la composición y estructura: Existe una amplia variedad en la composición de los hidrogeles, incluyendo diferencias en los grupos laterales (neutros o iónicos) y en la estructura física de las redes (amorfas, semicristalinas, etc.), lo que permite una gran versatilidad en su diseño y funcionalidad. - Propiedades mecánicas ajustables: Los hidrogeles pueden ser diseñados con diferentes grados de resistencia y elasticidad, lo cual es crucial para mantener su integridad estructural en diversas aplicaciones farmacéuticas. - Diseño de liberación controlada de fármacos: La estructura de los hidrogeles, incluyendo el tamaño de malla y la densidad de entrecruzamiento, puede ser ajustada para controlar la liberación de fármacos, lo que es fundamental para el diseño de sistemas de liberación de fármacos efectivos. Estas características hacen que los hidrogeles sean altamente funcionales y adaptables para una amplia gama de aplicaciones, especialmente en el campo de la administración controlada de fármacos al poder ajustar las formulaciones para que respondan a condiciones específicas del cuerpo. En la actualidad, las aplicaciones de los hidrogeles en la liberación de fármacos son muy variadas. Entre sus usos principales se encuentran los siguientes. - Sistemas de liberación controlada de fármacos: Los hidrogeles son ideales para el diseño de formulaciones que requieren la liberación sostenida o controlada de medicamentos. Tienen la capacidad de controlar la velocidad y el lugar de liberación del fármaco, lo cual es especialmente útil en tratamientos que requieren dosis precisas y liberación sostenida, reduciendo la frecuencia de administración y mejorando la adherencia al tratamiento. - Sistemas de liberación de fármacos sensibles a estímulos: Como se ha descrito anteriormente, algunos hidrogeles pueden responder a cambios en el ambiente como el pH, la temperatura y la fuerza iónica, lo que permite la creación de sistemas de liberación que se activan o modifican en respuesta a condiciones específicas del cuerpo o del entorno. - Liberación de fármacos en sitios específicos: Por su capacidad para hincharse y adherirse a tejidos específicos, los hidrogeles se utilizan para 23 dirigir fármacos a lugares concretos dentro del cuerpo, como el estómago, intestino delgado, colon y la cavidad oral. En forma de parches o geles, pueden ser aplicados sobre la piel o membranas mucosas, liberando el fármaco de manera controlada a través de la epidermis. - Aplicaciones en diversas rutas de administración: Su biocompatibilidad convierte a los hidrogeles en compuestos versátiles, ya que pueden emplearse para la administración de fármacos por multitud de vías oral, rectal, ocular, vaginal, epidérmica y subcutánea. - Liberación de péptidos y proteínas: Los hidrogeles protegen fármacos sensibles de la degradación enzimática, asegurando su entrega efectiva al sitio de acción. Su uso es significativo en la liberación de grandes moléculas como péptidos y proteínas, que son difíciles de administrar eficazmente mediante métodos convencionales. - Sistemas de liberación localizada: Los hidrogeles pueden usarse para la liberación localizada de fármacos en tratamientos de enfermedades específicas, como enfermedades periodontales, afecciones orales u oculares. Se utilizan en la formulación de lentes de contacto medicados y gotas oculares para la liberación sostenida de fármacos en el tratamiento de afecciones oculares. - Aplicaciones biomédicas diversas: Además de su uso en la liberación de fármacos, los hidrogeles tienen aplicaciones en áreas como biosensores, materiales para contactos y como componentes en preparaciones de proteínas o enzimas conjugadas. Estos usos reflejan la versatilidad y eficacia de los hidrogeles en el campo farmacéutico, particularmente en la creación de sistemas avanzados de liberación de fármacos. La investigación en el campo de los hidrogeles continúa explorando nuevas síntesis y modificaciones químicas para mejorar su funcionalidad y eficacia. El desarrollo de hidrogeles inteligentes, que pueden cambiar sus propiedades en respuesta a estímulos específicos, abre nuevas posibilidades para terapias personalizadas y precisas. En conclusión, los hidrogeles son sistemas de liberación de fármacos que ofrecen numerosas ventajas, incluyendo la capacidad de liberación controlada, alta biocompatibilidad y sensibilidad a estímulos ambientales. Representan una herramienta prometedora en la mejora de la eficacia y seguridad de los tratamientos farmacológicos, con un potencial considerable para innovaciones 24 futuras en el campo de la medicina y la farmacia. Su desarrollo y aplicación continúan siendo un área de investigación activa y de gran interés en la búsqueda de soluciones terapéuticas avanzadas. 4 GOMAS NATURALES Las gomas naturales son polisacáridos de origen natural que se extraen de diversas fuentes. Se caracterizan por su capacidad para formar geles y soluciones viscosas cuando se disuelven en agua. Esta propiedad les confiere un valor único en múltiples aplicaciones, lo que las convierte en un componente significativo con diversas aplicaciones industriales, incluyendo el sector farmacéutico. Las gomas naturales son excipientes ampliamente utilizados tanto en formas de dosificación convencionales como en otras más novedosas. Destaca el interés creciente en los polímeros de origen natural en el mundo farmacéutico y la conformidad con su uso en formulaciones. En años recientes, ha habido un desarrollo significativo en productos naturales para diversos propósitos. Las gomas naturales tienen ventajas sobre las sintéticas, ya que son químicamente inertes, no tóxicas, menos costosas, biodegradables y ampliamente disponibles. Además, pueden ser modificadas de diversas maneras para obtener materiales a medida para sistemas de administración de medicamentos (49,50). Goswami S. y Naik S. (49), clasifican las gomas naturales en función de los distintos factores descritos a continuación. - Según la carga: o Polisacáridos aniónicos: Incluyen ácido algínico, pectina, goma xantana, ácido hialurónico, sulfato de condroitina, goma arábiga, goma karaya y goma tragacanto. o Polisacáridos catiónicos: Como el quitosano y la goma guar catiónica. o Polisacáridos no iónicos: Como el almidón, dextrinas y goma guar. o Polisacáridos anfotéricos: Como carboximetilquitosano. o Polisacáridos hidrofóbicos: Como la cetil hidroxietilcelulosa. - Según la fuente: o Origen marino/algas (algas marinas): Incluyen agar, carragenanos, ácido algínico y laminarina. 25 o Origen vegetal: Exudados de arbustos/árboles como goma arábiga, goma ghatti, goma karaya, goma tragacanto, gomas de Khaya y Albizia; gomas de semillas como goma guar y goma garrofina; extractos como pectina y goma de alerce; y gomas de tubérculos y raíces como almidón de patata. o Origen animal: Como quitina y quitosano, sulfato de condroitina y ácido hialurónico. o Origen microbiano (bacteriano y fúngico): Como la goma xantana, dextrina, curdian, pullulano, emulsan, glicano de levadura, esquizofílan, lentinan, krestin y scleroglucan. o Gomas preparadas: Como gomas biosintéticas, almidón y sus derivados, y derivados de celulosa. - Según la forma: o Lineal: Como los alginatos, amilosa, celulosa y pectinas. o Reticulada: Con ramificaciones cortas como la goma xantana, xilano, galactomananos; y ramificaciones sobre ramificaciones como amilopectina, goma arábiga y tragacanto. - Según las unidades monoméricas en la estructura química: o Homoglucanos: Como la amilosa, arabinanas y celulosa. o Diheteroglucanos: Como los alginatos, carragenanos y galactomananos. o Tri-heteroglucanos: Como los arabinoxilanos, gellan y la goma xantana. o Tetra-heteroglucanos: Como goma arábiga y goma de semilla de psyllium. o Penta-heteroglucanos: Como goma ghatti y tragacanto. Esta clasificación destaca la diversidad y complejidad de las gomas naturales, así como su amplio rango de aplicaciones en diversas industrias, entre las que se incluye la farmacéutica. Las características principales de las gomas naturales que las hacen interesantes para su uso en sistemas de liberación de fármacos, son las siguientes: - Biocompatibilidad y baja toxicidad: Las gomas naturales son biocompatibles y tienen una baja toxicidad, lo que las hace adecuadas para su uso en aplicaciones farmacéuticas. Estas características aseguran que no causarán daño o reacciones adversas cuando se utilicen en sistemas de administración de medicamentos. 32 para lograr el efecto deseado y de su fondo aceptable en los alimentos no se consideró un peligro para la salud. En términos de regulación, la goma garrofina está listada como GRAS, incluida en la Base de Datos de Ingredientes Inactivos de la FDA (para comprimidos orales y barras masticables), en medicamentos no parenterales autorizados en el Reino Unido, y aceptada para su uso en Europa como aditivo alimentario. También está incluida en la Base de Datos Canadiense de Ingredientes de Productos Naturales para la Salud. Ha sido utilizada terapéuticamente en formulaciones orales para controlar el vómito y la diarrea en adultos y niños, y se utiliza en formulaciones de liberación controlada aprobadas en Europa y Estados Unidos (51). En resumen, la goma garrofina es un ingrediente versátil con amplias aplicaciones en las industrias alimentaria y farmacéutica, valorada por sus propiedades de espesamiento, estabilización, y como fibra soluble beneficiosa para la salud. 5 PRINCIPIOS ACTIVOS 5.1 Acetónido de triamcinolona El acetónido de triamcinolona, de nombre químico (1S,2S,4R,8S,9S,11S,12R,13S)- 12-fluoro-11-hydroxy-8-(2-hydroxyacetyl)-6,6,9,13-tetramethyl-5,7dioxapentacyclo[10.8.0.02,9.04,8.013,18]icosa-14,17-dien-16-one es un polvo cristalino blanco o casi blanco. Muestra polimorfismo. Es prácticamente insoluble en agua y ligeramente soluble en alcohol deshidratado, cloroformo y en alcohol metílico. Debe ser protegido de la luz. Tiene un peso molecular de 434,5 g/mol y la estructura molecular que se muestra en la Figura 4 (59,60). 33 Figura 4 - Estructura molecular del acetónido de triamcinolona (60). La triamcinolona es un corticoesteroide sintético con actividad principalmente glucocorticoide, un grupo de corticoesteroides que afectan el metabolismo de los carbohidratos (gluconeogénesis, deposición de glucógeno en el hígado, elevación del azúcar en sangre), inhiben la secreción de hormona adrenocorticotrópica y poseen una actividad antiinflamatoria pronunciada. También juegan un papel en el metabolismo de grasas y proteínas, el mantenimiento de la presión arterial, la alteración de la respuesta del tejido conectivo ante lesiones, la reducción en el número de linfocitos circulantes y el funcionamiento del sistema nervioso central. 4 mg de triamcinolona equivalen en actividad antiinflamatoria a aproximadamente 5 mg de prednisolona. Se utiliza, ya sea en forma del alcohol libre o en una de las formas esterificadas (de las que forma parte el acetónido). Está disponible en multitud de formas farmacéuticas, para ser administradas por todo tipo de vías desde la parenteral, intramuscular, intraarticular, a la vía tópica para el tratamiento de todo tipo de procesos inflamatorios y antialérgicos. Posee también actividad inmunosupresora. Estos agentes suprimen la función inmune mediante uno de varios mecanismos de acción. Los inmunosupresores citotóxicos clásicos actúan inhibiendo la síntesis de ADN. Otros pueden actuar a través de la activación de células T o inhibiendo la activación de células auxiliares. Mientras que la inmunosupresión se ha logrado en el pasado 34 principalmente para prevenir el rechazo de órganos trasplantados, están surgiendo nuevas aplicaciones que involucran la mediación de los efectos de las interleucinas y otros citocinas (59,60). Los corticosteroides son generalmente bien absorbidos desde el tracto gastrointestinal y también cuando se administran localmente. Después de su uso tópico, especialmente bajo un vendaje oclusivo o en piel lesionada, o su uso rectal como enema, puede absorberse suficiente cantidad para producir efectos sistémicos; esto también puede ocurrir con otras vías de administración local como la inhalación. Las formas solubles en agua de los corticosteroides se administran por inyección intravenosa para una respuesta rápida, mientras que las formas liposolubles se usan para efectos más prolongados mediante inyección intramuscular. Los corticosteroides se distribuyen rápidamente por todos los tejidos del cuerpo, cruzan la placenta en diferentes grados y pueden distribuirse en pequeñas cantidades en la leche materna. En la circulación, la mayoría de los corticosteroides están ampliamente unidos a proteínas plasmáticas, principalmente a globulina y en menor medida a albúmina. La globulina de unión a corticosteroides (transcortina) tiene alta afinidad, pero baja capacidad de unión, mientras que la albúmina tiene baja afinidad pero gran capacidad de unión. Los corticosteroides sintéticos están menos unidos a proteínas que la hidrocortisona (cortisol) y tienden a tener vidas medias más largas. Los corticosteroides se metabolizan principalmente en el hígado, pero también en otros tejidos, y se excretan en la orina. El metabolismo más lento de los corticosteroides sintéticos, junto con su menor afinidad de unión a proteínas, puede explicar su mayor potencia en comparación con los corticosteroides naturales. Específicamente la triamcinolona tiene una vida media en plasma de aproximadamente 2 a más de 5 horas, y se une a la albúmina plasmática en menor medida que la hidrocortisona. Los ésteres de triamcinolona, como el acetónido, diacetato y hexacetonida, se absorben muy lentamente en los sitios de inyección. También se señala que la triamcinolona atraviesa la placenta. Según Derendorf H. y colaboradores (61), el acetónido de triamcinolona administrado de diferentes maneras, muestra patrones farmacocinéticos distintos. Cuando se administra intravenosamente (2 mg), se elimina rápidamente con una velocidad de 37 L/h y una vida media de 2,0 horas, mientras que la biodisponibilidad oral promedio es del 23%. Por otro lado, la administración oral de 5 mg alcanza niveles máximos de 10,5 ng/mL en una hora. 35 Siguiendo el sistema de clasificación biofarmacéutico, el acetónido de triamcinolona se clasifica como un BCS clase IV, debido a su baja solubilidad y permeabilidad (62). Los corticoesteroides pueden causar efectos adversos por su acción mineralocorticoide o glucocorticoide, o por inhibir el eje hipotalámico-pituitarioadrenal. Los efectos mineralocorticoides incluyen retención de sodio y agua, edema, hipertensión y excreción de potasio, pudiendo causar alcalosis hipopotasémica y, en algunos casos, insuficiencia cardíaca. Los efectos adversos glucocorticoides conducen a la movilización de calcio y fósforo, osteoporosis, fracturas espontáneas, atrofia muscular, hiperglucemia y aumento del apetito. También pueden afectar la reparación de tejidos y la función inmune, aumentando la susceptibilidad a infecciones. Otros efectos adversos incluyen irregularidades menstruales, cambios en la piel, alteraciones oculares, mentales y neurológicas, hipertensión intracraneal, pancreatitis aguda, necrosis avascular del hueso y aumento de la coagulabilidad sanguínea. Los corticoesteroides pueden causar síntomas de Cushing y, en altas dosis, colapso cardiovascular. Las reacciones de hipersensibilidad son posibles, especialmente con aplicación tópica. Los efectos adversos deben manejarse reduciendo o retirando gradualmente la dosis de corticoesteroides (59). En general, las dosis altas de triamcinolona pueden tener una mayor tendencia a producir miopatía proximal y sus efectos en la retención de sodio y agua son menores que los de la prednisolona. Cuando se aplica tópicamente, especialmente en áreas grandes, en piel lesionada, bajo vendajes oclusivos o cuando se administra por vía intranasal, los corticoesteroides pueden absorberse en cantidades suficientes como para causar efectos sistémicos. Sobre la hipersensibilidad, se han atribuido reacciones locales a las preparaciones tópicas de triamcinolona al contenido de etilendiamina. Sin embargo, también se han reportado casos de shock anafiláctico después de inyecciones intraarticulares o intramusculares de acetónido de triamcinolona. Estos efectos destacan la importancia de un uso cuidadoso y monitoreado de este medicamento, especialmente en tratamientos prolongados o en dosis altas. Con todo lo expuesto, el acetónido de triamcinolona se considera un candidato idóneo para ser formulado en sistemas de liberación colónica de fármacos, con el objetivo principal de limitar la absorción en las primeras etapas del tracto gastrointestinal y aumentar la dosis en el lugar de acción. 36 5.2 Ciprofloxacino El ciprofloxacino, de nombre químico 1-cyclopropyl-6-fluoro-4-oxo-7-piperazin1-ylquinoline-3-carboxylic acid, es un polvo cristalino casi blanco o amarillo pálido, ligeramente higroscópico. Prácticamente insoluble en agua; muy ligeramente soluble en alcohol deshidratado y en diclorometano. Almacenar en recipientes herméticos y proteger de la luz. Tiene un peso molecular de 331,34 g/mol y la estructura molecular que se muestra en la Figura 5 (59,63). Figura 5 - Estructura molecular del ciprofloxacino (63). El ciprofloxacino es una fluoroquinolona sintética de segunda generación que ha generado muchos antibióticos derivados. Está presente en productos para administración oral, intravenosa, intratimpánica, oftálmica y ótica para una serie de infecciones bacterianas. El primer producto que contenía ciprofloxacina fue aprobado por la FDA el 22 de octubre de 1987. Está considerado un compuesto antimicrobiano de amplio espectro. La acción bactericida del ciprofloxacino 37 resulta de la inhibición de las enzimas topoisomerasa II (DNA girasa) y topoisomerasa IV, que son necesarias para la replicación, transcripción, reparación, reparación de superenrollamiento de hebras y recombinación del ADN bacteriano (63). El ciprofloxacino es un medicamento que se absorbe rápidamente y bien a través del tracto gastrointestinal. Tiene una biodisponibilidad oral de aproximadamente el 70 al 80%, alcanzando una concentración sérica máxima de alrededor de 2,4 microgramos/mL entre 1 y 2 horas después de una dosis oral de 500 mg. La absorción de los comprimidos de ciprofloxacino puede retrasarse por la presencia de alimentos, pero en general no se ve sustancialmente afectada. La unión a proteínas plasmáticas varía entre el 20 y el 40%. El ciprofloxacino se distribuye ampliamente en el cuerpo y penetra bien en los tejidos. Aparece en el líquido cefalorraquídeo, aunque las concentraciones son solo aproximadamente el 10% de las presentes en el suero cuando las meninges no están inflamadas. Cruza la placenta y se distribuye en la leche materna, alcanzando concentraciones altas en la bilis. Su vida media de eliminación es de aproximadamente 3 a 5 horas, con evidencia de una acumulación modesta. Esta vida media puede prolongarse en casos de insuficiencia renal (se ha informado un valor de 8 horas en enfermedad renal terminal) y en cierta medida en ancianos. Sin embargo, generalmente no es necesario ajustar la dosis en pacientes con insuficiencia renal a menos que sea grave; de manera similar, se pueden administrar las dosis habituales a personas mayores, excepto en aquellos con insuficiencia renal grave. Hay información limitada sobre el efecto de la insuficiencia hepática; la vida media de la ciprofloxacina se ha informado ligeramente prolongada en pacientes con cirrosis hepática grave. Con una o dos excepciones, la mayoría de los estudios han mostrado que la farmacocinética del ciprofloxacino no se ve afectada significativamente por la fibrosis quística. El ciprofloxacino se elimina principalmente a través de la excreción urinaria, pero la depuración no renal puede representar alrededor de un tercio de la eliminación e incluye metabolismo hepático, excreción biliar y posiblemente secreción transluminal a través de la mucosa intestinal. Se han identificado al menos 4 metabolitos activos. El oxociprofloxacino parece ser el principal metabolito urinario y el sulfociprofloxacino el principal metabolito fecal. La excreción urinaria se realiza mediante secreción tubular activa, así como por filtración glomerular, y se reduce con probenecid; se completa prácticamente en 24 horas. Alrededor del 40 al 50% de una dosis oral se excreta sin cambios en la orina y 38 aproximadamente el 15% como metabolitos. Hasta el 70% de una dosis parenteral puede ser excretada sin cambios en 24 horas y el 10% como metabolitos. La excreción fecal en 5 días ha representado el 20 al 35% de una dosis oral y el 15% de una dosis intravenosa (59). Siguiendo el sistema de clasificación biofarmacéutico, el ciprofloxacino se encuentra entre los BCS clase II y los III, ya que tiene un solubilidad alta por debajo de pH 6 pero baja por encima de este pH (64). Según la bibliografía consultada (59), el ciprofloxacino es generalmente bien tolerado, pero como con otras fluoroquinolonas, puede provocar una variedad de efectos secundarios. Estos efectos adversos son similares a los de quinolonas anteriores como el ácido nalidíxico. Los efectos más comunes afectan al tracto gastrointestinal, al sistema nervioso central o a la piel. Los trastornos gastrointestinales incluyen náuseas, vómitos, diarrea, dolor abdominal y dispepsia, siendo los efectos adversos más frecuentes. Casos raros de colitis pseudomembranosa, pancreatitis y disfagia también han sido reportados. En relación con el sistema nervioso central, los efectos más comunes son dolores de cabeza, mareos, confusión, insomnio e inquietud. Otros incluyen temblores, somnolencia, pesadillas, trastornos visuales y sensoriales, alucinaciones, reacciones psicóticas, depresión, convulsiones e hipertensión intracraneal. La parestesia y la neuropatía periférica también se han informado. Respecto a la piel, además de erupciones y prurito, se han dado reacciones de hipersensibilidad como vasculitis, eritema multiforme, síndrome de StevensJohnson y necrólisis epidérmica tóxica. La fotosensibilidad puede ocurrir, aunque es más frecuente con otras fluoroquinolonas como la lomefloxacina y esparfloxacina. La ciprofloxacina y algunas otras quinolonas han sido asociadas con casos de anafilaxia. Otros efectos adversos reportados con el ciprofloxacino incluyen cristaluria, aumentos transitorios en creatinina sérica o nitrógeno ureico en sangre y, raramente, insuficiencia renal aguda secundaria a nefritis intersticial. Se han observado valores elevados de enzimas hepáticas, ictericia y hepatitis, así como trastornos hematológicos como eosinofilia, leucopenia, trombocitopenia y, muy raramente, pancitopenia, anemia hemolítica o agranulocitosis. Los efectos adversos cardiovasculares incluyen taquicardia, hipotensión, edema, síncope, sofocos y sudoración. Algunas fluoroquinolonas pueden causar raramente 39 prolongación del intervalo QT y arritmias ventriculares, incluyendo torsade de pointes. Como con otros antibacterianos, la superinfección con organismos poco susceptibles al ciprofloxacino es posible, incluyendo Candida, Clostridium difficile y Streptococcus pneumoniae. Con todo lo expuesto, el ciprofloxacino se considera un buen candidato para ser formulado en sistemas de liberación colónica de fármacos, con el objetivo de tratar infecciones que afecten a la última porción de tracto gastrointestinal. 40 CAPÍTULO 1 Sinergia inducida por la presión de compresión en hidrogeles de goma xantana y goma garrofina. Efecto en la liberación de fármacos 41 48 el compartimento receptor se agitaba a 100 rpm. Los coeficientes de difusión, Dapp, se estimaron aplicando el modelo de Higuchi para sistemas semisólidos. 𝑄 𝐴=2𝐶0√𝐷𝑎𝑝𝑝 𝑡 𝜋 2 Ec. (1) donde Q/A representa la cantidad de fármaco liberado por unidad de área en el tiempo t, y C0 la concentración inicial del fármaco en el vehículo. La microviscosidad de las dispersiones se calculó utilizando la ecuación de Stokes-Einstein: 𝐷0·𝜂0=𝐷·𝜂 Ec. (2) donde D0 y η0 son el coeficiente de difusión del fármaco y las viscosidades en ausencia de polisacáridos, y D y η el coeficiente de difusión del fármaco y la microviscosidad en la dispersión de polisacáridos, respectivamente. 2.8 Propiedades de hinchamiento de los xerogeles Los xerogeles se obtuvieron por compresión directa de 500 mg de XAG, LBG y sus mezclas al 50% aplicando 5 toneladas durante 5 minutos. Los xerogeles se sumergieron en 250 ml de tampón ácido clorhídrico pH 1,2 y tampón fosfato pH 6,8 a 37 ± 0.5ºC. A las 2, 4, 6, 8, 10, 24, 30, 48 y 72 horas se retiraron los comprimidos del medio, el exceso de agua se secó cuidadosamente con papel y luego se registraron el diámetro, la altura y el peso. El grado de hinchamiento se calculó como la relación del volumen final al volumen inicial. La absorción de agua, expresada como gramos de tampón absorbidos por gramo de polisacárido seco, también se determinó. La prueba se realizó por triplicado. Para identificar el mecanismo de hinchamiento, los datos de absorción de agua y grado de hinchamiento se ajustaron a un modelo de difusión Fickiana de moléculas de agua hacia los xerogeles utilizando la siguiente ecuación: 49 𝑉𝑡 𝑉0=𝑘𝑡1 2 ⁄ or 𝑊𝑡 𝑊0=𝑘′𝑡1 2 ⁄ Ec. (3) Donde Vt/V0 y Wt/W0 representan el grado de hinchamiento y la absorción de agua en diferentes tiempos t, y k y k', son constantes dependientes del coeficiente de difusión del agua en el xerogel. Además, se investigó la evolución del hinchamiento, la difusión y el frente de erosión en ambos tampones con el tiempo. Para facilitar la detección de los diferentes frentes, se disolvió azul de metileno en los tampones. Los xerogeles se inmovilizaron entre dos láminas de vidrio de modo que el tampón solo penetrara a través de las capas laterales. La evolución de cada frente de las áreas se midió tomando fotografías en diferentes tiempos y analizando los frentes utilizando el software ImagePro Plus 6.0 (Media Cybernetic). 2.9 Ensayo de liberación Se añadieron 5 mg de acetónido de triamcinolona o 100 mg de ciprofloxacino a los polisacáridos para obtener xerogeles como se describió anteriormente, manteniendo el peso final constante en 500 mg. Los ensayos de liberación se llevaron a cabo en un aparato de disolución USP 2 con palas (Prolabo, París, Francia) conectado mediante una bomba peristáltica (HP 89092A) a un espectrofotómetro de diodo array (HP 8452A; Palo Alto, EE. UU.). El medio de liberación fue 450 ml de tampón de ácido clorhídrico pH 1,2 durante las primeras dos horas, y luego el pH se incrementó a 6,8 con la adición de un pequeño volumen de tampón fosfato pH 8,0 y NaOH 2M. De esta manera, se simuló el tránsito a través del tracto gastrointestinal con un tiempo de vaciado gástrico de 2 horas y un tiempo de tránsito intestinal de 24 horas. El medio se mantuvo bajo agitación a 100 rpm y 37 ± 0.5ºC. Todos los experimentos se llevaron a cabo con seis replicados de cada formulación. La cinética de liberación del fármaco se ajustó al modelo de Higuchi para formas cilíndricas delgadas: 50 𝑀𝑡 𝑀∞=𝐾𝑡1 2 ⁄ Ec. (4) donde Mt/M∞ es la fracción de fármaco liberada en cada punto de tiempo t, y K representa la constante cinética de liberación de Higuchi. 2.10 Análisis estadístico Los perfiles de liberación y de hinchamiento se ajustaron a las cinéticas más habituales y los resultados obtenidos para las diferentes formulaciones se compararon aplicando ANOVA multifactorial. 3 RESULTADOS Y DISCUSIÓN 3.1 Análisis de FTIR y DSC No se observaron cambios significativos en los espectros de FTIR ni en las curvas de DSC (Figura 7) de los polisacáridos después del proceso de compresión. De manera similar, la compresión de la mezcla de XAG y LBG tampoco mostró cambios significativos en comparación con los polisacáridos puros. El típico proceso de transición vítrea de los polisacáridos es evidente en las curvas de DSC con valores de temperatura de transición vítrea (Tg) de aproximadamente -10°C a -12°C, pero no se observaron cambios después de la compresión. Figura 7 - Gráficos DSC y espectros de FTIR de XAG, LBG y su mezcla 50/50 antes y después de la compresión aplicando una fuerza de 5 toneladas durante 5 minutos en un molde de matriz IR equipado con un troquel de 12 mm de diámetro. 51 3.2 Propiedades reológicas La dispersión acuosa de XAG sin comprimir mostró un perfil pseudoplástico de Bingham con un valor de esfuerzo de fluencia de 1,3 Pa (Figura 8). A valores bajos de tasa de cizallamiento (< 0,015 s-1), se observa un ligero aumento en la viscosidad con la tasa de cizallamiento. Por encima del esfuerzo de fluencia, las dispersiones mostraron un comportamiento de adelgazamiento por cizallamiento en el que la viscosidad disminuye gradualmente con el aumento de la tasa de cizallamiento. Sin embargo, la dispersión acuosa de LBG tuvo una viscosidad notablemente más baja con un comportamiento típico de adelgazamiento por cizallamiento (no se observó valor de esfuerzo de fluencia). Por otro lado, todas las mezclas muestran un comportamiento pseudoplástico de Bingham con un esfuerzo de fluencia variable dependiendo de la composición de la mezcla. Solo se observaron algunas diferencias en la viscosidad a valores pequeños de tasa de cizallamiento entre las mezclas de XAG/LBG sin comprimir (Figura 8); los valores de viscosidad a altas tasas de cizallamiento fueron similares para todas las mezclas, mostrando una viscosidad más baja que XAG pero un comportamiento muy diferente al observado para la dispersión de LBG. Las curvas de viscosidad a altas tasas de cizallamiento (después del esfuerzo de fluencia) se ajustaron al modelo de Ley de Potencia (relación de Ostwald de Waele), se calcularon la constante de ley de potencia n (índice de comportamiento del flujo) y el índice de consistencia K: 𝜂=𝐾𝛾𝑛−1 Ec. (5) donde η es la viscosidad aparente y γ la tasa de cizallamiento. La ecuación se ajusta adecuadamente a la viscosidad aparente después del esfuerzo de fluencia con valores de R2 > 0,99 y MRSE < 0,01. Para mezclas no comprimidas, los valores del índice de comportamiento de flujo n fueron < 1, correspondientes a sistemas que adelgazan por cizallamiento (Figura 8). XAG y sus mezclas muestran una mayor desviación del comportamiento newtoniano que LBG, y los valores de n 52 estuvieron bien correlacionados con la proporción de XAG/LBG, de acuerdo con la regla logarítmica aditiva. El índice de consistencia K (Figura 8) nos da una idea de la cohesión del fluido, de modo que cuanto mayor sea el valor de K, más viscosa será la dispersión. XAG muestra los valores más altos de K y LBG los más bajos. Curiosamente, todas las mezclas de XAG/LBG muestran valores de K similares independientemente de la proporción de XAG/LBG en la mezcla. Las dispersiones obtenidas después de la compresión de LBG apenas modifican el comportamiento reológico. Sin embargo, se observó una disminución en la viscosidad de la dispersión de XAG pre-comprimida, acompañada de una reducción en el índice de consistencia (K) de 3,62 a 2,96 Pa. (test F α < 0,01). Un comportamiento similar se detectó cuando las dispersiones de XAG se calentaron a temperaturas superiores a 45ºC (89). La viscosidad de las dispersiones de XAG depende de la estructura secundaria del polisacárido en solución. A bajas temperaturas, las cadenas laterales estaban orientadas lejos de la cadena principal, estableciendo interacciones intramoleculares que resultan en una conformación de hélice de cadena única ordenada y, a su vez, en dispersiones de alta viscosidad. Por encima de los 45ºC, se produce una ruptura de estas interacciones intramoleculares, permitiendo nuevas interacciones a través de los grupos metilo piruvato de las cadenas laterales y conduciendo a una estructura helicoidal rígida donde las cadenas laterales se pliegan a lo largo de la cadena principal. Esto resulta en una disminución de la viscosidad de la dispersión (70). De manera similar, el paso de pre-compresión puede haber causado cambios estructurales que persisten después de la dispersión en agua, lo que podría ser responsable de la menor viscosidad. 53 Figura 8 - Curvas de viscosidad versus tasa de cizallamiento para a) dispersiones de polisacáridos no comprimidas y b) comprimidas previamente, y relación y variación del c) índice de comportamiento de flujo "n" y d) el índice de consistencia "K" de las dispersiones de polisacáridos con la proporción XAG/LBG. En el caso de las mezclas de XAG/LBG, se observó un aumento significativo en los valores de viscosidad, especialmente en aquellas que contenían un 50% y 75% de XAG, lo que sugiere cambios en la interacción entre los dos polisacáridos debido al efecto de la presión. Estos cambios en el comportamiento también se mostraron claramente en la Figura 8 si comparamos las curvas de cambio porcentual en la viscosidad versus el esfuerzo de cizallamiento de polisacáridos no comprimidos y comprimidos previamente, calculados utilizando la ecuación propuesta por Walker y Wells: % 𝑐𝑎𝑚𝑏𝑖𝑜 𝑣𝑖𝑠𝑐𝑜𝑠𝑖𝑑𝑎𝑑=𝑣𝑖𝑠𝑐𝑜𝑠𝑖𝑑𝑎𝑑 𝑎𝑝𝑎𝑟𝑒𝑛𝑡𝑒−𝑣𝑖𝑠𝑐𝑜𝑠𝑖𝑑𝑎𝑑 𝑚𝑒𝑑𝑖𝑎 𝑐𝑎𝑙𝑐𝑢𝑙𝑎𝑑𝑎 𝑣𝑖𝑠𝑐𝑜𝑠𝑖𝑑𝑎𝑑 𝑚𝑒𝑑𝑖𝑎 𝑐𝑎𝑙𝑐𝑢𝑙𝑎𝑑𝑎 𝑥100 Ec. (6) y la viscosidad media calculada (𝜂𝑖 ) se estimó utilizando la regla logarítmica aditiva. 54 log𝜂𝑖  =𝑋𝑎log𝜂𝑎+𝑋𝑏log𝜂𝑏 Ec. (7) Figura 9 - Cambio porcentual en la viscosidad de las dispersiones de polisacáridos versus esfuerzo de cizallamiento a) muestras no comprimidas, b) muestras comprimidas previamente. Como se puede ver en los gráficos de la Figura 9, hubo diferencias en el cambio porcentual en la viscosidad tanto en las mezclas no comprimidas como en las pre-comprimidas. En el caso de las mezclas no comprimidas, los cambios se observaron principalmente para valores más bajos de esfuerzo de cizallamiento (< 2). Sin embargo, después de la compresión de las mezclas de polisacáridos, este comportamiento se modificó significativamente, especialmente en las muestras XAG/LBG 50%/50%. Se realizaron experimentos de reología oscilatoria para investigar los cambios con más detalle. Las pruebas de reología oscilatoria también evidenciaron marcadas diferencias entre las dispersiones de XAG y LBG. La dispersión de LBG sola, tenía valores de módulo de almacenamiento G’ inferiores a los del módulo de pérdida G’’ en todo el rango de frecuencias angulares evaluadas (Figura 10). Solo en la frecuencia más alta probada (50 rad/s) se observó una superposición de ambos módulos, indicando que los enredos entre las cadenas tienen una vida corta (1/50 = 0,02 s). Por el contrario, las dispersiones de XAG exhibieron valores de G’ más altos que los de G’’, sin importar la frecuencia angular, lo que sugiere que las cadenas de polímero forman una red tridimensional con uniones de larga duración (> 20 s). Una vez más, a medida que aumentaba el contenido de XAG, los gráficas reológicas de las mezclas cambiaron progresivamente del comportamiento viscoelástico mostrado por LBG al exhibido por XAG. 55 Figura 10 - Gráfico de reología oscilatoria para polisacáridos puros y sus mezclas, y evolución de los módulos de almacenamiento G’ y pérdida G” en las mezclas. La pre-compresión de XAG o LBG alteró significativamente el comportamiento reológico de las mezclas, conduciendo a un aumento considerable en los valores 56 de G’ y G’’ (Figura 9), obteniendo incluso resultados más altos que los registrados para la dispersión de xantana. Nuevamente, esto sugiere que los cambios en la conformación de los polisacáridos causados por la compresión a alta presión pueden promover interacciones intermoleculares entre ambas gomas, resultando en un efecto sinérgico sobre las propiedades viscoelásticas. Para probar si la compresión conjunta de ambos polisacáridos puede modificar este efecto sinérgico, se comprimieron mezclas de diferentes proporciones de XAG/LBG y se compararon las gráficas reológicas con las obtenidos con las mezclas de los polisacáridos comprimidos por separado (Figura 11). Figura 11 - Comparación de los módulos de almacenamiento G’ y de pérdida G” entre mezclas no comprimidas y mezclas preparadas con polisacáridos pre-comprimidos por separado o juntos. No se observaron diferencias significativas entre la dispersión preparada con los polisacáridos comprimidos juntos y la obtenida a partir de mezclas no comprimidas. Sin embargo, se obtuvieron valores más altos de ambos módulos con mezclas preparadas comprimiendo cada polisacárido individualmente. Los resultados sugieren cambios en el comportamiento reológico probablemente debido a cambios conformacionales en las cadenas de polisacáridos y no al establecimiento de nuevas interacciones intermoleculares entre los diferentes polisacáridos durante la etapa de compresión, especialmente en aquellas con un porcentaje más alto de XAG. Las dispersiones de mezclas pre-comprimidas se prepararon en agua fría y caliente (hirviendo) para obtener una comprensión más profunda del efecto de los cambios conformacionales y se registraron los módulos de almacenamiento y pérdida. Para analizar este comportamiento, se realizaron pruebas de fluencia y recuperación con las dispersiones de mezclas de XAG/LBG preparadas en agua fría y caliente, aplicando una fuerza constante de 0,1 Pa durante 5 minutos y calculando la capacidad de recuperación elástica (%) durante un tiempo de 5 minutos. Las pruebas de fluencia y recuperación caracterizan el comportamiento elástico de las muestras, y cuanto mayor sea la capacidad de recuperar el fluido, más importante será el componente elástico. 57 Figura 12 - Módulos de almacenamiento G’ y de pérdida G” (frecuencia angular de 1 rad/s) y recuperación elástica de dispersiones de polisacáridos (0,5% p/p) preparadas con mezclas de goma con y sin etapa de compresión en agua fría e hirviendo. Como se muestra en la Figura 12, se observó un aumento en la capacidad de recuperación elástica con la proporción 40:60 de XAG:LBG. Sin embargo, no se detectaron diferencias significativas entre las muestras preparadas utilizando agua hirviendo (100ºC), las cuales tienen una menor capacidad de recuperación en mezclas con proporciones más altas de XAG y una recuperación más alta para mezclas con más LBG. La etapa de pre-compresión reduce significativamente la capacidad de recuperación de las dispersiones preparadas con una alta proporción de XAG, de manera más pronunciada que el efecto de la temperatura. No obstante, la capacidad de recuperación se mantuvo e incluso aumentó en muestras con 50% o 60% de LBG. Estos resultados indican que los cambios estructurales en la cadena principal de la xantana producen un gel con 64 valores variables de esfuerzo de cizallamiento de rendimiento en función de la composición de la mezcla. Se observó que la goma xantana y sus mezclas se desviaban más del comportamiento newtoniano que la goma garrofina, y los valores del índice de comportamiento de flujo (n) se correlacionaban con la proporción de goma xantana/goma garrofina en la mezcla. El índice de consistencia (K) mostró que la goma xantana producía la dispersión más viscosa mientras que la goma garrofina daba lugar a la menos viscosa. Sin embargo, todas las mezclas de goma xantana/goma garrofina mostraron valores de K similares, independientemente de la proporción de goma en la mezcla. La pre-compresión de la goma xantana causó una disminución en la viscosidad de las dispersiones, mientras que la compresión de la goma garrofina apenas alteró su comportamiento reológico. Además, se observó que la temperatura también afectaba la viscosidad de las dispersiones de la goma xantana. Las pruebas de reología oscilatoria revelaron diferencias marcadas entre las dispersiones de goma xantana y las de goma garrofina. La goma xantana formó una red tridimensional con enlaces duraderos, mientras que la goma garrofina exhibió una red de corta duración. La pre-compresión de las gomas alteró significativamente el comportamiento reológico de las mezclas, aumentando los valores de los módulos de almacenamiento y pérdida. Las pruebas de difusión de fármacos revelaron que los geles de las mezclas de gomas xantana y garrofina no mostraron diferencias significativas en los perfiles de difusión, y las microviscosidades de las dispersiones de hidrogel eran similares a las del agua. En cuanto a la liberación de fármacos, se observó una liberación sostenida en los geles obtenidos, y las tasas de liberación variaron en función del pH y del fármaco utilizado. La goma garrofina mostró la misma tasa de liberación en ambos niveles de pH, mientras que la goma xantana y las mezclas de goma xantana y goma garrofina mostraron una tasa de liberación más baja a pH 6,8. La liberación del fármaco acetónido de triamcinolona fue lenta e independiente del pH y de la composición del xerogel. En resumen, el estudio concluye que la pre-compresión de gomas y la temperatura pueden ser parámetros efectivos para la modulación de las propiedades de hinchamiento y liberación de hidrogel. 65 CAPÍTULO 2 Caracterización de la bioadhesión de los hidrogeles basados en polisacáridos 66 67 CAPÍTULO 2 Caracterización de la bioadhesión de los hidrogeles basados en polisacáridos 1 INTRODUCCIÓN Una de las propiedades que presentan los hidrogeles, es su capacidad de integrarse e interaccionar con el medio en el que se administra (91). Su estructura tridimensional, así como el alto contenido en agua le aportan unas propiedades mecánicas y superficiales ideales para establecer interacciones con mucosas y otros tejidos. Por otra parte, los polisacáridos son macromoléculas de origen natural formadas por la unión de numerosos monosacáridos a través de enlaces glucosídicos, y su capacidad para adherirse a superficies biológicas es una propiedad clave que puede aprovecharse para diversas aplicaciones (43). Las propiedades bioadhesivas de los polisacáridos se refieren a su capacidad para unirse a tejidos biológicos, tales como la mucosas bucal, vaginal u ocular, las membranas mucosas gastrointestinales, la piel, entre otros. Esta propiedad se deriva principalmente de la interacción entre los grupos funcionales presentes en los polisacáridos y las moléculas específicas en las superficies celulares y de sus propiedades mecánica y capacidad de integrar los medios biológicos. Entre los polisacáridos conocidos por su destacada bioadhesión se encuentran el quitosano, el ácido hialurónico, la pectina y los mucopolisacáridos entre otros (92). 68 La capacidad bioadhesiva de los polisacáridos es muy interesante a la hora de la formulación de sistemas de administración de fármacos, sobre todo en mucosas. Estos polímeros naturales pueden actuar como vehículos que se adhieren a las superficies biológicas, prolongando así el tiempo de contacto con los tejidos y mejorando así la liberación y absorción de los fármacos. También se están utilizando polisacáridos en el ámbito de la ingeniería de tejidos aprovechando su capacidad bioadhesiva para mejorar la adhesión celular a scaffolds o matrices utilizadas en la regeneración de tejidos (93). La interacción específica entre los polisacáridos y las células facilita la adhesión celular, promoviendo así la proliferación y diferenciación celular en entornos tridimensionales. Existen diversos aspectos relacionados con la elaboración de los hidrogeles y con los medios biológicos que pueden ser relevantes a la hora de la bioadhesión de estos materiales. Por una parte, las propiedades mecánicas de las uniones bioadhesivas son fundamentales a la hora de establecer enlaces bioadhesivos resistentes. De acuerdo con las teorías de la bioadhesión, la difusión del material de la formulación en la mucosa o en la membrana biológica y el establecimiento de uniones bioadhesivas con él es fundamental para garantizar la bioadhesión (88,94). Los hidrogeles semisólidos menos densos y más fluidos pueden difundir fácilmente en la mucosa, sin embargo, su baja resistencia mecánica puede favorecer el fallo o fractura de la unión bioadhesiva en la superficie, que tiene lugar directamente en el hidrogel. Por otra parte, si se trata de hidrogeles muy rígidos y reticulados, no es posible la difusión del material en las mucosas por lo que no se forman los enlaces adhesivos. Por lo tanto, es importante el balance entre la movilidad de las cadenas del excipiente y su difusividad en el mucus o tejido y las propiedades mecánicas adecuadas y suficientes para sustentar las uniones bioadhesivas. En esta línea los hidrogeles de goma xantana, goma garrofina o sus mezclas preparadas mediante compresión tienen potencial como sistemas bioadhesivos. Los radicales específicos que poseen con capacidad de interacción con las superficies biológicas, la capacidad de captar e integrar fluidos acuosos e hinchar dando lugar a hidrogeles consistentes y de liberar los principios activos de manera controlada hacen que estos sistemas puedan tener gran interés para la administración de fármacos en mucosas. 69 El objetivo de este trabajo es la evaluación de la capacidad bioadhesiva de los hidrogeles de goma xantana, goma garrofina a sus mezclas empleando para ello el método de medida de la bioadhesión desarrollado por Blanco y colaboradores (88,94). 2 MATERIALES Y MÉTODOS 2.1 Materiales La goma xantana (XAG) y la goma garrofina (LBG) fueron suministradas por Inagarbe S.L. (Padrón, España). El Carbopol 940 fue un regalo de Lubrizol (Barcelona, España) El acetónido de triamcinolona (TA) fue adquirida a Fagrón (Barcelona, España). El dihidrogenofosfato de potasio, el ácido clorhídrico y el cloruro de sodio se adquirieron a Panreac Química S.A. (Barcelona, España); el dihidrogenofosfato de sodio dodecahidratado y el cloruro de potasio a Merck (Darmstadt, Alemania). El agua ultrapura se obtuvo por ósmosis inversa (MilliQ, Millipore; Madrid, España). 2.2 Preparación de los Xerogeles Los xerogeles se prepararon comprimiendo 500 mg de las mezclas estudiadas en una matriz de infrarrojos con un troquel de 12 mm de diámetro. Este proceso se llevó a cabo aplicando una fuerza de 7,5 toneladas durante 10 minutos mediante una prensa hidráulica Mega B-20 (Vizcaya, España). 2.3 Estudios de bioadhesión Para evaluar la bioadhesión, se utilizó piel curtida de cabra como sustrato, demostrando ser un modelo adecuado para determinar la bioadhesión de hidrogeles (94). La capacidad adhesiva se determinó midiendo la fuerza máxima de rotura y el trabajo de adhesión con el analizador de texturas TA-XT Plus Analyzer. 70 Los xerogeles se adhirieron al soporte superior, conectado a la célula de carga, mientras que el sustrato se unió al soporte inferior con adhesivo de cianoacrilato. Durante el ensayo, se aplicó una fuerza definida durante cierto tiempo, variando si se limitaba la cantidad de agua o si el sustrato e hidrogel estaban sumergidos en agua. En el primer caso, se depositó un volumen de 50 μl de medio sobre el sustrato, y el xerogel se descendió a una velocidad de 1 mm/s hasta que se estableció una presión de 0,5 N entre el xerogel y el sustrato. Esta presión se mantuvo durante 1 minuto antes de retirar el soporte superior a una velocidad de 1 mm/s, registrando la curva de fuerza frente a desplazamiento. En el segundo experimento, el sustrato se adhirió a una placa de Petri llena con el medio correspondiente, replicando el proceso anterior, pero con acceso libre de agua a los lados del comprimido durante todo el experimento. Ambos experimentos se realizaron a 37ºC. Se registró la fuerza (N) en función de la elongación para calcular la fuerza máxima antes de la rotura de la unión bioadhesiva y el trabajo de bioadhesión (mJ) como el área bajo el gráfico. Los ensayos se llevaron a cabo con fluido gástrico simulado pH 1,2, medio entérico pH 4,5 y pH 6,8 según la Farmacopea Europea. 2.4 Análisis estadístico Los valores de fuerza máxima y trabajo de adhesión en las diferentes condiciones se compararon aplicando ANOVA multifactorial. 71 3 RESULTADOS Y DISCUSIÓN TRABAJO pH1.2 50µl SOLV TRABAJO pH6.8 50µl SOLV TRABAJO pH4.5 50µl SOLV 1 3 5 7 CARBOPOL GARROFINA MEZCLA XANTANA Trabajo mJ FUERZA pH1.2 50µl SOLV FUERZA pH6.8 50µl SOLV FUERZA pH4.5 50µl SOLV 0 1 2 3 4 5 6 7 CARBOPOL GARROFINA MEZCLA XANTANA FUerza de rotura (N) Figura 17 - Resultados de los ensayos de bioadhesión en las condiciones de hidratación controlada de la unión bioadhesiva. En la Figura 17 se muestran los resultados obtenidos cuando se utilizan 50 l de medio para la humectación de la superficie. Este experimento imita las condiciones que se puede encontrar una formulación de hidrogel empleada para la administración de fármacos en superficies mucosas como la mucosa bucal o vaginal. En estos casos el hidrogel se coloca ejerciendo una presión sobre la mucosa que contiene cantidad limitada de fluido. En los resultados destaca la baja capacidad bioadhesiva de la goma garrofina, con valores de trabajo y fuerza máxima prácticamente despreciables a los tres valores de pH. En el lado contrario destaca la goma xantana con valores elevados de fuerza y trabajo, sobre todo a pH 4,5, superiores a los obtenidos con los hidrogeles de Carbopol 940 utilizados como referencia ( < 0,01). Las mezclas de goma xantana y goma garrofina poseen un comportamiento mejor que el esperado por los bajos valores obtenidos con la goma garrofina. En la Figura 18, se presentan los resultados de experimentos sin limitación de medio, simulando condiciones con gran cantidad de medio que baña las mucosas o membranas, como en sistemas administrados por vía oral. Se observa una disminución importante en los valores de fuerza máxima y trabajo de bioadhesión de todos los xerogeles, excepto para el de la goma garrofina, que muestra los mayores valores de fuerza máxima, aunque el trabajo de bioadhesión no presenta diferencias entre los componentes. 72 TRABAJO pH1.2 SOLV SIN LIMITAR TRABAJO pH6.8 SOLV SIN LIMITAR 0.0 0.1 0.2 0.3 0.4 0.5 0.6 CARBOPOL GARROFINA MEZCLA XANTANA Trabajo mJ FUERZA pH1.2 SOLV SIN LIMITAR FUERZA pH6.8 SOLV SIN LIMITAR 0.0 0.1 0.2 0.3 0.4 0.5 0.6 CARBOPOL GARROFINA MEZCLA XANTANA Fuerza de rotura (N) Figura 18 - Resultados de los ensayos de bioadhesión en las condiciones de hidratación controlada de la unión bioadhesiva. Como se mencionó en la introducción, la capacidad de difusión en el sustrato y la resistencia mecánica son fundamentales para la bioadhesión. Los estudios con volumen limitado a 50 μl mostraron los valores más elevados, excepto para la goma garrofina, sugiriendo que este volumen de medio puede ser insuficiente para una hidratación adecuada y homogénea de la interfase bioadhesiva. En el resto de los componentes y la mezcla de goma xantana y goma garrofina, se forma una interfaz gelificada entre xerogel y sustrato, mostrando niveles de bioadhesión adecuados. Cuando se realiza el ensayo sumergido en los fluidos, los valores de bioadhesión disminuyen, excepto para la goma garrofina. El exceso de medio favorece el hinchamiento del xerogel y la formación de una interfase más hidratada y menos resistente. Esta situación favorece la rotura de la interfase adhesiva durante la separación del hidrogel y el sustrato, que se produce por el fallo o la fractura del hidrogel en lugar de la rotura de las uniones bioadhesivas. Los xerogeles de goma garrofina muestran fuerza máxima superior, indicando una interfaz más rígida, aunque las propiedades plásticas y elásticas del resto compensan la menor fuerza necesaria con un aumento del trabajo necesario para la rotura total de la unión bioadhesiva. En cualquiera de los casos los xerogeles muestran capacidad similar al polímero de referencia Carbopol 940. 73 4 CONCLUSIONES Los estudios de bioadhesión revelan que los hidrogeles de goma xantana, goma garrofina y sus mezclas presentan propiedades bioadhesivas adecuadas, dependiendo de las condiciones de hidratación. Estos hidrogeles tienen una bioadhesión similar al Carbopol 940, lo que los hace interesantes para la formulación de medicamentos destinados a la administración en mucosas. 80 2.5 Ensayo de liberación a partir de xerogeles Los xerogeles se prepararon de acuerdo con las cantidades reflejadas en la Tabla 5. Tabla 5 - Composición de las mezclas empleadas para la fabricación de los xerogeles. Formulación XAG/LBG 1:1 (%) Acetónido de triamcinolona (%) −ciclodextrina (%) 1 99 1 2 98 2 3 95 3 4 96 1 3 5 96 1 3* 6 92 2 6* *malaxado Para la preparación de los xerogeles, las mezclas se prepararon en mortero. En el caso de la formulación 5 y 6, una vez realizada la mezcla se procedió a su malaxado añadiéndole una cantidad similar de agua y agitando hasta la evaporación del solvente. La masa obtenida se pulverizó antes de proceder a su compresión. Para el proceso de compresión se pesaron 500 mg de las mezclas y se depositaron en una matriz de infrarrojos de 12 mm de diámetro. La mezcla se sometió a una compresión con una fuerza de 7,5 toneladas durante 10 minutos. Los ensayos de liberación se llevaron a cabo en un aparato de ensayo de disolución USP 2 con palas (Prolabo, París, Francia) conectado mediante una bomba peristáltica (HP 89092A) a un espectrofotómetro de red de diodos (HP 8452A; Palo Alto, EE. UU.). El medio de liberación empleado fue de 450 ml de tampón clorhídrico pH 1,2 durante las dos primeras horas, y después se aumentó el pH a 6,8 añadiendo un pequeño volumen de tampón fosfato pH 8,0 y NaOH 2M. De este modo, se imitó el tránsito en el tracto gastrointestinal durante un tiempo de vaciado gástrico de 2 horas y un tiempo de tránsito intestinal de 24 horas. El medio se mantuvo en agitación a 100 rpm y 37 ± 0,5ºC. Todos los experimentos se realizaron con seis réplicas de cada formulación. 81 2.6 Análisis estadístico Los perfiles de liberación se ajustaron a la cinética más usual y los resultados obtenidos para las distintas formulaciones se compararon aplicando ANOVA multifactorial. 3 RESULTADOS Y DISCUSIÓN En la Figura 19 se presentan los perfiles de difusión de acetónido de triamcinolona a partir de dispersiones elaboradas con goma xantana, goma garrofina y sus mezclas al 50%, conteniendo dos proporciones de hidroxipropil-β-ciclodextrina o de γ-ciclodextrina. Todos los perfiles obtenidos se ajustan a un proceso de difusión del fármaco a través de la dispersión de polisacáridos, con un coeficiente de determinación superior al 99%. 82 Figura 19 - Perfiles de difusión del acetónido de triamcinolona a través de las suspensiones de polisacáridos que contienen ciclodextrinas, preparados sin comprimir (XAG, LBG y XAG/LBG) o después de ser comprimidos (pXAG, pLBG y pXAG/LBG), junto con los coeficientes aparentes de difusión del fármaco a través de las diferentes dispersiones. La difusión del fármaco en las dispersiones de polisacáridos, en ausencia de ciclodextrinas, muestra valores similares, con un ligero aumento en la velocidad de difusión después de la precompresión, aunque no significativo. La adición de hidroxipropil-β-ciclodextrina al 5% no modifica la difusividad del fármaco en la dispersión para ninguno de los polisacáridos o sus mezclas. Sin embargo, al incrementar la concentración al 10%, se observa una ligera tendencia a reducir la difusividad, especialmente en el caso de la goma xantana y, sobre todo, en la mezcla de goma xantana/goma garrofina. La incorporación de γ-ciclodextrina provoca una reducción de la difusividad a partir del 5%, en todos los casos, siendo más pronunciada nuevamente para la dispersión de goma xantana y para 0120 240 360 480 600 720 840 960 1080 1200 1320 1440 0 2 4 6 8 10 12 14 16 18 20 XAG XAG 5% gCD XAG 10% γCD XAG 5%HPB XAG 10%HPB pXAG pXAG 5% gCD pXAG 10% γCD pXAG 5%HPB pXAG 10%HPB Tiempo (min) Flujo de fármaco (mg/cm2) 0 5 10 0.0000 0.0001 0.0002 0.0003 0.0004 0.0005 % CD Dap γCD HPB pγCD pHPB 0120 240 360 480 600 720 840 960 1080 1200 1320 1440 0 2 4 6 8 10 12 14 16 18 20 Tiempo (min) Flujo de fármaco (mg/cm2) LBG 5% γCD LBG 10% gCD LBG 5% HPB LBG 10% HPB pLBG pLBG 5% γCD pLBG 10% γCD pLBG 5% HPB LBG pLBG 10% HPB 0 5 10 0.0000 0.0001 0.0002 0.0003 0.0004 0.0005 % CD Dap γCD HPB pγCD pHPB 0120 240 360 480 600 720 840 960 1080 1200 1320 1440 0 2 4 6 8 10 12 14 16 18 20 Tiempo (min) Flujo de fármaco (mg/cm2) XAG/LBG 5% γCD XAG/LBG 10% gCD XAG/LBG 5% HPB XAG/LBG 10% HPB pXAG/LBG pXAG/LBG 5% γCD pXAG/LBG 10% γCD pXAG/LBG 5% HPB XAG/LBG pXAG/LBG 10% HPB 0 5 10 0.0000 0.0001 0.0002 0.0003 0.0004 0.0005 % CD Dap γCD HPB pγCD pHPB 83 la mezcla de ambos polisacáridos. En este escenario, se evidencia una disminución prácticamente lineal de la Dapp en función de la concentración de γciclodextrina. Como se demostró en el capítulo 1, las dispersiones de goma garrofina poseen una menor viscosidad, la cual aumenta en el caso de la goma xantana y, especialmente, en las mezclas. La inclusión de ciclodextrinas en la dispersión puede favorecer la interacción con el principio activo, formando complejos de inclusión. Estos complejos tienen un mayor peso molecular y diámetro hidrodinámico que los fármacos libres, lo que resulta en una difusión más lenta, especialmente en medios más viscosos. En este contexto, los complejos de inclusión de γ-ciclodextrina presentan un mayor peso y tamaño molecular que los de hidroxipropil-β-ciclodextrina, posiblemente causando una mayor reducción en la Dapp, especialmente en los medios más viscosos. Loftsson y colaboradores (100,101) describieron la reducción en la difusión de diferentes fármacos a través de membranas debido a la formación de complejos de inclusión que incrementan la masa y el volumen molecular. Teniendo en cuenta estos resultados elegimos la γ-ciclodextrina para continuar nuestros estudios y procedimos a la fabricación y estudio de los hidrogeles elaborados mediante compresión de las mezclas de polisacáridos, γ-ciclodextrina y el acetónido de triamcinolona. En la Figura 20 podemos ver los perfiles de liberación de los hidrogeles y en la Tabla 6 los resultados obtenidos de los ajustes a las cinéticas de orden 0, Higuchi o a la ecuación de Korsmeyer y Peppas. 84 Figura 20 - Perfiles de liberación de triamcinolona acetónido obtenidos empleando fluido gástrico simulado sin enzimas pH 1,2 durante los primeros 120 minutos, y continuando con fluido entérico simulado sin enzimas pH 6,8. Una primera observación de los perfiles nos indica que la liberación del acetónido de triamcinolona es independiente del pH del medio. No se observa ningún salto significativo en la velocidad de liberación a partir de los 120 minutos, tiempo en el que se produce el cambio de pH. Por otra parte, no se observaron diferencias significativas ( n.s.) entre las formulaciones 1, 2 y 3 lo que nos indica que la velocidad de liberación es independiente de la cantidad de fármaco incluido en los hidrogeles y que probablemente se encuentre controlada por la baja hidrosolubilidad de este fármaco en medios acuosos. Por otra parte, la incorporación de la γ-ciclodextrina produce un incremento significativo ( < 0,01) de la velocidad y cantidad de acetónido de triamcinolona liberado en ambos medios, fluido gástrico y entérico simulados sin enzimas. Se observa gran influencia de la cantidad de γ-ciclodextrina incorporada, que aumenta la velocidad de liberación a medida que aumenta su proporción en la mezcla. Sin embargo, el proceso de malaxado no influye sobre la cinética de liberación. Al cabo de las 24 horas se observa la liberación de la mayor parte de acetónido de triamcinolona incorporado en los hidrogeles 4 y 5, con valores del Data 1 0 100 200 300 400 500 600 700 800 900 1000 1100 1200 1300 1400 0.0 0.5 1.0 1.5 2.0 2.5 3.0 3.5 4.0 4.5 5.0 Formulación 1 Formulación 2 Formulación 3 Formulación 4 Formulación 5 Formulación 6 Tiempo (min) mg TA liberados 85 5%, 13% 25%, 40%, 60% y 60% para las formulaciones 3, 2, 1, 6, 4 y 5 respectivamente. Los resultados de las cinéticas incluidas en la Tabla 6, muestran que el proceso de liberación del fármaco se ajusta mejor a una cinética de orden 0 que a la cinética de difusión. Los valores del coeficiente n obtenido en la ecuación de Korsmeyer-Peppas entre 0,72-0,92 sugieren una gran influencia de la relajación del polímero en el proceso de liberación del fármaco. Probablemente la baja solubilidad del acetónido de triamcinolona en el hidrogel también contribuya a que el peso de la relajación del polímero y la entrada de agua en el hidrogel sea muy importante. La presencia de la γ-ciclodextrina no modifica aparentemente el mecanismo de liberación, si bien aumenta la velocidad de liberación. Este aumento probablemente se produzca por el incremento de la solubilidad del complejo de inclusión que se forma in situ entre el acetónido de triamcinolona y la γ-ciclodextrina. Esta mayor hidrosolubilidad contribuye a minimizar el efecto que el complejo podría provocar sobre la velocidad de difusión, tal como se ha observado en los estudios de difusión realizados. Resultados similares se observaron para otros principios activos (98,99). Tabla 6 - Ajuste de los perfiles de liberación a la cinética de orden 0, Higuchi y a la ecuación de Korsmeyer-Peppas. Formulación 𝑸=𝒌𝒕 𝑸=𝒌√𝒕 𝑸=𝒌𝒕𝒏 k R2 k R2 k n R2 1 0,0008 0,9925 0,03266 0,9693 0,0021 0,872 0,9965 2 0,0008 0,9744 0,03229 0,9771 0,0055 0,737 0,8880 3 0,0007 0,9885 0,02660 0,9580 0,0012 0,920 0,9908 4 0,0020 0,9909 0,08076 0,9789 0,0089 0,797 0,9990 5 0,0021 0,9940 0,08280 0,9729 0,0062 0,851 0,9989 6 0,0030 0,9983 0,12090 0,9848 0,0133 0,766 0,9990 4 CONCLUSIONES La incorporación de ciclodextrinas a las mezclas de polisacáridos empleadas en la fabricación de los xerogeles influyen de manera significativa en la difusión y liberación del fármaco acetónido de triamcinolona. 86 La γ-ciclodextrina ha demostrado tener una influencia más pronunciada que la hidroxipropil-β-ciclodextrina en la difusión del acetónido de triamcinolona en los hidrogeles, destacando especialmente en aquellos elaborados con goma xantana o sus mezclas con goma garrofina. Esta diferencia puede atribuirse al mayor tamaño molecular de los complejos de inclusión formados con la γ-ciclodextrina y a la mayor viscosidad de estas mezclas. La incorporación de la γ-ciclodextrina tiene un efecto significativo en la capacidad de liberación del acetónido de triamcinolona desde los xerogeles. El aumento de la solubilidad del acetónido de triamcinolona, probablemente debido a la formación del complejo de inclusión in situ, parece desempeñar un papel crucial en este proceso. Los hidrogeles elaborados a partir de estas mezclas son capaces de liberar de manera prácticamente constante su contenido a lo largo de 24 horas, lo cual confiere a estos sistemas un gran potencial para la liberación de fármacos a lo largo de todo el tracto gastrointestinal, especialmente a nivel del colon. 87 CAPÍTULO 4 Efecto de la administración oral de acetónido de triamcinolona en hidrogeles de polisacáridos en modelo animal de colitis experimental inducida mediante TNBS 88 89 CAPÍTULO 4 Efecto de la administración oral de acetónido de triamcinolona en hidrogeles de polisacáridos en modelo animal de colitis experimental inducida mediante TNBS 1 INTRODUCCIÓN El colon constituye uno de los segmentos finales del intestino y puede verse afectado por diversas patologías que impactan localmente en este tejido. Recibe el contenido proveniente del íleon y desempeña un papel crucial en la absorción de agua y electrólitos, así como en la formación y almacenamiento de las heces antes de su expulsión a través del recto y el ano. Además, la presencia de bacterias en esta sección facilita la fermentación de sustancias no digeridas, generando algunos nutrientes adicionales y gases. El colon se divide en diferentes secciones: ciego, colon ascendente, colon transverso, colon descendente y colon sigmoide. Esta zona puede sufrir diversas patologías que pueden afectar localmente a su tejido, generando un espectro amplio de trastornos que van desde los funcionales hasta los inflamatorios y neoplásicos (102). Una de las condiciones más comunes que afecta al colon es el síndrome del intestino irritable, un trastorno funcional que se caracteriza por la presencia de síntomas como dolor abdominal, distensión y cambios en los hábitos intestinales. En contraste, las enfermedades inflamatorias intestinales, como la enfermedad de Crohn y la colitis ulcerosa, afectan el colon de manera más directa, 96 2.7.2 Sistema de puntuación de actividad clínica La actividad de la colitis se cuantificó con una puntuación clínica que evalúa la pérdida de peso, la consistencia de las heces y el sangrado rectal siguiendo el procedimiento descrito por Mura y colaboradores (108). La no pérdida de peso se contó como 0 puntos, 1-5% de pérdida de peso como 1 punto, 5-10% de pérdida de peso como 2 puntos, 10-20% de pérdida de peso como 3 puntos y una pérdida de peso mayor del 20% como 4 puntos. Para la consistencia de las heces, se otorgó 0 punto por gránulos bien formados, 2 puntos por heces pastosas y semiformadas que no se adhieren al ano y 4 puntos por heces líquidas que se adhieren al ano. El sangrado se calificó con 0 puntos por ausencia de sangre, 2 puntos por hallazgo positivo y 4 puntos por sangrado evidente. La suma de estas puntuaciones conformaba la puntuación clínica, que variaba de 0 (saludable) a 12 (actividad máxima de colitis). 2.7.3 Actividad de la mieloperoxidasa La evaluación detallada de la actividad enzimática de la mieloperoxidasa se llevó a cabo como un método cuantitativo para determinar la gravedad de la colitis inducida. Esta enzima, una peroxidasa, actúa como un indicador fiable del proceso inflamatorio, el cual se caracteriza por la infiltración de neutrófilos activados en el tejido inflamado. La metodología para analizar la actividad de la mieloperoxidasa se basó en los procedimientos establecidos por De Young y colaboradores y otros (108–110). Este proceso implica varios pasos detallados: inicialmente, una muestra de tejido colónico se incorporó en 750 µl de solución tampón HTAB (con una concentración del 0,5% en un tampón de fosfato 80 mM con un pH de 5,4) y se mantuvo en hielo. Posteriormente, esta muestra se sometió a un proceso de homogeneización para garantizar la uniformidad en la mezcla. Tras la homogeneización, la muestra se sometió a centrifugación (Centrífuga Heraeus Fresco 17 de Thermo Electron Corporation, España) operando a una temperatura de 4°C y a una velocidad de 10000 rpm durante un período de 15 minutos (Eppendorf AG 22331, Alemania). El objetivo de este paso era separar el sobrenadante, el cual contiene la mieloperoxidasa activa, del resto de los componentes celulares. La actividad de la mieloperoxidasa presente en el sobrenadante se midió mediante técnicas espectrofotométricas. Para ello, se 97 preparó una mezcla incubando 25 µl del sobrenadante con 75 µl de tampón de fosfato con un pH de 7,4, 10 µl de buffer de fosfato con un pH de 5,4 y 10 µl de una solución de peróxido de hidrógeno al 0,03%. Esta mezcla se mantuvo a una temperatura constante de 37°C durante un tiempo de 5 minutos. A continuación, se añadieron 20 µl de TMB a una concentración de 18 mM (previamente disuelto en un 8% de DMF) a la mezcla y se dejó incubar por otros 10 minutos. El paso final en la evaluación de la actividad enzimática consistió en detener la reacción añadiendo 15 µl de acetato de sodio a una concentración de 1,5 M y un pH ajustado a 3,0. La absorbancia de la solución resultante se midió a una longitud de onda de 620 nm, proporcionando una medida cuantitativa de la actividad de la mieloperoxidasa. 2.8 Análisis estadístico Los datos obtenidos se compararon aplicando ANOVA multifactorial. 3 RESULTADOS Y DISCUSIÓN El procedimiento experimental para inducir inflamación intestinal mediante TNBS consiste en la administración directa de una solución de TNBS en el colon mediante la inserción de un catéter o una sonda rectal. Esta mezcla provoca daño tisular y desencadena una respuesta inflamatoria localizada en el colon. El TNBS induce una inflamación aguda en el colon, caracterizada por la infiltración de células inflamatorias, como neutrófilos y linfocitos, en la mucosa y submucosa. Este modelo conduce a la destrucción del epitelio colónico, resultando en la pérdida de la barrera protectora, lo que contribuye a la gravedad de la inflamación. Aunque el modelo TNBS presenta similitudes con la colitis ulcerosa humana, es crucial reconocer sus limitaciones y considerar otros modelos que reflejen aspectos específicos de la enfermedad inflamatoria intestinal. Sin embargo, es útil para evaluar la eficacia de fármacos y tratamientos potenciales para la colitis ulcerosa, como antiinflamatorios, inmunomoduladores o agentes dirigidos específicamente a citocinas inflamatorias (105,106). 98 Una característica asociada a este modelo es el aumento de la producción de citocinas proinflamatorias. Tras la inducción, se observa un aumento en la producción de citocinas como el factor de necrosis tumoral alfa (TNF-α), interleucina-1 beta (IL-1β) e interleucina-6 (IL-6), contribuyendo a la cascada inflamatoria. Además, se producen cambios histológicos en el tejido colónico, incluyendo edema, ulceración, engrosamiento de la mucosa y formación de abscesos, reproduciendo características similares a las observadas en pacientes con colitis ulcerosa. Como consecuencia de estos cambios, la evolución de los animales se acompaña de una significativa pérdida de peso a lo largo de las primeras semanas de inducción. En la Figura 22 se muestra la pérdida de peso normalizada en los animales sometidos a diferentes tratamientos. La gráfica revela que la mayor disminución de peso en los primeros días corresponde a los animales tratados con la disolución placebo, la disolución de acetónido de triamcinolona y la espuma rectal. Por el contrario, la pérdida más lenta se observa en los casos de los xerogeles que contienen el fármaco, en donde se observaron diferencias significativas frente al suero salino (disolución placebo) y la espuma rectal ( < 0,05). Tanto en el caso de los xerogeles placebo como los que contienen el acetónido de triamcinolona se aprecia una menor pérdida de peso que el resto hasta el quinto día post tratamiento, a partir del que se obtienen niveles similares a los otros animales. 99 Figura 22 - Pérdida de peso observada en los grupos de animales en función del tratamiento. Los datos se encuentran normalizados por la máxima y mínimo peso alcanzado en cada grupo. En la Figura 23 se presentan los valores obtenidos para los niveles de mieloperoxidasa y edema colónico. Aunque no se detectaron diferencias significativas debido a la gran variabilidad encontrada entre los animales, tanto la espuma rectal como la solución salina resultan en los mayores valores de ambos parámetros. Para ambos parámetros se observan los valores más bajos en el grupo de animales tratados con el xerogel con acetónido de triamcinolona y la solución del principio activo. 100 Figura 23 - Niveles de mieloperoxidasa y edema colónico obtenidos para los diferentes grupos de animales. Los valores obtenidos para el edema colónicos de los animales fueron similares a los obtenidos por Mura y colaboradores en 2011 (108) y por Ferri y colaboradores (111) en modelo experimental de TNBS. En estos trabajos estudiaron el efecto de una suspensión de 5-ASA, un sistema liofilizado conteniendo una mezcla de 5ASA y succinil quitosano 1:1, micropartículas succinil quitosano cargadas con 5ASA (108), así como Entocord® y con micropartículas de sílica mesoporosa decoradas con derivados azo y conteniendo budesónida como fármaco (111). Mura y colaboradores (108) obtuvieron valores de edema colónico de alrededor de 20 mg/g para los animales tratados con suero fisiológico y de 17 mg/g en el estudio de Ferri y colaboradores (111). Asimismo, mostraron valores de edema colónico tras los diferentes tratamientos de entre 5 y 10 mg/g, ligeramente superiores a los observados en nuestro estudio. En cuanto a los niveles de mieloperoxidasa fueron similares a los observados por Mura y colaboradores (108) para el sistema liofilizado y las micropartículas. En la Figura 24 se muestra las puntuaciones de la actividad clínica asignadas a cada grupo de animales en función de su tratamiento. Al igual que lo observado en la pérdida de peso, índice de edema colónico y niveles de mieloperoxidasa, la puntuación indica la tendencia del grupo tratado con los xerogeles conteniendo acetónido de triamcinolona a mostrar las menores puntuaciones comparado con el resto de los animales. Nuevamente los más altos de puntuación se observaron para el grupo tratado con suero salino y la espuma rectal. Llama la atención que 101 los comprimidos placebo, constituidos solo por los polisacáridos den lugar a valores de mieloperoxidasa, edema y a puntuaciones inferiores a la espuma recta y al suero salino y similares a los obtenidos con la disolución de acetónido de triamcinolona. La puntuación de la actividad clínica obtenida fue también del mismo orden de los observados por Ferri y colaboradores en 2019 y por Mura y colaboradores en 2011 (108,111) en los animales tratados con suero fisiológico (media de puntuación  6 y 8 respectivamente) así como los obtenidos con los animales tratados con Entocord (media  2.5), las micropartículas decoradas de budesónida (media 3.5) o las mezclas liofilizadas y micropartículas de succinil quitosano y 5-ASA (media  1-1.5). Figura 24 - Puntuación de la actividad clínica obtenidos para los diferentes grupos de tratamientos de los animales con colitis inducida por TNBS. El conjunto de los resultados sugiere que se produce un incremento de la actividad clínica del acetónido de triamcinolona cuando se administra en forma de xerogel elaborado con la mezcla de polisacáridos. Sorprendentemente el grupo de animales tratados con el xerogel placebo, sin principio activo, muestra un nivel de actividad similar al observado en los animales tratados con la espuma rectal o la solución oral. Este resultado muestra un efecto positivo de los polisacáridos sobre la evolución de la enfermedad. 102 Existen distintas publicaciones que sugieren la posible actividad terapéutica de los polisacáridos naturales en enfermedad inflamatoria intestinal (112,113). Se cree que la microbiota intestinal y sus productos fermentativos, principalmente los ácidos grasos de cadena corta (AGCC), median en el efecto de los polisacáridos naturales en las enfermedad inflamatoria intestinal. Algunos expertos atribuyen su eficacia a su capacidad para la reparación de la barrera intestinal dañada el mantenimiento del microambiente intestinal y a la mejora de la respuesta inmunitaria de la mucosa del huésped (112). En el anexo I se recogen las imágenes de las porciones de colon de los animales correspondientes a los diferentes grupos de tratamiento, así como observaciones y comentarios de las alteraciones observadas. 4 CONCLUSIONES Se ha realizado un estudio de efectividad clínica de los hidrogeles de goma xantana y goma garrofina empleando un modelo de colitis ulcerosa inducida mediante TNBS. Se ha analizado para ello la variación de peso tras la inducción y durante los diferentes tratamientos, así como los niveles de mieloperoxidasa, el índice de edema y la puntuación de la actividad clínica. Para ello se han estudiado diferentes tratamientos además de los hidrogeles conteniendo el acetónido de triamcinolona. Los resultados muestran la mejor actividad de los hidrogeles frente a la espuma rectal o a la disolución de acetónido de triamcinolona administrada oralmente. Sorprendentemente el grupo de animales tratados con el xerogel placebo, sin principio activo, mostró un nivel de actividad similar al observado con la espuma o la solución oral. Este resultado muestra un efecto positivo de los polisacáridos sobre la evolución de la enfermedad. 103 5 ANEXO 1. Resultados del análisis de los cambios fisiopatológicos 5.1 Grupo tratado con solución placebo Descripción del fragmento Imágenes Evaluación alteraciones Fragmento intestinal en dos mitades de 3 cm de largo y 2,5 cm de ancho sin lesiones macroscópicas. - Mucosa de colón preservada. - Algún punto con infiltrado inflamatorio leve en la lámina propia que no llega a destruir las glándulas. Fragmento intestinal en dos mitades de 3 x 2,4 cm macroscópicamente con cambios de color a marrón oscuro y que presenta engrosamiento, una de las mitades presenta una lesión de color marrón oscuro intenso y de bordes irregulares. - Pérdida de la mucosa intestinal por infiltrado inflamatorio moderado/severo con presencia de necrosis. - Grandes zonas de congestión vascular. - Pérdida de submucosa y muscular por infiltrado inflamatorio moderado/severo. Fragmento intestinal de 3 cm en dos mitades sin lesiones macroscópicas. - Mucosa de colón preservada. - En algún punto se observan vasos congestivos muy grandes con infiltrado inflamatorio leve en la lámina propia. 104 Fragmento intestinal de 2,8 x 1,2 cm macroscópicamente sin lesión. - Pared intestinal preservada en algunos puntos. - En una zona, erosión de la mucosa intestinal e infiltrado inflamatorio severo de toda la pared intestinal. Fragmento intestinal en dos mitades, de 3 cm de largo y 2,2 cm de ancho sin lesión macroscópica aparente, pero con un mayor grosor que las muestras descritas sin lesión. - Mucosa de colón preservada. - Algún punto con infiltrado inflamatorio leve que sustituye a alguna glándula. Fragmento intestinal que mide 3 x 2,5 cm y con un engrosamiento de aprox. 0,5 cm con zonas de color marrón claro. - Erosión de la mucosa intestinal por infiltrado inflamatorio severo e infiltrado inflamatorio moderado en submucosa y muscular. - Se observa algunas glándulas respetadas. Fragmento intestinal en una sola pieza para su procesado de 3 cm sin lesión macroscópica. - Mucosa de colon preservada. - Algunos puntos con infiltrado inflamatorio leve en la lámina propia. - Algunos puntos con vasos congestivos. 105 Fragmento intestinal en dos mitades de 2,6 cm con ligeros engrosamientos. - Pared intestino grueso normal, en uno de los puntos las glándulas de la mucosa se pierden y han sido sustituidas por un infiltrado inflamatorio moderado. Fragmento intestinal en una sola pieza para su procesado de 3 x 1,6 cm sin lesión macroscópica. Tiene un mayor grosor a diferencia de algunas muestras donde no se observan lesiones macroscópicas aparentes. - Mucosa de colon preservada. - Algunos vasos congestivos. - En algunos puntos hay infiltrado inflamatorio leve en alguna glándula. - Muscularis y submucosa respetadas. Fragmento intestinal de 2,8 cm en dos mitades que en la porción central presenta lesión color marrón oscuro y engrosamiento de 1,5 cm. - Erosión de la mucosa por infiltrado inflamatorio moderado. - Toda la pared presenta infiltrado inflamatorio moderado. 112 5.4 Grupo tratado con espuma rectal Descripción del fragmento Imágenes Evaluación alteraciones Fragmento intestinal de 2,5 x 2 cm en dos mitades sin lesión macroscópica tiene un mayor grosor a diferencia de algunas muestras donde no se observan lesiones macroscópicas aparentes. - Pared intestinal preservada. Fragmento intestinal de 3 cm en dos mitades con engrasamiento de la pared de 1,5 cm de color marrón oscuro. - Erosión y necrosis de la mucosa por infiltrado inflamatorio severo. - Infiltrado inflamatorio severo en submucosa. - Algunos puntos donde tanto la mucosa, submucosa y muscular han sido sustituidas por un infiltrado inflamatorio severo. - En algunos puntos las glándulas están preservadas. Fragmento intestinal de 2,5 cm en dos mitades, con un engrosamiento de 7 mm en una de las mitades y en la otra mitad normal. - Erosión de la mucosa intestinal por infiltrado inflamatorio severo. - Infiltrado inflamatorio severo en submucosa y muscular. 113 Fragmento intestinal en dos mitades, una de ellas mide 2,8 cm y la otra 2,6 cm, ambas sin lesiones macroscópicas. - Mucosa de colón preservada. - Algún punto con infiltrado inflamatorio muy leve que llega a infiltrar a algunas glándulas. - Submucosa y muscular respetadas, sólo en algunos puntos se observa la presencia de vasos congestivos. Fragmento intestinal de 2,9 cm en dos mitades sin lesiones macroscópicas. - Mucosa de colón preservada. - En algún punto donde se observa infiltrado inflamatorio leve que llega a sustituir alguna glándula. - Mucosa y muscularis mucosae respetadas. Fragmento intestinal de 2,5 cm en dos mitades, que en la porción central presenta lesión de 1,2 cm. - A nivel de la submucosa se observa en uno de los puntos un infiltrado inflamatorio severo. - Colón preservado en la mayoría de los puntos. Sólo en un punto hay pérdida de glándulas con erosión de estas por un infiltrado inflamatorio moderado que infiltra toda la mucosa. 114 Fragmento intestinal de 3 cm en dos mitades sin lesiones macroscópicas. - Mucosa de colón preservada. Fragmento intestinal en una sola pieza para su procesado con lesión en uno de los extremos de color marrón oscuro y engrosamiento. - Abundante pared de colon preservada. - En algún punto se observa infiltrado inflamatorio leve/moderado en la submucosa que se extiende hasta la mucosa produciendo erosión y necrosis glandular. Fragmento intestinal en dos mitades de 2,7 x 2,4 cm presenta lesión y engrosamiento en la mayor parte de la superficie de la muestra, algunas zonas de color marrón oscuro. - Pared de intestino grueso normal. 115 Fragmento intestinal de forma irregular en sus dimensiones con lesión macroscópica de color marrón en casi toda la superficie. De aprox. 3 cm de largo y un extremo engrosado de 2,7 cm, el otro extremo de 1,9cm sin cambio de color y sin engrosamiento. - Necrosis y congestión en toda la pared intestinal con infiltrado inflamatorio moderado. 116 5.5 Grupo tratado con comprimido de acetónido de triamcinolona Descripción del fragmento Imágenes Evaluación alteraciones Fragmento intestinal en una sola pieza sin lesión macroscópica aparente excepto en una de las paredes que se observa un ligero engrosamiento. - Mucosa de colón preservada. - En algún punto hay infiltrado inflamatorio muy leve que sustituye a alguna glándula. - En submucosa y muscularis se observan algunos vasos congestivos. Fragmento intestinal en dos mitades de 2,9 cm. En la porción superior y media presenta una lesión circular de color marrón en una de las mitades, en la otra mitad presenta en la parte superior y media una lesión circular un poco más pequeña y de color marrón, en la porción inferior sin lesión. - Mucosa intestinal con algunas zonas preservadas. - En algunos puntos con erosión y necrosis de la mucosa. - En puntos con infiltrado inflamatorio moderado en mucosa que sustituye a alguna glándula. Fragmento intestinal en una sola pieza de 2,8 x 1,2 cm sin lesión macroscópica aparente excepto en una de las paredes que se observa un ligero engrosamiento. - Pared de colón preservada. 117 Fragmento intestinal en dos mitades de 2,6 cm con ligero engrosamiento en un extremo de cada mitad y sin lesión macroscópica aparente. - Mucosa de colón preservada. - En algún punto hay erosión de la mucosa con pérdida de glándulas e infiltrado inflamatorio moderado/severo. - Submucosa y muscular con infiltrado inflamatorio leve. - Algunas zonas donde se observan vasos congestivos. Fragmento intestinal en una sola pieza de 2,9 cm con engrosamiento de 1 cm, con lesión de color marrón. - Necrosis de la mucosa intestinal. - Infiltrado inflamatorio severo en submucosa y leve en muscular. Fragmento intestinal de 2,8 cm (un solo fragmento) con lesión macroscópica en un extremo y de color marrón oscuro de 1,7 cm. - Necrosis de la mucosa intestinal. - Infiltrado inflamatorio severo en submucosa y leve en muscular. - En algunas zonas la pared intestinal está preservada. 118 Fragmento intestinal en una sola pieza para su procesado de 3 x 1 cm aparentemente sin lesión - Pared intestinal preservada. - En submucosa y en algunos puntos hay un importante infiltrado inflamatorio formando nódulos que protruyen en la mucosa. No se observa lesión. Fragmento intestinal en una sola pieza de 2,6 x 1 cm sin lesión macroscópica. - Pared intestinal sin lesiones con mucosa de colon preservada. - Leve infiltrado infamatorio en lámina propia. 119 DISCUSIÓN GENERAL 120 121 DISCUSIÓN GENERAL Con el objetivo de formular y evaluar la idoneidad de hidrogeles biodegradables de polisacáridos para la liberación colónica de fármacos, en el trabajo realizado se han empleado diversas técnicas in vitro, así como estudios in vivo. Se realizaron análisis mediante Espectroscopía por Transformada de Fourier de Infrarrojo (FTIR) y Calorimetría Diferencial de Barrido (DSC) para evaluar los efectos de la compresión en la goma xantana y la goma de garrofina. Los resultados obtenidos de ambos análisis no indicaron cambios significativos en las propiedades químicas o estructurales de los polisacáridos tras someterlos al proceso de compresión, ni en los polisacáridos de forma individual ni en la mezcla de ambos. En el espectro de FTIR, que proporciona información sobre los grupos funcionales presentes en las moléculas y puede indicar cambios en la estructura química, no se detectaron diferencias notables tras la compresión. Esto sugiere que la compresión a la que fueron sometidos los polisacáridos no alteró de manera detectable sus estructuras químicas o conformaciones moleculares. Por otro lado, el análisis mediante DSC, que evalúa las transiciones térmicas de las muestras, como la transición vítrea, también mostró resultados consistentes 128 CONCLUSIONES 129 130 CONCLUSIONES El capítulo 1 describe un estudio sobre la viscosidad y el comportamiento reológico de las dispersiones de goma xantana y goma garrofina en agua. Se observó que la goma xantana tiene una mayor viscosidad y exhibe un comportamiento pseudoplástico de Bingham, mientras que la goma garrofina tiene una viscosidad menor y un comportamiento de adelgazamiento por cizalladura. Las mezclas de ambas gomas mostraron un comportamiento pseudoplástico de Bingham con valores variables de esfuerzo de cizallamiento de rendimiento en función de la composición de la mezcla. Se observó que la goma xantana y sus mezclas se desviaban más del comportamiento newtoniano que la goma garrofina, y los valores del índice de comportamiento de flujo (n) se correlacionaban con la proporción de goma xantana/goma garrofina en la mezcla. El índice de consistencia (K) mostró que la goma xantana producía la dispersión más viscosa mientras que la goma garrofina daba lugar a la menos viscosa. Sin embargo, todas las mezclas de goma xantana/goma garrofina mostraron valores de K similares, independientemente de la proporción de goma en la mezcla. La pre-compresión de la goma xantana causó una disminución en la viscosidad de las dispersiones, mientras que la compresión de la goma garrofina apenas 131 alteró su comportamiento reológico. Además, se observó que la temperatura también afectaba la viscosidad de las dispersiones de la goma xantana. Las pruebas de reología oscilatoria revelaron diferencias marcadas entre las dispersiones de goma xantana y las de goma garrofina. La goma xantana formó una red tridimensional con enlaces duraderos, mientras que la goma garrofina exhibió una red de corta duración. La pre-compresión de las gomas alteró significativamente el comportamiento reológico de las mezclas, aumentando los valores de los módulos de almacenamiento y pérdida. Las pruebas de difusión de fármacos revelaron que los geles de las mezclas de gomas xantana y garrofina no mostraron diferencias significativas en los perfiles de difusión, y las microviscosidades de las dispersiones de hidrogel eran similares a las del agua. En cuanto a la liberación de fármacos, se observó una liberación sostenida en los geles obtenidos, y las tasas de liberación variaron en función del pH y del fármaco utilizado. La goma garrofina mostró la misma tasa de liberación en ambos niveles de pH, mientras que la goma xantana y las mezclas de goma xantana y goma garrofina mostraron una tasa de liberación más baja a pH 6,8. La liberación del fármaco acetónido de triamcinolona fue lenta e independiente del pH y de la composición del xerogel. En resumen, el estudio concluye que la pre-compresión de gomas y la temperatura pueden ser parámetros efectivos para la modulación de las propiedades de hinchamiento y liberación de hidrogel. Los estudios de bioadhesión revelan que los hidrogeles de goma xantana, goma garrofina y sus mezclas presentan propiedades bioadhesivas adecuadas, dependiendo de las condiciones de hidratación. Estos hidrogeles tienen una bioadhesión similar al Carbopol 940, lo que los hace interesantes para la formulación de medicamentos destinados a la administración en mucosas. La incorporación de ciclodextrinas a las mezclas de polisacáridos empleadas en la fabricación de los xerogeles influyen de manera significativa en la difusión y liberación del fármaco acetónido de triamcinolona. La γ-ciclodextrina ha demostrado tener una influencia más pronunciada que la hidroxipropil-β-ciclodextrina en la difusión del acetónido de triamcinolona en los hidrogeles, destacando especialmente en aquellos elaborados con goma xantana o sus mezclas con goma garrofina. Esta diferencia puede atribuirse al 132 mayor tamaño molecular de los complejos de inclusión formados con la γ-ciclodextrina y a la mayor viscosidad de estas mezclas. La incorporación de la γ-ciclodextrina tiene un efecto significativo en la capacidad de liberación del acetónido de triamcinolona desde los xerogeles. El aumento de la solubilidad del acetónido de triamcinolona, probablemente debido a la formación del complejo de inclusión in situ, parece desempeñar un papel crucial en este proceso. Los hidrogeles elaborados a partir de estas mezclas son capaces de liberar de manera prácticamente constante su contenido a lo largo de 24 horas, lo cual confiere a estos sistemas un gran potencial para la liberación de fármacos a lo largo de todo el tracto gastrointestinal, especialmente a nivel del colon. Se ha realizado un estudio de efectividad clínica de los hidrogeles de goma xantana y goma garrofina empleando un modelo de colitis ulcerosa inducida mediante TNBS. Se ha analizado para ello la variación de peso tras la inducción y durante los diferentes tratamientos, así como los niveles de mieloperoxidasa, el índice de edema y la puntuación de la actividad clínica. Para ello se han estudiado diferentes tratamientos además de los hidrogeles conteniendo el acetónido de triamcinolona. Los resultados muestran la mejor actividad de los hidrogeles frente a la espuma rectal o a la disolución de acetónido de triamcinolona administrada oralmente. Sorprendentemente el grupo de animales tratados con el xerogel placebo, sin principio activo, mostró un nivel de actividad similar al observado con la espuma o la solución oral. Este resultado muestra un efecto positivo de los polisacáridos sobre la evolución de la enfermedad. 133 REFERENCIAS BIBLIOGRÁFICAS 134 135 REFERENCIAS BIBLIOGRÁFICAS 1. Negussie AB, Dell AC, Davis BA, Geibel JP. Colonic Fluid and Electrolyte Transport 2022: An Update. Cells [Internet]. 2022 May 1 [cited 2024 Jan 5];11(10). Available from: /pmc/articles/PMC9139964/ 2. Banks MR, Farthing MJG. Fluid and electrolyte transport in the small intestine. Curr Opin Gastroenterol [Internet]. 2002 [cited 2024 Jan 5];18(2):176–81. Available from: https://pubmed.ncbi.nlm.nih.gov/17033283/ 3. Irving MH. ABC of Colorectal Diseases ANATOMY AND PHYSIOLOGY OF THE COLON, RECTUM, AND ANUS. BMJ [Internet]. 1992;304. Available from: http://www.bmj.com/ 4. Tan J, McKenzie C, Potamitis M, Thorburn AN, Mackay CR, Macia L. 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