Edición genética aplicada a la terapia celular del cáncer: Uso de CRISPR/Cas en la inmunoterapia con linfocitos infiltrantes de tumor (TILs) y linfocitos T con receptor de antígeno quimérico (CAR-T)

Edición genética aplicada a la terapia celular del cáncer: Uso de CRISPR/Cas en la inmunoterapia con linfocitos infiltrantes de tumor (TILs) y linfocitos T con receptor de antígeno quimérico (CAR-T) Giráldez Martínez, Martín Tutor: Dr. Ángel María Carracedo Álvarez Cotutora: Dra. Catarina Allegue Toscano Departamento: Medicina Xenómica Curso: 2020-2021 Convocatoria: Primeira 1 Índice Abreviaciones ................................................................................................................................ 3 Resumen ........................................................................................................................................ 4 Objetivos y metodología ............................................................................................................... 5 Introducción a la edición genómica .............................................................................................. 6 Sistema CRISPR/Cas ....................................................................................................................... 8 Aspectos históricos.................................................................................................................... 8 Aspectos técnicos ...................................................................................................................... 9 CRISPR-Cas como herramienta de edición genética. .................................................................. 12 Limitaciones y retos del sistema CRISPR/Cas .............................................................................. 14 Inmunoterapia ............................................................................................................................. 16 CAR-T ........................................................................................................................................... 18 CAR-T aprobados ......................................................................................................................... 19 Efectos adversos .......................................................................................................................... 20 El papel de la edición CRISPR en la mejora de las terapias CAR-T .............................................. 21 Linfocitos Infiltrantes de Tumor .................................................................................................. 27 Efectos adversos .......................................................................................................................... 29 El papel de la edición CRISPR en la mejora de la terapia con TILs .............................................. 29 Nuevas estrategias en la terapia celular ..................................................................................... 32 Reflexión personal desde el punto de vista clínico ..................................................................... 33 Conclusión ................................................................................................................................... 34 Referencias .................................................................................................................................. 35 2 Índice de figuras Figura 1. Esquema de la HDR y la NHEJ ......................................................................................... 7 Figura 2. Estructura y función del sistema CRISPR-Cas ................................................................. 9 Figura 3. Esquema de las etapas del sistema CRISPR .................................................................. 11 Figura 4. DSB mediada por el complejo gRNA/Cas9 ................................................................... 12 Figura 5. Efectos off-target.......................................................................................................... 15 Figura 6. Aplicaciones de CRISPR en la inmunoterapia y sobre la célula tumoral ...................... 17 Figura 7. Estructura y evolución de los CAR ................................................................................ 18 Figura 8. Limitaciones de la terapia CAR-T .................................................................................. 21 Figura 9. Análisis de la supervivencia con la inserción del CAR en el locus TRAC ....................... 22 Figura 10. Análisis de supervivencia con CAR TCR/HLA-1 negativo ............................................ 23 Figura 11. K.O. de TRAC y PD1 ..................................................................................................... 23 Figura 12. Análisis de supervivencia con CAR-T EGFRvIII delta PD1 ........................................... 24 Figura 13. Análisis de supervivencia con CAR-T CD19 K.O. GM-CSF ........................................... 25 Figura 14. Pasos en la terapia con linfocitos infiltrantes de tumor ............................................ 28 Figura 15. Eliminación dirigida de Gata3 y tamaño tumoral ....................................................... 30 Figura 16. Enfermedades, intervenciones y fases del ensayo clínico con TILs ........................... 31 Figura 17. Índice de fagocitosis ................................................................................................... 33 Índice de tablas Tabla 1 Estrategias con CRISPR para mejorar la terapia CAR-T................................................... 25 Tabla 2 Ensayos clínicos con CRISPR para la obtención de CAR-T universales ........................... 26 3 Abreviaciones - Cas: CRISPR associated (gene) - dsDNA: double-stranded DNA - CAR: chimeric antigen receptor - PAM: protospacer adjacent motifs - crRNA: CRISPR RNA - ZFNs: Zinc-finger nucleases - CRISPR: clustered regularly - KI: knockin interspaced short palindromic - KO: knockout repeats - TCR: T cell receptor - CRS: cytokine release syndrome - CPP: cell penetrating peptides - EMA: European Medicine - LNP: lipids nanoparticles Agency - WT: wild type - FDA: Food and Drug - TAMs: tumor associated macrophages Administration - TEM: tumor microenvironment - HDR: homology directed repair - gRNA: guide RNA - NHEJ: non homologous end - dCas9: dead Cas9 joining - DSB: double-strand break - pegRNA: prime editing guide RNA - SNP: single nucleotide polymorphism - TILs: tumor infiltrating lymphocytes - TALENs: transcription activatorlike effector nucleases - tracrRNA: trans-activating CRISPR RNA - MHC: Major histocompatibility complex 4 Resumen La edición genética aplicada a la inmunoterapia celular del cáncer es un potente campo de investigación hoy en día, gracias en gran parte a las herramientas basadas en el sistema CRISPR/Cas, que permite una edición sencilla y eficaz, en múltiples genes a la vez. El salto de estas terapias del laboratorio a la clínica está cada día más cerca, y en el caso de los linfocitos con receptor de antígeno quimérico (CAR-T) ya es una realidad, aunque aún quedan importantes pasos en el camino hacia la optimización de esta nueva arma contra el cáncer. En este trabajo, veremos cómo funciona el sistema CRISPR/Cas, así como la terapia celular con CAR-T y con linfocitos infiltrantes de tumor (TILs), y el papel que en ellas desempeña la edición genética mediada por la herramienta previamente mencionada, para finalizar con la última novedad de la terapia celular contra el cáncer. La búsqueda documental bibliográfica se complementó con la asistencia a journal clubs, sesiones de discusión de los proyectos de la Unidad de Edición Genómica del grupo de Medicina Xenómica y asistencia puntual a los laboratorios del CIMUS. Gene editing applied to cancer cell immunotherapy is a powerful field of research today, thanks in large part to tools based on the CRISPR/Cas system, which allows simple and efficient editing, in multiple genes at the same time. The leap of these therapies from the laboratory to the clinic is closer every day, and in the case of lymphocytes with chimeric antigen receptor (CAR-T) it is already a reality, although there are still important steps on the road to optimization of this new weapon against cancer. In this work, we will see how the CRISPR/Cas system works, as well as cell therapy with CAR-T and tumor infiltrating lymphocytes (TILs), and the role that gene editing mediated by the previously mentioned tool plays in them, to end with the latest novelty in cell therapy against cancer. The bibliographic documentary search was complemented with attendance at journal clubs, discussion sessions of the projects of the Genomic Editing Unit of the Xenomic Medicine group, and punctual attendance at the CIMUS laboratories. A edición de xenes aplicada á inmunoterapia con células cancerosas é hoxe un poderoso campo de investigación, grazas en gran parte a ferramentas baseadas no sistema CRISPR/Cas, que permite a edición sinxela e eficiente, en múltiples xenes ao mesmo tempo. O salto destas terapias do laboratorio á clínica está cada día máis preto e no caso dos linfocitos con receptor de antíxeno quimérico (CAR-T) xa é unha realidade, aínda que aínda hai pasos importantes no camiño para optimizar esta nova arma contra o cancro. Neste traballo veremos como funciona o sistema CRISPR/Cas, así como a terapia celular con CAR-T e linfocitos infiltrantes de tumores (TILs) e o papel que xoga neles a edición de xenes mediada pola ferramenta mencionada anteriormente, para rematar coa última novidade da terapia celular contra o cancro. A busca documental bibliográfica complementouse coa asistencia a journal clubs, sesións de debate dos proxectos da Unidade de Edición Xenómica do grupo de Medicina Xenómica e asistencia puntual aos laboratorios do CIMUS. 5 Objetivos y metodología El objetivo de este trabajo es revisar diferentes estrategias que se están desarrollando en el campo de la terapia celular, en concreto con linfocitos de la estirpe T, basadas en la edición genética mediada por el sistema CRISPR/Cas. Se hablará de la investigación con CAR-T, sus efectos secundarios, limitaciones, y posibles estrategias para mejorar esta terapia, como la obtención de linfocitos universales o más resistentes a la regulación negativa que ejerce el tumor sobre ellos. De igual modo se aborda la otra terapia con linfocitos T: los linfocitos infiltrantes de tumor (TILs). Al final del trabajo se mencionan nuevas estrategias con estirpes celulares diferentes a los linfocitos, así como una reflexión personal desde el punto de vista más clínico. La información se obtuvo de la base de datos PubMed (https://pubmed.ncbi.nlm.nih.gov/), de diversos artículos científicos proporcionados por miembros del equipo del CIMUS, la web de la Agencia Europea del Medicamento (EMA) (https://www.ema.europa.eu/en), la de la Food and Drug Administration (FDA) (https://www.fda.gov/), así como el registro de ensayos clínicos ClinicalTrials (https://clinicaltrials.gov/). La búsqueda fue guiada tratando de incorporar publicaciones lo más recientes posibles, con el objetivo de mostrar lo último en este campo. 6 Introducción a la edición genómica El popular sistema CRISPR / Cas permite la ingeniería de precisión sobre el genoma al inducir una ruptura de doble hebra en el DNA (Double strand break, DSB) específicamente en el sitio que buscamos dentro del genoma. La DSB se repara mediante vías de reparación de DNA endógenas, ya sea mediante la unión de extremos no homólogos (NonHomologous End Joining, NHEJ) o reparación dirigida por homología (Homologous Directed Repair, HDR) (1). Nos fijaremos un poco más en estas dos vías principales de reparación antes de entrar en detalle con la CRISPR/Cas. - NHEJ: es la vía de reparación de rotura de doble hebra predominante a lo largo del ciclo celular y representa casi toda la reparación de DSB fuera de las fases S y G2. NHEJ se basa en la proteína Ku para enhebrarse en los extremos del DNA y así mejorar la afinidad de los componentes enzimáticos del NHEJ que consisten en polimerasas (Pol μ y Pol λ), una nucleasa (el complejo Artemis · DNA-PKcs) y una ligasa (XLF · XRCC4 · Complejo Lig4). Cada uno de los componentes enzimáticos se distingue por su versatilidad al actuar en diversas configuraciones de extremos de DNA incompatibles junto con una flexibilidad en el orden de carga, lo que da lugar a muchos resultados de unión posibles de una DSB. Los extremos del DNA pueden ligarse directamente o, si los extremos son incompatibles, procesarse hasta que se logre una configuración ligable que a menudo se estabiliza con hasta 4 pb de microhomología terminal. El procesamiento de extremos de DNA da como resultado la pérdida o adición de nucleótidos, lo que explica por qué las DSB reparadas por NHEJ rara vez se restauran a su secuencia de DNA original. Por lo tanto, NHEJ es una vía con múltiples enzimas a su disposición para reparar las DSB, lo que conlleva una diversidad de resultados de reparación, como por ejemplo la producción de microdeleciones o microinserciones, que pueden alterar el marco de lectura (2). - HDR: Se trata de una reparación que emplea un molde homólogo como base para arreglar la ruptura de la doble hebra de DNA. Esta secuencia que sirve de guía suele provenir de la cromátida hermana, y por eso este tipo de reparación acontece en las fases S y G2 del ciclo celular. Al principio, actúa sobre la secuencia el complejo MRN (Mre11‐Rad50‐Nbs1), que produce una resección en uno de los hilos de los extremos de la ruptura, convirtiéndolos en cohesivos. Luego se une la proteína RPA (Replication Protein A), lo que a su vez permite la participación de otras (como RAD51 o BRCA) y se cataliza una estructura filamentosa en el extremo. Esto conlleva la invasión de una doble hebra de DNA que se estabiliza en un bucle D (D-loop formation) en presencia de un alto nivel de homología, un proceso que conduce a la formación de un heterodímero. La secuencia homóloga dirigirá la síntesis de la cadena cortada, que posteriormente se estabilizará mediante ligasas, lo que resultará en la reparación del daño (3). 7 Figura 1. Esquema de la HDR y la NHEJ Figura 1. Esquema de la HDR y la NHEJ. En el caso de la HDR (izquierda en la imagen), vemos representadas diferentes complejos proteicos que intervienen en la reparación, como el MRE11 o el RAD51, así como el molde de DNA sobre el que se realiza la reparación. A la derecha de la imagen tenemos la NHEJ, donde también se representan diferentes proteínas (polimerasas, nucleasas, ligasas) que llevan a la reparación de la doble hebra generando en el proceso un indel, una deleción o una incorporación de un nucleótido en la secuencia. Imagen tomada de (4). Estos métodos de reparación son clave cuando hablamos de edición genética, no solo con CRISPR/Cas, si no que en otras técnicas también, como los dedos de Zinc o las TALENs (Transcription activator-like effector nuclease). La NHEJ tiende a producir cambios en el marco de lectura de un gen, con la incorporación o la deleción de un solo nucleótido ya se alteran los codones (agrupación de tres nucleótidos, que codifican normalmente para un aminoácido) a partir de ese nucleótido, y esto conlleva una alta probabilidad de que se genere un codón de parada, lo que no permitiría que continuase la transcripción de ese gen, dando lugar a la no expresión de lo que codificaba ese gen. Es decir, que cuando una célula usa este método de reparación, facilita la generación de un KnockOut (KO), esto es, una modificación en la célula que hace que pierda la expresión de un gen. 8 Por otra parte, tenemos la HDR, la cual nos permite introducir nuevo material genético en una región concreta si suministramos un fragmento de DNA homólogo en la rotura que producimos. Para ello, las células necesitan estar en unas fases concretas del ciclo celular como mencionamos previamente (S y G2) para poder llevar a cabo esta reparación. Regular qué método de reparación emplea la célula según nos interese sería muy interesante (5). Sistema CRISPR/Cas Aspectos históricos Veamos cómo fueron los orígenes de esta técnica y su evolución (apenas 30 años desde su descubrimiento). El primer antecedente del sistema CRISPR se remonta a 1987, cuando se publicó el primer artículo que hacía mención a la existencia de secuencias repetidas en el genoma bacteriano, en concreto en Escherichia Coli (6). Inicialmente se consideró que tales secuencias carecían de función. Posteriormente, en el año 1993, el investigador español Francisco Martínez Mojica, describió secuencias con una estructura similar en las arqueas Haloferax mediterranei (7), que habitan exclusivamente en las salinas de Santa Pola (Alicante), y dos años después (1995) publicó otro artículo reportando su presencia también en Haloferax volcanii (8). En este segundo artículo se describían dichas secuencias como fragmentos de 30 pb (pares de bases) con simetría de díadas que se repetían en tándem, intercaladas con secuencias únicas de 33-39 pb y se las denominaba TREPs (por tándem repeats). Posteriormente pasaron a denominarse “repeticiones cortas regularmente espaciadas” (SRSRs por sus siglas en inglés: short regularly spaced repeats) y en el año 2000 Mojica ya había encontrado estas secuencias en 20 microorganismos diferentes (9). Dos años más tarde, Ruud Jansen identificó genes que estaban asociados a estas secuencias, los genes cas (CRISPR-associated) que codifican para las proteínas Cas, y de común acuerdo con Mojica, decidieron utilizar en adelante el nombre que actualmente conocemos: CRISPR (Clustered Regularly Interspaced Short Palindromic Repeats / repeticiones palindrómicas cortas agrupadas interespaciadas con regularidad) (10). Fue en 2005 cuando tres laboratorios independientes, entre ellos el de Mojica, dilucidaron la función biológica del sistema CRISPR, al identificar similitudes entre los espaciadores asociados a CRISPR y el genoma de ciertos virus que infectan a bacterias, deduciendo así que CRISPR podría ser un sistema de defensa frente a virus (11, 12, 13). Estos descubrimientos sentaron las bases para el posterior desarrollo de la técnica de edición genética. Tras el descubrimiento de 2005, se sucedieron toda una serie de investigaciones que fueron esclareciendo y ratificando la función y el modo de acción de este sistema defensivo inmune adaptativo natural con memoria (14). Finalmente, en el año 2012, Doudna y Charpentier utilizaron el sistema CRISPR para cortar ADN de forma dirigida in vitro y demostraron que los dos RNA necesarios para la función de Cas9 (crRNA y tracrRNA) podían unirse en un único ARN guía (sgRNA) (15). Su artículo fue el primero en el que se reconocía el potencial de CRISPR para ser utilizado en edición genética, y a partir de ahí vinieron nuevos avances de interés biotecnológico y biomédico (16). El descubrimiento de la aplicación de este sistema como herramienta de edición genética les valió el premio Nobel de Química 2020 a estas dos investigadoras. 15 Figura 5. Efectos off-target Figura 5. Representación de los posibles efectos off-target del sistema CRISPR/Cas (44). Con las mejoras en del diseño del gRNA se ha reducido notablemente los efectos off-target; sin embargo, ahora mismo uno de los mayores retos que plantea este sistema son los efectos indeseados on-target, es decir, que el complejo Cas-gRNA llega correctamente al lugar que nosotros queremos, pero en su proceso de escisión no actúa como lo habíamos planeado, llegando a producir un extenso daño on-target, incluyendo grandes deleciones, inversiones e inserciones. Un estudio Investigó la aparición de efectos nocivos on-target en células madre humanas después de la inserción de mutaciones relacionadas con la enfermedad mediante HDR y edición de genes mediante NHEJ. Identificaron grandes deleciones genómicas mono-alélicas y pérdida de heterocigosidad que escapan a los controles de calidad estándar en hasta el 40% de los clones editados. Para detectar de manera confiable tales eventos, describen herramientas basadas en genotipado simple, de bajo costo y ampliamente aplicable de PCR de genotipado cuantitativo (qgPCR) y polimorfismo de un solo nucleótido (SNP) y sugirieron su uso como controles de calidad adicionales después de la edición. Esto ayudaría a garantizar la integridad de los loci editados y aumentaría la confiabilidad de la edición CRISPR (79). 16 Inmunoterapia La inmunoterapia es una forma de tratamiento del cáncer que utiliza las fortalezas del propio sistema inmunitario para prevenir, controlar y eliminar el cáncer. La inmunoterapia puede: - Educar al sistema inmunitario para reconocer y atacar células cancerosas específicas. - Incrementar las células inmunitarias para ayudar a eliminar el cáncer. - Proporcionar al cuerpo otros elementos que mejoren la respuesta inmunitaria. La inmunoterapia se presenta de diversas formas: como anticuerpos dirigidos, vacunas contra el cáncer, transferencia de células adoptivas, virus que se inyectan en tumores, inhibidores de puntos de control, citocinas y adyuvantes. Algunos tratamientos de inmunoterapia utilizan ingeniería genética para mejorar la capacidad de las células inmunitarias para combatir el cáncer, lo que se conoce como terapia génica. En los últimos años, se han desarrollado varias técnicas de manipulación genética que involucran mecanismos de reparación del DNA que incorporan modificaciones específicas en el genoma de una célula. Estas técnicas han hecho posible diversas alteraciones en el genoma de una manera específica, y así poder editar el genoma de las células tumorales para inducir la apoptosis, reducir la resistencia a los fármacos o restaurar los genes mutantes. También se pueden emplear en la manipulación genética del sistema inmunológico para potenciar las respuestas inmunitarias antitumorales. CRISPR es una de estas técnicas. Debido a su excepcional potencial y eficacia, esta plataforma ha definido una nueva era, inclinando el equilibrio del tratamiento del cáncer a favor de la manipulación genética del tumor y las células inmunes. CRISPR se emplea preferentemente para tratar de determinar las funciones de varios genes y vías de señalización, lo que lleva al descubrimiento de nuevas dianas terapéuticas. Además, ha contribuido en avances como la identificación de la interacción entre el sistema inmunitario y el tumor, la investigación de células T con receptor de antígeno quimérico universal (CAR-T), la inhibición de los inhibidores de puntos de control inmunitarios y la viroterapia oncolítica (45). 17 Figura 6. Aplicaciones de la tecnología CRISPR en múltiples aspectos del tratamiento del cáncer (45). La figura 6 muestra la gran versatilidad y utilidad del sistema CRISPR/Cas tanto en el campo de la inmunoterapia como en otras muchas estrategias para luchar contra el cáncer. A la derecha de la imagen vemos su aplicación en la terapia génica sobre la propia célula tumoral, la identificación de biomarcadores pronóstico, así como el descubrimiento de nuevos objetivos a los que dirigir un tratamiento, o el descifrar la causa de que el tumor sea resistente a una terapia determinada. También nos permitiría realizar screenings masivos a la población. En la izquierda tenemos ejemplos de su aplicación para con la inmunoterapia: desarrollo de virus oncolíticos, capaces de infectar específicamente a las células tumorales y destruirlas; propiciar en los macrófagos que se diferencien hacia el fenotipo proinflamatorio para desencadenar una potente reacción inmune ante el tumor; mejora de la terapia con CAR-T; inhibición de los puntos de control del sistema inmune que limitan la acción de los linfocitos T; así como buscar el apoyo de otras células como los Natural Killer. Figura 6. Aplicaciones de CRISPR en la inmunoterapia y sobre la célula tumoral 18 Nosotros vamos a centrarnos particularmente en dos: los CAR-T (Linfocito T con receptor de antígeno quimérico) y los TILs (Linfocitos infiltrantes de tumor). CAR-T Los receptores de antígenos quiméricos (CAR) son receptores diseñados genéticamente que confieren una especificidad dirigida en una célula efectora inmunitaria (célula T) (46). El receptor de antígeno quimérico es una proteína de fusión modular que comprende: un dominio de unión a la diana extracelular que generalmente se deriva del fragmento variable de cadena única (scFv) del anticuerpo, un dominio espaciador, un dominio transmembrana y un dominio de señalización intracelular que contiene CD3z unido con ninguna, o bien una o dos moléculas coestimuladoras como CD28, CD137 y CD134. Las células T diseñadas para expresar CAR mediante tecnología de transferencia de genes son capaces de reconocer específicamente su antígeno diana a través del dominio de unión scFv, lo que da como resultado la activación de las células T de una manera independiente del complejo mayor de histocompatibilidad (MHC), y de este modo atacar específicamente a las células cancerígenas (47). Figura 7. Estructura y evolución de los CAR 19 Figura 7. Estructura y evolución de los receptores de antígeno quimérico. El apartado a) representa la estructura central de un CAR, destacando los componentes principales del dominio extracelular, el dominio transmembrana y el dominio intracelular (endodominio). El apartado b) muestra la evolución del desarrollo de CAR. La primera generación contenía solo motivos ITAM en el dominio intracelular. Los CAR de segunda generación incluían una molécula coestimuladora (CM) 1, y los CAR de tercera generación contenían un segundo CM. La cuarta generación de CAR se basó en CAR de segunda generación (que contienen 1 a 3 ITAM) emparejados con una quimiocina expresada de manera constitutiva o inducible (por ejemplo, IL-12). Estas células T también se denominan células T redirigidas para la destrucción universal mediada por citocinas (TRUCK). La quinta, o "próxima generación", también se basa en la segunda generación de CAR, con la adición de dominios intracelulares de receptores de citocinas (p. Ej., Fragmento de cadena IL-2Rβ) (48). CAR-T aprobados La terapia con CAR-T es un nuevo tratamiento eficaz para las neoplasias hematológicas. Cuatro productos de células T con CAR dirigidos contra células que expresan CD-19, y uno dirigido contra el BCMA (B cell maturation antigen), están aprobados para su uso clínico por la FDA de EE. UU y también por la EMA en Europa: Dirigidos contra CD-19: - Tisagenlecleucel (Kymriah), para leucemia linfoblástica aguda (LLA) en niños y adultos jóvenes de hasta 25 años cuyo cáncer no respondió al tratamiento anterior, ha vuelto dos o más veces o ha vuelto después de un trasplante de células madre, y subtipos de linfoma difuso de células B grandes (LDCBG) en adultos cuyo cáncer ha regresado o no respondió después de dos o más tratamientos previos (49). - Axicabtagene ciloleucel (Yescarta), para LDCBG y linfoma mediastínico primario de células B grandes (LPMBD) en adultos cuyo cáncer ha regresado o ha dejado de responder al tratamiento anterior (50). - Lisocabtagene maraleucel (Breyanzi), para el tratamiento de pacientes adultos con linfoma de células B grandes en recaída o refractario (R / R), incluido el LDCBG no especificado de otra manera (incluido el LDCBG derivado de un linfoma indolente), linfoma de células B de alto grado, LPMBD y linfoma folicular grado 3B (51). - Brexucabtagene autoleucel (Tecartus), para el tratamiento de pacientes adultos con linfoma de células del manto (LCM) en recaída o refractario (52). Dirigido contra BCMA: - Idecabtagene vicleucel (Abecma), para el tratamiento de pacientes adultos con mieloma múltiple en recaída o refractario después de cuatro o más líneas de terapia previas que incluyen un agente inmunomodulador, un inhibidor del proteasoma y un anticuerpo monoclonal antiCD38 (53). 20 Aparte de su empleo en neoplasias hematológicas donde están demostrando un notable éxito, se intenta también extender su uso a los tumores sólidos, en los cuales ese éxito se ha visto limitado. Los desafíos que plantean los tumores sólidos a la terapia con células CAR-T se pueden describir en tres pasos: encontrar, ingresar y sobrevivir en el tumor. El uso de diseños de CAR duales que reconocen múltiples antígenos a la vez y la administración local de células CAR-T son estrategias que se han utilizado para superar el obstáculo de localizar el tumor. Además, el microambiente inmunosupresor del tumor (TME) tiene implicaciones para la función de las células T en términos de diferenciación y agotamiento, y la combinación de los CAR con el bloqueadores del punto de control o el agotamiento de otros factores supresores en el microambiente ha mostrado resultados muy prometedores para mitigar el fenómeno del agotamiento de las células T. Finalmente, identificar y superar los mecanismos asociados con la disfunción en las células CAR-T es de vital importancia para generar linfocitos que puedan proliferar y eliminar con éxito las células tumorales. La estructura y los dominios coestimuladores elegidos para el CAR pueden desempeñar un papel importante en la función general de las células CAR-T en el TME, y los CAR "blindados" que secretan citoquinas así como los CAR de tercera y cuarta generación con múltiples dominios coestimuladores ofrecen formas de mejorar la función de las células CAR-T (54). La tecnología de edición genómica CRISPR/Cas ofrece posibles dianas y aplicaciones prometedoras para crear células CAR-T de una nueva generación, incluyendo células CAR-T universales al eliminar el TCR o HLA endógeno, células CAR-T más potentes mediante la ablación de moduladores inhibidores y células CAR-T más controlables añadiendo interruptores seguros o genes suicidas inducibles (55). Efectos adversos A pesar de sus prometedores resultados, las terapias con CAR-T no están exentas de riesgos para la salud de los pacientes, y es que al igual que la clásica quimioterapia, esta estrategia también presenta diversos efectos secundarios, que pueden ir desde unos síntomas considerados como leves, hasta graves desenlaces, incluyendo la muerte del paciente en casos extremos. El Síndrome de liberación de citocinas (CRS) es uno de los efectos secundarios más prevalentes de esta terapia. A medida que las células CAR-T se multiplican, pueden liberar grandes cantidades de citoquinas en la sangre, entre las que destacan IFN-γ, TNF-α, IL-10 y particularmente IL-6, que pueden activar el sistema inmunológico y producir un indeseable incremento de la permeabilidad vascular. Los efectos secundarios graves de esta excesiva liberación pueden incluir: fiebre alta y escalofríos, dificultad para respirar, náuseas intensas, vómitos y / o diarrea, sensación de mareo o aturdimiento, dolores de cabeza, ritmo cardíaco acelerado, sensación de mucho cansancio, dolor muscular y / o articular, disfunción cardíaca, insuficiencia renal, insuficiencia hepática y coagulación intravascular diseminada. La excesiva permeabilidad vascular puede producir anasarcas, edema pulmonar, derrame pericárdico y potencialmente fallo multiorgánico. El CRS requiere un diagnóstico precoz para poder instaurar el tratamiento adecuado: corticosteroides, y en caso de que fuera necesario, tocilizumab (anticuerpo monoclonal contra la interleuquina 6) (56). Toxicidad neurológica: se desconoce la fisiopatología causante de estos efectos secundarios neurológicos, pero es posible que los niveles elevados de citoquinas sean en parte responsables 21 de las secuelas neurológicas. Se piensa que la permeabilidad vascular producida por el CRS podría alterar la barrera hematoencefálica, volviéndola más vulnerable. Podemos encontrarnos con: cambios en la conciencia, confusión o agitación, convulsiones, temblores o espasmos, dificultad para hablar y comprender, pérdida del equilibrio. Tratamiento: si es necesario, tratamiento de soporte y / o corticoides. Otros posibles efectos secundarios graves de la terapia con CAR-T pueden ser: Reacciones alérgicas durante la perfusión, niveles anormales de minerales en la sangre, como niveles bajos de potasio, sodio o fósforo; un sistema inmunológico debilitado, con mayor riesgo de infecciones graves, recuento bajo de células sanguíneas, que puede aumentar el riesgo de infecciones, fatiga y hematomas o sangrado. Entre los efectos adversos más graves también está descrito el síndrome de lisis tumoral tras la infusión de CARTs (57). Figura 8. Limitaciones de la terapia CAR-T Figura 8. Limitaciones de la terapia con células CAR-T. A) No reconocimiento de las células tumorales al no presentar el antígeno en la superficie. B) Reaccionan y atacan a células sanas con el marcador para el que están diseñados. C) Dificultad para llegar hasta donde se encuentra el tumor. D) El microambiente inmunosupresivo generado por el tumor limita la acción de los linfocitos. E) La toxicidad asociada a las CAR-T. Imagen tomada de (58). El papel de la edición CRISPR en la mejora de las terapias CAR-T Como vemos, no son pocas las limitaciones y los efectos indeseados que presenta esta terapia. Por ello, los científicos están buscando soluciones para tratar de optimizarla. Y es aquí donde la herramienta de edición genética CRISPR puede, y ya lo está haciendo, desarrollar un papel muy importante a la hora de mejorar la inmunoterapia. CRISPR-Cas9 logra una alta eficiencia, logrando buenos resultados en la edición múltiple (multiplex editing), y ofrece la posibilidad de 22 dirigir la integración del material genético introducido mediante recombinación homóloga. Permite resolver los problemas que se presentaron con las otras herramientas de edición genética (TALENs y ZFNs) y facilita enormemente problemas como el de la universalidad o la mejora de la supervivencia en los entornos tumorales (55). Las estrategias para desarrollar nuevos y mejores CAR-Ts se basan en múltiples ediciones genéticas que permitan su universalidad, así como la introducción de mecanismos de control y reducción de efectos adversos, y mejorar su eficacia aumentando la supervivencia y evitando mecanismos de anergia tumoral. Veremos algunos estudios que se han llevado a cabo o se están desarrollando en este campo. Dirigir un CAR al locus TRAC con CRISPR / Cas9 mejora la respuesta antitumoral (59). En este estudio, muestran que dirigir un CAR específico de CD19 al locus de la constante α del receptor de células T (TRAC) no solo da como resultado una expresión de CAR uniforme en las células T en sangre periférica humana, sino que también mejora la potencia de las células T editadas superando a las células CAR T generadas convencionalmente en un modelo de ratón de leucemia linfoblástica aguda. Además, demuestran que dirigir el CAR al locus TRAC evita la señalización continuada del CAR y establece la internalización y reexpresión efectivas del CAR después de una exposición única o repetida al antígeno, lo que retrasa la diferenciación y el agotamiento de las células T efectoras (59). Figura 9. Análisis de la supervivencia con la inserción del CAR en el locus TRAC Figura 9. Análisis de Kaplan-Meier de la supervivencia de los ratones después de la inyección de los CAR-T. Vemos una mayor supervivencia en aquellos ratones con en el CAR en el locus TRAC. Imagen adaptada de (59). En otro estudio usaron la edición múltiple del genoma para generar células CAR-T universales resistentes a la inhibición de PD1 (60). El propósito de los investigadores era demostrar que el uso de células T alogénicas con alteraciones genéticas como células efectoras universales proporciona una alternativa y potencial mejora a la terapia actual con CAR-Ts contra cánceres y enfermedades infecciosas. Diseño experimental: emplearon el sistema CRISPR/Cas9 para realizar una edición genética múltiple. Combinando la entrega lentiviral de CAR y la electrotransferencia de mRNA de Cas9 y gRNAs que se dirigen al TCR endógeno, microglobulina β-2 (B2M) y PD1 simultáneamente, para generar células T con CAR alogénicas con alteraciones genéticas deficientes en TCR, molécula HLA de clase I y PD1. Resultados: Las células CAR-T editadas con CRISPR mostraron potentes actividades antitumorales, tanto in vitro como en modelos animales y eran tan potentes como las células CAR-T no editadas. Además, las células 23 T de doble deficiencia de TCR y HLA de clase I tenían una alorreactividad reducida y no causaban enfermedad de injerto contra huésped. Finalmente, la edición triple simultánea del genoma mediante la adición de la alteración de PD1 condujo a una actividad antitumoral in vivo mejorada de las células CAR-T editadas geneticamente. Conclusiones: Las células CAR-T y TCR alogénicas con modificaciones genéticas podrían actuar como donantes universales y proporcionar una alternativa a las células T autólogas, las cuales conllevan ciertas dificultades y altos costes de producción. Los linfocitos CAR-T y TCR alterados genéticamente junto a la inhabilitación de puntos de control pueden ser potentes células efectoras contra cánceres y enfermedades infecciosas (60). Figura 10. Análisis de supervivencia con CAR TCR/HLA-1 negativo Figura 10. Análisis de Kaplan-Meier de la supervivencia de los ratones después de la inyección de los CAR-T. Figura adaptada de (60). De nuevo otros investigadores siguieron esta línea de actuación, y generaron CAR-T universales frente EGFRvIII produciendo el knockout de PD1 con CRISPR/Cas9, lo que llevó a una mejora de su acción en un modelo preclínico de un tumor sólido, el glioblastoma (61). Figura 11. K.O. de TRAC y PD1 24 Figura 11. Edición del CAR-T con CRISPR/Cas9 para generar los KO de TRAC y PD1. Imagen tomada de (62). Un mecanismo por el cual los gliomas y otros cánceres pueden obstaculizar las células CAR-T es a través de la expresión superficial de ligandos inhibidores como el ligando 1 de muerte celular programada (PD-L1). Utilizando el sistema CRIPSR-Cas9, crearon células CAR-T universales resistentes a la inhibición de PD-1 a través de la edición genética múltiple, produciendo el KO del receptor de células T endógeno (TRAC), microglobulina beta-2 (B2M) y PD-1 (PDCD1). Las células CAR-T con triple edición demostraron una mejor actividad en modelos de glioma preclínicos. Se logró una supervivencia prolongada en ratones con tumores intracraneales después de la administración intracerebral, pero no intravenosa. La edición de genes con CRISPR-Cas9 no solo proporciona una potencial fuente de células donantes universales alogénicas, sino que también permite la interrupción simultánea de la señalización del punto de control que, de otro modo, impide la funcionalidad antitumoral máxima (61). Figura 12. Análisis de supervivencia con CAR-T EGFRvIII delta PD1 Figura 12. Respuestas antitumorales producidas por CAR-T-EGFRvIIIΔPD-1 in vivo. Las curvas de supervivencia se estimaron para cada grupo utilizando la estimación de límite de producto de Kaplan-Meier (61). 31 adversos más comunes encontrados fueron colitis, hepatitis, insuficiencia de la hormona adrenocorticotrópica, hipotiroidismo, diabetes tipo 1, daño renal agudo y miocarditis (75). Actualmente se está desarrollando un estudio sobre cánceres gastrointestinales metastásicos tratados con linfocitos infiltrantes de tumores en los que el gen que codifica el punto de control inmune intracelular CISH se inhibe mediante ingeniería genética CRISPR (NCT04426669). Los linfocitos infiltrantes de tumores han demostrado su eficacia en ciertos cánceres, principalmente en el melanoma. La terapia combinada con inhibidores de puntos de control de la superficie celular también se ha empleado en un intento de mejorar la eficacia de estas terapias celulares. Ahora es posible la ingeniería genética de las células T para aumentar aún más la actividad antitumoral. CISH (proteína SH2 inducida por citoquinas) es un nuevo punto de control inmunológico intracelular y un importante regulador negativo de la función y señalización de las células T. La inhibición de CISH en linfocitos antitumorales de ratón da como resultado un marcado aumento en la capacidad de estos para mediar en la regresión tumoral después de la administración a ratones portadores de tumores. Además, los datos en células T humanas específicas de neoantígeno, genéticamente modificadas, en las que se inhibió CISH, mostraron una mayor avidez funcional de TCR y una mayor capacidad de estas células T para detectar mutaciones específicas del cáncer y generar respuestas inmunes sólidas contra sus antígenos cancerosos afines. Por tanto, estas células T parecen tener una ventaja significativa en la inducción de respuestas antitumorales en comparación con los linfocitos antitumorales de tipo salvaje. Los investigadores han desarrollado y optimizado una estrategia basada en CRISPR/Cas9 para la ingeniería genética precisa y eficiente en células T humanas primarias sin sacrificar su viabilidad o su función, lo que permite la inhibición de un punto de control intracelular hasta ahora no farmacológico. Por lo tanto, en este protocolo, los investigadores proponen inhibir el gen que codifica el punto de control intracelular objetivo CISH en linfocitos de pacientes con cánceres metastásicos que se seleccionan por actividad antitumoral con el fin de evaluar la seguridad y eficacia de la terapia con células T genéticamente modificadas para tumores sólidos en el contexto de una nueva inhibición de puntos de control. Figura 16. Enfermedades, intervenciones y fases del ensayo clínico con TILs 32 Figura 16. Primera columna: cánceres del tracto gastrointestinal. Segunda columna: fármacos empleados para la linfodepleción preinfusión de TILs (ciclofosfamida y fludarabina), los propios TIL y Aldesleukin (interleuquina 2) para estimular a los linfocitos T. Tercera columna: fases del estudio. Imagen adaptada de NCT04426669. Nuevas estrategias en la terapia celular Hemos mencionado ya el papel del microambiente inmunosupresor que generan los tumores como un factor muy negativo para la inmunoterapia. Se ha visto que formando parte de ese ambiente se encuentran los macrófagos asociados a tumor (TAMs), que puede promover la progresión del tumor (M2) o potenciar la inmunidad antitumoral (M1). Se demostró que un subconjunto de TAM que expresan el receptor de folato β (FRβ) poseen un perfil inmunosupresor de tipo M2. En modelos de ratón de tumor singénico, la eliminación de FRβ + TAM en el TME mediada por CAR-T dirigidos contra el FRβ da como resultado un enriquecimiento de monocitos proinflamatorios, afluencia de linfocitos T CD8 + endógenos específicos del tumor, retraso en la progresión del tumor, y supervivencia prolongada. El preacondicionamiento del microambiente inmunosupresor tumoral con células CAR-T específicas de FRβ también mejora la eficacia de las células CAR-T anti-mesotelina dirigidas al tumor, mientras que simultáneamente la coadministración de ambos productos CAR no lo hace. Estos resultados destacan el papel potenciador de los FRβ + TAMs en el microambiente tumoral y las implicaciones terapéuticas de los agentes reductores de TAMs como complementos preparativos de las inmunoterapias convencionales que se dirigen directamente a los antígenos tumorales (76). Hasta ahora la inmunoterapia celular se había centrado en los linfocitos T. Pero nuevas estrategias basadas en otros tipos celulares se están desarrollando. Una muy prometedora se basa en aprovechar los macrófagos que se encuentran en el tumor, en potenciar el fenotipo proinflamatorio M1, para luchar contra el cáncer. Dadas las características funciones de los macrófagos y su capacidad para penetrar tumores, un equipo de investigadores diseñó, genéticamente, macrófagos humanos con CAR para dirigir su actividad fagocítica contra los tumores. Descubrieron un vector adenoviral quimérico capaz de superar la inherente resistencia de los macrófagos humanos primarios a la manipulación genética, e impulsó un fenotipo proinflamatorio sostenido (M1). Estos macrófagos con CAR (CAR-Ms) demostraron fagocitosis específica de antígeno y aclaramiento de tumores in vitro. En dos modelos de ratón de xenoinjerto de tumor sólido, una sola infusión de CAR-Ms humanos disminuyó la carga tumoral y prolongó la sobrevivencia promedio. La caracterización de la actividad CAR-M mostró que los CAR-M expresaban citoquinas proinflamatorias y quimioquinas, favorecían la conversión de los macrófagos M2 transeúntes en M1, la regulación al alza de la maquinaria de presentación de antígeno, un reclutamiento y presentación de antígenos a las células T, además de resistir los efectos de citoquinas inmunosupresoras. En modelos de ratones humanizados, demostraron además que los CAR-Ms inducen un efecto proinflamatorio en el microambiente tumoral y potencian la actividad de las células T antitumorales (77). 33 Figura 17. Índice de fagocitosis Figura 17. Fagocitosis basada en perlas marcadas con Rodo con pH de control o funcionalizadas con HER-2 por UTD (Untransduced, macrófagos no transducidos) y CAR-Ms contra HER-2. Imagen adaptada de (77). La investigación con los Natural Killers con receptor de antígeno quimérico (CAR-NK) también está consiguiendo unos resultados prometedores. En comparación con las células CAR-T, las células CAR-NK podrían ofrecer algunas ventajas significativas, que incluyen: (1) una mayor seguridad, como un síndrome de liberación de citocinas y una neurotoxicidad ambos menores en entornos autólogos, y un descenso de la enfermedad de injerto contra huésped en entornos alogénicos; (2) múltiples mecanismos para activar la actividad citotóxica, y (3) alta viabilidad para la fabricación "off-the-shelf". Las células CAR-NK podrían diseñarse para dirigirse a diversos antígenos, mejorar la proliferación y la persistencia in vivo, aumentar la infiltración en tumores sólidos, superar el microambiente tumoral resistente y, en última instancia, lograr una respuesta antitumoral eficaz (80). Reflexión personal desde el punto de vista clínico La terapia celular con CAR-T (única aprobada por el momento para su uso en clínica) ha permitido remisiones en pacientes con cánceres hematológicos que ya estaban prácticamente desahuciados. Está llegando cada vez a más hospitales de primer nivel, y seguramente dentro de poco tiempo los CAR-T pasen a ser la primera línea de múltiples leucemias y linfomas debido a sus asombrosos resultados, según refutados hematólogos que están trabajando e investigando con estas células. He podido rotar por el servicio de hematología de un hospital universitario de primer nivel (H.U. Álvaro Cunqueiro, Vigo), y hablar de esta terapia con una hematóloga que sigue sus avances muy de cerca: según su experiencia, la técnica está dando muy buenos resultados, concretamente frente al linfoma difuso de células grandes B, donde están alcanzando remisiones espectaculares tras el fracaso de varias líneas previas de tratamiento. Contaba el caso de un paciente que padecía este linfoma que hemos mencionado en un estadio 34 muy avanzado, que fue sometido a un trasplante de médula ósea, tras el cual la enfermedad recidivó, y cuando ya se habían agotado las demás alternativas terapéuticas, decidieron incluirlo en un ensayo clínico con CAR-T, obteniendo una respuesta espectacular (ese paciente lleva ahora tres años en remisión completa). Ella está convencida de que pronto los CAR-T serán la segunda, o hasta puede que la primera, línea de tratamiento en muchos pacientes. Un problema con el que se encuentran los pacientes al llegar a esta terapia después de pasar por diversas líneas de tratamiento muy agresivas y que desafortunadamente no logran la remisión de la enfermedad es la extenuación que desarrollan los linfocitos. Cuando por fin se opta por la terapia con CAR-T, las células inmunológicas están exhaustas, lo que perjudica notablemente el máximo potencial de este tratamiento. Sería de gran utilidad disponer de marcadores biológicos que nos permitiesen predecir la respuesta del paciente ante diferentes tratamientos, para así ofrecer de entrada la mejor terapia y no reservar los CAR-T para el final, cuando los linfocitos ya están resentidos debido a las terapias que no han funcionado. Conclusión La inmunoterapia celular se ha convertido en una importantísima terapia contra el cáncer, y en los próximos años estoy seguro de que asistiremos a una revolución en este campo. El sistema CRISPR/Cas se postula como una de las herramientas claves para liderar esta revolución. Esta herramienta es capaz de producir ediciones eficaces y rápidas a diferentes niveles del genoma, e incluso permite trabajar con más de un gen a la vez. Se ha empleado, por ejemplo, para conocer la función de un gen, generar modelos de experimentación, explorar rutas metabólicas, así como en el descubrimiento de potenciales marcadores biológicos. En cuanto a su papel en la mejora de la inmunoterapia, CRISPR/Cas está dando grandes resultados en multitud de novedosas estrategias para mejorar las terapias celulares: conseguir CAR-Ts universales, lo que permitiría la producción en masa de este producto que no sería rechazado por el sistema inmune del paciente al no detectarlo como extraño; crear linfocitos más activos y resistentes a la inmunosupresión que genera el tumor, mediante la edición de los receptores de citoquinas inhibitorias y potenciando los que responden a las citoquinas activadoras, así como eliminando los elementos implicados en los puntos de control inmunitario como PD1 o CTLA-4. La terapia con linfocitos infiltrantes de tumor no se queda atrás, sigue el ejemplo de los CAR-T, tratando de conseguir potenciar a las células T mediante la edición de las vías inhibitorias sin perder eficacia en la lucha contra las células tumorales. Y en este campo, hasta ahora protagonizado por los linfocitos T, se abren camino los macrófagos, con un gran potencial debido a su capacidad de fagocitar y presentar antígenos, ambas actividades con posibilidad de orientarse a la eliminación del tumor. La combinación de macrófagos con linfocitos (CAR-M y CAR-T, con TILs, o incluso con los CAR-NK) podría potenciar la inmunoterapia celular, o la incorporación de partículas microscópicas de productos quimioterápicos asociados a macrófagos, valiéndose de su capacidad para infiltrar el tejido tumoral y así llevar el fármaco directamente a donde está el cáncer. Ya se están realizando investigaciones al respecto, y en un futuro no muy lejano, gracias a las herramientas de edición genética, podrían convertirse en la primera línea de tratamiento frente a múltiples tumores, tanto hematológicos como sólidos. 35 Referencias 1. Pawelczak KS, Gavande NS, VanderVere-Carozza PS, Turchi JJ. 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