Efecto de la anestesia inhalatoria con isoflurano y sevoflurano sobre el electrorretinograma en el perro, normocapnia e hipercapnia

UNIVERSIDAD DE SANTIAGO DE COMPOSTELA FACULTAD DE VETERINARIA DEPARTAMENTO DE CIENCIAS CLÍNICAS VETERINARIAS EFECTO DE LA ANESTESIA INHALATORIA CON ISOFLURANO Y SEVOFLURANO SOBRE EL ELECTRORRETINOGRAMA EN EL PERRO: NORMOCAPNIA E HIPERCAPNIA. Memoria presentada por el Licenciado en Veterinaria D. Óscar Varela López para optar al Grado de Doctor. Óscar Varela López Lugo, Septiembre de 2006 Dr. D. Antonio González Cantalapiedra, Profesor Titular del Departamento de Ciencias Clínicas Veterinarias de la Facultad de Veterinaria de la Universidad de Santiago de Compostela. INFORMA: Que el trabajo de investigación titulado “Efecto de la anestesia inhalatoria con isoflurano y sevoflurano sobre el electrorretinograma en el perro: normocapnia e hipercapnia”, presentado por el licenciado D. Óscar Varela López para optar al Grado de Doctor, ha sido realizado bajo mi dirección en la Unidad de Cirugía y Patología Quirúrgica del Departamento de Ciencias Clínicas Veterinarias de la Universidad de Santiago de Compostela. Revisado el presente estudio, quedo conforme con su presentación para ser juzgado. A los efectos oportunos firmo el presente informe En Lugo, Septiembre de 2006 Fdo. Antonio González Cantalapiedra DEPARTAMENTOTO DE CIENCIAS CLÍNICAS VETERINARIAS Facultade de Veterinaria Campus de Lugo E-27002 Lugo (Spain) Telf. 982 285 900 , ext. 22741 Correo electrónico: [email protected] A José Luis A mis padres, a mis abuelos y a Bea porque me lo han dado todo EFECTO DE LA ANESTESIA INHALATORIA CON ISOFLURANO Y SEVOFLURANO SOBRE EL ELECTRORRETINOGRAMA EN EL PERRO: NORMOCAPNIA E HIPERCAPNIA Abreviaturas XVII ABREVIATURAS: AERG: adapto-electrorretinograma AMPA/KA: alfa-amino-3-hidroxi-metil-4-ácido isoxazolepropiónico/kainato APB: ácido DL-2-amino-4-fosfonobutírico ASP: aspartato ATP: adenosina trifosfato CAM: concentración alveolar mínima CCG: capa de células ganglionares cd/m2.s: candelas/metro cuadrado. Segundo cm: centímetros CMR: commom mode rejection CNE: capa nuclear externa CNI: capa nuclear interna CPE: capa plexiforme externa CPI: capa plexiforme interna CV: coeficiente de variación DNQX: 6,7-dinitroquinoxalina-2,3-diona DT: dark through ECVO: European College of Veterinary Ophthalmologists EEG: electroencefalograma EOG: electro-oculograma EPR: epitelio pigmentario ERG(s): electrorretinograma(s) FC: frecuencia cardiaca FDE: fosfodiesterasa FEFCO2: fracción espiratoria final de CO2 fERG: electrorretinograma focal FiO2: fracción inspiratoria de oxígeno FR: fotorreceptores ft: foot-candle GABA: ácido gamma amino butírico Abreviaturas XVIII GMPC: guanosina monofosfato cíclico GTP: guanosina trifosfato HI: células horizontales tipo 1 HII: células horizontales tipo 2 HIII: células horizontales tipo 3 Hz: Hertzios in: inches IR: iluminación retiniana ISCEV: International Society for Clinical Electrophysiology of Vision kΩ : kiloohmio l: litros lm: lumen LP: light peak lx: lux mfERG: electrorretinograma multifocal mg: miligramos ml: mililitros mm: milímetros mM: milimoles mmHg: milímetros de mercurio ms: milisegundos mV: milivoltios nt: nit nm: nanómetros: NMDA: N-metil-D-aspartato NO: nervio óptico ºC: grados centígrados OP(s): potencial(es) oscilatorio(s) PaCO2: presión arterial de dióxido de carbono PAD: presión arterial diastólica PAM: presión arterial media PaO2: presión arterial de oxígeno Abreviaturas XIX PAS: presión arterial sistólica PDA: cis2,3-piperidinedicarboxílico PERG(s): electrorretinograma(s) a patrón PEV: potenciales evocados visuales PhNR: respuesta fotópica negativa PIO: presión intraocular PRP: potencial de recepción precoz SD: desviación estándar SF: single flash SpO2: saturación parcial de oxígeno STR: respuesta de umbral escotópico Tª: temperatura TC: tiempo de culminación Td: Troland TL: tapetum lucidum TTX: tetradoxin µm: micrómetros µV: microvoltios VI: valor inicial EFECTO DE LA ANESTESIA INHALATORIA CON ISOFLURANO Y SEVOFLURANO SOBRE EL ELECTRORRETINOGRAMA EN EL PERRO: NORMOCAPNIA E HIPERCAPNIA Índices XXIII ÍNDICE DE CONTENIDO: AGRADECIMIENTOS:__________________________________________________ XI ABREVIATURAS: ____________________________________________________ XVII ÍNDICE DE CONTENIDO:____________________________________________ XXIII ÍNDICE DE FIGURAS:_______________________________________________ XXIX ÍNDICE DE TABLAS:________________________________________________XXXV ÍNDICE DE GRÁFICOS: ___________________________________________ XXXVII I.- INTRODUCCIÓN: ____________________________________________________ 3 II.- OBJETIVOS.-________________________________________________________ 9 III.- REVISIÓN BIBLIOGRÁFICA.- _______________________________________ 13 1LA RETINA:_________________________________________________________ 13 1.1.- DESARROLLO EMBRIOLÓGICO:_______________________________________ 13 1.2.- ESTRUCTURA GENERAL: _____________________________________________ 13 1.3.- DIVISIÓN FUNCIONAL:________________________________________________ 15 1.3.1.- CAPA PRE-RECEPTORA: ___________________________________________________ 15 1.3.1.1.- EPITELIO PIGMENTARIO (EPR):_________________________________________ 15 1.3.1.2.- TAPETUM LUCIDUM (TL):______________________________________________ 17 1.3.2.- CAPA RECEPTORA:________________________________________________________ 18 1.3.2.1.- ESTRUCTURA: ________________________________________________________ 18 1.3.2.2.- DISTRIBUCIÓN: _______________________________________________________ 21 1.3.2.3.- TERMINACIONES SINÁPTICAS:_________________________________________ 21 1.3.2.4FOTOTRANSDUCCIÓN:_________________________________________________ 22 1.3.2.4.1.- FASE DE EXCITACIÓN:_____________________________________________ 23 1.3.2.4.2.- FASE DE RECUPERACIÓN: _________________________________________ 25 1.3.2.5.- ADAPTACIÓN A DISTINTOS NIVELES LUMINOSOS:_______________________ 27 1.3.3.- CAPA POST-RECEPTORA: __________________________________________________ 28 1.3.3.1.- CÉLULAS BIPOLARES:_________________________________________________ 28 1.3.3.1.1.- TIPOS:____________________________________________________________ 28 1.3.3.1.2.- RECEPTORES:_____________________________________________________ 29 1.3.3.1.1.1.- Metabotrópicos:_________________________________________________ 29 1.3.3.1.1.1.- Ionotrópicos: ___________________________________________________ 30 1.3.3.2.- CÉLULAS DE ASOCIACIÓN: ____________________________________________ 30 1.3.3.2.1.- CÉLULAS HORIZONTALES:_________________________________________ 30 1.3.3.2.2.- CÉLULAS AMACRINAS:____________________________________________ 31 1.3.3.2.3.- CÉLULAS INTERPLEXIFORMES: ____________________________________ 32 1.3.3.3.- CÉLULAS DE SOSTÉN: _________________________________________________ 33 1.3.4.-CAPA DE LA CONDUCCIÓN: ________________________________________________ 33 1.4.- VASCULARIZACIÓN:__________________________________________________ 34 2.- ELECTROFISIOLOGÍA OCULAR: _____________________________________ 35 2.1.- POTENCIAL DE REPOSO DE LA RETINA: _______________________________ 36 2.1.1.- ELECTRO-OCULOGRAMA (EOG): ___________________________________________ 36 2.1.1.1.- ORIGEN DE LAS ONDAS:_______________________________________________ 36 2.1.1.2.- CARACTERÍSTICAS: ___________________________________________________ 37 2.2.- POTENCIALES DE ACCIÓN DE LA RETINA:_____________________________ 39 2.2.1.- EL ELECTRORRETINOGRAMA (ERG): _______________________________________ 39 2.2.1.1.- HISTORIA:____________________________________________________________ 39 Índices XXIV 2.2.1.2.- BASES ELÉCTRICAS:___________________________________________________ 40 2.2.1.3.- ORIGEN DE LAS PRINCIPALES ONDAS: __________________________________44 2.2.1.3.1.- ONDA c: __________________________________________________________ 46 2.2.1.3.2.- ONDA a: __________________________________________________________ 47 2.2.1.3.3.- ONDA b: __________________________________________________________ 49 2.2.1.4.- COMPONENTES MENORES DEL ERG: ____________________________________ 53 2.2.1.4.1.- POTENCIALES OSCILATORIOS (OPs): ________________________________53 2.2.1.4.2.- ONDA d: __________________________________________________________ 54 2.2.1.4.3.- RESPUESTA DE UMBRAL ESCOTÓPICO (STR): ________________________ 55 2.2.1.4.4.- ONDA i:___________________________________________________________ 56 2.2.1.4.5.- RESPUESTA FOTÓPICA NEGATIVA (PhNR): ___________________________ 58 2.2.1.4.6.- POTENCIAL DE RECEPCIÓN PRECOZ (PRP): __________________________ 59 2.2.1.4.- PRUEBAS ESPECIALES Y MODALIDADES DEL ERG:_______________________60 2.2.1.4.1.- ERG FOTÓPICO: ___________________________________________________61 2.2.1.4.1.1.- ERG flicker, definición y origen: ____________________________________ 61 2.2.1.4.1.2.- Curvas de luminancia-respuesta, definición y origen: ____________________ 69 2.2.1.4.2.- ERG ESCOTÓPICO: _________________________________________________ 73 2.2.1.4.2.1.- AERG: ________________________________________________________ 74 2.2.1.4.2.2.- Curvas de luminancia-respuesta: ____________________________________ 75 2.2.1.5.-ANÁLISIS DEL ERG: ____________________________________________________77 2.2.1.6.- USO CLINICO DE LA ELECTRORRETINOGRAFÍA: _________________________ 78 2.2.1.7.- LIMITACIONES DEL ESTUDIO ELECTRORRETINOGRÁFICO: _______________ 80 2.2.2.- ELECTRORRETINOGRAMA FOCAL (fERG) Y MULTIFOCAL (mfERG):____________ 81 2.2.3.- ERG A PATRÓN (PERG): ____________________________________________________ 82 2.3.- POTENCIALES EVOCADOS VISUALES (PEV): ___________________________ 83 3.- FACTORES QUE AFECTAN AL REGISTRO DEL ERG: ___________________ 83 3.1.- FACTORES CONTROLABLES: _________________________________________ 83 3.1.1.- CARACTERÍSTICAS DE LA ESTIMULACIÓN LUMINOSA:_______________________ 83 3.1.1.1.- LONGITUD DE ONDA DEL ESTÍMULO: ___________________________________ 85 3.1.1.2.- NIVEL ENERGÉTICO DEL ESTÍMULO:____________________________________ 86 3.1.1.3.- FRECUENCIA TEMPORAL DEL ESTÍMULO: _______________________________87 3.1.1.4.- DURACIÓN DEL ESTÍMULO: ____________________________________________ 88 3.1.1.5.- TIPO DE FOTO-ESTIMULADORES: _______________________________________88 3.1.1.6.- LUMINANCIA DEL AMBIENTE:__________________________________________ 89 3.1.2.- DILATACIÓN PUPILAR: ____________________________________________________ 89 3.1.3.- PROTOCOLOS: ____________________________________________________________90 3.1.4.- RECOGIDA Y TRATAMIENTO DE LA SEÑAL: _________________________________ 91 3.1.4.1.- GENERADORES DE LA SEÑAL:__________________________________________ 91 3.1.4.1.1.- GENERADORES ANALÓGICOS:______________________________________91 3.1.4.1.2.- GENERADORES DIGITALES: ________________________________________ 91 3.1.4.2.- CAPTORES DE LA SEÑAL: ______________________________________________ 92 3.1.4.2.1.- ELECTRODOS ACTIVOS:____________________________________________ 92 3.1.4.2.2.- ELECTRODOS DE REFERENCIA Y DE MASA:__________________________94 3.1.4.3.- TRATAMIENTO DE LA SEÑAL: __________________________________________ 95 3.1.4.4.- FUENTES DE RUIDO:___________________________________________________ 97 3.1.5.- RITMOS CIRCADIANOS:____________________________________________________ 98 3.1.6.- ANESTESIA:_______________________________________________________________98 3.1.6.1.- AGENTES VOLÁTILES: _________________________________________________99 3.1.6.1.1.- EFECTOS SOBRE EL ERG:__________________________________________ 100 3.1.6.1.2.- MECANISMO DE ACCIÓN: _________________________________________ 100 3.1.6.2.- PROPOFOL: __________________________________________________________ 101 3.1.6.3.- BLOQUEANTES NEUROMUSCULARES: _________________________________ 102 3.1.7.- PRESIÓN SANGUÍNEA DE GASES: __________________________________________ 102 3.1.7.1PRESIÓN ARTERIAL DE OXÍGENO (Pa O2): _______________________________ 103 3.1.7.2.- PRESIÓN ARTERIAL DE DIÓXIDO DE CARBONO (PaCO2): _________________ 104 3.1.8.- PRESIÓN ARTERIAL MEDIA (PAM):_________________________________________ 106 3.2.- FACTORES NO CONTROLABLES:_____________________________________ 107 Índices XXV 3.2.1.- DIFERENCIAS ANATÓMICAS: _____________________________________________ 107 3.2.2.- FACTORES INDIVIDUALES: _______________________________________________ 107 3.2.3.- EDAD: __________________________________________________________________ 107 3.2.4.- FACTORES ENDÓGENOS: _________________________________________________ 108 3.2.5.- PRESIÓN INTRAOCULAR (PIO): ____________________________________________ 108 IV.-MATERIAL Y MÉTODOS.- __________________________________________ 113 1.- MATERIAL: _______________________________________________________ 113 1.1.- ANIMALES:__________________________________________________________ 113 1.2.- MATERIAL DE ANESTESIA:___________________________________________ 113 1.2.1.- EQUIPAMIENTO ANESTÉSICO: ____________________________________________ 113 1.2.2.- FÁRMACOS ANESTÉSICOS: _______________________________________________ 114 1.2.3.- OTROS FÁRMACOS: ______________________________________________________ 114 1.2.4.- MATERIAL DE MONITORIZACIÓN:_________________________________________ 114 1.2.4.1.- MONITORIZACIÓN RESPIRATORIA Y DE GASES: ________________________ 114 1.2.4.2.- MONITORIZACIÓN CARDIOVASCULAR Y TERMOMETRÍA:_______________ 114 1.3.- MATERIAL AUXILIAR: _______________________________________________ 115 1.4.- MATERIAL DE ESTIMULACIÓN Y DE REGISTRO:______________________ 115 1.4.1.-FOTOESTIMULADORES:___________________________________________________ 115 1.4.2.- AMPLIFICADOR: _________________________________________________________ 116 1.4.3.- UNIDAD DE PROCESADO Y DE RECOGIDA DE DATOS:_______________________ 116 1.4.3.1.- ELECTRODOS: _______________________________________________________ 116 1.4.3.1.1.- ACTIVOS:________________________________________________________ 116 1.4.3.1.2.- REFERENCIA Y MASA:____________________________________________ 117 1.4.3.2.- BASE INFORMÁTICA:_________________________________________________ 117 2.- MÉTODOS:________________________________________________________ 118 2.1.- GRUPOS Y DISEÑO EXPERIMENTAL: _________________________________ 118 2.2.- PROTOCOLO ANESTÉSICO: __________________________________________ 120 2.2.1.- DESARROLLO:___________________________________________________________ 120 2.2.2.- MEDICIONES:____________________________________________________________ 120 2.3.- ESTUDIO ELECTRORRETINOGRÁFICO:_______________________________ 121 2.3.1.- DESARROLLO:___________________________________________________________ 121 2.3.2.- PROTOCOLO: ____________________________________________________________ 122 2.3.2.1.- PRIMERA PARTE; FOTÓPICA:__________________________________________ 123 2.3.2.1.1.- FUNCIÓN LUMINANCIA-RESPUESTA (“PHOTOPIC HILL”): ____________ 123 2.3.2.1.2.- FLICKER: ________________________________________________________ 124 2.3.2.2.- SEGUNDA PARTE; ESCOTÓPICA: ______________________________________ 124 2.3.2.3.- TERCERA PARTE; FOTÓPICA: _________________________________________ 124 2.3.3.- MEDICIÓN DE LAS ONDAS: _______________________________________________ 125 2.4.- ANÁLISIS ESTADÍSTICO: _____________________________________________ 127 2.4.1.- DATOS ELECTRORRETINOGRÁFICOS Y DIÁMETRO PUPILAR:________________ 127 2.4.2.- PARÁMETROS CARDIOVASCULARES, RECUPERACIÓN ANESTÉSICA Y TEMPERATURA (Tª): ___________________________________________________________ 128 2.4.3.- PARÁMETROS RESPIRATORIOS:___________________________________________ 128 V.- RESULTADOS: ____________________________________________________ 131 1.- RESULTADOS ELECTRORETINOGRÁFICOS: _________________________ 131 1.1.- ANÁLISIS CUANTITATIVO: ___________________________________________ 131 1.1.1.- PRIMERA PARTE; FOTÓPICA:______________________________________________ 131 1.1.1.1.- FUNCIÓN LUMINANCIA-RESPUESTA (“PHOTOPIC HILL”):________________ 131 1.1.1.1.1.- Imax ( log cd.s.m-2): ________________________________________________ 132 1.1.1.1.1.1.- Valores: ______________________________________________________ 132 Índices XXXII Figura 49: Curvas de eficacia luminosa del sistema fotópico (línea naranja) y del escotópico (línea azul) del hombre (Gouras, 1984). _________________________________________________________________86 Figura 50: Respuestas de los conos y de los bastones a un estímulo breve de luminancia variable. En ambiente fotópico, los bastones responden en modo saturación (adaptado de Lazard et al., 2000). _______ 87 Figura 51: Tipo de fotoestimuladores: binoculares independientes (izquierda) y Ganzfeld (derecha). _____88 Figura 52: Protocolo electrorretinográfico para especies diurnas (Rosolen et al., 2005d)._______________ 90 Figura 53: Protocolo electrorretinográfico para especies nocturnas (Rosolen et al., 2005d). ____________ 91 Figura 54: Electrodos corneales de tipo AllenBurian (izquierda) y de tipo ERG-jet (derecha). _________ 93 Figura 55: Electrodo gold-foil de Arden. ____________________________________________________ 93 Figura 56: Electrodo DTL (izquierda) y manera de colocarlo (derecha).____________________________ 93 Figura 57: Electrodo conjuntivo-escleral (derecha) y colocación en la conjuntiva escleral cerca del limbo._ 94 Figura 58: Electrodos de referencia y de masa utilizados en el hombre (derecha) y en los animales (izquierda). ___________________________________________________________________________ 94 Figura 59: Operación de lisado, que consiste en descomponer una sinusoide compleja en varias sinusoides sencillas utilizando la transformada de Fourier (A). Filtrado de la señal inicial de 0-300 Hz a 100-300 Hz para extraer los OPs (B)._________________________________________________________________ 96 Figura 60: ERG recogido en un perro con sedación insuficiente. La señal está muy contaminada debido a la actividad muscular (flechas) (Komaromy et al., 2002). _________________________________________ 97 Figura 61: Fondo de ojo de uno de los animales utilizado en el experimento, zona tapetal (izquierda) y zona no tapetal (derecha). ___________________________________________________________________ 113 Figura 62: Fotoestimulador de tipo binocular, con ranuras para la interposición de filtros._____________ 116 Figura 63: Electrodos de tipo esclero-conjuntival (izquierda), utilizado como activo, y de tipo aguja de acupuntura (derecha), utilizado como referencia y masa._______________________________________ 117 Figura 64: Ventana de selección de parámetros de estimulación, de recogida, así como de tipo de examen.117 Figura 65: Ventana de análisis y tratamiento de las curvas obtenidas._____________________________ 118 Figura 66: Posición de los electrodos activos y de referencia, así como de la cabeza del animal previo al inicio del examen electrorretinográfico. ____________________________________________________ 119 Figura 67: Posición de los fotoestimuladores durante el examen electrorretinográfico. _______________ 121 Figura 68: Colocación del electrodo activo en la conjuntiva bulbar y del de referencia a nivel del canto temporal (derecha).____________________________________________________________________ 122 Figura 69: Esquema del protocolo electrorretinográfico utilizado, con una primera parte fotópica, una segunda parte escotópica y una tercera parte de nuevo fotópica (adaptado de Rosolen et al., 2005). _____ 122 Índices XXXIII Figura 70: ERG del perro en el que se aprecian las distintas ondas que lo componen. Para una onda determinada, las flechas azules representan los TC y las verdes la amplitud. _______________________ 125 Figura 71: Ejemplo de flicker ERG de 30 Hz y manera de medir la amplitud de pico a pico (líneas rojas) y el TC (flecha azul). La flecha roja representa el inicio del flash. __________________________________ 126 Figura 72: Función luminancia-respuesta (“photopic hill”) del perro (izquierda) y representación gráfica de las amplitudes de las ondas a y b en función de la intensidad del estímulo, así como extracción de Imax, Vmax, Amax y K (derecha). ____________________________________________________________ 126 Figura 73: Extracción de los OPs (trazado inferior) por filtrado( 100-300 Hz) de la curva original (trazado superior) para su posterior análisis. _______________________________________________________ 127 Figura 74: Curvas luminancia-respuesta en condiciones fotópicas con la retina adaptada a la luz (“photopic hill”, la flecha roja indica el inicio del flash) representativas del grupo ISON (izquierda) y representación gráfica de las amplitudes de las ondas a y b con respecto a la intensidad del estímulo (derecha) del mismo grupo.______________________________________________________________________________ 154 Figura 75: Curvas luminancia-respuesta en condiciones fotópicas con la retina adaptada a la luz (“photopic hill”, la flecha roja indica el inicio del flash) representativas del grupo ISOH (izquierda) y representación gráfica de las amplitudes de las ondas a y b con respecto a la intensidad del estímulo (derecha) del mismo grupo.______________________________________________________________________________ 155 Figura 76: Curvas luminancia-respuesta en condiciones fotópicas con la retina adaptada a la luz (“photopic hill”, la flecha roja indica el inicio del flash) representativas del grupo SEVON (izquierda) y representación gráfica de las amplitudes de las ondas a y b con respecto a la intensidad del estímulo (derecha) del mismo grupo.______________________________________________________________________________ 155 Figura 77: Curvas luminancia-respuesta en condiciones fotópicas con la retina adaptada a la luz (“photopic hill”, la flecha roja indica el inicio del flash) representativas del grupo SEVOH (izquierda) y representación gráfica de las amplitudes de las ondas a y b con respecto a la intensidad del estímulo (derecha) del mismo grupo.______________________________________________________________________________ 156 Figura 78: ERG fotópico representativo, en el que se aprecia la morfología de la onda i, en nuestro experimento. La flecha roja indica el inicio del flash._________________________________________ 156 Figura 79: ERG fotópico representativo, en el que se aprecia la morfología de los OPs de nuestro experimento (trazado inferior) tras ser extraídos de la curva original (trazado superior), la flecha roja indica el inicio del flash._______________________________________________________________________ 157 Figura 80: ERG fotópico representativo, en el que se aprecia la morfología de la PhNR, en nuestro experimento. La flecha roja indica el inicio del flash._________________________________________ 157 Figura 81: Flicker ERG fotópico representativo, en el que se aprecia la morfología de las ondas para cada una de las frecuencias estudiadas en nuestro experimento, la flecha roja indica el inicio del flash. _________ 158 Índices XXXIV Figura 82: AERG representativo de los grupos normocápnicos (ISON y SEVON) de nuestro experimento, en el que se aprecia la morfología del ERG escotópico durante 32 minutos de adaptación a la oscuridad. En algún animal apareció una pequeña onda a en el minuto 32 y/o 16 (izquierda). La flecha roja indica el inicio del flash. ____________________________________________________________________________ 159 Figura 83: AERG representativo de los grupos hipercápnicos (ISOH y SEVOH) de nuestro experimento, en el que se aprecia la morfología del ERG escotópico durante 32 minutos de adaptación a la oscuridad. La flecha roja indica el inicio del flash._______________________________________________________ 159 Figura 84: ERG fotópico representativo de nuestro experimento, en el que se aprecia la morfología de la PhNR, (trazado inferior). ERG escotópico en T32 del AERG en el que se aprecia una negatividad posterior a la onda b, más tardía que la PhNR (trazado superior). La flecha roja indica el inicio del flash. _________160 Figura 85: SF representativo de nuestro experimento. La flecha roja indica el inicio del flash. _________ 160 Índices XXXV ÍNDICE DE TABLAS: Tabla 1: Afecciones retinianas comunes en distintas razas de perro (adaptado de: Narfström y Ekesten, 1999). ____________________________________________________________________________________ 80 Tabla 2: Factores de conversión de luminancias (Brigell et al., 1988). _____________________________ 84 Tabla 3: Amplitud y TC de las ondas a y b en Imax (Amax y Vmax), así como Imax. Para cada parámetro, las medias de los grupos con distinta letra son estadísticamente diferentes (P < 0,05).________________ 134 Tabla 4: Relación b/a y K. Para cada parámetro, las medias de los grupos con distinta letra son estadísticamente diferentes (P < 0,05). ____________________________________________________ 136 Tabla 5: Amplitud y TC de la onda i y de la PhNR. No hubo diferencias significativas entre grupos.____ 137 Tabla 6: Amplitud de los OPs 2, 3 y 4, así como el sumatorio (ΣOPs) y la relación de cada uno de ellos con el total. No hubo diferencias significativas entre grupos. ________________________________________ 139 Tabla 7: Amplitud de los OPs 2, 3 y 4, así como el sumatorio (ΣOPs) y la relación de cada uno de ellos con el total. No hubo diferencias significativas entre grupos. ________________________________________ 140 Tabla 8: TC de los OPs 2, 3 y 4. No hubo diferencias significativas entre grupos.___________________ 140 Tabla 9: Amplitud del primer flicker en las 4 frecuencias realizadas (6, 12, 20 y 30). Para cada frecuencia, las medias de los grupos con distinta letra son estadísticamente diferentes (P < 0,05). __________________ 143 Tabla 10: Amplitud de la onda b durante el AERG (t0, t2, t4, t8, t16 y t32). En t32, para cada grupo, las medias con distinta letra son estadísticamente diferentes (P < 0,05). _____________________________ 146 Tabla 11: TC de la onda b durante el AERG (t0, t2, t4, t8, t16 y t32). No hubo diferencias significativas entre grupos en t32.________________________________________________________________________ 147 Tabla 12: Amplitud y TC de las ondas a y b, así como la relación b/a del SF. No hubo diferencias significativas entre grupos. _____________________________________________________________ 148 Tabla 13: Amplitud del segundo (2º F) y tercer flicker (3er F) en las 4 frecuencias realizadas (6, 12, 20 y 30 Hz) representada con la media ± SD. Para cada frecuencia y dentro de cada grupo, los * representan diferencia estadística entre el segundo y el tercer flicker (p < 0,05).______________________________ 152 Tabla 14: Dilatación pupilar al inicio y al final del experimento, representada con la media ± SD. Las medias con distinta letra son estadísticamente diferentes (P < 0,05). ___________________________________ 162 Tabla 15: PAM. Los valores se representan con su media ± SD. Para un mismo grupo los * indican diferencia estadística de las medias con respecto al valor basal (minuto 0). No hubo diferencias significativas entre grupos. ________________________________________________________________________ 168 Tabla 16: PAM. Los valores se representan con su media ± SD. Para un mismo grupo los * indican diferencia estadística de las medias con respecto al valor basal (minuto 0). No hubo diferencias significativas entre grupos. ________________________________________________________________________ 169 Índices XXXVI Tabla 17: FC. Los valores se representan con su media ± SD. Para un mismo grupo, los * indican diferencia estadística de las medias con respecto al valor basal (minuto 0). No hubo diferencias significativas entre grupos. _____________________________________________________________________________ 169 Tabla 18: Tª. Los valores se representan con su media ± SD. Para un mismo grupo, los * indican diferencia estadística de las medias con respecto al valor basal (minuto 0). No hubo diferencias significativas entre grupos. _____________________________________________________________________________ 170 Tabla 19: Tiempos de recuperación anestésica. Para cada parámetro, las medias de los grupos con distinta letra son estadísticamente diferentes (P < 0,05).______________________________________________ 172 Índices XXXVII ÍNDICE DE GRÁFICOS: Gráfico 1: Amax y Vmax representados con la media ± SD. Para cada onda, las medias de los grupos con distinta letra son estadísticamente diferentes (P < 0,05)._______________________________________ 133 Gráfico 2: Relación b/a en Imax, representada con la media ± SD. Para cada grupo, las medias con distinta letra son estadísticamente diferentes (P < 0,05). _____________________________________________ 135 Gráfico 3: K representada con la media ± SD. Para cada grupo, las medias con distinta letra son estadísticamente diferentes (P < 0,05). ____________________________________________________ 136 Gráfico 4: Amplitud del primer flicker en las 4 frecuencias realizadas (6, 12, 20 y 30 Hz), representada con la media ± SD. Para cada frecuencia, las medias de los grupos con distinta letra son estadísticamente diferentes (P < 0,05). __________________________________________________________________________ 142 Gráfico 5: TC del primer flicker de 30 Hz, representado con la media ± SD. Para cada grupo, las medias con distinta letra son estadísticamente diferentes (P < 0,05)._______________________________________ 142 Gráfico 6: Amplitud de la onda b durante el AERG (t0, t2, t4, t8, t16 y t32). Los valores se representan solamente con la media, omitiendo las barras de SD (ver tabla 9) para facilitar la visualización de las curvas. En t32, para cada grupo, las medias con distinta letra son estadísticamente diferentes (P < 0,05)._______ 146 Gráfico 7: Amplitud del segundo (2º F) y tercer flicker (3er F) en las 4 frecuencias realizadas (6, 12, 20 y 30 Hz) representada con la media ± SD. Para cada frecuencia y dentro de cada grupo, los * representan diferencia estadística entre el segundo y el tercer flicker (p < 0,05).______________________________ 151 Gráfico 8: Amplitud de la onda a durante el “photopic hill”. Los valores se representan solamente con la media, omitiendo las barras de SD (ver figuras 74-77) para facilitar la visualización de las curvas. _____ 153 Gráfico 9: TC de la onda a durante el “photopic hill”. Los valores se representan solamente con la media, omitiendo las barras de SD para facilitar la visualización de las curvas. La línea punteada representa la intensidad de estímulo necesaria para la cual la amplitud de la onda a fue de 10 ms.________________ 153 Gráfico 10: Amplitud de la onda b durante el “photopic hill”. Los valores se representan solamente con la media, omitiendo las barras de SD (ver figuras 74-77) para facilitar la visualización de las curvas. _____ 154 Gráfico 11: Dilatación pupilar al inicio y al final del experimento, representada con la media ± SD. Las medias con distinta letra son estadísticamente diferentes (P < 0,05). _____________________________ 161 Gráfico 12: PAM del grupo ISON. Los valores se representan con su media ± SD. Los * indican diferencia estadística de las medias con respecto al valor basal (minuto 0). ________________________________ 162 Gráfico 13: PAM del grupo ISOH. Los valores se representan con su media ± SD. Los * indican diferencia estadística de las medias con respecto al valor basal (minuto 0). ________________________________ 163 Gráfico 14: PAM del grupo SEVON. Los valores se representan con su media ± SD. Los * indican diferencia estadística de las medias con respecto al valor basal (minuto 0). ________________________ 163 Índices XXXVIII Gráfico 15: PAM del grupo SEVOH. Los valores se representan con su media ± SD. Los * indican diferencia estadística de las medias con respecto al valor basal (minuto 0). ________________________164 Gráfico 16: FC del grupo ISON. Los valores se representan con su media ± SD. Los * indican diferencia estadística de las medias con respecto al valor basal (minuto 0)._________________________________ 164 Gráfico 17: FC del grupo ISOH. Los valores se representan con su media ± SD. Los * indican diferencia estadística de las medias con respecto al valor basal (minuto 0)._________________________________ 165 Gráfico 18: FC del grupo SEVON. Los valores se representan con su media ± SD. Los * indican diferencia estadística de las medias con respecto al valor basal (minuto 0)._________________________________ 165 Gráfico 19: FC del grupo SEVOH. Los valores se representan con su media ± SD. Los * indican diferencia estadística de las medias con respecto al valor basal (minuto 0)._________________________________ 166 Gráfico 20: Tª del grupo ISON. Los valores se representan con su media ± SD. Los * indican diferencia estadística de las medias con respecto al valor basal (minuto 0)._________________________________ 166 Gráfico 21: Tª del grupo ISOH. Los valores se representan con su media ± SD. Los * indican diferencia estadística de las medias con respecto al valor basal (minuto 0)._________________________________ 167 Gráfico 22: Tª del grupo SEVON. Los valores se representan con su media ± SD. Los * indican diferencia estadística de las medias con respecto al valor basal (minuto 0)._________________________________ 167 Gráfico 23: Tª del grupo SEVOH. Los valores se representan con su media ± SD. Los * indican diferencia estadística de las medias con respecto al valor basal (minuto 0)._________________________________ 168 Gráfico 24: Tiempo total de recuperación anestésica, representado con la media ± SD. Para cada grupo, las medias con distinta letra son estadísticamente diferentes (P < 0,05).______________________________ 172 EFECTO DE LA ANESTESIA INHALATORIA CON ISOFLURANO Y SEVOFLURANO SOBRE EL ELECTRORRETINOGRAMA EN EL PERRO: NORMOCAPNIA E HIPERCAPNIA Introducción 3 I.- INTRODUCCIÓN: Se puede decir que la electrofisiología ocular nació en 1849 cuando Dubois-Reymond descubrió el dipolo córneo-retiniano y desde entonces no ha parado de evolucionar (Lazard et al., 2000; Benítez del Castillo et al., 2002). Los primeros electrorretinogramas (ERGs) fueron recogidos en ojos de rana por Holmgren en 1865. Pocos años después, Dewar observó que los ojos de rana expuestos a la luz provocaban ligeros movimientos en la aguja de un galvanómetro, sugiriendo que existía un cambio eléctrico positivo de la córnea con respecto al fondo del ojo (De Rouck, 1991). En 1933, Ragnar Granit publicó un estudio más detallado sobre el ERG del gato, descomponiéndolo en sus tres componentes fundamentales PI, PII y PIII (Granit, 1933). El análisis de Granit ha sido modificado a lo largo de los años, pero sigue siendo una buena base para la interpretación del ERG (Lazard et al., 2000). Hoy en día el origen celular exacto de alguno de sus componentes sigue siendo objeto de discusión. En lo que respecta a esto último, en los últimos años, se ha adquirido mucha información, en parte gracias al descubrimiento de algunos fármacos que bloquean selectivamente la respuesta de uno u otro grupo celular a nivel de la retina (Green y KapoustaBruneau, 1999). De entre esos fármacos destacan el APB y el PDA que bloquean de manera selectiva la respuesta de las vías retinianas ON y OFF respectivamente. Son muy efectivos, aunque su empleo requiere una técnica específica y presentan algunos efectos secundarios (Slaughter y Miller, 1981; 1983a; Xu et al., 1991). Dentro de las distintas pruebas electrofisiológicas que se pueden realizar, el ERG, objeto de nuestro estudio, es el más utilizado en la práctica veterinaria. Se trata de una técnica diagnóstica que permite registrar los cambios en el potencial eléctrico del ojo cuando es estimulado por la luz (Komaromy et al., 1998; Lazard et al., 2000; Narfström et al., 2002). Tales cambios reflejan la actividad de diversas células de la retina incluyendo los fotorreceptores (FR) (conos y bastones). Por ello, es indispensable un buen conocimiento de la anatomía y fisiología de las estructuras responsables de generar las señales eléctricas que el electrofisiólogo estudia. En muchas ocasiones, permite detectar anomalías funcionales de la retina, incluso en ausencia de alteraciones oftalmoscópicas (Komaromy et al., 1998; Lazard et al., 2000; Narfström et al., 2002; Rosolen et al., 2005d). En el caso de los animales, en los cuales la comunicación verbal es lógicamente imposible, el ERG se convierte en una herramienta en ocasiones imprescindible a la hora de evaluar la función visual. En el perro, se usa con fines clínicos, principalmente para evaluar la función retiniana antes de una cirugía de cataratas, para diagnosticar precozmente distrofias retinianas y para distinguir entre varios tipos de cegueras (con origen retiniano o con origen central) (Acland, 1988; Narfström y Ekesten, 1999; Narfström y Wrigstad, 1999; Alexander et al., 2003). Estos registros han servido y EFECTO DE LA ANESTESIA INHALATORIA CON ISOFLURANO Y SEVOFLURANO SOBRE EL ELECTRORRETINOGRAMA EN EL PERRO: NORMOCAPNIA E HIPERCAPNIA Revisión Bibliográfica 13 III.- REVISIÓN BIBLIOGRÁFICA.- 1LA RETINA: 1.1.- DESARROLLO EMBRIOLÓGICO: Al cerrarse el tubo neural, se divide en 3 partes: proencéfalo, mesencéfalo y rombencéfalo, que en una segunda diferenciación darán las 5 partes del encéfalo (mielencéfalo, metencéfalo, mesencéfalo, diencéfalo y telencéfalo) y casi inmediatamente aparecen unos abultamientos laterales del diencéfalo formando las vesículas ópticas, por ello se dice que la retina proviene directamente del tubo neural que se proyecta hacia las estructuras superficiales del organismo, y es por lo tanto parte del sistema nervioso central. Se forma la cúpula óptica por cuyo interior transcurre el ventrículo óptico, una extensión del tercer ventrículo del diencéfalo, que se va progresivamente cerrando hasta convertirse en la capa que rodea al tejido nervioso formando más tarde el epitelio pigmentario (EPR) de la retina que arropa externamente los fotorreceptores (FR). Según va madurando la cúpula óptica se van aproximando más sus dos capas: la interna o nerviosa y la externa o pigmentaria, que se va haciendo más fina y aparecen los primeros gránulos de pigmento (Aguirre et al., 1972; Hoar, 1982). Gran parte de este desarrollo ocurre en el útero materno, y el nivel de madurez de la función visual depende de la especie animal. Así por ejemplo, en el conejillo de indias (Carvia Porcellus), que nace con los ojos abiertos el desarrollo es similar al del hombre en base a que las respuestas electrorretinográficas en las primeras etapas de vida son muy parecidas (Armitage et al., 2001). Según Breton et al., en el humano al nacimiento la funcionalidad de los FR no es completa debido a la poca concentración de algunos sustratos de la fototransducción del neonato y a una escasa longitud de los segmentos externos de los FR. Los FR tendrían un desarrollo más tardío que otras células más internas de la retina, en base a estudios electrorretinográficos realizados en el hombre (Breton et al., 1995). En el caso del perro y del gato que nacen con los ojos cerrados el desarrollo es más tardío y continúa en parte en la vida postnatal. Así la retina alcanza su madurez morfológica a las 6-7 semanas de vida en el perro (Gum et al., 1984), y a los 5 meses en el gato (Vogel, 1978). 1.2.- ESTRUCTURA GENERAL: La retina es como un tapiz que recubre el fondo del ojo cuyo espesor en el perro es de 200 a 240 µm en la zona central y de 100 a 190 µm en la zona periférica (Buttery et al., 1991). En los vertebrados está invertida con respecto a la dirección de los rayos luminosos. En efecto, la luz después de atravesar la óptica ocular, debe traspasar todo el espesor de la retina antes de alcanzar Revisión Bibliográfica 14 los segmentos externos de los FR (conos y bastones) que contienen el pigmento fotosensible (Samuelson, 1999). Esto es porque las membranas de los FR que contienen los fotopigmentos han de estar en contacto con la capa de EPR que le suministra la molécula visual por excelencia, el retinol o vitamina A, que permanece unida a una proteína (opsina), donde un pequeño cambio en su conformación en respuesta a un fotón, desencadenará todo el proceso de la fototransducción (Kolb, 2003). Los estudios de Ramón y Cajal, utilizando el método de tinción de Golgi, sentaron las bases neuroanatómicas del sistema nervioso en general, y del sistema visual en particular describiendo los principales tipos celulares a nivel de la retina: FR, células bipolares, células horizontales, células amacrinas y células ganglionares (figura 1) (Cajal, 1892, traducido por Thorpe y Glickstern, 1972). Desde un punto de vista anatómico la retina está formada por la neurorretina y el EPR. Este último en algunas especies animales no está totalmente pigmentado (Tso y Friedman, 1967). La neurorretina en todos los vertebrados está compuesta por tres capas que contienen cuerpos celulares y dos capas de interacciones sinápticas (denominadas plexiformes). La capa nuclear externa (CNE) contiene los cuerpos celulares de los conos y bastones. La capa nuclear interna (CNI) contiene los cuerpos celulares de las células horizontales, bipolares y amacrinas y la capa de células ganglionares (CCG) contiene los cuerpos celulares de estas células ganglionares además de los de algunas células amacrinas desplazadas (Wässle y Boycott, 1991). Entre estas 3 capas se localizan las capas plexiformes donde se realizan la mayor parte de contactos sinápticos de la retina (Kolb, 2003). La plexiforme externa (CPE) es en donde contactan los conos y bastones con las dendritas de las células bipolares y con las células horizontales (Kolb, 1970). En la plexiforme interna (CPI) se produce la segunda sinapsis de la vía vertical de la retina. Aquí contactan los axones de las células bipolares con las dendritas de las células ganglionares. Además, a este nivel terminan gran cantidad de prolongaciones de las células amacrinas, que influencian y modulan la información que es transferida a las células ganglionares. Los axones de las células ganglionares forman el nervio óptico (NO) por donde sale la información ya codificada hacia la corteza visual (figura 1) (Wässle y Boycott, 1991; Kolb, 2003). Revisión Bibliográfica 15 Figura 1: Esquema de las diferentes capas de la retina y de las células que la componen (adaptado de: Kolb, 2003). 1.3.- DIVISIÓN FUNCIONAL: Dividiendo la retina desde un punto de vista funcional, se pueden distinguir cuatro capas o zonas (Lazard et al., 2000): • Capa pre-receptora • Capa receptora • Capa post-receptora • Capa de conducción 1.3.1.- CAPA PRE-RECEPTORA: 1.3.1.1.- EPITELIO PIGMENTARIO (EPR): El EPR separa la neurorretina de la coroides y por debajo del mismo nos encontramos con el espacio subretiniano. Está formado por una sola capa de células unidas entre sí por uniones intercelulares muy complejas. Su parte basal reposa sobre la membrana de Brüch y su parte apical posee numerosas expansiones citoplasmáticas. Las más largas y estrechas de esas expansiones se hunden entre los segmentos externos de los FR en una sustancia (matriz) formada por mucopolisacáridos y carbohidratos, mientras que las expansiones más cortas y anchas forman vainas alrededor de la parte apical de los FR. Este encaje entre los FR y dichas vainas crea una superficie de contacto muy importante entre las dos capas celulares, favoreciendo los intercambios en el interior del espacio subretiniano, limitado proximalmente por las expansiones de las células de Müller (Tso y Friedman 1967; Samuelson, 1999). Las funciones del EPR son muy importantes y muy variadas. Por un lado, constituyen una trampa de fotones, ya que en las zonas pigmentadas (variables según la especie), la presencia de Revisión Bibliográfica 16 melanosomas cercanos a la parte apical, hace que el EPR se comporte como una pantalla opaca absorbiendo los fotones que atravesaron la neurorretina sin estimular los FR (Kommonen et al., 1991). Por otro lado, tienen un papel importante en la constitución de la barrera hemato-retiniana, similar al de las células gliales que protegen las células nerviosas del encéfalo (Steinberg, 1985). Dentro de sus importantes funciones metabólicas destacan: • Stock y liberación de vitamina A, a través de su membrana apical a lo largo del metabolismo y la regeneración de los pigmentos visuales, cuyo déficit produce ceguera nocturna además de enlentecimiento en la producción de nuevos segmentos externos en los FR (Crouch et al., 1996; Herrón et al., 1974). • Fagocitosis regular de una pequeña porción de la membrana de los artículos externos de los FR que se renuevan periódicamente con un ritmo circadiano. El fagosoma resultante se transporta desde la zona apical a la zona basal del EPR en donde se fusiona con un lisosoma para su degradación; los catabolitos resultantes se transfieren a la circulación coroidea (Ishikawa y Yamada, 1970; Young, 1971). • Aporte nutritivo a los FR para formar sus nuevas membranas (Young, 1971). El EPR es el responsable de la existencia de un potencial córneo-retiniano. En efecto, cuando se coloca in vivo un electrodo a uno y otro lado del EPR se registra un potencial trans-epitelial de unos 6 mV independiente del nivel luminoso; el llamado potencial de reposo. Esto permite asimilar la retina a un dipolo eléctrico. Así, el campo eléctrico generado por este dipolo se manifiesta fuera del EPR; las cargas negativas y positivas se propagan por los distintos medios del ojo cuya resistencia es baja. La electropositividad es recogida a nivel de la córnea y la electronegatividad en región escleral y periocular (Arden et al., 1962; Kommonen et al., 1991; Marmor, 1991). Trabajos sobre retinas bovinas han permitido identificar canales iónicos específicos y cotransportadores a nivel de la membrana apical y a nivel de la membrana basal asociados a sistemas de transmisión intracelulares (mediante mensajeros). Las conductancias de estos diferentes canales iónicos se regulan en función de la composición del medio que los rodea (Edelman y Miller, 1990; Joseph y Miller, 1991). La membrana apical de la célula epitelial posee un canal específico para el transporte de los iones de K+ controlado en parte por el transporte activo mediante una bomba de Na+/K+. Esta membrana tiene asimismo la posibilidad de integrar a partir del medio subretiniano una combinación de iones de Na+-K+-Clpor un lado y Na+-HCO3por el otro, por la acción de un co-transportador asegurando su paso a través de la membrana y permitiendo así la regulación del pH celular. La membrana basal es permeable a los iones de K+ y de Clpor medio de dos canales distintos. El transporte de otros iones como el Na+ y el bicarbonato (HCO3-) se efectúa indirectamente con la Revisión Bibliográfica 17 ayuda de co-transportadores. Estos fenómenos de transportes iónicos juegan un papel fundamental contribuyendo a mantener el volumen de la célula, su hidratación, el pH y el potencial transmembrana (figura 2) (Joseph y Miller, 1991). Este último es muy sensible a las variaciones de concentración iónica en particular la de K+ (Oakley, 1977). La reabsorción de agua a partir del espacio subretiniano es esencial para la cohesión entre el EPR y la capa de los FR. En efecto, las células del EPR se comportan como los astrocitos del sistema nervioso central y de la retina; regulan la cantidad de K+ y de neurotransmisores en el espacio subretiniano así como la cantidad de agua (Schnitzer, 1988). Figura 2: Modelo de transporte iónico en las membranas basal y apical del EPR bovino (Joseph y Miller, 1991) 1.3.1.2.- TAPETUM LUCIDUM (TL): En los ojos de los mamíferos se encuentran diferencias anatómicas, según el nivel de adaptación a la luz, en la organización de la retina, el sistema óptico, el tamaño del ojo y la presencia de estructuras especializadas como es el tapetum lucidum (TL). El TL influye en la sensibilidad a la luz, ya que ofrece una segunda oportunidad de estimular los FR en niveles bajos de iluminación, al reflejar la luz que llega a la retina (Ollivier et al., 2004). En el perro tiene forma triangular, de bordes redondeados con la base orientada horizontalmente excluyendo el disco óptico, y el ápex hacia arriba. Cubre un área que ronda el 30℅ del fundus superior (figura 3) (Lesiuk y Braekevelt, 1983). El hombre así como varias especies animales (monos, cerdos) no poseen TL (Ollivier et al., 2004). Revisión Bibliográfica 18 Figura 3: Fondo de ojo del perro, en el que se aprecia el TL (zona brillante superior). 1.3.2.- CAPA RECEPTORA: Esta capa se corresponde con la neurorretina y en concreto con la zona más externa de la misma; la CNE, en donde se encuentran los cuerpos celulares de los FR, conos y bastones (Wässle y Boycott, 1991). 1.3.2.1.- ESTRUCTURA: Se trate de un cono o de un bastón, todos los FR están constituidos por un segmento externo y otro interno unidos por un cilio conector. Los conos presentan una estructura cónica, con sus núcleos alineados en una sola capa justo por debajo de la membrana limitante externa. Sus segmentos internos y externos se proyectan dentro del espacio subretinal hacia el EPR (Samuelson, 1999). Su tiempo de respuesta es muy corto y proporcional a la cantidad de energía recibida. Son los responsables de la visión coloreada en ambiente fotópico (Baylor, 1987). Los bastones poseen una morfología alargada con sus segmentos internos y externos rellenando el espacio entre los conos y los procesos de las células del EPR. Los cuerpos celulares de los bastones constituyen el resto de la CNE, donde se sitúan formando varias capas (Samuelson, 1999). Son sensibles a bajas frecuencias espaciales y temporales y a las cortas longitudes de onda. Solo tienen un tipo de pigmento; la rodopsina, no participan en la apreciación de los colores. Funcionalmente los conos se diferencian de los bastones por su sensibilidad lumínica. Mientras que los bastones son capaces de detectar un fotón de luz o mínima cantidad de energía lumínica conocida (Taylor et al., 2004), los conos precisan intensidades mil veces superiores para producir una variación de potencial en su membrana (Baylor, 1987). Los segmentos internos de los bastones son más delgados que los de los conos y ambos están repletos de largas mitocondrias (Miller et al., 1989). A partir de los cilios que unen el segmento externo al interno se producen una serie de evaginaciones e invaginaciones de la membrana Revisión Bibliográfica 19 plasmática de los FR, que dan lugar a los segmentos externos (Young, 1971). Esta es la porción de los FR donde se encuentran los pigmentos visuales. A nivel de los bastones, los segmentos externos están constituidos por discos membranosos aislados de la membrana plasmática donde se encuentran inmersos los pigmentos sensibles a las radiaciones luminosas. Por contra en los conos no existen discos membranosos aislados sino múltiples repliegues de la membrana plasmática (figura 4) (Steinberg et al., 1980). Figura 4: Estructura básica de los FR (izquierda) y del segmento externo de los conos y de los bastones (derecha) (adaptado de: Young, 1971). A diferencia de los bastones, que forman un sólo tipo morfológico y funcional, en el hombre existen tres tipos de pigmentos para conos (yodopsinas) que dan lugar a tres tipos de conos: unos que presentan una sensibilidad máxima para las longitudes onda más largas (L), otros con mayor sensibilidad a las longitudes de onda medias (M) y otros con mayor sensibilidad a las longitudes de onda más cortas (S). Estos tres tipos de conos no son numéricamente iguales y dan lugar a la visión tricromática que poseen los humanos (Gouras, 1984). Algunas especies de mamíferos poseen una visión dicromática debido a la presencia de sólo dos tipos de conos: los sensibles a las longitudes de onda medias y cortas. Es el caso del perro, que solo tiene dos tipos de pigmentos uno con un pico de absorción espectral de 429 nm (conos S) y otro de 555 nm (conos M) (Neitz et al., 1989) así como del zorro que también es dicromático (figura 5) (Jacobs et al., 1993). Revisión Bibliográfica 26 El ciclo se cierra con la isomerización del todo-trans a 11-cis-retinal en condiciones de oscuridad, esta reconversión requiere de energía metabólica y está catalizada por la enzima retinal isomerasa, una vez formado el 11-cis retinal se recombina automáticamente con la opsina para volver a formar rodopsina; dicha unión se realiza mediante la formación de un enlace no covalente seguido por la formación de uno covalente (Kefalov et al., 2001). La rodopsina así formada permanece estable hasta que la absorción de energía lumínica vuelve a desencadenar su descomposición (Crouch et al., 1996). Existe una segunda vía química para esta regeneración que consiste en la conversión por reducción del todo-trans retinal primero en todo-trans retinol que es una forma de la vitamina A, este a su vez se transforma en 11-cis retinol, y por último en 11-cis retinal que se unirá a la opsina (Chen et al., 2005). La vitamina A está presente en el citoplasma de los conos así como en el EPR de la retina, por lo tanto siempre se encuentra disponible para formar nuevo retinal cuando se necesita, y cuando la cantidad de retinal es excesiva en la retina el sobrante se convierte de nuevo en vitamina A, disminuyendo la cantidad de fotopigmento en la retina (Crouch et al., 1996). Esta interconversión entre retinal y vitamina A contribuye a la adaptación a largo plazo de la retina a diferentes intensidades de luz (Fain et al., 2001). Figura 10: Diagrama que representa los mecanismos de activación e inactivación en los FR de los vertebrados (Fain et al., 2001). Revisión Bibliográfica 27 1.3.2.5.- ADAPTACIÓN A DISTINTOS NIVELES LUMINOSOS: En oscuridad la rodopsina mantiene su forma cis, pero cuando se absorbe un fotón de luz se transforma rápidamente en todo-trans, esto cambia su forma y por lo tanto la forma de la proteína (opsina) también, este proceso se conoce con el nombre de blanqueamiento (Yau, 1994). La acción inversa, el paso de todo-trans-retinal a 11-cis-retinal, requiere una reacción enzimática y es mucho más lenta. La molécula de todo-trans retinal, a través de enzimas y transportadores, es llevada al EPR donde es transformada nuevamente en 11-cis retinal y devuelta al bastón con mediación de proteínas G, siendo un proceso que lleva varios minutos (Deretic y Papermaster, 1995). En el caso de los conos la regeneración de sus pigmentos es hasta 20 veces más rápida (Mata et al., 2000). En cuanto a los conos, existe un fenómeno de adaptación a distintos ambientes luminosos. Así cuando se pasa de un ambiente oscuro a uno iluminado, si se realizan ERGs se aprecia que las amplitudes van aumentando durante los primeros minutos, esto se conoce como efecto de adaptación a la luz. Algunos autores creen que se trata de cambios en el potencial de reposo (Biersdorf y Armington, 1960) y otros que se trata de re-despolarizaciones que tienen lugar en los conos (Gouras y Mackai, 1989). Según Benoit y Lachapelle este efecto está mediado no por uno, sino por dos mecanismos o rutas retinianas distintas, todavía desconocidas (Benoit y Lachapelle, 1995). Los conos recuperan su corriente circulante muchísimo más rápido que los bastones. Mientras a los bastones les cuesta recuperar su corriente circulante unos 1520 minutos tras estar expuestos a un ambiente luminoso que blanquea gran parte de sus pigmentos, a los conos les basta con unos segundos. En efecto, estudios electrorretinográficos tras exposición de la retina a ambientes luminosos intensos que causan el blanqueamiento de gran parte de los pigmentos de los conos, demostraron que con estímulos intensos la recuperación del ERG es rapidísima para los conos. Esto se podría deber a que son capaces de aprovechar fotoproductos del proceso de blanqueamiento para mantener su corriente circulante. Sin embargo, con flashes débiles el tiempo de recuperación es más largo, correspondiendo con el tiempo de regeneración de los fotopigmentos de los conos. Indicando además que la sensibilidad de los conos a flashes débiles depende de la cantidad de fotopigmentos (Paupoo et al., 2000). Estas diferencias fisiológicas entre los conos y los bastones se deben en parte a que el 11-cis retinal en su unión covalente inicial con la opsina provoca la desactivación de la cascada de fototransducción en el caso de los conos, mientras que en los bastones provoca una activación Revisión Bibliográfica 28 transitoria de la misma enlenteciendo el proceso de adaptación a la oscuridad (Kefalov et al., 2001). 1.3.3.- CAPA POST-RECEPTORA: En esta capa se encuentran las células bipolares además de células de asociación (amacrinas, horizontales e interplexiformes) y de sostén (células de Müller) (Wässle y Boycott, 1991). 1.3.3.1.- CÉLULAS BIPOLARES: Las células bipolares conectan con las terminaciones sinápticas de los FR y transmiten las señales hacia las células ganglionares. Representan el segundo peldaño de la vía vertical de la retina (FRbipolares-ganglionares) y el neurotransmisor que utilizan es el mismo que el que usan los FR y también la mayoría de las células ganglionares; el glutamato (Kolb, 2003). 1.3.3.1.1.- TIPOS: El número de tipos de células bipolares es variable en función de la especie; en la retina del mono se han descrito 9 tipos morfológicos distintos, 8 de estos tipos celulares corresponden a células bipolares para cono, mientras que sólo existe un tipo de célula bipolar para bastón (Boycott y Wässle, 1991). Las células bipolares se subdividen en dos grupos; las que se conectan a los conos L y M y las que se conectan a los conos S. Las conectadas a los conos M o L pueden ser enanas o difusas y su conexión puede ser invaginante o superficial (Kolb et al.,., 1981; Wässle y Boycott, 1991). Las bipolares de los conos S son de un tamaño intermedio a las anteriores y establecen uniones con los conos solo por invaginación en la sinapsis en cintilla (Kouyama y Marshak, 1992). Las bipolares de bastones se conectan con varios de ellos (20-40) por sinapsis invaginantes (Kolb et al., 1981; Wässle y Boycott, 1991). Varias células bipolares convergen hacia un número más restringido de células ganglionares, por el intermedio de células amacrinas de tipo AII, a nivel de la capa plexiforme interna (Kolb et al., 1981). Desde un punto de vista funcional, los conos L y M están conectados a un acoplamiento de células bipolares; una invaginante y una superficial que funcionan de manera opuesta en respuesta a la luz. Así las bipolares invaginantes llamadas ON están hiperpolarizadas en oscuridad y se despolarizan Revisión Bibliográfica 29 con la luz y las bipolares superficiales llamadas OFF a la inversa. Esto es importante ya que reciben la misma tasa de glutamato y sin embargo tienen un comportamiento opuesto. En efecto, cuando los FR disminuyen la tasa de liberación de glutamato tras un estímulo luminoso, causan la liberación de glutamato por parte de las bipolares ON, y la inhiben por parte de las OFF. Esto ocurre porque las bipolares ON poseen receptores distintos a las OFF. Las células bipolares conectadas a los bastones y a los conos S funcionan solo bajo el modo ON (Figura 8) (Kolb, 2003). Figura 11: Esquema de los distintos tipos de células bipolares (ON y OFF) y su reacción ante la tasa de glutamato liberado por los FR estimulados por la luz. Las bipolares ON (a y b) tienen receptores de glutamato inhibidores, y las bipolares OFF (c) tienen receptores de glutamato excitadores (Kolb, 2003). El conjunto de FR unidos funcionalmente a una célula bipolar determinada constituye su campo receptor. La conexión puede ser directa recubriendo el campo dendrítico generando el centro, o indirecta por mediación de células horizontales limitando el contorno del campo receptor. Esta organización también se encuentra en las células ganglionares (Kolb, 2003). 1.3.3.1.2.- RECEPTORES: Las células bipolares tienen receptores de glutamato. Se han identificado dos tipos distintos: receptores metabotrópicos y receptores ionotrópicos (Nakanishi, 1992). 1.3.3.1.1.1.- Metabotrópicos: Revisión Bibliográfica 30 Son los que utilizan las células bipolares ON. Al contrario que los ionotrópicos, los canales iónicos asociados a estos receptores están acoplados a proteínas G, y utilizan segundos mensajeros (GMPc). Cuando el ligando (glutamato) se une a estos receptores activa una cascada intracelular y cierra el canal catiónico dependiente de GPMc que lleva asociado, por ello se consideran receptores inhibidores (Nakanishi, 1994). 1.3.3.1.1.1.- Ionotrópicos: Son los que poseen las células bipolares OFF. Cuando el glutamato interactúa con un receptor de este tipo abre el canal iónico (muy permeable al Na+ y al K+) de manera directa, ya que ambos, receptor y canal forman una única estructura. Esta característica los hace ser más rápidos que los metabotrópicos (Verdoorn et al., 1991). Se consideran receptores excitadores. Existen dos tipos dentro de esta clase de receptores, los de tipo NMDA y los de tipo no-NMDA. Este último es el que poseen las bipolares OFF; se trata de receptores alfa-amino-3-hidroxi-5-metil-4-ácido isoxazolepropionico/kainato (AMPA/KA) (Keinanen et al., 1990; Nakanishi, 1992). 1.3.3.2.- CÉLULAS DE ASOCIACIÓN: Todas las retinas de mamíferos contienen varios tipos de células de asociación lateral. A nivel de la CPE están las células horizontales, a nivel de la plexiforme interna las células amacrinas, e interconectando ambas las interplexiformes (Wässle y Boycott, 1991). 1.3.3.2.1.- CÉLULAS HORIZONTALES: Estudios recientes, combinando microscopía óptica y electrónica con el método de Golgi, han demostrado que en la retina humana existen tres tipos de células horizontales. Las células horizontales de tipo I (HI) contactan preferentemente con conos L y M, aunque también con conos S, a través de sus dendritas y con bastones en una sinapsis invaginante a trabes de su único axón. Las células horizontales de tipo II (HII) o células horizontales con axón, contactan preferentemente con conos S pero también con otros tipos de conos a nivel de sus terminaciones dendríticas y únicamente con conos S a nivel de su axón terminal. Las células horizontales de tipo III (HIII) son semejantes a las células de tipo I, aunque de mayor tamaño y evitan cualquier contacto con conos S. Se cree que utilizan el ácido gamma amino butírico (GABA) como neurotransmisor, por lo menos las HI y las HII, y sus polos dendríticos y axónicos funcionan de manera independiente (figura 12) (Ahnelt y Kolb, 1994). Revisión Bibliográfica 31 Figura 12: Distinto tipo de células horizontales y su conexión con los conos y los bastones. Los conos M, L y S se representan en color verde, rojo y azul respectivamente. Las células horizontales responden a la luz con una hiperpolarización, pero a la vez existen sinapsis recíprocas desde las células horizontales hacia los FR. Estas sinapsis hacen que la información de las redes de células horizontales, que se encuentran extensamente acopladas a través de contactos eléctricos, realice una sumación espacial de los estímulos colaborando en la organización centro/periferia de los campos receptores de las células ganglionares (Mangel, 1991). Dichos acoplamientos por contactos eléctricos son muy sensibles a ciertos neurotransmisores, como la dopamina secretada por las células amacrinas dopaminérgicas que ejercen así un control retroactivo sobre la capa plexiforme externa (figura 13) (Kolb, 2003). Figura 13: Las células horizontales recogen información de un amplio rango de conos, y ejercen su influencia sobre las bipolares directamente y/o por mecanismos de feed-back hacia los conos (Kolb, 2003). 1.3.3.2.2.- CÉLULAS AMACRINAS: Estas células presentan un cuerpo celular situado en la CNI y unas prolongaciones que se extienden por la misma. No reciben conexiones directas de los FR, sino sólo de células bipolares y de otras células amacrinas, estableciendo a su vez conexiones con células ganglionares y retroalimentando Revisión Bibliográfica 32 también a las células bipolares. Por tanto forman la vía de asociación lateral a nivel de la plexiforme interna (Wässle y Boycott, 1991). Están conectadas entre ellas por sinapsis químicas. Sus neurotransmisores son la glicina y el GABA, pero además liberan sustancias que pertenecen al sistema colinérgico, serotoninérgico y dopaminérgico, que funcionan como neuromoduladores (Kolb, 2003). Proporcionan una respuesta de tipo fásico, al contrario que las bipolares cuya respuesta es tónica. Gracias a la retroalimentación ejercida sobre las células bipolares, la acción excitadora sostenida de estas sobre las ganglionares es interrumpida, realizando una diferenciación temporal sobre la señal de las bipolares (Kolb et al., 1981). De esta manera contribuyen a los aspectos dinámicos de las interacciones entre el centro y el contorno del campo receptor de las células ganglionares, campo receptor cuya estructura espacial fue construida por las bipolares y horizontales más externas (Kolb, 2003). El papel de las amacrinas de tipo AII es muy importante ya que aseguran la unión entre las bipolares ON de los bastones y las ganglionares por medio de 2 sinapsis; una eléctrica a nivel de las terminaciones presinápticas de una bipolar ON de un cono, y la segunda, de tipo químico inhibidora glicinérgica con una bipolar OFF de cono. De tal manera que las células bipolares de los bastones contribuyen a la excitación por la vía ON y a la vez a la inhibición por la vía OFF, manteniendo así bien separadas las vías ON y OFF a pesar de que las bipolares de los bastones son solo de tipo ON (figura 14) (Sharpe y Stockman, 1999; Kolb, 2003). Figura 14: Los bastones utilizan las vías OFF a través de células amacrinas de tipo AII (Kolb, 2003). 1.3.3.2.3.- CÉLULAS INTERPLEXIFORMES: Las células interplexiformes fueron descritas por primera vez por el Doctor Antonio Gallego en la retina del gato en 1971 (Gallego, 1971). Interconectan la plexiforme interna y la externa (Wässle y Revisión Bibliográfica 33 Boycott, 1991). Están en contacto con las horizontales y ejercen un retrocontrol sobre la capa receptoral. Se cree que son GABAérgicas, al menos en el gato (Kolb y West, 1977). 1.3.3.3.- CÉLULAS DE SOSTÉN: Las células de sostén son células gliales entre las que cabe destacar a las células de Müller (Wässle y Boycott, 1991). Estas, son células gliales especiales, cuyos núcleos se sitúan en la CNE y sus prolongaciones se extienden a través de todas las capas (Wässle y Boycott, 1991). Desempeñan un gran número de funciones entre las cuales destacan (Newman, 1986): 1. Absorben residuos de las células nerviosas, tales como dióxido de carbono y amoníaco, y reciclan los neurotransmisores de tipo aminoácidos que se van gastando. 2. Protegen las neuronas frente a la excesiva exposición a neurotransmisores tales como el glutamato. 3. Podrían estar implicadas en la fagocitosis de los desechos neuronales y en la liberación de sustancias neuroactivas tales como GABA, taurina y dopamina. 4. Controlan la homeostasis y protegen a las neuronas contra cambios dañinos en su ambiente iónico, captando el K+ extracelular y redistribuyéndolo. 5. Podrían sintetizar ácido retinoico a partir del retinol (Edwards, 1994). 1.3.4.-CAPA DE LA CONDUCCIÓN: Aquí comienza la conducción de las señales generadas en la retina para terminar en la corteza visual. En esta capa se encuentran las células ganglionares con sus axones que darán origen al NO (Wässle y Boycott, 1991). Las células ganglionares poseen un cuerpo celular voluminoso y ramificaciones dendríticas que forman sinapsis a nivel de CPI con las terminaciones de las células bipolares y amacrinas. Su axón sólo se mieliniza a nivel del NO, por fuera ya del globo ocular. Este axón tiene un porcentaje variable de decusación en el quiasma óptico (75 % en el perro, 50 % en el mono...) (Brooks et al., 1999). Del quiasma óptico llega hasta el cuerpo geniculado lateral externo, donde se produce la siguiente sinapsis de la vía visual. La información que transportan es transmitida en forma de código de frecuencias de potenciales de acción. Los potenciales de acción son descargas eléctricas de la membrana celular de gran amplitud (>100 mV) y corta duración (~1 ms), que pueden ser Revisión Bibliográfica 34 conducidos de forma activa y a gran velocidad a lo largo del axón de las células ganglionares (Howard y Breazile, 1973). La codificación de las formas de los estímulos visuales por la retina es posible gracias a mecanismos de inhibición lateral. En este sentido, es conocido el papel que juegan las células horizontales de la retina, modulando transversalmente el efecto que el glutamato liberado por los FR ejerce sobre las células bipolares. Gracias a estos mecanismos de inhibición lateral, las células bipolares de la retina son capaces de responder con despolarizaciones (respuesta ON) o hiperpolarizaciones (respuesta OFF) a estímulos luminosos puntuales que inciden en el centro de su campo receptor, y de forma completamente antagónica a estímulos luminosos que inciden sobre la periferia de su campo receptor (Mangel, 1991). Las células ganglionares pequeñas de la retina presentan una organización concéntrica de sus campos receptores (centro ON/periferia OFF o centro OFF/periferia ON), admitiéndose en el momento actual que dicho antagonismo centro/periferia es la base de la percepción de las formas por las células de la corteza visual (Kolb, 2003). Las células ganglionares tienen un funcionamiento que se puede llamar digital, mientras que las células de la capa receptoral y postreceptoral tienen un funcionamiento de tipo analógico (Lazard et al., 2000). Es decir, las ganglionares tienen despolarizaciones equipotenciales (de igual amplitud), pero el número de despolarizaciones por unidad de tiempo refleja la intensidad del estímulo, ya que incluso sin estimulación transmiten impulsos continuos, y las señales excitatorias incrementan el número de impulsos, mientras que las inhibidoras lo disminuyen. Así las ganglionares de centroON aumentan la frecuencia de descarga cuando se ilumina el centro, y reciben su estímulo de las bipolares invaginantes (ON). Las ganglionares de centro-OFF, disminuyen la frecuencia de sus descargas cuando se ilumina el centro, recibiendo su estímulo de las bipolares superficiales (OFF). Ambos tipos están presentes en igual número en la retina y la luz difusa no es un estímulo eficaz en ninguno de ellos (Kolb, 2003). 1.4.- VASCULARIZACIÓN: La retina es extremadamente activa metabólicamente, con elevado consumo de oxígeno. Al igual que ocurre con el cerebro, la retina presenta una barrera (hemato-retiniana) altamente selectiva para mantener la regulación homeostática de su capa nerviosa (Rodríguez-Peralta, 1975). En los mamíferos se pueden encontrar retinas avasculares (algunos marsupiales) y vasculares (perro, gato, caballo...). Las retinas vasculares reciben su aporte sanguíneo por dos vías: la arteria central de la retina y los vasos coroidianos (Buttery et al., 1990). En el perro así como en el hombre, la vascularización de la mayoría de la neurorretina está asegurada por la ramas de la arteria central de Revisión Bibliográfica 35 la retina, que forman una amplia red capilar. Estos vasos se pueden encontrar a nivel de casi todo el espesor de la retina, desde la capa de fibras del NO hasta la CPE e incluso la CNE. La delicada capa de los FR y el EPR se nutren directamente de ramas que provienen de la arteria coriocapilar (Samuelson, 1999). La circulación retiniana se caracteriza por su flujo más bajo en comparación con la circulación coroidiana. Esta última es controlada principalmente por inervación simpática y apenas se autoregula. La circulación retinal carece de inervación autónoma, se regula fundamentalmente por factores locales mostrando una eficiente capacidad de autorregulación (Demant et al., 1982; Delaey y Van de Voorde, 2000). 2.- ELECTROFISIOLOGÍA OCULAR: La electrofisiología ocular es la ciencia que estudia y recoge los cambios eléctricos del globo ocular y su conducción hasta el área visual occipital a través de las vías ópticas. Permite un estudio global del funcionamiento de las estructuras responsables de la información visual sensorial. La retina es considerada como una prolongación periférica del cerebro y presenta, como toda estructura nerviosa, potenciales de reposo y potenciales de acción (Komaromy et al., 1998; Lazard et al., 2000; Benítez del Castillo et al., 2002; Mora y Aregall, 2005). El globo ocular se comporta como un dipolo eléctrico, con una diferencia de potencial entre la córnea y el polo posterior, en el caso del hombre, de unos 6 mV. Las capas externas de la retina son electro-negativas en relación a las internas que son electro-positivas. La córnea recibe el potencial positivo de las capas internas retinianas, en tanto que el entorno periocular recibe el potencial negativo de las capas externas (Benítez del Castillo et al., 2002). Este potencial córneo-retiniano en reposo, sin la menor influencia de estimulación luminosa fue descubierto en 1894 por Dubois-Reymond que lo llamó potencial de reposo o potencial córneoretiniano (Lazard et al., 2000; Benítez del Castillo et al., 2002). Por medio de esta disciplina se pueden recoger trazados que corresponderán a diversas y diferentes capas del órgano, así como a su estado, ya sea en reposo o en acción. Por lo tanto vamos a distinguir y separar para su estudio, los potenciales de reposo y de acción de la retina, que se van a generar en diferentes capas de la misma (Lazard et al., 2000; Benítez del Castillo et al., 2002; Ofri, 2002; Mora y Aregall, 2005). • Potencial de reposo de la retina: electro-oculograma (EOG). Revisión Bibliográfica 42 Figura 18: Resistencias eléctricas de los distintos tejidos oculares. C y D representan los puntos de localización de electrodos para registrar el ERG extrarretinal. Un estímulo luminoso mediante un proceso electroquímico denominado fototransducción genera una corriente extracelular (I) que se divide en dos rutas: una que fluye a través de la retina (ruta local IA) y otra que fluye a través de los tejidos oculares (ruta remota IB). Cada uno de los tejidos oculares (retina, vítreo, esclera, coroides, EPR) se representa en la figura 18 como resistencias eléctricas (R) (Brindley, 1963). Según la ley de Ohm la diferencia de potencial entre dos puntos es independiente de la ruta seguida por la corriente. Por lo tanto la diferencia de potencial entre los puntos A y B puede ser calculada para la ruta local o la remota (Honsho et al., 2004). IAR1 = IB (R2 + R3 + R4 + R5 + R6) (Ecuación 1) De esto se puede deducir que la corriente IA en la ruta local es mayor a la corriente IB en la ruta remota ya que la suma de resistencias R2 + R3 + R4 + R5 + R6 es lógicamente mayor que R1. Cuando utilizamos dos electrodos para registrar la actividad eléctrica de la retina en respuesta a estímulos luminosos obtendremos los mayores cambios de potencial cuando los electrodos se coloquen entre los puntos A y B, es decir a ambos lados de las células que producen la respuesta eléctrica (Brown y Wiesel, 1961a; 1961b). Evidentemente cuando el ERG se registra en humanos o en animales de manera repetida los electrodos no se pueden colocar en la retina. La alternativa es colocar tanto el electrodo activo como el de referencia lejos de la misma. Si dichos electrodos se colocan en el lugar señalado en la figura 18 como C y D la diferencia de potencial entre ellos se obtiene de las siguientes ecuaciones: Revisión Bibliográfica 43 VC - VD = IB x R4 (Ecuación 2) VC - VD = IAR1 - IB(R2 + R3 + R5 + R6) (Ecuación 3) Esto es el ERG: el cambio de potencial inducido por un estímulo luminoso relacionado con la actividad eléctrica de la retina en respuesta a la luz. Por norma general cuando la función retiniana se deteriora, la actividad eléctrica en respuesta a la luz disminuye. Las corrientes IA e IB serán más pequeñas y en consecuencia el ERG también indicando que existe una patología retiniana (Brown, 1968). Hay que tener en cuenta que la magnitud de las resistencias de los distintos tejidos oculares y más aún la relación entre ellas también puede afectar al ERG medido con electrodos extraoculares. En este sentido, según Wali y Leguire, los pacientes con el fondo de ojo más pigmentado tienen respuestas menores en el ERG bajo ciertas condiciones, debido a la resistencia de los gránulos de melanina (Wali y Leguire, 1993). En efecto, la relación entre la corriente originada de la actividad eléctrica de la retina en respuesta a la luz en las rutas local y remota depende de la relación entre las resistencias de ambas rutas. De la ecuación 1 se extrae la siguiente relación: IA/IB = (R2 + R3 + R4 + R5 + R6)/ R1 (Ecuación 4) Cualquier cambio en las resistencias de los tejidos oculares va a cambiar la magnitud de la corriente en la ruta remota (IB) y el ERG (VC - VD) se va a modificar independientemente de la funcionalidad de la retina. Por lo tanto, el conocimiento de las distintas resistencias y la comprensión de los factores que las pueden modificar es importante para utilizar correctamente el ERG tanto en clínica como en investigación. El EPR ofrece la mayor resistencia (R6 en la figura 18) al paso de la corriente a través de los tejidos oculares debido a la membrana de Brüch, (Tomita et al., 1960) o a la membrana limitante externa (Brindley, 1956), con lo que cualquier cambio en esa resistencia afectará a la distribución de las corrientes entre la ruta local (IA) y la ruta remota (IB). Este cambio en las resistencias tisulares se reflejará en el ERG medido con electrodos extraoculares (Brindley, 1956; Tomita et al., 1960; Byzov, 1968). Arden y Brown resaltaron en 1965 la importancia de las resistencias de los tejidos oculares. En su experimento sustituyeron el humor vítreo de varios gatos por aceite pesado para abolir el flujo de corriente desde la retina a tejidos lejanos (ruta remota) y asegurar así mayores registros de Revisión Bibliográfica 44 potenciales en la retina (ruta local) (Arden y Brown, 1965). Esto está igualmente documentado a nivel clínico, en pacientes que tras una lesión extensa de la retina se sometieron a una vitrectomía con inyección de silicona en el vítreo. Puesto que el aceite de silicona no conduce la corriente, la resistencia del vítreo aumenta y disminuye la corriente remota (IB) y el ERG (Doslak, 1988). 2.2.1.3.- ORIGEN DE LAS PRINCIPALES ONDAS: Este apartado se puede abordar fundamentalmente desde dos puntos de vista; uno farmacológico y otro fisiológico. Los experimentos fisiológicos se basan en la asunción de que los generadores de los distintos componentes del ERG se encuentran en capas concretas de la retina y en consecuencia cuando estos son registrados con un microelectrodo en la retina distal, la polaridad de las ondas específicas del ERG se invertirá con respecto a las ondas obtenidas colocando el electrodo activo en la retina proximal, el vítreo o la córnea (Green y Kapousta-Bruneau, 1999). Otro tipo de experimentos fisiológicos son los basados en el análisis de densidad y origen de corrientes con microelectrodos introducidos en distintas capas de la retina (Karwoski y Xu, 1999). Desde el punto de vista farmacológico, se utilizan agonistas y antagonistas específicos y se analizan sus efectos sobre el ERG (Narahashi, 1974; Green y Kapousta-Bruneau, 1999). Los fármacos más utilizados para aislar la respuesta de uno a varios grupos celulares son los que siguen: • El ácido DL-2-amino-4-fosfonobutirico (APB) que bloquea la actividad postreceptoral de las vías ON. Se trata de un agonista competitivo de los receptores de glutamato (neurotransmisor de los FR) que normalmente conducen las señales visuales hacia las células bipolares despolarizantes (bipolares ON). En presencia de APB esa sinapsis está constantemente activada simulando una situación de constante oscuridad. También bloquean las células horizontales (Slaughter y Miller, 1981). • El cis-2,3-piperidinedicarboxílico (PDA), que bloquea la actividad postreceptoral de las vías OFF. Es un aminoácido excitador que bloquea el flujo desde los FR hacia las células bipolares hiperpolarizantes bloqueando también la actividad de las células horizontales. En presencia de PDA las células horizontales y las bipolares OFF no responden a la luz (Slaughter y Miller, 1983a). • El 6,7-dinitroquinoxalina-2,3-diona (DNQX), un antagonista específico de los receptores de glutamato de tipo no-NMDA (AMPA/KA) (Andreasen et al., 1989; Robson y Frishman, 1996), receptores presentes en las células bipolares OFF (Keinanen et al., 1990; Nakanishi, 1992). Revisión Bibliográfica 45 • EL aspartato (ASP) es un análogo del glutamato que inhibe su recaptación, con lo que aumenta en la sinapsis y simula una situación de constante oscuridad (Xu et al., 1991). • El tetradoxin (TTX) bloquea los canales de sodio y evita los potenciales de acción generados en las células ganglionares y algunas amacrinas (Narahashi et al., 1964). • El n-metil-d-aspartato NMDA suprime la transmisión sináptica de la subclase NMDA de receptores de glutamato localizada sobre todo en células de tercer orden (ganglionares y amacrinas) (Slaughter y Miller, 1983b; Nakazawa et al., 2005). • Los iones de bario (Ba2+) bloquean la conductancia al K+ de las células de Müller (Newman, 1989). • Ácido kinurénico (KYN) bloquea la actividad de neuronas de tercer orden; amacrinas y ganglionares (Coleman, 1986). Los ERGs obtenidos en diferentes especies son claramente diferentes en amplitud, latencia y forma debido a diferencias propias de la especie, en particular a la distinta densidad de conos y de bastones en sus retinas, pero también son distintos debido a factores técnicos como la duración e intensidad del estímulo y el método de recogida de las respuestas. Sin embargo, en la mayoría de los vertebrados los ERGs conservan la misma forma básica de sus ondas a y b (figura 19) (Noell, 1954; Komaromy et al., 1998; Sims, 1999, Lazard et al., 2000; Benítez del Castillo et al., 2002). Figura 19: Forma básica del ERG, con sus ondas a y b. La flecha roja representa el inicio del estímulo. A continuación describiremos los orígenes de las ondas a, b y c no por su orden de aparición en el ERG (latencia), sino por su lugar de origen en la retina comenzando por su capa más distal; el EPR, lugar en donde se origina la onda c (Steinberg et al., 1970). Revisión Bibliográfica 46 2.2.1.3.1.- ONDA c: Hoy en día se sabe que la onda c se origina en el EPR. Los primeros indicios de esto fueron documentados por Noell en 1954 cuando comprobó que una inyección sistémica de ázida sódica (N3Na) inducía un potencial eléctrico en la retina similar a la onda c del ERG. Este potencial no se veía alterado por el ácido iodoacético, el cual destruye los FR, ni por la sección del nervio óptico con la consiguiente destrucción de las células ganglionares (Noell, 1954). Esta hipótesis sobre el origen de la onda c fue confirmada años más tarde cuando se hicieron registros intracelulares del EPR y se vio que en respuesta a la luz se obtenía una onda con idéntica forma y temporalidad que la onda c (Steinberg et al., 1970). Además, cuando la retina es separada del EPR solo proporciona ERGs con ondas a y b normales pero sin onda c (figura 20) (Pepperberg et al., 1978). Figura 20: ERGs registrados sobre retinas enteras (A), desprovistas de EPR (B) y retinas tratadas con aspartato (C) (adaptado de Pepperberg et al., 1978). El mecanismo exacto por el cual las células del EPR generan la onda c se conoció cuando se desarrollaron los microelectrodos sensibles al K+. Las células del EPR son funcionalmente asimétricas, con su membrana basal (hacia la coroides) menos permeable a los iones de K+ que su membrana apical (hacia la retina). Dicha asimetría causa un potencial constante entre la retina y la coroides con la parte retinal positiva con respecto a la coroidal, esto se conoce como el potencial de reposo del ojo (Arden et al., 1962; Marmor, 1991; Kommonen et al., 1991). El potencial de reposo es muy sensible a la concentración de K+ y cualquier cambio en su concentración a uno u otro lado implicará un cambio en el potencial trans-epitelial. Medidas con microelectrodos sensibles al K+ en la capa de los FR muestran una disminución de la concentración extracelular de K+ en respuesta a estímulos luminosos, debida a la actividad inducida por la luz en los conos y bastones (Steinberg, 1985). Esta reducción de K+ cerca de la membrana apical de las células del EPR se expresa como Revisión Bibliográfica 47 un incremento del potencial trans-epitelial con el borde apical volviéndose más positivo con relación al borde coroidal. Esto es la onda c del ERG cuando se registra con un electrodo corneal (Oakley y Green, 1976; Oakley 2nd, 1977). A pesar de que la onda c se origina en el EPR, depende directamente de la integridad de los FR ya que es la absorción de luz por parte de estos la que dispara la cadena de eventos que termina con el descenso en la concentración extracelular de K+ (Oakley 2nd, 1977). Por lo tanto la onda c del ERG puede ser utilizada para evaluar la función del EPR, de los FR y de las interacciones entre ambos (Steinberg et al., 1970). Para registrar la onda c se necesita aplicar un estímulo largo y realizar las mediciones en corriente continua, apareciendo dicha onda entorno al cuarto segundo de iluminación. En la práctica este tipo de registros con estímulos largos son delicados en su realización y son mucho más comunes los registros de ERGs con estímulos luminosos breves (flash), de entre 1 y 10 ms (Marmor et al., 2004), en los que no se registra la onda c (Steinberg et al., 1970). 2.2.1.3.2.- ONDA a: La onda a del ERG se corresponde con el componente PIII de Granit. Hoy se sabe que el componente PIII se divide en otros dos un PIII rápido y un PIII lento (Murakami y Kaneko, 1966). El estudio desde un punto de vista farmacológico del origen de la onda a fue posible cuando se identificó el neurotransmisor liberado por los FR; el glutamato (Massey, 1990). Exponiendo la retina a sus agonistas y antagonistas se puede imitar o bloquear la transmisión sináptica y aislar e identificar la contribución de los FR al ERG (Bush y Sieving, 1996; Kondo y Sieving, 2001). En este sentido, fue común el uso de ASP, un aminoácido excitador (Xu et al., 1991). En la figura 20 podemos observar en el último trazado el ERG obtenido con estímulos intensos tras el uso de ASP en el que desaparece el componente PII (onda b) quedando solo el PIII rápido (onda a) (Pepperberg et al., 1978). Este estudio refleja que la onda a (componente PIII rápido) se corresponde con la respuesta a la luz de los FR (Pepperberg et al., 1978). Más recientemente se usaron nuevos fármacos como el APB y el PDA que al igual que el ASP aíslan la respuesta de los FR bloqueando su sinapsis con células de segundo orden pero son fármacos menos tóxicos que este último (Xu et al., 1991; Bush y Sieving, 1996; Kondo y Sieving, 2001). Al utilizar PDA (bloquea las células bipolares OFF y las células horizontales) la onda b aumenta y desaparece la onda a (figura 21). Revisión Bibliográfica 48 Figura 21: ERG obtenido en condiciones normales (trazado inferior) y tras aplicar PDA (trazado superior). Con PDA desaparecer la onda a y aumenta la amplitud de la onda b (Bush y Sieving, 1996). Los autores explican la ausencia de onda a debido a la pérdida de contribución del potencial negativo corneal que aportan las células horizontales y bipolares OFF (ambas bloqueadas por el PDA). El uso de APB, elimina la onda b pero no tiene efectos sobre la onda a. Por otro lado y acorde con esto último, la pérdida de onda a ha sido relacionada con el uso de estímulos cercanos al umbral de estimulación (muy usados en la clínica habitual) de los conos ya que estos estímulos bajos forman una onda a en la que participan células postsinápticas (bipolares OFF, horizontales). El componente mayoritario de la onda a corresponde principalmente a los conos cuanto más intenso es el estímulo utilizado (figura 22) (Bush y Sieving, 1994). Figura 22: Onda a del ERG obtenida con distintas intensidades de estímulo en condiciones normales, y tras tratar la retina con APB o con la combinación de APB y PDA. Con estímulos débiles e intermedios, el APB y el PDA eliminan la onda a (Bush y Sieving, 1994). Este hecho ha sido confirmado recientemente en monos (Robson et al., 2003; Ueno et al., 2004) gatos (Robson y Frishman, 1996) y en el hombre (Friedburg et al., 2004). Por otra parte, Revisión Bibliográfica 49 actualmente se asume que únicamente los primeros 10-12 ms de la onda a se corresponden con la actividad de los FR, en el hombre (Marmor et al., 2004). El componente lento de PIII no se puede identificar en un ERG convencional debido a la gran amplitud de PI (onda c), no obstante al separar la retina de su EPR y exponerla a fármacos como el ASP o la combinación de APB y PDA, se puede aislar y estudiar el componente PIII lento (figura 20) (Witkovsky et al., 1975; Pepperberg et al., 1978; Bush y Sieving, 1994). Las células de Müller son muy permeables al K+ y una reducción en su concentración en la capa de los FR tras un estímulo luminoso induce cambios en el potencial de membrana de las células de Müller que se expresa como el componente lento del PIII del ERG (Karwosky y Proenza, 1977). En resumen, la onda a es una onda negativa que refleja la hiperpolarización de los FR, tanto los conos como los bastones, con participación de células horizontales y bipolares OFF. Frente a estímulos intensos la respuesta está dominada por los FR y frente a estímulos bajos la respuesta está dominada por las células horizontales y bipolares OFF (Bush y Sieving, 1994, 1996; Robson et al., 2003; Ueno et al., 2004). Además la actividad de los FR se ve reflejada en la onda a, únicamente en sus 10-12 primeros ms (Marmor et al., 2004). Tras determinadas condiciones de adaptación larga a la oscuridad y si el tipo de estímulo activa tanto a los conos como a los bastones, se puede distinguir debido a su distinta cinética una onda a1 y otra a2 unos ms después, correspondientes a los conos y a los bastones respectivamente (Benítez del Castillo et al., 2002). Casi siempre estas dos ondas se solapan particularmente en el perro cuyos conos son menos sensibles a la luz que los del hombre (Lazard et al., 2000). 2.2.1.3.3.- ONDA b: La onda b del ERG ha sido y sigue siendo muy estudiada debido a que es el componente mayor del ERG humano y de la mayoría de los vertebrados. Se origina en células retinianas post-sinápticas a los FR. En efecto, al bloquear la transmisión sináptica entre los FR y las células retinianas saturando los receptores post-sinápticos con ASP (figura 20) o APB, se elimina la onda b del ERG (Pepperberg et al., 1978; Bush y Sieving, 1994, 1996; Ueno et al., 2004) y se aísla el componente PIII (Karwosky y Proenza, 1977). La onda b también se elimina cuando el flujo sanguíneo en la arteria retiniana central se bloquea, debido a que la neurorretina esta irrigada por la vascularización retiniana, mientras que los FR se nutren de los vasos de la coroides (Nilsson, 1971; Delaey y Van De Voorde, 2000). Faber fue el primero en 1969 en hallar las corrientes extracelulares que originan la onda b del ERG del conejo. Señaló que la fuente se encontraba en la retina distal, concretamente en la capa Revisión Bibliográfica 50 plexiforme externa, mientras que el origen se distribuía proximal y distal a la fuente. Las únicas células de la retina que tienen una distribución espacial que justifiquen este hallazgo son las células de Müller (atraviesan toda la retina). Basados en estas y otras observaciones, Miller y Dowling sugieren que la despolarización de las células de Müller en la retina distal da como resultado corrientes extracelulares que se expresan en el ERG como la onda b (Miller y Dowling, 1970). Cambios en la concentración de iones permeables a las células de Müller son susceptibles de producir un cambio en el potencial de membrana, hablamos sobretodo de los iones de K+ (Miller, 1973). La idea de que la onda b resulta de cambios en el potencial de membrana de las células de Müller debido a cambios en la concentración extracelular de K+ inducidos por la luz, sentó la base de la hipótesis de las células de Müller (Figura 24) (Miller y Dowling, 1970; Miller, 1973; Karwoski y Proenza, 1977; Kline et al., 1978; Newman, 1980). Desde que surgió esta idea, numerosos investigadores han realizado registros intracelulares de las células de Müller, midiendo concentraciones extracelulares de K+ y registros de ERGs en distintas capas de la retina en varias especies animales (Newman y Odette, 1984; Karwoski y Xu, 1999). Estos y otros estudios confirman que existe un aumento inducido por la luz en la concentración de K+ extracelular en las capas plexiformes externas e internas (Karwoski et al., 1985; Frishman y Steinberg, 1989) y un descenso como vimos antes en proximidad a los FR (figura 23) (Kline et al., 1985). Figura 23: Cambios inducidos por la luz en la concentración extracelular de K+ (ΔVK), en las distintas capas de la retina (Karwoski et al., 1985). Por otra parte, se asume que este incremento del K+ extracelular en la capa plexiforme externa tiene su origen en las células bipolares ON que se despolarizan con la luz (Dick et al., 1985). En la capa plexiforme interna, el incremento de K+ inducido por la luz resulta de la actividad de las células amacrinas y ganglionares (Karwoski et al., 1985; Dick et al., 1985). Los cambios en la Revisión Bibliográfica 51 concentración de K+ alteran el potencial de membrana de las células de Müller generando corrientes eléctricas en esas dos zonas (plexiforme interna y externa) que se escapan a través de sus terminaciones distales y proximales (figura 24) (Kline et al., 1978; Newman, 1980). Figura 24: Corrientes extracelulares de K+ (inducidas por la luz), implicadas en la formación de la onda b del ERG, según la hipótesis de las células de Müller (Newman, 1980). El uso de agonistas y antagonistas específicos de los receptores de glutamato confirman el origen de la onda b. Al exponer la retina de los vertebrados al APB, un agonista de los receptores de glutamato, se elimina la onda b (Bush y Sieving, 1994, 1996; Sieving et al., 1994; Kondo y Sieving, 2001; Ueno et al., 2004). Debido a que estos receptores de glutamato sensibles al APB solo se encuentran en las células bipolares ON (Slaughter y Miller, 1981), se puede afirmar que dichas células participan en generar la onda b (Stockton y Slaughter, 1989; Gurevich y Slaughter, 1993). En otros estudios se consiguió aumentar la amplitud de la onda b utilizando otros agonistas, ya que estos anulan fuentes de corrientes que se oponen a la formación de la onda b, se trata de experimentos realizados con DNQX (Robson y Frishman, 1996) y con PDA (Sieving et al., 1994; Bush y Sieving, 1996; Kondo y Sieving, 2001; Ueno et al., 2004), ambos bloquean las células bipolares OFF (Slaughter y Miller, 1983a). Sieving et al., plantean que en la formación de la onda b del ERG fotópico del hombre y del mono, participan principalmente las células bipolares ON, mientras que las bipolares OFF y las horizontales se oponen (Sieving et al., 1991). Esta teoría del “tira y afloja” (“push-pull”) entre las vías ON y OFF es la más aceptada actualmente (Sieving et al., 1994). Revisión Bibliográfica 58 Figura 29: Onda i registrada en los ERGs de distintas especies. En la rata y en el ratón no se aprecia o es muy pequeña (Rosolen et al., 2004b). 2.2.1.4.5.- RESPUESTA FOTÓPICA NEGATIVA (PhNR): El origen de este potencial negativo ha sido recientemente atribuido a las células de la retina interna en la rata (Raz-Prag et al., 2004), en el mono (Viswanathan et al., 1999; Frishman et al., 2002), en el hombre (Viswanathan et al., 2001) y en el gato (Viswanathan y Frishman, 1997). En efecto, según estos y otros estudios realizados en pacientes con glaucoma adquirido o inducido, este potencial lento y negativo del ERG fotópico de pleno campo proviene de la retina interna y en particular de las células ganglionares. En estos experimentos se observó como esta respuesta disminuía o desaparecía en los ojos con glaucoma (figura 30) (Frishman et al., 2002; Viswanathan et al., 1999; 2001). Figura 30: ERGs de un paciente sano (columna izquierda) y de otro con glaucoma primario de ángulo abierto (POAG; columna derecha). El ERG del paciente con POAG carece de PhNR (Viswanathan et al., 2001). Revisión Bibliográfica 59 Los ojos normales presentan una PhNR tras la onda b de entre 60 y 120 µV en el mono (Frishman et al., 2002). Resultados similares se han visto en monos tras inyectar TTX y NMDA (Ueno et al., 2004) y en humanos con patologías del NO y de las células ganglionares (Rangaswamy et al., 2004). La PhNR también es abolida por los iones de bario, que bloquean los canales de K+ afectando a corrientes en la glía, lo que indica que este tipo de células (gliales) también están implicadas en su formación (Raz-Prag et al., 2004). El PERG es el método más utilizado para valorar la funcionalidad de las células ganglionares. La PhNR posee un tiempo de culminación muy similar a la onda negativa N95 del PERG que se sabe tiene su origen en las células ganglionares (Holder, 2001). Por todo esto se piensa que la PhNR, al igual que el PERG, puede ser útil para valorar la función de las células ganglionares, siendo aquella más fácil de registrar que el PERG (Viswanathan y Frishman, 1997; Viswanathan et al., 1999, 2001; Frishman et al., 2002; Raz-Prag et al., 2004). Recientemente Rosolen et al., concluyen que una onda negativa posterior a la onda b similar a la PhNR guarda relación con el tapetum lucidum (TL), ya que refieren dos casos de perros desprovistos de TL con ERGs normales pero con ausencia de negatividad tras la onda b (Rosolen et al., 2005a). Por otro lado en otro estudio de los mismos autores se comparan los ERGs de especies sin TL, el cerdo y el mono, con los de especies con TL, el perro y el gato, observando que las especies con TL no tienen o está muy disminuida la negatividad tras la onda b. Se cree que esta negatividad post onda b guarda relación con el TL y además es distinta de la PhNR anteriormente descrita ya que la primera se puede registrar también en condiciones escotópicas (Rosolen et al., 2005b). 2.2.1.4.6.- POTENCIAL DE RECEPCIÓN PRECOZ (PRP): Esta respuesta eléctrica es la primera de la retina tras una estimulación luminosa, aparece inmediatamente tras el estímulo y tiene un patrón bifásico. En el hombre termina dentro de los primeros 1.5 ms y a continuación viene la onda a. Registros intracelulares y con microelectrodos demuestran que el PRP se origina en los FR (Murakami y Pak, 1970). La amplitud del PRP depende directamente de la intensidad del estímulo y de la cantidad de pigmentos visuales en los segmentos externos de los FR. Se cree que el PRP refleja cambios en el dipolo, debidos a modificaciones en la conformación de los pigmentos visuales cuando absorben fotones (Murakami y Pak, 1970). En humana se hacen registros de manera ocasional para estimar la cantidad de rodopsina en pacientes con retinosis pigmentaria, una enfermedad de los FR (Benítez del Castillo et al., 2002). Su empleo en clínica no se ha generalizado entre otras cosas porque requiere estimulaciones luminosas muy breves (0,8 ms) y muy intensas lo cual suele ser molesto para Revisión Bibliográfica 60 pacientes despiertos. La morfología del PRP muestra dos ondas, la primera R1 positiva es breve y sin latencia medible. La otra R2, negativa, más lenta y amplia, se considera que es preludio de la onda a del ERG (figura 31) (Walther y Hellner, 1986). Figura 31: ERP humano con una onda positiva (R1) y otra más lenta y negativa (R2) (Benítez del Castillo et al., 2002). 2.2.1.4.- PRUEBAS ESPECIALES Y MODALIDADES DEL ERG: El sistema visual de los vertebrados se puede separar en dos subsistemas, el de los conos (visión diurna) y el de los bastones (visión nocturna). Ambos sistemas operan de manera independiente con muy pocas interacciones entre ellos. Así el sistema más sensible frente a determinadas situaciones es el que determina la visión (Kolb, 2003). En algunas especies el sistema de los bastones es el que domina (ratas) y en otras es el de los conos (algunos reptiles) el que lo hace. No obstante en la mayoría de las especies, incluidas la humana y la canina, se encuentran ambos sistemas bien desarrollados, son retinas duales (Samuelson, 1999). En electrofisiología existe la ventaja de poder modular las condiciones de estimulación para separar la actividad de conos y bastones. Esto es de suma importancia ya que ante determinadas patologías se verá más afectado el sistema de los conos que el de los bastones o vice-versa (Narfström y Ekesten, 1999). Así utilizando iluminaciones ambientales de cierta intensidad, se saturan los bastones obteniendo respuestas dependientes únicamente del sistema de los conos como describiremos a continuación en el caso del “photopic hill” o del ERG flicker (Lazard et al., 2000; Narfström et al., 2002; Marmor et al., 2004). De otra manera, y sabiendo que los bastones no son capaces de responder a frecuencias de estimulación superiores a 20 Hz, podemos aislar la respuesta dependiente de conos aplicando frecuencias de estímulo cercanas a 30 Hz, como en el caso del flicker de altas frecuencias descrito más adelante (Dodt, 1951; Benítez del Castillo, 1999). El ERG fotópico (sistema de los conos) se caracteriza por su rápida cinética y su pequeña amplitud mientras que el ERG escotópico (sistema de los bastones) tiene propiedades temporales más lentas pero una considerable mayor amplitud. Si lo que queremos es poner en evidencia ambos sistemas debemos operar con ambientes luminosos que no saturen a los bastones y con frecuencias de Revisión Bibliográfica 61 estímulos a los que puedan responder los bastones (menos de 20 Hz) pero con suficiente intensidad para que los conos respondan; de esa manera se obtiene una respuesta global de la retina (Lazard et al., 2000; Benítez del Castillo et al., 2002). 2.2.1.4.1.- ERG FOTÓPICO: 2.2.1.4.1.1.- ERG flicker, definición y origen: Cuando se utilizan frecuencias de estimulación bajas (menos de 4 Hz) se obtienen respuestas llamadas transitorias. Al aplicar estímulos de más de 4 Hz se obtienen respuestas entretenidas. Tales frecuencias se utilizan para realizar el ERG flicker (30 Hz). Estas frecuencias de estimulación elevadas permiten seleccionar de manera preferente circuitos de conducción M (magnocelulares), ya que solo estas pueden gestionar esas altas frecuencias temporales y conducir el influjo de la mayoría de los conos (Lazard et al., 2000). Hasta 20 Hz tanto los bastones como los conos son capaces de responder pero más allá solo responden los conos. Esta peculiaridad la aprovechan los electrofisiólogos para aislar la respuesta de los conos de la de los bastones, cuando realiza el flicker de 30 Hz (Dodt, 1951). Si seguimos subiendo la frecuencia temporal del estímulo la amplitud de las respuestas disminuye ya que las vías visuales no son capaces de codificar frecuencias tan altas, de manera que en el perro, entorno a los 70 Hz, encontramos la frecuencia de fusión del ERG (Miller y Murphy, 1995). La búsqueda paso a paso de la frecuencia de fusión del ERG variando la frecuencia y la luminancia del estímulo, permite establecer una curva característica de la respuesta de los conos y de la de los bastones, que varía según la especie, la edad y las distintas patologías oculares (Gum et al., 1984; Lazard et al., 2000). Durante años, merced a trabajos de varios investigadores, se atribuyó el origen del flicker a potenciales originados en los FR. En efecto, Baron et al., vieron que el bloqueo de la conducción postsináptica a los FR con ASP no afectaba al flicker registrado a nivel de la fóvea del mono. Concluyeron que el componente principal del flicker lo aportaban los FR (Baron et al., 1979a; 1979b). Otros investigadores tomaron registros intracelulares de las células de Müller, llegando a la conclusión y acorde a las investigaciones de Baron et al., que los potenciales del ERG derivados de las mismas respondían de manera pobre a estímulos de tipo flicker (Miller y Dowling, 1970). Por otro lado, estudios en ratas demuestran que el componente PIII lento, atribuido a las células de Müller (Karwoski y Proenza, 1977) no puede seguir frecuencias de flicker por encima de 3 Hz (Ernst y Arden, 1972). Estos y otros autores opinan en base a sus investigaciones que el flicker tiene su origen en los FR, y en particular en los conos con estímulos superiores a los 25 Hz (Baron et al., 1979a; 1979b; Abraham et al., 1985). Revisión Bibliográfica 62 En ninguno de estos trabajos se realizaron registros corneales de contraste es decir los registros fueron únicamente locales, intrarretinales. En un posterior estudio, Donovan y Baron compararon los resultados obtenidos a nivel corneal y a nivel intrarretinal llegando a la conclusión de que para flicker de entre 4 y 8 Hz, el ERG corneal y el intrarretinal se originan al mismo nivel, es decir en los conos (Donovan y Baron, 1982). No obstante hay evidencias de que los conos no son la única fuente del flicker ERG. Rosolen et al., realizaron ERGs (ERG 1,3 Hz, 30,3 Hz y ERG tras adaptación a la oscuridad) a varias especies animales entre ellas el mono, la rata albina y la pigmentada, el perro y el gato. Los ratios ERG fotópico (conos)/ERG escotópico (bastones) fueron bastante acordes con los ratios anatómicos conos/bastones. Sin embargo, el ratio 1,3/30,3 Hz parecía no seguir ninguna lógica, no siendo capaces de proporcionar una explicación de que es lo que realmente se valora con el flicker de alta frecuencia (Rosolen et al., 2004a). Por otro lado existen varios trabajos que relacionan el aminoácido glicina con ceguera temporal. En estos artículos describen casos de pérdida de visión tras recibir una irrigación con un suero rico en glicina durante una cirugía de próstata. Creel et al., lograron mediante inyección intravítrea de glicina hacer desaparecer del ERG la onda b y los OPs mientas que se mantenía la onda a, y por otro lado se atenuaba también el flicker de 30 Hz (figura 32). Esto ocurre según los autores debido a que la glicina bloquea la conducción a nivel de las células amacrinas (Creel et al., 1987). Figura 32: ERGs obtenidos antes y después de aplicar glicina en el vítreo (Creel et al., 1987). En 1996 se publica un trabajo hecho con monos en el que se aísla la actividad de los FR utilizando ASP por un lado y una combinación APB y PDA por el otro. Este estudio concluye que para el flicker fotópico rápido (30 Hz o más) las respuestas derivan en menor medida de los FR (conos) y en mayor grado de células de segundo orden (retina proximal) posteriores a los mismos. Además añade que el flicker rápido (30 Hz o más) registrado a nivel corneal, es generado por las mismas células que forman (directa o indirectamente) la onda b y la d del ERG flash (Bush y Sieving, 1996). Revisión Bibliográfica 63 Otro estudio más reciente realizado también en monos, que también utiliza APB y PDA saca conclusiones similares y además, mediante un complicado análisis vectorial de las respuestas, añade que a frecuencias inferiores a 24 Hz la contribución de los conos al flicker es mayor que la de los componentes postsinápticos ocurriendo lo contrario a frecuencias de estimulación de más de 24 Hz (figura 33). Figura 33: ERG Flicker del mono realizado a distintas frecuencias de estimulación (4-64 Hz), antes (columna de la izquierda) y después de aplicar APB (columna del medio), o la mezcla de APB y PDA (columna de la derecha) (Kondo y Sieving, 2001). En efecto, a partir de 4 Hz y hasta 10 Hz la contribución de los conos es mayoritaria y después va disminuyendo aportando la mitad o menos de las respuestas a 16 Hz para finalmente ser minoritaria (menos del 20 %) a partir de 24 Hz. De su complicado análisis vectorial podemos resumir que los componentes ON y OFF tienen un desfase que varía de 160 a 230 º en función de la frecuencia del flicker. Así, debido a ese desfase, los componentes ON y OFF interfieren entre sí dando como resultado un componente más pequeño que cada uno de ellos por separado. Este hecho se hace más patente a 10 Hz, en donde el desfase entre los componentes ON y OFF es de unos 180º (están opuestos), y aunque por separado los componentes sean más grandes que el de los FR, se anulan parcialmente (no se anulan del todo ya que a esa frecuencia el componente OFF es ligeramente mayor al ON) entre sí dejando una respuesta global más pequeña que en 4 Hz. Finalmente a 32 Hz el desfase ON-OFF ronda los 230º y además el componente de los FR es muy pequeño dando como resultado un flicker dominado por la actividad post-sináptica ON-OFF (figura 34) (Kondo y Sieving, 2001). Revisión Bibliográfica 64 Figura 34: Representación vectorial de los distintos componentes del ERG flicker de 4, 10 y 32 Hz: ON, OFF (vías post-sinápticas; post) y FR (ph). (Kondo y Sieving, 2001). Estos resultados sugieren que es importante tener en cuenta la amplitud pero también la fase de los tres principales ingredientes del flicker ERG (vías ON, OFF y FR). En efecto, la amplitud absoluta de los vectores por separado no es suficiente para describir los resultados, como ocurre a 10 Hz en donde los componentes ON y OFF son grandes pero desfasados diametralmente, con lo que se cancelan en gran parte dando como resultado una considerable contribución del vector de los FR mucho más pequeño (Kondo y Sieving, 2001). Estos mismos autores realizan un muy interesante modelo de vectores para ayudar a comprender como disfunciones en células post-receptorales (ON y OFF) que alteren la amplitud o la fase de las respuestas ON y OFF repercuten en el ERG flicker de 32 Hz. Un retraso en el componente ON de 23 º provoca un aumento cercano al 48 % del ERG flicker con solo 7º de variación en el ERG resultante. Si ese mismo retraso es en el componente OFF, el ERG disminuye un 50% con respecto al control y se retrasa 31º. Es interesante ver como reducciones de hasta el 50 % en el componente ON no provocan apenas cambios en el ERG con respecto al control, pero si que lo retrasan 35º (unos 3 ms). Por último una reducción del componente OFF del 50 %, disminuye el ERG un 17% y lo adelanta 49º (unos 4 ms) (figura 35) (Kondo y Sieving, 2001). Revisión Bibliográfica 65 Figura 35: Representación vectorial de los componentes que forman el ERG flicker de 32 Hz del mono. El círculo superior se corresponde con una situación normal. El resto de círculos representan situaciones patológicas hipotéticas en las que existe un retraso del componente ON (A), retraso del OFF (C), reducción del componente ON (B) o reducción del OFF (D) (Kondo y Sieving, 2001). Estos resultados indican que disfunciones en los componentes post-sinápticos, que afecten diferencialmente a las vías ON u OFF (Sieving, 1993), como ocurre en ciertas formas de ceguera nocturna (Barnes et al., 2002) o en la retinitis pigmentaria pueden cambiar sustancialmente el flicker ERG tanto en fase como en amplitud (Alexander et al., 2003). Lo anteriormente descrito se refiere al flicker obtenido en respuesta a estímulos sinusoidales y al análisis del componente fundamental del mismo (Kondo y Sieving, 2001). En efecto, el flicker es una respuesta en forma de onda con aspecto más o menos sinusoidal (según el tipo de estímulo utilizado). Mediante un análisis armónico es posible descomponer la respuesta en un componente fundamental (que se corresponde con la frecuencia del estímulo), y otros sucesivos componentes armónicos. Esto se realiza con el análisis de Fourier (figura 36) (Bach y Meigen, 1999). Revisión Bibliográfica 66 Figura 36: Descomposición de una onda sinusoidal compleja (gráfico superior) en su componente fundamental y sucesivos armónicos (gráfico inferior), mediante el análisis de Fourier (Bach y Meigen, 1999). La descomposición en componentes fundamental y sucesivos puede ser útil, ya que según algunos autores pueden tener orígenes distintos en la retina, y en ciertas patologías se afectan más unos u otros componentes con estímulos sinusoidales (Falsini et al., 1999). El ERG flicker se puede obtener mediante varios tipos de estímulos: sinusoidales, de ondas cuadradas, pulsos o flash estroboscópicos blancos (Kondo y Sieving, 2002). Estos últimos son los más utilizados en la clínica habitual (Marmor et al., 2004). Kondo y Sieving realizaron registros de flicker con cada uno de estos tipos de estímulos para completar su anterior estudio que solo usaba estímulos sinusoidales. Concluyeron que las frecuencias de flicker cercanas a 30 Hz tienen el mismo origen independientemente del tipo de estímulo (células post-receptorales ON y OFF). Las diferencias encontradas entre estímulos sinusoidales y estroboscópicos blancos son dos fundamentalmente: 1. Los componentes ON y OFF están unos 20º más desfasados con estímulos sinusoidales. Esto hace que su comportamiento ante variaciones de los componentes ON y OFF sea ligeramente diferente (figura 37). Aunque considerables cambios en la amplitud de vías ON u OFF siguen sin alterar mucho la amplitud global del flicker en cualquiera de los 4 tipos de estímulos. El motivo de esta diferencia, según los autores, no está muy claro pero podría deberse a que con los flashes estroboscópicos los eventos ON y OFF se evocan casi a la vez, mientras que en los estímulos sinusoidales están más separados (Kondo y Sieving, 2002). Revisión Bibliográfica 67 Figura 37: Representación vectorial de los distintos componentes que forman el ERG flicker de 32 Hz, en respuesta a estímulos sinusoidales (círculo de la izquierda) o a estímulos con flash estroboscópico (Kondo y Sieving, 2002). 2. Con estímulos sinusoidales la mayoría de la respuesta está contenida en el componente fundamental, mientras que el segundo componente armónico aporta bastante a la respuesta en el caso del flash estroboscópico (figura 38) (Kondo y Sieving, 2002). Figura 38: Amplitud del componente fundamental y sucesivos armónicos en el flicker de 32 Hz evocado por estímulos sinusoidales (arriba) o por flashes estroboscópicos (abajo) (Kondo y Sieving, 2002). Revisión Bibliográfica 74 En condiciones escotópicas se pueden realizar básicamente dos tipos de registros electrorretinogáficos en donde predomina el sistema de los bastones: uno con la retina totalmente adaptada a la oscuridad y otro que estudie la propia adaptación a la oscuridad de la retina (AERG) (Yanase et al., 1995; Lazard et al., 2000). 2.2.1.4.2.1.- AERG: Como se describió anteriormente, cuando la retina está suficientemente adaptadaza a un nivel luminoso fotópico (por ejemplo 2 horas de luz diurna), la diferencia de potencial del dipolo córnea-retina es estable. Cuando colocamos al animal en un ambiente oscuro los FR de la retina retornan rápidamente a su estado inicial de despolarización y regeneran más lentamente sus fotopigmentos, necesitando para ello obligatoriamente mediación del EPR en el caso de los bastones (Kommonen et al., 1991; Crouch et al., 1996). Estos cambios originan variaciones de potenciales en el EPR que se reflejan sobre los valores del dipolo córneo-retiniano (Steinberg, 1985; Marmor, 1991). Por lo tanto, si se recoge la respuesta electrorretinográfica generada por los bastones durante su adaptación a la oscuridad obtendremos variaciones en amplitud de dichas respuestas que son el reflejo indirecto de la variación del potencial de base del EPR (Steinberg, 1985). En el hombre se encuentran aumentos de amplitud de las ondas b mayores del 30 % que culminan entre el sexto y octavo minuto de adaptación a la oscuridad (correspondientes al DT del EOG) y aumentos en los tiempos de culminación de unos 10 o 12 ms. En el cerdo se han encontrado resultados similares. (Lessel et al., 1993; Rosolen y Lazard, 1997). En el caso del perro, la culminación de la onda b se produce en el minuto 12 y los tiempos de culminación varían menos que los del hombre. Esto no quiere decir que sobre el minuto 8 en el hombre y 12 en el perro, la onda b no siga aumentando con el tiempo, sino que en esos tiempos se produce un cambio en la pendiente de la curva que refleja la amplitud de la onda b con respecto al tiempo que estos autores relacionan con el DT del EOG (Rosolen et al., 1997; Rosolen y Lazard, 1997; Lazard et al., 2000). En esta línea, Rosolen et al., realizaron un AERG a perros de raza beagle midiendo la amplitud de la onda b y su tiempo de culminación en los minutos 0, 2, 4, 8, 16, y 32 (Rosolen et al., 2002). La amplitud de la onda b sube durante todo el AERG, así como los tiempos de culminación (figura 45) (Rosolen et al., 2002; 2005d). Revisión Bibliográfica 75 Figura 45: AERG del perro realizado en los tiempos (minutos) 0 (T0), 2 (T2), 4 (T4), 8 (T8), 16 (T16) y 32 (T32) de adaptación a la oscuridad (Rosolen et al., 2005d). Yanase et al., estudiaron con detalle la adaptación a la oscuridad realizando ERGs con luz azul o roja de baja intensidad durante 91 minutos, tras “blanqueamiento” de los FR con luz intensa durante 10 minutos. Los resultados fueron prácticamente idénticos con los estímulos rojos que con los azules (Yanase et al., 1995). Sin embargo, en el hombre utilizando estímulos rojos, se obtienen curvas durante la adaptación a la oscuridad, distintas que con estímulos azules. Esto es así en el hombre porque tiene conos sensibles a largas longitudes de onda (conos L), que participan en la respuesta, sin embargo el perro no tiene ese tipo de conos (Gouras, 1984; Neitz et al., 1989; Benítez del Castillo et al., 2002). En resumen el AERG es un método de aproximación indirecto, pero interesante, al funcionamiento del EPR y del acoplamiento neurorretina-EPR en los animales y también en el hombre, aunque en este se puede valorar fácilmente mediante el EOG (Rosolen et al., 1997; Rosolen y Lazard, 1997; Lazard et al., 2002). 2.2.1.4.2.2.- Curvas de luminancia-respuesta: Al igual que en el ERG fotópico, en condiciones escotópicas y con la retina adaptada a la oscuridad, se puede realizar una curva luminancia-respuesta. Sin embargo, no se encuentra un fenómeno similar al “photopic hill” descrito anteriormente, en donde la onda b aumenta con la intensidad del estímulo hasta cierto punto en el que al aumentar el estímulo la amplitud de la onda b comienza a descender (Wali y Leguire, 1992). En efecto, en el caso de retinas adatadas a la oscuridad, con estímulos crecientes en intensidad la onda b aumenta hasta alcanzar su Vmax (el Vmax de los bastones). Tanto en el perro como en el hombre, una vez alcanzado el Vmax de los bastones, si sigue aumentando la intensidad del estímulo, la onda b sigue creciendo, pero ahora lo Revisión Bibliográfica 76 hace por la contribución de los conos a esos niveles de estimulación (Peachey et al., 1989; Fulton y Hansen, 1988; Yanase et al., 1996). Al contrario que el “photopic hill”, sigue una progresión más o menos lineal que además se puede representar como función hiperbólica y analizar usando la ecuación de Naka-Rushton (V/Vmax = I/(I + k)), reflejando la distinta naturaleza del ERG de los conos con respecto a la de los bastones. En esta ecuación V y Vmax son las amplitudes obtenidas con un estímulo de intensidad I y un estímulo que provoca saturación de la onda b respectivamente, k es la constante de semi-saturación y representa el estímulo necesario para alcanzar una respuesta cuya amplitud es la mitad de la amplitud máxima (Vmax) (figura 46) (Fulton y Hansen, 1988; Wali y Leguire, 1989). Al contrario que en el “photopic hill” la onda b aumenta siempre, asimismo al contrario que en el AERG los tiempos de culminación disminuyen a medida que aumenta la intensidad del estímulo (figura 46) (Peachey et al., 1989; Rosolen et al., 2005d). Figura 46: Curvas de luminancia-respuesta en condiciones escotópicas y con la retina adaptada a la oscuridad de una especie nocturna (rata). Trazados de ERG (izquierda) y representación gráfica de las amplitudes de las ondas a y b con respecto a la intensidad del estímulo (derecha) (Rosolen et al., 2005d). Revisión Bibliográfica 77 En el perro, tras blanqueamiento con luz intensa de sus FR, una onda b comienza a aparecer con estímulos de más de -3,2 log cd.s/m2 y un ambiente totalmente escotópico, y va aumentando a la par que aumenta el estímulo. Sin embargo, si se realiza con ambientes lo suficientemente luminosos como para anular el STR (-3,5 log cd/m2 o más), la onda b comienza a surgir esta vez con estímulos mucho más bajos (-4 log cd.s/m2) y sigue aumentando de amplitud con el aumento del estímulo. Esto implica que el STR camufla el verdadero umbral de aparición de la onda b. Con este estudio los autores demostraron que en el perro el STR tiene gran influencia en el ERG registrado en condiciones de adaptación a la oscuridad (Yanase et al., 1996). 2.2.1.5.-ANÁLISIS DEL ERG: En la forma básica del ERG de pleno campo se encuentran las ondas a y b (figura 19). La amplitud de a se mide desde la línea de base hasta su pico negativo en µV. La amplitud de b se mide también en µV desde el pico negativo de a hasta el pico positivo de b. Las propiedades temporales del ERG se definen generalmente como tiempo de culminación (TC) (“implicit time” o “time to peak”), se miden en ms para las ondas a y b y representan el tiempo transcurrido entre el inicio del estímulo y el pico de la onda. En ocasiones se mide también la latencia en ms, que representa el tiempo transcurrido entre el inicio del estímulo y el inicio de la onda en cuestión (figura 47) (Marmor et al., 2004; Narfström et al., 2002; Rosolen et al., 2005d). Figura 47: Forma básica del ERG y manera de medir las principales ondas (a y b). La flecha roja representa el inicio del estímulo, las flechas azules los TC (ms) y las negras las amplitudes (µV). En cuanto a los potenciales oscilatorios se suelen considerar solamente los tres más grandes (OP2, OP3 y OP4), midiendo su amplitud desde la línea de base o desde el pico negativo anterior a cada uno, asimismo se suele medir la suma de las amplitudes de todos ellos. Ciertos autores valoran la posibilidad de medir también su latencia. En el flicker se suele medir la amplitud de pico a pico en microvoltios (Rosolen et al., 2005d). Revisión Bibliográfica 78 Para las curvas de luminancia respuesta en ojos adaptados a la luz (“photopic hill”) o a la oscuridad se usan una serie de descriptores que expusimos anteriormente (Fulton y Hansen, 1988; Rufiange et al., 2003). El análisis del ERG basado solamente en la amplitud de las ondas a y b puede llevar a interpretaciones erróneas, si las pupilas no están completamente dilatadas o si se utilizan electrodos de distinto tipo (Lazard et al., 2000; Mentzer et al., 2005). Este es un hecho que puede afectar a la repetibilidad y al intercambio de información entre distintos clínicos y/o investigadores. Una manera de solventar este problema es comparar la relación entre la onda b y la a. Así la relación b/a se mantiene aun cuando se utilizan electrodos de distinto tipo o cuando el tamaño pupilar fue distinto en la realización del ERG. De la misma manera esta relación puede ayudarnos a distinguir en que grupo celular se encuentra el problema ya que los orígenes de ambas ondas son distintos (Perlman, 1983). En general en todo trabajo o informe clínico relacionado con la electrorretinografía la forma en la que se han realizado las mediciones debe ir indicada (Narfström et al., 2003; Marmor et al., 2004; Rosolen et al., 2005d). 2.2.1.6.- USO CLINICO DE LA ELECTRORRETINOGRAFÍA: El uso de las técnicas electrorretinográficas para el diagnóstico oftalmológico en veterinaria aporta un apoyo como técnica complementaria, al mismo nivel que la angiografía fluoresceínica o la ecografía, siempre después de haber realizado una exploración ocular completa (Narfström, 2002). En determinadas patologías se hace imprescindible para realizar un diagnóstico temprano. Es el caso de la degeneración progresiva de retina que es una forma de alteración de los FR similar a la retinitis pigmentaria descrita en humanos (Narfström y Wrigstad, 1999; Alexander et al., 2003), así en las más de 20 razas de perros estudiadas, siempre los cambios en el ERG aparecen mucho antes que los signos clínicos (tabla 1) (Acland, 1988; Narfström y Ekesten, 1999). En el caso de enfermedades hereditarias proporciona una herramienta vital para poder erradicar la patología (Acland et al., 1988; Narfström y Ekesten, 1999). Otra importante aplicación es la del diagnóstico de la degeneración súbita retiniana adquirida, en la que el fondo de ojo presenta un aspecto normal mientras que el ERG es plano (Cullen y Grahn, 2002). Revisión Bibliográfica 79 Tabla 1: Afecciones retinianas comunes en distintas razas de perro (adaptado de: Narfström y Ekesten, 1999). RAZA TIPO DE AFECCIÓN RETINIANA ALTERACIONES ERG/EDAD DE APARICIÓN EDAD DE APARICIÓN DE LESIONES EN FONDO DE OJO ALASKAN MALAMUTE DEGENERACIÓN DE CONOS (hemeralopia) Ausencia de respuesta de los conos, persistiendo la de los bastones. Aparición 6 semanas 8-29 semanas CANICHES ENANOS Y TOYS DEGENERACIÓN PROGRESIVA DE CONOS Y BASTONES Alteración respuesta de los bastones y luego de los conos. A los 9 meses 3-5 años LABRADOR RETRIEVER DEGENERACIÓN PROGRESIVA DE CONOS Y BASTONES ↓ amplitud de la onda b, ↑ tiempo de culminación de la respuesta de los bastones, importante al año y medio. Menor disminución en la respuesta de los conos. 3-6 años COCKER SPANIEL AMERICANO DEGENERACIÓN PROGRESIVA DE CONOS Y BASTONES Descenso en la respuesta de los conos y mayor reducción de los bastones. A los 9 meses. 2 y medio-3 años COCKER SPANIEL INGLES DEGENERACIÓN PROGRESIVA DE CONOS Y BASTONES Afectación inicial de los bastones y luego de los conos que alcanzan un menor descenso. Entre 2 y 3 años. 3-8 años AKITA ATROFIA PROGRESIVA DE RETINA Descenso de la actividad de los conos y más importante de los bastones. Aparecen a partir del año y medio. 1-3 años TECKEL PELO LARGO ATROFIA PROGRESIVA DE RETINA A las 17 semanas, ↓ la amplitud y ↑ los tiempos de culminación mayor en los bastones. 6 meses PAPILLON ATROFIA PROGRESIVA DE RETINA Alteración de la respuesta mayor en bastones que en conos. Entre los 9 meses y el año y medio. 1-5 años TIBETANO SPANIEL ATROFIA PROGRESIVA DE RETINA Descenso en la respuesta de los conos y mayor reducción de los bastones, que se manifiesta en el ERG al año y medio. 3-5 años SETTER IRLANDES DISPLASIA DE BASTONES TIPO 1 En el ERG disminuye la respuesta de los conos y está ausente la de los bastones a las 6 semanas. 16 semanas COLLIE DISPLASIA DE BASTONES TIPO 2 En el ERG disminuye la respuesta de los conos y está ausente la de los bastones a las 6 semanas. 16 semanas Revisión Bibliográfica 80 HUSKY SIBERIANO DEGENERACIÓN PROGRESIVA DE RETINA LIGADA AL CROMOSOMA X Descenso en la respuesta de los conos y mayor reducción de los bastones al año. 2 años SCHNAUZER ENANO DEGENERACIÓN DE FOTORRECEPTORES Disminuye la respuesta de los fotorreceptores (igual de conos y bastones) a las 6 semanas. Entre año y medio y los 5 años COLLEY, PASTOR DE SHETLAND, BORDER COLLIE, GOLDEN RETRIEVER, LABRADOR. DEGENERACIÓN DEL EPR 7-12 meses, ↓ amplitud, alteraciones en el AERG 18 meses a 7 años, manchas en la zona tapetal Tabla 1: Afecciones retinianas comunes en distintas razas de perro (adaptado de: Narfström y Ekesten, 1999). Además del estudio de patologías, el estudio electrofisiológico de la retina se hace para determinar la toxicidad de determinados fármacos y el seguimiento de las lesiones provocadas (Rosolen et al., 2005d). Algunos ejemplos son los antipalúdicos de síntesis, la clorpromazina, la tioridazina, la indometacina, la quinina, etc. (Novack, 1997). Así mismo las quinolonas utilizadas con frecuencia en veterinaria pueden tener gran toxicidad retiniana, sobre todo en gatos, provocando ceguera irreversible en la mayoría de los casos (Wiebe y Hamilton, 2002). La vigabatrina, fármaco utilizado para tratar la epilepsia, también provoca daños retinianos fundamentalmente a nivel de las células de Müller que se pueden monitorizar con el ERG (Ponjavic et al., 2004). Otra utilidad en clínica veterinaria es el estudio preoperatorio de los pacientes que padecen cataratas, para determinar la función de la retina ante la imposibilidad de exploración directa del fondo de ojo y, aún siendo esta posible, para diagnosticar degeneraciones de forma más precoz (Narfström et al., 2002; Komaromy et al., 1998). Por último, el ERG puede resultar útil en situaciones de alteración del comportamiento en carnívoros o en équidos cuyos defectos visuales pueden causar alguna forma de agresividad o comportamiento anómalo, pudiendo así realizar el diagnóstico diferencial con otros procesos (Lazard et al., 2000). 2.2.1.7.- LIMITACIONES DEL ESTUDIO ELECTRORRETINOGRÁFICO: La más importante es el efecto masa, ya que el ERG traduce la actividad eléctrica del conjunto de elementos que constituyen la retina, por ello podemos encontrarnos con el caso de un ojo patológico con un ERG normal. Esto es debido a que el trazado de un ERG es la respuesta de la mayoría de los FR, pudiendo quedar minimizadas las lesiones de un número limitado de ellos. Así, Revisión Bibliográfica 81 una lesión en el polo posterior de unas 3 veces el diámetro papilar provocada con láser, no produce cambios en la amplitud del ERG (Benítez del Castillo et al., 2002). Otra limitación importante es la de valorar la funcionalidad de las células ganglionares. En efecto, salvo determinados estudios que hablan de la relación de la onda i y de la PhNR con la actividad de las células ganglionares (Viswanathan et al., 1999; Rosolen et al., 2004b), la idea general es que para valorar la integridad de las células ganglionares resulta mucho más significativo el PERG que el ERG (Rousseau et al., 1996; Holder, 2001; Atilla et al., 2006; Parisi et al., 2006). 2.2.2.- ELECTRORRETINOGRAMA FOCAL (fERG) Y MULTIFOCAL (mfERG): Una de las limitaciones del ERG tradicional de pleno campo es que el registro es una respuesta en masa de la totalidad de la retina. Esto quiere decir que el ERG traduce la actividad de gran parte de los elementos que constituyen la retina. Por lo tanto no es extraño que un fondo de ojo con lesiones más o menos amplias tenga un ERG normal. Podemos afirmar que el trazado de un ERG es la respuesta de la mayoría de los FR, y por tanto, pueden quedar ocultas lesiones que afecten a un conjunto mínimo de los mismos. Esto cobra mayor importancia cuando dichas lesiones se localizan en macula o en área centralis en los animales (Benítez del Castillo et al., 2002). Hoy en día existe la posibilidad de realizar un fERG para examinar la función de una zona concreta de la retina, en particular de la mácula en el hombre. Dada la gran transmisión de luz dentro de la retina, es complicado estimular de manera selectiva los conos maculares, pero con ayuda de ordenadores que promedian respuestas muy pequeñas y utilizando sistemas, que con visualización directa permiten dirigir un estímulo en forma de flicker sobre mácula, es posible obtener una respuesta focal de la zona central, muy útil para detectar una afectación incipiente de la zona (Fish et al., 1986). El mfERG es una variante del anterior. Se trata de una técnica reciente, que permite hacer un mapa de las respuestas eléctricas de la retina central hasta los 20 grados paracentrales. Con este método se pueden obtener ERGs de un centenar de pequeñas áreas retinales (100 µm) simultáneamente en menos de 10 minutos por ojo (Marmor et al., 2003). Para algunos autores no es una prueba que permita detectar alteraciones en la retina interna (células ganglionares) (Hood et al., 2000), sin embargo para otros si tendría cierta utilidad (Raz et al., 2002). Este examen requiere una completa colaboración por parte del paciente. En los animales sigue siendo una herramienta de los investigadores sin aplicación en la clínica corriente (Raz et al., 2002). Revisión Bibliográfica 82 2.2.3.- ERG A PATRÓN (PERG): Salvo recientes estudios que relacionan ciertos componentes del ERG flash con capas internas de la retina (onda i, PhNR) (Rousseau et al., 1996; Rosolen et al., 2004b; Rangaswamy et al., 2004) está bastante reconocido que las células ganglionares aportan muy poco o nada al ERG flash convencional (Komaromy et al., 1998; Lazard et al., 2000; Narfström, 2002; Ofri, 2002; Mora y Aregall, 2005). El PERG es pues, la mejor prueba para valorar la funcionalidad de las células ganglionares, en enfermedades del NO (Atilla et al., 2006) o en el glaucoma por ejemplo (Holder, 2001; Parisi, 2006). En el trazado típico del PERG encontramos dos o tres (según autores) elementos separados. Una onda precoz positiva, llamada P50 con una culminación de entre 40 y 60 milisegundos, que se considera asociada con la luminancia del estímulo, aunque parcialmente puede estar originada por las células que generan el ERG-flash. Es seguida de una inflexión negativa, la onda N95 con culminación de entre 90 y 100 ms, que está estrechamente relacionada con el contraste y con los factores específicos del estímulo. Algunos autores describen como la onda más precoz a una pequeña inflexión negativa que llaman N35 (figura 48) (Bach et al., 2000). Figura 48; Trazado típico del PERG (Bach et al., 2000). De los trabajos de Maffei y Fiorentini se sabe que el origen del PERG se halla en las células ganglionares. Tras sección del NO en el gato y en el mono observaron como se mantenían normales los trazados del ERG-flash, así como, los del propio PERG. Pasados cuatro meses el ERG-flash permanecía normal, mientras que el PERG había desaparecido. Esta circunstancia coincide con la aparición de una degeneración retrógrada del NO que implica a las células ganglionares (Maffei y Fiorentini, 1981; Maffei et al., 1985). Es un examen difícil de realizar en animales debido a su realización técnica y a la obligación de corregir cualquier error de refracción, con lo que sigue siendo una herramienta propia de los investigadores (Maffei y Fiorentini, 1981; Maffei et al., 1985; Lazard et al., 2000). En esta línea se Revisión Bibliográfica 83 han realizado PERGs en perros con glaucoma inducido, obteniéndose ondas con similar morfología a las obtenidas en humanos (Sasaki et al., 1998; Hamor et al., 2000). 2.3.- POTENCIALES EVOCADOS VISUALES (PEV): La llegada de un influjo nervioso aferente a nivel de las áreas corticales visuales entraña una variación de su potencial eléctrico. Esta variación de potencial se denomina potencial evocado visual (PEV) y se puede decir que no es más que la respuesta eléctrica de la corteza provocada por estímulos visuales (Lazard et al., 2000; Benítez del Castillo et al., 2002; Odom et al., 2004). Aportan información muy interesante sobre el funcionamiento de la mácula y de las vías de conducción en el hombre en donde este examen está bien definido (Odom et al., 2004; Atilla, 2006). En los animales se utilizan actualmente los PEV principalmente con fines experimentales. El número de ondas varía según el individuo y la especie, así como, de la localización de los electrodos (Sasaki et al., 1998; Lazard et al., 2000). 3.- FACTORES QUE AFECTAN AL REGISTRO DEL ERG: Para que el ERG sea una herramienta útil, tanto a nivel clínico como experimental, es imprescindible conocer los múltiples factores que afectan tanto a su morfología como a su amplitud y latencia. En efecto, el ERG presenta características constantes frente a condiciones de examen determinadas y también constantes. Muchos son los factores que van a modificar el ERG. Estos factores de variación se podrían dividir en controlables (tipo de iluminación, de electrodos, anestesia…) y no controlables (raza, especie, edad, patologías…) (Komaromy et al., 1998, Sloan, 1998; Lazard et al., 2000; Narfström, 2002; Ofri, 2002; Mora y Aregall, 2005). 3.1.- FACTORES CONTROLABLES: 3.1.1.- CARACTERÍSTICAS DE LA ESTIMULACIÓN LUMINOSA: La luz, al igual que las ondas de radio, los rayos x o los gamma son una forma de energía. No toda la luz emitida por una fuente llega al ojo y produce sensación luminosa. Todo esto se ha de evaluar Revisión Bibliográfica 90 3.1.3.- PROTOCOLOS: Con lo anteriormente descrito es fácil de entender que en electrofisiología las características del estímulo tienen una importancia vital. Surge por lo tanto la necesidad de estandarizar y definir claramente las características de los estímulos utilizados, así como, otros factores de un completo examen electrorretinográfico. Con ese fin en 1989 la ISCEV elaboró un protocolo estándar de ERG de pleno campo con el fin de hacer este examen lo más reproducible posible. Dicho protocolo está dirigido a la oftalmología humana y ha sido actualizado dos veces. La última versión está disponible desde 2004 (Marmor et al., 2004). En 2002 Narfström et al., hicieron lo propio a través del ECVO para ser aplicado en el perro (Narfström et al., 2002). Las características del estímulo definidas en estos protocolos son similares para el perro y para el hombre. Hay que señalar que son protocolos clínicos que no contemplan por ejemplo el uso de estímulos coloreados (azules o rojos por ejemplo), ni ambientes con luz coloreada (Narfström et al., 2002; Marmor et al., 2004). Recientemente han sido publicados unos protocolos de ERG para especies animales de experimentación y para estudios toxicológicos. En ese trabajo se separan a las especies de estudio en función de si son diurnas (figura 52) o nocturnas (figura 53). Siguiendo este protocolo se puede estudiar la funcionalidad de conos y bastones por separado así como su adaptación a la luz y a la oscuridad respectivamente (Rosolen et al., 2005d). Figura 52: Protocolo electrorretinográfico para especies diurnas (Rosolen et al., 2005d). Revisión Bibliográfica 91 Figura 53: Protocolo electrorretinográfico para especies nocturnas (Rosolen et al., 2005d). 3.1.4.- RECOGIDA Y TRATAMIENTO DE LA SEÑAL: Es necesario comprender el funcionamiento biológico de las diferentes estructuras del sistema visual generadoras de la señal y las diferentes posibilidades de recogida en la periferia mediante los captores de la señal. En efecto, esto puede ser una fuente de variación evitable (Komaromy et al., 2002). 3.1.4.1.- GENERADORES DE LA SEÑAL: Los generadores biológicos son de dos tipos en función de quien los origina; analógicos o digitales. 3.1.4.1.1.- GENERADORES ANALÓGICOS: Los generadores analógicos son potenciales causados por movimientos iónicos, proporcionales a los fenómenos físicos que los originan, nacen y mueren a nivel local, y decrecen en función de la distancia a la que se recogen. Son representables por un dipolo localizado y de características variables en el tiempo (latencia, tiempo de culminación). Son los FR y las células de las capas intermedias de la retina que se exploran mediante el ERG cuyos orígenes concretos discutimos ampliamente en capítulos anteriores (Brown, 1968; Lazard et al., 2000; Benítez et al., 2002). 3.1.4.1.2.- GENERADORES DIGITALES: Revisión Bibliográfica 92 Los generadores digitales son las células ganglionares situadas en la capa interna de la retina. Son generadores de potenciales de acción (“spikes”) de frecuencia variable (Mangel, 1991). El estímulo desencadena un fenómeno irreversible, propagado y de amplitud independiente al fenómeno físico que le dio origen, en electrofisiología se explora mediante el PERG (Bach et al., 2000; Holder, 2001). El conjunto de los potenciales generados constituye el potencial global de los nervios que los conducen. Esa conducción por las vías ópticas del mensaje visual, codificado a nivel de la retina y transmitidos al cortex visual primario, se explora mediante los PEV (Sasaki et al., 1998; Odom et al., 2004). 3.1.4.2.- CAPTORES DE LA SEÑAL: Los captores, comúnmente llamados electrodos, miden las variaciones de campos eléctricos creados por los generadores biológicos y establecen el enlace entre estos y los instrumentos de procesado. Son una parte muy importante del equipo electrorretinográfico, ya que frecuentemente son el origen de variaciones o de disfunciones, por su degradación (oxidación, polarización, conexiones defectuosas…) (Komaromy et al., 2002; Honsho et al., 2004). Se distinguen tres categorías de electrodos: activos, de referencia o pasivos y de masa. La señal se recoge entre el activo, que se coloca lo más cerca posible de la fuente que origina la señal, y el de referencia, que sirve de referencia eléctrica. El electrodo de masa evita perturbaciones eléctricas uniendo el paciente al aparato (Narfström et al., 2002). Las mediciones se realizan entre el electrodo activo (variable según el estímulo) y el de referencia (no varia sea cual sea el estímulo). 3.1.4.2.1.- ELECTRODOS ACTIVOS: Normalmente los electrodos activos son monopolares pero los hay bipolares en cuyo caso incorporan una parte activa y otra de referencia (Lazard et al., 2000; Benítez del Castillo et al., 2002; Komaromy et al., 2002). Existen diversos tipos de electrodos activos, los más conocidos son: • Electrodos corneales: el más clásico es el de Allen y Burian, tiene una lente corneal en cuyo interior se realiza la conexión eléctrica. Lleva unos pequeños vástagos que ayudan a mantener los párpados abiertos. Son bipolares, es decir incorporan la parte activa y la de referencia (figura 54). Existen otro tipo de electrodos desechables estériles que consisten en una lente que se adapta a la córnea y que lleva un fino anillo de oro en su interior para la conexión con la córnea, son los llamados ERG-jet (monopolares) (figura 54). Este tipo de electrodos tienen la desventaja de interferir con el campo visual y de disminuir la cantidad de estímulo que llega a la retina. Si se hace Revisión Bibliográfica 93 con el paciente despierto, requiere anestesia de la córnea (Benítez del castillo, 2000; Komaromy et al., 2002; Marmor et al., 2004). Figura 54: Electrodos corneales de tipo AllenBurian (izquierda) y de tipo ERG-jet (derecha). • Gold-foil de Arden: son unas finas tiras recubiertas de oro que se colocan en el borde del párpado inferior como cuando se hace un test de Schrimer, de manera que no interfieren con el campo visual haciéndolos adecuados para el PERG (figura 55). No requiere anestesia de la córnea (Holder, 1988). • Figura 55: Electrodo gold-foil de Arden. • El electrodo DTL: su nombre viene de quienes lo desarrollaron (Dawson-Trick-Litzkow). Se trata de un fino hilo de nylon recubierto de plata que se deja “flotar” en la lágrima (figura 56). No requiere anestesia de la córnea y no interfiere con el campo visual. Este tipo de electrodo ha dado buenos resultados en varios estudios en cuanto a calidad de la señal y reproducibilidad (Herbert et al., 1999). También ha sido empleado en caballos, dando buenos resultados (Komaromy et al., 2003). Figura 56: Electrodo DTL (izquierda) y manera de colocarlo (derecha). • Electrodo conjuntivo-escleral: está formado por un gancho de cobre retráctil que se encuentra dentro de una vaina de plástico. Se colocan en la conjuntiva bulbar a nivel del limbo (figura 57). Son de gran utilidad en veterinaria, ya que no interfieren con la visión, impiden movimientos Revisión Bibliográfica 94 oculares y mantienen los párpados abiertos. Son más traumáticos que el resto (Rosolen et al., 1998). Han sido utilizados en varios trabajos publicados, dando muy buenos resultados tanto en el perro como en el gato (Lazard et al., 2000, Rosolen et al., 2002; 2004b). Figura 57: Electrodo conjuntivo-escleral (derecha) y colocación en la conjuntiva escleral cerca del limbo. 3.1.4.2.2.- ELECTRODOS DE REFERENCIA Y DE MASA: En el hombre son similares a los utilizados para electrocardiografía (figura 58) (Benítez del Castillo et al., 2002). En los animales para evitar interferencias y malos contactos debido al pelo se utilizan electrodos de aguja que se implantan a nivel subcutáneo. Son agujas esterilizables similares a las de acupuntura (figura 58) (Komaromy et al., 2002; Lazard et al., 2000). Figura 58: Electrodos de referencia y de masa utilizados en el hombre (derecha) y en los animales (izquierda). Es importante, en la medida de lo posible, utilizar siempre el mismo tipo de electrodos y colocarlos en las mismas posiciones ya que existen variaciones, sobre todo en la amplitud de los trazados del ERG obtenidos en función del tipo de electrodo activo utilizado, así como la posición del mismo con respecto al de referencia (Mentzer et al., 2005). Como norma general sea cual sea el electrodo utilizado, este debe tener poca impedancia (mínima resistencia al paso de la electricidad), menos de 5 kΩ según la ISCEV (Marmor et al., 2004) y el ECVO (Narfström et al., 2002). En el perro el electrodo activo debe colocarse a nivel corneal (electrodo de tipo lentilla; ERG-jet o de tipo Allen-Burian) (Narfström et al., 2002), o en la conjuntiva bulbar a nivel de limbo (electrodo conjuntivo-escleral) (Rosolen et al., 2002; 2005d). Los de referencia en el caso en que el activo no Revisión Bibliográfica 95 los incorpore (electrodos bipolares) serán colocados a medio camino entre el canto temporal y la oreja de cada lado. El de masa se puede colocar en el espacio interescapular. Tanto los electrodos de referencia como el de masa se insertan a nivel subcutáneo a través de una aguja hipodérmica de unos 18 gauges (Narfström et al., 2002) y evitando el contacto con músculos, ya que pueden dar interferencias (Komaromy et al., 2002). 3.1.4.3.- TRATAMIENTO DE LA SEÑAL: Los métodos de registro y de tratamiento de la señal son de suma importancia, ya que recogen la actividad en el tiempo de muchas células a nivel de los electrodos de registro. La magnitud y la polaridad de esas respuestas pueden estar influenciadas por los métodos de registro y los equipos utilizados, así como, por factores dependientes del animal. Estos últimos son los que interesan, ya que son los que permiten sospechar o no de determinadas patologías (Komaromy et al., 1998; 2002). La cadena de electrofisiología recoge las señales a través de los electrodos (captores). Son señales débiles y contaminadas que provienen de varios generadores. El tratamiento de la señal apunta a seleccionar, filtrar y amplificar el conjunto de las señales recogidas con el fin de aislar y convertir en interpretable la señal que proviene de un grupo en concreto de generadores biológicos (Lazard et al., 2000). La amplificación es indispensable para transformar las señales biológicas débiles en señales lo suficientemente fuertes como para ser estudiadas. La señal que sale del amplificador es igual a la que entra multiplicada por la ganancia (regulable) del amplificador: S (señal de salida) = E (entrada) x G (ganancia). En biología se utilizan amplificadores diferenciales que solo amplifican las diferencias de tensión. El inconveniente es que amplifican las diferencias de tensión tanto de la señal biológica útil como de la parásita (ruido). En efecto, hay muchos tipos de señales parásitas que nos pueden contaminar nuestra lectura: actividad del corazón (electrocardiograma; ECG), del cerebro (electroencefalograma; EEG), de los músculos, de aparatos eléctricos conectados cerca, etc. Las señales propias del ERG estarán cerca del electrodo activo y lejos del de referencia, mientras que normalmente el ruido está en ambos, de esa manera el aparato amplifica selectivamente las señales que aparecen en uno u otro electrodo pero no las comunes a los dos (ruido), este proceso en inglés se conoce como: common mode rejection (CMR) (Komaromy et al., 2002). Para que el CMR funcione correctamente, el electrodo activo y los de referencia deben tener impedancias similares. Además hay que señalar que toda señal próxima al electrodo de referencia que no lo esté del activo, como por ejemplo actividad muscular, también será amplificada. Por lo tanto, no es una garantía absoluta de eliminación completa de ruido aunque sí es de gran ayuda. Revisión Bibliográfica 96 Además están provistos de filtros electrónicos regulables que eliminan parte de los parásitos, eliminando las frecuencias que no están comprendidas dentro de las de la señal que queremos estudiar (Brigell et al., 1998). Cada amplificador tiene una banda pasante comprendida entre 1 y como mínimo 300 Hz. Esta banda pasante es regulable de manera que si queremos recoger por ejemplo PEV basta con ajustarla entre 1 y 70 Hz y si solo nos interesan los OPs basta con ajustar el filtro entre 100 y 300 ya que por debajo de 100 Hz no aparece ningún OP (figuras 26 y 59) (Narfström, 2002). La mayoría de los aparatos poseen además un filtro automático que elimina todas las señales que contengan 50 Hz, ya que esa frecuencia es la usada por cualquier instalación eléctrica en Europa (en América suele ser 60 Hz) y es por lo tanto susceptible de producir parásitos. Estos filtros de frecuencia pueden actuar en el momento de recoger la señal (filtros analógicos) o una vez recogida (numéricos) (Komaromy et al., 2002). En la práctica es mejor recoger la señal sin filtrar y hacerlo después si es necesario mediante un proceso que se llama lisado. Generalmente el lisado que permiten realizar estos aparatos utiliza la transformada de Fourier que descompone la señal biológica en cierto número de sinusoides (figura 59) (Bach et al., 1999). Figura 59: Operación de lisado, que consiste en descomponer una sinusoide compleja en varias sinusoides sencillas utilizando la transformada de Fourier (A). Filtrado de la señal inicial de 0-300 Hz a 100-300 Hz para extraer los OPs (B). El último proceso que deben realizar estos aparatos es la conversión de la señal analógica obtenida (señal biológica e inevitablemente algo de ruido a pesar del CMR) en señal digital. La señal última obtenida puede no ser discernible del ruido con lo que es indispensable extraerla realizando una mejora de la relación señal/ruido. En efecto, cuando hacemos n estímulos repetidos se postula que la señal biológica generada es idéntica en cada uno de esos n estímulos mientras que el ruido es aleatorio. Así repitiendo n veces el estímulo se recoge n veces la misma señal biológica y distinto ruido, con lo que efectuando la suma y media de estas n señales la amplitud de la señal biológica Revisión Bibliográfica 97 presenta una mejora proporcional a la raíz cuadrada de n mientras que el ruido (aleatorio) es cada vez de menor amplitud. En el caso del ERG la señal está bastante desprovista de ruido y es amplia con lo que basta una mejora señal/ruido de 3 a 4, con lo que entre 9 y 16 estímulos suelen ser suficientes. Sin embargo, los PEV a flash son de muy débil amplitud y están “ahogados” en el ruido provocado en este caso por el EEG, con lo que se necesita una mejora señal/ruido grande, del orden de 8 a 10 (entre 64 y 100 estímulos) (Lazard et al., 2000). 3.1.4.4.- FUENTES DE RUIDO: Las mayores fuentes de ruido son las líneas eléctricas (50 o 60 Hz), el propio amplificador, actividad fisiológica del animal distinta a la que queremos medir, problemas en los electrodos y mala calidad de la toma de tierra. Generalmente los aparatos vienen provistos de un filtro automático de 50 o 60 Hz según la zona, que minimiza las interferencias que las líneas eléctricas pueden tener sobre el animal o el amplificador (fenómenos de capacitancia e inductancia). La actividad fisiológica que puede alterar los trazados del ERG es básicamente la que originan los músculos cardíaco y esquelético, frutos estos últimos de una deficiente relajación muscular y/o sedación del animal (figura 60). Este tipo de ruido es problemático sobre todo cuando se origina en proximidad del electrodo de referencia ya que no puede ser descartado por el CMR (Komaromy et al., 2002). Figura 60: ERG recogido en un perro con sedación insuficiente. La señal está muy contaminada debido a la actividad muscular (flechas) (Komaromy et al., 2002). Los electrodos recogen potenciales en su superficie y en ocasiones pueden estar en contacto con fluidos extracelulares o sudor lo cual puede originar ruido. Esto sucede cuando los electrodos se mueven o están en mal estado (sucios, polarizados, rotos…). Atendiendo a lo anterior y con el fin de evitar en la medida de lo posible interferencias que puedan falsear resultados, se aconseja la anestesia general de los animales además de limpieza, cuidado y correcta colocación de los electrodos. Asimismo se recomienda reducir en la medida de lo posible los aparatos eléctricos en funcionamiento dentro o cerca de la sala de exploración (Brigell et al., 1998; Komaromy et al., 1998; 2002). Revisión Bibliográfica 98 3.1.5.- RITMOS CIRCADIANOS: La influencia de los ritmos circadianos ha sido bastante estudiada en el hombre y en el mono, demostrando que la amplitud del ERG es menor cuando la concentración de melatonina es mayor, sobre todo las dependientes de conos (Rufiange et al., 2002a). No obstante parece que tales variaciones no tienen significación clínica para la mayoría de pacientes, no siendo relevante el momento del día en el que se realice el examen siguiendo los protocolos de la ISCEV (Marcus et al., 2004). 3.1.6.- ANESTESIA: Este apartado es importante, ya que en el caso de los animales es casi siempre imprescindible recurrir a la anestesia más o menos profunda para realizar estudios electrofisiológicos. En efecto, el registro de señales eléctricas relacionadas con el sistema visual en el hombre o en el animal no es particularmente doloroso pero requiere cierto grado de cooperación. En el caso del animal, que suele estar inquieto y sorprendido ante las manipulaciones llevadas a cabo, dicha cooperación es mínima. Por lo tanto el recurso a la anestesia general es inevitable salvo en contadas excepciones (Komaromy et al., 1998; Lazard et al., 2000; Narfström et al., 2002). Podemos encontrar así trabajos realizados sobre cerdos despiertos que suelen ser bastante cooperadores y cuyos ojos tienen una movilidad bastante limitada (Rosolen y Lazard, 1997). Asimismo, en el caso de los roedores se pueden utilizar sistemas de contención adecuados para realizar ERGs sin necesidad de dormirlos (Lazard et al., 2000). En la bibliografía se puede encontrar técnicas para realizar ERGs y PEV a perros despiertos, pero requiere adiestramiento específico de los mismos con lo que su uso clínico es prácticamente nulo (Sato et al., 1982). También algunos autores realizaron de manera fiable ERGs a monos despiertos (Sato et al., 1980). En el caso del perro según Komaromy et al., para protocolos cortos se puede recurrir a la sedación con acepromacina y butorfanol pero para protocolos largos es necesaria la anestesia general (Komaromy et al., 1998). En el hombre se suele recurrir a la sedación o anestesia general en el caso de pacientes con desórdenes psiquiátricos o en niños, cuya cooperación en ocasiones es escasa (Wongpichedchai et al., 1992; Tremblay y Parkinson, 2003; Marmor et al., 2004). En definitiva, en el caso de los animales, para realizar ERGs, es casi siempre imprescindible el uso de anestesia general. Se consigue así evitar artefactos producidos por movimientos de los animales, excesiva actividad muscular o estrés (Komaromy et al., 2002). Es importante tener en cuenta el tipo Revisión Bibliográfica 99 de anestésico utilizado ya que estos tienen en mayor o menor medida efectos sobre los registros electrofisiológicos (Sloan, 1998). De entre los anestésicos disponibles para los animales los más utilizados para la realización de ERGs son la ketamina asociada a agonistas α-2 adrenérgicos (Kommonen y Raitta, 1987; Kommonen, 1988). Tiene la ventaja de modificar muy poco la morfología del ERG y de centrar el ojo facilitando así su exposición a los flashes. No obstante esta combinación sería útil para protocolos que no excedan los 40 minutos. Para protocolos de más de 40 minutos es conveniente recurrir a la anestesia con agentes volátiles a pesar de que alteran más el ERG (Kommonen et al., 1988; Yanase y Ogawa, 1996; Sloan, 1988). 3.1.6.1.- AGENTES VOLÁTILES: Los agentes volátiles más usados en veterinaria son el halotano, el isoflurano y el sevoflurano, este último de incorporación más reciente tiene la ventaja de no irritar apenas las vías respiratorias (Steffey, 1996). La concentración alveolar mínima (CAM) en el perro de estos agentes es 2,09 ± 0,13, 1,30 ± 0,12 y 0,94 ± 0,09 para el sevoflurano, isoflurano y halotano respectivamente. Concentraciones de entre 1 y 1,5 CAM, mantienen la ventilación espontánea en el perro (Mutoh et al., 1997) y en el gato (Hikasa et al., 1997). Los efectos respiratorios del isoflurano y del sevoflurano son similares y mayores que los del halotano. La calidad de la anestesia es buena con los tres agentes. El sevoflurano proporciona tiempos de recuperación más cortos que el halotano y similares a los del isoflurano (Mutoh et al., 1997). Todos los anestésicos inhalatorios provocan hipotensión sistémica por disminución de la resistencia vascular periférica (Steffey, 1996). Este efecto es similar entre el isoflurano y el sevoflurano y menor con el halotano (Mutoh et al., 1997). El halotano y el isoflurano en la rata (Antunes et al., 2003a) y en el hombre (Sloan, 1998) disminuyen sensiblemente las amplitudes del EEG y de los potenciales evocados auditivos. Para algunos autores los halogenados disminuyen sensiblemente la PIO en el hombre (Mirakhur et al., 1990). Para otros, tienen un mínimo efecto sobre la PIO, tanto en el hombre (Watcha et al., 1990) como en el perro (Almeida et al., 2004). En un trabajo reciente se vio que los tiempos angiográficos del perro no varían con el uso de isoflurano, halotano o sevoflurano, con lo que estos anestésicos no alteran de forma significativa la hemodinámica de la retina. Además el uso de cualquiera de estos tres anestésicos, es seguro y favorece una recuperación rápida (Martin et al., 2001). Revisión Bibliográfica 106 CO2 provocan efectos más rápidos sobre el pH intracelular que sobre el extracelular (Hiroi et al., 1994). 3.1.8.- PRESIÓN ARTERIAL MEDIA (PAM): El hecho de que la onda b no se altere por cambios en el flujo vascular retiniano se ha observado en el hombre (Riva et al., 1981) y en otros mamíferos (Demant et al., 1982; Delaey y Van De Voorde, 2000). La función retiniana depende en gran medida de la presión de O2 tisular, por lo tanto ante oxigenación constante del paciente, dicha PO2 depende del flujo de los vasos retinianos. Conviene recordar en este punto que en los animales existen varias maneras de medir la presión arterial. La más fiable es la medición invasiva, cateterizando directamente una arteria y conectándola a un aparato equipado con un transductor de presiones. Los métodos oscilométricos son los más inexactos. Por último, está el doppler, con el inconveniente de que solo se puede medir de manera fiable la presión arterial sistólica (Haskins, 1996). En el gato ha sido estudiado con detalle el efecto que provocan modificaciones drásticas de la PAM sobre las ondas b y c del ERG, las cuales dependen de la vascularización retiniana y coroidal respectivamente. La onda b permanece estable ante un gran rango de variaciones de PAM. Lo cual demuestra una vez más la gran capacidad de autorregulación de los vasos retinianos. El límite bajo de autorregulación en este experimento fue de 55 mmHg, el límite alto no fue alcanzado a pesar de que la máxima PAM llegó hasta 255 mmHg (Demant et al., 1982). Ese límite bajo de autorregulación vascular retiniana coincide con el límite de autorregulación vascular cerebral del hombre y del perro que se sitúa sobre 50 mmHg (Lassen, 1959). En el hombre se observó que la capacidad autorreguladora de sus vasos retinianos, particularmente de los capilares de la mácula, es capaz de compensar caídas de la presión de perfusión ocular (provocada experimentalmente por una PIO de 30 mmHg) de hasta un 36 % (Riva et al., 1981). En cuanto a la onda c relacionada con el EPR, varía su amplitud en dirección opuesta a los cambios de PAM. Esto es debido a la menor capacidad de autorregulación de los vasos de la coroides. La onda c tiene un componente que se genera en le EPR (PI) y otro que se genera en la retina (PIII), los cambios en su amplitud provienen de PI, ya que PIII se genera en la neurorretina, la cual se nutre de vasos retinianos cuya capacidad de autorregulación es buena (Riva et al., 1981; Demant et al., 1982; Delaey y Van de Voorde, 2000). Revisión Bibliográfica 107 3.2.- FACTORES NO CONTROLABLES: 3.2.1.- DIFERENCIAS ANATÓMICAS: El conocimiento de la anatomía y de la fisiología específica de la especie estudiada es importante para establecer un protocolo de exploración y su interpretación. Las capacidades de absorción espectral y la densidad de los diferentes tipos de FR en la retina son variables. En efecto, el protocolo de ERG para una rata será distinto del de un mono ya que estos son animales esencialmente diurnos y las ratas son animales esencialmente nocturnos teniendo distinto ratio conos/bastones (Rosolen et al., 2005d). Por otra parte, la presencia o no de TL puede influir en el ERG (Rosolen et al., 2005a; 2005b). En el perro al igual que en el hombre, existen variaciones en el ERG intra e interindividuales (Rosolen et al., 1999; Grover et al., 2003). Este hecho se puede contrarrestar en los estudios experimentales utilizando un tamaño de muestra adecuado (MontianiFerreira et al., 2004). 3.2.2.- FACTORES INDIVIDUALES: El estado de salud y la condición del animal es importante, ya que la presencia de ciertas enfermedades sistémicas, el estrés o el celo con sus cambios neurohormonales tienen repercusiones importantes sobre el funcionamiento retiniano. La presencia de opacidades oculares alterará la iluminación retiniana y por lo tanto también el ERG. Obviamente la mayoría de las enfermedades retinianas afectan al ERG (Narfström y Ekesten, 1999) y son precisamente las que interesa distinguir del resto (Lazard et al., 2000; Mora y Aregall, 2005). 3.2.3.- EDAD: La edad influye sobre los trazados del ERG. La mayoría de los animales poseen al nacimiento un sistema visual inmaduro (Samuelson, 1999). En el hombre la mayoría de las diferenciaciones nerviosas y conexiones sinápticas de la retina tienen lugar en el útero (Breton et al., 1995). En la primera semana de vida del perro, en la que los ojos todavía están cerrados no hay ERGs registrables, pero en la segunda se detecta una pequeña onda negativa de apenas 5 µV. A las tres semanas de vida empiezan a aparecer ERGs con su morfología típica cuya amplitud aumenta hasta la cuarta semana. A las 8 semanas las amplitudes del ERG se asemejan ya a las de un adulto. En este desarrollo en las primeras semanas de vida, las variaciones de latencia aparecen de forma más marcada en las ondas b y c y menos en la a. La frecuencia de fusión del flicker que se sitúa cercana a los 70 Hz en el adulto (Miller y Murphy, 1995), también varía con la edad. Así en cachorros de Revisión Bibliográfica 108 menos de 3 semanas la curva de fusión del flicker solo presenta la rama de los conos. A las 8 semanas la curva presenta además la de los bastones y se asemeja a la de un adulto. Estos resultados se correlacionan con le desarrollo histológico de la retina en esas primeras semanas de vida. A partir de las 8 semanas se mantiene el ERG y va disminuyendo muy lentamente al ritmo que lo hacen el número de FR y células del EPR (Gum et al., 1984). La retina del gato alcanza su madurez morfológica entorno a los 5 meses (Vogel, 1978). En el caso del cochinillo de indias (Carvia Porcellus) que al igual que el hombre nace con los ojos abiertos, el desarrollo de las respuestas visibles en el ERG son muy similares a las de este último (Breton et al., 1995; Armitage, 2001), apuntando a esa especie como un buen modelo animal para ensayos clínicos (Racine et al., 2005). En cualquier caso es interesante establecer en la medida de lo posible normas propias a cada laboratorio considerando las especies estudiadas, la raza y el rango de edad. Aunque generalmente este fin está condicionado por la casuística de cada clínico y no siempre es posible (Lazard et al., 2000). 3.2.4.- FACTORES ENDÓGENOS: Existen factores endógenos como los niveles de glucosa que afectan al ERG. Rosolen et al., observaron una importante reducción en la amplitud del flicker de 30 Hz en monos tras administrar glucosa por vía endovenosa (Rosolen et al., 2005c). Se han observado alteraciones en el ERG ante cambios en los niveles de glucosa en sangre en el gato, en donde los bastones se ven más afectados por la glucemia que los conos (Macaluso et al., 1992). En el hombre se observan reducciones en la amplitud de la onda b con niveles bajos de glucosa y reducciones en la latencia del flicker con niveles altos (Dawson et al., 2000). Cuando se trabaja con animales hay que prestar especial atención a la influencia que el estrés y el celo, en el caso de las hembras, pueden tener sobre los niveles sanguíneos de glucosa, conviene tenerlo en cuenta a la hora de interpretar los ERGs (Lazard et al., 2000). 3.2.5.- PRESIÓN INTRAOCULAR (PIO): La PIO tiene gran influencia en la funcionalidad retiniana. En efecto, una PIO elevada sostenida en el tiempo provoca daños en las células ganglionares (Mittag et al., 2000). De ahí que en electrofisiología la prueba más sensible para detectar los daños causados por una PIO elevada en el hombre (Holder, 2001; Parisi et al., 2006; Atilla et al., 2006) y en el perro (Hamor et al., 2000) sea el PERG. No obstante estudios recientes relacionan la PhNR del ERG de pleno campo Revisión Bibliográfica 109 convencional con la actividad de las células ganglionares en monos y humanos. Varios estudios demuestran que tras inducir glaucoma la PhNR disminuye, por lo que podría ser una herramienta útil a la hora de valorar los daños producidos por el glaucoma (Viswanathan y Frishman, 1997; Viswanathan et al., 1999; Frishman et al., 2002). Estudios realizados en el conejo demuestran que incrementos agudos de la PIO no afectan al ERG de pleno campo, a menos que tales incrementos superen los 60 mmHg (Feghali et al., 1991). Así mismo, si la elevación de la PIO dura poco tiempo no afecta a la vasodilatación retiniana en respuesta al flicker ni al propio flicker, indicando que los mecanismos de autorregulación vascular siguen funcionando en esas condiciones en el hombre (Garhofer et al., 2005). EFECTO DE LA ANESTESIA INHALATORIA CON ISOFLURANO Y SEVOFLURANO SOBRE EL ELECTRORRETINOGRAMA EN EL PERRO: NORMOCAPNIA E HIPERCAPNIA 111 Material y Métodos 113 IV.-MATERIAL Y MÉTODOS.- 1.- MATERIAL: 1.1.- ANIMALES: En este trabajo se han utilizado 6 perros de raza Beagle, procedentes del servicio de animales de experimentación de la universidad de Córdoba, todas hembras, ovariohisterectomizadas 3 meses antes del inicio del experimento, con una edad de 18 ± 3 meses y un peso de 16 ± 2 kg. Los animales fueron privados de comida durante las 12 horas previas a cada sesión experimental, pero tuvieron libre acceso al agua en todo momento. El experimento se realizó en las instalaciones del hospital clínico veterinario Rof Codina y se prolongó durante un periodo de dos meses. Todos los animales estaban clínicamente sanos lo cual se determinó de manera periódica a lo largo de esos dos meses mediante exploración física y analítica de rutina. La normalidad oftalmológica se determinó mediante una exploración completa incluyendo examen de fondo de ojo mediante cámara de retinografía 72 horas antes de iniciar los registros de ERGs (figura 61). Los animales se alojaron en el animalario del HCV Rof Codina cumpliendo con todos los requisitos autonómicos, nacionales y de la Unión Europea relativos a la experimentación animal. Figura 61: Fondo de ojo de uno de los animales utilizado en el experimento, zona tapetal (izquierda) y zona no tapetal (derecha). 1.2.- MATERIAL DE ANESTESIA: 1.2.1.- EQUIPAMIENTO ANESTÉSICO: • Tubos endotraqueales con balón y manguito, con un diámetro interno de 7, 7.5 y 8 milímetros (Sheridan®, Kendall Company, MA, USA). Material y Métodos 114 • Oxígeno medicinal (Praxair® SL, Madrid). • Circuito de anestesia circular (Excel 210 SE; Ohmeda-BOC Group, Madison, WI, USA) con vaporizador de isoflurano (Isotec 3, Ohmeda-BOC) y de sevoflurano (Sevotec 3, Ohmeda-BOC). 1.2.2.- FÁRMACOS ANESTÉSICOS: • Isoflurano (Forane® Abott Laboratorios, Madrid). • Sevoflurano (Sevorane® Abott Laboratorios. Madrid). • Propofol (Diprivan®; 10mg/ml, ICI-Farma SA. Pontevedra). 1.2.3.- OTROS FÁRMACOS: • Besilato de atracurio (Traquium®, 5 mg/ml, Abbott Laboratorios SA, Barcelona). • Tropicamida (Tropicamida®, 10mg/ml, AlconCusi, Barcelona). • Colirio humectante (Colircusi Humectante®, Alconcusi, Barcelona). 1.2.4.- MATERIAL DE MONITORIZACIÓN: 1.2.4.1.- MONITORIZACIÓN RESPIRATORIA Y DE GASES: • Monitor respiratorio y de gases (Dräger PM 8050-Medizintecknik GMBH-D-2342, Lübeck, Germany). 1.2.4.2.- MONITORIZACIÓN CARDIOVASCULAR Y TERMOMETRÍA: • Monitor de signos vitales (DinamapTM Plus Monitor de Signos Vitales; Critikon Inc., Tampa, FL, USA). Material y Métodos 115 1.3.- MATERIAL AUXILIAR: • Catéteres intravenosos radiopacos apirógenos de 20 y 22 gauges (Vialon® Material, Becton Dickinson, Madrid). • Solución de ringer lactato (Ringer Lactato, B/Braun Medical SA, Barcelona). • Jeringas de 1 ml y de 10 ml (DiscarditTM II, Becton Dickinson, Madrid). • Sistemas de infusión por gravedad (Perfusend®, Sendal, Cáceres). • Regulador de flujo (Easyflow®, Cardiomedical del Mediterráneo, Murcia)). • Alargadera con llave de tres vías (Discofix® C-3, B/Braun Medical SA, Barcelona). • Alcohol (Alcohol sanitario 96%, Laboratorio Noriega SL, Asturias). • Esparadrapo de tejido (Galeno, Martínez Llenas SA, Barcelona). • Gasas de algodón 100 x 100 (Texpol®, Textilplanas Oliveras, Manresa). • Agujas hipodérmicas de 20 gauges (MicrolanceTM 3, Becton Dickinson, Madrid). • Mini-cámara inalámbrica (Receiver LYD®-203c, Heymelot SL, Barcelona) • Monitor de televisión a color de 14 pulgadas (Philips®, San Luis SL, Lugo). • Luxómetro (Digital Lux tester TES-1334, Barcelona). • Dispositivo posicionador y de contención cefálica (manufactura propia). 1.4.- MATERIAL DE ESTIMULACIÓN Y DE REGISTRO: Hemos utilizado un electroretinógrafo de la marca Visiosystem (Siem Bio-Médicale, Nîmes, France). Consta de una unidad estimuladora, de un amplificador y de una unidad de recogida y procesado de datos. 1.4.1.-FOTOESTIMULADORES: Fotoestimulador binocular, con dos flashes de xenon independientes. La luz emitida por los fotoestimuladores consiste en flashes blancos de 2,5 ms de duración y 6,5 cd/m2.s (0,81 log cd.s.m2) de luminancia. La superficie estimulante de cada flash posee una superficie difusora de color blanco que mide 2,5 cm de diámetro. Consta de dos ranuras en cada vía para la interposición de filtros (figura 62). Se han utilizado dos tipos de filtros: Bibliografía 218 215. Peachey NS, Alexander KR, Fishman GA (1989): The luminance-response function of the dark-adapted human electroretinogram. Vision Research. 29(3), pps.: 263-270. 216. Pepperberg DR, Brown PK, Lurie M, Dowling JE (1978): Visual pigment and photoreceptor sensitivity in the isolated skate retina. Journal of General Physiology. 71, pps.: 369396. 217. 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