Uni e sidad de San iago de Compos ela
Facul ad de Medicina y Odon ología
Depa amen o de Medicina
E ec os molecula es de los p oduc os
inales de glicación a anzada en la célula
endo elial humana
Memo ia expe imen al que p esen a pa a op a al g ado de doc o en biología:
B uno K. Rodiño Janei o
San iago de Compos ela, 2011
ISBN 978-84-9887-764-9 (Edición digi al PDF)
Po ada: Imagen de mic oscopía con ocal
ob enida po inmuno luo escencia de
HUVEC incubadas con an icue pos an i-
Nox4 ( e de) y los núcleos ma cados con
TO-PRO
®
(Rojo).
El doc o D. Ezequiel Ál a ez Cas o, in es igado con a ado de la
Uni e sidad de San iago de Compos ela y el p o eso doc o José Ramón
González Juana ey, Ca ed á ico de Ca diología de la Uni e sidad de San iago
de Compos ela,
CERTIFICAN:
Que la p esen e Tesis Doc o al “E ec os molecula es de los p oduc os
inales de glicación a anzada en la célula endo elial humana” del Licenciado en
Biología Molecula D. B uno K. Rodiño Janei o, ha sido ealizada bajo mi
di ección en el Depa amen o de Medicina, Facul ad de Medicina y
Odon ología, conside ándola en condiciones pa a op a al G ado de Doc o y
au o izándola pa a su de ensa an e el T ibunal co espondien e.
Y pa a que cons e, se expide el p esen e ce i icado en San iago de
Compos ela, a 10 de Mayo de 2011.
Fdo. D Ezequiel Ál a ez Cas o Fdo. D José R. González Juana ey
Ag adecimien os
An es de empeza a ag adece a los conocidos, engo el debe de
ag adece a odos los genios y enómenos que han dado las pis as y las
he amien as necesa ias pa a que yo pudie a llega a los esul ados y
conclusiones de es a esis.
De en e los conocidos, empiezo ag adeciendo a mis di ec o es po
da me la opo unidad de con inua en el negocio, guia me en el abajo, da me
luga y medios pa a es e es udio y po enseña me nue as mane as de baila .
A mi je e, po que es de las mejo es pe sonas que conozco y además se
le da bien lucha po causas pe didas (una de ellas soy yo).
A los compañe os de labo a o io, po odas las buenas ho as que
pasamos allí en el zulo, aunque bueno, an es de muda nos allí ya e an g andes
conseje os, amigos, isas y sopo ado es de mis dise aciones.
A odos los del IDIS po los encuen os pasille os, los ca és, las comidas,
los ie nes pizza, los cumples mul i udina ios, las cañejas…ah! y po man ene
i o aquel si io sin luz.
Al se icio de obs ec icia, donde p esencié el p ime pa o, y a las
mad es que, amablemen e, han cedido los co dones umbilicales.
A las seño as de la limpieza, po que son undamen ales y po deja me
pisa los egados sin da me con la escoba.
A los que compa imos la plan a ce o, espe o que man engamos el
con ac o pa a que haya más deba es, isas y a des sin je es.
A los inol idables e imp escindibles de la ca e a, cinco años
aguan ándome y aún en con ac o.
A los colegas de Pon e, po da me an os buenos a os du an e más de
20 años y po es a ahí, siemp e igual, aunque yo desapa ezca algunas
empo adas.

A mi amilia po acompaña me desde siemp e, in i a me a sus mesas,
sus casas y sus momen os especiales. Además, es un place e como amos
c eciendo.
A mis dos chicas especiales. La que me dejo un mon ón de uppe s con
ideales, me is ió con una adecuada educación y me dejó un boni o álbum de
ecue dos. Y la que es una digna suceso a, una mano al alcance y un u u o
p ome edo .
A odos los que, sin compa i ningún apellido conmigo, se han
con e ido en pa e de mi amilia, lejos del hoga . He compa ido pisos, mesas,
ies as, películas, camas, ida…y que sea así po mucho más iempo. Tan
cómodo como en casa, así da gus o.
A los e o es, me as no conseguidas, ciencia as ood y a los momen os
is es po enseña me como se puede ap ende , con inua , pe ecciona y se
eliz.
Es os ag adecimien os, aunque no con ienen ningún nomb e, con ienen
los hechos po los que doy las g acias. A quién conside e o sepa que se
encuen a uno o a ios de es os g upos, pues eso, muchísimas g acias.
Dedicada, po supues o, a mi mad e
Índice
9
Índice
Lis ado de ab e ia u as..................................................................... 11
In oducción....................................................................................... 17
La dis unción endo elial como o igen de la en e medad ca dio ascula .......17
Fac o es asocons ic o es...................................................................................18
Fac o es in lama o ios y de adhesión....................................................................18
Fac o es p o ombó icos .......................................................................................20
Fac o es de c ecimien o celula ............................................................................20
Biodisponibilidad del óxido ní ico.........................................................................21
Asociación en e la diabe es melli us y la dis unción endo elial....................23
Posibles mecanismos de las complicaciones ascula es diabé icas............27
Es és oxida i o y diabe es............................................................................30
Fuen es de ROS...................................................................................................32
NADPH oxidasa y diabe es...................................................................................36
E ec os del aumen o de ROS................................................................................36
P o eínas con glicaciones no enzimá icas.....................................................37
Relación de los p oduc os de Amado i con la dis unción endo elial .............41
P oduc os de Amado i y es és oxida i o: las NADPH oxidasas...................44
Hipó esis y Obje i os ........................................................................ 51
Ma e ial y mé odos............................................................................ 55
Cul i o de HUVEC .........................................................................................55
Ca ac e ización de las células endo eliales...................................................56
Medida de la p oli e ación celula ..................................................................56
Medida de ROS en HUVEC...........................................................................57
Es udio del ni el de exp esión median e RT-PCR en iempo eal ................59
Elec o o esis en gel de aga osa...................................................................62
Inmuno luo escencia celula ..........................................................................62
F accionamien o de la p o eína de núcleo y ci oplasma ...............................63
Es udio de las acciones de p o eínas del núcleo y el ci oplasma median e
Wes e n Blo ..................................................................................................64
Cuan i icación de p o eína en medio de cul i o median e ensayo po
inmunoabso ción ligado a enzimas. ..............................................................65
Fá macos y eac i os.....................................................................................65
Análisis es adís ico ........................................................................................66
Resul ados......................................................................................... 69
Ca ac e ización del modelo celula endo elial...............................................69
P oducción de ROS en HUVEC a adas con albúmina glicada ...................73
Exp esión de las subunidades de NADPH oxidasa en HUVEC a adas con
albúmina glicada............................................................................................81
Ru as implicadas en el aumen o de ROS po albúmina glicada ...................84
Es udio de los ac o es de ansc ipción implicados en el cambio de
exp esión de las subunidades de NAPDH oxidasa en HUVEC ....................87
Papel de la eNOS en los cambios inducidos po la albúmina glicada en las
HUVEC ..........................................................................................................91

In oducción
17
In oducción
La dis unción endo elial como o igen de la en e medad ca dio ascula
La dis unción endo elial es de inida como la pé dida de la capacidad del
endo elio de egula de o ma adecuada la homeos asis ascula . Las unciones
más impo an es que se conocen del endo elio son: la egulación del ono
ascula , la ac uación como ba e a selec i a de mac omoléculas, la
modulación de la in lamación, la egulación del c ecimien o ascula y el con ol
de la ag egación plaque a ia y la coagulación [1]. Así que, los p incipales
cambios ocu idos en las células endo eliales que impiden que és as cumplan
con sus unciones habi uales se ían: la p oducción aumen ada de ac o es
asocons ic o es, in lama o ios, p o ombó icos o de c ecimien o celula y la
pé dida de biodisponibilidad del óxido ní ico en el ejido ascula [2].
Una de las unciones del endo elio que hemos mencionado es la
egulación del ono ascula , ac uando di ec amen e en la asodila ación y en
la asocons icción, y en consecuencia, con olando el lujo sanguíneo [3]. En el
diagnós ico clínico se u iliza la pé dida de con ol de la asodila ación del
endo elio pa a medi su dis unción y se puede analiza po di e en es mé odos:
la in usión in aco ona ia de ace ilcolina, la dila ación mediada po lujo en la
a e ia b aquial y la ple ismog a ía del an eb azo o del pulso de los dedos [1].
Se ha obse ado po es os mé odos que la asodila ación mediada po el
endo elio es á educida en los pacien es hipe ensos, pacien es con
en e medad co ona ia y en pacien es que p esen an dis in os ac o es de iesgo
ca dio ascula ales como diabe es melli us, dislipemias o abaquismo, y es e
descenso en la asodila ación se hace más p onunciado de una mane a
p opo cional al núme o de ac o es de iesgo [2]. Po o o lado, la dis unción
endo elial es á elacionada con en e medad co ona ia [4], con insu iciencia
ca díaca [5] y con en e medad a e ial pe i é ica [1]. De es a mane a nos
encon amos que la dis unción endo elial se encuen a elacionada con los
dis in os ac o es de iesgo ca dio ascula y ambién se asocia con las dis in as
pa ologías ca dio ascula es, siendo un elemen o impo an e y común en es e
ipo de en e medades.
In oducción
18
Los dis in os mecanismos molecula es que modulan los cambios que
su e el endo elio dis uncional ya han sido mencionados: ac o es
asocons ic o es, ac o es in lama o ios y de adhesión, ac o es
p o ombó icos, ac o es de c ecimien o celula y la biodisponibilidad del óxido
ní ico (Figu a 1).
Fac o es asocons ic o es
El ono ascula es a egido po un equilib io en e los elemen os
asodila ado es y los asocons ic o es. En e los p ime os podemos menciona
el óxido ní ico, la p os aciclina y el ac o hipe pola izan e de i ado del
endo elio. En e los asocons ic o es pod íamos des aca la endo elina-1 y la
angio ensina II [3]. En la dis unción endo elial p e alecen los ac o es
asocons ic o es en e a los asodila ado es [2]. En es e desequilib io oma un
g an p o agonismo la angio ensina II, que es en sí misma una po en e molecula
asocons ic o a, pe o que además es capaz de ac i a a la nico inamida
adenina dinucleó ido os a o (NADPH, del inglés nico inamide adenine
dinucleo ide phospha e) oxidasa y p oduci especies eac i as del oxígeno
(ROS del inglés eac i e oxygen species) que a ec an al sis ema ascula en
gene al y a la p oducción de óxido ní ico en pa icula [6]. La p oducción de
óxido ní ico ocupa un papel especial en la asodila ación, pe o se á
comen ado de una o ma más de allada más adelan e.
Fac o es in lama o ios y de adhesión
En la dis unción endo elial exis e una ac i ación in lama o ia de las
células endo eliales, que pod ía es a elacionada con el es ado in lama o io
p esen e en la a e oscle osis [3]. En elación a la in lamación, las in ecciones
bac e ianas y la adminis ación de ci ocinas in lama o ias educen la unción
endo elial [2]. En humanos, los es ados agudos in lama o ios inducidos po la
in usión de lipopolisacá ido en bajas dosis o las acunaciones empeo an la
asodila ación dependien e del endo elio [3]. La asodila ación p o ocada po
ace ilcolina en las a e ias del an eb azo se co elaciona nega i amen e con los
alo es de p o eína c eac i a en pacien es con en e medad co ona ia [7]. Po
el con a io, el a amien o con medicamen os an iin lama o ios, como po
ejemplo los inhibido es de la ciclooxigenasa mejo a la unción endo elial en
pacien es con a e oscle osis [2].
In oducción
19
In i o, las células endo eliales son es imuladas po ac o es p o-
in lama o ios como el ac o de nec osis umo al al a (TNF-α, del inglés Tumo
nec osis ac o alpha) y la p o eína c eac i a y en consecuencia es as células
exp esan ac o es de adhesión e in lama o ios. En es e es ado se al e an los
ni eles de ac i ación y exp esión de ac o es de ansc ipción implicados en la
eacción in lama o ia, como po ejemplo, el ac o nuclea kappa B (NF-kB, del
inglés nuclea ac o kappa B). Se ha obse ado en células endo eliales
aisladas de indi iduos ancianos u obesos una ac i ación del NF-kB a a és de
una exp esión inc emen ada de la subunidad ac i a de NF-kB p65 y una
disminución del egulado de NF-kB (IkB). Es a ac i ación se ha elacionado
con una peo asodila ación dependien e del endo elio [3]. Es un hecho a
des aca que se ha is o que las ROS pueden ac i a al ac o de ansc ipción
NF-kB [8].
A su ez, los ac o es in lama o ios ac i an a las moléculas de adhesión.
Las p incipales moléculas de adhesión son la molécula de adhesión
in e celula -1 (ICAM-1 del inglés In e cellula adhesion molecule-1), la molécula
de adhesión ascula -1 (VCAM-1 del inglés Vascula cellula adhesion
molecule-1), la molécula de adhesión de leucoci os (LAM del inglés Leukocy e
adhesion molecule-1) y la E-selec ina. La acción combinada de las moleculas
de adhesión y ci ocinas como la molécula quimio ác ica de monoci os-1 (MCP-
1) a ae células del sis ema inmune y pe mi e que se unan a las células
endo eliales, in il ándose a a és de ellas y p oduciendo in lamación. La
exp esión de es as moléculas de adhesión es á ín imamen e ligada al es ado
in lama o io del endo elio. El NF-kB egula los genes de la ICAM-1, la VCAM-1
y la E-selec ina [9]. La p o eína c eac i a aumen a la exp esión de ICAM-1,
VCAM-1, E-selec ina y MCP-1 [1, 9]. Como hemos comen ado an e io men e,
las ROS ienen un papel en la egulación de la in lamación y ambién se
pueden elaciona con el aumen o de los ac o es de adhesión. El pe óxido de
hid ógeno, p oducido po la dismu ación del anión supe óxido p o enien e de la
NADPH oxidasa, puede ac i a el NF-kB pa a aumen a la exp esión de ICAM-
1 en la memb ana de las células endo eliales. De o ma ecip oca, an o ICAM-
1 como VCAM-1 median la gene ación de ROS pa a egula la pe meabilidad
del endo elio, in ensi icando la in lamación inicial al pe mi i la in il ación de los
monoci os a a és de la ín ima ascula [8].
In oducción
20
Fac o es p o ombó icos
El endo elio en su es ado basal exp esa ac o es con ac i idades
an icoagulan es. Cuando el endo elio es dis uncional p esen a p opiedades p o-
coagulan es. Las células endo eliales juegan un papel undamen al en la
egulación de la gene ación de la plasmina, que es la enzima undamen al pa a
la disolución de los coágulos. El endo elio ambién egula la ib inolisis po
p oduci el ac i ado del plasminógeno del ejido ( -PA del inglés Tissue
plasminogen ac i a o ) y el inhibido del ac i ado del plasminógeno-1 (PAI-1
del inglés Plasminogen ac i a o inhibi o -1). Además, el endo elio limi a la
ac i ación de la cascada de coagulación po la ombomodulina y po la
an i ombina. También se egula a ni el del endo elio las in e acciones en e el
ac o isula -inhibido del ac o isula y la sín esis o libe ación del inhibido del
ac o isula es á posi i amen e egulado po la hepa ina, el lujo sanguíneo y la
ombina [9]. La in lamación y el desequilib io de es as u as p o ocan una
dis unción de la egulación de la coagulación po pa e de las células
endo eliales, siendo uno de los pasos undamen ales en las e apas a anzadas
de la a e oscle osis [10].
Fac o es de c ecimien o celula
La célula endo elial egula el c ecimien o de las células ce canas, como
las células del músculo liso ascula , po lo que la pé dida de la unción de la
célula endo elial lle a a un descon ol en la p oli e ación. El ac o de
c ecimien o ascula endo elial (VEGF, del inglés ascula endo elial g ow h
ac o ) es uno de los ac o es más impo an es en el con ol de es a unción del
endo elio y se ha is o que es capaz de egula la ac i idad de la NADPH
oxidasa y la p oducción de ROS. El VEGF es imula la NADPH oxidasa y la
mig ación de las células endo eliales, siendo modulado es e e ec o po la
p esencia de an ioxidan es [11]. El VEGF ac úa a a és del ecep o de VEGF
de ipo 2 (VEGFR2 del inglés Vascula endo helial g ow h ac o ecep o 2).
Es e ecep o se une a la IQGAP1, que es un egulado undamen al de la
p oducción de ROS inducida po VEGF [12]. La ac i idad de la NAPDH oxidasa
es necesa ia pa a la p oli e ación, la supe i encia y la apop osis de las células
endo eliales [13]. Dos iso o mas de la amilia de las NADPH oxidasa, la Nox2 y
la Nox4, con ibuyen de igual mane a a la gene ación de ROS y al aumen o de
In oducción
21
p oli e ación en condiciones basales en células endo eliales [14]. Es más, las
ROS puede señaliza an o el inc emen o de p oli e ación como el de apop osis
en células endo eliales, dependiendo de la concen ación y del ipo celula [15].
Biodisponibilidad del óxido ní ico
Uno de los p incipales ac o es que egulan la unción endo elial es la
p oducción y la biodisponibilidad del óxido ní ico, el cual elaja los asos
sanguíneos, p e iene la ag egación y la adhesión plaque a ia, limi a la
oxidación del coles e ol de la lipop o eína de baja densidad (LDL del inglés low
densi y lipop o ein), inhibe la p oli e ación de las células del músculo liso
ascula y educe la exp esión de genes p oin lama o ios. Po odas es as
acciones, una de iciencia en la p oducción del óxido ní ico es una de las
p incipales causas de dis unción endo elial. El óxido ní ico se p oduce a a és
de la con e sión del aminoácido L-a ginina a L-ci ulina po la enzima óxido
ní ico sin e asa (NOS, del inglés ni ic oxide syn hase). Hay a ias iso o mas:
la NOS1 aislada del ce eb o, la NOS2, o óxido ní ico sin asa inducible (iNOS,
del inglés Inducible ni ic oxide syn hase), encon ada en mac ó agos y la
NOS3 o óxido ní ico sin asa endo elial (eNOS, del inglés Endo elial ni ic oxide
syn hase) de las células endo eliales. La NOS1 y la eNOS poseen ac i idad
cons i u i a mien as que la ac i idad de la iNOS es inducida po dis in os
es ímulos. Todas las NOS son homodíme os que compa en un dominio
homólogo a la ci oc omo educ asa P-450 en el ex emo ca boxílico de la
p o eína, iene luga es de unión pa a NADPH, Mononucleó ido de la ina (FMN
del inglés Fla in mononucleo ide), e ahid obiop e ina (BH4), y calmodulina,
siendo necesa ios odos los coenzimas pa a el co ec o uncionamien o de la
enzima [16].
La eNOS, es la NOS más impo an e en el ejido ascula y oma un
p o agonismo especial en la dis unción endo elial. Es una enzima ac i ada po
el lujo pulsá il de la sang e a a és de los asos y el es és de cizalla. El
es és de cizalla se elaciona de mane a di ec amen e p opo cional con el lujo
a e ial e in e samen e con el diáme o a e ial, eniendo mucha más ele ancia
es e úl imo pa áme o. La eNOS es gene almen e ac i ada po un inc emen o
de la concen ación in acelula de Ca
+2
, que a a és de la calmodulina,
inc emen a la ans e encia de elec ones en el dominio educ asa del enzima

In oducción
22
(desde el NADPH a las la inas) necesa ia pa a educi la L-a ginina. La
adminis ación de ace ilcolina en las a e ias, causa una dila ación de la a e ia
debido a un inc emen o in acelula de Ca
+2
en el endo elio. El óxido ní ico
p oducido di unde a las células del músculo liso ascula donde se ac i a la
guanila o ciclasa, aumen ando el mono os a o de guanosina (GMP del inglés
Guanosin monophospha e) cíclico, que pa icipa en la elajación de las células
del músculo liso ascula [1-3, 9, 16].
Uno de los p incipales ac o es que in luye en la biodisponibilidad del
óxido ní ico es la eacción de és e con el anión supe óxido, pa a o ma
pe oxini i o. O a posibilidad es la incapacidad de las NOS pa a p oduci óxido
ní ico po e ec os del es és oxida i o o el ago amien o de la
e ahid obiop e ina, que conducen al desacoplamien o de la NOS, pasando a
p oduci aniones supe óxido en ez de óxido ní ico [16].
Como se ha is o en odos los cambios que p esen an las células
endo eliales en la dis unción endo elial, la p oducción de adicales lib es del
oxígeno iene un p o agonismo especial. La p oducción de ROS a ni eles bajos
iene unciones indispensables en la isiología no mal del sis ema
ca dio ascula , pe o cuando la p oducción de ROS sob epasa las de ensas
an ioxidan es que lo egulan p oduce una se ie de p oblemas, como po
ejemplo, los que hemos is o en es e apa ado en elación a la dis unción
endo elial.
La dis unción endo elial pa icipa an o en el inicio como en el desa ollo
de la a e oscle osis. En la a e oscle osis se p oduce una pé dida de la
eac i idad no mal de los asos que lle a a isquemia, angina e in a o de
mioca dio, un inc emen o de pe meabilidad a mac omoléculas como las
lipop o eínas, un aumen o de la exp esión de ac o es in lama o ios o de
adhesión que a o ecen el eclu amien o de monoci os-mac ó agos, una
des egulación del c ecimien o de las células endo eliales y del músculo liso y,
inalmen e, el aumen o de ac o es de coagulación [17].
In oducción
23
Figu a 1: Rep esen ación de los ac o es que lle an a la dis unción endo elial. Resumen de los
dis in os ac o es asocons ic o es, de in lamación o adhesión, ombó icos, de c ecimien o
celula y de biodisponibilidad del óxido ní ico, que a ec an a la célula endo elial y a sus
unciones. Ab e ia u as.- BH4: Te ahid obiop e ina; EDHF: Fac o hipe pola izan e de i ado del
endo elio; eNOS: óxido ní ico sin asa endo elial; FMN: mononucleó idos la ina; H
2
O
2
: Pe óxido
de hid ógeno; ICAM-1: Molécula de adhesión in e celula -1; L-a g: L-a ginina; L-ci : L-ci ulina;
MCP-1: P o eína quimio ác ica de monoci os-1; NADPH: Nico inamida adenina dinucleó ido
os a o; NF-kB: Fac o Nuclea kappa B; Nox: NADPH oxidasa; O
2-
: Anión supe óxido; PAI-1:
Inhibido del ac i ado del plasminógeno; TF: Fac o isula ; TFPI: Inhibido de la u a del ac o
isula ; TNF-α: Fac o de nec osis umo al al a; -PA: Ac i ado isula del plasminógeno; VCAM-
1: molécula de adhesión celula ascula -1; VEGF: Fac o de c ecimien o endo elial ascula .
Asociación en e la diabe es melli us y la dis unción endo elial
La diabe es es un deso den me abólico ca ac e izado po hipe glicemia e
in ole ancia a la glucosa que es causado po una de iciencia y/o una unción
In oducción
24
empeo ada de la insulina. Los ac o es de iesgo ca dio ascula más
impo an es son la obesidad abdominal y la esis encia a la insulina (diabe es
melli us ipo 2), los al os ni eles de coles e ol y la p esión sanguínea al a. La
p e alencia de la diabe es ipo 2 es á aumen ando ápidamen e en odo el
mundo. La mayo ía de las discapacidades y las mue es p ema u as en
pacien es diabé icos se deben a complicaciones ascula es. A lo la go del
2010, se a ibuye on a la diabe es al ededo de 4 millones de mue es en el
mundo y el 50% de és as sucedie on po en e medades ca dio ascula es [18].
La diabe es ambién lide a las causas de la cegue a, el allo enal y las
ampu aciones de las ex emidades in e io es. Todas son a ecciones
elacionadas con los asos sanguíneos [9]. Sabiendo odo lo an e io , es
impo an e ema ca que la diabe es y la esis encia a la insulina son unos
ac o es des acados en la dis unción endo elial. Es e hecho se ha obse ado a
ni el clínico y expe imen al [3].
A ni el clínico, es udios ans e sales han mos ado una educción en la
asodila ación dependien e del endo elio en a e ias co ona ias y pe i é icas de
pacien es con diabe es ipo 1 y 2 [19-21]. Va ios es udios han examinado la
elación en e la esis encia a la insulina y la dis unción endo elial en pacien es.
Pa a es a asociación se han ealizado dis in as p uebas del con ol glucémico
como son el clamp de glucosa o de insulina, el es o al de ole ancia de la
glucosa, los ni eles de insulina plasmá ica y el modelo de homeos asis de
esis encia a la insulina (HOMA-IR del inglés homeos asis model assessmen
insulin esis ance). En odos ellos, se obse ó una elación in e sa en e los
ni eles de esis encia a la insulina y la asodila ación medida con dis in os
mé odos an o a ni el b aquial, adial o co ona io [22-33] (Tabla 1).
Además, en humanos sanos, la in usión de la insulina es imula la
asodila ación e inc emen a el lujo sanguíneo en ejidos pe i é icos, y es e
e ec o se debili a en pacien es con diabe es melli us y esis encia a la insulina
[21, 34].
In oducción
25
Tabla 1: Es udios clínicos que elacionan la sensibilidad a la insulina y la
dis unción endo elial
Tipo de pacien es P ueba/Tes Resul ado Re .
Muje es obesas Clamp de glucosa ↑ Sensibilidad a insulina, ↑ de lujo
inducido po ace ilcolina [22]
No diabé icos Clamp de glucosa ↑ Sensibilidad a insulina,
↑ dila ación
mediada po lujo en a e ia b aquial
[23, 24]
Suje os sanos
Tes o al de
ole ancia a la
glucosa
↑ Dosis de espues a a la insulina, ↓
ci culación co ona ia [25]
Pacien es obesos en e a
delgados
Tes o al de
ole ancia a la
glucosa
↑ Dosis de espues a a la insulina, ↓
ci culación co ona ia [26]
Suje os sanos Ni eles de insulina
↑ Ni eles insulina, ↓ dila ación
mediada po lujo en la a e ia
b aquial
[27]
No diabé icos con ni eles
a iables de índice de masa
co po al
HOMA-IR
↑ HOMA-IR, ↓ espues a a
me acolina en e
l lujo de la sang e de
la pie na
[28]
Diabé icos en e a no
diabé icos HOMA-IR ↑ HOMA-IR, ↓ espues a en la
ci culación de la piel a la ace ilcolina
[29]
Pacien es del es udio
F aminghan HOMA-IR ↑ HOMA-IR, ↓ la dila ación mediada
po lujo en la a e ia b aquial [30]
Suje os sanos, obesos y/o
con esis encia a la insulina
Clamp de insulina
La can idad de glucosa cap ada se
elaciona con la asodila ación
mediada po insulina
[31-33]
HOMA-IR: modelo de homeos asis de esis encia a la insulina, del inglés homeos asis model
assessmen insulin esis ance.
In oducción
32
aunque no u o bene icio en los diabé icos ipo 2 [3]. El a amien o con empol
disminuyó la apop osis y la o mación de neoín ima as el daño po ca é e en
la a e ia ca ó ida de a as diabé icas [83].
Fuen es de ROS
El aumen o de ROS en el sis ema ascula de diabé icos puede p o eni
de a ias uen es, como son el sis ema de anspo e elec ónico de la
mi ocond ia, la xan ina oxidasa, la eNOS desacoplada y la NADPH oxidasa.
La mi ocond ia puede se una impo an e uen e de ROS. Las ROS
de i adas de la mi ocond ia a ec an al c ecimien o, a la di e enciación y a la
mue e celula p og amada. En elación a la diabe es y a la esis encia a la
insulina, las ROS de i adas de la mi ocond ia juegan un papel en la ac i ación
de la AMP-cinasa (AMPK) y en la dila ación dependien e del endo elio inducida
po el es és de cizalla. Es udios ecien es han mos ado la asociación en e la
dis unción endo elial y la pé dida de masa mi ocond ial con un inc emen o en la
p oducción de ROS en a e iolas aisladas de pacien es con diabe es melli us
compa adas con con oles sanos [3]. Se ha is o además que al no maliza la
p oducción del anión supe óxido mi ocond ial se bloquean a ias de las u as
de daño po hipe glicemia [84].
La xan ina oxidasa es una molibdoenzima capaz de ca aliza la oxidación
de hipoxan ina y xan ina en el p oceso me abólico de las pu inas. Reduce el
oxígeno molecula pa a p oduci aniones supe óxido, que lle a án a la
o mación de pe óxido de hid ógeno (H
2
O
2
) [4]. Se ha obse ado un inc emen o
en la p oducción de ROS a a és de la xan ina oxidasa en a ones a ados
con es ep ozo ocina, un an ibió ico que se u iliza pa a induci la diabe es ipo 1
en modelos animales [85]. La inhibición de la xan ina oxidasa educe el es és
oxida i o inducido po la hipe glicemia en el músculo esquelé ico de a ones
diabé icos [86]. La inhibición de la xan ina oxidasa con alopu inol educe el
es és oxida i o y mejo a la unción ascula y neu al en a as o conejos con
diabe es ipo I [87, 88]. También se encon ó co elación en e los ni eles de la
xan ina oxidasa y la hemoglobina glicada en diabé icos ipo 2 [89].
Las NOS pueden ac ua como uen es de aniones supe óxido po sí
mismas. Las NOS con ienen cua o g upos p os é icos edox ac i os ( la ín

In oducción
33
adenín dinucleó ido (FAD), FMN, hemo y BH4) que pueden educi el O
2
. Así,
los elec ones ans e idos a la enzima NOS ienen que es a es echamen e
con olados pa a e i a la educción del O
2
en la sín esis de óxido ní ico.
Cuando la eNOS se encuen a en unas condiciones de e minadas, p oduce
aniones supe óxido y en es e es ado se dice que la eNOS se encuen a
desacoplada. Hay e idencias de desacoplamien o de la NOS en a as a adas
con es ep ozo ocina, un modelo animal de diabe es (48) y en pacien es con
diabe es melli us (41).
Se han desc i o a ios mecanismos que egulan el desacoplamien o de
la eNOS: la oxidación de la e ahid obiop e ina, la ca encia de L-a ginina po
acción de las a ginasas y el desequilib io en e la ADMA y la dime ila ginina
dime ilaminohid olasa (DDAH, del inglés Dime hyla ginine
dime hylaminohyd olase); mecanismos implicados en el me abolismo de las
me ila ginina, un inhibido endógeno de la eNOS [90]; la S-glu a ionilación de la
eNOS [91]; y po úl imo la eacción del pe oxini i o con el cen o ac i o de la
eNOS [77].
La NADPH oxidasa es la p incipal uen e de ROS en el ejido ascula y
es á uncionalmen e ac i a en odas las células de la pa ed ascula ,
incluyendo las células endo eliales, las células muscula es lisas ascula es, los
ib oblas os, los monoci os y los mac ó agos [92, 93]. La NADPH oxidasa es
una enzima mul i-componen e compues a po las subunidades p22phox y
gp91phox. Los gp91phox posee 7 homólogos ca alí icos, 4 de los cuales, Nox1,
Nox2, Nox4 y Nox5 son encon ados en el ejido ascula [94] (Figu a 2). La
gp91phox es á egulada además po los componen es ci oplasmá icos
p47phox, p67phox y la pequeña p o eína GTPasa, Rac1, que pa icipa en la
ac i ación de la NAPDH oxidasa. Es as enzimas ans ie en elec ones del
NADPH al oxígeno molecula , y así p oducen anión supe óxido. La p o eínas
de la amilia de las NADPH oxidasas compa en luga es de unión comunes
pa a FAD, hemo, y NADPH y 6 dominios ansmemb ana [8]. Dependiendo de
la localización subcelula de las Nox, el anión supe óxido es libe ado den o de
o ganelas o ex acelula men e, dando como consecuencia una señal in e na o
a e ec os pa ac inos, espec i amen e. La SOD ápidamen e con ie e el anión
supe óxido a un p oduc o más du ade o que puede a a esa memb anas, el
H
2
O
2
. De es a mane a se inc emen a el adio de acción y se modi ica la señal.
In oducción
34
Mien as algunos e ec os de las NADPH oxidasas es án mediados po el anión
supe óxido, ales como la inac i ación del óxido ní ico y su papel en la
egulación de la p esión sanguínea, muchos o os e ec os son a ibuidos a la
modi icación de las p o eínas po el H
2
O
2
, incluyendo la ansducción de
señales de c ecimien o en células muscula es lisas ascula es [94].
La subunidad de la NADPH más abundan e en el ejido endo elial es la
Nox4. El ARN mensaje o de la Nox4 es á p esen e en odas las células de la
pa ed ascula y es signi ica i amen e más abundan e que o as enzimas
NADPH oxidasa [94]. Es a subunidad se encuen a en el núcleo, en las
adhesiones ocales y en las ib as de es és de células del músculo liso
ascula , sin emba go, en las células endo eliales la encon amos en el espacio
pe inuclea , en el e ículo endoplásmico y en el núcleo [94].
La Nox4, jun o con la Nox1 y la Nox2, es á unida a la subunidad
egulado a p22phox. La Nox4 es una enzima cons i u i a y es la esponsable
de la p oducción basal y ela i amen e baja de ROS. Recien emen e se ha
demos ado que la Nox4 ambién es egulada po la p o eína de in e acción con
la polime asa del a 2 (Poldip2 del inglés Polyme ase del a-in e ac ing p o ein 2),
aumen ando su ac i idad. Además puede se egulada po o os es ímulos
como la anslocación a compa imen os de memb ana con balsas lipídicas [95]
y po encialmen e, po la in e acción con GTPasas ales como Rac1 [94, 96]. Sin
emba go, la ac i idad de es a enzima es undamen almen e egulada po sus
ni eles de exp esión [97].
In oducción
35
Figu a 2: Esquema de las dis in as subunidades de la NADPH oxidasa p esen es en el sis ema
ascula . Rep esen ación esquemá ica de la con o mación de dis in as Nox en la memb ana
plasmá ica. A) Nox1, B) Nox2, C) Nox4 y D) Nox5. Se indican las egiones de unión de las
coenzimas, FAD y NADPH. También se indican las dis in as p o eínas ci oplasmá icas
egulado as.
Nox1 Nox2
Poldip2
FAD
NADPH
O
2
O2-
Ca
2+
Ca
2+
FAD
NADPH
Ca
2+
Ca
2+
Ca
2+
O
2
O2-
Rac p47phox
p40phox
p67phox
FAD
NADPH
O
2
O2-
Rac NOX01
NOXA1
O
2
O2-
FAD
NADPH
Nox4 Nox5
: Iso o mas de
la gp91phox
: p22phox
Nox1 Nox2
Poldip2
FAD
NADPH
O
2
O2-
Ca
2+
Ca
2+
FAD
NADPH
Ca
2+
Ca
2+
Ca
2+
O
2
O2-
Rac p47phox
p40phox
p67phox
FAD
NADPH
O
2
O2-
Rac NOX01
NOXA1
O
2
O2-
FAD
NADPH
Nox4 Nox5
Nox1 Nox2
Poldip2
FAD
NADPH
FAD
NADPH
O
2
O2-
O
2
O2-
Ca
2+
Ca
2+
FAD
NADPH
Ca
2+
Ca
2+
Ca
2+
O
2
O2-
Ca
2+
FAD
NADPH
Ca
2+
Ca
2+
Ca
2+
O
2
O2-
O
2
O2-
Rac p47phox
p40phox
p67phox
FAD
NADPH
FAD
NADPH
O
2
O2-
O
2
O2-
Rac NOX01
NOXA1
O
2
O2-
O
2
O2-
FAD
NADPH
FAD
NADPH
Nox4 Nox5
: Iso o mas de
la gp91phox
: p22phox
: Iso o mas de
la gp91phox
: p22phox
In oducción
36
NADPH oxidasa y diabe es
La ac i ación o la exp esión de la NADPH oxidasa es á implicada en el
es és oxida i o asociado a la hipe glicemia y es e e ec o ha sido es udiado en
dis in os modelos celula es. El a amien o de células endo eliales de ena
umbilical (HUVEC, del inglés human umbilical ein endo elial cells) con al as
concen aciones de glucosa inc emen a la exp esión de NADPH oxidasa, los
ni eles de es és oxida i o y la apop osis [98]. La p oducción de ROS y la
exp esión de p22phox y p47phox ue on inc emen adas en células endo eliales
mic o ascula es a adas con al as concen aciones de glucosa [99]. El ARN
pequeño in e e en e de p47phox educe la p oducción de anión supe óxido
inducida po hipe glicemia en células del músculo liso [100]. Pa e de los
e ec os de esis encia al óxido ní ico bajo condiciones de hipe glicemia es án
egulados po la Nox4, como se obse ó pa a la p oli e ación de las células
muscula es lisas [101]. En dis in os modelos animales se ha podido ap ecia el
papel de la NADPH oxidasa en la dis unción endo elial y en la diabe es. Las
subunidades de NADPH oxidasa eguladas po la Rac1, la Nox1 y la Nox2,
es án implicadas en una asodila ación mediada po endo elio ano mal en un
modelo de a as con diabe es ipo 1 [102]. En elación con es e esul ado, los
ec o es de adeno i us exp esando un dominan e nega i o de Rac1 educen la
p oducción de aniones supe óxido y mejo an la elajación ascula en modelos
mu inos de diabe es, demos ando un impo an e papel de Rac1 en la
egulación de la p oducción de ROS [103]. La deleción gené ica de Nox2 se ha
obse ado que ecupe a las espues as angiogénicas en los modelos de
isquemia de los miemb os in e io es en a ones con diabe es melli us ipo 1
[104]. Po o a pa e, los inhibido es de Nox p e inie on la in lamación inducida
po es ep ozo ocina y la o u a de la ba e a sanguínea e inal en a ones
[105].
A ni el de suje os sanos, se ha asociado un polimo ismo gené ico
(C242T) en el gen p22phox con un descenso de la sensibilidad a la insulina
[106].
E ec os del aumen o de ROS
El aumen o de p oducción de ROS con ibuye a la dis unción endo elial
de nume osas o mas pe o la inac i ación o la inhibición de la o mación del
In oducción
37
óxido ní ico es uno de los mecanismos más impo an es [107]. El aumen o del
es és oxida i o lle a a la pé dida de las acciones an i-plaque a ias, an i-
in lama o ias y an ioxidan es del endo elio po la inhibición de la eNOS y de la
p os aciclina sin e asa, que sin e iza la p os aciclina (PGI2), que es un po en e
asodila ado . De es a mane a los ROS es án di ec amen e elacionados con la
dis unción endo elial [108]. La e ahid obiop e ina ambién es ápidamen e
oxidada po los pe oxini i os, que p oceden de la in e acción en e el óxido
ní ico y los aniones supe óxido, con ibuyendo odo es o a la inac i ación e
incluso al desacoplamien o de la eNOS [109]. Los pe oxini i os en al as
concen aciones son ci o óxicos y causan daños en p o eínas, lípidos y ADN
[110]. La p oducción de ROS ambién puede a ec a al me abolismo de los
eicosanoides y p oduci isop os anos di ec amen e po oxidación del ácido
a aquidónico, que son capaces de p o oca la ac i ación de las plaque as y
ac ua como asocons ic o [77].
Las ROS modi ican la LDL, oxidándola, y es a lipop o eína modi icada
con ibuye a la disminución de la p oducción de óxido ní ico, al empeo amien o
de la elajación del endo elio y juega un papel cen al en el p oceso de
a e oscle osis [111-115]. La p oducción de ROS ambién a ec a al c ecimien o
de las células del músculo liso, a la p oli e ación, a la mig ación y a la
senescencia de las células endo eliales, además de p omo e el inc emen o en
la deposición de la ma iz ex acelula [8, 77]. Los ac o es de adhesión y la
in lamación ambién se elacionan con un aumen o de ROS, de al o ma que
al os ni eles de es as especies es á implicados en el aumen o de la sín esis de
la VCAM-1 y la ac i ación de ac o es de ansc ipción elacionados con la
in lamación en las células endo eliales [8].
P o eínas con glicaciones no enzimá icas
Como hemos mos ado, la diabe es p oduce al e aciones en la célula
endo elial lle ándola a su dis unción. P incipalmen e se elacionan los daños
causados po la diabe es en la célula endo elial con 5 mecanismos p incipales,
odos ellos asociados al es ado de hipe glicemia. Es os son: 1) un lujo
aumen ado de glucosa y o os azúca es a a és de la u a me abólica de los
polioles, 2) La ac i ación de la PKC, que como hemos comen ado
an e io men e se ha is o como uno de los mecanismos de las complicaciones

In oducción
38
diabé icas, 3) la sob eac i ación del me abolismo de las hexosaminas, 4) la
o mación de p o eínas glicadas, an o las emp anas, como los p oduc os
inales de glicación a anzada (AGE del inglés ad anced glyca ion end-
p oduc s), el aumen o de su ecep o RAGE y de sus o os ligandos [75].
La u a de los polioles es á basada en una amilia de enzimas
educ asas, que p oducen alcoholes de azúca (polioles) a pa i de
compues os ca bonilos y de NADPH. Una sob eexp esión de la aldosa
educ asa en a ones aumen a la a e oscle osis y la exp esión de los genes que
egulan el glu a ión, un sis ema con cie as p opiedades an ioxidan es. A es o
hab ía que añadi le el uso del NADPH en la u a de los polioles, que es un
sus a o común a la glu a ión educ asa [75].
En cuan o a la sob eac i ación del me abolismo de las hexosaminas, en
es a u a la uc osa 6- os a asa se sepa a de la glucolisis pa a suminis a un
sus a o a la enzima glu amina: uc osa 6- os a asa amido ans e asa (GFAT;
EC 2.6.1.16). Es a enzima modi ica las p o eínas uniendo N-ace ilglucosamina
en se inas o eoninas (O-GlcNac del inglés se ine h eonine O-linked N-
ace ylglucosamine). Es a modi icación es á elacionada con la ac i ación de
p o eína especí ica 1 (Sp1 del inglés Speci ici y P o ein 1), que es un ac o de
ansc ipción elacionado con la exp esión de dos ac o es de c ecimien o
ans o man e (TGF del inglés T ans o ming g ow h ac o ) el α y el β además
de con el PAI-1, p o eínas implicadas en el c ecimien o celula y la coagulación,
espec i amen e. Además, la unión de O-GlcNac en Ak no pe mi e la
ac i ación de la eNOS [75].
Ac ualmen e, el mecanismo más es udiado elacionado con la diabe es y
que ha podido explica la mayo ía de los cambios y las pa ogénesis inducidas
po la hipe glicemia son las p o eínas con glicaciones no enzimá icas
emp anas y/o los AGE. Las glicaciones no enzimá icas consis en en una
se ie de eacciones en los g upos amino lib es de las p o eínas (como po
ejemplo, esiduos de la lisina) con los g upos ca bonilo de los azúca es
aldehídos, como la glucosa acíclica, a a és de una adición nucleo ílica
o mándose de es e modo una aldimina, conocida como base de Schi . Es e
p oduc o emp ano de la glicación aumen a ápidamen e unas pocas ho as
después de la incubación de p o eína y glucosa (Figu a 3).
In oducción
39
La concen ación de las bases de Schi depende de al as
concen aciones de glucosa y se a a de una eacción len a [116]. A a és de
una ca álisis ácido-base, es os esiduos lábiles su en eo denamien os
molecula es secuenciales, llamados eo denamien os de Amado i, pa a o ma
una 1-amino-deoxi uc osa ( uc osamina) es able, la cual puede cicla se a una
es uc u a de anillo. La eacción de glicación sigue una ciné ica de segundo
o den y p incipalmen e depende de la concen ación y del iempo de exposición
a la glucosa. In i o, es os dos ac o es se asladan al g ado y du ación de la
hipe glicemia en la diabe es, p oduciendo una len a e i e e sible glicación de
las p o eínas [117, 118]. De los da os expe imen ales se sabe que la
uc osamina alcanza su equilib io de eacción a las 38 ho as [119]. La
concen ación de uc osamina en el plasma de humanos sanos es de 140 µM
y se inc emen a en e 2 y 3 eces en la diabe es melli us [120].
La albúmina glicada supone el 80% de las p o eínas glicadas
ci culan es y la albúmina modi icada con Amado i es la o ma p edominan e in
i o. En la albúmina in i o, los p incipales esiduos suje os a glicación son
lisinas en las posiciones 525, 439, 281 y 199, siendo la más impo an e la
modi icación en la posición 525 [121]. Al igual que la medida de la can idad de
hemoglobina glicada (HbA1c) en e i oci os, la de e minación de la
concen ación en el sue o de la albúmina glicada e alúa la glicemia de una
mane a e ospec i a, aba cando un pe iodo de en e 2-3 semanas en
humanos [118].
La hemoglobina glicada (HbA1c), es o o p oduc o de Amado i y si e
como ma cado del es ado glicémico du an e el mismo pe iodo mencionado, sin
emba go, se ha encon ado que la albúmina glicada iene además sus p opios
e ec os biológicos elacionados con la ne opa ía diabé ica y o as
complicaciones [118].
Solo una pa e de es os p oduc os de Amado i, que son ela i amen e
es ables, pueden su i un cambio más, o mándose los AGE (Figu a 3). Una
dis inción impo an e en e los p oduc os de Amado i y los AGEs, es la
na u aleza i e e sible de es os úl imos. El es és oxida i o es un elemen o
impo an e en la o mación de los AGEs, acele ando es e p oceso [117, 118].
Aunque exis en nume osos es udios que explican el papel de los e ec os
In oducción
40
biológicos de los AGE en el sis ema ascula [122], hay que ma iza que en
és os no se hace una adecuada sepa ación de los AGEs y de los p oduc os de
Amado i. Teniendo en cuen a que en las p o eínas glicadas del plasma hay
más p oduc os de Amado i que bases de Schi [123] y que solo una pequeña
pa e de los p oduc os de Amado i se eo denan pa a o ma AGEs, po pone
un ejemplo, un 3-8% de las p o eínas sé icas son p oduc os de Amado i en e
a <0.01% de AGEs [124]. Es o quie e deci que pueden ene más p esencia
los posibles e ec os de los Amado i que los de los AGE. In i o sucede lo
mismo: con concen aciones de glucosa en e 5 y 25 mM du an e 10 días, la
can idad de p oduc os de Amado i sob e la albúmina aumen a en un 10%,
mien as que, en las mismas condiciones, no se ap ecia la apa ición de ningún
AGE sob e la albúmina. Solo apa ece ían AGEs en incubaciones más la gas
pe o nunca llegan a ene una concen ación an al a como los p oduc os de
Amado i [125]. Pese a que muchos a ículos desc iben a amien os con AGE,
las p epa aciones de és os es p obable que con engan una concen ación
mayo de p oduc os de Amado i, así que pa e de los e ec os desc i os en es os
es udios pueden es a mediados po es os úl imos y no po los AGE.
Los p oduc os de Amado i pa ece que ienen sus p opios ecep o es.
Es udios con albúmina glicada mos a on a la calnexina [126] y nucleo osmina
[127, 128] como p o eínas de unión especí ica a la uc osamina. De es a
mane a, la albúmina Amado i no compi e con la albúmina-AGE po el RAGE y
puede eje ce sus p opios e ec os [129].
Los e ec os causados po los p oduc os de Amado i se han is o
expe imen almen e con independencia del RAGE. Ha o i e al. obse a on la
ac i ación del NF-kB y de la AP-1 en células del músculo liso ascula a adas
con albúmina con p oduc os de Amado i y ambién con AGE. La ac i ación de
los ac o es de ansc ipción ue inhibida po el RAGE soluble cuando es a
ac i ación e a consecuencia del a amien o con AGE, pe o no ue inhibida en
el caso del a amien o con p oduc os de Amado i [130]. En ca diomioci os de
a a, el a amien o con albúmina modi icada an o con p oduc os de Amado i
como con AGE aumen aba el es és oxida i o y és e solo e a inhibido po los
an icue pos con a el RAGE en los a amien os con AGE, pe o no en los
a amien os con los p oduc os de Amado i [131]. Es os es udios mues an
In oducción
41
cla amen e que los p oduc os de Amado i eje cen unos e ec os
independien emen e de los AGE.
Figu a 3: Esquema de la o mación de los p oduc os de glicación sob e las p o eínas. Fo mación
paso a paso de los p oduc os de glicación, comenzando desde la in e acción de la glucosa con
un g upo amino (NH2-R), pasando po la o mación de los p oduc os de Amado i. Se pueden
dis ingui dos ías de o mación de AGE que pa en del eo denamien o o la deg adación de los
p oduc os de Amado i.
Po odas es as azones, los p oduc os de Amado i, y más
conc e amen e, la albúmina glicada, es una buena candida a pa a se la
causan e de los e ec os de la dis unción endo elial en la diabe es.
Relación de los p oduc os de Amado i con la dis unción endo elial
Además de la albúmina, exis en muchas o a p o eínas abundan es en el
plasma en las que se iden i ica on modi icaciones de Amado i como en la
ans e ina, la α-1-an i ipsina, la α-2-mac oglobulina, la apolipop o eína A-I y
A-II, el ib inógeno y la α-1-glicop o eína ácida, así como o as p o eínas
mode adamen e abundan es [132]. En es udios en pacien es se han asociado
los ni eles de la albúmina Amado i con la dis unción endo elial, y de o ma
independien e, con la ne opa ía y la e inopa ía diabé ica. Se ha encon ado
que la albúmina glicada es aba dos eces aumen ada en pacien es con

Hipó esis y obje i os
Hipó esis y obje i os
51
Hipó esis y Obje i os
Hipó esis
- Las p o eínas glicadas no enzimá icamen e pueden se el p incipal
mecanismo de la dis unción endo elial causada po la diabe es.
- De las p o eínas glicadas, la albúmina con modi icaciones de Amado i,
puede se el p incipal agen e pa a inicia la dis unción endo elial que conduzca
a los p oblemas ascula es diabé icos.
- La albúmina glicada puede inc emen a el es és oxida i o a ni el
ascula .
- La albúmina glicada puede al e a la biodisponibilidad del óxido ní ico
p oceden e del endo elio.
- La albúmina glicada puede al e a la espues a in lama o ia de las
células endo eliales.
Obje i o gene al:
- De e mina si los p oduc os de Amado i (albúmina glicada) pueden
p oduci dis unción endo elial y cuales son los mecanismos implicados.
Obje i os especí icos:
- Medi el e ec o de la albúmina glicada en la p oducción de ROS, an o a
ni el in acelula como ex acelula , en la célula endo elial humana en cul i o.
- Es ablece el papel de las NADPH oxidasas endo eliales en la
p oducción de ROS.
- Analiza los cambios eno ípicos inducidos po la albúmina glicada en
las dis in as subunidades de NAPDH oxidasa endo elial.
- De e mina la ía de señalización ac i ada po la albúmina glicada que
conduce a la p oducción de ROS.
Hipó esis y obje i os
52
- De ini el e ec o de la albúmina glicada sob e la óxido ní ico sin asa
endo elial en cuan o a posibles cambios de exp esión e inducción de
desacoplamien o.
- Cuan i ica la p oducción de moléculas de adhesión y ci ocinas
in lama o ias en la célula endo elial humana en p esencia de albúmina glicada.
Ma e ial y mé odos

Ma e ial y mé odos
55
Ma e ial y mé odos
Cul i o de HUVEC
Las HUVEC ue on aisladas de co dones umbilicales escos de
emba azos lle ados a é mino, donados bajo consen imien o in o mado de las
mad es. Todos los p ocedimien os elacionados con la ob ención, manejo y
eliminación de los co dones y de las células ex aídas de ellos ue on
ap obados po el Comi é de É ica de In es igación Clínica de Galicia (España),
de acue do con la Decla ación de la Asociación Médica Mundial de Helsinki.
Todos los co dones umbilicales que se ecibie on han sido a ados de o ma
anónima, no eniendo ninguna in o mación de los donan es. De o ma
esumida, las enas umbilicales ue on la adas de sang e y llenadas con
colagenasa IA 22 U/mL (Gibco, In i ogen, Ba celona, España) en una solución
amponada con HEPES (HBS del inglés HEPES bu e ed saline) de la siguien e
composición (en mM): NaCl 110,0, KCl 5,0, NaH
2
PO
4
0,5, KH
2
PO
4
0,5, CaCl
2
0,2, MgCl
2
2,0, NaHCO
3
10,0, sal e asódica del ácido
e ilenediamina e aacé ico 0,5 (EDTA del inglés E hylenediamine e aace ic
acid e asodium sal ), ácido 4-(2-hid oxie il)-1-pipe azinee anosul ónico
(HEPES del inglés 4-(2-hyd oxye hyl)-1-pipe azinee hanesul onic acid) 10,0 y
glucosa 10,0 (pH 7,4). Después de 6 minu os de diges ión a 37ºC, las células
endo eliales ue on ecogidas y la adas con medio de cul i o (PAA, Pasching,
Aus ia). A con inuación ue on cen i ugadas a 500 x g du an e 5 minu os,
esuspendidas en medio de c ecimien o endo elial (PAA) suplemen ado con β-
ac o de c ecimien o endo elial (EGF-β) 10 ng/mL (Sigma-Ald ich, Mad id,
España), con hepa ina 10 µg/mL (Mayne Pha ma, Spain), con penicilina 100
U/mL (Labo a o ios No mon, Mad id, España) y con es ep omicina 100 µg/mL
(Labo a o io Reig Jo é, Ba celona, España). Finalmen e, las HUVEC ue on
cul i adas en ascos o placas (Co ning, New Yo k, USA) p e- ecubie as con
gela ina al 0,2% (p/ ) (Sigma-Ald ich) y c ecidas has a con luencia en una
a mós e a sa u ada de humedad con CO
2
al 5% y a 37ºC. Los cul i os
con luen es ue on sepa ados de la placa con ipsina al 0,25% (p/ ) en
solución equilib ada de Hanks (Gibco) con EDTA 1 mM y las células pa a los
expe imen os ue on usadas en e el cua o y el décimo pase.
Ma e ial y mé odos
56
Pa a los expe imen os, las HUVEC pos -con luen es ue on ipsinizadas
y pues as a una concen ación de 30.000 células po cm
2
, con medio endo elial
suplemen ado. Se ealizó una dep i ación de suplemen os de 12 ho as an es
de los expe imen os y las HUVEC quiescen es ue on a adas como se indica
más adelan e. Todas las incubaciones se ealiza on a 37ºC en ambien e
húmedo con CO
2
al 5%.
Ca ac e ización de las células endo eliales
Al ededo de 10.000 HUVEC ob enidas como se desc ibe an e io men e,
ue on c ecidas sob e un po aobje os es é il ecubie o con gela ina al 0,2% y
luego ijadas con una mezcla de ace ona:me anol (1:1) du an e 10 minu os a
empe a u a ambien e. Se bloqueó la ac i idad pe oxidasa en es as
p epa aciones con pe óxido de hid ógeno al 3%, se incubó con an icue po
policlonal de conejo con a el ac o de on Willeb and (Dako Cy oma ion, BD
Biosciences, Mad id, España) o monoclonal de a ón con a el CD31 a una
dilución de 1:10 (Dako Cy oma ion) du an e 30 minu os. La de ección se ealizó
con un sis ema ma cado con bio ina es ep a idina (Dako Cy oma ion)
siguiendo las ins ucciones del ab ican e. Es o es, después de la incubación
con el an icue po p ima io o sin él pa a el con ol nega i o, se incubó con
bio ina du an e 15 minu os y a con inuación con es ep a idina conjugada con
pe oxidasa de ábano du an e 15 minu os. Finalmen e, el sus a o c omógeno
de la pe oxidasa (diamino bencidina) se añadió du an e 10 minu os. An es del
mon aje, las mues as ue on sume gidas 3 segundos en hema oxilina de Ha is
pa a con a inción. Los co espondien es con oles nega i os de cada mues a
ue on p epa ados sus i uyendo el an icue po p ima io po solución de ampón
os a o. Las p epa aciones ue on obse adas y o og a iadas con un
mic oscopio óp ico (Leica Mic osys ems GMBH, We zla , Alemania).
Medida de la p oli e ación celula
Es e expe imen o pe mi e de e mina la ac i idad me abólica de las
células en unción de una eacción colo imé ica. Pa a ello se u iliza el MTT (3-
[4,5-dime il iazol-2-1]-2,5-di enil e azolio b omu o; Sigma-Ald ich), una sal de
colo ama illo que la célula me aboliza median e acción de la deshid ogenasas
mi ocond iales. La me abolización de es a sal supone la o mación de unos
c is ales denominados o mazán que p esen an un g upo diazónico que
Ma e ial y mé odos
57
abso be la luz a 550 nm. La me abolización de MTT a o mazán solo a a ene
luga en las células i as, y supone un cambio de colo de ama illo a iole a. La
solubilización de los c is ales de o mazán esul a á en una solución colo eada
que puede se analizada median e un espec o o óme o. Un inc emen o en el
núme o de células i as supone un aumen o en la ac i idad o al de las
deshid ogenasas mi ocond iales. Es e aumen o se co elaciona di ec amen e
con la can idad de o mazán iole a o mado.
Así, 10.000 HUVEC po pocillo semb adas en placa de 96 pocillos se
dep i a on du an e 12 ho as. T anscu ido es e iempo, las células se a a on
du an e 12 ho as más con dis in as concen aciones de albúmina glicada o sin
glica (25-800 µg/mL). Al inaliza el iempo de a amien o se añadie on 10 µL
de la sal MTT po 100 µL de a amien o a cada uno de los pocillos, de o ma
que la concen ación inal de la sal ue de 0,5 mg/ml. Se dejó eacciona den o
del incubado a 37 ºC du an e 4 ho as. En ese momen o se añadie on 100 µl
de agen e solubilizan e, el cual con iene dodecil sul a o de sodio (SDS, del
inglés sodium dodecyl sul a e) al 10% (p/ ) en una solución de HCl 0,01 M), y
se man u o en el incubado du an e oda la noche. Al día siguien e, se
de e mina on los alo es de abso bancia median e la lec u a en un lec o de
mic oplacas (Ve saMax Mic opla e Reade , Molecula De ices, Sunny ale,
Cali o nia, USA) a una longi ud de onda de 550 nm.
Medida de ROS en HUVEC
La p oducción de ROS ex acelula e in acelula de las HUVEC ue
medida usando dos mé odos di e en es. La o mación de aniones supe óxido
en el espacio ex acelula ue de e minada po el mé odo de la educción del
ci oc omo c. 10.000 HUVEC po pocillo de mic oplacas de 96, dep i adas
du an e 12 ho as de suplemen os y se a a on con albúmina sé ica humana
(HSA del inglés human se um albumin) o albúmina sé ica humana glicada
(gHSA del inglés glyca ed human se um albumin) a dis in as concen aciones
en e 6 y 800 µg/mL. Además se ealiza on a amien os combinados con
inhibido es como con la apocinina 100 µM, el BAY11-7082 2µM, el SP600125
20µM, el LY-294002 1,5 µM, el SL327 10 µM o el me il és e de L-N
G
-
Ni oa ginina (L-NAME, del inglés L-N
G
-Ni oa ginine me hyl es e ) 100 µM
du an e dis in os iempos, es ando es os comp endidos en e 4 y 12 ho as. En
Ma e ial y mé odos
64
lisadas con un ampón A compues o po HEPES 10 mM, EDTA 1 mM, KCl 10
mM, di io ei ol (DTT) 1mM y an ip o easas (Roche) a un pH de 7,9. Al ex ac o
celula se le añadió NP-40 0,5% ( / ) y se incubó du an e 10 minu os.
Seguidamen e ue agi ado en un ó ex du an e 15 segundos y cada mues a
cen i ugada du an e 5 minu os a 200 x g y 4 ºC pa a sepa a las células no
lisadas. El sob enadan e se ecupe ó, se cen i ugó de nue o du an e 15
minu os a 1500 x g y a 4 ºC. Así se ob ienen las p o eínas ci oplasmá icas en el
sob enadan e y las p o eínas nuclea es en el pelle . El sob enadan e se sepa a
a o os ubos y se lisa on los núcleos con el ampón A an e io men e desc i o
añadiéndole glice ol 20% y KCl 0,4 M. Se incubó du an e 30 minu os con
agi ación pe iódica y luego se cen i ugan du an e 15 minu os a 13.000 x g y 4
ºC. En el sob enadan e se ob u ie on las p o eínas nuclea es.
Es udio de las acciones de p o eínas del núcleo y el ci oplasma
median e Wes e n Blo
El análisis de la composición de las acciones p o eicas p oceden es del
núcleo y el ci oplasma se ealizó median e Wes e n blo . Las acciones
subcelula es se sepa a on po elec o o esis en gel de ac ilamida
desna u alizan e (SDS-PAGE, del inglés sodium dodecyl sul a e polyac ylamide
gel elec opho esis) al 10% y las p o eínas así sepa adas se ans i ie on a una
memb ana de poli inilideno di luo u o (PVDF, del inglés Poly inylidene
di luo ide) ambién po elec o o esis du an e 45 minu os a in ensidad cons an e
(280 mA). Las memb anas de PVDF ue on bloqueadas du an e 1 ho a a
empe a u a ambien e con leche desna ada en pol o al 5% (p/ ) en ampón
salino con ween 20 (TBS-T del inglés T is-bu e ed saline Tween-20)
con eniendo T is-HCl 20 mM (pH 7,6), NaCl 150 mM y Tween-20 al 0,1%. T as
el bloqueo de los pun os ac i os inespecí icos de la memb ana se incubó és a
con an icue pos pa a la subunidad p65 de NF-kB (San ac uz Bio echnology) en
una dilución 1:500 en ampón de bloqueo du an e oda la noche. Después, se
incuba on las memb anas con el an icue po secunda io ap opiado, conjugado
con pe oxidasa. Las p o eínas inmuno eac i as ue on isualizadas usando un
sis ema de de ección de quimioluminiscencia mejo ada (Pie ce), y ue on
cuan i icadas densi ome icamen e usando el so wa e ImageJ (U.S. Na ional
Ins i u es o Heal h, Be hesda, Ma yland, USA). Los esul ados se exp esa on
de acue do a la siguien e ó mula de densidades óp icas de las bandas

Ma e ial y mé odos
65
p oceden es de cada a amien o y sub acción celula :
(núcleo/ci oplasma)gHSA/(núcleo/ci oplasma)HSA. Se comp obó que las
acciones nuclea es no se encon aban con aminadas con ci oplasma,
midiendo la p esencia de deshid ogenasa 3- os a o glice aldéhido (GAPDH del
inglés Glyce aldehyde 3-phospha e dehyd ogenase) con un an icue po con a
es a p o eína 1:1000 (San aC uz Bio echnology).
Cuan i icación de p o eína en medio de cul i o median e ensayo po
inmunoabso ción ligado a enzimas.
Pa a cuan i ica la concen ación de las dis in as ci ocinas in lama o ias
en el medio de cul i o se ealizó un ensayo po inmunoabso ción ligado a
enzimas (ELISA, del inglés Enzyme-Linked ImmunoSo ben Assay). Se a a on
las HUVEC con HSA o gHSA 25 µg/mL, con BAY11-7082 2 µM, SP600125 20
µM, LY-294002 1,5 µM, SL327 10 µM, apocinina 100 µM o plumbagin 5 µM
du an e 2, 4, 6, 8 ó 12 ho as. T as el iempo de a amien o se ecogie on los
medios de cul i o pa a ealiza el ELISA pa a la MCP-1 (Bende MedSys ems
GMBH, Viena, Aus ia). El ELISA de MCP-1 iene los pocillos de la mic oplaca
ecubie os con an icue pos an i-MCP-1 humano. Sob e es os se incuba on los
medios de cul i o de las células a adas. A con inuación, se incuba on con
an icue pos monoclonales an i-MCP-1 conjugados con pe oxidasa de ábano
que se unie on al MCP-1 que quedó unido a los an icue pos adso bidos en el
pocillo. Finalmen e, se añadió el sus a o de la pe oxidasa y la eacción dio un
cambio de colo p opo cional a la can idad de MCP-1 p esen e en los medios
de cul i o. La eacción se pa ó añadiendo ácido y se midió la abso bancia a
450 nm (Ve saMax Mic opla e Reade , Molecula De ices).
Fá macos y eac i os
Los siguien es á macos ue on comp ados a Sigma-Ald ich: el EGF-β, la
gela ina de piel bo ina, la HSA, la gHSA, la apocinina, el BAY11-7082, el
SP600125, el LY-294002, el SL327, la L-NAME, el ci oc omo c, la SOD, el DPI,
la NADH, la NADPH y el MTT. La cH
2
-DCF-DA ue comp ada a In i ogen.
El BAY11-7082 (50 mM), el SP600125 (50 mM), el LY-294002 (1,5 mM),
el SL327 (10 mM), y el cH
2
-DCF-DA (10 mM) ue on disuel os inicialmen e en
dime il sul óxido (DMSO) pu o a las concen aciones indicadas. Es as
Ma e ial y mé odos
66
soluciones ue on man enidas a -20ºC como soluciones s ock a pa i de las
cuales se p epa a on en el momen o de lso expe imen os las diluciones inales
u ilizando en HBS ico en calcio. El DPI (10 mM) ue disuel o en una mezcla de
DMSO:H2O (1:1) y después diluido en HBS ico en calcio. El EGF-β (100
µg/mL) ue disuel o en PBS con albúmina sé ica bo ina 0,1% (p/ ) y después
diluido en HBS ico en calcio. La gela ina 0,2% (p/ ) pa a ecub i las
supe icies de cul i o ue disuel a en agua. La HSA (80 mg/mL), la gHSA (80
mg/mL) y el MTT (5 mg/mL) ue on disuel os en PBS. Después, la HSA y la
gHSA ue on diluidas en HBS ico en calcio. La apocinina, el ci oc omo c, la
SOD, la NADH y la NADPH ue on disuel os en HBS ico en calcio. El L-NAME
ue disuel o en agua des ilada y después en HBS ico en calcio.
Las concen aciones inales de DMSO nunca excedie on el 0,1% ( / ) en
los expe imen os, y se ealiza on los con oles adecuados pa a medi los
e ec os del ehículo. El equipamien o, los medios y eac i os especí icos o
an icue pos empleados en las dis in as écnicas se indican en las secciones
co espondien es. Todos los demás compues os usados en los expe imen os y
en la p epa ación de las soluciones de abajo ue on de la mejo calidad
come cialmen e disponible.
Análisis es adís ico
Los esul ados se exp esa on como medias ± e o es ánda de la media
(e.e.m.). Las compa aciones en e dos g upos ue on analizadas po el es de
dos colas. Las compa aciones múl iples ue on analizadas po un análisis de la
a ianza (ANOVA) seguido de un es Tukey. Las di e encias signi ica i as
ue on conside adas con p < 0,05.
Resul ados
Resul ados
69
Resul ados
Ca ac e ización del modelo celula endo elial
Realizamos la ex acción de las HUVEC según se indica en la sección
me odológica y las semb amos en una supe icie de cul i o de 19 cm
2
.
Realizamos pases consecu i os con ipsina doblando la supe icie has a
alcanza una supe icie equi alen e a 4 ascos de 75 cm
2
. Realizamos odos
los es udios y a amien os a pa i de las HUVEC desde el pase 4º has a el
10º. A pa i del pase 10º, las células comenzaban a pe de su eno ipo y la
capacidad de eplicación, con lo que no nos daban la iabilidad necesa ia en el
modelo. Cada cul i o p oceden e de un co dón se indi idualizó con un núme o
que pe mi i ía anonimiza la mues a a pa i de es e pun o. Los expe imen os
se ealiza on con al menos es cul i os di e en es. Realizamos análisis
inmunoci oquímico a es as células pa a dos ma cado es del eno ipo endo elial,
el ac o de on Willeb and y el CD31. Las células ue on posi i as pa a ambos
ac o es (Figu a 4).
A con inuación es udiamos qué subunidades de NADPH oxidasa es án
exp esadas en nues as células. Es udios an e io es desc ibie on que las
HUVEC exp esan p incipalmen e la Nox2 y la Nox4, es ando es a úl ima
subunidad mucho más exp esada [182]. Es udiamos la exp esión de las
dis in as subunidades de la NADPH en HUVEC median e eacción de la
cadena de polime asa en ansc ipción e e sa (RT-PCR del inglés Re e se
ansc ip ion polyme ase chain eac ion). Nues os esul ados indica on que las
subunidades que más se exp esaban son la Nox4 y la p22phox (Figu a 5). Pa a
la Nox5 encon amos mucha meno exp esión (Figu a 5). A con inuación,
ealizamos un análisis inmunoci oquímico pa a e si es e modelo celula
exp esaba la p o eína pa a Nox4. Como se puede e en la Figu a 5, es e
análisis e eló la p esencia de Nox4 en la o alidad de las HUVEC en cul i o
siguiendo un pa ón g anula ci oplasmá ico y pe inuclea .

Resul ados
70
Figu a 4: Imágenes ep esen a i as de inciones inmunoci oquímicas pa a la exp esión de
ma cado es del eno ipo endo elial en HUVEC, el ac o de on Willeb and ( WF) y el CD31. Se
semb a on 10.000 HUVEC sob e un po aobje os es é il ecubie o con gela ina al 0,2% y luego
ijadas. Se incuba on con an icue pos an i- ac o de on Willeb and ( WF) y an i-CD31. Se
con a- iñe on con hema oxilina y o og a iadas en un mic oscopio óp ico. Se indican los dis in os
aumen os a los que ue on omadas las o og a ías (40x y 20x espec i amen e). Los con oles
nega i os es án si uados en la columna de la izquie da, mien as la inmunoci oquímicas con los
an icue pos p ima ios es án si uada a la de echa.
Finalmen e, analizamos la iabilidad de los a amien os que íbamos a
ealiza con HSA o gHSA sob e las células en cul i o. Pa a es o ealizamos
expe imen os de p oli e ación en p esencia de MTT, en los que exis e una
elación di ec a en a la ac i idad de las educ asas de la mi ocond ia y la
in ensidad del colo pú pu a de la sal esul an e. Es udiamos dis in as
concen aciones de HSA y gHSA (25-800 µg/mL) du an e 12 ho as y
obse amos que no cambiaban signi ica i amen e la iabilidad de nues as
células (Figu a 6).
Resul ados
71
Figu a 5: Exp esión de las subunidades de NADPH oxidasa en HUVEC. a) P oduc os de
ampli icación po RT-PCR pa a dis in as subunidades de NADPH oxidasa, Nox 1-5, p22phox, y
ambién de la GAPDH pa iendo de ARN de HUVEC. Se ealiza on las dis in as RT-PCR en las
condiciones ap opiadas y se ealizó una elec o o esis en gel de aga osa con los p oduc os de
ampli icación. El ma cado indica el núme o de bases que con iene cada p oduc o de
ampli icación. Se incluyó un con ol nega i o de la ansc ipción e e sa (-). b) Imágenes
ep esen a i as de inmunoci oquímicas pa a la exp esión de la p o eína Nox4. Se semb a on
al ededo de 10.000 HUVEC sob e un po aobje os es é il ecubie o con gela ina al 0,2% y luego
ijadas. Se incuba on con an icue pos an i-Nox4 y se con a- iñe on con hema oxilina pa a se
o og a iadas en un mic oscopio óp ico (aumen o 40x). Los con oles nega i os es án si uados a
la izquie da, mien as que la inmunoci oquímicas con los an icue pos p ima ios es án si uados a
la de echa.
Resul ados
72
Figu a 6: Medida de la p oli e ación celula median e el ensayo con MTT en HUVEC a adas con
di e en es concen aciones de HSA y gHSA en medio dep i ado de suplemen os. Se semb a on
10.000 HUVEC po pocillo en placas de 96, se dep i a on de suplemen os du an e 12 ho as y a
con inuación se a a on con dis in as concen aciones de HSA y gHSA (25-800 µg/mL) du an e
12 ho as. Se man u ie on los suplemen os de algunos pocillos de HUVEC du an e la dep i ación
y el a amien o, como con ol posi i o de la p oli e ación. Las columnas ep esen an la
abso bancia medida a 550 nm, exp esada como de media ± e.e.m. (ba as e icales) de al
menos es expe imen os independien es. * p < 0,05 del con ol posi i o en e al es o de los
a amien os.
0,0
0,1
0,2
0,3
0,4
0,5
*
µg/mL
800
400
200
100
5025
800
400
100 200
50
25
Abso bancia (550nm)
con ol con suplemen os
HSA
gHSA
Resul ados
73
P oducción de ROS en HUVEC a adas con albúmina glicada
An es de ealiza los expe imen os con la gHSA, es anda izamos las
condiciones pa a ealiza la medida de la educción del ci oc omo c en HUVEC.
La educción de ci oc omo c basal, sin el es ímulo de NADH o NADPH ue casi
nula, mien as que en p esencia de es as coenzimas se aumen ó
sus ancialmen e la p oducción de ROS. La capacidad pa a educi el ci oc omo
c pa a los dos sus a os no ue la misma, en p esencia de NADH las HUVEC
p oduje on más ROS que con el NADPH (6,53 x 10
-4
± 0,81 x 10
-4
Abs
550nm
/min
pa a NADH en e a 5,4 x 10
-4
± 0,56 x Abs
550nm
/min pa a el NADPH). La
p oducción de aniones supe óxido ambién ue di e en e pa a los dos sus a os,
siendo ambién más al a pa a el NADH que pa a el NADPH (52,1 ± 6,3 s. 43,4
± 4,5 O
2-
mM · min
-1
· 10.000 células
-1
, pa a NADH y NADPH, espec i amen e).
Después de es as obse aciones, los siguien es expe imen os se ealiza on
siemp e con NADH (100 µM), en luga de con NADPH, como coenzima pa a la
p oducción de ROS.
Realizamos es udios sob e la espues a de las HUVEC a dis in as
concen aciones y iempos con gHSA en la p oducción de ROS ex acelula
median e el mé odo de educción del ci oc omo c. Después de 12 ho as de
dep i ación, a amos 10.000 HUVEC po pocillo en placas de 96, con
di e en es concen aciones de HSA o gHSA (6-200 µg/mL) du an e 4, 6 ó 12
ho as pa a de e mina la mejo concen ación y iempo de a amien o pa a se
usado en el es udio.
El a amien o con gHSA a dis in as concen aciones comp endidas en e
25 y 200 µg/mL du an e 12 ho as indujo de mane a signi ica i a un inc emen o
de la p oducción de ROS ex acelula con espec o a la misma concen ación
de HSA (Figu a 7; p.ej. 6,58 x 10
-4
± 0,72 x 10
-4
Abs
550nm
/min, n = 18 y 7,11 x
10
-4
± 0,78 x 10
-4
Abs
550nm
/min, n=18 pa a HSA y gHSA 25 µg/mL,
espec i amen e; p < 0,05). So p enden emen e, obse amos el mayo
inc emen o de la educción del ci oc omo c con la concen ación de 25 µg/mL
(1,08 ± 0,03 pa a la azón gHSA/HSA, p < 0,05 con espec o al e ec o de HSA,
n = 18). La p oducción de ROS inducida po gHSA aumen ó de una mane a
dependien e de la concen ación has a los 25 µg/mL. A pa i de es a
concen ación, el inc emen o en la p oducción de ROS se edujo g adualmen e
Resul ados
80
Es udiamos el e ec o de la gHSA en la p oducción de ROS in acelula es.
Después de una dep i ación de 12 ho as, a amos 10.000 HUVEC po pocillo
de una placa de 96 con 25 µg/mL de HSA o gHSA du an e 4 ó 6 ho as.
Después del a amien o, medimos la luo escencia del cH
2
-DCF-DA oxidado
du an e 2 ho as. Obse amos un aumen o es adís icamen e signi ica i o en la
oxidación del cH
2
-DCF-DA en p esencia de gHSA compa ado con HSA
después de 4 ho as pe o no después de 6 ho as de a amien o (Tabla 4).
Es os esul ados concue dan con los ob enidos al medi ROS ex acelula es.
La p oducción de ROS medida bajo es as condiciones ue apenas
inhibida en p esencia de la SOD (100 U/mL) e inhibida pa cialmen e po el DPI
(60µM, Tabla 4). Es os da os indican dos cues iones impo an es: p ime o, la
SOD p obablemen e ue incapaz de c uza la memb ana plasmá ica y en
consecuencia no consiguió inhibi la p oducción de ROS in acelula . Segundo,
la inhibición po el DPI sugie e que la p oducción in acelula de ROS p o iene
de la NADPH oxidasa.
Tabla 4: P oducción in acelula de ROS medida con cH
2
-DCF-DA en
HUVEC incubadas con 25 µg/mL de HSA o gHSA y con SOD o DPI du an e 4 ó
6 ho as.
HSA
25 µg/mL
gHSA
25 µg/mL
T a SOD
100 U/mL
DPI
60µM
SOD
100 U/mL
DPI
60µM
4 h
100 98,77 ± 5.5 83,64 ± 3,73#
109,43 ± 4,29**
94,42 ± 6,63 77,35 ± 7,60#
6 h
100 93,42 ± 8,08 83,08 ± 6,03#
103,46 ± 6,92 94,31 ± 8,40 85,74 ± 8,74#
Albúmina sé ica humana (HSA); Albúmina sé ica humana glicada (gHSA); Supe óxido dismu asa
(SOD); Di enilen yodonio (DPI). Los da os se ep esen an como po cen aje de la a iación de
unidades ela i as de luo escencia po minu o pa a el HSA ± el e.e.m. * p < 0,05 compa ando
gHSA con el a amien o de HSA. # p < 0,05 compa ando el a amien o con y sin DPI.

Resul ados
81
Exp esión de las subunidades de NADPH oxidasa en HUVEC a adas con
albúmina glicada
Como imos, en las HUVEC el a amien o con gHSA 25 µg/mL
inc emen ó la p oducción ex acelula e in acelula de ROS. Las ROS
p oducidas e an aniones supe óxido y g acias a la inhibición con DPI, sabemos
que és os son p oducidos po la NADPH oxidasa. De modo que, una de las
posibles causas de es e aumen o de la p oducción de ROS es un cambio en la
exp esión de las subunidades de NAPDH oxidasa con el a amien o de gHSA.
De ahí que, es udiá amos la exp esión de las p incipales subunidades de
NAPDH oxidasa en el endo elio humano, Nox4 y p22phox, median e
ansc ipción e e sa y PCR cuan i a i a (RT-qPCR).
Así, cuan i icamos los ni eles ela i os de ARN mensaje o de Nox4 y
p22phox con espec o al gen de la β-ac ina. Los cul i os de HUVEC ue on
dep i ados de suplemen os du an e 12 ho as, siendo a ados en onces con
HSA y gHSA (25 µg/mL) du an e 4, 6 ó 12 ho as. El a amien o de 4 ho as con
gHSA (25 µg/mL) indujo una exp esión aumen ada de Nox4 y p22phox en
compa ación con el a amien o con HSA (25 µg/mL) (Figu a 11) (1,31 ± 0,08
s. 1,16 ± 0,09 de cambio ela i o pa a Nox4 espec o al con ol, con gHSA y
HSA, espec i amen e, p < 0,05, n = 5; 1,25 ± 0,05 s. 1,04 ± 0,07 de cambio
ela i o pa a p22phox espec o al con ol, con gHSA y HSA, espec i amen e, p
< 0,05, n = 4). Po el con a io, los mismos a amien os a 6 y 12 ho as no
inducen ningún cambio es adís icamen e signi ica i o (Figu a 11).
So p enden emen e, a pesa del hecho de que los e ec os en la
exp esión de Nox4 po los a amien os con HSA y gHSA du an e 6 ho as son
indis inguibles en e ellos (1,21 ± 0,20 s. 1,24 ± 0,28 cambio ela i o pa a
Nox4 con espec o al con ol pa a HSA y gHSA, espec i amen e, p = 0,45, n =
4), mues an una mayo exp esión con espec o al con ol sin a a , aunque
es os aumen os no son es adís icamen e signi ica i os. Sucede lo mismo pa a
el p22phox. No hubo di e encias de exp esión en e los a amien os de HSA y
gHSA a las 6 ho as, pe o los ni eles de exp esión de Nox4 y p22phox se
encon a on ele ados espec o al con ol sin a amien o (1,23 ± 0,20 s. 1,20 ±
0,32 cambio ela i o pa a p22phox con espec o al con ol pa a HSA y gHSA,
espec i amen e, p = 0,90, n = 4).
Resul ados
82
Después de 12 ho as de a amien o con HSA y gHSA, los ni eles de
ARN mensaje o pa a Nox4 y p22phox ue on iguales a los cul i os con oles
(cul i os sin a amien os con HSA o gHSA), indicando que el e ec o emp ano
de es imulación de gHSA o HSA en la exp esión de los genes iene un e ec o
limi ado en el iempo.
Figu a 11: Cuan i icación ela i a de los ni eles de exp esión de ARN mensaje o de las
subunidades de NADPH oxidasa median e RT-qPCR. Se semb a on 300.000 HUVEC po pocillo
en placa de 6, se dep i a on de suplemen os du an e 12 ho as y a con inuación se a a on con
HSA o gHSA 25 µg/mL du an e 4, 6 ó 12 ho as. Las columnas ep esen an el cambio ela i o de
la exp esión de ARN mensaje o pa a Nox4 y p22phox ela i izado en e al gen cons i u i o β-
ac ina y con espec o al a amien o con HSA. Se exp esan en alo es de media ± e.e.m. (ba as
e icales) de al menos es expe imen os di e en es. * p < 0,05 con espec o a los alo es de la
HSA.
0,0
0,2
0,4
0,6
0,8
1,0
1,2
1,4
1,6 *
*
6 ho as 12 ho as
4 ho as
Cambio ela i o del
ARN mensaje o
Nox4 HSA 25µg/mL
p22phox gHSA 25µg/mL
Resul ados
83
Figu a 12: Ni eles de p o eína de Nox4 medido po inmuno luo escencia en HUVEC a adas con
HSA o gHSA 25 µg/mL du an e 4 ó 6 ho as. Se semb a on 10.000 HUVEC en un po aobje os
es é il ecubie o con gela ina al 0,2%, se dep i a on de suplemen os du an e 12 ho as y a
con inuación, se a a on con HSA y gHSA 25 µg/mL du an e 4 ó 6 ho as. a) Imágenes
ep esen a i as del ma caje po inmuno luo escencia indi ec a usando un an icue po con a Nox4
y an icue po secunda io conjugado con FITC ( e de) y TO-PRO-3
®
pa a eñi los núcleos ( ojo).
Se mues an los a amien os con HSA (a la izquie da) o con gHSA (a la de echa) 25 µg/mL. b)
Cuan i icación de la in ensidad de luo escencia ep esen ada como la azón de gHSA/HSA a las
4 ó 6 ho as. Las columnas ep esen an alo es de media ± e.e.m. (ba as e icales) de al
menos es expe imen os independien es. * p < 0,05 con espec o al con ol (HSA).
0,8
1,0
1,2
1,4
b)
*
6 hou s
4 hou s
Exp esión de p o eína de Nox4
(gHSA/HSA)
Resul ados
84
A con inuación, es udiamos el e ec o del a amien o con gHSA en la
exp esión a ni el p o eico de Nox4. Después de 12 ho as de dep i ación de
suplemen os, a amos las HUVEC quiescen es con gHSA y HSA (25 µg/mL)
du an e 4 ó 6 ho as. Las p o eínas de Nox4 ue on cuan i icadas po
inmuno luo escencia en es as células. Obse amos un inc emen o signi ica i o
en la exp esión de Nox4 en las células a adas con gHSA compa ado con las
células a adas con HSA después de 4 ho as de a amien o (Figu a 12). Es os
da os indica on que el a amien o de 4 ho as con 25 µg/mL de gHSA aumen ó
los ni eles de p o eína Nox4 en HUVEC compa ado con el a amien o con
HSA. Sin emba go, a las 6 ho as de a amien o, los ni eles de exp esión de
Nox4 en HUVEC a adas con gHSA y HSA no ue on es adís icamen e
di e en es (Figu a 12). Es o esul ó cohe en e con los da os de exp esión
génica mos ados más a iba.
Ru as implicadas en el aumen o de ROS po albúmina glicada
Ya desc ibimos que obse amos un inc emen o en la p oducción de ROS
en las HUVEC a adas con gHSA. Es e aumen o, además se puede explica
po un inc emen o en la exp esión de las subunidades de Nox4 y p22phox de la
NADPH oxidasa, ya que es a enzima iene una ac i idad cons i u i a y
p incipalmen e es á egulada po sus ni eles de exp esión.
En es e pun o, nos p opusimos es udia la u a de señalización ac i ada
po gHSA que puede es a implicada en el inc emen o de la p oducción de
ROS. Pa a ello, es udiamos la educción del ci oc omo c en HUVEC po el
a amien o con HSA o gHSA y en p esencia de inhibido es del NF-kB (BAY11-
7082 2µM), la AP-1 (SP600125 20µM), PI3K (LY294002 1,5µM) y la MEK 1/2
(SL327 10µM).
Así, a amos las HUVEC con HSA y gHSA 25 µg/mL du an e 4 ho as en
p esencia o ausencia de es os inhibido es. Los inhibido es ue on p eincubados
30 minu os an es del a amien o y es u ie on ambién p esen es du an e las 4
ho as pos e io es de a amien o con HSA ó gHSA. En es as condiciones, la
gHSA inc emen ó la p oducción de ROS signi ica i amen e compa ado con
HSA (1,09 ± 0,04 pa a la azón gHSA/HSA,
p
< 0,05,
n
= 10) (Figu a 13). Sin
emba go, ninguno de los inhibido es u o un e ec o signi ica i o en es a
p oducción inc emen ada de ROS excep o el inhibido de la AP-1, SP600125.
Resul ados
85
Es e inhibido inc emen ó la p oducción de ROS en el a amien o de HSA con
SP600125 en compa ación con el HSA solo (1,15 ± 0,06 pa a la azón
HSA+SP600125/HSA,
p
< 0,05,
n
= 5) (Figu a 13). Sin emba go, la p esencia
de SP600125 en el a amien o con gHSA no p o ocó un cambio signi ica i o
compa ado con el gHSA solo (1,09 ± 0,04 pa a la azón gHSA/HSA
s.
1,04 ±
0,07 pa a la azón gHSA+SP600125/HSA,
p
> 0,05,
n
= 5) (Figu a 13).
Es os esul ados mos a on un inc emen o en la p oducción ex acelula
de ROS en p esencia del inhibido de AP-1, SP600125, con el a amien o con
HSA 25 µg/mL pe o la inhibición de la AP-1 no p o ocó un cambio signi ica i o
en el a amien o con gHSA 25 µg/mL.
Además de es os e ec os del SP600125, el a amien o con BAY11-
7082 o LY294002 disminuye on la p oducción de ROS, aunque es e descenso
no ue signi ica i o pa a ninguno de los inhibido es (1,03 ± 0,03 pa a la azón
HSA+BAY11-7082/HSA con espec o al e ec o de la HSA,
p
> 0,05,
n
=5; 0,96
± 0,08 pa a la azón gHSA+BAY11-7082/HSA
s.
1,10 ± 0,04 pa a la azón
gHSA/HSA,
p
> 0,05,
n
= 5; 1,06 ± 0,07 pa a la azón HSA+ LY294002/HSA
con espec o al e ec o de la HSA,
p
> 0,05,
n
=5; 0,96 ± 0,10 pa a la azón
gHSA+ LY294002/HSA
s.
109,83 ± 3.81 pa a la azón gHSA/HSA,
p
> 0,05,
n
= 5).
En esumen, de las u as de señalización analizadas, solamen e la AP-1
pa ece con ola pa e de la p oducción de ROS en la célula endo elial humana.
Mien as que la inhibición de la AP-1 con SP600125 no pa ece modi ica la
p oducción de ROS inducida po gHSA, lo que sí p o oca es un inc emen o en
la p oducción ex acelula de ROS en HUVEC a ada con HSA.

Resul ados
86
Figu a 13: Medida de la p oducción ex acelula de ROS en HUVEC, en p esencia de dis in os
inhibido es median e el mé odo de educción del ci oc omo c. Se semb a on 10.000 HUVEC po
pocillo en placas de 96, se dep i a on de suplemen os du an e 12 ho as y a con inuación se
a a on con HSA o gHSA 25 µg/mL con los inhibido es BAY11-7082 2µM (BAY), SP600125
20µM (SP), LY294002 1,5µM (LY) y SL327 10µM (SL) du an e 4 ho as. Los inhibido es se
p eincuba on ambién 30 minu os an es del a amien o. Las columnas ep esen an la azón
a amien o/HSA, exp esados como alo es de media ± e.e.m. (ba as e icales) de al menos
es expe imen os independien es. * p < 0,05 con espec o al a amien o con HSA.
0,5
0,6
0,7
0,8
0,9
1,0
1,1
1,2
*
*
SL 10µM
LY 1.5µM
SP 20µM
BAY 2µM
**
P oducción ex acelula de ROS
( azón T a amien o/HSA)
HSA 25µg/mL
gHSA 25µg/mL
Resul ados
87
Es udio de los ac o es de ansc ipción implicados en el cambio de
exp esión de las subunidades de NAPDH oxidasa en HUVEC
Es udiamos dos ac o es de ansc ipción, el NF-kB y la AP-1, po que ya
se desc ibió p e iamen e que pueden es a elacionados con un cambio de
exp esión de Nox4 y p22phox. Medimos la exp esión génica, median e RT-
PCR en iempo eal, de Nox4 y p22phox en HUVEC es imuladas con HSA o
gHSA 25 µg/mL du an e 4 ho as. En una se ie de expe imen os incluimos en
los a amien os los inhibido es del NF-kB (BAY11-7082, 2µM) o de la AP-1
(SP600125, 20 µM). La gHSA aumen ó de nue o los ni eles de exp esión de
Nox4 signi ica i amen e compa ado con el HSA (1,25 ± 0,11 de cambio ela i o
de Nox4 con espec o a HSA pa a gHSA,
p
< 0,05,
n
= 13; Figu a 14a) y ocu ió
lo mismo pa a p22phox (1,12 ± 0,05 cambio ela i o de p22phox con espec o a
HSA pa a gHSA,
p
< 0,05,
n
= 10; Figu a 14b).
El inhibido de NF-kB, BAY11-7082, sup imió de o ma signi ica i a el
inc emen o de la exp esión de Nox4 inducido po gHSA (1,25 ± 0,10 de cambio
ela i o de Nox 4 con espec o a HSA pa a gHSA
s.
0,83 ± 0,10 de cambio
ela i o de Nox 4 con espec o a HSA pa a gHSA+BAY11-7082,
p
< 0,05,
n
= 5;
Figu a 14a). Sin emba go, es e inhibido , aunque pudo educi la exp esión de
p22phox, es a educción no esul ó es adís icamen e signi ica i a (1,12 ± 0,05
de cambio ela i o de p22phox con espec o a HSA pa a gHSA
s.
0,91 ± 0,16
de cambio ela i o de p22phox con espec o a HSA pa a gHSA+BAY11-7082,
p
> 0,05,
n
= 4; Figu a 14b).
Resul ados
88
Figu a 14: Cuan i icación de los ni eles de exp esión de ARN mensaje o de las subunidades de
NADPH oxidasa a) Nox4 y b) p22phox median e RT-qPCR. Se semb a on 300.000 HUVEC po
pocillo en placas de 6, se dep i a on de suplemen os du an e 12 ho as y a con inuación se
a a on con HSA o gHSA 25 µg/mL y con los inhibido es BAY11-7082 2µM (BAY) o SP600125
20 µM (SP) du an e 4 ho as. Los inhibido es se p eincuba on ambién 30 minu os an es del
0,0
0,5
1,0
1,5
2,0
2,5
3,0
3,5
a)
*
#
SP 20µM
BAY 2µM
#
#
Cambio ela i o del
ARN mensaje o de Nox4
HSA 25µg/ml
gHSA 25µg/ml
0,6
0,8
1,0
1,2
b)
SP 20µM
BAY 2µM
*
**
Cambio p opo cional
del ARNm de p22phox
HSA 25µg/mL
gHSA 25µg/mL
Resul ados
89
a amien o. Las columnas ep esen an el cambio ela i o de la exp esión de ARN mensaje o
pa a cada gen (Nox4 o p22phox) ela i izado en e al gen cons i u i o β-ac ina y con espec o al
a amien o con HSA. Se exp esan los alo es como media ± e.e.m. (ba as e icales) de al
menos es expe imen os di e en es. * p < 0,05 con espec o a los alo es de la HSA; # p < 0,05
con espec o a los alo es de la gHSA.
Po o a pa e, el a amien o con el inhibido de la AP-1, SP600125
inc emen a signi ica i amen e la exp esión de Nox4, independien emen e de si
es as células es aban a adas con HSA (2,16 ± 0,32 de cambio ela i o de
Nox4 con espec o a HSA pa a HSA+SP600125,
p
< 0,05,
n
= 6; Figu a 14a) o
gHSA 25 µg/mL (1,25 ± 0,12 de cambio ela i o de Nox4 con espec o a HSA
pa a gHSA
s.
2,39 ± 0,51 de cambio ela i o de Nox4 con espec o a HSA
pa a gHSA+SP600125,
p
< 0,05,
n
= 6; Figu a 14a).
Del mismo modo, el a amien o con el inhibido de AP-1 inc emen ó
signi ica i amen e la exp esión de p22phox en p esencia de la HSA (1,14 ±
0,07 de cambio ela i o de p22phox con espec o a HSA pa a HSA+SP600125,
p
< 0,05,
n
= 4; Figu a 14b). Sin emba go, la adicción de SP600125 al
a amien o con gHSA p odujo un inc emen o en la exp esión de p22phox que
no ue es adís icamen e signi ica i o espec o al gHSA solo (1,12 ± 0,06 de
cambio ela i o de p22phox con espec o a HSA pa a gHSA
s.
1,12 ± 0,07 de
cambio ela i o de p22phox con espec o a HSA pa a gHSA+SP600125,
p
<
0,05,
n
=4; Figu a 14b).
Pues o que obse amos una exp esión inc emen ada de Nox4 con el
a amien o de gHSA 25 µg/mL y es e e ec o ue e e ido po el a amien o
con BAY11-7082 2µM, decidimos es udia el e ec o de la gHSA 25µg/mL
du an e 4 ho as en la ac i ación de NF-kB. Pa a ello ealizamos un
Wes e n
blo
con las acciones celula es pa a obse a la p esencia de la subunidad de
NF-kB, p65, en el ci oplasma o en el núcleo, midiendo de es a mane a su ni el
de ac i ación (Figu a 15). De es a o ma, obse amos un inc emen o
signi ica i o de más de dos eces de la subunidad p65 en el núcleo as el
a amien o con gHSA du an e 4 ho as espec o a la HSA (2,29 ± 0,23 la azón
de (núcleo/ci oplasma) gHSA/(núcleo/ci oplasma) HSA,
p
< 0,01,
n
= 3; Figu a
15). Es e aumen o de la subunidad p65 en el núcleo nos indicó un aumen o en
la ac i ación de NF-kB.
Resul ados
96
célula endo elial en espues a a la gHSA p esen an su mayo in ensidad a las 4
ho as de a amien o en nues as condiciones expe imen ales.
Sin emba go, el a amien o con gHSA 25 µg/mL no p odujo ningún
aumen o signi ica i o en la exp esión del ARN mensaje o de la MCP-1 en
ninguno de los a amien os, aunque man u o una endencia ascenden e a
medida que aumen aba la du ación del a amien o.
Pa a es udia el ni el de MCP-1 en el medio de cul i o, dep i amos las
HUVEC du an e 12 ho as y a con inuación las a amos con HSA o gHSA 25
µg/mL du an e 2, 4, 6, 8 ó 12 ho as, pa a medi median e un ELISA la
concen ación de ci ocina en los sob enadan es de es os cul i os.
En es os expe imen os, los ni eles de exp esión de la MCP-1 as el
a amien o con gHSA no se ie on modi icados espec o al a amien o con
HSA. Además, no hubo di e encias es adís icamen e signi ica i as en e los
a amien os con gHSA en los dis in os iempos es udiados. Es o indica que la
p oducción de la MCP-1 po pa e de las HUVEC no se e a ec ada po el
a amien o con gHSA y es a si uación no cambia en el ango de iempos de
a amien o es udiados (2-12 ho as).
De o ma pa alela ambién es udiamos como a ec aban a la p oducción
de la MCP-1 los inhibido es del NF-kB (BAY11-7082 2 µM), de la AP-1
(SP125600 20 µM), de la PI3K (LY-294002 1,5 µM) y de la MEK1/2 (SL327 10
µM) en combinación con la gHSA o la HSA 25 µg/mL du an e el a amien o de
4 ho as. Los esul ados de es os expe imen os mos a on que las HUVEC
p esen an una p oducción basal de MCP-1 de 273 ± 32 ng/mL (en p esencia de
HSA; 10.000 HUVEC po pocillo de placa de 96). Es a p oducción no se io
a ec ada po el a amien o con gHSA, ni po la inhibición de la PI3K, ni de la
MEK 1/2 (inhibido es LY-294002 y SL327, espec i amen e). Tampoco se io
a ec ada po el ehículo (dilución ap opiada de DMSO) de los á macos
empleados (Figu a 19). Sin emba go, obse amos di e encias signi ica i as
cuando medimos la concen ación de MCP-1 en los a amien os con HSA 25
µg/mL y BAY11-7082 2 µM o gHSA 25 µg/mL y SP600125 20 µM (0,53 ± 0,16
pa a la azón HSA+BAY/HSA con espec o al e ec o de HSA;
p
< 0,05;
n
= 4; y
0,62 ± 0,17 pa a la azón gHSA+SP/HSA
s
.1,07 ± 0,06;
p
< 0,05;
n
= 4; Figu a
19).

Resul ados
97
Figu a 18: Cuan i icación de los ni eles de exp esión de ARN mensaje o de ICAM-1 o VCAM-
1 median e RT-qPCR. Se semb a on 300.000 HUVEC po pocillo en placas de 6, se
dep i a on de suplemen os du an e 12 ho as y a con inuación se a a on con HSA o gHSA 25
µg/mL du an e 4, 6 o 12 ho as. Las columnas ep esen an el cambio ela i o de la exp esión
de ARN mensaje o pa a la eNOS ela i izado en e al gen cons i u i o, β-ac ina, con espec o
al a amien o con HSA, exp esado en alo es de media ± e.e.m. (ba as e icales) de al
menos es expe imen os di e en es. * p < 0,05 con espec o a los alo es de la HSA sola con el
mismo iempo de a amien o. # p < 0,05 con espec o a gHSA 25 µg/mL du an e 4 ho as.
0,0
0,5
1,0
1,5
a)
6 ho as 8 ho as
4 ho as
*
Cambio ela i o del
ARN mensaje o del ICAM-1
HSA 25 µg/mL
gHSA 25 µg/mL
0,0
0,5
1,0
1,5
2,0
2,5
b)
#
#
8 ho as
6 ho as
4 ho as
*
Cambio ela i o del
ARN mensaje o del VCAM-1
HSA 25µg/mL
gHSA 25µg/mL
Resul ados
98
Figu a 19: Cuan i icación de los ni eles de exp esión de p o eína de MCP-1 median e ELISA. Se
semb a on 10.000 HUVEC po pocillo en placas de 96, se dep i a on de suplemen os du an e 12
ho as y a con inuación a a on con HSA o gHSA 25 µg/mL con los inhibido es BAY11-7082 2µM
(BAY), SP600125 20µM (SP), LY294002 1,5µM (LY) y SL327 10µM (SL) du an e 4 ho as. Las
columnas ep esen an el cambio ela i o de la exp esión de p o eína pa a MCP-1 con espec o a
la azón del a amien o/HSA, exp esado en alo es de media ± e.e.m. (ba as e icales) de al
menos es expe imen os di e en es. * p < 0,05 con espec o a los alo es del a amien o sin
inhibido .
Es os esul ados indican que ni la ac i ación de las cinasas PI3K y MEK
1/2 ni, po lo an o, las u as po ellas ac i adas, no in luyen en la p oducción de
la MCP-1 po pa e de las HUVEC. Po el con a io, los ac o es de
ansc ipción NF-kB y AP-1, pa ecen es a implicadas en la exp esión de la
MCP-1 en es as células y además, algo muy impo an e, la HSA y la gHSA
pa ecen pode modula de o ma di e en e la exp esión génica a a és de
es as dos ías.
0,0
0,5
1,0
SL 10µM
LY 1,5µMSP 20µMBAY 2µM
DMSO
*
*
Can idad de MCP-1
(Razón a amien o/HSA)
HSA µg/mL
gHSA µg/mL
Discusión
Discusión
101
Discusión
Resumen
Los esul ados de es e es udio explican pa e de los mecanismos po los
que la albúmina glicada, un p oduc o de Amado i, a ec a al es és oxida i o y al
es ado in lama o io de la célula endo elial y en consecuencia, puede se causa
de la dis unción endo elial elacionada con la diabe es.
Nos plan eamos un es udio sob e un modelo de células endo eliales que
ob u imos de la ena del co dón umbilical. Es ás células exp esa on las
subunidades de la NADPH oxidasa, Nox4 y p22phox además de ma cado es
p opios de es e ipo celula . Sob e es e modelo, las dis in as concen aciones
de albúmina glicada u ilizadas no a ec a on a la iabilidad celula .
Las HUVEC ue on a adas con dis in as concen aciones de gHSA (6-
200 µg/mL), lo que indujo un aumen o de p oducción de ROS de una mane a
dependien e de la concen ación en e 6 y 25 µg/mL, descendiendo
g adualmen e la p oducción de ROS a concen aciones más al as. El
inc emen o de p oducción de ROS inducido po gHSA ambién mos ó un
in e esan e compo amien o empo al. Alcanzó un máximo después de 4 ho as
de a amien o y disminuyó g adualmen e has a las 12 ho as de a amien o,
aunque man eniéndose du an e odo es e iempo po encima de los ni eles del
a amien o con el con ol no glicado (HSA). También, obse amos que la
p oducción de ROS ue dependien e del es ado de con luencia celula ,
sugi iendo que la Nox4 es á implicada en es e aumen o de ROS. A ni el
in acelula , la p oducción de ROS ambién ue es imulada después de 4 ho as
de a amien o con gHSA 25 µg/mL.
El inc emen o en la p oducción de ROS pod ía debe se a que las
HUVEC después de 4 ho as de a amien o con gHSA mos a on un inc emen o
en la exp esión de las p incipales subunidades de la NADPH oxidasa en la
célula endo elial humana, la Nox4 y la p22phox, obse ado an o a ni el del
ARN mensaje o como de la p o eína.
Pa a analiza el mecanismo molecula que pe mi e es a sob eexp esión
inducida po gHSA es udiamos el papel de dos impo an es ac o es de

Discusión
102
ansc ipción y dos cascadas de os o ilación mediadas po la PI3K o la
MEK1/2. El a amien o con gHSA 25 µg/mL du an e 4 ho as aumen ó la
anslocación de la subunidad del NF-kB, p65, lo que implica una ac i ación del
ac o de ansc ipción po pa e de la p o eína glicada. Además, la inhibición
del NF-kB e i ió la exp esión aumen ada de la Nox4 inducida po gHSA.
Ambos esul ados sugi ie on que la inducción de la NADPH oxidasa endo elial
po pa e de la gHSA es á mediada p incipalmen e po el NF-kB.
Po o a pa e, obse amos un inc emen o en la p oducción de ROS en
el a amien o con HSA 25 µg/mL cuando es aba ambién p esen e el inhibido
de la AP-1, SP600125, e ec o que no imos en el a amien o con gHSA 25
µg/mL. Además, pudimos medi un inc emen o en la exp esión de Nox4 y
p22phox en a amien os con SP600125, independien emen e de la p esencia
de HSA o gHSA en p esencia del inhibido de AP-1.
Pa a explica el dis in o compo amien o de la HSA y la gHSA en
p esencia de SP600125 en la p oducción de ROS en HUVEC, es udiamos un
elemen o undamen al en la ges ión del es és oxida i o a ni el ascula , la
eNOS. El a amien o con gHSA en HUVEC no cambió los ni eles de la eNOS,
pe o la p esencia de SP600125 disminuyó los ni eles de exp esión de es e
enzima independien emen e del a amien o con HSA o gHSA. Es o sugi ió que
el a amien o con gHSA desacoplaba a la eNOS, lo que pod ía explica la
di e encia en la p oducción ex acelula de ROS inducida po la HSA y la gHSA,
con o sin SP600125.
La inhibición de las cascadas de os o ilación mediadas po la PI3K o la
MEK 1/2 no u o e ec o en la p oducción de ROS de las HUVEC y po lo an o,
las impo an es u as de señalización in acelula en las que es as enzimas
pa icipan, no pa ecen es a implicadas en la egulación de la p oducción de
ROS inducida po gHSA en el endo elio.
Po o a pa e, en las HUVEC, gHSA indujo la exp esión de ICAM-1 y
VCAM-1 y iene un papel egulado en la exp esión de MCP-1. Es os da os
demos a on que la gHSA puede se un modulado impo an e de la ac i idad
in lama o ia endo elial y que es a modulación puede eje ce se de o ma
indi ec a, a a és de la inducción de espues as oxida i as.
Discusión
103
En conclusión, el inc emen o de ROS inducido po gHSA en las HUVEC
es la combinación de al menos dos elemen os, el aumen o de la p oducción de
ROS po el aumen o de exp esión de NADPH oxidasa mediado po NF-kB y el
desacoplamien o de la eNOS. Hay que des aca , además el impo an e papel
que eje ce el AP-1 sob e la exp esión de las subunidades de NADPH oxidasa y
la eNOS. La modulación de la ac i idad oxida i a po pa e de la gHSA puede
juga ambién un papel ele an e en la espues a in lama o ia de las células
endo eliales.
Es udio del modelo endo elial
Las HUVEC es el modelo que hemos escogido pa a es e es udio po su
ácil ob ención y man enimien o en condiciones de cul i o. Es un modelo de
célula endo elial ampliamen e conocido y u ilizado, aunque sea un modelo que
no puede ep esen a odas las p opiedades de los dis in os ipos de células
endo eliales. Exis en más de 100,000 publicaciones sob e células endo eliales
y de es as, más de 10,000 son abajos ealizados con HUVEC [184].
Comp obamos que las células ob enidas de la diges ión enzimá ica e an
células endo eliales po la p esencia de dos de los ma cado es que pueden
ca ac e iza las, el ac o de on Willeb and y el CD31 [185, 186]. Encon amos
que las células poseían un ma caje inmunohis oquímico posi i o pa a es os dos
ac o es y así pudimos conclui que nues o cul i o e an células endo eliales,
única y exclusi amen e. También se u ilizan o os ma cado es como el CD-34,
el CD54 o la ICAM-1, el CD62E o la E-selec ina, el CD106 o la VCAM-1, que
son más o menos especí icos pa a las células endo eliales y exp esadas a
menudo en HUVEC después de es imula las [184].
Hemos u ilizado células de pases comp endidos en e el 4º y el 10º.
Comenzamos en el 4º po que nos pe mi ía ene el núme o necesa io de
células pa a los expe imen os, en una can idad su icien e pa a su
man enimien o y po que después de 3 pases nos asegu amos que el cul i o es
o almen e homogéneo. No u ilizamos cul i os a pa i del pase 10, pa a e i a
que las células pe die an su eno ipo y la capacidad de eplicación. Se ha
documen ado que a medida que se ealizan pases de es ás células puede
acele a se su senescencia, p o oca apop osis o disminui la exp esión de
Discusión
104
cie as p o eínas como la enzima con e ido a de la angio ensina (ECA) o
disminui la sín esis de moléculas como las de p os aciclinas [187, 188].
Se ha desc i o que las células endo eliales exp esan la gp91phox (Nox2),
la Nox4, la Nox5 y la p22phox [189]. También exp esan dis in as subunidades
egulado as de la ac i idad de la NADPH oxidasa , la p47phox y la p67phox
[189]. Las células endo eliales solo exp esan la Nox1 median e la es imulación
con lujo in e mi en e [190]. La p incipal subunidad de NADPH oxidasa en el
endo elio es la Nox4 [182]. Noso os hemos es udiado la p esencia de las
p incipales subunidades de NADPH oxidasa en nues o modelo median e RT-
PCR, de mane a que comp obamos la exp esión del ARN mensaje o de las
Nox1-5 y de la p22phox de mane a cuali a i a. Encon amos una al a exp esión
de dos subunidades p incipalmen e, la Nox4 y la p22phox y ambién
obse amos la p esencia de Nox5, pe o en meno medida. Adicionalmen e, no
solo obse amos la exp esión de la Nox4 de o ma cuali a i a po la p esencia
de su ARN mensaje o, ambién comp obamos que las células exp esaban la
p o eína de Nox4 median e inmunoci oquímica. Así, nues o modelo de célula
endo elial es adecuado pa a es udia los e ec os de las p o eínas glicadas no
enzimá icamen e sob e el p incipal p oduc o de ROS en el sis ema ascula ,
las NADPH oxidasas.
Se ha desc i o que los p oduc os de Amado i pueden p oduci apop osis
o cambios en el c ecimien o celula . Po ello, noso os quisimos comp oba es e
hecho ealizando expe imen os de p oli e ación en las HUVEC a adas con
concen aciones c ecien es de gHSA (25-800 µg/mL) du an e 12 ho as. Aunque
en nues os expe imen os obse amos que no había ningún cambio en la
iabilidad de las HUVEC po e ec o de la gHSA, hay dos es udios que
con adicen es e esul ado. Po un lado, se obse ó que en células endo eliales
de i adas de células p ogeni o as de la sang e en p esencia de al as
concen aciones de glucosa y albúmina glicada (400 µg/mL) du an e 72 ho as,
aumen aba la p oli e ación celula pe o ambién la ac i idad de la caspasa-3, un
ma cado de apop osis [191]. Po o o lado, en el abajo ealizado po Amo e e
al. obse a on apop osis en células endo eliales a pa i de unas
concen aciones de albúmina glicada de 1,2 mg/mL du an e 12 ho as [159].
Noso os no encon amos ninguna di e encia en la iabilidad o el me abolismo
de las HUVEC en p esencia de gHSA en e 25 y 800µg/mL. Nues o ango de
Discusión
105
concen aciones comp ende la usada po Wang e al. (400 µg/mL) [191] en el
p ime abajo desc i o, pe o las condiciones de su es udio son muy di e en es a
las nues as. Ellos examina on los cambios en la iabilidad de las células con
400µg/mL de gHSA, en p esencia de al a glucosa du an e 72 ho as, lo que
supone un a amien o mucho más ag esi o y p olongado que los nues os.
En de ini i a, después de ealizadas las medidas y comp obaciones
desc i as, podemos deci que las HUVEC que ob u imos, man enidas en las
condiciones de cul i o de alladas en la co espondien e sección, son un buen
modelo de célula endo elial pa a el es udio del papel del es és oxida i o en
elación a las NADPH oxidasas y su iabilidad no se e al e ada po la
albúmina glicada.
P oducción de ROS en HUVEC a adas con albúmina glicada
Nues os esul ados demos a on que las células endo eliales a adas
con gHSA mos aban una mayo p oducción de ROS que las a adas con HSA.
En es e es udio, el mayo inc emen o en la p oducción de ROS en HUVEC
a adas con gHSA en compa ación con HSA sucedió con una concen ación
de 25 µg/mL y es a concen ación ambién ob u o los mejo es esul ados a
cualquie a de los iempos de a amien o u ilizados. En compa ación con o os
es udios, 25 µg/mL es una concen ación mucho meno que la usada po los
o os au o es. Sin emba go, es as disc epancias quizás se puedan explica po
las di e encias me odológicas.
Higai e al [170] de ec ó la p oducción de ROS con azul de ni o e azolio
después de 30 minu os de a amien o con 500 µg/mL de gHSA. La
concen ación que noso os usamos p o iene de un es udio de concen ación-
espues a usando el mé odo de educción del ci oc omo c, mien as Higai e al.
escogie on en e di e en es concen aciones según su e ec o en el cambio de
exp esión de E-selec ina. En o o es udio, midie on la p oducción de ROS en
ca diomioci os con cH
2
-DCF-DA, y su concen ación más e ec i a de gBSA en
ese caso ue de 400 µg/mL [131].
La concen ación e ec i a en los expe imen os es muy baja en elación a
los ni eles que se encuen an en los pacien es. La concen ación de albúmina
en sang e es de 4g/dL, y se ha publicado que en suje os sanos los ni eles de
Discusión
112
endo elial dependien e de la NADH y del es ado de con luencia. Las NADPH
oxidasas es án compues as po dos subunidades unidas a memb ana, la
gp91phox o sus homólogos y la p22phox, o mando un complejo denominado
ci oc omo b
558
. La subunidad de Nox4 es el homólogo de gp91phox que se
exp esa con más ecuencia en células endo eliales y es a subunidad es á
implicada en la p oducción de supe óxido en es as células [182, 220, 221]. La
exp esión de la p o eína p22phox en células endo eliales ue demos ada po
Jones e al. [222], y es a subunidad es c í ica pa a la unción co ec a del
complejo enzimá ico [223].
El inc emen o en la exp esión del ARN mensaje o de Nox4 se
co elacionó con un inc emen o en los ni eles de su p o eína, demos ados po
inmuno luo escencia. De mane a in e esan e, la HSA u o unos e ec os sob e
la exp esión de Nox4 pa ecidos a la gHSA a las 6 ho as. Sin emba go, a pesa
de los ni eles pa ecidos en la exp esión de Nox4 con los a amien os de HSA
y gHSA después de 6 ho as, solo se obse a on aumen os signi ica i os en la
p oducción ex acelula de ROS en el a amien o con la gHSA y no en los de la
HSA. Es os esul ados sugie en, po un lado, un aumen o en la p oducción de
ROS inducido po la gHSA debido a un aumen o de la exp esión de la Nox4.
Po o o lado, en la ac i ación a las 6 ho as se p oduce una ac i ación
p olongada de la NADPH oxidasa en p esencia de gHSA que no ocu e con la
HSA, o bien es o a iso o ma de la NADPH oxidasa di e en e de la Nox4 la que
pasa a ene un papel ele an e.
En el caso de la subunidad Nox4, el cambio de los ni eles de exp esión
iene un g an e ec o en su ac i idad como obse ó el g upo de Se ande e al
[224]. Únicamen e po la ans ección con el gen de Nox4 en células HEK293,
que no exp esan o iginalmen e Nox4, se inc emen ó la p oducción de ROS de
o ma cons i u i a [225]. En es e es udio ans ec a on conjun amen e la Nox4
con las subunidades egulado as NOXO1, NOXA1, p47, p67 y ac1,
obse ando que ninguna de es as subunidades aumen ó la p oducción de ROS
po Nox4. Sin emba go, en células mesangiales la angio ensina II indujo la
p oducción de ROS po la Nox4 de una mane a dependien e de Rac1 [226].
Sólo se conocen dos p o eínas que pueden egula la unción de Nox4, la
p22phox y la poldip2. En es e es udio obse amos que el aumen o de los

Discusión
113
ni eles de la Nox4 ue acompañado po un aumen o de los ni eles de la
p22phox. P e iamen e ya se había obse ado que en expe imen os de
ans ección conjun a de la Nox4 y la p22phox demos aban la elación de
in e dependencia en e ambas subunidades [225, 227]. Es os au o es
comp oba on cómo la p22phox colocaliza con la Nox4 y se encuen an unidas
a a és de la his idina 115 de la Nox4, siendo necesa ia la unión pa a la
o mación de ROS. La ans ección po sepa ado de es as dos subunidades en
células que no exp esaban las subunidades NADPH oxidasa no p odujo ROS,
sin emba go, al ans ec a las dos subunidades conjun amen e aumen ó la
p oducción de ROS [225, 227]. Es o signi ica que la subunidad p22phox es
undamen al pa a el uncionamien o de la Nox4 y como hemos is o en
nues os esul ados, el inc emen o de la exp esión de las dos subunidades
lle a al aumen o de la p oducción de ROS.
La elación en e la Poldip2 y la Nox4 es bas an e ecien e [228].
U iliza on la pa e c e minal de la p22phox, la egión donde se unen las
p o eínas egulado as, pa a encon a la elación de la Poldip2 con es e
complejo. Así, obse a on que la Poldip2 colocalizaba con la p22phox y la
Nox4. No sé sabe a a és de que mecanismo la Poldip2 egula la ac i idad de
la Nox4, pe o se piensa que puede da es abilidad al complejo Nox4-p22phox.
Se ha desc i o que la subunidad de Nox4 se localiza en adhesiones
ocales, en el núcleo y en el e ículo endoplásmico [94]. En nues os
expe imen os no uimos capaces de dis ingui ninguna localización pa icula .
Po el con a io, median e expe imen os de inmuno luo escencia obse amos
una dis ibución más bien ubicua po odo el ci oplasma. En e e encia a es o,
hay que ene en cuen a que noso os ijamos las células con una mezcla de
me anol y ace ona. Es e mé odo de ijación conse a la in eg idad an igénica de
las p o eínas y la es uc u a de las memb anas. Sin emba go, iene un ue e
e ec o deshid a an e en las mues as y es o puede deslocaliza los
componen es ci osólicos. Puede se en onces, que se deslocalice la Nox4
si uada en esículas en el ci oplasma.
Ru as implicadas en el aumen o de ROS po albúmina glicada
Nox4 es una p o eína con un uncionamien o cons i u i o y se conoce
muy poco sob e como es á egulada. Como ya hemos comen ado, además de
Discusión
114
po los cambios de exp esión ambién es á egulada po dos p o eínas, la
p22phox y la poldip2. Aunque se ha is o que puede se ac i ada de mane a
aguda, como po ejemplo, po los ácidos g asos poliinsa u ados, aumen ando
la p oducción de ROS a las 4 ho as sin al e aciones en los ni eles de la Nox4 y
la p22phox, siendo e e ido el e ec o con el silenciamien o de la subunidad de
Nox4 [229]. También se ha is o que la insulina aumen a la p oducción de ROS
en 5 minu os [230], y los lipopolisacá idos ac i an Nox4 a a és del ecep o
oll like en 30 minu os [231].
Aunque no se conocen los mecanismos a a és de los cuales se egula
la ac i idad de la Nox4, se ha is o que puede ac i a se po anslocación a
compa imen os de la memb ana como las balsas lipídicas [95] e incluso pod ía
in e acciona con GTPasas como Rac1 [96]. Sin emba go, p incipalmen e se
piensa que el con ol de la p oducción de ROS po la Nox4 es po la
modi icación de sus ni eles de exp esión [97].
Pese a no conoce se cuales son las u as o mecanismos que pueden
ac i a a la Nox4, sabemos que la p esencia de albúmina glicada puede lle a a
la ac i ación de dis in as u as de señalización como PI3k-Ak , MEK1/2-ERK1/2
y PKC.
Pese a que noso os no obse amos un cambio signi ica i o en la
p oducción de ROS inducida po gHSA cuando inhibimos la PI3K con
LY294002, hay di e sos es udios que obse a on la ac i ación de PI3K po la
gHSA. En HUVEC a adas con albúmina glicada se ha is o aumen ada la
exp esión de E-selec ina y es e aumen o ue le emen e educido con la
inhibición de PI3K, pe o ue ue emen e educido en p esencia del inhibido de
PKB/Ak [170]. Además, en es e es udio obse a on que la p oducción de ROS
es aba elacionada con el aumen o de exp esión de la E-selec ina.
Hay dos es udios que mues an esul ados que no co esponden con los
desc i os an e io men e. En células del epi elio pigmen a io e inal, el
a amien o con gHSA aumen ó la exp esión de VEGF pe o sin ac i a ni PI3K
ni Ak [232] y po o o lado, en células del músculo esquelé ico, el a amien o
con gHSA disminuyó la ac i ación de PI3K po la insulina y ambién disminuyó
la ac i idad de PKB [198]. Aunque el es udio en HUVEC haya is o que PI3K
pa icipa en la egulación del aumen o de exp esión de E-selec ina inducido po
Discusión
115
gHSA y que en es e aumen o es én implicadas las NADPH oxidasas, no se
demos ó que PI3K u ie a algún con ol sob e es a p oducción de ROS.
Po o o lado, cuando inhibimos la MEK 1/2, la cinasa que ac i a a la
ERK 1/2, no obse amos ningún e ec o signi ica i o sob e el aumen o de
p oducción de ROS inducido po la gHSA. Hay a ios es udios que mues an
una ac i ación de ERK 1/2 inducida po la gHSA en dis in os ipos celula es.
En células del músculo liso ascula , el a amien o con albúmina glicada
aumen ó la p oli e ación ac i ando ERK1/2 y es o lo obse a on median e la
inhibición de MEK 1 [165]. En células del epi elio pigmen ado de la e ina
a adas con gHSA, se obse ó un aumen o en la sec eción de VEGF, IL-8 y
MCP-1 ambién a a és de la ac i ación de ERK 1/2 [232, 233]. En células
simila es a monoci os MonoMac6 disminuyó la ac i ación de NF-kB inducida
po gHSA con la inhibición de MEK 1 [234] y en mac ó agos RAW, la
combinación en e gHSA y ni eles al os de glucosa ac i ó ERK y es a
ac i ación lle ó al aumen o de TGF
β
y al aumen o del es és oxida i o,
obse ado midiendo los TBARS [152]. gHSA disminuyó la p oli e ación y
aumen ó la p oducción de ib onec ina en células mesangiales mien a que, la
inhibición de MEK e i ió es os e ec os [235]. En células de la mic oglia
e inales, la albúmina glicada ac i ó ERK y es a ac i ación pa icipa en el
aumen o de la sín esis de TNF-
α
[236]. Es os es udios nos mues an cómo la
gHSA puede aumen a la ac i ación de ERK 1/2, e incluso egula el aumen o
de es és oxida i o, pe o no se ha obse ado que egule di ec amen e la
ac i ación de la NADPH oxidasa en los dis in os ipos celula es.
Noso os no es udiamos la posible egulación de la ac i idad de PKC po
la gHSA. Se sabe que la PKC ac i a y aumen a la exp esión de la NADPH
oxidasa [76, 237]. Se ha elacionado la ac i ación de PKC con cambios de
exp esión de Nox4, pe o a iempos la gos (48 ho as) [238], y en nues os
esul ados imos el aumen o de exp esión de Nox4 a 4 ho as de a amien o.
Aún así, el a amien o con gHSA puede lle a a la ac i ación o a e ec os
egulados po la PKC en a ios modelos celula es. Se ha obse ado es a
ac i ación en p esencia de gHSA en células mesangiales [239], células
endo eliales del glomé ulo [240], células del músculo liso ascula [165], del
epi elio pigmen a io de la e ina [233], en la línea celula monocí ica MonoMac 6
[153, 234] y en células del músculo esquelé ico [198]. Al egula la exp esión
Discusión
116
de Nox4 a iempos la gos, la PKC no end ía in luencia en los cambios de
exp esión en a amien os de 4 ho as.
Fac o es de ansc ipción implicados en la exp esión de las subunidades
de NAPDH oxidasa
La gHSA, a a és de la ac i ación de las u as mencionadas en el
apa ado an e io , lle a a la egulación de de e minados ac o es de
ansc ipción génica como el NF-kB [152, 153, 233, 234], el ac o inducible po
hipoxia-1, (HIF-1 del inglés
Hypoxia-inducible ac o -1
)[232], el Elk-1 [130, 164],
la AP-1 [130, 153, 164] y el p o eína homóloga al C/EBP (CHOP del inglés
C/EBP-homologous p o ein
) [130, 164] en dis in os modelos celula es. Es os
ac o es de ansc ipción pueden egula la exp esión de la subunidad de la
NADPH oxidasa, Nox4, o la exp esión de su p o eína egulado a, p22phox.
Los p incipales ac o es de ansc ipción elacionados con los e ec os de
las p o eínas glicadas en la exp esión de genes son el NF-kB y la AP-1. Dos
subunidades de la NADPH oxidasa, la gp91phox y la p47phox, son eguladas
po el NF-kB [74, 172]. Las p o eínas glicadas ambién se han elacionado con
la ac i ación del NF-kB [131, 152, 164, 173]. Incluso an o la AP-1 como el NF-
kB ue on asociados con la egulación de la exp esión de p22phox [174, 175].
Además, la AP-1 ue elacionada con la ac i idad del p omo o de la p67phox,
una de las subunidades ci oplásmicas egulado as de algunas NADPH
oxidasas [176], y a ios es udios analiza on la elación en e las p o eínas
glicadas y la ac i ación de la AP-1 [130, 153, 178].
Nues os esul ados han mos ado un aumen o de la exp esión de Nox4
en p esencia de gHSA a las 4 ho as y ambién un aumen o de la ac i ación del
NF-kB inducido po la gHSA a es e iempo. Además, pudimos e e i el
aumen o de Nox4 inducido po la gHSA con la inhibición a macológica del NF-
kB. Un es udio an e io ealizado po Manea e al. desc ibió que el NF-kB
egula la exp esión de Nox4 en células del músculo liso ascula [241]. A
di e encia de noso os, es os au o es obse a on una egulación de la Nox4
mediada po el inhibido de NF-kB a las 24 ho as, pe o no obse a on ningún
cambio a las 4 ho as. En cuan o al papel del NF-kB sob e la p22phox, aunque
en nues os expe imen os no obse amos ningún cambio signi ica i o de
egulación de la p22phox a a és del NF-kB, o os au o es elaciona on es e
Discusión
117
ac o con la egulación de la exp esión de p22phox en células del músculo liso
ascula [174].
La AP-1 demos ó egula la exp esión de las subunidades de la NADPH
oxidasa. Cuando inhibimos el ac o de ansc ipción AP-1, obse amos un
inc emen o en la exp esión de las subunidades Nox4 y p22phox.
Independien emen e de si a ábamos las HUVEC con HSA o con gHSA,
siemp e que inhibíamos el AP-1 aumen aba la exp esión de la Nox4. Sin
emba go, en el caso de la exp esión de p22phox no ocu ía es o. Cuando
inhibíamos la AP-1 en p esencia de la HSA, la exp esión de p22phox
aumen aba de mane a signi ica i a en compa ación con el a amien o con HSA
solo. En el caso del a amien o con gHSA la p esencia o la ausencia de la
inhibición de AP-1 no a ec aba al inc emen o causado po la gHSA en la
subunidad p22phox. Con a iamen e a nues os esul ados, los es udios
an e io es ie on que e a necesa ia la ac i ación de la AP-1 pa a modi ica los
ni eles de exp esión de las subunidades de la NADPH oxidasa. Manea e al.
obse a on el papel de la AP-1 en el aumen o de exp esión de Nox4 y p22phox
inducido po el TNF-
α
en células del músculo liso ascula es aó icas [175] AP-
1 ambién se ía necesa io pa a la exp esión de subunidades egulado as de la
NADPH oxidasa, como obse a on Gauss e al. mos ando una modulación del
ARN mensaje o de la p67phox po pa e de la AP-1 [176]. Nues os esul ados
mues an una cla a e idencia del con ol de la AP-1 sob e las subunidades de
NADPH oxidasa en células endo eliales humanas, pe o es una egulación
nega i a. La inhibición del ac o de ansc ipción lle a al aumen o de las
subunidades de la NADPH oxidasa. También hay da os p e ios que apoyan
es e esul ado, indicando que en condiciones de lujo lamina la unión del AP-1
al p omo o de la Nox4 disminuye la exp esión de la subunidad de la NADPH
oxidasa [242].
Es e e ec o de la inhibición de la AP-1 puede es a some ido, además, a
una posible egulación po pa e de la NADPH oxidasa ya que la p oducción de
ROS egula la ac i ación de la AP-1. Se sabe que las NADPH oxidasas, a
a és de la p oducción de ROS, pueden aumen a la ac i ación de la AP-1
mediada po la JNK y la p38MAPK [243], y los ROS pueden induci la
exp esión del ARN de los elemen os de la AP-1, cJun y la cFos [244, 245]. Se
ha is o que la p oducción de ROS lle a a la ac i ación de la AP-1 en células

Discusión
118
del músculo liso ascula [246-248] y en células endo eliales [249]. La inhibición
de es e ac o de ansc ipción, según nues os esul ados, conlle a ía a una
e oalimen ación nega i a mediada po la NADPH oxidasa. Así, la
dependencia de la p oducción de ROS pa a la ac i ación de la AP-1 pod ía se
la causan e del aumen o de la exp esión de Nox4 y p22phox, como un in en o
de la célula de ac i a la AP-1, en si uación de la inhibición de es e ac o .
Papel de la óxido ní ico sin asa endo elial en los cambios inducidos po
albúmina glicada en HUVEC
El óxido ní ico es un impo an e egulado de la unción endo elial,
eniendo e ec os en la elajación de los asos, la an iag egación y la
in lamación. En las células endo eliales es p oducido cons i u i amen e po la
eNOS y iene un papel cen al en el equilib io oxida i o celula . Un inc emen o
en la p oducción de ROS lle a a educi las unciones biológicas de la eNOS,
po desacoplamien o de la enzima o po el descenso de la biodisponibilidad del
óxido ní ico, conlle ando a la o mación de pe oxini i o. Es e hecho puede
lle a a la dis unción endo elial, uno de los p incipales p oblemas en las
en e medades ca dio ascula es [16].
En nues os expe imen os no encon amos modi icaciones en la
exp esión génica de la eNOS cuando a amos las células endo eliales con la
gHSA. Hay pocos abajos que hayan es udiado el papel de la albúmina con
modi icaciones de Amado i y la eNOS. Amo e e al. ienen dos in e esan es
a ículos que a an sob e la albúmina glicada y el papel de las óxido ní ico
sin asas en las células endo eliales [158, 159]. Es os au o es ie on cambios
en la exp esión de la eNOS po el a amien o con gHSA, a ibuyendo la
p oducción de óxido ní ico y la apop osis obse ada a la óxido ní ico sin asa
inducible. Las concen aciones de gHSA usadas en es os a ículos ue on
a ias eces más al as que en nues os expe imen os. En su p ime abajo
obse a on un imp esionan e e ec o en el inc emen o de óxido ní ico inducido
con 35 ó 17 mg/mL de gHSA y una educción en el i mo de p oli e ación
celula . Sin emba go, en su siguien e abajo ellos usa on unas
concen aciones de gHSA meno es que en el p ime caso (la concen ación
más al a ue de 10 mg/mL), y pese a ello obse a on apop osis en un 10% de
las células. Po es as azones, los e ec os obse ados en es os a ículos son
Discusión
119
di íciles de compa a con nues o abajo. En el abajo de Chen e al.
obse a on descensos en la p oducción del óxido ní ico y un aumen o en la
exp esión de eNOS en HUVEC cul i adas sob e colágeno glicado [250]. O o
es udio mos ó un inc emen o en la p oducción de ni i os en células del
músculo liso ascula a adas con gHSA [164].
Po nues a pa e, cuando a amos las células con el inhibido de AP-1
descendió la exp esión de eNOS, independien emen e de la p esencia de la
HSA o la gHSA en el a amien o. En elación a es os esul ados se ha is o
que la AP-1 egula la exp esión del gen de la eNOS. El p omo o de la eNOS
ca ece de la caja TATA y iene si ios de unión po encial a la AP-1 [251]. La AP-
1 aumen a la ansc ipción de la eNOS inducida po la ciclospo ina A, la
hipoxia, el es és de cizalla y el an ioxidan e ácido no dihid oguaia é ico [252].
También se obse ó que po e ec o del H
2
O
2
se p oduce una educción en la
unión de la AP-1 al p omo o de la eNOS, educiendo po an o la exp esión de
es e gen [253]. Es os esul ados sugie en un impo an e papel de la AP-1 en la
exp esión de la eNOS, siendo odos es os da os cohe en es con nues os
esul ados. Cuando inhibimos la ac i ación de la AP-1 con el SP600125,
obse amos un descenso en la exp esión de la eNOS en las HUVEC, de
acue do con la idea desc i a en los abajos an e io es. De odas o mas no en
odos los abajos la unión de la AP-1 al p omo o aumen a la exp esión de la
eNOS. En células endo eliales humanas aó icas a adas con al as
concen aciones de glucosa la unión de cJun y AP-1 al p omo o de la eNOS
p odujo un descenso en los ni eles de ARN mensaje o de la eNOS [254].
Nues os da os indica on que la eNOS es desacoplada po la albúmina
con modi icaciones de Amado i. En nues os expe imen os encon amos que el
a amien o con gHSA aumen aba la p oducción de ROS con espec o al HSA.
En p esencia del inhibido de la AP-1, SP600125, en el a amien o con HSA
aumen ó la p oducción de ROS. Dicho esul ado es cohe en e con el descenso
de exp esión de la eNOS p oducido po el a amien o con SP600125. Al
disminui la exp esión de eNOS aumen aba la can idad de ROS que medíamos
ya que exis ía menos óxido ní ico capaz de eacciona con el anión
supe óxido. Sin emba go, el aumen o de ROS inducido po gHSA se pe dió
cuando se encon aba p esen e el inhibido de la AP-1. Es o pod ía se
explicado si la eNOS se encon ase desacoplada. Si pa e de la p oducción de
Discusión
120
ROS p o iene de es e es ado de la eNOS, cuando es é p esen e el inhibido ,
SP600125, disminui á la exp esión de la óxido ní ico sin asa y en
consecuencia disminui á la p oducción de ROS.
Realizamos una se ie de expe imen os con el inhibido de la eNOS, L-
NAME, pa a pode sabe si la sin asa se encon aba desacoplada en p esencia
de gHSA. Como esul ado imos que el a amien o de HSA con L-NAME
aumen a las ROS p oducidas, indicando que la eNOS es aba uncionando
co ec amen e. Cuan o menos óxido ní ico p oducido, más anión supe óxido
lib e que puede se de ec ado. Sin emba go, cuando a amos las HUVEC con
gHSA y L-NAME, la can idad de ROS p oducidas disminuyó, al y como
ocu i ía si la eNOS es u iese desacoplada. La eNOS desacoplada p oduce
aniones supe óxido y es a ac i idad es inhibida po el L-NAME. Es udios
an e io es obse a on que el desacoplamien o de la eNOS es una condición
que apa ece en a ios modelos de es udio de ac o es de iesgo o p oblemas
ca dio ascula es, que ya hemos comen ado que se asocian a la dis unción
endo elial. Se ha obse ado el desacoplamien o de la eNOS en ao as de a a
a adas con pe oxini i o [255], en células endo eliales a adas con LDL [256],
en asos sanguíneos de animales con condiciones pa o isiológicas ales como
la hipe ensión a e ial espon ánea o inducida [237, 257-259], o como la
diabe es inducida po es ep ozo ocina [260] o po ole ancia a la ni oglice ina
[261].
El desacoplamien o de la sin asa ambién se ha is o en pacien es con
dis in os ac o es de iesgo ca dio ascula . El desacoplamien o de la eNOS se
ha obse ado en pacien es con dis unción endo elial debida a la
hipe coles e olemia [262], a la
diabe es melli us
[261], a la hipe ensión esencial
[263] o al abaquismo c ónico [261].
En nues o es udio hemos is o cómo la albúmina glicada puede lle a a
un aumen o de exp esión de las subunidades de la NADPH oxidasa. El es és
oxida i o p oducido po la NADPH oxidasa se ha elacionado ambién con el
desacoplamien o de la eNOS. En un es udio ealizado po Landmesse e al.
con a as hipe ensas obse a on un aumen o en el es és oxida i o
dependien e de eNOS. El aumen o de la e ahid obiop e ina oxidada y pa e
del es és oxida i o dependía de la subunidad ci osólica egulado a de la
Discusión
121
NADPH oxidasa, la p47phox [259]. En es e es udio mos a on de o ma cla a
que puede habe una elación en e la NADPH oxidasa y el desacoplamien o
de la eNOS po ago amien o de la e ahid obiop e ina, al es a es á oxidada.
En nues os expe imen os se p odujo un aumen o en la exp esión de las
subunidades de NAPDH oxidasa, Nox4 y p22phox, inducido po la albúmina
glicada y és e pod ía se un buen mecanismo pa a lle a al desacoplamien o de
la eNOS.
Exis en a ios mecanismos que lle an al desacoplamien o de la eNOS:
oxidación o deg adación de la e ahid obiop e ina, el descenso de los ni eles
in acelula es de la L-a ginina egulados po a ginasas o la modi icación de la
L-a ginina, un posible mecanismo mediado po la ADMA, un inhibido
endógeno de la NOS y la S-glu a ionilación de la eNOS [16].
Los ni eles de la e ahid obiop e ina in acelula se elacionan con la
p oducción del óxido ní ico y de la L-ci ulina [264]. Los ni eles in acelula es
de la e ahid obiop e ina dependen del equilib io en e su sín esis
de no o
y su
deg adación u oxidación. La e ahid obiop e ina es uno de los agen es con
mayo pode educ o y el es és oxida i o lle a a depleciona lo [109]. La
eacción en e el óxido ní ico y el anión supe óxido lle a a la p oducción de
pe oxini i o y se ha desc i o que és e oxida la e ahid obiop e ina (BH4) a la
ihid obiop e ina (BH3), la cual puede se educida de nue o a BH4 po la
eNOS o po la i amina C [265]. La BH3 ambién puede da luga a la BH2 que
de nue o se puede educi a la BH4 g acias a la i amina C [266].
Las modi icaciones con AGE en la L-a ginina, po encialmen e inhiben la
ac i idad de la eNOS según Lai e al [267]. Es os au o es obse a on una
pequeña inhibición de la L-a ginasa po la L-a ginina modi icada con AGE.
Además, la acción de las a ginasas puede lle a al ago amien o de la L-
a ginina como sus a o de la enzima. Así, se ha encon ado un aumen o de la
exp esión de la a ginasa II en el cue po ca e noso de diabé icos [268]. En
HUVEC, la ac i idad de la a ginasa II se io inc emen ada en p esencia de
ombina o ci ocinas in lama o ias [269, 270].
La ADMA, un inhibido de la NOS, ue p opues a como un posible
mecanismo pa a la dis unción endo elial p oducida po AGE [271]. En a as
a adas con gBSA se obse ó un inc emen o en ADMA y un descenso en
Discusión
128
a ec a a la p oducción de insulina y al me abolismo de la glucosa en células
β
del pánc eas de a a [312].
Es e aumen o del es és oxida i o emp ano inducido po bajas
concen aciones de p oduc os de Amado i puede ambién ene algún e ec o en
la esis encia a la insulina, pudiendo ene un papel en la diabe es ipo 2. La
p oducción de ROS e i a la edis ibución celula del IRS-1 y de la PI3K,
impidiendo la anslocación del anspo ado de la glucosa 4 (GLUT4 del inglés
glucose anspo e ype 4
) en los adipoci os 3T3-L1 [313, 314]. Además, el
a amien o con an ioxidan es p e iene la esis encia a la insulina inducida po
hipe glicemia
in i o
[315]. En diabé icos ipo 2, an o la adminis ación c ónica
como la aguda de ácido
α
-lipoico, un an ioxidan e, mejo an la esis encia a la
insulina, sugi iendo un papel pa a los ROS [316, 317]. Se ha obse ado que la
albúmina glicada disminuye la cap ación de glucosa mediada po la insulina y la
o mación de glucógeno en la célula muscula lisa. Es a disminución sucede a
a és de la educción de la os o ilación de la i osina del IRS-1, un aumen o
de la os o ilación en se inas/ eoninas y un aumen o en la ac i idad de PKC,
ac i idad que ue inhibida po un an ioxidan e [198].
Al p incipio de es e apa ado comen amos que la dis unción endo elial
puede p ecede a la a e oscle osis. De una mane a in e esan e, con nues os
esul ados se pod ía ab i una nue a línea de abajo que puede elaciona la
a e oscle osis con la dis unción endo elial en luga es ulne ables de los asos.
La dis unción endo elial iene ca ac e ís icas comunes con las zonas de
los asos con ausencia de es és de cizalla y la p esencia de la albúmina
glicada, que se ían si ios p opensos a la a e oscle osis. Nues o modelo celula
es un modelo es á ico, pe o se ía in e esan e pode es udia de mane a
conjun a los e ec os del lujo u bulen o y los p oduc os de glicación pa a e si
sus e ec os son siné gico, apo ando un posible mecanismo emp ano de inicio
de a e oscle osis en si ios ulne ables de los asos al aumen a el es és
oxida i o local.
La azón po la que exis en cie as zonas en los asos que son
especialmen e ulne ables a la apa ición de la a e oscle osis no es á cla a,
pe o se ha elacionado con las u bulencias en el lujo que lle an a di e encias
en el es és de cizalla. Los asos sanguíneos es án cons an emen e suje os a

Discusión
129
a ios ipos de ue zas hemodinámicas (incluyendo la p esión hid oes á ica, el
es i amien o ci cun e encial y el es és de cizalla inducido po el luido) debidas
a la p esión y el lujo sanguíneo pulsá il. La capa de células endo eliales
sopo a el es és de cizalla que eje cen las ue zas de icción del lujo
sanguíneo y que ac úan de mane a pa alela a la supe icie luminal de los asos
[17]. Cuando la célula endo elial no es á some ida a es e es és de cizalla,
siendo el lujo discon inuo o u bulen o, puede su i una se ie de cambios que
lle an a la dis unción endo elial. El lujo discon inuo o u bulen o es
ca ac e ís ico de las ami icaciones o cu a u as de las a e ias y enas. En el
endo elio, la pé dida del es és de cizalla p o oca un aumen o de es ímulos
p o-in lama o ios o p o-coagulan es. Las células endo eliales bajo el lujo
u bulen o exhiben un aumen o en los ni eles de NF-kB, de c-Fos, de c-Jun
[318], además de la exp esión aumen ada de ICAM-1 y E-selec ina [319]. Po
o o lado, la espues a in lama o ia de las células endo eliales al
lipopolisacá ido y al TNF-
α
, es bloqueada po e ec o del lujo lamina , pe o no
po el lujo discon inuo [320]. Las células endo eliales bajo un lujo lamina de
poca in ensidad, sin p oduci es és de cizalla, aumen an la ac i ación y la
exp esión de NF-kB, ICAM-1, VCAM-1, E-selec ina, MCP-1, gp91phox, Nox4,
JNK y p esen an un mayo es és oxida i o [17], además de disminui la
exp esión de genes p o ec o es como son la SOD, la hemo oxigenasa-1, la
eNOS y la disminución de ac o es como la e ahid obiop e ina o la
p os aciclina. Sin emba go, se ap ecia el e ec o opues o, es o es, la
disminución de los ac o es de ac i ación endo elial y un aumen o de los genes
p o ec o es, en p esencia de un lujo lamina lo su icien emen e ue e como
pa a p oduci es és de cizalla [17].
In i o
, se ha is o que en las zonas
p opensas a la a e oscle osis las células endo eliales han aumen ado su
p oli e ación, la cap ación de lípidos, la adhesión de monoci os, p esen an un
inc emen o en la exp esión de ICAM-1, VCAM-1, E-selec ina, angio ensina 2,
NF-kB, JNK, MCP-1 y ac o simila al ac o e i oide nuclea (N 2 del inglés
nuclea ac o e y h oid 2-like 2
) y el es és oxida i o es mayo que en los
segmen os de asos ec ilíneos [17].
En nues o es udio obse amos una pa icula idad que quizás es é
elacionada con la egulación del es ado endo elial po el es és de cizalla. En
es e es és exis e un equilib io en e cua o ac o es de ansc ipción, po un
lado el NF-kB y la AP-1, los p o agonis as p oin lama o ios y p ocoagulan es, y
Discusión
130
po o o lado, el ac o simila al ac o K üppel (KLF2 del inglés
ac o K üppel-
like ac o 2
) y N 2, con e ec os an i-in lama o ios y an i-coagulan es. En el
caso de que haya es és de cizalla se aumen a la ac i idad del KLF2 y del N 2
[321], el p ime o es especí icamen e ac i ado po es e es és y el segundo
con ola genes elacionados con la de ensa an ioxidan e [322]. Es os dos
ac o es de ansc ipción se han is o inducidos en zonas con poca
p edisposición a p esen a a e oscle osis de asos sanguíneos
in i o
[323,
324].
En nues o modelo es á ico de cul i o celula en p esencia de gHSA
obse amos la ac i ación de NF-kB y un impo an e papel de la inhibición de
AP-1 sob e la egulación de la exp esión de genes elacionados con el es és
oxida i o, como las subunidades de la NAPDH oxidasa y la eNOS. Se ía una
cues ión in e esan e es udia si en es a elación iene algún papel el N 2 y el
KLF2 o si es os e ec os causados po la albúmina glicada se en in ensi icados
en p esencia del lujo u bulen o. La inhibición de la AP-1 puede ac i a
espues as compensa o ias que p o oquen es os cambios pe o ambién puede
ocu i que es emos desequilib ando la acción con apues a de es os ac o es
de ansc ipción. N 2 y KLF2 es án egulados po dis in os mecanismos. Los
ni eles de exp esión de N 2 es án egulados po su deg adación en el
p o eosoma, y a su ez, és a es á egulada po la p o eína asociada a ECH
simila a Kelch (Keap1 del inglés
Kelch-like ECH-associa ed p o ein 1
), que es
sensible al es és oxida i o [325]. Como ya hemos comen ado, el N 2 con ola
la exp esión de genes con unciones an ioxidan es, como la hemo oxigenasa 1
o la NADPH dehid ogenasa quinona 1. El N 2 con ola es a exp esión po la
unión a secuencias que egulan dis in as p o eínas con p opiedades
an ioxidan es, és as secuencias eciben el nomb e de elemen os de espues a
an ioxidan e (ARE del inglés
an ioxidan esponse elemen
).
Po o o lado, el KLF2 es á modulado po el es és de cizalla y ambién
puede se ac i ado po es a inas. KLF2 aumen a la exp esión de eNOS y
ombomodulina po un lado y po o o, disminuye la exp esión del PAI-1, la IL-8
y el ac o isula [321].
En esumen, en es e abajo hemos es udiado los e ec os de la albúmina
glicada sob e las células endo eliales humanas, consiguiendo elaciona la
Discusión
131
diabe es, el es és oxida i o y la dis unción endo elial. Hemos obse ado que la
gHSA aumen a el es és oxida i o en la célula endo elial a a és de dos
mecanismos, el aumen o de la exp esión de las subunidades de la NADPH
oxidasa y el desacoplamien o de la eNOS. También hemos obse ado un
impo an e papel de la AP-1 en el es és oxida i o ascula . Además, nues os
esul ados mos a on que la gHSA puede ene una impo an e unción
egulado a sob e la exp esión de moléculas de adhesión y de la MCP-1
Los cambios obse ados en la célula endo elial nos pe mi en explica
pa e de las ca ac e ís icas conocidas de la diabe es, el es és oxida i o y la
dis unción endo elial. Nues o abajo ab e nue as ías de es udio sob e como
se inicia y desa olla la dis unción endo elial, un p oblema que se encuen a
elacionado an o con ac o es de iesgo como di ec amen e con las pa ologías
ca dio ascula es. Es e conocimien o pe mi e el desa ollo de nue as
es a egias de p e ención y descub e nue as dianas e apéu icas pa a las
en e medades ca dio ascula es, además de supone una ampliación del
conocimien o de la
diabe es melli us
.
Conclusiones

Conclusiones
135
Conclusiones
1. Las células endo eliales aisladas de la ena umbilical humana son un
buen modelo de es udio del papel de las p o eínas glicadas en la p oducción de
ROS.
2. El a amien o de las HUVEC con un p oduc o de Amado i, como es la
albúmina glicada, a bajas concen aciones aumen a la p oducción de aniones
supe óxido ex acelula men e de mane a dependien e de la concen ación a
a és de la NADPH oxidasa. Es e e ec o en la p oducción sucede a iempos
co os y se man iene al menos du an e 12 ho as. El aumen o de ROS ambién
se p oduce a ni el in acelula
3. El a amien o de las HUVEC con albúmina glicada aumen a la
exp esión de las p incipales subunidades endo eliales de NADPH oxidasa, la
Nox4 y la p22phox. Es o se debe, p obablemen e, a la ac i ación del NF-kB po
pa e de la gHSA
4. El a amien o de las HUVEC con albúmina glicada desacopla la
eNOS.
5. La inhibición de la AP-1 aumen a la exp esión de las subunidades de
NADPH oxidasa, Nox4 y p22phox, pe o disminuye la exp esión de la eNOS
es o explica que la inhibición de la AP-1 aumen e el es és oxida i o en HUVEC
a adas con albúmina pe o no con albúmina glicada
6. El aumen o de ROS inducido po la gHSA en HUVEC se debe al
aumen o de exp esión de las subunidades de la NADPH oxidasa, la Nox4 y la
p22phox, además de po el desacoplamien o de la eNOS. Las u as mediadas
po PI3K o MEK 1/2 no es án implicadas en es e e ec o.
7. La gHSA aumen a la exp esión de ICAM-1, VCAM-1, pe o no modi ica
la p oducción de MCP-1. Sin emba go el papel modulado de la gHSA sob e el
es és oxida i o pod ía egula indi ec amen e los ni eles de p oducción de
MCP-1 en la célula endo elial.
Conclusiones
136
8. Los p oduc os de Amado i, p ecu so es de los AGE, pueden p o oca
espues as a ni el del endo elio ascula que pueden lle a a la dis unción del
endo elio y a los p oblemas ca dio ascula es asociados.
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