Papel de la miostatina en la regulación de la hematopoyesis

Facultade de Medicina Departamento de Fisioloxía “Papel de la miostatina en la regulación de la hematopoyesis” Susana Fernández Nocelo 2011 I ISBN 978-84-9887-749-6 (Edición digital PDF) D. Victor M. Arce Vázquez, Profesor Titular del Departamento de Fisiología de la Universidade de Santiago de Compostela HACE CONSTAR Que Dña. Susana Fernández Nocelo ha realizado en este departamento y bajo su dirección la presente Tesis Doctoral titulada “Papel de la miostatina en la regulación de la hematopoyesis”, estimando que este trabajo se encuentra concluido y en condiciones de ser presentado para optar al grado de Doctora. Para que así conste, firmamos la presente: Santiago, 8 de marzo de 2011 Fdo.: Victor M. Arce Vázquez Fdo.: Susana Fernández Nocelo A mi abuela Carmen y a los Antonios No hallarás otra tierra ni otro mar. La ciudad irá en ti siempre. Volverás a las mismas calles. Y en los mismos suburbios llegará tu vejez; en la misma casa encanecerás. Pues la ciudad siempre es la misma. Otra no busques -no la hayni caminos ni barco para ti. La vida que aquí perdiste la has destruido en toda la tierra. Konstantínos Kavafis, La ciudad Ten siempre a Ítaca en la memoria. Llegar allí es tu meta. Mas no apresures el viaje. Mejor que se extienda largos años; y en tu vejez arribes a la isla con cuanto hayas ganado en el camino, sin esperar que Ítaca te enriquezca. Ítaca te regaló un hermoso viaje Sin ella el camino no hubieras emprendido. Mas ninguna otra cosa puede darte. Konstantínos Kavafis, Ítaca Hoy voy a empezar hoy es el comienzo del final… Lady, Lady Blue sin control, sin dirección la luz se fue, ¿a dónde voy? Bumbury, Lady Blue A mi director de tesis, Victor Arce, por su apoyo profesional y personal a lo largo de todos estos años. Al profesor Se-Jin Lee, (Johns Hopkins University School of Medicine) por cedernos los ratones MSTN -/- y al Dr. Cadavid por el anticuerpo de MSTN. Al profesor Jesús Devesa por dejarme empezar a trabajar en este departamento. Al Dr. Jesús García Devesa y a la Dra. Pilar Fernández por su gran ayuda con las “sangres” de mis ratoncillos. A la profesora Rosalía Gallego, por su ayuda con las inmunocitoquímicas. A mis compañeros de laboratorio, a los que todavía están y a los que ya se fueron. A José Antonio, por darme tanto la “paliza”, no hubiese sido lo mismo sin él. Y a toda mi familia biológica y no biológica, y a todos los “desafortunados” que están siempre o han estado a mi lado fuese fácil o no……… “Bilen, el boli y yo” “Esa tamén vale” “Jolín, no se porque…” “Manda carallo” “Me voy para Noyi” Los “bichos” ourensanos “Otra Estrella” “Septentrión” “Vete con cuidado”… “Mira que eres pesada...que pesada eres...eres la madre mas pesada” “ “Y a donde vas? y con quien? y ...?” “VALE?” OAZ: Olfatory Neuron-Specific Transcription Factor-1/Early B-cell factor-like Associated Zinc Finger Protein PCR: Polymerase Chain Reaction PRL: Prolactine RNA: Ribonucleic Acid RT-PCR: Reverse Transcription-Polymerase Chain Reaction SCL/tal-1: Stem Cell Leukaemia/T Cell Acute Leukaemia 1 Smad: Sma (small) + Mad (Mothers against dpp) SMURF-1: Smads Ubiquitination Regulatory Factor-1 TLD: Tolloid TGF-β: Transforming Growyh Factor-β TPA: 12-O-Tetradecanolyphorbol-13-Acetate 1. INTRODUCCIÓN Introducción 3 1.1. La superfamilia del TGF-β La superfamilia del factor de crecimiento transformante β (Transforming Growth Factor-β, TGF-β) comprende unos treinta factores de crecimiento y diferenciación que regulan un amplio rango de funciones celulares (proliferación, determinación, diferenciación, apoptosis, etc.) en todos los metazoos estudiados. Estas acciones son ejercidas tanto a lo largo del desarrollo embrionario como durante la vida adulta, participando, de esta forma, en el mantenimiento de la homeostasis y la regulación tisular 1 . Debido a su complejo patrón de expresión espacio-temporal, así como a la naturaleza multifuncional de sus acciones, no es de extrañar que los diferentes miembros de la superfamilia fuesen descubiertos en el curso de líneas de investigación totalmente dispares. Así, el miembro fundador de la familia, el TGF-β1, se identificó por su capacidad antimitogénica en células de origen epitelial 2 y hematopoyético 3 . Otro de los miembros de la familia, la activina, recibió su nombre de sus efectos estimuladores de la secreción de la hormona folículoestimulante (Follicle-Stimulating Hormone, FSH) por la adenohipófisis 4 , mientras que las proteínas morfogenéticas del hueso (Bone Morphogenetic Proteins, BMPs), fueron denominadas así por tratarse de potentes inductores de la formación de hueso y de cartílago 5 . Estos tres factores (TGF-β, activina y BMPs) definen los tres principales subgrupos de la familia, con una serie de características diferenciales, muchas de las cuales dependen de la utilización de vías de señalización específicas. La familia de las BMPs comprende, además, a la mayoría de los GDFs (Growth and Differentiation Factors) entre los que se incluyen el GDF-8 (miostatina, MSTN) y el GDF-11, su homólogo más cercano, que se incluyeron en este grupo a pesar de que no comparten la mayoría de las características del resto los GDFs. Todos los miembros de las superfamilia del TGF-β comparten una serie de características comunes 6 , entre las que destaca el ser sintetizados en forma de precursores inactivos que deben ser procesados proteolíticamente para dar lugar a la forma activa. Este procesamiento se produce generalmente en un sitio dibásico consenso Arg-X-(Ser/Arg)-Arg, dando lugar a la liberación de un gran Introducción 4 segmento del precursor (generalmente denominado propéptido) y un fragmento C-terminal que contiene la región activa de la molécula. Posteriormente, el fragmento C-terminal dimeriza, dando lugar a la forma madura, biológicamente activa. A diferencia de lo que ocurre con el fragmento C-terminal, que se encuentra bastante conservado entre los distintos miembros de la superfamilia, los propéptidos guardan poca homología de unos miembros a otros. Sin embargo, existe un elevado grado de conservación de unas especies a otras para cada propéptido, indicativo de la importancia de sus funciones. En primer lugar, los propéptidos actúan como chaperonas, regulando el plegamiento y transporte intracelular durante los procesos de síntesis y maduración. Además, el propéptido es capaz de mantenerse unido al dímero maduro tras su secreción, impidiendo la unión del dímero con su receptor y dando lugar a un estado de “latencia” en el que la hormona es biológicamente inactiva. Esta capacidad del propéptido de unirse e inactivar al dímero maduro fue descrita inicialmente para el propéptido del TGF-β1 7 que, por ese motivo, recibió el nombre de LAP (Latency Associated Peptide). Posteriormente se comprobó que existen otras proteínas capaces de unirse a miembros de la superfamilia del TGF-β como la folistatina (FST), que se une con gran afinidad a Act-A 8 y con menor afinidad a BMPs y GDFs 9 , o como noggin, chordin, dante, drm/kremlin, cerberus y caronte, capaces de unirse con distinta afinidad a BMPs y GDFs. Todas estas proteínas son capaces de impedir la unión del dímero maduro con su receptor, constituyendo uno de los niveles de regulación más importantes de los miembros de la superfamilia. Todos los miembros de la familia de TGF-β transmiten su señal mediante un grupo de receptores con actividad serina-treonina quinasa que constituyen la familia de receptores del TGF-β. Estos receptores se clasifican en dos grupos diferentes, aunque evolutivamente relacionados, dependiendo de la existencia de una región rica en residuos de glicina-serina (región GS) en el dominio intracelular, inmediatamente por encima del dominio quinasa 10-13 (figura 1). Los receptores con región GS son los denominados receptores tipo I y serán los que, tras ser activados por los receptores tipo II, se encargarán de transmitir la señal al interior de la célula. Introducción 5 Figura 1.- Mecanismo de transducción de la señal en los receptores de la superfamilia del receptor TGF-β. El proceso de señalización depende de la formación de complejos heterodiméricos de ligando, receptores tipo I y receptores tipo II, con una estequiometría 2:2:2 (figura 1). Existen dos modos de unión del ligando a los receptores: unión secuencial y unión cooperativa. En el modo de unión secuencial, característico del grupo del TGFβ y activinas, el ligando se une primero al receptor tipo II y posteriormente el receptor tipo I es incorporado al complejo 14,15 . En el modo de unión cooperativo, propio de las BMPs, ninguno de los receptores tiene afinidad suficiente para unirse al ligando por separado, por lo que lo hacen conjuntamente 16,17 . En ocasiones, la funcionalidad de estos complejos puede estar regulada por la presencia de receptores accesorios R-Smad fosforilada R-Smad Smad 4 R-Smad RII Ligando RI Smad 4 R-Smad Smad 4 Ligando Fosforilación R-Smad fosforilada R-Smad Smad 4 R-SmadR-Smad Smad 4 R-Smad RII Ligando RI Smad 4 R-Smad Smad 4 Ligando Fosforilación Introducción 6 como betaglucato 18 o endoglina 19 o de proteínas como BAMBI (Bmp and Activin Membrane-Bound Inhibitor), que tiene una homología parcial con algunos receptores de tipo I de modo que inhibe la formación del complejo ligando con el receptor 20 . Una vez activados, los receptores tipo I van a inducir la fosforilación de un grupo de proteínas intracelulares denominadas Smads. Existen 8 tipos de Smads diferentes (denominadas Smad1-Smad8). Cinco de estas Smads (Smad1, Smad2, Smad3, Smad5 y Smad8) pueden ser activadas por los receptores tipo I, por lo que reciben el nombre de R-Smads. Una vez fosforiladas, las R-Smads van a formar complejos triméricos con Smad4 que se traslocan al núcleo donde regularán la transcripción de genes diana 21,22 . Una de las principales características de esta familia de receptores es la gran disparidad que existe entre el número de receptores y el de ligandos. Hasta el momento se han identificado únicamente 7 receptores de tipo I y 5 receptores de tipo II y, lo más probable, es que la lista sea definitiva. Si tenemos en cuenta que las posibles combinaciones entre ellos son limitadas 23 y que existen más de 30 ligandos en la familia, resulta evidente que ligandos diferentes han de compartir el mismo par de receptores. Por otra parte, tampoco son posibles todas las asociaciones entre receptores y Smads, de forma que los receptores de la familia pueden dividirse en dos grandes grupos dependiendo de las Smad reclutadas. Un primer grupo estaría constituido por los receptores de TGF-β, activina, MSTN y nodal que activarían Smad2 y Smad3; mientras que un segundo grupo que engloba a las BMPs, algunos GDFs y el factor antimülleriano (Müllerian Inhibiting Substance, MIS) reclutaría Smad1, Smad5 y Smad8. La actividad de las Smads puede ser regulada por otros factores, tanto de forma positiva como negativa. Uno de los principales reguladores positivos es SARA (Smad Anchor for Receptor Activation) que hace de puente entre el receptor y Smad2 y 3 24 , mientras que dentro de los reguladores negativos destaca por su importancia SMURF-1 (SMads Ubiquitination Regulatory Factor- Introducción 7 1), que lleva a la ubiquitinación y degradación de Smad1 y 5 25 . Existen, asimismo, dos Smads antagonistas, que poseen una escasa homología con el dominio de unión al DNA de las diferentes Smads: Smad6, que se une a Smad4 e impide la unión de ésta con Smad1 26 y Smad7, que se une a ciertos tipos de receptor tipo I y evita que éstos se asocien a Smad2 y 3 27 . Finalmente, la unión de los Smads a los elementos de respuesta de los genes diana también está modulada por diferentes cofactores, ya que la unión del complejo R-Smad4 al DNA no es suficiente para mediar una activación transcripcional de la intensidad y especificidad requeridas. Los cofactores más importantes son Fast-1 y 2 (Forkhead Activin Signal Transducer-1 y 2), específico de la vía de TGF-β/activina 28 , y OAZ (Olfatory neuron-specific transcription factor-1/early B-cell factor-like Associated Zinc finger protein) característico de la vía de las BMPs 12 . El uso de cofactores, además de reforzar la especificidad para de las vías TGF-β/activina y BMPs, permite que la regulación sea específica para cada gen (según la presencia o ausencia del elemento respuesta apropiado para el complejo Smads/cofactor) y para cada tejido (presencia o ausencia del propio cofactor). 1.2. La miostatina El año 1997 marcó la primera introducción formal del GDF-8, denominado MSTN por Se Jin Lee y Alexandra McPherron, investigadores de la John Hopkins University. Mientras buscaban posibles miembros de la superfamilia del TGF-β, el equipo descubrió un nuevo gen que guardaba un parecido asombroso con los miembros de la superfamilia previamente investigados 29 . En dicho estudio, se pudo comprobar además, que la deleción de la región del gen que codifica el dominio C-terminal de la proteína causaba un marcado incremento en la masa muscular esquelética en ratones. Este efecto era resultado de una combinación de hiperplasia e hipertrofia (figura 2A), sugiriendo que la función de la MSTN es regular negativamente el desarrollo del músculo esquelético 29 . Posteriormente se pudo comprobar que mutaciones en Introducción 14 miembros de la superfamilia, como la Act-A 8 o el GDF-11. Al igual que hace con estos factores, la FST impide la interacción de la MSTN con su receptor actuando, por tanto, como potente antagonista de ésta 62,65 . Dado que durante el desarrollo embrionario la FST se expresa en células del miotomo, este mecanismo de modulación podría ser relevante a la hora de regular el desarrollo de la masa muscular 69,70 . La importancia del papel de la FST en la regulación de la acción de la MSTN se ha demostrado en ratones transgénicos en los que la sobreexpresión de FST en músculo causa dramáticos incrementos en su desarrollo 62 , mientras que la ausencia de FST provoca la reducción de la masa muscular 71 . Otras dos proteínas implicadas en la regulación de la actividad del dímero C-terminal son (FSTL3) (FST-like-3), también denominada FLGR (Follistatin-Related Gene) y GASP-1 (GDF Associated Serum Protein-1), que forman complejos con la MSTN circulante 72,73 . FLGR fue identificada como un gen relacionado con la FST y capaz de bloquear la actividad de muchos miembros de la familia del TGF-β y BMP-2 en ensayos in vitro 74,75 . GASP-1 es un nuevo miembro de la familia de las proteínas con dominios FS que contiene, además, múltiples dominios asociados con la inhibición de proteasas lo que sugiere un mayor espectro de acciones. GASP-1 puede inhibir la actividad de MSTN y de BMP-11, pero no la de act-A ni la de TGF-β1. GASP-1 se une directamente a la MSTN madura y al propéptido, dando lugar a la formación de un complejo terciario. Además, GASP-1 es altamente expresada en músculo esquelético sugiriendo que ésta puede unirse durante, o poco después de la secreción de la MSTN 73 . Aunque el papel que juegan estas dos proteínas no está claro todavía, es posible que formen junto con el propéptido complejos terciarios, de forma que la MSTN circulante sería una mezcla heterogénea de estos complejos. 1.4. Mecanismo de acción de la miostatina Como ocurre con el resto de miembros de la superfamilia del TGF-β la MSTN transmite su señal a través de complejos heterodiméricos de receptores tipo I y II, formando un complejo con una estequimetría 2:2:2 10-13 (figura 1). La Introducción 15 unión de la MSTN al receptor tipo II recluta al receptor tipo I dando lugar a la fosforilación de este último en residuos de serina y treonina de su región GS. El cambio conformacional inducido por la fosforilación activa el dominio quinasa del receptor tipo I, con la subsiguiente fosforilación del principal mediador intracelular de la vía, las Smads. Posteriormente, la R-Smad activada por MSTN (Smad2/3) se asocia con Smad4, y el dímero se dirige al núcleo, donde regula transcripcionalmente a genes diana. Mediante estudios de cross-linking se ha podido demostrar que la MSTN es capaz de unirse a los receptores de activina tipo II (ActRIIA y ActRIIB) con similar afinidad 62,76,77 . La importancia de estos receptores en la señalización de MSTN in vivo está respaldada por estudios en ratones transgénicos en los cuales la expresión específica de dominante negativo de la forma ActRIIB en músculo esquelético induce un fenotipo esencialmente idéntico al ratón knockout de MSTN 29,62 . Esta asociación con ActRIIB o ActRIIA implica, además que, al utilizar la MSTN Smad2, 3 para transducir su señal, el receptor tipo I utilizado tiene que ser necesariamente ALK4 (figura 5). Introducción 16 Figura 5.- Relaciones entre las distintas subfamilias de ligandos, receptores y R-Smads en la superfamilia del TGF-β. Receptor tipo II Receptor tipo ISmads ActRIIa ActRIIb TGFßRII BMPRII ALK1 Smad1 Smad5 Smad8 Smad2 Smad3 Smad4 Dad BMP-2 BMP-4 BMP-7 GDF-5 GDF-6 ALK 1 ALK2 ALK3 ALK6 ALK4 ALK5 TGFßRII GDF-11 GDF-8 TGF-ß2 TGF-ß1 TGF-ß3 AMH Inh-a GDNF Nodal Act A Act b Receptor tipo II Receptor tipo ISmads ActRIIa ActRIIb TGFßRII BMPRII ALK1 Smad1 Smad5 Smad8 Smad2 Smad3 Smad4 Dad BMP-2 BMP-4 BMP-7 GDF-5 GDF-6 ALK 1 ALK2 ALK3 ALK6 ALK4 ALK5 TGFßRII GDF-11 GDF-8 TGF-ß2 TGF-ß1 TGF-ß3 AMH Inh-a GDNF Nodal Act A Act b Introducción 17 1.5. Contextualización del desarrollo muscular como respuesta a la miostatina El hecho de que los ratones con deleción de la MSTN presentan hiperplasia e hipertrofia de las fibras musculares sugiere que la MSTN juega dos papeles distintos para la regulación del crecimiento de la masa muscular: regulación del número final de fibras musculares durante el desarrollo y regulación del crecimiento de la fibra muscular durante la etapa postnatal. A diferencia de lo que ocurre en los ratones knockout de MSTN, la sobreexpresión de una forma dominante negativa de MSTN (dnMS) 78 , o el tratamiento con anticuerpos neutralizantes de MSTN fibras 79,80 , produce un incremento del tamaño de las fibras musculares (hipertrofia) pero no de su número. De forma similar, la sustitución de una tirosina por una cisteína en la región madura de la MSTN 81 produce un aumento en el número de fibras totales (hiperplasia) con respecto a ratones wild type pero sin que se aprecie un aumento en su tamaño. Estos datos sugieren que cuando las funciones de la proteína endógena de MSTN son bloqueadas completamente 29 el incremento muscular es debido tanto a hiperplasia como a hipertrofia, mientras que si el bloqueo se produce de forma parcial, el incremento es debido a una de ellas solamente. En este sentido, es importante destacar que en ratones transgénicos que expresan inhibidores de MSTN (propéptido, FST y dominante negativo ActRIIB 62,66,71,78 ), que bloquean completamente la acción de la MSTN, se produce un efecto similar al encontrado en los ratones knockout. El efecto de la MSTN sobre el número de fibras se debe a su capacidad de regular la proliferación y/o diferenciación de mioblastos durante el desarrollo. Numerosos estudios en la línea celular mioblástica C 2 C 12 demuestran que la MSTN bloquea la proliferación de mioblastos a través de un incremento de los niveles de p21, y de una disminución de los niveles de Cdk2 y de la fosforilación de Rb 82-84 ; mientras que el efecto de la MSTN sobre la diferenciación depende de la disminución de la expresión de los reguladores de la miogénesis MyoD, miogenina y Myf-5 84-86 (figura 6). Introducción 18 En músculo adulto, la principal función de la MSTN es el mantenimiento de las células satélite en estado quiescente. Las células satélite son las encargadas de generar nuevas fibras musculares en circunstancias en las cuales la regeneración o crecimiento del músculo es requerido. Cuando la expresión de MSTN disminuye, las células satélite reentran en el ciclo celular, proliferando y fusionándose con fibras musculares ya existentes. Además, la ausencia de MSTN produce un incremento del número de células satélite 87 . En este sentido, la MSTN actuaría como una chalona, es decir, como una molécula capaz de inhibir el desarrollo del órgano que la produce, de modo que a medida que el músculo crece, aumenta la expresión de MSTN hasta alcanzar unos niveles que detienen el crecimiento muscular. Figura 6.- Efecto de la MSTN sobre la regulación de la miogénesis in vitro. La MSTN es también capaz de inhibir la síntesis de proteínas en miotubos 88 y adipocitos 65,76,89 , de forma que la sobreexpresión de MSTN produce una marcada pérdida de masa muscular y de tejido adiposo en ratones adultos 65 . De forma similar, en humanos se ha visto que existe un aumento de Precursores Pluripotenciales MyoDMyf5Mioblastos en diferenciación MyoD + Myf-5 + Id-1 Miotúbulos Apoptosis Determinación Proliferació n Diferenciación Miogenina 21 cip1 MHC p21 cip1 - Mioblastos proliferantes MyoD + Myf-5 + Id-1 Introducción 19 los niveles de MSTN en músculo y suero de sujetos con pérdida muscular ocasionada por diferentes patologías como SIDA, cáncer u osteoartritis, así como en sujetos sometidos a periodos prolongados de inmovilización 36,90,91 . Es importante señalar que el efecto de la MSTN sobre el tejido adiposo se debe a un efecto directo de la MSTN y no debe confundirse con el hecho de que los ratones carentes de MSTN presentan también una reducción de la grasa corporal que, en este caso, sería debido a un efecto indirecto, secundario al gran desarrollo de masa muscular que presentan estos animales 33,92 . Las importantes acciones que ejerce la MSTN sobre el desarrollo muscular han hecho que se esté investigado el bloqueo de sus efectos para promover el mantenimiento de la masa muscular o su crecimiento en situaciones de sarcopenia o en pacientes con enfermedades degenerativas musculares 79,93 . En este sentido, estudios realizados en ratones muestran el papel que podría jugar la MSTN en, al menos, dos tipos de distrofia muscular (Duchenne y Becker). El bloqueo de la MSTN endógena mediante el uso de anticuerpos neutralizantes provoca tanto un aumento en el tamaño como en la fuerza muscular en estos ratones, así como una disminución en la degeneración muscular y la concentración de creatina quinasa en suero en ratones mdx (deficientes en distrofina) 79 . De forma similar, el cruce de ratones knockout de MSTN con ratones mdx, produce una disminución de la fibrosis y de la infiltración de grasa en músculo sugiriendo una mejora en la regeneración muscular 94,95 . Por el contrario, en ratones dyw (distrofia muscular por deficiencia de lamina), la ausencia de MSTN favorece la regeneración muscular pero sin reducir los cambios patológicos existentes. Además, la pérdida de tejido adiposo que se produce en estos animales produce un aumento de la mortalidad perinatal 96 . 1.6. Hematopoyesis Todas las células sanguíneas provienen de un precursor común denominado célula madre hematopoyética (Haematopoietic Stem Cell, HSC). Introducción 20 En el tercer mes de la gestación, las células madre hematopoyéticas migran del saco vitelino al hígado y a continuación al bazo, que son los principales órganos hematopoyéticos desde el tercero al séptimo mes de embarazo. A partir de este momento la médula ósea se convierte en el principal lugar de hematopoyesis, y en el momento del nacimiento, ya no existe hematopoyesis, o muy poca, en el hígado y el bazo. Como ocurre con el resto de células madre multipontenciales, dos rasgos principales caracterizan a estas HSCs. En primer lugar, son células con capacidad de dividirse de forma asimétrica, dando lugar a una célula que conserva su carácter multipotencial y a una célula comprometida. En segundo lugar, y en contraste con una célula unipotente que se diferencia sólo en un tipo celular, una HSC es multipotente y por consiguiente, capaz de generar los distintos tipos de células hemáticas maduras: eritrocitos, granulocitos, monocitos, megacariocitos y linfocitos. En fases iniciales de la hematopoyesis, la HSC se diferencia a una célula progenitora linfoide común o una célula progenitora mieloide común. Las células progenitoras linfoides dan lugar a células B y T; mientras que las células progenitoras mieloides generan de glóbulos rojos (eritrocitos), megacariocitos, granulocitos (neutrófilos, eosinófilos, basófilos) y monocitos (figura 7). El compromiso hacia una u otra vía depende de la expresión de distintos grupos de genes determinantes y específicos de linaje en los tiempos apropiados y en el orden correcto. Aunque los factores implicados en el control de la diferenciación de las HSCs apenas se conocen, se han identificado diversos factores de transcripción necesarios para el mantenimiento y la proliferación de estas células. Mediante estudios de gene targeting realizados en ratones, se ha podido comprobar que los factores SCL/tal-1(Stem Cell Leukaemia/T Cell Acute Leukaemia 1), AML1/Runx1 (Acute Myeloid Leukemia 1/ Runt-related transcription factor 1), Lmo2 y GATA-1/2 son esenciales para la generación de HSCs, ya en el saco vitelino 9799 . Además, SCL/tal-1 participa en la hematopoyesis en el adulto, siendo imprescindible para la eritropoyesis y la megacariopoyesis, pero no para la formación de granulocitos y monocitos 100 , mientras que AML-1 desempeña un papel crucial en la megacariopoyesis y en el desarrollo de células T y B, aunque su efecto en el mantenimiento de las HSCs es menos claro 101 . Introducción 21 Uno de los aspectos claves en el control de la diferenciación de las HSCs es la presencia de determinadas señales en denominados nichos hematopoyéticos. Dentro de estas señales, destaca el importante papel desempeñado por múltiples citoquinas, cuya importancia en el control de la hematopoyesis se conoce ya desde las décadas de los 60 y 80 del pasado siglo, gracias a una serie de estudios en los que se logró identificar el primer factor capaz de estimular la formación de colonias específicas a partir de células progenitoras. Por este motivo, estos factores recibieron el nombre de factores estimuladores de colonias (Colony-Stimulating Factors, CSF). Posteriormente, se identificaron un gran número de factores capaces de regular la supervivencia, proliferación y diferenciación de células de estirpe hematopoyética. Algunos de estos factores son específicos para un determinado tipo celular, como ocurre con la eritropoyetina (EPO) que estimula la formación de eritrocitos, mientras que otros, como ocurre con la interleuquina3 (IL-3) estimulan el desarrollo de prácticamente todos los linajes 102 (tabla 1). Aunque analizar con detalle el papel de las múltiples citoquinas implicadas en el control de la hematopoyesis está fuera de los objetivos de la presente revisión, de forma resumida podemos considerar que, en la actualidad, existen dos modelos que explican el papel de estos factores en la hematopoyesis: el modelo inductivo y el modelo estocástico. El modelo inductivo o instructivo establece que serían las distintas citoquinas, implicadas en la regulación de la hematopoyesis las responsables de dirigir el destino de los diferentes progenitores. Por el contrario, según el modelo estocástico o permisivo, el destino de cada célula hematopoyética estaría determinado intrínsecamente, actuando las citoquinas como meros potenciadores de la supervivencia y la proliferación celular. Ambos modelos están apoyados por numerosos datos experimentales, por lo que resulta imposible, a día de hoy, decir cuál de ellos resulta más apropiado. En favor del modelo instructivo, están los resultados que muestran que la expresión ectópica de citoquinas restrictivas de linaje o de sus receptores en las líneas de células hematopoyéticas puede producir efectos similares a los de Introducción 22 la inducción de gen de un linaje específico. Así por ejemplo, en ratones en los que se sobreexpresa un receptor quimérico humano compuesto por el dominio extracelular del receptor de IL-3 y el citoplasmático de GM-CSF (Granulocyte Macrophage Colony-Stimulating Factor) el tratamiento con IL-3 humano, produce una diferenciación granulocítica de los monocitos, lo que sugiere que la cadena citoplasmática GM-CSFRa emite una señal instructiva que conduce a un compromiso de linaje 103 . En este sentido es importante señalar que la existencia de dominios esenciales para generar una señal de diferenciación pero prescindible para la mitogenesis, se ha demostrado para varios receptores de citoquinas 104,105 . Sin embargo, las observaciones más llamativas que apoyan el modelo instructivo se obtuvieron al demostrar que la expresión ectópica de los receptores de citoquinas en células pluripotenciales puede conducir a alteraciones en el proceso de diferenciación 106,107 . Kondo y col. 106 estudiaron las células progenitoras linfoides, un tipo de células que normalmente da lugar a linfocitos T y B y NK (Natural Killer), en las cuales se había inducido la expresión ectópica del receptor de IL-2b. Cuando estas células fueron cultivadas en presencia de IL-2, las células rápidamente generaron granulocitos y macrófagos, en lugar de únicamente células linfoides. De forma similar, se produjo una nueva reprogramación hacia la estirpe mieloide cuando estas células fueron transfectadas con GM-CSFR y tratadas con GM-CSF, pero no cuando el experimento se repitió con receptores de EPO o IL-7. Dado que, a diferencia de los progenitores linfoides que no lo expresan, las HSCs presentan niveles bajos pero detectables de GM-CSFR, se planteó la posibilidad de que la regulación negativa de la GM-CSFR fue uno de los eventos iniciales en el proceso de adhesión de los progenitores linfoides. En apoyo al modelo estocástico, se ha visto que cuando precursores eritroides se transducen con retrovirus que codifican el receptor del factor estimulador de colonias de monocitos (Macrophage Colony-Stimulating Factor, M-CSF), se produce un aumento del número de eritrocitos, pero no de monocitos al ser estimulados con M-CSF 108 . De forma similar los receptores de prolactina (PRL), hormona de crecimiento (Growth Hormone, GH) o de la Introducción 23 trombopoyetina (c-mpl), son capaces de reemplazara al receptor de EPO a la hora de estimular la diferenciación eritroide in vitro 109,110 . Otro fuerte apoyo para el modelo estocástico proviene de la expresión ectópica del factor antiapoptótico, bcl-2 (B-Cell Lymphoma 2) en determinadas líneas celulares hematopoyéticas estimula la diferenciación hematopoyética en ausencia de citoquinas 111 , mientras que la expresión forzada de bcl-2 es capaz de rescatar el déficit de células T que existen en ratones knockout de IL-7 o el déficit de monocitos en ratones deficientes M-CSF 112-114 . Factor crecimiento Sitios de producción Principales funciones hematopoyético Eritropoyetina Riñón, hígado Producción de eritrocitos G-CSF Células endoteliales, fibroblastos, macrófagos Producción de neutrófilos Trombopoyetina Hígado, riñón Producción de plaquetas M-CSF Fibroblastos, células endoteliales, macrófagos Producción de macrófagos y osteoclastos Ligando SCF/c-kit Células estrómicas de la médula ósea Células madre, supervivencia/división de células progenitoras Ligando Flt-3 Fibroblastos, células endoteliales Expansión de célula progenitora temprana; precélulas B GM-CSF Células T (TH1 y TH2), macrófagos, Producción de macrófagos, granulocitos; células cebadas maduración y activación de células dendríticas IL-3 Células T (TH1 y TH2), macrófagos Crecimiento de células madre y células progenitoras mieloides; células cebadas IL-5 Células T colaboradoras activas, sólo Producción de eosinófilos, crecimiento de célurespuesta TH2 las B murina IL-6 Células T activadas, monolitos, fibroblastos Estimulación de célula progenitora; producción células endoteliales de plaquetas; producción de inmunoglobulina en células B L-11 Células estrómicas de la médula ósea y Factor de crecimiento para megacariocitos fibroblastos estimulados por IL-1 IL-7 Células del estroma de médula ósea, fibroblastos Supervivencia de células T Tabla 1.- Citoquinas hematopoyéticas Objetivos 31 Aunque la MSTN fue descrita inicialmente como una hormona implicada en la regulación del desarrollo muscular, existen cada día más estudios que demuestran que su importancia va mucho más allá de este papel tan específico, interviniendo en la regulación de la proliferación y la diferenciación de muchos otros tipos celulares. El objetivo del presente estudio ha sido analizar el papel de la MSTN en la regulación de la hematopoyesis, tanto in vivo como in vitro, estudiando sus efectos sobre la proliferación, diferenciación y supervivencia de distintos tipos de células hematopoyéticas, así como las vías de señalización implicadas. 3. MATERIALES Y MÉTODOS Materiales y métodos 35 3.1. Animales Se utilizaron ratones MSTN +/+ y MSTN -/- (C57BL/6J-MSTN lean ), cedidos por el Prof. Se-Jin Lee, (Johns Hopkins University School of Medicine). Estos ratones se caracterizan por presentar una deleción de la región C-terminal de la proteína 29 que resulta en una molécula inactiva. Los animales se estabularon con temperatura y humedad constantes y sometidos a periodos artificiales de luz y oscuridad. La alimentación se realizó con dieta estándar (SAFE, Augy, Francia) suministrada ad libitum. Todos los procedimientos se realizaron de acuerdo la normativa vigente (Real Decreto 1201-2005 y Decreto 296/2008) en relación con la utilización de animales de experimentación. Las colonias se mantuvieron en heterozigosidad, determinándose el genotipo de cada animal a partir de muestras de DNA extraídas de una biopsia de tejido de la cola. Para la realización del genotipado, las muestras de tejido se incubaron en agitación a 55ºC durante toda la noche en 100 µl de buffer compuesto por NaCl (100 mM), Tris-HCl (10 mM) pH 7,5, EDTA (1 mM) y 1% SDS y 5 µl (20 mg/mL) de proteinasa K. Posteriormente, la muestra se centrifuga para eliminar los restos de tejido, se añade un volumen de etanol a 4ºC y se homogeniza. Para realizar la PCR se utilizaron 1 µg de DNA y 1,25 U de Taq polimerasa (Thermo, Ulm, Alemania) en 50 µl de una solución compuesta por Tris-HCl (pH 8,4) 20 mM, KCl 50 mM, MgCl 2 2 mM, 0,2 mM de cada dNTP y 0,4 µM de cada uno de los cebadores. Las condiciones de la reacción de PCR así como la secuencia de los cebadores utilizados se muestran en la tabla 2. Los productos de PCR se resolvieron en un gel de agarosa al 2% y se visualizaron mediante tinción con bromuro de etidio en el sistema digital de análisis de imagen GelDoc 1000 (BioRad, Berkeley, EEUU). Materiales y métodos 36 Secuencia Th Ciclos F.- 5´-GGCATCTGTTCTGCTATTACGTG-3´ R1.- 5´-ATCTTTTGGGTGCGATAATCC-3´ R2.- 5´-GTGGATGTGGAATGTGTGCGAG-3´ 58ºC 33 Tamaños aparente de migración: F1-R1 435 ratón MSTN +/+ F1-R2 285 ratón MSTN -/- F1-R1-R2 435 285 ratón MSTN +/- Tabla 2.- Características de la PCR (secuencias de los cebadores, temperatura de hibridación y ciclos) utilizada para el genotipado de los ratones y tamaño aparente de migración. Para la realización de los tratamientos in vivo se utilizaron G-CSF (Neupogen, 250 µg/kg/día, s.c.) o EPO (NeoRecormon 3000 U, 25 U/kg/día, s.c.). En ambos casos los tratamientos duraron 7 días. 3.1.1. Recuentos hematológicos Los recuentos hematológicos se realizaron tanto de forma manual, mediante análisis microscópico de extensiones de sangre periférica, como de forma automática por medio de un autoanalizador hematológico citoquímico ADVIA 120 (Siemens, Munich, Alemania). Para el realizar el recuento manual se utilizó el método de Wright modificado, tiñendo las extensiones con Hema-TEK slide stainer (Siemens). Dado que para la realización del recuento celular utilizamos un sistema automático diseñado para el recuento de los valores hematológicos humanos, realizamos un estudio preliminar para validar el uso de ese sistema en muestras de sangre murina. Para ello, comparamos los resultados obtenidos, en el mismo animal, mediante recuento manual de leucocitos en extensiones y mediante recuento automático. Los resultados de este estudio muestran que no existen diferencias significativas entre estos dos sistemas de recuento (figura 8). Materiales y métodos 37 Figura 8.- Validación del sistema de recuento de células hemáticas. No existen diferencias significativas al comparar los resultados obtenidos en el recuento de leucocitos mediante extensiones de sangre periférica y autoanalizador hematológico histoquímico. Los resultados se muestran como la media ± EEM de 12 determinaciones (p = NS). 3.1.2. Ensayos de maduración de granulocitos Para evaluar los efectos del tratamiento con G-CSF in vivo se realizó una citometría empleando los anticuerpos anti-Gr-1 FITC y anti-Mac-1 PE (eBioscience, San Diego, EEUU). Gr-1 es una proteína anclada al glucosilfosfatidilinositol que se expresa en granulocitos de médula ósea y en neutrófilos periféricos. Mac-1 (integrina αM β2) se forma por la asociación de CD11b (integrina αM) con CD18 (integrina β2). Se expresa en neutrófilos, células NK, monocitos y macrófagos. El anticuerpo utilizado está dirigido contra la subunidad CD11b. 3.1.3. Ensayos de células de ratón formadoras de colonias Las muestras de médula ósea se extrajeron del fémur. Tras aislar quirúrgicamente el fémur y seccionar las epífisis, se perfunde el interior de la diáfisis con 1-3 mL de medio de cultivo (Iscove´s MDM, StemCell Technologies, 0 2 4 6 8 1 0 MSTN +/+ MSTN - / - Autoanalizador Manual Autoanalizador Manual Leucocitos/µL (x10 3 ) Materiales y métodos 38 Vancouver, Canadá) a 4ºC. Una vez extraída la médula, se siembra inmediatamente a una concentración de 2x10 5 células/placa para CFU-E y BFUE y 2x10 4 células/placa para CFU-GM. Las células se incubaron a 37ºC en una atmósfera con un 5% CO 2 y 95% de humedad. Para los ensayos de CFU-E y BFU-E se utilizó el medio M3334 (StemCell Technologies) y los cultivos se mantuvieron durante 2 días para CFU-E y 34 para BFU-E. Para ensayos de CFU-GM se empleó el medio M3434 (StemCell Technologies) y los cultivos se mantuvieron de 7 a 10 días. 3.2. Líneas celulares Los estudios in vitro se llevaron a cabo en las líneas celulares HL60, Jurkat y K562 (ECACC, European Collection of Cell Culture, Wiltshire, Reino Unido). Las células se cultivaron en medio RPMI 1640 (Sigma, Saint Louis, EEUU) complementado con suero fetal bovino (10%), glutamina (2 mM), penicilina (100 UI/mL) y estreptomicina (100 mg/mL), a 37ºC en una atmósfera humidificada al 5% de CO 2 . La concentración a la que se mantienen estas líneas es de 10 5 a 10 6 células/mL para evitar que las células se diferencien espontáneamente. 3.2.1. Proliferación En los ensayos de proliferación las células se sembraron por triplicado 10 5 células en placas de 15 mm de diámetro. El número de células se determinó mediante recuento en una cámara Neubauer, y el ciclo celular mediante citometría de flujo (FacScan, BD Pharmingen, New Jersey, EEUU) de células teñidas con ioduro de propidio. El análisis de las poblaciones obtenidas se realizó con el software CellQuest (BD Pharmingen). Materiales y métodos 39 3.2.2. Apoptosis La apoptosis se determinó mediante citometría de flujo y por tinción de los núcleos celulares con bisbenzamida. Para realizar la tinción con bisbenzamida y el marcaje de las células, se sembraron por triplicado 3x10 5 células en placas de 15 mm de diámetro. Las células se incubaron durante 24 horas en medio sin suero en presencia de 125 ng/mL de MSTN recombinante o vehículo. Después de un periodo adicional de incubación de 24, 48, 72 y 96 horas, las células se tiñeron con bisbenzamida 50nM (Hoechst 33258, Sigma) y se fotografiaron con una magnificación de 100X tres campos aleatorios de cada uno de los replicados, con una cámara digital DP10 (Olympus Optical, Tokio, Japón). En paralelo, las células se incubaron con anexina V-FITC y yoduro de propidio-PE, de acuerdo con las instrucciones del “FITC Annexin V apoptosis detection Kit I” de BD Pharmingen. El análisis de los datos obtenidos se realizó con el software ModFit para Mac V3.0 (BD Pharmingen). En el caso de las células K562 el estudio se realizó empleando Trypan Blue (Sigma), en lugar de bisbenzamida. Se realizan las mismas condiciones de siembra que en el caso del ensayo con bisbenzamida, transcurridas 96 horas de incubación se prepara suspensión celular en HBSS (Hank´s Balanced Salt Solution, Invitrogen, Carlsbad, EEUU) y se transfieren 0,5 mL de solución de Trypan Blue (0,4% peso/volumen) a un tubo. Finalmente se añaden 0,3 mL de HBSS y 0,2 mL de la suspensión celular y se incuban 5-15 minutos a temperatura ambiente. 3.2.3. Diferenciación Para analizar el efecto del tratamiento con MSTN sobre la diferenciación celular, se sembraron por triplicado 4x10 5 células en placas de 35 mm de diámetro y se incubaron con medio con suero fetal bovino al 10%. Transcurridas 5 horas se tratan con 125 ng/mL de MSTN o vehículo (R&D Systems, Minneapolis, EEUU). Para analizar la diferenciación de células HL60 se determinó la expresión del antígeno CD33 por medio de citometría de flujo utilizando un anticuerpo monoclonal acoplado a FITC (BD Pharmingen). En el Resultados 47 4.1. La miostatina y su sistema de receptores se expresan en células hemáticas 4.1.1. Expresión de MSTN en células hemáticas Aunque la MSTN se expresa predominantemente en el músculo esquelético, existen diversos estudios que demuestran la existencia de expresión de MSTN en otros tejidos como músculo cardíaco 37-43 , tejido adiposo 29,33,45,172 , glándula mamaria 46 , hueso 47 , cerebro 173,174 , útero 50-52 y testículos 50 . Los resultados obtenidos demuestran que la MSTN se expresa también en células de estirpe hematopoyético (figura 9). Mediante RT-PCR hemos podido comprobar la presencia de mRNA de MSTN en muestras de sangre periférica humana (figura 9A). Los estudios inmunocitoquímicos mostraron la existencia de inmunoreactividad anti-MSTN tanto en granulocitos como en linfocitos. Sin embargo, no detectamos la presencia de MSTN en eritrocitos (figura 9B-E). A B C MWM Sangre RT - PCR - MSTN 400 300 Resultados 48 Figura 9.- La MSTN se expresa en células hemáticas. A.- RT-PCR (HPRT: 28 ciclos, MSTN: 35 ciclos) de RNA extraído de células de sangre periférica de humano empleando el kit de Qiagen para aislamiento de RNA total de sangre. B-C.- Inmunocitoquímica de extensiones de sangre periférica humana. Las células se depositaron en portaobjetos recubiertos con poli-L-lisina, se fijaron con etanol y se incubaron con el anticuerpo anti-MSTN (dilución 1:200) durante toda la noche a 4ºC. Como sistema de detección se utilizó el EnVision Detection Kit (Dako). La expresión de MSTN se detectó en granulocitos (B) y en linfocitos (C), pero no se detectó inmunoreactividad anti-MSTN en eritrocitos (40X). 4.1.2. Expresión de MSTN en líneas celulares hematopoyéticas Con el objetivo de poder analizar el papel funcional de la MSTN en células hemáticas, utilizamos 3 líneas celulares de estirpe hematopoyético (HL60, Jurkat y K562) y, como primer paso, investigamos si estas líneas celulares eran también capaces de expresar MSTN. Mediante RT-PCR se pudo comprobar la presencia de mRNA de MSTN en 2 de las 3 líneas celulares estudiadas (HL60 y Jurkat). Por el contrario, no encontramos expresión de MSTN en células K562 (figura 10). Estos resultados se corroboraron al analizar la presencia de proteína mediante western blot e imnunocitoquímica. El western blot demostró la presencia de una banda de aproximadamente 25 kDa en los dos tipos celulares en los que habíamos detectado la presencia del mensajero, pero no en células K562. Resultados similares se obtuvieron mediante inmunocitoquímica, que mostró la presencia de inmunorreactividad anti-MSTN únicamente en células HL60 y Jurkat. Esta inmunorreactividad se concentraba en áreas próximas a la membrana plasmática y, sobre todo, en regiones vecinas a otras células, lo que podría estar relacionado con la participación de la MSTN en procesos de regulación paracrina. Resultados 49 A B C D HL60 JURKAT K562 Figura 10.- La MSTN se expresa en líneas celulares hematopoyéticas. A.- RT-PCR (HPRT: 28 ciclos, MSTN: 35 ciclos) de mRNA extraído de líneas celulares hematopoyéticas humanas cultivadas en RPMI 1640 a 37ºC en una atmósfera humidificada al 5% de CO 2 . B.- Ensayo de restricción. Para comprobar la identidad de los productos amplificados, se incubaron con HindIII durante 2 h a temperatura ambiente. Como control positivo se utilizó músculo de ratón. C.- Western blot de extractos celulares obtenidos por incubación con tampón de lisis (RIPA). Las muestras se resolvieron mediante de SDS-PAGE al 12%, y se transfirieron a una membrana de nitrocelulosa que se incubó con el anticuerpo específico anti-MSTN (1:5000) a 4ºC toda la noche. D.- Inmunocitoquímica. Las células se depositaron en portaobjetos recubiertos con poli-L-lisina mediante citospin, se fijaron con etanol y se incubaron con el anticuerpo anti-MSTN (dilución 1:200) durante toda la noche a 4ºC. Como sistema de detección se utilizó el EnVision Detection Kit (Dako) (40X). Una vez demostrada la expresión de MSTN, nuestro siguiente objetivo fue analizar la presencia de receptores de MSTN funcionales en estas células. En la mayor parte de los casos, el receptor tipo II utilizado por la MSTN es ActRIIB, mientras que el principal receptor tipo I encargado de transmitir su señal HL60 JURKAT K562 25 MSTN MWM HL60 JURKAT K562 RT - PCR - 400 300 MWM MSTN HindIII MSTN HindIII MSTN HindIII MSTN HindIII Músculo ratón HL60 JURKAT RT - 345 245 189 89 67 400 100 Resultados 50 es Alk4 62 . En los tres tipos celulares estudiados fue posible detectar la presencia de mRNA de Act-RIIB y Alk4, aunque no de Act-RIIA (figura11 A), lo que permite aventurar que la MSTN es capaz de ejercer sus acciones en estas células. A B pSmad2 Smad2 Tubulina Figura 11.- Las líneas celulares hematopoyéticas expresan receptores de MSTN funcionales. A.- RT-PCR (HPRT: 28 ciclos, ALK4: 28 ciclos, Act-RIIA: 26 ciclos, Act-RIIB: 30 ciclos) de mRNA extraído de líneas celulares hematopoyéticas humanas cultivadas en RPMI 1640, a 37ºC en una atmósfera humidificada al 5% de CO 2 . B.- Western blot de extractos celulares obtenidos por incubación con tampón de lisis (RIPA). Las células se cultivaron en medio RPMI 1640 en condiciones de serodeprivación durante 24h y se trataron con MSTN (125 ng/mL) o vehículo durante 15 minutos. Los extractos celulares se resolvieron mediante de SDS-PAGE al 8%, y se transfirieron a una membrana de nitrocelulosa. Posteriormente, la membrana se incubó con los anticuerpos antifosfoSmad2 (1:1000, toda la noche a 4º C), anti-Smad2 (1:1000, 1 h a temperatura ambiente) y antitubulina (1:5000, 1 h a temperatura ambiente). Alk 4 Act RIIA Act RIIB HPRT 400 300 400 300 300 200 200 100 - + - + - + HL60 JURKAT K562 MSTN 60 58 55 MWM HL60 JURKAT K562 RT - PCR - Resultados 51 En la mayor parte de las células, la activación del complejo de receptores de MSTN (Act-RIIB-Alk4) induce la fosforilación de Smad2 que es la principal Smad implicada en la transmisión de señales de la MSTN. De acuerdo con esto, el tratamiento de células HL60 y K562 con MSTN produjo un marcado incremento de los niveles de fosfo-Smad2 detectados mediante western blot (figura 11B), lo que demuestra que los receptores de MSTN detectados en estas células son funcionales. Por el contrario, pese a que las células Jurkat expresan niveles similares de ActRIIB, Alk4 y Smad2, el tratamiento de estas células con MSTN apenas incrementó los niveles de Smad2 fosforilada detectados. Mediante estudios realizados tanto in vivo como in vitro, se ha podido comprobar que el fragmento N-terminal de la MSTN (propéptido) desempeña un papel fundamental en la regulación de la actividad biológica de la hormona. Por tanto, para comprobar la especificidad de la activación observada, tratamos células HL60 con distintas concentraciones del propéptido y estudiamos su efecto sobre la fosforilación de Smad2 inducida por MSTN. Como puede apreciarse en la figura 12, la presencia del propéptido produjo una disminución dosis-dependiente de la fosforilación de Smad2 inducida por MSTN. A pSmad2 60 Smad2 58 Tubulina 55 B pSmad2 60 Smad2 58 Tubulina 55 Control MSTN Propépt 125 325 (ng/mL) Control MSTN 1:2 1:4 1:6 MSTN:propéptido MSTN Resultados 52 Figura 12.- El bloqueo de la MSTN con su propéptido disminuye la fosforilación de Smad2 en células HL60. A, B.- Western blot de extractos celulares obtenidos por incubación con tampón de lisis (RIPA). Las células se cultivaron en medio RPMI 1640 en condiciones de serodeprivación durante 24 h y se trataron con MSTN (125 ng/mL) y con distintas concentraciones del propéptido durante 15 minutos. Las células control fueron tratadas con vehículo. Los extractos celulares se resolvieron mediante de SDS-PAGE al 8%, y se transfirieron a una membrana de nitrocelulosa. Posteriormente, la membrana se incubó con los anticuerpos anti-fosfoSmad2 (1:1000, toda la noche a 4ºC), anti-Smad2 (1:1000, 1 h a temperatura ambiente) y anti-tubulina (1:5000, 1 h a temperatura ambiente). 4.2. Acciones de la miostatina en células hematopoyéticas A fin de estudiar los posibles efectos biológicos de la MSTN en células hematopoyéticas, las tres líneas celulares investigadas se trataron con MSTN y se analizaron los efectos sobre proliferación, diferenciación y supervivencia celulares. 4.2.1. HL60 Dado que, en células musculares, uno de los principales efectos de la MSTN es regular la diferenciación de mioblastos a miocitos, estudiamos en primer lugar el efecto del tratamiento con MSTN sobre la diferenciación de las células HL60. La capacidad de las células HL60 de diferenciarse in vitro en respuesta a diferentes estímulos está perfectamente documentada en la literatura. Dos de los estímulos clásicos utilizados son el DMSO y el TPA que se caracterizan por inducir una disminución de la expresión de CD33 175 . De acuerdo con estos estudios, tanto el tratamiento con DMSO como con TPA produjo una disminución de la expresión de CD33 con respecto al basal (tabla 5). También de acuerdo con los datos existentes en la literatura 176 , esta disminución de la expresión de CD33 se acompañó de cambios fenotípicos característicos entre los que se incluye un marcado aumento de la capacidad de adhesión a la placa de cultivo en el caso de las células tratadas con TPA (figura 13B), o la presencia de núcleos polilobulados en células tratadas con DMSO (figura 13E). De forma similar, el tratamiento con MSTN produjo una Resultados 53 disminución de la expresión de CD33 en estas células (tabla 5), junto con la aparición de cambios morfológicos similares a los observados al inducir la diferenciación mediante tratamiento con DMSO (figura 13F). Además, el tratamiento con MSTN fue capaz de incrementar el efecto diferenciador inducido por el DMSO, mientras que apenas modificó los resultados obtenidos tras el tratamiento con TPA (tabla 5). En conjunto, estos resultados sugieren que MSTN estimula la diferenciación de células HL60 a través de un mecanismo similar al utilizado por el DMSO. En este sentido, es importante destacar que el proceso de diferenciación inducido por DMSO se acompañó de un aumento de la fosforilación de Smad2, que no se observó cuando la diferenciación se indujo mediante tratamiento con TPA (figura 13G). TPA (10 nM) 29,4± 1,5* DMSO (1,3%) 9,7± 0,7* MSTN (125 ng/mL) 5,1 ± 0,6* Propéptido (325 ng/mL) 0,9 ± 0,3 TPA (10 nM) + MSTN (125 ng/mL) 36,2 ± 0,2 α TPA (10 nM) + Propéptido (325 ng/mL) 28,9 ± 0,6 DMSO (1,3%) + MSTN (125 ng/mL) 23,6 ± 0,1# DMSO (1,3%) + Propéptido (325 ng/mL) 11,5 ± 0,3 Tabla 5.- El tratamiento con MSTN estimula la diferenciación de células HL-60. Efecto del tratamiento con TPA (10 nM), DMSO (1,3%), MSTN (125 ng/mL), propéptido (325 ng/mL), TPA+MSTN, DMSO+MSTN, TPA+propéptido o DMSO+propéptido sobre la expresión de CD33. Los resultados se muestran como porcentaje de incremento con respecto al control (*=p<0,01 vs. basal; α =p<0,01 vs TPA; # =p<0,01 vs DMSO). Resultados 54 A Medio RPMI B Medio RPMI + TPA (10 nM) C Medio RPMI + MSTN (125 ng/mL) D Medio RPMI E Medio RPMI + TPA (1,3%) G F Medio RPMI + MSTN (125 ng/mL) Control DMSO TPA 1,3% 10 nM pSmad2 Smad2 tubulina 60 58 55 Resultados 55 Figura 13.- El tratamiento con MSTN estimula la diferenciación de células HL-60. Las células se cultivaron en RPMI y se trataron con MSTN (125 ng/mL) durante 3 días. Como control positivo de difere nciación se utilizaron células tratadas con TPA (10 nM) o DMSO (1,3%), en ambos casos durante el mismo tiempo que el tratamiento de MSTN. Para valorar la diferenciación celular se analizaron los cambios en la morfología celular. A-C.- Comparación del efecto del tratamiento con TPA y el de MSTN. Las células se fotografiaron directamente en la placa de cultivo (10X). D-F.- Efecto del tratamiento con DMSO comparado con el de MSTN. Las células se depositaron en portaobjetos recubiertos con poli-L-lisina mediante citospin y se tiñeron con empleando el método Wright modificado (40X). G.- Western blot de extractos celulares obtenidos por incubación con tampón de lisis (RIPA). Las células se cultivaron en medio RPMI 1640 en condiciones de serodeprivación durante 24h y se trataron con TPA o DMSO. Las células control fueron tratadas con vehículo. Los extractos celulares se resolvieron mediante de SDS-PAGE al 8%, y se transfirieron a una membrana de nitrocelulosa. Posteriormente, la membrana se incubó con los anticuerpos anti-fosfoSmad2 (1:1000, toda la noche a 4º C), anti-Smad2 (1:1000, 1 h a temperatura ambiente) y anti-tubulina (1:5000, 1 h a temperatura ambiente). En segundo lugar, analizamos el efecto del tratamiento con MSTN sobre la proliferación y supervivencia celular. Como se puede observar en la figura 14 (A y B) las células HL60 responden al tratamiento con MSTN, pudiéndose observar un aumento en el número de células a partir del segundo día de tratamiento. Mediante el análisis del ciclo celular se pudo comprobar que este aumento del número de células no es debido a una estimulación de la proliferación, lo que sugiere un efecto sobre la supervivencia celular. Para comprobar esta posibilidad, investigamos el efecto del tratamiento con MSTN sobre el número de células apoptóticas presentes en el cultivo. Como puede observarse en la figura 14 (D y E), tanto los niveles de marcaje con anexina V detectados por citometría de flujo, como el número de células positivas a la tinción con Hoescht fueron significativamente inferiores en células tratadas con MSTN, en comparación con las células control. Al contrario de lo que ocurre con la MSTN, estas células no presentan ninguna respuesta al tratamiento con propéptido. Resultados 62 los rangos de edad estudiados (3, 6 y 12 meses) los ratones MSTN -/- presentaron un mayor número de leucocitos que los ratones MSTN +/+ . Por el contrario, no se observaron diferencias significativas ni en el hematocrito ni en los niveles de Hb en ninguno de los grupos de edad (figura 20). A B C Figura 20.- Los ratones MSTN -/- presentan un aumento del número de leucocitos circulantes. La concentración de leucocitos (A), el hematocrito (B) y la concentración de Hb (C) en sangre periférica se determinaron en un autoanalizador hematológico citoquímico. Solo se observó aumento significativo en el número de leucocitos circulantes en ratones MSTN -/- . Los resultados se muestran como media ± EEM de 12 determinaciones (*=p<0,01). 4.3.1. Papel de la MSTN en la granulopoyesis Para analizar el posible papel de la MSTN en el proceso de granulopoyesis, se realizó un tratamiento con G-CSF en ratones de 3, 6 y 12 meses. El tratamiento con G-CSF produjo un incremento significativo del 3 meses 6 meses 12 meses 2 4 6 8 10 12 14 16 0 Hemoglobina g/dL 3 meses 6 meses 12 meses 2 4 6 8 10 12 14 0 * * * Leucocitos/µL (x10 3 ) Hematocrito/ µL (x10 6 ) 2 4 6 8 10 12 0 3 meses 6 meses 12 meses Resultados 63 número de leucocitos circulantes tanto en ratones knockout como en ratones wild type, sin que se observen diferencias entre ambos fenotipos en la respuesta al tratamiento en los grupos de edad estudiados salvo en el grupo de 12 meses (figura 21A). No se observaron tampoco diferencias en el hematocrito tras administración de G-CSF en ninguno de los grupos estudiados (figura 21B). En cuanto a los niveles de Hb, el tratamiento con G-CSF produjo una disminución en ratones MSTN +/+ de 6 y 12 meses de edad. También se observó una ligera disminución de los niveles de Hb en ratones MSTN -/- (figura 21C) en dichos grupos de edad, aunque en este caso, las diferencias observadas no fueron estadísticamente significativas. Sí observamos, por el contrario, diferencias en cuanto a la maduración a neutrófilos, analizada en función de los niveles de expresión de Gr-1 Mac-1 PE detectados por citometría. Como puede observarse en la figura 22, los ratones MSTN -/- presentan un mayor grado de maduración de neutrófilos como respuesta a la administración de G-CSF que los ratones MSTN +/+ en los grupos de 3 y 12 meses. Resultados 64 A - + - + - + - + - + - + G-CSF MSTN +/+ MSTN -/- MSTN +/+ MSTN -/- MSTN +/+ MSTN -/- B - + - + - + - + - + - + G-CSF MSTN +/+ MSTN -/- MSTN +/+ MSTN -/- MSTN +/+ MSTN -/- C - + - + - + - + - + - + G-CSF MSTN +/+ MSTN -/- MSTN +/+ MSTN -/- MSTN +/+ MSTN -/- 3 meses 6 meses 12 meses 3 meses 6 meses 12 meses 3 meses 6 meses 12 meses * * * * * * * * * 4,0 3,5 3,0 2,5 2,0 1,5 1,0 0,5 0 1,4 1,2 1,0 0,8 0,6 0,4 0,2 0 1,4 1,2 1,0 0,8 0,6 0,4 0,2 0 * Incremento vs día 0 (leucocitos) Incremento vs día 0 (hematocrito)Incremento vs día 0 (hemoglobina) Resultados 65 Figura 21.- El tratamiento con G-CSF provoca un aumento en el número de leucocitos circulantes. Se trataron ratones MSTN +/+ y MSTN -/- con C-GSF (250 µg/kg de peso corporal, s.c.) durante 7 días, y se determinó la concentración de leucocitos (A), el hematocrito (B) y la concentración de Hb (C) en sangre periférica con un autoanalizador hematológico citoquímico. Los resultados se representan como media ± EEM del incremento con respecto al basal en 6 animales en cada grupo (*p<0,01). - + - + - + - + - + - + G-CSF MSTN +/+ MSTN -/- MSTN +/+ MSTN -/- MSTN +/+ MSTN -/- Figura 22.- El tratamiento con G-CSF provoca una estimulación de la maduración de neutrófilos. Se trataron ratones MSTN +/+ y MSTN -/- con C-GSF (250 µg/kg/día, s.c.) durante 7 días y se determinó la presencia de neutrófilos maduros en sangre periférica mediante citometría de flujo con los anticuerpos anti-Gr-1 FITC y anti-Mac-1 PE. Los resultados (anti-Gr-1/anti-Mac-1 +/+ ) se representan como media ± EEM del incremento con respecto al basal en 6 animales en cada grupo (*p<0,01). 3 meses 6 meses 12 meses * 4,5 4,0 3,5 3,0 2,5 2,0 1,5 1,0 0,5 0 * * * * * * * Incremento número eventos vs día 0 Resultados 66 4.3.2. Papel de la MSTN en la eritropoyesis El tratamiento con EPO produjo un incremento significativo del número de glóbulos rojos y de la concentración de Hb tanto en ratones knockout como en ratones wild type, sin que se observen diferencias significativas entre ambos fenotipos en la respuesta al tratamiento en el grupo de edad estudiado (figuras 23A y B). Este efecto se vio acompañado de un aumento del porcentaje de reticulocitos en sangre periférica en ambos fenotipos, siendo este menor en el caso de knockout (figura 23C). El tratamiento con EPO produjo también una disminución en el número de leucocitos circulantes, que también fue similar en ambos fenotipos (figura 23D). A B C - + - + - + - + - + - + EPO MSTN +/+ MSTN -/- MSTN +/+ MSTN -/- MSTN +/+ MSTN -/- D - + - + EPO MSTN +/+ MSTN -/- * * * 3,5 3,0 2,5 2,0 1,5 1,0 0,5 0 * * 1,6 1,4 1,2 1,0 0,8 0,6 0,4 0,2 0 * 1,8 1,6 1,4 1,2 1,0 0,8 0,6 0,4 0,2 0 * * * 1,2 1,0 0,8 0,6 0,4 0,2 0 Incremento vs día 0 (leucocitos) Incremento vs día 0 (hematocrito) Incremento vs día 0 (hemoglobina) Incremento vs día 0 (% reticulocitos) Resultados 67 Figura 23.- El tratamiento con EPO estimula la eritropoyesis in vivo de forma similar en ratones MSTN +/+ y MSTN -/- . Se trataron ratones MSTN +/+ y MSTN -/- con EPO (25 U/Kg/día, s.c.) durante 7 días, y se determinó el hematocrito (A), la concentración de Hb (B), el número de reticulocitos (C) y el número de leucocitos (D), en sangre periférica con un autoanalizador hematológico citoquímico. Los resultados se representan como media ± EEM del incremento con respecto al basal en 6 animales en cada grupo (*p<0,01). El tratamiento con EPO también modificó la maduración de células hematopoyéticas de médula ósea in vitro. En ratones wild type el tratamiento con EPO potencia la formación de CFU-E y BFU-E. Sin embargo, en ratones knockout solo se produce esta potenciación en el caso de formación de CFU-E ya que la formación de BFU-E se ve significativamente disminuida en estos ratones (figura 24A y B). Estos datos apoyan la respuesta observada en el porcentaje de reticulocitos que se detecta en ambos fenotipos tras el tratamiento con EPO, existiendo como era de esperar un porcentaje menor en el caso de ratones knockout. Por el contrario, la administración de EPO, produjo una disminución del número de CFU-GM, tanto en ratones MSTN +/+ como en ratones MSTN -/- (figura 24D), si bien en descenso fue significativamente menor en estos últimos. Resultados 68 A B C - + EPO D E - + EPO Figura 24.- La formación de colonias eritropoyéticas in vitro está disminuida en ratones MSTN -/- , mientras que la formación de colonias granulopoyéticas in vitro está disminuida tanto en ratones MSTN +/+ como en MSTN -/- . Para la realización de los ensayos de células formadoras de colonias (CFCs) se utilizaron muestras de médula ósea. A-C.- Las células se sembraron a una concentración de 2x10 5 células/placa en medio M3334. Los cultivos se mantuvieron durante 2 días para CFU-E y 3-4 para BFU-E. (A) Formación de colonias de CFU-E. (B) Formación de colonias de BFU-E. (C) Imágenes representativas de colonias BFU-E. D y E.- Las células se sembraron a una concentración de 2x10 4 células/placa en medio M3434 y se mantuvieron en cultivo durante 7-10 días. (D) Formación de colonias de CFU-GM. (C) Imágenes representativas de colonias CFU-GM. Cada barra representa la media ± EEM de 6 animales (*=p<0,01). - + - + MSTN +/+ MSTN -/- MSTN +/+ MSTN - / - Nº de colonias * * * * 120 100 80 60 40 20 0 - + - + MSTN +/+ MSTN -/- MSTN +/+ MSTN - / - - + - + MSTN +/+ MSTN -/- Nº de colonias (*10 2 ) * * * 12 10 8 6 4 2 0 * * * 40 30 20 10 0 Nº de colonias 5. DISCUSIÓN Discusión 71 Aunque la MSTN fue descrita originariamente como una proteína de expresión muscular, cada vez son más los estudios que demuestran la existencia de diversos tejidos capaces de sintetizarla. Uno de los primeros tejidos en los que se pudo demostrar la existencia de expresión de MSTN fue en el adiposo 29 , donde podría actuar regulando, de forma local, la función de los adipocitos. Posteriormente, se pudo comprobar su expresión en tejido mamario 46 , localizada principalmente en células epiteliales, habiéndose relacionado con la regulación de la diferenciación de la glándula; o en tejido cardíaco 37 , en el que, la MSTN sintetizada por cardiomiocitos y células de Purkinje podría desempeñar algún papel en la regulación del desarrollo del corazón. Más recientemente, se ha encontrado también expresión de MSTN en útero 51,52 , donde podría regular el desarrollo del miometrio y en placenta, en la que parece intervenir en la captación y transporte de nutrientes. Los datos mostrados en el presente estudio demuestran que determinados tipos de células hematopoyéticas son también capaces de sintetizar MSTN, lo que, unido a la presencia de receptores de ésta funcionales, abre una nueva posibilidad, la de que la MSTN esté también implicada en el control de la hematopoyesis. La hematopoyesis es un proceso complejo, en el cual se van a originar diferentes linajes celulares a partir de un precursor común, la célula madre hematopoyética. A diferencia de otros tejidos, la mayoría de las células hemáticas maduras tienen una corta vida media, lo que determina que el sistema hematopoyético tenga que estar reponiendo continuamente las células perdidas y adaptando su número a las necesidades del organismo en cada momento. Este proceso continuo de renovación hace que sea imprescindible la existencia de complejos sistemas de control que sean capaces, por una parte, de satisfacer las necesidades del organismo en cada momento y, por la otra, de controlar los riesgos derivados de una proliferación incontrolada. Aunque los mecanismos responsables del control de la proliferación, supervivencia y diferenciación de las células hematopoyéticas no se conocen en su totalidad, los datos existentes en la actualidad sugieren la existencia de un complejo Discusión 78 aumento de la liberación de citoquinas proinflamatorias y quimioquinas que afectan directamente la homeostasis muscular, alterando el balance proteico. Además, la presencia de estos factores produce una estimulación de la infiltración de macrófagos, linfocitos y neutrófilos en el tejido muscular, con el consiguiente aumento de la liberación de mediadores inflamatorios, a la que hay que unir el efecto destructivo de los neutrófilos activados sobre el tejido muscular 206 . Por tanto, el hecho de que hayamos sido capaces de demostrar la existencia de expresión de MSTN en leucocitos sugiere la posibilidad de que la MSTN liberada localmente por estas células sea uno de los factores implicados en la pérdida de masa muscular asociada a la infiltración inflamatoria del músculo. En este sentido, es importante señalar la existencia de numerosos estudios que demuestran la importancia de la MSTN en la aparición de atrofia muscular, tanto en condiciones experimentales 207-209 como en determinadas patologías 36,210-212 . Por tanto, aunque serían necesarios más estudios para conocer exactamente la importancia de la MSTN producida por los leucocitos en este proceso, este mecanismo de acción podría explicar la eficacia de algunos tratamientos en los que la inhibición de la MSTN reduce la pérdida de masa muscular. Un ejemplo típico sería el efecto del bloqueo de la MSTN en ratones mdx, un modelo de enfermedad de Duchenne 213-215 . Aunque este tipo de patologías no suele asociarse con cambios en la expresión de MSTN 216,217 , su bloqueo se asocia con un efecto positivo sobre la evolución de la enfermedad 94,95 . Aunque clásicamente este efecto se ha atribuido a que el bloqueo de la MSTN aumenta la capacidad de regeneración del músculo, la posibilidad de que se esté impidiendo el efecto de la MSTN liberada por las células inflamatorias que infiltran los músculos afectados podría ser una posibilidad a tener en cuenta. 6. CONCLUSIONES Conclusiones 81 1. La MSTN es uno de los factores implicados en el control de la hematopoyesis, regulando la diferenciación y supervivencia de células de estirpe mieloide, pero sin actuar sobre células linfoides. Estas acciones serían ejercidas, al menos en parte, a través de un mecanismo autocrino/paracrino que implica la activación del complejo ActRIIB/ALK4 y la regulación de ERK y p38MAPK. 2. La ausencia de MSTN no produce cambios marcados sobre la hematopoyesis in vivo, probablemente debido a la existencia de otros factores que compensan su ausencia y a los cambios fenotípicos que produce la ausencia de MSTN y que, secundariamente, son capaces de modificar la hematopoyesis. 3. La existencia de síntesis de MSTN en leucocitos sugiere su participación en la pérdida de masa muscular asociada a procesos inflamatorios del músculo. 7. BIBLIOGRAFÍA Bibliografía 85 1. Hogan,B.L., Blessing,M., Winnier,G.E., Suzuki,N., & Jones,C.M. Growth factors in development: the role of TGF-beta related polypeptide signalling molecules in embryogenesis. Dev. Suppl 53-60 (1994). 2. Korc,M., Haussler,C.A., & Trookman,N.S. Divergent effects of epidermal growth factor and transforming growth factors on a human endometrial carcinoma cell line. Cancer Res. 47, 4909-4914 (1987). 3. 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