Genes implicados en la glomeruloesclerosis focal y segmentaria autosómica dominante

  GENES IMPLICADOS EN LA GLOMERULOESCLEROSIS FOCAL Y SEGMENTARIA AUTOSÓMICA DOMINANTE Departamento de Medicina Facultad de Medicina y Odontología Universidad de Santiago de Compostela Memoria presentada por la Licenciada María Sánchez Ares para optar al Grado de Doctora por la Universidad de Santiago de Compostela. Santiago de Compostela, 2011  ISBN 978-84-9887-766-3 (Edición digital PDF)   La presente tesis ha sido realizada gracias a la financiación otorgada por el Contrato Predoctoral María Barbeito concedido por la Xunta de Galicia. La imagen de la portada que representa la estructura normal del podocito mediante microscopía electrónica de barrida ha sido obtenida del artículo de Smoyer WE & Mundel P, J Mol Med 76:172-183 (1998).    El Doctor D. Xosé Manuel Lens Neo, Licenciado en Medicina por la Universidad de Santiago de Compostela, Doctor en Medicina por la Universidad de Barcelona y Facultativo Especialista de Nefrología, y el Doctor D. Juan Jesús Gómez-Reino Carnota, Licenciado en Medicina por la Universidad Complutense de Madrid, Doctor en Medicina por la Universidad Complutense de Madrid, Catedrático de Medicina de la Universidad de Santiago de Compostela, CERTIFICAN: Que la presente Tesis Doctoral GENES IMPLICADOS EN LA GLOMERULOESCLERORIS FOCAL Y SEGMENTARIA AUTOSÓMICO DOMINANTE de la Licenciada en Biología Molecular y Biotecnología Dª María Sánchez Ares, ha sido realizado bajo nuestra dirección en el Departamento de Medicina, Facultad de Medicina y Odontología, considerándola en condiciones para optar al Grado de Doctor y autorizándola para su defensa ante el Tribunal Correspondiente. Y, para que conste a los efectos oportunos, firman el siguiente certificado en Santiago de Compostela a 5 de Mayo del 2011. Fdo. Dr Xosé Manuel Lens Neo Fdo. Prof Juan Jesús Gómez-Reino Carnota    AGRADECIMIENTOS Este trabajo que aquí presento es el resultado del esfuerzo conjunto de muchas personas que, con palabras y hechos, me han ayudado a llegar al final de este camino. En primer lugar me gustaría darle las gracias a mi director de tesis, el Dr Lens. Gracias por haberme permitido entrar a formar parte de su grupo de investigación y poder llegar a realizar esta tesis. Gracias por haber confiado en mí y haberme dado la libertad de poner en práctica alguna disparatada idea. Gracias a Marina, compañera y amiga, que no solo me ha ayudado en el trabajo diario de laboratorio sino que también ha sido mi apoyo en los momentos en los que pensaba que este trabajo no saldría adelante. Gracias a mis dos mentoras y amigas en este mundo de la ciencia, Patri y Sonia. Para mi sois un ejemplo de personas y profesionales. Gracias Patri, porque aun estando lejos nunca has dejado de tener un momento para ayudarme, escucharme y darme apoyo en los momentos más difíciles. Gracias por haberme acogido en tu casa y hacer que pasase tres semanas que guardo como uno de los mejores recuerdos de mi vida. Gracias Sonia por haberme enseñado a no rendirme frente a nada ni a nadie. Por haberme escuchado como doctoranda y amiga y haberme enseñado, creo que sin saberlo, como se puede llegar a ser una buena investigadora. Y por supuesto, gracias por esas tardes de compras, discusiones y aprendizaje de vocabulario. Gracias a mis chicos del lado oscuro, Ezequiel, Bruno y Toño. Me habéis llevado por el camino de la perdición y de la risa. Habéis estado siempre ahí para echarme una mano, muchas veces dejando vuestro trabajo de lado. Gracias por todas las charlas sobre todas las cosas y sobre ninguna, sin duda he aprendido de vosotros lo que es la generosidad sin pedir nada a cambio. Gracias a mis compañeros de laboratorio durante estos años, a los que están y a los que ya se han ido (desde el 1 al 5 y ahora desde el 2 al 12, laboratorios no numerados incluidos). Gracias Miguel Nefro por enseñarme a manejar el Illustrator, “tienes razón”, las figuras se ven mejor. Gracias Jana por haber acudido cada vez que me volvía loca con el Photoshop y con otras cosas. Gracias a los guapetones de Anatomía Patológica (Elena y Ángel) por haberme dejado molestarles y haberme hecho reír tanto. Algun@s os habéis convertido en mucho más que compañeros. Gracias a todas mis amig@s del colegio, instituto, carrera y postcarrera por haberme apoyado durante todos estos años. Gracias a mis compañeras de piso por haberme ayudado a reírme después de un duro día de trabajo. Gracias a mi madrina, mi tía y el resto de mi familia por haber estado ahí animándome y dándome los mejores consejos. Desde donde estéis gracias. Por último, el mayor GRACIAS, sin dudarlo, es para mis padres. No hay palabras en el mundo para describir lo que sois para mí. GRACIAS A TODOS y CARPE DIEM   A mis Padres que han colaborado en cada paso de esta tesis con su apoyo y cariño.     17 ABREVIATURAS ACTN4 Alfa actinina 4 AD Autosómica dominante ADH Hormona antidiurética ADN Ácido desoxirribonucleico AKT Serina-Treonina quinasa AMP Adenosín 5’ monofosfato ANK Anquirina AR Autosómica recesiva ARNm Ácido ribonucleico mensajero BAD Proteína agonista de muerte celular asociada a BCL2 BCL2 Linfoma de célula B 2 BFG Barrera de filtración glomerular C Conservativo C3 Factor del complemento C3 CaM Calmodulina CCD Dispositivo de carga acoplada CD2 Cúmulo de diferenciación 2 CD2AP Proteína de asociación a CD2 CDH3 P-caderina CH Dominio de unión a la actina homólogo la calponina cM Centimorgan COL4A1 Colágeno tipo IV alfa 1 COL4A6 Colágeno tipo IV alfa 6 COOH-terminal, C-terminal Extremo carboxilo-terminal CP Proteína bloqueadora de la actina CREB Proteína de unión al elemento de respuesta al AMPc  18 A breviaturas DAAM Del inglés Dishevelled-Associated Activator of Morphogenesis DAD Del inglés Diaphanous autoinhibitory domain DAG Diacilglicerol DIA Del inglés Diaphanous homolog (Drosophila) DID Del inglés Diaphanous inhibitory domain dNTP Desoxirribonucleósidos trifosfato EDTA Ácido etilendiaminotetraacético EMD Esclerosis mesangial difusa ERK Quinasa regulada por señales extracelulares Exo I Exonucleasa I FH1 Dominio de homología a formina 1 FH2 Dominio de homología a formina 2 FHOD Del inglés Formin Homology Domain protein FMN Del inglés Formin FMNL Del inglés Formin-like FN1 Fibronectina 1 GEFS Glomeruloesclerosis Focal y Segmentaria GMP Guanosina 5’ monofosfato HA Hipertensión arterial IgM Inmunoglobulina M IgSF Superfamilia de las inmunoglobulinas INF2 Formina invertida 2 (Inverted formin 2) IP3 Inositol 1,4,5-trisfosfato IP3R Receptor de IP3 IRT Insuficiencia Renal Terminal ITGA3 Integrina alfa 3 LCK Proteína tirosina quinasa específica de leucocitos LM Laminina mA Miliamperios  19 A breviaturas MAC Complejo de Adhesión de Membrana MAGUK Guanilato quinasas asociadas a membrana MAP Proteína quinasa mitogénica activa MEK MAP quinasa quinasa MGB Membrana glomerular basal MgCl2 Cloruro de magnesio Min Minutos mM Milimolar N No conservativo NaCl Cloruro de sodio ND Dato no disponible NEPH1 Proteína de unión a nefrina 1 NFAT Factor nuclear de activación de células T NF-κB Factor nuclear kappa B ng Nanogramo NH2-terminal, N-terminal Extremo amino-terminal NPHS1 Nefrina NPHS2 Podocina ºC Grados centígrados pb Pares de bases PCR Reacción en Cadena de la Polimerasa PI3K Fosfoinosítido-3-hidroxiquinasa PIP2 Fosfatidilinositol 4,5-bifosfato PIP3 Fosfatidilinositol 3,4,5-trifosfato PKB Proteína quinasa B PKC Proteína quinasa C PKG Proteína quinasa dependiente de GMP cíclico PLC Fosfolipasa C PLCE1 Fosfolipasa C épsilon 1  20 A breviaturas PLCγ1 Fosfolipasa C gamma 1 PLCXc, PLCYc Dominios catalíticos denominados X e Y PT Post-trasplante RA1 Dominio de asociación a Ras 1 RA2 Dominio de asociación a Ras 2 RasGEF Dominio intercambiador de nucleótidos de guanina de Ras RE Retículo endoplasmático s Segundos SAP Fosfatasa alcalina de camarón SH3 Dominio de homología 3 con las Src SN Síndrome Nefrótico SNF Síndrome Nefrótico Finlandés SP Dominio espectrina SV40 Virus del simio 40 TBE Ácido bórico-tris TRP Receptor de potencial transitorio TRPA Receptor de potencial transitorio tipo anquirina TRPC6 Receptor de potencial transitorio catiónico 6 TRPM Receptor de potencial transitorio tipo melastina TRPML Receptor de potencial transitorio tipo mucolipina TRPN Receptor de potencial transitorio tipo no mecanopotencial TRPP Receptor de potencial transitorio tipo poliquistina TRPV Receptor de potencial transitorio tipo vaniloide. UTR Región no traducida VIH Virus de la inmunodeficiencia humana WASP 2 Familia de proteínas del síndrome Wiskott-Aldrich WH2 Dominio C-terminal homólogo a WASP 2 WT Forma salvaje  21 A breviaturas ZO-1 Zonula ocludens-1 Α Alfa Β Beta γ Gamma Κ Kappa µl Microlitro     23  RESUMEN El término Glomeruloesclerosis Focal y Segmentaria (GEFS) describe un patrón histológico caracterizado por la presencia de ciertos glomérulos con esclerosis (focal) en parte de su superficie (segmentaria). Esta histología puede ser el resultado de numerosas etiologías entre las que se encuentra la genética. Dentro de las formas genéticas está la GEFS de herencia autosómica dominante (AD) con afectación exclusivamente renal. Aunque la diversidad de síntomas clínicos es característica de la patología, un rasgo que siempre está presente es la proteinuria. La ausencia de un tratamiento efectivo para esta enfermedad provoca una progresiva disminución de la función renal que acaba por desembocar en una insuficiencia renal terminal. Esto genera que el paciente requiera una terapia de reemplazamiento, bien sea diálisis, trasplante o ambas. La proteinuria está generada por una alteración en la barrera de filtración glomerular (BFG) compuesta por los capilares fenestrados, la membrana glomerular basal y las prolongaciones podocíticas. Hasta el momento se han descrito tres genes implicados en la generación de la GEFSAD: la α-actinina 4 (ACTN4), el canal de receptor transitorio de potencial catiónico 6 (TRPC6) y la formina invertida 2 (INF2). Estas tres proteínas presentan expresión podocítica y están muy relacionadas con la dinámica del citoesqueleto. Hasta el momento solo se ha identificado el gen responsable de la patología en unas 30 familias de todo el mundo, entre ellas una de las 5 familias que componen nuestra cohorte. El análisis por secuenciación directa de INF2 en dicha familia reveló que los individuos afectos presentaban una mutación en el exón 6 de dicho gen, lo que provocaba la sustitución de una leucina por una prolina en la posición 245 de la proteína. Esta mutación se localiza en el dominio inhibidor de la proteína (DID).   24 Resumen Es la primera vez que se identifica este cambio patogénico, ya que todos los encontrados anteriormente se situaban en los cuatro primeros exones del gen. Este hallazgo refuerza la responsabilidad de INF2 en esta patología además de ampliar la región de localización de mutaciones en el gen.   25  ABSTRACT The term Focal Segmental Glomerulosclerosis (FSGS) describes a histologic pattern characterized by the presence of some glomeruli with sclerosis (focal) in a significant part of its surface (segmental). This histology can be the result of numerous etiologies, being genetics one among of them. The autosomal dominant (AD) inheritance of FSGS with exclusive renal involvement is one of these genetic forms. Although the diversity of clinical symptoms is characteristic of the disease. Proteinuria is a trait that is always present. The absence of an effective treatment for the disease causes a progressive loss of renal function with a likely outcome to end-stage renal disease (ESRD). That provokes a requirement of a renal replacement therapy: dialysis, transplantation or both. Proteinuria is caused by an alteration in the glomerular filtration barrier (GFB) composed of a fenestrated endothelium, the glomerular basement membrane and the foot processes of the podocytes. To date only three genes have been involved in the AD-FSGS: the α-actinin 4 (ACTN4), the transient receptor potential cation channel 6 (TRPC6) and the inverted formin 2 (INF2). These three proteins have podocyte expression and are closely related to the dynamics of the cytoskeleton. So far, the gene responsible for the disease is only known in 30 families worldwide, including one of the 5 families in our cohort. Direct sequencing analysis of INF2 gene in this family revealed that affected individuals had a mutation in exon 6. This change causes a substitution of leucine for proline at position 245 of the protein. This mutation is located in the inhibitor domain of the protein (DID). It is the first time that this pathogenic change is identified, since all previously mutations found were at the first four exons of the gene. This  32 Introducción densa, que va a formar parte del aparato yuxtaglomerular (también compuesto por las células yuxtaglomerulares y las células mesangiales extraglomerulares), que es el encargado de regular el funcionamiento de la nefrona ya que es el responsable de la síntesis de la renina. A partir de esta región el túbulo distal se hace más tortuoso formando el túbulo contorneado distal, el cual se une a un conducto colector por medio del túbulo colector. Los túbulos colectores de varias nefronas se unen en el mismo conducto colector. Los espacios que quedan entre los túbulos renales están ocupados, además de por vasos sanguíneos y linfáticos, por tejido conectivo laxo (Figura 1.2.). 1.1.1.1. Mecanismo de filtración renal La formación de la orina está determinada por la coordinación de tres procesos distintos, la filtración, la reabsorción y la secreción, que tienen lugar a lo largo de la nefrona. En el glomérulo se lleva a cabo el primer paso de la filtración del plasma sanguíneo en dirección a la cápsula de Bowman generándose el ultrafiltrado. La reabsorción hacia la sangre de determinados componentes que se han filtrado útiles al organismo tiene lugar desde el lumen de los túbulos y la secreción de aquellas sustancias que no han sido filtradas pero que deben ser excretadas ocurre desde la sangre al interior del túbulo. La sangre que llega al riñón lo hace por medio de la arteria renal que se va ramificando hasta dar lugar a las arteriolas aferentes, cada una de las cuales está encargada de irrigar un único glomérulo. Al entrar en el glomérulo, la arteriola da lugar a la formación de los capilares glomerulares. La porción terminal de estos capilares se une para formar la arteriola eferente, a través de la cual la sangre abandona el glomérulo.  33 Introducción 1.1.1.2. Filtración glomerular El primer obstáculo para la filtración del plasma viene dado por la presencia de la barrera de filtración glomerular. Ésta se encuentra constituida por tres capas que interaccionan entre sí: el endotelio capilar fenestrado, la membrana glomerular basal y los podocitos. La capacidad del riñón para retener proteínas plasmáticas es esencial para la vida. Anormalidades genéticas o adquiridas en cualquiera de las capas que componen la barrera se han relacionado con la alteración de la filtración glomerular, la aparición de proteinuria y la generación de enfermedades renales1. 1.1.1.2.1. Composición de la barrera de filtración glomerular 1.1.1.2.1.1. Endotelio capilar Los tejidos capilares están formados por una capa de células endoteliales extremadamente aplanada, una gruesa lámina basal y una pequeña red de fibras reticulares. Los capilares glomerulares son fenestrados, es decir, presentan unos poros, pero a diferencia de otros capilares fenestrados carecen de diafragma. El área fenestrada representa del 20-50% de toda la superficie de células endoteliales. El lumen del endotelio está recubierto por una capa de glicocálix que le confiere una elevada carga negativa (Figura 1.3)2. Las presiones que tienden a expulsar líquido de los capilares son mayores que las que tienden a retenerlo, debido a lo cual se filtra líquido a través de las paredes de los capilares hacia la cápsula de Bowman.  34 Introducción 1.1.1.2.1.2. Podocitos Los podocitos son células epiteliales polarizadas altamente diferenciadas. Constan de un voluminoso cuerpo celular con unas largas prolongaciones podocíticas primarias que se ramifican dando lugar a los procesos podocíticos secundarios o pedicelos. El cuerpo celular contiene una gran cantidad de orgánulos lo cual es síntoma de un elevado nivel anabólico y catabólico. Presentan unas largas prolongaciones denominadas procesos podocíticos primarios que se ramifican dando lugar a los pedicelos. Las prolongaciones de podocitos adyacentes se interdigitan entre sí dando lugar a la formación de los poros de filtración. Una característica importante de la estructura podocítica es la presencia de un citoesqueleto muy desarrollado responsable de la forma celular y el mantenimiento de los procesos podocíticos. El cuerpo celular y los procesos primarios están compuestos principalmente por microtúbulos y filamentos intermedios. Por su parte la arquitectura de los pedicelos se mantiene por la presencia de haces de filamentos de actina que se extienden a lo largo del eje longitudinal de los pedicelos, y por una red de actina subcortical que se dispone rodeando los haces de actina de modo que estos no se encuentran en contacto directo con la membrana plasmática. El citoesqueleto de los procesos podocíticos es el responsable del establecimiento de las uniones entre podocitos y de la interacción de dichos podocitos con la MGB (Figura 1.3)3. 1.1.1.2.1.3. Membrana glomerular basal La MGB está situada entre la capa de podocitos y la de células endoteliales, jugando un papel fundamental en procesos de filtración glomerular, adhesión, migración y diferenciación celular. Se trata de un tipo  35 Introducción especial de membrana ya que muestra un elevado espesor. Entre sus componentes más importantes se encuentran: el colágeno tipo IV, la laminina, nidogén o los proteoglicanos4. El colágeno tipo IV es el componente estructural más abundante de las membranas basales donde forma una estructura reticular que actúa como esqueleto. Cada monómero de colágeno está compuesto por tres cadenas polipeptídicas que se pliegan formando una tripe hélice. Se conocen 6 tipos de cadenas polipeptídicas denominadas cadenas alfa (α) que están codificadas por seis genes distintos (COL4A1-COL4A6). En la MGB encontramos el colágeno α3α4α5(IV). Otro de los componentes más abundantes de la membrana glomerular basal son las lamininas. Éstas constituyen una gran familia de glicoproteínas heterotriméricas compuestas por una cadena α, una β (beta) y una γ (gamma) que se organizan en una estructura en forma de cruz. Hasta el momento se han identificado 5 cadenas α, 4 cadenas β y 3 cadenas γ, que dan lugar a la formación de 15 isoformas distintas de lamininas. En el caso de la membrana glomerular basal la isoforma que está presente es la laminina α5, β2, γ1 (LM-521)5. El nidogén, también conocido como entactina, es una glicoproteína sulfatada que contiene tres dominios globulares mediante los cuales se une al colágeno, la laminina y el perlecán estableciendo puentes entre ellos6. El cuarto de los componentes más abundantes en las membranas son los proteoglicanos. Se trata de glicoproteínas compuestas por un núcleo proteico al que se anclan, normalmente, cadenas de glucosaminoglicanos heparán sulfato que generan una fuerte naturaleza aniónica. En la MGB se encuentran mayoritariamente dos tipos de proteoglicanos, el perlecán y la agrina (Figura 1.3)7.  36 Introducción 1.1.1.2.1.4. Interacción entre podocitos: diafragma de filtración glomerular Los pedicelos adyacentes se unen entre sí mediante una variante de las uniones adherentes denominada diafragmas de filtración (slits diaphragms) dando lugar a la formación de pequeños espacios intercelulares denominados poros o hendiduras de filtración que permiten la salida del filtrado plasmático de los capilares glomerulares y su entrada en el espacio capsular. Se cree que son numerosas las proteínas implicadas en este tipo de unión que presentan un papel estructural o de transducción de señales, aunque hasta el momento se conoce un número reducido. Estudios moleculares sugieren que las proteínas del diafragma de filtración forman una estructura similar a una cremallera8,9. Ya en los años 70, Rodewald y Karnoswsky postularon que este diafragma presentaba una estructura en forma de cremallera, en donde, de la membrana lateral de los pedicelos de podocitos adyacentes se extendían unas varillas que conectaban con un filamento central10. Entre las proteínas que forman parte del diafragma de filtración se encuentran: zonula ocludens-1, la nefrina, la proteína de unión a nefrina 1, FAT, la podocina, la proteína asociada a CD2 y la P-cadherina. La primera que se localizó fue la proteína zonula ocludens-1 (ZO-1), que es un miembro de la familia de las guanilato quinasas asociadas a membrana (MAGUK). Esta proteína se localiza en la cara citoplasmática de estas uniones intercelulares situadas en los pedicelos, expresándose de una manera continua en los puntos de inserción de los diafragmas de filtración. Su función se relaciona con la organización de las señales de transducción y se ha visto que es capaz de interaccionar con proteínas implicadas en las uniones célula-célula (ocludina, α-catenina) y con el citoesqueleto de actina (espectrina, F-actina)11.  37 Introducción Una de las proteínas más conocida, y más importante, de las que se encuentran en el diafragma es la nefrina. El gen que codifica para esta proteína, NPHS1, fue descubierto en el año 1998 como responsable del síndrome nefrótico tipo 112. Es una glicoproteína transmembrana tipo 1, perteneciente a la superfamilia de las inmunoglobulinas (IgSF) y homóloga al complejo de moléculas de adhesión a membrana (MACs). Su expresión es específica de los podocitos glomerulares y predominantemente se localiza en el diafragma de filtración. Forma homodímeros con otras moléculas de nefrina por medio de su porción extracelular actuando como receptor de superficie que permite la transmisión de señales al citoesqueleto de actina y constituye el “esqueleto” del diafragma de filtración 13 14. Relacionada con la nefrina se ha identificado la proteína de unión a nefrina 1 codificada por el gen NEPH1 y que pertenece a la superfamilia de las inmunoglobulinas15. Como su nombre indica, esta proteína interacciona con la nefrina formando complejos oligoméricos, relación que parece necesaria para mantener las características normales de la BFG16-18. FAT es una proteína transmembrana miembro de la familia de las cadherinas que presenta el mismo patrón de expresión que la nefrina y ZO1. Participa en el establecimiento de interacciones homofílicas dependientes de Ca+2.19. También podría participar directamente en la polimerización de la actina durante la formación de los procesos podocíticos así como en su mantenimiento20. Mediante estudios de clonación posicional se descubrió un nuevo gen, NPHS2, que codifica para una proteína integral de membrana denominada podocina que pertenece a la familia de las estomatinas, las cuales están involucradas en el andamiaje del citoesqueleto. Su nombre proviene del lugar en el que se expresa de forma exclusiva, los podocitos, en concreto se ha visto que forma parte del diafragma de filtración. La mutación del gen  38 Introducción que codifica para esta proteína provoca el síndrome nefrótico autosómico recesivo resistente a esteroides tipo 2 21. La podocina junto con la nefrina y la NEPH1 forman un complejo proteico que actúa como un receptor transmembrana y que media la transducción de señales20. Otra de las proteínas identificadas como constituyente del diafragma de filtración fue la proteína asociada a CD2 (CD2AP). En un primer momento fue identificada como una proteína que se une al dominio citoplasmático de CD2 y que potencia su agrupamiento. CD2 es un marcador de células T e interviene favoreciendo la interacción de estas células con las células presentadoras de antígenos22. Posteriormente se vio que esta proteína presentaba expresión renal, en concreto se localiza en el podocito, y en células de los túbulos colectores y proximales23,24. En el podocito, CD2AP se une directamente a la F-actina por su extremo carboxilo-terminal (COOHterminal, C-terminal)25, y establece a su vez enlaces con la nefrina, es decir, parece que actúa como proteína de unión entre el citoesqueleto de actina y la nefrina26. Además se ha visto que CD2AP también interacciona con la podocina en el diafragma de filtración27. Distintos estudios han revelado que la podocina, la nefrina y CD2AP se localizan en regiones concretas de la membrana plasmática de los podocitos que se denominan balsas lipídicas (lipid rafts). Se trata de microdominios de la membrana que contienen altas concentraciones de colesterol y esfingolípidos. Estas balsas presentan gran importancia en procesos de regulación y transducción de señales así como en la adhesión celular. La podocina puede unirse directamente al colesterol y reclutarlo al diafragma de filtración, contribuyendo así a la formación de un supercomplejo compuesto por lípidos y proteínas. La presencia del colesterol es necesaria para el correcto funcionamiento de los canales iónicos asociados a la podocina27,28.  39 Introducción Por último, dentro de las proteínas más conocidas y mejor estudiadas del diafragma de filtración se encuentra la P-cadherina (CDH3). Las cadherinas constituyen una familia de glicoproteínas implicadas en la adhesión homofílica célula-célula dependiente de Ca+2 y se encuentran unidas al citoesqueleto de actina por medio de las cateninas α, β, γ. En concreto esta cadherina posee un lugar de unión a la β-catenina en el lado citoplasmático. Algunos estudios sugieren que interacciones homofílicas de las P-cadherinas se localizan en el diafragma formando puentes entre procesos podocíticos adyacentes (Figura 1.3.)29,30. 1.1.1.2.1.5. Interacción de los podocitos con la membrana glomerular basal La interacción del citoesqueleto con la MGB es fundamental para mantener la arquitectura de los procesos podocíticos. Los podocitos establecen contacto a través de sus pedicelos con la MGB por medio de las fibras de estrés, filamentos de actina contráctiles de gran tamaño entrelazados por la α-actinina. En dicha interacción intervienen moléculas de matriz de la MGB, las cuales actúan como ligandos para los receptores de adhesión transmembrana situados en los procesos podocíticos. Así mismo intervienen moléculas responsables de la señalización célula-matriz y de la transmisión de fuerzas mecánicas que fuerzan al citoesqueleto para formar un agregado de adhesión molecular31. Las integrinas son los principales receptores de adhesión celular que median la unión célula-matriz. Su nombre hace referencia a su capacidad de integrar el exterior celular (matriz extracelular) con el interior celular (citoesqueleto) Constituyen una familia de proteínas transmembrana heterodiméricas y glicosiladas que actúan como receptores de adhesión celular. Cada molécula consta de dos subunidades, una α y otra β, que se  40 Introducción Figura 1.3. Estructura simplificada de la Barrera de Filtración Glomerular. unen de forma no covalente. Los dominios extracelulares de las integrinas se unen a ligandos de la matriz, mientras que los dominios citoplasmáticos forman complejos multimoleculares con proteínas implicadas en la señalización celular así como con proteínas adaptadoras que proporcionan una conexión con el citoesqueleto. Como las integrinas carecen de actividad enzimática intrínseca deben reclutar proteínas que controlen los procesos dependientes de adhesión. Entre ellas podemos encontrar proteínas intracelulares del citoesqueleto (talina, vinculina, paxilina y α-actinina) o moléculas implicadas en procesos de señalización (quinasas, fosfatasas). Las integrinas activan distintas cascadas de señalización encargadas de la organización del citoesqueleto, la regulación de genes y de diversos procesos y funciones celulares 32-34. En el podocito la integrina que encontramos es la α3β1 que interacciona con los distintos componentes de la MGB.  41 Introducción Además de las integrinas también tienen su papel en esta unión el complejo de los distroglicanos. Éstos, al igual que las integrinas son moléculas de adhesión compuestas por dos subunidades denominadas α y β. La subunidad α establece por uno de sus lados interacciones con componentes de la MGB como la laminina o la agrina, y por su dominio Cterminal se une a la subunidad β. Ésta cruza la MGB y se une mediante su dominio citosólico a la actina por medio de otras proteínas como la distrofina o utrofina (Figura 1.3.)35,36. 1.1.1.3. Selectividad de la barrera de filtración El proceso mediante el cual la barrera realiza el ultrafiltrado del plasma sanguíneo ha sido objeto de debate desde los años 7037, y aún en la actualidad sigue sin haber un consenso sobre cómo se produce. No se conocen con absoluta certeza los mecanismos que determinan cómo la BFG excluye la entrada de proteínas en el espacio urinario y si hay algún componente de la misma que tenga una mayor implicación en la selectividad. Parece que dos de las características más importantes de los solutos, tamaño y carga, son las que van a determinar su paso o restricción en la BFG38. La existencia de una selectividad por tamaño está universalmente aceptada, de modo que la barrera es muy permeable al agua, electrolitos y moléculas de pequeño tamaño, mientras que opone resistencia al paso de proteínas del tamaño de la albúmina o mayor. Determinar que capa o capas de la BFG están más implicadas en la selectividad por tamaño sigue siendo objeto de numerosas investigaciones. En el caso de la proteinuria glomerular existen estudios que aportan distintas conclusiones sobre cuál de los componentes de la barrera constituye  48 Introducción ambos se internalicen en vesículas endosomales. El repertorio de ligandos de la megalina es muy variado: proteínas de unión a vitaminas, enzimas e inhibidores de enzimas, hormonas, toxinas, lipoproteínas, albúmina, hemoglobina, mioglobina… En el caso de la cubilina, algunos ligandos son los mismos que los de la megalina (proteínas de unión a vitamina D, albúmina, hemoglobina, mioglobina), pero también presenta algunos exclusivos como es la transferrina o la apolipoproteína AI52. El receptor se recicla a la membrana plasmática y su ligando proteico es transferido a los lisosomas donde se hidrolizan. Los aminoácidos resultantes retornan a la circulación a través de la membrana contraluminal53. Cuando se producen alteraciones en la selectividad por tamaño, y puede que también por carga, en la pared capilar glomerular se incrementa el paso de proteínas de mediano y alto peso molecular a la luz tubular. Estas proteínas compiten entre ellas y con las de bajo peso molecular por la reabsorción por las células epiteliales del túbulo proximal. En consecuencia, cuando la carga filtrada de proteínas sobrepasa la capacidad de los sistemas de transporte estas comienzan a aparecer en la orina final. Esta alteración en el proceso de recaptación provoca la alteración de la señalización en la región tubular proximal y de la actividad de factores de transcripción. Estos fenómenos provocan la generación de radicales de oxígeno dependientes de la proteína quinasa C (PKC), la translocación nuclear de NF-κB (factor nuclear kappa B) asociada a la regulación de genes y la síntesis de varias proteínas inflamatorias que generan fibrosis del intersticio54. Independientemente de las causas que determinan la proteinuria, un número creciente de estudios experimentales y clínicos indican que el paso de proteínas a través de la barrera capilar glomerular provoca efectos secundarios en el riñón. Así, en la mayoría de las enfermedades  49 Introducción glomerulares numerosas evidencias muestran una clara asociación entre la magnitud de la proteinuria y la tasa de declinación de la función renal. Los pacientes con proteinuria en un rango nefrótico (>3 gramos/24 horas) al inicio de la enfermedad tienen peor pronóstico que aquellos con menor proteinuria. Por otra parte, la disminución de la proteinuria se asocia a una disminución de la progresión del daño renal. Es interesante, sin embargo, que la correlación entre el daño tubular y la progresión de la enfermedad renal es mayor que entre ésta y el daño glomerular. 1.2.1. Formas hereditarias de la Glomeruloesclerosis Focal y Segmentaria En los últimos años los avances de la investigación en el campo de la genética han permitido mejorar el conocimiento de diferentes enfermedades renales hereditarias. Entre ellas se encuentran las formas familiares que presentan un patrón histológico de GEFS, que incluyen a las enfermedades renales sindrómicas y las no sindrómicas. Aunque el objetivo de esta tesis es el estudio de los genes responsables de la GEFS con herencia autosómica dominante (AD), con afectación exclusivamente renal y que normalmente aparece en edad adulta, debemos hacer una reseña sobre los genes que causan la GEFS autosómica recesiva (AR) debido a la estrecha relación que existe entre todos ellos.  50 Introducción 1.2.1.1. Glomeruloesclerosis focal y segmentaria de herencia autosómica dominante 1.2.1.1.1. Diagnóstico: características clínicas y biopsia renal Como se ha mencionado anteriormente, la determinación de la etiología de GEFS resulta fundamental. Para ello lo primero que se debe tener en cuenta es la historia clínica del paciente (enfermedades anteriores, ingesta de fármacos, resultado de analíticas…), ya que es necesario descartar que pueda ser una forma secundaria a otra patología. Al tratarse de una enfermedad hereditaria la historia familiar es de gran importancia, ya que proporciona información de si otros miembros de la familia padecen o han padecido alteraciones renales, además de permitir determinar si se trata de una forma de herencia autosómica dominante. Otros dos rasgos de vital importancia son los valores de proteinuria y creatinina en suero que proporcionan información sobre el estado de la función renal. Uno de los métodos fundamentales para el diagnóstico de esta enfermedad es la realización de una biopsia renal. La microscopía óptica revela la presencia de zonas de esclerosis parciales en algunos glomérulos y un engrosamiento de la matriz mesangial y de la MGB debido al aumento de la síntesis de colágeno tipo IV. La lesión contiene a menudo un depósito de material eosinófilo. Los podocitos aparecen como células alargadas y con numerosas vacuolas. Se observan sinequias entre la cápsula de Bowman y el ovillo de capilares. En estados más avanzados de la enfermedad la esclerosis de los glomérulos es global y se observa atrofia tubular y fibrosis intersticial por lo que la biopsia no aporta información para el diagnóstico de la enfermedad. La microscopía electrónica permite realizar un estudio a nivel ultraestructural. Los podocitos además de presentar vacuolas aparecen  51 Introducción Figura 1.4. Histopatología de la biopsia renal del paciente III:3 de la familia CHUS_GEFS_II. A. Tinción PAS (del inglés periodic acid-Shiff) (X330) que muestra una distribución focal y segmentaria de las lesiones escleróticas. El glomérulo de la imagen muestra un daño esclerótico segmental y una monocapa de podocitos que se superpone a la zona dañada. B. El estudio con microscopía electrónica de la biopsia muestra una hiperplasia de los podocitos con fusión de los procesos podocíticos, un aumento irregular del espacio subendotelial y ausencia de depósitos densos (X 11.000; Philip 208 SM).CEL END: célula endotelial, CEL MES: célula mesenquimal. Cortesía del Dr Eduardo Vázquez Martul. CHUAC. A Coruña. A B separados de la MGB. Se observa una fusión de los procesos podocíticos y una pérdida de los poros de filtración (Figura 1.4.). Los estudios de inmunofluorescencia generalmente muestran depósitos de IgM (inmunoglobulina M) y C3 (factor del complemento C3) en la inmunofluorescencia. Se cree que estos depósitos no representan complejos inmunes ni son patogénicos y que son el resultado de atrapamiento de proteínas plasmáticas. 1.2.1.1.2. Tratamiento y evolución del daño renal 1.2.1.1.2.1. Tratamiento inicial En un primer momento los pacientes con GEFS-AD son tratados con corticoides y ciclosporina. Hasta el momento no se conoce ningún caso con  52 Introducción herencia autosómica dominante que no sea resistente al tratamiento con esteroides. 1.2.1.1.2.2. Evolución de la esclerosis glomerular: insuficiencia renal terminal El mecanismo responsable de la generación de la esclerosis no se conoce con exactitud. En un primer momento se consideraron las células mesangiales como las principales responsables del desarrollo de la GEFS debido a un aumento en la producción de proteínas de la matriz que obliterarían los capilares. No obstante, no hubo una demostración que explicase con claridad este hecho. En la década de los 80 se estableció que era el podocito el mayor responsable de la progresión de la glomeruloesclerosis principalmente por dos hechos: que los podocitos del riñón adulto eran incapaces de replicarse y que la pérdida de podocitos provoca la disminución de la separación del ovillo de capilares de la cápsula de Bowman. La respuesta característica de los podocitos frente a un daño es un cambio en su forma. Se produce una simplificación gradual del patrón de interdigitación de los procesos podocíticos que sufren un proceso de fusión, también denominado borramiento de los procesos podocíticos. Los podocitos se convierten en células alargadas y aplanadas y el número de poros de filtración se reduce. Además sufren un aumento de vacuolas lipídicas y la aparición de depósitos hialinos. Estos daños estructurales permiten un aumento de la filtración proteica. Progresivamente pierden sus conexiones con la MGB provocando su separación de la misma. El que se produzca una pérdida de podocitos genera que los podocitos vecinos se hipertrofien para suplir su función, lo que los hace más vulnerables a daños. Este hecho será el responsable del carácter progresivo de la degeneración glomerular así como del fallo renal55.  53 Introducción Al desprenderse, los podocitos dejan áreas “desnudas” en la MGB. Como una de las funciones de los podocitos es dar estabilidad a los capilares al amortiguar los gradientes de presión externos generados a través de la pared del capilar, al perderse provoca la formación, en esas regiones de la membrana, de unas protuberancias que entran en contacto con las células parietales y la cápsula de Bowman, generándose una adhesión del ovillo de capilares con la cápsula, es decir, una sinequia. Este evento marca el inicio del desarrollo de la glomeruloesclerosis, que en un primer momento afectará sólo a parte de algunos glomérulos (focal y segmentaria)56,57. En biopsias de GEFS también se observa daño tubular y fibrosis intersticial. El daño en los podocitos produce que aumente la cantidad de proteínas plasmáticas que alcanzan los túbulos. Esto genera una excesiva reabsorción proteica en los túbulos proximales, los cuales responden secretando citoquinas que generan una respuesta inflamatoria. Esta reacción provoca una fibrosis intersticial y una degeneración tubular58. La ausencia de un tratamiento efectivo para la GEFS-AD genera que el daño glomerular vaya evolucionando, generándose una esclerosis global. Esto provoca una reducción de la función renal que acaba desencadenando en una insuficiencia renal terminal. Los pacientes son sometidos a diálisis hasta que reciben un trasplante renal. 1.2.1.1.3. Genes responsables de la glomeruloesclerosis focal y segmentaria autosómica dominante 1.2.1.1.3.1. ACTN4 Fue en el año 1998 cuando Mathis et al publicaron por primera vez el ligamiento de una familia con GEFS con un patrón de herencia autosómico dominante a la región cromosómica 19q1359. Abrieron así el camino para la  54 Introducción búsqueda de genes responsables para la GEFS-AD; aunque no fue hasta el año 2000 cuando se pudo refinar esta localización cromosómica (19q13.1) gracias a los estudios realizados en tres familias que mostraban ligamiento a esta región. Se pudo llevar a cabo entonces un estudio de varios genes definidos como posibles candidatos que dio como resultado la identificación del gen ACTN4 como responsable de esta patología en estas tres familias60. Este gen codifica para una proteína denominada α-actinina 4 que se encarga de establecer puentes entre los filamentos de actina. Está compuesto por 21 exones que dan lugar a una proteína que consta de 911 aminoácidos. La α-actinina 4 presenta dos dominios CH (dominios de unión a la actina homólogos a la calponina) en el extremo amino-terminal (NH2terminal, N-terminal) que permiten la unión con la actina, una región cilíndrica central compuesta por 4 repeticiones de espectrina que forman una triple α-hélice y dos dominios EF que permiten la interacción con el calcio61. En humanos se conocen cuatro genes (ACTN1-4) que codifican para αactinina, altamente homólogos y conservados entre especies. La α-actinina 2 y 3 se expresan en los sarcómeros del músculo esquelético y cardíaco, mientras que la expresión de la α-actinina 1 y 4 es ubicua. En el riñón de humanos se expresa únicamente la α-actinina 4, que se localiza predominantemente en los procesos podocíticos y en los capilares. El análisis de la secuencia de ACTN4 reveló que cada una de las familias presentaba una sustitución aminoacídica no conservativa (K228Q, T232I, S235P) que se situaba en el exón 8 y afectaba a la región proteica situada entre el dominio de unión a la actina y el primer dominio rod. Todas ellas generan un aumento de la unión de la proteína a los filamentos de actina, lo que podría provocar una alteración en la dinámica normal de los filamentos de actina. Un dato importante que reveló el análisis fue la  55 Introducción existencia de una penetrancia incompleta, es decir, la mutación se encontraba no sólo en pacientes afectos sino también en aquellos pacientes que no mostraban ningún síntoma de la enfermedad60. 1.2.1.1.3.2. TRPC6 La existencia de al menos otro gen responsable de la glomeruloesclerosis focal y segmentaria autosómica dominante ya había quedado de manifiesto tras los estudios de Kaplan et al60. En el año 1999 Winn et al publican un trabajo en el que describen el fenotipo de una gran familia de Nueva Zelanda diagnosticada con GEFS-AD que no mostraba ligamiento a la región 19q13.162. Tras este resultado este grupo realizó nuevos análisis de ligamiento en ésta y en otras familias en las que ACTN4 no era responsable de la patología. La familia de origen neozelandés mostró un claro ligamiento al brazo largo del cromosoma 11, en concreto a la región 11q21-q22, pero en las otras familias no se obtuvieron unos valores de ligamiento significativos. Este hecho confirmaba la heterogeneidad genética de esta enfermedad y la existencia de al menos 3 genes responsables de la GEFS-AD63. Tras unos años en los que se logró el refinamiento de la región candidata a unos 2.1 centimorgan (cM) por medio de análisis haplotípicos, y el estudio de 42 genes candidatos que se encontraban en esa región, se determinó que el gen responsable de la patología en la familia neozelandesa era TRPC6. Dicho gen está compuesto por 13 exones que dan lugar a la formación de una proteína de 931 aminoacídicos denominada canal de receptor transitorio de potencial catiónico 6 (TRPC6). El análisis de su secuencia nucleotídica reveló que el exón 2 presentaba una mutación no conservativa que provocaba la sustitución de una prolina (Pro, P) por una glutamina (Gln, Q) en la posición 112 de la proteína (P112Q)64.  56 Introducción Simultáneamente, Reiser et al publicaron la identificación de 5 variantes heterocigotas en TRPC6 en 5 familias no relacionadas que presentaban GEFS-AD (N134S, S270T, K874Stop, R895C y E897K)65. TRPC6 pertenece a la superfamilia de los canales de receptores transitorios de potencial (TRP), la cual está compuesta por un grupo diverso de canales catiónicos no selectivos permeables al calcio (Ca+2) y al sodio (Na+). Esta superfamilia se divide a su vez en siete subfamilias que se clasifican en dos grupos. El primero de ellos está compuesto por cinco subfamilias de canales: TRPC o canónicos, TRPV o vaniloide, TRPM o melastatina, TRPA o anquirina y TRPN o no mecanopotencial. El segundo grupo está constituido por dos subfamilias, TRPP o poliquistina y TRPML o mucolipina. Dentro de la subfamilia TRPC se diferencian siete subunidades proteicas (TRPC1-7), aunque en humanos solo se expresan seis ya que TRPC2 es un pseudogén, es decir, no presenta expresión. En base a su secuencia nucleotídica estas siete proteínas se pueden subdividir en cuatro subgrupos: TRPC1, TRPC2, TRPC3/6/7 y TRPC4/5. Desde el punto de vista estructural, los canales TRP son homoo hetero-tetrámeros formados por la asociación de cuatro subunidades en torno a un eje de simetría central que coincide con el poro iónico66. Cada subunidad consta de una proteína formada por seis segmentos transmembrana (S1-S6) con un lazo hidrofóbico entre el S5 y el S6 que estructura el poro iónico. Los extremos N-terminal y C-terminal son ambos intracelulares pero los motivos y dominios que presentan son distintos en cada subfamilia67-69. La subfamilia TRPC se caracteriza por presentar en el extremo Nterminal de tres a cuatro repeticiones de anquirina (ANK) que median el reconocimiento molecular a través de las interacciones proteína-proteína; y un dominio “coiled-coil” que está formado por dos o más hélices α que se  57 Introducción enrollan como los ramales de una cuerda y que intervienen en la interacción proteína-proteína. En la región del extremo C-terminal se localiza el dominio TRP el cual está constituido aproximadamente por 25 residuos aminoacídicos. Dentro de este dominio se encuentra la caja TRP compuesta por seis aminoácidos (EWKFAR) altamente conservados en esta subfamilia. En este extremo también se ha descrito la presencia de dominios de unión a calmodulina (CaM) y de dominios de unión PDZ70. Mediante estudios con quimeras se identificaron dos dominios de interacción implicados en la oligomerización de los canales TRPC. El primer dominio abarca las repeticiones de ANK y el dominio “coiled-coil” y es el responsable del ensamblaje de los extremos N-terminal de TRPCs adyacentes. El segundo engloba la región del poro, incluyendo la unión entre los segmentos 4 y 5, y el extremo C-terminal, y se encarga de la interacción entre el extremo C-terminal y el N-terminal de subunidades adyacentes71. La familia TRPC puede subdividirse en dos subgrupos funcionalmente distintos. Uno de ellos está compuesto por TRPC1, TRPC4 y TRPC5, mientras que el otro incluye a TRPC3, TRPC6 y TRPC7. Todos los miembros de un mismo subgrupo pueden ensamblarse bien sea para formar homotetrámeros o heterotetrámeros. Así mismo se ha visto que también pueden darse agrupamientos entre miembros de los dos subgrupos funcionales, como es el caso de TRPC1 y TRPC372. Estudios recientes han mostrado que se pueden formar tetrámeros entre subunidades de las distintas subfamilias de TRP. Entre las nuevas combinaciones se han visto TRPC1/TRPC6/TRPV4 y TRPA1/TRPV170. El canal TRPC6 presenta una expresión ubicua, con niveles más elevados en los pulmones, ovarios, placenta y bazo. En general podríamos decir que esta proteína se encuentra en tejidos ricos en células del músculo liso73. En el riñón, TRPC6 se expresa en tres tipos de células del glomérulo,  64 Introducción adyacentes e interacción por medio de uniones homofílicas, contribuyendo a la formación de la estructura en forma de cremallera del diafragma, estructura que ya se ha descrito previamente donde participan activamente en el proceso de filtración glomerular13. El número y tipo de mutaciones descritas para este gen es muy elevado. Parece que estas provocan que la nefrina quede retenida en el retículo endoplasmática y no pueda migrar a la superficie celular donde ejerce su función96-98. 1.2.1.2.2. NPHS2 El síndrome nefrótico autosómico recesivo resistente a esteroides tipo 2 está causado por mutaciones en el gen que codifica para la podocina, NPHS2. Este gen fue identificado en el año 2000 y recibe este nombre porque su expresión es exclusiva del podocito, en concreto se encuentra formando parte del diafragma de filtración. Previamente ya se había identificado por estudios de ligamiento la región cromosómica en la que se hallaba (1q25-q31)21,99. Este síndrome suele manifestarse en la infancia aunque también se han descrito casos donde se presenta ya en edad adulta de una forma esporádica. Se caracteriza por ser resistente al tratamiento con corticoides, proteinuria, una rápida progresión a la IRT, ausencia de recidiva tras el trasplante y ausencia de manifestaciones extra-renales. Su histología en estados tempranos de la enfermedad muestra un patrón de cambios glomerulares mínimos, pero en estados más tardíos presenta un patrón histológico de GEFS100. El gen NPHS2 consta de 8 exones que dan lugar a una proteína constituida por 383 aminoácidos. La podocina es un miembro de la familia  65 Introducción de las estomatinas, una fosfoproteína integral de membrana que consta de un dominio N-terminal, un corto dominio transmembrana y un dominio citosólico C-terminal. La proteína presenta una forma “horquilla” y se ha visto que interacciona con la nefrina y CD2AP en las balsas lipídicas27,101. La podocina atrae a la nefrina a las balsas lipídicas. La interacción entre ellas es fundamental para que tengan lugar los procesos de transducción de señales mediados por la nefrina. Se ha visto que mutaciones en la podocina provocan que no pueda reclutar a la nefrina y por lo tanto se van a generar alteraciones en las rutas de señalización102. 1.2.1.2.3. PLCE1 En el año 2006 se descubrió que mutaciones en el gen PLCE1, que codifica para la fosfolipasa C épsilon 1, causan el síndrome nefrótico tipo 3 que se caracteriza por una aparición en una edad temprana, y por la presencia de proteinuria y edemas. El patrón histológico puede ser de esclerosis mesangial difusa (EMD) o GEFS y los pacientes pueden ser resistentes o sensitivos al tratamiento con corticoides. La forma resistente se asocia normalmente con la GEFS y suele dar lugar a IRT necesitando una terapia de reemplazamiento renal en forma de diálisis o trasplante renal. En este artículo se identificaron mutaciones en 12 hermanos de 6 familias distintas diagnosticados en una edad temprana de SN con EMD y que presentaban una mutación en homocigosis que provocaba la ruptura de la pauta de lectura; y en 2 hermanos con un debut más tardío de la enfermedad y con GEFS que tenían una mutación no conservativa en homocigosis103. Posteriormente de identificaron 3 individuos no afectos que presentaban la misma mutación en homocigosis en PLCE1 que los individuos afectos relacionados. Este hecho es particularmente inusual en  66 Introducción enfermedades con herencia autosómica recesiva. Hechos como éste abrieron la puerta al planteamiento de distintas hipótesis para explicarlo (posibilidad de ser una enfermedad oligogénica, presencia de genes modificadores, etc). Este gen se localiza en la región cromosómica 10q23 y consta de 34 exones que dan lugar a la formación de 2 isoformas proteicas, una de 2302 aminoácidos y otra de 1994 aminoácidos. PLCE1 presenta en su región Nterminal un dominio intercambiador de nucleótidos de guanina de Ras (RasGEF), seguido de dos dominios catalíticos denominados X e Y (PLCXc, PLCYc), un dominio regulador C2 y 2 dominios C-terminal RA1 y RA2 (dominio de asociación a Ras 1 y 2). Esta proteína presenta una expresión ubicua104. Esta fosfolipasa cataliza la hidrólisis del fosfatidilinositol-4,5-bisfosfato (PIP2) para generar dos segundos mensajeros, el inositol 1,4,5-trisfosfato (IP3) y el diacilglicerol (DAG). Estos segundos mensajeros se encargan de regular diversos procesos de crecimiento celular, diferenciación y expresión de genes. No se conoce con claridad el mecanismo por el cual puede causar la GEFS, ya que, al contrario que las otras proteínas asociadas a GEFS, PLCE1 no se expresa en los pedicelos sino en el cuerpo celular del podocito y en los proceso podocíticos primarios50.  II. OBJETIVOS    69 2. OBJETIVOS 1. Estudio de los genes conocidos como responsables de la Glomeruloesclerosis Focal y Segmentaria de herencia Autosómica Dominante (ACTN4, TRPC6 e INF2) para intentar determinar si son los causantes de la patología en nuestra cohorte. 2. Búsqueda y análisis de nuevos genes candidatos, mediante clonación funcional, que puedan explicar la aparición de la GEFS-AD en nuestra cohorte. 3. Análisis de los rasgos fenotípicos para el intento de establecimiento de una correlación genotipo-fenotipo en la GEFS-AD.     III. MATERIAL Y MÉTODOS     73 3. MATERIAL Y MÉTODOS 3.1. Cohorte de pacientes GRUPO 1: está compuesto por 5 familias (I-V) diagnosticadas de GEFS que cumplen las siguientes características: 9 Claro patrón de herencia autosómico dominante. 9 Biopsia renal con histología de glomeruloesclerosis focal y segmentaria en al menos 1 miembro de la familia. 9 Diagnóstico de la enfermedad en edad adulta (≥18 años). 9 Presencia de proteinuria en al menos 2 miembros de la familia de distintas generaciones. GRUPO 2: 2 familias (VIVII) con un patrón de herencia autosómico recesivo: 9 Patrón de herencia autosómico recesivo. 9 Biopsia renal con histología de glomeruloesclerosis focal y segmentaria. 9 Diagnóstico de la enfermedad en edad adulta (≥18 años). 9 Presencia de proteinuria. GRUPO 3: 18 pacientes diagnosticados de GEFS esporádica: 9 Ausencia de historia familiar de enfermedad renal. 9 Biopsia renal con histología de glomeruloesclerosis focal y segmentaria. 9 Diagnóstico de la enfermedad en edad adulta (≥18 años). 9 Presencia de proteinuria.   80 Material y métodos 3.3.2.2.2. Gen TRPC6 Tabla 3.2. Cebadores para PCR y secuenciación de TRPC6. TRPC6 Cebadores en sentido 5’→3’ Cebadores en sentido 5’→3 5’UTR/ Exón 1 ggAAAAAAAgAgTgCgTgCC Exón 8 CCATCCTTgCAgCAATCCTA CCTCCACTCACTCAggTCCCAg gAATgAACAAAgggCgAAgA Exón 2 CTATTggCCTTCTTggACCg Exón 9 CgATCACTggggTCTgAgAg TTgACTCTggCTTgTggAggg CATCTCgCTgCCACACCTgC Exón 3 TCTgAAgCATAgTAAAACgTggT Exón 10 gggTggTTTACAggTCTgg CCCTTTATCCTTATTTAgCACCAA gCTTCTgAACATCTgTCCCTTT Exón 4 gCCATTTgTTTgTTgCCTgT Exón 11 CTCAgACAACCTCTAACAAACAgC ACCCAACTgTgATTCCCTgA CTCTgTCACTTACAAAATgCCTgg Exón 5 ggAgATCATTggAATgTgCAg Exón 12 ACAgCCATCACTTCCAAAggg AATgAACCCAAggCAACTgT TAACAgAACggCggTTggTg Exón 6 CAggCTgAgACCTTTCAAACA Exón 13 CTTATggTggACTTggAgggAg TgCAgTAACCgAACTACTACTgAC CAACCACAgTgTTTgTTTggg Exón 7 ggAgACTTCCATTCgAAAACC 3’UTR TTTTCCTCCACTgAACCCTgg AgAgTCCCTCCAACTCATTTgT gCTgTCATAgAgCATCCTTggg   81 Material y métodos 3.3.2.2.3. Gen CD2AP Tabla 3.3. Cebadores para PCR y secuenciación de CD2AP. CD2AP Cebadores en sentido 5’→3’ Cebadores en sentido 5’→3 5’UTR / exón 1 gCCTTTgCCTCTgCCTCg Exón 10 ggATTgAATgAAgAggAgAgAC gCTgACCgCAgTCgCCTC gACAgATACTAATgCATgTgA ACAC Exón 2 ggAgTgAgACATTACgCCCTgC Exón 11 gAgCCTggTAATTCCggTAC CCCTAAAgATTgTTTTCTggCA g gAAATgAACTACTCCCTCCCA g Exón 3 TTCTTTgTAgTTggggTgAgTgg Exón 12 TgCCTCTgTCACACTTTTCCA gC ATgTAATgCTCTCCTTCTTTgC C ACAgTTACCgAAgCCATTCCA C Exón 4 TTTgTAgTTTggggCTTggg Exón 13 AgCCTTAggAgAgAgTTTTgCg TgCTgCTCTgTCTATCCCAgTgg TTAAATgCACCACCgCTgTCC Exón 5 CCCATAgggTgACgATTTTCAC Exón 14 gggCgAgTgTTgTTTTCC CAgTTAggTCCCCATCATAATT TgC CCCTgTTggAATgAACACACC Exón 6 CATCTTgCTCTTCTggATATTT CAg Exón 15 gggATATCAgCAACAgTAgCAg C CTCACAgCCTCCTCATTCATA ACC gATgTCCACAAAgAATCCCAg Exón 7 TAgggAAAgCTgggTAACTg Exón 16 TCATTTTAgTgACTCTTCCTg gACC ggCACAgATTCAACTACAAgg CgAACTACCACACCCAgCCA C Exón 8 CCTTgTAgTTgAATCTgTgCC Exón 17 CTCAgATTTgTCTTggTTTTgC Tg CAgCTCTTCTAgATTCCAggg AggAACCgATTACCCAgTTgg Exón 9 CATCACTgCACTTCAgCC Exón 18/ 3’UTR CAACCAAATTATAgCATggg CTCCTACCTgAATAgCTACAT CTg AAggCTAATCTgTCCCTCTC   82 Material y métodos 3.3.2.2.4. Gen INF2 Tabla 3.4. Cebadores para PCR y secuenciación de INF2. INF2 Cebadores en sentido 5’→3’ Cebadores en sentido 5’→3 5’UTR/ exón 1 AACTgAgACCgAgggAAgTg Exones 13, 14 gCCCTgTCCTgTgATCCTT CCTgAAgCCTCATACCAggTC TggCCTCTACgCCTCTACAC Exones 2, 3 ATgggAAggggTgCATTg Exón 15 AgTgggAACAgggTCATCC ATgCAgCATgggATgCAC gTCCCAAAAgggAAgTgTTC Exón 4 gCAgAAgTgAAATggggAAg Exón 16 CgTgCAgCCTCAgAgTACAg ATCTggAggTgCTgCTTAgg CTCgCCCAgCTCACTCTATC Exón 5 CgCTATCCCTggCTATgTg Exón 17 CCTgCTCCTTgTCAgAgACC CCTggAgTCTCACCCCAAAg gACCCCACTCTAgCCAgACA Exón 6 gTgggAATAgAgggggTg Exones 18, 19 gCAgAggCACCTTTCgTC gCgAAACTTTCAggATgCTC AggCACAgggTAgggACAg Exón 7 gCTTTTTCCTgCCTCTTCC Exón 20 TAgACAgCggAATggAggAg gCgCACACAAgTTCCATg CCAgCgATgTCCTAACCAC Exones 8, 9 CCAggCAggACATCCTTTAg Exón 21 ggTgTTggCATggCTgTC gTCAgAAggCTCAggTgg TAgTgTCCCggAggggTg Exones 10, 11 CCATgACTACgTggggAAAC Exón 22 TgTTgCCCAggCTggAgTgC gCTCCCTATTCCTgCTCTCC gCTTATTAACCAgACAgCgTggTg Exón 12 AgTgCCCCTCTggCAgggAC 3’UTR ggTggggACgTTTgTggCAg CAgCAgggTggTTTCCggAg CCACCTggCACTgTggTggC  83 Material y métodos 3.3.2.2.5. Gen ITGA3  Tabla 3.5. Cebadores para PCR y secuenciación de ITGA3. ITGA3 Cebadores en sentido 5’→3’ Cebadores en sentido 5’→3 5’UTR/ exón 1 ggAAAAAAAgAgTgCgTgCC Exones 11, 12 CCATCCTTgCAgCAATCCTA CCTCCACTCACTCAggTCCCAg gAATgAACAAAgggCgAAgA Exones 2, 3 CTATTggCCTTCTTggACCg Exones 13,14, 15 CgATCACTggggTCTgAgAg TTgACTCTggCTTgTggAggg CATCTCgCTgCCACACCTgC Exón 4 TCTgAAgCATAgTAAAACgTggT Exones 16, 17,18 gggTggTTTACAggTCTgg CCCTTTATCCTTATTTAgCACCAA gCTTCTgAACATCTgTCCCTTT Exón 5 gCCATTTgTTTgTTgCCTgT Exones 19, 20,21 CTCAgACAACCTCTAACAAACAgC ACCCAACTgTgATTCCCTgA CTCTgTCACTTACAAAATgCCTgg Exón 6 ggAgATCATTggAATgTgCAg Exón 22 ACAgCCATCACTTCCAAAggg AATgAACCCAAggCAACTgT TAACAgAACggCggTTggTg Exón 7 CAggCTgAgACCTTTCAAACA Exón 23 CTTATggTggACTTggAgggAg TgCAgTAACCgAACTACTACTgAC CAACCACAgTgTTTgTTTggg Exones 8, 9, 10 ggAgACTTCCATTCgAAAACC Exones 24, 25/ 3’UTR TTTTCCTCCACTgAACCCTgg AgAgTCCCTCCAACTCATTTgT gCTgTCATAgAgCATCCTTggg    84 Material y métodos 3.3.2.2.6. Gen FN1 Tabla 3.6. Cebadores para PCR y secuenciación de FN1. FN1 Cebadores en sentido 5’→3’ Cebadores en sentido 5’→3 5’UTR/ exón 1 TTCTTggAggCgACAACCC Exón 26 TgATTTTACCTTTCCAgCTACTT Cg CAACTTTggTCggCTTTAggg gCTCTTAgCTCCTCCTACTTgAg AATT Exón 2 ggAAAAggAgAAATgCAAATgTAAC Exón 27 TCAAATAgTCCTgggCgTgC CTTACTAATgCAAAgTTTAACAATT ACCACT gCTACTggATAgTCATACTgCCA ACA Exón 3 ACTAgAAAAgCTTgTACCTAAgTgAg gC Exón 28 CgTTAATTTCCCCTACACCTTC C TTTTggCATCATTTTACACAATCTC T gAgCTgATgACAgACAACAgCAA Exón 4 ACCTAAgTACCTACCATgggTggAA Exón 29 CACAATTTgAATgggCTCTg CATCCCAgCTCTTgCTCAgC TgggCTTTCAggTTATCCAC Exón 5 ACAgggAgCTTgCACAATTCA Exón 30 gCTCTAAACCCCTCACACTCTg AA CAgAAAACAATACCTggCTTAATCT TTAA gAATAAgTAAAAgCTggTgTCAC CC Exón 6 ATTgACCACTTgCgACTCTCg Exón 31 AATATgTACCAgACCTAgAgAgg AggACT TTgACCTgCTTCCCCATTTC TCgAACTCCTAACCTCAAgTgA TCT Exón 7 AgATCCTgAAgATCCTgACTgC Exón 32 ACTCTAgACgCCACTTgAggACT T GggTggTAAgATTACAggCTTC gggCATTCAgACACCCAAgA Exón 8 ggAgATAAAgCATCTCTgTTTACTgA CA Exón 33 TgCAAAACTgCTTTgCATgTT TgAAAgTgAgTTTTTCTCACTTCTgT g TAAAgCCgCTgCTCCCAT Exón 9 TTggAAAgCTCAgCggTAATC Exón 34 TTTTCCTTTTCCCCCATTTCC gACAACCCACAAgggCTTCA CCACCTTAgAAACTgTgTTAgAg ATgA Exón 10 TTAgACCTggTgATCATTTATCAAgT g Exón 35 CTTgggTTTCAgTTgAggACg CCTTTCTgTACCTTTTgCCATCTC CAgCTTCCCAAAgTgCTTgg  85 Material y métodos FN1 Cebadores en sentido 5’→3’ Cebadores en sentido 5’→3 Exón 11 TTTgAgAAgCATACCTTTTTTCTTT CAT Exón 36 CATggATgAgCCAAgCAgg CCATTCCCCCTgTgCAAAC CgTAgAACAgTTAATAAgCCCgT TTAC Exón 12 AgCACCCTgAAATTAAATTCgTAgT TA Exones 37, 38 AATTgCAggCTAgCTTgAgAATT C TAACTACgAATTTAATTTCAgggTg CT gTgggAgTTTgCTAAggACTTCAT Exón 13 GTACACAgTTTTAAgTTgAAgTgAgT gAATATT Exón 39 ACCgACTTCCACTTgACTAgCTg TgggAAAAAAAgAAACCATCAgA TgCATCAAAACATggAgAACCTT Exones 14, 15 TTACCTTCTAgTCgCTTTTCCCTAT g Exón 40 TCCTggAgCTTAATgCgCTTT CCCTCCCTgCTgATgTCATT TTCTgTgCTgCCCCATgAg Exones 16 , 17 AAACAgTgCATCTTACTTTTgCTCA T Exón 41 AgCCCgTgTCATTCCTCACT gACAAAACAACCCTCCTTCAgg gCCCATCTCTggTgTACAgCA Exón 18 TggCTTCTTAAAAgTAATCTTCAgC A Exón 42 AgCCCgTgTCATTCCTCACT CAggCTgCAAgTgAgggTg gCCCATCTCTggTgTACAgCA Exón 19 CTTAgACATTCAATCAAgTTTCAgg ACT Exón 43 TACAgTCATTCgATTTTCTTCTT ATggT CATgAAgAATAgAgAATgTAAATAT AgTTAAgAAAA TgCATggAACTTgAggAgACAA Exón 20 TTACCTTCTAgTCgCTTTTCCCTAT g Exón 44 gTgACACgTCCCAgTTCACCT CCCTCCCTgCTgATgTCATT CAgCCTgATAATgAAAgTgAgAA Tg Exón 21 CTTggTTAAACTgAggTTCTCCATA AA Exón 45 AACCACCCCTAgATCAAgTC CACAAggACAgCTCAgggCT CAggAgCCCACCCTTTATC Exones 22, 23 AATCATAgCCTCACAgCAgTAACAg T Exón 46 TgCCAgTgCATATgATgTg TTCTAAAATCTTTgTCTTgggAAggT TgggCAATAggAgATgTTC Exón 24 AgTCCTgCATTCCgCCC Exón 47 CTgTCATgAgTCCCCACCTC AATCCCCACTCTTATTggAAgTgT gATCTTggCAgAgAgACATgC Exón 25 TTCCTTTTgCCTCCCCCTC TTCCCCCATgAAACATCCAT    86 Material y métodos 3.3.2.2.7. Gen NEPH1 Tabla 3.7. Cebadores para PCR y secuenciación de NEPH1. NEPH1 Cebadores en sentido 5’→3’ Cebadores en sentido 5’→3 5’UTR/ Exón 1 ggAAAAAAAgAgTgCgTgCC Exón 8 CCATCCTTgCAgCAATCCTA CCTCCACTCACTCAggTCCCAg gAATgAACAAAgggCgAAgA Exón 2 CTATTggCCTTCTTggACCg Exón 9 CgATCACTggggTCTgAgAg TTgACTCTggCTTgTggAggg CATCTCgCTgCCACACCTgC Exón 3 TCTgAAgCATAgTAAAACgTggT Exón 10 gggTggTTTACAggTCTgg CCCTTTATCCTTATTTAgCACCAA gCTTCTgAACATCTgTCCCTTT Exón 4 gCCATTTgTTTgTTgCCTgT Exón 11 CTCAgACAACCTCTAACAAACAgC ACCCAACTgTgATTCCCTgA CTCTgTCACTTACAAAATgCCTgg Exón 5 ggAgATCATTggAATgTgCAg Exón 12 ACAgCCATCACTTCCAAAggg AATgAACCCAAggCAACTgT TAACAgAACggCggTTggTg  3.3.2.3 Electroforesis en geles de agarosa Con el fin de confirmar que se había realizado la amplificación correcta de los distintos fragmentos, los productos de esta reacción de PCR se separaron por medio de una electroforesis horizontal en un gel de agarosa al 1% (p/v). Para ello se necesitó agarosa (Sigma-Aldrich, St. Louis, MO, USA) y un tampón de electroforesis a una concentración 1X denominado EDTAÁcido Bórico-Tris (TBE del inglés Tris-Boric Acid-EDTA). Éste está compuesto por: tris(hidroximetil)aminometano 50 mM (Roche, Basilea, Suiza), ácido bórico 40 mM (J.T.Baker, Phillipsburg, New Jersey, USA) y EDTA 0,636 mM (AcBiochem, Malvern, Pennsylvania, USA). Se añadió la agarosa al TBE y se disolvió con ayuda de calor. A continuación se le  87 Material y métodos incorporó el bromuro de etidio (BrEt), a una concentración final de 62,5 ng/mL, para poder ver con posterioridad los ácidos nucleicos en un transiluminador por medio de la radiación ultravioleta (UV). La disolución se dejó gelificar en la cubeta apropiada durante unos 30 minutos. Para cargar los pocillos del gel, 5 µl del productos de PCR se mezclaron con 2 µl de un tampón de carga con la siguiente composición: sacarosa 400 g/L (Sigma-Aldrich,St. Louis, MO, USA) y naranja de acridina 2,5 g/L (Sigma-Aldrich, St. Louis, MO, USA). Para conocer el tamaño del producto amplificado uso un marcador de peso molecular comercial, el Hyperladder II (con un rango de 50-2000 pb) (Bioline, London, United Kingdom). El gel cargado se corrió a 120 voltios y 100 mA durante 1 hora. Tras este tiempo se visualizó en el transiluminador de luz ultravioleta con cámara con dispositivo de carga acoplada (CCD del inglés charge-coupled device)(EC3 Imagin System, UVP, Upland California, USA). 3.3.2.4 Purificación enzimática del producto de PCR Los fragmentos de PCR fueron purificados por medio de la digestión con 1 µl Exonucleasa I (Exo I) y 2 µl de Fosfatasa Alcalina de Camarón (SAP del inglés Shrimp Alkaline Phosphatase), (USB Corporation, Cleveland, Ohio, USA). La exonucleasa actúa degradando ADN de cadena sencilla en dirección 3’ a 5’. Por su parte, la fosfatasa elimina el fosfato del extremo 5’ del ADN. La mezcla fue sometida al siguiente programa en el termociclador: • Primer paso: un ciclo durante 15 minutos a 37 ºC para que se produzca la activación de las enzimas y el proceso de degradación. • Segundo paso: un ciclo durante 15 minutos a 80ºC para la inactivación de las enzimas.   88 Material y métodos 3.3.2.5. Reacción de secuenciación La reacción de secuenciación directa de los fragmentos de la PCR se realizó usando un paquete comercial de secuencia, el BigDye ® Terminator v3.1 Cycle Sequencing Kit (Applied Biosystems, Warrintong, UK) siguiendo el protocolo recomendado por la compañía. Las condiciones para la reacción de secuenciación fueron las siguientes: Programa de PCR Temperatura (ºC) Tiempo (min, s) Número de ciclos Desnaturalización inicial 96 4 min 1 Desnaturalización 94 15 s 30 Hibridación del cebador con el ADN 50 10 s Elongación cebadores 60 3 min ççElongación final 60 10 min 1 Almacenamiento 4 ∞ Los cebadores utilizados para realizar la secuenciación de los distintos genes fueron los mismos que los empleados en la reacción de amplificación por PCR y que se recogen en las Tablas 3.1, 3.2, 3.3, 3.4, 3.5, 3.6 y 3.7. 3.3.2.6. Purificación de la reacción de secuencia Las reacciones de secuencia fueron precipitadas por el método EDTA y Etanol para placas de 96 pocillos. Para ello se mezclan 5μL de reacción de secuencia con 2,5 μL de EDTA 125 mM de pH 8 con 30 μL de etanol al 100%. Agitamos la placa durante unos 15 segundos y dejamos incubar a temperatura ambiente al menos 15 minutos para precipitar los fragmentos de secuencia. A continuación se centrifuga a 3000 x g durante 30 minutos y se retira el sobrenadante mediante una rápida centrifugación a 3000 x g  89 Material y métodos invirtiendo la placa. Posteriormente se añaden a cada muestra 30 μl de etanol al 70% y se centrifuga durante 15 minutos a 3000 x g. Para retirar el sobrenadante repetimos el procedimiento anterior. Seguidamente dejamos secar la placa a temperatura ambiente en oscuridad al menos durante dos horas o en una estufa a 37ºC durante 1 hora para eliminar los restos de etanol Finalmente las muestras se resuspenden en 10 μl de formamida (Applied Biosystems, Warrintong, UK). 3.3.2.7. Análisis de las secuencias Las muestras fueron analizadas en el Secuenciador Automático ABI3130xl (Applied Biosystems, Warrintong, UK) y analizadas con el paquete informático Sequencing Analysis v5.2. (Applied Biosystems, Warrintong, UK). 3.3.2.8. Análisis de cosegregación En los pacientes en los que se encontró un cambio potencialmente patogénico se procedió a secuenciar el exón correspondiente en todos los miembros de la familia de los que se disponía, tanto afectos como sanos, para comprobar si el cambio cosegregaba con la enfermedad, es decir, estaba ausente en los individuos sanos y presente en los afectos. 3.3.3. Caracterización de mutaciones • MATRICES DE SUSTITUCIÓN: o Matriz de BLOSUM62: La matriz de sustitución de bloque de aminoácidos o matriz de BLOSUM (del inglés BLOcks of amino acid SUbstitution Matrix)seemplea paraconocersi un cambio puede ser potencialmente patogénico. Éstas se   96 Resultados 4.1.1.2. Cambios nucleotídicos en TRPC6 En la Tabla 4.2. están recogidas las variaciones nucleotídicas que se detectaron mediante la secuenciación del gen TRPC6, así como los cambios aminoacídicos generados por estas variaciones en algunos exones. Tabla 4.2. Relación de los cambios detectados en la secuenciación del gen TRPC6. C= cambio aminoacídico conservativo, NC= cambio aminoacídico no conservativo, pb= pares de bases. Región Posición Cambio Aminoácido Homocigoto o heterocigoto Tipo de cambio Frecuencia 5’UTR g. 65 T>A - heterocigoto - 3/20 g. 172 G>C - heterocigoto - 1/20 g. 208 T>C - heterocigoto - 3/20 EXÓN 1 g. 468 c. 468 p.15 T>C P15S heterocigoto NC 1/20 INTRÓN 1 g. 79045 G>C heterocigoto - 4/20 g. 79171 G>A heterocigoto - 4/20 EXÓN 4 g. 94910 c. 1836 p. 404 T>C A404V heterocigoto C 3/20 INTRÓN 5 g. 100996 G>C - heterocigoto - 5/20 INTRÓN 7 g. 110483 T>C - heterocigoto - 4/20 INTRÓN 10 g. 128690 T>C - heterocigoto - 6/20 EXÓN 11 g. 128872 c. 2955 p. 863 T>C F863F heterocigoto C 5/20 INTRÓN 12 g. 130801 Del 4 pb - heterocigoto - 5/20  97 Resultados En el estudio de este gen se detectó un cambio aminoacídico no conservativo, P15S, en el exón 1 del caso índice (II:4) de la familia I (CHUS_GEFS-I) (Figura 4.1.A). La presencia de una variación nucleotídica que implicaba el cambio de una citosina (C) por una timina (T) en uno de los alelos del paciente provocaba que el aminoácido original, una prolina, un aminoácido neutro e hidrofóbico, fuese sustituido por una serina, un aminoácido neutro y polar (Figura 4.1.B). Según la matriz BLOSUM62 este cambio tiene un valor de -1, es decir, que cabe la posibilidad de que tenga una repercusión biológica. La matriz de Kumar y Miller nos indicó que es un cambio que ocurre con frecuencia con lo que la probabilidad de que sea patogénico es menor. La introducción del cambio en el programa PolyPhen no proporcionó información. Aunque estos datos no sugerían que el cambio P15S fuese patogénico realizamos de igual modo el estudio de cosegregación en los individuos afectos y no afectos de la familia I de los que se disponía muestra de ADN (II:3, II:4, III:6, III:7). El análisis resultó negativo ya que de los dos individuos afectos presentes en la familia sólo el paciente II:4 presentaba el cambio (Figura 4.1.C).   98 Resultados PRESENCIA DEL CAMBIO P15S II:4 AUSENCIA DEL CAMBIO P15S II:3, III:6, III:7 COSEGREGACIÓN NEGATIVA A C Figura 4.1. Estudio de cosegregación del cambio P15S en el gen TRPC6 de la familia IV. A : Árbol genealógico de la familia con la edad de IRT para aquellos pacientes en los que se dispone del dato. B: Electroferograma normal y mutado del cambio P15S. C: Relación de individuos estudiados con y sin mutación. IRT = insuficiencia renal terminal, WT= forma salvaje. B  99 Resultados 4.1.1.3. Cambios nucleotídicos en CD2AP En la Tabla 4.3. están recogidas las variaciones nucleotídicas que se detectaron mediante la secuenciación del gen CD2AP, así como los cambios aminoacídicos generados por estas variaciones en algunos exones. Tabla 4.3. Relación de los cambios detectados en la secuenciación del gen CD2AP. C= cambio aminoacídico conservativo, NC= cambio aminoacídico no conservativo. Región Posición Cambio Aminoácido Homocigoto o heterocigoto Tipo de cambio Frecuencia INTRÓN 3 g. 56047 C>T - heterocigoto - 2/70 EXÓN 4 g.66907 c. 865 p.137 G>A I137V heterocigoto C 1/70 INTRÓN 4 g. 76833 A>G - heterocigoto - 11/70 homocigoto - 6/70 EXÓN 6 g. 96430 c. 1152 p. 232 T>C S232S heterocigoto C 2/70 EXÓN 12 g. 118084 c. 1120 p. 374 A>G T374A heterocigoto NC 1/70 INTRÓN 12 g. 118274 T>G - heterocigoto - 3/70 INTRÓN 15 g. 130248 G>T - heterocigoto - 1/70   100 Resultados En el análisis por secuenciación de CD2AP se detectaron 2 cambios en la secuencia de la proteína que debemos resaltar, I137V y T374A. En el exón 4 de un individuo del grupo control se descubrió el cambio de un adenina (A) por una guanina (G) en heterocigosis. Esta variación provocaba la sustitución de una isoleucina (I) por una valina (V) en la posición 137 de la proteína. El hecho de que este cambio fuese conservativo y se localizase en un individuo sano provocó que se descartase como objeto de estudio. En el exón 12 del caso índice de la familia VI (Figura 4.2.A) se observó el cambio de una G por una A que daba lugar a una variación aminoacídica no conservativa, T374A, la treonina original (aminoácido neutro y polar) era sustituida por una valina (aminoácido neutro e hidrofóbico) en la posición 374 de la proteína (Figura 4.2.B). Según la matriz BLOSUM62 este cambio tiene un valor de 0, es decir, que el cambio tiene pocas posibilidades de ser patogénico. La matriz de Kumar y Miller nos indicó que es un cambio que ocurre con una frecuencia media. La introducción del cambio en el programa PolyPhen indicó que era benigno (score: 0.000, sensibilidad: 1.00, especificidad: 0.00). A pesar de los datos proporcionados por las matrices y el programa PolyPhen se realizó un análisis de la secuencia del exón 12 en los individuos de la familia VI de los que se disponía de muestra (I:1, II:2, III:1, III:2). Se vio que el cambio estaba presente en heterocigosis tanto en los individuos afectos como en los sanos de la familia. El estudio nos reveló que esta variación era heredada por vía materna (II:2) y que no era responsable de la patología ya que los otros dos individuos que presentaban el cambio carecían de síntomas clínicos (I:1, II:2) (Figura 4.2.C).  101 Resultados PRESENCIA DEL CAMBIO T374A I:1, II:2, III:1, III:2 AUSENCIA DEL CAMBIO T374A - Figura 4.2. Estudio del cambio T374A en el gen CD2AP de la familia VI. A: Árbol genealógico de la familia con la edad de IRT para aquellos pacientes en los que se dispone del dato. B: Electroferograma normal y mutado del cambio T374A. C: Relación de individuos estudiados con y sin mutación. IRT= insuficiencia renal terminal, WT= forma salvaje. B C A   102 Resultados 4.1.1.4. Cambios nucleotídicos en INF2 En la Tabla 4.4. están recogidas las variaciones nucleotídicas que se detectaron mediante la secuenciación del gen INF2, así como los cambios aminoacídicos generados por estas variaciones en algunos exones. Tabla 4.4. Relación de los cambios detectados en la secuenciación del gen INF2. C= cambio aminoacídico conservativo, NC= cambio aminoacídico no conservativo. Región Posición Cambio Aminoácido Homcigoto o heterocigoto Tipo de cambio Frecuencia EXÓN 6 g.17034 c. 846 p.245 C>T L245P heterocigoto C 1/20 EXÓN 6 g.17108 c.892 p.259 A>G L260L heterocigoto C 1/20 INTRÓN 6 g.17187 T>C - heterocigoto - 3/20 EXÓN 7 g.18112 A>G - heterocigoto 3/20 INTRÓN 14 g.22010 Deleción de1 A - heterocigoto - 3/20 homocigoto - 6/20 INTRÓN 16 g.22743 C>T - heterocigoto - 2/20 homocigoto 4/20 INTRÓN 16 g.22856 C>G - heterocigoto - 3/20 homocigoto 4/20  103 Resultados En el estudio por secuenciación directa de este gen se detectó la presencia en el exón 6 del caso índice (III:3) la familia II (CHUS_GEFS-IV) (Figura 4.3.A) una variación de una T por una C que daba lugar a un cambio aminoacídico conservativo, L245P. Este cambio nucleotídico producía la sustitución de una leucina (aminoácido neutro e hidrofóbico) por una prolina (aminoácido neutro y hidrofóbico) en la posición 245 de la proteína. Esta variación se produce entre dos aminoácidos con una estructura muy distinta lo que hace pensar que pueda ser un cambio patogénico (Figura 4.3.B). Según la matriz BLOSUM62 este cambio tiene un valor de -3, es decir, que tiene una alta posibilidad de ser patogénico. La matriz de Kumar y Miller nos indicó que es un cambio que ocurre con poca frecuencia y que cuando se da es altamente patogénico. La introducción de la variación en el programa PolyPhen ha indicado que se trata de un cambio altamente patogénico (probabilidad de ser un cambio patogénico= 97.9 %, sensibilidad = 0.67; especificidad = 0.94). El análisis de cosegregación se realizó usando las muestras de los individuos de la familia IV de las que se disponía (II:4, II:8, III:2, III:3). Se observó la presencia de mutación en los pacientes III:2 y III:3 y su ausencia en los individuos II:4 y II:8. A pesar de no disponer de muestra de ADN del individuo II:3 se puede afirmar que el estudio de cosegregación es positivo, ya que se ve que el cambio viene por la línea paterna que es la que muestra la afectación renal (Figura 4.3.C).   104 Resultados PRESENCIA DEL CAMBIO L245P III:2, III:3 AUSENCIA DEL CAMBIO L245P II:4, II:8 COSEGREGACIÓN POSITIVA Figura 4.3. Estudio de cosegregación del cambio L245P en el gen INF2 de la familia II. A: Árbol genealógico de la familia con la edad de IRT para aquellos pacientes en los que se dispone del dato. B: Electroferograma normal y mutado del cambio L245P. C: Relación de individuos estudiados con y sin mutación. IRT= insuficiencia renal terminal, WT= forma salvaje.  A C B  105 Resultados Figura 4.5. Estudio de conservación evolutiva de parte de la secuencia aminoacídica del dominio DID donde se encuentra el cambio L245P. En el estudio se han incluido 5 especies: Homo sapiens (humano), Pan troglodytes (chimpancé), Mus musculus (ratón), Rattus norvergicus (rata), Monodelphis domestica (marsupial) y Danio rerio (pez cebra). Para su realización se ha utilizado el programa ClustalW2. Tras ver que el estudio de cosegregación era positivo, se determinó la posición en la secuencia proteica de INF2 del cambio L245P. Se vio que éste se localizaba dentro del dominio DID que se sitúa en el extremo N-terminal de la proteína (Figura 4.4.). El alineamiento de parte de la secuencia aminoacídica del dominio DID de INF2 en diferentes organismos nos ha ayudado a predecir si el cambio L245P es patogénico o no. Esta capacidad se debe en gran medida a la conservación de dicho aminoácido a lo largo de la evolución en distintas especies. Dicho estudio ha mostrado que la leucina es un residuo altamente conservado en esa posición. Figura 4.4. Representación gráfica del cambio L245P en la proteína y el gen INF2. En la imagen se muestra la estructura del gen y la proteína INF2 donde se marca la posición del cambio nucleotídico C>T en el exón 6 (g.17034) y de la mutación L245P en el dominio DID situado en el extremo N-terminal. EX= exón, DID= dominio inhibidor diaphanous, FH1: dominio homólogo a formina 1, FH2: dominio homólogo a formina 2, DAD: dominio autoregulador diaphanous.   112 Resultados 4.2. Fenotipo Estudio del fenotipo de nuestra cohorte de familias con GEFS-AD En la Tabla 4.8. se recogen las principales características clínicas de los miembros afectos de las cinco familias (I-V) que han sido diagnosticadas con GEFS-AD y que alguno de sus miembros son controlados en nuestro hospital. Tabla 4.8. Fenotipo de los pacientes diagnosticados con GEFS-AD. HA= hipertensión arterial, PT= post-trasplante, IRT= insuficiencia renal terminal. Paciente Edad de diagnóstico Proteinuria máxima (g/l) Microhematuria HA IRT (edad) Recurrencia PT I-1 32 3 No No 32 No I-2 19 5 NoNo25 No II-1 26 4 NoNo26 - II-2 21 6 NoNo22 No II-3 28 8 NoNo35 No III-1 - - - - 54 - III-2 26 4 - - 26 No III-3 34 3 Sí 34 37 No III-4 32 7 No 31 42 No III-5 38 0.36 No No - - III-6 33 4 No 33 No - III-7 19 5 No - No - III-8 19 1.1 Sí No - - IV-1 37 - - - 37 No IV-2 28 3 No No No - IV-3 27 3 Sí No 29 - V-1 40 3 Sí40 45 No V-2 18 - Sí18 No -  113 Resultados En la Tabla 4.9. se describen los principales datos fenotípicos de la familia II de nuestra cohorte en la que se localizó una mutación en el gen INF2. Tabla 4.9. Fenotipo de los pacientes afectos de la familia CHUS_GEFS-II con la mutación L245P en el gen INF2. ND: dato no disponible, ITR: insuficiencia renal terminal, PT: post-trasplante. El análisis de los datos revela que la edad mínima de diagnóstico fue de 18 años (paciente V-2), mientras que la máxima, perteneciente al otro miembro afecto de la misma familia, fue de 40 años (paciente V-1). Esta es la familia en la que se observa una mayor diferencia de tiempo en la presentación de la enfermedad entre unos y otros afectos (22 años). De forma similar podemos ver que en las otras familias también existe gran variedad en cuanto a la edad de presentación de la enfermedad. En la familia I la media de edad de presentación es de 25.5 años (19-32 años), en la II es de 25 Paciente II:3 III:2 III:3 Edad de diagnóstico (años) 26 22 28 Proteinuria máxima (g/l) ND 7 7.8 Microhematuria ND Sí No Hipertensión arterial ND Sí (21 años) Sí (28 años) Respuesta a esteroides No tratado No tratado Resistente Respuesta a ciclosporina No tratado No tratado No respuesta Edad de IRT (años) 26 22 35 Trasplante renal No Sí Sí Recurrencia PT - No tras 13 años No tras 5 años   114 Resultados años (21-28 años), en la III es de 28.7 años (19-38 años), en la IV es de 30.6 años (27-30 años) y en la V es de 29 años (18-40 años). En cuanto a los valores de proteinuria máxima alcanzada, todos, excepto los individuos III-5 y III-8, alcanzan una proteinuria en rango nefrótico, es decir, superior a 3 g/l. La presencia de microhematuria e hipertensión arterial no es un rasgo común en todos los pacientes, incluso dentro de los miembros de la misma familia existen unos que la presentan y otros que no. La edad a la que se alcanza la IRT también es variable. En el caso de nuestra cohorte se dan tres tipos de casos: • Presencia de IRT en el momento del diagnóstico: pacientes I-1, II-2, III-2 y IV-1. • Aparición de IRT tras un corto período de tiempo después del diagnóstico (1-3 años): pacientes II-2, III-3 y IV-3. • Aparición de la IRT tras 5-10 años después del diagnóstico: pacientes I-2, II-3, III-4 y V-1. Si analizamos en conjunto los datos de las 5 familias vemos que la media de aparición de la IRT tras el diagnóstico es de 3.1 años. Por último destacar que no se ha observado recurrencia post-trasplante en ninguno de los pacientes de la cohorte diagnosticados con GEFS-AD.   V. DISCUSIÓN     117 5. DISCUSIÓN Hasta la fecha el conocimiento sobre la etiología y el desarrollo de la Glomeruloesclerosis Focal y Segmentaria de herencia Autosómica Dominante sigue siendo reducido. Este hecho, sin embargo, no significa que no se tenga una mayor noción de esta patología, sino todo lo contrario. En los últimos 20 años el desarrollo de nuevas metodologías y la mejora de las ya existentes han permitido aclarar múltiples ideas sobre la GEFS. Una de ellas, y quizás la más importante para establecer un punto de partida claro, ha sido la descripción de la GEFS como un patrón histológico que se observa en enfermedades de distinto origen. A partir de aquí, y en el campo de las formas familiares, dentro de la GEFS se han separado las formas sindrómicas de las no sindrómicas (afectación exclusivamente renal). Dentro de estas últimas se encuentra la GEFS de herencia Autosómica Dominante, la cual ha sido el objeto de estudio de esta tesis doctoral. Son tres los genes que se conocen hasta el momento como responsables de la GEFS-AD (ACTN4, TRPC6 e INF2), pero éstos solo explican en torno al 20% de los casos descritos de esta patología (37 familias). Esto implica, sin duda, la existencia de uno o más genes cuya mutación desencadena la aparición de la enfermedad. En estas familias se conoce el gen y la mutación, pero todavía no se tiene una idea clara del efecto del cambio en la funcionalidad de la proteína. En este estudio se ha intentado establecer si alguno de los genes responsables de la GEFS-AD conocidos hasta el momento (ACTN4, TRPC6, INF2) era la causa de la enfermedad en nuestra cohorte. No se ha detectado ningún cambio patogénico ni en ACTN4 ni en TRPC6 que puedan ser responsables de la patología en ninguna de las familias del estudio. Por el   118 Discusión contrario, se ha visto que la secuencia del gen INF2 mostraba en los pacientes afectos de la familia II una sustitución nucleotídica en el exón 6 de una T por una C. Dicho cambio daba lugar al reemplazo en la posición 245 de la proteína de una leucina por una prolina. La elevada variabilidad estructural entre ambos aminoácidos provoca que sea un cambio altamente patogénico. La introducción de una prolina en esta posición, situada en una hélice α, provoca que la estructura de este dominio sufra en este punto una torsión de 30º y se altere la estabilidad de la proteína121,122. Además se ha realizado una búsqueda de nuevos posibles genes candidatos responsables de la GEFS-AD. Teniendo en cuenta una serie de criterios, ya citados anteriormente, se han seleccionado tres genes para su estudio, NEPH1, ITGA3 y FN1. El análisis por secuenciación directa no ha revelado la presencia de ningún cambio al que se le pueda atribuir el origen de la enfermedad en el caso de NEPH1 y FN1. En ITGA3 se ha localizado un cambio, R463Q, en un individuo con GEFS esporádica que tiene posibilidades de ser patogénico. 5.1. ACTN4 como gen responsable de la GEFS-AD En el caso de la α-actinina 4 se ha visto que los cambios patogénicos descritos (I149del, K228E, T232I, S235P) provocan un aumento de la afinidad de la actinina por los filamentos de actina. Las 4 mutaciones que se han descrito hasta ahora afectan a residuos aminoacídicos de los dominios CH de la actinina, los cuales son responsables de la unión entre estas dos proteínas (Figura 5.1). A la vista de estos hechos se puede pensar que mutaciones en estos dominios de unión a actina provocan algún tipo de alteración estructural que varía el patrón de afinidad normal entre actina y α-actinina 460,123.   119 Discusión Figura 5.1. Estructura de la proteína α-actinina 4 con las mutaciones responsables de GEFS-AD. CH: dominio homólogo a calponina, SP: dominio espectrina, EF: motivo de unión a calcio. Pero como sabemos, esta actinina no solo establece interacciones con los filamentos de actina, sino que también se une a otras proteínas (nefrina, β1-integrina, etc). Conociendo este dato nos surgen ciertas preguntas, ¿se producen alteraciones de la conexión entre la α-actinina 4 y estas otras proteínas?, y si es así, ¿cuál es el efecto que causa en la generación de la GEFS-AD? Respuestas a estas preguntas se han intentado buscar en la realización de estudios in vitro y en modelos murinos de los efectos de mutaciones en la α-actinina 4 tanto en homocigosis como en heterocigosis. Los primeros estudios se realizaron en ratones que presentan una mutación en heterocigosis de esta proteína con expresión específica en el podocito y que causa un aumento de la afinidad de la actinina por la actina. Dicha mutación genera, en algunos de ellos, un fenotipo similar al de humanos con mutaciones en ACTN4. Este estudio desveló un dato muy importante, que los ratones que presentaban la mutación y desarrollaban proteinuria mostraban una reducción de en torno al 70% en la expresión de la nefrina. Este resultado es consistente con el hecho de que se observe una fusión de procesos podocíticos. Este estudio fue el primero en establecer una relación entre la alteración del citoesqueleto de actina y la alteración de la estructura del diafragma de filtración124.   120 Discusión En el caso de ratones que carecen de la expresión de α-actinina 4 (Actn4-/-) se ha visto que una proporción significativa no supera el período perinatal aunque se desconoce la causa ya que el análisis histológico de embriones y neonatos no muestra ningún tipo de anormalidad. Los que superan el período perinatal desarrollan alteraciones glomerulares con una progresiva pérdida de la morfología podocítica, proteinuria y fallo renal eventual. Los ratones heterocigotos no muestran ninguna evidencia de enfermedad renal al cabo de seis meses. Al contrario que ocurría en el caso anterior, en estos ratones no se observa una disminución significativa de la expresión de nefrina ni de podocina. Según estos resultados parece que la ausencia de expresión de Actn4 provoca daños podocíticos y GEFS porque causa cambios en el citoesqueleto y no por graves defectos en la estructura del diafragma de filtración. En estos ratones las anormalidades celulares no solo se limitaban al riñón sino que también se encontraban afectados los linfocitos, que mostraban un aumento de la quimiotaxis y de la quimiocinesis.125. En este caso la ausencia de α-actinina 4 parece tener un doble efecto, por una parte parece que aumenta la fluidez del citoesqueleto provocando la alteración de la motilidad celular (lo que provocaría en efecto que se ve en los linfocitos) y por otra parte genera cambios en la adhesión celular, ya que provoca cambios en la unión entre podocitos y en la unión de los podocitos a la membrana glomerular basal. El estudio de tres de las mutaciones de ACTN4 asociadas a la enfermedad (K228E, T232I, S235P) en una línea celular de podocitos inmortalizados mostraron una alteración en la localización de la α-actinina 4 mutada, ya que esta se distribuía formando agregados citoplasmáticos. El desarrollo de ratones heterocigotos y homocigotos para una de las mutaciones asociadas a la enfermedad en humanos, la mutación K228E, mostró que los ratones Actn4K228E/K228E presentaban niveles normales de expresión del ARN mensajero de Actn4, pero por el contrario se observaba   121 Discusión una reducción de un 90% de la expresión de la proteína. En el caso de los heterocigotos Actn4K228E/+ también se observaba una reducción de expresión proteica de en torno a un 50 %. Así mismo en el análisis de expresión de αactinina 4 en linfocitos de un paciente con la mutación K228E en heterocigosis se veía que ocurría lo mismo que en los ratones Actn4K228E/+, es decir, se reducía la expresión de la proteína. En el estudio histológico de los riñones de estos ratones se vio que los homocigotos para la mutación K228E (Actn4K228E/K228E) presentaban anormalidades en la estructura de los podocitos y pérdida de la localización de la α-actinina 4 que se distribuye formando agregados citoplasmáticos. Además se vio que la pérdida de proteínas era significativamente mayor en los ratones homocigotos para el alelo nulo y para la mutación K228E (Actn4-/- Actn4K228E/K228E) que para la forma salvaje, y las formas heterocigotas para el alelo nulo y la mutación K228E (Actn4+/+, Actn4K228E/+, Actn4+/-). Como se ha visto hasta ahora parece que solo los ratones con una mutación en homocigosis en Actn4 (Actn4-/- Actn4K228E/K228E) presentan un fenotipo glomerular, mientras que las formas heterocigotas (Actn4K228E/+, Actn4+/-) no muestran ningún rasgo fenotípico de patología renal. Se cree que mutaciones en la α-actinina 4 provocan una reducción de la actividad normal de la proteína y provoca la formación de agregados proteicos tóxicos. Mientras que la enfermedad observada en los ratones homocigotos Actn4K228E/K228E refleja principalmente la pérdida de función resultante de la rápida degradación de la α-actinina 4, los humanos heterocigotos muestran un lento desarrollo del daño podocítico debido a los efectos de la agregación de la proteína. En estudios realizados in vivo e in vitro con un modelo de ratón knockin que lleva una mutación en la región de unión a actina en la α-   128 Discusión la corriente en TRPC6 estimulan la transcripción mediada por NFAT. La introducción de mutaciones en el poro que impidan la actividad del canal también provocan el bloqueo de NFAT. La calcineurina es un intermediario crítico entre TRPC6 y la transcripción mediada por NFAT. Células que expresan los canales TRPC6 con las mutaciones P112Q, R895C o E897K se ha visto que posee un aumento de la concentración de calcio intracelular y aumentan la transcripción mediada por calcineurina-NFAT. El aumento de esta ruta de señalización podría estar implicado en la generación de la GEFS141. Uno de los mecanismos para la regulación de la actividad de los canales TRPC6 es su inserción en la membrana plasmática. TRPC6 es translocado a la membrana tras la estimulación de receptores acoplados a proteínas G o receptores tirosina-quinasa. La fosforilación de los canales por PKC, PKG o tirosinas de la familia Src también causan su inserción en la membrana. El transporte de TRPC6 se ha visto que está controlado por la interacción con PLC-γ1 dependiente de la fosforilación de tirosinas generada por una variedad de estímulos. La nefrina se une directamente a TRPC6 e inhibe la interacción TRPC6PLC-γ1, lo que conduce a la supresión de la expresión del canal en la superficie celular. La alteración de este proceso podría también estar implicada en la generación de GEFS; las mutaciones causantes de GEFS podrían reducir la interacción entre la nefrina y TRPC6 aumentando la expresión en membrana de estos canales y por lo tanto las corrientes de Ca+2 142. Recientemente se ha demostrado que el AMPc activa el flujo y la corriente de calcio por medio de TRPC6, y que esta acción está mediada por la ruta de señalización PI3K-PKB-MEK-ERK1/2. Se ha visto también que este mecanismo juega un papel clave en la proliferación inducida por glucagón de las células mesangiales renales lo que genera un daño glomerular143.   129 Discusión En estudios de enfermedades glomerulares adquiridas se han detectado niveles elevados de expresión de canales TRPC6. En cultivos de podocitos se ha visto que esto provoca una reorganización del citoesqueleto de actina de los podocitos y una alteración en la regulación del Ca+2, en este artículo se muestra que estos canales también presentan un papel importante en enfermedades glomerulares de origen no genético144. La mutación P112Q provoca un aumento en la expresión de canales TRPC6 en la superficie celular145. En modelos de ratón se ha visto que el aumento de expresión de canales TRPC6 no mutados exclusivamente en podocitos es suficiente para generar un fenotipo patológico146. Todas las mutaciones en TRPC6 asociadas hasta la fecha con la GEFS se localizan en los dominios N-terminal o C-terminal intracelulares, y la mayoría están asociadas con un aumento de la actividad del canal en comparación con las formas no mutadas. Esto incluye 6 mutaciones que se localizan dentro o en las proximidades de los dominios de anquirina (G109S, P112Q, N125S, M132T, N134S y S270T). Estas mutaciones podrían alterar la habilidad del canal para oligomerizarse con otras subunidades de TRPC6 o alterar la localización o el nivel de expresión de TRPC6 en la superficie celular. Las mutaciones N-terminales también pueden afectar a las propiedades de apertura de TRPC6, como se ha visto en el caso de N143S y S270T, que aumentan significativamente el tiempo de apertura del canal comparada con la forma WT. La mutación N-terminal que causa un mayor efecto en la función del canal es M132T situada en el segundo dominio de anquirina. En el extremo C-terminal de TRPC6, la mutación L780P se localiza cerca del dominio TRP, mientras que las otras cuatro (K874Stop, Q889K, R895C y E897K) se localizan hacia la región del dominio coilded-coil. La región C-terminal también es importante para el proceso de oligomerización   130 Discusión por lo que las mutaciones de esta región pueden provocar los mismos efectos que las de la región N-terminal147. Como en los podocitos también hay expresión de otros canales TRPC, un debut tardío de la enfermedad podría ser causa de la compensación de la función de TRPC6 por parte de estos canales148. La podocina también se une y regula el canal TRPC6. Mutaciones en el canal pueden alterar esta interacción y generar enfermedades renales28. 5.3. INF2 como gen responsable de la GEFS-AD INF2 es, hasta la fecha, el gen responsable de un mayor número de casos de GEFS-AD, en concreto se le atribuye el origen de la enfermedad en 22 familias. En este gen, codificante para la formina invertida 2, se han descrito 14 mutaciones distintas (A13T, L42P, L76P, R177H, E184K, S186P, Y193H, L198R, R214H, R214C, R218Q, R218W, E220K, L245P). De los tres genes sólo en el caso de INF2 se ha visto que una misma mutación esté presente en más de una familia, así tenemos las mutaciones R177H, S186P, L198R, R214H, R214C y R218W cada una de las cuales está presente en dos familias no relacionadas y la mutación E220K que está presente en tres familias no relacionadas (Figura 5.3.)80,149,150. La lentitud del proceso de nucleación espontánea de los monómeros de actina provoca que sean necesarios factores para acelerar el proceso. Entre estos factores se encuentran las forminas como INF2. Al igual que otras proteínas de la familia INF2 interviene en la polimerización y despolimerización de la actina. Se ha visto que la capacidad de despolimerización de la actina de esta formina reside en la región C-terminal (en el dominio FH2 y el dominio DAD). Esta actividad está regulada por la interacción autoinhibitoria entre los dominios DID y DAD. Cuando estos   131 Discusión Figura 5.3. Representación gráfica de los cambios descritos en la proteína INF2. En la imagen se muestra la estructura de la proteína INF2 con las distintas mutaciones descritas hasta el momento, incluida la mutación L245P descrita por primera vez en este trabajo. Todas las mutaciones se sitúan dentro del dominio proteico DID. DID= diaphanous inhibitory domain, FH1: dominio homólogo a formina 1, FH2: dominio homólogo a formina 2, DAD: diaphanous autoregulatory domain. C N dominios interaccionan se inhibe la capacidad de despolimerización de INF2 pero no se ve afectada la actividad de polimerización. Distintos estudios han permitido ver que INF2 se localiza predominantemente en el RE y que mutaciones que anulan la interacción DID-DAD de INF2 provocan un colapso del retículo debido a una acumulación de filamentos de actina89. Recientemente se ha visto que Cdc42 unido a GTP se une al dominio DID de INF2 y modula la actividad de esta formina. Además se ha descubierto que forminas de la familia mDIA interaccionan con INF2. La interacción del dominio DID de INF2 con el dominio DAD de mDIA actúa limitando la polimerización de la actina mediada por DIA y la transcripción   132 Discusión dependiente de SRF (factor de respuesta al suero) de una forma dependiente de Rho y Cdc42151. Otro de los procesos en los que interviene INF2 es el de transcitosis basolateral-apical, una ruta indirecta de transporte de proteínas, es decir, las proteínas normalmente van primero a la superficie basolateral y después son transportadas en vesículas a la superficie apical. En este proceso es fundamental la actuación de la proteína integral de membrana MAL2. INF2 se une por su región C-terminal a MAL2 y por su dominio DID a Cdc42 y Rac1 (proteínas implicadas en el ensamblaje y organización del citoesqueleto de actina). Cdc42 unida a INF2 regula la dinámica de MAL2 y el proceso de transcitosis a la membrana apical. Además parece que en ensamblaje y desensamblaje de cortos filamentos de actina por esta formina facilita el movimiento de vesículas90. INF2 no solo interacciona por su extremo C-terminal con MAL2, sino también con MAL, un componente de la maquinaria de transporte entre el aparato de Golgi y la superficie apical de células epiteliales polarizadas. MAL media una ruta especial de transporte responsable de transportar Lck (proteína tirosina quinasa específica de leucocitos) a la membrana plasmática de las células T humanas. INF2 es necesaria para la formación de las vesículas transportadoras de Lck, para una distribución subcelular normal de Lck y una correcta formación de las sinapsis inmunológicas. Además el transporte de Lck requiere de la actividad polimerizadora y despolimerizadora de actina de INF2. En este tipo de transporte también es necesaria la unión de Cdc42 y Rac1 al dominio DID de INF2152. Como vemos las mutaciones descritas en DID podrían afectar a múltiples procesos; podrían anular la interacción entre los dominios DID/DAD provocando una desregulación del proceso de polimerización de la actina y un colapso del RE, bloquear la interacción con las forminas del grupo DIA y paralizar los procesos de transporte mediados por MAL y   133 Discusión MAL2. La alteración de estas funciones celulares causadas por mutaciones en DID podría ser el origen del desarrollo de la GEFS-AD. 5.4. ITGA3, FN1 y NEPH1 como genes candidatos para la GEFS-AD Ninguno de los genes seleccionados como candidatos a responsables de la GEFS, ITGA3, FN1 y NEPH1 presentó ningún cambio al que se le pudiera asociar un carácter claramente patogénico. El único cambio que se ha detectado, y que fue considerado como probablemente dañino por el programa PolyPhen, se encontró en el gen para la subunidad α de la integrina 3 en un individuo con una forma de GEFS esporádica. Se trata de un cambio en heterocigosis no conservativo, R463Q, que solo fue detectado en dicho individuo. El estudio de conservación evolutiva mostró que era un residuo altamente conservado entre especies. El cambio se sitúa en el 7º dominio α-integrina que se pliega junto con los otros seis restantes para formar una estructura β-propeller153,154. De hecho se ha visto que este tipo de sustitución aminoacídica, arginina por glutamina, es patogénica en alguna enfermedad como la neuropatía Charcot-Marie-Tooth tipo 2A155. No podríamos, por lo tanto, descartar por completo que este cambio tenga alguna implicación en la GEFS. El hecho de que en nuestra cohorte de pacientes estos genes no se pudiesen considerar como responsables de la GEFS en ninguno de los casos no los excluye como posibles genes responsables de la patología. Esto se debe a que un gen, como se ha visto en el caso de ACTN4, puede ser responsable de un número muy reducido de casos.   134 Discusión 5.5. Correlación genotipo-fenotipo en familias con GEFS-AD Hasta la fecha se conocen 37 familias diagnosticadas con GEFS-AD en las que se ha encontrado el gen responsable de la patología. De los tres genes asociados a esta enfermedad, el responsable de un menor número de casos es ACTN4. En este gen se han identificado 4 mutaciones distintas (I149del, K228E, T232I, S235P) que generan la patología en 4 familias no relacionadas60,123. A continuación estaría TRPC6 causante de la enfermedad en 11 familias distintas, cada una de ellas con una mutación diferente en el gen (G109S, P112Q, N125S, M132T, N134S, S270T, L780P, K874Stop, Q889K, R895C, E897K)64,65,132-134. Por último estaría INF2, el gen responsable de la patología en un mayor número de familias, un total de 22 familias entre las que se encuentra la familia CHUS_GEFS-II que hemos descrito previamente en el apartado de Resultados. En este gen se han descrito 14 mutaciones distintas (A13T, L42P, L76P, R177H, E184K, S186P, Y193H, L198R, R214H, R214C, R218Q, R218W, E220K, L245P) y es el único en el que una mutación es responsable de más de un caso de GEFSAD80,149,150. Una característica que comparten estos tres genes es la de la penetrancia incompleta, es decir, la presencia de la mutación no asegura al 100% que se vaya a desarrollar la enfermedad. Los rasgos fenotípicos de los miembros de las familias con mutaciones en ACTN4 y TRPC6 reiteran los datos que hemos extraído del análisis comparativo del fenotipo de las 22 familias con mutaciones en INF2, es decir, la existencia de una gran variabilidad tanto intrafamiliar como interfamiliar. Como se ha mencionado anteriormente, entre los rasgos más variables se encuentran la edad de diagnóstico (572 años), la edad de IRT (14-70), o la presencia de microhematuria e hipertensión. Incluso en familias con la misma mutación se observan estas variaciones.   135 Discusión A pesar de esta gran variabilidad hay ciertos rasgos que son homogéneos para la GEFS-AD, mismo porcentaje de afectación en hombres y mujeres, presencia de la patología en todas las etnias o ausencia de recidiva tras el trasplante. Todos estos rasgos son independientes del gen responsable del origen de la patología. Otro patrón común que comparten estas familias son los hallazgos histológicos en la biopsia renal: regiones esclerosadas, engrosamiento de la matriz mesangial, sinequias entre los capilares y la cápsula de Bowman, fusión de los procesos podocíticos o daño intersticial. Aunque como decimos estos rasgos son comunes, la presencia de unos u otros dependerá de la fase en la que se encuentre la enfermedad en el momento de la realización de la biopsia. En los últimos tiempos se han realizado estudios de las biopsias de los pacientes con GEFS-AD con el objetivo de intentar establecer algún rasgo que diferencie a los pacientes en los que se conoce el gen responsable de la patología. En esta línea, Henderson et al realizaron un trabajo en el que estudiaron las biopsias de las 4 familias que presentan mutación en el gen de la α-actinina 4. Compararon dichas biopsias con las de otros pacientes con GEFS de etiología desconocida y con pacientes con GEFS secundaria a otra patología. Este estudio reveló que los pacientes con GEFS causada por mutaciones en ACTN4 presentaban unas características únicas en la microscopía electrónica y en la de inmunofluorescencia. Una de esas características era la presencia de agregados electrodensos en el citoplasma de los podocitos que están compuestos, al menos en parte, por actina y αactinina mutada. Se desconoce cómo se originan dichos agregados, aunque se baraja la hipótesis de que el aumento de afinidad generado por la mutación en la α-actinina 4 pudiese dar lugar a que la actina unida a la actinina se fuese acumulando lentamente en el citoplasma aumentando el daño glomerular. La otra característica diferencial que se encontró fue el patrón   136 Discusión de tinción irregular granular de la α-actinina 4 en las paredes de los capilares glomerulares observados por inmunofluorescencia. Este patrón irregular parece ser el resultado de una desorganización del citoesqueleto156. Este patrón histológico no había sido visto hasta el momento ya que en ese trabajo mencionado se ha recurrido al uso de un anticuerpo anti-αactinina 4. Este hallazgo facilita sin duda el diagnóstico de la enfermedad para los pacientes con GEFS-AD causada por ACTN4. Hasta el momento no se conocen estudios similares con las familias con mutaciones en TRPC6 e INF2, pero la posibilidad de identificación de rasgos como estos facilitaría la realización del diagnóstico para las familias con GEFS-AD sin que fuese necesario realizar un estudio mutacional de todos los genes conocidos responsables de la enfermedad. 5.6. Perspectivas de futuro Una de las dificultades de esta patología, que se está solventando con las mejoras sanitarias, es la realización de un diagnóstico temprano, ya que en muchos casos en el momento en el que comienzan a aparecer los síntomas la enfermedad ya está muy avanzada y la función renal muy deteriorada. Incluso se han descrito casos en los que se llega a detectar la presencia de la enfermedad en un paciente porque este acude a la consulta por dolencias que nada tienen que ver con la GEFS-AD. La dificultad de un diagnóstico temprano junto con la ausencia de un tratamiento eficaz conducen al paciente a una insuficiencia renal que provoca la necesidad de diálisis y/o trasplante en un corto período de tiempo tras el diagnóstico. Lo que en un primer momento se consideraba una enfermedad de aparición en edad adulta ha ido dejando paso al diagnóstico de casos cada vez en individuos más jóvenes; signos como la aparición de proteinuria se detectan en edades cada vez más tempranas permitiendo un seguimiento   137 Discusión más exhaustivo del paciente con el objetivo de ralentizar el progreso de la enfermedad. Esto puede ser debido por una parte a que la aparición de un posible caso de GEFS con etiología hereditaria en una familia conduce a un estudio de su historia familiar para poder confirmar el diagnóstico y además a realizar un estudio de otros miembros de la familia para poder diagnosticar lo más tempranamente posible la presencia de rasgos de la patología. Por otra parte, la realización de controles rutinarios desde edades tempranas también saca a la luz signos que conducen a ahondar en el estudio de su origen y poder realizar el diagnóstico. La información que se tiene hasta el momento sobre el origen y progresión de la GEFS-AD todavía hace que queden numerosas cuestiones en el aire. Se desconoce por ejemplo porque a pesar de que las tres proteínas presentan un patrón de expresión amplio el fenotipo asociado con sus mutaciones sólo se manifiesta en el riñón; o por qué las mutaciones se distribuyen dentro de las proteínas en unas regiones muy concretas, en la αactinina 4 todas ellas se localizan en el segundo dominio CH, en el canal catiónico se sitúan en los extremos citoplasmáticos y en la formina en el dominio DID. Futuros estudios deben perseguir la búsqueda de otros genes responsables de la patología, así como el estudio de los efectos generados por las mutaciones en los genes responsables de la GEFS-AD. Sin duda, otro de los objetivos que deben perseguir nuevos trabajos de investigación es la búsqueda de posibles dianas terapeúticas que permitan el tratamiento de la patología y eviten el desarrollo de la IRT. .     145 7. BIBLIOGRAFÍA 1. Jarad G, Miner JH. Update on the glomerular filtration barrier. Curr Opin Nephrol Hypertens. 2009;18:226-232. 2. Haraldsson B, Jeansson M. Glomerular filtration barrier. Curr Opin Nephrol Hypertens. 2009;18:331-335. 3. Faul C, Asanuma K, Yanagida-Asanuma E, Kim K, Mundel P. Actin up: regulation of podocyte structure and function by components of the actin cytoskeleton. Trends Cell Biol. 2007;17:428-437. 4. Miner JH. Renal basement membrane components. Kidney Int. 1999;56:2016-2024. 5. Gubler MC. Inherited diseases of the glomerular basement membrane. Nat Clin Pract Nephrol. 2008 4:24-37. 6. Ho MS, Bose K, Mokkapati S, Nischt R, Smyth N. NidogensExtracellular matrix linker molecules. Microsc Res Tech. 2008;71:387-395. 7. Kruegel J, Miosge N. 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