Estudio de la respuesta inmune en hemocitos en "Mytilus galloprovincialis" Lmk.

Estudio de la respuesta inmune en hemocitos en Mytilus galloprovincialis Lmk. Departamento de Bioquímica e Bioloxía Molecular Universidade de Santiago de Compostela Memoria presentada por Ana Novás Maseda para optar al grado de Doctora en Biología Lugo, septiembre de 2005 La presente memoria ha originado la siguiente publicación: Novás, A., Cao, A., Barcia, R. y Ramos-Martínez, J.I. (2004). Nitric oxide release by hemocytes of the mussel Mytilus galloprovincialis Lmk. was provoked by interleukin-2 but not by lipopolysaccharide. Int. J. Biochem. Cell Biol. 36, 390-394. Este trabajo ha sido financiado por los proyectos de investigación XUGA 26100 PB96 y PGIDT MAR26102PR de la Secretaría Xeral de Investigación e Desenvolvemento de la Xunta de Galicia. D. Juan Ignacio Ramos-Martínez, Catedrático del Departamento de Bioquímica y Biología Molecular de la Universidad de Santiago de Compostela, y D. Ramiro Barcia Vieitez, Profesor Titular del mismo departamento, INFORMAN: Que la presente memoria con título “Estudio de la respuesta inmune en hemocitos de Mytilus galloprovincialis Lmk.” elaborada por la licenciada en Biología, Dña. Ana Novás Maseda, ha sido realizada bajo nuestra dirección en el laboratorio de Bioquímica y Biología Molecular de la Facultad de Veterinaria de Lugo y hallándose concluida, autorizamos su presentación a fin de que pueda ser juzgada por el tribunal correspondiente para optar al grado de Doctora en Biología, especialidad Bioquímica y Biología Molecular. Lugo, septiembre de 2005 Fdo. J.I. Ramos-Martínez Fdo. R. Barcia Vieitez Fdo. A. Novás Maseda Departamento de Bioquímica e Bioloxía Molecular Universidade de Santiago de Compostela “Atreverse, es no hacer pie por un momento, no atreverse, es perderse a uno mismo para siempre.” Sören Kierkegaard 4 protuberancia dorsal denominada umbo, a partir de la que se pueden apreciar líneas de crecimiento concéntricas (Brusca y Brusca, 2005) (Figura 1). La musculatura se encuentra adherida a la concha y son los músculos aductores, anterior y posterior, los más destacados. Estos músculos están constituidos por dos tipos de fibras, estriadas y lisas, lo que les permite cerrar las valvas rápidamente y durante largos períodos de tiempo (Durán et al., 1990; Brusca y Brusca, 2005) (Figura 2). En la cavidad paleal sobresalen las branquias, que además de actuar como órgano respiratorio, colaboran en la alimentación. Los bivalvos y concretamente M. galloprovincialis son animales filtradores que adquieren el alimento suspendido en el agua del mar por un mecanismo de tamizado por medio de cilios. El agua es arrastrada a través de los poros que hay en las branquias y las partículas alimentarias quedan pegadas a una capa de mucus. El aparato digestivo de este organismo está diferenciado en boca (rodeada de palpos labiales), esófago, estómago e intestino, rodeado de glándula digestiva o hepatopáncreas. La mayor parte de los procesos digestivos tienen lugar en los divertículos digestivos, que comunican el estómago con el hepatopáncreas (Brusca y Brusca, 2005). Figura 1. Ejemplar de Mytilus galloprovincialis Lmk Introducción 5 En la glándula digestiva o hepatopáncreas coexisten dos tipos celulares, las células digestivas o acidófilas y las piramidales o basófilas, caracterizadas por poseer un extenso retículo endoplasmático, abundancia de ribosomas, aparato de Golgi muy activo y numerosas vesículas apicales, rasgos típicos de células que sintetizan y secretan proteínas (Owen, 1966). El manto es el principal tejido de reserva del molusco y permanece adherido a la concha por unas fibras musculares que constituyen la línea o seno paleal. El borde del manto presenta tres pliegues: externo, medio e interno. El pliegue externo se relaciona con la secreción de la concha; el medio desempeña la función sensorial, mientras que el pliegue interno contiene músculos radiales y circulares, involucrados en el movimiento del agua dentro de la cavidad del manto. El pie es un órgano musculoso, con forma de hoja y comprimido lateralmente, cuyos movimientos se consiguen por una combinación de acciones musculares y de presión hidráulica. Secreta gránulos de naturaleza proteica, que posteriormente se endurecen en forma de filamentos, constituyendo el biso, cuya función es el anclaje del molusco. Los moluscos presentan un sistema circulatorio abierto y la hemolinfa desempeña diversas funciones en el molusco, entre las que destacan el transporte de un pigmento respiratorio (la hemocianina), la defensa del organismo frente a patógenos y el soporte corporal, puesto que el hemocele funciona como un esqueleto hidrostático (Marshall y Williams, 1980; Durán et al., 1990; Brusca y Brusca, 2005). 6 Figura 2. Morfología de un individuo de la especie Mytilus galloprovincialis 2. Inmunidad: sistemas y respuestas inmunitarias La respuesta inmune ha sido definida tradicionalmente, como un sistema antimicrobiano no específico para autolimitar la respuesta inflamatoria (Miyajima et al., 1992). El sistema inmune en todos los animales comprende elementos celulares y humorales que interaccionan para proteger al organismo de patógenos, parásitos y células neoplásicas (Ratcliffe et al., 1985; Smith, 1991), de forma que todos los organismos manifiestan una capacidad determinada genéticamente para distinguir entre lo propio y lo extraño. Las bases moleculares para los mecanismos de reconocimiento y respuesta del efector varían según los niveles de organización biológica (Nappi y Ottaviani, 2000; Nappi y Vass, 2000). Los organismos multicelulares poco evolucionados sólo presentan un tipo de inmunidad, denominada innata que es exclusivamente celular y filogenéticamente más antigua que la inmunidad adquirida, que está presente en Pie Branquias Músculo aductor posterior Biso Manto Hepatopáncreas Músculo aductor anterior Introducción 7 organismos como peces (cartilaginosos y óseos), anfibios, reptiles, aves y mamíferos (Thompson, 1995). 2.1 Células y tejidos del sistema inmune en invertebrados En el sistema circulatorio de invertebrados, se detecta una gran variedad de tipos de células sanguíneas (Ratcliffe y Rowley, 1979; 1981), las cuales, aparentemente, desempeñan funciones variadas como son transporte, almacenamiento, reparación de heridas y pigmentación, así como defensa del organismo. De acuerdo con su papel biológico poseen especializaciones estructurales, bioquímicas y de comportamiento. Los invertebrados carecen de respuestas inmunes adaptadas que son características de mamíferos, pero poseen una respuesta inmune innata que incluye la acción de componentes humorales y celulares (Nappi y Vass, 1993; Carton y Nappi, 1997; Nappi y Ottaviani, 2000; Nappi y Vass, 2000). La inmunidad humoral incluye la activación de cascadas proteolíticas que finalizan en la opsonización y la síntesis de varios péptidos antimicrobianos (Meister et al., 1997, Hoffman et al., 1999; Bulet et al., 1999; Engstrom, 1999). Las respuestas celulares son realizadas por hemocitos (Söderhäll y Smith, 1983, Smith y Söderhäll, 1983; 1991), los cuales poseen la capacidad de fagocitar patógenos y desarrollar el proceso de encapsulación de metazoos (Nappi y Vass, 1993; Carton y Nappi, 1997; Nappi y Ottaviani, 2000; Nappi y Vass, 2000). El análisis microscópico y funcional de los hemocitos sugiere fundamentalmente la presencia de tres tipos celulares: células hialinas, células semigranulares y células granulares (Söderhäll y Smith, 1983, Smith y Söderhäll, 1983; 1991). Las células hialinas carecen de grandes gránulos distintivos, presentando una gran actividad fagocítica (Bauchau, 1981; Smith y Söderhäll, 1983). Otros autores, afirman que en el citoplasma de este tipo celular aparecen 8 algunos pequeños gránulos basófilos. Las células granulares y semigranulares son de mayor tamaño que las hialinas, presentando gránulos acidófilos, basófilos o incluso de ambos tipos (Carballal et al., 1997). Estos gránulos intracelulares pueden descargarse al exponer a la célula frente a materiales no propios (Smith y Söderhäll, 1983). 2.1.1 Poblaciones celulares en hemolinfa de moluscos bivalvos Los hemocitos en invertebrados tienen una importancia clave en las reacciones de defensa de estos organismos (Pipe et al., 1997). Existen diferentes opiniones en relación al número y tipo de hemocitos en moluscos bivalvos, así como en su clasificación celular. La existencia de diversos tipos de clasificación se debe a la variabilidad de técnicas empleadas, que abarcan desde las morfológicas hasta la citrometría de flujo (Soares da Silva et al., 2002) (Figura 3). En Anadonta cygnea, los hemocitos pueden englobarse en dos categorías, granulocitos e hialinocitos. Los primeros, son células de gran tamaño, con un núcleo excéntrico, pseudópodos, numerosos gránulos y mitocondrias abundantes, Figura 3 . Poblaciones celulares en hemolinfa de moluscos bivalvos (Barcia et al. , 1999; Cao et al., 2003, 2004a) Introducción 9 además son la población que aparece en mayor número, concretamente un 75% del total. La actividad peroxidasa desarrollada por las mitocondrias y la movilidad desempeñada por los pseudópodos, encontrada sólo en esta población celular de hemocitos, indica su supuesta implicación en la fagocitosis (Lanz et al., 1993; Glinski y Jarosz, 1997; Soares da Silva et al., 2002). El segundo tipo de hemocitos, los hialinocitos, son células pequeñas, con forma oval, sin pseudópodos, con escasa representación (sólo el 25% del total) y con actividad de defensa citotóxica en la hemolinfa (Soares da Silva et al., 2002). La clasificación de hemocitos en Mytilus edulis, ha recibido históricamente considerable atención (Jones, 1846; Williams, 1852; Sabatier, 1877; Flemming, 1878; Kollmann, 1980; Feng et al., 1977; Moore y Lowe, 1977; Rasmussen et al., 1985; Pipe, 1990a; Koehn, 1991; Nöel et al., 1994). En estudios iniciales, se clasificaron varias fases de su desarrollo incluyendo estados granulares finos y gruesos, así como células nucleadas, incluyéndose descripciones de aglomeraciones y la formación de pseudópodos (Jones, 1846). Una de las clasificaciones, describe la caracterización antigénica de dos subpoblaciones con anticuerpos monoclonales y reconoce tres clases de hemocitos (Pipe et al., 1997). Los hemocitos de M. edulis pueden dividirse en dos grupos, basófilos y eosinófilos; en el primer grupo se incluyen células hialinas y granulares, mientras que en el grupo de los eosinófilos sólo se encuentran células granulares (Friebel y Renwrantz, 1995; Pipe et al., 1994). A su vez, los hemocitos granulares de M. edulis contienen dos tipos distintos de gránulos, que se diferencian en tamaño, contenido enzimático y características de tinción con lectinas (Pipe, 1990b; 1992; Dyrynda et al., 1997). En la hemolinfa de M. galloprovincialis han sido detectados dos tipos diferentes de células (Barcia et al., 1999; Cao et al., 2003, 2004a). En primer lugar, un grupo de células pequeñas redondeadas, denominadas células RH, con un 10 núcleo que ocupa casi la totalidad de la célula y un pequeño volumen de citoplasma, que a veces es tan sólo un halo alrededor del núcleo (Figura 4). Esta morfología recuerda a las células RH aisladas a partir de hemolinfa de P. corneus (Ottaviani et al., 1993a) o los hialinocitos aislados de la hemolinfa de M. edulis (Pipe et al., 1997). El segundo tipo celular encontrado en hemolinfa de M. galloprovincialis, presenta un mayor tamaño y un citoplasma expandido (células SH) (Figura 5), siendo similares a las SH aisladas en P. corneus (Ottaviani et al., 1993a), recordando a su vez la estructura de macrófagos de vertebrados y eosinófilos detectados en M. edulis (Pipe et al., 1997). Figura 4 . Células RH de hemolinfa de Mytilus galloprovincialis Lmk. (Barcia et al., 1999; Cao et al., 2003, 2004a) Figura 5 . Células S H de hemolinfa de Mytilus galloprovincialis Lmk. (Barcia et al. , 1999; Cao et al., 2003, 2004a) Introducción 11 2.2 El lipopolisacárido bacteriano y las citoquinas en la respuesta inmune La respuesta inmune está regulada por múltiples y complejas interacciones entre moléculas, las cuales desencadenan señales de transducción intercelulares. Algunas de estas moléculas importantes en la respuesta inmunitaria son el lipopolisacárido bacteriano y las citoquinas (Goméz et al., 1998). El lipopolisacárido o LPS es el principal componente de la membrana externa de bacterias Gram-negativas (Pipe et al., 1997; Lien et al., 2000) y posee la capacidad para activar macrófagos de vertebrados (Celada y Nathan, 1994; Chen et al., 2003; Khadaroo et al., 2003; Stout et al., 2005) y hemocitos de invertebrados (Ottaviani et al., 1995). Al activar macrófagos, se desencadena la secreción, entre otros, de óxido nítrico (Ottaviani et al., 1997), citoquinas (Weiss et al., 2001; Zhang et al., 2005) y la activación de múltiples señales de transducción en las que están implicadas fosfolipasas, proteínas G, proteína quinasas, etc. (Liu et al., 1994; Sweet y Hume, 1996; von Knethen et al., 2005). Al igual que en vertebrados, los hemocitos de invertebrados responden a la acción del LPS mediante cambios conformacionales, incremento de la movilidad y liberación de óxido nítrico (Hughes et al., 1991a; 1991b; Lowestein et al., 1993; Xie et al., 1993). A su vez, las citoquinas representan un grupo diverso de moléculas que participan en la tranducción de señales (Leonard y Lin, 2000) y estas señales, pueden ser de dos tipos, autocrina y/o paracrina (Gómez et al., 1998; Leonard y Lin, 2000). Tradicionalmente, han sido clasificadas según su origen o función y desde un punto de vista funcional, las citoquinas son: 12 1. Redundantes, distintas citoquinas provocan la misma respuesta. 2. Pleiotrópicas, la mima citoquina provoca diferentes respuestas. 3. Sinérgicas, la combinación de dos o más citoquinas potencian su respuesta al actuar sobre un mismo tipo celular (Chyczewska y Mroz, 1997; Badovinac et al., 1998; Wald et al., 2001; Zhao et al., 2003) En animales superiores, las citoquinas están relacionadas con la inmunidad, la inflamación, el estrés y la regulación de la expresión de diversas proteínas (Arai et al., 1990; Blach-Olszewka, 2005; Gobert et al., 2005). En invertebrados, los hemocitos no sólo responden a la administración exógena de citoquinas de vertebrados (Hughes et al., 1992; Ottaviani et al., 2004), sino que también han sido detectadas moléculas similares a ellas (Hughes et al., 1992; Stefano et al., 1991; Ottaviani et al., 1993a; Granath et al., 1994). El empleo de TNF-α, IL-2, PDGF y TGF-β 1 provoca cambios en la forma de los hemocitos, modifica la movilidad de estas células, incrementa la fagocitosis, promueve la síntesis de aminas biógenas (Hughes et al., 1991a; 1992; Ottaviani et al., 1994; Ottaviani et al., 1995), induce las enzimas responsables de la síntesis de óxido nítrico y es conocida la implicación del PDGF y del TGF-β 1 en rutas de transducción de señales a través del fosfatidilinositol y AMPc (Ottaviani et al., 2004). Además, se ha detectado que un tipo celular presente en Mytilus galloprovincialis, concretamente, las células SH, expresan la cadena α del receptor de IL-2 (Barcia et al., 1999); mientras que en la membrana plasmática de hemocitos de algunas especies de insectos y de moluscos, han sido detectadas moléculas similares a los receptores de PDGF y TGF-β 1 de vertebrados (Kletsas et al., 1998; Ottaviani et al., 2001). Introducción 13 3. Óxido nítrico y sistema inmunitario 3.1 El nitrógeno El nitrógeno es un gas diatómico, que forma parte de la atmósfera (78% del volumen). A pesar de su baja reactividad química, el nitrógeno es uno de los 20 bioelementos que entran a formar parte de los seres vivos, con la particularidad de ser el cuarto componente más abundante (1.4%), superado por el oxígeno (25%), el carbono (9.5%) y el hidrógeno (63%). Su importancia proviene de su presencia en biomoléculas como los ácidos nucleicos, proteínas, hormonas, neutrotransmisores, vitaminas, coenzimas, fosfolípidos y otros lípidos estructurales complejos. Como en el caso del carbono y del oxígeno, el nitrógeno está sometido a un ciclo biológico complejo que permite su integración desde el estado diatómico básico en que se encuentra en la atmósfera, hasta el estado reducido que caracteriza su presencia como componente de biomoléculas. Este ciclo comienza con la acción de distintos microorganismos del suelo (Azotobacter, Rhyzobium, Klebsiella), que fijan el nitrógeno atmosférico, para que luego, otros microorganismos puedan transformarlo en nitritos y nitratos. En estas formas moleculares sencillas, el nitrógeno puede ser asimilado por las plantas y entrar en la cadena trófica en forma reducida (NH4) o en la forma oxidada (nitritos, nitratos). El proceso de putrefacción de la materia orgánica devuelve el nitrógeno a la biosfera por un mecanismo de desnitrificación que llevan a cabo bacterias saprófitas. Finalmente el hombre incide de forma negativa en este ciclo al enviarlo a la atmósfera en forma de residuos industriales de los combustibles fósiles, capaces de reaccionar con el ozono y formar parte de la lluvia ácida (Diehl et al., 1985; Solomon et al., 2001) (Figura 6). 20 basales de Ca2+ (Boo y Jo, 2003). Su masa molecular es de 130 kDa (Xie et al., 1996). Esta isoforma inducible, se expresa en respuesta a estímulos inmunológicos como pueden ser los provocados por el lipopolisacárido de bacterias Gramnegativas (LPS) y citoquinas proinflamatorias (IFN-γ) (Hibbs et al., 1988; Schmidt et al., 1992; Meda et al., 1995). El NO sintetizado por la iNOS, contribuye a la defensa del hospedador debido a la capacidad citotóxica que presenta frente a bacterias, protozoos y células tumorales (Bred, y Snyder, 1990; Pfeilschifter et al., 1996). Así, una de sus funciones es controlar distintos procesos de la fagocitosis en células inmunes (Franchini et al., 1995; Forslund y Sundquist, 1997). 3.3.2 Estructura de las óxido nítrico sintetasas La estructura de NOS ha sido conservada a lo largo de la evolución, presentando dos dominios (Boo y Jo, 2003): un dominio carboxilo terminal utilizado básicamente para la unión del NADPH (Cho et al., 1995), FAD y FMN (Bredt et al., 1991); un dominio amino terminal al que se une la tetrahidrobiopterina, el grupo hemo y la L-arginina (Richards y Marletta, 1994; McMillan y Master, 1995; Ghosh y Stuehr, 1995; Kolios et al., 2004); mientras que a la zona hidrofóbica central se une la calmodulina (Marletta, 1993; Bredt y Snyder, 1994) (Figura 9). Figura 9. Esquema de la secuencia aminoacídica de la óxido nítrico sintetasa endotelial (eNOS). Se muestran los lugares de unión para el grupo hemo, calmodulina (CaM), flavín mir L - arg/Hemo/BH 4 CaM FMN FAD NADPH H2NCOOH Dominio oxigenasa Dominio reductasa Introducción 21 nucelótidos (FMN, FAD), NADPH y el ácido mirístico (mir) (Original tomado de Kolios et al., 2004). Estructuralmente, la diferencia entre la NOS endotelial y las otras dos isoformas, es la presencia en el dominio oxigenasa de eNOS, de un sitio consenso para procesos de acilación, concretamente para miristoilación y palmitoilación (Pollock et al., 1992; Busconi y Michel, 1993; Sessa et al., 1993; Sakoda et al., 1995; Robinson y Michel, 1995) (Figura 10). Figura 10. Esquema de la estructura de eNOS y de los sitios de unión para el ácido mirístico (naranja) y para el ácido palmítico (verde) en el dominio amino terminal. La miristoilación es un proceso irreversible catalizado por la miristoiltransferasa, que consiste en la unión covalente del ácido mirístico a la glicina existente en la posición 2 de la enzima (Boutin, 1997; Farazo et al., 2001). Este proceso hace que eNOS sea más hidrofóbica, lo que le permite asociarse con membranas intracelulares, resultando dicha asociación necesaria para el inicio de L-arg/Hemo/BH4CaM FNM FA D NADPH H2NCOOH 2 15 26 H2NGly Cys Cys C OOH C O OH C O OH 22 su fosforilación, la activación de la NOS endotelial y producción de NO en respuesta a un estímulo (Sessa et al., 1993; Fulton et al., 2002). A su vez, la miristoilación es un requisito previo para que ocurra la palmitoilación (Robinson y Michel, 1995; Sessa et al., 1993; Liu et al., 1997; Dunphy y Linder, 1998; Resh, 1999). Este segundo tipo de acilación, consiste en la tiopalmitoilación de un residuo cisteína en la posición 15 o 26, siendo un proceso totalmente reversible (Robinson y Michel, 1995; Galbiati et al., 1999; Melkonian et al., 1999) y catalizado por una enzima (palmitoil-transferasa) que reconoce selectivamente residuos miristoilados (Milligan et al., 1995; Simons y Toomre, 2000; Janes et al., 2000). Figura 11. Esquema de la translocación de eNOS desde la membrana hasta el citosol como consecuencia del ciclo de pamitoilación y depalmitoilación. OH CO HO C O Palmitoilación Depalmitoilación HO C O Introducción 23 Se cree que el control de la localización subcelular de determinadas enzimas, entre ellas la eNOS, se debe a ciclos de palmitoilación y depalmitoilación (McCabe y Berthiaume, 1999; Yeh et al., 1999; Simons y Toomre, 2000) (Figura 11), siendo dichos ciclos la razón para que eNOS, no sólo se encuentre asociada a membranas, sino que también pueda translocarse al citosol como consecuencia de una depalmitoilación en respuesta a un estímulo externo (Robinson et al., 1995; Prabhakar et al., 1998). 3.3.3 Grupos prostéticos Las óxido nítrico sintetasas son catalíticamente activas sólo en forma dimérica (Stuehr et al., 1991a; Giovanelli et al., 1991; Channon, 2004). Para formar dímeros activos son necesarios un sustrato (L-arginina) y varios grupos prostéticos, que facilitan la funcionalidad de las distintas isoformas: FAD, FMN (Stuehr et al., 1991b; Hevel et al., 1991), Ca2+/calmodulina (CaM) (Cho et al., 1992), tetrahidrobiopterina (BH4) (Kwon et al., 1998; Tayeh y Marletta, 1989) y grupo hemo (Xie et al., 1996) (Figura 12). 3.3.3.1 NADPH y flavín-nucleótidos (FAD, FMN) El flujo de electrones a las óxido nítrico sintetasas para la síntesis de NO depende de la función de determinados nucleótidos (Abu-Soud et al., 1994; Griffith y Stuerh, 1995). La actividad catalítica de las NOS, implica la transferencia secuencial de electrones desde el NADPH a las flavinas (FAD y FMN), que a su vez, son transferidos al dominio oxigenasa de otro monómero, en donde ocurre la oxidación de la L-arginina (Fleming y Busse, 2003; Channon, 2004). 24 Figura 12. Formación de dímeros activos de óxido nítrico sintetasas mediante la unión de distintos grupos prostéticos Ca M FMN FAD Monómero inactivo Dominio reductasa Dominio oxigenasa Monómero inactivo CaM FMN FAD Monómero inactivo BH 4 Fe CaM FMN FAD L-arginina BH 4 Fe Dímero activo NADPH NADP + L - argin ina L - citrulina O 2 NO BH 4 Fe CaM FMN FAD NADPH NADP + L-arginina L-citrulina O2 NO BH 4 Fe CaM FMN FAD Introducción 25 3.3.3.2 Calmodulina (CaM) La calmodulina (CaM) es una proteína pequeña, altamente conservada y ubicua, que posee cuatro lugares de unión para el Ca2+. Una segunda denominación de la proteína como “proteína moduladora del calcio” nos indica la estrecha relación existente entre CaM y el ión calcio (Chin y Means, 2000; Stull, 2001). Su función se reduce básicamente a dos aspectos: 1. Protección del sitio de unión del substrato de NOS de la acción de las proteasas (Sheta et al., 1994; Ghosh y Stuehr, 1995) 2. La unión de la CaM a la enzima facilita la transferencia de electrones desde el NADPH a los flavín nucleótidos y de éstos a los aceptores exógenos (Abu-Soud et al., 1994; Fleming y Busse, 2003; Channon, 2004). Las NOS son sintetizadas en forma monomérica, en estos monómeros se aprecia un dominio oxigenasa, inicialmente no funcional (Sheta et al., 1994) y un dominio reductasa funcional. A esta segunda región, se unen los flavín nucleótidos y el NADPH; mientras que a la región oxigenasa, se unirán la BH4 y el grupo hemo, en presencia de la L-arginina (Nishimura et al., 1995). Entre ambos dominios, se halla la CaM (Bredt et al., 1991;Cho et al., 1992; Sheta et al., 1994), de forma que esta proteína facilita la transferencia de electrones entre NADPH y flavín nucleótidos y de éstos a la región oxigenasa (Abu-Soud et al., 1994; Christopherson, 1996). Cada una de las óxido nítrico sintetasas posee una limitación para la transferencia de electrones, mostrando mayor dificultad para modular este transporte las isoformas constitutivas (Miller et al., 1999). En las distintas isoformas existen secuencias consenso para la unión de la calmodulina a las enzimas (Lamas et al., 1992; Lowesntein et al., 1992; Lyons et 26 al., 1992; Xie et al., 1992). La unión de la CaM a las NOS, está mediada inicialmente por interacciones hidrofóbicas. La alta afinidad existente entre CaMiNOS, podría explicarse por la presencia de un mayor número de residuos hidrofóbicos en iNOS (Aoyagi et al., 2003). En mamíferos, la calmodulina se considera una subunidad dentro de la propia isoforma inducible; consecuentemente, la iNOS resulta independiente de elevadas concentraciones de calcio para su activación (Cho et al., 1992). Desde un punto de vista bioquímico, la unión de la calmodulina a la isoforma inducible no está regulada por el ión calcio. Por el contrario, en las cNOS, la unión de la CaM es dependiente de Ca2+, siendo un proceso totalmente reversible (Lowenstein et al., 1992; Xie et al., 1992). 3.3.3.3 Tetrahidrobiopterina (BH4) La tetrahidrobiopterina actúa como un grupo prostético para la formación de dímeros activos de NOS, además de proporcionar el lugar de unión para la Larginina, que actúa como sustrato en la síntesis de óxido nítrico (Cho et al., 1995; Channon, 2004). Podemos destacar tres aspectos por los cuales la BH4 tiene importancia: 1. La dimerización es obligatoria para la síntesis de óxido nítrico y la tetrahidrobiopterina es esencial para la formación de dímeros estables de NOS (Stuehr et al., 1991a; Baek et al., 1993; Channon, 2004). 2. Al unirse la BH4 a los monómeros de NOS, se favorece el cambio alostérico del sitio catalítico de la enzima, de forma que el grupo hemo puede unirse más fácilmente al complejo enzimático (Klatt et al., 1994; Raman et al., 1998). Introducción 27 3. La BH4 ejerce doble protección, por una lado, protege a los homodímeros de la proteolisis por tripsina (Panda et al., 2002); por otro, protege al grupo hemo de la acción del óxido nítrico sobre la propia NOS (Griscavege et al., 1994), evitando que se produzca una modificación del potencial redox (Wang et al., 1995). El dímero es la forma activa de las óxido nítrico sintetasas y se considera a la BH4 como la principal promotora de la formación de dímeros, ya que es esencial para la estabilización y el mantenimiento de dímeros activos, así como para regulación la actividad de las distintas isoformas. La producción de óxido nítrico citosólico está correlacionada con un incremento de la tetrahidrobiopterina intracelular (Tzeng et al., 1995). Un ejemplo de la importancia de la tetrahidrobiopterina para iNOS, es el observado en células NIH 3T3 de recombinantes humanos con una deficiencia en BH4, que poseen una baja actividad de la isoforma inducible. Estas células son capaces de recuperar la actividad normal de la enzima, si son incubadas durante un tiempo con BH4 (Tzeng et al., 1995). En el caso de la eNOS, cuando se produce una limitación o ausencia de los niveles intracelulares de BH4, se produce un descenso en la actividad de la enzima. En primer lugar, el dímero de la NOS endotelial se desestabiliza, lo que supone una reducción de dímeros en relación a los monómeros de eNOS presentes en la célula. En segundo lugar, la actividad catalítica de la enzima se desacopla, en ese momento, puede seguir produciéndose o no la oxidación de la L-arginina; pero sigue ocurriendo la transferencia de electrones, formándose superóxidos y/o peróxidos de hidrógeno. La funcionalidad de eNOS en este momento, está regulada 28 por mecanismos dependientes de la disponibilidad de arginina y de la restauración de los niveles de BH4 (Ozaki et al., 2002). 3.3.3.4 Grupo hemo En estrecha relación con la tetrahidrobiopterina para la estabilización de dímeros activos de NOS, está el grupo hemo. La importancia del grupo hemo radica en que la producción de óxido nítrico por NOS, requiere la dimerización de la enzima y el sitio activo de dichas enzimas necesita dos grupos hemo. Si bien es cierto que para dimerizar sería suficiente con un solo grupo hemo, pero la catálisis precisa dos (Xie et al., 1996). De forma esquemática, en la siguiente figura, se puede observar el modelo para la formación del complejo NOS-NO durante la catálisis. En presencia de Larginina y con exceso de NADPH, el ión férrico (Fe3+) del grupo hemo unido a la NOS, se reduce a ión ferroso (Fe2+) (Wang et al., 1994). La unión del óxido nítrico es más fuerte a la forma reducida (Fe2+), estando a su vez, estabilizada por la presencia de L-arginina en el medio (Porter y Coon, 1991; Wells et al., 1992). Figura 13. Modelo para la formación del complejo constituido por la L-arginina y el óxido nítrico (NO) durante la etapa catalítica (Original tomado de Wang et al., 1994) Fe3+ Cys NO Fe2+ Cys NADPH L-arginina Introducción 29 3.3.4 Regulación de las óxido nítrico sintetasas La expresión de las tres isoformas de NOS está regulada por mecanismos transcripcionales y posttranscripcionales. Los mecanismos transcripcionales implicados en la regulación de la actividad de las NOS implican a factores de transcripción (NFκB), al propio NO y a proteínas asociadas a las isoformas (proteína quinasas y proteínas de estrés térmico). A nivel posttranscripcional, la expresión de las óxido nítrico sintetasas se regula por cambios en la estabilidad del ARNm de cada una de las isoformas (Arnal et al., 1992; Searles et al., 1999). Ciertos estímulos como pueden ser estados de hipoxia, determinadas citoquinas (TNF, LPS) o estrés, provocan una disminución de la vida media del ARNm (Mohamed et al., 1995; Zhang et al., 1997). 3.3.4.1. Factores de transcripción NFκB Los factores de transcripción NFκB son homo o heterodímeros de proteínas que pertenecen a la familia Rel (Verma et al., 1995; Baldwin, 1996). La expresión de estos factores, regula procesos inmunitarios en respuesta al estrés, inflamación (Bauerle y Baltimore, 1996) e incluso regula la inhibición de la apoptosis (Van Antwerp et al., 1996; Wang et al., 1996). Los NFκB están presentes en la mayoría de las células y tejidos como proteínas inactivas. Son retenidos en el citosol por su interacción con unas proteínas denominadas IκBs. La actividad de NFκB puede ser inducida por un amplio espectro de señales, incluyendo citoquinas, virus, luz ultravioleta, etc (Kopp y Ghosh, 1995). Estos elementos externos promueven la fosforilación, ubiquitinación y degradación de IκBs, facilitando la liberación de NFκB. Es en este 36 En Mytilus galloprovincialis han sido identificadas dos subunidades reguladoras, Rmyt1 y Rmyt2, las cuales son homólogas a las subunidades reguladoras RI y RII de mamíferos. Estas subunidades poseen el mismo peso molecular, aunque han sido purificadas a partir de diferentes tejidos de mejillón, obteniéndose Rmyt1 a partir de músculo aductor posterior (PAM) y Rmyt2 a partir de manto (DíazEnrich et al., 2003; Bardales et al., 2004). 4.1.2 PKC La PKC es reconocida como una familia de serina/treonina quinasas que utilizan el γ-fosfato de ATP, o GTP en menor grado, para generar fosfomonoésteres utilizando como fosfoacepores los grupos alcohol en serina y treonina y/o el grupo fenólico en tirosina (Hanks y Hunter, 1995). Esta quinasa, se ha reconocido como receptor celular para el diacilglicerol (DAG), capaz de fosforilar una amplia variedad de sustratos celulares, siendo su papel clave en mecanismos de transducción de señales, involucrados en la activación de receptores acoplados a fosfolipasas (Chauhan et al., 1990; Khan et al., 1995; Ron y Kazanietz, 1999). Al menos once isoenzimas de PKC han sido identificadas y se han clasificado en tres grupos, atendiendo a su estructura y a los cofactores implicados en su activación (Azzi et al., 1992; Nishizuka, 1995; Kanashiro y Khalil, 1998).  PKCs clásicas (cPKCs). Es el grupo mejor conocido y corresponde al primero que fue descrito. Son dependientes de Ca2+, DAG y activadas por fosfatidil L-serina (PS); in vitro son sensibles a ésteres de forbol como por ejemplo el 12-miristoato 13-acetato o PMA (Castagna et al., 1982; Ono et al., 1989). Introducción 37  PKCs nuevas (nPKCs). Son independientes de Ca2+ (Schaap et al., 1989; Leibersperguer et al., 1991; Osada et al., 1992), pero son activadas por DAG y por PS, además de ser sensibles a PMA (Zhang et al., 1995).  PKCs atípicas (aPKCs). Son sólo dependientes de PS, insensibles a DAG, Ca2+ y PMA (Coghlan et al., 2000). 4.1.2.1 Estructura molecular de la PKC La PKC es un polipéptido simple en el que se distinguen dos dominios, un dominio regulador (región amino terminal) y un dominio catalítico (región carboxilo terminal). El dominio regulador posee secuencias aminoacídicas involucradas en la unión de cofactores: lípidos y calcio. Participa en interacciones proteína-proteína que regulan la localización y actividad de esta quinasa. El dominio catalítico posee actividad quinasa y presenta regiones involucradas en la unión de ATP y del sustrato (Azzi et al., 1992; Ron y Kazanietz, 1999) (Figura 15). El clonaje de las primeras isoenzimas, reveló la presencia de cuatro dominios conservados (C1-C4) y cinco dominios variables (V1-V5) (Coussens et al., 1986). Los dominios C1 y C2 forman parte de la región reguladora, siendo C1 rico en el residuos de cisteína (Cys), éste aparece duplicado en la mayoría de las isoenzimas (Klevit, 1991). A cada una de estas regiones están unidos dos átomos de Zn 2+. Lo que proporciona una estequiometría de cuatro Zn 2+ por molécula de PKC (Quest et al., 1992). Los dominios están plegados como si de una estructura globular se tratase, surcada por dos láminas β plegadas, a las que, in vitro, se unen el DAG y ésteres de forbol (Ono et al., 1989; Hommel et al., 1994). 38 Figura 15. Esquema de la estructura molecular de PKC. C1-C4: dominios conservados; V1-V5: dominios variables (Original tomado de Kanashiro y Khalil, 1998) 4.1.2.2 Fosforilación de la PKC En general, las PKCs son sintetizadas como proteínas catalíticamente inactivas, que se convierten en enzimas activas a través de un proceso secuencial de adición de fosfatos (Chow et al., 1998; Dutil et al., 1998; Le Good et al., 1998; BehnKrappa y Newton, 1999; Dutil y Newton, 2000), en el cual pueden estar involucrados determinados cambios conformacionales (Johnson y Barford, 1993). La conservación de residuos acídicos en las distintas isoformas, indica la importancia de la fosforilación en la regulación de esta familia de PKCs (Dutil et al., 1998). Aunque estas proteína quinasas están sujetas a procesos de autofosforilación, también pueden ser sustratos de otras quinasas e incluso de otras isoformas de PKC (Ron y Kazanietz, 1999). Zn 2+ Zn 2+ C1 C2 C2 C3 V2 V4 3 V5 COOH V1 NH2 V3 DAG/PMA + Pseudosustrato - PS + Ca 2+ + ATP + Sustrato + Introducción 39 4.1.2.3 Translocación de la PKC La PKC ha sido localizada en la fracción citosólica de las células y la activación de esta quinasa está asociada a una redistribución de la enzima desde el citosol hacia ambientes más hidrofóbicos como puede ser la membrana plasmática (Kraft y Anderson, 1983; Kanashiro y Khalil, 1998). La unión de Ca2+ y DAG a esta quinasa en presencia de fosfatidil L-serina (PS), provoca un cambio conformacional en la PKC, incrementándose de esta forma, su hidrofobicidad (Kanashiro y Khalil, 1998). La dinámica del movimiento de la quinasa a la membrana plasmática, en respuesta a la activación de receptores de superficie celular, ocurre en tres pasos: la translocación a la membrana, el anclaje y la disociación. Se sabe que estos procesos son regulados por autofosforilaciones, aunque la quinasa se fosforile en el citosol, necesita de varias fosforilaciones para alcanzar la membrana, aún en presencia de calcio. Las fosforilaciones inciden en el aumento de la afinidad por DAG y PS. Finalmente, una vez cesada la estimulación sobre el receptor de superficie, se produce la disociación de la PKC, por un descenso de los niveles de DAG y Ca2+, que inducen una autofosforilación de los dominios reguladores (Xiao et al., 2000). Se ha descrito la capacidad de la PKC para translocarse al núcleo, cuando las células son estimuladas con ésteres de forbol, como por ejemplo, forbol 12miristoato 13-acetato (PMA) (Hocevar et al., 1993; Goss et al., 1994) que es un potente promotor tumoral (Yeung y Hurta, 2001). Se puede decir que DAG y PMA, son homólogos fisiológicamente y pueden unirse al mismo sitio, concretamente al dominio C1 de la quinasa (Sharkey, 1984; Kazanietz, 2000; Brose y Rosenmund, 2002; Kazanietz, 2002); de forma que los ésteres de forbol pueden desempeñar la misma función que el DAG y activar tanto in vivo como in vitro a la PKC (Castagna et al., 1982; Sano et al., 1983; Yamanishi et al., 1983; Yeung y Hurta, 2001). Los ésteres de forbol aumentan la afinidad de la PKC por el 40 Ca2+ y a diferencia del DAG, el PMA obliga a la enzima a permanecer en la membrana plasmática, favoreciendo el desarrollo de procesos cancerígenos (Buchner et al., 1992; Kazanietz et al., 2001). 4.1.2.4 PKC en Mytilus galloprovincialis Lmk. En el caso de Mytilus galloprovincialis Lmk., ha sido identificada una proteína de 105 kDa (p105) que presenta actividad quinasa dependiente de fosfatidil Lserina y PMA e independiente de Ca2+. Se comprobó que la p105, estaba presente en manto, branquias, pie, músculo aductor posterior, hepatopráncreas y hemocitos de M. galloprovincialis. In vitro, la proteína p105 es capaz de autofosforilarse sin la presencia de cofactores lipídicos (Mercado et al., 2002a; 2002b). A su vez, los parámetros cinéticos de esta proteína, la asemejan a una isoforma nPKC de mamíferos. Mediante análisis con microscopía confocal, se detectó que p105 tenía una distribución citoplasmática homogénea y que no estaba presente en el núcleo (Figura16). Debido al conocimiento de la susceptibilidad que presentan las isoformas de PKC frente a la estimulación con ésteres de forbol, se estudió el comportamiento de la enzima (p105) en cultivos de hemocitos expuestos a un tipo de forbol, concretamente el PMA. En la figura 16, se aprecia la translocación que sufre p105 a la membrana cuando las poblaciones de hemocitos son expuestos a PMA (Mercado et al., 2003). Introducción 41 Figura 16. Distribución citosólica y translocación de p105 en poblaciones de hemocitos de Mytilus galloprovincialis (Mercado et al., 2003) 5. Apoptosis o muerte celular programada La apoptosis (Kerr et al., 1972) es un mecanismo fisiológico de muerte celular, que ha sido conservado evolutivamente desde nematodos hasta mamíferos (Vaux y Strasser, 1996). Con este proceso específico se pueden eliminar células de tejidos normales, siendo considerado un mecanismo importante para la proliferación celular, desarrollo embrionario (Arends y Wyllie, 1991; Ellis et al., 1991; Cohen et al., 1994), desarrollo nervioso (Raff et al., 1993), defensa Distribución citosólica de p105 en poblaciones de hemocitos de Mytilus galloprovincialis Translocación de p10 5 a la membrana plasm ática en poblaciones de hemocitos Mytilus galloprovincialis Exposición a éster de forbol (PMA) 42 inmunitaria (Golstein et al., 1991; Williams, 1991) y envejecimiento (Kennedy et al., 1995; Vaux y Strasser, 1996). Se cree que la supresión de la apoptosis, puede contribuir al desarrollo inicial de cáncer y de la aparición de células tumorales resistentes a la terapia citotóxica (Williams, 1991; Hale et al., 1996). 5.1 Fases de la apoptosis Algunos autores dividen la apoptosis en cuatro fases: temprana, de detección, efectora y postmorten: 1. Fase temprana: Esta fase está constituída por el estímulo que provoca una respuesta apoptótica. Este estímulo puede ser una señal externa en receptores de superficie o puede originarse en el interior de la propia célula como respuesta a la acción de toxinas, radiación o drogas. 2. Fase de detección: Esta es la fase que incluye la detección y transducción de la señal por el metabolismo. La ruta o rutas de transducción de señales activan los procesos necesarios para iniciar la muerte celular. 3. Fase efectora: La tercera fase de este mecanismo celular incluye la acción de las proteasas, y sus moduladores que las regulan positiva y negativamente. 4. Fase postmorten: En esta última fase se produce la condensación de la cromatina y la degradación del ADN. In vivo, pero no necesariamente in vitro, las células apoptóticas son reorganizadas y englobadas por células adyacentes (Ellis et al., 1991). Introducción 43 Figura 17. Modelo de apoptosis en células de mamíferos Sin embargo, otros autores reagrupan estas cuatro fases, sólo en dos. Considerando las fases principales aquellas en las que se producen cambios morfológicos extremos en la estructura celular como condensación y fragmentación de cromatina nuclear, compactación de orgánulos citoplasmáticos, dilatación del retículo endoplasmático, descenso del volumen celular y alteraciones de la membrana plasmática. Toda esta primera fase concluiría en una segunda, que consiste en la reorganización y fagocitosis de células apoptóticas, previniendo una posible respuesta inflamatoria (Arends y Wyllie, 1991; Jacobson et al., 1994; Takahashi y Earnshaw, 1996). Todas estas alteraciones nucleares están asociadas a la escisión internucleosomal del ADN, lo que ópticamente se observa como ADN en escalera. Cada uno de los fragmentos de esa escalera, están constituídos por 200-300 pb (Oberhammer et al., 1993; Cohen et al., 1994). Drogas, radiaciones, especies reactivas del oxígeno Fase I: temprana Fase III: efectora Proteasas Condensación de la cromatina Degradación del ADN Fase IV: postmorten Transducción de señales Fase II: detección 44 5.2 Regulación de la apoptosis Las condiciones que desencadenan la apoptosis son variadas y variables. El polimorfismo existente en la ruta de activación de la muerte celular programada, se puede relacionar con un control intracelular, que puede variar significativamente según sea la función y el estado celular, así como los mecanismos inductores de la apoptosis (Golstein et al., 1991). Una célula sufrirá apoptosis como resultado de la información recibida de su ambiente. La interpretación de dicha señal dependerá de ciertas variables como el tipo, desarrollo y estado de maduración celular (Williams y Smith, 1993). Desde un estímulo externo, una parte de la información decidirá entre la supervivencia y la destrucción de la célula. De forma similar, los mecanismos que controlan la apoptosis, actúan siempre a través de un sistema de transducción que está involucrado en la estimulación de receptores de superficie, activación de proteína quinasas y fosfatasas, así como en la liberación de segundos mensajeros para regular (positiva y negativamente) la transcripción de genes específicos (Hale et al., 1996). 5.2.1 Óxido nítrico El óxido nítrico puede participar en la inducción de la muerte programada en macrófagos (Mills, 1991; Dimmeler y Zeiher, 1997), células tumorales (Cui et al., 1994; Kwon et al., 2004) y timocitos (Tai et al., 1997), aunque, el NO puede prevenir la apoptosis en células B (Genaro et al., 1995). La razón, por la cual se cree que el óxido nítrico es capaz de exhibir dualidad en la regulación de la muerte programada mediante efectos pro-apoptóticos y anti-apoptóticos, se debe a su concentración. La NOS inducible es capaz de sintetizar elevadas concentraciones de óxido nítrico en respuesta a estímulos externos, de forma que este NO pueda Introducción 45 actuar en múltiples procesos inflamatorios con un efecto pro-apoptótico. En cambio, las isoformas constitutivas, sintetizan mínimas concentraciones de óxido nítrico, las cuales podrían ser insuficientes para inducir apoptosis (Dimmeler y Zeiher, 1997). En el caso de linfocitos B (Hale et al., 1996) y de hepatocitos de mamíferos (Dimmeler et al., 1997; Li et al., 1997; Saavedra et al., 1997) (Figura 18) se ha observado que al liberarse óxido nítrico, se previene el descenso de la expresión de bcl-2 en procesos apoptóticos inducidos por antígenos. Figura 18. Esquema de la regulación de la apoptosis mediante la acción del óxido nítrico en linfocitos B y en hepatocitos. Es conocida también la propiedad que posee el NO para bloquear la escisión de bcl-2 a través de la limitación de la actividad de las caspasas en algunos tipos celulares. Esta limitación de la actividad, está relacionada con la capacidad Apoptosis Antígeno NO bcl2 - bcl2 S-nitrosilación de caspasas 52 Figura 21. Transducción de señales a través de Akt inducidas por la interacción de TNF-α con TNFR1 IKB/NFκB NFκB P IKB PI(3)Kl IKKβ IKKα/ PP Akt P TNFR1 Núcleo NFκB Citosol TNF - α PKC P Objetivos 55 El cultivo de mejillón en Galicia comenzó en el año 1945 y se expandió de una manera sorprendente durante años posteriores. Sin embargo, este incremento en la producción no fue debido a un mayor conocimiento científico de la biología del animal, sino que la mayor parte de las técnicas de cultivo se elaboraron sobre bases empíricas (Barcia et al., 1992). De la misma forma, el estudio de enfermedades que puedan afectar a los moluscos, se ha visto retardado en el tiempo entre otras causas por la carencia de sistemas de cultivo de células apropiados. La investigación de los mecanismos de defensa del mejillón, cobra un importante interés debido a su prolífica distribución, a su trascendencia en la acuicultura y en su empleo como modelo en estudios de contaminación ambiental (Shelton et al., 1999). De forma que el principal objetivo de este trabajo fue el estudio de la influencia del lipopolisacárido (LPS) y algunas citoquinas (TNF-α, IL-2, PDGF y TGF-β1)en la respuesta inmune de Mytilus galloprovincialis Lmk. Para poder alcanzar dicho objetivo, fue preciso establecer varios subobjetivos: 1. Adaptación de un medio de cultivo compatible con el método empleado para la cuantificación de óxido nítrico liberado por hemocitos de Mytilus galloprovincialis. 2. Estudio de la respuesta de hemocitos de Mytilus galloprovincialis mediante: 56 2.1 La cuantificación de la producción de óxido nítrico (NO) y la expresión proteica en hemocitos incubados con LPS, TNF-α, IL-2, PDGF y TGF-β 1. 2.2 El análisis de la implicación de PKA y de PKC en las rutas de señalización relacionadas con la síntesis de NO en hemocitos. 2.3 Detección de la enzima responsable de la producción de NO. 3. Estudio de la posible variación estacional en la respuesta de los hemocitos de Mytilus galloprovincialis al ser incubados con LPS, IL-2, TNF-α, PDGF y TGF-β 1. 4. Inducción de apoptosis en hemocitos de Mytilus galloprovincialis mediante el empleo de LPS, TNF-α, IL-2, PDGF, TGF-β 1y CHX. Material y Métodos 59 1. Material biológico Se utilizaron mejillones de la especie Mytilus galloprovincialis Lmk. Los moluscos fueron recogidos en una planta depuradora localizada en la ría de Betanzos (A Coruña). 2. Reactivos Para la preparación de las disoluciones y tampones se usaron reactivos de las casas: E. Merck (Darmstad, Alemania); Sigma Chemical CO. (St. Louis, U.S.A.); Boehringer Mannheim (Mannheim, Alemania); Montplet & Esteban, Probus, Vorquímica (España). En todos los casos, fueron reactivos de grado analítico. El medio de cultivo Leibovitz L-15 sin L-glutamina se obtuvo de la firma Biochrom KG, Berlín. Las electroforesis de poliacrilamida y de agarosa se realizaron con reactivos y aparatos de la firma Bio – Rad (Richmond, USA). La membrana Immobilon-P (PVDF) empleada para transferencia de proteínas y los filtros Millex estériles 0,45 μm y Steriavac TM-GP10 0,22 μm se obtuvieron de la firma Millipore (Bedford, MA, USA). El kit ECLpara la detección por quimioluminiscencia empleados en el western-blotting fue proporcionado por Amershan International (Buckinghamshire, Inglaterra). Los marcadores de peso molecular para las electroforesis de poliacrilamida se obtuvieron de la firma GibcoBRL (Inchinna, Scotland) y Bio –Rad (Richmond, USA). El anticuerpo monoclonal de la óxido nítrico sintetasa inducible (iNOS) humana y el anticuerpo monoclonal de la óxido nítrico endotelial (eNOS) bovina, 60 así como el anticuerpo anti IgG de ratón conjugado con peroxidasa fueron de la firma Sigma Chemical CO (St. Louis, USA). Los anticuerpos anti-PKC de mejillón fueron sintetizados a partir de ratón en el laboratorio de Bioquímica y Biología Molecular de la Facultad de Veterinaria (Mercado et al., 2002a). 3. Aparatos El esterilizador de sólidos empleado fue de la casa Matachana, serie 500; para la manipulación celular y del material en condiciones estériles se utilizó una campana de flujo laminar Telstar AH-100. Los reactivos fueron pesados con un granatario eléctrico monoplato Sartorius modelo 1409 y una balanza analítica monoplato eléctrica Sartorius modelo 1601. Las centrifugaciones para el lavado de hemocitos así como para la obtención de lisados celulares se realizaron en centrífugas Centromix, Denver Instrument y BHGHermle Z229. La osmolaridad de las disoluciones se comprobó en un osmómetro de la casa Gonotec, modelo Osmomat 030; la determinación del pH se realizó con un pHmetro Crison modelo micropH2001. Las valoraciones espectrofotométricas se realizaron con un espectrofotómetro de la marca Phillips modelo PV8720 y con un lector de placas de la marca Bio – Rad, modelo 550. Los tratamientos térmicos se realizaron en un baño termostatizado Selecta Precisterm S.138. Las incubaciones a 4º C y en movimiento continuo se realizaron en un Mixing Rotor de la casa Renner Gmbtt; Agitador Rotamax 120 Heidolph. La estabilización de los cultivos de hemocitos se realizó en una estufa de la marca Selecta. Material y Métodos 61 El equipo concentrador centrífugo empleado fue de la marca Savant, modelo AS160 Automatic SpeedVac. El microscopio binocular utilizado en las observaciones celulares fue de la marca Olympus CX40 y los mircroscopios invertidos de Olympus CK2 y URA.Technic XDS, modelo 173. El material fotográfico empleado fue de la firma Kodak (Biomax MS) y Agfa (Curix R2), realizándose el revelado de las placas con un equipo automático de la firma Agfa-Gevaert, modelo Gevamatic 60. Los capturadores de imagen empleados fueron Versa Doc Imaging Sistem Modelo 2000 y Gel Doc 1000, ambos de la marca Bio – Rad. En las electroforesis de poliacrilamida y de agarosa, se emplearon fuentes de alimentación PAC 3000, mientras que para secar geles de acrilamida se utilizó un secador de geles modelo 543, todos de la marca Bio-Rad. 4. Procedimientos generales Todas las manipulaciones de las células se realizaron en condiciones estériles. La esterilización de la solución antiagregante de Alseve (ALS) (Nöel et al., 1993) se hizo por filtración a través de membranas Millipore de 0.22 m. 5. Extracción de hemolinfa y obtención de hemocitos Se limaron las valvas del mejillón de forma que se permitiese la entrada de una aguja directamente hasta el músculo aductor posterior (Figura 22). La hemolinfa fue obtenida de forma estéril y diluida 1:1 (v/v) en tampón ALS (Barcia et al., 1999). Esta operación se repitió el número de veces necesario hasta extraer el volumen máximo posible de hemolinfa. El recuento de dichas células se realizó en una cámara de Neubauer empleando Trypan Blue como colorante vital. 62 6. Cultivo de hemocitos de mejillón La hemolinfa extraída fue centrifugada durante 10 min a 450 x g, recogiéndose el precipitado para ser tratado con ALS (Nöel et al., 1993) y eliminar posibles impurezas de las muestras. Se repitió el procedimiento una ocasión más, eliminándose el sobrenadante. Posteriormente, se añadió 1 ml de medio Leibovitz L-15 suplementado por cada 5x105 hemocitos. Para lograr la estabilización de las células se mantuvieron durante 3 días a una temperaratura constante de 20ºC (Cao et al., 2003). 7. Tampones y soluciones Los tampones y las soluciones empleados para la realización de esta memoria fueron las siguientes: Figura 22. Extracción de hemolinfa en Mytilus galloprovincialis Lmk. Material y Métodos 63 7.1 Tampón Alseve (ALS) (pH 7,0; Osmolaridad 1000 mOs) (Nöel et al., 1993) Glucosa 20,8 g/l Citrato sódico 8 g/l EDTA 3,36 g/l Cloruro sódico 22,5 g/l 7.2 Inactivación del suero fetal bovino (FCS) El FCS utilizado para suplementar el medio Leibovitz-L15 fue previamente inactivado, para ello, en primer lugar el FCS se dejó 30 min a temperatura ambiente, se descongeló a 37ºC, para después llevarlo a 55ºC y se dejó a esa temperatura durante 1 hora más, para luego ser congeladas las alícuotas. 7.3 ALS suplementado (pH 7,0; Osmolaridad 1000 mOs) Al tampón Alseve (ALS), se le añadieron: Arginina 17,4 g/ml Glutamina 29,22 μg/ml Suero bovino fetal (FCS) 10% Penicilina G 100 100 unidades/ml Estreptomicina 100 μg/ml Gentamicina 40 mg/ml Anfotericina 0.1 g/ml 64 7.4 Medio de cultivo celular: Leibovitz L-15 suplementado (pH 7,0; Osmolaridad 1000 mOs) Al medio Leibovitz15 comercial sin L-glutamina, se le añadieron: 7.5 Tampón de extracción de proteínas de citosol (pH 7,4) Hepes 20 mM EDTA 5 mM PPi 20 mM NaF 30 mM Triton X-100 0,5 % NaCl 20,2 g/l KCl l 0,54 g/l CaCl2.2H2O 0,6 g/l MgSO4.7H2O 1 g/l MgCl2.6 H2O 3,9 g/l Glucosa 20,8 g/l Suero bovino fetal (FCS) 10 % Penicilina G 100 unidades/ml Estreptomicina 100 g/ml Gentamicina 40 mg/ml Anfotericina B 0.1 g/ml Glutamina 10l/ml Material y Métodos 65 7.6 Tampón de extracción de proteínas de membrana (pH 6,5) MES 20 mM EGTA 10 mM EDTA 2 mM Sacarosa 250 mM β-mercaptoetanol 10 mM Glicerol 10 % Triton X-100 10 % 8. Preparación de lisados de hemocitos Las suspensiones celulares de hemocitos obtenidos como se han descrito en el apartado 6 fueron lavadas con ALS centrifugándose durante 10 min a 450 x g a temperatura ambiente. Se recogió el precipitado y se añadieron 100 l de ALS suplementado por cada 106 células. Se incubaron los hemocitos durante un tiempo específico para cada uno de los inductores e inhibidores seleccionados. Transcurrido el tiempo de incubación a una temperatura constante de 20ºC se procedió a la centrifugación durante 10 min a 450 x g, recogiéndose los hemocitos. A éstos, se les añadieron 100 l de tampón de lisis celular y un cóctel de inhibidores de proteasas (PMSF, Benzamidina, Aprotinina, Pepstatina A). A continuación, se mantuvieron durante 30 min a temperatura ambiente con agitación constante. Transcurrido dicho tiempo, se centrifugaron las muestras durante 10 min a 12000 x g a 4ºC y se recogió el sobrenadante. Este último se mezcló con tampón de muestra en la proporción 1:4 (v/v). Las muestras tratadas con tampón de muestra se calentaron en un baño a 90ºC durante 5 min, fueron enfriadas en hielo de forma inmediata y congeladas hasta su uso. 72 Para la determinación de la producción de óxido nítrico en hemocitos se utilizó el sobrenadante obtenido después de la incubación a 20ºC de 106hemocitos con ALS suplementado y los inductores seleccionados. Del sobrenadante resultante de la centrifugación se tomaron 50 l para introducirlos en una de las celdas de la placa junto con: 10 l de Nitrato reductasa (0.2 unidades/ml) 10 l de NADPH+H+ (2 mM) Se dejaron transcurrir 20 min y se añadieron: 100 l de disolución 1 (HCl 20 mM, ácido sulfanílico 10 mM) Se dejaron transcurrir 20 seg y se añadieron: 100 l de disolución 2 [N-naftil-1-etilendiamino (NEDA) 10 mM] Figura 23. Reacción química del ensayo colorimétrico de Griess. El proceso consta de dos pasos, el primero es la conversión de nitrato a nitrito usando Nitrato Reductasa. El segundo paso consiste en la adición de sulfanilamida al nitrito en medio ácido, que reacciona con el N-1-naphtiletilendiamina (NEDA), originando un compuesto coloreado. Nitrato reductasa NO2 - NO3 - NADP + NADPH + H + NO2 - NH2 H + SO3NH3SO3NH2 N + N HN NH 2 N-1-naphtiletilendiamina Sulfanilamida N N SO2NH2 HN NH 2 Material y Métodos 73 De forma inmediata, se preparó una curva estándar de NO2Na en ALS con las siguientes concentraciones de nitrito sódico: 0, 1, 2, 5, 10, 20, 30 M (figura 24). A esta solución, se añadieron 100 l de la disolución formada por HCl y ácido sulfanílico, se dejaron transcurrir 20 seg para posteriormente añadir 100l de la disolución de NEDA. A continuación, se introdujo la placa en un lector y se cuantificó la producción de óxido nítrico a una longitud de onda de 540 nm. Figura 24. Curva estándar de NO2Na en ALS 12. Extracción y cuantificación de ácidos nucleicos. 12.1 Extracción de ADN Para la extracción de ADN se utilizaron 3x106hemocitos para cada ensayo. Las suspensiones celulares de hemocitos fueron obtenidas como se ha descrito en el apartado 6. Se recogió el precipitado y se añadieron 150 μl de 74 TBS (Tris-HCl 20 mM, NaCl 150 mM, pH 7,5), 150 μl de tampón de lisis celular (2X) (Tris-HCl 400 mM, EDTA 100 mM, SDS 1 %, pH 8,0), 10 μl de ARNsa (100 mg/ml) y 25 μl de proteinasa K (10 μg/ml). En un baño, se incubaron las muestras entre 1-3 horas a una temperatura constante de 56ºC. A continuación, se añadió 1 ml de fenol, se agitaron los tubos durante 5 min y se centrifugaron a 4ºC durante 10 min a 2800 x g. Se añadió 1 ml de cloroformo:fenol 1:1 (v/v), se agitaron los tubos y se centrifugaron a 4ºC durante 10 min a 2800 x g. Por último, se añadió 1 ml de cloroformo, los tubos se agitaron y centrifugaron a 4ºC durante 10 min a 2800 x g. Se observó una fase inferior o fase orgánica, en donde se encuentran las proteínas y una fase superior o acuosa, en la que se queda la mayor parte del ADN. Esta fase acuosa, se transfirió a un eppendorf, para añadir a continuación 30 μl de acetato amónico (3 M) y 750 μl de etanol al 95% conservado a −20ºC y se agitaron los eppendorf en varias ocasiones. Después se dejaron las muestras a −20ºC durante toda la noche para que precipitase el ADN. Al día siguiente, se centrifugaron las muestras durante 10 min a 12000 x g a 4ºC, se decantó el etanol al 95 % y se secaron al vacío durante 15 min en un concentrador centrífugo. A continuación, se añadió etanol al 70 % conservado a -20ºC , se resuspendieron las muestras de ADN, se centrifugaron las muestras durante 10 min a 12000 x g, para posteriormente decantar el etanol al 70 % y se secaron al vacío durante 15 min en un concentrador centrífugo. 12.2 Determinación de la concentración de ADN La concentración del ADN se deteminó midiendo la absorbancia en un espectrofotómetro. Las longitudes de onda (λ) empleadas fueron 280 nm, longitud de onda de absorbancia para las proteínas y 260 nm, longitud de onda Material y Métodos 75 de absorbancia para los ácidos nucleicos. La absorbancia se midió en diluciones 1:100 de las muestras de ADN en agua milli-Q®. Una absorbancia de 1 corresponde a una concentración de 50 μg/ml para ADN dicatenario. La concentración de este ácido nucleico se calculó como la absorbancia a 260 nm, multiplicándose por 50 y por el factor de dilución. El cociente entre absorbancia a 260 nm y a 280 nm, indica el grado de pureza de las muestras, siendo entre 1,5-2 la relación ideal de pureza para el ADN. 13. Electroforesis en geles de agarosa La electroforesis en geles de agarosa se realiza en cubetas de metacrilato horizontales y requiere dos elementos indispensables: la fase móvil y la fase estacionaria. La fase móvil es el medio amortiguado que permite la movilidad de las moléculas cargadas hacia los electrodos correspondientes cuando se genera un campo eléctrico. La fase estacionaria o soporte, es un polímero de naturaleza gelatinosa (agarosa) con un tamaño de poro homogéneo que se sumerge en la fase móvil. La migración de los fragmentos de ADN en un gel de agarosa sometido a un campo eléctrico depende tanto del voltaje del campo, como del tamaño de poro del gel de agarosa. La separación de los fragmentos de ADN depende tanto de la masa como de la carga de los distintos fragmentos. La localización de los fragmentos una vez finalizada la electroforesis se determina empleando bromuro de etidio (10 mg/ml), que posee grupos tricíclicos, los cuales se mezclan con las bases del ADN, concretamente cada 2,5 pb (Waring, 1965). El [DNA] µg/ml Factor de dilución x 50x absorbancia 260 nm 76 bromuro de etidio, además de ser un agente intercalante, posee la capacidad de disminuir la densidad del ADN y de emitir luz al ser expuesto a luz UV. 13.1 Composición y preparación de los geles Se preparó un gel de agarosa al 1,5 %, pesando 0,75 g de agarosa diluidos en tampón TAE (Tris 2 M, ácido acético 10 M, EDTA (pH 8,0) 0,5 M) (1X). En un horno microondas, la agarosa se fundió a 80º-90ºC durante 30 seg. A continuación, se añadieron a la disolución templada (30ºC) 2 μl de bromuro de etidio. Mientras, la disolución se enfriaba, se preparó el molde para depositar la mezcla. Normalmente, los moldes están abiertos por dos de sus extremos, de modo que se sellaron con cinta adhesiva. Una vez sellado el molde, el depósito se realizó con cuidado para evitar la formación de burbujas y principalmente, para evitar contaminaciones con el bromuro de etidio, ya que se trata de un compuesto altamente cancerígeno. Con la agarosa todavía líquida, se colocó un peine para formar los pocillos de muestra y se dejó polimerizar. Una vez polimerizado el gel, se retiraron las cintas adhesivas que sellaban los extremos del molde y se cargaron las muestras. Cada muestra fue mezclada con 2 μl de loading dye (marcador de frente), ajustándose la carga a 15 μg de ADN por pocillo. La carcasa se rellenó con tampón T.A.E. (1X) y se conectó a la fuente de alimentación. La electroforesis se realizó durante 40 min con un voltaje de 100 V a temperatura ambiente. Cuando el frente llegó aproximadamente a 10 mm del final se cortó la corriente y se extrajo el gel. El resultado se visualizó con luz U.V. Material y Métodos 77 14. Método estadístico El análisis de los datos se realizó con el programa estadístico InStat GraphPad Software, Inc, San Diego, U. S.A. En primer lugar, era preciso conocer el tipo de distribución de los datos obtenidos. Por ese motivo, se aplicó el test de Bartlett´s o test de homogeneidad de varianzas, el cual determina si los datos siguen una distribución normal o de tipo gaussiano. De esta forma, podían aparecer dos supuestos: 1. Los datos tienen una distribución gaussiana, en cuyo caso se aplica el test del análisis de la varianza (ANOVA). 2. Los datos no tienen una distribución gaussiana, en estos casos, se aplica el test no paramétrico de Kruskal-Wallis. En nuestro caso, la distribución de los datos fue siempre de tipo no gaussiano, aplicándose en todas las situaciones el test no paramétrico de Kruskal-Wallis. Resultados 81 1. Cultivo primario de hemocitos obtenidos de hemolinfa de mejillón Los hemocitos de M. galloprovincialis se obtuvieron tal como se describe en el apartado 5 de Material y Métodos. Transcurrido el tiempo de estabilización, se sustituyó el medio Leibovitz suplementado empleado para el mantenimiento de los hemocitos por ALS suplementado. La sustitución de este tampón se debe a las interferencias que provoca el indicador del medio con los reactivos del método colorimétrico de Griess (Schulz et al., 1999) utilizado para la determinación del óxido nítrico. Tiempo (horas) Viabilidad medio Leibovitz suplementado Viabilidad medio ALS suplementado 0100% 100% 24 96.5% 94.8% 48 90.15% 85.6% 72 86.10% 83.8% Tabla 2. Viabilidad de hemocitos incubados en los medios Leibovitz y ALS suplementados, durante tres días de cultivo Al igual que se había hecho con el medio Leibovitz suplementado, se comprobó la utilidad del medio sin color. Como se observa en la tabla 2, la viabilidad de células mantenidas en el medio ALS suplementado durante 72 horas, es prácticamente igual que la obtenida al emplear el medio Leibovitz L-15 suplementado. 82 2. Estudio de la producción de NO por Mytilus galloprovincialis Lmk. Una vez comprobada la utilidad del medio ALS suplementado, se procedió al estudio de la producción de óxido nítrico mediante la incubación de hemocitos con LPS, TNF-α, IL-2, PDGF y TGF-β 1. Al igual que había sucedido con anteriores trabajos realizados en el laboratorio de Bioquímica y Biología Molecular, en la síntesis de óxido nítrico, se apreció un cambio progresivo en la respuesta de los hemocitos incubados con estos inductores a lo largo del año, que si bien es muy pequeño de semana en semana, es estadísticamente significativo al comparar los picos máximos. Esta variabilidad de respuestas a lo largo del año permitió agrupar los resultados en dos períodos, invernal y estival. Podemos decir que la etapa comprendida entre septiembre-marzo se corresponde con el período denominado invernal, mientras que la etapa comprendida entre abril-agosto, se corresponde con el período denominado estival. 2.1 Producción de óxido nítrico y expresión proteica en hemocitos 2.1.1 LPS En la figura 25 se muestra la variación de la producción de NO al ser incubados los hemocitos con LPS [10 ng/ml] a distintos tiempos. Como se puede apreciar, fue a las 6 horas cuando se obtuvo una mayor producción de óxido nítrico; a tiempos de incubaciones mayores, la respuesta se reduce y se estabiliza en valores similares a los obtenidos a las 12 horas de incubación. Resultados 83 Figura 25. Variación de la producción de NO en función del tiempo de incubación de los hemocitos con LPS [10 ng/ml] En la figura 26 se muestra la variación de la producción de óxido nítrico con distintas concentraciones de LPS, empleando hemocitos obtenidos de mejillones de invierno y de verano. Se observa que en todos los ensayos realizados, los hemocitos de verano producen a todas las concentraciones de LPS, una cantidad de NO doble que la observada durante el invierno. Durante el período invernal se observa un pequeño incremento en la síntesis de NO al emplear en las incubaciones de hemocitos una concentración de 10 ng/ml de LPS. 90 Figura 32. Producción de NO por hemocitos incubados durante 24 horas con distintas concentraciones de IL-2 durante el período de invierno (■) y de verano (▲). En la figura 33 se muestran los patrones electroforéticos de células incubadas con IL-2 durante los períodos de invierno y de verano. Al igual que sucedía con los anteriores inductores, la expresión de las proteínas durante el período estival es diferente a la expresión proteica del período invernal, siendo más tenue la intensidad de las bandas durante el verano. Las diferencias entre el período invernal y el período estival se comprobaron al realizar el análisis densitométrico (Figura 33, B) de las bandas de 85 y 71 kDa. Este análisis confirma la existencia de diferencias muy significativas en la expresión de proteínas entre células de invierno y de verano. : Período invernal : Período estival Resultados 91 Figura 33. Efecto de la IL-2 [0,1 μg/ml] sobre la expresión de proteínas en hemocitos incubados durante 24 horas. A. SDS-PAGE obtenido a partir de 106 células por calle. M: marcadores peso molecular. 1: Células control durante el período de invierno; 2: Células incubadas con IL-2 durante el período de invierno; 3: Células control durante el período de verano; 4: Células incubadas con IL-2 durante el período de verano. B. Análisis densitométrico de las bandas de proteínas de 85 y 71 kDa. *** p< 0,001 valor muy significativo vs células control de invierno, n=15 A. 185 121 86 69 52 40 M 1 2 3 4 85 kDa 71 kDa B . 0 0,05 0,1 0,15 0,2 0,25 0,3 0,35 0,4 0,45 1 2 3 4 D.O. 85 kDa 71 kDa * * * * * * * * * * * * 92 2.1.4 PDGF A diferencia de los anteriores inductores (LPS, TNF-α y IL-2), la respuesta de los hemocitos incubados con PDGF se traduce en una serie de picos de producción de NO (Figura 34); se aprecia que a los 15 minutos de incubación se obtiene un leve incremento en la síntesis de NO. Figura 34. Variación de la producción de NO en función del tiempo de incubación de los hemocitos con PDGF [5 ng/ml] En la figura 35, se puede percibir que durante el invierno, la producción de NO es menor que la observada durante el verano, aunque en este último período, destaca un descenso brusco en la liberación de NO al utilizar concentraciones elevadas de PDGF. Cabe destacar que en el invierno se obtiene una mayor liberación de óxido nítrico con una concentración de 5 ng/ml, mientras que la producción de NO durante el verano, alcanza un máximo con la mitad de dicha concentración. Resultados 93 Figura 35. Variación de la producción de NO por hemocitos incubados durante 15 minutos con distintas concentraciones de PDGF durante el período de invierno (■) y de verano (▲). En la figura 36 se muestran los patrones elctroforéticos de hemocitos incubados con PDGF y la variabilidad de respuestas observada en la figura 35 en relación a la síntesis de NO durante ambos períodos del año, no se ve reflejada en la expresión proteica, resultando en esta ocasión la intensidad de las bandas similar en todos los casos. El análisis densitométrico (Figura 36, B) de tres de esas bandas (108, 85 y 71 kDa) revela que en relación a células control de invierno no existen diferencias significativas entre células control y células incubadas con PDGF ni tampoco entre células incubadas en presencia de PDGF en los períodos de invierno y de verano. : Período invernal : Período estival 94 Figura 36. Efecto del PDGF [5 ng /ml] sobre la expresión de proteínas en hemocitos incubados durante 15 minutos. A. SDS-PAGE obtenido a partir de 106 células por calle. M: marcadores peso molecular. 1: Células control durante el período de invierno; 2: Células incubadas con PDGF durante el período de invierno; 3: Células control durante el período de verano; 4: Células incubadas con PDGF durante el período de verano. B. Análisis densitométrico de las bandas de proteínas de 108, 85 y 71 kDa, n=15 M 1 2 3 4 185 121 86 69 52 40 85 kDa 71 kDa 108 kDa A. 0 0,05 0,1 0,15 0,2 0,25 0,3 0,35 0,4 0,45 1 2 3 4 D.O. 108 kDa 85 kDa 71 kDa B . Resultados 95 2.1.5 TGF- 1 En la figura 37 se muestra la variación de la producción de óxido nítrico al ser los hemocitos incubados con TGF- 1a distintos tiempos. Como se puede apreciar es a las 3 horas de incubación cuando se obtiene una incremento en la síntesis de NO. Figura 37. Variación de la producción de NO en función del tiempo de incubación de los hemocitos con TGF- 1 [0,1 ng/ml] La figura 38 muestra los resultados obtenidos al incubar los hemocitos con diferentes concentraciones de TGF- 1durante el invierno y el verano. Durante el período invernal se observa un aumento en la liberación de NO al ser incubados los hemocitos con TGF- 1 [0,1 ng/ml]. Sin embargo, durante el período estival, no se aprecia ningún pico en la síntesis de NO y al igual que sucedía en las incubaciones realizadas con los demás inductores, esta síntesis no se altera al emplear diferentes concentraciones de TGF- 1. 96 Figura 38. Variación de la producción de NO por hemocitos incubados durante 3 horas con distintas concentraciones de TGF-β 1 durante el período de invierno (■) y de verano (▲). Al igual que había sucedido con el PDGF, de forma intuitiva, el patrón electroforético de hemocitos incubados con TGF-β 1 no revela diferencias entre los casos estudiados (Figura 39, A). Mediante el análisis densitométrico de tres bandas de 108, 85 y 71 kDa (Figura 39, B), se comprueba que no existen cambios significativos entre células control y células incubadas en presencia de TGF-β 1tanto en invierno como en verano y tampoco se observan diferencias muy significativas entre ambos períodos. : Período invernal : Período estival Resultados 97 Figura 39. Efecto del TGF-β 1 [0,1 μg/ml] sobre la expresión de proteínas en hemocitos incubados durante 3 horas. A. SDS-PAGE obtenido a partir de 106 células por calle. M: marcadores peso molecular. 1: Células control durante el período de invierno; 2: Células incubadas con TGF-β 1durante el período de invierno; 3: Células control durante el período de verano; 4: Células incubadas con TGF-β 1durante el período de verano. B. Análisis densitométrico de las bandas de proteínas de 108, 85 y 71 kDa, n=15 0 0,05 0,1 0,15 0,2 0,25 0,3 0,35 0,4 1 2 3 4 D.O. 108 kDa 85 kDa 71 kDa B . A. M 1 2 3 4 185 121 86 69 52 40 85 kDa 71 kDa 108 kDa 98 3. Rutas de señalización implicadas en la producción de óxido nítrico 3.1 Implicación de la PKA en la producción de óxido nítrico En la tabla 3 se reflejan los resultados de la cuantificación de la síntesis de NO al ser incubados los hemocitos con IL-2 [0,1 g/ml] y un inhibidor de la PKA (H89) (Chijiwa et al., 1990; Wieprecht et al., 1994). Tabla 3. Producción de óxido nítrico al incubar los hemocitos con IL-2 [0,1 g/ml] y H89 [100 nM] durante 24 horas. Se representa la media ± desviación estándar de los resultados obtenidos. ••• p<0,001 valor muy significativo vs células control; ***p<0,001 valor muy significativo vs células incubadas con IL-2, n=10 En la tabla 3 puede apreciarse que durante el período invernal, la síntesis de óxido nítrico por hemocitos estimulados con IL-2 sufre un incremento notable en relación a la liberada por células control. Sin embargo, el empleo de un inhibidor de la PKA, el H89, provoca un descenso muy significativo en la síntesis de óxido nítrico. A su vez, durante el período estival, se observa que los hemocitos incubados con IL-2 liberan mayor cantidad de óxido nítrico que las células control. Al igual que sucedía durante el invierno, en las incubaciones realizadas con H89 se aprecia una disminución muy significativa de la producción de NO en relación a células incubadas con IL-2. Incubaciones Invierno Verano Control 4,69 ± 0,03 13,83 ± 0,75 IL-2 128,57 ± 6,5••• 38,94 ± 0,08••• IL-2+H89 12,46 ± 0,16*** 6,92 ± 0,3*** Resultados 99 3.2 Implicación de la PKC en la producción de óxido nítrico La tabla 4 refleja la producción de óxido nítrico al ser incubados los hemocitos con IL-2 [0,1 g/ml] y un inhibidor de la actividad de la PKC [bisindolilmaleimida (BSM)] (Gekeler et al., 1996; Ku et al., 1997). Tabla 4. Producción de óxido nítrico al incubar los hemocitos con IL-2 [0,1 g/ml] y BSM [25 nM] durante 24 horas. Se representa la media ± desviación estándar de los resultados obtenidos. ••• p<0,001 valor muy significativo vs células control; ***p<0,001 valor muy significativo vs células incubadas con IL-2, n=10 Como puede apreciarse, durante el período invernal, la síntesis de óxido nítrico por hemocitos estimulados con IL-2 se incrementa de forma muy significativa en relación a la producida por células control. La incubación de hemocitos con un inhibidor de la PKC, provoca una disminución de la producción de NO que resulta ser estadísticamente muy significativa. Por el contrario, durante el período estival, se observa que los hemocitos incubados con IL-2 liberan mayor cantidad de óxido nítrico que las células control; mientras que el empleo del inhibidor de la PKC provoca un incremento ligero de la síntesis de óxido nítrico en relación a la producción de NO inducida por hemocitos incubados con IL-2. En la figura 40 se muestran los resultados obtenidos mediante inmunodetección con anti-p105. Como puede observarse en la el caso de extracto Incubaciones Invierno Verano Control 4,69 ± 0,03 14,83 ± 0,75 IL-2 128,57 ± 6,5••• 38,94 ± 0,08••• IL-2+BSM 106,59 ± 1,06*** 58,15 ± 0,28*** 106 los otros inductores (LPS, TNF-α, PDGF y TGF-β 1) en combinación con la IL-2 se observan diferencias muy significativas en relación a los hemocitos incubados solamente con IL-2. Al realizar inmunodetección con anti-eNOS en extracto de membrana de hemocitos incubados en las condiciones anteriormente citadas, no se detectó ninguna banda. 5. Presencia de p105 en hemocitos de M. galloprovincialis Se estudió la presencia en citosol y en membrana de p105 (Mercado et al., 2002a; 2002b; 2003), en hemocitos incubados con distintos inductores durante los períodos de invierno y de verano. Figura 44. Inmunodetección con anti-p105 en hemocitos incubados con distintos inductores durante el período invernal. A: Extracto citosólico. B: Extracto de membrana. 1: Células control; 2: Células incubadas con LPS [10 ng/ml]; 3: Células incubadas con TNF-α [10 ng/ml]; 4: Células incubadas con IL-2 [0,1 g/ml]; 5: Células incubadas con PDGF [5 ng/ml]; 6: Células incubadas con TGF-β 1 [0,1 ng/ml]. En el período invernal y en el caso del citosol (Figura 44, A), la inmunodetección realizada con un anticuerpo anti-p105 reveló la presencia de dos bandas de 105 y 108 kDa. Como puede apreciarse, las bandas detectadas aparecen 105 kDa 108 kDa 123456 A. 123456 105 kDa 108 kDa B. Resultados 107 con la misma intensidad en todos los ensayos realizados. Sin embargo, en el caso de membrana (Figura 44, B), se observa la permanencia de doble banda en células control, en las incubadas con PDGF y TGF -β 1, aunque en estos últimos la banda de 108 kDa es muy tenue. En el caso de las incubaciones realizadas con TNF-α e IL-2, se aprecia claramente la desaparición de las bandas de 105 y 108 kDa; mientras que en las incubaciones realizadas con LPS, se detecta una única banda de 105 kDa. Figura 45. Inmunodetección con anti-p105 en hemocitos incubados con distintos inductores durante el período estival. A. Extracto citosólico. B. Extracto de membrana. 1: Células control; 2: Células incubadas con LPS [10 ng/ml]; 3: Células incubadas con TNF-α [10 ng/ml]; 4: Células incubadas con IL-2 [0,1 g/ml]; 5: Células incubadas con PDGF [5 ng/ml]; 6: Células incubadas con TGF-β 1 [0,1 ng/ml]. La figura 45 muestra los resultados obtenidos durante el período estival. Como puede apreciarse en citosol (Figura 45, A), se detecta una doble banda, correspondiente a 105 y 108 kDa en todos los ensayos estudiados. En el caso de extracto de membrana (Figura 45, B) sólo se detecta una doble banda correspondiente a 105 y 108 kDa en los hemocitos control, mientras que en los hemocitos incubados con los inductores, se aprecia la desaparición de ambas bandas. 1 2 3 4 5 6 105 kDa 108 kDa A. 1 2 3 4 5 6 105 kDa 108 kDa B. 108 En esta ocasión, al igual que se había realizado en las inmunodetecciones con anti-eNOS, se tomaron como modelo las incubaciones realizadas con IL-2, así como las correspondientes combinaciones de esta citoquina con los demás inductores. En la figura 46 se muestran los resultados obtenidos durante el período de invierno. En el caso del citosol (Figura 46, A), se detecta una doble banda, correspondiente a 105 y 108 kDa. Sin embargo en membrana (Figura 46, B) se detecta únicamente una doble banda en células control. Figura 46. Inmunodetección con anti-p105 en hemocitos incubados con distintos inductores durante el período invernal. A. Extracto citosólico. B. Extracto de membrana. 1: Células control; 2: Células incubadas con IL-2 [0,1 g/ml]; 3: Células incubadas con IL-2 [0,1 g/ml] y LPS [10 ng/ml]; 4: Células incubadas con IL-2 [0,1 g/ml] y TNF-α [10 ng/ml]; 5: Células incubadas con IL-2 [0,1 g/ml] y PDGF [5 ng/ml]; 6: Células incubadas con IL-2 [0,1 g/ml] y TGF-β 1[0,1 ng/ml]. Posteriormente, se realizaron los ensayos con la IL-2 y las combinaciones con inductores durante el período estival. Tanto en citosol (Figura 47, A) como en membrana (Figura 47, B), se observaron los mismos resultados que se habían obtenido durante el período invernal. A. 1 2 3 4 5 6 105 kDa 108 kDa 105 kDa 108 kDa 1 2 3 4 5 6 B. Resultados 109 Figura 47. Inmunodetección con anti-p105 en hemocitos incubados con distintos inductores durante el período estival. A. Extracto citosólico. B. Extracto de membrana. 1: Células control; 2: Células incubadas con IL-2 [0,1 g/ml]; 3: Células incubadas con IL-2 [0,1 g/ml] y LPS [10 ng/ml]; 4: Células incubadas con IL-2 [0,1 g/ml] y TNF-α [10 ng/ml]; 5: Células incubadas con IL-2 [0,1 g/ml] y PDGF [5 ng/ml]; 6: Células incubadas con IL-2 [0,1 g/ml] y TGF-β 1[0,1 ng/ml]. 6. Comportamiento de hemocitos de mejillón durante los años 20032004 Durante los años 2003 y 2004, el comportamiento de los hemocitos fue diferente al observado en los años anteriores (2001 y 2002), ya que aunque se conservaron las condiciones para el tiempo de incubación y la concentración del inductor empleado, no se apreció liberación de óxido nítrico por hemocitos de Mytilus galloprovincialis. En la figura 48 se muestra el patrón electroforético de proteínas citosólicas de hemocitos incubados con LPS, TNF-α, IL-2, PDGF y TGF-β 1 durante el período invernal. 105 kDa 108 kDa 1 2 3 4 5 6 A. 105 kDa 108 kDa 1 2 3 4 5 6 B. 110 Figura 48. Estudio de la expresión de proteínas de citosol de hemocitos incubados durante el período invernal. A. SDS-PAGE obtenido a partir de 106 células por calle. M: marcadores peso molecular. 1: Células control; 2: Células incubadas con LPS [10 ng/ml]; 3: Células incubadas con TNF-α [10 ng/ml]; 4: Células incubadas con IL-2 [0,1 g/ml]; 5: Células incubadas con PDGF [5 ng/ml]; 6: Células incubadas con TGF-β 1 [0,1 ng/ml]. B. Análisis densitométrico de las bandas de proteínas de 73, 52 y 42 kDa. ***p<0,001 valor muy significativo vs células control de invierno, n=15 De forma intuitiva, parece que los patrones proteicos son similares, aunque cabe destacar que algunas bandas (73, 52 y 42 kDa), presentan 190 125 86 82 40 M 1 2 345 6 52 kDa 42 kDa 73 kDa A. B. 0 0,05 0,1 0,15 0,2 0,25 0,3 0,35 0,4 0,45 1 2 3 4 5 6 D.O. 73 kDa 52 kDa 42 kDa * * * * * * * * * * * * * * * * * * * * * * * * Resultados 111 diferencias en la intensidad dependiendo del inductor utilizado en las incubaciones. Para comprobar la existencia de estas diferencias, se procedió al análisis de cada banda, resultando un densitograma (Figura 48, B) que revela que en relación a células control: la banda que se corresponde con 73 kDa, presenta diferencias muy significativas al emplear en las incubaciones IL-2 y PDGF. la banda que se corresponde con 52 kDa, presenta diferencias muy significativas en las incubaciones realizadas con TNF-α, IL-2, PDGF y TGFβ 1. la banda de 42 kDa, presenta diferencias muy significativas al incubar los hemocitos en presencia de IL-2. En la figura 49 se observa la expresión de proteínas de membrana de hemocitos incubados durante el período invernal con los inductores citados anteriormente. A simple vista resulta llamativa la presencia de una única banda de 52 kDa, observándose diferencias en la expresión proteica de hemocitos incubados en presencia de los distintos inductores (LPS, TNF-α, IL-2, PDGF y TGF-β 1) y destacando la baja intensidad de la banda obtenida mediante las incubaciones realizadas con IL-2. El análisis densitométrico (Figura 49, B) de los perfiles proteicos, revela que en relación a células control existen diferencias muy significativas de la banda de 52 kDa en todos los casos, excepto en las incubaciones realizadas con TNFα. 112 Figura 49. Estudio de la expresión de proteínas de membrana de hemocitos incubados durante el período invernal. A. SDS-PAGE obtenido a partir de 106 células. M: marcadores peso molecular. 1: Células control; 2: Células incubadas con LPS [10 ng/ml]; 3: Células incubadas con TNF-α [10 ng/ml]; 4: Células incubadas con IL-2 [0,1 g/ml]; 5: Células incubadas con PDGF [5 ng/ml]; 6: Células incubadas con TGF-β 1 [0,1 ng/ml]. B. Análisis densitométrico de la banda de proteína de 52 kDa.n=15. ***p<0,001 valor muy significativo vs células control de invierno, n=15 52 kDa 190 125 86 82 M 123 4 5 6 A. * * * * * * * * * * * * 0 0,05 0,1 0,15 0,2 0,25 0,3 0,35 0,4 1 2 3 4 5 6 7 D.O. 52 kDa B. Resultados 113 En el caso de los patrones electroforéticos tanto de citosol como de membrana obtenidos al incubar los hemocitos con los inductores durante el período estival, los resultados fueron similares a los observados durante el período invernal. Los resultados obtenidos durante estos dos años, 2003 y 2004, al realizar inmunodetecciones con anticuerpos monoclonales anti-iNOS humana y con antieNOS bovina, contrastan con los resultados expuestos en el apartado 4 de Resultados, puesto que ni en citosol ni en membrana se detectaron iNOS y eNOS para ninguno de los inductores estudiados. 7. Estudio de las poblaciones de hemocitos de M. galloprovincialis Como se ha mencionado en el apartado anterior, se observaron años de producción de óxido nítrico y otros años en los que no se detectaba producción de óxido nítrico. En un principio, se creyó que esta variabilidad en la producción de NO podría deberse a cambios en el número de células totales por kg de mejillón en años consecutivos (2001-2004). La tabla 5 refleja el recuento de células totales por kg de mejillón durante los períodos de invierno y de verano en años consecutivos, tomando como células control las del año 2001. En primer lugar, se compararon los valores de células totales por kg de mejillón durante los años del trabajo experimental. Tal como se observa en la tabla, en relación a células totales del año 2001 sólo resulta muy significativa la diferencia de células totales durante el año 2002 en el período invernal. Sin embargo, durante el período estival, se aprecia que las diferencias resultan muy significativas en el recuento de células totales de los años 2002 y 2003. En el resto de los casos, no se observan cambios significativos. 114 En segundo lugar, se compararon los resultados obtenidos durante el período invernal y estival. En esta ocasión y tomando como referencia los datos conseguidos durante el invierno, resulta que el número de células totales durante los años 2001, 2002 y 2004 presentan diferencias muy significativas en relación al recuento obtenido en invierno. Tabla 5. Recuento en millones de células totales por kg de mejillón durante el período invernal y estival en años consecutivos. Se representa la media ± desviación estándar. ***p<0,001 valor muy significativo vs células totales del años 2001; ••• p<0,001 valor muy significativo vs células de invierno, n=150 En la tabla 6, se muestra la proporción de los dos tipos celulares hallados en hemolinfa de M. galloprovincialis, células RH y células SH (Barcia et al., 1999; Cao et al., 2003) durante los períodos invernal y estival en años consecutivos. Se aprecia que durante los dos períodos, la proporción de células SH siempre supera a la de células RH, salvo en el período estival del año 2001. Año Invierno Verano 2001 11,57 ± 0,02 15,25 ± 0,03••• 2002 16,4 ± 0,07*** 19,18 ± 0,05***/••• 2003 11,56 ± 0,1 12,08 ± 0,08*** 2004 10,6 ± 0,04 15,27 ± 0,01••• Resultados 115 Tabla 6. Porcentaje de poblaciones celulares de hemolinfa de M. galloprovincialis durante el período invernal y estival en años consecutivos. Se representa la media ± desviación estándar. *** p <0,001 valor muy significativo vs poblaciones celulares del año 2001, n=150 8. Inducción de apoptosis De todos los inductores estudiados (LPS, TNFα, IL-2, PDGF, TGFβ 1) y un inhibidor de la síntesis proteica [cicloheximida (CHX)] empleados en las incubaciones de hemocitos de mejillón, sólo se aprecia apoptosis con CHX, TNF-α y TGF-β 1. Cabe destacar que la inducción de apoptosis ocurre exclusivamente durante los años 2003 y 2004, período en el cual se comprobó que los hemocitos eran incapaces de sintetizar NO. A continuación, se muestran los tiempos de incubación y las concentraciones utilizadas de los distintos inductores de la apoptosis: Año Invierno Verano 2001 SH 54 ± 0,02 RH 46 ± 0,05 SH 29 ± 0,07 RH 71 ± 0,09 2002 SH 61 ± 0,08*** RH 39 ± 0,04 SH53 ± 0,05*** RH 47 ± 0,03 2003 SH 73 ± 0,06*** RH 27 ± 0,01 SH 64 ± 0,02*** RH 36 ± 0,06 2004 SH 84 ± 0,03*** RH 16 ± 0,01 SH 68 ± 0,07*** RH 32 ± 0,04 124 aprecia un fuerte descenso en la liberación de NO al emplear una concentración de 10 ng/ml. Podemos decir que a la vista de los resultados obtenidos al realizar incubaciones con los inductores estudiados a distintas concentraciones durante el período estival, parece que la síntesis de NO está influenciada por otros factores como la variación estacional, la cual provoca una variabilidad significativa en la respuesta de los hemocitos. Estas afirmaciones se demuestran mediante el estudio de la expresión proteica de hemocitos incubados con los inductores (LPS, TNF-α, IL-2, PDGF y TGFβ 1), que refleja una diversidad en los patrones electroforéticos debida no tanto a la acción del inductor, sino más bien debido a la variación estacional (Resultados, figuras 27, 30, 33, 36 y 39). La variación estacional es un concepto sugerido por diversos autores que está íntimamente relacionado con la fisiología del animal, apreciándose cambios en el contenido lipídico (Cancio et al., 1999; Beliaeff et al., 2002) y sobre la movilización de los hidratos de carbono (Zandee et al., 1980; Gabbott, 1983; Robledo et al., 1995). Según Ibarguren et al. (2000), el metabolismo de los hidratos de carbono de M. galloprovincialis, muestra dos fases separadas estacionalmente. La disponibilidad de alimento durante el verano, provoca acumulación de hidratos de carbono en el manto, concretamente glucógeno. En invierno, se acelera la glucolisis para poder obtener ácidos grasos, concretamente triglicéridos, los cuales aportan a los gametos más energía que los carbohidratos (Ibarguren et al., 1990; Crespo y Espinosa, 1990; Alonso et al., 2001). En los años 60, Feng (1965) sugirió que la variación en el número de hemocitos de Crassostrea virginea era dependiente de la temperatura y de la cantidad de alimento disponible. A finales de los años 80, Fisher y Newell, indicaron la posibilidad de que el desarrollo de los gametos pudiese ser responsable de las variaciones en las proteínas de la hemolinfa a lo largo del año. En la década de los 90, se confirmó la dependencia de estos organismos de la Discusión 125 variabilidad de factores como la temperatura, salinidad y nutrientes de las rías (Santarém et al., 1992; 1994). En Mytilus galloprovincialis se estudió tanto el número de células totales por kg de mejillón como la proporción de los dos tipos celulares detectados en mejillón. El recuento de células totales por kg de mejillón a lo largo de los cuatro años estudiados (Resultados, tabla 5) revela que el número total de células es mayor durante el verano que en invierno. Cabe destacar que tanto en invierno como en verano, el mayor recuento de células totales por kg de mejillón se aprecia durante el año 2002. Por otra parte, el análisis de la proporción de los dos tipos celulares detectados en mejillón, revela durante el invierno una mayor presencia de células SH que de células RH (Resultados, tabla 6). Estos datos coinciden con los resultados obtenidos en otros moluscos bivalvos, en los que se aprecia que son los granulocitos las células más numerosas (Canesi et al., 2002; Soares da Silva et al., 2002). Durante el período estival, la proporción de células SH también supera a la de células RH, salvo en el caso del año 2001 (Resultados, tabla 6). En nuestro caso, se aprecia que durante el verano la proporción de células SH supera la de RH, siendo esta proporción de SH menor que la observada durante el invierno y, es en verano cuando se incrementa la morbilidad y mortalidad de los mejillones. La existencia de trabajos en los que se hace referencia a una posible degranulación en hemocitos de crustáceos como respuesta a infecciones de origen bacteriano (Lorenz et al., 1999; 2001) hace pensar que en hemocitos de M. galloprovinicalis pueda suceder algo similar. Se sabe también que durante el verano, los mejillones son más susceptibles de sufrir infecciones, debido al aumento de la temperatura, lo que parece influir en la permeabilidad de la membrana plasmática (Hernroth, 2002; 2003). 126 En trabajos desarrollados anteriormente en nuestro laboratorio, se identificaron dos proteína quinasas implicadas en multitud de rutas de señalización en eucariotas, PKA y PKC. La PKA se caracterizó a partir de dos tejidos de mejillón, el manto y el músculo aductor posterior (PAM), identificándose dos subunidades reguladoras (Rmyt1 y Rmyt2) homólogas a las subunidades reguladoras RI y RII de mamíferos (Díaz-Enrich et al., 2003; Bardales et al., 2004). Mientras que en manto, pie, branquias, músculo aductor posterior, hepatopráncreas y hemocitos de mejillón se identificó una proteína de 105 kDa (p105) semejante a una isoforma de nPKC de mamíferos (Mercado et al., 2002a; 2002b). El hecho de conocer la existencia de la PKA y de la PKC en Mytilus galloprovincialis Lmk., facilitó el estudio de la implicación de estas quinasas en la producción de óxido nítrico. Para el estudio de las posibles rutas de transducción de señales implicadas en la síntesis de NO, se tomó como referencia el mejor inductor de la síntesis de óxido nítrico por hemocitos de mejillón, la IL-2. Durante el invierno (Resultados, tabla 3), se observa que los hemocitos producen una elevada concentración de NO al ser incubadas las células con IL-2, pero esta producción se bloquea al emplear en las incubaciones un inhibidor de la PKA. Durante el verano, aunque la producción es menor que la observada durante el invierno, la incubación de hemocitos con un inhibidor de la PKA, supone un descenso en la síntesis de óxido nítrico, aunque no tan brusco como en invierno. Estos resultados, obtenidos durante el período invernal y estival, permiten relacionar a la PKA con la producción de NO. El empleo de un inhibidor de la PKC (Resultados, tabla 4) provoca efectos diferentes a los observados en las incubaciones realizadas con un inhibidor de la PKA. Así, aunque durante el invierno se aprecia un descenso en la producción de NO al emplear un inhibidor de la PKC, resulta llamativo el hecho de que en verano aún incubando las células con este inhibidor, se produzca un incremento en Discusión 127 la síntesis de óxido nítrico. Estos resultados son contrarios a los obtenidos en líneas celulares de macrófagos de ratón, en los que la inhibición de la PKC induce a un descenso en la producción de óxido nítrico (Chio et al., 2004). Estos datos sugieren que en la producción de NO por hemocitos de Mytilus galloprovincialis, la PKC podría estar implicada en al menos dos rutas. Una relacionada directamente con la síntesis de óxido nítrico, dado que durante el invierno, se observa una disminución de la síntesis de óxido nítrico al inhibir la PKC. Y otra en la PKC podría regular la PKA, tal como sucede en células musculares de vertebrados (Graves et al., 1996), puesto que durante el verano se incrementa la producción de NO, aunque esté inhibida la PKC. A su vez, inmunodetecciones realizadas con anti-p105 (Resultados, figura 40) revelan la presencia en citosol de una doble banda (105 y 108 kDa) para todos los casos estudiados, mientras que en membrana sólo se aprecia translocación de la enzima en células control. Estos datos confirmarían que la bisindolilmaleimida es un inhibidor de la actividad, pero no de la expresión de esta quinasa, dado que en citosol se observa una doble banda tanto en hemocitos incubados con el inhibidor como con la IL-2. El estudio de la expresión de p105 revela que durante el período invernal (Resultados, figura 44), LPS, TNF-α, IL-2, PDGF y TGF-β 1 no provocan cambios en la presencia de la enzima en la fracción citosólica, mientras que en membrana, no todos los inductores provocan la misma respuesta. Así, en hemocitos incubados IL - 2 ? PKA NO PKC NO ? 128 con IL-2 y TNF-α se aprecia una downregulation de la enzima. La respuesta obtenida con IL-2 concuerda con lo observado por Lu y Durkin (1997, 1999) en células T, los cuales afirman que la estimulación con este inductor no conduce a la translocación de la enzima a la membrana. Las incubaciones de hemocitos realizadas con LPS revelan la presencia de una sola banda (105 kDa), siendo esta banda la que se corresponde con la proteína fosforilada (Mercado et al., 2002a; 2002b). Estos datos coinciden con los estudios realizados en macrófagos humanos, en donde se ha visto que el LPS induce la fosforilación de proteínas con residuos de serina/treonina, (Wright et al., 1990; Weinstein et al., 1991; Ulevitch y Tobias, 1995) y en el caso de mejillón p105 también es fosforilada en residuos de serina, pero no de tirosina (Mercado et al., 2002a). Estos resultados se oponen a los obtenidos por Cao et al. (2004b), en los que en hemocitos incubados con LPS, éste provoca el bloqueo de la translocación de la p105 a la membrana. Es posible que estas diferencias observadas en el mismo tipo celular sean debidas a los distintos tiempos y concentraciones empleados. Durante el período estival (Resultados, figura 45) en la fracción citosólica no se aprecian cambios en la presencia de p105 al utilizar distintos inductores. Sin embargo, todos los inductores en este período, bloquean la translocación de la enzima a la membrana. Estos resultados coinciden con los observados al realizar incubaciones con IL-2 y las combinaciones de esta citoquina con los otros inductores estudiados (LPS, TNF-α, PDGF y TGF-β 1), en los que independientemente del período estudiado, se observa la misma respuesta que al utilizar cada uno de los inductores por separado (Resultados, figuras 46 y 47). Estos resultados parecen indicar que en hemocitos de mejillón, no se aprecia el efecto sinérgico característico de las citoquinas. Las óxido nítrico sintetasas son las enzimas responsables de la síntesis de óxido nítrico en mamíferos (Stuehr, 1997; Palmer et al., 1988). El empleo de un Discusión 129 anticuerpo monoclonal anti-iNOS humana en hemocitos de mejillón durante el período invernal (Resultados, figura 41), revela la presencia de tres bandas de 55, 99 y 130 kDa, siendo ésta última de tamaño similar al de iNOS de otras especies (Xie et al., 1996). El empleo de LPS, IL-2 y PDGF no provocó cambios en la expresión de la banda de 130 kDa. Resulta interesante que a pesar de ser la IL-2 el mejor inductor de la síntesis de NO en hemocitos de Mytilus galloprovincialis, no provoque cambios en la expresión de la isoforma inducible, oponiéndose a los estudios realizados por Ottaviani et al. (2004), en los que se afirma que la IL-2 induce la activación de la óxido nítrico sintetasa inducible. Sin embargo, durante el período estival (Resultados, figura 42) se observan cambios en la expresión de la banda de 130 kDa al realizar incubaciones de hemocitos con todos los inductores, excepto con el PDGF. Aunque en este período, sí se aprecian cambios en la expresión de iNOS al emplear IL-2 en las incubaciones, los hemocitos no responden sintetizando mayor cantidad de óxido nítrico. Atendiendo a los resultados obtenidos durante el invierno y el verano, se puede afirmar que al incubar los hemocitos con distintos inductores, la producción de óxido nítrico aparentemente no es dependiente de los cambios en la expresión de la isoforma inducible. En las inmunodetecciones realizadas con un anticuerpo monoclonal antieNOS bovina, durante el invierno (Resultados, figura 43), en citosol se detectó una única banda de 131 kDa, tamaño similar al de eNOS de otros organismos (Busse y Fleming, 1995). En todos los casos, se apreciaron cambios en la expresión de eNOS, aunque resulta llamativo el incremento de la intensidad de la banda de 131 kDa al ser los hemocitos incubados con IL-2 junto con LPS, PDGF o TGF-β 1. Estos resultados son similares a los obtenidos con iNOS, dado que, aunque se aprecian cambios en la expresión de las enzimas, estos cambios no se corresponden con una mayor producción de NO. 130 En nuestro caso la isoforma endotelial sólo se detecta en el citosol en hemocitos capaces de liberar NO (Resultados, figura 43), comprobando la desaparición de eNOS en citosol en hemocitos incapaces de sintetizar NO. Al igual que sucede en otras especies, la eNOS de mejillón en respuesta a determinados estímulos se detecta solamente en citosol, apoyándose este resultado en afirmaciones de varios autores que sostienen que esta isoforma constitutiva puede ser activada en respuesta a estímulos causados por estrés, citoquinas y determinadas hormonas e inducir de esta forma en distintos tipos celulares la síntesis de óxido nítrico (Kopec y Carroll, 2000; Fleming y Busse, 2003; Connelly et al., 2005). La existencia de estudios realizados en distintos tipos celulares confirman que en respuesta a una estimulación, se produce la depalmitoilación de la eNOS, la cual se disocia de la membrana y puede translocarse al citosol (Robinson et al., 1995; Kauser y Rubanyi, 1997; Papapetropoulos et al., 1997; Prabhakar et al., 1998; Davis et al., 2001), aunque la translocación de esta enzima ha sido motivo de controversia en los últimos años (Sowa et al., 1999). En hemocitos de M. galloprovincialis, creemos que al igual que sucede en ratones, la isoforma endotelial desempeña una función pro-inflamatoria en respuesta a distintos estímulos. Mediante estudios realizados in vivo durante procesos de septicemia, el NO sintetizado constitutivamente por la eNOS de ratón actúa regulando la expresión y la activación de iNOS, la cual puede sintetizar mayores concentraciones de óxido nítrico (Connelly et al., 2005). Durante los años 2003 y 2004, curiosamente años posteriores a uno de los mayores desastres ecológicos ocurridos en las costas gallegas, se aprecian cambios en el comportamiento de los hemocitos en relación al observado durante los dos años anteriores, en los que se detectó producción de óxido nítrico. Diversos estudios realizados con M. galloprovincialis, han confirmado que la existencia de determinados aceites y/o hidrocarburos en agua de mar provocan cambios en la Discusión 131 expresión de determinadas proteínas en esta especie (Middaugh et al., 1996, 1998; Shelton et al., 1999; Snyder et al., 2001) y por otra parte se ha comprobado que la presencia de p.p.m. de hidrocarburos en agua marina, provoca la inhibición del desarrollo embrionario de varias especies de invertebrados, como las estrellas de mar (Spies y Davis, 1982). Además de comprobar que la producción de óxido nítrico se anula durante estos años, se observa un cambio en la expresión proteica de los hemocitos (Resultados, figuras 48 y 49), en las inmunodetecciones realizadas con anti-iNOS humana y anti-eNOS bovina y se aprecia apoptosis en hemocitos obtenidos durante este bienio. En relación a la expresión proteica resulta extraña la aparición de una única banda de 52 kDa en proteínas de membrana de hemocitos incubados con los inductores estudiados (Resultados, figura 49), resultados que contrastan con los obtenidos por Cao (2002) en los que se apreciaba un gran número de bandas en el perfil proteico de mejillón. En las inmunodetecciónes realizadas con anti-iNOS humana y anti-eNOS bovina, cabe destacar que durante este período en el que no se apreció producción de óxido nítrico por hemocitos incubados con LPS, TNF-α, IL-2, PDGF y TGF-β 1, no se detectó ninguna de las dos isoformas para ninguno de los casos, lo cual nos sugiere que estas dos isoformas podrían estar implicadas en la síntesis de NO en hemocitos de M. galloprovincialis. Es también durante los años 2003 y 2004 cuando en Mytilus galloprovincialis se aprecia inducción de apoptosis al ser los hemocitos incubados con CHX, TGF-β 1 y TNF-α y a diferencia de los resultados obtenidos con hepatocitos (Oberhammer et al., 1992; Blom et al., 1999; Shima et al., 1999), en hemocitos las concentraciones y los tiempos de incubación empleados fueron menores (Resultados, tabla 7). 132 El TGF-β 1 dependiendo del tipo celular sobre el que actúe presenta una dualidad de respuestas (Sánchez-Capelo, 2005), una anti-apoptótica como la observada en microglía (Schlapbach et al., 2000) y osteoblastos (Sowa et al., 2003) y otra respuesta pro-apotótica observada en hepatocitos (Oberhammer et al., 1992; Shima et al., 1999) y linfocitos B y T (Lomo et al., 1995; Chaouchi et al., 1995; Douglas et al., 1997). En el caso de hemocitos de Mytilus galloprovincialis, se aprecia que el empleo de TGF-β 1 induce apoptosis (Resultados, figura 51), a diferencia de lo observado por Ottaviani et al. (2004), que afirman que la administración exógena de TGF-β 1 tiene un efecto anti-apoptótico en hemocitos de líneas celulares de insectos y de M.galloprovincialis, al activarse la PI(3)K, PKA y PKC. Diversos autores sugieren la capacidad del TNF-α para participar tanto en procesos apoptóticos como en procesos necróticos (Rothe et al., 1992; Tracey y Cerami, 1993; Barsacchi et al., 2002; Hughes et al., 2005). Estos trabajos apoyan los resultados obtenidos en hemocitos, ya que en las incubaciones realizadas con TNF-α durante el invierno, esta citoquina provoca un efecto apoptótico, mientras que durante el verano y en las mismas condiciones que en el período invernal, provoca necrosis (Resultados, figura 52). Por otra parte, TNF-α y TGF-β 1, no sólo provocan apoptosis en hemocitos, sino que en las incubaciones realizadas con estos dos inductores, se observa un descenso en la expresión de iNOS (Resultados, figuras 41y 42). Conclusiones 135 1. El ALS suplementado mantiene la viabilidad de hemocitos de Mytilus galloprovincialis Lmk. durante largos períodos de tiempo y no interfiere con los reactivos del método de Griess empleado para la cuantificación del óxido nítrico. 2. De todos los supuestos inductores de la respuesta inmune estudiados, solamente la IL-2 provoca notables incrementos de la producción de óxido nítrico en hemocitos de Mytilus galloprovincialis Lmk. Sorprendentemente, el LPS, conocido estimulador de la síntesis de NO en células de vertebrados, no provoca en hemocitos la inducción de dicha síntesis. 3. La inhibición de la producción de NO al emplear el inhibidor específico H89, sugiere la implicación de la proteína quinasa dependiente de AMPc (PKA) en la ruta de señalización empleada por la IL-2 para la síntesis de NO. 4. La implicación de la proteína quinasa dependiente de calcio (PKC) en las rutas de transducción de señales inducidas por la IL-2, parece estar condicionada por factores ambientales, puesto que se aprecian diferentes respuestas en la síntesis de NO a lo largo del año. 144 Bauchau, A.G. (1981). In: Invertebrate Blood Cells, volumen 2. Academic Press, New York. pp.385-420. Baeuerle, P.A. y Baltimore, D. (1996). NFκB: ten years after. Cell 87, 13-20. Beckman, J. S. (1991). The double edged role of nitric oxide in brain function and superoside mediated injury. J.Dev. Physiol. 15, 53-59. Behn-Krappa, A. y Newton, A.C. (1999). The hydrophobic phosphorylation motif of conventional protein kinase C is regulated by autophosphorylation. Curr. Biol. 9, 728-737. Beliaeff, B., O´Connor, T.P., Munschy, C., Raffin, B. y Claisse, D. (2002). Comparison of polycyclic aromatic hydrocarbon levels in mussels and oysters in France and in the United States. Environ. Toxicol. Chem. 9, 1783-1787. Belvisi, M.G., Stretton, C.D., Yacoub, M. y Barnes, P.J. (1992) Nitric oxide is the endogenous neurotransmitter of bronchodilator nerves in humans. Eur. J. Pharmacol. 210, 221-222. Berridge, M.J. e Irvine, R.F. (1984). Inositol trisphosphate a novel second messenger in cellular signal transduction. Nature 312, 315-325. Billecke, S.S., Bender, A.T., Kanelakis, K.C., Murphy, P.J., Lowe, E.R., Kamada, Y., Pratt, W.B. y Osawa, Y. (2002). HSP90 is required for heme binding and activation of APO neuronal nitric oxide synthase: geldanamycin mediatd oxidant generation is unrelated to any action of HSP90. J. Biol. Chem. 277, 20504-20509. Bissonnette, E.Y., Hogaboam, C.M., Wallace, J.L. y Befus, A.D. (1991). Potentiation of tumor necrosis factor-alpha-mediated cytotoxicity of mast cells by their production of nitric oxide. J. Immunol. 147, 3060-3065. Bibliografía 145 Blach-Olszewska, Z. (2005). Innate immunity: cells, receptors and signaling pathways. Arch. Immunol. Ther. Exp. 53, 245-253. Blom, W.M., de Bont, H.J., Meijerman, I., Mulder, G.J. y Nagelkerke, J.F. (1999). Prevention of cycloheximide induced apoptosis in hepatocytes by adenosine and by caspase inhibitors. Biochem. Pharmacol. 58, 1891-1898. Boissel, J.P., Schwarz, P.M. y Forstermann, V. (1998). Neuronal-type NO synthase: Transcript diversity and expressional regulation. Nitric Oxide, 2 337-349. Boland, M.P. (2001). DNA damage signalling and NF-kappaB: implications for survival and death in mammalian cells. Biochem. Soc. Trans. 29, 674-678. Boo, Y.C. y Jo, H. (2003). Flow depend regulation of endothelial nitric oxide synthase: role of protein kinases. Am. J. Physiol. Cell. Physiol. 285, 499-508. Boo, Y.C., Sorescu, G., Boyd, N., Shiojima, I., Walsh, K., Du, J., y Jo, H., (2002). Shear stress stimulates phosphorylation of endothelial nitric oxide synthase at Ser1179 by Aktindependent. J. Biol. Chem. 277, 3388-3396. Boutin, J.A. (1997). Myristoylation. Cell. Signal. 9, 15-35. Bred, D.S. y Snyder, S.H. (1990). Isolation of nitric oxide synthase, a calmodulin requiring enzyme. Proc. Natl. Acad. Sci. USA 87, 682-685. Bredt, D.S. y Snyder, S.H. (1994). Nitric oxide: physiologic messenger molecule. Ann. Rev. Biochem. 63, 175-195. Bredt, D.S., Hwang, P.M.., Glatt, C.E., Lowenstein, C., Reed, R.R., Snuyder, S.H. (1991). Cloned and expressed nitric oxide synthase structurally resembles cytochrome P-450 reductase. Nature 371, 714-718. 146 Brose, N. y Rosenmund, C. (2002). Move over protein kinase C, you´ve got company: alternative cellular effectors of diacylglycerol and phorbol esters. J. Cell. Sci. 115, 43994411. Brouet, A., Sonveaux, P., Dessy, C., Balligand, J-L. y Feron, O. (2001). Hsp90 ensures the transition from the early Ca2+ dependent to the late phosphorylation dependent activation of the endothelial nitric oxide synthase in vascular endothelial growth factor-exposed endothelial cells. J Biol Chem. 276, 32663-32669. Brusca, R.C. y Brusca, G.J. (2005). Filo Moluscos (Mollusca). En: Invertebrados, 2ª Edición. Ed. McGraw-Hill Interamericana. Madrid, pp 757-833. Buchner, K., Otto, H., Hilbert, R., Lindschau, C., Haller, H. y Hucho, F. (1992). Properties of protein kinase C associated with nuclear membranes. Biochem. J. 286, 369-375. Bulet, P., Hetru, C., Dimarcq, J.L. y Hoffmann, D. (1999). Antimicrobial peptides in insects: Structures and function. Dev. Comp. Immunol. 23, 329-344. Busconi, L y Michel, T. (1993). Endothelial nitric oxide synthase: N terminal myristoylation determines subcelular localization. J. Biol. Chem. 268, 8410-8413. Busse, R. y Fleming, I. (1995). Regulation and functional consequences of endothelial nitric oxide formation. Annu. Med. 27, 331-340. Butt, E., Bernhardt, M., Smolenski, A., Kotsonis, P., Frohlich, L.G., Sickmann, A., Cancio, I., Ibabe, A. y Cajaraville, M.P. (2000). Seasonal variation of peroxisomal enzyme activites and peroxisomal structure in mussels Mytilus galloprovincialis and its relationship with the lipid content. Comp. Biochem. Physiol. C Pharmacol. Toxicol. Endocrinol. 123, 135-144. Bibliografía 147 Cancio, I., Ibabe, A. y Cajaraville, M.P. (1999). Seasonal variation of peroxisomal enzyme activities and peroxisomal structure in mussels Mytilus galloprovincialis and its relationship with the lipid content. Comp. Biochem. Physiol. C Pharmacol. Toxicol. Endocrinol. 123, 135-144. Canesi, L., Gallo, G., Gavioli, M. y Pruzzo, C. (2002). Bacteria hemocyte interactions and phagocytosis in marine bivalves. Microsc. Res. Tech. 57, 469-476. Cao, A. (2002). Aportaciones al estudio de la respuesta inmune en hemocitos de Mytilus galloprovincialis Lmk. Tesis Doctoral. Universidade de Santiago de Compostela (USC). Cao, A., Mercado, L.A., Ramos, J.I. y Barcia, R. (2003). . The primary cultures of hemocytes from the mussel Mytilus galloprovincialis Lmk.: The expression of the IL-2R subunit. Aquaculture 216, 1-8. Cao, A., Ramos-Martínez, J.I. y Barcia, R. (2004a). In vitro effects of LPS, IL-2, PDGF and CRF on hemocytes of Mytilus galloprovincialis Lmk. Fish Shellfish Immunol. 16, 215225. Cao, A., Ramos-Martínez, J.I. y Barcia, R. (2004b). Implication of PKA and PKC in the activation of the hemocytes of Mytilus galloprovincialis Lmk. By LPS and IL-2. Mol. Immunol. 41, 45-52. Cao, J., Fernández, M., Ramos-Martínez, J.I. y Villamarín, J.A. (1996). Identification of RII-binding proteinas in the mollusc Mytilus galloprovincialis. FEBS Lett. 382, 93-96. Cao, J., Ramos-Martínez, J.I. y Villamarín, J.A. (1995). Characterization of a cAMP binding protein from the bivalve mollusc Mytilus galloprovincialis. Eur. J. Biochem. 232, 664-670. 148 Carballal, M.J., López, M.C., Azevedo, C. y Villalba, A. (1997). Hemolymph cell types of the mussel Mytilus galloprovincialis. Dis. Aquat. Org. 29, 127-135. Carton, Y. y Nappi, A.J. (1997). Drosophila cellular immunity against parasitoids. Parasitol. Today 13, 218-227. Castagna, M., Takai, Y., Kaibuchi, K., Sano, K., Kikkawa, U. y Nishizuka, Y. (1982). Direct activation of calcium activated, phospholipid-dependent protein kinase by tumorpromoting phorbol esters. J. Bio. Chem. 257, 7847-7851. Celada, A. y Nathan, C. (1994). Macrophage activation revisited. Immnunol. Today 15, 100-102. Coghlan, M., Chon, M. y Carpenter, C. (2000). Atypical protein kinase C lambda and zeta asociate with the GTP-binding protein Cdc42 and mediate stress fiber loss. Mol. Cell. Biol. 20, 2880-2889. Cohen, G.M., Sun, X-M., Fearnhead, H., MacFarlane, M., Brown, D.G., Snowden, R.T. y Dinsdate, D. (1994). Formation of large molecular weight fragments of DNA is a key committed step of apoptosis in thymocytes. J. Immunol. 153, 507-516. Connelly, L., Madhani, M. y Hobbs, A. J. (2005). Resistance to endotoxic shock in endothelial nitrico oxide synthase (eNOS) knockout mice: a pro-inflamatory role for eNOS derived NO in vivo. J. Biol. Chem. 280, 10040-10046. Conte, A. y Ottaviani, E. (1995). Nitric oxide synthase activity in molluscan hemocytes. FEBS Letters, 365, 120-124. Coussens, L., Parker, P., Rhee, L., Yang-Feng, T., Chen, E., Waterfield, M., Francke, U. y Ullrich, A. (1986). Multiple distinct forms of bovine and human protein kinase C suggest diversity in cellular signaling pathways. Science 233, 859-866. Bibliografía 149 Crespo, C. y Espinosa, J. (1990). Nutrient storage cells from mantle tissue of Mytilus galloprovincialis: glucose release and glycogen content. Rev. Esp. Fisiol. 46, 241-246. Cui, S., Reichner, J.S., Mateo, R.B. y Albina, J.E. (1994). Activated murine macrophages induce apoptosis in tumor cells through nitric oxide dependent or independent mechanisms. Cancer Res. 54, 2462-2467. Channon, K.M. (2004). Tetrahydrobiopterin. Regulator of endothelial nitric oxide synthase in vascular disease. Trends. Cardiovasc. Med. 14, 323-327. Chaouchi, N., Arvanitakis, L., Auffredou, M.T., Blanchard, D.A., Vazquez, A. y Sharma, S. (1995). Characterization of transforming growth factor β1 induced apoptosis in human B cells and lymphoma B cell lines. Oncogene 11, 1615-1622. Chauhan, V., Chauhan, A., Deshumkh, D. yBrockerhoff, H. (1990). Lipid activators of protein kinase C. Live Sci. 47, 981-986. Chen, C.C., Chiu, K.T., Sun Y.T. y Chen, W.C. (1999). Role of the cyclic AMP protein kinase A pathway in lipopolysaccharide induce nitric oxide synthase expression in RAW 264.7 macrophages. Involvement of cyclooxygenase-2. J. Biol. Chem. 274, 1559-1564. Chen, P-F., Tsai, A-L, Berka, V. y Wu, K.K. (1996). Endothelial nitric oxide synthase. Evidence for bidomain structure and successful reconstitution of catalytic activity from two separate domains generated by a baculovirus expression system. J. Biol. Chem. 271,1463114635. Chen, Z.T., Li, S.L., Cai, E.Q., Wu, W.L., Jin, J.S. y Zhu, B. (2003). LPS induces pulmonary intravascular macrophages producing inflammatory mediators via activating NF-kappaB. J. Cell Biochem. 89, 1206-1214. 150 Chin, D. y Means, A.R. (2000). Calmodulin: a protypical calcium sensor. Trends. Cell. Biol. 10, 322-328. Chio, C-C., Chang, Y-H., Hsu, Y-W., Chi, K-H. y Lin, W-W. (2004). PKA dependent activation of PKC, p38 MAPK and IKK in macrophage: implication in the induction of inducible nitric oxide synthase and inteleukin 6 by dibutyryl cAMPC. Cell. Sign. 16, 565575. Chijiwa, T., Mishima, A., Hagiwara, M., Sano, M., Hayashi, K., Ionue, T., Naito, K., Tashioka, T y Hidaka, H. (1990). Inhibition of forskolin induced neurite out growth and protein phosphorylation by a newly synthesized selective inhibitor of cyclic AMP dependent protein kinase, N-[2(p-bromociannamylamino) ethyl]-5-isoquinesulfonamide (H-89), of PC12D pheochromocytoma cells. J. Biol. Chem. 265, 5267-5272. Cho, H. J., Martin, E., Xie, Q-W., Sassa, S. y Nathan, C. (1995). Inducible oxide nitric synthase: identification of amino acid residues essential for dimerization and binding of tetrahydrobiopterin. Proc. Natl. Acad. Sci. USA 92, 11514-11518. Cho, H. J., Xie, Q-W., Calaycay, J. Mumford, R.A., Swinderek, K.M., Lee, T.D. y Nathan, C. (1992). Calmodulin is a subunit of nitric oxide synthase from macrophages. J. Exp. Med. 176, 599-604. Chow, M., Hou, W., Johnson, J., Graham, L., Lee, M., Chen, C., Newton, A., Schaffhausen, B. y Toker, A. (1998). Regulation of protein kinase C-ζ by PI 3-kinase – PDK-1-Akt/PKB signalling pathway. Curr. Biol. 8, 1069-1077. Christopherson, J.A. (1996). The captive medical malpractice insurance company alternative. Ann. Health. Law. 5, 121-143. Chyczewska, E. y Mroz, R.M. (1997). Cytokines and cancer. Rocz. Akad. Med. Bialymst. 42, 8-22. Bibliografía 151 Daniel, P.B. (1998). Cyclic AMP signaling and gene regulation. Annu. Rev. Nutr. 18, 353383. Davis, M.E., Cai, H., Drummond, G.R. y Harrison, D.G. (2001). Shear stress regulates endothelial nitric oxide synthase expression through c-Src by divergent signaling pathways. Circ. Res. 89, 1073-1080. Díaz-Enrich, M.J., Ibarguren, I., Hellman, U. y Villamarín, J.A. (2003). Characterization of a type I regulatory subunit of cAMP depedent protein kinase from the bivalve mollusc Mytilus galloprovincialis. Arch. Biochem. Biophs. 416, 119-127. Diehl, R., Mateo, J.M. y Urbano, P. (1985). El suelo, medio biológico. En: Fitotecnia general, 2ª Edición. Ed. Mundi-Prensa. Madrid pp. 213-219. Dimmeler, S. y Zeiher, A.M. (1997). Nitric oxide and apoptosis: another paradigm for the double-edged role of nitric oxide. Nitric Oxide 4, 275-281. Dimmeler, S., Ankarcrona, M., Nicotera, P. y Brune, B. (1997). Exogenous nitric oxide (NO): Generation of IL-1β induced intracellular NO production stimulates inhibitory auto ADP ribosylation of glyceraldehyal-3-phospate dehydrogenase in rIN m5F cells. J. Immunol. 150, 2964-2971. Douglas, R.S., Capocasale, R.J., Lamb, R.J., Nowel, P.C. y Moore, J.S. (1997). Chronic lymphocytic leukaemia B cells are resistant to the apoptotic effects of transforming growth factor β-1. Blood 89, 941-947. Dunphy, J.T. y Linder, M.E. (1998). Signaling functions of protein palmitoylation. Biochem. Biophys. Acta. 1436, 245-261. 152 Durán, C., Acuña, R. y Santiago, J. (1990). El Mejillón. Biología, Cultivo y Comercialización. Centro de Investigaciones Submarinas (CIS). Fundación Caixa Galicia. Dutil, E., Toker, A. y Newton, A. (1998). Regulation of conventional protein kinase C isozymes by phosphoinositide dependent kinase 1 (PDK-1). Curr. Biol. 8, 1366-1375. Dutil, E.M. y Newton, A.C. (2000). Dual role of pseudosubstrate in the coordinated regulation of protein kinase C by phosphorylation and diacylglycerol. J. Biol. Chem. 275, 10697-106701. Dyrynda, E.A., Pipe, R.K. y Ratcliffe, N.A. (1997). Sub-populations of haemocyte in the adult and developing marine mussel, Mytilus edulis, identified by use of monoclonal antibodies. Cell Tissue Res. 289, 527-536. Eberhardt, W., Pluss, C., Hummel, R. y Pfeilschifter, J. (1998). Molecular mechanism of inducible nitric oxide synthase gene expression by IL-1 beta and cAMP in rat mensangial cells. J. Immunol. 160, 4961-4969. Ellis, R.E., Yuan, J. y Horvitz, H.R. (1991). Mechanisms and functions of cell death. Annu.Rev. Cell. Biol. 7, 663-698. Engstrom, Y. (1999). Induction and regulation of antimicrobial peptides in Drosophila. Dev. Comp. Immunol. 23, 345-358. Eun, J.S., Suh, Y.H., Kim, D.K. y Jeon, H. (2000). Regulation of cytokine production by exogenous nitric oxide in murine splenocyte and peritoneal macrophage. Arch. Pharm. Res 23, 531-534. Fabregat, I. y Fernández, M. (2002). Acción dual del TGF-beta: Supresor de tumores y activador de la progresión tumoral. Schironia 1, 47-50. Bibliografía 153 Farazo, T.A., Waksman, G. y Gordon, J.I. (2001). The biology and enzymology of protein N-myristoylation. J. Biol. Chem. 276, 39501-39504. Feng, S. Y. (1965). Heart rate and leucocyte circulation in Crassostrea virginica (Gmelin). Biol. Bull. 128, 198-210. Feng, S.Y., Fene, J.S. y Yasmasn, T. (1977). Roles of Mytilus coruscus and Crassostrea gigas blood celss in defense and nutrition. Comp. Pathobiol. 3, 31-61. Fisher, W.S. y Newell, R.I.E. (1986). Seasonal and environmental variations in proteins and carbohidrates levels in the hemolymph from American oysters (Crassostrea virginica Gmelin). Comp. Biochem. Physiol. 85A, 365-372. Fleming, I. y Busse, R. (2003). Molecular mechanisms involved in the regulation of the endothelial nitric oxide synthase. Am. J. Physiol. Regul. Integr. Comp. Physiol. 284, R1R12. Fleming, W. (1878). Veber die Blutzellen der Acephlen und bermerkunges iiber cleren Blutbath. Arch. Mikro. Anat. 15, 243-252. Forslund, T. y Sundquist, T. (1997). Nitric oxide releasing particles inhibit phagocytosis in human neutrophils. Biochem. Biophys. Res. Commun. 233, 492-495. Franchini, A., Conte, A. y Ottaviani, E. (1995). Nitric oxide: An ancestral immunocyte effector molecule. Adv. Neuroimmunol. 5, 463-478. Francis, J.M., Heyworth, C.M., Spooncer, E., Pierce, A., Dexter, T.M. y Whetton, A.D. (2000). Transforming growth factor β1 induces apoptosis independently of p53 and selectively reduces expression of Bcl-2 in multipotent hematopoietic cells. J. Biol. Chem. 275, 39137-39145.