Neurorreparación mediada por células progenitoras endoteliales en el ictus isquémico: influencia de factores de proliferación y migración celular endógenos

UNIVERSIDAD DE SANTIAGO DE COMPOSTELA Facultad de Medicina Departamento de Medicina NEURORREPARACIÓN MEDIADA POR CÉLULAS PROGENITORAS ENDOTELIALES EN EL ICTUS ISQUÉMICO: INFLUENCIA DE FACTORES DE PROLIFERACIÓN Y MIGRACIÓN CELULAR ENDÓGENOS Tesis doctoral Tomás Sobrino Moreiras 2007 I UNIVERSIDADE DE SANTIAGO DE COMPOSTELA FACULTADE DE MEDICINA Departamento de Medicina NEURORREPARACIÓN MEDIADA POR CÉLULAS PROGENITORAS ENDOTELIALES EN EL ICTUS ISQUÉMICO: INFLUENCIA DE FACTORES DE PROLIFERACIÓN Y MIGRACIÓN CELULAR ENDÓGENOS TESIS DOCTORAL Tomás Sobrino Moreiras 2007 D. JOSÉ CASTILLO SÁNCHEZ, Catedrático de Neurología del Departamento de Medicina de la Universidad de Santiago de Compostela y Jefe de Sección de Neurología y de la Unidad de Ictus del Hospital Clínico Universitario de Santiago, CERTIFICA: Que el presente trabajo titulado “ NEURORREPARACIÓN MEDIADA POR CÉLULAS PROGENITORAS ENDOTELIALES EN EL ICTUS ISQUÉMICO: INFLUENCIA DE FACTORES DE PROLIFERACIÓN Y MIGRACIÓN CELULAR ENDÓGENOS” ha sido realizada bajo mi dirección por el Licenciado en Biología Molecular D. TOMÁS SOBRINO MOREIRAS y se encuentra en condiciones de ser presentado y defendido como Tesis Doctoral ante el Tribunal correspondiente en la Universidad de Santiago de Compostela. Santiago de Compostela, Enero de 2007 Prof. José Castillo Sánchez II Este trabajo ha sido financiado con subvenciones concedidas por: el Ministerio de Educación y Ciencia (SAF2005-00359); la Consellería de Innovación e Industria de la Xunta de Galicia (PGIDIT06BTF91801PR); la Consellería de Educación y Ordenación Universitaria de la Xunta de Galicia (Programa de consolidación y estructuración de unidades de investigación competitivas, número de expediente 2006/80); la Fundación de Investigación Médica Mútua Madrileña; y por el Grupo Ferrer Internacional, S.A. III AGRADECIMIENTOS Plasmar en un papel un conjunto de sentimientos de enorme gratitud, escrito por una persona instruida en ciencias puras, no es tarea fácil y, ya lo comprobaréis, poco aconsejable. Seguramente, este conglomerado de palabras carezca de metáforas y otras herramientas gramaticales esenciales a la hora de reflejar sentimientos, pero espero que las palabras que utilice a continuación realicen su único cometido, que no es otro que daros las gracias: Cuando buscamos en un diccionario las distintas acepciones de la palabra maestro, podemos encontrar: persona que enseña un arte, una ciencia o un oficio; persona muy diestra o con profundos conocimientos en alguna materia; persona que ha adquirido una gran sabiduría o experiencia en una materia; y por último, persona que ha alcanzado un alto grado en su oficio. Ahora sé que cuando escriba que el Prof. José Castillo ha sido y será mi maestro en este mundillo de la investigación no estaré cometiendo un error gramatical. Pero lo que significa para mí el Prof. Castillo supera con creces el significado de la palabra maestro. Por ello, le agradezco enormemente la oportunidad que me ha ofrecido y me está ofreciendo, así como su amabilidad y acogida, su voto de confianza, sus consejos, su ayuda, e infinidad de detalles, la mayoría inmerecidos. Sinceramente, no encuentro las palabras adecuadas que expresen la enorme gratitud, admiración y cariño que tengo a Pepe Castillo. Gran parte de mi agradecimiento va dirigido a las personas que cariñosamente llamo “clínicos”, por su gran acogida, su ayuda incondicional, su complicidad y amistad. Muchísimas gracias al Dr. Rogelio Leira, otro gran maestro, y a los Drs. Miguel Blanco y Manuel Rodríguez Yáñez, futuros maestros, así como a Isabel Jiménez. Con ellos he aprendido a dilucidar el significado de las distintas variables clínicas y a comprender la compleja y angustiosa realidad clínica y social que representan enfermedades como el ictus. Gracias por vuestros consejos, puntualizaciones, consideraciones y sobre todo amistad. IV Gracias a los residentes de Neurología: Diego Santos, Xiana Rodríguez Osorio, Susana Arias y Ana Torea. Para prevenir cualquier tipo de perspicacia, debo decir que el orden de los citados se debe a aspectos puramente cronológicos, y como tal no altera el resultado. Muchas gracias por vuestra colaboración a la hora de incluir pacientes en los poco deseados protocolos del GPS.com. No debo olvidarme de dos antiguos compañeros, los Drs. Javier Abella y Jorge García. Una dedicatoria especial debe ir dirigida a mis compañeros de laboratorio: Iván Cristobo, Raquel Rodríguez González, David Brea, Octavio Moldes, Jesús Agulla y a los Drs. Pedro Ramos y Olivia Hurtado; ellos son mis grandes colegas, confidentes y sobre todo amigos. Gracias a toda la gente del GPS.com, especialmente a los Drs. Lizasoain, Moro, Dávalos, Serena, Vivancos, Castellanos, Nombela, Millán y Arenillas. Con ellos, y no a través de los bocetos informativos de las distintas administraciones públicas, he aprendido lo que significa la “Investigación Traslacional”, y que esta no es posible sin la amistad. La dedicatoria más especial, sentida y emotiva es para mi familia, especialmente para mi mujer Laura. Si digo que es la persona más importante de mi vida suena a tópico; pero, cuando veo que es mi mayor confidente, mi mejor amiga, mi mejor consejera, mi mayor admiradora y la persona que más me da sin pedirme nada a cambio, entonces me doy cuenta que toda mi vida gira entorno a ella. Muchas gracias a mis padres y hermanos porque sé que son las personas que más me quieren y apoyan. Sin ellos nada de esto sería posible. A mi ahijado Brais que con su dulzura y al mismo tiempo picardía hace de la risoterapia el mejor tratamiento contra el estrés. A mis suegros y cuñadas, así como a mi abuela Esperanza, ya que son piezas imprescindibles en el engranaje de mi vida. A todos vos, …………………………………………………………GRACIÑAS Neurorreparación mediada por Células Progenitoras Endoteliales en el Ictus Isquémico: influencia de Factores de Proliferación y Migración Celular Endógenos Tomás Sobrino Moreiras 5 1.1. ENFERMEDAD CEREBROVASCULAR: ICTUS. 1.1.1. CONCEPTO La isquemia cerebral es el resultado de una disminución del flujo sanguíneo cerebral hasta un nivel suficiente como para provocar alteraciones metabólicas y bioquímicas que producen necrosis celular y alteran el funcionamiento del sistema nervioso. Dependiendo del territorio afectado hablamos de isquemia cerebral focal cuando existe un área de disminución de flujo limitada a una zona del encéfalo, y de isquemia cerebral global cuando se afecta la totalidad del tejido, como ocurre en el caso de paro cardíaco o shock prolongado. La Organización Mundial de la Salud define ictus como el desarrollo clínico rápido de signos focales de alteración de la función cerebral sin otra causa aparente que no sea el origen vascular (1). 1.1.2. EPIDEMIOLOGÍA El ictus es una de las principales causas de mortalidad y morbilidad en todo el mundo. Según la OMS representa la tercera causa de muerte y la primera de invalidez en la población adulta en el mundo. En España, según los datos del INE (Instituto Nacional de Estadística) correpondientes al año 2002, el ictus isquémico es la primera causa de Neurorreparación mediada por Células Progenitoras Endoteliales en el Ictus Isquémico: influencia de Factores de Proliferación y Migración Celular Endógenos Tomás Sobrino Moreiras 6 muerte en mujeres y la segunda en varones, suponiendo el 10% de la mortalidad global (2). Mientras la mayoría de los países desarrollados muestran tasas estables de mortalidad por ictus, los países en desarrollo incrementan sus tasas anuales de prevalencia y mortalidad; 4.5 de los 10 millones de fallecimientos anuales por ictus pertenecen a los países no industrializados. En España, su incidencia es de 174 casos nuevos por 100.000 habitantes y año (3), y su tasa de mortalidad de 97.7 por cada 100.000 habitantes y año, siendo ligeramente superior en mujeres (111.9 por 100.000 habitantes/año) que en hombres (82.9 por 100.000 habitantes/año) (4). El ictus es la primera causa de discapacidad en los adultos. De los supervivientes, aproximadamente el 31% necesita ayuda para realizar sus actividades de la vida diaria, el 20% necesita ayuda para caminar, el 16% requieren cuidados institucionales y hasta un 25% presentará después del ictus un deterioro cognitivo en mayor o menor grado. Todo ello conlleva a un gasto económico muy elevado, estimado en 41 billones de dólares al año en los Estados Unidos. Por esto, el ictus supone un auténtico problema de salud que obliga a establecer las mejores pautas de prevención y tratamiento para reducir su incidencia y el grado de discapacidad que origina. Además, teniendo en cuenta que la incidencia aumenta en personas mayores de 65 años y que, debido a la mejora en la calidad de vida, se está produciendo un incremento notable en la esperanza de vida y un envejecimiento progresivo de la Neurorreparación mediada por Células Progenitoras Endoteliales en el Ictus Isquémico: influencia de Factores de Proliferación y Migración Celular Endógenos Tomás Sobrino Moreiras 7 población mundial, la prevalencia de esta enfermedad aumenta y consecuentemente también lo hace la magnitud del problema sociosanitario que supone. 1.1.3. CLASIFICACIÓN Existen dos tipos principales de ictus: el isquémico, en el que un flujo sanguíneo inadecuado provoca un área circunscrita de infarto cerebral, y el hemorrágico, en el que una extravasación sanguínea en el parénquima cerebral o en el espacio subaracnoideo produce lesión y desplazamiento de las estructuras cerebrales. Los ictus isquémicos se dividen a su vez en ataques isquémicos transitorios e infartos cerebrales. Los ictus hemorrágicos se dividen en hemorragias intracerebrales y hemorragias subaracnoideas. Los ataques isquémicos transitorios (AIT) se definen como la disfunción cerebral focal o monocular, con una duración de los síntomas inferior a 24 horas, causada por la alteración cualitativa o cuantitativa vascular debida a trombosis o embolia arterial en relación con enfermedad arterial, cardiaca o hematológica (5). El infarto cerebral está ocasionado por la alteración cualitativa o cuantitativa del aporte circulatorio a un territorio encefálico, que determina un déficit neurológico de más de 24 horas de duración, lo cual es expresión de una necrosis tisular. Neurorreparación mediada por Células Progenitoras Endoteliales en el Ictus Isquémico: influencia de Factores de Proliferación y Migración Celular Endógenos Tomás Sobrino Moreiras 8 Dependiendo del mecanismo de producción, el infarto cerebral se subdivide, según los criterios TOAST (6), en: - Infarto aterotrombótico: Presencia de estenosis igual o mayor al 50% del diámetro luminal u oclusión de una arteria extracraneal o intracraneal de gran calibre que supla la región clínicamente afectada, en ausencia de otra etiología. - Infarto cardioembólico: Presencia de fuente embolígena inequívoca (trombo o tumor intracardíaco, estenosis mitral reumática, prótesis aórtica o mitral, endocarditis, fibrilación auricular, enfermedad del nodo sinusal, aneurisma ventricular izquierdo, infarto agudo de miocardio de menos de 3 meses de evolución, o presencia de hipocinesia cardíaca global o discinesia) en ausencia de otra etiología. - Infarto lacunar: Infarto de menos de 15 mm de diámetro en el territorio de una arteria perforante cerebral, que suele ocasionar clínicamente un síndrome lacunar (síndrome motor, sensitivo, sensitivo-motor, hemiparesia ataxia, disartria-mano torpe), en ausencia de otra etiología. - Infarto de origen inhabitual: infarto de pequeño, mediano o gran tamaño, de localización cortical o subcortical, en territorio carotídeo o vertebrobasilar, habiendo descartado origen aterotrombótico, cardioembólico o lacunar. Suele estar producido Neurorreparación mediada por Células Progenitoras Endoteliales en el Ictus Isquémico: influencia de Factores de Proliferación y Migración Celular Endógenos Tomás Sobrino Moreiras 9 por enfermedades sistémicas (conectivopatías, infecciones, neoplasias, síndrome mieloproliferativo, alteraciones metabólicas o de la coagulación) o por otras enfermedades como disección arterial, displasia fibromuscular, aneurisma sacular, malformaciones arteriovenosas, trombosis venosa cerebral, vasculitis, migraña, etc. - Infarto de origen indeterminado: Infarto cerebral en el que tras un exhaustivo estudio diagnóstico, han sido descartados los subtipos aterotrombótico, cardioembólico, lacunar o inhabitual, o bien coexista más de una posible etiología. En este caso se pueden subdividir en indeterminado por estudio incompleto, por más de una etiología o por causa desconocida. Según la clasificación OCSP (Oxfordshire Community Stroke Project) (7) los infartos cerebrales se dividen en función de su localización clínica en: - Infarto total de la circulación anterior o TACI (Total anterior circulation infarction): Cuando se cumplen estos tres criterios: 1. Disfunción cerebral superior (afasia, disclaculia o alteraciones viso espaciales). 2. Déficit motor y/o sensitivo en al menos dos extremidades (valorando cara, brazo y pierna). 3. Hemianopsia homónima. Neurorreparación mediada por Células Progenitoras Endoteliales en el Ictus Isquémico: influencia de Factores de Proliferación y Migración Celular Endógenos Tomás Sobrino Moreiras 10 - Infarto parcial de la circulación anterior o PACI (Partial anterior circulation infarction): Cuando se cumple alguno de los siguientes criterios: 1. Disfunción cerebral superior (afasia, disclaculia o alteraciones visoespaciales); o 2. Cuando se cumplen 2 de los 3 criterios de TACI; o 3. Déficit motor y/o sensitivo más restringido que el clasificado como LACI (déficit limitado a una sola extremidad, o a cara y mano pero sin afectación del resto del brazo). - Infartos lacunares o LACI (Lacunar infarction): Cuando no existe disfunción cerebral superior ni hemianopsia y se cumple uno de los siguientes criterios: 1. Hemisíndrome motor puro que afecte al menos a dos extremidades (valorando cara, brazo y pierna). 2. Hemisíndrome sensitivo puro que afecte al menos a dos extremidades (valorando cara, brazo y pierna). 3. Hemisíndrome sensitivo-motor que afecte al menos a dos extremidades (valorando cara, brazo y pierna). 4. Hemiparesia-ataxia ipsilateral. 5. Disartria-mano torpe u otro síndrome lacunar. Neurorreparación mediada por Células Progenitoras Endoteliales en el Ictus Isquémico: influencia de Factores de Proliferación y Migración Celular Endógenos Tomás Sobrino Moreiras 11 - Infartos de la circulación posterior o POCI (Posterior circulation infarction): Cuando se cumple alguno de los criterios siguientes: 1. Afectación ipsilateral de pares craneales con déficit motor y/o sensitivo contralateral. 2. Déficit motor y/o sensitivo bilateral. 3. Patología oculomotora. 4. Disfunción cerebelosa sin déficit de vías largas ipsilaterales. 5. Hemianopsia homónima aislada. En la figura 1 se muestra la correlación en neuroimagen de los distintos tipos de infartos cerebrales según la clasificación OCSP. TACI PACI POCI LACI Figura 1. Tipos de infartos cerebrales según su localización clínica (clasificación OCSP). En cuanto a los ictus hemorrágicos, constituyen el 20 % de las enfermedades cerebrovasculares. Consisten en la extravasación de sangre dentro de la cavidad craneal, secundaria a la rotura de un vaso Neurorreparación mediada por Células Progenitoras Endoteliales en el Ictus Isquémico: influencia de Factores de Proliferación y Migración Celular Endógenos Tomás Sobrino Moreiras 12 sanguíneo, arterial o venoso. A su vez, se pueden dividir en hemorragia intracerebral o hemorragia subaracnoidea (8). Dentro de las hemorragias intracerebrales se pueden distinguir la hemorragia intraventricular primaria y la hemorragia parenquimatosa, a su vez subdividida en lobar, profunda, troncoencefálica o cerebelosa. 1.1.4. FACTORES DE RIESGO VASCULAR (FRV) Los factores de riesgo para el ictus cerebral se clasifican en factores que no se pueden modificar (como el sexo, la edad o la raza), y factores modificables, y por lo tanto prevenibles. Dentro de los factores modificables los más frecuentes son la hipertensión arterial (52.1%), la fibrilación auricular (27.4%), la diabetes mellitus (20%), la hiperlipemia (16.8%), el infarto cerebral previo (16.4%), la cardiopatía isquémica (13.3%), el ataque isquémico transitorio (12.4%), el tabaquismo (11.5%) y la arteriopatía periférica (7.8%) (9). 1.1.4.1. Factores de riesgo no modificables: - Edad: El envejecimiento es uno de los principales factores de riesgo para el la enfermedad cerebrovascular. La incidencia del ictus aumenta exponencialmente con la edad, alcanzando sus valores máximos por encima de los 65 años. Neurorreparación mediada por Células Progenitoras Endoteliales en el Ictus Isquémico: influencia de Factores de Proliferación y Migración Celular Endógenos Tomás Sobrino Moreiras 13 - Sexo: Se ha visto que los varones tienen mayor incidencia de ictus que las mujeres. - Raza: La ateromatosis de grandes vasos afecta con mayor frecuencia a los individuos de raza caucásica, mientras que la patología de pequeño vaso es más frecuente en africanos y asiáticos. - Herencia y genética: Existe una clara predisposición familiar a padecer ictus, tanto por vía materna como paterna. Puede ser que esta tendencia se deba a la asociación de los factores de riesgo fundamentales, como son la hipertensión arterial, la diabetes mellitus y la hipercolesterolemia. Sin embargo, sobre todo en personas jóvenes, en ocasiones el único antecedente que se recoge es un familiar de primer grado afecto de ictus. 1.1.4.2. Factores de riesgo modificables: - Hipertensión arterial: Es el principal factor de riesgo para cualquier tipo de ictus, tanto isquémico como hemorrágico. Todos los tipos de hipertensión, tanto sistólica como diastólica o combinada, incrementan el riesgo de ictus a partir de cifras moderadas. Cifras de tensión arterial sistólica en torno a 140-160 mm Hg o diastólica de 90-94 mm Hg incrementan el riesgo de ictus en 1.5 veces. Neurorreparación mediada por Células Progenitoras Endoteliales en el Ictus Isquémico: influencia de Factores de Proliferación y Migración Celular Endógenos Tomás Sobrino Moreiras 14 - Cardiopatía: Las enfermedades cardíacas tienen una clara asociación con los ictus, especialmente la fibrilación auricular, las valvulopatías, el infarto de miocardio, la hipertrofia ventricular izquierda y la cardiomegalia. - Diabetes mellitus: Se ha estimado que el riesgo de ictus en pacientes diabéticos aumenta 1.8 veces en varones y en 2.2 veces en mujeres. La diabetes predispone a los ictus isquémicos debido a su influencia en el desarrollo de aterosclerosis. - Hiperlipemia: La hiperlipemia favorece el desarrollo de la ateromatosis y de la isquemia, tanto coronaria como carotídea. - Tabaquismo: El consumo de cigarrillos predispone a la aparición de aterosclerosis en hombres y mujeres, con un incremento del riesgo de 2-3 veces. El tabaco facilita el espasmo arterial y el daño endotelial. Se ha visto que este riesgo añadido del tabaco desaparece tras cinco años de abstención. - Otros factores: El sedentarismo, la obesidad, el ronquido nocturno, el síndrome de apneas del sueño, los anticonceptivos orales y el consumo excesivo de alcohol también se han relacionado con un incremento del riesgo de ictus. Para ver cuales son los factores de riesgo que más influyen en la enfermedad cerebrovascular, es importante conocer su prevalencia y su riesgo relativo, ya que un factor con un riesgo relativo elevado, puede tener poca relevancia si no es muy frecuente. En la tabla 1 se resumen Neurorreparación mediada por Células Progenitoras Endoteliales en el Ictus Isquémico: influencia de Factores de Proliferación y Migración Celular Endógenos Tomás Sobrino Moreiras 21 intracraneal son muy pequeñas, por lo que la presión de perfusión cerebral es equiparable a la presión sanguínea de las arterias de mediano calibre. Cuando se produce hipertensión intracraneal, trombosis venosa o respiración artificial se modifica de manera importante la presión de perfusión cerebral, lo que puede condicionar la aparición de infartos cerebrales. En situaciones fisiológicas, la regulación del flujo sanguíneo cerebral es independiente de variaciones amplias de la presión de arterial, gracias a un complejo mecanismo de autorregulación de la circulación cerebral (gráfica 2), en el que intervienen factores miogénicos, bioquímicos, neurogénicos y peptidérgicos (11). 200 150 100 50 0 Flujo sanguíneo cerebral (% control) 0 50 100 150 200 Presión arterial media (mm Hg) 250 Normotenso Hipertenso Isquemia 200 150 100 50 0 Flujo sanguíneo cerebral (% control) 0 50 100 150 200 Presión arterial media (mm Hg) 250 Normotenso Hipertenso Isquemia Gráfica 2. Autorregulación del flujo sanguíneo cerebral normal, en pacientes hipertensos y en el tejido isquémico. Neurorreparación mediada por Células Progenitoras Endoteliales en el Ictus Isquémico: influencia de Factores de Proliferación y Migración Celular Endógenos Tomás Sobrino Moreiras 22 En pacientes hipertensos, la curva de autorregulación se desplaza a la derecha, por lo que los límites superior e inferior de la autorregulación se desplazan hacia presiones medias más altas. Durante la isquemia cerebral se produce una alteración de los mecanismos de autorregulación del flujo cerebral. Dicho mecanismo desaparece en el territorio isquémico y la presión de perfusión se hace dependiente de la tensión arterial (esta falta de regulación aparece con disminuciones superiores al 40% del flujo cerebral). Esta dependencia es más intensa con la disminución de la tensión arterial que con el aumento, debido a que en el tejido isquémico la presión de perfusión está por debajo del límite inferior de la capacidad autorregulatoria del lecho vascular, y por esta razón los vasos están dilatados al máximo. Una disminución de la presión arterial, en este caso, no puede compensarse con una mayor reducción de la resistencia vascular (24). Durante el infarto cerebral también se altera la regulación funcional, y se produce una abolición de la reactividad al CO2 en el centro del territorio afectado. En algunas ocasiones se produce una disminución del flujo al aumentar la concentración de CO2 por un fenómeno de “robo intracerebral” originado por la vasodilatación de las arterias normales como respuesta a la hipercapnia, que roba sangre del tejido isquémico donde los vasos ya están dilatados al máximo (25). El área con abolición del mecanismo de autorregulación en la isquemia cerebral focal es mayor que la zona de arreactividad al CO2. Esto origina Neurorreparación mediada por Células Progenitoras Endoteliales en el Ictus Isquémico: influencia de Factores de Proliferación y Migración Celular Endógenos Tomás Sobrino Moreiras 23 en la periferia del infarto un desequilibrio entre el control hemodinámico y metabólico responsable de la “circulación de lujo” cerebral aumentado por encima de las necesidades titulares de oxígeno, lo que conduce a una extracción de oxígeno reducida y a la aparición de una red de sangre venosa (26). 1.1.5.1.4. Circulación colateral El cerebro se protege contra la isquemia focal mediante la circulación colateral, que constituye un factor adicional de seguridad en la vascularización del cerebro. La principal anastomosis a nivel extracraneal está situada entre las dos carótidas primitivas. Entre la circulación intracraneal y la carótida externa se establece una comunicación a través de la arteria oftálmica. Dentro de la circulación intracraneal se establecen comunicaciones por medio del polígono de Willis y a través de las anastomosis leptomeníngeas. 1.1.5.2. Fisiopatología de la isquemia en el tejido cerebral El cerebro consume una tercera parte de su energía en el mantenimiento de la transmisión sináptica, otra tercera parte en el transporte de iones y otro tercio en la preservación de su integridad estructural. Cuando disminuye la perfusión cerebral, se alteran Neurorreparación mediada por Células Progenitoras Endoteliales en el Ictus Isquémico: influencia de Factores de Proliferación y Migración Celular Endógenos Tomás Sobrino Moreiras 24 progresivamente estas funciones, hasta conducir a la muerte celular. Sin embargo, no todas las neuronas reaccionan de la misma manera a la isquemia, existiendo una vulnerabilidad selectiva en relación con la densidad neuronal. Las neuronas de la corteza cerebral, del hipocampo, núcleo amigdalino y cerebelo son más sensibles a la isquemia que el resto de las neuronas o las células gliales, y sufren cambios estructurales de manera más precoz (27). La mayoría de los infartos cerebrales se produce en la sustancia gris, pero hasta un 20% de los casos se produce en al sustancia blanca como consecuencia de la oclusión de una arteria perforante (28). La fisiopatología de la isquemia cerebral es diferente en la sustancia gris y en la sustancia blanca del cerebro, debido a que ésta no contiene cuerpos neuronales ni sinapsis, pero sí axones mielinizados con una compleja estructura especializada (29). 1.1.5.2.1. Isquemia en la sustancia gris La hipoxia produce una disminución del ATP, lo que ocasiona un fallo en las bombas de Na+ y K+, con lo que se origina una rápida depleción del K+ intracelular, con la consecuente despolarización neuronal. Este hecho es responsable de la apertura de los canales de Ca2+ voltaje-dependientes y el desbloqueo de algunos canales de Ca2+ receptor-dependientes, produciendo un incremento de la concentración Neurorreparación mediada por Células Progenitoras Endoteliales en el Ictus Isquémico: influencia de Factores de Proliferación y Migración Celular Endógenos Tomás Sobrino Moreiras 25 de Ca2+ intracelular de aproximadamente el doble de su valor, que aunque no es capaz de producir la muerte neuronal por sí sola, lo es de originar una despolarización de la membrana (12, 13, 30, 31). Esto produce una cascada citotóxica en la que intervienen diferentes sustancias, desencadenando una respuesta inflamatoria. Glutamato El fallo energético y la consecuente despolarización de la membrana neuronal condiciona el aumento de la liberación de cantidades excesivas de glutamato y otros aminoácidos excitadores (30, 31). Esto se debe, en parte, a la inversión de los transportadores de glutámico (32). Existen 5 transportadores de glutamato, 2 gliales (EAAT1 y EAAT2), y 3 neuronales (EAAT3, EAAT4 y EAAT5). Estos transportadores intercambian Na+ e H+ por K+, y recaptan glutamato hacia el interior de la célula, a través de un mecanismo dependiente de energía. Tras la caída de ATP, los transportadores neuronales de glutamato dejan de recaptar, por lo que aumenta la concentración extracelular de glutamato, que estimula receptores de membrana ionotrópicos (fundamentalmente AMPA y NMDA) y receptores metabotrópicos. La estimulación del receptor AMPA produce una mayor despolarización de membrana al aumentar la concentración intracelular de Na+, induciendo la liberación de más glutamato, lo que produce Neurorreparación mediada por Células Progenitoras Endoteliales en el Ictus Isquémico: influencia de Factores de Proliferación y Migración Celular Endógenos Tomás Sobrino Moreiras 26 edema celular y abre canales no específicos voltaje-dependientes permeables al Ca2+. La estimulación de los receptores NMDA es responsable del aumento de la concentración de Ca2+ intracelular, desencadenando la cascada isquémica que conducirá a la muerte neuronal (figura 3). AMPA NMDA Na + Ca ++ O2• NO• ONOO • Glutamato Glutamato GABA Cl - AMPA NMDA Na + Ca ++ O2• NO• ONOO • Glutamato Glutamato GABA Cl - Figura 3. Acción del glutamato. Estimulación de los receptores AMPA y NMDA. El papel de los receptores metabotrópicos no está totalmente aclarado. Existen tres grupos de receptores metabotrópicos distintos para el glutamato: Grupo I (mGlu1a, b, c, d, e y mGlu5a, b), cuya activación libera Ca2+ intracelular y activa la protein-kinasa C; Grupo II (mGlu2 y mGlu3), que reduce la formación de AMPc y el Grupo III Neurorreparación mediada por Células Progenitoras Endoteliales en el Ictus Isquémico: influencia de Factores de Proliferación y Migración Celular Endógenos Tomás Sobrino Moreiras 27 (mGlu4a, b, mGlu6, mGlu7a, b y mGlu8a, b), que disminuye la concentración intracelular de Ca2+ y GMPc. El estímulo de los receptores del grupo I aumenta la liberación de glutámico, mientras que el estímulo de los receptores del grupo II y III la disminuye. Sustancias reactivas de oxígeno La elevación de la concentración intracelular de Ca2+ es un factor clave en el desarrollo del daño neuronal irreversible. El aumento del Ca2+ intracelular activa una serie de enzimas (proteínquinasas, proteasas, endonucleasas, proteínfosfatasas y sintasa de óxido nítrico) y condiciona la expresión de varios genes de respuesta inmediata (33). En la isquemia cerebral, la formación de especies reactivas de oxígeno (ROS) puede exceder la capacidad antioxidante de las neuronas, provocando alteraciones de algunos constituyentes celulares, como proteínas, ácidos nucleicos y lípidos. Las ROS responsables del estrés oxidativo de las neuronas son los radicales libres como el anión superóxido (O2●-), el radical hidroxilo (●OH) y el óxido nítrico (NO●), y otras especies reactivas que no son radicales libres, pero son sustancias muy tóxicas, como el peróxido de hidrógeno (H2O2) y el peroxinitrito (ONOO-) (34). El anión superóxido se genera a través de múltiples vías metabólicas, e inicia la cascada del estrés oxidativo en la isquemia Neurorreparación mediada por Células Progenitoras Endoteliales en el Ictus Isquémico: influencia de Factores de Proliferación y Migración Celular Endógenos Tomás Sobrino Moreiras 28 cerebral. La activación del receptor NMDA estimula la fosfolipasa A2, liberando ácido araquidónico, prostaglandinas, leucotrienos y tromboxanos. Durante el metabolismo del ácido araquidónico se forma el O2●-, que estimula de nuevo la fosfolipasa A2, estableciendo un sistema de retroalimentación positiva. También se puede generar O2●- por otros mecanismos, como la conversión de la xantinadeshidrogenasa en xantina-oxidasa, los neutrófilos infiltrados y las mitocondrias dañadas. El O2●- se produce en el interior de la neurona, y allí es donde actúa, ya que es incapaz de atravesar la membrana neuronal. Sin embargo, mediante la actuación del enzima superóxido dismutasa, el O2●- se transforma en H2O2, que difunde fácilmente en la célula donde se origina y en las neuronas situadas en la proximidad (34). El óxido nítrico (NO●) es un gas inorgánico permeable, difusible, con gran capacidad reactiva (35). Se sintetiza a partir del aminoácido Larginina por medio del enzima sintetasa del óxido nítrico (NOS). En condiciones normales, el NO● actúa como mensajero neuronal, pero en situaciones especiales como la isquemia, se origina una elevada producción de NO●, que se ha puesto en relación con mecanismos antagónicos de neurotoxicidad y de neuroprotección. La acción diferente del incremento del NO● depende del tipo de NOS que actúe. Existen tres isoformas del enzima NOS: la neuronal (nNOS), la endotelial (eNOS) y una forma inmunológicamente inducida (iNOS). El aumento de NO● Neurorreparación mediada por Células Progenitoras Endoteliales en el Ictus Isquémico: influencia de Factores de Proliferación y Migración Celular Endógenos Tomás Sobrino Moreiras 29 producido por la acción de la nNOS produce una lesión neuronal inmediata, mientras que el producido por la iNOS contribuye al daño neuronal retardado. Sin embargo, la producción de NO● mediada por la eNOS actúa como neuroprotector, al inducir la relajación de la fibra muscular lisa y el mantenimiento del flujo sanguíneo cerebral (36). La formación de NO● interviene en la excitotoxicidad por estímulo del NMDA (37, 38). En situaciones de isquemia, la activación de los receptores NMDA y la entrada de Ca2+ estimula la nNOS, produciendo un aumento de la síntesis de NO●. NMDA NMDA Ca ++ -Calmodulina nNOS L-arginina NO• Ferritina Fe 2+ O 2 •ONOOONOO ONOO- - NMDA NMDA Ca ++ -Calmodulina nNOS L-arginina NO• Ferritina Fe 2+ O 2 •ONOOONOO ONOO- - Figura 4. Acción del NO● sobre la membrana celular. La toxicidad del NO● depende de su reacción con el O2●- (figura 4). Cuando se forma NO● en presencia de O2●- se origina el anión Neurorreparación mediada por Células Progenitoras Endoteliales en el Ictus Isquémico: influencia de Factores de Proliferación y Migración Celular Endógenos Tomás Sobrino Moreiras 30 ONOO-, que es el responsable directo de la lisis neuronal, al reaccionar con grupos sulfidrilo, proteínas, lípidos y con los ácidos nucleicos (39). Glicina y GABA Durante la isquemia cerebral, además del glutamato, aparecen otros neurotransmisores en el espacio extracelular, principalmente la glicina y el ácido γ-aminobutírico (GABA). La glicina es un coactivador del receptor NMDA. Su excesiva liberación durante la isquemia origina un aumento de la estimulación del receptor, ocasionando un mayor daño neuronal (40). El GABA ejerce una acción inhibitoria. Los niveles de GABA en el cerebro son controlados por el enzima descarboxilasa del ácido glutámico (GAD), que sintetiza GABA a partir del glutamato, y por el enzima GABA-transaminasa (GABA-T), que lo degrada. El GABA actúa a través de dos receptores, el GABA-A, más abundante en la sustancia gris, y el GABA-B, más activo en sustancia blanca. El receptor GABA-A es ionotrópico, y su estimulación condiciona la entrada de Clen el interior de la neurona, facilitando su repolarización. El receptor GABAB es metabotrópico, acoplado a la proteína G, que actúa a través de un segundo mensajero modificando la conductancia del Ca2+ y del K+. Durante la isquemia cerebral se produce un aumento de la síntesis del GABA, por un lado favorecido por el aumento de la Neurorreparación mediada por Células Progenitoras Endoteliales en el Ictus Isquémico: influencia de Factores de Proliferación y Migración Celular Endógenos Tomás Sobrino Moreiras 37 disminución global del flujo sanguíneo cerebral, sino una redistribución del mismo. En estas circunstancias, se produce una alteración inmediata de la barrera hematoencefálica y un edema vasogénico masivo localizado en la sustancia gris, donde habitualmente impactan los émbolos. Pocas horas después, el edema se desplaza a la sustancia blanca adyacente (60). 1.1.5.4. Mecanismos bioquímicos de la progresión del ictus isquémico Uno de los mecanismos que conduce a la progresión del ictus es la transformación de la penumbra isquémica en una zona de lesión irreversible. En la zona de la penumbra isquémica se produce una mayor demanda de energía debido a que aumentan las necesidades metabólicas al producirse ondas de despolarización recurrentes. Estas mayores necesidades de aporte de nutrientes no pueden ser cubiertas debido a una disminución del flujo sanguíneo cerebral, por lo que el umbral de perfusión se hace cada vez más crítico, y zonas de penumbra se incorporan progresivamente al parénquima cerebral no viable. Sin embargo, la zona de penumbra isquémica es clínicamente expresiva, por lo que es probable que el deterioro neurológico implique, además, el reclutamiento de la región de oligohemia más periférica (17). Neurorreparación mediada por Células Progenitoras Endoteliales en el Ictus Isquémico: influencia de Factores de Proliferación y Migración Celular Endógenos Tomás Sobrino Moreiras 38 Con niveles de flujo sanguíneo cerebral inferiores a 22 ml/100 g/min se produce la liberación de grandes cantidades de glutamato y de otros aminoácidos neuroexcitadores, capaces de inducir ondas de despolarización recurrentes en la zona de penumbra isquémica (17). El predictor más potente de progresión de infarto cerebral es el glutamato. Niveles plasmáticos de glutamato por encima de 200 μM/L en las primeras 24 horas desde el inicio de la sintomatología predicen el deterioro neurológico con una probabilidad del 92% (61). También se han asociado niveles elevados de glicina con el aumento de la frecuencia de deterioro neurológico precoz (61). La disminución de la concentración del GABA en plasma también es un predictor importante de deterioro neurológico en las primeras 48 horas desde el inicio de la clínica en los infartos lacunares, sobre todos los localizados en los núcleos de la base (62). Pero para la progresión de la isquemia cerebral son necesarios otros mecanismos secundarios. Se ha demostrado una relación entre el aumento de los depósitos de hierro (como fuente de radicales libres) y el deterioro neurológico (63). También se ha visto que el NO● es un factor importante en la progresión de la zona de penumbra isquémica, especialmente en las zonas más periféricas, donde la presencia de oxígeno facilita la producción de peroxinitrilo (38). Los mecanismos inflamatorios también desempeñan un papel fundamental en la Neurorreparación mediada por Células Progenitoras Endoteliales en el Ictus Isquémico: influencia de Factores de Proliferación y Migración Celular Endógenos Tomás Sobrino Moreiras 39 progresión del infarto, y concentraciones plasmáticas elevadas de IL-6 son un potente predictor de deterioro neurológico precoz (64). La hiperglucemia, la hipertermia, la cefalea y las crisis comiciales en las primeras horas del ictus se han relacionado con el infarto cerebral progresivo. Los niveles plasmáticos de glucosa elevados durante la fase aguda del ictus isquémico aumentan la concentración de ácido láctico. Se ha visto que el efecto de la hipertermia sobre la progresión del infarto es dependiente de la neurotoxicidad del glutamato (65), y posiblemente de la IL-6 y del TNF-α. La cefalea al inicio del ictus isquémico está mediada por el glutamato, por el NO● y por la IL-6 (66). Las crisis convulsivas al inicio del ictus aparecen en los infartos corticales, y se relacionan con un empeoramiento neurológico como resultado del aumento de concentración de glutamato extracelular liberado en esta zona (67). También existen marcadores de neuroimagen del ictus progresivo. La presencia de hipodensidad precoz en la tomografía axial computarizada (TAC) o de hiperseñal en la resonancia magnética de difusión (RM-DWI) se relaciona con la progresión del infarto cerebral. Este hecho se debe a la presencia de edema citotóxico relacionado con el glutamato (46) o de edema vasogénico relacionado con el aumento de la permeabilidad vascular originado por el NO● y por los mecanismos de inflamación (38, 64, 68, 69). Neurorreparación mediada por Células Progenitoras Endoteliales en el Ictus Isquémico: influencia de Factores de Proliferación y Migración Celular Endógenos Tomás Sobrino Moreiras 40 1.1.5.5. Inflamación en el ictus isquémico Diferentes estudios han demostrado la asociación entre la inflamación sistémica y un riesgo aumentado de padecer infarto de miocardio e ictus (70, 71). La isquemia cerebral y la posterior reperfusión inducen una respuesta inflamatoria que se inicia en la microcirculación, que ayudará a la destrucción celular (37, 64, 72). En la periferia de la zona isquémica se activan las células endoteliales, las neuronas, los astrocitos y la glia, para iniciar una respuesta inflamatoria a través de la liberación de citocinas (69, 73), unas glicoproteínas que poseen la capacidad de interaccionar entre ellas mismas y con muchas estirpes celulares. Las citocinas que inician la inflamación son la interleucina-1β (IL1β) y el factor de necrosis tumoral-α (TNF-α) (figura 5) (73). La activación de estas citocinas en la isquemia cerebral ocurre de manera precoz, aunque de forma transitoria (64, 74). Citoquinas (IL-1β, TNF-α) Citoquinas (IL-1β, TNF-α) Citoquinas (IL-1β, TNF-α) Citoquinas (IL-1β, TNF-α) Figura 5. Inicio de la respuestra inflamatoria. Acción de la IL-1β y TNF-α. Neurorreparación mediada por Células Progenitoras Endoteliales en el Ictus Isquémico: influencia de Factores de Proliferación y Migración Celular Endógenos Tomás Sobrino Moreiras 41 La IL-1β y el TNF-α inducen una segunda respuesta inflamatoria, mucho más persistente, mediada por otras citocinas, la interleucina-6 (IL-6) y la interleucina-8 (IL-8) (figura 6). La IL-6 y la IL-8 juegan un papel importante en el desarrollo de reactantes de fase aguda, incluyendo la fiebre, la proteína C reactiva y el fibrinógeno (75), y en la liberación de un grupo de moléculas, conocidas como moléculas de adhesión celular o adhesinas, que originan la agregación leucocitaria y posteriormente su adherencia al tejido conjuntivo de la pared vascular (76). Citoquinas (IL-6, IL-8) Citoquinas (IL-6, IL-8) Citoquinas (IL-6, IL-8) Citoquinas (IL-6, IL-8) Figura 6. Segunda respuesta inflamatoria. Acción de IL-6 e IL-8 Dentro del grupo de las moléculas de adhesión se conocen diferentes grupos: las selectinas, miembros de la superfamilia de las inmunoglobulinas, y las integrinas. Las selectinas son glicoproteínas que contribuyen a la interacción inicial entre leucocitos y células endoteliales en la periferia del infarto. Su acción es transitoria y reversible, y conduce a otras interacciones celulares secundarias mediadas por otros grupos de adhesinas. Las principales moléculas de la superfamilia de las inmunoglobulinas son la molécula de adhesión Neurorreparación mediada por Células Progenitoras Endoteliales en el Ictus Isquémico: influencia de Factores de Proliferación y Migración Celular Endógenos Tomás Sobrino Moreiras 42 intracelular-1 (ICAM-1), la molécula de adhesión vascular-1 (VCAM-1) y la molécula de adhesión plaquetoendotelial-1 (PECAM-1). Las integrinas intervienen en la adhesión intracelular y en la interacción de estas células con elementos de la matriz extracelular. Estas moléculas se activan por la IL-8, a diferencia de las selectinas y la superfamilia de las inmunoglobulinas, que se activan por la IL-6, y su acción es mucho más tardía (77) (figura 7). IL-6 IL-6 Lselectinas Lselectinas ICAM-1 ICAM-1 IL-8 IL-8 VCAM-1 VCAM-1 NO• O2• OONOIntegrinas Integrinas IL-6 IL-6 Lselectinas Lselectinas ICAM-1 ICAM-1 IL-8 IL-8 VCAM-1 VCAM-1 NO• O2• OONOIntegrinas Integrinas Figura 7. Acción de las moléculas de adhesión celular. Debido a la activación de las moléculas de adhesión se produce un reclutamiento de leucocitos, y posteriormente, su agregación y adherencia a la pared vascular, lo cual es responsable de la obstrucción de la microvascularización. Se ha visto que algunas metaloproteasas de matriz (MMPs) intervienen en la lesión tisular tras la isquemia. Los leucocitos que se acumulan y se adhieren por la acción de las citocinas en la isquemia cerebral utilizan la producción de MMPs para migrar a través del Neurorreparación mediada por Células Progenitoras Endoteliales en el Ictus Isquémico: influencia de Factores de Proliferación y Migración Celular Endógenos Tomás Sobrino Moreiras 43 endotelio, desestructurar la barrera hematoencefálica y contribuir a la producción del edema (figura 8). Isquemia Isquemia Citotoxicidad Citotoxicidad Inflamaci Inflamació ón n Proteasas Proteasas de matriz de matriz Isquemia Isquemia Citotoxicidad Citotoxicidad Inflamaci Inflamació ón n Proteasas Proteasas de matriz de matriz Figura 8. Acción de las metaloproteasas de matriz sobre el endotelio. 1.1.5.6. Marcadores moleculares de utilidad diagnóstica y pronóstica Los mecanismos bioquímicos de neurotoxicidad e inflamación han resultado de utilidad como marcadores asociados a signos precoces de isquemia, deterioro neurológico, volumen del infarto, transformación hemorrágica y con la eficacia del tratamiento trombolítico. El edema citotóxico que se origina como consecuencia de la activación de los receptores AMPA por los aminoácidos excitatorios es responsable de los cambios más precoces que se pueden identificar en Neurorreparación mediada por Células Progenitoras Endoteliales en el Ictus Isquémico: influencia de Factores de Proliferación y Migración Celular Endógenos Tomás Sobrino Moreiras 44 la tomografía computerizada, conocidos como signos precoces. Posteriormente, otros factores como los diferentes mecanismos inflamatorios y la disrupción de la barrera hematoencefálica son responsables del edema vasogénico. Se ha visto que existe una asociación secuencial entre los marcadores de excitotoxicidad (glutamato), inflamación (IL-6 y TNF-α) y ruptura de la barrera hematoencefálica (MMP-9) según la intensidad de los marcadores precoces de isquemia (78). (Figura 9) Figura 9. Asociación de los signos precoces de isquemia cerebral con marcadores bioquímicos. Hipodensidad Sin efecto masa Efecto masa Grado I Borrado del surco cortical Grado II A simetría ventricular Grado III L í nea media Glutamato OR 13,2 TNFα OR 21,6 IL6 OR 18,2 -6 OR 26,5 MMP-9 OR 11,9 MMP-9 OR 34,4 TC al ingreso (11.6 (9.4) horas ), n=271 Signos precoces de isquemia cerebral, n=169 (62.3%) n=61 (22.5%) n=56 (20.6%) n=32 (11.8%) n=20 (7.4%) Marcadores bioquímicos asociados Hipodensidad Sin efecto masa Efecto masa Grado I Borramiento del surco cortica l Grado II A simetr í a ventricular Grado III L í nea media Glutamato OR 13,2 TNFα OR 21,6 IL6 OR 18,2 IL-6 OR 26,5 MMP-9 OR 11,9 MMP-9 OR 34,4 Signos precoces de isquemia cerebral, n=169 (62.3%) n=61 (22.5%) n=56 (20.6%) n=32 (11.8%) n=20 (7.4%) Marcadores bioquímicos asociados Neurorreparación mediada por Células Progenitoras Endoteliales en el Ictus Isquémico: influencia de Factores de Proliferación y Migración Celular Endógenos Tomás Sobrino Moreiras 45 Uno de los mecanismos responsables del deterioro neurológico precoz es la transformación del tejido isquémico periférico a la zona de infarto, denominado penumbra isquémica, en tejido necrótico. El glutamato es el marcador bioquímico predictivo más potente de progresión del infarto (61), aunque también se ha visto que las concentraciones elevadas de glicina, así como los niveles bajos de GABA en plasma son predictores del deterioro neurológico que se produce en las primeras 48 horas (62). Existe una fuerte relación entre los depósitos de hierro, una fuente de radicales libres, y el deterioro neurológico (63), al igual que con los marcadores moleculares de inflamación, como la IL-6 (64,68,72). El volumen final del infarto es consecuencia de la interacción de factores vasculares, hemodinámicas y bioquímicos. Algunos marcadores moleculares poseen un efecto neuroprotector, como el GABA y la IL-10, mientras que otros, como el ICAM-1, VCAM-1, TNF-α, IL-6, glutamato, ferritina, MMP-9 y NO● se asocian con un mayor volumen del infarto (79). (Figura 10) Neurorreparación mediada por Células Progenitoras Endoteliales en el Ictus Isquémico: influencia de Factores de Proliferación y Migración Celular Endógenos Tomás Sobrino Moreiras 46 Excitotoxicidad Ca 2+ Radicales libres Óxido nítrico Inflamación Peoteasas de matriz Remodelación Glutamato GABA IL-6 IL-10 TNF-α VCAM-1 ICAM-1 NO • Ferritina MMP-9 r = 0.48 r = -0.39 r = 0.57 r = -0.26 r = 0.42 r = 0.29 r = 0.18 r = 0.71 r = 0.54 r = 0.58 Excitotoxicidad Ca 2+ Radicales libres Óxido nítrico Inflamación Peoteasas de matriz Remodelación Glutamato GABA IL-6 IL-10 TNF-α VCAM-1 ICAM-1 NO • Ferritina MMP-9 r = 0.48 r = -0.39 r = 0.57 r = -0.26 r = 0.42 r = 0.29 r = 0.18 r = 0.71 r = 0.54 r = 0.58 r = 0.48 r = -0.39 r = 0.57 r = -0.26 r = 0.42 r = 0.29 r = 0.18 r = 0.71 r = 0.54 r = 0.58 Figura 10. La interacción entre los marcadores bioquímicos y el volumen del infarto presenta una gran complejidad. Los marcadores con acción neurotóxica se reflejan mediante línea continua, mientras que aquellos que poseen acción neuroprotectora se reflejan mediante línea discontinua. La transformación hemorrágica de un infarto cerebral es una complicación evolutiva con implicaciones clínicas significativas. El tamaño de la lesión, la hipertensión arterial, el tratamiento con anticoagulantes, la edad, la presencia de signos precoces en neuroimagen o la hiperglucemia se asocian con un mayor riesgo de transformación hemorrágica (80,81). Parece que la causa de la transformación hemorrágica es la pérdida de la integridad de la lámina basal de la microcirculación cerebral debido a la isquemia (82). La activación de las MMPs en modelos animales produce el deterioro de los componentes de la lámina basal, como la laminina, el colágeno y la fibronectina, originando la transformación hemorrágica (83). Se ha observado que la concentración de MMP-9 es tres veces mayor en Neurorreparación mediada por Células Progenitoras Endoteliales en el Ictus Isquémico: influencia de Factores de Proliferación y Migración Celular Endógenos Tomás Sobrino Moreiras 53 migración de EPCs puede constituir una nueva estrategia terapéutica antiangiogénica (114). 1.2.3. FACTORES QUE INFLUYEN EN EL NÚMERO DE EPCs La mayoría de las EPCs residen en la médula ósea en estrecha asociación con las HSCs y las células estromáticas que suministran el microambiente necesario para la hematopoyesis (86). En la médula ósea, las células progenitoras están presentes en diferentes estadíos de diferenciación. En condiciones fisiológicas, las EPCs representan únicamente el 0.01% de las células mononucleadas sanguíneas (115). La movilización de las EPCs requiere la disociación del contacto entre las células estromáticas de la médula ósea y las células progenitoras (91). Este proceso se denomina reclutamiento. 1.2.3.1. Reclutamiento y movilización de las EPCs Estímulos endógenos, tales como una isquemia tisular o la terapia exógena con ciertas citocinas, han demostrado promover la movilización de EPCs. Una isquemia focal en modelos experimentales induce un incremento en el número de EPCs circulantes (116). De igual modo, las EPCs fueron movilizadas en pacientes con trauma vascular o infarto agudo de miocardio (96,117). Estudios con citometría de flujo revelan que las concentraciones de EPCs se incrementan significativamente en pacientes con infarto agudo de miocardio, un Neurorreparación mediada por Células Progenitoras Endoteliales en el Ictus Isquémico: influencia de Factores de Proliferación y Migración Celular Endógenos Tomás Sobrino Moreiras 54 incremento que ha sido positivamente correlacionado con niveles plasmáticos elevados de VEGF (117). La capacidad regenerativa endógena de las EPCs es mediada principalmente por quimocinas y citocinas. Numerosos estudios han demostrado que el factor angiogénico VEGF promueve la movilización e incorporación de EPCs a las áreas de neovascularización (118-122). VEGF promueve angiogénesis por inducción, diferenciación y quimiotaxis de las células endoteliales (123). Asimismo, este factor de crecimiento es esencial para los procesos de hematopoyesis y angiogénesis (124). Múltiples isoformas de VEGF son secretadas, siendo el VEGF165 la más abundante. El VEGF165 ejerce su actividad biológica a través de su interacción con 2 receptores tirosín quinasa, VEGFR-1 y VEGFR-2 (115). Ambos receptores son expresados por las HSCs y EPCs. La liberación de VEGF por las HSCs y otras células en la médula ósea puede inducir la proliferación de EPCs, el remodelado vascular de la médula ósea y la regulación de la expresión de las moléculas de adhesión vascular. En conjunto, estos mecanismos promueven la migración de las EPCs desde la médula ósea (125). En modelos experimentales, la administración de VEGF induce una elevación de las concentraciones de EPCs en la circulación sanguínea, generando a su vez un aumento de su actividad proliferativa y migratoria (119). En los seres humanos, la administración exógena de VEGF aumenta el número de EPCs circulantes (121), lo que sugiere que Neurorreparación mediada por Células Progenitoras Endoteliales en el Ictus Isquémico: influencia de Factores de Proliferación y Migración Celular Endógenos Tomás Sobrino Moreiras 55 su sobreexpresión puede inducir la movilización de EPCs. Además del VEGF, otros factores de crecimiento angiogénicos, incluyendo la angiopoyetina 1, el factor de crecimiento fibroblástico y el factor de crecimiento derivado de las células estromáticas 1 (SDF-1), estimulan la movilización y el reclutamiento de las EPCs (118,122,126). El factor de crecimiento placental, un miembro de la familia de los VEGF, ha sido implicado en la formación de vasos sanguíneos colaterales en el corazón isquémico vía VEGFR-1, induciendo el reclutamiento de EPCs derivadas de la médula ósea (127,128). Además de los efectos directos del VEGF en la movilización de EPCs, VEGF puede inducir la liberación de otros factores de crecimiento hematopoyéticos, tales como el factor estimulante de colonias de macrófagos y granulocitos (GM-CSF) por las células endoteliales de la médula ósea (129). En modelos experimentales de isquemia focal, la administración exógena de GMCSF induce específicamente la movilización de EPCs contribuyendo a un aumento de vascularización en el área isquémica (116). La administración de GM-CSF en pacientes con excesivo daño de la arteria coronaria (CAD) induce un aumento del flujo colateral del miocardio (130). El factor estimulante de colonias de granulocitos (G-CSF), al igual que el GM-CSF, induce un aumento en el número de células CD34+ que podría estimular la neovascularización en regiones de miocardio isquémico (89). Neurorreparación mediada por Células Progenitoras Endoteliales en el Ictus Isquémico: influencia de Factores de Proliferación y Migración Celular Endógenos Tomás Sobrino Moreiras 56 El reclutamiento de las células progenitoras desde la médula ósea parece requerir la actividad de la metaloproteasa de matriz - 9 (MMP-9) (131). Ratones MMP-9-/- presentan una deficiencia en la movilización de células madre, de tal modo, que la administración de inhibidores de MMPs bloquean la movilización de EPCs. La actividad de la MMP-9 provoca la liberación masiva de la quimocina del factor de células madre (SCF), lo que favorece el reclutamiento de células progenitoras positivas c-kit, entre las que se encuentran las EPCs, desde la médula ósea. La MMP-9 activa induce la liberación de citocinas activadoras de células madre que provocan la movilidad de EPCs quiescentes (115). El mecanismo por el cual el factor de crecimiento placental recluta células progenitoras derivadas de la médula ósea requiere la actividad de la MMP-9, que induce la liberación de SCF (128). Una vez reclutadas y movilizadas, las EPCs deben dirigirse y diferenciarse a las zonas de endotelización. 1.2.3.2. Autodirección y diferenciación de las EPCs Los mismos factores responsables de la movilización de las EPCs también pueden desempeñar una función importante en su migración e incorporación a las áreas de endotelización y neovascularización. La expresión aumentada de VEGF, después de una lesión vascular, recluta EPCs. Asimismo, paralelamente a la migración de las EPCs al área de Neurorreparación mediada por Células Progenitoras Endoteliales en el Ictus Isquémico: influencia de Factores de Proliferación y Migración Celular Endógenos Tomás Sobrino Moreiras 57 lesión, se produce un aumento de los niveles plasmáticos de VEGF (96). En modelos experimentales, se ha comprobado que la implantación de VEGF induce neovascularización in vivo, mediada en gran medida por EPCs (132). Estos datos nos indican que las EPCs fueron dirigidas al área de implantación de VEGF. El SDF-1 también puede contribuir al autoguiado de las EPCs hacia las zonas de neovascularización. El SDF1, que se encuentra en concentraciones elevadas tras un infarto de miocardio, se une al receptor de quimocinas CXCR-4, que se expresa abundantemente en las EPCs (126,133,134). Actualmente se ha comprobado que: las EPCs expresan CXCR4, receptor de SDF-1 (134,135); VEGF induce la expresión de CXCR4 en EPCs (136); SDF-1 actúa como quimiotáctico de EPCs in vitro (137,138,139); SDF-1 induce la expresión de VEGF y angiogenesis in vivo (136). Por ello, debido a que las EPCs expresan receptores funcionales de CXCR4 y VEGF, se postula que una interacción conjunta entre SDF-1/CXCR4 y VEGF generaría un proceso de feed-back positivo que aumentaría los efectos terapéuticos de las EPCs en la Neovascularización in vivo (126,136-139). Neurorreparación mediada por Células Progenitoras Endoteliales en el Ictus Isquémico: influencia de Factores de Proliferación y Migración Celular Endógenos Tomás Sobrino Moreiras 58 1.2.3.3. Influencia de los factores de riesgo vascular en las EPCs La caracterización de las EPCs en pacientes con CAD fue realizada por Vasa y colaboradores (97). El estudio demuestra que existe una correlación negativa entre el número de factores de riesgo vascular y el número y actividad migratoria de las EPCs. El factor de riesgo más asociado a la reducción de los niveles de EPCs fue el tabaco, mientras que la hipertensión es el factor que más influye en la reducción de la actividad migratoria. Los mecanismos por lo que los factores de riesgo vascular reducen el número y la funcionalidad de las EPCs son desconocidos. Sin embargo, Vasa y colaboradores (97) especulan con la posibilidad de que estos mecanismos implican un aumento de la apoptosis de EPCs. Recientemente, se ha sugerido que los niveles de EPCs circulantes en sangre periférica podrían ser un marcador de la función endotelial y de riesgo cardiovascular (140). Neurorreparación mediada por Células Progenitoras Endoteliales en el Ictus Isquémico: influencia de Factores de Proliferación y Migración Celular Endógenos Tomás Sobrino Moreiras 59 1.2.3.4. Fármacos que aumentan la movilización y diferenciación de las EPCs Además del uso de la administración exógena de factores de crecimiento, citocinas o quimocinas, los inhibidores de la reductasa de HMG-CoA o estatinas aumentan la movilización y funcionalidad de las EPCs. Las estatinas poseen efectos beneficiosos como el aumento de la función endotelial, independientemente de la reducción del colesterol (141). Dimmeler y colaboradores (142) así como Llevadot y colaboradores (143) han demostrado que las estatinas incrementan la diferenciación de EPCs in vitro, y su movilización in vivo. Estos efectos fueron mediados a través de la vía fosfatidil inositol – 3 – kinasa/Akt, que también es utilizada por los factores de crecimiento angiogénicos que inducen la diferenciación de HSC (144). La influencia de las estatinas en la movilización de las EPCs se reflejó en un aumento 3x en el número de EPCs circulantes en pacientes con CAD estable después de 4 semanas de tratamiento con atorvastatina (145). Asimismo, el tratamiento con estatinas aumentan el flujo sanguíneo coronario en pacientes con CAD estable (146). Neurorreparación mediada por Células Progenitoras Endoteliales en el Ictus Isquémico: influencia de Factores de Proliferación y Migración Celular Endógenos Tomás Sobrino Moreiras 60 1.2.4. EPCs Y ENFERMEDAD CEREBROVASCULAR La disfunción endotelial propicia procesos de aterosclerosis y trombosis (101), responsables de enfermedades cerebrovasculares (147). Se ha sugerido que la concentración de EPCs circulantes en sangre periférica pueda ser un marcador de la función endotelial y de riesgo cardiovascular (140,148). El número de EPCs es significativamente inferior y su actividad migratoria menor en sujetos con elevado colesterol en suero, hipertensión y diabetes, así como en fumadores (97), todos ellos factores de riesgo cerebrovascular. También se han observado reducciones en el número de EPCs en pacientes con enfermedad coronaria (149), diabetes (150) e ictus (151). En modelos experimentales de isquemia cerebral, se ha demostrado que las EPCs median procesos de neovascularización cerebral (152). Recientemente, los beneficios de la terapia con EPCs fueron demostrados en pacientes con isquemia cerebral grave y con infarto agudo de miocardio (153155). En la actualidad apenas existen estudios acerca de la relación existente entre EPCs y enfermedad cerebrovascular. Este estudio pretende evaluar los efectos de las EPCs en la recuperación del Infarto cerebral, así como el papel de los factores moleculares que median su proliferación y migración. Neurorreparación mediada por Células Progenitoras Endoteliales en el Ictus Isquémico: influencia de Factores de Proliferación y Migración Celular Endógenos Tomás Sobrino Moreiras 61 2. HIPÓTESIS 62 Neurorreparación mediada por Células Progenitoras Endoteliales en el Ictus Isquémico: influencia de Factores de Proliferación y Migración Celular Endógenos Tomás Sobrino Moreiras 69 4. PACIENTES Y MÉTODOS 70 Neurorreparación mediada por Células Progenitoras Endoteliales en el Ictus Isquémico: influencia de Factores de Proliferación y Migración Celular Endógenos Tomás Sobrino Moreiras 71 Se ha realizado un análisis prospectivo en el que se han estudiado 48 pacientes con diagnóstico de ictus isquémico hemisférico no lacunar de menos de 12 horas de evolución. Las variables clínicas, neurorradiológicas y moleculares de los pacientes incluidos en el estudio se recogieron en un banco de datos prospectivo, diseñado con el propósito de estudiar la función de las EPCs en el ictus isquémico, su influencia en el pronóstico funcional y la influencia de los factores de crecimiento en la concentraciones de EPCs en sangre periférica. La base de datos cumplía las siguientes características: 1. Se recogieron un gran número de variables comunes, incluyendo escalas neurológicas y funcionales. 2. Los datos clínicos y moleculares fueron recogidos por los mismos investigadores. 3. Las muestras de sangre congelada y fresca, para la determinación de los factores de crecimiento y el cultivo de EPCs respectivamente, se recogieron usando un protocolo común. 4.1. CRITERIOS DE SELECCIÓN Se seleccionaron los pacientes que cumplían los criterios de inclusión y no presentaban ninguno de los criterios de exclusión. Neurorreparación mediada por Células Progenitoras Endoteliales en el Ictus Isquémico: influencia de Factores de Proliferación y Migración Celular Endógenos Tomás Sobrino Moreiras 72 4.1.1. CRITERIOS DE INCLUSIÓN 1. Pacientes ingresados con primer episodio de ictus isquémico hemisférico de menos de 12 horas de evolución, en los que persista la sintomatología neurológica durante al menos 2 horas. 2. Edad mayor de 18 años. 3. Ausencia de discapacidad previa (puntuación en la escala de Rankin modificada ≤ 1). 4.1.2. CRITERIOS DE EXCLUSIÓN 1. Infarto cerebral no confirmado por tomografía computerizada. 2. Inclusión en ensayos clínicos con tratamiento versus placebo en la fase aguda del ictus. 3. Pacientes con infarto lacunar o con infartos cerebrales previos que dificulten la evaluación de los resultados. 4. Enfermedades sistémicas graves. 5. Pacientes con alta probabilidad de exitus. 4.1.3. CONSENTIMIENTO INFORMADO A todos los pacientes se les proporcionó la información del proyecto por escrito y firmaron un formato de consentimiento informado.70 Neurorreparación mediada por Células Progenitoras Endoteliales en el Ictus Isquémico: influencia de Factores de Proliferación y Migración Celular Endógenos Tomás Sobrino Moreiras 73 4.2. DESCRIPCIÓN DE PARÁMETROS ANALIZADOS Y TÉCNICAS En el momento de la llegada al hospital se realizó extracción de sangre para la determinación de glucosa, fibrinógeno y recuento de leucocitos; radiografía de tórax; electrocardiograma y tomografía computerizada. También se extrajeron muestras de sangre para la determinación de los factores de crecimiento y el cultivo de EPCs. Los datos iniciales que se recogieron fueron: 1. Edad. 2. Sexo. 3. Tiempo de latencia, definido como el tiempo transcurrido desde el inicio de los síntomas hasta la llegada al hospital. 4. Antecedentes de hipertensión arterial, diabetes mellitus, dislipemia, fibrilación auricular, cardiopatía isquémica, tabaquismo, alcoholismo u otro factor de riesgo vascular. 5. Tratamiento previo con estatinas. 6. Temperatura corporal medida en el hueco axilar. 7. Situación neurológica del paciente. 8. Tensión arterial no invasiva. Para evaluar la situación funcional previa de los pacientes se empleó la Escala de Rankin modificada (mRS). Dicha escala valora la Neurorreparación mediada por Células Progenitoras Endoteliales en el Ictus Isquémico: influencia de Factores de Proliferación y Migración Celular Endógenos Tomás Sobrino Moreiras 74 discapacidad en diferentes grados, con una puntuación comprendida entre 0 y 6 puntos (tabla 2) (156). Tabla 2. Escala de Rankin modificada. 4.2.1. EVALUACIÓN CLÍNICA DEL ICTUS Todos los pacientes fueron atendidos en una Unidad de Ictus por el mismo equipo neurológico, aplicándoseles el protocolo diagnóstico terapéutico de ictus del hospital, adaptado a las guías del Grupo de Estudio de Enfermedades Cerebrovasculares de la Sociedad Española de Neurología. (157) Sólo los pacientes con presión arterial sistólica (PAS) ≥220 mm Hg o diastólica (PAD) ≥120 mm Hg recibieron medicación antihipertensiva durante las primeras 48 horas desde el ingreso. La hiperglucemia se trató con insulina cuando los niveles de glucosa fueron ≥160 mg/dL. Escala de Rankin modificada (mRS) 0 Asintomático 1 Incapacidad no significativa pese a la existencia de síntomas: capaz de realizar su trabajo y actividad habituales. 2 Incapacidad ligera: incapaz de realizar todas sus actividades habituales previas, capaz de realizar sus necesidades personales sin ayuda 3 Incapacidad moderada: requiera alguna ayuda, capaz de caminar sin ayuda. 4 Incapacidad moderadamente severa: incapaz de caminar sin ayuda, incapaz de atender sus necesidades sin ayuda. 5 Incapacidad severa: limitado a cama, incontinencia, requiere cuidados de enfermería y atención constante 6 Muerte Neurorreparación mediada por Células Progenitoras Endoteliales en el Ictus Isquémico: influencia de Factores de Proliferación y Migración Celular Endógenos Tomás Sobrino Moreiras 75 Para el tratamiento de la hipertermia (temperatura axilar >37.5 ºC) se inició tratamiento con metamizol o paracetamol intravenoso. Como profilaxis del tromboembolismo pulmonar se emplearon heparinas de bajo peso molecular. También se administró medicación antiagregante. Sólo se administraron anticoagulantes cuando existía una fuente cardioembólica mayor, pero no como tratamiento del deterioro neurológico precoz. Quince pacientes recibieron tratamiento fibrinolítico con tPA según criterios SITS-MOST. En los pacientes con tratamiento previo de estatinas se les mantuvo la medicación; en los que no recibían esta medicación, 20 mg de atorvastatina fue administrada entre el tercer y quinto día después de la hospitalización. Asimismo, un grupo randomizado de pacientes fue tratado con citicolina (2.000 mg Somazina/día) desde las primeras 24 horas y durante 3 meses. 4.2.1.1. Clasificación etiológica Los ictus se clasificaron etiológicamente según los criterios TOAST (6) en 4 grupos: 1. Aterotrombóticos. 2. Cardioembólicos. 3. Lacunares 4. Indeterminados. Neurorreparación mediada por Células Progenitoras Endoteliales en el Ictus Isquémico: influencia de Factores de Proliferación y Migración Celular Endógenos Tomás Sobrino Moreiras 76 4.2.1.2. Evaluación clínica Para cuantificar el grado de afectación neurológica se empleó la Escala de Ictus del National Institute of Health (NIHSS) (158) al ingreso, 24 horas, 72 horas, día 7±1 y a los 3 meses. Se realizó un estudio ultrasonográfico de los arcos supraaórticos y Doppler Transcraneal al ingreso y a las 24 horas de evolución. 4.2.1.3. Valoración del tamaño del infarto El volumen del infarto se midió en centímetros cúbicos. Para su determinación se realizó una segunda tomografía computerizada entre el 4º y el 7º día. Se empleó la fórmula 0.5 x a x b x c, donde “a” y “b” corresponden a los diámetros mayores en sentido perpendicular, y “c” al número de cortes de 10 mm en los que aparecía el infarto cerebral. 4.2.1.4. Evaluación pronóstica Para evaluar el pronóstico de los pacientes, se emplearon las siguientes variables: - El volumen del infarto medido entre el 4º y el 7º día. - El deterioro neurológico precoz. - La puntuación en la mRS a los 3 meses. - La mejoría en la puntuación en la NIHSS. Neurorreparación mediada por Células Progenitoras Endoteliales en el Ictus Isquémico: influencia de Factores de Proliferación y Migración Celular Endógenos Tomás Sobrino Moreiras 77 Se consideró deterioro neurológico precoz a un aumento igual o superior a los 4 puntos en la NIHSS en las primeras 24 horas de evolución. Se consideró mal pronóstico cuando los pacientes presentaban una puntuación mayor de 2 puntos en la mRS o se producía el fallecimiento del paciente (asignando una puntuación de 6 en dicha escala). La mejoría en la puntuación de la NIHSS fue determinada como la diferencia de puntuación entre el día 7 y la determinación basal, y entre el día 90 y la determinación basal. 4.2.2. EVALUACIÓN MOLECULAR Después de la inclusión, se extrajo una primera muestra de sangre para hemograma, coagulación, bioquímica y VSG. A continuación se realizó una extracción sanguínea basal al ingreso del paciente, que se repitió a las 24 y 72 horas, así como a los 7±1 días y a los 3 meses de la determinación basal para la posterior determinación de los marcadores moleculares. Cada extracción constó de 1 tubo de 4.5 mL de bioquímica con separador (para la obtención de suero): Dejamos reposar los tubos durante 10 minutos a temperatura ambiente para la formación del botón celular, y luego centrifugamos los tubos a 3.000 rpm. durante otros 10 minutos. El suero se repartió en 2 Neurorreparación mediada por Células Progenitoras Endoteliales en el Ictus Isquémico: influencia de Factores de Proliferación y Migración Celular Endógenos Tomás Sobrino Moreiras 78 alícuotas de 1 mL. Congelamos las 2 alícuotas a - 80 ºC hasta la realización de los test moleculares oportunos. Los niveles séricos de VEGF y SDF-1α se midieron mediante kits comercializados de análisis cuantitativo de inmunoabsorción ligada a enzimas (ELISA), obtenidos de Instant Elisa, MedSystems Diagnostics GmbH, Vienna, Austria; y Quantinea, R&D System. Minneapolis, MN, USA, respectivamente. Los niveles séricos de MMP-9 activa se determinaron mediante un ensayo de actividad, obtenida de Biotrack, Amersham Pharmacia, UK. El análisis de estos marcadores moleculares se llevó a cabo sin conocer los datos clínicos ni de neuroimagen. 4.2.3. EVALUACIÓN CELULAR Para la cuantificación de las EPCs en sangre periférica se realizó una extracción sanguínea (14 mL) basal al ingreso, así como a los días 7±1 y a los 3 meses ± 15 días desde el momento de la inclusión en el estudio. 4.2.3.1. Extracción, conservación y procesamiento de las muestras Se extrajeron 2 tubos de 7 mL con EDTA K3. Las muestras de sangre se conservaron a temperatura ambiente si fueron procesadas inmediatamente después de su extracción o en nevera a 4ºC si la Neurorreparación mediada por Células Progenitoras Endoteliales en el Ictus Isquémico: influencia de Factores de Proliferación y Migración Celular Endógenos Tomás Sobrino Moreiras 85 5. RESULTADOS 86 Neurorreparación mediada por Células Progenitoras Endoteliales en el Ictus Isquémico: influencia de Factores de Proliferación y Migración Celular Endógenos Tomás Sobrino Moreiras 87 En este estudio se han incluido 48 pacientes con el diagnóstico de ictus isquémico hemisférico no lacunar, de menos de 12 horas de evolución. 5.1. ANÁLISIS DESCRIPTIVO En nuestra muestra, la edad fue de 70.9 ± 10.1 años. La distribución por sexos fue de 24 hombres (50 %) y 24 mujeres (50 %). En cuanto al diagnóstico etiopatogénico, 8 pacientes presentaron un ictus de origen aterotrombótico (16.7 %). Veintiún pacientes (43.8 %) presentó un infarto de origen cardioembólico, y 19 pacientes (39.6 %) un infarto de origen indeterminado (Gráfica 4). Aterotrombótico Cardioembólico Indeterminado DIAGNÓSTICO 0 5 10 15 20 25 NÚMERO DE PACIENTES 43.8 % 16.7 % 39.6 % Gráfica 4. Clasificación etiopatogénica (criterios TOAST) En nuestra muestra, 23 pacientes presentaron más de 2 factores de riesgo vascular (47.9%). Asimismo, 16 pacientes (33.3%) estaban a Neurorreparación mediada por Células Progenitoras Endoteliales en el Ictus Isquémico: influencia de Factores de Proliferación y Migración Celular Endógenos Tomás Sobrino Moreiras 88 tratamiento con estatinas previo al ictus; quince pacientes (31.3%) recibieron tratamiento trombolítico con rtPA siguiendo los criterios SITS-MOST; y por último, 26 pacientes (54.2 %) recibieron tratamiento con citicolina. El tiempo de latencia desde el inicio de los síntomas al ingreso fue de 5.6 [2.4, 8.5] horas. Las cifras de PAS y PAD al ingreso fueron de 151.2 (23.2) y 82.6 (12.5) mm Hg, respectivamente; la temperatura axilar al ingreso fue de 36.5 (0.45) ºC; y los niveles de glucosa y fibrinógeno en suero al ingreso fueron de 133.1 (40.1) y 422.1 (128.6) mg/dL, respectivamente. El grado de afectación neurológica al ingreso, evaluada por la NIHSS fue de 13 [6-18], (tabla 3). Tabla 3. Características basales de la muestra Hombres, % 50 Edad, años 70.9 (10.1) Pacientes con >2 FRV, % 47.9 Pacientes a tratamiento previo con estatinas, % 33.3 Pacientes que recibieron tratamiento con rtPA, % 31.3 Pacientes a tratamiento con citicolina, % 54.2 PAS al ingreso, mm Hg 151.2 (23.2) PAD al ingreso, mm Hg 82.6 (12.5) Temperatura al ingreso, ºC 36.5 (0.45) Glucemia, mg/dL 133.1 (40.1) Fibrinógeno, mg/dL 422.1 (128.6) NIHSS al ingreso, mediana [percentiles] 13 [6-18] Tiempo de Latencia, h 5.6 [2.4, 8.5] Subtipos de Ictus, %: Cardioembólicos Aterotrombóticos Indeterminados 43.8 16.7 39.6 Neurorreparación mediada por Células Progenitoras Endoteliales en el Ictus Isquémico: influencia de Factores de Proliferación y Migración Celular Endógenos Tomás Sobrino Moreiras 89 5.2. ANÁLISIS COMPARATIVOS 5.2.1. INFLUENCIA DEL SEXO Y DE LOS FRV EN EL NÚMERO DE CFU-EC AL INGRESO No se encontraron diferencias significativas en el número de CFUEC al ingreso entre pacientes de distinto sexo (gráfica 5), así como entre pacientes que presentaban, o no, más de 2 factores de riesgo vascular al ingreso (gráfica 6). Sin embargo, sí que se observaron diferencias significativas en el curso evolutivo del crecimiento de las EPCs, de tal modo que el incremento de CFU-EC durante la primera semana fue significativamente menor en el grupo de pacientes que presentaban más de 2 factores de riesgo vascular al ingreso (gráfica 7). MujerHombre Sexo 25 20 15 10 5 0 CFU-EC al Ingreso Gráfica 5. Influencia del sexo en el número de CFU-EC al ingreso. p = 0.296 Neurorreparación mediada por Células Progenitoras Endoteliales en el Ictus Isquémico: influencia de Factores de Proliferación y Migración Celular Endógenos Tomás Sobrino Moreiras 90 SíNo >2 Factores de riesgo vascular 25 20 15 10 5 0 CFU-EC al Ingreso Gráfica 6. Influencia de los FRV en el número de CFU-EC al ingreso. SíNo >2 Factores de riesgo vascular 50 25 0 Incremento CFU-EC 7d-0d: (T2-T1) Gráfica 7. Influencia de los FRV en el Incremento de CFU-EC durante la primera semana. p = 0.648 p < 0.0001 Neurorreparación mediada por Células Progenitoras Endoteliales en el Ictus Isquémico: influencia de Factores de Proliferación y Migración Celular Endógenos Tomás Sobrino Moreiras 91 5.2.2. RELACIÓN ENTRE EL NÚMERO DE CFU-EC Y EL PRONÓSTICO FUNCIONAL A LOS 3 MESES. Para observar qué factores influyen en el pronóstico de los pacientes con ictus isquémico agudo, fue utilizada la puntuación en la mRS a los 3 meses, comparando a los pacientes con buen pronóstico (mRS < 3 puntos) con los pacientes con mal pronóstico (mRS ≥ 3 puntos) (tabla 4). Buen Pronóstico (n = 25) Mal Pronóstico (n = 23) p Edad (años) 68.2 (12.6) 73.3 (4.1) 0.391 Hombres (%) 56.0 43.5 0.282 Tiempo de latencia (h) 5.3 (2.1) 5.3 (2.3) 0.274 Factores de Riesgo Vascular Ant. de Hipertensión (%) 36.0 69.7 0.020 Ant. de Diabetes (%) 24.0 34.8 0.307 Ant. de Dislipemia (%) 24.0 30.4 0.430 Ant. de Tabaquismo (%) 12.0 8.7 0.541 Ant. de Enolismo (%) 16.0 13.0 0.352 Ant. de Cardiopatía isquémica (%) 20.0 17.4 0.556 Ant. de Fibrilación Auricular (%) 24.0 40.0 0.182 Ictus previo (%) 0 8 0.203 Bioquímica y signos vitales al ingreso Temperatura (ºC) 36.4 (0.3) 36.7 (0.4) 0.006 Presión Arterial Sistólica (mm Hg) 144.7 (21.1) 160.0 (24.6) 0.039 Presión Arterial Diastólica (mm Hg) 81.2 (12.4) 84.7 (13.2) 0.268 Glucemia (mg/dL) 119.1 (31.2) 148.9 (44.1) 0.015 Fibrinógeno (mg/dL) 380.8 (103.6) 434.6 (125.9) 0.026 Tratamiento con tPA, (%) 44.0 17.4 0.046 Tratamiento con estatinas, (%) 40.0 26.1 0.238 Variables de Neuroimagen Volumen del infarto (cc) 13.2 (10.1) 64.8 (29.6) <0.0001 Neurorreparación mediada por Células Progenitoras Endoteliales en el Ictus Isquémico: influencia de Factores de Proliferación y Migración Celular Endógenos Tomás Sobrino Moreiras 92 Tabla 4. Factores que influyen en el pronóstico de los pacientes con ictus. Se ha evaluado la edad; sexo; tiempo de latencia; antecedentes de factores de riesgo vascular (hipertensión, diabetes mellitus, dislipemia, antecedentes de tabaquismo y enolismo, antecedentes de cardiopatía isquémica, antecedentes de fibrilación auricular e ictus previo); bioquímica y signos vitales al ingreso (temperatura, PAS y PAD, glucemia y fibrinógeno, así como tratamiento previo con estatinas y tratamiento trombolítico con tPA); variables de neuroimagen (volumen del infarto); características clínicas (NIHSS al ingreso, signos ultrasonográficos y la Mejoría en la puntuación de la NIHSS en la primera semana y a los 3 meses); diagnóstico etiológico del ictus; y variables de las EPCs (Número de CFU-EC al ingreso, a los 7 días y a Buen Pronóstico (n = 25) Mal Pronóstico (n = 23) p Características Clínicas NIHSS al ingreso 6 [5, 9] 18 [14, 20] <0.0001 Signos ultrasonográficos, (%) 40.0 39.1 0.377 Mejoría de la NIHSS 1ª semana -6 [-8, -3] -4 [-6, -1] 0.001 Mejoría de la NIHSS a los 3 meses 0 [0, 0] 12 [11, 16] <0.0001 Diagnóstico Etiológico Aterotrombótico (%) 16.0 17.4 Cardioembólico (%) 36.0 52.2 Indeterminado (%) 48.0 30.4 0.435 Células Progenitoras Endoteliales (EPCs) Número de CFU-EC al ingreso 8 [4, 12] 9 [3, 14] 0.407 Número de CFU-EC al 7º día 36 [14, 47] 3 [2, 10] <0.0001 Número de CFU-EC a los 3 meses 37 [22, 63] 9 [4, 17] <0.0001 Incremento CFU-EC en 1ª semana 23 [11, 36] -3 [-7, 1] <0.0001 Incremento CFU-EC a los 3 meses 80 [68, 86] 27 [-102, 51] <0.0001 Neurorreparación mediada por Células Progenitoras Endoteliales en el Ictus Isquémico: influencia de Factores de Proliferación y Migración Celular Endógenos Tomás Sobrino Moreiras 93 los 3 meses, así como el incremento del número de CFU-EC durante la primera semana y los 3 primeros meses) . Los resultados se expresan como porcentaje, media (desviación estándar) o como la mediana y los percentiles 25 y 75. Los factores que se relacionan con un peor pronóstico son los antecedentes de hipertensión arterial (69.7 % vs. 36.0 %, p=0.020); una mayor cifra de PAS al ingreso (160 (24.6) mm Hg vs. 144.7 (21.1), p=0.039); mayor temperatura (36.7 ºC vs 36.4, p=0.006), mayor glucemia (148.9 mg/dL vs. 119.1, p=0.015) y los niveles más elevados de fibrinógeno (434.6 mg/dL vs. 380.8, p=0.026); mayor puntuación en la NIHSS al ingreso (18 [14, 20] vs. 6 [5, 9], p <0.0001); y mayor volumen del infarto (64.8 cc vs. 13.2, p < 0.0001). No se encontraron diferencias en el número de CFU-EC al ingreso entre los pacientes con buen y mal pronóstico (8 [4, 12] vs. 9 [3, 14], p=0.407). Sin embargo, al 7º día de evolución, el número de CFU-EC fue significativamente más elevado en los pacientes que presentaron buen pronóstico funcional a los 3 meses (36 [14, 47] vs. 3 [2, 10], p <0.0001) y esta diferencia se evidenció nuevamente a los 3 meses (37 [22, 63] vs. 9 [4, 17], p <0.0001) (Gráfica 8). Asimismo, los pacientes con buen pronóstico presentaron un mayor incremento en el número de CFU-EC durante la primera semana de evolución (23 [11, 36] vs. -3 [-7, 1], p<0.0001) así como a los 3 meses (80 [68, 86] vs. 27 [-102, 51], p<0.0001). Neurorreparación mediada por Células Progenitoras Endoteliales en el Ictus Isquémico: influencia de Factores de Proliferación y Migración Celular Endógenos Tomás Sobrino Moreiras 94 Gráfica 8. Perfil temporal del número de CFU-EC en pacientes con buen y mal pronóstico durante un periodo de 3 meses. Además, durante la primera semana, el mayor incremento del número de CFU-EC fue observado en el grupo de pacientes con buen pronóstico (mRS < 3) a los 3 meses. (Gráfica 9) Gráfica 9. Probabilidad de buen pronóstico a los 3 meses en relación al Incremento del número de CFU-EC en la primera semana (en quintiles). 0 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 65 70 Buen pronóstico Mal pronóstico CFU-EC / 106 células cultivadas T iempo desde el in g reso Basa 24 48 72 Dí a 73 th m 0 10 20 30 40 50 60 70 80 90 100 Porcentaje de pacientes con mRS<3 a los 3 meses Incremento del nº de CFU-EC en la 1ª semana -17 a -4 -4 a 0 0 a 13 13 a 34 >34 Neurorreparación mediada por Células Progenitoras Endoteliales en el Ictus Isquémico: influencia de Factores de Proliferación y Migración Celular Endógenos Tomás Sobrino Moreiras 101 Tabla 8. Resumen de correlaciones entre las EPCs y los marcadores moleculares endógenos de proliferación y migración celular. Puesto que el análisis ROC nos muestra que el Incremento de EPCs ≥4 CFU-EC, durante la primera semana, predice con la más alta sensibilidad (88%) y especificidad (92%) la probabilidad de buen pronóstico (mRS <3) a los 3 meses (ver página 86) el análisis se centra en aquellos marcadores que se correlacionan positivamente con el Incremento del número de CFU-EC en la primera semana. La relación del Icremento del número de CFU-EC en la primera semana con los niveles de VEGF se expresa en las gráficas 12, 13, 14 y 15; con los niveles de SDF-1α en las gráficas 16, 17, 18 y 19; y con los niveles de MMP-9 activa en las gráficas 20, 21, 22, y 23. GRUPO MARCADOR Coef. Pearson p CFU-EC basales MMP9 activa basal 0.078 0.590 MMP9 activa basal 0.343 0.017 MMP9 activa 24h 0.740 < 0.0001 MMP9 activa 72h 0.442 0.002 Incremento CFU-EC 1ª Semana MMP9 activa 7º día 0.474 0.001 MMP9 activa basal 0.287 0.062 MMP9 activa 24h 0.561 < 0.0001 MMP9 activa 72h 0.343 0.024 MMP9 activa 7º día 0.403 0.007 CFU-EC 3er mes MMP9 activa 3er mes 0.201 0.196 Neurorreparación mediada por Células Progenitoras Endoteliales en el Ictus Isquémico: influencia de Factores de Proliferación y Migración Celular Endógenos Tomás Sobrino Moreiras 102 Encontramos que existe correlación positiva entre el Incremento de CFU-EC durante la 1ª semana y los niveles de VEGF a las 24 horas (r=0.782), 72 horas (r=0.839) y al 7º día (r=0.602); con los niveles de SDF-1α a las 24 horas (r=0.828); así como con los niveles de MMP-9 activa basales (r=0.343), 24 horas (r=0.740), 72 horas (0.442) y al 7º día (r=0.474). 300,00250,00200,00150,00100,0050,000,00 [VEGF] basal (pg/mL) 50 25 0 Incremento CFU-EC 7d-0d: (T2-T1) Gráfica 12. Relación entre los niveles de VEGF basal y el Incremento del número de CFU-EC en la primera semana. Coef. Pearson = 0.054, p = 0.718. Neurorreparación mediada por Células Progenitoras Endoteliales en el Ictus Isquémico: influencia de Factores de Proliferación y Migración Celular Endógenos Tomás Sobrino Moreiras 103 700,00600,00500,00400,00300,00200,00100,000,00 [VEGF] 24 horas 50 25 0 Incremento CFU-EC 7d-0d: (T2-T1) Gráfica 13. Relación entre los niveles de VEGF a las 24 h y el Incremento del número de CFU-EC en la primera semana. Coef. Pearson = 0.782, p <0.0001. 700,00600,00500,00400,00300,00200,00100,000,00 [VEGF] 72 horas 50 25 0 Incremento CFU-EC 7d-0d: (T2-T1) Gráfica 14. Relación entre los niveles de VEGF a las 72 h y el Incremento del número de CFU-EC en la primera semana. Coef. Pearson = 0.839, p <0.0001. Neurorreparación mediada por Células Progenitoras Endoteliales en el Ictus Isquémico: influencia de Factores de Proliferación y Migración Celular Endógenos Tomás Sobrino Moreiras 104 1200,001000,00800,00600,00400,00200,000,00 [VEGF] 7º día 50 25 0 Incremento CFU-EC 7d-0d: (T2-T1) Gráfica 15. Relación entre los niveles de VEGF al 7º día y el Incremento del número de CFU-EC en la primera semana. Coef. Pearson = 0.602, p <0.0001. 350,00300,00250,00200,00150,00100,0050,00 [SDF-1alpha] basal (pg/mL) 50 25 0 Incremento CFU-EC 7d-0d: (T2-T1) Gráfica 16. Relación entre los niveles de SDF-1α basal y el Incremento del número de CFU-EC en la primera semana. Coef. Pearson = - 0.175, p = 0.235. Neurorreparación mediada por Células Progenitoras Endoteliales en el Ictus Isquémico: influencia de Factores de Proliferación y Migración Celular Endógenos Tomás Sobrino Moreiras 105 700,00600,00500,00400,00300,00200,00100,00 [SDF-1alpha] 24 horas 50 25 0 Incremento CFU-EC 7d-0d: (T2-T1) Gráfica 17. Relación entre los niveles de SDF-1α a las 24 h y el Incremento del número de CFU-EC en la primera semana. Coef. Pearson = 0.828, p <0.0001. 400,00200,00 [SDF-1alpha] 72 horas 50 25 0 Incremento CFU-EC 7d-0d: (T2-T1) Gráfica 18. Relación entre los niveles de SDF-1α a las 72 h y el Incremento del número de CFU-EC en la primera semana. Coef. Pearson = - 0.026, p = 0.859. Neurorreparación mediada por Células Progenitoras Endoteliales en el Ictus Isquémico: influencia de Factores de Proliferación y Migración Celular Endógenos Tomás Sobrino Moreiras 106 350,00300,00250,00200,00150,00100,00 [SDF-1alpha] 7º día 50 25 0 Incremento CFU-EC 7d-0d: (T2-T1) Gráfica 19. Relación entre los niveles de SDF-1α al 7º día y el Incremento del número de CFU-EC en la primera semana. Coef. Pearson = - 0.142, p = 0.335. 30,0025,0020,0015,0010,005,000,00 [MMP-9 activa] basal (ng/mL) 50 25 0 Incremento CFU-EC 7d-0d: (T2-T1) Gráfica 20. Relación entre los niveles de MMP-9 activa basal y el Incremento del número de CFU-EC en la primera semana. Coef. Pearson = 0.343, p = 0.017. Neurorreparación mediada por Células Progenitoras Endoteliales en el Ictus Isquémico: influencia de Factores de Proliferación y Migración Celular Endógenos Tomás Sobrino Moreiras 107 40,0020,000,00 [MMP-9 activa] 24 horas 50 25 0 Incremento CFU-EC 7d-0d: (T2-T1) Gráfica 21. Relación entre los niveles de MMP-9 activa a 24 h y el Incremento del número de CFU-EC en la primera semana. Coef. Pearson = 0.740, p<0.0001. 30,0025,0020,0015,0010,005,000,00 [MMP-9 activa] 72 horas 50 25 0 Incremento CFU-EC 7d-0d: (T2-T1) Gráfica 22. Relación entre los niveles de MMP-9 activa a 72 h y el Incremento del número de CFU-EC en la primera semana. Coef. Pearson = 0.442, p = 0.002. Neurorreparación mediada por Células Progenitoras Endoteliales en el Ictus Isquémico: influencia de Factores de Proliferación y Migración Celular Endógenos Tomás Sobrino Moreiras 108 25,0020,0015,0010,005,000,00 [MMP-9 activa] 7º día 50 25 0 Incremento CFU-EC 7d-0d: (T2-T1) Gráfica 23. Relación entre los niveles de MMP-9 activa 7º día y el Incremento del número de CFU-EC en la primera semana. Coef. Pearson = 0.474, p = 0.001. Para analizar qué marcadores moleculares endógenos de proliferación y migración celular influyen independientemente en el Incremento del número de CFU-EC en la primera semana, hemos empleado un modelo de regresión lineal múltiple, utilizando como variable dependiente el Incremento del número de CFU-EC en la primera semana (tabla 9). Las variables que han demostrado una correlación significativa con el Incremento del número de CFU-EC son los niveles de VEGF a las 72 horas, así como los niveles de SDF-1α a las 24 horas. Neurorreparación mediada por Células Progenitoras Endoteliales en el Ictus Isquémico: influencia de Factores de Proliferación y Migración Celular Endógenos Tomás Sobrino Moreiras 109 Tabla 9. Correlación entre el Incremento de CFU-EC en la 1ª semana y los marcadores moleculares endógenos de proliferación y migración celular. a. variable dependiente: Incremento del nº de CFU-EC en la 1ª semana. Coeficientesa Intervalo de confianza para B al 95 % Variables independientes B Sig. Límite inferior Límite superior VEGF 24 h - 0.043 0.124 - 0.098 0.012 VEGF 72 h 0.091 0.003 0.033 0.149 VEGF 7ª día - 0.016 0.127 -0.036 0.005 SDF-1α 24 h 0.037 0.036 0.002 0.071 MMP-9 activa basal 0.360 0.220 -0.225 0.945 MMP-9 activa 24 h 0.248 0.114 -0.062 0.558 MMP-9 activa 72 h 0.041 0.910 -0.695 0.777 MMP-9 activa 7º día 0.033 0.933 -0.757 0.823 Neurorreparación mediada por Células Progenitoras Endoteliales en el Ictus Isquémico: influencia de Factores de Proliferación y Migración Celular Endógenos Tomás Sobrino Moreiras 110 5.2.5. INFLUENCIA DE FÁRMACOS EN FASE AGUDA SOBRE EL INCREMENTO DEL NÚMERO DE CFU-EC EN LA PRIMERA SEMANA. Para observar qué factores, incluidos fármacos en fase aguda, influyen en el Incremento del número de CFU-EC en la primera semana de evolución, fue realizado un estudio bivariado, comparando a los pacientes que presentaron, o no, Incremento del número de CFU-EC entre el día 7 y el ingreso con los pacientes (tabla 10). Incremento (n = 24) No Incremento (n = 24) p Edad (años) 69.7 (12.6) 72.2 (6.7) 0.391 Hombres (%) 50.0 50.0 0.613 Tiempo de latencia (h) 5.0 (3.1) 4.4 (2.3) 0.134 Factores de Riesgo Vascular Ant. de Hipertensión (%) 29.4 75.0 0.002 Ant. de Diabetes (%) 20.8 37.5 0.171 Ant. de Dislipemia (%) 20.8 33.3 0.259 Ant. de Tabaquismo (%) 8.3 12.5 0.500 Ant. de Enolismo (%) 4.2 4.2 0.919 Ant. de Cardiopatía isquémica (%) 20.8 16.7 0.500 Ant. de Fibrilación Auricular (%) 33.3 33.3 0.620 Ictus previo (%) 8.3 4.2 0.221 Bioquímica y signos vitales al ingreso Temperatura (ºC) 36.3 (0.3) 36.7 (0.5) 0.003 Presión Arterial Sistólica (mm Hg) 144.5 (21.5) 157.9 (23.4) 0.045 Presión Arterial Diastólica (mm Hg) 81.3 (12.3) 83.8 (12.9) 0.336 Glucemia (mg/dL) 117.5 (27.8) 148.7 (44.8) 0.016 Fibrinógeno (mg/dL) 376.8 (101.6) 467.4 (138.6) 0.018 Diagnóstico Etiológico Aterotrombótico (%) 16.7 16.7 Cardioembólico (%) 45.8 41.7 Indeterminado (%) 37.5 41.7 0.951 Neurorreparación mediada por Células Progenitoras Endoteliales en el Ictus Isquémico: influencia de Factores de Proliferación y Migración Celular Endógenos Tomás Sobrino Moreiras 117 6. DISCUSIÓN 118 Neurorreparación mediada por Células Progenitoras Endoteliales en el Ictus Isquémico: influencia de Factores de Proliferación y Migración Celular Endógenos Tomás Sobrino Moreiras 119 A pesar de la existencia de gran cantidad de estudios, la función de las Células Progenitoras Endoteliales como un marcador pronóstico en el ictus isquémico es incierta. Este es el primer estudio prospectivo que valora la influencia de las EPCs circulantes en sangre periférica sobre el pronóstico funcional de pacientes con ictus isquémico. Los pacientes que presentaron buen pronóstico a los 3 meses, definido como una puntuación mRS <3, muestran un número más elevado de CFU-EC al 7º día y un mayor incremento de CFU-EC durante la primera semana de evolución, en comparación con los pacientes con mal pronóstico (mRS ≥3). Numerosos factores han sido identificados como marcadores de mal pronóstico en el ictus isquémico: la edad, la intensidad del déficit neurológico al ingreso del paciente, la fiebre, la hipertensión, los niveles elevados de glucosa y fibrinógeno, la enfermedad cardiaca y la elevación de la proteína C reactiva. Asimismo, se ha demostrado que las EPCs circulantes se ven influenciadas en gran medida por muchos de estos factores pronósticos (97,150,159-162). Los datos de este estudio, después de ser ajustados por los antecedentes de hipertensión, PAS, temperatura corporal, niveles de glucosa y fibrinógeno, así como por la puntuación en la NIHSS al ingreso, muestran que el Incremento del número de CFU-EC ≥4 durante la primera semana de evolución se asocia independientemente con el buen pronóstico a los 3 meses. Estos datos confirman que las EPCs Neurorreparación mediada por Células Progenitoras Endoteliales en el Ictus Isquémico: influencia de Factores de Proliferación y Migración Celular Endógenos Tomás Sobrino Moreiras 120 circulantes en sangre periférica son un marcador pronóstico en el ictus isquémico. La mayoría de los factores de riesgo cardio y cerebrovascular han sido correlacionados con las EPCs. La hipercolesterolemia está asociada con reducciones del número de EPCs (163) y las estatinas son capaces de incrementar los niveles de EPCs circulantes (142). El tabaquismo ha sido identificado como uno de los factores de riesgo que más potencia la reducción del número de EPCs (97). Además, en patología cardiovascular se ha observado una disminución del número y la funcionalidad de las EPCs (164). Asimismo, se ha demostrado la existencia de una fuerte correlación entre el número de EPCs circulantes en sangre periférica y la puntuación en la Escala de Framingham (140). Finalmente, nuestros resultados están en consonancia con los descritos por Ghani y colaboradores (151). Estos investigadores demostraron que los niveles de EPCs en los pacientes con ictus son significativamente más reducidos en comparación con sujetos control, y que estos niveles de EPCs se correlacionan negativamente con la Escala de Framingham. Los pacientes con más factores de riesgo e infartos más graves tienen una menor capacidad de incrementar el número de EPCs, lo que se asocia a un peor pronóstico. Algunos tratamientos, como los fibrinolíticos, podrían condicionar no sólo una respuesta beneficiosa inmediata, sino a más largo plazo. Nuestro estudio plantea la hipótesis Neurorreparación mediada por Células Progenitoras Endoteliales en el Ictus Isquémico: influencia de Factores de Proliferación y Migración Celular Endógenos Tomás Sobrino Moreiras 121 del probable papel de la reperfusión en el incremento del número de EPCs. Los pacientes que recibieron tratamiento fibrinolótico mostraron un aumento significativo de las EPCs, y en los pacientes en los que se demostró una recanalización ultrasonográfica a las 24 horas (8 de 13, datos no mostrados) también presentaron un significativo aumento de las EPCs (40.8 (13.7) vs 10.6 (8.1), p <0.0001). De todas formas, el tratamiento fibrinolítico se asocia a un aumento del nivel de la MMP-9 (165), y ésta es un potente estimulador de la liberación de las EPCs (131); el incremento de marcadores moleculares asociados a la reperfusión, más que esta misma, podría ser el responsable de la respuesta de las EPCs. Esta hipótesis podría coincidir con los resultados de nuestro estudio, en los que el incremento de las EPCs fue independiente del tratamiento fibrinolítico. Diversos estudios sugieren que las EPCs desempeñan una importante función no sólo en la regeneración celular sino también en la neovascularización (87,164,166,167). En este contexto, estudios en clínica humana e isquemia experimental indican que la neovascularización está presente en el cerebro adulto (168,169), y que las EPCs particpan en procesos de neovascularización cerebral en modelos animales de isquemia cerebral (152). El hecho de que los pacientes con buen pronóstico muestren un mayor número de CFU-EC al 7º día y a los 3 meses, pero no así al ingreso, sustenta la hipótesis de que las EPCs pueden mediar procesos crónicos de neurorreparación. Neurorreparación mediada por Células Progenitoras Endoteliales en el Ictus Isquémico: influencia de Factores de Proliferación y Migración Celular Endógenos Tomás Sobrino Moreiras 122 Además, el incremento de las EPCs durante la primera semana se asocia a una mejoría en la puntuación de la NIHSS en el mismo espacio de tiempo. Aunque el volumen del infarto es menor en los pacientes con mayor incremento de las EPCs, esta relación no es independiente; probablemente, esta asociación podría haberse demostrado si hubiésemos considerado el volumen residual a los 3 meses. En este sentido, los tratamientos dirigidos a potenciar la neuroprotección, ampliamente eficaz en modelos experimentales de isquemia cerebral, en las fases aguda e hiperaguda del ictus isquémico no han mostrado beneficio (170), por lo que son necesarias nuevas estrategias terapéuticas. La neurorreparación por neovascularización mediada por EPCs podría ser una nueva e interesante alternativa en futuros tratamientos en el ictus isquémico (Figura 16). Figura 16. Neuroprotección vs. Neurorreparación en el ictus isquémico. NEUROPROTECCI Ó N NEUROREPARACI Ó N NMDA & AMPA Excitotoxicidad Excitoprotección Gabaérgica HIPERAGUDO AGUDO SUBAGUDO CRÓNICO Inflamació n Edema Hemorrágico Ruptura BH E Neovascularizació n A popt o si s Neurorreparación mediada por Células Progenitoras Endoteliales en el Ictus Isquémico: influencia de Factores de Proliferación y Migración Celular Endógenos Tomás Sobrino Moreiras 123 Por otra parte, numerosos estudios han demostrado que el factor angiogénico VEGF promueve la movilización e incorporación de EPCs a las áreas de neovascularización (118-122). Asimismo, las concentraciones de EPCs aumentan significativamente tras un infarto agudo de miocardio, un incremento que ha sido correlacionado positivamente con los niveles plasmáticos elevados de VEGF (117). Los resultados de este estudio muestran igualmente una correlación positiva entre el incremento del número de CFU-EC y las concentraciones séricas de VEGF, por lo que se puede concluir que tras un ictus isquémico la movilización de EPCs puede ser inducida por los niveles de VEGF. Del mismo modo, el Incremento del número de CFU-EC durante la primera semana fue correlacionado positivamente con los niveles séricos de MMP-9 activa. Estos datos sugieren que la actividad de la MMP-9 participa en el reclutamiento de las EPCs desde la médula ósea, tal como habían descrito Heissig y colaboradores (131). La correlación, para las concentraciones séricas al ingreso de MMP-9 activa, fue mayor con el incremento del número de CFU-EC durante la primera semana que con el número de CFU-EC al ingreso. Este dato podría hacer referencia a que la actividad de la MPP-9 podría inducir la liberación de citocinas activadoras de células madre, que provocarían la movilidad de EPCs quiescentes (115). Neurorreparación mediada por Células Progenitoras Endoteliales en el Ictus Isquémico: influencia de Factores de Proliferación y Migración Celular Endógenos Tomás Sobrino Moreiras 124 Finalmente, los resultados del presente estudio vendrían a refrendar los estudios que sugieren que el SDF-1α podría contribuir al autoguiado de las EPCs hacia las zonas de neovascularización y reendotelización (126,137-139). Asimismo, la proteína SDF-1α induce la expresión de VEGF y media procesos de angiogenesis in vivo (136). Por ello, debido a que nuestros resultados muestran una correlación positiva entre el Incremento del número de CFU-EC y los niveles séricos de VEGF y SDF-1α, y a que las EPCs expresan receptores funcionales de CXCR4 (receptor de SDF-1) y VEGF, se podría postular que una interacción conjunta entre SDF-1α/CXCR4 y VEGF generaría un proceso de feed-back positivo que aumentaría los efectos terapéuticos de las EPCs en la Neovascularización in vivo (126,136-139). Como se ha comentado anteriormente, el tratamiento fibrinolótico fue asociado a un aumento significativo de las EPCs, y los pacientes en los que se demostró una recanalización ultrasonográfica a las 24 horas también presentaron un incremento significativo del número de CFUEC. Otro tratamiento farmacológico en fase aguda que evidenció un comportamiento similar al tPA fue la citicolina. La citicolina es un intermediario en la síntesis de fosfolípidos de membrana que, administrada exógenamente, incrementa el contenido de membrana en fosfatidilcolina y esfingomielina desde el primer día de reperfusión en Neurorreparación mediada por Células Progenitoras Endoteliales en el Ictus Isquémico: influencia de Factores de Proliferación y Migración Celular Endógenos Tomás Sobrino Moreiras 125 modelos experimentales de isquemia (171). A pesar de que generalmente se asume que la función neuroprotectora de la citicolina se debe a su propiedad estabilizadora de membranas, un reciente estudio demuestra que el tratamiento crónico con citicolina mejora la recuperación funcional e incrementa la plasticidad neuronal en modelos experimentales de isquemia (172). Los resultados de este estudio vendrían a refrendar la hipótesis de que la citicolina podría mediar procesos de neurorreparación crónica en el ictus isquémico, no sólo mediante el incremento de la plasticidad neuronal sino también por un incremento del número de EPCs. Por último, numerosos estudios han demostrado que las estatinas incrementan la diferenciación de EPCs in vitro y su movilización in vivo (142-145). En este estudio, el tratamiento con estatinas induce un incremento del número de CFU-EC, aunque estadísticamente no es significativo. En conclusión, el presente estudio demuestra que las EPCs circulantes en sangre periférica son un excelente marcador de buen pronóstico en pacientes con ictus isquémico agudo. Los pacientes que presentan niveles más altos de EPCs muestran una mejoría del déficit neurológico y tienen un mejor pronóstico funcional a los 3 meses. Asimismo, un Incremento del número de CFU-EC ≥4 durante la primera semana de evolución incrementa en 22 veces la frecuencia de buen pronóstico a los 3 meses. La función de las EPCs como una nueva Neurorreparación mediada por Células Progenitoras Endoteliales en el Ictus Isquémico: influencia de Factores de Proliferación y Migración Celular Endógenos Tomás Sobrino Moreiras 126 herramienta farmacológica que mediaría procesos de neurorreparación crónica necesita ser explorada en el futuro, pero es posible que se pueda conseguir, bien sea por estimulación endógena de las EPCs mediante factores moleculares endógenos (VEGF, SDF-1α y MMP-9 activa) o tratamientos farmacológicos (tPA, citicolina y estatinas) que potencien su proliferación, migración y activación, o a través de su administración exógena. Neurorreparación mediada por Células Progenitoras Endoteliales en el Ictus Isquémico: influencia de Factores de Proliferación y Migración Celular Endógenos Tomás Sobrino Moreiras 133 1. WHO MONICA Project, Principal Investigators. 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