Optimización do valor nutritivo de microalgas mariñas para o enriquecemento e cultivo do rotífero "Brachionus plicatilis"

Optimización do valor nutritivo de microalgas mariñas para o enriquecemento e cultivo do rotífero Brachionus plicatilis Memoria que para optar ao Grao de Doutor en Bioloxía presenta Martiña Ferreira Novio Santiago de Compostela, Decembro de 2006 Facultade de Bioloxía Departamento deMicrobioloxía e Parasitoloxía Ana María Otero Casal, Profesora Titular e Jaime Fábregas Casal, Catedrático, ambos os dous do Departamento de Microbioloxía e Parasitoloxía da Universidade de Santiago de Compostela FAN CONSTAR Que a memoria titulada “Optimización do valor nutritivo de microalgas mariñas para o enriquecemento e cultivo do rotífero Brachionus plicatilis” que presenta Martiña Ferreira Novio para optar ao Grao de Doutor en Bioloxía, foi realizada baixo a nosa dirección no Departamento de Microbioloxía e Parasitoloxía, e autorizamos a súa presentación. E para que así conste, asinamos a presente en Santiago de Compostela a 20 de decembro de 2006. Asdo. Ana Otero Casal Asdo. Jaime Fábregas Casal Facultade de Bioloxía Departamento deMicrobioloxía e Parasitoloxía Aos meus pais. _______________________________Índice ______________________________________________________________________Índice IX Introdución 1 Requerimentos nutricionais das larvas 6 Producción e utilización de rotíferos en acuicultura 9 O papel das microalgas na acuicultura: valor nutritivo e técnicas de producción 13 Obxectivos 21 Obxectivos xerais 23 Obxectivos particulares 23 Materiais e métodos 25 Sistemas de cultivo de microalgas e rotíferos 27 Reconto celular e obtención de biomasa seca de microalgas e rotíferos 30 Cálculo da taxa de crecemento 30 Determinación da concentración de nitrato no medio de cultivo de microalgas 31 Determinación do peso seco 31 Análise elemental (C-H-N) 32 Determinación do contido de proteínas 33 Determinación do contido de lípidos 34 Determinación do contido de glícidos en biomasa e sobrenadante 36 Cálculo do valor calórico da biomasa 37 Determinación do contido de pigmentos 37 Análise de ácidos graxos 38 Determinación do contido de oligoelementos 40 Tratamento estatístico das mostras 41 Descrición das especies utilizadas 43 Isochrysis aff. galbana (Clon T-ISO) 45 Nannochloropsis gaditana Lubián 47 Brachionus plicatilis O. F. Müller 50 Capítulo 1. Cultivo discontinuo de Isochrysis aff. galbana (Clon T-ISO). Efecto da suplementación con CO2 e da intensidade luminosa 57 Introdución 59 Deseño experimental 60 Resultados e discusión 61 Capítulo 2. Cultivo semicontinuo de Isochrysis aff. galbana (Clon T-ISO) con intensidade luminosa elevada 75 Introdución 77 Deseño experimental 77 Resultados e discusión 78 Capítulo 3. Cultivo semicontinuo de Isochrysis aff. galbana (Clon T-ISO) con intensidade luminosa moderada 93 Introdución 95 Deseño experimental 95 Resultados e discusión 96 Introdución__________________________________________________________________ 4 reservas de vitelo, e transcorrido este periodo comeza a capturar pequenos zooplanctontes. O descoñecemento dos requerimentos nutritivos das larvas de peixe impediu completar os ciclos biolóxicos en cautividade ata que arredor de 1930 se descubriu a idoneidade dos nauplios de Artemia para a alimentación das larvas dalgúns peixes e crustáceos (Seale, 1933; Gross, 1937; Rollefsen, 1939). O descubrimento de que os nauplios de Artemia podían servir de alimento para as larvas de certas especies que presentaban unha boca o suficientemente grande para inxerilos supuxo un paso fundamental para o cultivo larvario (Van Stappen, 1996). Outro gran avance tivo lugar cando se observou que o rotífero Brachionus plicatilis podía ser tamén utilizado como alimento vivo para larvas de peixes mariños e de auga dóce. Este organismo constituía unha grave plaga nos cultivos de anguías en Xapón. Proliferaba rapidamente nos tanques de cultivo e consumía grandes cantidades de osíxeno, causando a morte dos peixes. Para combater o rotífero, nos anos 50 e 60 do século pasado leváronse a cabo estudos sobre a súa bioloxía, que paradoxalmente resultaron útiles para cultivalo de forma masiva (Fukusho, 1989). Os rotíferos demostraron ser especialmente indicados para ser utilizados como alimento das larvas polas súas características de rápido crecemento, tamaño, velocidade de natación e dixestibilidade, e permitiron ampliar o rango de especies de peixes cultivables. En menor medida tamén se utilizan como alimento vivo outros organismos como Daphnia , o nematodo Panagrellus redivivus , as larvas trocóforas de varios bivalvos e diversas especies de copépodos (Delbare e Dhert, 1996; Delbare et al ., 1996). Entre todos os diferentes organismos ensaiados como alimento vivo para o cultivo larvario, os copépodos dan lugar aos mellores resultados. Os copépodos son os constituíntes maioritarios do zooplancton mariño e polo tanto as presas habituais das larvas de peixe no medio natural, e considérase que a súa composición bioquímica satisfai todos os requerimentos nutricionais das larvas debido principalmente a unha elevada relación proteína:lípido, a unha gran proporción de lípidos polares e á súa riqueza nos ácidos graxos esenciais EPA (20:5ω-3, ácido eicosapentaenoico) e sobre todo DHA (22:6ω-3, ácido docosahexaenoico, DHA). Estas cualidades fan dos copépodos un alimento de maior valor nutritivo que os rotíferos ou Artemia (Evjemo e Olsen, __________________________________________________________________Introdución 5 1997; McEvoy et al ., 1998; Støttrup, 2001, 2003; Evjemo et al ., 2003). Porén, os copépodos son difíciles de producir de forma intensiva e aínda que poden colleitarse do medio natural a súa abundancia está restrinxida aos meses de primavera e verán, polo que na actualidade aínda non poden ser utilizados para o cultivo larvario a gran escala. Para este propósito é necesario dispoñer dun alimento vivo que poida ser cultivado facilmente en grandes cantidades durante todo o ano de xeito económico. Artemia e os rotíferos do xénero Brachionus , (principalmente B. plicatilis , a especie máis utilizada) cumpren estes requisitos, e a produción de peixes e crustáceos baséase nestes dous organismos. Ademais de ser fáciles de cultivar, os organismos empregados como alimento vivo deben reunir unha serie de características que os fagan aceptables para as larvas: satisfacer os seus requerimentos nutricionais, ter un tamaño apropiado e ser facilmente capturables. Un dos obxectivos máis perseguidos no cultivo larvario de peixes mariños na actualidade é a substitución do alimento vivo por microdietas artificiais, pero ata o momento soamente se conseguiu un éxito total no caso do peixe lobo Anarhinchas spp., que pode alimentarse con dietas formuladas desde a eclosión. As larvas de todas as demais especies estudadas unicamente son capaces de manterse con dietas artificiais cando estas se complementan con rotíferos ou Artemia . Estes organismos poderían ter un efecto indirecto, como estímulo visual ou químico da captura e inxestión das presas tanto vivas como inertes, ou actuar directamente ao ser consumidos, contribuíndo coas súas propias enzimas dixestivas aos procesos de dixestión e asimilación (Kolkovski et al ., 1997). Aínda que existe controversia respecto a estas hipóteses (Cahu e Zambonino Infante, 2001), o certo é que a actividade das enzimas dixestivas nas larvas é baixa e dificulta a dixestión de micropartículas que conteñen entre un 60% e un 90% de materia seca, fronte ao 10% do zooplancton (Kolkovski, 2001). Os resultados obtidos ata o de agora permiten pensar que o alimento vivo seguirá sendo imprescindible para o cultivo larvario de practicamente todas as especies de peixes mariños, sendo o principai obxectivo a mellora da produción, tanto en cantidade como en calidade. Introdución__________________________________________________________________ 6 Requerimentos nutricionais das larvas A nutrición larvaria ten sido obxecto de numerosísimos estudos durante as últimas décadas, e o aspecto máis investigado é o requerimento de ácidos graxos poliinsaturados de cadea longa. Os ácidos graxos 22:6ω-3, 20:5ω-3 e 20:4ω-6 (ácido araquidónico, ARA) son nutrintes esenciais para os peixes mariños, que carecen das enzimas necesarias para producilos a partir doutros ácidos graxos de cadea máis curta e deben polo tanto recibilos a través da dieta. Cada un destes ácidos graxos ten funcións ben definidas nos procesos fisiolóxicos dos peixes e non poden ser substituídos uns por outros, así que o alimento debe aportar cantidades suficientes dos tres. O contido destes ácidos graxos nos tecidos dos peixes é proporcional ao contido presente na dieta (Mourente et al ., 1993; Rainuzzo et al ., 1994; Rodríguez et al ., 1994; Estévez et al ., 1999). O DHA concéntrase especialmente nos fosfolípidos das membranas neuronais do cerebro (Mourente et al ., 1991) e da retina (Navarro et al ., 1997). Unha dieta deficitaria en DHA ocasiona problemas de visión nos alevíns de arenque, aínda que non se coñece o papel concreto do DHA nos procesos visuais (Bell et al ., 1995). É probable que a malpigmentación, frecuente nos peixes cultivados cunha dieta con baixo contido de DHA (Reitan et al ., 1994a) estea relacionada cun mal procesamento dos sinais visuais no ollo ou no cerebro, ou por unha produción anormal da hormona estimulante de melanocitos, tamén segregada polo cerebro (Sargent et al ., 1999). O ARA e o EPA son precursores dos eicosanoides, moléculas que median en multitude de procesos metabólicos. Estes dous ácidos graxos compiten polos enzimas responsables da síntese de eicosanoides, sendo os producidos a partir do EPA menos activos que os sintetizados a partir do ARA. Os contidos de EPA e ARA na dieta deben estar en equilibrio para regular a produción de eicosanoides e en consecuencia a súa acción no organismo dos peixes. Aínda que un aporte suficiente de ARA aumenta a resistencia das larvas de dourada ao estrés producido pola manipulación e os cambios de salinidade, unha cantidade excesiva pode afectar negativamente á supervivencia e ao crecemento (Koven et al ., 2003), e nos peixes planos o exceso de ARA na dieta pode dar lugar a defectos de pigmentación (Estévez et al ., 1999). Considérase que a composición lipídica ideal da dieta debe ser similar á das propias larvas, á do viltelo dos ovos da especie en cuestión e á das súas __________________________________________________________________Introdución 7 presas naturais, contendo un 10% de fosfolípidos ricos en ácidos graxos ω-3 e menos dun 5% de triacilglicerois (Sargent et al ., 1999). As proporcións óptimas entre os ácidos graxos esenciais varían entre as distintas especies. A relación DHA:EPA óptima para a robaliza ( Dicentrarchus labrax ), o rodaballo ( Scophthalmus maximus ) e o fletán ( Hippoglossus hippoglossus ) sitúase arredor de 2:1, pero a relación óptima EPA:ARA é maior nos peixes planos, 10:1, que na robaliza, 2:1 (Sargent et al ., 1999). Na práctica, a principal dificultade no aporte de ácidos graxos radica en subministrar unha cantidade suficiente de DHA, especialmente cando se utilizan nauplios de Artemia como alimento, xa que son capaces de retroconverter o DHA en EPA (Navarro et al ., 1999). A cantidade de ARA presente no alimento vivo é normalmente baixa pero suficiente para cubrir as necesidades das larvas, e se o contido de DHA é o apropiado, os requerimentos de EPA están determinados polo contido de ARA e non polo de DHA (Estévez et al ., 1999; Sargent et al ., 1999). Os aminoácidos constitúen outro grupo de nutrintes moi estudado na nutrición larvaria. O rápido crecemento das larvas demanda unha gran inxesta de aminoácidos, que tamén constitúen unha fonte de enerxía durante as primeiras etapas da vida dos peixes. Os requerimentos varían segundo as especies e a fase de desenvolvemento, e un desequilibrio entre os requerimentos larvarios e o perfil de aminoácidos da dieta pode dar lugar a que ata o 40% dos aminoácidos subministrados polo alimento non sexan asimilados (Conceiçao et al ., 2003). Durante os seus primeiros días de vida as larvas carecen dun verdadeiro estómago polo que son incapaces de segregar o HCl e as enzimas responsables de iniciar a desnaturalización e a dixestión das proteínas, de maneira que a asimilación das proteínas pode resultar ineficiente. Os péptidos de pequeno tamaño e sobre todo os aminoácidos libres son asimilados con maior facilidade que as proteínas intactas e polo tanto son nutrintes moi valiosos para as larvas (Rønnestad et al ., 2003). As vitaminas liposolubles e os carotenoides xogan un papel importante no correcto desenvolvemento da pigmentación dorsal das larvas dos peixes planos. A vitamina A é necesaria para a síntese da rodopsina e postúlase que un déficit nutricional desta substancia dá lugar a deficiencias na transmisión dos sinais visuais cara o cerebro afectando ao correcto establecemento do patrón de Introdución__________________________________________________________________ 8 pigmentación (Rønnestad et al ., 1993). Por outra banda, un exceso de vitamina A na dieta pode producir problemas de hiperpigmentación na cara inferior do peixe e deformidades das vértebras (Tarui et al ., 2006). A cantaxantina e a astaxantina poden ser transformadas en vitamina A polos peixes e probablemente xogan un papel importante na pigmentación (Olson, 1989). O β-caroteno exerce unha acción distinta á dos carotenoides antes citados: induce a proliferación linfocitaria e está probablemente relacionado cun incremento da resistencia ás enfermidades infecciosas (Tachibana et al ., 1997). A suplementación do alimento vivo con vitamina C tamén reforza o sistema inmunitario reducindo a mortalidade por infeccións e asimesmo mellora a resistencia das larvas ao estrés e ten efectos positivos sobre o seu crecemento (Merchie et al ., 1995, 1997). Os traballos realizados sobre os requerimentos de oligoelementos dos peixes céntranse sobre todo en alevíns alimentados con dietas artificiais e non en larvas que consumen alimento vivo. Nos peixes, estes elementos forman parte de estructuras esqueléticas, manteñen os sistemas coloidais, regulan o equilibrio ácido-base e ademais son compoñentes de hormonas e enzimas ou cofactores enzimáticos, pero unicamente se coñecen ben as funcións dalgúns deles, incluíndo o ferro, cobre, manganeso, cinc, selenio, iodo, cobalto, cromo, potasio, magnesio, fósforo ou calcio (Lall, 1989; Watanabe et al ., 1997). A carencia de selenio durante 28 semanas provoca descensos dos niveis de vitamina E en sangue e alteracións nas células pancreáticas, ademais de reducir a actividade dalgunhas enzimas e incrementar a fraxilidade dos eritrocitos nos salmóns (Bell et al ., 1987). A deficiencia de iodo reduce a síntese de hormonas tiroideas nas larvas de halibut, o que podería estar relacionado con problemas de pigmentación e da migración do ollo (Solbakken et al ., 2002). Os nucleótidos son un grupo de nutrintes tradicionalmente considerados non esenciais, aínda que eran incluídos na formulación dalgunhas dietas polas súas propiedades como atraentes químicos e estimulantes da alimentación. Porén, investigacións máis recentes concluíron que os nucleótidos poderían tamén actuar como inmunoestimulantes, incrementando a resposta do sistema inmunitario e a resistencia ás infeccións. Nalgúns casos os nucleótidos poderían actuar tamén positivamente sobre o crecemento (Li e Gatlin, 2006). __________________________________________________________________Introdución 9 Produción e utilización de rotíferos en acuicultura O tamaño de Brachionus plicatilis , que oscila entre os 100 e os 340 µm, fai que habitualmente se utilice no inicio da alimentación esóxena, sendo substituído por nauplios de Artemia cando as larvas alcanzan unha determinada talla que lles permite inxerir presas de maior tamaño. Nas instalacións dedicadas á produción de rotíferos é unha práctica habitual manter unha serie de cultivos en tubos ou matraces Erlenmeyer de 50 ou 100 ml con auga de mar previamente esterilizada e alimentados con microalgas. Estes cultivos empréganse para o estudo da bioloxía e a fisioloxía do rotífero e para conservar especies ou cepas. A partir deles poden realizarse cultivos a gran escala para a produción masiva de rotíferos, para o que se inoculan progresivamente unha serie de matraces de maior capacidade que finalmente son utilizados para iniciar cultivos en grandes tanques (Dhert, 1996). Os cultivos destinados á produción de grandes cantidades de rotíferos clasifícanse en discontinuos, continuos ou semicontinuos. Dado que Brachionus plicatilis é un filtrador non selectivo e consume calquera tipo de partícula de tamaño apropiado (Rothhaupt, 1990) poden utilizarse distintos tipos de alimento: microalgas frescas, conxeladas ou liofilizadas, levadura ou diversas formulacións de alimento seco. Cultivos discontinuos. Lubzens (2003) describe catro tipos de cultivos discontinuos de rotíferos. Nos cultivos de tipo I os rotíferos inocúlanse a moi baixa densidade en tanques de fitoplancton, déixanse medrar e colléitanse unha vez que consumiron todas as algas. Esta técnica dá lugar a baixas densidades de rotíferos, e son propensos a colapsarse de xeito impredecible. Os cultivos de tipo II consisten en inocular cunha alta densidade de rotíferos unha quinta parte do volume do tanque. Aliméntanse con levadura e o volume de cultivo vaise incrementando progresivamente coidando de manter unha densidade de rotíferos alta. Os cultivos de tipo III son similares aos de tipo I, coa diferencia de que non hai cultivo previo de fitoplancton. Os rotíferos inocúlanse a unha baixa densidade no tanque e aliméntanse con levadura, concentrados de microalgas ou alimento seco, e recóllense unha vez alcanzada unha densidade elevada, arredor de 200 Introdución__________________________________________________________________ 10 individuos/ml. Por último, no tipo IV os cultivos son inoculados con densidades de rotíferos moi elevadas (5.000-10.000 individuos/ml) e alimentados con Chlorella concentrada. A duración dos cultivos con densidades elevadas é de entre 2 e 5 días, mentres que os baseados en densidades máis baixas teñen unha duración maior e dependente da taxa reproductiva dos rotíferos. Nos cultivos con grandes densidades de rotíferos é necesario subministrar osíxeno e vixiar o pH e a produción de amonio. Cultivos continuos. Inspíranse nos quimiostatos e turbidostatos empregados no cultivo de microorganismos e son sistemas de tamaño relativamente pequeno, habitualmente 1000 l. Utilizando unha dieta apropiada, como Nannochloropsis ou unha mestura de varias especies de microalgas, poden conseguirse elevadas taxas de crecemento nos cultivos de B. plicatilis e polo tanto tamén altas produtividades, de ata 222×106 rotíferos/m3/día (James e Abu-Rezeq, 1989; Abu-Rezq et al ., 1997). Crese que a eficiencia deste tipo de cultivos é debida en parte ao crecemento de bacterias que reciclan o nitróxeno excretado polos rotíferos e que ao mesmo serven de alimento (Hino et al ., 1997). Cultivos semicontinuos. Neste tipo de cultivos unha parte do cultivo é retirada diariamente e reemprazada por auga de mar. A taxa de renovación está determinada pola taxa de crecemento da poboación. Os rotíferos son alimentados con levadura e a densidade de cultivo oscila entre 100 e 300 individuos/ml. A acumulación dos produtos de excreción e dos residuos da dixestión pode dar lugar ao colapso do cultivo, que pode evitarse acoplando un sistema de recirculación para eliminar a materia orgánica particulada para ser posteriormente descomposta e utilizada como fertilizante para cultivos microalgais. Esta variante do cultivo semicontinuo denomínase “cultivo feed-back” (Lubzens, 1987; 2003). Controlando a calidade da auga e alimentando cunha dieta artificial poden conseguirse densidades de 3.000 rotíferos/ml mantendo unha taxa de renovación do 20% (Suantika et al ., 2000). En xeral, os sistemas de cultivo son os mesmos independentemente da cepa ou especie de rotífero que se cultive, aínda que as condicións de cultivo si deben ser modificadas coa finalidade de obter as máximas produtividades. A temperatura de cultivo de Brachionus rotundiformis pode variar entre os 25 ºC e __________________________________________________________________Introdución 11 os 35 ºC, mentres que para cultivar B. plicatilis debe manterse entre 20 ºC e 25 ºC (Lubzens, 2003). As diferentes taxas de crecemento das dúas especies tamén deben terse en conta para axustar a taxa de dilución no caso dos cultivos semicontinuos (James e Abu-Rezeq, 1989; Navarro e Yúfera 1998). A utilización de microalgas encarece notablemente o cultivo de rotíferos. 18 litros de Chlorella concentrada (20.000 × 106 células/ml) custaban en 2001 entre 140 e 150 $. Aínda así, as microalgas son imprescindibles se se queren realizar cultivos de rotíferos a moi elevadas densidades (Hagiwara et al ., 2001). Pero o alimento habitualmente usado na produción de rotíferos é a levadura de panadería ( Saccharomyces cerevisiae ), moito máis barata e fácil de obter e de almacenar. Os rotíferos cultivados con levadura presentan taxas reproductivas máis baixas que os alimentados con microalgas (Yúfera e Pascual, 1980; Carić et al ., 1993; Lubzens et al ., 1995), aínda que non todos os autores atopan estas diferencias (Tamaru et al ., 1993). O principal inconveniente da levadura é que os rotíferos cultivados con esta dieta carecen de ácidos graxos poliinsaturados de cadea longa (Watanabe et al ., 1983). Os rotíferos reflexan a composición bioquímica do alimento que consumen (Whyte e Nagata, 1990; Frolov et al ., 1991; Whyte et al ., 1994), así que polo tanto a selección da dieta pode ser de crucial importancia, xa que en última instancia determina o valor nutritivo dos rotíferos. Aínda que os rotíferos posúen a dotación enzimática necesaria para sintetizar ácidos graxos ω-3 de cadea longa, a taxa de síntese é demasiado lenta para que cheguen a acumularse grandes cantidades de DHA e EPA se o rotífero non os recibe a través da dieta (Lubzens et al ., 1985). Por este motivo, antes de ser ofrecidos ás larvas os rotíferos son sometidos a un enriquecemento, incubándoos durante un determinado intervalo con dietas que lles aportan os nutrintes esenciais para as larvas de peixe, principalmente ácidos graxos poliinsaturados da serie ω-3. Para enriquecer os rotíferos poden utilizarse microalgas mariñas, emulsións lipídicas ou micropartículas de diversas composicións (Coutteau e Sorgeloos, 1997; Dhert et al ., 2001). As técnicas de enriquecemento de rotíferos soen clasificarse en curtas (“short-term enrichment”) ou longas (“long-term enrichment”), pero as características de cada unha delas non están claramente definidas. Algúns autores opinan que un enriquecemento curto debe ter unha Introdución__________________________________________________________________ 12 duración inferior a 8 h (Coutteau e Sorgeloos, 1997), mentres que para outros este tipo de enriquecemento pode prolongarse ata as 24 h e consideran enriquecementos longos aqueles que duran varios días, periodo no que se produce un crecemento da poboación de rotíferos (Rainuzzo et al ., 1994). O obxectivo principal do enriquecemento é elevar o contido de EPA e DHA dos rotíferos, conseguindo ademais unha relación DHA/EPA igual ou superior a 2 para satisfacer os requerimentos nutricionais das larvas. Os datos sobre o grao de acumulación de ácidos graxos poliinsaturados en rotíferos durante periodos curtos de enriquecemento son variados, pero diversos autores coinciden en que para obter os maiores contidos de lípidos e ácidos graxos son necesarios enriquecementos de entre 12 e 24 h (Ando et al ., 2004; Fernández-Reiriz et al ., 1993; Frolov et al ., 1991; Rodríguez et al ., 1996). Por outra banda, durante os enriquecementos longos os lípidos inxeridos son dixeridos, absorbidos e incorporados aos tecidos dos rotíferos en forma de novas moléculas lipídicas, e isto pode reducir a dispoñibilidade de certos ácidos graxos para as larvas de peixe. O DHA e o EPA nos triacilglicéridos dos rotíferos tenden a incorporarse na posición sn -3 e en menor medida, na sn -1 (Ando et al ., 2004), mentres que as lipasas pancreáticas dos peixes eliminan o ácido graxo situado na posición sn -1 dos triacilglicéridos e fosfolípidos e conservan o situado na posición sn -2, que permanece no novo lípido que se forme a partir da molécula orixinal (Bell et al ., 2003). Deste xeito, os enriquecementos longos poderían provocar que parte do EPA e o DHA non fose ben asimilada polas larvas alimentadas con eses rotíferos. Axustar o tempo de enriquecemento podería axudar a optimizar a acumulación dos diversos nutrintes nos rotíferos. A porcentaxe de proteína tende a incrementarse coa duración do enriquecemento, mentres que a porcentaxe de glícidos se reduce, e ao cabo de 6 h obtéñense os valores máximo e mínimo respectivamente (Frolov et al ., 1991). Fernández-Reiriz et al . (1993) tamén sinalan diferencias significativas nas porcentaxes de proteínas e glícidos ás 6 h de enriquecemento respecto dos rotíferos iniciais. Prolongar o periodo de enriquecemento parece ser necesario para enriquecer os rotíferos cun contido elevado de ácido ascórbico (Brown et al ., 1998). Porén, nalgúns casos o enriquecemento curto dá mellores resultados xa que prolongalo pode provocar a __________________________________________________________________Introdución 13 degradación dos nutrintes que se queren incorporar aos rotíferos, como no caso da astaxantina (Domínguez et al ., 2005). As posibilidades de modificar o perfil de aminoácidos nos rotíferos son máis limitadas. Tanto o contido de proteína como o de aminoácidos libres poden variar co estado nutricional do rotífero (Frolov e Pankov, 1992; Øie et al ., 1997), pero a composición da proteína é moi estable e non varía co tipo de alimentación (Frolov et al ., 1991). A composición de aminoácidos libres pode ser manipulada, pero os rotíferos presentan o inconveniente de que unicamente un 3% aproximadamente dos seus aminoácidos totais son aminoácidos libres (Øie et al ., 1997). O enriquecemento pode incrementar a porcentaxe de aminoácidos libres nos rotíferos e tamén en Artemia , especialmente cando se utilizan microalgas, máis vantaxosas que os enriquecedores comerciais (Aragão et al ., 2004). O papel das microalgas na acuicultura: valor nutritivo e técnicas de produción As microalgas mariñas están consideradas un alimento excelente para o enriquecemento de rotíferos (Dhert et al ., 2001), e posúen ademais outras aplicacións no cultivo larvario de peixes. A adición de microalgas nos tanques de larvas, técnica coñecida como “auga verde”, permite que os rotíferos se sigan alimentando e conserven o seu valor nutritivo (Reitan et al ., 1993; Øie et al ., 1997), mentres que en ausencia de microalgas os rotíferos poden perder ata un 50% da súa biomasa e proteínas en 4 días (Makridis e Olsen, 1999) e un 20% diario do contido de lipidos (Reitan et al ., 1993). A presencia de microalgas nos tanques de cultivo larvario probablemente modifica as comunidades bacterianas dos mesmos e contribúe ao establecemento da flora microbiana no tracto dixestivo das larvas (Reitan et al ., 1997). As larvas consumen parte destas microalgas, aínda que a súa capacidade de dixerilas é variable (Reitan et al ., 1997). A pesar das múltiples propiedades das microalgas, os inconvenientes derivados do custo e a complexidade de produción (Duerr et al ., 1998) fan que o seu uso como enriquecedores para os rotíferos sexa limitado, utilizándose Introdución__________________________________________________________________ 20 rotíferos un elevado contido de EPA (Watanabe et al ., 1983). Isochrysis aff. galbana Clon T-ISO constitúe un bo alimento para as larvas de bivalvos, aínda que debe combinarse cunha diatomea (Ewart e Epifanio, 1981; Helm e Laing, 1987). T-ISO tamén se utiliza no enriquecemento de rotíferos e nas técnicas de “auga verde” polo súa elevada porcentaxe de DHA (Øie et al ., 1997). 21 ____________________________Obxectivos 22 __________________________________________________________________Obxectivos 23 Obxectivo xeral Estudo das condicións óptimas para o cultivo en réxime semicontinuo de dúas microalgas mariñas ( Nannochloropsis gaditana e Isochrysis aff. galbana Clon T-ISO) para a mellora do perfil bioquímico de Brachionus plicatilis en experimentos de enriquecemento e cultivo, mediante a variación da taxa de renovación e da intensidade luminosa. Obxectivos particulares Estudo do efecto da dispoñibilidade de luz e de CO2 sobre a composición bioquímica de Isochrysis aff. galbana (Clon T-ISO) en cultivo discontinuo. Estudo do efecto da taxa de renovación e da intensidade luminosa sobre a composición bioquímica de Isochrysis aff. galbana (Clon T-ISO) en cultivo semicontinuo. Estudo do efecto da taxa de renovación sobre a composición bioquímica de Nannochloropsis gaditana en cultivo semicontinuo. Estudo das modificacións na composición bioquímica de Brachionus plicatilis producidas polo enriquecemento durante 24 h con Nannochloropsis gaditana e Isochrysis aff. galbana (Clon T-ISO) cultivadas en sistema semicontinuo con distintas taxas de renovación. Cultivo de Brachionus plicatilis con Isochrysis aff. galbana (Clon T-ISO) procedente de cultivo semicontinuo: efecto da taxa de renovación do cultivo microalgal sobre o crecemento poboacional e a composición bioquímica do rotífero. Estudo do efecto da utilización de distintas cantidades da microalga Nannochloropsis gaditana cultivada en sistema semicontinuo sobre a composición bioquímica de Brachionus plicatilis . Estudo de efecto do tempo de enriquecemento con Nannochloropsis gaditana e Isochrysis aff. galbana (Clon T-ISO) cultivadas en sistema semicontinuo sobre a composición de ácidos graxos de Brachionus plicatilis . Estudo da acumulación de oligoelementos nas microalgas Nannochloropsis gaditana e Isochrysis aff. galbana (Clon T-ISO) en cultivo semicontinuo e en Brachionus plicatilis alimentado con estas microalgas. 24 25 ____________________Materiais e métodos 26 ___________________________________________________________Materiais e métodos 27 Sistemas de cultivo de microalgas e rotíferos Para o cultivo de microalgas utilizáronse minifotobiorreactores tubulares de vidro, de fondo cóncavo e 30 mm de diámetro, con 80 ml de volume de cultivo. Cada tubo conectouse a un sistema de aireación que proporcionou un fluxo de aire continuo de 230 ml/min, suplementado durante o periodo de luz con pulsos de de CO2 de 10 s de duración cada 10 min, coa finalidade de proveer os cultivos dunha fonte de carbono inorgánico e ao mesmo tempo manter o pH entre 7,5 e 8. Os biorreactores mantivéronse nunha cámara de cultibvo a unha temperatura de 22 ºC e un fotoperiodo circadiano de 12 h de luz e 12 h de escuridade. A iluminación consistiu en tubos fluorescentes Mazda Fluor Lumière du Jour 36W/LJ (Figura 1). Outro sistema de cultivo empregado (Capítulo 9) consistiu en botellas de 90 mm de diámetro e 1 l de capacidade con 900 ml de cultivo mantidas nas mesmas condicións que os fotobiorreactores. Figura 1. Sistema de cultivo de microalgas en fotobiorreactores de 80 ml. Isochrysis aff. galbana Clon T-ISO (arriba) e Nannochloropsis gaditana (abaixo). Materiais e métodos___________________________________________________________ 28 O medio de cultivo preparouse autoclavando auga de mar a 120 ºC durante 20 minutos, axustando previamente a salinidade a 3,5% cun refractómetro Atago S/mill. Unha vez autoclavada e fría, enriqueceuse con nutrintes inorgánicos e orgánicos nas seguintes concentracións: KNO3, 4 mM; NaH2PO4, 0,22 mM; ZnCl2, 2,29 µM; MnCl2, 3,4 µM; NaMoO4, 2,72 µM; CoCl3, 0,38 µM; CuSO4, 0,46 µM; citrato férrico, 21,2 µM; tiamina, 1 mg/l; biotina, 13,4 µg/l; vitamina B12, 9,4 µg/l; EDTA, 4,7 mg/l (modificado de Fábregas et al ., 1984). Nos cultivos realizados en botellas a concentración de KNO3 foi 2,5 mM e tódolos demais nutrintes engadíronse en proporción. Os fotobiorreactores –tubos e botellas– inoculáronse cunha densidade inicial de microalgas correspondente ao 10% ou 15% da densidade celular máxima alcanzada na fase estacionaria. Os cultivos deixáronse medrar ata o final da fase logarítmica. Considerouse que se alcanzara a fase estacionaria cando a densidade celular se mantiña constante durante tres días consecutivos como mínimo. Nese momento iniciouse o réxime semicontinuo. Basicamente, o sistema de cultivo semicontinuo consiste en retirar diariamente unha parte do cultivo, Figura 2. Sistema de cultivo de Nannochloropsis gaditana e Isochrysis aff. galbana T-ISO en botellas de 1 l. ___________________________________________________________Materiais e métodos 29 substituíndoo por medio fresco. Esta operación realízase durante a primeira hora do ciclo de luz, que segundo os estudios existentes é o momento máis conveniente (Otero, 1995). A porcentaxe de volume de cultivo que se retira denomínase taxa de renovación. Nos experimentos realizados as taxas de renovación empregadas foron o 10%, 20%, 30%, 40% e 50%, que corresponden a taxas de crecemento de 0,2, 0,4, 0,6, 0,8 e 1,0 divisións/día. O estado de estabilización alcánzase cando a densidade celular nos cultivos se mantén constante durante polo menos tres días consecutivos. O rotífero Brachionus plicatilis cultivouse de forma rutinaria en botellóns de 6 l con auga de mar autoclavada durante 20 min a 120 ºC, sometido a aireación suave e fotoperiodo circadiano de 12 h de luz e 12 h de escuridade nunha cámara de cultivo a 22 ºC. Diariamente os rotíferos foron alimentados con microalgas frescas de varias especies: Tetraselmis suecica , Nannochloropsis gaditana , Isochrysis galbana , Isochrysis aff. galbana clon T-ISO, Rhodomonas lens e Phaeodactylum tricornutum . Aproximadamente cada quince días os rotíferos filtrábanse e pasábanse a un novo botellón con auga de mar limpa. Este proceso realizouse tamén dous días antes de iniciar os experimentos con rotíferos. Para realizar os experimentos de enriquecemento e cultivo os rotíferos transferíronse a botellas de 1 l de capacidade, sometidos a un fluxo de aire de 120 ml/minuto aproximadamente e un ciclo de luz:escuridade 12 h:12 h cun tubo fluorescente Mazda Fluor Lumière du Jour 36W/LJ (Figura 3). A intensidade luminosa foi de 54 µmoles quanta/m2/s. Figura 3. Sistema de cultivo do rotífero Brachionus plicatilis en botellas de 1 l. Materiais e métodos___________________________________________________________ 36 Determinación do contido de glícidos en biomasa e sobrenadante Todos os métodos propostos para a determinación de glícidos totais son colorimétricos e derivan do test de Molish para glícidos; implican o quencemento do material con ácido sulfúrico concentrado e un composto causante de cor que usualmente é unha amina aromática ou un fenol (Herbert et al ., 1971). O fenol é un alcool moi reactivo que reacciona cos glícidos dando lugar a un complexo coloreado de tonalidade entre amarelo e marrón, segundo a concentración de glícidos. Esta relación é lineal a unha lonxitude de onda de 485 nm. O método fenol-sulfúrico (Dubois et al ., 1956) continúa a ser o máis empregado e a penas foi modificado. É moi insensible á interferencia con proteínas e a cor producida é moi estable. Existe a posibilidade de interferencia polas pentosas compoñentes dos ácidos nucleicos, pero a súa simplicidade fai que sexa o método máis estendido neste tipo de investigacións (Kochert, 1978). O nitrato tamén interfire cando se determina o contido de exopolisacáridos en mostras de medio de cultivo, pero este problema pode evitarse diluíndo a mostra. Para a determinación do contido de glícidos en biomasa utilizáronse 4-5 mg da mostra de rotíferos liofilizada ou 2-5 ml de cultivo microalgal centrifugado (3.100 rpm, 15 min) e posteriormente conxelado. Resuspendeuse a biomasa en 4 ml de NaOH 1 N. As mostras tratáronse nun disruptor ou nun sonicador para facilitar a hidrólise. Deste hidrolizado repartíronse por triplicado alícuotas de 0,5 a 1 ml. Se o volume era inferior a 1 ml, completouse ata esta cantidade con NaOH 1 N. Preparouse tamén un branco con 1 ml de NaOH 1 N e unha recta patrón cunha disolución de glucosa anhidra 0,1 mg/ml en NaOH 1 N que se repartiu en tubos con 0,2, 0,4, 0,6, 0,8 e 1 ml, enrasándose os tubos ata 1 ml con NaOH 1 N. Ós tubos engadíronselles 25 µl de fenol ao 80% en auga destilada e mesturáronse ben nun axitador vórtex. Inmediatamente adicionáronse 2,5 ml de ácido sulfúrico concentrado (riqueza 95,5 %, d=1,84), dirixindo a caída do ácido cara á superficie do líquido e axitando o tubo no vórtex. Despois de repousar 30 min a temperatura ambiente, a absorbencia das mostras leuse a 485 nm nun ___________________________________________________________Materiais e métodos 37 espectrofotómetro HP8453-DA en cubetas de vidro de 1 cm contra o branco. Os valores da mostra de glucosa axustáronse a unha recta por mínimos cadrados da que por extrapolación se calculou o contido de glícidos das mostras problema. Para determinar o contido de exopolisacárido en mostras de sobrenadante do cultivo de T-ISO o sobrenadante foi diluído nunha proporción 1:5 con auga de mar autoclavada. Desta dilución repartíronse alícuotas de 1 ml ás que se lles engadiron directamente 25 µl de fenol ó 80% e 2,5 ml de ácido sulfúrico. Deixáronse repousar 30 minutos e leuse a absorbencia a 485 nm. O branco consistiu en auga de mar autoclavada. Cálculo do valor calórico da biomasa O valor calórico calculouse a partir do contido de proteínas, lípidos e glícidos obtido mediante as técnicas analíticas anteriormente descritas, utilizando as fórmulas de conversión propostas polo National Research Council (1977): Valor calórico (Kcal/g)=(5,72×peso proteína) + (9,50×peso lípidos) + (4,03×peso glícidos) A conversión de calorías a joules realizouse tendo en conta a relación 1 caloría = 4,185 joules Determinación do contido de pigmentos O contido de pigmentos determinouse mediante un método espectrofotométrico que permite obter os contidos celulares das distintas clases de clorofilas pero non permite distinguir entre os distintos carotenoides, polo que Materiais e métodos___________________________________________________________ 38 se determinou o contido de carotenoides totais. Os tubos contendo mostras de 2 ou 5 ml de cultivo de microalgas previamente centrifugadas e conxeladas recubríronse con papel de aluminio e mantivéronse en xeo durante todo o proceso de extracción para evitar a degradación dos pigmentos pola acción da luz ou do osíxeno. A estas mostras engadíronselles 3 ml de acetona ao 90% (diluída con auga destilada) e sonicáronse durante 1 min. Tras a sonicación centrifugáronse durante 15 minutos a 4 ºC e 3.100 rpm nunha centrífuga Hettich Universal 32R. O sobrenadante transferiuse a unha cubeta de vidro de 1 cm para a determinación espectrofotométrica do contido de pigmentos nun espectrofotómetro HewlettPackard 8453E-DA. A absorbencia (A) das mostras mediuse ás lonxitudes de onda 480, 630, 664 e 667 nm. Os cálculos realizáronse mediante as ecuacións propostas por Jeffrey e Humphrey (1975) para a determinación de clorofilas e as de Strickland e Parsons (1972) para a determinación de carotenoides totais: Clorofila a (μg/ml)=11,47 A664 − 0,40 A630 Clorofilas c 1 + c 2 (μg/ml)=24,36 A647 − 3,73 A630 Carotenoides totais (μg/ml)= 4 A480 O contido de clorofilas c pode ser subestimado se é moito menor que o contido de clorofila a ; aínda así as ecuacións de Jeffrey e Humphrey (1975) son máis precisas que outras ecuacións (Jeffrey e Welschmeyer, 1997). Análise de ácidos graxos A obtención dos ácidos graxos consta de dúas fases. En primeiro lugar realízase unha extracción dos lípidos da mostra e a continuación o extracto lipídico é esterificado para obter os ésteres metílicos dos ácidos graxos que serán analizados nun cromatógrafo de gases. ___________________________________________________________Materiais e métodos 39 A extracción dos lípidos realizouse segundo o método de Bligh e Dyer (1959) a partir de mostras conxeladas de cultivo de microalgas fresco e centrifugado (3.100 rpm, 15 min) ou de 4-5 mg de rotífero tamén conxelados. Os lípidos extraéronse con 3 ml de CHCl3:CH3OH (1:2 v:v). Para facilitar a extracción as mostras de rotífero deixáronse repousar a 4 ºC durante 30 minutos e posteriormente tratáronse cun disruptor celular durante 5 min, igual que as mostras de Nannochloropsis gaditana . As mostras de T-ISO tratáronse cun sonicador durante 1 minuto. En todo momento os tubos contendo as mostras mantivéronse en xeo e tapados con papel de aluminio para evitar no posible a degradación dos ácidos graxos. Os extractos lipídicos centrifugáronse durante 10 minutos e recolleuse o sobrenadante, engadíndose 1,8 ml de auga destilada e 1,8 de CHCl3. Separáronse as fases por centrifugación e eliminouse a fase acuosa. Á fase apolar engadíronselle 50 µl dunha disolución 1 mg/ml de triheptadecanoína (Sigma) como estándar interno. Evaporouse o cloroformo mediante un fluxo de N2 e os extractos lipídicos foron sometidos a metanolise mediante a adición de 2 ml de HCl:CH3OH ao 5% en peso e tratamento a 85 ºC durante 2,5 horas (Sato e Murata, 1988). Os metilésteres dos ácidos graxos obtidos separáronse da fase polar mediante unha dobre extracción con hexano e foron concentrados por evaporación con N2 do disolvente ata un volume de 100 ou 200 µm, dependendo do grado esperado de concentración dos ácidos graxos. A separación e identificación dos ácidos graxos realizouse nun cromatógrafo de gases GC8000 Series acoplado a un espectrómetro de masas MD800 Perkin-Elmer, usando unha columna OmegawaxTM 250 fused silica (Supelco) de 30 m de lonxitude e 0,25 mm de diámetro. As condicións da análise foron as seguintes: volume inxectado, 1 µl; gas portador, He; fluxo de gas portador na columna, 0,8 ml/min; relación split, 1,99; temperatura inxector, 230 ºC. Método do cromatógrafo: tempo de splitless, 1 min; rango de temperaturas, 1 min a 35 ºC, rampa de 35 ºC/min ata 200 ºC e 45 min a 200 ºC. Método de adquisición de espectros de masas: retardo do solvente, 4,5 min; rango de masas, 10-400; tempo interscan, 30 s. Os ácidos graxos foron identificados mediante a comparación dos espectros de masas cos espectros contidos na base de datos de espectros de Materiais e métodos___________________________________________________________ 40 masas NIST e WILEY. Esta identificación foi conrfirmada mediante a comparación cun patrón comercial de metilésteres de ácidos graxos PUFA-3 (Metreya Inc., Pleasant Gap, PA, USA). O cálculo da concentración realizouse mediante a integración da área dos picos, que no sistema GC-MS é directamente proporcional á masa. Determinación do contido de oligoelementos A determinación do contido de metais e algúns elementos non metálicos realizouse mediante espectrometría de emisión óptica con plasma acoplado inductivamente (ICP-OES). Nesta técnica, a mostra é normalmente transportada ó interior do aparello coma unha corrente líquida que se converte nun aerosol mediante o proceso coñecido como nebulización. A mostra en forma de aerosol transpórtase ó plasma, onde é desolvatada, vaporizada, atomizada e excitada e/ou ionizada polo plasma. O plasma é formado con un fluxo de argon que pasa a través de un campo de radiofrecuencia onde é mantido nun estado de ionización parcial. Isto permite alcanzar temperaturas moi altas, de aproximadamente uns 10.000 ºC. A alta temperatura, a maior parte dos elementos emiten luz nunha lonxitude de onda característica. Esta radiación é detectada e pódese converter en información sobre concentración. A luz dos diferentes elementos que compoñen as mostras é separada en diferentes lonxitudes de onda por medio dunha renxela e é capturada por detectores sensibles á luz, un por cada elemento a analizar. Isto permite a análise de máis de 70 elementos químicos nunha mostra. En termos de sensibilidade, pódese comparar á absorción atómica de chama, aínda que os límites de detección atópanse normalmente en soluciones acuosas a niveis de μg/L. O equipo utilizado foi un ICP-OES da marca PerkinElmer, modelo Optima 4300 DV. O tratamento das mostras conxeladas de microalgas e as mostras liofilizadas de rotífero consistiu nunha hidrólise en ácido nítrico ao 65% a 90 ºC durante 2 h. A continuación as mostras filtráronse e diluíronse con auga MilliQ ata ___________________________________________________________Materiais e métodos 41 unha concentración de ácido nítrico do 6,5%. Tamén se preparou un branco con ácido nítrico ao 65% que se someteu ao mesmo tratamento que as mostras. Tratamento estatístico das mostras Para realizar o tratamento estatístico utilizouse o software SPSS para Windows versión 14.0. Empregáronse tests non paramétricos debido ao pequeno tamaño das mostras (n<30), que impediu axustalas a unha distribución normal estándar. A comparación das medias de dúas mostras realizouse mediante o test U de Mann-Whitney (Capítulos 1, 2, 3, 4, 7 e 8), mentres que para comparar as medias de máis de dúas mostras aplicouse o test H de Kruskal-Wallis (Capítulo 8). 42 43 __________Descrición das especies utilizadas 44 ________________________________________________Descrición das especies utilizadas 45 Isochrysis aff. galbana (Clon T-ISO) Pertence á Division Prymnesiophyta, Clase Prymnesiophyceae, Orde Isochrysidales, Familia Isochrysidaceae, Xénero Isochrysis . A clase Haptophyceae (=Prymnesiophyceae) foi proposta por Christensen (1962) para acomodar a unha serie de organismos naquel momento incluídos na división Chrysophyta e que presentaban unhas características morfolóxicas que os diferenciaban doutras crisófitas. Máis adiante considerouse necesario crear unha nova división, Prymnesiophyta, e tamén se propuxo cambiar o nome da clase de Haptophyceae a Prymnesiophyceae (Hibberd, 1796). Coñécense uns 50 xéneros e aproximadamente 500 especies de primnesiófitas (Green et al ., 1990), pero constantemente descóbrense novas especies. As primnesiófitas poden medir ata 30 µm de diámetro pero a maioría das especies teñen un tamaño comprendido entre 2 e 20 µm (Jeffrey e Vesk, 1997). Son de cor amarela-marrón e presentan variedade de formas, podendo ser esféricas, ovaladas, elipsoidais, fusiformes ou aplanadas (Heimdal, 1993). A maioría son de vida libre, móbiles, cocoides ou palmeloides, pero tamén hai especies formadoras de colonias e filamentos (Green et al ., 1990). Case todas as primnesiófitas son mariñas aínda que hai algunhas especies de auga dóce. Algunhas presentan reproducción sexual con alternancia de fases haploides e diploides (Gayral e Fresnel, 1983; Green et al ., 1990). Nas formas filamentosas algunhas células divídense dando 8 ou 16 células flaxeladas que se dispersan para dar lugar a novos filamentos (Green e Parke, 1975). As células están recubertas de escamas que poden estar ou non calcificadas; as especies que presentan placas calcificadas –cocolitos– denomínanse cocolitofóridos. As escamas están compostas de polisacáridos e proteínas. Fórmanse no complexo de Golgi e libéranse na superficie da célula mediante a fusión da vesícula que as contén coa membrana plasmática (Klaveness e Paasche, 1979; Hibberd, 1980; Romanovicz, 1981). Os cocolitos sintetízanse tamén no Golgi ou nun sistema vacuolar independente. Posúen dous flaxelos isocontos lisos, coa excepción da orde Pavlovales na que os flaxelos son diferentes. Na maioría das especies asociado aos flaxelos Descrición das especies utilizadas________________________________________________ 52 no cerebro. Os rotíferos poden responder positivamente ós estímulos luminosos ou amosarse indiferentes á luz. As poboacións de rotíferos están constituídas case na súa totalidade por femias e na maioría das especies a reproducción é partenoxenética. Os machos son máis pequenos que as femias, miden como máximo unha cuarta parte do seu tamaño. Son raros e na clase Bdelloidea non existen en absoluto. A fecundación ten lugar por impregnación hipodérmica. Figura 4. Ciclo biolóxico de Brachionus plicatilis (modificado de Lubzens, 2003). ________________________________________________Descrición das especies utilizadas 53 As femias da clase Monogononta teñen un único ovario que se abre á cloaca por un oviducto e unha glándula vitelóxena. Nas da clase Bdelloidea ou Digononta hai dous xermovitelarios (o ovario e a glándula vitelóxena aparecen combinados) cun oviducto común. Na clase Seisonidea as femias presentan dous ovarios pero non glándulas vitelóxenas. Os mecanismos reproductivos son diferentes en cada clase. Os bdelloideos reprodúcense exclusivamente por partenoxénese ao non haber machos. Polo contrario, na clase Seisonidea os machos sempre están presentes e os ovos teñen que ser fecundados, orixinando indistintamente machos e femias, e non hai partenoxénese. Os monogonontes teñen un ciclo máis complicado (Figura 4). Durante a maior parte do ano a poboación componse de femias diploides, chamadas amícticas porque producen ovos tamén diploides que se desenvolven partenoxeneticamente. En resposta a determinados factores que aínda non se coñecen ben, estes ovos amícticos orixinan femias mícticas, morfoloxicamente distintas ás anteriores. As femias mícticas producen por meiose ovos haploides, que en ausencia de fecundación dan lugar a machos. Estes machos fecundan ás femias mícticas, que entón producirán ovos diploides dotados dunha cuberta grosa, permanecendo como formas de resistencia que darán novamente femias, mícticas ou amícticas (Barnes, 1987, Meglitsch, 1972). A salinidade, a densidade de poboación e a temperatura inflúen na producción de femias mícticas e por tanto na reproducción sexual en Brachionus plicatilis (Snell, 1986). Outros factores implicados en distintas especies de rotíferos son o xenotipo, a dieta ou o fotoperiodo. A porcentaxe de femias mícticas na poboación está relacionada coa taxa de reproducción asexual. Cando a salinidade sobrepasa o 3,5% non se observa mixis en B. plicatilis , pero en salinidades máis baixas increméntase tanto a taxa de reproducción asexual coma a porcentaxe de femias mícticas (Lubzens et al . , 1985). A temperatura exerce un efecto similar, reducíndose significativamente o número de femias mícticas a partir dos 28 ºC (Snell, 1986). Nun medio cunha salinidade alta, a taxa de filtración do rotífero disminúe, reducíndose así a inxestión de comida; nestas condicións predomina a reproducción asexual. Un ambiente favorable sen limitacións de alimento permitiría a reproducción sexual. Isto parece acontecer no xénero Asplanchna , no Descrición das especies utilizadas________________________________________________ 54 que a presencia de α-tocoferol no medio indicando a dispoñibilidade de alimento induce a mixis (Gilbert, 1980). Altas densidades poboacionais nun cultivo tamén fan incrementar a proporción de femias mícticas. Probablemente o estímulo é algún metabolito liberado polos propios rotíferos, pois obtense o mesmo resultado cando un pequeno número de rotíferos se cultiva nun medio no que previamente se mantivo unha poboación moi densa (Carmona et al ., 1993). Esa substancia podería actuar como un sinal para a producción de ovos de resistencia ante un posible deterioro do hábitat debido á sobreexplotación. Así, algúns autores consideran que a mixis responde a un fenómeno de inducción por un factor que indica que o ambiente é favorable, como sería a presencia de α-tocoferol, ou ao contrario, por un factor que indica unha degradación das condicións ambientais, por exemplo unha alta concentración de metabolitos causada por unha densidade poboacional excesiva. Pola contra, outros autores (Snell, 1986) sosteñen que a reproducción sexual non responde a un factor inductor, senón que ten lugar de forma habitual nos ambientes favorables, e é reprimida cando as condicións se volven extremas, sendo entón substituída pola reproducción asexual. Brachionus plicatilis é unha especie nadadora cun tamaño arredor dos 240 µm de longo e 170 µm de ancho en estado adulto (Serra et al ., 1998). Os rotíferos do xénero Brachionus poden alimentarse de diversos tipos de partículas (microalgas, bacterias, levaduras ou micropartículas artificiais) xa que soamente seleccionan o alimento en función do seu tamaño, e os individuos máis grandes prefiren partículas de maior tamaño (Rothhaupt, 1990). Brachionus é capaz de tolerar amplos rangos de variación nas condicións ambientais. Pode vivir en augas cunha salinidade entre o 0,1 e o 6%, podendo ser cultivado perfectamente en auga de mar sen diluír, aínda que para conseguir as máximas taxas de reproducción a salinidade debe estar entre o 0,4 e o 3,5% (Walker, 1981). É unha especie particularmente termofílica. Nos cultivos de anguía aparece a finais da primavera, cando a temperatura da auga é de 17-20 ºC e desaparece en decembro, cando a temperatura disminúa ata os 10 ºC, quedando os ovos latentes como formas de resistencia no fondo dos tanques (Fukusho, 1989). A temperatura óptima depende da cepa, alcanzándose as máximas taxas de reproducción entre os 25 ºC e os 35 ºC (Lubzens, 1987), aínda que algunhas ________________________________________________Descrición das especies utilizadas 55 cepas poden reproducirse mesmo cando a temperatura baixa ata os 5 ºC (Iwamoto e Fukusho, 1980). O rango de pH que poden tolerar vai de 5 a 10 (Ito, 1980). A concentración óptima de osíxeno no medio é 5-7 ppm (Abe et al ., 1982). Os rotíferos utilizados proceden das instalacións de INSUIÑA S. L. en Mougás, Oia (Pontevedra). 56 57 ____________________________Capítulo 1. Cultivo discontinuo de Isochrysis aff. galbana (Clon T-ISO). Efecto da suplementación con CO2 e da intensidade luminosa 58 __________________________________________Capítulo 1. Cultivo discontinuo de T-ISO 59 Introdución As microalgas do xénero Isochrysis , entre elas Isochrysis aff. galbana (Clon T-ISO), acumulan glícidos tanto en resposta á carencia de nutrintes (Fernández-Reiriz et al ., 1989) como en condicións de elevada intensidade luminosa (Sukenik e Wahnon, 1991), pero non se atopan na literatura referencias á producción de exopolisacáridos por parte destas especies. Porén, en ensaios de cultivo semicontinuo de T-ISO con intensidades luminosas elevadas reallizados no noso laboratorio presentáronse problemas que poderían estar relacionados coa sínteses deste tipo de compostos. Nos cultivos con altas taxas de renovación e polo tanto sometidos a unha radiación luminosa elevada, observouse a formación de agregados celulares que os facían inservibles para o seu uso en acuicultura, acompañada dun gran crecemento bacteriano que finalmente provocaba a morte das células (Figura 1). Nos cultivos con taxas de renovación baixas, que presentaban unha gran densidade celular, a viscosidade do medio de cultivo era tan alta que as células non se depositaban mesmo despois de permanecer 24 horas en repouso (Figura 2). Este fenómeno facía imposible a recollida de Figura 1. Formación de flóculos nun cultivo semicontinuo de T-ISO cultivado con taxa de renovación e intensidade luminosa elevadas. Figura 2. Mostras de cultivos semicontinuos de T-ISO recén recollidas (arriba) e despois de 24 h (abaixo). Unicamente se depositan as células dos cultivos con taxas de renovación altas (as taxasde renovación están indicadas polas inscripcións nos tubos). Capítulo 1. Cultivo discontinuo de T-ISO__________________________________________ 60 mostras, tanto por centrifugación como por filtración. A tinción das células con Alcian Blue revelou que as células presentaban unicamente pequenas cantidades de exopolisacárido na súa superficie xa que fixaban moi pouco colorante. O exopolisacárido, se efectivamente se estaba a producir, debía ser liberado ao medio. Para tratar de solucionar este problema, é necesario establecer unhas condicións de cultivo que permitan obter unha alta produtividade de T-ISO reducindo ao mesmo tempo a producción de exopolisacárido. Neste primeiro experimento realizáronse cultivos batch nos que se modificaron dúas variables: a intensidade luminosa e o aporte de CO2. Deseño experimental A microalga mariña Isochrysis aff. galbana (Clon T-ISO, CCMP 1324) cultivouse en réxime discontinuo en biorreactores tubulares con 80 ml de volume de cultivo. A concentración de nitróxeno, en forma de KNO3, foi 4 mM. A composición detallada do medio de cultivo está descrita no apartado Materiais e métodos. Os cultivos sometéronse a un fluxo de aire de 230 ml/minuto, e a un réxime de luz:escuridade 12h:12h. Probáronse dúas intensidades luminosas distintas, 25 e 93 µmoles quanta/m2/s e dous tipos de aireación, con e sen aporte suplementario de CO2, xenerándose así catro condicións de cultivo diferentes, que se denominaron como se indica na Táboa 1. Empregáronse tres réplicas para cada condición (12 cultivos en total). A densidade celular inicial foi de 10×106 células/ml. Escolleuse unha densidade inicial relativamente alta para evitar a fotoinhibición durante os primeiros días de crecemento nos cultivos sometidos a unha intensidade luminosa elevada. Os cultivos deixáronse medrar e unha vez alcanzada a fase estacionaria –indicada por unha densidade celular constante durante un mínimo de tres días consecutivosrecolléronse mediante centrifugación mostras da biomasa microalgal para a determinación de proteínas, lípidos, glícidos e ácidos graxos, e mostras do medio de cultivo –o sobrenadante resultante da centrifugaciónpara a determinación do exopolisacárido producido polas células de T-ISO. __________________________________________Capítulo 1. Cultivo discontinuo de T-ISO 61 Resultados e discusión As densidades celulares na fase estacionaria foron notablemente maiores nos cultivos que recibiron un aporte suplementario de CO2, que alcanzaron densidades celulares arredor dos 50×106 células/ml, mentres que os cultivos que non recibiron CO2 tiveron unha densidade celular aproximada de 35×106 células/ml. O test U de Mann-Whitney indica diferencias significativas nas densidades celulares dos cultivos con e sen aporte de CO2 (p=0,004). Polo contrario, a intensidade luminosa non tivo influencia sobre a densidade celular. Os distintos cultivos non alcanzaron a fase estacionaria simultaneamente, xa que +C+L precisou só catro días para alcanzar a súa densidade máxima, mentres que os demais grupos entraron na fase estacionaria no 10º ou 11º día de cultivo (Táboa 2; Figura 3). En consecuencia, a taxa de crecemento ( r ) foi notablemente maior nos cultivos +C+L en comparación co resto dos grupos (Táboa 1). O carbono inorgánico pode ser un nutrinte limitante e o seu efecto positivo sobre a taxa de crecemento e a densidade celular do xénero Isochrysis xa foi demostrado (Kaplan et al ., 1986; Clark et al ., 1999). O pH foi maior nos cultivos que non recibiron CO2, entre 9 e 9,7, e nos que foron suplementados, a captación do CO2 fixo que o pH se incrementara durante a fase de crecemento expoñencial, de 7,5 a 8,7, experimentando un descenso na fase estacionaria (Figura 4). A pH 9 o carbono inorgánico está principalmente en forma de HCO3-. Aínda que Isochrysis galbana cultivada á concentración atmosférica de CO2 presenta anhidrasa carbónica externa, demostrouse que dispón dun mecanismo de transporte activo de HCO3- (Bhatti et al ., 2002). Outros autores sosteñen que a captación de HCO3en T-ISO é bastante ineficiente, polo que recomendan suplementar os cultivos con CO2 para asegurar densidades celulares altas (Camiro-Vargas et al ., 2005), tal e como demostran os con aporte de CO2sen aporte de CO2 alta luz +C+L -C+L baixa luz +C-L -C-L Táboa 1. Denominación dos grupos de cultivo, segundo as condicións de iluminación e aporte suplementario ou non de CO2. Capítulo 1. Cultivo discontinuo de T-ISO__________________________________________ 68 Os lípidos non formados por ácidos graxos que máis contribúen ao contido lipídico en T-ISO son as alquenonas, metil e etilcetonas de cadea formada por entre 36 e 39 carbonos e frecuentemente con dobres enlaces (Volkman et al ., 1989; Brown et al ., 1993). O contido de alquenonas increméntase en resposta a un aumento da intensidade luminosa ou á limitación por nitóxeno, e na fase estacionaria poden supoñer ata un 26% dos lípidos totais de T-ISO (Brown et al ., 1993; Dunstan et al ., 1993). No tocante aos pigmentos, os maiores contidos de clorofila rexistráronse nos cultivos non suplementados con CO2, pero a súa contribución ao contido total de lípidos é reducida (Figura 10). Entre as demais clases de lípidos “non acílicos”, os esterois están presentes unicamente en pequenas cantidades no xénero Isochrysis , entre un 0,2 e un 1,2 % dos lípidos, dependendo das condicións de cultivo e da fase de cultivo na que se recollen as mostras (Dunstan et al ., 1993; Volkman et al ., 1989). Non tódolos autores que fixeron estudos sobre a composición lipídica de Isochrysis citan a presencia de hidrocarburos, pero cando aparecen tamén o fan en porcentaxes moi pequenas, representando entre o 0,10% e o 0,57% do peso orgánico (Ben-Amotz et al ., 1985) ou o 0,4% dos lípidos en Isochrysis sp. (Volkman et al ., 1989). O perfil de ácidos graxos non variou moito coas distintas condicións de cultivo. A porcentaxe de ácidos graxos saturados+monoinsaturados estivo comprendida entre o 67,80% e o 72,57% do total, situándose a porcentaxe de ácidos graxos poliinsaturados entre o 26,25% e o 31,02% (Figura 9; Táboa 3). Figura 9. Contido de ácidos graxos saturados (), monoinsaturados () e poliinsaturados () de Isochrysis aff. galbana. Esquerda, expresado en porcentaxes sobre o total de ácidos graxos. Dereita, expresado en pg/célula. __________________________________________Capítulo 1. Cultivo discontinuo de T-ISO 69 Esta porcentaxe tan alta de ácidos graxos saturados e monoinsaturados é típica dos cultivos microalgais en fase estacionaria, nas que a maioría dos lípidos son triacilglicéridos ou outros lípidos de reserva. O maior contido por célula dos tres tipos de ácidos graxos correspondeu aos cultivos –C-L. Os ácidos graxos máis abundantes foron o 14:0, o 16:0, o 18:1ω-9, o 18:4ω-3 e o 22:6ω-3 (DHA). O 14:0 e o 18:4ω-3 foron máis abundantes nos cultivos privados de CO2 tanto en porcentaxe como en contido neto, e o 16:0 e o 18:1ω-9 alcanzaron porcentaxes maiores nos cultivos suplementados con CO2 pero os contidos por célula máis elevados obtivéronse nos cultivos sen CO2 (Táboa 3). En T-ISO, o 14:0 aparece sobre todo en glicolípidos e fosfolípidos, e o 18:4ω-3 é característico dos glicolípidos, mentres que os ácidos graxos 16:0 e 18:1ω-9 localízanse principalmente nos triglicéridos (Sukenik e Wahnon, 1991). A abundancia de 14:0 e 18:4ω-3 podería estar polo tanto relacionada cunha maior superficie de membrana fotosintética; as células procedentes dos cultivos –C+L e –C–L son máis novas, e os seus maiores contidos de clorofila e carotenoides (Figura 10; Táboa 2) reforzan esta posibilidade. A maior cantidade de lípidos nas células cultivadas sen CO2 implica tamén unha maior cantidade de triglicéridos, representados polos ácidos graxos 16:0 e 18:1ω-9. En canto ao DHA, as maiores porcentaxes obtivéronse nos cultivos sometidos a intensidade luminosa máis alta. O DHA é un ácido graxo característico dos fosfolípidos, pero en T-ISO unha fracción relativamente importante do mesmo atópase formando parte dos triacilglicéridos (Sukenik e Wahnon, 1991), que probablemente se acumularon en Figura 10. Contido celular de pigmentos en Isochrysis aff. galbana T-ISO. , clorofila a; , clorofilas totais; , carotenoides totais. Capítulo 1. Cultivo discontinuo de T-ISO__________________________________________ 70 resposta á elevada intensidade luminosa. Tzovenis et al . (1997) sinalan un efecto positivo da luz na acumulación de DHA en T-ISO tanto en porcentaxe como en contido celular en cultivos non suplementados con CO2. O aporte de CO2 deu lugar á porcentaxe máxima de DHA, pero o contido por célula foi maior nos cultivos –C+L debido ao seu maior contido total de ácidos graxos (Táboa 3). Nos dous casos os maiores valores obtéñense na fase expoñencial, pero a elevada densidade celular ao final da fase expoñencial resulta nunha maior produtividade final de DHA. Un incremento da porcentaxe de ácidos graxos poliinsaturados ao comezo da fase estacionaria tamén se observa en Isochrysis galbana (Fidalgo et al ., 1998). A modo de resume, pode concluírse que foi a dispoñibilidade de carbono o principal factor determinante do crecemento e da composición bioquímica de TISO. Nos cultivos suplementados con CO2, a maior parte do carbono destinouse á síntese de glícidos mentres que os cultivos limitados por carbono acumularon preferentemente lípidos. Nos cultivos non suplementados con CO2 a menor densidade celular permitiu ás células captar máis nitróxeno e sintetizar maiores cantidades de proteína. A maior duración da fase expoñencial implica que os cultivos medren lentamente e polo tanto que a idade das células sexa menor, polo que acumulan máis ácidos graxos típicos de lípidos de membrana. Curiosamente, a variación da intensidade luminosa non tivo efectos sobre a densidade celular final e afectou soamente de forma limitada á composición bioquímica de T-ISO. A intensidade luminosa máis elevada favoreceu unha maior síntese de proteínas e de DHA respecto dos cultivos sometidos a unha intensidade luminosa débil, pero o seu principal efecto foi estimular a producción de exopolisacárido nos cultivos con CO2. A diferente evolución dos cultivos discontinuos de T-ISO pode ser indicativa de como os factores estudados afectarían á microalga nun cultivo semicontinuo. Para o cultivo de T-ISO débese evitar o aporte excesivo de CO2 – coidando de non limitar o crecemento– e de luz, dado que os excedentes de carbono fixado na fotosíntese derívanse á formación de glícidos intracelulares, que reducen o valor nutritivo da microalga, e polisacáridos, que poden provocar a perda do cultivo debido á agregación celular e á proliferación de bacterias. __________________________________________Capítulo 1. Cultivo discontinuo de T-ISO 71 Táboa 2. Composición de Isochrysis aff. galbana (Clon T-ISO) cultivada en sistema discontinuo con e sen subministro de CO2 e dúas intensidades luminosas diferentes. +C+L, con CO2 e alta luz; +C-L, con CO2 e baixa luz; -C+L, sen CO2 e alta luz; -C-L, sen CO2 e baixa luz. +C+L +C-L -C+L -C-L Densidade celular (106 cél/ml±std) 47,38±2,76 51,38±5,30 32,58±2,55 34,19±4,23 Taxa de crecemento ( r ) 0,38 0,15 0,11 0,11 Produtividade (109 células/l/día) 3,64 3,95 2,51 2,63 Proteína (pg/cél±std) 4,12±0,77 3,79±0,19 6,06±0,27 5,54±0,32 Lípidos (pg/cél±std) 7,29±0,23 7,77±1,08 9,67±0,38 8,91±0,66 Glícidos en biomasa (pg/cél±std) 15,72±1,14 14,54±1,49 6,75±0,58 7,15±0,88 Exopolisacárido (pg/cél±std) 2,63±0,28 1,36±0,16 0,90±0,11 0,78±0,09 Total prot+líp+glúc (pg/cél±std) 28,83±1,38 27,46±1,75 23,38±1,21 22,24±1,64 Valor calórico (10-7 J/cél) 6,81 6,67 6,58 6,20 Proteína/ml (μg/ml±std) 185,12 ±7,71 194,70 ±9,72 197,51 ±8,72 189,28 ±11,06 Lípidos/ml (μg/ml±std) 345,53 ±11,11 399,00 ±55,35 315,11 ±12,48 304,50 ±22,60 Glícidos/ml (μg/ml±std) 762,35 ±21,52 747,08 ±76,73 219,86 ±18,98 244,60 ±30,07 Exopolisacárido/ml (mg/ml±std) 124,36 ±13,30 69,89 ±7,99 29,21 ±3,61 26,65 ±2,93 % proteína na F. O. 14,30 13,80 25,93 24,89 % lípidos na F. O. 25,30 28,28 41,37 40,05 % glícidos na F. O. 54,53 52,96 28,87 32,17 % EPS (no total dos glícidos) 15,11 8,55 11,77 9,83 Clorofila a (pg/cél±std) 0,12 ±0,02 0,14 ±0,01 0,25 ±0,02 0,27 ±0,06 Clorofilas totais (pg/cél±std) 0,19 ±0,04 0,19 ±0,02 0,32 ±0,01 0,36 ±0,09 Carotenoides totais (pg/cél±std) 0,10 ±0,02 0,11 ±0,01 0,14 ±0,04 0,12 ±0,06 Capítulo 1. Cultivo discontinuo de T-ISO__________________________________________ 72 +C+L +C-L -C+L -C-L Ácidos graxos % ácidos graxos pg/cél % ácidos graxos pg/cél % ácidos graxos pg/cél % ácidos graxos pg/cél 14:0 20,07 ±3,48 0,275 ±0,033 20,05 ±1,94 0,347 ±0,052 20,91 ±0,15 0,409 ±0,071 25,47 ±3,23 0,561 ±0,125 16:0 20,14 ±2,01 0,277 ±0,013 19,52 ±3,90 0,340 ±0,090 17,22 ±1,22 0,338 ±0,054 18,43 ±0,95 0,402 ±0,038 16:1 (ω-9) 0,95 ±0,15 0,013 ±0,003 0,86 ±0,24 0,015 ±0,004 0,98 ±0,00 0,019 ±0,003 1,03 ±0,90 0,021 ±0,019 16:1 (ω-7) 4,36 ±0,36 0,060 ±0,002 3,23 ±0,18 0,056 ±0,007 4,48 ±0,50 0,088 ±0,015 4,78 ±0,71 0,105 ±0,024 16:2 (ω-6) 0,21 ±0,02 0,003 ±0,000 0,21 ±0,05 0,004 ±0,001 0,25 ±0,03 0,005 ±0,001 0,29 ±0,04 0,006 ±0,000 16:2 (ω-4) 0,69 ±0,00 0,010 ±0,001 0,52 ±0,04 0,009 ±0,001 0,54 ±0,10 0,011 ±0,003 0,61 ±0,04 0,013 ±0,001 18:0 0,83 ±0,05 0,012 ±0,001 1,43 ±1,38 0,026 ±0,026 1,91 ±2,40 0,039 ±0,039 0,76 ±0,33 0,016 ±0,006 18:1 (ω-9) 21,20 ±2,61 0,294 ±0,052 24,75 ±3,27 0,424 ±0,026 18,94 ±1,15 0,370 ±0,045 18,75 ±1,75 0,407 ±0,013 18:1 (ω-7) 1,01 ±0,21 0,014 ±0,004 1,02 ±0,05 0,018 ±0,001 1,20 ±0,06 0,024 ±0,006 1,00 ±0,18 0,022 ±0,002 18:2 (ω-6) 1,87 ±0,38 0,026 ±0,007 2,94 ±0,20 0,051 ±0,002 1,75 ±0,03 0,034 ±0,010 1,99 ±0,12 0,043 ±0,004 18:3 (ω-6) 0,04 ±0,01 0,001 ±0,000 0,44 ±0,60 0,008 ±0,011 0,09 ±0,01 0,002 ±0,001 0,05 ±0,01 0,001 ±0,000 18:3 (ω-3) 3,20 ±0,74 0,045 ±0,012 4,01 ±0,29 0,069 ±0,001 4,45 ±0,24 0,087 ±0,020 4,53 ±0,19 0,099 ±0,006 18:4 (ω-3) 10,54 ±1,40 0,146 ±0,025 10,85 ±0,85 0,187 ±0,001 13,71 ±2,47 0,267 ±0,037 12,77 ±1,10 0,278 ±0,024 20:0 0,17 ±0,05 0,002 ±0,001 0,14 ±0,02 0,002 ±0,000 0,16 ±0,02 0,003 ±0,001 0,09 ±0,02 0,002 ±0,000 20:1 (ω-9) 0,55 ±0,11 0,008 ±0,002 0,86 ±0,04 0,015 ±0,001 1,55 ±0,29 0,030 ±0,008 1,33 ±0,01 0,029 ±0,003 20:2 (ω-9) 0,09 ±0,06 0,001 ±0,001 0,09 ±0,04 0,002 ±0,001 0,05 ±0,02 0,001 ±0,000 0,09 ±0,03 0,002 ±0,001 20:3 (ω-6) 0,04 ±0,02 0,001 ±0,000 0,20 ±0,23 0,004 ±0,004 0,08 ±0,05 0,001 ±0,001 0,25 ±0,38 0,006 ±0,009 20:4 (ω-6) 0,03 ±0,01 - 0,04 ±0,01 0,001 ±0,000 0,04 ±0,01 0,001 ±0,000 0,02 ±0,01 - 20:5 (ω-3) 0,32 ±0,02 0,004 ±0,000 0,25 ±0,05 0,004 ±0,000 0,42 ±0,00 0,008 ±0,002 0,24 ±0,02 0,005 ±0,001 22:0 0,35 ±0,07 0,005 ±0,001 0,21 ±0,03 0,004 ±0,001 0,25 ±0,04 0,005 ±0,001 0,12 ±0,06 0,003 ±0,002 22:1 (ω-9) 0,24 ±0,04 0,003 ±0,001 0,51 ±0,67 0,008 ±0,010 0,21 ±0,01 0,004 ±0,001 0,10 ±0,01 0,002 ±0,000 22:5 (ω-6) 1,86 ±0,10 0,026 ±0,003 1,28 ±0,20 0,022 ±0,002 1,18 ±0,01 0,023 ±0,003 0,88 ±0,08 0,019 ±0,003 22:6 (ω-3) 11,24 ±0,31 0,155 ±0,012 6,59 ±0,90 0,113 ±0,007 9,66 ±0,25 0,189 ±0,013 6,43 ±0,22 0,140 ±0,011 Total 1,381 ±0,076 1,726 ±0,135 1,959 ±0,176 2,184 ±0,208 Táboa 3. Composición de ácidos graxos de Isochrysis aff. galbana (Clon T-ISO) en cultivo discontinuo con e sen subministro de CO2 e dúas intensidades luminosas diferentes. +C+L, con CO2 e alta luz; +C-L, con CO2 e baixa luz; -C+L, sen CO2 e alta luz; -C-L, sen CO2 e baixa luz. __________________________________________Capítulo 1. Cultivo discontinuo de T-ISO 73 Saturados 41,56 ±5,34 0,57 ±0,04 41,35 ±5,94 0,72 ±0,15 40,44 ±5,86 0,79 ±0,16 44,87 ±2,89 0,98 ±0,15 Monoinsaturados 28,32 ±2,67 0,39 ±0,06 31,22 ±3,90 0,54 ±0,03 27,36 ±2,49 0,54 ±0,06 27,00 ±2,25 0,59 ±0,01 Sat+Mono 69,88 ±2 , 94 0,96 ±0 , 03 72,57 ±2 , 05 1,25 ±0 , 13 67,80 ±3 , 45 1,33 ±0 , 16 71,86 ±1 , 11 1,57 ±0 , 16 Poliinsaturados 28,26 ±2 , 84 0,39 ±0 , 06 26,15 ±1 , 85 0,45 ±0 , 01 31,02 ±3 , 41 0,61 ±0 , 07 27,25 ±1 , 18 0,59 ±0 , 05 ω-3 25,29 ±2,40 0,35 ±0,05 21,70 ±2,06 0,37 ±0,01 28,23 ±3,08 0,55 ±0,06 23,96 ±1,32 0,52 ±0,04 ω-6 2,28 ±0,44 0,03 ±0,01 3,93 ±0,23 0,07 ±0,01 2,24 ±0,45 0,04 ±0,01 2,68 ±0,32 0,06 ±0,01 ω-3 : ω-6 11,27 ±1,29 11,27 ±1,29 5,55 ±0,81 5,55 ±0,81 12,79 ±1,87 12,79 ±1,87 9,05 ±1,46 9,05 ±1,46 74 75 ____________________________Capítulo 2. Cultivo semicontinuo de Isochrysis aff. galbana (Clon T-ISO) con intensidade luminosa elevada 76 _____________Capítulo 2. Cultivo semicontinuo de T-ISO con intensidade luminosa elevada 77 Introdución No capítulo 1 observouse que a intensidade luminosa e a dispoñibilidade de CO2 afectan á composición bioquímica e á producción de exopolisacárido de Isochrysis aff. galbana (Clon T-ISO) na fase estacionaria en cultivos discontinuos. O cultivo semicontinuo é unha ferramenta eficaz para manter poboacións de microalgas en crecemento expoñencial, o que permite reducir o seu contido de substancias de reserva. Existen datos sobre o cultivo semicontinuo de Isochrysis galbana con varias taxas de renovación (Otero et al ., 1997a), pero non sobre TISO. Neste experimento T-ISO foi cultivada en sistema semicontinuo con varias taxas de renovación. Para evitar a excesiva producción de exopolisacárido que podería arruinar os cultivos controlouse o subministro de CO2 pero utilizouse unha intensidade luminosa elevada, que algúns autores relacionan cunha maior producción de DHA en T-ISO (Tzovenis et al ., 1997). Deseño experimental A microalga mariña Isochrysis aff. galbana (clon T-ISO, CCMP 1324) cultivouse en réxime semicontinuo, empregando biorreactores tubulares contendo 80 ml de cultivo cunha concentración de nutrintes equivalente a 4 mmoles/l de nitróxeno en forma de KNO3 (ver Materiais e métodos). Os cultivos sometéronse a un réxime de luz:escuridade 12 h:12 h, sendo a intensidade luminosa de 162 µmoles quanta/m2/s. Introduciuse aireación suplementada con CO2 e o pH mantívose en valores arredor de 8. Os cultivos unialgais iniciáronse cunha densidade de 7,2×106 células/ml e deixáronse medrar ata acadar a fase estacionaria. Durante os primeiros días reduciuse a intensidade luminosa para evitar problemas de fotoinhibición. Cando os cultivos entraron na fase estacionaria iniciouse o réxime semicontinuo, retirando diariamente o 10%, 20%, 30%, 40% ou 50% do volume de cultivo. Unha vez en estado de equilibrio, recolléronse mostras de biomasa microalgal para determinacións de peso seco e análises bioquímicas. O último día todo o volume de cultivo foi recollido para realizar o experimento de enriquecemento de rotífero (Capítulo 5). Para conseguir a cantidade de microalga necesaria para este experimento cultiváronse tres réplicas Capítulo 2. Cultivo semicontinuo de T-ISO con intensidade luminosa elevada_____________ 84 comprendidos entre 3,5 e 5,3 pg de proteína por célula. Outros autores en cambio citan cantidades de proteína moito maiores, de 7,7 a 11 pg/célula dependendo do sistema de cultivo e da intensidade luminosa, pero equivalentes a un 37% da fracción orgánica (Renaud et al ., 1991), que é un valor algo inferior aos obtidos no noso experimento en condicións de saturación por nitróxeno. Por outra banda, a porcentaxe de proteína en relación ao peso seco duplicouse entre as taxas de renovación do 10% e do 40% debido ao descenso do peso seco celular, e pasou do 16,70% ao 34,41%, que é un valor moi similar ao obtido en cultivos discontinuos de T-ISO (Whyte, 1987) e de primnesiófitas en xeral (Brown et al ., 1997) na fase de crecemento expoñencial. Na taxa de renovación do 50% o contido de proteína disminuíu ata 4,16 pg/célula que supuxeron un 23,19% do peso seco. A porcentaxe de proteína en T-ISO pode alcanzar o 41% do peso seco na fase de crecemento expoñencial, pero un réxime semicontinuo con condicións de cultivo deficientes (bolsas de 85 l con iluminación de 100 µmoles quanta/m2/s, medio de cultivo f/2 e taxa de renovación do 15% cada dous días) pode provocar que o contido proteico disminúa ata os valores típicos dun cultivo discontinuo en fase estacionaria, aproximadamente un 21% (Brown et al ., 1993b). Os cultivos de T-ISO en fase estacionaria acumularon unha gran cantidade de glícidos (Capítulo 1), e os glícidos foron tamén a principal substancia de reserva nos cultivos semicontinuos con taxas de renovación baixas. Experimentaron un significativo descenso ao incrementarse a taxa de renovación, pasando de 10,19 pg/célula na taxa de renovación do 10% a 2,54 pg/célula na taxa de renovación do 50% (Figura 5; Táboa 1), evolucionando de maneira practicamente igual a I. galbana cultivada nas mesmas condicións (Otero et al ., 1997a). O contido de glícidos debeu ser aínda maior, especialmente nas taxas de renovación baixas, xa que non se tivo en conta a producción de exopolisacáridos. A disminución no contido de glícidos en T-ISO é a causa principal do descenso de QC e da relación C:N a medida que se incrementa a taxa de renovación. Un descenso continuo aínda que non linear, de 16 a 5 pg/célula, tamén se observa en T-ISO cultivada en quimiostato a medida que a taxa de dilución aumenta de 0,18 a 0,95/día (Sukenik e Wahnon, 1991). En porcentaxe, os valores obtidos representaron un 50,77% e un 23,26% respectivamente da fracción orgánica da _____________Capítulo 2. Cultivo semicontinuo de T-ISO con intensidade luminosa elevada 85 microalga e son comparables aos observados en distintas fases do crecemento de Isochrysis galbana , que van do 15,21% na fase de crecemento expoñencial ao 48,35% na fase estacionaria unha vez que cesou o crecemento (Fernández-Reiriz et al ., 1989). En porcentaxes de peso seco os valores foron similares, do 49,93% ao 14,16%. Sen embargo, non todos os autores citan porcentaxes tan elevadas de glícidos en T-ISO. Nalgúns casos os glícidos non representan máis que un 20% do peso seco en condicións de deficiencia de nitróxeno (Ben-Amotz et al ., 1985), ou mesmo un 9% aproximadamente (Whyte, 1987). A razón máis probable destes valores é a baixa intensidade luminosa á que foron cultivadas as microalgas. A porcentaxe de lípidos na fracción orgánica experimentou un lixeiro incremento coa taxa de renovación, pasando do 32,24% ao 38,64% (Figura 5; Táboa 1). Sen embargo, o contido lipídico por célula reduciuse de 6,47 pg na taxa de renovación do 10% a 4,23 pg na taxa de renovación do 30%, valor que se mantén nas taxas de renovación superiores (Figura 6; Táboa 1). En cultivos en quimiostato, o contido lipídico pode descender dos 6,3 aos 2,6 pg/célula cando a taxa de crecemento é 0,95 divisións/día (Sukenik e Wahnon, 1991). En porcentaxes de peso seco os lípidos mantivéronse estables, oscilando entre o 27% e o 31% entre as taxas de renovación do 10% e do 40%, e unicamente descenderon ata o 23% na taxa de renovación do 50% (Táboa 1). As porcentaxes de lípidos obtidas no noso sistema coas taxas de renovación mínima e máxima son moi semellantes ás obtidas en cultivos de T-ISO limitados por nitróxeno e fósforo e con taxas de crecemento equivalentes respectivamente ao 5% e ao 50% de µmáx (Reitan et al ., 1994). A pesares de que estas taxas de crecemento son inferiores ás dos cultivos semicontinuos con taxas de renovación do 10% e do 50% (taxa de crecemento µ=0,2 e =1 respectivamente), as células non acumularon maiores cantidades de lípidos debido probablemente á menor intensidade luminosa, 70-90 µmol quanta/m2/s para cultivos en matraces de 5 l. O contido celular de ácidos graxos de T-ISO non resultou significativamente afectado pola taxa de renovación. Os valores máximos obtivéronse nas taxas de renovación do 10% e do 40%, con 1,34 e 1,31 pg/célula respectivamente, e nas demais taxas de renovación variaron entre 0,99 e 1,12 pg/célula (Figura 7B; Táboa 2). Estes datos son moi similares aos obtidos por Volkman et al . (1989) ao final da fase logarítmica en cultivos discontinuos. En Capítulo 2. Cultivo semicontinuo de T-ISO con intensidade luminosa elevada_____________ 86 cambio, si houbo variacións na composición de ácidos graxos producidas pola taxa de renovación. En cultivos semicontinuos, os ácidos graxos saturados e monoinsaturados disminúen a medida que aumenta a taxa de renovación mentres que o nitróxeno é limitante, aumentando os ácidos graxos poliinsaturados (Otero e Fábregas, 1997). En resposta á maior dispoñibilidade de nitróxeno, o conxunto dos ácidos graxos saturados e monoinsaturados experimentou un descenso en porcentaxe ata a taxa de renovación do 40%, pasando do 69% ao 52,49%, e en contido celular ata a taxa de renovación do 30%, de 0,92 a 0,55 pg/célula, ascendendo a continuación. O comportamento dos ácidos graxos poliinsaturados foi o inverso, e incrementáronse en porcentaxe e contido celular ata a taxa de renovación do 40%, pasando dun 29,50% e 0,39 pg/célula a un 46% e 0,57 pg/célula (Figuras 7A e 7B; Táboa 2). Os ácidos graxos máis abundantes en Isochrysis aff. galbana T-ISO son o 14:0, o 16:0, o 18:1ω-9 e o 18:4ω-3, e todos apareceron en porcentaxes superiores ao 15% do total dos ácidos graxos na maioría das taxas de renovación probadas. Outros ácidos graxos importantes son 16:1ω-7, 18:2ω-6, 18:3ω-3 e 22:6ω-3 (DHA), presentes en porcentaxes superiores ao 5%. Os ácidos graxos 16:0 e 18:1ω-9 foron os principais responsables da disminución do conxunto de ácidos graxos saturados e monoinsaturados, xa que a suma dos dous pasou de representar o 40,35% dos ácidos graxos na taxa de renovación do 10% a un Figura 7. Evolución do contido de ácidos graxos de T-ISO en cultivo semicontinuo cunha intensidade luminosa de 162 µmoles quanta/m2 / s. A: expresado en porcentaxe sobre o total dos ácidos graxos. B: expresado en pg de ácido graxo por célula. -zácidos graxos poliinsaturados; -▲- ácidos graxos saturados + monoinsaturados ; --ácidos g raxos totais. _____________Capítulo 2. Cultivo semicontinuo de T-ISO con intensidade luminosa elevada 87 25,73% na taxa de renovación do 40%, e o contido celular de cada un deles reduciuse case á metade (Táboa 2). No tocante aos ácidos graxos poliinsaturados, os maiores incrementos en porcentaxe rexistráronse nos ω-3. O DHA pasou do 6,28% na taxa de renovación do 10% ao 9,88% na taxa de renovación do 40%, aumentando o contido celular de 0,084 a 0,129 pg/célula (Figura 8; Táboa 2). Estas porcentaxes son similares ás rexistradas nos cultivos discontinuos (Capítulo 1), pero menores que as porcentaxes sinaladas por diversos autores (Sukenik e Wahnon, 1992; Brown et al ., 1993a; Tzovenis et al ., 1997). O menor contido de ácidos graxos nos cultivos semicontinuos deu lugar tamén a menores contidos de DHA. As porcentaxes dos ácidos graxos 18:3ω-3 e 18:4ω-3 case se duplicaron, pasando de 4,66% e 11,98% a 7,90% e 20,48% respectivamente, mentres que os seus respectivos contidos celulares experimentaron un notable incremento, de 0,062 e 0,160 pg/célula a 0,103 e 0,267 pg/célula respectivamente. O conxunto dos ácidos graxos ω-6 incrementouse de 4,77% ata 6,93% na taxa de renovación do 40% (Figura 8), e a relación ω-3:ω-6 elevouse lixeiramente nas taxas de renovación intermedias. Os ácidos graxos 14:0 e 16:1ω-7 non sufriron modificacións destacadas, producíndose soamente un pequeno descenso nas taxas de renovación máis altas tanto en porcentaxe como en contido celular, mentres que o 18:2ω-6 incrementouse lixeiramente (Táboa 2). As variacións das porcentaxes dos ácidos graxos saturados, monoinsaturados e poliinsaturados suxire a posible existencia de cambios na composición das clases de lípidos acílicos. A disminución do 16:0 e o 18:1, principais compoñentes dos lípidos neutros en T-ISO (Sukenik e Wahnon, 1991), indica unha reducción do contido de lípidos de reserva. O DHA é característico dos fosfolípidos e o 18:4ω-3 nas primnesiofíceas localízase case exclusivamente nos galactolípidos, principais compoñentes das membranas tilacoidais (Sukenik e Wahnon, 1991; López Alonso et al ., 1997; Zhu et al ., 1997; Meireles et al ., 2003). O incremento destes dous ácidos graxos ata a taxa de renovación do 40% suxire que a maior dispoñibilidade de nitróxeno co aumento da taxa de renovación ocasionou un incremento da superficie fotosintética e polo tanto tamén un incremento do contido de clorofila, igual que acontece con I. galbana en cultivo semicontinuo (Otero et al ., 1997). Capítulo 2. Cultivo semicontinuo de T-ISO con intensidade luminosa elevada_____________ 88 A relativa estabilidade do contido de ácidos graxos contrasta co descenso do contido lipídico. Ademais, os ácidos graxos representaron unicamente entre un 20% e un 31% dos lípidos totais. Estas porcentaxes son baixas comparadas cos datos de Reitan et al . (1994) que citan entre un 36% e un 40% de ácidos graxos nos lípidos de T-ISO en condicións de limitación por fósforo e cos de Sukenik e Livne (1991) que atoparon porcentaxes de ácidos graxos comprendidos entre o 40% e o 60% do peso dos lípidos totais. T-ISO presenta unha gran variedade de clases de lípidos (Volkman et al ., 1989), polo que unha gran parte do seu contido lipídico debe corresponder a lípidos non acílicos. Probablemente os lípidos “acílicos” experimentaron cambios nas súas respectivas proporcións, disminuíndo a porcentaxe de triacilglicerois e aumentando os lípidos polares –fosfolípidos e glicolípidospero sen producirse grandes variacións cuantitativas. O incremento da taxa de crecemento de T-ISO en quimiostato pode causar unicamente pequenas disminucións no contido lipídico das células, pero grandes cambios na súa composición, reducindo a porcentaxe de lípidos neutros e incrementando as de glicolípidos e fosfolípidos (Saoudi-Helis et al ., 1994). Os lípidos non formados por ácidos graxos que máis contribúen ao contido lipídico de T-ISO son as alquenonas. A limitación por nitróxeno ou unha intensidade luminosa elevada incrementan o contido de alquenonas (Brown et al ., Figura 8. Evolución do contido de ácidos graxos ω-3 (-▲-), ω-6 (-z-) e DHA (--) en Isochrysis aff. galbana T-ISO en cultivo semicontinuo cultivada cunha intensidade luminosa de 162 µmoles quanta/m2/s. A: expresado en porcentaxes. B: expresado en pg de ácido graxo por célula. _____________Capítulo 2. Cultivo semicontinuo de T-ISO con intensidade luminosa elevada 89 1993a; Dunstan et al ., 1993). Aínda que as alquenonas poden supoñer ata un 26% dos lípidos totais de T-ISO (Dunstan et al ., 1993), outros autores citan cantidades de alquenonas máis baixas cando T-ISO é cultivada en turbidostato, aproximadamente 0,30 pg/célula en cultivos saturados por nitróxeno e 0,48 pg/célula —11% dos lípidos totais— en cultivos limitados (Parrish et al ., 1998). A contribución dos pigmentos ao contido lipídico total pode considerarse limitado xa que clorofilas e carotenoides representan porcentaxes pequenas do peso celular no xénero Isochrysis (Capítulo 1). Dependendo das condicións de cultivo, o contido de clorofilas pode oscilar entre o 0,41% e o 1,83% do peso orgánico de Isochrysis sp., e o de carotenoides entre o 0,33% e o 0,64% (Ben-Amotz et al ., 1985). Polo tanto a evolución do contido de clorofila nos nosos cultivos probablemente non tivo un efecto destacado sobre os lípidos totais, aínda que evolucionaron de forma inversa. É posible que tamén se producisen pequenos incrementos no contido de carotenoides (Saoudi-Helis et al ., 1994; Sukenik e Wahnon, 1991), pero asimesmo con escasa influencia sobre o contido lipídico total. Outras clases de lípidos presentes en T-ISO como esterois ou hidrocarburos aparecen soamente en pequenas cantidades (Volkman et al ., 1989; Dunstan et al ., 1993). A variación da taxa de renovación produciu modificacións importantes na composición de T-ISO. Nos cultivos saturados por nitróxeno obtivéronse os máximos contidos de proteína e de ácidos graxos ω-3 e reduciuse en gran medida o contido de glícidos, ademais de alcanzarse produtividades elevadas. Porén, o contido de DHA foi máis baixo do agardado para cultivos semicontinuos polo que é necesario introducir novas modificacións nas condicións de cultivo. Capítulo 2. Cultivo semicontinuo de T-ISO con intensidade luminosa elevada_____________ 90 Táboa 1. Composición de Isochrysis aff. galbana (Clon T-ISO) cultivada en réxime semicontinuo cunha concentración de nitróxeno 4 mM e intensidade luminosa de 162 µmoles quanta/m2/s. Taxa de renovación 10 % 20 % 30 % 40 % 50% Densidade celular (106 cél/ml±std) 70,58 ±5,67 69,00 ±3,79 60,56 ±6,55 42,91 ±3,93 27,27 ±2,61 Produtividade (109 células/l/día) 7,06 13,80 18,17 17,16 13,63 (mg/l/día) 144 268 263 250 244 Peso seco (pg/cél±std) 20,41±3,36 19,39±1,16 14,49±0,86 14,57±1,70 17,92±0,52 Proteína (pg/cél±std) 3,41±0,15 3,63±0,39 3,48±0,18 5,01±0,26 4,16±0,43 Lípidos (pg/cél±std) 6,47±0,43 5,32±0,74 4,23±0,35 4,18±0,31 4,22±0,25 Glúcidos (pg/cél±std) 10,19±1,17 6,91±0,61 3,92±0,40 2,69±0,36 2,54±0,55 Total prot+líp+glúc (pg/cél±std) 20,07±1,34 15,86±1,38 11,83±0,48 11,88±0,48 10,91±0,32 Valor calórico (10-7 J/cél) 5,10 4,14 3,17 3,31 3,10 % proteína 16,70 18,71 24,01 34,41 23,19 % lípidos 31,70 27,44 29,20 28,70 23,54 % glúcidos 49,93 35,64 27,04 18,44 14,16 Total orgánico 98,33 81,79 80,25 81,55 60,18 % proteína na F. O. 16,99 22,88 29,92 42,20 38,10 % lípidos na F. O. 32,24 33,55 36,37 35,19 38,64 % glúcidos na F. O. 50,77 43,57 33,71 22,61 23,26 QN (pg/cél±std) 0,55±0,04 0,55±0,02 0,71±0,06 1,01±0,18 0,77±0,29 QC (pg/cél±std) 8,81±0,55 6,34±0,17 6,42±0.78 7,20±1,32 5,30±1,91 Relación C:N (átomos) 18,7 13,5 10,6 8,3 8,0 Taxa de renovación 10% 20% 30% 40% 50 % Ácidos graxos % ácidos graxos pg/cél % ácidos graxos pg/cél % ácidos graxos pg/cél % ácidos graxos pg/cél % ácidos graxos pg/cél 14:0 17,81 ±1,29 0,238 ±0,021 16,69 ±1,59 0,183 ±0,030 17,11 ±1,15 0,168 ±0,006 15,90 ±2,43 0,207 ±0,033 15,23 ±2,14 0,172 ±0,040 16:0 19,86 ±0,43 0,266 ±0,010 17,31 ±0,34 0,189 ±0,016 13,28 ±1,01 0,131 ±0,003 12,38 ±0,66 0,161 ±0,009 14,42 ±0,50 0,162 ±0,019 16:1 (ω-9) 0,32 ±0,03 0,004 ±0,000 0,24 ±0,05 0,003 ±0,000 0,10 ±0,09 0,001 ±0,001 0,24 ±0,06 0,003 ±0,001 0,31 ±0,08 0,004 ±0,001 16:1 (ω-7) 5,87 ±0,44 0,078 ±0,004 6,03 ±0,29 0,066 ±0,008 5,71 ±0,28 0,056 ±0,001 4,94 ±0,46 0,065 ±0,009 4,44 ±0,42 0,050 ±0,009 16:2 (ω-6) 0,31 ±0,13 0,004 ±0,002 0,35 ±0,02 0,004 ±0,001 0,48 ±0,03 0,005 ±0,000 0,51 ±0,15 0,007 ±0,002 0,43 ±0,16 0,005 ±0,002 16:2 (ω-4) 1,32 ±0,12 0,018 ±0,001 0,94 ±0,10 0,010 ±0,002 0,64 ±0,02 0,006 ±0,000 0,59 ±0,13 0,008 ±0,002 0,53 ±0,06 0,006 ±0,001 18:0 1,01 ±0,15 0,014 ±0,002 0,61 ±0,42 0,007 ±0,005 0,34 ±0,26 0,003 ±0,003 0,90 ±0,65 0,012 ±0,008 0,84 ±0,24 0,009 ±0,002 18:1 (ω-9) 20,49 ±0,91 0,274 ±0,005 17,09 ±0,50 0,187 ±0,014 15,82 ±0,79 0,156 ±0,017 13,35 ±1,01 0,174 ±0,015 14,46 ±1,06 0,161 ±0,009 18:1 (ω-7) 1,89 ±0,04 0,025 ±0,001 1,75 ±0,15 0,019 ±0,001 1,42 ±0,23 0,014 ±0,003 1,58 ±0,20 0,021 ±0,003 1,66 ±0,19 0,018 ±0,001 18:2 (ω-6) 4,22 ±0,27 0,056 ±0,004 4,42 ±0,16 0,048 ±0,002 5,09 ±0,03 0,050 ±0,003 5,62 ±0,54 0,073 ±0,008 5,56 ±0,34 0,062 ±0,001 18:3 (ω-6) 0,10 ±0,03 0,001 ±0,000 0,14 ±0,02 0,002 ±0,000 0,33 ±0,01 0,003 ±0,000 0,61 ±0,03 0,008 ±0,001 0,59 ±0,04 0,007 ±0,000 18:3 (ω-3) 4,66 ±0,27 0,062 ±0,001 6,75 ±0,98 0,074 ±0,010 7,28 ±0,20 0,072 ±0,006 7,90 ±0,58 0,103 ±0,009 7,53 ±0,66 0,084 ±0,002 18:4 (ω-3) 11,96 ±0,64 0,160 ±0,012 16,49 ±0,77 0,180 ±0,019 18,63 ±0,31 0,184 ±0,011 20,48 ±0,58 0,267 ±0,008 18,17 ±1,12 0,202 ±0,009 20:0 0,25 ±0,05 0,003 ±0,001 0,12 ±0,09 0,001 ±0,001 0,13 ±0,01 0,001 ±0,000 0,07 ±0,01 0,001 ±0,000 0,09 ±0,01 0,001 ±0,000 20:1 (ω-9) 1,00 ±0,23 0,013 ±0,003 1,51 ±0,11 0,017 ±0,003 1,68 ±0,19 0,017 ±0,002 2,96 ±0,13 0,039 ±0,003 4,46 ±0,83 0,049 ±0,007 Táboa 2. Composición de ácidos graxos de Isochrysis aff. galbana (T-ISO) cultivada en réxime semicontinuo cunha concentración de nitróxeno 4 mM, expresada en porcentaxes sobre o total de ácidos graxos e pg/célula. 92 20:2 (ω-9) 0,10 ±0,04 0,001 ±0,001 0,15 ±0,05 0,002 ±0,001 0,07 ±0,02 0,001 ±0,000 0,05 ±0,04 0,001 ±0,001 0,05 ±0,02 0,001 ±0,000 20:3 (ω-6) 0,07 ±0,01 0,001 ±0,000 0,09 ±0,03 0,001 ±0,000 0,08 ±0,01 0,001 ±0,000 0,08 ±0,01 0,001 ±0,000 0,10 ±0,01 0,001 ±0,000 20:4 (ω-6) 0,08 ±0,02 0,001 ±0,000 0,14 ±0,10 0,002 ±0,001 0,16 ±0,10 0,002 ±0,001 0,12 ±0,01 0,002 ±0,000 0,09 ±0,02 0,002 ±0,000 20:5 (ω-3) 0,41 ±0,15 0,005 ±0,002 0,53 ±0,20 0,006 ±0,002 0,44 ±0,05 0,004 ±0,001 0,53 ±0,04 0,007 ±0,001 0,44 ±0,03 0,007 ±0,001 22:0 0,34 ±0,04 0,004 ±0,001 0,23 ±0,01 0,003 ±0,000 0,21 ±0,03 0,002 ±0,000 0,13 ±0,01 0,002 ±0,000 0,17 ±0,04 0,002 ±0,000 22:1 (ω-9) 0,16 ±0,13 0,002 ±0,002 0,20 ±0,08 0,002 ±0,001 0,10 ±0,01 0,001 ±0,000 0,04 ±0,01 0,001 ±0,000 0,05 ±0,04 0,001 ±0,000 22:5 (ω-6) 1,49 ±0,27 0,020 ±0,005 1,69 ±0,15 0,018 ±0,001 2,06 ±0,20 0,020 ±0,003 1,84 ±0,24 0,024 ±0,003 1,75 ±0,24 0,024 ±0,003 22:6 (ω-3) 6,28 ±1,47 0,084 ±0,023 6,52 ±0,70 0,071 ±0,009 8,83 ±0,59 0,087 ±0,011 9,88 ±0,03 0,129 ±0,013 8,63 ±0,37 0,129 ±0,013 Total 1,337 ±0,059 1,092 ±0,096 0,986 ±0,060 1,311 ±0,058 1,118 ±0,096 Saturados 39,28 ±1,58 0,525 ±0,032 34,96 ±2,32 0,383 ±0,049 31,07 ±1,77 0,306 ±0,005 29,38 ±2,57 0,382 ±0,033 30,75 ±2,52 0,345 ±0,059 Monoinsaturados 29,73 ±1,36 0,397 ±0,003 26,82 ±0,92 0,293 ±0,026 24,82 ±0,70 0,245 ±0,022 23,11 ±0,84 0,301 ±0,022 25,39 ±1,12 0,283 ±0,012 Sat+Mono 69,00 ±1,86 0,922 ±0,029 61,78 ±1,43 0,675 ±0,069 55,89 ±1,07 0,551 ±0,023 52,49 ±1,74 0,683 ±0,036 56,13 ±1,52 0,628 ±0,071 Poliinsaturados 29,50 ±1,72 0,395 ±0,036 36,52 ±1,31 0,399 ±0,031 42,05 ±0,91 0,415 ±0,034 46,36 ±2,41 0,604 ±0,040 42,12 ±1,76 0,470 ±0,022 ω-3 23,30 ±1,59 0,312 ±0,033 30,29 ±1,11 0,331 ±0,026 35,19 ±0,81 0,347 ±0,029 38,79 ±1,79 0,505 ±0,031 34,76 ±1,38 0,388 ±0,020 ω-6 4,77 ±0,37 0,064 ±0,005 5,14 ±0,23 0,056 ±0,003 6,15 ±0,11 0,061 ±0,004 6,93 ±0,71 0,090 ±0,010 6,78 ±0,47 0,075 ±0,001 ω-3 : ω-6 4,89 ±0,33 5,90 ±0,22 5,72 ±0,09 5,62 ±0,33 5,14 ±0,22 5,137 ±0,223 EPA : ARA 5,19 ±1,64 4,32 ±1,33 3,24 ±1,33 4,66 ±0,38 4,86 ±1,10 DHA : EPA 17,25 ±7,73 13,20 ±3,42 19,92 ±1,07 18,47 ±0,57 19,65 ±0,55 93 ____________________________Capítulo 3. Cultivo semicontinuo de Isochrysis aff. galbana (Clon T-ISO) con intensidade luminosa moderada Capítulo 3. Cultivo semicontinuo de T-ISO con intensidade luminosa moderada___________ 100 A reducción da dispoñibilidade de luz dá lugar a resultados similares en cultivos batch de T-ISO e C-ISO, cepa orixinaria do Caribe (Wikfors e Patterson, 1994), que sometidas a 35 µmoles quanta/m2/s presentan maior contido de lípidos que de glícidos en todo o ciclo de crecemento, mentres que unha intensidade luminosa de 250 µmoles quanta/m2/s reduce o contido de lípidos na transición da fase expoñencial á estacionaria e na propia fase estacionaria (Nelson et al ., 1992). En turbidostato tamén houbo unha resposta positiva da síntese de glícidos ante o aumento da intensidade luminosa, acompañada do descenso do contido lipídico (Sukenik e Wahnon, 1991). Á vista destes resultados e dos nosos propios datos, semella que as especies do xénero Isochrysis reaccionan ante a baixa dispoñibilidade de luz reducindo a síntese de glícidos en beneficio dunha maior acumulación de lípidos. O contido de lípidos ou de ácidos graxos non está necesariamente correlacionada coa actividade da acetil CoA carboxilasa e coa síntese lipídica en T-ISO. En quimiostato, ambas mostran unha resposta positiva fronte ao incremento da taxa de crecemento, aínda que o contido lipídico descende nestas condicións. En turbidostato, increméntanse en resposta á intensidade luminosa ata un valor máximo a partir do cal descenden, mentres que o contido lipídico a penas varía dentro dun amplo rango de intensidades luminosas (Sukenik e Livne, 1991). Nos traballos citados, as microalgas foron cultivadas con aireación pero sen suplementación de CO2. Probablemente un aporte extra de CO2 daría lugar a maiores contidos de glícidos nas células cultivadas con intensidades luminosas elevadas, tal e como se viu no Capítulo 1. En cultivos discontinuos non aireados, moitas veces un incremento na intensidade luminosa produce unicamente pequenos incrementos ou mesmo descensos dos lípidos e glícidos celulares, probablemente polo déficit de CO2 debido á ausencia de aireación (Brown et al ., 1993a). Como consecuencia destas modificacións na composición bioquímica tamén se rexistraron diferencias nas porcentaxes de proteínas, glícidos e lípidos na fracción orgánica de T-ISO en función da intensidade luminosa. A porcentaxe proteica incrementouse nos dous casos ata a taxa de renovación do 40%, pero o valor máximo foi lixeiramente maior nos cultivos sometidos a 162 µmoles quanta/m2/s, un 42% fronte a un 36%. A porcentaxe de glícidos descendeu coa ___________Capítulo 3. Cultivo semicontinuo de T-ISO con intensidade luminosa moderada 101 taxa de renovación e foi moito menor nas células cultivadas con 97 µmoles quanta/m2/s, cun máximo do 35% e un mínimo do 15%. A fracción lipídica foi a maioritaria nos cultivos de T-ISO sometidos a unha menor radiación lumínica e non sufriu grandes variacións coa taxa de renovación, oscilando entre un 43% e un 49% da fracción orgánica. Nos cultivos sometidos a 162 µmoles quanta/m2/s a porcentaxe de lípidos tampouco variou de forma importante coa taxa de renovación pero os valores que alcanzou foron máis baixos (Figura 6; Táboa 2). O perfil de ácidos graxos de Isochrysis galbana var. T-ISO viuse intensamente afectado pola intensidade luminosa. As células cultivadas cunha radiación de 97 µmoles quanta/m2/s contiñan o dobre de ácidos graxos que as cultivadas con 162 µmoles quanta/m2/s en tódalas taxas de renovación excepto na do 50%, na que a cantidade de ácidos graxos non chegou a duplicarse. O maior contido debeuse sobre todo aos ácidos graxos poliinsaturados, compoñentes típicos dos lípidos de membrana, suxerindo un incremento da superficie tilacoidal para mellorar a captación de luz. O aumento dos saturados e monoinsaturados foi menor. Estes resultados concordan cos obtidos por Tzovenis et al. (2003b), que atopou que en cultivos batch de T-ISO sometidos a ciclos de 12 h luz: 12 h escuridade, intensidades luminosas baixas xeneraban os maiores contidos de ácidos graxos na fase expoñencial. A cantidade de ácidos graxos variou da mesma maneira que os lípidos, descendendo coa taxa de renovación pero experimentando un incremento na taxa de renovación do 40%. En contido Figura 6. Comparación das porcentaxes de proteínas, lípidos e glícidos na fracción orgánica de T-ISO cultivada con dúas intensidades luminosas diferentes. Esquerda, 97 µmoles quanta/m2/s; dereita, 162 µmoles quanta/m2/s.  proteínas;  lípidos;  glícidos. Capítulo 3. Cultivo semicontinuo de T-ISO con intensidade luminosa moderada___________ 102 celular, os ácidos graxos saturados e monoinsaturados descenderon coa taxa de renovación, pasando de 1,54 a 0,77 pg/célula. Os poliinsaturados alcanzaron un valor máximo de 1,35 pg/célula na taxa de renovación do 30%, e o seu valor mínimo foi 0,77 pg/célula na taxa de renovación do 50% (Figura 7; Táboa 3). A suma das porcentaxes de ácidos graxos saturados e monoinsaturados mantívose estable nas taxas de renovación do 10% e 20% e experimentou un marcado descenso na taxa de renovación do 30%, pasando de representar un 55% a un 41% dos ácidos graxos totais, e recuperouse nas taxas de renovación superiores chegando ata o 48%. Inversamente, os ácidos graxos poliinsaturados incrementáronse na taxa de renovación do 30% ata o 56% do total de ácidos graxos e descenderon ata o 48% nas taxas de renovación máis altas. Este comportamento contrasta co acontecido nos cultivos sometidos a 162 µmoles Figura 7. Evolución dos ácidos graxos totais (--), saturados+monoinsaturados (-S-) e poliinsaturados (-z-) de T-ISO cultivada con dúas intensidades luminosas distintas. A, porcentaxes, 97 µmoles quanta/m2/s; B, porcentaxes, 162 µmoles quanta/m2 / s; C, pg/célula, 97 µmoles quanta/m2/s; D, pg/célula, 162 µmoles quanta/m2/s. Taxa de renovación ___________Capítulo 3. Cultivo semicontinuo de T-ISO con intensidade luminosa moderada 103 quanta/m2/s, nos que as porcentaxes de ácidos graxos saturados e monoinsaturados descendían de forma case lineal ata a taxa de renovación do 40%, incrementándose novamente na taxa de renovación do 50%. Ademais, a porcentaxe de ácidos graxos poliinsaturados non foi en ningún caso superior á suma dos ácidos graxos saturados e monoinsaturados, mentres que nos cultivos sometidos a 97 µmoles quanta/m2/s os ácidos graxos poliinsaturados superaron notablemente a porcentaxe de saturados e monoinsaturados nas taxas de renovación do 30% e 40% (Figura 7; Táboa 3). Os ácidos graxos 14:0, 16:0, 16:1ω-7, 18:1ω-9, 18:2ω-6, 18:3ω-3, 18:4ω-3 e 22:6ω-3 (DHA) son os máis abundantes en T-ISO, pero o cultivo cunha intensidade luminosa de 97 µmoles quanta/m2/s provocou cambios nas súas proporcións respecto dos cultivos de T-ISO sometidos a 162 µmoles quanta/m2/s. As porcentaxes de 14:0 e 16:0 foron sensiblemente menores que nas células cultivadas con 162 µmoles quanta/m2/s. 14:0 non seguiu ningunha tendencia clara, oscilando entre o 8,58% e o 13,47%; o contido celular mantívose entre 0,193 e 0,324 pg/célula. O 16:0 descendeu desde o 13,57% e 0,392 pg/célula na taxa de renovación do 10% ata o 8,95% e 0,195 pg/célula na taxa de renovación do 30%, aumentando nas taxas de renovación superiores (Táboa 3). O 16:1ω-7, o 18:1ω-9 e o 18:2ω-6 mantiveron evolucións e porcentaxes similares nas dúas condicións de iluminación, aínda que os seus respectivos contidos celulares nos cultivos sometidos a 97 µmoles quanta/m2/s aumentaron como consecuencia do incremento do contido total de ácidos graxos. Os ácidos graxos poliinsaturados máis importantes, 18:3ω-3, 18:4ω-3 e 22:6ω-3, presentaron porcentaxes máis elevadas nos cultivos sometidos a 97 µmoles quanta/m2/s, e contidos celulares tamén maiores, que chegaron a triplicarse nalgúns casos. O 18:4ω-3 foi o ácido graxo ω-3 máis abundante e alcanzou a súa porcentaxe e contido celular máximos na taxa de renovación do 30%, cun 25,04% e 0,583 pg/célula respectivamente. A porcentaxe de DHA foi maior nos cultivos sometidos a 97 µmoles quanta/m2/s pero non experimentou grandes variacións coa taxa de renovación. A porcentaxe e o contido celular máximos alcanzáronse na taxa de renovación do 40% con 15,04% e 0,381 pg/célula, o triple do contido máximo de DHA das células cultivadas con 162 µmoles quanta/m2/s. As taxas de renovación do 10% e 20% tamén rexistraron contidos de DHA superiores aos Capítulo 3. Cultivo semicontinuo de T-ISO con intensidade luminosa moderada___________ 104 0,300 pg/célula, debido á elevada cantidade de ácidos graxos totais e ás porcentaxes de DHA relativamente altas desas células (Táboa 3). En cultivos batch o DHA presenta correlación positiva coa intensidade luminosa independentemente da fase de crecemento do cultivo e de se a iluminación é continua ou non (Brown et al ., 1993a; Tzovenis et al ., 1997, 2003b). Sukenik e Wahnon (1991) tamén observaron en turbidostatos un incremento da porcentaxe de DHA en resposta a un incremento da intensidade luminosa no rango de 30 a 300 µmoles quanta/m2/s. Nos cultivos semicontinuos aconteceu o fenómeno contrario. Unha posible hipótese para a resposta positiva do DHA fronte a incrementos na intensidade luminosa é a súa síntese e acumulación en triacilglicerois en condicións enerxeticamente favorables (Tzovenis et al ., 1997, 2003b), xa que unha parte relativamente importante do DHA en T-ISO atópase nos triacilglicéridos (Sukenik e Wahnon, 1991). Esta hipótese podería ser válida para explicar o aumento do DHA en cultivos en quimiostato con baixa densidade celular sometidos a intensidades luminosas elevadas (Sukenik e Wahnon, 1991), pero os cultivos de Tzovenis et al ., de 4 l de volume, posiblemente estiveran limitados por luz e reaccionaran ao incremento da intensidade luminosa cun aumento da síntese de ácidos graxos, entre eles DHA. De acordo cos nosos resultados, a proporción de ácidos graxos poliinsaturados en T-ISO increméntase en resposta a un descenso da intensidade luminosa sempre que non se alcancen condicións limitantes, tal como sinalan outros autores (Carvalho e Malcata, 2005). En condicións de limitación por nutrintes, o incremento da taxa de dilución fai aumentar o contido de ácidos graxos poliinsaturados tanto en quimiostato como en cultivos semicontinuos, e cando a concentración de nutrintes alcanza o nivel de saturación o contido de ácidos graxos poliinsaturados volve a disminuír (Sukenik e Wahnon, 1991; Sukenik et al ., 1993; Saoudi-Helis et al ., 1994; Otero e Fábregas, 1997; Otero et al ., 1997b). En estudos sobre cultivos en quimiostato de Isochrysis galbana , Fernández Sevilla et al . (1998) concluíron que o contido celular dos ácidos graxos poliinsaturados non depende da radiación incidente ou da intensidade luminosa media no interior do cultivo, senón da taxa de crecemento. Este tipo de experimentos dirixidos á maximización da produtividade de ácidos graxos ω-3, especialmente EPA, empregan elevadas concentracións de nitróxeno. Probablemente estes cultivos microalgais están ___________Capítulo 3. Cultivo semicontinuo de T-ISO con intensidade luminosa moderada 105 saturados por nutrintes en todas ou case tódalas condicións de dilución e iluminación probadas, a diferencia dos nosos cultivos semicontinuos, limitados por nutrintes ata a taxa de renovación do 40% como indica a evolución de QN e C:N. En consecuencia, no cultivo semicontinuo as condicións de iluminación influíron de xeito decisivo no perfil de ácidos graxos de T-ISO en tódalas taxas de renovación, incluídas as do 40% e 50%, non limitadas por luz nin por nutrintes. A taxa de renovación determinou a evolución dos ácidos graxos, pero a intensidade luminosa modificou as porcentaxes e o contido celular de cada un deles. As variacións na composición bioquímica causadas polas diferentes taxas de renovación en T-ISO foron notablemente distintas en función da intensidade luminosa empregada. Podería pensarse que a diferencia na intensidade luminosa á que foron expostos os cultivos fixo variar a forma de aproveitamento da radiación incidente. As células sometidas a unha intensidade luminosa elevada almacenaron gran parte do carbono fixado durante a fotosíntese en forma de glícidos, e probablemente tamén se produciu a síntese de elevadas cantidades de exopolisacáridos. En cambio, cunha intensidade luminosa menor as células derivaron o carbono fixado á síntese de lípidos preferentemente, e polo tanto o contido celular de glícidos disminuíu respecto aos cultivos que recibiron a iluminación máis alta. Á vista destes resultados semella que T-ISO e, de acordo coa literatura revisada probablemente tamén outras especies do xénero Isochrysis , reacciona fronte á baixa dispoñibilidade de luz reducindo a síntese de glícidos en beneficio dunha maior acumulación de lípidos. A menor intensidade luminosa fixo variar, ademais do contido lipídico, o perfil de ácidos graxos, e a porcentaxe de ácidos graxos poliinsaturados foi maior nos cultivos sometidos a 97 µmoles quanta/m2/s en tódalas taxas de renovación. En cambio, non se rexistraron diferencias significativas nos valores de proteína nin de produtividade. A intensidade luminosa, xunto coa taxa de renovación, constitúe un parámetro de cultivo capaz de producir grandes modificacións na composición bioquímica de TISO en réxime semicontinuo e podería resultar moi útil de cara á producción dunha microalga cun perfil bioquímico determinado. Capítulo 3. Cultivo semicontinuo de T-ISO con intensidade luminosa moderada___________ 106 Táboa 2. Composición de Isochrysis aff. galbana (Clon T-ISO) cultivada en réxime semicontinuo cunha concentración de nitróxeno 4 mM e intensidade luminosa de 97 μmoles quanta/m2/s. Taxa de renovación 10 % 20 % 30 % 40 % 50% Densidade celular (106 cél/ml±std) 63,69 ±3,81 62,49 ±5,18 56,13 ±1,01 35,46 ±3,71 25,45 ±1,56 Produtividade (109 células/l/día) 6,37 12,50 16,84 14,18 12,73 Proteína (pg/cél±std) 3,38±0,25 3,82±0,32 3,80±0,15 5,22±0,22 3,66±0,29 Lípidos (pg/cél±std) 10,09±0,41 7,70±0,27 6,24±0,29 6,81±0,21 4,65±0,25 Glúcidos (pg/cél±std) 7,26±0,75 6,21±0,31 2,71±0,29 2,51±0,43 1,51±0,16 Total prot+líp+glúc (pg/cél±std) 20,73±1,04 17,72±0,34 12,73±0,44 14,54±0,49 9,82±0,68 Valor calórico (10-7 J/cél) 6,04 5,02 3,84 4,37 2,98 % proteína na F. O. 16,30 21,53 29,78 35,90 37,31 % lípidos na F. O. 48,68 43,46 48,95 46,82 47,33 % glúcidos na F. O. 35,02 35,01 21,27 17,28 15,36 QN (pg/cél±std) 0,72±0,07 0,96±0,13 0,87±0,06 1,07±0,09 0,87±0,12 QC (pg/cél±std) 9,78±1,07 8,73±1,16 6,49±0,49 6,41±0,60 5,22±0,75 Relación C:N (átomos) 15,8 10,6 8,6 7,0 7,0 Taxa de renovación 10% 20% 30% 40% 50% Ácidos graxos % ácidos graxos pg/cél % ácidos graxos pg/cél % ácidos graxos pg/cél % ácidos graxos pg/cél % ácidos graxos pg/cél 14:0 8,58 ±2,15 0,261 ±0,118 12,92 ±3,22 0,324 ±0,103 8,63 ±0,49 0,193 ±0,045 11,05 ±2,51 0,273 ±0,037 13,47 ±3,25 0,210 ±0,031 16:0 13,57 ±2,69 0,392 ±0,134 15,02 ±0,81 0,371 ±0,013 8,95 ±1,62 0,195 ±0,012 10,16 ±1,86 0,252 ±0,022 12,61 ±2,70 0,197 ±0,021 16:1 (ω-9) 0,85 ±1,29 0,025 ±0,038 1,39 ±1,04 0,034 ±0,026 0,96 ±0,90 0,021 ±0,018 1,73 ±0,23 0,043 ±0,004 0,88 ±0,79 0,013 ±0,012 16:1 (ω-7) 5,12 ±1,28 0,142 ±0,046 5,09 ±0,91 0,125 ±0,019 4,33 ±0,97 0,094 ±0,014 3,56 ±0,91 0,088 ±0,015 4,27 ±0,89 0,068 ±0,015 16:2 (ω-6) 0,31 ±0,13 0,011 ±0,005 0,39 ±0,07 0,010 ±0,001 0,47 ±0,09 0,010 ±0,001 0,53 ±0,13 0,013 ±0,002 0,51 ±0,09 0,008 ±0,002 16:2 (ω-4) 0,77 ±0,23 0,021 ±0,008 0,51 ±0,05 0,013 ±0,000 0,42 ±0,01 0,009 ±0,002 0,56 ±0,11 0,014 ±0,002 0,53 ±0,05 0,008 ±0,001 18:0 2,44 ±1,49 0,037 ±0,010 1,13 ±0,17 0,028 ±0,003 1,19 ±0,29 0,026 ±0,001 1,31 ±0,30 0,033 ±0,011 1,89 ±0,47 0,029 ±0,004 18:1 (ω-9) 21,75 ±2,30 0,603 ±0,110 16,98 ±0,49 0,420 ±0,024 15,68 ±1,72 0,346 ±0,050 12,78 ±0,48 0,322 ±0,045 14,21 ±2,20 0,228 ±0,060 18:1 (ω-7) 1,46 ±0,45 0,038 ±0,010 0,88 ±0,06 0,022 ±0,001 1,04 ±0,19 0,024 ±0,010 0,96 ±0,08 0,024 ±0,005 0,89 ±0,22 0,014 ±0,005 18:2 (ω-6) 5,24 ±1,14 0,142 ±0,023 4,17 ±0,57 0,102 ±0,006 6,61 ±0,62 0,146 ±0,022 5,71 ±0,61 0,144 ±0,027 4,06 ±0,72 0,065 ±0,018 18:3 (ω-6) 0,12 ±0,01 0,003 ±0,000 0,27 ±0,04 0,007 ±0,001 0,60 ±0,07 0,014 ±0,005 0,51 ±0,05 0,013 ±0,002 0,37 ±0,05 0,006 ±0,001 18:3 (ω-3) 5,85 ±0,99 0,162 ±0,010 6,36 ±0,50 0,157 ±0,006 9,19 ±0,57 0,209 ±0,064 8,72 ±0,77 0,220 ±0,037 7,32 ±0,81 0,117 ±0,026 18:4 (ω-3) 15,07 ±3,25 0,416 ±0,032 15,47 ±1,36 0,382 ±0,021 25,04 ±5,53 0,583 ±0,275 21,40 ±3,58 0,543 ±0,145 19,84 ±3,43 0,319 ±0,088 20:0 0,25 ±0,21 0,009 ±0,001 0,83 ±0,31 0,021 ±0,008 0,03 ±0,05 0,001 ±0,001 0,30 ±0,31 0,008 ±0,009 0,25 ±0,43 0,003 ±0,006 20:1 (ω-9) 0,27 ±0,36 0,001 ±0,001 0,30 ±0,48 0,007 ±0,012 0,08 ±0,10 0,002 ±0,002 1,43 ±2,48 0,034 ±0,059 0,11 ±0,10 0,002 ±0,002 Táboa 3. Composición de ácidos graxos de Isochrysis aff. galbana (Clon T-ISO) cultivada en réxime semicontinuo cunha concentración de nitróxeno 4 mM e intensidade luminosa de 97 μmoles quanta/m2/s, expresada en porcentaxes sobre o total de ácidos graxos e pg/célula. 20:2 (ω-7) 0,20 ±0,14 0,007 ±0,001 0,14 ±0,04 0,004 ±0,001 0,35 ±0,23 0,007 ±0,004 0,03 ±0,03 0,001 ±0,001 0,23 ±0,29 0,004 ±0,005 20:3 (ω-6) 0,09 ±0,04 0,003 ±0,001 0,07 ±0,01 0,002 ±0,000 0,09 ±0,03 0,002 ±0,001 0,06 ±0,01 0,001 ±0,000 0,06 ±0,00 0,001 ±0,000 20:4 (ω-6) 0,10 ±0,05 0,003 ±0,001 0,09 ±0,01 0,002 ±0,000 0,14 ±0,03 0,003 ±0,001 0,12 ±0,02 0,003 ±0,001 0,10 ±0,01 0,002 ±0,000 20:5 (ω-3) 1,25 ±0,96 0,033 ±0,020 0,69 ±0,19 0,017 ±0,005 0,75 ±0,26 0,017 ±0,007 0,76 ±0,04 0,019 ±0,002 0,75 ±0,21 0,012 ±0,004 22:0 0,59 ±0,31 0,017 ±0,007 0,39 ±0,04 0,010 ±0,001 0,15 ±0,02 0,003 ±0,000 0,15 ±0,04 0,004 ±0,002 0,19 ±0,06 0,003 ±0,001 22:1 (n-9) 0,41 ±0,09 0,012 ±0,001 0,42 ±0,13 0,010 ±0,004 0,19 ±0,06 0,004 ±0,002 0,10 ±0,07 0,003 ±0,002 0,07 ±0,02 0,001 ±0,000 22:5 (ω-6) 2,98 ±0,30 0,085 ±0,012 3,29 ±0,28 0,081 ±0,002 2,42 ±0,35 0,054 ±0,013 3,02 ±0,27 0,076 ±0,015 2,89 ±0,33 0,046 ±0,010 22:6 (ω-3) 12,59 ±0,23 0,363 ±0,059 13,21 ±1,58 0,329 ±0,061 12,69 ±1,60 0,284 ±0,068 15,04 ±2,10 0,381 ±0,091 14,50 ±2,12 0,229 ±0,036 Total 2,787 ±0,367 2,476 ±0,202 2,248 ±0,558 2,513 ±0,272 1,587 ±0,188 Saturados 25,43 ±5,89 0,716 ±0,242 30,29 ±2,22 0,753 ±0,114 18,95 ±2,20 0,418 ±0,057 22,98 ±3,85 0,571 ±0,042 28,42 ±6,64 0,443 ±0,055 Monosaturados 29,87 ±2,91 0,821 ±0,159 25,05 ±1,01 0,619 ±0,026 22,29 ±2,55 0,492 ±0,064 20,57 ±2,25 0,514 ±0,042 20,42 ±1,73 0,326 ±0,064 Poliinsaturados 41,57 ±6,42 1,164 ±0,036 41,37 ±1,06 1,023 ±0,064 56,34 ±4,82 1,285 ±0,427 53,42 ±5,61 1,352 ±0,287 48,27 ±4,58 0,771 ±0,158 Sat+Mono 55,30 ±6,38 1,538 ±0,347 55,34 ±1,27 1,372 ±0,140 41,24 ±4,67 0,910 ±0,120 43,55 ±5,81 1,085 ±0,062 48,85 ±4,92 0,769 ±0,037 ω-3 34,75 ±5,37 0,975 ±0,016 35,73 ±0,39 0,884 ±0,068 47,67 ±5,62 1,093 ±0,399 45,91 ±5,25 1,163 ±0,261 42,40 ±4,01 0,677 ±0,136 ω-6 6,05 ±1,36 0,162 ±0,021 5,13 ±0,68 0,123 ±0,007 8,25 ±0,86 0,175 ±0,030 6,96 ±0,63 0,175 ±0,029 5,34 ±1,02 0,082 ±0,021 ω-3 : ω-6 5,83 ±0,69 7,04 ±0,82 5,87 ±1,34 6,60 ±0,56 8,09 ±1,25 EPA : ARA 13,10 ±7,39 7,39 ±2,54 5,32 ±0,62 6,34 ±1,28 7,40 ±1,14 DHA : EPA 15,06 ±10,59 20,74 ±8,60 17,82 ±3,83 20,02 ±3,62 20,82 ±7 50 109 ____________________________Capítulo 4. Cultivo semicontinuo de Nannochloropsis gaditana con intensidade luminosa elevada Capítulo 4. Cultivo semicontinuo de Nannochloropsis gaditana_________________________ 116 A cota celular de carbono, QC, mantívose elevada entre as taxas de renovación do 10% ao 30% e disminuíu nas taxas de renovación superiores (Táboa 1). A disminución da cota celular de carbono QC en condicións de saturación por nitróxeno difire dos resultados obtidos por Otero et al . (1998) nun cultivo semicontinuo de Phaeodactylum tricornutum cunha concentración 4 mM de nitróxeno, no que QC experimentou unha evolución parabólica, rexistrando valores mínimos nas taxas de renovación intermedias. En cultivos en quimiostato de Thalassiosira fluviatilis limitados por nutrintes, o incremento da taxa de dilución fai que o consumo de carbono na respiración celular aumente de forma lineal, sen embargo a cota celular de carbono mantense practicamente constante nesas condicións, debido a que unha maior dispoñibilidade de nutrintes provoca un incremento da produtividade fotosintética. No caso de que a limitación sexa por luz, QC increméntase coa taxa de dilución (Laws and Bannister, 1980). Laws and Wong (1978) tamén citan un aumento da taxa de respiración en Thalassiosira allenii , Monochrysis lutheri e Dunaliella tertiolecta , pero polo contrario rexistraron unha disminución de QC coa taxa de dilución. O sistema de cultivo semicontinuo xenerou unha ampla variabilidade na composición bioquímica de N. gaditana dependente da taxa de renovación. A Figura 5. Porcentaxes de proteínas, lípidos e glícidos na fracción orgánica de Nannochloropsis gaditana.  proteínas;  lípidos;  glícidos. Figura 6. Contido celular (pg/célula) de proteínas, lípidos e glícidos de Nannochloropsis gaditana. -zproteínas; -zlípidos; -zglícidos. _________________________Capítulo 4. Cultivo semicontinuo de Nannochloropsis gaditana 117 proporción de proteína na fracción orgánica incrementouse ata a taxa de renovación do 30%, na que o nitróxeno deixa de ser un nutrinte limitante, pasando do 36,19% ao 60,39%. Nas taxas de renovación superiores mantívose esta elevada porcentaxe de proteína. Paralelamente, houbo descensos nas porcentaxes de lípidos e glícidos. A fracción lipídica reduciuse á metade, de 35,34% a 18,60%, entre as taxas de renovación do 10 % e do 30 %, recuperándose lixeiramente nas taxas de renovación superiores. A porcentaxe de glícidos disminuíu ao aumentar a taxa de renovación, desde 28,47% ata 16,71% (Figura 5, Táboa 1). As variacións que experimentan as porcentaxes de proteínas, lípidos e glícidos na fracción orgánica tamén se manifestan no contido celular, sendo a evolución de cada compoñente paralela á da súa respectiva porcentaxe na fracción orgánica. A cantidade de proteína por célula aumenta desde 1,60 pg/célula na taxa de renovación do 10% ata 2,65 pg/célula na taxa de renovación do 30%, para descender lixeiramente nas taxas de renovación superiores. Os valores obtidos foron maiores que os de N. gaditana cultivada en panel con 4 mM de nitróxeno e taxa de renovación do 40% (Fábregas et al ., 2002). A evolución do contido da proteína é paralela á de C:N e QN e altamente dependente da concentración de nitróxeno no medio de cultivo. En condicións de limitación por nitróxeno a cantidade de proteína por célula increméntase seguindo a mesma tendencia que QN e estabilízase cando o fai a relación C:N. A proteína é o compoñente maioritario da fracción orgánica do xénero Nannochloropsis (Sukenik and Carmeli, 1990; Volkman et al ., 1993; Hu and Gao, 2003), pero contidos de proteína elevados son característicos de microalgas cultivadas con altas concentracións de nitróxeno, como os que se conseguen en sistemas semicontinuos con taxas de renovación altas. Nestes casos a porcentaxe de proteína na fracción orgánica de Nannochloropsis gaditana (Fábregas et al ., 2002) e Nannochloropsis sp. (Fábregas et al ., 2004) sobrepasa o 40%. Os medios de cultivo pobres en nitróxeno reducen o contido proteínico a menos dun 20% do peso seco celular en Nannochloropsis , aínda que a proteína segue sendo a fracción orgánica maioritaria (Volkman et al ., 1993). A intensidade luminosa tamén exerce un efecto sobre o contido de proteína xa que esta acada o Capítulo 4. Cultivo semicontinuo de Nannochloropsis gaditana_________________________ 118 seu valor máximo en condicións de saturación por luz que permiten converter en proteína o 100 % do nitróxeno dispoñible (Fábregas et al ., 2004). Suplementar con CO2 a aireación dos cultivos incrementa a producción de proteína, mentres que a adición de acetato como fonte de carbono ten un efecto positivo pero menos intenso (Hu and Gao, 2003). Os lípidos experimentaron unha evolución inversa á das proteínas, disminuíndo de 1,57 pg/célula na taxa de renovación do 10% a 0,82 pg/célula na taxa de renovación do 30%. Nas taxas de renovación máis elevadas a cantidade de lípidos increméntase ata alcanzar valores arredor de 1 pg/célula. A disminución do contido de lípidos por célula a medida que aumenta a taxa de dilución en quimiostatos limitados por nitróxeno xa foi documentada por Sukenik et al . (1993) en Nannochloropsis sp. Rebolloso-Fuentes et al . (2001) rexistran resultados similares en Nannochloropsis sp. cultivada en quimiostato con luz continua, cunha disminución da porcentaxe de lípidos sobre o peso seco da microalga acompañada dun incremento da proteína ao aumentar a taxa de dilución, o que suxire que no seu sistema experimental os cultivos están limitados por nutrintes en tódalas taxas de dilución. O contido de lípidos de Nannochloropsis gaditana nas taxas de renovación con saturación de nitróxeno (1,12±0,06 e 1,04±0,12 pg/célula nas taxas de renovación do 40% e 50% respectivamente) foi menor que o obtido en N. gaditana cultivada en panel cunha taxa de renovación do 40%, no que a concentración residual de nitrato no medio de cultivo era 2 mM (Fábregas et al ., 2002). É posible que no cultivo en panel a menor dispoñibilidade de luz inducira na microalga un aumento da síntese de ácidos graxos poliinsaturados e pigmentos fotosintéticos para incrementar a superficie de membrana tilacoidal e mellorar o aproveitamento da escasa luz incidente. Sen embargo, o aumento do contido lipídico nas taxas de renovación con exceso de nutrintes, nas que se produce unha saturación por luz debido á baixa densidade celular, non pode explicarse por un incremento no contido de triacilglicéridos, fosfolípidos ou galactolípidos, xa que a cantidade de ácidos graxos saturados e monoinsaturados redúcese a menos da metade cando desaparece a limitación por nutrintes e esta disminución non se compensa co incremento dos poliinsaturados (Figura 7B; Táboa 2). É posible que _________________________Capítulo 4. Cultivo semicontinuo de Nannochloropsis gaditana 119 o exceso de luz inducira un aumento da síntese de esterois ou de carotenoides, que teñen a finalidade de protexer os sistemas fotosintéticos da fotooxidación. Nannochloropsis gaditana acumula carotenoides, especialmente cantaxantina, na fase de crecemento expoñencial en cultivos con concentracións de nitróxeno relativamente altas (2 mM) e intensidades luminosas elevadas, entre 83-110 µmol quanta/m2/s (Lubián et al ., 1986). Se hai dispoñibilidade de nutrintes, Nannochloropsis sp. sintetiza máis lípidos con maiores intensidades de luz, pero este incremento na síntese lipídica detense cando a luz alcanza intensidades inhibitorias (Sukenik et al ., 1989; 1993). En condicións de limitación por nitróxeno, sen embargo, a proporción de lípidos na fracción orgánica experimenta só un lixeiro incremento ao duplicarse a intensidade luminosa de 220 a 480 µm quanta/m2/s (Fábregas et al ., 2004). O comportamento da fracción lipídica en sistemas semicontinuos varía segundo a especie de microalga. Xa se observou que en T-ISO o contido de lípidos descende ao aumentar a taxa de renovación ata o punto de saturación por nitróxeno, estabilizándose ou descendendo a continuación, mentres que Isochrysis galbana evoluciona igual que Nannochloropsis gaditana , xa que o seu contido lipídico aumenta novamente cando hai un exceso de nitróxeno (Otero et al ., 1997). En Phaeodactylum tricornutum prodúcese un descenso continuo dos lípidos coa taxa de renovación (Fábregas et al ., 1998). Polo contrario, en Tetraselmis suecica cultivada con concentracións de nitrato 2 e 4 mM o porcentaxe de lípidos na fracción orgánica increméntase coa taxa de renovación ata o punto de saturación por nitróxeno (Otero e Fábregas, 1997). No caso dos glícidos o contido celular redúcese á metade a medida que a taxa de renovación aumenta, disminuíndo linealmente de 1,26 pg/célula na taxa de renovación do 10% a 0,67 pg/célula na taxa de renovación do 50% (Figura 6, Táboa 1). Os glícidos son os constituíntes da fracción orgánica presentes en menor cantidade en Nannochloropsis gaditana . No xénero Nannochloropsis o contido celular de glícidos descende de forma lineal en resposta a un incremento na dispoñibilidade de nitróxeno, tanto en sistemas semicontinuos como o aquí descrito como en quimiostatos con iluminación continua (Sukenik et al ., 1993). As cantidades de glícidos obtidas nas taxas de renovación máis altas, 0,74±0,03 e Capítulo 4. Cultivo semicontinuo de Nannochloropsis gaditana_________________________ 120 0,67±0,01 pg/célula nas taxas de renovación do 40% e 50% respectivamente, son lixeiramente maiores que as obtidas por Fábregas et al. (2002) nun cultivo semicontinuo en panel saturado por nitróxeno. En condicións de saturación por nutrintes, as células de Nannochloropsis sp. incrementan o seu contido de glícidos en resposta a un aumento na intensidade luminosa, mesmo se esta alcanza valores que poden causar fotoinhibición (Sukenik et al. , 1989). A resposta é similar en cultivos limitados por nitróxeno: a fracción glucídica en Nannochloropsis sp. increméntase con intensidades luminosas elevadas (Fábregas et al. , 2004). Outras especies microalgais responden do mesmo xeito cando se cultivan en réxime semicontinuo. En Tetraselmis suecica cultivada cunha concentración de nitróxeno 2 mM, o contido celular de glícidos redúcese de 100 pg/célula coa taxa de renovación do 10% a soamente 20 pg/célula coa taxa de renovación do 50 % (Otero and Fábregas, 1997). A porcentaxe de glícidos na fracción orgánica de Phaeodactylum tricornutum disminúe coa taxa de renovación cando os cultivos están limitados por nitróxeno, e estabilízase cando o nitróxeno deixa de ser limitante (Fábregas et al. , 1996). O mesmo comportamento dos glícidos en relación á dispoñibilidade de nitróxeno rexístrase en Isochrysis galbana (Otero et al. , 1997a). A disminución de lípidos e glícidos non foi compensada co incremento no contido proteico, polo que se produciu unha reducción do contido orgánico celular, expresado como a suma de proteínas, lípidos e glícidos. Polo contrario, a porcentaxe orgánica das células, expresada como a suma das porcentaxes sobre o peso seco celular de proteína, lípidos e glícidos sobre o peso seco celular, incrementouse coa taxa de renovación en condicións de limitación por nitróxeno. En condicións de saturación por nitróxeno, a porcentaxe orgánica disminuíu lixeiramente (Táboa 1). As variacións ocasionadas polo cultivo semicontinuo no contido lipídico de Nannochloropsis gaditana van acompañadas de intensas modificacións no seu perfil de ácidos graxos, tanto nas porcentaxes sobre o total dos ácidos graxos como no contido celular dos mesmos. O efecto da taxa de renovación sobre o _________________________Capítulo 4. Cultivo semicontinuo de Nannochloropsis gaditana 121 contido de ácidos graxos de N. gaditana foi moito máis marcado que en T-ISO cultivada coa mesma intensidade luminosa (Capítulo 2). Os ácidos graxos totais descenderon ata a taxa de renovación do 40%, pasando de 1,18 a 0,54 pg/célula, e incrementáronse lixeiramente na taxa de renovación do 50%. Esta disminución debeuse a un forte descenso do contido dos ácidos graxos saturados e monoinsaturados a medida que aumentou a taxa de renovación en condicións de limitación por nitróxeno, que estivo acompañado dun incremento do contido de ácidos graxos poliinsaturados ata a taxa de renovación do 30%. En porcentaxes, os ácidos graxos saturados e monoinsaturados pasaron de representar o 78% dos ácidos graxos totais na taxa de renovación do 10% ao 60% a partir da taxa de renovación do 30%, e os poliinsaturados incrementáronse do 22% ao 40% nas mesmas condicións. A partir da taxa de renovación do 30%, na que o nitróxeno deixa de ser un nutrinte limitante, as porcentaxes dos distintos ácidos graxos estabilízanse (Figuras 7A, 7B; Táboa 2). Os ácidos graxos máis abundantes en Nannochloropsis gaditana son o ácido palmítico (ácido hexadecanoico, 16:0), o ácido palmitoleico (ácido 9hexadecenoico, 16:1ω-7) e o ácido eicosapentaenoico, 20:5ω-3 (EPA). Aínda que o contido de cada un deles variou fortemente en función da taxa de renovación, a Figura 7. Evolución do contido de ácidos graxos saturados, monoinsaturados e poliinsaturados de Nannochloropsis gaditana en cultivo semicontinuo. A: expresado en porcentaxe sobre o total dos ácidos graxos. B: expresado en pg de ácido graxo por célula. -▲-, ácidos graxos saturados + monoinsaturados; -z-, ácidos graxos poliinsaturados. Capítulo 4. Cultivo semicontinuo de Nannochloropsis gaditana_________________________ 122 suma dos tres constituíu en tódolos casos arredor do 75% do total dos ácidos graxos. Os ácidos mirístico (ácido tetradecanoico, 14:0), oleico (ácido 9octadecenoico, 18:1ω-9) e araquidónico (ácido eicosatetraenoico, 20:4ω-6) son tamén relativamente abundantes en N. gaditana , aínda que en ningún caso superaron o 10% do total. Estes son tamén os ácidos graxos máis abundantes noutras especies do xénero Nannochloropsis : N. salina e N. oculata (Volkman et al ., 1993) e Nannochloropsis sp. (Sukenik et al ., 1993). As súas proporcións relativas, sen embargo, varían enormemente en función das condicións de cultivo, sendo os principais factores desa variación a dispoñibilidade de nutrintes e a intensidade luminosa. Os demais ácidos graxos de Nannochloropsis gaditana son minoritarios e agás o ácido linoleico (ácido 9,12-octadecadienoico, 18:2ω-6) ningún se presentou en porcentaxes maiores do 3% (Táboa 2). O efecto da concentración de nutrintes sobre a composición de ácidos graxos en microalgas está amplamente estudiado tanto en cultivos discontinuos (Dunstan et al ., 1993; Brown et al ., 1996) como en continuos (Sukenik et al ., 1993; López Alonso et al ., 2000) e semicontinuos (Dunstan et al ., 1993; Fábregas et al ., 1998; Otero et al ., 1995; Otero et al ., 1997a; Otero et al ., 1997b; Reitan et al ., 1994). A carencia de nutrintes debida a unha taxa de dilución baixa en cultivos continuos e semicontinuos provoca unha disminución da proporción de ácidos graxos poliinsaturados, principalmente ω-3, polo que a relación ω-3/ω-6 disminúe en condicións de limitación por nutrintes, de maneira similar ao que acontece nos cultivos discontinuos en fase estacionaria. O esgotamento dos nutrintes fai que as células deixen de dividirse e deriven a enerxía captada á síntese de productos de reserva, principalmente triacilglicerois, nos que predominan os ácidos graxos saturados e monoinsaturados. Algúns autores sinalan unha correlación positiva entre a proporción de triacilglicerois e a de ácidos graxos saturados e monoinsaturados e entre a proporción de lípidos polares e a de ácidos graxos poliinsaturados (Brown et al ., 1996). En Nannochloropsis sp., os ácidos graxos 20:5ω-3 e o 20:4ω-6 atópanse case exclusivamente localizados en galactolípidos, que tamén presentan 16:0 e 16:1, mentres que os lípidos neutros presentan 16:0 e 16:1 e cantidades menores de 14:0 e 18:0, e os fosfolípidos conteñen 16:1, 18:1 e 18:4, ausente en N. gaditana (Sukenik et al ., 1989). _________________________Capítulo 4. Cultivo semicontinuo de Nannochloropsis gaditana 123 As porcentaxes de 16:0 e 16:1ω-7 descenderon coa taxa de renovación en condicións de limitación por nitróxeno, estabilizándose a partir da taxa de renovación do 30 %. O 16:0 pasou de representar o 36,27% do total de ácidos graxos na taxa de renovación do 10 % a un 22,88% na taxa de renovación do 30%. A proporción de 16:1ω-7 descendeu do 31,59% ao 24,35% entre a taxas de renovación do 10% e do 30 %. O 18:1ω-9 disminuíu a medida que aumentaba a taxa de renovación en condicións de limitación por nitróxeno, pasando do 10,18% ao 2,92% na taxa de renovación do 30%, e incrementándose lixeiramente nas taxas de renovación superiores. As variacións que experimentou o contido celular de cada un destes ácidos graxos debido ao cultivo semicontinuo foron aínda maiores. O 16:0 experimentou o descenso máis drástico, pois a cantidade por célula disminuíu entre 3 e 3,5 veces, de 0,429 pg/célula na taxa de renovación do 10% a 0,122 pg/célula na taxa de renovación do 40%. A disminución do contido de 16:1ω-7 foi algo menor, baixando de 0,374 pg/célula na taxa de renovación do 10% a 0,132 pg/célula na taxa de renovación do 40%. O contido celular de 18:1ω-9 disminuíu de 0,120 a 0,020 pg/célula. O 14:0 non segue a tendencia xeral dos ácidos graxos saturados e monoinsaturados e a súa porcentaxe mantívose practicamente constante en tódalas taxas de renovación, aínda que o seu contido celular se reduciu á metade ao incrementarse a taxa de renovación (Táboa 2). No que se refire aos ácidos graxos poliinsaturados, a porcentaxe de EPA (20:5ω-3) cuadruplicouse, aumentando do 6,76% na taxa de renovación do 10% ao 27,11% na taxa de renovación do 30%. A pesares de que a porcentaxe de EPA sobre o total dos ácidos graxos se multiplicou por catro, o contido celular nas taxas de renovación máis altas –nas que o nitróxeno está en exceso no medio de cultivorespecto á taxa de renovación do 10% soamente se duplicou, pasando de 0,079 pg/célula a un máximo de 0,179 pg/célula (Figuras 8A, 8B; Táboa 2). Unha evolución semellante dáse en Phaeodactylum tricornutum , no que a porcentaxe de EPA se incrementa coa taxa de renovación en cultivos semicontinuos con diferentes concentracións de nutrintes, e se estabiliza ao redor dun 25%, coincidindo coas taxas de renovación nas que hai un exceso de nitróxeno no medio (Otero et al ., 1995). O ARA (20:4ω-6) duplicouse entre as taxas de renovación do 10% e o 30%, pasando dun 3,56% a un 6,55% e mantívose Capítulo 4. Cultivo semicontinuo de Nannochloropsis gaditana_________________________ 124 constante nas taxas de renovación superiores, aínda que o contido por célula case non variou, entre 0,037 e 0,049 pg/célula (Figura 8A, 8B; Táboa 2). As porcentaxes dos distintos ácidos graxos que se mostran neste traballo son semellantes ás rexistradas por Dunstan et al . (1993) en Nannochloropsis oculata tanto en réxime semicontinuo como en fase estacionaria, aínda que N. oculata presentou unha proporción de 20:5ω-3 sensiblemente maior e cantidades de ácidos graxos saturados e monoinsaturados lixeiramente menores en tódalas condicións e fases de cultivo probadas. Dado que outros autores non rexistran porcentaxes de 20:5ω-3 superiores ao 30% do total dos ácidos graxos no xénero Figura 8. Ácidos graxos poliinsaturados de Nannochloropsis gaditana. A: evolución do contido de EPA (-z-) e ARA (-z-) en función da taxa de renovación. B: evolución do contido de ácidos graxos poliinsaturados ω-3 (-z-) e ω-6 (-z-). C e D: relacións EPA/ARA e ω-3/ω-6. _________________________Capítulo 4. Cultivo semicontinuo de Nannochloropsis gaditana 125 Nannochloropsis , a proporción tan elevada sinalada por Dunstan podería deberse a algunha particularidade no método de determinación dos ácidos graxos. O incremento do contido de ácidos graxos poliinsaturados coa taxa de renovación reflexouse tanto no grupo dos ácidos graxos ω-3 como no grupo dos ω-6. A porcentaxe dos ω-3 multiplicouse por catro debido ao forte incremento do contido en EPA entre as taxas de renovación do 10% e o 30%, mentres que a proporción de ω-6 soamente se duplicou. Desta maneira, a relación ω-3:ω-6 aumentou de 1,26 a 2,29 (Figura 8D). A relación EPA:ARA tamén se duplicou, pasando de 1,90 na taxa de renovación do 10% a 4,14 na taxa de renovación do 30% (Figura 8C; Táboa 2). En definitiva, o cultivo semicontinuo causou unha ampla variabilidade bioquímica en Nannochloropsis gaditana . Os efectos máis interesantes de cara á utilización desta microalga como base da cadea alimentaria no cultivo larvario de peixes son os incrementos no contido de proteína e de ácidos graxos poliinsaturados, principalmente EPA, en condicións de saturación por nitróxeno no medio. A influencia que estas modificacións poidan ter sobre o valor nutritivo da microalga para a súa utilización no cultivo ou enriquecemento de Brachionus plicatilis permitirán definir as condicións óptimas de cultivo para Nannochloropsis gaditana . Capítulo 5. Enriquecemento de Brachionus plicatilis con T-ISO_________________________ 132 nas botellas foi de 200 individuos/ml. Aplicouse aireación suave para manter o alimento e os rotíferos distribuídos uniformemente por toda a columna de auga. Ás 24 horas os rotíferos recolléronse e distribuíronse da seguinte maneira: 100 ml recolléronse para determinar peso seco, 80 ml recolléronse nunha malla de 40 µm de luz e foron conxelados para a posterior determinación de ácidos graxos e os rotíferos restantes recolléronse nunha malla, laváronse con auga destilada, transferíronse a tubos de vidro e foron conxelados e posteriormente liofilizados para realizar análises de proteínas, lípidos, glícidos, e análise elemental. Antes de iniciar o experimento recolleuse do botellón unha cantidade de rotíferos como mostra control. Resultados e discusión Despois das 24 horas de alimentación a densidade nos cultivos de rotíferos variou respecto á densidade inicial. A densidade máxima obtívose nos cultivos alimentados con T-ISO cultivada cunha taxa de renovación do 30%, e disminuíu progresivamente nos grupos alimentados con microalgas das taxas de renovación inferiores e superiores; a disminución foi máis marcada nos cultivos alimentados coas taxas de renovación do 40% e 50% (Figura 1, Táboa 1). A disminución do número de rotíferos respecto da densidade inicial na maioría das condicións probadas pode deberse a que a ausencia de alimento nas 12 horas previas ao experimento provocou un incremento da mortalidade que non foi compensado co nacemento de novos individuos. O peso inicial dos rotíferos foi moi baixo, indicando que a poboación se atopaba en malas condicións de alimentación. A ración de microalga por rotífero foi calculada en base aos resultados de Patiño (1995), que concluíu que unha ración de 2.000 Tetraselmis suecica por rotífero é consumida case por completo en 24 horas e asegura unha taxa de inxestión constante, evitando a alternancia de periodos de saturación do sistema dixestivo e periodos de reducción da actividade filtradora. Experimentos de enriquecemento con distintas cantidades de microalga confirmaron que racións maiores non dan lugar a mellores resultados no incremento do contido de _________________________Capítulo 5. Enriquecemento de Brachionus plicatilis con T-ISO 133 proteínas ou ácidos graxos poliinsaturados (Capítulo 8). O peso seco medio das racións de T-ISO, uns 470 ng/rotífero, equivale ao peso de 2.000 T. suecica , considerando un peso seco para T. suecica de 200-220 pg/célula. O reconto das células de T-ISO sobrantes indica que a inxestión de microalga se incrementou desde as 22.800 células consumidas por rotífero na taxa de renovación do 10% a case 26.000 células na taxa de renovación do 30%, mentres que nas taxas de renovación do 40% e 50% o consumo foi moito menor, algo máis de 21.000 células/rotífero (Figura 1; Táboa 1). Porén, debe terse en conta que as células microalgais introducidas nos cultivos de rotífero puideron seguir dividíndose, especialmente aquelas que foran cultivadas cunha taxa de renovación alta e polo tanto eran células xóvenes e en boas condicións fisiolóxicas. Este feito pode levar a subestimar o consumo de células de T-ISO por parte dos rotíferos nas taxas de renovación do 40% e 50%. Os rotíferos enriquecidos alcanzaron un peso seco entre 2,5 e 4 veces superior ao dos rotíferos control (115,30±16,28 ng/rotífero). O peso seco disminuíu desde a taxa de renovación do 10%, con 312 ng/rotífero ata a taxa de renovación do 30% con 282 ng/rotífero, pero os pesos máis elevados rexistráronse nas taxas de renovación do 40% e 50%, chegando a 475 ng/rotífero nos individuos que recibiron microalga da taxa de renovación do 50% (Figura 2; Táboa 2). Tendo en conta a densidade de rotíferos ao final do experimento e o Figura 1. Densidade de rotíferos () e número de células inxeridas (-¡-) despois do enriquecemento de 24 h con Isochr y sis aff. g albana T-ISO. Figura 2. Peso seco dos rotíferos control (C) e dos sometidos a enriquecemento con TISO. Capítulo 5. Enriquecemento de Brachionus plicatilis con T-ISO_________________________ 134 peso seco individual, obsérvase que a produción neta de biomasa foi practicamente igual nos grupos alimentados con microalgas das taxas de renovación entre o 10% e o 30%, mentres que nas taxas de renovación superiores se rexistrou un forte incremento. Non se determinou a relación ovo/rotífero, pero é probable que o peso dos rotíferos alimentados con microalgas das taxas de renovación do 40% e 50% se debera a unha elevada produción de ovos. O peso do ovo depende da cepa de rotífero, pero tamén varía coa especie de microalga empregada como alimento (Yúfera et al ., 1993), e contríbúe de forma importante á biomasa do cultivo, existindo unha alta correlación positiva entre a relación ovo/rotífero e o peso seco por individuo (Scott e Baynes, 1978; Yúfera et al ., 1983). O aumento do peso individual compensou o menor número de rotíferos por ml, especialmente nos alimentados con microalgas das taxas de renovación de 40% e 50%. Polo tanto, a FCR, calculada como a relación entre o peso inxerido de T-ISO e a produción neta de biomasa de rotífero por ml disminuíu coa taxa de renovación, pasando de 2,6 a 1,3 nas taxas de renovación do 40% e 50%. Se a FCR se calcula a partir do peso total de T-ISO subministrado por ml, a tendencia é a mesma (Táboa 1). O peso orgánico dos rotíferos seguiu a mesma evolución que o peso seco. Xa que o contido orgánico de T-ISO descendía coa taxa de renovación (Capítulo 2), a FCR orgánica experimentou un descenso de forma completamente lineal, e en consecuencia houbo correlación negativa (R2=0,78) entre a biomasa orgánica de T-ISO inxerida e a biomasa orgánica de rotífero por Figura 3. Correlación entre o peso orgánico de T-ISO inxerido e o peso orgánico de rotífero (µg/ml). _________________________Capítulo 5. Enriquecemento de Brachionus plicatilis con T-ISO 135 ml (Figura 3). A reducción da FCR coa taxa de renovación, xa foi observado en Artemia sp. alimentada con Tetraselmis suecica , así como un incremento da produtividade e do peso seco individual de Artemia (Fábregas et al ., 2001). A composición bioquímica dos rotíferos resultou afectada polos cambios na composición de T-ISO debidos á taxa de renovación dos cultivos. Os tres compoñentes orgánicos rexistraron fortes incrementos respecto aos rotíferos control recollidos antes do enriquecemento. O contido de proteína mantívose máis ou menos constante, arredor de 100 ng/rotífero, nos rotíferos que recibiron T-ISO cultivada con taxas de renovación do 10% ao 30%, a mesma tendencia observada na microalga. Coas taxas de renovación máis altas a proteína incrementouse ata os 158 ng/rotífero nos alimentados coa taxa de renovación do 50%, a pesares de que nestas condicións o contido de proteína da microalga disminuíu (Figura 4; Táboa 1; Táboa 2). Os contidos proteicos da microalga e do rotífero presentaron unha correlación positiva elevada (R2=0,914) ata a taxa de renovación do 40%. A existencia de correlación positiva entre a porcentaxe de proteína de varias especies de microalgas e a porcentaxe de proteína do rotífero alimentado con elas é citada por algúns autores (Frolov et al ., 1991). A porcentaxe de proteína nos rotíferos está comprendida nun rango entre o 28% e o 59% aproximadamente (Scott e Baynes, 1978; Ben-Amotz et al ., 1987; Frolov et al ., 1991), e constitúe o compoñente orgánico maioritario dos rotíferos independentemente do tipo de alimento que reciban, pero o contido de proteína por individuo é moi variable e increméntase sensiblemente cando os rotíferos son alimentados con dietas ricas en proteína (Øie et al ., 1997; Øie e Olsen, 1997), como acontece no noso caso. Os lípidos disminuíron lixeiramente desde 34 ng/rotífero na taxa de renovación do 10% ata os 28 ng/rotífero nos alimentados con microalgas da taxa de renovación do 30%, e despois incrementáronse ata 45 ng/rotífero nos alimentados coa taxa de renovación máis alta (Figura 4; Táboa 2). Non existe correlación entre o contido lipídico de T-ISO e dos rotíferos, aínda que outros autores citan a existencia de correlación en experimentos de cultivo de rotíferos (Frolov et al ., 1991). A porcentaxe de lípidos no peso seco que se obtén cando os rotíferos se alimentan con microalgas é menor que cando se utilizan emulsións (Ben-Amotz et al ., 1987; Fernández-Reiriz et al ., 1993; Rainuzzo et al ., 1994; Scott and Baynes, 1978; Whyte et al ., 1994), aínda que un enriquecemento Capítulo 5. Enriquecemento de Brachionus plicatilis con T-ISO_________________________ 136 durante 24 horas produce grandes incrementos do contido lipídico –ata un 100%- tanto se se empregan emulsións como dietas artificiais completas (Øie and Olsen, 1997). Os glícidos mantivéronse estables arredor de 28 pg/rotífero nas taxas de renovación do 10% e 20% e despois incrementáronse de forma lineal ata alcanzar os 50 ng nos rotíferos alimentados con T-ISO cultivada coa taxa de renovación do 50% (Figura 4; Táboa 2). Esta evolución é totalmente contraria á experimentada pola microalga, de xeito que a correlación entre a cantidade de glícidos de T-ISO e do rotífero é negativa (R2=0,82). O contido de glícidos dos rotíferos non soe ser superior ao 15% do peso seco (Ben-Amotz et al ., 1987; Carić et al ., 1992; Whyte et al ., 1994) e tende a disminuír a medida que aumenta o tempo de alimentación (Fernández-Reiriz et al ., 1993). A suma das cantidades de proteínas, lípidos e glícidos, é dicir, o contido orgánico dos rotíferos aumentou coa taxa de renovación, comportándose do xeito inverso ao do contido orgánico de T-ISO, que disminuíu a medida que se incrementaba coa taxa de renovación (Figura 4; Táboa 2). A porcentaxe do peso total dos rotíferos correspondente ao contido orgánico non dependeu da taxa de renovación, e oscilou entre o 50% e o 56%. As porcentaxes de proteínas, lípidos e glícidos na fracción orgánica case non variaron entre as distintas taxas de Figura 4. Composición bioquímica de Brachionus plicatilis (A) e T-ISO empregada como alimento (B), expresada en ng/individuo e pg/célula respectivamente. , proteínas; , lípidos; , glícidos. _________________________Capítulo 5. Enriquecemento de Brachionus plicatilis con T-ISO 137 renovación, con valores entre o 62% e o 65% no caso das proteínas, 17% e 21% para os lípidos e 17% e 20% para os glícidos (Táboa 2). A evolución da proteína no rotífero reflectiu a evolución da proteína na microalga, pero o comportamento dos lípidos e dos glícidos, independente e contrario respectivamente da tendencia rexistrada en T-ISO, indican que a comunmente aceptada afirmación de que os rotíferos reflicten a composición bioquímica do seu alimento non é totalmente correcta en experimentos de enriquecemento curto. A incorporación da proteína aportada pola dieta oscilou entre o 58% e o 72% nas taxas de renovación do 10% ao 40%, pero foi case total na taxa de renovación do 50%. No caso dos lípidos, a incorporación á biomasa do rotífero mantense entre o 13% e o 15% nas taxas de renovación do 10% ao 30%, e increméntase ata o 27% nas taxas de renovación superiores. A incorporación dos glícidos aumentou drasticamente coa taxa de renovación, pasando do 7,7% na taxa de renovación do 10% a case o 55% na taxa de renovación do 50% (Táboa 1). Existe unha tendencia a manter unha composición bioquímica constante mentres os rotíferos son alimentados con T-ISO cultivada en condicións de deficiencia de nitróxeno, independentemente da taxa de renovación empregada e dos cambios ocasionados por esta na composición bioquímica da microalga. Ademais, as porcentaxes de incorporación de proteínas e lípidos foron similares nos tres grupos alimentados con microalgas limitadas por nitróxeno, é dicir, as taxas de renovación do 10% ao 30% (Capítulo 2). Unha vez que se superou a limitación por nitróxeno nos cultivos de T-ISO, a incorporación dos nutrintes da microalga ao rotífero aumentou coa taxa de renovación aínda que o contido dos mesmos xa se estabilizara ou mesmo disminuíra. As variacións experimentadas pola composición bioquímica individual son comparables ás da biomasa de rotífero recuperada por ml de cultivo. A evolución da biomasa orgánica de rotífero por ml pode explicarse por unha mellora da dixestión e asimilación producida pola disminución da materia orgánica inxerida, tal e como indica a evolución da FCR orgánica. En cambio, o contido orgánico por individuo non está directamente relacionado coa cantidade de T-ISO ou de Capítulo 5. Enriquecemento de Brachionus plicatilis con T-ISO_________________________ 138 materia orgánica consumida por rotífero nin coa evolución de ningún dos compoñentes da fracción orgánica da microalga. A disminución das substancias de reserva de T-ISO co aumento da taxa de renovación non favoreceu por si soa a asimilación de proteínas ou lípidos nos rotíferos alimentados con microalgas procedentes dos cultivos limitados por nitróxeno. Scott (1980) observou que os rotíferos mantidos en quimiostato presentaban unha eficiencia máxima no aproveitamento enerxético da microalga usada – Brachiomonas submarina – como alimento cando as relacións proteína:lípidos:glícidos se aproximaban a 1:1:1. Nos nosos cultivos de T-ISO as relacións proteína:lípidos e proteína:glícidos foron superiores a 1 en condicións de saturación por nitróxeno coincidindo cos máximos aproveitamentos dos tres compoñentes orgánicos, pero alcanzaron os seus valores máximos, 1,86 e 1,20 respectivamente, na taxa de renovación do 40%, polo que a relación entre estes índices e a asimilación dos nutrintes da microalga tampouco é directa. A evolución do perfil de ácidos graxos do rotífero reflectiu con máis exactitude a composición de T-ISO, xa que a maioría das tendencias observadas tiveron o seu punto de inflexión na taxa de renovación do 40% que marcou a saturación por nitróxeno nos cultivos de microalga. Porén, as modificacións no perfil de ácidos graxos dos rotíferos foron menores que as provocadas en T-ISO pola taxa de renovación. O contido de ácidos graxos nos rotíferos enriquecidos duplicou o dos rotíferos control e experimentou a mesma evolución que os lípidos, incrementándose lixeiramente nos rotíferos alimentados con microalga das taxas de renovación do 40% e 50%. Porén foi moi similar en tódolos grupos, entre 16,3 e 18,1 ng/individuo. Tampouco se obtiveron grandes cambios nas proporcións de ácidos graxos saturados e insaturados do rotífero. A porcentaxe de ácidos graxos saturados e mais monoinsaturados descendeu ata a taxa de renovación do 40%, pasando do 68,83% ao 61,18%. O contido por rotífero non variou coa taxa de renovación, manténdose entre 10,6 e 11,0 ng/rotífero. Os ácidos graxos poliinsaturados incrementáronse en porcentaxe e pasaron do 30,06% na taxa de renovación do 10% ao 35,90% na taxa de renovación do 40%. En contido mantivéronse arredor dos 5 ng/rotífero nas taxas de renovación do 10% ao 30%, e incrementáronse ata 6,6 ng/rotífero na taxa de renovación do _________________________Capítulo 5. Enriquecemento de Brachionus plicatilis con T-ISO 139 40%, descendendo a 6,1 ng/rotífero na taxa de renovación do 50% (Táboa 3, Figura 5). Os ácidos graxos máis abundantes nos rotíferos enriquecidos foron 14:0, 16:0, 18:1ω-9 e 18:4ω-3, todos presentes en porcentaxes superiores ao 10% en tódalas taxas de renovación. Tamén se atoparon cantidades importantes de 16:1ω-7, 18:2ω-6, 18:3ω-3 e 22:6ω-3 (DHA), de maneira que o perfil de ácidos graxos dos rotíferos reflectiu o de T-ISO. O 14:0 e o 16:1ω-7 incrementáronse coa taxa de renovación tanto en porcentaxe como en contido por rotífero, mentres que o contido e a porcentaxe de 18:1ω-9 descenderon. As porcentaxes de 16:0 e 18:2ω-6 descenderon lixeiramente, pero os seus respectivos contidos por individuo mantivéronse bastante constantes en tódalas taxas de renovación (Táboa 3). Os ácidos graxos poliinsaturados 18:3ω-3, 18:4ω-3 e 22:6ω-3 incrementáronse coa taxa de renovación en porcentaxe e contido por rotífero (Táboa 3). O 18:4ω-3, o ácido graxo poliinsaturado máis abundante nos rotíferos enriquecidos con T-ISO, pasou de representar o 9,79% dos ácidos graxos na taxa de renovación do 10% ao 14,35% na taxa de renovación do 40%, e o seu contido pasou de 1,61 a 2,66 ng/rotífero. A porcentaxe de DHA foi sensiblemente menor, e incrementouse de 3,42% a 5,06% entre as taxas de renovación do 10% e o Figura 5. Evolución do contido de ácidos graxos totais, saturados + monoinsaturados e poliinsaturados de Brachionus plicatilis, expresados en porcentaxe (A) ou en ng de ácido graxo por rotífero (B). -▲-, ácidos graxos saturados + monoinsaturados; -z-, ácidos graxos poliinsaturados; --, ácidos graxos totais. Capítulo 5. Enriquecemento de Brachionus plicatilis con T-ISO_________________________ 140 40%. O contido de DHA incrementouse en cambio de forma continua, e dos 0,70 ng/rotífero na taxa de renovación do 10% pasou a 0,90 ng/rotífero na taxa de renovación do 50%. En conxunto, os ácidos graxos ω-3 incrementáronse desde o 20% na taxa de renovación do 10% ao 26,5% na taxa de renovación do 40%, pero estes incrementos son notablemente inferiores aos obtidos na microalga (Figura 6; Táboa 3). Polo contrario, as porcentaxes de ω-6, entre o 8% e o 9%, foron superiores no rotífero. Dado que non sufriron case modificacións coa taxa de renovación, a relación ω-3/ω-6 incrementouse coa taxa de renovación, pasando de 2,22 nos rotíferos alimentados con microalgas da taxa de renovación do 10% a 3,14 nos alimentados con microalgas da taxa de renovación do 50%. A relación EPA:ARA mantívose constante, entre 2,05 e 2,14, e a relación DHA:EPA incrementouse lixeiramente coa taxa de renovación, de 2,51 a 3,10 (Figura 7). A marcada influencia do perfil de ácidos graxos de T-ISO no perfil de ácidos graxos no rotífero maniféstase na existencia de correlacións lixeiramente positivas para as porcentaxes de ω-3 e DHA (Figura 8), xa observadas por Rodríguez Rainuzzo et al . (1989) en rotíferos enriquecidos con distintas dietas durante 24 horas. A correlación entre as porcentaxes da suma de ácidos graxos saturados e monoinsaturados foi tamén relativamente elevada, R2=0,61. No caso Figura 6. Evolución das porcentaxes de ácidos graxos ω-3 e ω-6 en T-ISO e Brachionus plicatilis. --, ω-3 en T-ISO; - -, ω-3 en B. plicatilis; -▲-, ω-6 en T-ISO; -▲-, ω-6 en B. plicatilis. Figura 7. Evolución das relacións ω-3:ω-6 e DHA:EPA en Brachionus plicatilis. --, ω-3:ω-6; -▲-, DHA:EPA. _________________________Capítulo 5. Enriquecemento de Brachionus plicatilis con T-ISO 141 dos ácidos graxos poliinsaturados reduciuse a R2=0,52, e non houbo correlación entre as porcentaxes de ω-6 de T-ISO e do rotífero. Os resultados obtidos poñen de manifesto a importancia das condicións de cultivo da microalga, neste caso T-ISO, para obter rotíferos cunha composición bioquímica apropiada para ser empregado como alimento vivo no cultivo larvario de peixes ou crustáceos. T-ISO procedente de cultivos limitados por nitróxeno deu lugar a rotíferos cun contido de proteínas e ácidos graxos ω-3 e un valor calórico baixos, independentemente do grado de limitación por nutrintes ao que estiveran sometidos os cultivos de microalga. A sobresaturación por nitróxeno nos cultivos de T-ISO da taxa de renovación do 50% non deu lugar a unha disminución do valor nutritivo da microalga senón que favoreceu a asimilación dos nutrintes por parte do rotífero. Non se atopou unha explicación clara para este fenómeno, pero debe terse en conta á hora de establecer un sistema de cultivo para obter unha biomasa microalgal coa maior calidade nutritiva posible. Figura 8. Correlacións entre a porcentaxe de ω-3 () e DHA (U) en T-ISO e B. p licatilis. _________________________________________________________________Referencias 245 Abe, T., Nagano, Y. and Imada, K. 1982. Environmental conditions of culture medium for the rotifer Brachionus plicatilis . Proc. Autumn Conference Japan. Soc. Sci. Fish in 1982, 68. AbuRezq, T. S., Al-Shimmari, J. and Dias, P. 1997. Live food production using batch culture and chemostat systems in Kuwait. Hydrobiologia 358, 173-178. Amenta, J. S. 1964. A rapid chemical method for quantification of lipids separated by thin-layer chromatography. Journal of Lipid Research 5, 270-272. Andersen, R. A., Brett, R. W., Potter, D. and Sexton, J. P. 1998. Phylogeny of the Eustigmatophyceae based upon 18S rDNA, with emphasis on Nannochloropsis . Protist 149, 61-74. Ando, Y., Kobayashi, S., Sugimoto, T. and Takamaru, N. 2004. Positional distribution of n-3 highly unsaturated fatty acids in triacyl-sn-glycerols (TAG) of rotifers ( Brachionus plicatilis ) enriched with fish and seal oils TAG. Aquaculture 229, 275-288. Aragão, C., Conceição, L. E. C., Dinis, M. T. and Fyhn, H.-J. 2004. Amino acid pools of rotifers and Artemia under different conditions: nutritional implications for fish larvae. Aquaculture 234, 429-445. Arredondo-Vega, B. O., Lamela, T., Otero, A., Patiño, M. and Fábregas, J. 1995. Mixotrophic production of arachidonic and eicosapentaenoic acids by Porphyridium cruentum . Journal of Marine Biotechnology 3, 79-81. Bajpai, P. and Bajpai, P. K. 1993. Eicosapentaenoic acid (DPA) produciton from microorganisms: a review. Journal of Biotechnology 30 (2), 161-183. Barnes, R. D. 1987. Zoología de los invertebrados (traducción da 5ª edición inglesa). Nueva Editorial Interamericana McGraw-Hill, México D. F. Bell, J. G., Cowey, C. B., Adron, J. W. and Pirie, B. J. S. 1987. Some effects of selenium deficiency on enzyme activities and indices of tissue peroxidation in Atlantic salmon parr ( Salmo salar ). Aquaculture 65 (1), 43-54. Bell, M. V., Batty, R. S., Dick, J. R., Fretwell, K., Navarro, J. C. and Sargent, J. R. 1995. Dietary deficiency of docosahexaenoic acid impairs vision at low light intensities in juvenile herring ( Clupea harengus ). Lipids 30 (5), 443-449. Bell, J. G., McEvoy, L. A., Estévez, A., Shields, R. J. and Sargent, J. R. 2003. Optimising lipid nutrition in first-feeding flatfish larvae. Aquaculture 227, 211-230. Ben-Amotz, A., Fishler, R. and Schneller, A. 1987. Chemical composition of dietary species of marine unicellular algae and rotifers with emphasis on fatty acids. Marine Biology 95, 31-36. Ben-Amotz, A., and Avron, M. 1990. The biotechnology of cultivating the halotolerant alga Dunaliella . Trends in Biotechnology 8 (5), 121-126. Referencias_________________________________________________________________ Bengtson, D. A. 2003. Status of marine aquaculture in relation to live prey: past, present and future. En: Live feeds in marine aquaculture. Støttrup, J. G. and McEvoy, L. A. (Eds.). Blackwell Publishing, Oxford, 1-16. Bhatti, S., Huertas, I. E. and Colman, B. 2002. Acquisition of inorganic carbon by the marine haptophyte Isochrysis galbana (Prymnesio-phyceae). Journal of Phycology 38, 914-921. Blair, T., Castell, J., Neil, S., D’Abramo, L., Cahu, C., Harmon, P. and Ogunmoye, K. 2003. Evaluation of microdiets versus live feeds on growth, survival and fatty acid composition of larval haddock ( Melanogrammus aeglefinus ). Aquaculture 225, 451-461. Bligh, E. G. and Dyer, W. J. 1959. A rapid method of total lipid extraction and purification. Canadian Journal of Biochemistry and Physiology 37, 911-917. Borowitzka, M. A. 1988. Fats oils and hydrocarbons. En Microalgal Biotechnology. Borowitzka, M. A. and Borowitzka, L. J. (Eds.). Cambridge University Press, Cambridge, 257-287. Boussiba, S., Sandbank, E., Shelef, G., Cohen, Z., Vonshak, A., Ben-Amotz, A., Arad, S., and Richmond, A. 1988. Outdoor cultivation of the marine microalga Isochrysis galbana in open reactors. Aquaculture 72, 247-253. Brown, J. S. 1987. Functional organization of chlorophyll a and carotenoids in the alga Nannochloropsis salina . Plant Physiology 83, 434-437. Brown, M. R., Garland, C. D., Jeffrey, S. W., Jameson, I. D. and LeRoi, J. M. 1993. The influence of irradiance on the biochemical composition of the primnesiophyte Isochrysis sp. (clone T-ISO). Journal of Phycology 29, 601-612. Brown, M.R., Dunstan, G. A., Jeffrey, S. W., Volkman, J. K., Barrett, S. M. and LeRoi, J. M. 1993. The gross and amino acid compositions of batch and semicontinuous cultures of Isochrysis sp. (clone T-ISO), Pavlova lutheri and Nannochloropsis oculata . Journal of Applied Phycology 5, 285-296. Brown, M. R., Dunstan, G. A., Norwood, S. J. and Miller, K. A. 1996. Effects of harvest stage and light on the biochemical composition of the diatom Thalassiosira pseudonana . Journal of Phycology 32, 64-73. Brown, M. R., Jeffrey, S. W., Volkman, J. K. and Dunstan, G. A. 1997. Nutritional properties of microalgae for mariculture. Aquaculture 151, 315-331. Brown, M. R., Skabo, S. and Wilkinson, B. 1998. The enrichment and retention of ascorbic acid in rotifers fed microalgal diets. Aquaculture Nutrition 4, 151-156. Bruce, J. R., Knight, M. and Parke, M. W. 1940. The rearing of oyster larvae on an algal diet. Journal of the Marine Biological Association of the United Kingdom 24, 337-374. Cahu, C. and Zambonino Infante, J. 2001. Substitution of live food by formulated diets in marine fish larvae. Aquaculture 200, 161-180. _________________________________________________________________Referencias 247 Camiro-Vargas, T.K., Hernández-Ayón, J. M., Valenzuela-Espinoza, E., DelgadilloHinojosa, F. and Cajal-Medrano, R. 2005. Dissolved inorganic carbon uptake by Rhodomonas sp. and Isochrysis aff. galbana determined by a potentiometric technique. Aquacultural Engineering 33, 83-95. Carić, M., Sanko-Njire, J. and Skaramuca, B. 1992. Dietary effects of different feeds on the biochemical composition of the rotifer ( Brachionus plicatilis Müller). Aquaculture 110, 141-150. Carmona, M. J., Serra, M. and Miracle, m. R. 1993. Relationships between mixis in Brachionus plicatilis and preconditioning of culture medium by crowding. Hydrobiologia 255/256, 145-152. Carvalho, A. P. and Malcata, F. X. 2005. Optimization of ω-3 fatty acid production by microalgae: crossover effects of CO2 and light intensity under batch and continuous cultivation modes. Marine Biotechnology 7, 381-388. Chisholm, S. W., Stross, R. G. and Nobbs, P. A. 1975. Light/dark phased cell division in Euglena gracilis (Z) (Euglenophyceae) in PO4 limited continuous cultures. Journal of Phycology 11, 367-373. Christensen, T. 1962. Alger. En: Botanik. II. Systematisk Botanik. Bocher, T. W., Lange, M., Sørensen, T. (eds). København: Munksgaard. Clark, D. R., Merrett, M,. J. and Flynn, K. J. Utilization of dissolved inorganic carbon (DIC) and the response of the marine flagellate Isochrysis galbana to carbon or nitrogen stress. New Phytologist 144, 463-470. Collos, Y., Mornet, F., Sciandra, A., Waser, N., Larson, A. and Harrison, P. J. 1999. An optical method for the rapid measurement of micromolar concentrations of nitrate in marine phytoplankton cultures. Journal of Applied Phycology 11, 179184. Conceiçao, L. E. C., Grasdalen, H. and Rønnestad, Y. 2003. Amino acid requirements of fish larvae and post-larvae: new tools and recent findings. Aquaculture 227, 221-232. Copeman, L. A., Parrish, C. C., Brown, J. A. and Harel, M. 2002. Effects of docosahexaenoic, eicosapentaenoic and arachidonic acids on the early growth, survival, lipid composition and pigmentation of yellowtail flounder ( Limanda ferruginea ): a live food enrichment experiment. Aquaculture 210, 285-304. Coutinho, P., Rema, P., Otero, A., Pereira, O., Fábregas, J. 2006. Use of biomass of the marine microalga Isochrysis galbana in the nutrition of goldfish ( Carassius auratus ) larvae as source of protein and vitamins. Aquaculture Research 37:793798. Coutteau, P. and Sorgeloos, P. 1997. Manipulation of dietary lipids, fatty acids and vitamins in zooplankton cultures. Freshwater Biology 38, 501-512. Referencias_________________________________________________________________ Delbare, D. and Dhert, P. 1996. Cladocerans, nematodes and trochophora larvae. En: Manual on the production and use of live food for aquaculture. FAO Fisheries Technical Paper nº 361. Lavens, P. and Sorgeloos, P. (eds.). FAO, Roma, 283-295. Delbare, D., Dhert, P. and Lavens, P. 1996. Zooplankton. En: Manual on the production and use of live food for aquaculture. FAO Fisheries Technical Paper nº 361. Lavens, P. and Sorgeloos, P. (eds.). FAO, Roma, 252-282. Dhert, P. 1996. Rotifers. En: Manual on the production and use of live food for aquaculture. FAO Fisheries Technical Paper nº 361. Lavens, P. and Sorgeloos, P. (eds.). FAO, Roma, 49-78. Dhert, P., Rombaut, G. and Suantika, G. 2001. Advancement of rotifer culture and manipulation techniques in Europe. Aquaculture 200, 129-146. Dittmer, J. C. and Wells, M. A. 1969. Quantitative and qualitative analysis of lipids and lipid components. Methods in Enzymology 14, 482-530. Domínguez, A., Ferreira, M., Coutinho, P., Fábregas, J. and Otero, A. 2005. Delivery of astaxanthin from Haematococcus pluvialis to the aquaculture food chain. Aquaculture 250, 424-430. D’Souza, F. M. L. and Kelly, G. J. 2000. Effects of a diet of a nitrogen-limited alga ( Tetraselmis suecica ) on growth, survival and biochemical composition of tiger prawn ( Penaeus semisulcatus ) larvae. Aquaculture 181, 311-329. Dubois, M., Gilles, K. A., Hamilton, J. K., Rebers, P. A. and Smith, f. 1956. Colorimetric method for determination of sugars and related substances. Anal. Chem. 28, 350-356. Duerr, E. O., Molnar, A. and Sato, V. 1998. Cultured microalgae as aquaculture feeds. Journal of Marine Biotechnology 7, 65-70. Dunstan, G. A., Volkman, J. K., Barrett, S. M. and Garland, C. D. 1993. Changes in the lipid composition and maximisation of the polyun-saturated fatty acid content of three microalgae grown in mass culture. Journal of Applied Phycology 5, 71-83. Establier, R. and Lubián, L. Mª. 1982. Composición de pigmentos en Nannochloris maculata Butcher y N. oculata Droop (CCAP 251/6). Implicaciones de tipo taxonómico. Investigación Pesquera 46(3), 451-457. Estévez, A., McEvoy, L. A., Bell, J. G. and Sargent, J. R. 1999. Growth, survival, lipid composition and pigmentation of turbot ( Scophthalmus maximus ) larvae fed live-prey enriched in arachidonic and eicosapentaenoic acids. Aquaculture 190, 321-343. Evjemo, J. O. and Olsen, Y. 1997. Lipid and fatty acid content n cultivated live feed organisms compared to marine copepods. Hydrobiologia 358, 159-162. Evjemo, J. O., Reitan, K. I. and Olsen, Y. 2003. Copepods as live food organisms in the larval rearing of halibut larvae ( Hippoglossus hippoglossus L.) with special emphasis on the nutritional value. Aquaculture 227, 191-210. _________________________________________________________________Referencias 249 Ewart, J. W. and Epifanio, C. E. 1981. A tropical flagellate food for larval and juvenile oysters, Crassostrea virginica Gmelin. Aquaculture 22, 297-300. Fábregas, J., Abalde, J., Herrero, C., Cabezas, B., Veiga, M. 1984. Growth of the marine microalga Tetraselmis suecica in batch cultures with different salinities and nutrient concentrations. Aquaculture 42, 207-215. Fábregas, J., Herrero, C., Abalde, J. and Cabezas, B. 1985. Growth, chlorophyll a and protein of the marine microalga Isochrysis galbana in batch cultures with different salinities and high nutrient concentration. Aquaculture 50, 1-11. Fábregas, J., Herrero, C., Cabezas, B. and Abalde, J. 1985. Mass culture and biochemical variability of the marine microalga Tetraselmis suecica Kylin (Butch) with high nutrient concentrations. Aquaculture 49, 231-244. Fábregas, J. and Herrero, C. 1986. Marine microalgae as a potential source of minerals in fish diets. Aquaculture 51 (3-4), 237-243. Fábregas, J., Herrero, C., Abalde, J., Liaño, R. and Cabezas, B. 1986. Biomass production and bichemical variability of the marine microalga Dunaliella tertiolecta (Butcher) with high nutrient concentrations. Aquaculture 53, 187-199. Fábregas, J., Herrero, C., Cabezas, B. and Abalde, J. 1986. Biomass production and biochemical composition in mass cultures of the marine microalga Isochrysis galbana Parke at varying nutrient concentrations. Aquaculture 53, 101-113. Fábregas, J., Herrero, C., Cabezas, B. and Abalde, J. 1987. Growth and biochemical variability of the marine microalga Chlorella stigmatophora in batch cultures with different salinities and nutrient gradient concentration. British Phycological Journal 22, 269-276. Fábregas, J. Abalde, J., Cabezas, B. and Herrero, C. 1989. Changes in protein, carbohydrates and gross energy in the marine microalga Dunaliella tertiolecta (Butcher) by nitrogen concentrations as nitrate, nitrite and urea. Aquacultural Engineering 8, 223-239. Fábregas, J., Patiño, M., Arredondo-Vega, B. O., Tobar, J. L. and Otero, A. 1995. Renewal rate and nutrient concentration as tools to modify productivity and biochemical composition of cyclostat cultures of the marine microalga Dunaliella tertiolecta . Applied Microbiology and Biotechnology 44, 287-292. Fábregas, J., Patiño, M., Vecino, E., Cházaro, F. and Otero, A. 1995. Productivity and biochemical composition of cyclostat cultures of the marine microalga Tetraselmis suecica . Applied Microbiology and Biotechnology 43: 617-621. Fábregas, J., Cid, Á., Morales, E., Cordero, B. And Otero, A. 1996. Discrepancies between cell volume and organic content in semi-continuous cultures of a marine microalga. Letters in Applied Microbiology 22, 206-208. Fábregas, J., Otero, A., Morales, E., Cordero, B. and Patiño, M. 1996. Tetraselmis suecica cultured in different nutrient concentrations varies in nutritional value to Artemia . Aquaculture 143, 197-204. Referencias_________________________________________________________________ Fábregas, J., Patiño, M., Morales, E. D.; Cordero, B. And Otero, A. 1996. Optimal renewal rate and nutrient concentration for the production of the marine microalga Phaeodactylum tricornutum in semicontinuous cultures. Applied and Environmental Microbiology 62 (1), 266-268. Fábregas, J., Morales, E. D., Lamela, T., Cabezas, B. and Otero, A. 1997. Mixotrophic productivity of the marine diatom Phaeodactylum tricornutum cultured with soluble fractions of rye, wheat and potato. World Journal of Microbiology and Biotechnology 13, 349-351. Fábregas, J., Otero, A., Morales, E. D., Arredondo-Vega, B. O. and Patiño, M. 1998. Modification of the nutritive value of Phaeodactylum tricornutum for Artemia sp. in semicontinuous cultures. Aquaculture 169, 167-176. Fábregas, J., Otero, A., Dominguez, A. and Patiño, M. 2001. Growth rate of the microalga Tetraselmis suecica changes the biochemical composition of Artemia species. Marine Biotechnology 3, 256-263. Fábregas, J., Maseda, A., Domínguez, A., Ferreira, M. and Otero, A. 2002. Changes in the cell composition of the marine microalga Nannochloropsis gaditana during a light:dark cycle. Biotechnology Letters 24, 1699-1703. Fábregas, J., Maseda, A., Domínguez, A. and Otero, A. 2004. The cell composition of Nannochloropsis sp. changes under different irradiances in semicontinuous culture. World Journal of Microbiology & Biotechnology 20, 31-35. FAO, 2004. The state of world fisheries and aquaculture. FAO Fisheries Department, Roma. Fernández-Reiriz, M. J., Labarta, U. and Ferreiro, M. J. 1993. Effects of commercial enrichment diets on the nutritional value of the rotifer ( Brachionus plicatilis ). Aquaculture 112, 195-206. Fernández Sevilla, J. M., Molina Grima, E., García Camacho, F., Acién Fernández, F. G. and Sánchez Pérez, J. A. 1998. Photolimitation and photoinhibition as factors determining optimal dilution rate to produce eicosapentaenoic acid from cultures of the microalga Isochrysis galbana . Applied Microbiology and Biotechnology 50: 199-205. Fidalgo, J. P. Cid, Á., Torres, S., Sukenik, A. and Herrero, C. 1998. Effects of nitrogen source and growth phase on proximate biochemical composition, lipid classes and fatty acid profile of the marine microalga Isochrysis galbana . Aquaculture 166, 105-116. Flynn, K. J., Davidson, K. and Leftley, J. W. 1993. Carbon-nitrogen relations during batch growth of Nannochloropsis oculata (Eustigamtophyceae) under alternating light and dark. Journal of Applied Phycology 5 (4). 465-475. Frolov, A. V., Pankov, S. L., Geradze, K. N., Pankova, S. A. and Spektorova, L. V. 1991. Influence of the biochemical composition of food on the biochemical composition of the rotifer Brachionus plicatilis . Aquaculture 97, 181-202. _________________________________________________________________Referencias 251 Frolov, A. V., Pankov, S. L. 1992. The effect of starvation on the biochemical composition of the rotifer Brachionus plicatilis . Journal of the Marine Biological Association of the U. K. 72, 343-356. Fukusho, K. and Iwamoto, H. 1980. Cyclomorphosis in size of the cultured rotifer, Brachionus plicatilis . Bull. Natl. Res. Inst. Aquaculture 1, 29-37. Fukusho, K. 1989. Biology and mass production of the rotifer, Brachionus plicatilis (1). Int. J. Aq. Fish Technol. 1, 232-240. Gayral, P. and Fresnel, J. 1983. Description, sexualité et cycle de développement d’une nouvelle Coccolithophoraceé (Prymnesiophyceae): Pleurochrysis pesudoroscoffensis sp. nov. Protistologica 19, 245-261. Gilbert, J. J. 1980. Female polymorphism and sexual reproduction in the rotifer Asplanchna : evolution of their relationship and control of dietary tocopherol. Am. Nat. 116, 409-431. Gladu, P. K., Patterson, G. W., Wikfors, G. H. and Smith, B. C. 1995. Sterol, fatty acid, and pigment characteristics of UTEX 2341, a marine eustigmatophyte identified previously as Chlorella minutissima (Chlorophyceae). Journal of Phycology 31, 774-777. Goldman, J. C., McCarthy, J. J. and Peavey, D. G. 1979. Growth rate influence on the chemical composition of phytoplankton in oceanic waters. Nature 279, 210214. Goldman, J. C. and Peavey, D. G. 1979. Steady-state growth and chemical composition of the marine chlorophyte Dunaliella tertiolecta in nitroge-limited continuous cultures. Applied and Environmental microbiology 38 (5), 894-901. Goldman, J. C. 1986. On phytoplankton growth rates and particulate C:N:P ratios at low light. Limnology and Oceanography 31 (6), 1358-1363. Gordillo, F. J. L., Goutx, M., Figueroa, F. L. and Niell, F. X. 1998. Effects of light intensity, CO2 and nitrogen supply on lipid class composition of Dunaliella viridis . Journal of Applied Phycology 10, 135-144. Green, J. C. and Parke, M. 1975. A reinvestigation by light and electronmicroscopy of Ruttnera spectabilis Geitler (Haptophyceae), with special reference to the fine structure of the zoids. Journal of the Marine Biological Association of the United Kingdom 52, 469-474. Green, J. C., Perch-Nielsen, K. and Westbroek, P. 1990. Phylum Prymnesiophyta. En: Margulis, L., Corliss, J. O., Melkonian, M., Chapman, D. J. (eds.), Handbook on Protoctista. Jones and Bartlett, Boston. 293-317. Gross, F. 1937. Notes on the culture of some marine plankton organisms. Journal of the Marine Biological Association of the United Kingdom 21, 753-768. Guerrini, F., Mazzotti, A., Boni, L. and Pistocchi, R. 1998. Bacterial-algal interactions in polysaccharide production. Aquatic Microbial Ecology, 15, 247-253. Referencias_________________________________________________________________ Guerrini, F., Cangini, M., Boni, L., Trost, P. and Pistocchi, R. 2000. Metabolic responses of the diatom Achnanthes brevipes (Bacillariophyceae) to nutrient limitation. Journal of Phycology 36, 882-890. Guillard, R. R. L. and Ryther, J. 1962. Studies of marine planktonic diatoms. I. Cyclotella nana Hustedt and Detonula confervaceae (Cleve) Gran. Canadian Journal of Microbiology 8, 229-239. Guillard, R. R. L. and Lorenzen, C. J. 1972. Yellow-green algae with chlorophyllide c . Journal of Phycology 8(1) 10-14. Hagiwara, A., Gallardo, W. G., Assavaaree, M., Kotani, T and De Araujo, A. B. 2001. Live food production in Japan: recent progress and future aspects. Aquaculture 200, 111-127. Heimdal, B. R. 1993. Modern coccolithophorids. En: Marine Phytoplankton. Tomas, C. R. (ed.). Academic Press, London, 147-247. Helm, M. M. and Laing, I. 1987. Preliminary observations on the nutritional value of “Tahiti Isochrysis ” to bivalve larvae. Aquaculture 62, 281-288. Herbert, D., Phipps, P. J. and Stranoe, R. E. 1971. Chemical analysis of microbial cells. En: Methods in Microbiology. Norris, J. R. and Ribbons, D. W. (eds.). Academic Press 209-344. Hibberd, D. J. and Leedale, G. F. 1970. Eustigmatophyceae – a new algal class with unique organization of the motile cell. Nature 225, 758-760. Hibberd, D. J. and Leedale, G. F. 1971. A new algal class – the Eustigmatophyceae. Taxon 20, 523-525. Hibberd, D. J. and Leedale, G. F. 1972. Observations on the cytology and ultrastructure of the new algal class, Eustigmatophyceae. Annals of Botany 36, 4971. Hibberd, D. J. 1976. The ultrastructure and taxonomy of the Chrysophyceae and Prymnesiophyceae (Haptophyceae): a survey with some new observations on the ultrastructure of the Chrysophyceae. Botanical Journal of the Linnean Society 72, 55-80. Hibberd, D. J. 1981. Notes on the taxonomy and nomenclatures of the algal classes Eustigmatophyceae and Trbophyceae (synonym Xanthophyeceae). Botanical Journal of the Linnean Society 82, 93-119. Hibberd, D. J. 1990. Phylum Eustigmatophyta. En: Margulis, L., Corliss, J. O., Melkonian, M., Chapman, D. J. (eds), Handbook on Protoctista. Jones and Bartlett, Boston. 326-333. Hino, A., Aoki, S. and Ushiro, M. 1997. Nitrogen-flow in the rotifer Brachionus rotundiformis and its significance in mass cultures. Hydrobiologia 358, 77-82. _________________________________________________________________Referencias 253 Holland, D. L. and Gabbott, P. A. 1971. A microanalytical scheme for the determination of protein, carbohydrate, lipids and RNA levels in marine invertebrate larvae. Journal of the Marine Biological Association of the U.K. 51, 695-668. Hu, H., and Gao, K. 2003. Optimization of growth and fatty acid composition of a unicellular marine picoplankton, Nannochloropsis sp., with enriched carbon sources. Biotechnology Letters 25, 421-425. Ishida, Y., Hiragushi, N., Kitaguchi, H., Mitsutani, A., Nagai, S. and Yoshimura, M. 2000. A highly CO2-tolerant diatom, Thalassiosira weissflogii H1, enriched from coastal sea, and its fatty acid composition. Fisheries Science 66, 655-659. Ito, T. 1980. Fundamental studies on the culture of mixohaline rotifer, Brachionus plicatilis . VII. Effects of pH of cultured water upon the survival and reproduction of B. plicatilis . Artificial propagation of Ayu fish 5, 147-157. James, C. H. and Abu-Rezeq, 1989. An intesive chemostat culture system for the production of rotifers for aquaculture. Aquaculture 81, 291-301. Jeffrey, S. W. and Humphrey, G. F. 1975. New spectrophotometric equations for determining chlorophylls a , b , c 1 and c 2 in higher plants, algae and natural phytoplankton. Biochem. Physio. Pflanzen 167, 191-194. Jeffrey, S. W. and Wright, S. W. 1994. Photosyinthetic pigments in the Prymnesiophyceae. En: The Haptophyte Algae. Green, J. C., Leadbeater, B. S. C. (eds.). Clarendon Press, Oxford, 111-132. Jeffrey, S. W. and Vesk, M. 1997. Introduction to marine phytoplankton and their pigment signatures. En: Phytoplankton pigments in oceanography. S. W. Jeffrey, R. F. C. Mantoura and S. W. Wright (eds.). UNESCO Publishing, Paris, 37-84. Jeffrey, S. W. and Welschmeyer, N. A. 1997. Spectrophotometric and fluorometric equations in common use in oceanography. En: Phytoplankton pigments in oceanography. Jeffrey, S. W., Mantoura, R. F. C. and Wright, S. W. (eds). UNESCO Publishing, Paris, 597-615. Jensen, T.C. and Verschoor, A. M. 2004. Effects of food quality on life history of the rotifer Brachionus calyciflorus Pallas. Freshwater Biology 49, 1138-1151. Kaplan, D., Cohen, Z. and Abeliovich, A. 1986. Optimal growth conditions for Isochrysis galbana . Biomass 9, 37-48. Karlson, B., Potter, D., Kuylenstierna, M;., and Andersen, R. A. 1996. Ultrastructure, pigment composition, and 18S rRNA gene sequence for Nannochloropsis granulata sp. nov. (Monodopsidaceae, Eustigmato-phyceae), a marine ultraplankter isolated from the Skagerrak, northeast Atlantic Ocean. Phycologia 35(3), 253-260. Klaveness, D. and Paasche, E. 1979. Physiology of coccolithophorids. En. Biochemistry and Physiology of Protozoa, vol. 1. Levandowsky, M. and Hutner, S. H. (eds.). Academic Press, New York, 2nd edition, 191-213. Referencias_________________________________________________________________ Rodolfi, L., Chini Zittelli, G., Barsanti, L., Rosati, G. and Tredici, M. R. 2003. Growth medium recycling in Nannochloropsis sp. mass cultivation. Biomolecular Engineering 20, 243-248. Rodríguez, C., Pérez, J. A., Lorenzo, A., Izquierdo, M. S. and Cejas, J. R. 1994. n3 HUFA requirement of larval gilthead seabream Sparus aurata when using high levels of eicosapentaenoic acid. Comparative Biochemistry and Physiology 107A (4), 693-698. Rodríguez, C., Pérez, J. A., Izquierdo, M. S., Cejas, J. R., Bolaños, A. and Lorenzo, A. 1996. Improvement of the nutritional value of rotifers by varying the type and concentration of oil and the enrichment period. Aquaculutre 147, 93-105. Rodríguez Rainuzzo, J., Olsen, Y. and Rosenlund, G. 1989. The effect of enrichment diets on the fatty acid composition of the rotifer Brachionus plicatilis . Aquaculture 79, 157-161. Roessler, P. G. 1990. Environmental control of glycerolipid metabolisms in microalgae: commercial implications and future research directions. Journal of Phycology 26, 393-399. Rollefsen, G. 1939. Artificial rearing of fry of seawater fish-preliminary communication. Rapp. Procès-verbaux Réunions Cons. Perm. Int. Explor. Mer. 109, 133. Romanovicz, D. K. 1981. Scale formation in flagellates. En: Cytomorphogenesis in Plants. Kiermayer, O. (ed.). Springer-Verlag, Viena, 27-62. Rønnestad, I., Hemre, G. I., Finn, R. N. and Lie, Ø. 1993. Alternate sources and dynamics of vitamin A and its incorporation into the eyes during early endotrophic and exotrophic larval stages of Atlantic halibut (Hippoglossus hippoglossus ). Comparative Biochemistry and Physiology 119A, 787-793. Rønnestad, I., Tonheim, S. K., H.J. Fyhn, H. J., Rojas-García, C. R., Kamisaka, Y., Koven, W., Finn, R. N., Terjesen, B. F., Barr, Y. and Conceiçao, L. E.C. 2003. The supply of amino acids during early feeding stages of marine fish larvae: a review of recent findings. Aquaculture 227, 147-164. Rothhaupt, K. O. 1990. Differences in particle size-dependent feeding efficiencies of closely related rotifer species. Limnology and Oceanography 35 (1), 16-23. Rothhaupt, K. O. 1995. Algal nutrient limitation affects rotifer growth rate but not ingestion rate. Limnology and Oceanography 40 (7), 1201-1208. Santos, L. M. A. 1996. The Eustigmatophyceae: Actual knowledge and research perspectives. Beiheft Nova Hedwigia 112, 391-405. Saoudi-Helis, L., Dubacq, J.-P., Marty, Y., Samain, J.-F. and Gudin, C. 1994. influence of growth rate on pigment and lipid composition of the microalga Isochrysis aff. galbana clone T.iso. Journal of Applied Phycology 6, 315-322. _________________________________________________________________Referencias 261 Sato, N. and Murata, N. 1988. Membrane lipids. Methods in Enzimology 167, 251259. Sargent, J., Bell, G., McEvoy, L., Tocher, D. and Estévez, A. 1999. Recent developments in the essential fatty acid nutrition of fish. Aquaculture 177, 191199. Sargent, J., McEvoy, L., Estévez, A., Bell, G., Bell, M., Henderson, J. and Tocher, D. 1999. Lipid nutrition of marine fish during early development: current status and future directions. Aquaculture 179, 217-229. Sato, N. and Murata, N. 1988. Membrane lipids. Methods in Enzymology 167, 251259. Schnepf, E., Niemann, A. and Wilhelm, C. 1996. Pseudostaurastrum limneticum , an eustigmatophycean alga with astigmatic zoospores. Morphogenesis, fine estructure, pigment composition and taxonomy. Arch. Protistenkd 146, 237-249. Scott, A. P. and Baynes, S. M. 1978. Effect of algal diet and temperature on the biochemical composition of the rotifer, Brachionus plicatilis . Aquaculture 14, 247260. Scott, A. P. 1980. Effect of growth rate of the food alga on the growth/ingestion efficiency of a marine herbivore. J. Mar. Biol. Ass. U.K. 60, 681-702. Seale, A. 1933. Brine shrimp ( Artemia ) as a satisfactory food for fishes. Trans. Am. Fish. Soc. 63, 129-130. Serra, M., Gómez, A. and Carmona, M. J. 1998. Ecological genetics of Brachionus . Hydrobiologia 387/388, 373-384. Snell, T. W. 1986. Effect of temperature, salinity and food level on sexual and asexual reproduction in Brachionus plicatilis (Rotifera). Marine Biology 92, 157162. Snell, 1991. Improving the design of mass culture systems for the rotifer, Brachionus plicatilis . En: Rotifer and microalgae culture systems. Proceedings of a U.S.-Asia workshop. Fulks, W. and Main, K. L. (eds.), 61-72. Solbakken, J. S., Berntssen, M. H. G., Norberg, B., Pittman, K. and Hamre. 2002. Different iodine and thyroid hormone levels between Atlantic halibut larvae fed wild zooplankton or Artemia from first exogenous feeding until post metamorphosis. Journal of Fish Biology 61 (6), 1345-1362. Starkweather, P. J. and Gilbert, J. J. 1978. Feeding in the rotifer Brachionus calyciflorus . IV: Selective feeding on tracer particles as a factor in ttrophic ecology and in situ techniques. Verh. Int. Ver. Limnol. 20, 2389-2394. Sterner, R. W. and Robinson, J. L. 1994. Thresholds for growth of Daphnia magna with high and low phosphorus. Limnology and Oceanography 39(5), 1228-1232. Referencias_________________________________________________________________ Støttrup, J. G. 2001. The elusive copepods: their production and suitability in marine aquaculture. Aquaculture Research 31, 703-711. Støttrup, J. G. 2003. Production and nutritional value of copepods. En: Live feeds in marine aquaculture. Støttrup, J. G. and McEvoy, L. A. (Eds.). Blackwell Publishing, Oxford, 145-205. Strickland, J. D. H. and Parsons, T. R. 1972. A practical handbook of seawater analysis. Fisheries Research Board of Canada. Bulletin 167 (2nd edition) Ottawa. 310 pp. Suantika, G., Dhert, P. Nurhudah, P. and Sorgeloos, P. 2000. High-density production of rotifer Brachionus plicatilis in recirculated system: consideration of water quality, zootechnical and nutrient aspects. Aquacultural Engineering 21, 201-214. Suda, S., Atsumi, M., Miyashita, H. 2002. Taxonomic characterization of a marine Nannochloropsis species, N. oceanica sp. nov. (Eustigmato-phyceae). Phycologia 41(3), 273-279. Sukenik, A., Carmeli, Y. and Berner, T. 1989. Regulation of fatty acid composition by irradiance level in the eustigmatophyte Nannochloropsis sp. Journal of Phycology 25, 686-692. Sukenik, A. and Carmeli, Y. 1990. Lipid synthesis and fatty acid composition in Nannochloropsis sp. (Eustigmatophyceae) grown in a light-dark cycle. Journal of Phycology 26, 463-469. Sukenik, A., and Livne, A. 1991. Variations in lipid and fatty acid content in relation to acetyl CoA carboxylase in the marine prymnesiophyte Isochrysis galbana . Plant Cell Physiology 32 (3) 371-378. Sukenik, A. and Wahnon, R. 1991. Biochemical quality of marine unicellular algae with special emphasis on lipid composition. I. Isochrysis galbana . Aquaculture 97, 61-72. Sukenik, A., Livne, A., Neori, A., Yacobi, Y. Z. and Katcoff, D. 1992. Purification and characterization of a light-harvesting chlorophyll-protein complex from the marine eustigmatophyte Nannochloropsis sp. Plant Cell Physiology, 33(8), 10411048. Sukenik, A., Zmora, O. and Carmeli, Y. 1993. Biochemical quality of marine unicellular algae with special emphasis on lipid composition. II. Nannochloropsis sp. Aquaculture 117, 313-326. Tachibana, K., Yagi, M., Hara, K., Mishima, T. and Tsuchimoto, M. 1997. Effects of feeding of β-carotene-supplemented rotifers on survival and lymphocyte proliferation reaction of fish larvae (Japanese parrotfish Oplegnathus fasciatus ) and spotted parrotfish ( Oplegnathus punctatus )): preliminary trials. Hydrobiologia 358, 313-316. _________________________________________________________________Referencias 263 Tamaru, C. S., Murashige, L., Lee, C. S., Ako, H. And Sato, V. 1993. Rotifers fed various diets of baker’s yeast and/or Nannochloropsis oculata and their effect on the growth and survival of striped mullet ( Mugil cephalus ) and milkfish ( Chanos chanos ) larvae. Aquaculture 110, 361-372. Tarui, F., Haga, Y., Ohta, K., Shima, Y. and Takeuchi, T. 2006. Effect of Artemia nauplii enriched with vitamin A palmitate on hypermelanosis on the blind side in juvenile Japanese flounder Paralichthys olivaceus. Fisheries Science 72, 256–262. Tempest, D. W. 1978. Dynamics of microbial growth. En “Essays in Microbiology”. Norris, J. R. and Richmond, M. H. (Eds.). John Wiley & Sons, Chichester. Turner, M. F. and Gowen, R. J. 1984. Some aspects of the nutrition and taxonomy of fourteen small green and yellow-green algae. Botanica Marina 27, 249-255. Tzovenis, I., De Pauw, N. and Sorgeloos, P. 1997. Effect of different light regimes on the docosahexaenoic acid. (DHA) content of Isochrysis aff. galbana (clone TISO). Aquaculture International 5, 489-507. Tzovenis, I., De Pauw, N. and Sorgeloos, P. 2003. Optimisation of T-ISO biomass production rich in essential fatty acids I. Effect of different light regimes on growth and biomass production. Aquaculture 216, 203-222. Tzovenis, I., De Pauw, N. and Sorgeloos, P. 2003. Optimisation of T-ISO biomass production rich in essential fatty acids II. Effect of different light regimes on the production of fatty acids. Aquaculture 216, 223-242. Van Stappen, G. 1996. Artemia . En: Manual on the production and use of live food for aquaculture. FAO Fisheries Technical Paper nº 361. Lavens, P. and Sorgeloos, P. (eds.). FAO Roma, 79-251. Vaz-Pires, P., Seixas, P. and Barbosa, A. 2004. Aquaculture potential of the common octopus ( Octopus vulgaris Cuvier, 1797): a review. Aquaculture 238, 221-238. Volkman, J. K., Jeffrey, S. W., Nichols, P. D., Rogers, G. I. and Garland, C. D. 1989. Fatty acid and lipid composition of 10 species of microalgae used in mariculture. Journal of Experimental Marine Biology and Ecology 128, 219-240. Volkman, J., Brown, M. R., Dunstan, G. A. and Jeffrey, S. W. 1993. The biochemical composition of marine microalgae from the class Eustigmatophyceae. Journal of Phycology 29, 69-78. Walker, K. F. 1981. A synopsis of ecological information on the saline lake rotifer Brachionus plicatilis Müller 1786. Hydrobiologia 81, 159-167. Walne, P. R. 1966. Experiments in the large scale culture of the larvae of Ostrea edulis . Fish. Invest. 2, 25-53. Watanabe, T., Kitajima, C. and Fujita, S. 1983. Nutritional values of live organisms used in Japan for mass propagation of fish. A review. Aquaculture 34, 115-143. Referencias_________________________________________________________________ Watanabe, T., Viswanath, K. And Shuichi, S. 1997. Trace minerals in fish nutrition. Aquaculture 151 (1-4), 185-207. Whittle, S. J. 1976. The major chloroplast pigments of Chlorobotrys regularis (West) Bohlin (Eustigmatophyceae) and Ophiocytium majus Naegeli (Xanthophyceae). British Phycological Journal 11, 111-114. Whittle, S. J. and Casselton, P. J. 1969. The chloroplast pigments of some green and yellow-green algae. British Phycological Journal 4, 55-64. Whittle, S. J. and Casselton, P. J. 1975. The chloroplast pigments of the algal classes Eustigmatphyceae and Xanthophyceae. I Eustimatophyceae. British Phycological Journal 10, 179-191. Whyte, J. N. C. 1987. Biochemical composition and energy content of six species of phytoplankton used in mariculture of bivalves. Aquaculture 60, 231-241. Whyte, J. N. C. and Nagata, W. D. 1990. Carbohydrate and fatty acid composition of the rotifer, Brachionus plicatilis, fed monospecific diets of yeast or phytoplankton. Aquaculture 89, 263-272. Whyte, N. J. C., Clarke, W. C., Ginther, N .G., Jensen, J. O. T. and Townsend, L. D. 1994. Influence of composition of Brachionus plicatilis and Artemia on growth of larval sablefish ( Anoplopoma fimbria Pallas). Aquaculture 119, 47-61. Wikfors, G. H. and Patterson, G. W. 1994. Differences in strains of Isochrysis of importance to mariculture. Aquaculture 123, 127-135. Wikfors, G. H. and Ohno, M. 2001. Impact of algal research on aquaculture. Journal of Phycology 37, 968-974. Wood, A. M., Everroad, R. C. and Wingard, L. M. 2005. Measuring growth rates in microalgal cultures. En: Algal culturing techniques. Andersen, L. A. (Ed.). Elsevier Academic Press, Oxford, 269-286. Yongmanitchai, W. and Ward, O. P. 1991. Screening of algae for potential alternative sources of eicosapentaenoic acid. Phytochemistry 30, 2963-2967. Yúfera, M. and Pascual, E. 1980. Estudio del rendimiento de cultivos del rotífero Brachionus plicatilis O. F. Müller alimentados con levadura de panificación. Investigación Pesquera 44 (2), 361-368. Yúfera, M., Lubián, L. Mª and Pascual, E. 1983. Efecto de cuatro algas marinas sobre el crecimiento poblacional de dos cepas de Brachionus plicatilis (Rotifera: Brachionidae) en cultivo. Investigación Pesquera 47, 325-336. Yúfera, M., Pascual, E. and Guinea, J. 1993. Factors influencing the biomass of the rotifer Brachionus plicatilis in culture. Hydrobiologia 255/256, 159-164. Zhu, C. J., Lee, Y. K. and Chao, T.M. 1997. Effects of temperature and growth phase on lipid and biochemical composition of Isochrysis galbana TK1. Journal of Applied Phycology 9, 451-457. _________________________________________________________________Referencias 265 _______________________Agradecementos _____________________________________________________________Agradecementos 267 O camiño máis longo comeza cun primeiro paso... e remata tamén cun derradeiro paso. Agora que alcancei a miña meta, quero dar as grazas a todos os que me acompañaron. Ao meu codirector, o Profesor Jaime Fábregas, agradézolle ter confiado en min, ofrecéndome a oportunidade de incorporarme ao seu equipo e realizar a miña tese., e poñer en todo momento á miña disposición canto precisei. Á miña codirectora, a Profesora Ana Otero, que supervisou todo o meu traballo. Grazas por ter sempre un momento –ou longas horaspara dedicarme, e pola túa axuda, os teus consellos e tamén, polas túas chamadas de atención de vez en cando. Todo me resultou moi útil. Aos meus compañeiros. ¡Canto tempo compartindo espazo de traballo, material, cafés e bos e malos momentos! Grazas por terme aturado e por axudarme tantas veces, especialmente a Ana e Fito, os veteranos que me ensinaron e me axudaron en tantas cousas. En fin, que vos debo moito. Vicen axudoume coa estatística e Elena cun montón de detalles. ¡Moitísimas grazas! E como non, grazas á miña familia, que me apoiou en todo momento durante estes anos, alegrándose dos meus avances e solidarizándose cando me tocaba madrugar os domingos para ocuparme das microalgas ou escribir todo o verán. E grazas tamén aos meus amigos, que a pesar de que ás veces desaparecín durante días e días dedicada por completo ao meu traballo nunca se esqueceron de min, nin tampouco de axudarme a desconectar do laboratorio e de interesarse pola saúde dos meus “peixiños”. Pagou a pena.