Desarrollo de nuevas estrategias de preparación de muestra aplicadas al control de contaminantes medioambientales a niveles traza

UNIVERSIDAD DE SANTIAGO DE COMPOSTELA FACULTAD DE QUÍMICA Departamento de Química Analítica, Nutrición y Bromatología INSTITUTO DE INVESTIGACIÓN Y ANÁLISIS ALIMENTARIO DESARROLLO DE NUEVAS ESTRATEGIAS DE PREPARACIÓN DE MUESTRA APLICADAS AL CONTROL DE CONTAMINANTES MEDIOAMBIENTALES A NIVELES TRAZA MARÍA DEL ROSARIO RODIL RODRÍGUEZ Memoria para optar al grado de Doctora en Química Santiago de Compostela, Marzo de 2005 Dña. Pilar Bermejo Barrera, Catedrática de Universidad y Directora del Departamento de Química Analítica, Nutrición y Bromatología de la Universidad de Santiago de Compostela, Informa: Que Dña. M M aría del Rosario Rodil Rodríguez ha realizado en este departamento, bajo la dirección de Dña. Antonia Mª Carro Díaz y Dña. Rosa Antonia Lorenzo Ferreira, Profesoras Titulares de Universidad, el trabajo “Desarrollo de nuevas estrategias de preparación de muestra aplicadas al control de contaminantes medioambientales a niveles traza” , que presenta para optar al grado de Doctora en Química. Y para que así conste, firmo el presente informe en Santiago de Compostela, Marzo de 2005. Dña. Pilar Bermejo Barrera Dña. Antonia Mª Carro Díaz y Dña. Rosa Antonia Lorenzo Ferreira, Profesoras Titulares de Universidad del Departamento de Química Analítica, Nutrición y Bromatología de la Universidad de Santiago de Compostela, Autorizan: A la licenciada D D ña. Maria del Rosario Rodil Rodríguez, a la presentación de la memoria adjunta, titulada “Desarrollo de nuevas estrategias de preparación de muestra aplicadas al control de contaminantes medioambientales a niveles traza” , que ha realizado bajo su dirección en el Departamento de Química Analítica, Nutrición y Bromatología de la Facultad de Química, para optar al grado de Doctora en Química. Y para que conste, firmamos la presente en Santiago de Compostela, Marzo de 2005. Dña. Antonia Mª Carro Díaz Dña. Rosa Antonia Lorenzo Ferreira AGRADECIMIENTOS Tengo que agradecer a mucha gente su ayuda y apoyo durante estos años tanto a nivel personal como en el desarrollo de este trabajo, la verdad es que me resulta muy difícil y me invade la tristeza al escribir esta hoja porque es como una despedida. Por si alguien se me olvida, gracias a todos. Quiere expresar mi agradecimiento al Departamento de Química Analítica, Nutrición y Bromatología y al Instituto de Investigación y Análisis Alimentario, en especial a Rafael Cela y a todo su grupo por facilitarme los medios necesarios y permitirme realizar este trabajo. Al Ministerio de Ciencia y Tecnología (Proyectos BQU2002-01944, REN2000-0984 HID y BQU2003-02090) y a la Xunta de Galicia (Proyecto PGIDT01PX23701PN) por el financiamiento de este trabajo. Además quiero agradecer a la Xunta de Galicia por la concesión de la beca de tercer ciclo y la beca predoctoral y a la Universidad de Santiago de Compostela y a la Xunta de Galicia por las ayudas para estancias en el extranjero. A mis jefas, Toñi y Tuchi por su orientación, apoyo y comprensión, por todo lo que me han enseñado, y por su confianza en estos 5 años. A Isaac, porque siempre se puede contar contigo, por tu ayuda en mi lucha con los equipos y por tus consejos, he aprendido mucho de ti. Thanks to Prof. Carlo Creszenci and Prof. Thorsten Reemtsma for their welcome and help during my stages in Stockholm University and Technical University of Berlin, respectively. A todos mis compañeros del IIAA, los que ya se han ido y los que todavía están, por todos los ratos vividos, porque habéis conseguido un ambiente de trabajo muy agradable, de manera que la jornada de trabajo pasa de manera amena y, en algunos momentos, incluso divertida. A mis proyectandas , Loli, Mónica, Almudena, Fátima y Marta por aguantarme y por haber colaborado en el trabajo que se recoge en esta memoria. A Jos, Carmen González, Elena, Eva, Juana, Carmen Salgado, Julio y Tito, por haber sido además de compañeros de trabajo verdaderos AMIGOS. A Jos por haberme ayudado tanto, sobre todo cuando llegué al insti, en las peleas con el AED y por hablarme aunque yo no lo hiciera. A Carmen González por aguantarme cuando iba a darle la lata, por aquel verano mientras escribía, me he acordado mucho de ti durante estos últimos meses. A Eva por tantas conversaciones en las largas jornadas de trabajo y por ayudarme a ver las cosas desde otro punto de vista. A Tito por haberme escuchado y comprendido tantas veces, por los cafés y los paseos, por tantos momentos compartidos sobre todo en los últimos meses y por ayudarme este verano en Berlín. Thanks to Kristina and Chiara for your help during my stage in Stockholm and for being my friends. A l@s niñ@s por su amistad y porque siempre han creído en mí aunque quisiera tirar la toalla. Perdonadme por haber estado aislada del mundo estos últimos meses. Y por último, a mi familia por su apoyo y confianza incondicional. A mis padres por su cariño y porque me han dado todo lo necesario para que pudiera hacer mi camino. A mis hermanas por haber estado ahí en todo momento y por su comprensión. A Lola por las grandes alegrías que me ha dado en estos meses. Í NDICE ii I.2.2.3.5. Formación de quelatos 53 I.2.2.4. SEPARACIÓN Y DETECCIÓN 53 I.2.2.4.1. Cromatografía de Gases (GC) 54 I.2.2.4.2. Cromatografía Líquida (LC) 58 I.2.2.4.3. Electroforesis Capilar (CE) 60 I.2.2.5. PROBLEMAS EN LA ESPECIACIÓN 60 I.3. CONTAMINANTES ORGÁNICOS 81 I.3.1. INTERÉS MEDIOAMBIENTAL 81 I.3.1.1. IDENTIDAD Y PROPIEDADES 82 I.3.1.1.1. Plaguicidas Organoclorados (OCPs) 82 I.3.1.1.2. Bifenilos Policlorados (PCBs) 85 I.3.1.1.3. Bifenilos Polibromados (PBBs) y Éteres de Difenilo Polibromados (PBDEs) 88 I.3.1.1.4. Ésteres Organofosforados (TAPs) 93 I.3.1.2. FUENTES Y DISTRIBUCIÓN EN EL MEDIOAMBIENTE 96 I.3.1.3. BIODISPONIBILIDAD Y TOXICIDAD 101 I.3.2. DETERMINACIÓN DE CONTAMINANTES ORGÁNICOS 103 I.3.2.1. PREPARACIÓN DE MUESTRAS LÍQUIDAS 105 I.3.2.1.1. Extracción Líquido-Líquido (LLE) 105 I.3.2.1.2. Extracción en Fase Sólida (SPE) 107 I.3.2.1.3. Microextracción en Fase Sólida (SPME) 109 I.3.2.2. PREPARACIÓN DE MUESTRAS SÓLIDAS 113 I.3.2.2.1. Extracción Soxhlet (SOX) 113 I.3.2.2.2. Extracción Asistida por Ultrasonidos (USE) 115 I.3.2.2.3. Dispersión de la Matriz en Fase Sólida (MSPD) 116 I.3.2.2.4. Extracción Asistida por Microondas (MAE) 117 I.3.2.2.5. Extracción con Fluidos Supercríticos (SFE) 118 I.3.2.2.6. Extracción Acelerada con Disolventes (ASE) 119 I.3.2.3. LIMPIEZA DE LOS EXTRACTOS 127 Í NDICE iii I.3.2.3.1. Tratamientos no destructivos 128 I.3.2.3.2. Tratamientos destructivos 130 I.3.2.4. SEPARACIÓN Y DETECCIÓN 131 I.3.2.4.1. Cromatografía de Gases (GC) 131 I.3.2.4.2. Cromatografía Líquida (LC) 135 I.4. PLANIFICACIÓN DE EXPERIENCIAS EN QUÍMICA ANALÍTICA 149 I.4.1. PLANIFICACIÓN DE EXPERIENCIAS: ESTRATEGIA EXPERIMENTAL 150 I.4.2. OBJETIVOS DEL DISEÑO EXPERIMENTAL 152 I.4.2.1. INVESTIGACIÓN EXPLORATORIA 152 I.4.2.2. CRIBADO DE FACTORES 153 I.4.2.3. ESTUDIOS CUANTITATIVOS DE LOS FACTORES 153 I.4.2.4. ESTUDIOS CUANTITATIVOS DE LAS RESPUESTAS 153 I.4.3. OPTIMIZACIÓN DE PROCESOS 154 I.4.3.1. DISEÑOS SECUENCIALES 154 I.4.3.2. DISEÑOS SIMULTÁNEOS 155 I.4.3.3. OPTIMIZACIÓN MULTICRITERIO: FUNCIÓN DE DESEABILIDAD 156 I.4.4. COMPOSICIÓN ESTRATÉGICA DE MUESTRA 157 I.4.4.1. USO DE MATRICES SUPERSATURADAS 158 II. JUSTIFICACIÓN Y OBJETIVOS 163 III. MEDIOS EXPERIMENTALES 169 III.1. DISOLVENTES, REACTIVOS Y GASES 171 III.2. PATRONES Y MATERIALES DE REFERENCIA 172 III.3. MATERIAL 175 III.4. INSTRUMENTACIÓN ANALÍTICA 177 III.5. SOFTWARE 178 III.6. LAVADO DEL MATERIAL 178 Í NDICE iv IV. RESULTADOS E DISCUSIÓN 181 IV.1. DETERMINACIÓN DE ESPECIES DE MERCURIO EN MUESTRAS ACUOSAS MEDIANTE MICROEXTRACCIÓN EN FASE SÓLIDA Y CROMATOGRAFÍA DE GASES CON COLUMNA MULTICAPILAR 183 IV.1.1. MATERIAL Y MÉTODOS 183 IV.1.1.1. PATRONES 183 IV.1.1.2. OTRAS DISOLUCIONES 184 IV.1.1.3. CONDICIONES INSTRUMENTALES DE MEDIDA 185 IV.1.1.4. PREPARACIÓN DE MUESTRAS 186 IV.1.2. RESULTADOS Y DISCUSIÓN 188 IV.1.2.1. OPTIMIZACIÓN CON LAS CONDICIONES DE DETECCIÓN SIMULTÁNEA DE ESPECIES DE Hg Y Sn 188 IV.1.2.2. IDENTIFICACIÓN DE LOS COMPUESTOS Y VALIDACIÓN DEL MÉTODO DE DETECCIÓN 192 IV.1.2.3. OPTIMIZACIÓN DE LAS CONDICIONES DE DERIVATIZACIÓN/ EXTRACCIÓN PARA LAS ESPECIES DE Hg 194 IV.1.2.4. VALIDACIÓN DEL MÉTODO ANALÍTICO 199 IV.1.2.5. APLICACIÓN A MUESTRAS REALES 200 IV.1.2.5.1. Estudio del efecto salino 202 IV.2. DETERMINACIÓN DE ESPECIES DE MERCURIO EN MUESTRAS BIOLÓGICAS Y SEDIMENTOS MEDIANTE MAE-DERIVATIZACIÓNSPME Y CROMATOGRAFÍA DE GASES CON ESPECTROMETRÍA DE EMISIÓN ATÓMICA 207 IV.2.1. MATERIAL Y MÉTODOS 208 IV.2.1.1. PATRONES 208 IV.2.1.2. OTRAS DISOLUCIONES 208 IV.2.1.3. MUESTRAS 209 IV.2.1.4. CONDICIONES INSTRUMENTALES DE MEDIDA 211 IV.2.1.5. PREPARACIÓN DE MUESTRAS 212 IV.2.2. RESULTADOS Y DISCUSIÓN 214 Í NDICE v IV.2.2.1. IDENTIFICACIÓN DE LOS COMPUESTOS 214 IV.2.2.2. OPTIMIZACIÓN DE LAS CONDICIONES DE DERIVATIZACIÓN/SPME 215 IV.2.2.3. OPTIMIZACIÓN DE LAS CONDICIONES DE LIXIVIACIÓN 223 IV.2.2.4. VALIDACIÓN DEL MÉTODO ANALÍTICO 233 IV.2.2.5. APLICACIÓN A MATERIALES DE REFERENCIA Y MUESTRAS REALES 236 IV.3. DETERMINACIÓN DE PLAGUICIDAS ORGANOCLORADOS EN AGUA. MONITORIZACIÓN MEDIANTE COMPOSICIÓN ESTRATÉGICA DE MUESTRAS 243 IV.3.1. MATERIAL Y MÉTODOS 244 IV.3.1.1. PATRONES 244 IV.3.1.2. MUESTRAS 245 IV.3.1.3. OTRAS DISOLUCIONES 245 IV.3.1.4. CONDICIONES INSTRUMENTALES DE MEDIDA 245 IV.3.1.5. EXTRACCIÓN DE LAS MUESTRAS 246 IV.3.1.5.1. Cartuchos de carbón grafitizado (GCB) ENVICarb 247 IV.3.1.5.2. Cartuchos de divinilbenceno-N-vinilpirrolidona (DVB-VP) OASIS HLB 249 IV.3.1.6. MATRIZ DE EXPERIENCIAS. PREPARACIÓN DE MUESTRAS 250 IV.3.1.6.1. Lote 1: Matriz 12x30 253 IV.3.1.6.2. Lote 2: Matriz 12x24 254 IV.3.2. RESULTADOS Y DISCUSIÓN 255 IV.3.2.1. IDENTIFICACIÓN DE LOS COMPUESTOS 255 IV.3.2.2. VALIDACIÓN DE LOS MÉTODOS ANALÍTICOS 256 IV.3.2.3. COMPOSICIÓN DE MUESTRAS 258 IV.3.2.3.1. Análisis de muestras individuales 259 IV.3.2.3.2. Análisis de las muestras compuestas 261 IV.3.2.3.3. Comparación de los resultados 266 Í NDICE vi IV.4. DETERMINACIÓN DE PIRORRETARDANTES ORGANOFOSFORADOS Y PLASTIFICANTES Y DE SUS POSIBLES PRODUCTOS DE DEGRADACIÓN EN AGUAS MEDIANTE CROMATOGRAFÍA LÍQUIDA-ESPECTROMETRÍA DE MASAS EN TÁNDEM 279 IV.4.1. MATERIAL Y MÉTODOS 280 IV.4.1.1. PATRONES 280 IV.4.1.2. HIDRÓLISIS QUÍMICA DE LOS TRIÉSTERES DEL ÁCIDO FOSFÓRICO 281 IV.4.1.3. MUESTRAS 282 IV.4.1.4. OTRAS DISOLUCIONES 282 IV.4.1.5. CONDICIONES INSTRUMENTALES DE MEDIDA 282 IV.4.1.5.1. Separación y detección de los pirorretardantes fosforados 283 IV.4.1.5.2. Separación y detección de los productos de hidrólisis 285 IV.4.1.6. PREPARACIÓN DE MUESTRAS 288 IV.4.1.6.1. Extracción de los pirorretardantes organofosforados 289 IV.4.1.6.2. Extracción de los productos de hidrólisis 290 IV.4.1.7. ESTUDIO DE BIODEGRADACIÓN 291 IV.4.2. RESULTADOS Y DISCUSIÓN 291 IV.4.2.1. RESULTADOS DE LA HIDRÓLISIS QUIMICA 291 IV.4.2.2. OPTIMIZACIÓN DE LOS PARÁMETROS DE DETECCIÓN ESI-MS/MS 292 IV.4.2.2.1. Optimización y espectro de MS/MS para los ésteres tri-sustituidos 292 IV.4.2.2.2. Optimización y espectro de MS/MS para los ésteres monoy di-sustituidos 297 IV.4.2.3. OPTIMIZACIÓN DE LA FASE MÓVIL E IDENTIFICACIÓN DE LOS COMPUESTOS 301 IV.4.2.3.1. Optimización de la separación de los TAPs 301 Í NDICE vii IV.4.2.3.2. Optimización de separación de ésteres mono- /di-sustituidos 303 IV.4.2.4. OPTIMIZACIÓN DE LAS CONDICIONES DE EXTRACCIÓN (SPE) 305 IV.4.2.4.1. Extracción de TAPs mediante SPE 305 IV.4.2.4.2. Extracción de los dialquil-/arilfosfatos mediante SPE 308 IV.4.2.5. ESTUDIO DE LOS EFECTOS DE MATRIZ 310 IV.4.2.6. VALIDACIÓN DEL MÉTODO ANALÍTICO 312 IV.4.2.6.1. Estudio de los parámetros analíticos para los TAPs 312 IV.4.2.6.2. Estudio de los parámetros analíticos para los DAPs 315 IV.4.2.7. APLICACIÓN A MUESTRAS REALES 317 IV.4.2.8. ESTUDIO DE BIODEGRADACIÓN 321 IV.5. DETERMINACIÓN DE COMPUESTOS CLORADOS Y BROMADOS EN MUESTRAS DE ACUICULTURA 325 IV.5.1. MATERIAL Y MÉTODOS 326 IV.5.1.1. PATRONES 326 IV.5.1.2. MUESTRAS 327 IV.5.1.3. ADSORBENTES 328 IV.5.1.4. CONDICIONES INSTRUMENTALES DE MEDIDA 328 IV.5.1.4.1. Cromatografía de Gases con Detección por Captura Electrónica (GC-ECD) 328 IV.5.1.4.2. Cromatografía de Gases acoplada con Espectrometría de Masas (GC-MS y GC-MS/MS) 329 IV.5.2.5. PREPARACIÓN DE MUESTRAS 332 IV.5.1.5.1. Extracción con Fluidos Supercríticos (SFE) 332 IV.5.1.5.2. Dispersión de la Matriz en Fase Sólida (MSPD) 333 IV.5.1.5.3. Microextracción en Fase Sólida (SPME) 334 IV.5.2. RESULTADOS Y DISCUSIÓN 335 Í NDICE viii IV.5.2.1. IDENTIFICACIÓN DE LOS COMPUESTOS 335 IV.5.2.1.1. Cromatografía de Gases con Detección de Captura Electrónica (GC-ECD) 335 IV.5.2.1.2. Cromatografía de Gases –Espectrometría de Masas (GC-MS) 336 IV.5.2.1.3. Cromatografía de Gases –Espectrometría de Masas en tándem (GC-MS/MS) 341 IV.5.2.2. VALIDACIÓN DE LOS MÉTODOS DE DETERMINACIÓN 343 IV.5.2.3. OPTIMIZACIÓN DE LAS CONDICIONES DE EXTRACCIÓN/ LIMPIEZA MEDIANTE SFE 346 IV.5.2.3.1. Estudio de la homogeneidad del pienso 346 IV.5.2.3.2. Estudio de la limpieza 347 IV.5.2.3.3. Optimización de las condiciones de SFE 350 IV.5.2.4. OPTIMIZACIÓN DE LAS CONDICIONES DE MSPD 359 IV.5.2.5. OPTIMIZACIÓN DE LAS CONDICIONES DE SPME 363 IV.5.2.6. VALIDACIÓN DE LOS MÉTODOS ANALÍTICOS 369 IV.5.2.7. APLICACIÓN A MUESTRAS REALES 374 V. CONCLUSIONES 383 ANEXOS 391 A.I. Espectros de masas en tándem (Electrospray) de ésteres del ácido fosfórico 393 A.II. Espectros de masas y masas en tándem (Impacto Electrónico) de los contaminantes halogenados 409 A.III. Acrónimos 433 Í NDICE T ABLAS ix Tabla I.2.1. Principales especies de mercurio en el medio ambiente 8 Tabla I.2.2. Fuentes de mercurio medioambiental 9 Tabla I.2.3. Absorción de las especies de mercurio por vías 13 Tabla I.2.4. Resumen de métodos de determinación de especies de mercurio en muestras acuosas 26 Tabla I.2.5. Resumen de métodos de determinación de especies de mercurio en muestras de sedimentos 38 Tabla I.2.6. Resumen de métodos de determinación de especies de mercurio en muestras de material biológico 40 Tabla I.2.7. Principales agentes derivatizantes 49 Tabla I.3.1. Principales propiedades físicas de los plaguicidas estudiados 84 Tabla I.3.2. Isómeros de los PCBs y su nomenclatura según la IUPAC 86 Tabla I.3.3. Principales propiedades físicas de los PCBs estudiados 87 Tabla I.3.4. Composición de las mezclas comerciales de PBDEs 92 Tabla I.3.5. Principales propiedades físicas de los PBBs y PBDEs estudiados 92 Tabla I.3.6. Principales propiedades físicas de los TAPs estudiados 96 Tabla I.3.7. Uso de los contaminantes orgánicos estudiados 97 Tabla I.3.8. Clasificación de la toxicidad: escala de Hodge y Sterner 102 Tabla I.3.9. Toxicidad de los contaminantes orgánicos estudiados 103 Tabla I.3.10. Resumen de métodos de determinación de los compuestos orgánicos estudiados en muestras acuosas 111 Tabla I.3.11. Resumen de métodos de determinación de los compuestos orgánicos estudiados en muestras de sedimentos 121 Tabla I.3.12. Resumen de métodos de determinación de los compuestos orgánicos estudiados en muestras de material biológico 123 Tabla IV.1.1. Condiciones experimentales de medida del sistema GC-MIPAES para la determinación de compuestos etilados de mercurio y estaño 185 Tabla IV.1.2. Dominio experimental de los factores seleccionados en el diseño experimental 23+2 para la optimización de las condiciones de detección del sistema GC-MIP-AES 189 Í NDICE T ABLAS x Tabla IV.1.3. Matriz de experiencias y respuestas obtenidas para las especies de mercurio y estaño (cuentas de área) del diseño experimental 23+2 para la optimización de las condiciones de detección del sistema GC-MIP-AES 189 Tabla IV.1.4. Tiempos de retención de los compuestos de mercurio y estaño 192 Tabla IV.1.5. Parámetros de validación del método de determinación de los compuestos etilados de mercurio y estaño mediante inyección directa 194 Tabla IV.1.6. Dominio experimental de los factores seleccionados en el diseño experimental 23+2 para la optimización de las condiciones de SPME 197 Tabla IV.1.7. Matriz de experiencias y respuestas obtenidas para las especies de mercurio (cuentas de área) del diseño experimental 23+2 para la optimización de las condiciones de SPME 197 Tabla IV.1.8. Condiciones óptimas de extracción mediante SPME 199 Tabla IV.1.9. Parámetros de validación del método de determinación de los compuestos etilados de mercurio mediante SPME-GC-MIP-AES 200 Tabla IV.1.10. Resultado del análisis de especies de mercurio (60 ng.L-1) en agua de río 201 Tabla IV.1.11. Resultado del análisis de especies de mercurio (100 ng.L-1) en agua de mar 201 Tabla IV.2.1. Condiciones experimentales de medida del sistema GC-MIPAES para la determinación de compuestos fenilados de mercurio 211 Tabla IV.2.2. Tiempos de retención de los compuestos de mercurio como especies feniladas 214 Tabla IV.2.3. Dominio experimental de los factores seleccionados en el diseño experimental central compuesto para la optimización del proceso de SPME 217 Tabla IV.2.4. Matriz de experiencias y respuestas obtenidas para las especies de mercurio del diseño experimental central compuesto para la optimización de las condiciones de SPME 218 Tabla IV.2.5. Dominio experimental de los factores seleccionados en el diseño experimental factorial fraccionado 25-1 para la optimización del proceso de lixiviación 224 Tabla IV.2.6. Matriz de experiencias y respuestas obtenidas para las especies de mercurio del diseño experimental factorial fraccionado 25-1 para la optimización de las condiciones de lixiviación 225 Í NDICE T ABLAS xi Tabla IV.2.7. Dominio experimental de los factores seleccionados en el diseño experimental central compuesto para la optimización de las condiciones de MAE 228 Tabla IV.2.8. Matriz de experiencias y respuestas obtenidas para las especies de mercurio del diseño experimental central compuesto con 3 puntos centrales 229 Tabla IV.2.9. Estimaciones de los coeficientes para las especies de mercurio del diseño experimental central compuesto con 3 puntos centrales 230 Tabla IV.2.10. Parámetros de calibración de la determinación de los compuestos de mercurio en material biológico 234 Tabla IV.2.11. Parámetros de calibración de la determinación de los compuestos de mercurio en sedimentos 234 Tabla IV.2.12. Parámetros de validación del método de determinación de los compuestos de mercurio 235 Tabla IV.2.13. Resultado del análisis metilmercurio en diversos materiales biológicos de origen marino 236 Tabla IV.2.14. Resultado del análisis mercurio total en diversos materiales biológicos de origen marino 237 Tabla IV.2.15. Resultado del análisis de metilmercurio en materiales de referencia de sedimentos 239 Tabla IV.2.16. Resultado del análisis de mercurio total en materiales de referencia de sedimentos 239 Tabla IV.3.1. Condiciones experimentales de medida del sistema GC-ECD para la determinación de plaguicidas organoclorados 246 Tabla IV.3.2. Matriz supersaturada 12x30 251 Tabla IV.3.3. Matriz supersaturada 12x24 252 Tabla IV.3.4. Tiempos de retención de los plaguicidas organoclorados estudiados 255 Tabla IV.3.5. Parámetros de validación del método de determinación de los plaguicidas organoclorados mediante SPE con cartuchos ENVI-Carb y GCECD 257 Tabla IV.3.6. Parámetros de validación del método de determinación de los plaguicidas organoclorados mediante SPE con cartuchos OASIS HLB y GC-ECD 258 Tabla IV.3.7. Resultados obtenidos en el análisis de las muestras individuales contaminadas del lote 1 259 Í NDICE F IGURAS xviii Figura IV.4.13. Cromatograma de LC-ESI-MS/MS de un patrón de 50 µg.L-1 de TAPs 303 Figura IV.4.14. Influencia de la concentración de tributilamina en la respuesta media de todos los compuestos 304 Figura IV.4.15. Cromatograma de LC-ESI-MS/MS de una mezcla de los ésteres mono-/di-sustituidos obtenidos como producto de hidrólisis 305 Figura IV.4.16. Estudio del volumen de elución para el TPPO 306 Figura IV.4.17. Estudio del volumen de elución para el DnBP 308 Figura IV.4.18. Estudio de los efectos de matriz en LC-ESI-MS/MS de los TAPs 311 Figura IV.4.19. Estudio de los efectos de matriz en LC-ESI-MS/MS de DAPs 312 Figura IV.4.20. Cromatograma de una muestra de agua residual tratada, mediante SPE-LC-MS/MS, para la determinación de TAPs 320 Figura IV.4.21. Cromatograma de una muestra de agua residual, mediante SPE-LC-MS/MS, para la determinación de los productos de hidrólisis de los TAPs 321 Figura IV.4.22. Patrón de degradación de los esteres de fosfato trisustituidos en la prueba de degradación 322 Figura IV.5.1. Esquema del llenado de una celda del SFE 333 Figura IV.5.2. Esquema de la jeringa de MSPD 334 Figura IV.5.3. Cromatograma de GC-ECD para la determinación de especies halogenadas (50 ng.mL-1)336 Figura IV.5.4. Cromatogramas de GC-MS para la determinación de especies halogenadas (100 ng.mL-1)338 Figura IV.5.5. Cromatogramas de GC-MS/MS para la determinación de especies halogenadas (50 ng.mL-1)342 Figura IV.5.6. Estudio de la homogeneidad del pienso preparado 347 Figura IV.5.7. Estudio del % de grasa en el extracto usando diferentes adsorbentes 348 Figura IV.5.8. Estudio de la limpieza con diferentes adsorbentes 349 Figura IV.5.9. Gráfico Lenth de efectos principales e interacciones 355 Figura IV.5.10. Superficie de respuesta del tiempo de extracción dinámica frente a la presión 358 Í NDICE F IGURAS xix Figura IV.5.11. Funciones de deseabilidad global, gráfico bidimensional y tridimensional 359 Figura IV.5.12. Gráfica de efectos totales 362 Figura IV.5.13. Estudio de la limpieza con diferentes adsorbentes 363 Figura IV.5.14. Estudio del modo de SPME 364 Figura IV.5.15. Estudio del tiempo de extracción de SPME a 75 ºC 365 Figura IV.5.16. Gráfica de superficies de respuesta 368 Figura IV.5.17. Gráfica de deseabilidad global 369 Figura IV.5.18. Cromatograma de un extracto de una muestra de berberecho obtenido mediante GC-MS/MS, extraída mediante MSPD 379 Figura IV.5.19. Cromatograma de una muestra de almeja obtenido mediante GC-MS/MS, extraída mediante SFE-SPME 380 I. INTRODUCCIÓN I NTRODUCCIÓN 3 I.1. CONTROL DE CONTAMINANTES MEDIOAMBIENTALES Este trabajo se centra en el desarrollo de nuevas estrategias de preparación de muestra para el control de contaminantes medioambientales en el medio acuático. Las muestras medioambientales están normalmente contaminadas con una gran variedad de compuestos. El problema general que se presenta en el análisis de estas muestras es el gran número de componentes de la matriz que podrían interferir en el análisis cuantitativo1. Por lo tanto, el control medioambiental se basa en el desarrollo de métodos analíticos que eviten los problemas en la detección, mejoren el control de calidad y garanticen la fiabilidad de los resultados del proceso analítico, de manera que permitan conocer el nivel de persistencia de un cierto compuesto. Actualmente, en la sociedad hay un aumento de la conciencia pública sobre la presencia de contaminantes en el medio ambiente y en las fuentes de alimentos. Es muy importante estudiar la presencia de contaminantes en el medio acuático, tanto en agua, como en sedimentos y organismos vivos, ya que la mayoría tienden a bioacumularse en los tejidos grasos de los organismos acuáticos, como peces, y se biomagnifican a lo largo de la cadena alimenticia. Por lo que, los consumidores de estos productos, incluyendo los humanos, podrían verse afectados por los efectos de estos contaminantes2. En las últimas décadas, debido al aumento en la demanda por la población mundial, se ha producido un aumento de la producción de peces de granja, es decir, de la acuicultura3. Por lo tanto, para prevenir C ONTROL DE CONTAMINANTES MEDIOAMBIENTALES 4 potenciales riesgos para la salud humana, además del estudio de estos contaminantes en el medio natural, es necesaria su monitorización en medios controlados para identificar su origen. Por ejemplo, los piensos empleados en la acuicultura pueden suponer un camino potencial de introducción directa de contaminantes en peces4. Los contaminantes medioambientales incluyen una multitud de compuestos químicos que pueden clasificarse según su origen, natural o antropogénico, y según su naturaleza química, inorgánica u orgánica5. Así, algunos compuestos pueden aparecer de manera natural en el medioambiente, otros pueden producirse comercialmente debido a su actividad sobre los seres vivos, como plaguicidas, o con fines industriales, como PCBs, y otros pueden producirse como subproductos no deseados. Además, algunos compuestos pueden tener varios orígenes: naturales y antropogénicos. Los contaminantes inorgánicos son principalmente aniones, gases y metales pesados. Algunos de estos metales (Hg, Sn, Pb) pueden sufrir procesos metabólicos en los seres vivos dando lugar a compuestos organometálicos. Existe una gran variedad de contaminantes orgánicos que comprenden desde aceites y/o grasas hasta plaguicidas o PCBs. Muchos de estos compuestos son peligrosos ya que son cancerígenos y/o son disruptores endocrinos6 (EDs), es decir, son sustancias que actúan de manera similar a algunas hormonas alterando las rutas metabólicas naturales de los seres vivos. I NTRODUCCIÓN 5 Para el desarrollo de este trabajo se han seleccionado los siguientes grupos de contaminantes: •Mercurio y sus derivados orgánicos, •Compuestos organohalogenados: plaguicidas organoclorados, bifenilos policlorados, bifenilos polibromados y éteres de difenilo polibromados, •Compuestos organofosforados: trialquilfosfatos, triarilfosfatos y bisfosfatos. 1. Eljarrat, E.; de la Cal, A.; Barceló, D., J. Chromatogr. A 1008 (2003) 181-192. 2. Baird, C., “Quimica Ambiental”, Ed. Reverté, Barcelona (2001). pg. 299-366. 3. Serrano, R.; Barreda, M.; Pitarch, E.; Hernández, F., J. Sep. Sci. 26 (2003) 75-86. 4. Gfrerer, M.; Chen, S.; Lankmayr, E.P.; Quan, X.; Yang, F., Anal. Bioanal. Chem. 378 (2004) 1861-1867. 5. Pérez-Bendito, D.; Rubio, S., “Environmental Analytical Chemistry”, de “Comprensive Analytical Chemistry”, Ed. Elsevier, Amsterdam (1999). 6. “European Workshop on the impact of Endocrine Disrupters on Human Health and Wildlife”. Report of the Proceedings, 2-4, pg.125. European Commission, Weybridge, Reino Unido (1996). I NTRODUCCIÓN 7 I.2. EL MERCURIO I.2.1. INTERÉS MEDIOAMBIENTAL DEL MERCURIO En las últimas dos décadas el mercurio y los compuestos organomercuriales han sido muy estudiados en el medio ambiente1,2,3,4,5,6,7 debido a su toxicidad, su persistencia en el medio y su tendencia a acumularse en los seres vivos. El mercurio está considerado entre los contaminantes medioambientales prioritarios, también se clasifica como disruptor endocrino. Está entre los metales traza tóxicos más bioconcentrados en la cadena alimenticia humana y, varias agencias y organizaciones nacionales e internacionales como WHO y diferentes gobiernos como el canadiense y los escandinavos, se han puesto como objetivo el control de su emisión. I.2.1.1. IDENTIDAD Y PROPIEDADES El mercurio aparece en el medio ambiente en diferentes formas incluyendo mercurio elemental (Hg0), especies de mercurio inorgánico (Hg+, Hg2+), y especies orgánicas [CH3Hg+, C2H5Hg+, C6H5Hg+,(CH3)2Hg] (tabla I.2.1). Las especies de mercurio difieren mucho en propiedades pero son todas tóxicas tanto para humanos como para animales y las formas orgánicas, especialmente el metilmercurio y dimetilmercurio, presentan la mayor toxicidad. EL MERCURIO 14 La exposición a mercurio elemental es casi exclusivamente a través de la inhalación del vapor. La población general ha tenido pocas exposiciones a mercurio elemental, y estas exposiciones se producen por usos deliberados. La exposición más alta es la ocupacional, normalmente en operaciones de minería pero sobre 50 ocupaciones específicas o tareas conllevan frecuentes exposiciones a mercurio vapor. También producen exposiciones a mercurio elemental el uso del mercurio en amalgamas dentales y algunas prácticas culturales, como la Santería. Sobre la absorción a través de la piel se tiene poca información aunque se sospecha que mientras para mercurio elemental y sales inorgánicas es nula para especies orgánicas es moderadamente alta. El uso de jabones y cremas blanqueadores de piel está aumentando sustancialmente la exposición a mercurio por vía dérmica, principalmente en Norte América y África10. La forma de exposición más importante a metilmercurio es a través de la dieta, principalmente por la ingesta de peces, crustáceos y derivados. Para peces comestibles la concentración de mercurio total no debe exceder 0,5 mg.kg-1 9,21, siendo un 85 % la media encontrada como metilmercurio14, excepto para los principales depredadores: rape, mero, bonito, fletán, lucio, raya, tiburón, esturión, pez espada, atún,..., en los que no debe exceder 1 mg.kg-1 de peso fresco21, y se recomienda limitar la frecuencia del consumo de estos peces depredadores en particular en mujeres embarazadas y niños de corta edad22. La mayoría de las especies de mercurio se eliminan principalmente por la orina y las heces. I NTRODUCCIÓN 15 El mercurio y sus compuestos pueden causar efectos tóxicos reversibles e irreversibles, dependiendo de la dosis y la duración de la exposición. Los síntomas clásicos de envenenamiento por vapores de mercurio son eretismo (irritabilidad, excitabilidad, perdida de memoria, insomnio), temblores y gingivitis. La mayoría de los efectos del mercurio vapor son reversibles con el cese de la exposición, aunque la recuperación completa de los efectos psicológicos es difícil de determinar16. El metilmercurio produce daños neurológicos irreversibles, en animales se ha observado un período latente de semanas o meses entre el cese de la exposición y el comienzo del envenenamiento, produciéndose cambios morfológicos en el cerebro antes del comienzo de los síntomas. Los fetos son más sensibles que los adultos16. Los síntomas más comunes de intoxicación por metilmercurio son parestesia, reducción del campo visual, defectos de oído, y ataxia. Los efectos son irreversibles pero puede producirse alguna mejora de la coordinación motora16. En la bibliografía pueden encontrarse varios episodios de contaminación por exposición a las especies de mercurio, principalmente por la ingesta de alimentos con un elevado contenido de metilmercurio. El primer caso de muerte por intoxicación con un compuesto organomercúrico tuvo lugar en 1863, cuando dos químicos intentaban determinar el número de oxidación del compuesto dimetilmercurio14. El caso de contaminación más conocido ocurrió en la bahía de Minamata23, Japón, alrededor de 1960, en una industria de fertilizantes que EL MERCURIO 16 producía el metilmercurio como subproducto en la producción de acetaldehído, los residuos acababan en las aguas de la bahía y la población de Minamata se alimentaba de los peces provenientes de esa bahía. Oficialmente se reconoció que 2.252 personas fueron directamente intoxicadas por el metilmercurio, los muertos ascendieron a 1.043 y un total de 12.127 personas reivindicaron tener la dolencia. En la década de los 70, en Irak, Pakistán, Gana y Guatemala tuvieron lugar varios episodios de contaminación de agricultores y sus familias, que utilizaban granos tratados con funguicidas a base de metily etilmercurio para elaborar el pan. En el caso particular de Irak más de 6.900 personas fueron hospitalizadas y unas 459 murieron. En 1969, en los Estados Unidos, se produjo una intoxicación por la ingestión de carne de cerdos alimentados con granos tratados con plaguicidas organomercuriales24. En 1997, una investigadora de la universidad de Dartmouth (USA) murió intoxicada algunos meses después de que unas gotas de dimetilmercurio puro atravesaran sus guantes de látex25. Actualmente en el Amazonas26, se ha reconocido un gran problema de contaminación de mercurio en peces que afecta principalmente a los indígenas cuya principal base de proteínas en la alimentación es el pescado. El mercurio se liberó durante las operaciones en minas de oro, pero los principales problemas de contaminación de mercurio son probablemente debidos a la deforestación y a la construcción de embalses en los ríos. I NTRODUCCIÓN 17 I.2.2. ESPECIACIÓN DE MERCURIO De acuerdo con la IUPAC, el análisis de especiación se define como “la actividad analítica de identificación y medida de una o más de las especies químicas individuales en una muestra”, mientras la especiación de un elemento se define como “la distribución de las especies químicas definidas de un elemento en un sistema”27. Por lo tanto, puede entenderse como especiación elemental el análisis que lleva a la determinación de la distribución de las especies químicas de un elemento particular en una muestra, nos da información de las formas químicas de un elemento y de la cantidad existente de cada una de ellas en una muestra. El interés en la especiación ha crecido en las últimas dos décadas como puede verse reflejado en el desarrollo de técnicas analíticas que discriminan entre las diferentes formas de un elemento5,28,29,30. Debido a la toxicidad del mercurio orgánico, al hecho de que los compuestos de mercurio orgánico pueden formarse en la naturaleza y a la bioacumulación del metilmercurio es de gran interés intentar comprender la distribución del mercurio en la naturaleza y la interconversión entre los diferentes compuestos de mercurio, para lo que es necesaria la especiación de mercurio6,8,31,32,33,34. Pero la determinación de las formas químicas de un elemento es todavía un desafío analítico. Las especies orgánicas frecuentemente son inestables y las concentraciones encontradas en las diferentes matrices de interés son de µg.L-1 o en algunos casos ng.L-1 (aguas) o ng.g-1 (sedimentos y tejidos biológicos), mientras las formas inorgánicas pueden EL MERCURIO 18 presentarse simultáneamente en concentraciones que difieren hasta en tres órdenes de magnitud. El análisis de la mayoría de las muestras medioambientales requiere una secuencia de tres pasos: preparación de muestra, separación y detección. La preparación de muestra tiene que transferir las especies de la muestra a una disolución adecuada a la técnica de separación, normalmente una técnica cromatográfica, lo cual requiere varios pasos incluyendo: oFiltración, para separar partículas de muestras gaseosas y acuosas; oExtracción, separación de las especies de la matriz de la muestra o solubilización, no se elimina la matriz de la muestra; oPreconcentración, para incrementar la concentración de las especies en disoluciones; oLimpieza, eliminación de componentes de la matriz; oDerivatización, conversión controlada de las especies presentes en la muestra en formas que mejoran la separación cromatográfica. El muestreo y la preparación de muestra son áreas críticas para el desarrollo de estudios de especiación. En la etapa de almacenamiento a veces se introducen errores y, por lo tanto, lo datos analíticos no contendrán información sobre las especies en las muestras originales. El procedimiento de preparación de muestra va a venir condicionado por las bajas concentraciones de los analitos, del tipo de muestra que va a ser analizada, la estabilidad de los analitos y la necesidad de conservar la forma organometálica durante el procedimiento y los requerimientos de la I NTRODUCCIÓN 19 técnica de separación y determinación en términos de volumen de muestra, polaridad, y volatilidad. Para la detección, se usan técnicas atómicas analíticas sensibles y selectivas, generalmente acopladas con cromatografía líquida o de gases. La especiación simultánea de varios elementos también constituye una importante tarea, aunque generalmente surgen problemas en la preparación de muestra debido a las diferentes condiciones necesarias para cada elemento. I.2.2.1. PREPARACIÓN DE MUESTRAS LÍQUIDAS En muestras líquidas, aparecen estudios en la bibliografía35 de varios parámetros que podrían influir en la estabilidad del mercurio inorgánico y del metilmercurio durante el almacenamiento como pueden ser: la concentración de las especies13,36 (mayor pérdida en disoluciones donde la concentración es mas baja), el material del recipiente13,37 (se desaconseja el uso de recipientes de polietileno, polipropileno y cloruro de polivinilo, los mejores recipientes son teflón y pirex), la temperatura de almacenamiento36, el pH de la muestra36 (se recomienda la acidificación de la muestra para evitar pérdidas por absorción en las paredes de los recipientes de almacenamiento) y la exposición a la luz36 (parece no tener importancia). La concentración total de mercurio en aguas naturales está entre 0,2 a 100 ng.L-1 mientras el nivel de metilmercurio alcanza aproximadamente 10 ng.L-1 38. El criterio de calidad de agua de la EPA para mercurio inorgánico EL MERCURIO 20 son 0,77 µg.L-1 para agua dulce y 0,94 µg.L-1 para agua salada. El nivel máximo de mercurio inorgánico permitido en agua de bebida es 2 µg.L-1 39. En la extracción, el objetivo es separar el analito de interés de la matriz de la muestra con un rendimiento y selectividad óptimos, de tal manera que sólo especies con pequeño potencial interferente pasen a través del paso de separación de la muestra. DERIVATIZACIÓN EXTRACCIÓN DERIVATIZACIÓN PRECONCENTRACIÓN SEPARACIÓN DETECCIÓN DERIVATIZACIÓN COMPLEJACIÓN MUESTRA ACUOSA PURGA Y ATRAPADO SPME SPE DESTILACIÓN LIQUIDOLIQUIDO DERIVATIZACIÓN COMPLEJACIÓN PURGA Y ATRAPADO LIQUIDOLIQUIDO CROMATOGRAFIA DE GASES CROMATOGRAFIA LIQUIDA ELECTROFORESIS CAPILAR MIP-AES ECD MS CVAFS CVAAS ICP-MS UV Figura I.2.2. Técnicas de preparación de muestra para el análisis de especiación de mercurio en muestras acuosas. En la figura I.2.2 se recogen las técnicas de tratamiento de muestra, separación y detección utilizadas en muestras de agua. Las técnicas más usadas para la extracción de compuestos de mercurio de muestras acuosas son la extracción líquido-líquido con disolventes, la destilación, la extracción en fase sólida (SPE), la microextracción en fase sólida (SPME) y la purga y atrapado. I NTRODUCCIÓN 21 I.2.2.1.1. Extracción con Disolventes La extracción con disolventes es un método tradicional que consiste en obtener los analitos de la muestra por partición en un disolvente inmiscible. Es necesario el uso de disolventes no miscibles con el agua, como tolueno40, hexano41, isooctano42, diclorometano43,44 y benceno45,46,47. Para mejorar la transferencia de los compuestos a la fase orgánica es necesario la formación de un complejo quelato extraíble o compuestos no polares en la disolución antes de su extracción. Los agentes más utilizados son iones haluro45,47 (I-), tetra(alquil/-aril) boratos42,43,44 (NaBPh4, NaBPr4, NaBEt4), aminas ternarias46 y ditizona40. Este método usa grandes volúmenes de disolventes orgánicos y grandes volúmenes de muestra, teniendo que repetirse la extracción 2-3 veces para alcanzar recuperaciones elevadas. Con algunas muestras, pueden producirse emulsiones lo que podría complicar y prolongar el paso de extracción. El proceso es lento, requiere una considerable mano de obra y genera un gran volumen de residuo de disolvente orgánico. I.2.2.1.2. Destilación Se ha utilizado la destilación 48,49,50,51 con ácido sulfúrico y haluros de potasio para la separación de metilmercurio de las muestras de agua. La extracción se realiza a presión atmosférica y elevada temperatura (140180ºC) y, normalmente, seguido por la extracción en un disolvente orgánico (diclorometano) y derivatización de los analitos (NaBEt4). Con esta técnica se obtienen recuperaciones más altas y más reproducibles que con EL MERCURIO 22 otras técnicas de extracción como la extracción líquido-líquido, aunque es una técnica bastante lenta. La adición de ditiocarbamato pirrolidín amónico49,50 (APDC) puede mejorar la recuperación en agua de mar, disminuir el tiempo de extracción (hasta 8,5 min) y eliminar totalmente la co-destilación de mercurio inorgánico. I.2.2.1.3. Extracción Líquido-Gas (Purga y atrapado) La extracción líquido-gas consiste en burbujear la disolución acuosa con un gas inerte (nitrógeno o helio) para extraer las especies volátiles no polares en la fase gas, las especies necesitan ser convertidas previamente en hidruros52,53,54,55 o derivados alquilados/arilados56,57,58,59,60,61,62 volátiles (derivatización), las especies purgadas son atrapadas en una trampa criogénica52,54,56,60 o en una trampa57,63 de tenax o carbotrap y liberadas normalmente en la columna cromatográfica. Bloom56 desarrolló este método usando NaBEt4 como derivatizante y el atrapado en trampa criogénica, este método ofrece altos factores de preconcentración y permite la introducción de muestras bastante limpias en la columna cromatográfica. Pueden aparecer algunas interferencias durante la etapa de derivatización en muestras de agua de mar debido a la gran concentración de iones cloruro. I.2.2.1.4. Extracción en Fase Sólida (SPE) En este método los analitos se extraen por atrapado en una fase inmovilizada, se eluyen con un volumen mínimo de disolvente. Las ventajas sobre la extracción líquido-líquido incluyen un factor de enriquecimiento I NTRODUCCIÓN 23 más alto, menor consumo de disolvente, menor riesgo de contaminación y resulta fácilmente automatizable. Las muestras tienen que estar filtradas previamente. Se han utilizado diferentes fases: resinas con agentes quelatantes inmovilizados como ditiocarbamato64,65,66,67,68,69,70,71, ditiocarbazona71,72, ditizona73, 2-mercaptoetanol74, con grupos dadores de nitrógeno y azufre75 (1,2-bis (o-aminofeniltio)etano) y columnas de algodón76,77,78,79 con grupos funcionales –SH (SCF). Las fases más utilizadas son las de ditiocarbamato y las de algodón con grupos sulfhidrilo. La separación de los compuestos de mercurio de los otros componentes de la muestra se lleva a cabo basándose en la gran afinidad del mercurio por los grupos dadores de azufre. En las resinas con grupos ditiocarbamato la elución de los compuestos de mercurio se consigue con una disolución de tiourea acidificada64,65,66,67,68,69,70, y en las de algodón con grupos sulfhidrilo con ácido clorhídrico76,77, mejorando la elución mediante la adición de sales de cobre y bromuro de potasio al eluyente78,79. Las resinas modificadas con grupos dadores de nitrógeno y azufre75 permite la elución selectiva, primero se realiza la elución del metilmercurio con etanol y después la elución del mercurio inorgánico con tiourea acidificada. Fernández y col.71 utilizan columnas C18 con diferentes modificadores: dietil ditio carbamato, pirrolidin–1–etil ditio formato, difenil EL MERCURIO 30 Tabla I.2.4. Resumen de métodos de determinación de especies de mercurio en muestras acuosas. Año Preparación de la muestra Separación/ Detección Obs. Ref. 2003 SPE: 1,2-bis (o-aminofeniltio)etano elución con etanol (MeHg) y tiourea con HCl (Hg) CVAAS LOD: 90 ng.L-1 (50 mL) 75 2003 LLE: Extracción en DCM; Derivatización con NaBEt4; Extracción en agua por evaporación HS-GC-AFS LOD: 0,01 ng.L-1 (200 mL) 44 2003 Derivatización con NaBH4; Purga y atrapado en Au paredes en la cámara de grafito GF-ETV-MIPOAS Determinacion simultanea de As, Bi, Ge, Sb, Se, Hg 55 2004 SPE: SCF elución con mezcla ácida de KBr, CuSO4; Extracción DCM GC-pirolisisAFS LOD: 0,01 ng.L-1 79 2004 Derivatización con NaBPr4; SPME: PDMS 5min 25ºC GC-ICP-MS LOD: 0,17 ng.L-1 MeHg y 0,35 ng.L-1 Hg (3 mL) 86 2004 Derivatización con NaBEt4; SPME: HS DVB/CAR/PDMS 30 min 20ºC GC-MS LOD : 3,1 ng.L-1 MeHg; 2,3 ng.L-1 Hg (5 mL) Determinacion multielemental Hg, Sn, Hg. 89 I.2.2.2. PREPARACIÓN DE MUESTRAS SÓLIDAS Las muestras sólidas de interés para el análisis de especiación puede dividirse en dos categorías: muestras de sedimentos y suelos y materiales biológicos. Los sedimentos son capas de partículas minerales y orgánicas que se encuentran en el fondo de los reservorios de aguas naturales. Normalmente, en los sedimentos el metilmercurio sólo representa entre el 0,1-2 % del mercurio total. Los compuestos organometálicos aparentemente no están incluidos en procesos mineralógicos en I NTRODUCCIÓN 31 sedimentos y suelos, por lo tanto, la disolución completa de la muestra antes del análisis no se considera necesaria. Por el contrario, en los materiales biológicos el metilmercurio representa entre el 80-90 % del mercurio total. Los compuestos organometálicos podrían ser incorporados en los tejidos de los organismos vivos, por lo tanto sería necesaria la disolución completa de la muestra. En las muestras sólidas se pueden considerar diferentes métodos para el almacenamiento38: húmedo a temperatura ambiente, húmedo a bajas temperaturas, congelado, liofilizado, secado en el horno, secado en horno microondas y secado al aire a temperatura ambiente. La principal fuente de inestabilidad para el metilmercurio es debida a las bacterias por demetilación o formación de dimetilmercurio. En la figura I.2.3 se recogen las técnicas de tratamiento de muestra, separación y detección en muestras sólidas, las más usadas para la extracción de compuestos de mercurio son la lixiviación ácida, la hidrólisis alcalina, la destilación, la extracción asistida por ultrasonidos, la extracción asistida por microondas (MAE) y la extracción con fluidos supercríticos (SFE). La lixiviación ácida, hidrólisis alcalina y la destilación son métodos analíticos no sólo laboriosos y lentos sino que también presentan insuficiente eficiencia. La lixiviación con HCl a temperatura ambiente no libera cuantitativamente los compuestos de metilmercurio de sedimentos, y la digestión alcalina con 25% KOH en metanol y la destilación libera cuantitativamente metilmercurio de sedimentos pero lleva entre 1 y 6 EL MERCURIO 32 horas95,96. Por lo tanto, se ha pasado al uso de técnicas de extracción más rápidas, con menos consumo de disolventes y con mayor eficacia como son la extracción asistida por ultrasonidos, la extracción asistida por microondas y la extracción con fluidos supercríticos. EXTRACCIÓN DERIVATIZACIÓN PRECONCENTRACIÓN SEPARACIÓN DETECCIÓN MUESTRA DE SEDIMENTO O MATERIAL BIOLÓGICO LIXIVIACIÓN ÁCIDA SPME SFE DESTILACIÓN MAE DERIVATIZACIÓN COMPLEJACIÓN PURGA Y ATRAPADO LIQUIDOLIQUIDO CROMATOGRAFIA DE GASES CROMATOGRAFIA LIQUIDA ELECTROFORESIS CAPILAR MIP-AES ECD MS CVAFS CVAAS ICP-MS UV HIDRÓLISIS ALCALINA ULTRASONIDOS Figura I.2.3. Técnicas de preparación de muestra para el análisis de especiación de mercurio en muestras sólidas. I.2.2.2.1. Lixiviación Ácida La lixiviación ácida consiste en el tratamiento de la muestra con un ácido seguido normalmente de la extracción en un disolvente orgánico. Principalmente este método se ha utilizado en la extracción de metilmercurio en peces y crustáceos, basándose en protocolos derivados de la técnica clásica de Westöö97,98 que consiste en la extracción selectiva en benceno conteniendo HCl, seguido de la formación de un complejo de I NTRODUCCIÓN 33 cisteína, éste se extrae en agua y el metilmercurio se libera de nuevo por acidificación y es reextraído en benceno. Algunas modificaciones de este método en la extracción de metilmercurio sustituyen el benceno por tolueno99,100,101 o por tolueno con un agente complejante como dietilditiocarbamato (DDTC)102,103,104, o la disolución de cisteína por una disolución de tiosulfato sódico101,105 o por un papel impregnado de cisteína100. Para evitar problemas por interferencias del mercurio inorgánico éste se elimina por lavado de la muestra con acetona previamente a la extracción106,107,108,109,110. Este método también se ha aplicado a la extracción de metilmercurio de sedimentos106 y se ha conseguido una mayor eficacia realizando la lixiviación ácida en presencia de bromuro potásico e iones cobre (II)111,112. Decadt y col.113 desarrollaron la extracción de los compuestos de mercurio mediante el tratamiento de la muestra con ácido iodoacético y tiosulfato, este método fue posteriormente modificado por Lansens y Baeyens114 adicionando H2SO4. Este método permite la extracción y la formación de un compuesto volátil en un solo paso. I.2.2.2.2. Hidrólisis Alcalina La hidrólisis alcalina consiste en el tratamiento de la muestra con una base seguido del ajuste de pH, se usa normalmente en muestras biológicas. La hidrólisis básica se realiza con reactivos como hidróxido de tetrametilamonio (TMAH)115 o KOH metanólico116o NaOH117, en muchos casos seguida de la extracción en un disolvente orgánico118,119. EL MERCURIO 34 El método desarrollado por Bloom116 basado en la digestión alcalina con hidróxido potásico metanólico durante 2 o 3 horas a 75ºC ha sido muy usado como base para el desarrollo de numerosos métodos92,118,119,120. Y también se ha aplicado a muestras de sedimentos118. Filippelli121 compara los resultados obtenidos mediante la lixiviación ácida en tolueno y la hidrólisis alcalina con KOH metanólico, obteniendo resultados similares, pero en el caso de la lixiviación ácida es necesario un paso de limpieza que consiste en la extracción de los analitos de interés en una disolución de tiosulfato sódico. Harms117 compara la lixiviación ácida en tolueno con la hidrólisis alcalina con NaOH en presencia de cisteína, obteniendo mejores resultados con NaOH. I.2.2.2.3. Destilación En este método la muestra de sedimento, suelo o material biológico se suspende en una disolución ácida, y la mezcla se destila a temperaturas elevadas (140-180ºC) con nitrógeno95 o a temperatura más baja (40ºC) a elevada presión122. La destilación se realiza normalmente con ácido sulfúrico95,123,124,125,126,127, cloruro potásico o sódico y sales de cobre, los iones cloruro forman los compuestos de mercurio clorados volátiles y las sales de cobre mejoran la eficacia de liberación de los compuestos organomercúricos de su unión a los grupos sulfhidrilo. I NTRODUCCIÓN 35 I.2.2.2.4. Extracción Asistida por Ultrasonidos (USE) La extracción con ultrasonidos es una técnica sencilla y barata, bastante adecuada para el tratamiento de tejidos biológicos y sedimentos. Se usa el baño de ultrasonidos para minimizar las desventajas de los procedimientos convencionales de extracción en términos de tiempo, eficacia de extracción y gasto de disolvente, tanto de lixiviación ácida con HCl128,129,130 o ácido acético84 o de digestión alcalina con KOH metanólico81,131,132 o TMAH133,134. Fisher y col.132 utilizan un baño de ultrasonidos para minimizar el tiempo de extracción del método propuesto por Bloom116 que extrae el metilmercurio de tejidos biológicos mediante el tratamiento con KOH metanólico. Este método se ha utilizado tanto en material biológico81,135,136 como en sedimentos131. Caricchia y col.131 comparan la extracción de especies de mercurio de sedimentos en baño de ultrasonidos con diferentes ácidos y bases como KOH metanólico, NaOH/NaCl, HCl y H2SO4/CuSO4/KBr, obteniendo los mejores resultados con hidróxido potásico. Cabañero y col.129 eligen la extracción con HCl en baño de ultrasonidos para la extracción de material biológico tras su comparación con otros extractantes como TMAH, KOH metanólico y dodecilsulfato sódico (SDS). I.2.2.2.5. Extracción Asistida por Microondas (MAE) La extracción asistida por microondas se ha usado para la extracción de especies de mercurio de material biológico, suelos y sedimentos, EL MERCURIO 36 acelerando la extracción tanto con ácidos, bases o con disolventes orgánicos. Los parámetros esenciales a optimizar son el medio de extracción, la energía aplicada y el tiempo de exposición. MAE es considerablemente más rápida que otras técnicas de extracción y preparación de muestra, un tratamiento de muestra puede realizarse sólo en 2 o 3 minutos137,138. MAE se ha utilizado principalmente en sedimentos con ácido nítrico44,53,137,139,140, obteniendo la extracción en 3 min con una potencia de 60W y en material biológico con hidróxido de tetrametilamonio (TMAH)53,138,141,142,143,144,145,146,147,148 en 2-3 min a 40-60W. Vázquez y col. desarrollaron la extracción con tolueno en presencia de ácido clorhídrico durante 10 min a 100-120ºC tanto en sedimentos149 como en material biológico150. Tseng y col. han estudiado diferentes medios de extracción en diferentes matrices. En sedimentos137 han probado ácido acético, ácido clorhídrico, ácido nítrico y ácido sulfúrico, obteniendo bajas recuperaciones con HAc y H2SO4. Y en material biológico138 los reactivos evaluados han sido ácido acético, ácido clorhídrico, ácido nítrico, TMAH y KOH. HAc produce bajas recuperaciones y HCl y HNO3 producen la descomposición del metilmercurio, obteniendo los mejores resultados con medios básicos. Rio Segade y Tyson151 comparan la eficacia de extracción e interferencias de matriz en la determinación de mercurio en muestras biológicas y sedimentos mediante extracción convencional (3 horas) y asistida por microondas (60 W, 3 min) en medio alcalino (25% hidróxido de I NTRODUCCIÓN 37 tetrametilamonioTMAH) o ácido (HCl 6 mol.L-1). HCl proporciona buenos resultados tanto en sedimentos como en material biológico, mientras TMAH sólo proporciona buenos resultados para muestras de material biológico. La extracción asistida por microondas produce una recuperación igual o mejor que con métodos convencionales, menores interferencias de matriz y el tiempo se reduce de 3 horas a 3 minutos. I.2.2.2.6. Extracción con Fluidos Supercríticos (SFE) El uso de fluidos supercríticos es un procedimiento adecuado para la preparación de muestra debido a la reducción del consumo de disolventes orgánicos. El CO2 es el fluido supercrítico más adecuado y usado en las extracciones, ya que no es tóxico ni inflamable y presenta un gran poder disolvente. Se ha utilizado para la extracción de especies de mercurio de muestras de sedimentos152 y de material biológico153,154. Sun y col.155 estudiaron la posibilidad de la extracción/bencilación con NaBPh4 en un solo paso con patrones depositados sobre papel de filtro. Wai y col.156 estudiaron la aplicabilidad de SFE a la extracción de especies de mercurio de muestras sólidas utilizando metanol como modificador y bis(trifluoroetil)ditiocarbamato de litio (LiFDDC) como agente quelatante. Este método se ha aplicado recientemente a muestras reales de sedimentos y suelos157. Dada la extensa bibliografía sobre la especiación de mercurio en sedimentos se han recogido en la tabla I.2.5. EL MERCURIO 38 Tabla I.2.5. Resumen de métodos de determinación de especies de mercurio en muestras de sedimentos. Año Preparación de muestra Separación/ Detección Obs. Ref. 1993 Destilación KCl/H2SO4; Derivatización con NaBEt4; Purga y atrapado en Trampa Carbotrap GC-CVAFS LOD: 0,001 ng.g-1 95 1994 Extracción de la muestra acidificada con KBr y Cu2+ en DCM; Extracción en tiosulfato y Reextracción en DCM GCpirolisis-AFS 111 1994 Extracción de la muestra acidificada con benceno; Extracción con cisteína y Reextracción con benceno GC-MIP-AES 106 1994 Extracción de la muestra acidificada con tolueno; Extracción con cisterna y Reextracción con tolueno GC-ECD LOD: 5 ng.mL-1 158 1995 Destilación ácida con nitrógeno; Derivatización con NaBEt4; Purga y atrapado en tenax GC-ICP-MS LOD: 0,02 ng.g-1 123 1995 Extracción con NaOH metanólica; Derivatización con NaBEt4/ Extracción en n-pentano GC-MIP-PED 159 1996 SFE: trampa ODS, elución con tolueno; Derivatización con Reactivo de Grignard GC-MIP-AES LOD: 0,1 ng.g-1 (1 g) 152 1996 Extracción con KOH metanólico 75ºC 3 h; Extracción con DCM y Reextracción en agua; Derivatización con NaBEt4; Purga y Atrapado GC-CVAFS LOD: 0,02 ng.g-1 (0,5 g) 118 1997 MAE: HCl 6M + Tolueno; 120ºC 10 min GC-ECD LOD: 8 ng.g-1 (1,5 g) 149 1997 Extracción con KOH/metanol en ultrasonidos 45 min; Extracción en tolueno con H2SO4, CuSO4, KBr; Extracción en cisteína y Reextracción en benceno con CuSO4 y KBr GC-ECD LOD: 0,5 ng.g-1 (2 g) 131 1997 Destilación ácida (H2SO4 y NaCl) con nitrógeno a elevada temperatura 140ºC 45 min; Complejación con SPDC HPLC-UVPCO - CVAAS LOD: 0,04 ng.g-1 (1 g) 124 I NTRODUCCIÓN 39 Tabla I.2.5. Resumen de métodos de determinación de especies de mercurio en muestras de sedimentos. Año Preparación de muestra Separación/ Detección Obs. Ref. 1997 Destilación ácida (H2SO4 y KCl) con nitrógeno a elevada temperatura 180ºC 45 min; Complejación con SPDC HPLCHPF/HHPNICP-MS LOD: 0,025 ng.g-1(0,5 g) 160 1997 Destilación ácida (H2SO4 y KCl) con nitrógeno a elevada temperatura 180ºC 45 min; Complejación con SPDC HPLC-UVPCO-CVAFS LOD: 0,015 ng.g-1 (0,5 g) 161 1997 MAE: HNO3 2M 60W 3 min; Derivatización con NaBEt4; Purga y atrapado criogénico GC-QFAAS LOD: 0,5 ng.g-1 (1 g) 137 1997 Destilación ácida (H2SO4, NaCl y CuCl2) a vacio a 40ºC; Extracción en tolueno y Reextraccción en tiosulfato CVAFS LOD: 0,2 ng.g-1 122 1998 Destilación ácida (H2SO4 y NaCl) 150ºC 30 min; Complejación con SPDC HPLC-ICPMS LOD: 0,015 ng.g-1 162 1998 Sonicación con tiourea durante 50 minutos; Derivatización con NaBPh4; Extracción en tolueno GC-MS 163 1998 MAE: HNO3 60 W 3 min; Derivatización con NaBEt4; Purga y atrapado criogénico GC-GFAAS LOD: 0,5 ng.g-1 53 1998 Destilación ácida (H2SO4 y KCl) 140ºC 90min; Derivatización con NaBEt4; Purga y atrapado en Tenax GC-ICP-MS 125 1998 MAE: HNO3 60 W 3 min; Derivatización con NaBEt4; Extracción en hexano GC multicapMIP-AES Determinación simultanea de Pb, Hg, Sn 139 1999 Extracción ácida (ácido acético) en MeOH ultrasonidos 0,5-1h; Derivatización con NaBEt4; SPME: PDMS, 10 min GC-ICP-MS LOD: 0,18 ng.g-1 (0,5 g) Determinación simultanea de Sn, Hg y Pb 84 EL MERCURIO 46 Tabla I.2.6. Resumen de métodos de determinación de especies de mercurio en muestras de material biológico. Año Preparación de muestra Separación/ Detección Obs. Ref. 2003 Tratamiento con KOH/MeOH en ultrasonidos 4h; Derivatización con NaBEt4; HS SPME: PDMS 10 min + 2min 22ºC GC-FAPES LOD: 1,5 ng.g-1 (MeHg) 0,7 ng.g-1 (Hg(II) (0,25g) 135 2003 Tratamiento con KOH/MeOH en ultrasonidos; Microcolumna con un complejo de Cu y dietilditiocarbamato absorbido, elución con etanol ETAAS LOD: 3,4 ng.g-1 (0,1g) 136 2003 Tratamiento con KOH/MeOH; Derivatización con NaBPr4; HS SPMEPDMS 10 min GC-ICP-MS LOD: 2,1 ng.g-1 120 2003 Tratamiento con KOH/MeOH; Derivatización con NaBPr4; HS SPMEPDMS 10 min GC-MS LOD: 37 ng.g-1 181 2003 Tratamiento con KOH/MeOH; Derivatización con NaBPr4; SPME PDMS 10 min GC-FAPES LOD: 0,23-0,55 ng.g1 (0,25 g) 182 2003 MAE: TMAH 40W 2 min; Derivatización con NaBEt4; Extracción en isooctano GC-ICP-MS LOD: 0,11 ng.g -1 MeHg, 0,24 ng.g-1 Hg (0,25 g) Determinación simultanea de Hg y Sn 146 2004 MAE: TMAH adición de Cu 45W 2,5 min; Derivatización con NaBPr4; Extracción en n-heptano GC-MS LOD: 40 ng.g-1 (0,5 g) 147 2004 MAE: TMAH 2 min 40W; Derivatización con NaBEt4; HS SPME: 25ºC 12 min GC multicapICP-TOFMS LOD 1,3 pg.g-1 MeHg; 2 pg.g-1 Hg(II) (0,3 g) Especiacion multielemental PDMS/DVB, para Hg CAR/PDMS 75um 148 2004 Tratamiento con HCl en ultrasonidos 10 min; columna con APDC y Cu, elución con metanol HPLC-UV LOD: 10-25 ng.g-1 (0,5 g) 130 I NTRODUCCIÓN 47 I.2.2.2.7. Preconcentración y Limpieza Para la introducción del extracto en la técnica de separación, es necesario que éste tenga unas características determinadas que dependen de la técnica. Las técnicas de cromatografía de gases requerirán un disolvente no polar libre de partículas en suspensión que contenga especies volátiles térmicamente estables. Por lo tanto, en algunos casos tras el proceso de pre-tratamiento es necesario un paso de extracción de los analitos a un disolvente orgánico100,117, normalmente se utiliza benceno o tolueno. En algunos procedimientos de preparación de muestra se lleva a cabo una reacción de derivatización101,102,103,118,126,140 a especies con mejores características cromatográficas, reacción que también puede realizarse simultáneamente con la extracción119,139,141,145,147,159,163,178. La introducción de la muestra se puede realizar por inyección directa, por purga y atrapado de los analitos, cromatografía de gases con espacio de cabeza o mediante SPME. El método mas usado de preconcentración es el de purga y atrapado. Esto puede realizar mediante trampas criogénicas53,116,132,144 (que se encuentran a temperaturas muy bajas normalmente con nitrógeno líquido) o trampas de tenax115,123,127 o carbotrap95,176. La elución de estos compuestos se realiza térmicamente con un aumento de la temperatura. La cromatografía en espacio de cabeza44,113,114 difiere de la purga y atrapado en que los compuestos se transfieren directamente a la columna cromatográfica en vez de ser atrapados primero en una trampa. En ambos EL MERCURIO 48 casos, los analitos son previamente derivatizados a compuestos más volátiles. La microextracción en fase sólida (SPME)81,84,88,120,135,179,182, como ya se ha indicado, combina la extracción, pre-concentración e introducción de la muestra, normalmente, en el sistema cromatográfico. Se ha utilizado como técnica de limpieza y pre-concentración tras el tratamiento de la muestra con ácidos o bases y derivatización de los analitos. Para técnicas basadas en cromatografía líquida o electroforesis capilar se requerirán soluciones acuosas de especies estables termodinámicamente, inertes cinéticamente y libres de partículas en suspensión. En algunos casos para mejorar las propiedades cromatográficas y de detección UV, es necesario formar complejos, normalmente se utiliza cisteína110,173, carbamatos124,162 y ditizona177. I.2.2.3. DERIVATIZACIÓN La derivatización se utiliza para obtener especies con mejores características para la separación o para la detección. La mayoría de las especies organometálicas existen en forma iónica con relativamente altos puntos de ebullición y una baja estabilidad térmica. Para mejorar su separación por GC, estas especies deben convertirse en especies no polares, volátiles y térmicamente estables. Los métodos de derivatización más comunes incluyen: conversión de iones inorgánicos y organometálicos en compuestos covalentes volátiles (hidruros, alquilados) en medio acuoso y conversión de cationes alquilmetálicos con reactivos de Grignard para saturar los grupos no polares. I NTRODUCCIÓN 49 Tabla I.2.7. Principales agentes derivatizantes. Tipo Agente Ejemplo Haluro Ácido Iodoacético Hidruro NaBH4 Reactivo de Grignard RMgX (BuMgCl) Volatilización Agente Alquilante NaBEt4, NaBPh4, NaBPr4 Carbamato N S S Pirrolidín ditiocarbamato Cisteína NH3 O SH OH Complejación Ditizona SO3N N SO3N HN SH Sulfato de ditizona Los compuestos de mercurio no absorben a longitudes de onda de UV-VIS, por lo tanto para el uso de esta técnica de detección, acoplada a EC o LC, es necesaria la formación de complejos quelatos que absorban a estas longitudes de onda. Principalmente se utilizan como agentes quelatantes el ditiocarbamato, ditizona y cisteína. I.2.2.3.1. Formación de haluros más volátiles Algunos investigadores han usado métodos de volatilización de metilmercurio para evitar extracciones. Por ejemplo, Lansens y Baeyens114 y Decadt113 separan MeHg+ de material biológico por tratamiento con ácido sulfúrico en un vial cerrado y conversión del MeHg+ en MeHgI por adición de ácido iodoacético. EL MERCURIO 50 I.2.2.3.2. Generación de hidruros La generación de hidruros se ha empleado para la determinación de un amplio rango de especies elementales. El metilmercurio y mercurio (II) pueden transformarse en hidruros volátiles52,53,54,55,141,171,183 por tratamiento con NaBH4 en fase acuosa: 233 0 24 272262 HBOHNaHgOHNaBHHg +++→++ ++ 23324 33 HBOHNaMeHgHOHNaBHMeHg +++→++ ++ Esta técnica puede presentar interferencias debidas a metales de transición que pueden afectar al rendimiento de la reacción y a la precisión analítica. La presencia de altas concentraciones de sales (NaCl) favorece la reducción de MeHg+ a Hg0, pero este problema se puede solucionar empleando AEDT183,184. I.2.2.3.3. Reactivos de Grignard En este método, las especies organometálicas son peralquiladas en especies volátiles apolares66,67,69,102,103,112: ++ ++→+ 2 22 22MgMgClHgBuBuMgClHg () 2 ,: MgClEtMeRRBuHgBuMgClRHgCl +→+ La principal ventaja es su versatilidad, se hace uso de más de 30 reactivos de Grignard disponibles comercialmente. La principal desventaja es la sensibilidad del reactivo hacia el agua, y también al aire, por lo tanto, los analitos deben extraerse primero en un disolvente no polar, aprótico y seco. Además, los reactivos de Grignard tienen una pureza insuficiente para la especiación de metales a niveles traza. I NTRODUCCIÓN 51 Hay un riesgo de transalquilación de especies orgánicas de mercurio cambiando las concentraciones de las especies de mercurio y también las reacciones con haluros pueden producir recuperaciones no cuantitativas41. La derivatización con reactivos de Grignard es aplicable a extractos que contienen complejos de los compuestos organometálicos con ditizona o ditiocarbamatos66,102. Los reactivos de Grignard que no han reaccionado tienen que ser destruidos antes de la inyección del extracto derivatizado en la columna, esto se alcanza por agitación con ácido sulfúrico diluido. I.2.2.3.4. Tetra alquil-/arilBoratos Los compuestos de tetra alquil-/arilborato se han utilizado como reactivos de derivatización en numerosas publicaciones relacionadas con el análisis de especiación de compuestos organometálicos ya que la reacción se realiza en disolución acuosa y es una alternativa a la generación de hidruros que es muy vulnerable a las interferencias en muestras reales. Además se puede realizar la derivatización y la extracción en un disolvente orgánico en un solo paso. Los principales tetra alquil-/arilboratos usados como derivatizantes son: tetraetilborato sódico (NaBEt4), tetrafenilborato sódico (NaBPh4) y tetrapropilborato sódico (NaBPr4). La alquilación de compuestos organometálicos con tetraalquilboratos es fuertemente dependiente del pH. La derivatización con NaBPr4 puede utilizarse a pH de 4,5 a 6, con NaBPh4 debe utilizarse un intervalo de pH de 2 a 6, mientras que con NaBEt4 debe trabajarse alrededor de 5. EL MERCURIO 52 El NaBEt440,44,48,49,51,53,57,61,81,116,128,132,135,139,140,144,146,159,176 es el más usado. Su disolución es bastante estable pero debe prepararse inmediatamente antes de su uso. Fue introducido por Rapsomanikis y Craig101 en la derivatización de compuestos organomercúricos. Una limitación importante en los estudios de especiación es la imposibilidad de diferenciación las especies de etilmercurio del mercurio inorgánico y además, la etilación del metilmercurio sufre interferencias por la presencia de iones cloruro184. El NaBEt4 permite la derivatización multielemental y multiespecie de Sn, Hg y Pb58,63,82,83,84,89,148: ""222 324 2BEtNaHgEtNaBEtHg ++→+ ++ "" 34 BEtNaMeHgEtNaBEtMeHg ++→+ ++ La fenilación con NaBPh4 fué propuesta por Lückow y Russel185. El NaBPh4 sólo reacciona con el mercurio inorgánico y los alquilmercuriales lo que elimina posibles interferencias de otros metales: ++ ++→+ NaBPhHgPhNaBPhHg 222 324 2 () ++ ++→+ NaBPhEtMeRRPhHgNaBPhRHg 34 ,: De Smaele y col.42 propusieron el uso de NaBPr4 para la determinación de especies de mercurio60,86,120,147,182. El NaBPr4 permite la derivatización multielemental y multiespecie42. Tanto el NaBPh4 como el NaBPr4 están disponibles comercialmente y combinan dos ventajas, su fácil manipulación para la derivatizaciónextracción in situ, y la posibilidad de distinguir entre el etilmercurio y el mercurio inorgánico. Además, son más baratos y sus disoluciones son más estables que el NaBEt4. I NTRODUCCIÓN 53 La derivatización con NaBPh4 se ve afectada por el uso en la digestión de TMAH, ya que el ion tetrametilamonio forma con el tetrafenilborato sódico un precipitado blanco de baja solubilidad179. I.2.2.3.5. Formación de quelatos La formación de quelatos permite la detección de las especies de mercurio mediante detección UV y mejora la separación de las diferentes especies, los agentes quelatantes más usados son los carbamatos93,124,130,160,161,162, la cisteína110,173,174 y la ditizona177. I.2.2.4. SEPARACIÓN Y DETECCIÓN La metodología analítica más usada para la especiación combina la separación cromatográfica con un sistema de detección altamente específico. Los métodos más comunes para la especiación de mercurio son la cromatografía de gases (GC) y la cromatografía líquida de alta resolución (HPLC) acopladas con un detector específico de mercurio. Los métodos de detección acoplados con técnicas cromatográficas para la especiación de mercurio incluyen espectroscopia de absorción atómica (AAS), espectroscopia de fluorescencia atómica (AFS), plasma de acoplamiento inductivo-espectrometría de masas (ICP-MS), plasma de acoplamiento inductivo-espectrometría de emisión atómica (ICP-AES) y plasma inducido por microondas-espectroscopia de emisión atómica (MIP-AES). Estos métodos de detección son adecuados para la especiación de mercurio debido a sus excelentes límites de detección y selectividad. EL MERCURIO 54 I.2.2.4.1. Cromatografía de Gases (GC) La cromatografía de gases requiere que las especies de analito se presenten como compuestos no polares, térmicamente estables en disolventes no polares. La preparación de la muestra debe incluir un paso de transferencia de los analitos de la disolución acuosa en un disolvente orgánico o un paso de pre-concentración sobre un absorbente cromatográfico por purga y atrapado o microextracción en fase sólida. Se pueden presentar durante la separación cromatográfica algunos problemas. La separación cromatográfica de compuestos con enlace haluro-mercurio llevan a picos cromatográficos con largas colas, debido a su elevada polaridad y a que puede interaccionar con la fase estacionaria de la columna. Para evitar este problema se han usado varias alternativas, en primer lugar la pasivación100,106,108,109 de la columna que consiste en el acondicionamiento de dicha columna usando una disolución de cloruro de mercurio en un disolvente orgánico (benceno o tolueno). Pero este procedimiento debe repetirse frecuentemente ya que la eficiencia de la columna se deteriora con el tiempo. Una alternativa para alcanzar el óptimo de eficiencia es la formación de derivados alquilados42,101,185 (derivatización) no polares que tienen características cromatográficas mejores. El paso de derivatización para obtener especies térmicamente estables puede seguir al paso de extracción en el disolvente (derivatización de Grignard) o precederlo (derivatización con NaBH4 o NaBEt4). I NTRODUCCIÓN 55 Para mejorar los límites de detección, se han mejorado aspectos en la separación cromatográfica con la introducción de la columna multicapilar. Se obtiene una excelente resolución a pesar de los tiempos de retención realmente cortos y la separación total puede conseguirse en menos de un minuto143. El aumento en la velocidad se debe al diseño especial de la columna multicapilar (figura I.2.4) que ensambla un haz de 9002000 columnas microcapilares con diámetros internos de 20 a 40 µm. Este diseño permite aplicar flujos mucho mas grandes que en las columnas normales. Este mecanismo se ha usado con MIP-AES62,139,142,143 o ICP-MS148. Los detectores que se han usado acoplados con cromatografía de gases son: detector de captura electrónica (ECD)76,97,100,102,107,108,117,131,149,154,168,172, espectroscopia de fluorescencia atómica (AFS)40,44,48,50,52,54,56,78,79,111,129,176, espectroscopia de absorción atómica (AAS)53,87,101,138, espectroscopia infrarroja con transformada de Fourier (FTIR)171, espectroscopia de emisión atómica (AES)41,45,47,65,66,69,77,85,103,106,112,113,115,119,159,166,178, espectrometría de masas (MS)43,81,147,163,181 y plasma acoplado por inducción-espectrometría de masas (ICP-MS)42,51,60,82,84,86,125,140,146. 3 mm Figura I.2.4. Corte de una columna multicapilar. EL MERCURIO 62 inorgánico, esto puede producir una sobreestimación del 30-80% de la concentración del metilmercurio en el sedimento192. La Comisión Europea ha financiado un estudio para poder evaluar los problemas que presentan los valores de metilmercurio en materiales de referencia, las conclusiones se resumieron en un número de la revista de ámbito internacional Chemosphere195 publicado en 1999. Se evaluaron sistemáticamente las causas y factores relacionados con la formación de metilmercurio durante el análisis196. Se estudiaron diferentes técnicas para la extracción de metilmercurio de diferentes matrices para evaluar la potencial generación del metilmercurio a partir del mercurio inorgánico. Los resultados mostraron la posibilidad de transformaciones durante el paso de pre-tratamiento de muestra y, más específicamente, usando métodos basados en la destilación. Estas observaciones se basaban en la metilación de mercurio inorgánico adicionado, sin tener en cuenta posibles transformaciones del metilmercurio adicionado. Hintelmann y col.192 investigaron la metilación abiótica de mercurio inorgánico añadido cuando la matriz se sometía a varios procedimientos de preparación de muestra como destilación, lixiviación ácida o extracción alcalina de diferentes muestras medioambientales. Dependiendo del procedimiento de pre-tratamiento usado y de la matriz de la muestra la metilación abiótica del mercurio varía desde 0,005% de la lixiviación ácida de sedimentos con ácido clorhídrico al 4,3% de la extracción alcalina de muestras de pescado con TMAH. Lambertsson y col.127 determina una metilación abiótica de mercurio inorgánico en sedimentos de 0,05%, usando extracción I NTRODUCCIÓN 63 ácida/enriquecimiento con KBr/H2SO4/CuSO4 en diclorometano y etilación seguida de GC-ICP-MS. Bloom y col.49 encuentra con el mismo pretratamiento de muestra una metilación abiótica 25 veces más baja en un sedimento material de referencia, 0,002%. Qvarnström y Frech134 estudia las transformaciones de las especies durante diferentes pasos de pre-tratamiento de muestra usando patrones enriquecidos de Me198Hg+ y 201Hg2+ y HPLC en combinación con SSID (adición de isótopos específicos de species)-ICP-MS. Determinando un metilación del 11,5% del mercurio inorgánico y una demetilación del 6,26% del metilmercurio. Rodríguez Martín-Doimeadios y col.197 estudian la formación de metilmercurio en materiales de referencia de sedimentos (CRM 580, IAEA 356 y IAEA 405) usando SSID combinada GC-ICP-MS usando extracción ácida asistida por microondas. Se obtienen recuperaciones de metilmercurio entre 148 y 413%, que corresponde a porcentajes de metilación entre 0,07 y 0,34%. Sugieren la posible relación entre la formación de metilmercurio y los niveles de carbono y azufre en el sedimento. Recientemente, Rahman y Kingston198 evalúan diferentes métodos de extracción selectiva para la especiación de mercurio en sedimentos utilizando HPLC acoplado a ICP-MS y los resultados se comparan con los obtenidos con el método 3200 de la EPA. Los métodos evaluados están basados en la sonicación, extracción asistida por microondas y extracción ácida fría. Como ninguno de estos métodos puede corregir ninguna interconversión o transformación de mercurio inorgánico a metilmercurio o EL MERCURIO 64 viceversa, se usa como herramienta de diagnostico el metodo 6800 de la EPA (SIDMS, espectrometría de masas con dilución isotópica elemental y de especies). Como resultado concluyen que, el método 3200 de la EPA, sonicación con ácido nítrico y extracción asistida por microondas con ácido nítrico presentan menos eficiencia de extracción para mercurio inorgánico pero bastante alta para metilmercurio, y no introducen interconversión de mercurio inorgánico a metilmercurio o viceversa. Por otro lado, la sonicación con ácido clorhídrico y la extracción ácida fría demuestran gran eficiencia en la extracción de mercurio inorgánico pero induce a la conversión de metilmercurio en mercurio inorgánico. El problema de formación de artefactos se intenta solucionar por eliminación o reducción del mercurio inorgánico de la muestra lo que es un importante factor de la formación de artefactos, o por el uso del método de dilución isotópica específica de especies (SSID). La reducción del mercurio inorgánico en la muestra (lavado con acetona) elimina la posibilidad de la especiación del mercurio, permitiendo sólo determinar el mercurio orgánico. La aplicación de la dilución isotópica específica de especies199 (SSID) en combinación con técnicas que permitan la determinación de isótopos (ICP-MS o MS) permite detectar, cuantificar y corregir este proceso preservando la integridad de todas las especies de interés durante el proceso analítico. Con SSID, se añaden y equilibran con la muestra antes del análisis las especies marcadas del analito de interés, preparadas desde isótopos estables enriquecidos, y las transformaciones de las especies se I NTRODUCCIÓN 65 reflejarán por la desviación de las relaciones de los isótopos de las especies de su valor natural134. 1. Alloway, B.J., “Heavy metals in soils”, Blackie & son, Londres (1990). pg. 222236. 2. Kabata-Pendias, A.; Pendias, H., “Trace elements in soils and plants”, CRC Press, Florida (1984), pg. 116-125. 3. Hutzinger, O., “The handbook of environmental chemistry; vol 1: The natural environment and the biogeochemical cycles”, Springer-Verlag, Berlin (1980), pg. 177-185. 4. Downs, S.G.; Macleod, C.L.; Lester, J.N., Water, Air and Soil Pollution 108 (1998) 149-187. 5. Quevauviller Ph.; Maier, E.A.; Griepink, B., “Quality Assurance for Environmental Analysis”, Elsevier, Amsterdam (1995), pg. 305-317. 6. 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INTERÉS MEDIOAMBIENTAL La exposición a contaminantes orgánicos es una preocupación de la población general, especialmente el grupo contaminantes orgánicos persistentes (POPs), que está constituido por un grupo heterogéneo de compuestos químicos cuyas características de persistencia en el medio ambiente, acumulación en organismos biológicos y toxicidad hacen de ellos contaminantes prioritarios y por ello son un riesgo medioambiental para seres humanos y ecosistemas. El grupo de contaminantes orgánicos persistentes incluye hidrocarburos aromáticos polinucleares (PAHs), bifenilos policlorados (PCBs), dibenzo-p-dioxinas policloradas (PCDDs) y plaguicidas organoclorados (OCPs). La mayoría de estos compuestos están prohibidos o bien su producción, uso y eliminación están restringidos1,2. Como resultado de estas prohibiciones o restricciones se han buscado alternativas al uso de estos contaminantes orgánicos persistentes, aumentando la producción de otros compuestos, cuya distribución en el medioambiente y toxicidad debe evaluarse antes de que puedan suponer un riesgo medioambiental. Además de la acumulación más o menos persistente de los contaminantes orgánicos en el medioambiente y del consiguiente aumento de su concentración, estos compuestos pueden dar lugar a interacciones químicas con componentes del medio, con la formación de subproductos que son a veces más tóxicos que los compuestos de partida, por lo que, deben ser también cuidadosamente estudiados1. CONTAMINANTES ORGÁNICOS 82 A continuación, el texto se va a centrar en las familias de contaminantes orgánicos objeto del presente trabajo, entre ellos POPs prohibidos o de uso muy restringido, como plaguicidas organoclorados (OCPs) y bifenilos policlorados (PCBs) y compuestos usados como alternativa de los POPs, éteres de difenilo polibromados (PBDEs), bifenilos polibromados (PBBs) y ésteres de trialquil-/arilfosfato (TAPs). I.3.1.1. IDENTIDAD Y PROPIEDADES Es importante conocer la estructura y propiedades de los compuestos, ya que su estabilidad química y biológica y su carácter hidrosoluble o liposoluble van a determinar su distribución en el medioambiente y su posible bioacumulación en los organismos, y, además, su toxicidad va a determinar su efecto sobre dichos organismos1. En general cuanto mayor es el coeficiente de partición octanol/agua (kow), mayor es la probabilidad de que un compuesto químico esté unido a la materia orgánica de suelos y sedimentos, y migre a los tejidos grasos de organismos vivos. Y, cuanto menor sea el valor de la dosis letal (LD50) más toxico es el compuesto químico ya que requiere menos cantidad para afectar al animal3. I.3.1.1.1. Plaguicidas Organoclorados (OCPs) La definición de plaguicida incluye cualquier compuesto o mezcla de compuestos que se aplique sobre un territorio agrícola para destruir, mantener alejados, prevenir o limitar la acción, en general, de plantas, animales o microorganismos que puedan afectar al desarrollo, rendimiento y conservación de los productos cultivados4,5,6,7,8,9,10,11. I NTRODUCCIÓN 83 Los plaguicidas se suelen clasificar según la acción específica que son capaces de desarrollar sobre los distintos tipos de organismos (herbicidas, insecticidas y fungicidas) o según la estructura o composición química (organofosforados, organohalogenados, compuestos bipiridínicos, derivados fenólicos, carbamatos, triazinas, etc.)1. Difenilo Clorado Hexaclorociclohexanos Cl Cl Cl Cl Cl 4,4’-DDT Cl Cl Cl Cl Cl Cl α-HCH Cl Cl Cl Cl Cl Cl γ-HCH o lindano Ciclodienos Clorados Cl Cl Cl Cl Cl Cl Aldrin Cl Cl Cl Cl Cl Cl O Dieldrin Cl Cl Cl Cl Cl Cl Cl Heptacloro Cl Cl Cl Cl Cl Cl O Endrin O O Cl Cl Cl Cl Cl Cl S O α-Endosulfan Figura I.3.1.Estructura química de los plaguicidas organoclorados estudiados. En particular, los plaguicidas organoclorados normalmente son compuestos orgánicos con sustituyentes cloro en varios lugares de su estructura con acción insecticida. Los más conocidos son el paradiclorodifeniltricloroetano (DDT), derivados del hexaclorociclohexano (HCH) CONTAMINANTES ORGÁNICOS 84 y derivados ciclodienicos. Este estudio se centra en 8 plaguicidas organoclorados cuyas estructuras se muestran en la figura I.3.1. La mayoría de estos plaguicidas organoclorados llegaron al mercado tras la segunda guerra mundial y en los años 50, pero el uso de casi todos estos compuestos a partir de los años 70 ha sido prohibido o muy restringido, debido a su persistencia, toxicidad y su tendencia a acumularse en los tejidos grasos4. Tabla I.3.1. Principales propiedades físicas de los plaguicidas estudiados. Compuestos P. Vapor a 25ºC(a) (Pa) Solubilidad en agua(a) (mg.L-1) Log Kow(a)(b) LD50 oral(c) (mg.kg-1) α-HCH 1,05.10-1 8,00 4,26 500-4670 γ-HCH 1,05.10-1 8,00 4,26 60-250 Heptacloro 5,35.10-2 0,18 6,10 40-162 Aldrin 1,61.10-2 0,017 6,50 40-70 Endosulfan 2,32.10-5 0,32 3,83 18-355 Dieldrin 7,88.10-4 0,19 5,40 40-70 Endrin 4,02.10-4 0,25 5,20 3-43 4,4’-DDT 2,14.10-5 0,0055 6,91 80-250 (a) Valores obtenidos en la base de datos Physprop12; (b) logaritmo del coeficiente de partición octanol/agua; (c) toxicidad aguda para ratas, valores obtenidos de las monografías correspondientes de WHO5,6,7,8,9,10,11. Los plaguicidas organoclorados son sólidos a temperatura ambiente, y sus principales propiedades (mostradas en la tabla I.3.1) pueden resumirse en los tres puntos siguientes: oEstabilidad frente a la descomposición o degradación en el medioambiente. oBaja presión de vapor. I NTRODUCCIÓN 85 oSolubilidad baja en agua y alta en medios hidrofóbicos como los tejidos grasos en organismos vivos, es decir, marcado carácter liposoluble. Los plaguicidas organoclorados presentan una gran estabilidad pero bajo ciertas condiciones pueden sufrir una serie de reacciones que originen metabolitos del producto aplicado originalmente. Así, el DDT en presencia de reductores o en ausencia de oxígeno sufre una reacción de eliminación perdiendo HCl y originando diclorodifenildicloroeteno (DDE). El aldrin se transforma en dieldrin bajo la acción de la luz solar y con el oxígeno atmosférico o por medio de microorganismos que son capaces de producir reacciones de epoxidación. El endrin origina varios metabolitos entre los que se encuentra el endrin cetona y endrin aldehido. El lindano puede degradarse por la radiación ultravioleta a pentaclorociclohexano y tetraclorociclohexano. El endosulfan todavía se usa como insecticida en todo el mundo, tanto para aplicaciones domésticas como agrícolas, ya que su bioconcentración y persistencia ambiental es mucho menor que las de los otros plaguicidas organoclorados1. I.3.1.1.2. Bifenilos Policlorados (PCBs) Los bifenilos policlorados son hidrocarburos clorados con un núcleo bifenilo donde entre 1 y 10 hidrógenos fueron sustituidos por cloros13,14,15. La fórmula química se representa como C12H10-x-yClx+y, donde x e y son el número de átomos de cloro en cada anillo comprendidos entre 1 y 5 (figura I.3.2). CONTAMINANTES ORGÁNICOS 86 56 1 2 3 41' 2' 3' 4' 5' 6' Cl Cl xy x,y = 1-5 Figura I.3.2. Estructura general de los bifenilos policlorados. Los PCBs se producen por cloración del bifenilo con cloro molecular en presencia de un catalizador adecuado (normalmente Fe o FeCl3), obteniéndose una mezcla de diferentes PCBs individuales. Existen 209 compuestos análogos, que se nombran siguiendo una nomenclatura de la IUPAC en la que a cada congénere se le asigna un número, desde el 1 al 209 según el grado de cloración, como puede verse en la tabla I.3.2. Tabla I.3.2. Isómeros de los PCBs y su nomenclatura según la IUPAC15 Serie Nº isómeros Nº IUPAC Bifenilos monoclororados 3 1-3 Bifenilos diclorados 12 4-15 Bifenilos triclorados 24 16-39 Bifenilos tetraclorados 42 40-81 Bifenilos pentaclorados 46 82-127 Bifenilos hexaclorados 42 128-169 Bifenilos heptaclorados 24 170-193 Bifenilos octaclorados 12 194-205 Bifenilos nonaclorados 3 206-208 Bifenilo decaclorado 1 209 Los PCBs se produjeron comercialmente como mezclas complejas desde 1929 bajo varios nombres de marcas (Acelor, Aroclor, Clophen, etc.) con un contenido promedio de cloro en los diferentes productos comprendido entre 21 y 68 %. Su uso se prohibió en los países industrializados a finales de los 70 debido al impacto ambiental que producían15. I NTRODUCCIÓN 87 Se utilizaron ampliamente como fluidos de refrigeración en transformadores eléctricos y condensadores, como plastificantes, como fluidos de transferencia de calor en máquinas, como agentes impermeables al agua y en otras muchas aplicaciones16. La mayoría de los PCBs son cristales incoloros, aunque las mezclas comerciales son líquidos viscosos y claros. Las propiedades químicas varían mucho según las clases (monoCB-decaCB), pero en general los PCBs presentan: oAlta estabilidad frente a la descomposición o degradación medioambiental o metabólica. oBajas presiones de vapor. oBajas solubilidades en agua y altamente solubles en disolventes no polares. Tabla I.3.3. Principales propiedades físicas de los PCBs estudiados. Congénere Nº IUPAC P. Vapor a 25ºC(a) (Pa) Solubilidad en agua(a) (mg.L-1) Log Kow(a)(b) LD50 oral(c) (mg.kg-1) 2,6-dicloroCB PCB-10 2,54.10-2 2,41 4,98 2,4,4’-tricloroCB PCB-28 2,61.10-2 0,27 5,62 2,2’,5,5’-tetracloroCB PCB-52 1,13.10-3 0,0153 6,09 2,2’,4,4’,5,5’- hexacloroCB PCB-153 4,59.10-4 0,0095 7,15 10 2,2’,3,4,4’,5’-hexaCB PCB-138 3,76.10-4 0,0054 7,75 2,2’,3,4,4’,5,5’- heptaCB PCB-180 1,31.10-4 0,0038 8,27 3 (a) Valores obtenidos en la base de datos Physprop12; (b) logaritmo del coeficiente de partición octanol/agua; (c) toxicidad aguda para ratas, valores obtenidos de la monografía de la WHO14. CONTAMINANTES ORGÁNICOS 94 oTrialquilfosfatos: tributilfosfato (TBP), tri(2-butoxietil)fosfato (TBEP), tri(2-etilhexil)fosfato (TEHP) oTricloroalquilfosfatos: tri(2-cloroetil)fosfato (TCEP), tri (1-cloro2-propil)fosfato (TCPP), tri(1,3-dicloro-2-propil)fosfato (TDCP) oTriarilfosfato: trifenilfosfato (TPhP) oBisfosfatos: resorcinol bi(difenilfosfato) (RDP), bisfenol A bi(difenilfosfato) (BDP) OPO O O R R R OPO O O ROPO O O Ph Ph Ph Ph Cl R Cl R Cl Cl R R R R RO R RR TCEP TCPP TDCP TPhP TiBP TnBP TBEP TEHP RDP BDP Tris(alquil-/aril-)fosfatos Bisfosfatos Figura I.3.5. Estructura de los TAPs estudiados. Los compuestos organofosforados comercializados consisten en un grupo de cerca de 250 compuestos producidos en todo el mundo, aproximadamente 140 de estos compuestos son plaguicidas y el resto se han usado desde los años 40 como pirorretardantes, fluidos hidráulicos y disolventes. Predominantemente, consisten en fosfatos alquilados y arilados31. I NTRODUCCIÓN 95 Estos ésteres de trialquil-/arilfosfato se usan para reemplazar a los PCBs32, como pirorretardantes en plásticos y fluidos hidráulicos. En pequeñas cantidades también se usan como lubricantes, adhesivos y revestimientos33. Los tri(alquil)fosfatos clorados como TCPP y TDCP se usan principalmente en espumas de poliuretano, mientras los tri(alquil- /aril)fosfatos no clorados, como el TPhP, TBP y TBEP se usan como plastificantes, lubricantes y disolventes31. Además, tras la prohibición en 2006 de algunos pirorretardantes halogenados, se podrán usar otros compuestos no halogenados entre ellos pirorretardantes organofosforados, nitrogenados e inorgánicos como alternativa. El uso de tri(aril)fosfatos y resorcinol bi (difenilfosfato), principalmente en plásticos, llevará a un aumento de su producción, como ya se está notando en el consumo de pirorretardantes en los países del norte de europa34. Los tri(aril-/alquil-) fosfatos difieren mucho en sus propiedades35 de biodegradabilidad, solubilidad en agua y toxicidad como puede verse en la tabla I.3.6. En general, los TAPs tienen baja presión de vapor y una solubilidad en agua de baja a moderada y exhiben baja letalidad. La mayoría de los trialquil-/arilfosfatos se hidrolizan rápidamente en disolución alcalina dando lugar a los correspondientes di(aril-/alquil- )fosfatos, por lo que, también se ha estudiado su posible degradación biológica. Se observó que mientras los tricloroalquilfosfatos presentan baja biodegradablidad, los triarilfosfatos son fácilmente biodegradados36. CONTAMINANTES ORGÁNICOS 96 Algunos de los posibles productos de degradación (difenilfosfato) se han identificado en el medioambiente, estos productos son no volátiles y fuertemente polares27,37. Tabla I.3.6. Principales propiedades físicas de los TAPs estudiados. Compuesto P. Vapor a 25ºC(a) (Pa) Solubilidad en agua(a) (mg.L-1)Log Kow(a)(b) LD50 oral(c) (mg.kg-1) TCEP 1,45.10-2 7000 1,44 430-1400 TCPP 2,70.10-3 1200 2,59 1000-4200 TDCP 9,85.10-4 700 3,65 2800 TPhP 8,4.10-4 1,9 4,59 3500-5000 TBP 1,51.10-1 400 4,0 1000-3000 TBEP 3,35.10-6 1100 3,75 3000-4700 TEHP 1,10.10-5 0,6 9,49 10000-37000 RDP 5,03.10-11 (d) 5,98(d) BDP 1,98.10-15 (d) 8,66(d) > 2000 (e) (a) Valores obtenidos en la base de datos Physprop12; (b) logaritmo del coeficiente de partición octanol/agua; (c) toxicidad aguda para ratas, valores obtenidos de las monografías de la WHO27,28,29,30; (d) valores calculados con Advanced Chemistry Development (ACD/Labs) Software Solares V4.67; (e) Material Safety Data Sheet suministrada por Akzo Nobel. La biodegradación de tri(aril-/alquil-)fosfatos en el medioambiente es moderada, lo que conduce a que no sean considerados contaminantes persistentes. Los efectos de los ésteres organofosforados y de sus posibles productos de degradación para la salud humana no han sido estudiados en detalle y algunos de ellos están sometidos a valoración de riesgos por la Unión Europea38. I.3.1.2. FUENTES Y DISTRIBUCIÓN EN EL MEDIOAMBIENTE Los contaminantes orgánicos aquí tratados se han usado en grandes cantidades y se han esparcido intencionadamente (plaguicidas) o han llegado al medio por una manipulación descuidada1. I NTRODUCCIÓN 97 Las fuentes de todos estos contaminantes orgánicos son de origen antropogénico ya que no aparecen de forma natural en el medioambiente. Algunos de estos compuestos, como PCBs y plaguicidas organoclorados, debido a su persistencia en el medioambiente, están prohibidos o su producción y uso está severamente restringida. La principal fuente de exposición al medio ambiente de estos contaminantes ya retirados del uso parece ser su redistribución en el medio. Tabla I.3.7. Uso de los contaminantes orgánicos estudiados. Familia Años de aplicación Usos POCs 1950-1980 Lucha contra plagas (insecticidas) Tratamiento de animales contra parásitos Salud Pública (Lucha contra Malaria y Tifus) PCBs 1920-1975 Fluidos refrigerantes en Transformadores y Condensadores Plastificantes y adhesivos Fluidos lubricantes PBBs 1970-2000 Pirorretardantes en Espuma de poliuretano, aparatos electrónicos, lacas y plásticos PBDEs 1960-2006 Pirorretardantes en Aparatos electrónicos e Instalaciones eléctricas, Textiles, Aislantes TAPs 1960Pirorretardantes en componentes eléctricos, plásticos Plastificante Fluidos hidráulicos industriales Las principales fuentes difusoras han sido las emisiones incontroladas debidas a sus extensas aplicaciones agrícolas o industriales y el incorrecto tratamiento de los residuos llevado a cabo en el pasado, así como los vertidos producidos en accidentes. En la tabla I.3.7 aparecen un resumen de los principales usos de los compuestos estudiados y su período de producción. CONTAMINANTES ORGÁNICOS 98 La fuente secundaria de contaminación es la lixiviación y evaporación de la tierra contaminada y vertederos, incineración y combustión, descargas de aguas residuales y lodos1,4,19. Además, los PCBs pueden producirse como co-productos de una gran variedad de procesos químicos que contienen fuentes de cloro e hidrocarburos, durante la cloración de agua y la degradación térmica de otros compuestos orgánicos clorados16. Una vez que estos contaminantes han sido emitidos al medio, se distribuyen, pudiendo ser detectados en aire, agua, suelo, sedimentos, organismos acuáticos y terrestres. La distribución de estos compuestos en el medio ambiente depende de sus propiedades físicas ya mencionadas, como presión de vapor, solubilidad en agua y coeficiente de partición octanol/agua. En la figura I.3.6 puede verse un esquema de los posibles procesos que pueden sufrir los contaminantes orgánicos en el medio ambiente. La mayoría de los compuestos estudiados son semivolátiles, por lo que, se produce su volatilización del suelo y el agua para pasar a la atmósfera, con el posterior transporte por el aire y la eliminación de la atmósfera mediante deposición o sedimentación húmeda o seca. En el terreno interactúan con las moléculas produciéndose la adsorción, de ella va a depender la posterior movilización de los compuestos a través de procesos de lavado, volatilización y lixiviación. Así, compuestos con baja solubilidad en agua (POCs, PCBs, PBBs y PBDEs) van a ser difícilmente lavados de los suelos, sobre todo si tienen un alto I NTRODUCCIÓN 99 contenido en materia orgánica, mientras en general los compuestos con alta solubilidad en agua, van a ser fácilmente lavados y lixiviados de los suelos, llegando al medio acuático. Degradación por radiación UV Lavado Adsorción Lixiviación Degradación bacteriana o hidrólisis química Transporte por agua subterráneas Adsorción Bioconcentración Biomagnificación Deposición Deposición Evaporación Figura I.3.6. Distribución en el medioambiente de los contaminantes orgánicos. En el medio acuático, los compuestos con mayor solubilidad en agua (algunos TAPs) van a estar disueltos, mientras los más hidrofóbicos (POCs, PCBs, PBBs y PBDEs) van a interaccionar principalmente con la materia en suspensión o con los sedimentos. A partir de estas fuentes (suelos, agua y sedimentos), estos compuestos entran en organismos vivos, incorporándose a las plantas, y a los animales, por el agua o la alimentación. Produciéndose una bioacumulación de los contaminantes orgánicos más lipofílicos (log kow >4) en sistemas biológicos. Sin embargo, cuando el valor de log Kow es 8 o mayor entonces existe una elevada adsorción en los sedimentos, de CONTAMINANTES ORGÁNICOS 100 manera que no existe suficiente movilidad como para incorporarse al tejido vivo. Así, los compuestos con valores de log Kow entre 4 y 8 tienen el mayor grado de bioacumulación1, encontrándose en los tejidos a concentraciones que son algunos órdenes de magnitud mayores que los que se encuentran en el medio donde habitan, principalmente en los peces. Además, muchos de estos compuestos se biomagnifican, es decir, su concentración aumenta a lo largo de la cadena alimenticia como resultado de una secuencia de etapas de bioacumulación1. Para estudiar la persistencia en el medio de estos compuestos hay que tener en cuenta su posible degradación. Así, los contaminantes orgánicos pueden sufrir una serie de reacciones que originan metabolitos del contaminante original, ya sea por la acción de la luz solar o por medio de microorganismos, dando lugar a contaminantes secundarios. La degradación medioambiental y metabólica de los POCs, PCBs, PBBs y PBDEs es normalmente lenta. A excepción de los PBDEs y PBBs de alto grado de bromación que sufren una debromación fotoquímica dando lugar a compuestos de menor grado de bromación19, debido a esto, la distribución de estos compuestos en el medioambiente no corresponde con su producción. Por el contrario, los TAPs no halogenados podrían presentar una degradación moderada, transformándose posiblemente en el correspondiente éster de dialquil-/arilfosfato y en menor cantidad en el monoalquil-/arilfosfato36,39. I NTRODUCCIÓN 101 I.3.1.3. BIODISPONIBILIDAD Y TOXICIDAD La presencia en el medio ambiente de grandes cantidades de compuestos artificiales y de sus productos de transformación implica un riesgo para la salud humana. Tales compuestos pueden entrar en el organismo a través de la piel o del aparato respiratorio, o bien pueden ser ingeridos cuando se hallan presentes en el agua, en los vegetales o en los animales que constituyen la base de la alimentación, y algunos pueden bioacumularse debido a una alta estabilidad y un alto grado de lipofibilidad. La principal vía de exposición ocupacional es la inhalación y la absorción cutánea, mientras para la población general es el consumo de comida, particularmente peces y carnes. En general, estos compuestos en animales y humanos son fácilmente absorbidos a través del tracto intestinal, se absorbe >80 %, o través de los pulmones seguido de la inhalación del vapor, un 50 %. Sin embargo, son poco absorbidos a través de la piel (7-8 %). Estos compuestos cuando entran en la cadena alimenticia de los animales superiores y, en última instancia, en el organismo humano, se acumulan en algunos órganos vitales y dan lugar al desarrollo de intoxicaciones más o menos graves, por lo que, resulta indispensable evaluar la acción tóxica sobre los distintos organismos. Los valores de LD50 oral para los compuestos estudiados están recogidos en las tablas correspondientes del apartado I.3.1.1, siguiendo la escala de Hodge y Sterner (tabla I.3.8) puede concluirse: CONTAMINANTES ORGÁNICOS 102 xLos efectos de los POCs y PCBs presentan una toxicidad entre moderada y alta y sus efectos sobre los animales y los seres humanos han sido ampliamente estudiados. xLos PBBs y PBDEs son ligeramente tóxicos, y debido a su estructura parecida a los PCBs se supone que los efectos son similares aunque están todavía bajo investigación. xLos TAPs pueden considerarse ligeramente tóxicos o prácticamente no tóxicos pero actualmente existen pocos estudios sobre sus efectos sobre los seres humanos y la mayoría de los estudios son contradictorios. Tabla I.3.8. Clasificación de la toxicidad: escala de Hodge y Sterner3. Niveles de Toxicidad LD50 oral, mg.kg-1 1Extremadamente Tóxico  1 2 Altamente Tóxico 1-50 3Moderadamente Tóxico 50-500 4 Ligeramente Tóxico 500-5000 5Prácticamente No Tóxico 5000-15000 6 Relativamente inocuo  15000 Los efectos que presentan para los seres humanos son variados y de diversa consideración según los compuestos considerados, como aparece recogido en la tabla I.3.9. I NTRODUCCIÓN 103 Tabla I.3.9. Toxicidad de los contaminantes orgánicos estudiados. Familia Nivel de Toxicidad Efectos POCs Moderadamente Tóxicos Disruptores del sistema endocrino Problemas Neurológicos Disfunciones renales y hepáticas Inductores de cáncer PCBs Altamente Tóxicos Disruptores del sistema endocrino Problemas neurológicos Lesiones dérmicas (cloroacné) Disfunciones hepáticas Inductores de cáncer PBBs Ligeramente Tóxicos Disruptores del sistema endocrino Lesiones dérmicas Inductores de cáncer PBDEs Ligeramente Tóxicos Disruptores del sistema endocrino Problemas neurológicos Disfunciones hepáticas Inductores de cáncer TAPs Ligeramente a Prácticamente no tóxicos Problemas neurológicos Dermatitis Inhibidor de colinesterasa eritrocitrica Posibles Inductores de cáncer I.3.2. DETERMINACIÓN DE CONTAMINANTES ORGÁNICOS Las muestras medioambientales y biológicas están normalmente contaminadas con una gran variedad de compuestos. El control del estado de contaminación del ecosistema, la distribución y movimiento de los contaminantes, se basa fundamentalmente en el desarrollo de métodos analíticos sensibles. CONTAMINANTES ORGÁNICOS 110 1600 rpm) y desorción (temperatura: 140-310ºC; tiempo de desorción: 120 min)42. La SPME se aplicó a la determinación de los contaminantes estudiados en este trabajo en muestras líquidas usando principalmente la fibra de polidimetilsiloxano (PDMS)72,73,74,75,76,77,78, aunque también existen algunos estudios con poliacrilato (PA)79,80,81, polidimetilsiloxano/divinilbenceno (PDMS/DVB)82,83,84 para la extracción de OCPs. En los últimos años una nueva fibra de divinilbenceno/carboxen/polidimetilsiloxano (DVB/CAR/PDMS)56,85 se ha utilizado para la extracción de OCPs. También se ha aplicado como técnica de preconcentración tras el paso de extracción de compuestos organoclorados de una muestra sólida86,87. Para corregir la influencia de la matriz en la eficiencia de SPME se requiere el uso de patrón interno y/o método de adición estándar. Es importante tener en cuenta, que para que el patrón interno funcione bien en SPME su coeficiente de partición entre la muestra y el revestimiento de la fibra debe ser similar a los de los analitos objetivo, y esto se podría conseguir con análogos marcados isotópicamente pero que resultan caros y no siempre están comercialmente disponibles86. Una variación de esta técnica es la extracción con barra adsorbente88 (SBSE) que se ha usado para la extracción de PCBs. En esta técnica la fase estacionaria recubre una barra magnética, usa un mayor espesor de fase que la SPME y por lo tanto presenta mayor capacidad. Después del paso de concentración, los analitos se desorben térmicamente de la barra agitadora on-line con el cromatógrafo de gases. I NTRODUCCIÓN 111 Los métodos de extracción de los compuestos organohalogenados y organofosforados en muestras líquidas aparecen resumidos en la tabla I.3.10. Tabla I.3.10. Resumen de métodos de determinación de los compuestos orgánicos estudiados en agua. Año Preparación de muestra Separación/ Detección Obs. Ref. 1981 SPE: XAD-2; elución con DCM GC-NPD TAPs 33 1983 SPE: XAD-2; elución con acetona; derivatización diazobutano GC-FID DAPs, LOD: 0,3 µg.L-1 (1 L) 39 1985 LLE: con DCM GC-FPD o MS TAPs, LOD: 5-20 ng.L-1 (3 L) 44 1988 LLE: con DCM GC-ECD OCPs, LOD: 0,02-0,09 µg.L-1 PCBs, LOD: 0,5-0,9 µg.L-1 45 1998 SPME: PDMS 30 min 100ºC PCBs, LOD: 0,3-1 ng.L-1 76 1999 LLE: con DCM GC-FPD TAPs 46 1999 SPE: RP-C18, elución con acetona o agua:acetonitrilo GC-MS TAPs 54 1999 SPE: GCB, elución DCM:metanol GC-MIP-AES OCPs, LOD: 3-80 ng.mL-1 69 1999 SPME: PA 45 min 60100ºC GC-ECD OCPs, LOD: 0,15-0,30 ng.L-1 81 2000 SPE: C18; eluyente acetonitrilo:DCM GC-ECD GC-MS OCPs, LOD: 2-26 ng.L-1 55 2000 SPE: OASIS; eluyente acetonitrilo:DCM GC-MS OCPs, PCBs 59 2000 SPME: PDMS 55ºC 30 min GC-ECD OCPs, LOD: 0,1 ng.mL-1 77 2000 SPME: PA 100ºC 40 min GC-ECD OCPs, PCBs; LOD: 0,06-3,4 ng.mL-1 80 CONTAMINANTES ORGÁNICOS 112 Tabla I.3.10. Resumen de métodos de determinación de los compuestos orgánicos estudiados en agua. Año Preparación de muestra Separación/ Detección Obs. Ref. 2001 SPE: Bond Elut PPL, eluyente acetonitrilo:metanol GC-MS TAPs, LOD: 1 ng.L-1 31 2001 LPME: 50ºC 25 min, con hexano GC-ECD OCPs, LOD: 0,05 ng.mL-1 49 2001 SPE: estireno-DVB, eluyente acetato de etilo GC-MS TAPs, LOD: 0,1-0,7 ng.L-1 61 2002 LLE: disolvente hexano:DCM GC-ECD OCPs, LOD: 0,01-0,2 ng.mL-1 48 2002 SPE: C18, eluyente hexano GC-ECD OCPs, LOD: 0,02 ng.mL-1 56 2002 SPME: DVB/CAR/PDMS, 30 min 22ºC GC-ECD OCPs, LOD: 0,05 ng.mL-1 56 2002 SPE: OASIS, eluyente tolueno GC-µECD OCPs, LOD: 0,01-0,3 ng.mL-1 62 2002 SPME: PDMS 50 min 50ºC GC-MS PCBs, LOD: 0,03-0,11 ng.mL-1 72 2002 SPME: PDMS 45 min GC-ECD OCPs 74 2002 SPME: PDMS/DVB GC-ECD OCPs, LOD: 1-10 ng.mL-1 82 2002 SPME: DVB/CAR/PDMS 30 min GC-ECD OCPs, LOD : 0,5-7,4 ng.L-1 85 2003 LLE: disolvente DCM GC-ECD OCPs, LOD: 5,5-20,6 ng.L-1 47 2003 MMLLE GC-NPD TAPs, LOD : 0,2-0,9 ng.mL-1 51 2003 SPE : cartuchos C18, eluyente MTBE GC-MS OCPs, PCBs; LOD: 0,05-0,5 ng.mL-1 57 2003 SPE : OASIS HLB, eluyente DCM :metanol GC-MS OCPs, PCBs; LOD: 2-80 pg.g-1 63 2003 SPE : OASIS HLB, eluyente metanol :MTBE LC-MS TAPs 64 2004 MMLLE GC-MS OCPs, LOD: 0,05-2,3 ng.mL-1 52 2004 SPE: discos C18 GC-ECD PCBs 58 I NTRODUCCIÓN 113 Tabla I.3.10. Resumen de métodos de determinación de los compuestos orgánicos estudiados en agua. Año Preparación de muestra Separación/ Detección Obs. Ref. 2004 SPE: DVB (Speedisks), eluyentes MTBE y tolueno GC-MS TAPs, LOD: 1-7 ng.L-1 65 2004 SPME: PDMS 100ºC 30 min GC-MS PBDEs, LOD : 20-190 pg.L-1 PBBs, LOD : 7-9 pg.L-1 73 2004 SPME : PA 40 min OCPs 79 I.3.2.2. PREPARACIÓN DE MUESTRAS SÓLIDAS Las técnicas más antiguas usadas en la extracción sólido-líquido incluyen Soxhlet y agitación. Estos métodos se han usado con una gran variedad de combinaciones de disolventes y aditivos. En los últimos años, la extracción tradicional Soxhlet (SOX) se ha reemplazado por algunas técnicas de extracción más rápidas, incluyendo extracción con ultrasonidos (USE), dispersión de la matriz en fase sólida (MSPD), extracción asistida por microondas (MAE), extracción con fluidos supercríticos (SFE) y extracción acelerada con disolventes (ASE). Estas técnicas alternativas reducen considerablemente el consumo de disolvente y simplifican el procedimiento de extracción. Los métodos usados en la extracción de sedimentos, suelos y tejidos biológicos dependerán de la naturaleza lipofílica de la matriz41. I.3.2.2.1. Extracción Soxhlet (SOX) La extracción Soxhlet (SOX) es una de las técnicas de extracción sólido-líquido más usadas, se desarrolló a finales del siglo diecinueve, se CONTAMINANTES ORGÁNICOS 114 usa un disolvente orgánico (hexano, acetona, diclorometano o metanol) para la extracción de contaminantes orgánicos no polares o semipolares en matrices sólidas41. Después de la homogeneización de la muestra con sulfato sódico, para eliminar el agua presente en la muestra se deja entre 6-24 horas. A continuación, el polvo seco se pone a reflujo con el disolvente. El tamaño del sistema puede variar, pero la mayoría de las configuraciones usa alrededor de 100-200 mL de disolvente y 5-50 g de muestra sólida, con extracciones que llevan de 4 a 18 horas. Como resultado se obtiene un volumen grande de extracto que debe concentrarse y en muchas ocasiones someterse a una etapa adicional de limpieza16,89,90. La extracción de OCPs, PCBs y PBDEs con Soxhlet se puede llevar acabo con un disolvente como diclorometano47,91 o hexano92 aunque para la extracción exhaustiva de los compuestos en la mayoría de los casos es necesario el uso de mezcla de disolventes polares y no polares como acetona/hexano86,93,94,95,96,97,98,99,100,101,102. Soxhlet es una técnica simple y sencilla de implantar y usar, con una inversión inicial baja y no requiere una posterior filtración. Sin embargo, entre sus desventajas están que requiere grandes volúmenes de disolventes, largo tiempo de extracción como resultado de la lenta difusión de los analitos, generación de extractos con interferencia que requieren etapas de limpieza, dilución de los analitos que hace necesaria una posterior concentración de los extractos y no puede ser totalmente automatizable. I NTRODUCCIÓN 115 Para superar algunas de las desventajas de la extracción Soxhlet convencional se han desarrollado las extracciones Soxtec o Soxtherm103,104 y Soxhlet asistida por microondas105,106, reduciendo el tiempo y el volumen de disolvente usado41. I.3.2.2.2. Extracción Asistida por Ultrasonidos (USE) La extracción asistida por ultrasonidos (USE) es una técnica de extracción simple en la que la muestra se sumerge en un disolvente orgánico apropiado en un recipiente y se coloca en un baño de ultrasonidos, tras la extracción la mezcla de la muestra y disolvente orgánico se separa por filtración y posteriormente se lava la muestra con disolvente. USE ha demostrado ser un camino efectivo de extracción de un gran número de analitos orgánicos e inorgánicos de diferentes tipos de muestras sólidas41. La eficiencia de extracción depende de la polaridad del disolvente, la homogeneidad de la matriz y el tiempo de ultrasonicación. La USE es una técnica que requiere 30-200 mL de disolvente, 1-30 g de muestra y un tiempo de extracción de 10-60 minutos. En muchos casos, la extracción asistida por ultrasonidos es una alternativa eficiente frente a otras técnicas de extracción98,102,103,107,108 para la lixiviación de los compuestos organoclorados estudiados. Es una técnica barata, sencilla y no requiere instrumentos caros. Sin embargo, requiere un gran volumen de disolvente, podría requerir extracciones sucesivas, el método no está automatizado y es necesario un paso de limpieza. Se obtienen precisiones más bajas debido a que normalmente en el baño de CONTAMINANTES ORGÁNICOS 116 ultrasonidos la distribución de la energía no es uniforme109. La ultrasonicación fue aceptada como alternativa al Soxhlet, con menor tiempo de extracción, pero las condiciones de extracción tienen que ser cuidadosamente optimizadas para obtener eficiencias de extracción satisfactorias. I.3.2.2.3. Dispersión de la Matriz en Fase Sólida (MSPD) La dispersión de la matriz en fase sólida110 (MSPD) es una técnica de extracción y limpieza, introducida en 1989, que se basa en la dispersión de la muestra sobre un adsorbente generalmente Florisil111,112 o C18113,114,115,116. En MSPD, una pequeña cantidad de muestra se homogeniza y dispersa en un soporte sólido. La matriz homogeneizada se coloca en una columna, potencialmente multifásica, y los analitos se eluyen con un disolvente orgánico. Así, se lleva a cabo la extracción y limpieza en un mismo paso. Normalmente la fase que se coloca debajo de la muestra está formada por un adsorbente como gel de sílice115 o florisil111,112,113,114,116, que retienen los compuestos interferentes en muestras, principalmente, con alto contenido lipídico117. Ling y Huang115 compararon el uso de diferentes adsorbente para la extracción de contaminantes clorados mediante MSPD, como florisil, gel de sílice acidificado y alúmina neutra, obteniendo los mejores resultados mediante la utilización de florisil. El procedimiento MSPD en comparación con las técnicas de extracción clásicas (Soxhlet) requiere menor tamaño de muestra (0,5 vs 25 g), menor I NTRODUCCIÓN 117 tiempo de análisis (40 min vs 300 min) y menor volumen de disolvente (10 mL vs 100 mL de disolvente)115. I.3.2.2.4. Extracción Asistida por Microondas (MAE) La extracción asistida por microondas118,119 (MAE) es una técnica aplicada a partir de los años 80, consiste en la suspensión de las muestras en disolventes orgánicos y su irradiación con energía microondas, permite una extracción rápida de solutos desde la matriz sólida con una eficiencia de extracción comparable a la de las técnicas clásicas. Es necesario un paso de filtración y limpieza después de la extracción. La aplicación de la energía a la muestra se puede realizar de dos maneras, en vasos cerrados bajo control de presión y temperatura o en vasos abiertos a presión atmosférica. La extracción asistida por microondas presurizada (MAE) permite una rápida extracción (10-30 min) con bajo consumo de disolvente (20-30 mL) para tamaños de muestra pequeños (1-10 g), y hasta una extracción simultanea de 12 muestras con un coste inicial del equipamiento medio. Las principales desventajas son la necesidad de limpieza, el largo tiempo de enfriamiento de las celdas de extracción y la necesidad de que el disolvente absorba energía de microondas. Como en las otras técnicas de extracción sólido-líquido la principal mezcla de disolventes que se utiliza para la extracción de OCPs y PCBs es hexano/acetona98,102,103,120,121,122,123. Aunque el hexano no absorbe radiación de microondas, la acetona si lo hace permitiendo así el calentamiento de la muestra, normalmente en torno a los 115ºC 47,124. El CONTAMINANTES ORGÁNICOS 118 mismo efecto puede conseguirse con la mezcla hexano:DCM para la extracción de TAPs32,. Esta técnica de MAE se ha comparado con la extracción Soxhlet obteniendo resultados similares47,102,103,98,122,123, con las considerables ventajas de menor consumo de disolventes y tiempo que MAE supone. López-Ávila y col.103 compararon la extracción asistida con microondas con otras técnicas de extracción como Soxtec y USE para la extracción de POCs, obteniendo mejores recuperaciones con el uso de MAE y en un tiempo más corto de preparación de muestra. I.3.2.2.5. Extracción con Fluidos Supercríticos (SFE) La extracción con fluidos supercríticos (SFE) ha recibido una gran atención en los últimos 20 años para la extracción de muestras sólidas o semisólidas. Consiste en la extracción de los analitos con un fluido supercrítico que tiene densidades similares a líquidos, pero con viscosidades más bajas y coeficientes de difusión más altos, lo que hace que sean fluidos más penetrantes, con mayor poder de solvatación y mayor velocidad de extracción de solutos. Además, combinando la extracción SFE con trampas de adsorbentes sólidos y su posterior elución con disolventes orgánicos, se obtiene en un simple paso la extracción y limpieza. El fluido supercrítico más usado es el CO2 debido a su adecuada temperatura critica (31,2ºC) y presión (72,8 atm). La extracción con fluidos supercríticos se ha usado ampliamente para los compuestos organoclorados estudiados93,94,125,126,127,128,129,130. Además, debido a la presencia de posibles sustancias que se coextraigan con los I NTRODUCCIÓN 119 compuestos de interés, se han estudiado mejoras en la etapa de limpieza de los extractos antes de su inyección directa en el sistema cromatográfico. La introducción en la celda de un adsorbente de compuestos de naturaleza lipídica (como alúmina131,132,133, florisil134,135,136 y gel de sílice137) o de azufre (como cobre138,139), ha simplificado la extracción de estos analitos. Los resultados se han comparado con otras técnicas de extracción, como Soxhlet, obteniendo resultados similares y en algunos casos mejores para los OCPs y PCBs estudiados93,94,125,128,129,130. La extracción con fluidos supercríticos es un método rápido (10-60 min), simple, totalmente automatizable, donde se obtiene extractos limpios, con un bajo consumo de disolventes (2-5 mL) y de muestra (1-5 g) y un alto grado de selectividad. Pero una desventaja importante es el gran número de variables a controlar, por lo que el desarrollo y la validación de los métodos de SFE puede ser costoso y largo. Además hay que tener en cuenta la gran inversión inicial del equipo automatizado. I.3.2.2.6. Extracción Acelerada con Disolventes (ASE) La extracción acelerada con disolventes (ASE) se introdujo en 1995, en sus diferentes variantes como extracción con fluidos presurizados (PFE) o extracción con líquido a presión (PLE), y se basa en la extracción de una muestra sólida con un disolvente bajo condiciones de presión y temperatura elevadas (50-200 ºC y 50-2000 Pa). La extracción se realiza incluyendo los siguientes pasos: colocación de la muestro en la celda de extracción, llenado de la celda con un disolvente, calentamiento y presurización de la celda a los valores marcados (paso de M ERCURIO EN MATERIAL BIOLÓGICO Y S EDIMENTOS 222 A BC Figura IV.2.7. Funciones de deseabilidad global bidimensionales para la optimización de SPME; A, temperatura frente a pH; B, tiempo frente a pH; C, tiempo frente a temperatura. La función de deseabilidad combinada predijo las condiciones de SPME óptimas (figura IV.2.7) en las cercanías de pH 5, temperatura de extracción 100ºC y tiempo de exposición de 15 min. Estas condiciones optimizadas se utilizaron para la realización de SPME sobre los extractos tanto de material biológico como de sedimentos. R ESULTADOS Y D ISCUSIÓN 223 IV.2.2.3. OPTIMIZACIÓN DE LAS CONDICIONES DE LIXIVIACIÓN Las condiciones de lixiviación para muestras de material biológico se adoptaron de un trabajo anterior desarrollado en el laboratorio1, utilizándose como agente lixiviante 10 mL de HCl 3 mol.L-1. La lixiviación se realizó con energía de microondas a máxima potencia (100%) a 100ºC durante 10 min. Las condiciones de lixiviación para muestras de sedimentos fueron optimizadas usando una muestra de sedimentos con adición que se preparó en el laboratorio, según se describe en el apartado IV.2.1.3. Antes de su uso se estudió la homogeneidad del sedimento tomando diferentes cantidades entre 0,1 y 2 g, realizando la extracción por triplicado y calculando el coeficiente de variación de las respuestas obtenidas. Como puede verse en la figura IV.3.3, se puede considerar que el sedimento es homogeneo para tamaños de muestra a partir de 1 g, ya que los coeficientes de variación obtenidos son inferiores al 10%. 0 40 80 120 MeHg+ Hg2+ Coeficiente de variación 0,1 g 0,5 g 1 g 1,5 g 2 g Figura IV.2.8. Perfiles de los coeficientes de variación (%) con el tamaño de muestra (0,1; 0,5; 1,0; 1,5; 2,0 g) en sedimentos para MeHg+ y Hg2+. M ERCURIO EN MATERIAL BIOLÓGICO Y S EDIMENTOS 224 Se evaluaron los factores que afectan a la lixiviación asistida por microondas, estudiando los efectos del tiempo y temperatura de lixiviación, tipo y concentración de ácido y la potencia del microondas mediante un diseño experimental factorial fraccionado 25-1, es decir, mediante 16 experiencias, utilizando el paquete estadístico Nemrod9. Los niveles de los factores tiempo y la temperatura de lixiviación se eligieron en función de estudios anteriores3 entre 2-15 min y 60-120ºC, respectivamente. También se consideró la potencia de MW, entre 40% y 100%. Asimismo se estudió el tipo de ácido que se debe utilizar en la lixiviación, se consideró un ácido fuerte (ácido clorhídrico) y uno débil (ácido acético) desde concentraciones bajas (0,5 mol.L-1) a altas (6 mol.L-1). En la tabla IV.2.5 se muestra el dominio experimental evaluado con el diseño factorial fraccionado 25-1. Tabla IV.2.5. Dominio experimental de los factores seleccionados en el diseño experimental factorial fraccionado 25-1 para la optimización del proceso de lixiviación. Factor Nivel Bajo (-1) Nivel Alto (+1) Unidades Tiempo 2 15 min Temperatura 60 120 ºC Ácido HCl HAc Concentración de ácido 0,5 6 mol.L-1 Potencia 40 100 % Los experimentos se realizaron con una muestra de sedimentos con adición tomando 1 g y adicionando 10 mL del agente lixiviante siguiendo la matriz de experiencias aleatoria que se muestra en la tabla IV.2.6. Tras la lixiviación se realizó la preconcentración del extracto de microondas mediante SPME en espacio de cabeza a pH 5 con una agitación de 500 R ESULTADOS Y D ISCUSIÓN 225 r.p.m. a 100ºC durante 15 min usando una fibra de PDMS, condiciones optimizadas en el apartado IV.2.2.2. Tabla IV.2.6. Matriz de experiencias y respuestas obtenidas para las especies de mercurio del diseño experimental factorial fraccionado 25-1 para la optimización de las condiciones de lixiviación. Matriz de experiencias aleatoria Respuestas (cuentas de área) Nº Exp Tiempo Tª Ácido Concentración Potencia MeHg+Hg2+ 1 2 60 HCl 0,5 100 424,2 2475,2 2 15 60 HCl 0,5 40 645,8 2486,1 3 2 120 HCl 0,5 40 633,1 1298,1 4 15 120 HCl 0,5 100 84,3 4,2 5 2 60 HAc 0,5 40 46,7 124,8 6 15 60 HAc 0,5 100 46,7 102,2 7 2 120 HAc 0,5 100 82,0 356,7 8 15 120 HAc 0,5 40 70,8 61,1 9 2 60 HCl 6,0 40 1079,5 59136,0 10 15 60 HCl 6,0 100 1077,5 46076,6 11 2 120 HCl 6,0 100 38,8 39665,1 12 15 120 HCl 6,0 40 31,9 26926,4 13 2 60 HAc 6,0 100 138,8 81,3 14 15 60 HAc 6,0 40 204,5 727,3 15 2 120 HAc 6,0 40 269,7 210,3 16 15 120 HAc 6,0 100 562,5 116,2 Se estudió la influencia de los factores y las interacciones sobre la respuesta, tal como se muestra en la figura IV.2.9, para metilmercurio; Ningún factor es estadísticamente significativo al nivel de confianza fijado (95 %), siendo la temperatura de extracción y el tipo de ácido los que parecen más importantes. Para mercurio inorgánico, el tipo y la concentración de ácido presentan un efecto estadísticamente significativo, en el caso de la concentración un efecto positivo y el tipo de ácido un M ERCURIO EN MATERIAL BIOLÓGICO Y S EDIMENTOS 226 efecto negativo, que indica una clara preferencia por ácidos fuertes como en este caso el ácido clorhídrico. Figura IV.2.9. Gráfico Lenth de efectos principales e interacciones del diseño factorial fraccionado 25-1 para: A, MeHg+; B, Hg2+. Factores: 1, Tiempo; 2, Temperatura; 3, Tipo de ácido; 4, Concentración de ácido; 5, Potencia; 12,13,23,14,24,34,15,25,35 y 45, interacciones entre los factores indicados. Para MeHg+ ninguna interacción es estadísticamente significativa, pero la interacción temperatura-tipo de ácido (2-3) presenta un efecto positivo y está muy cerca del nivel de significación. Para Hg2+ la interacción concentración de ácido-tipo de ácido (3-4) es estadísticamente significativa R ESULTADOS Y D ISCUSIÓN 227 presentando un efecto negativo. Estas interacciones se pueden estudiar de una manera gráfica, en los gráficos de interacciones (figura IV.2.10). Figura IV.2.10. Gráficos de interacciones del diseño factorial fraccionado 25-1 para: A y B MeHg+ para la interacción temperatura-tipo de ácido; C y D, Hg2+ para la interacción tipo-concentración de ácido. Podemos concluir que el tipo de ácido para ambos compuestos tiene una influencia claramente negativa, es decir debe fijarse en el nivel bajo (HCl), por lo tanto las siguientes experiencias se realizaran con ácido clorhídrico. En los gráficos de interacciones mostrados en la figura IV.2.10, se puede observar que para MeHg+ si se usa HCl la mayor respuesta se obtiene a temperatura baja, y para Hg2+ el HCl produce una mayor eficiencia de extracción a elevada concentración (6 mol.L-1). La potencia de MAE no tiene apenas influencia sobre los compuestos estudiados, se decidió fijar en el nivel bajo porque según la bibliografía11 a una potencia elevada, independientemente del tiempo, se puede producir la ruptura de los enlaces Hg-C. Por lo tanto se fija al 40%. M ERCURIO EN MATERIAL BIOLÓGICO Y S EDIMENTOS 228 Los factores tiempo, temperatura y concentración del ácido se estudiaron de forma pormenorizada mediante un diseño de superficie de respuesta, un diseño central compuesto con tres puntos centrales, utilizando el paquete estadístico Nemrod9. Los niveles de los factores se muestran en la tabla IV.2.7. La temperatura de extracción se acotó por el nivel máximo (100ºC) debido a que para ambos compuestos tiene un efecto negativo y a la temperatura máxima se produce una presión muy elevada en el vaso de microondas. Tabla IV.2.7. Dominio experimental de los factores seleccionados en el diseño experimental central compuesto para la optimización de las condiciones de MAE. Factor Nivel -α (-1,68) Nivel Bajo (-1) Nivel Medio (0) Nivel Alto (+1) Nivel +α (+1,68) Unid. Tiempo 1 3 6 9 11 min Temperatura 50 60 75 90 100 ºC Concentración 0,6 1,8 3,5 5,2 6,4 mol.L-1 Los experimentos se realizaron de igual manera que en el cribado, con una muestra de sedimentos con adición tomando 1 g y adicionando 10 mL de ácido clorhídrico siguiendo la matriz de experiencias aleatoria que se muestra en la tabla IV.2.8. Así mismo, en esta tabla se incluyen las respuestas, expresadas en cuentas de área, obtenidas para MeHg+ y Hg2+. R ESULTADOS Y D ISCUSIÓN 229 Tabla IV.2.8. Matriz de experiencias y respuestas obtenidas para las especies de mercurio del diseño experimental central compuesto con 3 puntos centrales. Matriz de experiencias aleatoria Respuestas (cuentas de área) Nº Exp. Tiempo Tª Concentración MeHg+Hg2+ 1 3 60 1,8 2153,8 32298,3 2 9 60 1,8 937,2 28146,1 3 3 90 1,8 1230,8 24187,7 4 9 90 1,8 1138,8 30977,2 5 3 60 5,2 1281,3 41126,8 6 9 60 5,2 2804,1 53718,0 7 3 90 5,2 948,1 37598,8 8 9 90 5,2 1108,8 48319,8 9 1 75 3,5 1791,8 42338,0 10 11 75 3,5 1796,4 43226,6 11 6 50 3,5 1645,6 39057,2 12 6 100 3,5 656,4 32877,2 13 6 75 0,6 1370,1 7312,4 14 6 75 6,4 985,7 26962,8 15 6 75 3,5 2355,0 37995,9 16 6 75 3,5 1310,1 19269,2 17 6 75 3,5 1558,6 38592,4 En la estimación de coeficientes (tabla IV.2.9) para MeHg+ se puede observar que el coeficiente b2 del modelo, asociado a la temperatura de extracción, tiene una influencia negativa y es estadísticamente significativo, mientras que para Hg2+ se puede observar que el coeficiente b3 del modelo, asociado a la concentración de ácido, es estadísticamente significativo con un efecto positivo. M ERCURIO EN MATERIAL BIOLÓGICO Y S EDIMENTOS 230 Tabla IV.2.9. Estimaciones de los coeficientes para las especies de mercurio del diseño experimental central compuesto con 3 puntos centrales. MeHg+Hg2+ Coeficiente Valor del coeficiente t exp. Significación (%) Valor del coeficiente t exp. Significación (%) b0 1734,90 6,41 0,0471*** 31624,90 7,34 0,0229*** b1 28,02 0,22 82,6 2009,53 0,99 35,6 b2 -323,17 -2,54 377* -1801,23 -0,89 40,6 b3 2,58 0,02 98,2 7190,66 3,55 0,933** b11 40,51 0,29 77,6 4957,45 2,23 6,0 b22 -186,86 -1,33 22,3 2547,97 1,14 29,1 b33 -177,35 -1,27 24,5 -4109,25 -1,85 10,5 b12 -29,69 -0,18 85,7 1133,94 0,43 68,2 b13 374,01 2,25 5,8 2584,36 0,98 36,3 b23 -163,39 -0,98 36,0 -455,84 -0,17 86,2 1, tiempo; 2, temperatura; 3, concentración; 11,22,33,12,13 y 23 interacciones. El signo del coeficiente indica la tendencia del efecto. * significación estadística al 95%. La interacción más importante para metilmercurio es la existente entre el tiempo de extracción y la concentración del ácido (asociada al coeficiente b13). En la figura IV.2.11 se muestra la respuesta cromatográfica en función de esos factores estudiados (tiempo y concentración) mientras la temperatura se mantiene en el nivel 0 correspondiente con el centro del dominio (temperatura 75ºC), las mejores respuestas observadas se obtienen a concentración y tiempo en nivel alto. R ESULTADOS Y D ISCUSIÓN 231 Figura IV.2.11. Superficie de respuesta del tiempo de extracción frente a la concentración del ácido para metilmercurio. Para alcanzar unas condiciones óptimas de extracción para ambos compuestos de forma simultánea se busca una solución de compromiso mediante una optimización multicriterio, como es la función de deseabilidad. Se eligieron funciones de deseabilidad individuales unilaterales por la izquierda buscando la maximización de la respuesta (figura IV.2.12). Figura IV.2.12. Funciones de deseabilidad individual para la optimización de las condiciones de MAE; A, metilmercurio; B, mercurio inorgánico. M ERCURIO EN MATERIAL BIOLÓGICO Y S EDIMENTOS 238 Las medidas obtenidas utilizando calibración con patrón interno (tabla IV.2.13 y IV.2.14) para metilmercurio y mercurio total están en concordancia con los valores certificados. Mostrando que el método es adecuado para la extracción de los compuestos de mercurio en muestras biológicas. También se estudió la exactitud del método optimizado para la determinación de compuestos de mercurio en s s edimentos mediante el análisis de los materiales de referencia CRM 580, PACS-2 y IAEA-356, que tiene diferentes contenidos de metilmercurio y mercurio total. El metilmercurio y mercurio inorgánico no se pueden cuantificar simultáneamente, debido a las diferencias de concentraciones en los materiales de referencia, como puede verse en la figura IV.2.15. Tiempo de retención (min) 3456 78910 0 50 100 150 200 250 300 Respuesta (unidades de emisión) A B 1 2 3 Figura IV.2.15. Cromatograma de GC-MIP-AES (línea de emisión de Hg a 254 nm) para la determinación de los compuestos de mercurio como especies feniladas en una muestra de material de referencia CRM 580; A, determinación de metilmercurio; B, determinación de mercurio inorgánico; 1, MeHg+; 2, EtHg+; 3, Hg2+. R ESULTADOS Y D ISCUSIÓN 239 En las tablas IV.2.15 y IV.2.16 pueden verse los resultados para los diferentes materiales de referencia. Tabla IV.2.15. Resultado del análisis de metilmercurio en materiales de referencia de sedimentos. Material Valor Certificado (ng.g-1) Valor Medido (n=6) (ng.g-1) Recuperación (%) (n=6) Porcentaje de metilación(a) (%) CRM 580 75,5 ± 3,7 141 ± 32 186 ± 42 0,04 PACS-2 - 366 ± 33 - - IAEA-356 5,46 ± 0,38 6,59 ± 0,66 120 ± 11 0,02 Expresado como Media ± límites de confianza del 95%, expresada en µg.g-1 como Hg, excepto para CRM 580, expresada en µg.g-1 como MeHg; (a) porcentaje estimado de metilación respecto al mercurio inorgánico; (valor medido MeHg (como Hg) – valor certificado MeHg (como Hg))/(valor certificado de Hg total – valor certificado como MeHg). Tabla IV.2.16. Resultado del análisis mercurio total en materiales de referencia de sedimentos. Material Valor Certificado (µg.g-1 como Hg) Valor Medido (a) (n=6) (µg.g-1 como Hg) Recuperación (%) (n=6) CRM 580 132 ± 3 124 ± 21 94 ± 16 PACS-2 3,04 ± 0,20 2,72 ± 0,66 83 ± 22 IAEA-356 7,62 ± 0,61 7,07 ± 1,46 93 ± 27 Expresado como Media ± límites de confianza del 95%; (a), calculados como la suma del metilmercurio y el mercurio inorgánico obtenido. Las medidas obtenidas utilizando calibración con patrón interno están en concordancia con los valores certificados de mercurio total (tabla IV.2.16). Sin embargo, se obtienen resultados de metilmercurio mayores que los valores certificados (tabla IV.2.15). Esto puede ser debido a una metilación del mercurio inorgánico12,13 que, incluso, aunque ocurra en una pequeña proporción (0,02-0,04%), produce sobreestimaciones en la determinación del metilmercurio de entre 20-90% o incluso mayores, M ERCURIO EN MATERIAL BIOLÓGICO Y S EDIMENTOS 240 debido a que el metilmercurio representa sólo entre el 0,5-1 % del mercurio total. Los valores de % de metilación obtenidos en este estudio son comparables con los obtenidos en diversos trabajos publicados12,13,14,15 en los últimos años utilizando diferentes técnicas de tratamiento de muestra y determinación como se indica en el aparatado I.2.2.5 de la introducción de esta memoria. Rodríguez Martín-Doimeadios y col.15 obtienen una metilación del 0,073% para el material de referencia certificado CRM 580 y del 0,111 % para el material de referencia certificado IAEA-356. Ambos materiales han sido usados también en este estudio y se han obtenido unos % de metilación del 0,04 y 0,02%, respectivamente. Para poder corregir este fenómeno de la metilación sería necesario el uso del método de la dilución isotópica específica de especies16 (SSID) en combinación con técnicas que permitan la determinación de isótopos (ICPMS o MS). Por lo tanto, la determinación de especies de mercurio en sedimentos se alcanzó mediante lixiviación ácida con energía de microondasderivatización con NaBPh4/extracción mediante SPME y determinación por GC-MIP-AES. El método fue validado con materiales de referencia certificados. Pero se produce una sobreestimación del metilmercurio debido, probablemente, a un proceso de metilación abiótica durante el proceso de pretratamiento de muestra. R ESULTADOS Y D ISCUSIÓN 241 1. Vázquez, M.J.; Abuín, M.; Carro, A.M.; Lorenzo, R.A.; Cela, R. Chemosphere 39 (1999) 1211-1224. 2. Abuín, M.; Carro, A.M.; Lorenzo, R.A. J. Chromatogr. A 889 (2000) 185-193. 3. Vazquez, M.J.; Carro, A.M.; Lorenzo, R.A.; Cela, R., Anal. Chem .6 6 9 (1997) 221225. 4. Tseng, C.M.; de Diego, A.; Martin, F.M.; Donard, O.F.X., J. Anal. At. Spectrom . 12 (1997) 629-635. 5. Rio Segade, S.; Tyson, J.F., Spectrochim. Acta, Part B 58 (2003) 797-807. 6. Cai, Y.; Bayona, J.P., J Chromatogr. A 696 (1995) 113-122. 7. Moens, L.; de Smaele T.; Dams, R.; van der Broeck,P.; Sandra, P., Anal. Chem . 69 (1997) 1604-1611. 8. Carro, A.M.; Neira, I.; Rodil, R.; Lorenzo, R.A. Chromatographia 56 (2002) 733738. 9. Nemrod for Windows 95 , LPRAI, Université Aix-Marselle III, Marsella. 10. Arthur, C.L.; Killan, L.M.; Bucholz, K.D.; Pawliszyn, J.; Berg, J.R., Anal.Chem .6 6 4 (1992) 1960-1966. 11. Tutschku, S.; Schantz, M.M.; Wise, S.A., Anal. Chem .7 7 4 (2002) 4694-4701. 12. Hintelmann, H.; Falter, R.; Ilgen, G.; Evans, R.D. Fresenius J. Anal. Chem .3 3 58 (1997) 363-370. 13. Lambertsson, L.; Lundberg, E.; Nilsson, M.; Frech, W., J. Anal. At. Spectrom .1 1 6 (2001) 1296-1301. 14. Qvarsnström, J.; Frech, W . , J. Anal. At. Spectrom .1 1 7 (2002) 1486-1491. M ERCURIO EN MATERIAL BIOLÓGICO Y S EDIMENTOS 242 15. Rodríguez Martín-Doimeadios, R.C.; Monperrus, M.; Krupp, E.; Amouroux, D.; Donard, O.F.X., Anal. Chem .7 7 5 (2003) 3202-3211. 16. Monperrus, M.; Krupp, E.; Amouroux, D.; Donard, O.F.X.; Martín-Doimeadios, R.C., Trends Anal. Chem .2 2 3 (2004) 261-272. R ESULTADOS Y D ISCUSIÓN 243 IV.3. DETERMINACIÓN DE PLAGUICIDAS ORGANOCLORADOS EN AGUA. MONITORIZACIÓN MEDIANTE COMPOSICIÓN ESTRATÉGICA DE MUESTRAS Es muy importante la determinación de plaguicidas organoclorados en agua mediante procedimientos analíticos que puedan identificarlos y cuantificarlos en el medio ambiente con altos niveles de seguridad, precisión y sensibilidad. La legislación o regulaciones1,2 concernientes a plaguicidas en muestras de agua de bebida aceptan valores de 0,5 µg.L-1 para plaguicidas totales y 0,1 µg.L-1 para plaguicidas individuales, exceptuando para heptacloro, aldrin y dieldrin cuyo valor límite es 0,03 µg.L-1. Este estudio se centró en la determinación de 8 plaguicidas organoclorados (α-HCH, γ-HCH, Heptacloro, Aldrin, 4,4’-DDT, αEndosulfan, Dieldrin y Endrin) y un compuesto que es un producto de degradación de plaguicidas (endrin cetona) mediante GC-ECD. Para la extracción de estos compuestos se han comparado dos materiales de extracción en fase sólida (SPE): cartuchos de carbón grafitizado3,4 (GCB) ENVI-Carb y de copolímeros de divinilbenceno-Nvinilpirrolidona5,6 (DVB-VP) OASIS HLB, que han demostrado ser adecuados para la extracción de estos compuestos de muestras de agua. Además, se realizó un estudio de composición de muestras utilizando diseños experimentales supersaturados para el cribado o screening medioambiental de los plaguicidas organoclorados en muestras de agua, demostrando su eficiencia y economía. Se compararon dos matrices: 30 OCP S EN AGUA . C OMPOSICIÓN E STRATÉGICA DE M UESTRAS 244 muestras individuales mediante 12 muestras compuestas, y 24 muestras individuales mediante 12 muestras compuestas. IV.3.1. MATERIAL Y MÉTODOS IV.3.1.1. PATRONES Los patrones comerciales utilizados fueron: α-HCH 99,5 %, 1000 µg.mL-1 en MeOH (Supelco) γ-HCH 99,9 %, 1000 µg.mL-1 en MeOH (Supelco) Heptacloro 96,4 %, 1000 µg.mL-1 en MeOH (Supelco) Aldrin 99,0 %, 5000 µg.mL-1 en MeOH (Supelco) 4,4’-DDT 98,4 %, 5000 µg.mL-1 en MeOH (Supelco) α-Endosulfan 99,8 % (Riedel de Häen) Dieldrin 98,0 % (Supelco) Endrin 98,8 % (Riedel de Häen) Endrin cetona 98,5 % (Supelco) A partir de estos patrones comerciales se prepararon disoluciones de los patrones de cada compuesto de una concentración de 100 µg.mL-1 por pesada en metanol, excepto para el endrin cetona, que se preparó en tolueno-hexano (1:1). Las disoluciones mezcla de trabajo en el rango de 5-100 ng.mL-1 se prepararon por pesada y dilución de las disoluciones individuales de los 9 compuestos objeto de estudio (α-HCH, γ-HCH, Heptacloro, Aldrin, 4,4’- DDT, α-Endosulfan, Dieldrin, Endrin y Endrin cetona) en diclorometanometanol (9:1) y en acetato de etilo, dependiendo del adsorbente de SPE R ESULTADOS Y D ISCUSIÓN 245 empleado en el proceso de preparación de muestra. Todas las disoluciones se conservaron a -20ºC y protegidas de la luz. IV.3.1.2. MUESTRAS Las muestras utilizadas fueron de agua milli-Q con la correspondiente adición de los compuestos de interés. Estas muestras fueron conservadas a -4 ºC hasta el momento de su análisis. IV.3.1.3. OTRAS DISOLUCIONES La disolución de ácido ascórbico 10 g.L-1 para el acondicionamiento de los cartuchos de carbón grafitizado (GCB) ENVI-Carb se preparó en agua milli-Q, comprobando que el pH de la disolución final era de 2,9. IV.3.1.4. CONDICIONES INSTRUMENTALES DE MEDIDA La separación de los compuestos se realizó utilizando un cromatógrafo de gases HP 5890 Series II Plus con un Detector de captura electrónica. La adquisición y procesado de datos se llevaron a cabo con el software HP 9144 Chemstation. Los compuestos se separaron en una columna cromatográfica capilar SPB-5 de 30 m de longitud x 0,32 mm diámetro interno (0,25 µm de espesor de fase). Las condiciones experimentales de medida aparecen resumidas en la tabla IV.3.1. OCP S EN AGUA . C OMPOSICIÓN E STRATÉGICA DE M UESTRAS 246 Tabla IV.3.1. Condiciones experimentales de medida del sistema GC-ECD para la determinación de plaguicidas organoclorados. Sistema cromatográfico (GC-ECD) Temperatura del inyector 250ºC Modo de Inyección Splitless Volumen de inyección 3µL Tiempo de purga 60 s Relación de split 1:9 Flujo de gas portador de nitrógeno 3,6 mL/min-1 Programa Cromatográfico: Temp. Inicial (tiempo inicial) 100 ºC (2 min) Rampa 1 3 ºC.min-1 Temp. Final 1 (tiempo final 1) 230 ºC (0 min) Rampa 2 10 ºC.min-1 Temp. Final 2 (tiempo final) 280 ºC (10 min) Temperatura del detector 285 ºC Presión de N2 de make-up 20 psi IV.3.1.5. EXTRACCIÓN DE LAS MUESTRAS La extracción de los plaguicidas organoclorados de las muestras se realizó mediante extracción en fase sólida (SPE) evaluando dos tipos de fases. Por lo tanto, se utilizaron dos procedimientos de extracción de muestras (figura IV.3.1). R ESULTADOS Y D ISCUSIÓN 247 Inyección de 3 µLen el GC-ECD Enrasado a 1 mL con DCM/MeOH (9/1) Acondicionado de los cartuchos Paso de muestra a través de los cartuchos (extracción) Secado de los cartuchos con corriente N 2 (14 psi) Elución de los compuestos Concentración en corriente de nitrógeno Extracto final ENVI-Carb OASIS HLB 5 mL DCM/MeOH (9/1) 2 mL MeOH 15 mL ácido ascórbico inversa 15 min (inverso) 20 min (directo) 5 mL DCM/MeOH (9/1) A 0.5 mL 2 mL MeOH 2 mL agua milli-Q directa 30 min (directo) A sequedad Reconstitución en AcOEt 3 mL AcOEt Figura IV.3.1. Esquema de preparación de muestra para la determinación de plaguicidas organoclorados en agua. IV.3.1.5.1. Cartuchos de carbón grafitizado (GCB) ENVI-Carb En la extracción con cartuchos de carbón grafitizado4 (GCB) ENVICarb, se usa un volumen de muestra de 1500 mL, con la adición de los analitos en metanol. En las extracciones realizadas con los cartuchos ENVICarb no es necesario al ajuste del pH de las muestras, la retención de los analitos se produce de manera eficaz al pH del agua milli-Q (aproximadamente 5,5). El proceso de extracción consta de las siguientes etapas: OCP S EN AGUA . C OMPOSICIÓN E STRATÉGICA DE M UESTRAS 254 A continuación, se prepararon las muestras compuestas siguiendo la matriz 12x30 (tabla IV.3.2), se mezclaron manualmente alícuotas de 50 mL de las muestras individuales correspondientes y, se llevaron a un mismo volumen final de 1,5 L. Todas estas muestras, tanto las individuales como las compuestas, se sometieron al proceso de SPE con cartuchos ENVI-Carb, siguiendo el procedimiento indicado en el apartado IV.3.1.5.1 y se analizaron mediante GC-ECD. IV.3.1.6.2. Lote 2: Matriz 12x24 Se prepararon las muestras individuales en 24 botellas de 0,5 L con agua milli-Q, se numeraron y algunas fueron contaminadas a dos niveles, uno por debajo y otro por encima del límite máximo de la legislación1, ambos por debajo de 350 ng.L-1. Estas muestras contaminadas fueron analizadas individualmente para poder comparar los resultados con los obtenidos mediante la composición de muestras. La construcción de las muestras compuestas se llevó a cabo siguiendo la matriz 12x24 (tabla IV.3.3). El proceso de mezcla se realizó de manera automatizada usando un compositor de muestras automático, tomando alícuotas de 12,5 mL de las muestras individuales. Las muestras compuestas no se llevaron a un volumen final específico, ya que no es necesario tener un volumen constante en las muestras compuestas para la resolución de la matriz supersaturada, evitando así una dilución innecesaria de las muestras. R ESULTADOS Y D ISCUSIÓN 255 La extracción de los analitos de todas las muestras se llevó acabo mediante SPE con cartuchos OASIS HLB según el procedimiento del apartado IV.3.1.5.2 y a continuación se analizaron mediante GC-ECD. IV.3.2. RESULTADOS Y DISCUSIÓN IV.3.2.1. IDENTIFICACIÓN DE LOS COMPUESTOS Los compuestos se identificaron inyectando los patrones individuales en el sistema GC-ECD. En las condiciones experimentales del sistema GCECD descritas en el apartado IV.3.1.4 se obtiene una buena separación de los 9 plaguicidas organoclorados estudiados. En la figura IV.3.4 se presenta un cromatograma de un patrón de los plaguicidas organoclorados de 50 ng.mL-1 y en la tabla IV.3.4 se muestran los tiempos de retención para cada compuesto. Tabla IV.3.4. Tiempos de retención de los plaguicidas organoclorados estudiados. Compuestos Tiempo de retención/min α-BHC 18,8 γ-BHC 21,0 Heptacloro 25,6 Aldrin 27,8 α-endosulfan 32,6 Dieldrin 34,3 Endrin 35,5 4,4'-DDT 39,5 Endrin cetona 41,4 OCP S EN AGUA . C OMPOSICIÓN E STRATÉGICA DE M UESTRAS 256 Tiempo de retención /min 20 25 30 35 40 Respuesta 10000 20000 30000 40000 50000 60000 1 2 3 4 5 6 7 8 9 Figura IV.3.4.Cromatograma de GC-ECD para la identificación de los plaguicidas organoclorados (50 ng.mL-1); 1, α-HCH; 2, γ-HCH; 3, heptacloro; 4, aldrin; 5, αendosulfan; 6, dieldrin; 7, endrin; 8, 4,4’-DDT; 9, endrin cetona. IV.3.2.2. VALIDACIÓN DE LOS MÉTODOS ANALÍTICOS En las tablas IV.3.5 y IV.3.6 aparecen recogidos los parámetros analíticos de los métodos de extracción utilizados, tanto para la SPE utilizando cartuchos ENVI-Carb como OASIS HLB, según la descripción del apartado IV.3.1.5. La calibración se realizó en el rango 5-100 ng.mL-1, con 5 niveles inyectados por triplicado, y obteniéndose una buena linealidad en el rango estudiado. Se han obtenido unos coeficientes de correlación mayores de 0,9976 en todos los casos, pasando el test de linealidad y el test de falta de ajuste al 95% de probabilidad cuando se realiza el análisis de varianza. R ESULTADOS Y D ISCUSIÓN 257 Los datos de recuperación y precisión para muestras de 10-20 ng.L-1 fueron aceptables, entre 67-102% y 4,6-9,8% cuando se usaron los cartuchos ENVI-Carb y entre 93-117% y 2,8-16,4% para los cartuchos OASIS HLB. Los límites de cuantificación, calculados como 10 veces la relación señal/ruido, estuvieron muy por debajo de los límites legales máximos para estos compuestos, y fueron lo suficiente altos como para poder realizar las diluciones impuestas por la composición de muestras, entre 4,7 y 10,1 ng.L-1 para cartuchos de ENVI-Carb y entre 0,7 y 12,8 ng.L-1 para OASIS HLB. Tabla IV.3.5. Parámetros de validación del método de determinación de los plaguicidas organoclorados mediante SPE con cartuchos ENVI-Carb y GC-ECD. Compuesto Linealidad / r(a) Recuperación / %(b) Repetibilidad / C.V. % (c) LODs / ng.L-1 (d) LOQs / ng.L-1 (e) α-BHC 0,9994 88 6,2 2,1 7,0 γ-BHC 0,9994 102 9,4 1,9 6,5 Heptacloro 0,9990 85 8,4 1,7 5,8 Aldrin 0,9996 83 9,5 1,8 6,1 α-endosulfan 0,9997 87 4,6 1,7 5,7 Dieldrin 0,9994 72 8,2 1,4 4,7 Endrin 0,9988 75 6,8 3,1 10,1 4,4'-DDT 0,9985 80 9,8 1,7 5,9 Endrin cetona 0,9976 67 9,4 2,9 9,7 (a) Calibración a 5 niveles (5-100 ng.L-1); (b) Recuperación para una muestra de 1020 ng.L-1 de cada compuesto (n = 6); (c) muestra de 20 ng.L-1 (n = 5); (d) definidos para una relación señal/ruido (S/N) de 3; (e) definidos para una relación S/N de 10. OCP S EN AGUA . C OMPOSICIÓN E STRATÉGICA DE M UESTRAS 258 Tabla IV.3.6. Parámetros de validación del método de determinación de los plaguicidas organoclorados mediante SPE con cartuchos OASIS HLB y GC-ECD. Compuesto Linealidad / r(a) Recuperación / %(b) Repetibilidad / C.V. % (c) LODs / ng.L-1 (d) LOQs / ng.L-1 (e) α-BHC 0,9999 95 5,2 0,5 1,5 γ-BHC 0,9999 117 2,8 0,6 2,0 Heptacloro 0,9995 109 4,2 1,0 3,3 Aldrin 0,9999 95 16,4 0,7 2,4 α-endosulfan 0,9999 97 8,4 0,2 0,8 Dieldrin 0,9999 100 4,9 0,2 0,7 Endrin 0,9989 110 10,8 1,0 3,3 4,4'-DDT 0,9982 93 6,5 3,8 12,8 Endrin cetona 0,9979 109 7,3 0,5 1,8 (a) Calibración a 5 niveles (5-100 ng.L-1); (b) Recuperación para una muestra de 1020 ng.L-1 de cada compuesto (n = 6); (c) muestra de 20 ng.L-1 (n = 5); (d) definidos para una relación señal/ruido (S/N) de 3; (e) definidos para una relación S/N de 10. Las dos fases resultan adecuadas para la determinación de los plaguicidas organoclorados en aguas. Los cartuchos OASIS HLB presentan mejores recuperaciones, y la reducción del consumo de muestra y disolvente es considerable. IV.3.2.3. COMPOSICIÓN DE MUESTRAS Para poder comparar los resultados obtenidos en la composición de muestras, en primer lugar se analizaron las muestras contaminadas individuales. A continuación, se prepararon las muestras compuestas y se analizaron. Por último, los resultados se procesaron usando el software Gamich para obtener las concentraciones estimadas de cada compuesto en cada muestra individual. R ESULTADOS Y D ISCUSIÓN 259 IV.3.2.3.1. Análisis de muestras individuales Todas las muestras individuales contaminadas fueron analizadas siguiendo los procedimientos del apartado IV.3.1.5, para el lote 1 (matriz 12x30) utilizando el cartucho ENVI-Carb y para el lote 2 (matriz 12x24) el cartucho OASIS HLB. En las tablas IV.3.7 y IV.3.8 se muestran los resultados obtenidos en el análisis de las muestras individuales del lote 1 y del lote 2, respectivamente. Tabla IV.3.7. Resultados obtenidos en el análisis de las muestras individuales contaminadas del lote 1. α-BHC γ-BHC Heptacloro Aldrin αendosulfan Dieldrin Endrin 4,4'- DDT Endrin cetona 1 nd nd nd nd nd nd nd nd nd 2 297,3 nd nd nd 19,5 nd nd nd nd 3 nd nd 14,7 nd nd nd nd nd nd 4 nd nd nd nd nd nd nd nd nd 5 nd 309,8 nd nd nd nd 72,5 nd nd 6 nd nd 51,7 nd nd nd nd 392,1 nd 7 nd nd nd nd nd nd nd nd nd 8 nd nd nd 277,5 nd nd nd nd nd 9 nd nd nd nd nd nd nd nd nd 10 nd nd nd nd 380,8 nd nd nd nd 11 nd 59,1 nd nd nd nd nd nd 396,7 12 nd nd nd nd nd nd nd nd nd 13 nd 921,9 nd nd 676,9 nd nd nd nd 14 nd nd nd nd nd nd nd nd nd 15 nd nd 103,4 nd nd nd 309,0 nd nd 16 nd nd 351,4 nd nd nd nd nd nd 17 nd nd nd nd nd nd nd nd 904,4 18 nd nd nd nd nd nd nd nd nd 19 nd nd nd nd 262,4 353,8 nd nd nd OCP S EN AGUA . C OMPOSICIÓN E STRATÉGICA DE M UESTRAS 260 Tabla IV.3.7. Resultados obtenidos en el análisis de las muestras individuales contaminadas del lote 1. α-BHC γ-BHC Heptacloro Aldrin αendosulfan Dieldrin Endrin 4,4'- DDT Endrin cetona 20 nd nd nd nd nd nd nd nd nd 21 805,6 nd nd nd nd 17,2 nd nd nd 22 nd nd nd 70,5 nd nd nd nd nd 23 nd nd nd nd nd nd nd nd nd 24 nd nd nd nd nd nd nd 66,5 nd 25 nd nd nd nd nd nd nd nd nd 26 880,5 nd nd 14,1 nd nd nd nd nd 27 nd nd nd nd nd 939,8 nd nd nd 28 nd nd nd nd nd nd nd nd nd 29 nd nd nd nd nd nd 379,7 nd nd 30 nd nd nd nd nd nd nd 320,6 71,5 Todas las concentraciones están expresadas en ng.L-1, nd = no detectado. Tabla IV.3.8. Resultados obtenidos en el análisis de las muestras individuales contaminadas del lote 2. α-BHC γ-BHC Heptacloro Aldrin αendosulfan Dieldrin Endrin 4,4'- DDT Endrin cetona 1 nd nd nd nd nd nd nd nd nd 2 nd nd nd nd 202,7 nd nd nd 54,7 3 nd nd nd nd nd nd nd nd nd 4 nd nd nd nd nd nd nd nd nd 5 306,9 nd nd nd nd nd 73,1 nd nd 6 nd 294,0 35,3 nd nd nd nd nd nd 7 nd nd nd nd nd nd nd nd nd 8 nd nd 146,0 nd nd nd nd 83,4 nd 9 nd nd nd nd nd nd nd nd nd 10 nd nd nd nd nd nd nd nd nd 11 nd nd nd nd nd nd nd nd nd 12 nd nd nd nd nd nd nd nd nd 13 nd nd nd nd 91,4 313,2 nd nd nd 14 nd nd nd nd nd nd nd nd nd R ESULTADOS Y D ISCUSIÓN 261 Tabla IV.3.8. Resultados obtenidos en el análisis de las muestras individuales contaminadas del lote 2. α-BHC γ-BHC Heptacloro Aldrin αendosulfan Dieldrin Endrin 4,4'- DDT Endrin cetona 15 115,5 nd nd nd nd nd nd 192,2 nd 16 nd 98,2 nd 68,4 nd nd nd nd nd 17 nd nd nd nd nd nd nd nd nd 18 nd nd nd nd nd nd nd nd nd 19 nd nd nd nd nd nd nd nd nd 20 nd nd nd 10,8 nd nd 141,0 nd nd 21 nd nd nd nd nd nd nd nd nd 22 nd nd nd nd nd 210,1 nd nd 291,9 23 nd nd nd nd nd nd nd nd nd 24 nd nd nd nd nd nd nd nd nd Todas las concentraciones están expresadas en ng.L-1, nd = no detectado. IV.3.2.3.2. Análisis de las muestras compuestas Las muestras compuestas se prepararon siguiendo las matrices supersaturadas de las tablas IV.3.2 y IV.3.3, en el primer caso se hizo manualmente y en el segundo de manera automática utilizando un compositor de muestras automático. Este compositor no pudo usarse en el primer caso debido a que la capacidad máxima de los recipientes del compositor eran 300 mL y el volumen final de las muestras era mucho mayor (1,5 L). La automatización representa una clara ventaja debido a que se evitan posibles errores en la preparación de las muestras compuestas y además libra al analista de un trabajo tedioso. El compositor está controlado por el software Gamich y consiste, como puede verse en la figura IV.3.5, en dos muestreadotes giratorios y un dispensador automático con una jeringa de 10 mL. Permite la manipulación de 19 muestras individuales y 19 muestras OCP S EN AGUA . C OMPOSICIÓN E STRATÉGICA DE M UESTRAS 262 compuestas, en caso de necesitar más muestras individuales el sistema se para cuando acaba con la 19 y alerta al analista para que sustituya las muestras por las nuevas. Una limitación importante es el volumen total de las muestras compuestas, ya que los tubos tienen una capacidad máxima de 300 mL. Figura IV.3.5. Equipo para la preparación automática de las muestras compuestas. Una vez realizada la composición estratégica de muestras se analizaron las muestras compuestas, siguiendo los correspondientes métodos analíticos, según el apartado IV.3.1.5 utilizando para el análisis del lote 1 (matriz 12x30) cartuchos ENVI-Carb y para el lote 2 (matriz 12x21) los cartuchos OASIS HLB. Los resultados aparecen recogidos en las tablas IV.3.9 y IV.3.10. R ESULTADOS Y D ISCUSIÓN 263 Tabla IV.3.9. Resultados obtenidos en el análisis de las muestras compuestas de la matriz 12x30. α-BHC γ-BHC Heptacloro Aldrin αendosulfan Dieldrin Endrin 4,4'- DDT Endrin cetona MC1 42,4 8,8 nd 15,7 12,5 nd 30,0 38,4 34,5 MC2 23,8 24,3 5,4 nd 34,3 28,1 40,6 nd 31,0 MC3 27,4 11,3 3,2 8,2 18,6 12,9 31,5 66,1 15,4 MC4 37,6 28,8 15,0 15,9 22,1 27,5 28,1 38,7 7,9 MC5 121,9 39,2 15,4 8,9 26,8 31,6 nd 4,2 11,3 MC6 41,9 4,0 6,1 8,5 9,1 12,6 14,1 57,4 46,5 MC7 32,9 151,3 3,1 13,5 31,3 42,8 3,8 68,4 5,3 MC8 9,2 3,9 19,9 nd 11,4 47,2 50,1 22,3 17,7 MC9 49,1 nd 20,4 16,2 12,5 nd 12,4 23,8 31,4 MC10 51,4 11,0 19,7 7,8 10,9 13,3 15,6 nd 29,7 MC11 9,3 60,2 3,4 13,7 44,9 nd 4,4 22,8 12,0 MC12 143,6 66,1 21,8 22,7 60,7 49,6 58,6 75,5 59,7 Todas las concentraciones están expresadas en ng.L-1, nd = no detectado. Tabla IV.3.10. Resultados obtenidos en el análisis de las muestras compuestas de la matriz 12x24. α-BHC γ-BHC Heptacloro Aldrin αendosulfan Dieldrin Endrin 4,4'- DDT Endrin cetona MC1 nd 28,7 10,2 6,2 nd 5,6 13,7 13,9 18,3 MC2 18,8 8,9 nd 4,8 4,9 14,5 12,8 nd 18,6 MC3 nd nd nd nd 14,8 nd nd nd 6,4 MC4 34,9 nd nd nd 15,6 12,9 8,6 21,9 25,3 MC5 13,2 30,6 16,9 4,2 5,9 34,6 13,5 23,8 19,9 MC6 14,7 35,8 15,4 5,3 nd nd nd 25,3 nd MC7 37,6 10,9 nd 4,5 5,7 26,7 8,6 20,5 nd MC8 nd nd 18,2 4,0 6,5 32,4 13,0 16,6 nd MC9 30,4 32,1 11,4 4,4 17,0 11,0 21,9 nd 33,1 MC10 12,7 10,6 nd 4,2 21,0 32,3 nd 18,0 6,1 MC11 33,9 33,7 23,4 nd 19,2 nd 9,7 18,9 8,2 MC12 17,8 15,4 4,7 2,5 10,7 15,5 9,9 11,6 13,8 Todas las concentraciones están expresadas en ng.L-1, nd = no detectado. OCP S EN AGUA . C OMPOSICIÓN E STRATÉGICA DE M UESTRAS 270 (i) 0 200 400 600 800 1000 123456789101112131415161718192021222324252627282930 Muestras Concentración (ng/L) Figura IV.3.6. Resultados comparativos en el lote 1 para (i) Endrin cetona. Esperado = concentración esperada en las muestras en función de la cantidad adicionada de cada plaguicida; Encontrado = concentración medida individualmente en cada muestra; Predicho = resultados de concentración predichos por la composición estratégica de muestras usando la matriz 12x30 (tabla IV.3.2). Mediante la composición estratégica de muestras utilizando la matriz 12x24 (tabla IV.3.3) las muestras individuales contaminadas son detectadas correctamente y las estimaciones de los valores de concentración son buenas como puede verse en las figuras IV.3.7, especialmente para heptacloro, α-endosulfan, dieldrin y endrin cetona. En algunos casos aparecen falsos positivos, como en el caso de α-HCH, γ-HCH, aldrin, endrin 4,4’-DDT. R ESULTADOS Y D ISCUSIÓN 271 (a) 0 50 100 150 200 250 300 350 400 450 500 123456789101112131415161718192021222324 Muestras Concentración(ng/L) Esperado Encontrado Predicho (b) 0 100 200 300 400 500 1 2 3 4 5 6 7 8 9 101112131415161718192021222324 Muestras Concentración (ng/L) (c) 0 100 200 300 400 500 123456789101112131415161718192021222324 Muestras Concentración (ng/L) Figura IV.3.7. Resultados comparativos en el lote 2 para (a) α-HCH; (b) γ-HCH; (c) Heptacloro. Esperado = concentración esperada en las muestras en función de la cantidad adicionada de cada plaguicida; Encontrado = concentración medida individualmente en cada muestra; Predicho = resultados de concentración predichos por la composición estratégica de muestras usando la matriz 12x24 (tabla IV.3.3). OCP S EN AGUA . C OMPOSICIÓN E STRATÉGICA DE M UESTRAS 272 (d) 0 100 200 300 400 500 123456789101112131415161718192021222324 Muestras Concentración (ng/L) (e) 0 100 200 300 400 500 1 2 3 4 5 6 7 8 9 101112131415161718192021222324 Muestras Concentración (ng/L) (f) 0 100 200 300 400 500 1 2 3 4 5 6 7 8 9 101112131415161718192021222324 Muestras Concentración (ng/L) Figura IV.3.7. Resultados comparativos en el lote 2 para (d) Aldrin; (e) 4,4’-DDT; (f) αEndosulfan. Esperado = concentración esperada en las muestras en función de la cantidad adicionada de cada plaguicida; Encontrado = concentración medida individualmente en cada muestra; Predicho = resultados de concentración predichos por la composición estratégica de muestras usando la matriz 12x24 (tabla IV.3.3). R ESULTADOS Y D ISCUSIÓN 273 (g) 0 100 200 300 400 500 123456789101112131415161718192021222324 Muestras Concentración (ng/L) (h) 0 100 200 300 400 500 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14 15 16 17 18 19 20 21 22 23 24 Muestras Concentración (ng/L) (i) 0 100 200 300 400 500 123456789101112131415161718192021222324 Muestras Concentración (ng/L) Figura IV.3.7. Resultados comparativos en el lote 2 para (g) Dieldrin; (h) Endrin; (i) Endrin cetona. Esperado = concentración esperada en las muestras en función de la cantidad adicionada de cada plaguicida; Encontrado = concentración medida individualmente en cada muestra; Predicho = resultados de concentración predichos por la composición estratégica de muestras usando la matriz 12x24 (tabla IV.3.3). OCP S EN AGUA . C OMPOSICIÓN E STRATÉGICA DE M UESTRAS 274 Es necesario establecer un criterio para considerar la importancia de los falsos positivos y falsos negativos encontrados. Este criterio puede ser en función del límite de cuantificación o de detección o incluso respecto a los límites de la legislación europea1, es decir 100 ng.L-1 para cada plaguicida. Por lo tanto, valores obtenidos por debajo del límite de cuantificación o detección se pueden considerar como muestras no contaminadas. Normalmente lo que resulta interesante es conocer la contaminación de las muestras respecto al límite legal (MRL). En este caso, las muestras con valores mucho más grandes que este límite se consideran que están contaminadas y claramente por debajo de este límite se consideran no contaminadas. Las muestras contaminadas entre estas dos bandas se consideran sospechosas de estar contaminadas, por lo tanto aquellas muestras cuyo valor esté en la cercanía del límite legal deben ser reanalizadas individualmente para confirmar su posible contaminación. Usando estos criterios se calcularon las proporciones de falsos positivos y falsos negativos, así como la proporción de éxito en la predicción para los dos lotes de muestras, para poder comparar los resultados. A la vista de los datos de la tabla IV.3.13, los resultados del Lote 2 son mejores que los del 1. Esto en parte es debido a la mayor dilución a la que se ven sometidas las muestras del lote 1, como consecuencia de la matriz 12x30, y que el método presenta mayores límites de cuantificación (tabla IV.3.5). En la mayoría de los casos los datos de concentración en las R ESULTADOS Y D ISCUSIÓN 275 muestras compuestas se encuentran entre el límite de detección y de cuantificación, por lo que el error experimental en el lote 1 puede comprometer seriamente los resultados de la composición estratégica de muestras para cada una de las muestras individuales, principalmente en aquellas con una concentración cercana al límite legal máximo. Esto se aprecia en un pequeño porcentaje de falsos positivos y falsos negativos. En el caso del lote 2, la dilución no compromete los resultados en las muestras compuestas, ya que los valores de concentración en las muestras compuestas están por encima del límite de cuantificación. Por lo tanto, se pueden ver claramente las ventajas de la composición estratégica de muestras frente al análisis de las muestras individuales, pues se obtiene una buena estimación de los niveles de concentración en las muestras mientras reduce a la mitad el número de análisis. Tabla IV.3.13. Evaluación de la eficiencia de las predicciones mediante la composición estratégica de muestras para las muestras del lote 1 y 2, teniendo en cuenta diferentes criterios. Lote 1 LODs LOQs MRLs Éxito (%) 79,3 83,0 95,6 Falsos Positivos (%) 20,0 16,3 4,1 Falsos Negativos (%) 0,7 0,7 0,3 Lote 2 LODs LOQs MRLs Éxito (%) 95,8 95,8 99,1 Falsos Positivos (%) 4,2 4,2 0,0 Falsos Negativos (%) 0,0 0,0 0,9 Por lo tanto, la composición de muestras estratégica es una herramienta que reduce el número de análisis que tienen que realizarse, reduciendo por lo tanto el coste y el tiempo requerido. OCP S EN AGUA . C OMPOSICIÓN E STRATÉGICA DE M UESTRAS 276 Además, el uso de equipos automatizados para la preparación de las muestras compuestas, tal como se observa con los resultados obtenidos con el lote 2, evita errores humanos y procedimientos de trabajo tediosos. Dependiendo del método de extracción y de sus límites de detección y cuantificación se pueden construir matrices de diferentes tamaños, obteniendo resultados robustos con matrices con una relación filascolumnas 1:2, siendo no recomendable superar una relación 1:3. Esto es debido a que al aumentar la relación filas-columnas se produce un mayor número de factores (muestras individuales) correlacionados, por lo que el software Gamich encontrará más dificultades para alcanzar un óptimo global. 1. Directiva 80/778/CEE del Consejo, de 15 de julio de 1980, relativa a la calidad de las aguas destinadas al consumo humano, Diario Oficial de las Comunidades Europeas n° L 229, 30/08/1980, p. 0011 – 0029. 2. Clean Water Act, codification 33 U.S.C. 1251-et seq., P.L. 95-217, Dec.28, 1977, Water Quality Act P.L. 100-4, Feb 4, 1987, amendments 1997. 3. Di Corcia, A.; Samperi, R.; Marcomini, R.; Stelluto, S., Anal. Chem. 65 (1993) 907-912. 4. Carro, A.M.; Cobas, J.C.; Rodríguez, J.B.; Lorenzo, R.A.; Cela, R., J. Anal. At. Spectrom. 14 (1999) 1867-1873. 5. Piedra, L.; Tejedor, A.; Hernando, M.D.; Aguera, A.; Barceló, D.; FernándezAlba, A., Chromatographia 52 (2000) 631-638. 6. Lacassie, E.; Marquet, D.; Gaulier, J.M.; Dreyfuss, M.F.; Lachâtre, G., Forensic Sci. Int. 121 (2001) 116-125. R ESULTADOS Y D ISCUSIÓN 277 7. Jiménez, J.J.; Bernal, J.L.; del Nozal, M.J.; Toribio, L.; Arias, E., J. Chromatogr. A 919 (2001) 147-156. 8. Cela, R.; Martínez, E.; Carro, A.M., Chemom. Intell. Lab. Sys. 52 (2000) 167182. 9. Martínez, E., Composición de muestras mediante Diseño experimental. Aplicaciones en Química Analítica Ambiental. Tesis Doctoral. Universidad de Santiago de Compostela (2001). 10. Cela, R.; Martínez, E.; Carro, A.M., Chemom. Intell. Lab. Sys. 57 (2001) 72-92. R ESULTADOS Y D ISCUSIÓN 279 IV.4. DETERMINACIÓN DE PIRORRETARDANTES ORGANOFOSFORADOS Y PLASTIFICANTES Y DE SUS POSIBLES PRODUCTOS DE DEGRADACIÓN EN AGUAS MEDIANTE CROMATOGRAFÍA LÍQUIDA-ESPECTROMETRÍA DE MASAS EN TÁNDEM En este trabajo se pone a punto un método para la determinación de pirorretardantes organofosforados y plastificantes en aguas mediante extracción en fase sólida (SPE) y cromatografía líquida-espectrometría de masas en tandem (LC-MS/MS). Se determinaron 11 compuestos organofosforados, 4 trialquilfosfatos, 3 tricloroalquilfosfatos, 1 triarilfosfato, 2 bisfosfatos y un intermediario sintético, el óxido de trifenilfosfina. La cromatografía líquida elimina algunos problemas presentes en la cromatografía de gases1,2,3,4 para la determinación de estos compuestos, como son las colas en los picos (TPPO) y las dificultades de análisis de nuevos pirorretardantes fosforados poco volátiles (RDP y BDP). También, se ha intentado la identificación y determinación de sus productos de hidrólisis, posibles metabolitos de degradación, principalmente los mono-/dialquil-/arilfosfatos en muestras de agua; algunos de estos compuestos se producen industrialmente como DnBP5, MEHP y DEHP6. Para ello, se ha utilizando LC-MS/MS mediante formación de par iónico con tributilamonio (TrBA), evitando así el paso necesario de derivatización para su análisis mediante cromatografía de gases7. El análisis de estos compuestos en muestras de agua es importante para poder controlar sus concentraciones en el medio, ya que el agua TAP S Y SIUS PRODUCTOS DE HIDRÓLISIS EN AGUA 286 Tabla IV.4.4. Condiciones experimentales de la separación mediante LC para la determinación diéstery monoéster del ácido fosfórico. Cromatógrafo de Líquidos (LC) Volumen de inyección 50 µl Flujo 0,20 mL.min-1 Temperatura de la columna 45 ºC Eluyente A MeOH-H2O (20:80), 1 mM TrBA, 1 mM HAc Eluyente B MeOHH2O (95:5), 1 mM TrBA, 1 mM HAc Gradiente 0 min 25% B 0,5 min 40% B 15 min 48% B 16 min 100% B 18 min 100% B 19 min 25% B 28 min 25% B La detección se realizó mediante ionización con electrospray espectrometría de masas en tándem (ESI-MS/MS) en modo negativo. Los parámetros comunes mediante multiple reaction monitoring (MRM) aparecen reflejados en la tabla IV.4.5, y los parámetros de medida óptimos para cada uno de los compuestos aparecen en la tabla IV.4.6. Tabla IV.4.5. Parámetros comunes óptimos del sistema ESI-MS/MS para la determinación de los monoy diésteres del ácido fosfórico. Parámetro Valor Modo de ionización negativo Voltaje del capilar 3,0 kV Temperatura de la fuente 120 ºC Temperatura de desolvatación 200 ºC Flujo del gas de nebulización 100 L.h-1 Flujo del gas de secado 700 L.h-1 Presión del gas de colisión (Ar) 1,0. 10-3 mbar R ESULTADOS Y D ISCUSIÓN 287 Tabla IV.4.6. Parámetros individuales óptimos del sistema ESI-MS/MS para la determinación de mono-/diésteres del ácido fosfórico. Comp. Formula empírica tr / min Transiciones MRM (a) Ion Producto Propuesto Tr. 1 / Tr.2 (b) MCPP C3H8ClO4P 4,4 173(40) > 137(8) 175(40) > 137(8) [M – H – HCl]- [M – H – HCl]- 2,8 MiBP MnBP C4H11O4P 4,7 153(50) > 79(14) [PO3]- MPhP C6H7O4P 5,1 173(20) > 79(12) [PO3]- MBEP C6H15O5P 7,4 197(50) > 79(16) [PO3]- DCEP C4H9O4PCl2 7,9 221(25) > 35(8) 223(25) > 37(8) [Cl]- [Cl]- 2,4 DCPP C6H13O4PCl211,4 249(30) > 35(8) 251(30) > 37(8) [Cl]- [Cl]- 2,3 DiBP C8H19O4P 13,3 209.1(25) > 79(22) 209.1(25) > 152(14) [PO3]- [M - H – C4H8]- 2,3 DnBP C8H19O4P 14,0 209.1(25) – 79(22) 209.1(25) – 152(14) [PO3]- [M - H – C4H8]- 2.3 DPhP C12H11O4P 14,6 249(35) > 93(26) 249(35) > 155(20) [PhO]- [M – PhOH]- 9,8 MEHP C8H19O4P 15,8 209(50) > 79(14) [PO3]- DBzP C14H15O4P 18.8 277.06(45) > 79(32) [PO3]- DBEP C12H27O6P 20,0 297(50) > 79(24) 297(50) > 197(18) [PO3]- [M-H – C6H14]- 5,0 DEHP C16H37O4P 23,4 321.2(25) > 79(26) 321.2(25) > 209(22) [PO3]- [M – H – C8H16]- 4,6 (a) Ion precursor (voltaje del cono/V) > Ion producto (energía de colisión/eV); (b) Relación de intensidades entre las dos transiciones. TAP S Y SIUS PRODUCTOS DE HIDRÓLISIS EN AGUA 288 IV.4.1.6. PREPARACIÓN DE MUESTRAS En primer lugar, se filtraron las muestras, excepto las de agua ultrapura (ELGA), mediante un equipo de filtración bajo presión de nitrógeno, a través de un filtro de celulosa de 0,45 µm de diámetro de poro. La extracción de las muestras se realizó mediante extracción en fase sólida (SPE) en un sistema de extracción automatizado, modelo Autotrace SPE Workstation, que permite la extracción simultanea de seis muestras, como se muestra en la figura IV.4.1. Muestra Triester del ácido fosfórico Mono-/ Diester del ácido fosfórico Volumen: 100 mL Filtración 0,45 µm Volumen: 100 mL Filtración 0,45 µm Formación par iónico: 11 mL tampón TrBA Extracción en fase sólida (SPE) Cartuchos: OASIS HLB 60 mg Acondicionamiento: 5 mL MeOH, 5 mL agua Paso de muestra: 10 mL.min-1 Limpieza: 2,5 mL agua Secado: 30 min Elución: lavado 2x5 mL MeOH y elución 3x2 mL MeOH Cartuchos: Lichrolut EN 200 mg Acondicionamiento: 5 mL MeOH, 5 mL agua, 2x5 mL tampón TrBA Paso de muestra: 10 mL.min-1 Limpieza: 2,5 mL tampón TrBA, 1 mL agua Secado: 30 min Elución: 2x2 mL MeOH Concentración Concentración: 0,3 mL Adición TPrP 200 ng Volumen final: 1 mL Concentración: 0,3 mL Adición DBzP 200 ng Volumen final: 1 mL Determinación LC-ESI-MS/MS Inyección: 50 µL Modo: positivo Inyección: 50 µL Modo: negativo Figura IV.4.1. Esquema de preparación de muestra. R ESULTADOS Y D ISCUSIÓN 289 IV.4.1.6.1. Extracción de los pirorretardantes organofosforados La extracción se realizó con cartuchos de divilbenceno-nvinilpirrolidona (DVB-VP) OASIS HLB de 60 mg como se indica a continuación: - Acondicionamiento: Los cartuchos se acondicionan con 5 mL de metanol, seguido de 5 mL de agua ultrapura. - Paso de muestra: 100 mL de muestra se pasó a través del cartucho a un flujo de 10 mL.min-1. - Limpieza: El cartucho se lavó con 2,5 mL de agua ultrapura. - Secado: El cartucho se seca con ayuda de una corriente de nitrógeno durante 30 minutos. - Elución: Lavado del sistema de 2 x 5 mL de metanol y elución de los analitos con 3 x 2 mL de metanol. Los extractos se concentraron en el Turbo vap II a 0,3 mL, se les añadieron 40 µL de una disolución de patrón interno (TPrP) de 5 µg.mL-1, y se diluyeron a un volumen final de 1 mL con agua ultrapura. Las muestras se cuantificaron mediante el método de adición estándar con patrón interno. Para ello, se tomaron alícuotas de 200 µL del extracto y se les añadieron diferentes cantidades de patrones y se llevaron a un volumen final de 250 µL. TAP S Y SIUS PRODUCTOS DE HIDRÓLISIS EN AGUA 290 IV.4.1.6.2. Extracción de los productos de hidrólisis La extracción se realizó con cartuchos Lichrolut EN (200 mg) mediante formación de par iónico, utilizando un tampón de tributilamina 50 mM, como se indica a continuación: - Acondicionamiento: Los cartuchos se acondicionan con 5 mL de metanol, seguido de 5 mL de agua ultrapura y 2 veces con 5 mL del tampón. - Paso de muestra: 100 mL de muestra + 11 mL de tampón se pasó a través del cartucho a un flujo de 10 mL.min-1. - Limpieza: El cartucho se lavó con 2,5 mL de tampón y 1 mL de agua ultrapura. - Secado: El cartucho se seca con ayuda de una corriente de nitrógeno durante 30 minutos. - Elución: Los analitos se eluyen con 2 x 2 mL de metanol. Los extractos se concentraron en el Turbo vap II a 0,3 mL, se les añadieron 40 µL de una disolución de patrón interno (DBzP) de 5 µg.mL-1, y se diluyeron a un volumen final de 1 mL con agua ultrapura. Las muestras se cuantificaron mediante el método de adición estándar con patrón interno, para ello se tomaron alícuotas de 200 µL del extracto y se les añadieron diferentes cantidades de patrones, y se llevaron a un volumen final de 250 µL. R ESULTADOS Y D ISCUSIÓN 291 IV.4.1.7. ESTUDIO DE BIODEGRADACIÓN Se realizó un estudio de degradación biológica para evaluar la posible formación biológica de ésteres de fosfato monoy di-sustituidos a partir de los ésteres de fosfato tri-sustituidos, basándose en las normas EN ISO 78278. Las pruebas se realizaron en botellas de 2,5 L con 2 L de agua ultrapura, 10 mg.L-1 de lodo, un tampón fosfato8 y una adición de 50 µg.L-1 del compuesto investigado. Las botellas se cerraron con papel permitiendo la aireación de la disolución pero impidiendo la entrada de partículas y se mantuvieron en oscuridad y con agitación magnética. A estas botellas se les añadió una vez por semana leche en polvo (50 mg.L-1) para suministrar una fuente de carbono a los microorganismos. En otra botella se adicionaron sales de mercurio (II) para impedir el desarrollo bacteriano. Se tomaron muestras de unos 40 mL de los experimentos, al inicio del mismo, a las 6 y 24 horas, y cada dos o tres días. Estas muestras se filtraron inmediatamente a través de un filtro de 0,45 µm y se congelaron hasta el momento de ser analizadas mediante LC-MS/MS. IV.4.2. RESULTADOS Y DISCUSIÓN IV.4.2.1. RESULTADOS DE LA HIDRÓLISIS QUIMICA Debido a que sólo 4 mono-/di-sustituidos ésteres de fosfato están disponibles comercialmente, se llevó a cabo la hidrólisis alcalina de los compuestos precursores. TAP S Y SIUS PRODUCTOS DE HIDRÓLISIS EN AGUA 292 La mayoría de las reacciones de hidrólisis dieron lugar a los ésteres di-sustituidos y en menor proporción a los mono-sustituidos, excepto para los compuestos clorados donde la reacción tuvo lugar en menor proporción o no tuvo lugar. Así, para el TCEP se obtuvo sólo el éster di-sustituido y para el TDCP, la reacción no tuvo lugar. Las mezclas de los productos obtenidos se utilizaron para la optimización de las condiciones de detección mediante MS/MS y de la separación mediante LC. IV.4.2.2. OPTIMIZACIÓN DE LOS PARÁMETROS DE DETECCIÓN ESI-MS/MS Los principales parámetros a optimizar para la detección de los compuestos estudiados mediante ESI-MS/MS, a parte del modo de ionización, fueron el voltaje del cono y la energía de colisión. Para poder determinarlos se realizó la infusión de los patrones individuales, en primer lugar variando el voltaje del cono en busca de la máxima señal del ión molecular protonado (ESI positivo) o desprotonado (ESI negativo). Una vez fijado el voltaje del cono, se optimizó la energía de colisión, mediante la infusión directa en modo daughter , buscando la máxima señal de los diferentes iones producto procedentes de un ion precursor seleccionado. Se seleccionaron las dos transiciones más intensas para la cuantificación del compuesto. IV.4.2.2.1. Optimización y espectro de MS/MS para los ésteres trisustituidos Para la optimización de los parámetros de ESI-MS/MS de los trialquil- /arilfosfatos y bisfosfatos se realizó la infusión de los patrones individuales R ESULTADOS Y D ISCUSIÓN 293 en modo ESI positivo. En primer lugar, se optimizó el voltaje del cono, buscando la máxima señal del ión molecular protonado [M+H]+. En la figura IV.4.2 se puede ver la variación de la señal del ión [M+H]+ (m/z 267) con el voltaje del cono para su optimización para el TnBP. Como puede verse la señal aumenta hasta los 35 V, a voltajes del cono mayores comienza su descenso, por lo que se fijo el voltaje del cono en 35 V. 0,0E+00 5,0E+05 1,0E+06 1,5E+06 2,0E+06 2,5E+06 3,0E+06 3,5E+06 4,0E+06 20 25 30 35 40 Voltaje del cono/V Intensidad Figura IV.4.2. Optimización del voltaje del cono de ESI del TnBP (m/z 267). Una vez fijado el voltaje del cono para cada compuesto, se optimizó la energía de colisión. En la figura IV.4.3 se muestra la disminución de la señal del ion precursor protonado (m/z 267) y la variación de la señal de los iones producto, obteniendo los máximos para estos iones, m/z 211 a 10 eV, m/z 155 a 10 eV y m/z 99 a 22 eV. Las dos transiciones seleccionadas son las que alcanzan una mayor intensidad, es decir, m/z 155 y m/z 99. TAP S Y SIUS PRODUCTOS DE HIDRÓLISIS EN AGUA 294 0,0E+00 2,0E+05 4,0E+05 6,0E+05 8,0E+05 1,0E+06 1,2E+06 1,4E+06 1,6E+06 1,8E+06 8 1012141618202224 Energía de colisión/eV Intensidad m/z 57 m/z 99 m/z 155 m/z 211 m/z 267 Figura IV.4.3. Optimización de la energía de colisión de MS/MS para el TnBP. En el caso del RDP, debido a la escasa fragmentación del ion precursor se utilizó una transición pseudo-MRM. Mediante la infusión de una muestra de efluente (no con un patrón) se buscó la energía de colisión que producía la mayor relación señal/ruido, disminuyendo el ruido sin que llegue a caer la intensidad del ion molecular. Se obtuvo la mayor intensidad utilizando una energía de colisión de 10 eV, pero mayor relación señal/ruido a 25 eV. Se compararon los resultados de pseudo-MRM con los principales fragmentos, obteniendo las mayores relaciones señal/ruido para pseudoMRM a 25 eV y para la transición a m/z 481, resultados como puede verse en la tabla IV.4.3 seleccionados para la cuantificación. Las transiciones y los parámetros óptimos seleccionados para cada compuesto aparecen en la tabla IV.4.3. Para todos los compuestos se han seleccionado dos transiciones para su confirmación, excepto para el TPrP, que se utiliza como patrón interno, por lo que con una transición es suficiente. R ESULTADOS Y D ISCUSIÓN 295 Los espectros de MS/MS obtenidos para cada compuesto aparecen recogidos en el anexo I. La fragmentación de los trialquily tricloroalquilfosfatos tiene lugar mediante tres reagrupamientos McLafferty consecutivos, en los que se pierden los sustituyentes alquilo neutros quedando finalmente el ácido fosfórico protonado (m/z 99) como catión final. En algunos casos, este proceso viene acompañado por un proceso de migración de carga al grupo alquilo que aparece como catión alquilo, mientras el ácido fosfórico o el monoo diéster quedan como moléculas neutras. Como ejemplo puede verse en la figura IV.4.4 la fragmentación del TnBP. OC H 2 C H 2 C H 2 CH 3 O CH 2 CH 2 CH 2 CH 3 OH P + O C H 2 C H 2 C H 2 CH 3 OH O CH 2 CH 2 CH 2 CH 3 OH P + O C H 2 C H 2 C H 2 CH 3 C H 2 C H 2 C H 2 CH 3 OH OH OH P + O C H 2 C H 2 C H 2 CH 3 C H 2 C H 2 C H 2 CH 3 C H 2 C H 2 C H 2 CH 3 OH OH OH P + OH CH 2 + C H 2 C H 2 CH 3 OP OP OP m/z 267 m/z 211 m/z 155m/z 99 m/z 57 -(CH 3 CH 2 CH 2 CH 2 O) 2 -CH 3 CH 2 CH 2 CH 2 O -(OH) 3 Figura IV.4.4. Esquema de la fragmentación del TnBP. Para el trifenilfosfato (TPhP) el reagrupamiento McLafferty es menos favorable y en el espectro sólo aparece el fragmento m/z 251 correspondiente al primer reagrupamiento, como puede verse en la figura TAP S Y SIUS PRODUCTOS DE HIDRÓLISIS EN AGUA 302 como modificador orgánico. La concentración del modificador se optimizó inyectando patrones individuales de cada compuesto y midiendo su respuesta, variando la cantidad de ácido fórmico entre 0 y 2%. Para todos los compuestos se observó un comportamiento similar y como puede verse en la figura IV.4.12, la mayor intensidad de la señal se obtuvo para concentraciones de ácido fórmico en el rango 0,05-0,2%. Se eligió el valor de trabajo de 0,2% ya que produce una mayor capacidad tamponadora y por lo tanto se espera que los resultados sean mas robustos. 0 10 20 30 40 50 60 70 80 90 100 0 0,2 0,4 0,6 0,8 1 1,2 1,4 1,6 1,8 2 % Ácido fórmico Respuesta normalizada (%) Figura IV.4.12. Influencia de la concentración de ácido fórmico en la respuesta media de todos los compuestos. La identificación de los compuestos estudiados se muestra en la figura IV.4.13, que corresponde a un cromatograma de un patrón de 50 µg.L-1 medido en MRM, según las condiciones de separación de la tabla IV.4.1 y las condiciones de MS/MS descritas en las tablas IV.4.2 y IV.4.3. R ESULTADOS Y D ISCUSIÓN 303 6 8 10 12 14 16 18 20 22 24 Tiempo de retención /min 0 100 % 0 100 % Intensidad relativa 12 346 7 8910 11 IS 5 Figura IV.4.13. Cromatograma de LC-ESI-MS/MS de un patrón de 50 µg.L-1 de TAPs; 1, TCEP; 2, TPPO; 3, TCPP; 4, TDCP; 5, TPhP; 6, TiBP; 7, TnBP; 8, TBEP; 9, RDP; 10, BDP; 11, TEHP; IS, TPrP. Por lo tanto, el uso de LC-MS/MS permite la determinación de los trialquil-/arilfosfatos en un tiempo razonable (< 24 min), además de los bisfosfatos, RDP y BDP, cuya determinación no es posible por GC. IV.4.2.3.2. Optimización de separación de ésteres de fosfato mono-/disustituidos Para la separación de los analitos se utilizó cromatografía de par iónico usando como fase móvil metanol/agua con tributilamina (TrBA), como reactivo formador de pares iónicos. La concentración de TrBA se optimizó inyectando patrones individuales de cada compuesto y midiendo su respuesta frente a la variación de concentración de TrBA entre 0-20 mM. Para todos los compuestos se observó un comportamiento similar, produciéndose una importante disminución de la respuesta cuando TAP S Y SIUS PRODUCTOS DE HIDRÓLISIS EN AGUA 304 aumenta la concentración de TrBA. La respuesta normalizada para la suma de los compuestos puede verse en la figura IV.4.14. Se decidió utilizar TrBA 1 mM como concentración de compromiso entre la sensibilidad y la retención de los compuestos más ácidos y polares. 0 20 40 60 80 100 120 0,0 2,0 4,0 6,0 8,0 10,0 12,0 14,0 16,0 18,0 20,0 Concentración TrBA (mM) Respuesta normalizada (%) Figura IV.4.14. Influencia de la concentración de tributilamina en la respuesta media de todos los compuestos. La identificación de los compuestos estudiados se muestra en la figura IV.4.15, que corresponde a un cromatograma de una mezcla de los productos de hidrólisis según las condiciones de separación de la tabla IV.4.4 y las condiciones de MS/MS descritas en las tablas IV.4.5 y IV.4.6. R ESULTADOS Y D ISCUSIÓN 305 4 6 8 1012141618202224 0 100 % 0 100 % 0 100 % MPhP MCPP MiBP MnBP DCEP MBEP DCPP DiBP DnBP MEHP DBEP DBzP (IS) DEHP Tiempo de retención /min Intensidad relativa Figura IV.4.15. Cromatograma de LC-ESI-MS/MS de una mezcla de los esteres mono-/di-sustituidos obtenidos como producto de hidrólisis. Por lo tanto, el uso de LC de par iónico y MS/MS permite la determinación de los ésteres de fosfato monoy di-sustituidos en menos de 24 min, sin una etapa previa de derivatización necesaria en GC. IV.4.2.4. OPTIMIZACIÓN DE LAS CONDICIONES DE EXTRACCIÓN (SPE) IV.4.2.4.1. Extracción de TAPs mediante SPE Se evaluaron diferentes cartuchos de divinilbenceno-n-vinilpirrolidona (DVB-VP) OASIS HLB (60 mg), divinilbenceno-poliestireno (DVB-PS) Lichrolut EN (200 mg) y octadecilsilano (C18) Lichrolut RP-18 (500 mg) para la extracción de los pirorretardantes organofosforados. En primer lugar se estudió el volumen de metanol necesario para la elución de los analitos de cada tipo de cartucho. En general, con menos de TAP S Y SIUS PRODUCTOS DE HIDRÓLISIS EN AGUA 306 6 mL se eluyen todos los compuestos, menos del cartucho de Lichrolut EN para el que se necesitan más de 8 mL, tal como se observa en la figura IV.4.16 para el TPPO, por lo que se descartó este cartucho. 0 100000 200000 300000 400000 500000 600000 Oasis Lichrolut EN Licrolut RP-18 4ª Fracción 3ª Fracción 2ª Fracción 1ª Fracción Figura IV.4.16. Estudio del volumen de elución para el TPPO. A continuación, se estudio la recuperación y el efecto matriz que se produce durante el proceso de ionización en electrospray usando como muestra agua residual tratada. Como se ha realizado en trabajos anteriores9, para poder distinguir entre la recuperación real de SPE y el efecto matriz se evaluaron tres factores de respuesta obtenidos mediante: calibración externa con patrones en agua ultrapura (R1), adición estándar en los extractos de SPE (R2) y, por último, adición estándar en las muestras de agua residual antes de su extracción (R3). Los patrones se añadieron en tres niveles de concentración 0, 0,5 y 2,0 µg.L-1 referidos a la muestra. Por lo tanto, la relación entre el factor de respuesta de la adición estándar antes y después de la SPE (R3/R2) es una evaluación de la recuperación real del proceso de SPE, mientras la relación entre el factor de R ESULTADOS Y D ISCUSIÓN 307 respuesta de la adición estándar sobre los extractos de SPE y la calibración externa (R2/R1) da una medida del efecto matriz. Como puede verse en la tabla IV.4.7 las recuperaciones son mayores para el cartucho OASIS HLB que para el RP-18, y el efecto matriz es similar. Por lo tanto, tras la evaluación de estos dos cartuchos se eligió el cartucho OASIS HLB para la extracción de los pirorretardantes organofosforados de aguas mediante SPE. Tabla IV.4.7.Comparación de las recuperaciones (%) de SPE (R3/R2) y efecto matriz (R2/R1) en muestras de agua para los cartuchos Lichrolut RP-18 y Oasis HLB. Recuperación (%) Efectos de matriz (%) Compuesto RP-18 OASIS HLB RP-18 OASIS HLB TCEP 73 82 109 112 TPPO 69 90 138 131 TCPP 60 83 160 166 TDCP 60 75 141 139 TPhP 43 65 174 160 TiBP 49 66 187 189 TnBP 43 69 160 208 TBEP 47 71 176 153 TEHP 21 28 203 131 Las recuperaciones para los compuestos más hidrofóbicos (TEHP) son bajas (tabla IV.4.7). Para intentar mejorarlas se decidió lavar la botella de la muestra y los tubos del sistema de extracción dos veces con 5 mL de metanol tras la extracción, y posteriormente se transfirieron a los cartuchos de SPE para su elución. TAP S Y SIUS PRODUCTOS DE HIDRÓLISIS EN AGUA 308 IV.4.2.4.2. Extracción de los ésteres de fosfato mono-/di-sustituidos mediante SPE De igual manera que para los TAPs, se evaluaron diferentes cartuchos OASIS HLB (60 mg), Lichrolut EN (200 mg) y Lichrolut RP-18 (500 mg) para la extracción de los ésteres de fosfato monoy di-sustituidos disponibles comercialmente, pero en este caso es necesaria la acidificación de las muestras a pH 2. En primer lugar se estudió el volumen de metanol necesario para la elución de los compuestos de cada tipo de cartucho. Se descartó el cartucho de Lichrolut EN debido a la dificultad para eluir los compuestos, como puede comprobarse en la figura IV.4.17 para el DnBP. 0 2000 4000 6000 8000 10000 12000 14000 16000 Lichrolut EN C-18 OASIS Fracc 4 Fracc 3 Fracc 2 Fracc 1 Figura IV.4.17. Estudio del volumen de elución para el DnBP. Por lo tanto, se consideraron los otros 2 cartuchos y la posibilidad de utilizar la formación de par ionico adicionando TrBA a las muestras. Se evaluaron las recuperaciones y el efecto matriz como se ha indicado para los ésteres de fosfato trisustituídos en el apartado IV.4.2.4.1, añadiendo los R ESULTADOS Y D ISCUSIÓN 309 patrones en tres niveles de concentración 0, 0,2 y 1,0 µg.L-1 referidos a la muestra. Por lo tanto, la relación entre el factor de respuesta de la adición estándar antes y después de la SPE (R3/R2) es una medida de la recuperación del proceso de SPE, mientras la relación entre el factor de respuesta de la adición estándar sobre los extractos de SPE y la calibración externa (R2/R1) da una medida del efecto matriz. Como puede verse en la tabla IV.4.8, las recuperaciones son satisfactorias utilizando cualquier cartucho y cualquier mecanismo, a excepción del DEHP, para el que la recuperación tras la acidificación de la muestra es baja, mientras con el uso del par iónico se obtiene una buena recuperación. Además, se observa una menor supresión de la señal usando par iónico. Por lo tanto, para la extracción de muestras se utilizaron los cartuchos RP-18 con la formación de par iónico. Tabla IV.4.8.Comparación de las recuperaciones (%) de SPE (R3/R2) y efecto matriz (R2/R1) en muestras de agua para los cartuchos Oasis HLB y Lichrolut RP-18, en fase inversa o por par iónico. Recuperación (%) Efectos de matriz (%) Compuesto RP-18 OASIS HLB RP-18 Par ionico RP-18 OASIS HLB RP-18 Par ionico DnBP 111 80 123 50 72 73 DPhP 94 75 123 86 91 102 DEHP 36 30 109 58 50 79 TAP S Y SIUS PRODUCTOS DE HIDRÓLISIS EN AGUA 310 IV.4.2.5. ESTUDIO DE LOS EFECTOS DE MATRIZ Los efectos de matriz son uno de los principales problemas que se pueden producir con la técnica LC-ESI-MS, debido a la supresión de la señal que tiene lugar durante el proceso de ionización, y puede suponer una de las fuentes de error sistemático más importantes10. Para evaluar los efectos de matriz se realizó el mismo proceso indicado en el apartado IV.4.2.4 con agua residual tratada (efluente) y sin tratar (influente), determinando R2/R1 (relación entre el factor de respuesta de la adición estándar sobre los extractos de SPE y la calibración externa). Para las muestras de agua residual tratada (efluente), para la mayoría de los TAPs el efecto de matriz es menor del 20%, es decir, la respuesta normalizada en la figura IV.4.18 se encuentra entre 80 y 120%, excepto para el TCPP, RDP, BDP y TEHP. Pero en todos los casos el efecto matriz es menor del 50%. Sin embargo, para muestras de agua residual sin tratar (influente) los efectos de matriz son más fuertes, entre 11-74%. Además, los efectos de matriz son completamente diferentes para los diferentes analitos en las muestras, por lo que no pueden predecirse. R ESULTADOS Y D ISCUSIÓN 311 0% 100% 200% TCEP TPPO TCPP TDCP TPhP TiBP TnBP TBEP RDP BDP TEHP Respuesta realtiva Efluente Influente Figura IV.4.18. Estudio de los efectos de matriz en LC-ESI-MS/MS de los TAPs. Relación de la respuesta de los analitos añadidos a extractos de agua residual (R2) y de los analitos en solución acuosa (R1). Para los tres diaquil-/arilfosfatos estudiados, los efectos de matriz producen una supresión de la señal tanto en las muestras de agua residual tratada (efluente) como no tratada (influente). En algunos casos, como se muestra en la figura IV.4.19, los efectos de matriz llegan a reducir la señal un 50 %. TAP S Y SIUS PRODUCTOS DE HIDRÓLISIS EN AGUA 318 Como se muestra en la tabla IV.4.13, se detectaron 7 TAPs en todas las muestras de agua, en concentraciones que variaban entre 25 ng.L-1, para TPPO, hasta 12 µg.L-1, para TBEP. Tabla IV.4.13. Concentración de los TAPs encontrados en las aguas de una planta municipal de tratamiento de aguas residuales. Compuesto Agua residual no tratada (µg.L-1) (n=3) Efluente Primario (µg.L-1) (n=3) Efluente Terciario (µg.L-1) (n=3) TCEP 0,33 (0,01) 0,39 (0,03) 0,35 (0,02) TPPO 0,026 (0,004) 0,025 (0,001) 0,046 (0,001) TCPP 3,1 (0,1) 2,4 (0,2) 2,6 (0,1) TDCP 0,21 (0,01) 0,18 (0,01) 0,13 (0,01) TPhP nd nd nd TiBP * * * TnBP 0,59 (0,01) 0,69 (0,01) 0,13 (0,01) TBEP 12,06 (1) 11,4 (1) 0,067 (0,013) RDP nd nd nd BDP nd nd nd TEHP nd nd nd Expresado como: Concentración µg.L-1 (desviación estandar); nd = menor a los LODs; *= no fue posible su cuantificación por problemas de contaminación. Como puede verse en la tabla IV.4.14, se detectaron 6 posibles productos de hidrólisis de los TAPs en las muestras de agua, 5 de ellos disustituidos y uno monosustituido. Tres de los compuestos pudieron ser cuantificados debido a la disponibilidad de patrones comerciales, encontrando concentraciones entre 27 ng.L-1, para DnBP, hasta 62 µg.L-1, para DEHP. Las concentraciones de los otros tres compuestos no pudieron R ESULTADOS Y D ISCUSIÓN 319 ser calculadas, pero las áreas obtenidas en LC-MS/MS también aparece en la tabla IV.4.14. Tabla IV.4.14. Concentración de los productos de hidrólisis en las aguas de una planta municipal de tratamiento de aguas residuales. Compuesto Agua residual no tratada (µg.L-1) (n=3) Efluente Primario (µg.L-1) (n=3) Efluente Terciario (µg.L-1) (n=3) DnBP 1,6 (0,1) 1,8 (0,1) 0,027 (0,006) DPhP 0,18 (0,01) 0,20 (0,01) 0,050 (0,005) DEHP 61 (5) 62 (1) 4,7 (0,2) DiBP*1757 1542 113 MEHP*67127 75281 14879 DBEP*667 121 nd Expresado como: Concentración µg.L-1 (desviación estándar); nd = no detectado; *= expresado en área ya que no fue posible su cuantificación por que los patrones no están disponibles. Como puede observar en las tablas IV.4.13 y IV.4.14, la concentración de los analitos en el agua residual sin tratar (influente) es bastante elevada para algunos compuestos (12 µg.L-1 para TBEP y 62 µg.L-1 para DEHP). De los resultados obtenidos también puede deducirse que en el tratamiento de aguas se produce una importante disminución de la concentración de los analitos organofosforados, es decir, son degradados en el proceso de tratamiento de aguas, principalmente en el segundo paso de tratamiento biológico y no en el primer paso de sedimentación, excepto para los cloroalquilfosfatos y TPPO. De todas maneras, para algunos compuestos la concentración en el agua residual tratada (efluente terciario) sigue siendo elevada (2,6 µg.L-1 para TCPP y 4,7 µg.L-1 para DEHP). TAP S Y SIUS PRODUCTOS DE HIDRÓLISIS EN AGUA 320 En las figuras IV.4.20 y IV.4.21 aparecen dos cromatogramas de TAPs y productos de degradación, respectivamente, de una muestra de agua residual tratada (efluente) y una muestra de agua residual sin tratar (influente). 6.00 8.00 10.00 12.00 14.00 0 100 % Tiempo de retención /min Intesidad Relativa TCEP TPPO TCPP TDCP TiBP TnBP TBEP Figura IV.4.20. Cromatograma de una muestra de agua residual tratada, determinada mediante SPE-LC-MS/MS, para la determinación de TAPs. R ESULTADOS Y D ISCUSIÓN 321 12.00 14.00 16.00 18.00 20.00 22.00 24.00 Tiempo de retención /min 0 100 % 0 100 % DiBP DnBP MEHP DBzP (IS) DEHP DPhP DBEP Intesidad Relativa Figura IV.4.21. Cromatograma de una muestra de agua residual sin tratar, determinada mediante SPE-LC-MS/MS, para la determinación de los productos de hidrólisis de los TAPs. IV.4.2.8. ESTUDIO DE BIODEGRADACIÓN Los estudios de biodegradación se realizaron con los compuestos TPhP, TiBP y TBEP, ya que sus posible productos de biodegradación fueron encontrados en las muestras y a diferencia de otros compuestos encontrados como MEHP y DEHP6, no se producen industrialmente. Las concentraciones máximas en disolución acuosa no coinciden con las concentraciones añadidas (10 mg.L-1) debido a la relativa hidrofobicidad de los ésteres de fosfato tri-sustituidos. Los resultados obtenidos tras el análisis de las muestras tomadas (figura IV.4.22) están de acuerdo con los datos de la bibliografía11. Se observó que el TPhP (A) se degrada rápidamente; después de un día casi no TAP S Y SIUS PRODUCTOS DE HIDRÓLISIS EN AGUA 322 queda TPhP en disolución, formándose DPhP, pero degradándose rápidamente a partir del tercer día. La degradación de los tri-alquil fosfatos (B) es más lenta que para el TPhP, necesitando un tiempo de 15 días. En la figura IV.4.22 (B) se observa la progresiva degradación del TBEP y la formación de DBEP con un máximo de concentración alrededor de los 15 días. 0 20 40 60 80 100 120 0 5 10 15 20 25 días Concentración relativa (%) TPhP DPhP A 0 20 40 60 80 100 120 0 5 10 15 20 25 días Concentración relativa (%) TBEP DBEP Figura IV.4.22. Patrón de degradación de los esteres de fosfato trisustituidos en la prueba de degradación; A, TPhP; B, TBEP. R ESULTADOS Y D ISCUSIÓN 323 En las botellas que contenían sales de Hg(II) no se observa la degradación de TiBP y TBEP, ni la formación de dialquil fosfatos. Sin embargo, sí se observa una lenta degradación de TPhP y la formación de DPhP, que puede atribuirse a alguna actividad biológica remanente. Por lo tanto, estos resultados indican que la degradación biológica podría ser una fuente de ésteres de fosfato di-sustituidos en el medioambiente. 1. Lebel, G.L.; Williams, D.T.; Benoit, F.M., J. Asoc. Off. Anal. Chem. 64 (1981) 991-998. 2. Fries, E.; Püttmann, W., J. Environ. Monit. 3 (2001) 621-626. 3. Jonsson, O.B.; Nilsson, U.L., J. Sep. Sci. 26 (2003) 886-892. 4. Toda, H.; Sako, K.; Yagome, Y.; Nakamura, T., Anal. Chim. Acta 519 (2004) 213-218. 5. BUA Stoffberichte 108. Tributylphosphat/dibutylphosphat (1992). 6. BUA Stoffberichte 172. Di(2-ethylhexyl)phosphat/tri(2-ethylhexyl)phosphate (1997). 7. Muir, D.C.G.; Grift, N.P., J. Assoc. Off. Anal. Chem. 66 (1983) 684-690. 8. ISO 7827, In: German Standard methods for the determination of water, wastewater and sludge, Beuth Verlag, Berlin (1995). 9. Kloepfer, A.; Jekel, M.; Reemtsma, T., J. Chromatogr. A 1058 (2004) 81-88. 10. Reemtsma, T., Trends Anal. Chem .2 2 0 (2001) 533-543. 11. Kawagoshi, Y.; Nakamura, S.; Fukunaga, I., Chemosphere 48 (2002) 219-225. R ESULTADOS Y D ISCUSIÓN 325 IV.5. DETERMINACIÓN DE COMPUESTOS CLORADOS Y BROMADOS EN MUESTRAS DE ACUICULTURA En este trabajo se estudian diferentes técnicas de extracción para la determinación de contaminantes halogenados (plaguicidas organoclorados, bifenilos policlorados, bifenilos polibromados y éteres de difenilo bromados) en muestras de acuicultura (piensos, peces y moluscos) mediante cromatografía de gases. El estudio de estos contaminantes en la acuicultura es muy importante debido al gran crecimiento que está experimentando este sector, y que constituye una fuente de riesgo muy importante1,2. La exposición a los compuestos halogenados ha estado sujeto a extensas discusiones y se ha regulado su presencia en los productos pesqueros y en los productos de alimentación de animales3,4,5,6. Se han desarrollados dos métodos de extracción de muestras: extracción con fluidos supercríticos (SFE) y extracción basada en la dispersión de la matriz en fase sólida (MSPD), buscando métodos rápidos, que en un solo paso permitan la extracción y limpieza de los extractos usando adsorbentes, y disminuyendo el consumo de disolventes frente a las técnicas de extracción tradicionales. Además, se ha estudiado el uso de la microextracción en fase sólida (SPME) como técnica de preconcentración de los extractos antes de su inyección en el sistema cromatográfico, con el fin de aumentar la sensibilidad. C ONTAMINANTES H ALOGENADOS EN MUESTRAS DE ACUICULTURA 326 Estas técnicas de extracción y preconcentración se han aplicado a la determinación de compuestos clorados y bromados en muestras de piensos y muestras sólidas biológicas provenientes de la acuicultura. IV.5.1. MATERIAL Y MÉTODOS IV.5.1.1. PATRONES Los patrones comerciales usados fueron los siguientes: α-HCH, 1000 µg.mL-1 en metanol (Supelco) γ-HCH, 1000 µg.mL-1 en metanol (Supelco) 4,4’-DDT, 98,4 % sólido (Supelco) Heptacloro, 1000 µg.mL-1 en metanol (Supelco) Mezcla de PBDEs, 10 µg.mL-1 total en isooctano (Dr. Ehrenstorfer) BDE-47 (éter de 2,2’,4,4’-tetrabromobifenilo), 42,5 % BDE-99 (éter de 2,2’,4,4’,5-pentabromobifenilo), 10,9 % BDE-100 (éter de 2,2’,4,4’,6-pentabromobifenilo), 39.3 % Mezcla de PCBs, 10 µg.mL-1 de cada congénere en isooctano (Supelco) CB-10 (bifenilo 2,6-diclorado) CB-28 (bifenilo 2,4,4’-triclorado) CB-52 (bifenilo 2,2’,5,5’-tetraclorado) CB-138 (bifenilo 2,2’,3,4,4’,5’hexaclorado) CB-153 (bifenilo 2,2’,4,4’,5,5’-hexaclorado) CB-180 (bifenilo 2,2’,3,4,4’,5,5’-heptaclorado) BB-15 (bifenilo 4,4’-dibromado), 99,8 % (Supelco) BB-49 (bifenilo 2,2’,4,5’-tetrabromado), 97 % (Dr. Ehrenstorfer) R ESULTADOS Y D ISCUSIÓN 327 Mezcla de PCBs marcados isotópicamente [13C], 5 µg.mL-1 de cada congénere en nonano (Cambridge Isotope Laboratoies): CB-28, CB-52, CB101, CB-138, CB-153, CB-180 y CB-209. A partir de los patrones comerciales se prepararon por pesada disoluciones de patrones individuales de 100 µg.mL-1 de 4,4’-DDT en metanol y de BB-15 y BB-49 en n-hexano, y se guardaron a -20 ºC. A partir de las disoluciones stock se prepararon por pesada y dilución en hexano patrones mezcla de 10 µg.mL-1 de las familias de OCPs, y PBBs. A continuación, se prepararon patrones de trabajo mezcla desde 25 ng.mL-1 a 400 ng.mL-1 para cada compuesto, excepto para PBDEs desde 50 ng.mL-1 a 800 ng.mL-1 para la mezcla total. Finalmente, se preparó una disolución de PCBs [13C] de 0,5 µg.mL-1 en n-hexano, para su uso como patrón interno. IV.5.1.2. MUESTRAS Antes de su uso las muestras se trituraron y homogeneizaron. Las muestras de rodaballo y moluscos, además, fueron liofilizadas. Para la optimización se prepararon dos lotes, de 100 g cada uno, de pienso de rodaballo adicionados con una concentración de cada compuesto de entre 5-20 ng.g-1. Para ello, se preparó una disolución de 200 mL de nhexano con una concentración de cada compuesto entre 2,5-10 ng.mL-1. Esta disolución fue añadida a 100 g aproximadamente de pienso y se mezcló. Se dejó que el disolvente se evaporara a temperatura ambiente durante varios días, homogeneizando la mezcla periódicamente. Antes de C ONTAMINANTES H ALOGENADOS EN MUESTRAS DE ACUICULTURA 334 alúmina básica, y la mezcla de la muestra y C18 homogeneizada. La adición de la alúmina y gel de sílice acidificada permite la limpieza de la muestra durante la extracción. ` Frita Frita ` Muestra Dispersada en C18 Alumina Basica Gel de silice acidificado Figura IV.5.2. Esquema de la jeringa de MSPD. A continuación, la columna se comprime a 8 mL y se realiza la elución con 30 mL de hexano. El extracto se concentra a 0,5 mL bajo corriente de nitrógeno en un Turbo-Vap II, y finalmente se lleva a sequedad. El residuo se reconstituye en 200 µL de n-hexano. IV.5.1.5.3. Microextracción en Fase Sólida (SPME) Esta técnica se usó para la preconcentración de los analitos tras su extracción, y previamente a su introducción en el sistema cromatográfico. Por lo tanto, se aplicó a los extractos llevados a sequedad antes de su reconstitución en hexano. La preconcentración se realizó con fibras de polidimetilsiloxano (PDMS) de 100 µm de espesor de fase en un vial de 1,8 mL a 75ºC durante R ESULTADOS Y D ISCUSIÓN 335 60 min. Posteriormente, los analitos se desorbieron en el inyector del sistema cromatográfico a 274ºC durante 5 min. IV.5.2. RESULTADOS Y DISCUSIÓN IV.5.2.1. IDENTIFICACIÓN DE LOS COMPUESTOS IV.5.2.1.1. Cromatografía de Gases con Detección de Captura Electrónica (GC-ECD) Se determinó el tiempo de retención de los compuestos (tabla IV.5.4) inyectando patrones individuales o patrones de grupos de compuestos. Tabla IV.5.4. Tiempos de retención de los compuestos estudiados mediante GC-ECD. COMPUESTO Tiempo de retención (min) CB-10 9,71 α-HCH 10,72 γ-HCH 11,63 CB-28 13,46 Heptacloro 13,88 CB-52 14,63 BB-15 15,80 CB-153 21,33 BB-49 22,05 CB-138 22,24 4,4'-DDT 22,41 CB-180 y BDE-47 25,22 BDE-100 28,87 BDE-99 29,87 En la figura IV.5.3 se presenta un cromatograma de un patrón de los compuestos de 50 ng.mL-1, obteniendo una buena separación C ONTAMINANTES H ALOGENADOS EN MUESTRAS DE ACUICULTURA 336 cromatográfica para todos los compuestos en 30 min, excepto para CB180 y BDE-47, cuya separación no fue posible. Respuesta Tiempo de retención /min 510 15 20 25 30 35 20000 40000 60000 80000 100000 120000 140000 160000 CB-10 α-HCH γ-HCH CB-28 Heptacloro CB-52 BB-15 CB-153 BB-49 CB-138 4,4’-DDT CB-180 + BDE-47 BDE-100 BDE-99 Figura IV.5.3. Cromatograma de GC-ECD para la determinación de especies halogenadas (50 ng.mL-1). IV.5.2.1.2. Cromatografía de Gases –Espectrometría de Masas (GC-MS) Se determinó el tiempo de retención de los compuestos (tabla IV.5.5) inyectando patrones individuales o patrones de grupos de compuestos. Los iones de cuantificación seleccionados fueron los iones más intensos en el espectro de masas para cada compuesto, que se muestran en el anexo II. R ESULTADOS Y D ISCUSIÓN 337 Tabla IV.5.5. Tiempos de retención e iones de cuantificación de los compuestos estudiados mediante GC-MS. Compuesto TR Iones de cuantificación CB-10 10,022 222:224+152 α-BHC 11,177 181:183+219 γ-BHC 12,249 181:183+219 CB-28 14,105 256:258 Heptacloro 14,639 100+272:274 CB-52 15,370 290:292 BB-15 16,708 152+312:314 CB-153 22,065 360:363 BB 49 23,177 391+470:472 4,4'-DDT 23,230 165+235:237 CB-138 23,268 360:363 CB-180 25,983 394:396 BDE-47 26,369 482:490 BDE-100 29,830 560:570 BDE-99 30,766 560:570 CB-28 C13 14,105 198+268+270 CB-52 C13 15,370 267+302+304 CB-101 C13 18,490 336+338+340 CB-153 C13 22,065 370+372+374 CB-138 C13 23,268 370+372+374 CB-180 C13 25,983 406+408+410 En la figura IV.5.4 se presenta un cromatograma de un patrón de los compuestos de 100 ng.mL-1, y se muestran el cromatograma de iones total y los cromatogramas de iones seleccionados según los iones de cuantificación de cada compuesto. C ONTAMINANTES H ALOGENADOS EN MUESTRAS DE ACUICULTURA 338 10 15 20 25 30 Tiempo de retención /min 0 5 10 15 20 25 kCuentas 0 1 2 3 4 5 6 7 8 0.0 0.5 1.0 1.5 2.0 2.5 0 1 2 3 (a) (b) (c) (d) kCuentaskCuentaskCuentas 12 2 3 3 4 5 5 6 7 8 9 10 10 11 12 13 14 15 Figura IV.5.4. Cromatogramas de GC-MS para la determinación de especies halogenadas (100 ng.mL-1); (a) TIC; (b) m/z 181:183+219; (c) m/z 100+272:274; (d) m/z 165 +235:237; 1, CB-10; 2, α-HCH; 3, γ-HCH; 4, CB-28; 5, Heptacloro; 6, CB-52; 7, BB-15; 8, CB-153; 9, BB-49; 10, 4,4’-DDT; 11, CB138; 12, CB-180; 13, BDE-47; 14, BDE-100; 15, BDE-99 . R ESULTADOS Y D ISCUSIÓN 339 10 15 20 25 30 Tiempo de retención /min 0.0 2.5 5.0 7.5 10.0 12.5 kCuentas 0 1 2 3 4 5 6 0 1 2 3 4 5 6 0 1 2 3 4 5 0.0 0.5 1.0 1.5 2.0 2.5 3.0 kCuentaskCuentas kCuentaskCuentas (e) (f) (g) (h) (i) 1 4 6 811 12 Figura IV.5.4. (Continuación) Cromatogramas de GC-MS para la determinación de especies halogenadas (100 ng.mL-1); (e) m/z 222:224+152; (f) m/z 256:258; (g) m/z 290:292; (h) m/z 360:363; (i) m/z 394:396; 1, CB-10; 2, α-HCH; 3, γ-HCH; 4, CB28; 5, Heptacloro; 6, CB-52; 7, BB-15; 8, CB-153; 9, BB-49; 10, 4,4’-DDT; 11, CB138; 12, CB-180; 13, BDE-47; 14, BDE-100; 15, BDE-99 . C ONTAMINANTES H ALOGENADOS EN MUESTRAS DE ACUICULTURA 340 10 15 20 25 30minutes 0 1 2 3 4 kCuentas 0 1 2 3 4 5 0.00 0.25 0.50 0.75 1.00 0.00 0.25 0.50 0.75 1.00 (j) (k) (l) (m) 7 kCuentas 9 kCuentas 13 9 kCuentas 14 15 Figura IV.5.4. (Continuación) Cromatogramas de GC-MS para la determinación de especies halogenadas (100 ng.mL-1); (j) m/z 152+312:314; (k) m/z 391+470:472; (l) m/z 482:490; (m) m/z 560:570; 1, CB-10; 2, α-HCH; 3, γ-HCH; 4, CB-28; 5, Heptacloro; 6, CB-52; 7, BB-15; 8, CB-153; 9, BB-49; 10, 4,4’-DDT; 11, CB-138; 12, CB-180; 13, BDE-47; 14, BDE-100; 15, BDE-99. R ESULTADOS Y D ISCUSIÓN 341 IV.5.2.1.3. Cromatografía de Gases –Espectrometría de Masas en tándem (GC-MS/MS) Para el desarrollo del método de MS/MS se trataron de optimizar fundamentalmente, además de la selección del ión precursor, el storage level de excitación y la amplitud de excitación. El ion precursor se seleccionó a partir de los espectros de masas obtenidos para cada compuesto tras su inyección en modo MS por impacto electrónico (anexo II). El storage level de excitación, que es dependiente de la masa del ion precursor, se seleccionó utilizando la calculadora “q” que posee el software, teniendo en cuenta que, como indica el manual del software utilizado7, este valor siempre tiene que encontrarse al menos dos unidades por debajo del ion producto de menor relación m/z. La amplitud de excitación se seleccionó buscando obtener la menor señal del ion precursor y la mayor señal de los principales iones producto. La optimización se realizó mediante el desarrollo automatizado de métodos (AMD), que es otra herramienta que posee el software del equipo y que permite variar este parámetro hasta en 10 valores diferentes a lo largo del pico del compuesto de interés, por lo que se consigue una optimización más rápida. La optimización se realizó en los modos resonante y no resonante, seleccionando finalmente para todos los compuestos el modo resonante, debido a que se obtenía una mayor respuesta. C ONTAMINANTES H ALOGENADOS EN MUESTRAS DE ACUICULTURA 342 Los parámetros optimizados y los tiempos de retención aparecen en la tabla IV.5.3. Los espectros de MS/MS obtenidos para cada compuesto aparecen recogidos en el anexo II. La principal fragmentación observada para los compuestos estudiados es la pérdida de 1 o 2 átomos de halógeno, [M-Xx]+ o [M-2Xx]+, como aparece ampliamente recogido en la bibliografía8,9,16. En la figura IV.5.5 se presenta un cromatograma de un patrón de los compuestos de 50 ng.mL-1. 10 15 20 25 30 Tiempo de retención /min 0.0 2.5 5.0 7.5 10.0 12.5 15.0 kCuentas 1 23 4 4’ 5 6 6’ 7 8’ 8 10 9 11 11’ 12 12’ 13 14 15 Figura IV.5.5. Cromatogramas de GC-MS/MS para la determinación de especies halogenadas (50 ng.mL-1); 1, CB-10; 2, α-HCH; 3, γ-HCH; 4, CB-28; 5, Heptacloro; 6, CB-52; 7, BB-15; 8, CB-153; 9, BB-49; 10, 4,4’-DDT; 11, CB-138; 12, CB-180; 13, BDE-47; 14, BDE-100; 15, BDE-99, ‘: indica los PCBs [13C] correspondientes. R ESULTADOS Y D ISCUSIÓN 343 IV.5.2.2. VALIDACIÓN DE LOS MÉTODOS DE DETERMINACIÓN Para la validación de los métodos de determinación se estudiaron parámetros como la linealidad, reproducibilidad y límites de detección. Los resultados se muestran en las tablas IV.5.6, IV.5.7 y IV.5.8 para GC-ECD, GC-MS y GC-MS/MS, respectivamente. La linealidad se estudió para mezclas de patrones a 6 niveles de concentración en el rango de 10400 ng.mL-1 para cada compuesto. Se obtuvieron coeficientes de correlación superiores a 0,994 para todos los compuestos, utilizando como patrón interno en la determinación mediante MS la mezcla de PCBs [13C]. El estudio de la precisión del método analítico se realizó evaluando la repetibilidad. Este valor se calculó para 5 inyecciones consecutivas de un patrón que contiene todas las especies en el nivel de 100 ng.mL-1, obteniendo una desviación estándar relativa (RSD) menor del 10 %. Los límites de cuantificación obtenidos para una relación señal/ruido de 10, están en el rango de 1,84-6,55 ng.mL-1 mediante GC-ECD, 0,2-1,3 ng.mL-1 mediante GC-MS, y 0,05-2,3 ng.mL-1 para GC-MS/MS. Tabla IV.5.6. Parámetros del método de determinación de contaminantes halogenados mediante GC-ECD. COMPUESTO Linealidad/ r(a) Repetibilidad/ RSD (%)(b) LODs / ng.mL-1 (c) LOQs / ng.mL-1 (d) CB-10 0,9986 3,4 0,86 2,87 α-HCH 0,9996 7,0 0,83 2,76 γ-HCH 0,9996 7,9 1,02 3,40 CB-28 0,9989 5,4 0,70 2,35 Heptacloro 0,9997 7,9 1,78 5,95 C ONTAMINANTES H ALOGENADOS EN MUESTRAS DE ACUICULTURA 350 IV.5.2.3.3. Optimización de las condiciones de SFE Para la optimización de las condiciones de SFE se fijaron algunas condiciones basándose en la bibliografía10,11,12 como el tipo de disolvente, n-hexano, y la temperatura de la trampa, 25ºC. El volumen de elución de la trampa se estudió realizando una extracción de pienso con adición y realizando la elución de la trampa con n-hexano en varias fracciones (5 x 1 mL), que fueron inyectadas en el sistema GC-ECD. Se observó que después de la elución con 2 mL de n-hexano los analitos han sido totalmente eluidos de la trampa, por lo tanto, se fija un volumen de elución de 2 mL. La influencia de factores tales como la temperatura de extracción, presión de extracción, tiempo de extracción estática, tiempo de extracción dinámica y el flujo de CO2 se estudiaron mediante un diseño de experiencias factorial fraccionado 25-1, que implica un total de 16 experiencias. El diseño y tratamiento analítico del diseño experimental se realizó con el software Nemrod13. La temperatura y la presión de extracción determinan la densidad del CO2 y, por lo tanto, sus propiedades de difusión en la muestra, por lo que se tuvieron en cuenta estos dos factores en el diseño para evaluar una densidad de CO2 entre 0,25 y 0,85 g.L-1. Para ello, los valores que se consideraron fueron una temperatura entre 60-120ºC y una presión entre 140-320 bar. El tiempo de extracción estático se estudió en el rango 5-20 minutos, tiempo suficiente para un buen contacto entre los R ESULTADOS Y D ISCUSIÓN 351 compuestos y el agente extractor. El tiempo dinámico se estudió entre 10-60 min para arrastrar los analitos a la trampa. También se consideró el flujo de agente extractor en el rango 1-2,5 mL.min-1. El dominio experimental del interés se muestra en la tabla IV.5.9. Tabla IV.5.9. Dominio experimental de los factores seleccionados en el diseño experimental 25-1 para la estudio de las condiciones de SFE. Factor Nivel Bajo (-1) Nivel Alto (+1) Unidades Temperatura de extracción 60 120 ºC Presión 140 320 bar Tiempo estática 5 20 min Tiempo dinámica 10 60 min Flujo de CO2 1 2,5 mL.min-1 Los experimentos se realizaron con el pienso con adición preparado, añadiendo, además, en la celda de extracción los adsorbentes seleccionados: alúmina básica y gel de sílice acidificado, siguiendo la matriz de experiencias aleatoria que se muestra en la tabla IV.5.10. Los extractos obtenidos se inyectaron en el sistema GC-ECD. Las respuestas registradas aparecen en la tabla IV.5.11. Tabla IV.5.10. Matriz de experiencias del diseño 25-1. Matriz de experiencias aleatoria Nº Exp. Temperatura extracción Presión Tiempo estática Tiempo dinámica Flujo CO2 1 60 140 5 10 2,5 2 120 140 5 10 1,0 3 60 320 5 10 1,0 4 120 320 5 10 2,5 5 60 140 20 10 1,0 C ONTAMINANTES H ALOGENADOS EN MUESTRAS DE ACUICULTURA 352 Tabla IV.5.10. Matriz de experiencias del diseño 25-1. Matriz de experiencias aleatoria Nº Exp. Temperatura extracción Presión Tiempo estática Tiempo dinámica Flujo CO2 6 120 140 20 10 2,5 7 60 320 20 10 2,5 8 120 320 20 10 1,0 9 60 140 5 60 1,0 10 120 140 5 60 2,5 11 60 320 5 60 2,5 12 120 320 5 60 1,0 13 60 140 20 60 2,5 14 120 140 20 60 1,0 15 60 320 20 60 1,0 16 120 320 20 60 2,5 Tabla IV.5.11. Respuestas obtenidas del diseño experimental 25-1. Nº Exp. CB-10 α-HCH γ-HCH CB-28 Heptacloro CB-52 BB-15 1 125082 320284 142340 61979,5 166906 95610,1 45215,4 2 1861,6 4275,8 14744,8 30468,9 40417,2 26756,2 6170,5 3 103616 218923 253781 51609,6 365847 37167,3 79985,1 4 126073 213296 149921 57338,1 248295 73366,5 112044 5 121386 297860 255323 70100,2 266700 80967,6 73527,9 6 29872,6 4622,7 17589,7 26532,2 28033,7 22821,7 4816 7 77651,3 105204 95606,4 46599,2 126748 70644,5 43922,2 8 84314,4 33601 15083,2 51551,9 54791,7 59705,3 44441,8 R ESULTADOS Y D ISCUSIÓN 353 Tabla IV.5.11. Respuestas obtenidas del diseño experimental 25-1. Nº Exp. CB-10 α-HCH γ-HCH CB-28 Heptacloro CB-52 BB-15 9 95761,7 230897 447753 77623,5 283050 77443,8 116603 10 106185 11334,9 41549,9 8224,2 66845,5 58181,2 4735,4 11 37166,7 70511 33256,2 41857,8 93249,2 67021,4 67746,8 12 83534 158329 152538 316926 237732 94711,1 257584 13 98344,3 303189 212945 44030 332759 43346 100895 14 67590,1 14173,6 24364,7 16070,4 31658,5 0 0 15 80576,1 260914 180106 103525 350736 160919 26467,4 16 83075 168739 135101 75567,4 271295 82894,2 274720 Tabla IV.5.11. Respuestas obtenidas del diseño experimental 25-1 (continuación). Nº Exp. CB-153 BB-49 CB-135 CB-180 y BDE-47 BDE-100 BDE-99 1 17236,6 32081,6 0 36022,9 0 0 2 14143,3 0 0 0 0 0 3 44833,8 110924 33518 23613 237986 47364,4 4 47317,4 37173,9 5516,6 564021,5 27999,5 0 5 14089 32285,2 6862,2 37829,1 0 0 6 0 0 0 5060,6 0 2129,6 7 5262,8 36056,1 25859,5 16664,9 10236,6 2267,3 8 13845,5 25696,1 0 34706 0 0 9 47794,8 63021,5 0 36535,7 142276 16529,9 10 14899,9 69468,2 0 22098,9 13559,8 8123,4 11 27159,9 105761 0 34550,9 47627,6 125657 12 47721,9 31326,5 9968,6 21010,8 204332 28422,7 C ONTAMINANTES H ALOGENADOS EN MUESTRAS DE ACUICULTURA 354 Tabla IV.5.11. Respuestas obtenidas del diseño experimental 25-1 (continuación). Nº Exp. CB-153 BB-49 CB-135 CB-180 y BDE-47 BDE-100 BDE-99 13 46439,5 95387,5 56836,7 52147,2 216295 0 14 14724,2 0 0 0 0 0 15 39561,4 143910 32723,8 59140,4 150300 185499 16 62458 84673,6 0 52688,8 334405 21996,2 El tratamiento de los resultados de la tabla IV.5.11, como se muestra en la figura IV.5.9, reflejan que ni el tiempo de extracción estática, ni el flujo de CO2 son estadísticamente significativos para ninguna de las respuestas. La pequeña influencia que tiene el tiempo de extracción estática es en todos los casos negativa y por ello se fija en el nivel bajo: 5 min. La influencia del flujo de CO2 varía para cada compuesto pero en todos los casos su influencia es muy pequeña, por lo que se fija en un nivel intermedio 2 mL.min-1. La temperatura de extracción tiene una influencia negativa para casi todos los compuestos por lo que se fija en el nivel bajo (60ºC). R ESULTADOS Y D ISCUSIÓN 355 Figura IV.5.9. Gráfico Lenth de efectos principales e interacciones.; A: BB-49; B: 4,4’- DDT. Los factores presión y tiempo de extracción tienen una influencia positiva en la extracción para la mayoría de los compuestos y en algunos casos son factores estadísticamente significativos. Se decidió estudiarlos mediante un diseño de superficie de respuesta para buscar un óptimo en unas condiciones intermedias que no requieran un tiempo de extracción dinámica de 60 min. Para ello se aplicó un diseño Doehlert13, considerando los factores y niveles que aparecen en la tabla IV.5.12. Tabla IV.5.12. Dominio experimental de los factores seleccionados en el diseño experimental Doehlert. Factor Centro Paso Unidades Presión 210 110 bar Tiempo dinámica 35 30 min C ONTAMINANTES H ALOGENADOS EN MUESTRAS DE ACUICULTURA 356 Las experiencias se hicieron, de igual manera que en el diseño factorial fraccional, siguiendo la matriz de la tabla IV.5.13. Tabla IV.5.13. Matriz de experiencias del diseño Doehlert. Matriz de experiencias aleatoria Nº Exp. Presión Tiempo dinámica 1 320 35 2 100 35 3 265 61 4 155 9 5 265 9 6 155 61 7 210 35 8 210 35 9 210 35 10 210 35 Se preparan las celdas con 1 g de pienso con adición, 1,5 g de alúmina básica y 1,5 g de gel de sílice acidificado. Se realizó la extracción en las condiciones indicadas por el número de experiencia. Los extractos se llevan a sequedad en corriente de nitrógeno, y posteriormente se reconstituyen en 100 µL de n-hexano para ser inyectados en el sistema GC-ECD. Los resultados se muestran en la tabla IV.5.14. R ESULTADOS Y D ISCUSIÓN 357 Tabla IV.5.14. Respuestas obtenidas con el diseño experimental Doehlert. Nº Exp. CB-10 α-HCH γ-HCH CB-28 Heptacloro CB-52 BB-15 1 93095,8 211698 237363 98634,7 239129 86702,4 103243 2 20504,1 6007,64 9757,82 21242,3 0 31228 13761,7 3 65630,8 216555 242364 102030 297670 93109,2 135512 4 31123,6 111764 55093,4 103557 86530 87379,5 106320 5 53398,1 172051 197185 92286,4 94118,9 84225,1 102002 6 108682 115317 258199 107601 160063 109525 113323 7 76682,5 211014 246472 106684 229416 104263 132636 8 96962,1 196583 230057 102886 190128 101730 110972 9 60462,6 190101 230652 98710,7 196636 101979 139877 10 108380 209254 229720 101151 178041 82767,1 119364 Tabla IV.5.14. Respuestas obtenidas del diseño experimental Doehlert (continuación). Nº Exp. CB-153 BB-49 CB-135 CB-180 y BDE-47 BDE-100 BDE-99 1 148534 137402 151358 243994 22317,1 51817,7 2 0 13792,4 0 0 0 8421,5 3 153376 134528 158890 262077 26831,4 52735,7 4 74492,3 40130,7 60899,9 0 0 15598,9 5 139775 119192 150276 207752 9618,42 23567,6 6 157448 149762 174967 274330 19638,4 44186,6 7 158288 148790 162971 284104 20143,9 53835 8 142404 134139 157129 245775 14099,9 54923,4 9 193525 165891 219224 298840 19148,5 53897,4 10 151322 151450 169089 253736 19241,5 54975,6 C ONTAMINANTES H ALOGENADOS EN MUESTRAS DE ACUICULTURA 358 De las gráficas de las superficies de respuesta, obtenidas tras el tratamiento de los datos de la tabla IV.5.14 con el paquete estadístico Newrod13, se deduce que las condiciones ideales de extracción estarían en la zona media–alta para los valores de los dos factores objeto de estudio. En la figura IV.5.10 se muestran, a modo de ejemplo, las superficies de respuesta de γ-HCH y CB-52. Figura IV.5.10. Superficie de respuesta del tiempo de extracción dinámica frente a la presión; A, γ-HCH; B, CB-52. Los diferentes compuestos estudiados presentaron diferente comportamiento en la extracción al observar todas las superficies de respuesta obtenidas. Por ello, se consideró la posibilidad de buscar una solución de compromiso que satisfaga, lo mejor posible, el conjunto de los objetivos expresados. Mediante el uso de la función de deseabilidad, se busca la maximización de la respuesta (funciones individuales de deseabilidad unilaterales). Considerando la función de deseabilidad global (figura IV.5.11) para todos los compuestos, se puede alcanzar el máximo de las R ESULTADOS Y D ISCUSIÓN 359 respuestas a una presión de 165 bar y un tiempo de extracción dinámica de 27 min. Las zonas sombreadas indican valores de deseabilidad global 0 y, por tanto, zonas no deseables de trabajo. Figura IV.5.11. Funciones de deseabilidad global, gráfico bidimensional y tridimensional. IV.5.2.4. OPTIMIZACIÓN DE LAS CONDICIONES DE MSPD La optimización de la MSPD se llevó a cabo con el pienso con adición preparado según el apartado IV.5.1.2. El tipo de adsorbente, la posibilidad de la elución bajo presión, la cantidad de C18 que se utiliza para la dispersión de la muestra y el volumen de n-hexano se estudiaron mediante un diseño híbrido14 2 232, que supone 9 experiencias13. Según las pruebas previas realizadas con adsorbentes (apartado IV.5.2.3.2) se decidió usar gel de sílice acidificado, ya que permitía obtener un extracto más limpio. Se estudió la combinación de gel de sílice con alúmina o con florisil. También se estudió la posibilidad de realizar la elución ejerciendo presión, bajando el émbolo 1 cm cada 5 min. Estos dos C ONTAMINANTES H ALOGENADOS EN MUESTRAS DE ACUICULTURA 366 Tabla IV.5.18. Dominio experimental de los factores seleccionados en el diseño experimental Doehlert para la optimización de la SPME. Factores Nivel bajo Nivel alto Unidades Tiempo desorción 1 11 min Temperatura desorción 250 280 ºC Tabla IV.5.19. Matriz de experiencias del diseño Doehlert. Matriz de experiencias aleatoria Nº Exp. Tiempo desorción Temperatura desorcion 1 11 265 2 1 265 3 9 280 4 4 250 5 9 250 6 4 280 7 6 265 8 6 265 9 6 265 Las experiencias se realizaron con extractos de SFE a sequedad, realizando la extracción a 75ºC durante 60 min, siguiendo la matriz de la tabla IV.5.19, y realizando la desorción en el puerto de inyección del cromatógrafo de gases para realizar la determinación por GC-MS. Los resultados obtenidos se muestran en la tabla IV.5.20. R ESULTADOS Y D ISCUSIÓN 367 Tabla IV.5.20. Respuestas obtenidas del diseño Doehlert para la optimización de la SPME. Nº Exp. CB-10 α-HCH γ-HCH CB-28 Heptacloro CB-52 BB-15 1 312227 118435 136184 431899 163601 630661 177748 2 276236 109772 133580 428926 185923 675209 164541 3 419408 143999 177907 509258 217784 826581 245275 4 417572 132620 149902 441031 170794 646979 158626 5 164273 94980 127792 363432 158068 581181 161200 6 221572 128559 165960 501872 200151 790855 219022 7 580682 196769 210586 610508 228692 906313 218279 8 402509 144449 159149 456875 184059 696421 170461 9 478562 152404 167266 517781 198552 759820 186080 Tabla IV.5.20. Respuestas obtenidas del diseño Doehlert para la optimización de la SPME (continuación). Nº Exp. CB-153 BB-49 CB-135 4,4’-DDT CB-180 BDE-47 BDE100 BDE99 1 637197 605607 293226 716428 287735 167305 7851 19811 2 818930 765213 383424 953322 433252 251186 12282 25631 3 1029468 891502 405496 1224211 540910 345657 17230 62614 4 653803 483083 216577 684404 209059 88397 2359 7124 5 706972 768480 364675 858091 383490 227554 11752 27941 6 971016 1004923 426642 1086639 533069 377911 19086 64798 7 959304 677998 256040 1064304 378040 142182 5127 14241 8 768823 643521 290539 894101 312061 154347 6160 16509 9 763356 588462 275499 812240 269063 111639 3557 8793 C ONTAMINANTES H ALOGENADOS EN MUESTRAS DE ACUICULTURA 368 Tras el tratamiento de los datos se observa que tanto la temperatura como el tiempo de desorción son factores estadísticamente significativos para el 4,4’-DDT, con una influencia positiva. Para los PBBs y PBDEs la temperatura es un factor estadísticamente significativo con una influencia también positiva. Para los demás compuestos ningún factor es estadísticamente significativo y presentan un comportamiento heterogéneo. En la figura IV.5.16, pueden observarse un ejemplo de las superficies de respuesta obtenidas para CB-10 y 4,4’-DDT. Figura IV.5.16. Gráfica de superficies de respuesta; A, CB-10; B, 4,4’-DDT. Debido a la heterogeneidad de comportamientos es necesario buscar una solución de compromiso que permita satisfacer, lo mejor posible, el conjunto de los objetivos expresados. Para ello se hará uso, de nuevo, de la función de deseabilidad. Se busca la maximización de la respuesta a través de funciones de deseabilidad unilaterales por la izquierda. Mediante el estudio de la función de deseabilidad global (figura IV.5.17), las coordenadas del óptimo de los factores estudiados en las R ESULTADOS Y D ISCUSIÓN 369 que se alcanzaba un mayor valor de di para todos los compuestos corresponden a un tiempo de desorción de 5 min y una temperatura de 274ºC. Figura IV.5.17. Funciones de deseabilidad global, gráfico bidimensional y tridimensional. IV.5.2.6. VALIDACIÓN DE LOS MÉTODOS ANALÍTICOS En la validación de los diferentes métodos de extracción se estudió la recuperación, coeficiente de variación, y los límites de detección y cuantificación utilizando el sistema GC-MS/MS como técnica de determinación. Para el cálculo de la recuperación y del coeficiente de variación se realizaron 6 extracciones de muestra de pienso con adición. La cuantificación para SFE y MSPD se realizó mediante calibración con patrón interno, utilizando los PCBs marcados isotópicamente [13C]. En el caso de SPME, debido al fuerte efecto matriz, la cuantificación se realizó mediante C ONTAMINANTES H ALOGENADOS EN MUESTRAS DE ACUICULTURA 370 adición estándar con patrón interno, utilizando los PCBs marcados isotópicamente [13C]. Para la SFE, como puede verse en la tabla IV.5.21, se obtuvieron recuperaciones entre 76-128%, con un coeficiente de variación menor de 15%. Los límites de detección, para una relación señal/ruido de 3, se obtuvieron en un intervalo entre 0,01-0,7 ng.g-1. Tabla IV.5.21. Parámetros del método de extracción mediante SFE de contaminantes halogenados mediante GC-MS/MS. COMPUESTO Recuperación/ %(a) Repetibilidad/ RSD (%)(b) LODs / ng.g-1 (c) LOQs / ng.g-1 (d) CB-10 76 3 0,01 0,05 α-HCH 96 7 0,07 0,22 γ-HCH 80 11 0,09 0,30 CB-28 95 7 0,12 0,41 Heptacloro 78 10 0,19 0,64 CB-52 98 5 0,03 0,09 BB-15 89 9 0,25 0,83 CB-153 98 6 0,07 0,25 BB-49 106 7 0,13 0,43 4,4'-DDT 119 13 0,23 0,77 CB-138 100 5 0,03 0,10 CB-180 90 14 0,12 0,39 BDE-47 101 7 0,70 2,33 BDE-100 128 3 0,23 0,75 BDE-99 76 13 0,24 0,81 (a) Pienso con adición entre 10-20 ng.g-1 (n=6); (b) Extracción del pienso con adición n=6 (c) definido para una relación señal/ruido de 3; (d) definido para una relación señal/ruido de 10. Para la extracción mediante MSPD (tabla IV.5.22) se obtuvieron recuperaciones entre 50-96%, con un coeficiente de variación menor de R ESULTADOS Y D ISCUSIÓN 371 15%. Los límites de detección, para una relación señal/ruido de 3, se encontraron entre 0,02-0,9 ng.g-1. Tabla IV.5.22. Parámetros del método de extracción mediante MSPD de contaminantes halogenados mediante GC-MS/MS. COMPUESTO Recuperación/ %(a) Repetibilidad/ RSD (%)(b) LODs / ng.g-1 (c) LOQs / ng.g-1 (d) CB-10 86 8 0,02 0,06 α-HCH 50 10 0,09 0,29 γ-HCH 68 10 0,12 0,40 CB-28 96 9 0,16 0,55 Heptacloro 78 9 0,25 0,85 CB-52 69 8 0,03 0,11 BB-15 85 11 0,33 1,11 CB-153 88 7 0,10 0,33 BB-49 72 9 0,17 0,57 4,4'-DDT 96 5 0,31 1,03 CB-138 89 7 0,04 0,14 CB-180 82 7 0,16 0,52 BDE-47 89 8 0,93 3,11 BDE-100 85 8 0,30 1,00 BDE-99 86 6 0,33 1,09 (a) Pienso con adición entre 10-20 ng.g-1 (n=6); (b) Extracción del pienso con adición n=6 (c) definido para una relación señal/ruido de 3; (d) definido para una relación señal/ruido de 10. La SPME se aplicó sobre los extractos secos de SFE, por lo tanto, para el método SFE-SPME (tabla IV.5.23) se obtuvieron recuperaciones entre 65101%, con un coeficiente de variación menor de 16%. Mediante el uso de SFE-SPME se obtienen límites de detección muy bajos, menores de 9 pg.g-1, C ONTAMINANTES H ALOGENADOS EN MUESTRAS DE ACUICULTURA 372 necesarios para llevar a cabo la determinación de los analitos estudiados a niveles de ultratraza. Tabla IV.5.23. Parámetros del método de extracción mediante SFESPME de contaminantes halogenados mediante GC-MS/MS. COMPUESTO Recuperación/ %(a) Repetibilidad/ RSD (%)(b) LODs / pg.g-1 (c) LOQs / pg.g-1 (d) CB-10 78 11 0,3 1,0 α-HCH 86 9 0,7 2,5 γ-HCH 89 12 1,2 4,0 CB-28 92 5 1,3 4,4 Heptacloro 65 7 1,8 6,0 CB-52 100 3 0,2 0,5 BB-15 77 10 2,1 6,9 CB-153 89 5 0,9 3,1 BB-49 99 11 1,2 3,9 4,4'-DDT 69 6 2,6 8,7 CB-138 77 7 0,5 1,7 CB-180 101 8 0,8 2,8 BDE-47 101 14 8,9 29,7 BDE-100 82 16 1,8 5,9 BDE-99 91 14 2,9 9,5 (a) Pienso con adición entre 10-20 ng.g-1 (n=6); (b) Extracción del pienso con adición de 200 pg.g-1 n=6 (c) definido para una relación señal/ruido de 3; (d) definido para una relación señal/ruido de 10. Por lo tanto, los tres procedimientos de extracción utilizados presentan unos valores de recuperación y repetibilidad satisfactorios. Los límites de detección mediante SFE y MSPD son adecuados para el análisis de estos compuestos en muestras medioambientales y en productos para la R ESULTADOS Y D ISCUSIÓN 373 alimentación animal y humana. El uso de SFE-SPME permite, además, el análisis de los contaminantes halogenados a niveles ultratraza. La exactitud y precisión del método se evaluó mediante el análisis del material de referencia IAEA-406. Los resultados pueden verse en la tabla IV.5.24 y están en concordancia con los valores de referencia. Todos los resultados se encuentran en el intervalo del material del IAEA, a pesar de que la homogeneidad del material sólo está garantizada para tamaños de muestra mayores de 5 g y la cantidad máxima utilizada en estos métodos es de 1,5 g, debido a las limitaciones de capacidad de las configuraciones utilizadas. Tabla IV.5.24. Análisis del material de referencia IAEA-406 (n=6). COMPUESTO Valor certificado IAEA-406 (ng.g-1) Intervalo de confianza certificado (ng.g-1) SFE-GCMS/MS (ng.g-1)(a) SFE-SPMEGC-MS/MS (ng.g-1)(a) MSPD-GCMS/MS (ng.g-1)(a) CB-10 - - - - α-HCH 0,79 0,23 – 1,7 0,25 ± 0,04 0,26 ± 0,02 0,28 ± 0,03 γ-HCH 0,27 0,11 – 0,80 0,78 ± 0,02 0,77 ± 0,1 0,72 ± 0,09 CB-28 0,57 0,43 – 1,3 1,26 ± 0,3 0,56 ± 0,04 1,06 ± 0,06 Heptacloro 0,32 0,23 – 0,46 n.d. 0,37 ± 0,03 n.d. CB-52 1,30 1,0 – 2,2 2,14 ± 0,2 1,16 ± 0,2 1,53 ± 0,05 BB-15 - - - - - CB-153 3,70 2,9 – 6,0 4,65 ± 0,3 3,11 ± 0,3 3,71 ± 0,18 BB-49 - - - - - 4,4'-DDT 3,00 1,8 – 5,6 3,16 ± 0,5 3,36 ± 0,4 2,22 ± 0,09 CB-138 4,00 2,5 – 6,3 3,04 ± 0,6 3,24 ±0,2 3,34 ± 0,10 CB-180 1,20 1,0 – 1,2 1,33 ± 0,2 1,06 ± 0,1 1,16 ± 0,14 C ONTAMINANTES H ALOGENADOS EN MUESTRAS DE ACUICULTURA 374 Tabla IV.5.24. Análisis del material de referencia IAEA-406 (n=6). COMPUESTO Valor certificado IAEA-406 (ng.g-1) Intervalo de confianza certificado (ng.g-1) SFE-GCMS/MS (ng.g-1)(a) SFE-SPMEGC-MS/MS (ng.g-1)(a) MSPD-GCMS/MS (ng.g-1)(a) BDE-47 - - - - - BDE-100 - - - - - BDE-99 - - - - - (a) valor medio ± desviación estándar. n.d.: no detectado, se encuentra por debajo del límite de cuantificación del método. IV.5.2.7. APLICACIÓN A MUESTRAS REALES Los métodos de extracción se aplicaron al análisis de varias muestras reales incluyendo piensos de pescado de acuicultura y especies cultivadas en granjas marinas como rodaballo, almeja, berberecho y mejillón. Los resultados se muestran en las tablas IV.5.25, IV.5.26 y IV.5.27. Como se muestra, los piensos de trucha fueron analizados mediante los tres procedimientos de preparación de muestra, y el pienso de rodaballo fue analizado mediante MSPD y SFE-SPME. Las muestras de moluscos analizadas por cada uno de los procedimientos de preparación de muestra fueron diferentes. R ESULTADOS Y D ISCUSIÓN 375 Tabla IV.5.25. Análisis de muestras reales mediante SFE y GC-MS/MS en ng.g-1 (n=3). COMPUESTO Pienso trucha 1 Pienso trucha 2 Berberecho 1Almeja 1 Mejillón 1 CB-10 n.d. n.d. 0,2 0,5 0,4 α-HCH n.d. n.d. n.d. n.d. n.d. γ-HCH n.d. n.d. n.d. 23,6 32,7 CB-28 n.d. 2,2 n.d. 10,4 9,5 Heptacloro n.d. n.d. n.d. n.d. n.d. CB-52 1,7 2,4 16,0 28,7 40,5 BB-15 n.d. n.d. n.d. n.d. n.d. CB-153 7,2 4,4 9,9 20,7 45,9 BB-49 n.d. n.d. n.d. n.d. n.d. 4,4'-DDT n.d. n.d. 5,4 117,8 10,8 CB-138 5,3 4,4 5,1 13,2 25,2 CB-180 1,7 1,0 2,8 3,1 2,8 BDE-47 n.d. n.d. n.d. 2,4 n.d. BDE-100 n.d. n.d. n.d. n.d. n.d. BDE-99 n.d. n.d. n.d. n.d. n.d. n.d.: no detectado.