Oxidación del tinte azo Orange II mediante MnP en reactores enzimáticos operados en continuo

UNIVERSIDADE DE SANTIAGO DE COMPOSTELA Departamento de Ingeniería Química Oxidación del tinte azo Orange II mediante MnP en reactores enzimáticos operados en continuo Memoria presentada por Carmen López Díaz Para optar al grado de Doctor por la Universidade de Santiago de Compostela Santiago de Compostela, Noviembre de 2005 UNIVERSIDADE DE SANTIAGO DE COMPOSTELA Departamento de Ingeniería Química Juan Manuel Lema Rodicio, Catedrático de Ingeniería Química y María Teresa Moreira Vilar, Profesora Asociada de Ingeniería Química de la Universidade de Santiago de Compostela, Informan: Que la memoria titulada “Oxidación del tinte azo Orange II mediante MnP en reactores enzimáticos operados en continuo”, que para optar al grado de Doctor en Ingeniería Química, Programa de Doctorado en Ingeniería Química y Ambiental, presenta Doña Carmen López Díaz, ha sido realizada bajo nuestra inmediata dirección en el Departamento de Ingeniería Química de la Universidade de Santiago de Compostela. Y para que así conste, firman el presente informe en Santiago de Compostela, el 19 de Julio de 2005. Juan M. Lema Rodicio M. Teresa Moreira Vilar Esta memoria fue presentada el 25 de Noviembre de 2005 en la Escola Técnica Superior de Enxeñería de la Universidade de Santiago de Compostela ante el tribunal compuesto por: Dr. Spyros N. Agathos. Université Catholique de Louvain, Louvain-la Neuve, Bélgica Dr. Gumersindo Feijoo Costa. Universidad de Santiago de Compostela. Dr. José Manuel Guisán Seijas. Centro Superior de Investigaciones Científicas, Madrid. Dra. Inmaculada Ortiz Uribe. Universidad de Cantabria. Dra. Herminia Domínguez González. Universidad de Vigo. Calificación: Sobresaliente Cum Laude. Reconocimiento de “Doctorado Europeo” dentro del programa de Doctorado “Ingeniería Química y Ambiental”. AGRADECIMIENTOS Cualquiera que haya tenido una tesis en sus manos sabe que esta primera página va a ser, sin duda, la más leída, y quizás la única. Así que trataré de esmerarme y plasmar en palabras mi agradecimiento a todos los que contribuisteis a la realización de este trabajo. En primer lugar, quiero dar las gracias más sinceras a mi director Juan Lema, por tu confianza en mi trabajo, tu asesoramiento científico y tu estímulo para encaminar la investigación hacia los logros alcanzados. A mi directora Mª Teresa Moreira, por tu supervisión científica y literaria y tu dedicación. Gracias al profesor Gumersindo Feijoo, por haberte comportado como un director más. Este trabajo ha sido financiado por el Ministerio de Educación, Cultura y Deporte, mediante una beca de Formación de Profesorado Universitario (AP20001712) y por la Comisión Española de Ciencia y Tecnología (CICYT) mediante el proyecto PPQ2001-3063. La realización de la tesis doctoral me permitió crecer intelectual y personalmente. Y a ello contribuyeron, en buena parte, las estancias realizadas. De todas ellas guardo muy buenos recuerdos, pues he podido aprovecharlas, científica y personalmente. Gracias al grupo de Ingeniería de Biocatalizadores y Biotransformaciones del Instituto de Catálisis y Petroleoquímica del C.S.I.C. de Madrid, dirigido por José Manuel Guisán. Gracias a Roberto, por dirigir mi trabajo, y a Lorena W., Lorena B., Palomo, Manuel, Rosa, Rodrigo, Beni… por hacer de mi primera estancia un bonito recuerdo. Gracias al Laboratoire de Synthèse et Etude de Systèmes à Intérêt Biologuique, de la Université BlaisePascal de Clermont-Ferrand (Francia) dirigido por la profesora Anne-Marie Delort. Gracias, en particular, a Bruno por tu interés y empeño en obtener resultados y sacar el artículo adelante. Gracias al Fungal Biotechnology Group de la University of Westminster, de Londres (Reino Unido), dirigido por el profesor Tajalli Keshavarz. Gracias a Romeo, Rakesh, Orr, Tati y, muy especialmente, a la loquita de Tata, por vuestras enseñanzas y vuestra amistad. Además, quisiera agradecer al profesor Juan Carlos García Monteagudo, del departamento de Química Física de la Facultad de Farmacia, sus enseñanzas sobre la voltametría cíclica y su colaboración en nuestra investigación, poniendo a nuestra entera disposición su equipo y su laboratorio. Gemma, eres la mejor compañera de trabajo del mundo! Mis dudas, mis quejas, mis problemas, mis tomas de muestra nocturnas, mis medidas, mis fracasos y mis éxitos han sido también tuyos. Gracias por compartir trabajo, diversión, congresos, cenas, confidencias… ¡Te quiero siempre a mi lado! Iñaki, Juani, Thelmo, Ángeles, gracias por vuestras lecciones. Juanca, Pablo, Lara, Alejandra, Ana, Lorena, compañeros de “hongos”, gracias por compartir poyata, risas, penas y alegrías, logrando el mejor ambiente de trabajo. Ana, gracias por ser mi mejor (y única, pero eso no importa) discípula, y por la parte de este trabajo que te corresponde. Mar, un “gracias” por cada muestra analizada en el HPLC, y Magda, un “gracias” por cada medida de toxicidad. Luis, un “gracias” por cada duda resuelta acerca de los bichitos esos que se escapan de mi ámbito más cercano. Rosa, un “gracias” por cada duda resuelta, cada dibujo escaneado, cada viaje organizado, cada café, cada broma y cada sonrisa. Javi, un “gracias” por cada dibujo, cada modificación, cada duda sobre informática y mil “gracias” por cada dibujo en Flash. ¡Siempre dan que hablar! Deberías hacer un Copy Right. Y ahora necesitaría 300 páginas más para seguir dando mis particulares gracias, porque no creo que sea posible separar la vida laboral de la afectiva, y en el éxito de esta última hay mucha gente involucrada. Belén, eres única y creas adición. Sé siempre así. Almu, sé que siempre puedo recurrir a ti, para todo. Marta, gracias por nuestras largas conversaciones. Mantengámoslas. Gonzalo, sigue sugiriendo churrascos, haces que estemos unidos. Sonia y Elena, gracias porque ya sois más amigas que compañeras de trabajo. Christian, ¡no dejes de visitarnos! Jose, gracias porque eres mucho más que mi ex−compañero de despacho. Alex, gracias por haberme hecho un huequito, por lo que hemos vivido y viviremos juntos. Como tú dices, sobran las palabras… A los que no aparecéis aquí, a las de la playa, las de la resi y las de Sarria. Gracias a mi familia. A Merce, porque eres todo lo que puede ser una hermana. Yo intento seguirte… A mis padres, por estar en cada momento, dedicarse a mí y por tantas cosas que no van a caber aquí. Ante todos me quito el sombrero. No dejéis de estar ahí! Índice i Índice Objetivos y resumen Obxectivos e resumo Objectives and abstract Capítulo 1. Introducción Resumen 1. Tintes industriales 1.1. Aplicaciones 1.2. Clasificación 2. Impacto ambiental de los efluentes coloreados 2.1. Efectos ecológicos 2.2. Efectos toxicológicos 2.3. Minimización de los impactos 3. Tecnologías para el tratamiento de efluentes coloreados 3.1. Tratamientos químicos 3.2. Tratamientos físicos 3.3. Tratamientos biológicos 4. Tratamiento de efluentes coloreados mediante hongos ligninolíticos 4.1. Hongos ligninolíticos 4.2. Aplicaciones 4.3. Degradación de tintes 5. Tratamiento de efluentes coloreados mediante enzimas ligninolíticas 5.1. Enzimas ligninolíticas 5.2. Manganeso peroxidasa 5.3. Peroxidasa versátil 5.4. Aplicaciones 6. Reactores enzimáticos 6.1. Reactores enzimáticos de membrana 6.2. Otros reactores enzimáticos 6.3. Aplicaciones 7. Referencias Capítulo 2. Materiales y métodos Resumen 1. Compuestos químicos 1 5 9 13 13 15 15 17 19 21 22 22 23 23 25 26 30 30 31 32 34 34 35 38 39 40 42 44 44 46 59 59 61 Objetivos y resumen 2 iv) Obtención, a partir del proceso en discontinuo, de un modelo cinético que permita el diseño de reactores, la simulación de procesos en continuo y la optimización de las condiciones de operación (Capítulos 3, 4 y 6). v) Identificación del mecanismo de degradación enzimática del tinte Orange II y cuantificación de los productos intermedios y finales, para evaluar la toxicidad del efluente generado (Capítulo 7). vi) Estudio del postratamiento de Orange II, mediante procesos anaerobios y aerobios, para determinar cuál de los procesos bacterianos es más adecuado para el tratamiento del efluente de la degradación enzimática (Capítulo 8). vii) Estudio de la energía relativa de quelación de Mn3+ por distintos ácidos y análisis de la posibilidad de que el propio tinte Orange II tenga capacidad quelante (Capítulo 9). viii) Estudio económico de los procesos de oxidación mediante MnP y comparación con otros procesos de oxidación avanzada (Anexo). En el Capítulo 1 se realizó una revisión de los tintes industriales y sus aplicaciones, así como de los distintos procesos de tratamiento de efluentes, propuestos en la bibliografía. Más particularmente, se estudió la degradación de tintes con hongos ligninolíticos y sus enzimas oxidativas, haciendo especial hincapié en el ciclo catalítico de la enzima MnP. Por último, se realizó una revisión de las distintas configuraciones de reactor enzimático, con enzima libre o inmovilizada. En el Capítulo 2 se describió el procedimiento de fermentación del hongo Bjerkandera sp. BOS55, así como la obtención y tratamiento del crudo enzimático. Además, se describieron los procedimientos empleados a lo largo de todo el trabajo experimental: análisis de la actividad MnP y determinación de las concentraciones de Orange II y los productos de degradación. Como paso previo al tratamiento en continuo de Orange II, se llevaron a cabo ensayos de oxidación enzimática en discontinuo mediante MnP, a diferentes concentraciones iniciales de tinte y diferentes velocidades de adición de H2O2, para obtener un modelo que describiese el comportamiento cinético del proceso de decoloración. Se obtuvo una ecuación cinética que es la combinación de una ecuación tipo Michaelis-Menten con respecto a Orange II y una función lineal con respecto a la velocidad de adición de H2O2 (Capítulo 3). Objetivos y resumen 3 La primera configuración de reactor propuesta fue un reactor de tanque agitado asociado a una membrana de ultrafiltración para la separación y recirculación de la enzima (Capítulo 4). Se estudiaron diversas estrategias de adición de enzima y el efecto de parámetros tales como el nivel de actividad enzimática, la velocidad de adición de H2O2, el tipo de ácido orgánico o el tiempo de residencia hidráulico. El objetivo fue maximizar la eficacia del sistema, que alcanzó un valor 16 veces superior al obtenido en los ensayos previos en discontinuo, con una decoloración superior al 90%. Se llevaron a cabo procesos de hasta 18 días de duración, en que el reactor permaneció estable y no hubo necesidad de cambio o limpieza de la membrana. Por último, se aplicó la ecuación cinética obtenida en el Capítulo 3 a los ensayos realizados, obteniendo un buen ajuste entre los datos experimentales y los datos simulados, tanto en estado estacionario como no estacionario. Se analizó una segunda estrategia de degradación en continuo de Orange II mediante enzima inmovilizada. Para ello, se estudiaron diversas posibilidades para la inmovilización de MnP, mediante enlaces iónicos y covalentes entre la enzima y el soporte de inmovilización (Capítulo 5). Un soporte de agarosa activado con grupos glutaraldehido para la unión covalente con la enzima dio lugar a un derivado estable, con una retención enzimática del 100%, aunque el proceso de inmovilización se realiza a condiciones severas que disminuyen la actividad enzimática en un 50%. El problema de la interacción entre el tinte y el soporte se solventó en los ensayos en continuo. Se operó un reactor de tanque agitado en que la enzima se retuvo por medio de un pequeño filtro de punta de pipeta (Capítulo 6). El tinte se adsorbió en el soporte hasta que este se saturó; a partir de ese momento, la eliminación de tinte en el reactor fue debida a la degradación enzimática. La eficacia del sistema se optimizó en función de dos factores: el soporte y la enzima. Se maximizó la cantidad de enzima inmovilizada en el soporte y se minimizó el consumo de enzima mediante la modificación de las condiciones de operación (TRH y carga de Orange II en la alimentación). Se alcanzó una decoloración superior al 80% con una eficacia ligeramente mayor que la obtenida en el reactor de membrana en las mismas condiciones. Por último, se modificó la ecuación cinética propuesta en el Capítulo 3 y se aplicó a los ensayos con enzima inmovilizada, obteniéndose un ajuste correcto entre los datos experimentales y simulados. Objetivos y resumen 4 En el Capítulo 7 se determinó, mediante RMN y HPLC, el mecanismo de degradación enzimática del tinte Orange II, con el objetivo de conocer los productos de degradación y estudiar la toxicidad de los mismos. Se identificaron 9 compuestos, de los cuales 2 no se habían identificado con anterioridad (4-diazonio bencenosulfonato y 2-naftol). Esto permitió considerar tres rutas distintas de degradación de Orange II, dos de ellas basadas en una ruptura asimétrica del enlace azo y la tercera basada en la ruptura simétrica. Los compuestos generados suponen un 30% de la concentración de tinte de partida, lo que indica la existencia de otras rutas o la degradación de los productos identificados. La degradación enzimática de Orange II permite la disminución de la toxicidad original. El efluente de la degradación enzimática de Orange II se puede tratar en una planta depuradora convencional con el objetivo de eliminar el tinte residual y los compuestos procedentes de la oxidación enzimática, que aportan DQO y color. En el Capítulo 8 se estudió el postratamiento anaerobio y aerobio del efluente del proceso enzimático. En ambos procesos se eliminó un 30% de la DQO, aunque a diferencia del proceso anaerobio, en el aerobio no hubo eliminación de color. La toxicidad se incrementó en el proceso anaerobio, aunque en valores muy alejados de aquellos para los cuales un efluente se considera tóxico. La capacidad de la enzima MnP para degradar Orange II en ausencia de compuestos quelantes que estabilicen el Mn3+ generado en el ciclo catalítico hizo pensar la posibilidad de que el propio tinte tenga efecto quelante. En el Capítulo 9 se estudió por voltametría cíclica la capacidad de varios ácidos carboxílicos para complejar el ion Mn3+, se estableció un orden de energía relativa de quelación y se obtuvieron evidencias de que el tinte Orange II tiene cierta acción quelante sobre el Mn3+. Así, no es necesaria la presencia de un compuesto quelante para realizar la degradación de Orange II mediante MnP. Por último, se realizó un estudio para comparar económicamente los procesos de degradación enzimática de compuestos recalcitrantes con otros procesos de oxidación avanzada y analizar en conjunto la mejor alternativa para la degradación enzimática de compuestos (Anexo). Se tuvo en cuenta principalmente el coste de producción de la enzima, pues es el factor más relevante del proceso. Los resultados indicaron que los costes de operación del reactor enzimático de membrana se sitúan en el rango de los procesos de oxidación avanzada. Obxectivos e resumo 5 Obxectivos e resumo Os efluentes xerados nas industrias téxtiles conteñen unha fracción significativa de tinguiduras, que, por adxuntar unha intensa cor, non poden ser vertidas ós cauces naturais. Estas tinguiduras son de difícil tratamento, pois os procesos biolóxicos aerobios convencionais practicamente non son capaces de degradalas, mentres que mediante os procesos anaerobios xéranse aminas aromáticas de potencial carácter canceríxeno. Neste traballo proponse, como alternativa, a degradación de tinguiduras mediante as encimas oxidativas de fungos ligninolíticos e, en particular, a encima manganeso peroxidasa (MnP). O obxectivo global deste traballo é o desenrolo de tecnoloxías avanzadas para o tratamento en continuo de compostos xenobióticos, baseadas en procesos de oxidación enzimática in vitro. Considerouse a tinguidura azo Orange II como composto modelo, xa que polo seu carácter azo pode ser representativa dun elevado número de tinguiduras empregadas na industria téxtil. Para a consecución deste obxectivo propóñense unha serie de obxectivos específicos: i) Desenrolo dun reactor encimático de membrana para a degradación en continuo de Orange II mediante MnP. Maximización da eficacia (definida como a cantidade de tinguidura degradada por unidade de encima consumida) e estudio da estabilidade do sistema (Capítulo 4). ii) Estudio da inmobilización da encima MnP. Obtención dun soporte de inmobilización que permita unha boa capacidade de retención da encima, baixa perda de actividade enzimática durante o proceso de inmobilización, alta estabilidade da encima inmobilizada, baixa interacción entre a tinguidura e o soporte e baixo custo (Capítulo 5). iii) Desenrolo dun reactor en continuo de tanque axitado para a degradación de Orange II mediante MnP inmobilizada. Maximización da eficacia mediante a minimización do consumo de soporte e encima (Capítulo 6). Obxectivos e resumo 6 iv) Obtención, a partires do proceso en descontinuo, dun modelo cinético que permita o deseño de reactores, a simulación de procesos en continuo e a optimización das condicións de operación (Capítulos 3, 4 e 6). v) Identificación do mecanismo de degradación encimática da tinguidura Orange II e cuantificación dos productos intermedios e finais, para avaliar a toxicidade do efluente xerado (Capítulo 7). vi) Estudio do postratamento de Orange II, mediante procesos anaerobios e aerobios, para determinar cal dos procesos bacterianos é máis axeitado para o tratamento do efluente da degradación encimática (Capítulo 8). vii) Estudio da enerxía relativa de quelación de Mn3+ por distintos ácidos e análise da posibilidade de que a propia tinguidura Orange II teña capacidade quelante (Capítulo 9). viii) Estudio económico dos procesos de oxidación mediante MnP e comparación con outros procesos de oxidación avanzada (Anexo). No Capítulo 1 realizouse unha revisión das tinguiduras industriais e as súas aplicacións, así como dos distintos procesos de tratamento de efluentes propostos na bibliografía. Máis particularmente, estudiouse a degradación de tinguiduras con fungos ligninolíticos e as súas encimas oxidativas, facendo especial fincapé no ciclo catalítico da encima MnP. Por último, realizouse unha revisión das distintas configuracións de reactor encimático, con encima libre ou inmobilizada. No Capítulo 2 describiuse o procedemento de fermentación do fungo Bjerkandera sp. BOS55, así como a obtención e tratamento do crudo encimático. Ademais, describíronse todos os procedementos empregados ó longo de todo o traballo experimental: análise da actividade MnP e determinación das concentracións de Orange II e os productos de degradación. Como paso previo ó tratamento en continuo de Orange II, leváronse a cabo ensaios de oxidación enzimática en descontinuo mediante MnP, a diferentes concentracións iniciais de tinguidura e diferentes velocidades de adición de H2O2, para obter un modelo que describise o comportamento cinético do proceso de degradación. Obtívose unha ecuación cinética que é a combinación dunha ecuación tipo Michaelis-Menten con respecto a Orange II e unha función lineal con respecto á velocidade de adición de H2O2 (Capítulo 3). Obxectivos e resumo 7 A primeira configuración de reactor proposta foi un reactor de tanque axitado asociado a unha membrana de ultrafiltración para a separación e recirculación da encima (Capítulo 4). Estudiáronse diversas estratexias de adición de encima e o efecto de parámetros como o nivel de actividade encimática, a velocidade de adición de H2O2, o tipo de ácido orgánico ou o tempo de residencia hidráulico. O obxectivo foi maximizar a eficacia do sistema, que acadou un valor 16 veces superior ó obtido nos ensaios previos en descontinuo, cunha eliminación de cor superior ó 90%. Leváronse a cabo procesos de ata 18 días de duración, en que o reactor permaneceu estable y non houbo necesidade de cambio ou limpeza da membrana. Por último, aplicouse a ecuación cinética obtida no Capítulo 3 ós ensaios realizados, obtendo un bo axuste entre os datos experimentais e os datos simulados, tanto en estado estacionario como non estacionario. Analizouse unha segunda estratexia de degradación en continuo de Orange II mediante encima inmobilizada. Para iso, estudiáronse diversas posibilidades para a inmobilización de MnP, mediante enlaces iónicos e covalentes entre a encima e o soporte de inmobilización (Capítulo 5). Un soporte de agarosa activado con grupos glutaraldehido para a unión covalente coa encima deu lugar a un derivado estable, cunha retención encimática do 100%, aínda que o proceso de inmobilización realízase a condicións severas que diminúen a actividade encimática nun 50%. O problema da interacción entre a tinguidura e o soporte eliminouse nos ensaios en continuo. Operouse un reactor de tanque axitado no que a encima se retivo por medio dun pequeno filtro de punta de pipeta (Capítulo 6). A tinguidura adsorbeuse no soporte ata que este se saturou; a partires dese momento, a eliminación de tinguidura no reactor foi debida á degradación encimática. A eficacia do sistema optimizouse en función de dous factores: o soporte e a encima. Maximizouse a cantidade de encima inmobilizada no soporte e minimizouse o consumo de encima mediante a modificación das condicións de operación (TRH e carga de Orange II na alimentación). Acadouse unha eliminación de cor superior ó 80% cunha eficacia lixeiramente maior que a obtida no reactor de membrana nas mesmas condicións. Por último, modificouse a ecuación cinética proposta no Capítulo 3 e aplicouse ós ensaios con encima inmobilizada, obténdose un axuste correcto entre os datos experimentais e os simulados. No Capítulo 7 determinouse, mediante RMN e HPLC, o mecanismo de degradación encimática da tinguidura Orange II, co obxectivo de coñecer os Obxectivos e resumo 8 productos de degradación e estudiar a toxicidade dos mesmos. Identificáronse 9 compostos, dos cales 2 non se identificaran con anterioridade (4-diazonio bencenosulfonato e 2-naftol). Esto permitiu considerar tres rutas distintas de degradación de Orange II, dúas delas baseadas nunha ruptura asimétrica do enlace azo e a terceira baseada na ruptura simétrica. Os compostos xerados supoñen un 30% da concentración de tinguidura de partida, o que indica a existencia doutras rutas ou a degradación dos productos identificados. A degradación encimática de Orange II permite a diminución da toxicidade orixinal. O efluente da degradación encimática de Orange II pódese tratar nunha planta depuradora convencional co obxectivo de eliminar a tinguidura residual e os compostos procedentes da oxidación encimática, que aportan DQO e cor. No Capítulo 8 estudiouse o postratamento anaerobio e aerobio do efluente do proceso encimático. En ambos procesos eliminouse un 30% da DQO, aínda que, a diferencia do proceso anaerobio, no aerobio non houbo eliminación de cor. A toxicidade incrementouse no proceso anaerobio, aínda que en valores moi lonxe daqueles para os cales un efluente considérase tóxico. A capacidade da encima MnP para degradar Orange II en ausencia de compostos quelantes que estabilicen o Mn3+ xerado no ciclo catalítico fixo pensar a posibilidade de que a propia tinguidura teña efecto quelante. No Capítulo 9 estudiouse por voltametría cíclica a capacidade de varios ácidos carboxílicos para complexar o ión Mn3+, estableceuse unha orde de enerxía relativa de quelación e obtivéronse evidencias de que Orange II ten certa acción quelante sobre o Mn3+. Así, non é necesaria a presencia dun composto quelante para realizar a degradación de Orange II mediante MnP. Por último, realizouse un estudio para comparar economicamente os procesos de degradación encimática de compostos recalcitrantes con outros procesos de oxidación avanzada e analizar en conxunto a mellor alternativa para a degradación encimática de compostos (Anexo). Tívose en conta principalmente o custe de producción da encima, pois é o factor máis relevante do proceso. Os resultados indicaron que os custes de operación do reactor encimático de membrana sitúanse no rango dos procesos de oxidación avanzada. Objectives and abstract 9 Objectives and abstract The effluents generated in textile industries present a significant concentration of dyes, which cannot be disposed into the natural streams due to their high color. These dyes are very difficult to be treated, as the conventional aerobic biological processes can hardly degrade them, whereas potential carcinogenic aromatic amines are generated during the anaerobic processes. In this work, an alternative is presented, based on the degradation of dyes by the oxidative enzymes from white-rot fungi, and especially the enzyme manganese peroxidase (MnP). The main objective of this work is the development of advanced technologies for the continuous treatment of xenobiotic compounds, based on in vitro enzymatic oxidation processes. The dye Orange II is considered as a model compound, since its azo bound can be representative of a high number of the dyes used in the textile industry. Some specific objectives are proposed for this aim: i) Development of an enzymatic membrane reactor for the continuous degradation of Orange II by MnP. Maximization of the efficiency (defined as the amount of dye degraded per unit of enzymatic activity consumed) and study of the stability of the system (Chapter 4). ii) Study of the MnP immobilization. Development of an immobilization support which allows a good enzyme retention capacity, a low activity loss during the immobilization process, a high stability of the immobilized enzyme, a low interaction between the dye and the support and a low cost (Chapter 5). iii) Development of a continuous stirred tank reactor for the degradation of Orange II by immobilized MnP. Maximization of the efficiency by means of the minimization of both the support and the enzyme consumption (Chapter 6). iv) Establishment of a kinetic model by means of the assays performed in a discontinuous operation. Application of the model to reactor design, Objectives and abstract 10 simulation of continuous operation and optimization of the operation conditions (Chapters 3, 4 and 6). v) Identification of the enzymatic degradation mechanism of Orange II, quantification of the intermediates and final products and evaluation of the generated effluent toxicity (Chapter 7). vi) Study of the Orange II postreatment, by both anaerobic and aerobic processes, aiming to determine the most adequate biological process for the treatment of the enzymatic degradation effluent (Chapter 8). vii) Study of the relative Mn3+ chelating energy of different acids and analysis of the possible chelating capacity of Orange II (Chapter 9). viii) Economic study of the MnP oxidation processes and comparison with other advanced oxidation processes (Appendix). In Chapter 1, a revision of the different industrial dyes, their applications and processes for the treatment of effluents proposed in the bibliography was carried out. Specifically, dye degradation by white-rot fungi and their oxidative enzymes was evaluated, with special emphasis on the catalytic cycle of MnP. Finally, a revision of the different configurations of enzymatic reactors with free and immobilized enzymes was considered. In Chapter 2, both the fermentation process of the fungus Bjerkandera sp. BOS55 and the treatment of the enzymatic crude obtained were described. Moreover, a description of the experimental procedures applied was made: determinations of MnP activity and the concentrations of Orange II and related degradation products. As a previous step for the continuous treatment of Orange II, discontinuous assays by MnP were performed, with different initial dye concentrations and different H2O2 addition rates, aiming to obtain a model that could describe the kinetic behaviour of the decolorization process. A kinetic equation was obtained as a combination of a Michaelis-Menten equation related to Orange II and a linear function related to the H2O2 addition rate (Chapter 3). The first reactor configuration proposed is a stirred tank reactor coupled to an ultrafiltration membrane for the retention and recycling of the enzyme (Chapter 4). Some strategies for the enzyme addition and the effect of parameters such as enzymatic activity, H2O2 addition rate, organic acid and hydraulic retention time Objectives and abstract 11 were studied. The objective was to maximize the efficiency of the system, which reached a level that was 16-fold the one obtained in the previous discontinuous assays, with a decolorization higher than 90%. A 18-day process was carried out, and the reactor was stable and the membrane was not changed or cleaned. Finally, the kinetic equation that had been obtained in Chapter 3 was applied to the continuous assays performed, obtaining a good adjustment between the experimental and simulated data, in both stationary and non-stationary states. A second strategy for the continuous degradation of Orange II was studied, using immobilized enzyme. With this purpose, some possibilities for MnP immobilization were analyzed, by means of ionic or covalent bonds between the enzyme and the support (Chapter 5). An agarose support activated with glutaraldehyde groups for the covalent attachment with the enzyme gave a stable derivative, with an enzymatic retention of 100%, although the immobilization process was performed under strong conditions that diminish the enzymatic activity about 50%. The problem of the interaction between the dye and the support was overcome in the continuous operation. A stirred tank reactor where a small filter retained the immobilized enzyme into the vessel was operated (Chapter 6). The dye was adsorbed into the support till saturation; thereafter, the removal of dye was due to the enzymatic degradation. The efficiency of the system was optimized by means of the modification of two factors: the support and the enzyme. The amount of enzyme immobilized onto the support was maximized and the enzyme consumption was minimized by the variation of the operational conditions (HRT and Orange II loading rate). The system reached a decolorization higher than 80% and an efficiency higher than that obtained in the enzymatic membrane reactor with the same conditions. Finally, the kinetic equation proposed in Chapter 3 was modified and applied to the assays with immobilized enzyme, obtaining a correct adjustment between the experimental and simulated data. In Chapter 7, the mechanism for the enzymatic degradation of the dye Orange II was studied by NMR and HPLC, aiming to know the degradation products and study their toxicity. Nine compounds were identified: two of them had not been identified before (4-diazonium benzenesulfonate and 2-naphtol). Having these products in mind, three degradation pathways were considered: two of them were based on the asymmetric cleavage of the azo bond and the third one was based on the symmetric cleavage. The compounds generated accounted for Capítulo 1 18 NN Azo O O Carbonilo N N NN N N HH N N Ftalocianina R N 2 NR 2 + Ion arilcarbonio N SS S O SR N S O SR R R RR Sulfuro R R n=0,1,2,... N R R .. + N n Polimetino O N 2 2 NO NO OH 2 Nitro Figura 1.1. Estructura de las distintas clases de tintes empleados en la industria textil Según el modo de aplicación Dado que la aplicación más común de los tintes industriales es la tinción de fibras en la industria textil, se ha desarrollado una clasificación de los tintes en función de su método de aplicación. La forma de fijación de la molécula de colorante a la fibra se realiza generalmente en disolución acuosa mediante alguna de las siguientes interacciones: uniones iónicas, puentes de hidrógeno, fuerzas de Van der Waals o enlaces covalentes. La Tabla 1.2 muestra la clasificación de los tintes en función del modo de aplicación a la fibra, así como las fibras a las cuales se aplican (Waring & Hallas, 1990; Guaratini & Zanoni, 2000). Introducción 19 Tabla 1.2. Clasificación de los tintes en función del método de aplicación a las fibras Clase de tinte Descripción Tipo de enlace Aplicación Ácido Mordiente Premetalizado Directo Reactivo De tina Disperso Básico Aniónico con grupos sulfónicos Requiere metales mordientes Complejos con iones metálicos Más de un grupo azo Grupo electrofílico reactivo Insoluble, se reduce y oxida sobre la fibra Insoluble, se hidroliza y precipita sobre la fibra Catiónico Interacción iónica Interacción iónica Interacción iónica Van der Waals Enlace covalente Interacción iónica Interacción iónica Interacción iónica Lana, seda, poliamida Lana, seda Lana, seda, poliamida Algodón Algodón, lana, seda, poliamida Algodón, viscosa Celulosa, nylon, poliéster Poliéster, acrílicos Los tintes reactivos son los más utilizados en la industria textil, debido a la fortaleza del enlace covalente, que los hace persistentes y les confiere buenas propiedades de solidez al lavado. Estos tintes se introdujeron comercialmente para su aplicación a fibras de celulosa, aunque en la actualidad también se aplican a fibras de proteína, poliamida o poliéster. 2. Impacto ambiental de los efluentes coloreados Aunque la industria de la fabricación de tintes representa una parte relativamente pequeña de la industria química, es importante el impacto ambiental que producen los efluentes que se generan. El tratamiento de estos efluentes viene determinado por una serie de características de la industria de los colorantes: Capítulo 1 20 i) Producción: En el mundo existen más de 100.000 tintes disponibles comercialmente (Kirby et al., 1995; Robinson et al., 2001) con una producción de más de 7·105 t/año (Meyer, 1981; Zollinger, 1987). ii) Variabilidad de tintes: Un 90% de los tintes se comercializan en cantidades inferiores a 100 t/año y sólo un 1% lo hacen en cantidades mayores de 1.000 t/año (Reife & Freeman, 1996; O´Neill et al., 1999). iii) Resistencia: La exigencia actual de la industria textil radica en la búsqueda de tintes con estabilidad química y fotolítica cada vez más elevadas. Se diseñan tintes resistentes a la ruptura debida a la exposición a la luz, agua, jabones o lejías. iv) Alto consumo de agua: La tinción es un proceso húmedo, en el que se consumen 160 kg de agua/kg de producto acabado. El volumen de efluente representa un 90-95% del agua utilizada (Blánquez, 2005). v) Elevadas pérdidas: Sobre un 2% de la producción mundial de tintes se pierde en el efluente en procesos de fabricación (O´Neill et al., 1999), mientras que un 10-15% se pierde en los procesos de tinción, como consecuencia de la incompleta fijación de los colorantes a las fibras. Este porcentaje representa la descarga de 200 t/d de estos compuestos al medio ambiente (Guaratini & Zanoni, 2000). Este porcentaje depende en gran medida del tipo de tinte y fibra que participan en la tinción, alcanzando valores desde 5% para tintes básicos hasta 50% para tintes reactivos (McMullan et al., 2001). vi) Altamente visible: Valores del orden de mg/L de tinte en las aguas son visibles para el ojo humano. Para algunas clases de tintes ese valor disminuye a 0,005 mg/L en un cauce limpio (Gutiérrez & Crespi, 1999a). vii) Variabilidad en la caracterización de las aguas: En función del tipo de tinte aplicado, la fibra sobre la que se aplica y las distintas etapas en el proceso de tinción, las aguas generadas presentan características muy diferentes en cuanto a DQO, DBO, color, sólidos, C, N, P o sales (Vandevivere et al., 1998; Bisschops & Spanjers, 2003). Todas estas características hacen que el vertido de efluentes de la industria textil se haya convertido en un problema ecológico y toxicológico a nivel mundial. Introducción 21 2.1. Efectos ecológicos La baja solubilidad de los pigmentos permite que estos sean mucho más fáciles de eliminar de las aguas por tratamientos físico-químicos. Sin embargo, los tintes presentan alta solubilidad, la cual se ve favorecida por la presencia de determinados grupos, tales como los sulfónicos. El primer efecto que causa el vertido de aguas residuales con tintes disueltos es el visual (Figura 1.2) y se presenta a concentraciones muy bajas de tinte. El hecho de transformar el entorno de cauces naturales es un aspecto negativo que debe ser solventado. El uso de esas aguas ya queda limitado, no siendo aptas para el consumo humano. Figura 1.2. Efecto visual del vertido de efluentes coloreados sobre ríos El principal problema ambiental derivado del aporte de color a las aguas de los ríos y lagos se debe a la reducción de la transparencia y la disminución del oxígeno disuelto, debido a que altas cargas de color dificultan la función fotosintética de las plantas. Adicionalmente algunos problemas asociados a los efluentes textiles son debidos a la presencia de metales pesados o azufre, que producen problemas ambientales debido a su naturaleza tóxica. Capítulo 1 22 2.2. Efectos toxicológicos Los riesgos toxicológicos de los tintes sobre la salud humana están relacionados con el modo y tiempo de exposición. Estos compuestos presentan una baja toxicidad aguda, que es la resultante de los tiempos de exposición cortos. Esto es debido a que los tintes tienen una baja solubilidad en fluidos corporales (Christie, 2003) y una alta solubilidad en agua, de manera que estos compuestos suministrados oralmente son metabolizados en la microflora intestinal y excretados más rápidamente que los compuestos menos solubles (Guaratini & Zanoni, 2000). Estos compuestos únicamente producen efectos de poca gravedad, tales como dermatitis de contacto o sensibilización respiratoria. La toxicidad crónica debida a exposición continuada a los tintes es baja. Se ha comprobado que algunos tintes de naturaleza azoica presentan un carácter cancerígeno potencial, y al menos 3.000 colorantes azo comerciales han sido catalogados como cancerígenos (Guaratini & Zanoni, 2000). Su toxicidad radica en que pueden dar lugar a las aminas aromáticas de las cuales derivan, debido a procesos de oxidación, hidrólisis o reducción del enlace azo. Algunas aminas aromáticas utilizadas en la fabricación de los tintes son carcinógenos reconocidos (Weisburger, 2002). Aun así, el análisis del grado de toxicidad de los tintes, medido a partir de 50% de la dosis letal (LD50) ha demostrado que apenas un número reducido de tintes presenta toxicidad aguda (LD50<5 g/kg) y son principalmente tintes bis-azo y básicos (Shore, 1996). 2.3. Minimización de los impactos La legislación se está haciendo cada día más estricta en la mayor parte de los países desarrollados en cuanto a la eliminación de tintes de los efluentes textiles, lo que se está convirtiendo en un problema creciente para esta industria. La minimización de los impactos causados por este tipo de efluentes pasa por la prevención de la contaminación y la reutilización del agua y los compuestos de los efluentes generados. Prevención de la contaminación Existen una serie de técnicas de prevención de la contaminación, es decir, de reducción de la contaminación desde la fuente de origen, tales como: Introducción 23 i) Modificación del proceso: Los cambios efectuados en el proceso y la implementación de tecnología nueva para llevarlo a cabo constituyen modificaciones a las operaciones básicas de una planta. Algunas reducen el uso del agua y eliminan o minimizan la descarga de compuestos químicos tóxicos o muy fuertes. Otras se basan en la recuperación de substancias y el aprovechamiento de energía. El procedimiento con disolventes o las operaciones en continuo son algunos ejemplos. ii) Ahorro del agua de proceso: La minimización del consumo de agua en las plantas textiles da lugar a un ahorro en los costes y permite una mejor gestión de la contaminación a través de la reducción en origen. iii) Substitución de compuestos químicos: En muchos casos es posible reducir la cantidad de compuestos químicos utilizados en el procesamiento textil sin que ello produzca un efecto significativo en la calidad del producto. Otra solución es la substitución de los compuestos químicos más contaminantes por otros con menor toxicidad. 3. Tecnologías para el tratamiento de efluentes coloreados El desarrollo de la tecnología adecuada para el tratamiento de efluentes textiles es objeto de gran interés en los últimos años debido a un aumento de la mentalización y la rigidez de la reglamentación ambiental. Las principales técnicas disponibles para la decoloración de este tipo de aguas se pueden agrupar en tres grandes grupos: tratamientos químicos, físicos y biológicos (Vandevivere et al., 1998; Robinson et al., 2001; Forgacs et al., 2004). 3.1. Tratamientos químicos Reactivo de Fenton El reactivo de Fenton es una combinación de H2O2 y sales de Fe(II). El ion ferroso se oxida a férrico mientras el H2O2 produce iones hidróxido y radicales hidroxilo. Estos últimos oxidan el tinte, y el compuesto formado precipita con el ion férrico y compuestos orgánicos (Lin & Peng, 1995). Con este método se consiguen altas velocidades de decoloración si las concentraciones de los reactivos implicados son elevadas (Kuo, 1992). Sin embargo, sus principales desventajas son la generación de lodos debida a la floculación de los reactivos con Capítulo 1 24 el tinte, el coste de los lodos formados y el coste de los reactivos. Eventualmente deberá eliminarse también el hierro empleado (Gutiérrez & Crespi, 1999a). Ozonización Las técnicas de ozonización consisten en la destrucción de compuestos en base a la elevada capacidad oxidativa del ozono. La reacción de oxidación es rápida, se pueden tratar altos caudales, no se generan residuos ni lodos y se obtiene un efluente incoloro y con baja DQO, de manera que es apto para su vertido al medio ambiente (Ince & Gonenc, 1997). Sin embargo debe comprobarse la toxicidad de cada efluente concreto, pues en algunos casos los compuestos generados tienen mayor carácter tóxico que los colorantes de partida (Gutiérrez & Crespi, 1999a). Otra gran desventaja de la ozonización es su corto tiempo de vida media, aproximadamente de 20 min, lo cual repercute fuertemente en el coste del proceso (Robinson et al., 2001). Oxidación fotoquímica Este método se basa en la combinación de la radiación UV con otros compuestos, tales como H2O2 o catalizadores como TiO2, de manera que los rayos UV activan dichos compuestos y los hacen capaces de oxidar los tintes. Este método presenta una elevada eficacia y no genera lodos ni olores. Sin embargo las necesidades de una fuente de radiación, el coste, la lentitud del proceso y las dificultades de implementación a gran escala hacen que este método sea poco efectivo a nivel industrial (Kunz et al., 2002). Oxidación electroquímica Los procesos electroquímicos se basan en la hidrólisis del colorante mediante un potencial o corriente controlada o a través de agentes secundarios generados electrolíticamente. Los procesos son limpios, operan a baja temperatura y en muchos casos no requieren la adición de productos químicos a las aguas residuales (Ochoa, 1995). El alto consumo de energía y la generación de compuestos secundarios por reacciones paralelas disminuyen la potencialidad del método (Guaratini & Zanoni, 2000). Introducción 25 Otros procesos químicos Se han propuesto otros muchos métodos de eliminación de colorantes de las aguas, ya sean basados en procesos oxidativos con NaOCl (Chang et al., 1996) o mediante la formación de complejos insolubles con ligandos (Buschmann, 1992). 3.2. Tratamientos físicos Adsorción La eficacia del proceso de adsorción está influenciada por una gran variedad de parámetros, entre ellos la interacción entre el tinte y el soporte, superficie específica, tamaño de la partícula, temperatura, pH o tiempo de contacto (Kumar et al., 1998). La eficacia del método depende en gran medida del tipo de soporte elegido. Se emplean tanto soportes inorgánicos como orgánicos. Los primeros tienen una gran estabilidad mecánica y química, alta superficie específica y alta resistencia a la degradación microbiana. Los soportes orgánicos se generan a partir de fuentes renovables o son residuos industriales. Los procesos de adsorción generan efluentes de alta calidad, pero tienen una serie de desventajas que los hace ineficaces para el tratamiento de efluentes coloreados: son procesos lentos; no selectivos, de manera que hay una competición entre las moléculas de tinte y otros compuestos presentes en el efluente; no destructivos, generándose un residuo que debe ser eliminado; la desorción es un proceso muy difícil y costoso; los adsorbentes suelen ser caros y en ocasiones requieren un proceso de activación previo (Forgacs et al., 2004). Membranas de filtración Los métodos de tratamiento basados en el empleo de membranas permiten una separación efectiva de las moléculas de colorante y otros compuestos de tamaño mayor al del poro de la membrana seleccionada. Principalmente se emplean las técnicas de ósmosis inversa y nanofiltración (Reife & Freeman, 1996). Se logra tratar grandes volúmenes de efluente en continuo de un modo rápido y satisfactorio. La generación de un residuo con una alta concentración de contaminante y la dificultad y coste de substitución de las membranas son las principales desventajas de estas técnicas (Robinson et al., 2001). Capítulo 1 26 Intercambio iónico El efluente pasa a través de las membranas de intercambio iónico hasta su saturación. La principal ventaja de esta técnica es que no hay pérdida de adsorbente durante su regeneración. Sin embargo, el coste es elevado, los disolventes necesarios para la limpieza son caros y es un método no apto para todo tipo de tintes (Slokar & Le Marechal, 1997). Coagulación-floculación Los métodos de coagulación-floculación se basan en la adición de polielectrolitos o floculantes inorgánicos (sales de hierro o aluminio), que forman flóculos con las moléculas de colorante facilitando su eliminación por sedimentación. Las eficacias de eliminación son altas, pero en el proceso se generan lodos que deben ser eliminados. Además los mejores rendimientos se logran al aplicar un exceso de coagulante, que aumenta la concentración de contaminante en el efluente (Gahr et al., 1994). La Tabla 1.3 muestra algunas aplicaciones de los distintos métodos químicos y físicos en la eliminación de colorantes de las aguas residuales, tanto sintéticas como reales, de la industria textil. 3.3. Tratamientos biológicos La aplicación de microorganismos a la degradación de aguas que contienen tintes sintéticos es una opción atractiva, aunque la mayor parte de estos compuestos son químicamente muy estables y resistentes al ataque microbiano. El estudio de tratamientos biológicos para la biodegradación de estos compuestos adquiere gran importancia por las ventajas que el método presenta: los procesos son relativamente económicos, los costes de operación son bajos y se pueden generar efluentes limpios tras la degradación parcial o total de los productos iniciales. Tratamiento bacteriano anaerobio La eficacia de los tratamientos anaerobios en la degradación de tintes ha sido ampliamente estudiada y demostrada, tanto con cultivos mixtos como con cepas Introducción 27 Tabla 1.3. Aplicación de distintos métodos físico-químicos al tratamiento de aguas residuales conteniendo tintes Método Tinte degradado Referencia Reactivo de Fenton Ozonización Oxidación fotoquímica Oxidación electroquímica Adsorción Membranas filtración Intercambio iónico Coagulación-floculación Tintes azo Antraquinona-sulfonato Orange II Tintes ácidos y reactivos Moléculas con doble enlace Tintes azo Tintes reactivos Aminoclorotrizinas Tintes reactivos Orange II Acid Blue 40 Aguas residuales textiles Tintes reactivos Tintes Tintes azo Aguas residuales textiles Methyl Orange Tintes azo Orange II Tintes ácidos Tintes ácidos Congo red Brilliant Yellow Porción Orange, Congo red Methylene Blue Remazol Brilliant Blue Tintes aniónicos Aguas residuales textiles Acilan Blue Solozhenko et al., 1995 Kiwi et al., 1993 Bandara et al., 1997 Hassan & Hawkyard, 2002 Slokar & Le Marechal, 1997 Shu & Huang, 1995 Peralta-Zamora et al., 1999 Arslan-Alaton et al., 2004 Peralta-Zamora et al., 1999 Vinodgopal et al., 1996 Tang & An, 1995 Kanmani & Thanasekaran, 2003 y 2004 Pelegrini et al., 1999 Gutiérrez & Crespi, 1999b McClung & Lemley, 1994 Lin & Peng, 1996 Sanromán et al., 2004 Bechtold et al., 2002 Jain et al., 2003 Poots & McKay, 1976 Walker & Weatherley, 1997 Namasivayam & Arisi, 1997 Yoshida & Takemori, 1997 Namasivayam et al., 1996 Dobbs et al., 1995 El-Sharkawy, 2001 Porter & Gomes, 2000 Slokar & Le Marechal, 1997 Ogutveren et al., 1992 Capítulo 1 34 5. Tratamiento de efluentes coloreados mediante enzimas ligninolíticas 5.1. Enzimas ligninolíticas Las principales enzimas ligninolíticas son oxidasas (lacasa) y peroxidasas (LiP y MnP). Son enzimas oxidativas que no requieren otros componentes celulares para poder desarrollar su función, tienen una gran especificidad por el substrato y son capaces de transformar una gran variedad de compuestos tóxicos. Además estas enzimas están fácilmente disponibles en la naturaleza y han sido ampliamente estudiadas a lo largo de los últimos años como catalizadoras de reacciones de degradación de compuestos recalcitrantes (Torres et al., 2003). Ambos tipos de enzimas ligninolíticas están glicosiladas, lo que aumenta su estabilidad (Nie et al., 1999). Las peroxidasas son enzimas con un grupo hemo, que requieren la presencia de peróxido de hidrógeno para oxidar la lignina. Tienen pesos moleculares entre 35 y 47 kDa, puntos isoeléctricos entre 2,8 y 5,4 y potenciales de oxidación de 1450-1510 mV (Mester & Tien, 2000; Wesenberg et al., 2003). Las principales peroxidasas ligninolíticas son: LiP, que oxida compuestos fenólicos y no fenólicos, y MnP, que oxida compuestos fenólicos y emplea preferentemente Mn2+ como substrato reductor. Lacasa es una fenoloxidasa que oxida fenoles y aminas aromáticas, utilizando oxígeno molecular como oxidante, que se reduce a agua por medio de la transferencia de cuatro electrones. La enzima lacasa tiene pesos moleculares entre 50 y 300 kDa, puntos isoeléctricos ácidos y potenciales de oxidación de 500-800 mV (Call & Mücke, 1997; Wesenberg et al., 2003). El ciclo catalítico de las peroxidasas ligninolíticas es similar al de otras peroxidasas. La forma férrica nativa de la enzima reacciona con una molécula de H2O2, de manera que se genera el llamado compuesto I, que es una forma de la enzima con un estado de oxidación superior en dos equivalentes a la forma nativa (Reacción 1). Durante la oxidación de la forma férrica, se toma un electrón de la forma Fe3+ y el otro del anillo porfirínico, de manera que se generan Fe4+ y un radical porfirínico. A continuación este compuesto I se reduce en dos pasos sucesivos por medio de un substrato, que opera como reductor. En un primer paso (Reacción 2) se forma el compuesto II, que es un intermediario con un grupo Fe4+, y la forma radical del substrato. En el segundo paso (Reacción 3) se produce la Introducción 35 reducción de la enzima a la forma férrica nativa, y se emplea una nueva molécula de substrato, generándose por consiguiente una nueva forma oxidada de la misma (Nakayama & Amachi, 1999; Mester & Tien, 2000). Las dos primeras reacciones (enzima nativa y compuesto I) son rápidas, mientras que la reacción del compuesto II suele ser unas 10 veces más lenta (Kuan et al., 1993). En exceso de H2O2 el compuesto II da lugar a una forma inactiva de la enzima (Reacción 4). [ ] OH Fe(IV)· I Compuesto OH férrica Enzima 2 k 22 1+⎯→⎯+ (1) [ ] [ ] R· Fe(IV) II Compuesto RH ·Fe(IV) I Compuesto 2 k+⎯→⎯+ (2) [ ] OH R· férrica Enzima RH Fe(IV) II Compuesto 2 k3++⎯→⎯+ (3) [ ] III Compuesto OH Fe(IV) II Compuesto 4 k 22 ⎯→⎯+ (4) Debido a que Phanerochaete chrysosporium, el hongo de podredumbre blanca más comúnmente estudiado, produce una alta actividad LiP, esta enzima se consideró tradicionalmente la más importante en la degradación de la lignina. Sin embargo, las condiciones óptimas de producción de LiP no son adecuadas para muchos hongos de podredumbre blanca, y especialmente los hongos con mayor eficiencia en la degradación de lignina no fueron capaces de degradarla en dichas condiciones. Además, se encontró que diferentes hongos ligninolíticos no producen LiP, sino únicamente MnP o lacasa. El estudio de varias cepas diferentes de hongos evidenció la presencia de MnP en todas ellas, mientras que la producción de LiP fue más difícil de demostrar (Hatakka, 1994). Este hecho centró el interés en el empleo de MnP como enzima ligninolítica adecuada para la degradación de lignina y otros compuestos. 5.2. Manganeso peroxidasa La enzima manganeso peroxidasa se descubrió por primera vez en el hongo de podredumbre blanca Phanerochaete chrysosporium (Kuwahara et al., 1984; Glenn & Gold, 1985; Paszczynski et al., 1985). Muchos grupos de hongos son capaces de producir MnP en múltiples formas, siendo los más comunes los de los géneros Pleurotus (Asada et al., 1995), Trametes (Johansson & Nyman, 1993), Phlebia (Karhunen et al., 1990) o Bjerkandera (de Jong et al., 1992). Capítulo 1 36 Generalmente la enzima MnP procedente de un mismo hongo se presenta en diferentes formas o isoenzimas, de manera que catalizan una misma reacción cinética pero se diferencian en el peso molecular, la carga o las constantes cinéticas, y están codificadas por diferentes genes. Así, se ha encontrado que el hongo Ceriporiopsis subvermispora produce hasta 11 isoenzimas (Hofrichter, 2002). Bjerkandera adusta produce dos isoenzimas, con pesos moleculares de 44 kDa. Tras la desglicosilación, la masa de la forma MnP1 se redujo a 42,7 kDa, lo que significa que la forma glicosilada contiene un 3% de carbohidratos. Los puntos isoeléctricos para ambas formas son 3,45 para MnP1 y 3,35 para MnP2 (Heinfling et al., 1998a). La estructura de MnP se puede dividir en tres regiones: zona distal, región próxima y sitio activo. La región distal contiene una serie de residuos (His, Arg, Asp y Leu) que intervienen en la reacción de la forma nativa de la enzima con H2O2. La región próxima es responsable de la reactividad frente a estabilidad del grupo hemo. El residuo encargado de conferir estabilidad al estado Fe4+ del grupo hemo es His. El sitio activo de MnP con Mn2+ se considera que está formado por un propionato hemo y Glu35, Glu39 y Asp179 (Mester & Tien, 2000). El ciclo tradicional de la enzima MnP comienza mediante una oxidación de la forma nativa por medio de una molécula de H2O2, de manera que se genera una forma oxidada de la enzima (compuesto I), con un estado de oxidación dos niveles superior al de la forma nativa, y una molécula de agua. El compuesto I es posteriormente reducido por medio de la oxidación de Mn2+, generándose Mn3+ y el compuesto II, en un estado de oxidación superior al de la enzima original. Por último se produce una nueva reducción de la enzima hasta recuperar la forma férrica. Esta nueva reducción implica la oxidación de otro Mn2+ a Mn3+. El compuesto II, en exceso de H2O2, da lugar a una forma inactiva (compuesto III). En la Figura 1.3 se muestra el ciclo catalítico de la enzima MnP. MnP es una enzima dependiente del manganeso, pues a pesar de que tanto Mn2+ como varios compuestos fenólicos pueden reducir la forma MnP I a MnP II (Wariishi et al., 1988), sólo Mn2+ es capaz de realizar la reducción de MnP II a la forma nativa MnP (Kuan et al., 1993). Cuando Mn2+ es el substrato reductor, por cada ciclo catalítico de la enzima se generan dos formas de Mn3+, que actúa como oxidante de otros compuestos, con un potencial redox de 1,5 V. El Mn3+ es un oxidante de pequeño tamaño, por tanto tiene acceso a un gran número de Introducción 37 Figura 1.3. Ciclo catalítico de la enzima manganeso peroxidasa compuestos que la enzima no podría alcanzar. Sin embargo, Mn3+ es un compuesto inestable en disolución acuosa, de manera que necesita formar un complejo estable con algún ácido orgánico. Los α-hidroxiácidos actúan quelando el Mn3+ y de esta forma facilitan la disociación de Mn2+-MnP I (Wariishi et al., 1989). La fuente de H2O2 para la iniciación del ciclo catalítico de la enzima puede provenir de dos orígenes: i) la reducción directa de O2 por medio de otras enzimas del propio hongo, tales como aril alcohol oxidasas (AAO) para Bjerkandera adusta o Pleurotus eryngii o glioxal oxidasa en el caso de Phanerochaete chrysosporium (Gómez-Toribio et al., 2001); ii) mediante la generación de radicales superóxido (O2•−) que proceden de la autooxidación de productos de reacción (Guillén et al., 1997). MnP MnP I MnP II H2O2H2O Mn2+ Mn3+ Mn2+ Mn3+ MnP III (inactiva) H2O2 H2O Capítulo 1 38 El ciclo catalítico de MnP también conlleva la generación de O2 como resultado de la actividad peroxidasa sobre el Mn2+, y es debida a la oxidación parcial de H2O2 por parte del Mn3+ generado por la enzima. La producción de O2 se hace más patente cuando hay ausencia de substratos susceptibles de oxidación por parte de Mn3+ (Martínez et al., 1996a). La capacidad oxidativa de la enzima MnP se puede ver incrementada en presencia de compuestos que actúen como mediadores, tales como tioles (cisteína o glutation) (Wesenberg et al., 2003) o ácidos grasos insaturados (Tween 80) (Mester & Tien, 2000). 5.3. Peroxidasa versátil La mayor parte de las MnP descritas parecen seguir el ciclo general mostrado en la Figura 1.3, pero hay algunas MnP que en ausencia de Mn2+ también oxidan compuestos aromáticos fenólicos (rojo fenol, 2,6-dimetoxifenol) y no fenólicos (alcohol veratrílico) y tienen actividad oxidasa con NADH, y por lo tanto se consideran formas híbridas entre LiP y MnP. Sin embargo la eficiencia catalítica es mucho más elevada en presencia de Mn2+ que con substratos aromáticos (Heinfling et al., 1998a). Estas enzimas, a las que se les llamó peroxidasas versátiles (VP), fueron descritas en los hongos Pleurotus eryngii (Martínez et al., 1996a), Bjerkandera sp. BOS55 (Mester & Field, 1998) y Bjerkandera adusta (Heinfling et al., 1998a). La actividad dependiente o independiente de Mn2+ es función en gran medida de las condiciones de pH y de la concentración de substratos. La actividad independiente de Mn2+ es máxima a pH 3, mientras que en presencia de Mn2+ el pH óptimo para la oxidación de substratos es 4,5-5 (Martínez et al., 1996b). En algunos casos Mn2+ actúa como inhibidor no competitivo en la degradación de compuestos, como ocurre en la decoloración de Reactive Blue 5 por MnP de P. eryngii. Esto sugiere que estas peroxidasas versátiles deben de disponer de al menos dos sitios activos de unión a substratos (Heinfling et al., 1998a). De esta manera las peroxidasas procedentes de Bjerkandera adusta y Pleurotus eryngii pueden realizar una oxidación directa de substratos o una oxidación vía la generación de complejos de Mn3+, que permite el acceso a substratos en que no puede penetrar la enzima. Ambas oxidaciones pueden ser alternativas o secuenciales (Heinfling et al., 1998a). A pesar de que la actividad de esta enzima puede ser independiente de la presencia de Mn2+, se mantendrá el nombre de Introducción 39 manganeso peroxidasa debido a que Mn2+ es su mejor substrato, que será el empleado en el desarrollo de este trabajo. Las ventajas de emplear MnP procedente del hongo Bjerkandera adusta frente a MnP de Phanerochaete chrysosporium son: i) MnP tiene actividad en presencia o en ausencia de Mn, aunque la afinidad a otros substratos y la cinética es menor; ii) la resistencia frente a altas concentraciones de H2O2 es mayor (Mielgo et al., 2003b), debido a que la enzima aril alcohol oxidasa del hongo Bjerkandera adusta produce concentraciones más altas de H2O2 que la enzima glioxal oxidasa de Phanerochaete chrysosporium (Böckle et al., 1999). 5.4. Aplicaciones El empleo de enzimas in vitro a nivel industrial es una práctica que presenta una serie de ventajas con respecto al empleo de los hongos (López et al., 2002; Torres et al., 2003; Forgacs et al., 2004): i) Las enzimas pueden operar bajo una variedad de condiciones de pH, fuerza iónica o temperatura ii) Considerando la posible reutilización de la enzima, los requerimientos enzimáticos son bajos iii) Las enzimas se pueden mantener activas en presencia de altas concentraciones de contaminantes y de concentraciones moderadas de disolventes orgánicos iv) El proceso se puede modificar fácilmente en función del carácter de los substratos a degradar v) Los períodos de tratamiento son mucho más cortos que en presencia de hongo vi) No existen retrasos causados por la fase de latencia de la biomasa vii) Se reduce considerablemente el volumen de lodos, de manera que el impacto ambiental es mínimo viii) La aplicación y el control del proceso son sencillos Por otra parte algunos de los inconvenientes que conlleva el empleo de enzimas in vitro son la sensibilidad de algunas enzimas a cambios en las Capítulo 1 40 condiciones ambientales, el coste del proceso de obtención de las mismas y, en el caso de las peroxidasas, la inactivación por H2O2. El efecto de estas variables debe ser estudiado en cada caso concreto para minimizar el consumo de enzima y favorecer la eficacia del proceso. Las enzimas ligninolíticas se han empleado tradicionalmente en procesos in vitro, principalmente en la degradación de compuestos recalcitrantes. Algunas de estas aplicaciones se esquematizan en la Tabla 1.4. Además de estas aplicaciones, las peroxidasas se emplean como catalizadores en exámenes clínicos, en inmunoensayos enzimáticos y en análisis de quimioluminiscencia (Nakayama & Amachi, 1999). 6. Reactores enzimáticos Si se pretende desarrollar un sistema económicamente viable, las reacciones catalizadas por enzimas deben considerar no sólo la separación de reactivos y productos sino también la recuperación y reutilización de la enzima (Prazeres & Cabral, 1994; Rios et al., 2004). Por medio de sistemas que permitan retener la enzima es posible la operación de procesos enzimáticos en continuo, con todas las ventajas que conlleva (López et al., 2002): i) Es posible trabajar con altas cargas de enzima ii) Se consigue mantener una actividad enzimática prolongada iii) Se reducen los costes, energía y productos de desecho iv) Se consigue reducir el riesgo de inhibición por substrato o por producto v) Se consigue un producto más purificado, libre de enzima vi) La operación, control y escalado del proceso son sencillos Las enzimas pueden estar presentes en diferentes formas: i) libres, solubles en la mezcla de reacción; ii) inmovilizadas en la superficie o la matriz de una membrana; iii) inmovilizadas mediante la formación de perlas o derivados sobre algún soporte (Figura 1.4). Si la enzima se mantiene libre, el sistema debe estar acoplado a una membrana y la retención de la enzima se realiza mediante su confinamiento en uno de los lados de la misma. Si la enzima está inmovilizada sobre la membrana o algún soporte, la inmovilización se realiza mediante Introducción 41 Tabla 1.4. Aplicación de enzimas ligninolíticas a la degradación in vitro de compuestos Compuesto Enzima Fuente Referencia Lignina Fenoles Hidrocarburos policíclicos aromáticos Compuestos nitroaromáticos Tintes MnP MnP MnP y LiP LiP HRP Lacasa MnP LiP Lacasa MnP MnP LiP Lacasa HRP MnP Phanerochaete chrysosporium Nematoloma frowardii y Phlebia radiata Phanerochaete chrysosporium Phanerochaete chrysosporium Phanerochaete chrysosporium -- -- Rhizoctonia praticola Coriolus versicolor Nematoloma frowardii Phanerochaete chrysosporium Trametes versicolor Phanerochaete laevis Nematoloma frowardii Phanerochaete chrysosporium Nematoloma frowardii y Stropharia rugosoannulata Nematoloma frowardii Phanerochaete chrysosporium Phanerochaete chrysosporium Phanerochaete chrysosporium Pyricularia oryzae Preparado comercial Pycnoporus cinnabarinus Trametes versicolor Preparado comercial Bjerkandera adusta y Pleurotus eryngii Phanerochaete chrysosporium Phanerochaete chrysosporium y Bjerkandera sp. Bjerkandera sp. Wariishi et al., 1991 Hofrichter et al., 1999 Thompson et al., 1998 Aitken et al., 1989 Hammel & Tardone, 1988 Wagner & Nicell, 2001 Cooper & Nicell, 1996 Bollag et al., 1988 Ullah et al., 2000 Hofrichter et al., 1998 Hammel et al., 1986 Majcherczyk et al., 1998 Bogan & Lamar, 1996 Sack et al., 1997 Bogan et al., 1996 Scheibner & Hofrichter, 1998 Hofrichter et al., 1998 van Aken et al., 2000 Chivukula et al., 1995 Ollikka et al., 1993 Chivukula & Renganathan, 1995 Soares et al., 2001 Schliephake et al., 2000 Moldes, 2005 Bhunia et al., 2001 Heinfling et al., 1998b Glenn & Gold, 1985 Moreira et al., 2001a Mielgo et al., 2003a Capítulo 1 42 adsorción física, enlace covalente, fuerzas electrostáticas, inclusión o atrapamiento (Prazeres & Cabral, 2001). Cuando se trabaja con enzima inmovilizada, es necesario el transporte de los substratos hasta el catalizador y de los productos desde el catalizador al medio de reacción. Por lo tanto la transferencia de materia juega a veces un papel muy importante (Giorno & Drioli, 2000). 6.1. Reactores enzimáticos de membrana Los reactores enzimáticos de membrana se definen como aquellos en que la separación de la enzima y los productos o substratos se realiza por medio de una membrana semipermeable que funciona como una barrera selectiva (Prazeres & Cabral, 1994). Los substratos y productos permeables se separan de la mezcla de reacción mediante un gradiente a través de la membrana (potencial químico, presión, campo eléctrico) que causa el movimiento de los solutos, por difusión, convección o migración electroforética. La combinación de la tecnología de membranas con los reactores enzimáticos permite hablar de tres configuraciones de reactor: i) reactor de membrana de contacto directo; ii) reactor con enzima inmovilizada en la membrana; iii) reactor de membrana extractiva. Reactores enzimáticos de contacto directo En estos reactores el substrato se alimenta a la zona del sistema que contiene la enzima, de manera que se produce un contacto directo entre ambos, pudiendo así producirse una actuación enzimática inmediata sobre el substrato. La enzima puede estar inmovilizada o libre. La separación del catalizador puede tener lugar en el mismo reactor o puede llevarse a cabo mediante el acoplamiento de una unidad de membrana externa. La configuración más común dentro de los reactores de contacto directo consiste en un reactor de tanque agitado con enzima libre asociado a una membrana de ultrafiltración para la retención del catalizador (Figura 1.4.a). El efluente retenido se recircula al reactor, mientras que los productos de reacción son capaces de atravesar la membrana y abandonan el sistema como efluente (López et al., 2002). Introducción 43 RECIRCULACIÓN ENZIMÁTICA Cofactores Enzima Substrato Producto (a) Cofactores Substrato Membran a Producto (b) Membran a Substrato Cofactores Producto (c) Figura 1.4. Configuraciones de reactores continuos de membrana: (a) reactor de tanque agitado combinado con una membrana de separación, (b) reactor de tanque agitado con enzima inmovilizada en la matriz de la membrana y (c) reactor de tanque agitado con enzima atrapada en geles, fibras o microcápsulas Reactores enzimáticos con enzima inmovilizada en la membrana La principal característica de estos reactores es que la enzima está inmovilizada en la membrana, bien dentro de la matriz o bien en su superficie. La reacción ocurre de manera simultánea a la separación de los productos (Gekas, 1986; Prazeres & Cabral, 2001). Cuando la inmovilización tiene lugar por unión covalente la interacción se produce entre un grupo activado de la membrana y un grupo funcional de la proteína, generalmente grupos amino de residuos básicos (Guisán et al., 1997). Si la inmovilización está basada en la adsorción, tienen lugar fuerzas de Van der Waals o interacciones electrostáticas entre la enzima y el soporte (Lante et al., 2000). Por último, las enzimas pueden haber sido atrapadas en una matriz polimérica durante el proceso de preparación de la membrana Capítulo 1 50 steric problems. Methods in Biotechnology. Immobilization of Enzymes and Cells. Bickerstaff, G. F. Totowa (N.J.), Humana Press Inc. 1: 261-275. Gutiérrez, M. C. and Crespi, M. (1999a) Colorantes reactivos en los efluentes textiles: nuevos tratamientos para su eliminación. Tecnología del Agua 195, 42-49. Gutiérrez, M. C. and Crespi, M. (1999b) A review of electrochemical treatments for colour elimination. Journal of Society of Dyers and Colourists 115(11), 342-345. Hammel, K. E., Kalyanaraman, B. and Kirk, T. K. (1986) Oxidation of polycyclic aromatic hydrocarbons and dibenzo[p]dioxins by Phanerochaete chrysosporium ligninase. Journal of Biological Chemistry 261(36), 16948-16952. Hammel, K. E. and Tardone, P. J. (1988) The oxidative 4-dechlorination of polychlorinated phenols is catalyzed by extracellular fungal lignin peroxidases. Biochemistry 27(17), 6563-6568. Hassan, M. M. and Hawkyard, C. J. (2002) Decolourisation of aqueous dyes by sequential oxidation treatment with ozone and Fenton's reagent. Journal of Chemical Technology and Biotechnology 77(7), 834-841. Hatakka, A. (1994) Lignin-modifying enzymes from selected white-rot fungi: production and role in lignin degradation. FEMS Microbiology Reviews 13, 125-135. Heinfling, A., Martínez, M. J., Martínez, A. T., Bergbauer, M. and Szewzyk, U. (1998a) Purification and characterization of peroxidases from the dye-decolorizing fungus Bjerkandera adusta. FEMS Microbiology Letters 165, 43-50. Heinfling, A., Martínez, M. J., Martínez, A. T., Bergbauer, M. and Szewzyk, U. (1998b) Transformation of industrial dyes by manganese peroxidases from Bjerkandera adusta and Pleurotus eryngii in a manganese-independent reaction. Applied and Environmental Microbiology 64, 2788-2793. Hofrichter, M., Scheibner, K., Schneegab, I. and Fritsche, W. (1998) Enzymatic combustion of aromatic and aliphatic compounds by manganese peroxidase from Nematoloma frowardii. Applied and Environmental Microbiology 64, 399-404. Hofrichter, M., Vares, T., Scheibner, K., Galkin, S., Sipilä, J. and Hatakka, A. (1999) Mineralization and solubilization of synthetic lignin (DHP) by manganese peroxidases from Nematoloma frowardii and Phlebia radiata. Journal of Biotechnology 67, 217-228. Hofrichter, M. (2002) Review: lignin conversion by manganese peroxidase (MnP). Enzyme and Microbial Technology 30, 454-466. Ince, N. H. and Gonenc, D. T. (1997) Treatability of a textile azo dye by UV/H2O2. Environmental Technology 18, 179-185. Isono, Y. and Nakajima, M. (2000) Membrane phase separation of aqueous/alcohol biphase mixture and its application for enzyme bioreactor. Progress in Biotechnology 2000(16), 63-68. Jain, R., Bhargava, M. and Sharma, N. (2003) Treatment and decolourisation of an azo dye in industrial effluent. Journal of Scientific and Industrial Research 62(8), 813-819. Introducción 51 Janikowski, T. B., Velicogna, D., Punt, M. and Daugulis, A. J. (2002) Use of two-phase partitioning bioreactor for degrading polycyclic aromatic hydrocarbons by a Sphingomonas sp. Applied Microbiology and Biotechnology 59, 368-376. Johansson, T. and Nyman, P. O. (1993) Isozymes of lignin peroxidase and manganese(II) peroxidase from the white-rot basidiomycete Trametes versicolor. I. Isolation of enzyme forms and characterization of physical and catalytic properties. Archives of Biochemistry and Biophysics 300(1), 49-56. Jolivalt, C., Brenon, S., Caminade, E., Mougin, C. and Pontié, M. (2000) Immobilization of laccase from Trametes versicolor on a modified PVDF microfiltration membrane: characterization of the grafted support and application in removing a phenylurea pesticide in wastewater. Journal of Membrane Science 180, 103-113. Jönsson, L. J., Palmqvist, E., Nilvebrant, N.-O. and Hahn-Hagerdal, B. (1998) Detoxification of wood hydrolysates with laccase and peroxidase from the white-rot fungus Trametes versicolor. Applied Microbiology and Biotechnology 49, 691-697. Kanmani, S. and Thanasekaran, K. (2003) A comparative study on UV and solar photocatalytic decolourisation of low salt cotton textile dyeing wastewaters. Indian Journal of Environmental Protection 23(1), 47-53. Kanmani, S. and Thanasekaran, K. (2004) Photocatalytic decolourisation of textile dyeing wastewaters using indigenous titanium dioxide. Journal of Industrial Pollution Control 20(2), 267-276. Karhunen, E., Kanterlinen, A. and Niku-Paavola, M. L. (1990) Mn-dependent peroxidase from the lignin-degrading white rot fungus Phlebia radiata. Archives of Biochemistry and Biophysics 279(1), 25-31. Keck, A., Klein, J., Kudlich, M., Stolz, A., Knackmuss, H. J. and Mattes, R. (1997) Reduction of azo dyes by redox mediators originating in the naphthalenesulfonic acid degradation pathway of Sphingomonas sp. strain BN6. Applied and Environmental Microbiology 63, 3684-3690. Kelsey, L. J., Pillarella, M. R. and Zydney, A. L. (1990) Theoretical analysis of convective flow profiles in a hollow-fiber membrane bioreactor. Chemical Engineering Science 45, 3211-3220. Kim, H.-Y. and Song, H.-G. (2000) Transformation of 2,4,6-trinitrotoluene by white-rot fungus Irpex lacteus. Biotechnology Letters 22, 969-975. Kinoshita, S., Chua, J. W., Kato, N., Yoshida, T. and Taguchi, H. (1986) Hydrolisis of cellulose by cellulases of Sporotrichum cellulophilum in an ultrafilter membrane reactor. Enzyme and Microbial Technology 8, 691-695. Kirby, N., McMullan, G. and Marchant, R. (1995) Decolourisation of an artificial textile effluent by Phanerochaete chrysosporium. Biotechnology Letters 17(7), 761-764. Kiwi, J., Pulgarin, C., Peringer, P. and Grätzel, M. (1993) Beneficial effects of homogeneous photo-Fenton pretreatment upon the biodegradation of anthraquinone sulfonate in waste water treatment. Applied Catalalysis B-Environmental 3, 85-89. Capítulo 1 52 Knapp, J. S., Newby, P. S. and Reece, L. P. (1995) Decolorization of dyes by woodrotting basidiomycete fungi. Enzyme and Microbial Technology 17, 664-668. Knapp, J. S. and Newby, P. S. (1999) The decolourisation of a chemical industry effluent by white rot fungi. Water Research 33, 575-577. Kojima, H., Ogawa, M., Tamai, S., Yamada, M. and Hasunuma, M. (1995) Oxidation of glucose by glucose oxidase entrapped in hollow fiber membrane. Journal of Chemical Engineering of Japan 28(5), 623-626. Kuan, I. C., Johnson, K. A. and Tien, M. (1993) Kinetic analysis of manganese peroxidase. The reaction with manganese complex. Journal of Biological Chemistry 268, 20064-20070. Kudlich, M., Keck, A., Klein, J. and Stolz, A. (1997) Localization of the enzyme system involved in the anaerobic reduction of azo dyes by Sphingomonas sp. strain BN6 and effect of artificial redox mediators on the rate of azo dye reduction. Applied and Environmental Microbiology 63, 3691-3694. Kumar, M. N. V. R., Sridhari, T. R., Bhavani, K. D. and Dutta, P. K. (1998) Trends in color removal form textile mill effluents. Colorage 40, 25-34. Kunz, A., Peralta-Zamora, P., Gomes de Moraes, S. and Durán, N. (2002) New tendencies on textile effluent treatment. Química Nova 25(1), 78-82. Kuo, W. G. (1992) Decolorizing dye wastewater with Fenton's reagent. Water Research 26, 881-886. Kuwahara, M., Glenn, J. K., Morgan, M. A. and Gold, M. H. (1984) Separation and characterization of two extracellular H2O2-dependent oxidases from ligninolytic cultures of Phanerochaete chrysosporium. FEBS Letters 169, 247-250. Lante, A., Crapisi, A., Krastanov, A. and Spettoli, P. (2000) Biodegradation of phenols by laccase immobilised in a membrane reactor. Process in Biochemistry 36(1-2), 51-58. Leonowicz, A., Matuszewska, A., Luterek, J., Ziegenhagen, D., Wojtas-Wasilewska, M. and Cho, N.-S. (1999) Biodegradation of lignin by white-rot fungi. Fungal Genetics and Biology 27, 175-185. Liese, A., Karutz, M., Kamphuis, J., Wandrey, C. and Kragl, U. (1996) Enzymatic resolution of 1-phenyl-1,2-ethanediol by enantioselective oxidation: Overxcoming product inhibition by continuous extraction. Biotechnology and Bioengineering 51(5), 544-550. Lin, S. H. and Peng, C. F. (1995) A continuous Fenton's process for treatment of textile wastewater. Environmental Technology 16, 693-699. Lin, S. H. and Peng, C. F. (1996) Continuous treatment of textile wastewater by combined coagulation, electrochemical oxidation and activated sludge. Water Research 30, 587-592. Liu, J. Q. and Liu, H. T. (1992) Degradation of azo dyes by algae. Environmental Pollution 75, 273-278. Introducción 53 Livingston, A. G. (1994) Extractive membrane bioreactors: a new process technology for detoxifying chemical industry wastewaters. Journal of Chemical Technology and Biotechnology 60, 117-124. López, C., Mielgo, I., Moreira, M. T., Feijoo, G. and Lema, J. M. (2002) Enzymatic membrane reactors for biodegradation of recalcitrant compounds. Application to dye decolourisation. Journal of Biotechnology 99(3), 249-257. Majcherczyk, A., Johannes, C. and Huttermann, A. (1998) Oxidation of polycyclic aromatic hydrocarbons (PAH) by laccase of Trametes versicolor. Enzyme and Microbial Technology 22(5), 335-341. Manimekalai, R. and Swaminathan, T. (2000) Removal of hazardous compounds by lignin peroxidase from Phanerochaete chrysosporium. Bioprocess Engineering 22, 29-33. Martínez, M. J., Böckle, B., Camarero, S., Guillén, F. and Martínez, A. T. (1996a) MnP isoenzymes produced by two Pleurotus species in liquid culture and during wheat-straw solid-state fermentation. 211th ACS National Meeting, New Orleans, LA. Martínez, M. J., Ruiz-Dueñas, F. J., Guillén, F. and Martínez, A. T. (1996b) Purification and catalytic properties of two manganese peroxidase isoenzymes from Pleurotus eryngii. European Journal of Biochemistry 237(2), 424-432. McClung, S. M. and Lemley, A. T. (1994) Electrochemical treatment and HPLC analysis of wastewater containing acid dyes. Textile Chemist and Colorist 26, 17-22. McMullan, G., Meehan, C., Conneely, A., Kirby, N., Robinson, T., Nigam, P., Banat, I. M., Marchant, R. and Smyth, W. F. (2001) Microbial decolourisation and degradation of textile dyes. Applied Microbiology and Biotechnology 56, 81-87. Méndez-Paz, D., Omil, F. and Lema, J.M. (2005a) Anaerobic treatment of azo dye Acid Orange 7 under batch conditions. Enzyme and Microbial Technology 36, 264-272. Méndez-Paz, D., Omil, F. and Lema, J.M. (2005b) Anaerobic treatment of azo dye Acid Orange 7 under fed-batch and continuous conditions. Water Research 39, 771-778. Mester, T. and Field, J. A. (1998) Characterization of a novel manganese peroxidaselignin peroxidase hybrid isoenzyme produced by Bjerkandera sp. strain BOS55 in the absence of manganese. Journal of Biological Chemistry 273, 15412-15417. Mester, T. and Tien, M. (2000) Oxidation mechanism of ligninolytic enzymes involved in the degradation of environmental pollutants. International Biodeterioration and Biodegradation 46, 51-59. Meyer, U. (1981) Biodegradation of synthetic organic colorants. Microbial degradation of xenobiotic and recalcitrant compounds. London, Academic Press. Mielgo, I., López, C., Moreira, M. T., Feijoo, G. and Lema, J. M. (2003a) Oxidative degradation of azo dyes by manganese peroxidase under optimized conditions. Biotechnology Progress 19(2), 325-331. Mielgo, I., Palma, C., Guisán, J.M., Fernández-Lafuente, R., Moreira, M.T., Feijoo, G. and Lema, J.M. (2003b) Covalent immobilisation of manganese peroxidases (MnP) from Capítulo 1 54 Phanerochaete chrysosporium and Bjerkandera sp. BOS55. Enzyme and Microbial Technology 32, 769-775. Moldes, D. (2005) Aplicación de enzimas ligninolíticos para la degradación de contaminantes modelo. Departamento de Ingeniería Química, Universidad de Vigo. Tesis Doctoral. Moreira, M. T., Feijoo, G., Mester, T., Mayorga, P., Sierra-Alvarez, R. and Field, J. A. (1998) Role of organic acids on the manganese-independent biobleaching system of Bjerkandera sp. strain BOS55. Applied and Environmental Microbiology 64(7), 24092417. Moreira, M. T., Palma, C., Mielgo, I., Feijoo, G. and Lema, J. M. (2001a) In vitro degradation of a polymeric dye (Poly R-478) by manganese peroxidase. Biotechnology and Bioengineering 75(3), 362-368. Moreira, M. T., Sierra-Alvarez, R., Lema, J. M., Feijoo, G. and Field, J. A. (2001b) Oxidation of lignin in eucalyptus kraft pulp by manganese peroxidase from Bjerkandera sp. strain BOS55. Bioresource Technology 78, 71-79. Moreira, P. R., Almeida-Vara, E., Sena-Martins, G., Polónia, I., Malcata, F. X. and Cardoso Duarte, J. (2001c) Decolourisation of Remazol Brilliant Blue R via a novel Bjerkandera sp. strain. Journal of Biotechnology 89(107-111). Nakayama, T. and Amachi, T. (1999) Fungal peroxidase: its structure, function, and application. Journal of Molecular Catalysis B: Enzymatic 6, 185-198. Namasivayam, C., Muniasamy, N., Gayatri, K., Rani, M. and Rangananathan, K. (1996) Removal of dyes from aqueous solutions by cellulosic waste orange peel. Bioresource Technology 57, 37-43. Namasivayam, C. and Arisi, D. J. S. E. (1997) Removal of congo red from wastewater by adsorption onto red mud. Chemosphere 34, 401-417. Nie, G., Reading, N. S. and Aust, S. D. (1999) Relative stability of recombinant versus native peroxidases from Phanerochaete chrysosporium. Archives of Biochemistry and Biophysics 365, 328-334. O´Neill, C., Hawkes, F. R., Hawkes, D. L., Lourenço, N. D., Pinheiro, H. M. and Delée, W. (1999) Colour in textile effluents - sources, measurement, discharge consents and simulation: a review. Journal of Chemical Technology and Biotechnology 74, 1009-1018. Ochoa, G. J. R. (1995) Técnicas electroquímicas para el tratamiento de efluentes industriales. Ingeniería Química 4, 125-131. Ogutveren, U. B., Gonen, N. and Koparal, S. (1992) Removal of dye stuffs from waste water: electrocoagulation of Acilan Blau using soluble anode. Journal of Environmental Science. Health A 27, 1237-1247. Ollikka, P., Alhonmäki, K., Leppänen, V. M., Glumoff, T., Raijola, T. and Suominen, I. (1993) Decolorization of azo, triphenyl methane, heterocyclic, and polymeric dyes by lignin peroxidase isoenzymes from Phanerochaete chrysosporium. Applied and Environmental Microbiology 59, 4010-4016. Introducción 55 Pagga, U. and Brown, D. (1986) The degradation of dyestuffs: part II. Behaviour of dyestuffs in aerobic biodegradation tests. Chemosphere 15(4), 479-491. Panswad, T. and Luangdilok, W. (2000) Decolorization of reactive dyes with different molecular structures under different environmental conditions. Water Research 34, 41774184. Pasti, M. B. and Crawford, D. L. (1991) Relationships between the abilities of streptomycetes to decolorize three anthron-type dyes and to degrade lignocellulose. Canadian Journal of Microbiology 37, 902-907. Paszczynski, A., Huynh, V.-B. and Crawford, R. (1985) Enzymatic activities of an extracellular, manganese-dependent peroxidase from Phanerochaete chrysosporium. FEMS Microbiology Letters 29, 37-41. Pelegrini, R., Peralta-Zamora, P., de Andrade, A. R., Reyers, J. and Durán, N. (1999) Electrochemically assisted photocatalytic degradation of reactive dyes. Applied Catalysis B-Environmental 22, 83-90. Peralta-Zamora, P., Kunz, A., Gómez de Morales, S., Pelegrini, R., de Capos Moleiro, P., Reyes, J. and Durán, N. (1999) Degradation of reactive dyes I. A comparative study of ozonation, enzymatic and photochemical processes. Chemosphere 38, 835-852. Pickard, M. A., Roman, R., Tinoco, R. and Vázquez-Duhalt, R. (1999) Polycyclic aromatic hydrocarbon metabolism by white-rot fungi and oxidation by Coriolopsis gallica UAMH 8260 laccase. Applied and Environmental Microbiology 65, 3805-3809. Poots, V. J. P. and McKay, J. J. (1976) The removal of acid dye from effluent using natural adsorbents - I Peat. Water Research 10, 1061-1066. Porter, J. J. and Gomes, A. C. (2000) The rejection of anionic dyes and salt from water solutions using a polypropylene microfilter. Desalination 128(1), 81-90. Prazeres, D. M. F. and Cabral, J. M. S. (1994) Enzymatic membrane bioreactors and their applications. Enzyme and Microbial Technology 16, 738-750. Prazeres, D. M. F. and Cabral, J. M. S. (2001) Enzymatic membrane reactors. Multiphase bioreactor design. Cabral, J. M. S., Mota, M. and Tramper, J. London, Taylor&Francis. 16: 135-180. Reddy, C. A. (1995) The potential for white rot fungi in the treatment of pollutants. Current Optical Biotechnology 6, 320-328. Reife, A. and Freeman, H. S. (1996) Environmental chemistry of dyes and pigments. New York, John Wiley & Sons, Inc. Rios, G. M., Belleville, M. P., Paolucci, D. and Sanchez, J. (2004) Progress in enzymatic membrane reactors - a review. Journal of Membrane Science 242, 189-196. Robinson, T., McMullan, G., Marchant, R. and Nigam, P. (2001) Remediation of dyes in textile effluent: a critical review on current treatment technologies with a proposed alternative. Bioresource Technology 77, 247-255. Capítulo 1 56 Russ, R., Rau, R. and Stolz, A. (2000) The function of cytoplasmic flavin reductases in the reduction of azo dyes by bacteria. Applied and Environmental Microbiology 66, 14291434. Sack, U., Hofrichter, M. and Fritsche, W. (1997) Degradation of polycyclic aromatic hydrocarbons by manganese peroxidase of Nematoloma frowardii. FEMS Microbiology Letters 152, 227-234. Sanromán, M. A., Pazos, M. and Cameselle, C. (2004) Optimisation of electrochemical decolourisation process of an azo dye, Methyl Orange. Journal of Chemical Technology and Biotechnology 79(12), 1349-1353. Scheibner, K. and Hofrichter, M. (1998) Conversion of aminonitrotoluenes by fungal manganese peroxidases. Journal of Basic Microbiology 38, 51-59. Schliephake, K., Mainnaring, D. E., Lonergan, G. T., Jones, I. K. and Baker, W. L. (2000) Transformation and degradation of the diazo dye Chicago Sky Blue by a purified laccase from Pycnoporus cinnabarinus. Enzyme and Microbial Technology 27, 100-107. Shore, J. (1996) Advances in direct dyes. Indian Journal of Fibre & Textile Research 21, 1-29. Shu, H.-Y. and Huang, C.-R. (1995) Ultraviolet enhanced oxidation for color removal of azo dye wastewater. American Dyestuff Reporter 8, 30-96. Slokar, Y. M. and Le Marechal, A. M. (1997) Methods of decoloration of textile wastewaters. Dyes Pigments 37, 335-356. Soares, G. M. B., de Amorim, M. T. P. and Costa-Ferreira, M. (2001) Use of laccase together with redox mediators to decolourize Remazol Brilliant Blue R. Journal of Biotechnology 89, 123-129. Solozhenko, E. G., Soboleva, N. M. and Goncharuk, V. V. (1995) Decolourization of azo dye solutions by Fenton´s oxidation. Water Research 29(9), 2206-2210. Spadaro, J. T., Gold, M. H. and Renganathan, V. (1992) Degradation of azo dyes by the lignin-degrading fungus Phanerochaete chrysosporium. Applied and Environmental Microbiology 58(8), 2397-2401. Sumathi, S. and Manju, B. S. (2000) Uptake of reactive dyes by Aspergillus foetidus. Enzyme and Microbial Technology 27, 347-355. Swamy, J. and Ramsay, J. A. (1999) The evaluation of white-rot fungi in the decolorization of textile dyes. Enzyme and Microbial Technology 24, 130-137. Tang, W. Z. and An, H. (1995) Photocatalytic degradation kinetics and mechanism of acid blue 40 by TiO2/UV in aqueous solution. Chemosphere 31, 4171-4183. Thompson, D. N., Hames, B. R., Reddy, C. A. and Grethlein, H. E. (1998) In vitro degradation of natural insoluble lignin in aqueous media by the extracellular peroxidases of Phanerochaete chrysosporium. Biotechnology and Bioengineering 57, 704-717. Torres, E., Bustos-Jaimes, I. and Le Borgne, S. (2003) Potential use of oxidative enzymes for the detoxification of organic pollutants. Applied Catalysis B: Environmental 46, 1-15. Introducción 57 Ullah, M. A., Bedford, C. T. and Evans, C. S. (2000) Reactions of pentachlorophenol with laccase from Coriolus versicolor. Applied Microbiology and Biotechnology 53(2), 230234. van Aken, B., Cameron, M. D., Stahl, J. D., Plumat, A., Naveau, H., Aust, S. D. and Agathos, S. N. (2000) Glutathione-mediated mineralization of 14C-labeled 2-amino-4,6dinitrotoluene by manganese-dependent peroxidase H5 from the white-rot fungus Phanerochaete chrysosporium. Applied Microbiology and Biotechnology 54, 659-664. Vandevivere, P. C., Bianchi, R. and Verstraete, W. (1998) Treatment and reuse of wastewater from the textile wet-processing industry: review of emerging technologies. Journal of Chemical Technology and Biotechnology 72, 289-302. van der Zee, F. P., Bouwman, R. H. M., Strik, D. P. B. T. B., Lettinga, G. and Field, J. A. (2001) Application of redox mediators to accelerate the transformation of reactive azo dyes in anaerobic bioreactors. Biotechnology and Bioengineering 75, 691-701. van Lier, J. B., van der Zee, F. P., Tan, N. C. G., Rebac, S. and Kleerebezem, R. (2001) Advances in high-rate anaerobic treatment: staging of reactor systems. Water Science and Technology 44, 15-25. Vinodgopal, K., Wynkoop, D. E. and Kamat, P. V. (1996) Environmental photochemistry on semiconductor surfaces: photosensitized degradation of a textile azo dye, acid orange 7, on TiO2 particles using visible light. Environmental Science and Technology 30, 16601666. Vyas, B. R. M. and Molitoris, H. P. (1995) Involvement of an extracellular H2O2dependent ligninolytic activity of the white rot fungus Pleurotus ostreatus in the decolourisation of Remazol Brilliant Blue R. Applied and Environmental Microbiology 61, 3919-3927. Wagner, M. and Nicell, J. A. (2001) Peroxidase-catalyzed removal of phenols from a petroleum refinery wastewater. Water Science and Technology 43(2), 253-260. Walker, G. M. and Weatherley, L. R. (1997) Adsorption of acid dyes on to granular activated carbon in fixed beds. Water Research 31, 2093-2101. Wariishi, H., Akaleswaran, L. and Gold, M. H. (1988) Manganese peroxidase from the basidiomycete Phanerochaete chrysosporium: spectral characterization of oxidized states and the catalytic cycle. Biochemistry 27, 5365-5370. Wariishi, H., Dunford, H. B., MacDonald, I. D. and Gold, M. H. (1989) Manganese peroxidase from the lignin-degrading basidiomycete Phanerochaete chrysosporium. Transient state kinetics and reaction mechanism. The Journal of Biological Chemistry 264(6), 3335-3340. Wariishi, H., Valli, K. and Gold, M. H. (1991) In vitro depolymerization of lignin by manganese peroxidase of Phanerochaete chrysosporium. Biochemical and Biophysical Research Communication 176, 269-275. Waring, D. R. and Hallas, G. (1990) The chemistry and application of dyes. New York and London. Capítulo 1 58 Weisburger, J. H. (2002) Comments on the history and importance of aromatic and heterocyclic amines in public health. Mutation Research 506-507, 9-20. Wesenberg, D., Kyriakides, I. and Agathos, S. N. (2003) White-rot fungi and their enzymes for the treatment of industrial dye effluents. Biotechnology Advances 22, 161187. Wong, Y. and Yu, J. (1999) Laccase-catalyzed decolorization of synthetic dyes. Water Research 33(16), 3512-3520. Yesilada, O., Fiskin, K. and Yesilada, E. (1995) The use of white-rot fungus Funalia trogii (Malatya) for the decolourization and phenol removal from olive mill wastewater. Environmental Technology 16, 95-100. Yesilada, O., Asma, D. and Cing, S. (2003) Decolorization of textile dyes by fungal pellets. Process Biochemistry 38, 933-938. Yoshida, H. and Takemori, T. (1997) Adsorption of direct dye con cross-linked chitosan fiber. Water Science and Technology 35, 29-37. Zollinger, H. (1987) Colour chemistry: Synthesis, properties and applications of organic dyes and pigments. New York, VCH Publishers. Materiales y métodos 59 Capítulo 2 Materiales y métodos Resumen En este capítulo se detallan los materiales y métodos empleados en la realización de la tesis doctoral. Se describen los medios de cultivo para la conservación y el mantenimiento de la cepa de Bjerkandera sp. BOS55, así como los medios aplicados para la producción de la enzima manganeso peroxidasa. Se hace una revisión de las distintas etapas de preparación del crudo enzimático para su posterior aplicación en los ensayos de decoloración. Se detallan además las diversas técnicas analíticas empleadas para la medida de la actividad enzimática, para la determinación de la proteína y para la determinación de las concentraciones del tinte Orange II y de los productos obtenidos en su degradación. La metodología específica de cada capítulo se describirá posteriormente en su correspondiente apartado de Materiales y métodos. Capítulo 2 66 4.2. Determinación de concentraciones por cromatografía (HPLC) El problema que presenta el seguimiento de la degradación del tinte Orange II mediante la técnica espectrofotométrica es que durante el transcurso de la reacción se generan productos que presentan cierta absorbancia a la longitud de onda de trabajo. Las señales se superponen y la medida de la concentración de Orange II puede ser ligeramente superior a la real. Para solventar este problema se midió la concentración de tinte mediante HPLC, que permitió a su vez determinar la concentración de algunos de los productos de la degradación. Los análisis de cromatografía líquida se llevaron a cabo en un HPLC Hewlett Packard ChemStation equipado con un detector de array de diodos HP 1090 M serie II. Se inyectaron 25 µL de muestra a través de una columna LiChrospher®100 RP-18 (4 mm d.i. x 250 mm longitud) que contiene partículas empacadas de 5 µm de tamaño (Merck KgaA, Darmstadt, Alemania). Se empleó como fase móvil una disolución de 30% de acetonitrilo y 70% de carbonato amónico 0,03 M a pH 7,9 con un caudal de 0,8 mL/min en condiciones isocráticas a 30ºC. Los cromatogramas se obtuvieron a una longitud de onda de 231 nm. Los tiempos de retención en esas condiciones fueron de 2,03-2,04 min para ácido 4hidroxibencenosulfónico, 2,00-2,01 min para ácido sulfanílico, 6,8-7,0 min para Orange II y 10,8-10,9 min para 1,2-naftoquinona. Las rectas de calibrado para los tres primeros compuestos se muestran en la Figura 2.3. Materiales y métodos 67 y = 0,018x - 0,2486 R 2 = 0,9998 0 20 40 60 80 100 120 0 1000 2000 3000 4000 5000 6000 Area (mAU·s) Orange II (mg/L) y = 0,0198x - 2,6469 R 2 = 0,9987 0 20 40 60 80 100 120 140 160 0 2000 4000 6000 8000 Area (mAU·s) Ácido 4-hidroxibencenosulfónico (mg/L) y = 0,0351x - 1,8350 R 2 = 0,9940 0 50 100 150 200 250 300 0 1000 2000 3000 4000 5000 6000 7000 8000 Area (mAU·s) Ácido sulfanílico (mg/L) Figura 2.3. Rectas de calibrado por cromatografía líquida: (a) Orange II, (b) ácido 4hidroxibencenosulfónico, (c) ácido sulfanílico (a) (b) (c) Capítulo 2 68 5. Referencias Bradford, M. M. (1976) A rapid and sensitive method for the quantification of micrograms quantities of proteins utilizing the principle of protein-dye binding. Analytical Biochemistry 72, 248-254. Field, J. A., de Jong, E., Feijoo, G. and de Bont, J. A. M. (1992) Biodegradation of polycyclic aromatic hydrocarbons by new isolates of white-rot fungi. Applied and Environmental Microbiology 58(7), 2219-2226. Mester, T., Peña, M. and Field, J. A. (1995) Nutrient regulation of extracellular peroxidases in the white-rot fungus Bjerkandera sp. BOS55. Applied Microbiology and Biotechnology 44, 778-784. Tien, M. and Kirk, T. K. (1988) Lignin peroxidase of Phanerochaete chrysosporium. Methods in Enzymology 161, 238-249. Wariishi, H., Valli, K. and Gold, M. H. (1992) Manganese(II) oxidation by manganese peroxidase from the basidiomycete Phanerochaete chrysosporium. The Journal of Biological Chemistry 267, 23688-23695. Cinética de degradación en discontinuo 69 Capítulo 3 Cinética de la degradación de Orange II en discontinuo Resumen El modelado de un proceso es un aspecto básico para su posterior escalado y control. En este capítulo se presenta un modelo cinético para la degradación del tinte azo Orange II. Se aplicó el método de las velocidades iniciales en ensayos en discontinuo, en los que se variaron las concentraciones iniciales de substrato y las velocidades de adición de H2O2. Trabajando con concentraciones de substrato elevadas, hasta valores de 2 g/L, se observó que el substrato tiene un cierto carácter inhibitorio sobre la cinética de la degradación. Los datos de velocidades de reacción presentaron un ajuste adecuado a un modelo de Haldane de inhibición por substrato. Sin embargo no se obtuvo inhibición a concentraciones por debajo de 500 mg/L de Orange II, condiciones que representan los valores más comunes en efluentes de plantas textiles reales. Por tanto a concentraciones inferiores a 500 mg/L es más adecuado hablar de una cinética de Michaelis-Menten con respecto a Orange II, y con una dependencia lineal de primer orden con respecto a la velocidad de adición de H2O2. Capítulo 3 70 Índice 1. Introducción 2. Materiales y métodos 2.1. Preparación del crudo enzimático 2.2. Medio de degradación 2.3. Ensayos de degradación 3. Resultados y discusión 3.1. Cinética en función de la concentración de Orange II 3.2. Cinética en función de la concentración de Orange II y H2O2 4. Conclusiones 5. Referencias 71 73 73 73 74 74 74 79 85 89 Cinética de la degradación en discontinuo 71 1. Introducción La obtención de una ecuación cinética que modelice la degradación de compuestos constituye la clave para escalar los procesos y para diseñar un sistema que permita el control de los mismos. Cuando se trata de reacciones enzimáticas la cinética se complica debido a la posible desactivación de la enzima como consecuencia, bien de condiciones externas o bien de la presencia de compuestos inhibidores, que pueden ser incluso productos de la degradación o los propios substratos. En función del significado físico que presenten, las ecuaciones cinéticas se pueden clasificar en tres grupos: i) ecuaciones físicas, basadas en modelos que explican las etapas que tienen lugar en la reacción enzimática; ii) ecuaciones empíricas o matemáticas, que introducen variables que no tienen significado físico; iii) ecuaciones mixtas, que proceden de un compromiso entre las ecuaciones cinéticas físicas y los modelos matemáticos (Gallifuoco et al., 2001). Las ecuaciones físicas proceden de modelos más o menos complejos que intentan describir las reacciones enzimáticas en función de los parámetros que intervienen en ellas. Los modelos muy complejos y que dependen de un gran número de parámetros generalmente consiguen un buen ajuste de los datos experimentales, pero son poco prácticos en el diseño de procesos. Otros modelos reducen el número de variables para lograr ecuaciones más simples y útiles. Se han propuesto varias expresiones de velocidad de reacción para las reacciones enzimáticas. El mecanismo de Michaelis-Menten es uno de los más sencillos (Ecuación 1), y se basa en la formación de un complejo enzima-substrato donde tiene lugar la transformación de dicho substrato al producto, que se libera de la enzima. Otros mecanismos consideran inhibiciones debidas a la presencia de compuestos inhibitorios externos o al propio substrato o producto. Uno de los modelos propuestos basados en la inhibición por substrato corresponde al modelo de Haldane (Ecuación 2). SK Sr r M m + = (1) 2 SKSK Sr r IM m ++ = (2) Capítulo 3 72 donde r es la velocidad de reacción, S es la concentración de substrato, rm es la velocidad máxima, KM es la constante de Michaelis-Menten y KI es la constante de inhibición. Las ecuaciones empíricas son expresiones matemáticas que a menudo resultan muy generales y poco predictivas. Sin embargo, presentan una serie de ventajas que las hacen útiles para el modelado de procesos: ajustan bien los datos experimentales y son ecuaciones sencillas de fácil aplicación. Por último las ecuaciones mixtas se usan cuando se conoce la dependencia física de la velocidad de reacción frente a una o varias variables, pero no frente a otras. Se proponen dos tipos de métodos para evaluar los parámetros cinéticos de reacciones enzimáticas: i) métodos diferenciales, en los que se obtiene la velocidad de reacción directamente de la pendiente de la curva de concentración de substrato o de producto frente al tiempo; ii) métodos integrales, en los que se integra la ecuación de velocidad y se obtiene una expresión para la variación de la concentración frente al tiempo (Bódalo et al., 1999). Los métodos diferenciales se aplican sobre ensayos en discontinuo, donde se obtiene la curva de la variación de la concentración con el tiempo. Estos métodos presentan la ventaja de que un solo ensayo proporciona un gran número de pares de puntos, aunque cuanto más suave es la pendiente de la curva, más difícil es determinar el valor con precisión. Otro inconveniente de estos métodos es que la actividad enzimática debe permanecer constante durante la reacción. Para solventar estas desventajas se trabaja con el método de las velocidades iniciales, en el que las concentraciones de productos, substratos y enzima se consideran constantes y la pendiente inicial de la curva se puede determinar fácilmente. Como contrapartida, este método presenta dos desventajas: por una parte, cada par de puntos se obtiene en un ensayo diferente; por otra parte, en este método casi nunca se trabaja en las mismas condiciones que aquellas correspondientes a una situación real, puesto que los reactores en continuo suelen operar con conversiones elevadas (Bódalo et al., 1999). Los métodos integrales se basan en valores obtenidos en estado estacionario, por lo que se requiere un ensayo distinto para obtener cada par de puntos. Esto implica una mayor complejidad y un mayor consumo de tiempo (Alfani et al., 1990). Otro inconveniente es la dificultad de integración de algunas ecuaciones cinéticas. Debido a esto, casi todos los autores realizan el modelado de las Cinética de la degradación en discontinuo 73 reacciones enzimáticas en procesos en discontinuo y posteriormente aplican las constantes cinéticas obtenidas a los ensayos en continuo (Bódalo et al., 2001a; Gallifuoco et al., 2001). Algunos autores aplican en los ensayos en continuo un valor de rm diferente al obtenido en los ensayos en batch. Bowski et al. (1972) utilizan un valor de rm/2 y Nakajima et al. (1992) consideran rm/10. En el presente capítulo se pretende obtener el modelo cinético de la degradación del tinte azo Orange II mediante la enzima MnP, en procesos en discontinuo, por medio de la aplicación del método de las velocidades iniciales. 2. Materiales y métodos 2.1. Preparación del crudo enzimático El crudo enzimático procedente de la fermentación del hongo Bjerkandera sp. BOS55, una vez descongelado, se centrifugó en tubos de 10 mL a 12.000xg en centrífuga Labofuge 200, Heraeus Sepatech GMBH (Alemania). Tras 5-10 min se separó el centrifugado del sobrenadante y este se filtró a través de filtros de membrana de celulosa de 0,45 µm (Millipore). La actividad enzimática del crudo tras ambos procesos osciló entre 3.000 y 10.000 U/L. 2.2. Medio de degradación La selección del medio de degradación del tinte azo Orange II en ensayos en discontinuo se basó en estudios previos en los que se determinaron las condiciones más adecuadas para conseguir una velocidad óptima de degradación del tinte (Mielgo et al., 2003). El medio empleado estuvo compuesto por un ácido orgánico (acético u oxálico), Mn2+, MnP y Orange II en las concentraciones que se indican en la Tabla 3.1. El pH se ajustó a 4,5 previo a la adición de la enzima. Tabla 3.1. Medio y condiciones para la degradación enzimática de Orange II Ácido orgánico MnSO4 Orange II H2O2 1 mM 33 µM 50-2000 mg/L 5-50 µmol/L·min MnP Volumen Temperatura pH 200 U/L 25 mL 22±2ºC 4,5 Capítulo 3 74 2.3. Ensayos de degradación Los ensayos de degradación se llevaron a cabo en matraces Erlenmeyer de 100 mL de capacidad con 25 mL de medio descrito en la Tabla 3.1. La reacción se inició al añadir H2O2, que se bombeó en continuo mediante una bomba peristáltica de velocidad variable Masterflex®C/L® Cole-Parmer (Illinois, EEUU). Los caudales de adición de H2O2 fueron de 40 µL/min, de manera que se prepararon disoluciones base de 3,125-31,25 mM para conseguir velocidades de adición entre 5 y 50 µmol/L·min. En todos los ensayos se realizó un seguimiento de la concentración de Orange II mediante espectrofotometría, y de la actividad enzimática, tal y como se describe en el Capítulo 2 de Materiales y métodos. Con el objetivo de observar la posible inhibición por substrato, se realizaron ensayos por duplicado a una única velocidad de adición de H2O2 (50 µmol/L·min) y un amplio rango de concentraciones iniciales de Orange II (100-250-500-7501000-1250-1500-1750-2000 mg/L), utilizando ácido acético, tal como se había considerado en estudios previos (Mielgo et al., 2003). A continuación se estudió la cinética del proceso en función de los dos parámetros que afectan en mayor grado a la velocidad de reacción, que son la concentración de substrato y la velocidad de adición de H2O2. Para ello se realizaron ensayos en discontinuo a diferentes concentraciones iniciales de Orange II (50-100-200-300-500 mg/L) y diferentes velocidades de adición de H2O2 (5-15-25-50 µmol/L·min), empleando oxálico como ácido carboxílico. Para excluir la posibilidad de que la decoloración fuese debida a un proceso distinto a la reacción enzimática, se realizó un control con MnP inactivada térmicamente. 3. Resultados y discusión 3.1. Cinética en función de la concentración de Orange II Teniendo en cuenta el ciclo catalítico de la enzima MnP, se puede observar que el substrato que reacciona con cada una de las formas de la enzima es diferente en las distintas etapas. Así, el substrato en la oxidación de MnP nativa al compuesto I es H2O2. La primera etapa de reducción, de MnP I a MnP II, se realiza mediante la oxidación de una molécula de Mn2+ a Mn3+. Por último, la Cinética de la degradación en discontinuo 75 tercera etapa, de reducción de la forma MnP II a MnP nativa, se realiza mediante la oxidación de otro compuesto que actúa como substrato (Glenn & Gold, 1985). Los compuestos oxidados obtenidos actúan a su vez como oxidantes de otros compuestos, que resultan ser los dadores finales de electrones, y por lo tanto los substratos finales de la oxidación enzimática. Cuando la cinética de la reacción enzimática propiamente dicha es más rápida que la de oxidación de los compuestos finales, esta última reacción se considera la etapa limitante del proceso, y por ello, la cinética global coincide con la cinética de degradación de dichos compuestos finales. Por este motivo, en términos cinéticos, se considera el Orange II como el substrato de la degradación enzimática. Se realizaron ensayos de degradación a distintas concentraciones iniciales de Orange II con el fin de observar el efecto de la concentración de substrato en la cinética de degradación. Se trabajó con las mismas concentraciones iniciales de ácido acético, Mn2+ y MnP en todos los ensayos, y se siguió la concentración de Orange II durante 1 h, a intervalos de 1 min durante los 10 primeros minutos y de 5 min hasta la finalización de los experimentos. Los perfiles de decoloración para las concentraciones iniciales de 100-500-1000-1500-2000 mg/L se muestran en la Figura 3.1. 0 10 20 30 40 50 60 70 80 90 100 0 10203040506070 Tiempo (min) Decoloración (%) Figura 3.1. Decoloración de Orange II en ensayos en discontinuo a diferentes concentraciones iniciales de tinte: () 100 mg/L; () 500 mg/L; (∆) 1000 mg/L; ({) 1500 mg/L; (⎯) 2000 mg/L Capítulo 3 82 0 10 20 30 40 50 60 70 80 90 100 0 10203040506070 Tiempo (min) Decoloración (%) 0 10 20 30 40 50 60 70 80 90 100 0 10203040506070 Tiempo (min) Decoloración (%) Figura 3.5. Decoloración de Orange II en ensayos a diferentes velocidades de adición de H2O2: () 50 µmol/L·min; () 25 µmol/L·min; (∆) 15 µmol/L·min; ({) 5 µmol/L·min; y diferentes concentraciones de Orange II: (a) 100 mg/L; (b) 50 mg/L En la mayoría de las condiciones aplicadas se alcanzó una decoloración superior al 90% tras 60 min. Para una concentración de Orange II elevada fue necesaria una mayor cantidad de H2O2 para lograr una decoloración entorno a ese valor. Sin embargo, una adición de 5 µmol/L·min no fue suficiente para degradar el 90% del tinte aun cuando la concentración inicial de este fue de 50 mg/L. En la Tabla 3.4 se presentan los valores de las velocidades iniciales para cada uno de los ensayos realizados. Por trabajar con concentraciones de substrato iguales o inferiores a 500 mg/L, y tal como se ha visto en el apartado anterior, no cabe esperar fenómenos de inhibición por substrato (Orange II). Sólo en el caso de una adición de H2O2 elevada, de 50 µmol/L·min, se pudo observar cierta (a) (b) Cinética de la degradación en discontinuo 83 inhibición a concentraciones de 500 mg/L de Orange II, debida probablemente a una inhibición parcial de la enzima. Por otra parte, se observa que existe una relación entre las velocidades cinéticas y la velocidad de adición de H2O2. Tabla 3.4. Velocidades de degradación de Orange II a diferentes concentraciones iniciales de tinte y diferentes velocidades de adición de H2O2 Velocidades de degradación (mg/L·min) Velocidad de adición de H2O2 ( µ mol/L·min) Concentración inicial de Orange II (mg/L) 5 15 25 50 50 100 200 300 500 0,84 1,10 1,47 1,65 2,24 3,42 4,97 5,48 5,36 6,11 4,93 6,10 6,99 7,24 8,00 7,10 11,6 13,1 15,2 13,3 En las condiciones de operación, el término de inhibición de la ecuación de Haldane determinado anteriormente no sería significativo con respecto al resto de los términos de la ecuación. Se consideró por ello el modelo más sencillo de Michaelis-Menten con respecto a la concentración de Orange II, y una función lineal con respecto a la velocidad de adición de H2O2, como se presenta en la Ecuación 4. ( ) 2222 OHOH M mQK SK Sr r+ + = (4) donde 22OH K es la constante de la función de la adición de H2O2 y 22OH Qes la velocidad de adición de H2O2. Si bien la constante cinética rm ya no tiene el significado de velocidad máxima, se seguirá manteniendo esta nomenclatura. Para una velocidad de adición de H2O2 constante, se puede considerar una velocidad máxima rm’ para cada uno de los valores de velocidad de adición, de manera que la Ecuación 4 se puede transformar en la Ecuación 5, en donde el término de la velocidad máxima aparente resulta una función lineal de la velocidad de adición de H2O2, para valores de este iguales o inferiores a 50 µmol/L·min. Capítulo 3 84 SK Sr r M m + =' donde ( ) 2222 'OHOHmm QKrr + = (5) Los valores de rm’ y KM para cada valor de velocidad de adición se expresan en la Tabla 3.5. Tabla 3.5. Parámetros cinéticos de la degradación de Orange II a diferentes velocidades de adición de H2O2 Velocidad de adición de H2O2 ( µ mol/L·min) Parámetros cinéticos 5 15 25 50 rm’(mg/L·min) KM (mg/L) 2,20 85,8 6,61 44,3 8,24 34,0 17,5 68,8 Considerando un valor medio de KM, que no debe variar con la velocidad de adición de H2O2, se obtiene una regresión lineal entre el valor de la velocidad máxima aparente rm’ y la velocidad de adición de H2O2, determinándose los parámetros cinéticos de la Ecuación 4, que se muestran en la Tabla 3.6. Tabla 3.6. Parámetros del modelo cinético en función de la concentración de Orange II y la adición de H2O2 rm (mg/ µ mol) KM (mg/L) 22OH K( µ mol/L·min) 0,33 58,2 2,4 A partir de estos parámetros cinéticos se puede comprobar cómo el modelo propuesto ajusta los datos experimentales, para cada una de las velocidades de adición de H2O2 de trabajo (Figura 3.6). El error entre los datos experimentales y los propuestos por el modelo es menor del 5% en la mayoría de los casos, lo que indica que el tipo de modelo aplicado y los valores de las constantes cinéticas obtenidos son adecuados para describir el sistema de reacción. Cinética de la degradación en discontinuo 85 0 2 4 6 8 10 12 14 16 0 100 200 300 400 500 600 Concentración Orange II (mg/L) r (mg/L·min) Figura 3.6. Comprobación del modelo cinético en función de la concentración de Orange II y la velocidad de adición de H2O2: () 50 µmol/L·min; () 25 µmol/L·min; (∆) 15 µmol/L·min; ({) 5 µmol/L·min; (—) datos simulados por el modelo cinético 4. Conclusiones La oxidación enzimática del tinte azo Orange II mediante la enzima MnP constituye un método muy efectivo para su degradación. Las condiciones en las cuales la oxidación es más rápida y la actividad enzimática se ve menos afectada han sido ampliamente estudiadas en trabajos anteriores (Moreira et al., 2001; Mielgo et al., 2003). La presencia del ion Mn2+ juega un papel importante en el ciclo catalítico de la enzima MnP. Numerosos autores mantienen que la enzima comúnmente denominada manganeso peroxidasa tiene actividad independiente de Mn2+, con lo cual podría recibir el nombre más adecuado de peroxidasa versátil (Heinfling et al., 1998; Mester & Field, 1998), aunque la eficiencia catalítica de la enzima es mucho más elevada en presencia de Mn2+ que en presencia de otros substratos aromáticos (Heinfling et al., 1998). Sin embargo una concentración muy elevada de Mn2+ en el medio ralentiza la degradación de Orange II (Mielgo et al., 2003). Por otra parte, la presencia de Mn2+ en el medio favorece la estabilidad de la enzima (Palma et al., 1997). Con el fin de llegar a un compromiso entre la cinética de la degradación y la estabilidad enzimática, se seleccionó 33 µM como Capítulo 3 86 la concentración más adecuada para los ensayos de degradación (Mielgo et al., 2003). El crudo enzimático es el factor más costoso del proceso. Por ello, para determinar el valor de actividad enzimática más adecuado se consideraron parámetros económicos. Por encima de 150-200 U/L de MnP no se apreciaron grandes cambios en cuanto a la cinética del proceso. Por ello, se consideró ese rango como el más adecuado para los procesos de degradación (Mielgo et al., 2003). El ácido orgánico juega un doble papel en el medio de degradación, pues ayuda a mantener el pH de la disolución en el valor óptimo para favorecer la estabilidad de la enzima, y por otra parte actúa como estabilizador del ion Mn3+ generado mediante la formación de un complejo. Sin embargo, concentraciones muy elevadas de ácido orgánico afectan negativamente a la estabilidad de la enzima, y con ello, al grado de decoloración alcanzado (Mielgo et al., 2003). Esto es debido a que los ácidos son oxidados por el propio Mn3+ y producen radicales que afectan a la estabilidad enzimática, a la vez que la cantidad de Mn3+ disponible para la degradación del substrato se reduce, afectando a la cinética de la degradación (Hofrichter et al., 1998). En estudios previos se llegó a una concentración óptima de ácido orgánico de 1 mM (Mielgo et al., 2003). No sólo se debe considerar la concentración sino también el tipo de ácido, pues la formación de un complejo exige la presencia de un ácido no monocarboxílico, que no tiene capacidad quelante. Sin embargo, se operó en ausencia de ácido en ensayos previos y se alcanzaron buenos niveles de degradación de Orange II, aunque se produjo una mayor desestabilización de la enzima como consecuencia de la ausencia de un medio tampón (Mielgo et al., 2003). Se consideró que podría ser el propio Orange II, que tiene carácter ácido y está presente en una concentración considerable, el que tuviese una cierta capacidad quelante con respecto al Mn3+, de manera que pudiese estabilizar al ion y favorecer su propia degradación. Una forma de realizar la selección del ácido carboxílico puede ser en función de la cinética de degradación en presencia de cada uno de los ácidos. De esta forma, si se consideran ambas cinéticas obtenidas en el presente capítulo y se comparan para una misma velocidad de adición de H2O2, de 50 µmol/L·min, se obtiene la representación de la Figura 3.7, en la que se observa que la cinética de Cinética de la degradación en discontinuo 87 degradación en presencia de ácido oxálico es más rápida que en presencia de acético. Este hecho está corroborado a su vez por los valores de la constante de Michaelis para los distintos ácidos. El valor de KM para el ácido acético es unas tres veces superior al del ácido oxálico (184 frente a 58 mg/L), lo que indica que a concentraciones pequeñas de Orange II la velocidad de degradación es mucho mayor en presencia de oxálico. Sin embargo, la velocidad de degradación máxima en el caso del acético es mayor que para el oxálico (23 y 19 mg/L·min, respectivamente), lo que significaría que a concentraciones de Orange II mayores de las representadas en la gráfica la presencia de acético favorecería la velocidad de degradación. 0 2 4 6 8 10 12 14 16 18 0 100 200 300 400 500 600 Concentración Orange II (mg/L) r (mg/L·min) Figura 3.7. Comparación entre los modelos cinéticos de la degradación de Orange II en presencia de: (---) ácido acético; (—) ácido oxálico Para facilitar la obtención y posterior aplicación de las ecuaciones cinéticas se asumieron una serie de consideraciones: el proceso es isotérmico, el volumen de reacción es constante y el reactor está perfectamente agitado. A partir de estas suposiciones se aplicó el método diferencial de velocidades iniciales, en el que se consideró la pendiente inicial de degradación de Orange II para cada concentración inicial de tinte. Se podría considerar un método diferencial que tomase todos los pares de puntos de concentración frente a tiempo para realizar el cálculo de los parámetros cinéticos, de forma que ganasen más peso aquellos puntos obtenidos a concentraciones bajas de tinte, por ser los más abundantes. Sin embargo, el parámetro cinético rm es una función lineal de la concentración de Capítulo 3 88 enzima, que no se mantiene constante a lo largo del proceso, sino que sufre una cierta desactivación. Diversos autores consideraron una cinética de desactivación de la enzima, que podría venir dada por la Ecuación 6 (Sehanputri & Hill, 2000; Bódalo et al., 2004). tkd eEE − ⋅= 0 (6) donde E es la actividad enzimática a tiempo t, E0 es la actividad enzimática inicial, kd es la constante de desactivación de primer orden y t es el tiempo. Esta ecuación se podría aplicar a la ecuación cinética, aunque dificultaría el cálculo de los parámetros. El modelo propuesto para la degradación de Orange II es un modelo semiempírico, que resulta de la combinación del modelo de Michaelis-Menten con respecto a la concentración de Orange II y un modelo matemático con respecto a la velocidad de adición de H2O2. Concentraciones muy elevadas de tinte producen un efecto inhibitorio en la reacción enzimática, de manera que la velocidad de reacción disminuye, aunque muy levemente. El modelo es útil para determinar la concentración de tinte que aporta una cinética más elevada, que está entorno a 750 mg/L. Sin embargo a medida que la concentración inicial aumenta, el porcentaje de decoloración alcanzado es menor, lo que implica que tras la reacción puede permanecer en el medio una concentración de tinte elevada. La concentración de Orange II se ha de seleccionar teniendo en cuenta ambos factores, cinética y decoloración, con el objetivo de alcanzar una decoloración adecuada en un tiempo reducido. El efecto del H2O2 en la ecuación cinética resulta ejercer una dependencia lineal con respecto, no a su concentración puntual (que es prácticamente nula), sino a su velocidad de adición. El modelo indica que a medida que aumenta la velocidad de adición de H2O2 (hasta 50 µmol/L·min) la degradación de tinte tiene lugar a mayor velocidad. Para velocidades más altas de adición de H2O2 deberá considerarse el aspecto de desactivación de MnP debido a concentraciones elevadas de H2O2. La determinación del caudal óptimo de H2O2 ha de resultar un compromiso entre la velocidad de la degradación y la desactivación enzimática. En conclusión, el modelo cinético propuesto es una herramienta útil para conocer la cinética del proceso, ya que por medio de ella se puede estudiar cómo los diversos parámetros (ácido carboxílico, concentración de Orange II, velocidad Cinética de la degradación en discontinuo 89 de adición de H2O2) afectan a la velocidad de degradación del tinte, y permite decidir cuáles son las condiciones que favorecen una cinética más rápida. 5. Referencias Alfani, F., Gallifuoco, A. and Cantarella, M. (1990) Study of Michaelis-Menten kinetics with linear-type product inhibition in ultrafiltration membrane reactors: mathematical model, experimental and data correlation. The Chemical Engineering Journal 43, B43B51. Bódalo, A., Gómez, J. L., Gómez, E., Bastida, J., León, G., Máximo, M. F., Hidalgo, A. M. and Montiel, M. C. (1999) Kinetic calculations in the enzymatic resolution of DLamino acids. Enzyme and Microbial Technology 24, 381-387. Bódalo, A., Gómez, J. L., Gómez, E., Bastida, J., Máximo, M. F. and Montiel, M. C. (2001a) Ultrafiltration membrane reactors for enzymatic resolution of amino acids: design model and optimization. Enzyme and Microbial Technology 28, 355-361. Bódalo, A., Gómez, J. L., Gómez, E., Máximo, M. F. and Hidalgo, A. M. (2001b) Simulation of transient state in enzymatic membrane reactors for resolution of DL-valine and experimental validation. Journal of Chemical Technology and Biotechnology 76, 978984. Bódalo, A., Gómez, J. L., Gómez, E., Máximo, M. F. and Montiel, M. C. (2004) Study of L-aminoacylase deactivation in an ultrafiltration membrane reactor. Enzyme and Microbial Technology 35, 261-266. Cantarella, M., Cantarella, L., Gallifuoco, A., Frezzini, R., Spera, A. and Alfani, F. (2004) A study in UF-membrane reactor on activity and stability of nitrile hydratase from Microbacterium imperiale CBS 498-74 resting cells for propionamide production. Journal of Molecular Catalysis B: Enzymatic 29, 105-113. Gallifuoco, A., Alfani, F., Cantarella, M. and Viparelli, P. (2001) Studying enzymecatalyzed depolymerization in continuous reactors. Industrial Engineering and Chemical Research 40, 5184-5190. Glenn, J. K. and Gold, M. H. (1985) Purification and properties of an extracellular Mn(II)- dependent peroxidase from the lignin-degrading basidiomycete, Phanerochaete chrysosporium. Archives of Biochemistry and Biophysics 242, 329-341. Heinfling, A., Martínez, M. J., Martínez, A. T., Bergbauer, M. and Szewzyk, U. (1998) Purification and characterization of peroxidases from the dye-decolorizing fungus Bjerkandera adusta. FEMS Microbiology Letters 165, 43-50. Capítulo 3 90 Hofrichter, M., Ziegenhagen, D., Vares, T., Friedrich, M., Jäger, M. G. and Fritsche, W. (1998) Oxidative decomposition of malonic acid as basis for the action of manganese peroxidase in the absence of hydrogen peroxide. FEBS Letters 434, 362-366. Mester, T. and Field, J. A. (1998) Characterization of a novel manganese peroxidaselignin peroxidase hybrid isoenzyme produced by Bjerkandera sp. strain BOS55 in the absence of manganese. Journal of Biological Chemistry 273, 15412-15417. Mielgo, I., López, C., Moreira, M. T., Feijoo, G. and Lema, J. M. (2003) Oxidative degradation of azo dyes by manganese peroxidase under optimized conditions. Biotechnology Progress 19(2), 325-331. Moreira, M. T., Palma, C., Mielgo, I., Feijoo, G. and Lema, J. M. (2001) In vitro degradation of a polymeric dye (Poly R-478) by manganese peroxidase. Biotechnology and Bioengineering 75(3), 362-368. Palma, C., Moreira, M. T., Feijoo, G. and Lema, J. M. (1997) Enhanced catalytic properties of MnP by exogenous addition of manganese and hydrogen peroxide. Biotechnology Letters 19(3), 263-267. Sehanputri, P. S. and Hill, C. G. (2000) Biotechnology for the production of nutraceuticals enriched in conjugated linoleic acid: II. Multiresponse kinetics of the hydrolysis of corn oil by a Pseudomonas sp. lipase immobilized in a hollow-fiber reactor. Biotechnology and Bioengineering 69(4), 450-456. Timofeevski, S. L., Reading, N. S. and Aust, S. D. (1998) Mechanisms for protection against inactivation of manganese peroxidase by hydrogen peroxide. Archives of Biochemistry and Biophysics 356(2), 287-295. Wariishi, H., Dunford, H. B., MacDonald, I. D. and Gold, M. H. (1989) Manganese peroxidase from the lignin-degrading basidiomycete Phanerochaete chrysosporium. Transient state kinetics and reaction mechanism. The Journal of Biological Chemistry 264(6), 3335-3340. Willeman, W. F., Straathof, A. J. J. and Heijnen, J. J. (2002) Comparison of a batch, fedbatch and continuously operated stirred-tank reactor for the enzymatic synthesis of (R)- mandelonitrile by using a process model. Bioprocess and Biosystems Engineering 24, 281-287. Degradación en reactor enzimático de membrana 91 Capítulo 4 Degradación en continuo de Orange II en un reactor enzimático de membrana1 Resumen En este capítulo se presenta el estudio de un reactor enzimático de membrana para la oxidación en continuo del tinte azo Orange II mediante MnP. La configuración consistió en un reactor de tanque agitado asociado a una membrana de ultrafiltración, que permitió la retención y recirculación de la enzima, mientras que los productos y substratos pasaron a través de la membrana y se eliminaron junto con el efluente. Con el objetivo de maximizar la eficacia del sistema, en términos de tinte degradado por unidad de enzima consumida, se estudiaron diversas estrategias de dosificación de enzima en un único pulso, pulsos periódicos o bien en continuo. Adicionalmente, se estudió la influencia de diversos parámetros tales como la actividad enzimática, velocidad de dosificación de H2O2, concentración de ácido orgánico y tiempo de residencia hidráulico. Las mejores condiciones permitieron obtener una decoloración superior al 90% con una mínima pérdida de actividad enzimática, alcanzándose una eficacia de 42,5 mg de Orange II oxidado por unidad de enzima MnP consumida, valor 16 veces superior al máximo obtenido en ensayos en discontinuo. El sistema se mantuvo estable durante 18 d, sin necesidad de limpieza o reemplazo de la membrana. Por último, se realizó una simulación mediante la aplicación de la ecuación cinética propuesta en el Capítulo 3 a los ensayos en continuo. El análisis de los datos muestra un ajuste satisfactorio entre los datos experimentales y los simulados para la operación del reactor tanto en estado estacionario como en no estacionario. 1 López, C., Moreira, M. T., Feijoo, G. and Lema, J. M. (2004) Dye decolorization by manganese peroxidase in an enzymatic membrane bioreactor. Biotechnology Progress 20, 74-81. Capítulo 4 98 su parte inferior, por lo tanto el flujo es ascendente y paralelo a la superficie de la membrana. El caudal de permeado atraviesa la membrana y abandona el cartucho por un conducto interior. La relación entre el caudal de permeado y de retenido se establece por medio de una válvula incorporada en la parte superior del soporte. El proceso se inicia por adición de tres disoluciones al reactor por medio de bombas peristálticas de velocidad variable: i) una disolución de Orange II (0,1-0,5 g/L), MnSO4 (33 µM) y ácido orgánico (1 mM), por medio de una bomba Masterflex®L/S® Cole-Parmer (Illinois, EEUU) (P1); ii) MnP (7.000 U/L) y iii) H2O2 (94-312 mM), mediante dos bombas Masterflex®C/L® Cole-Parmer (Illinois, EEUU) (P2 y P3). Se empleó una cuarta bomba peristáltica Masterflex®L/S® para bombear el efluente del reactor hacia el cartucho de ultrafiltración (P4). Preparación y mantenimiento de la membrana Los cartuchos Prep/Scale TFF se disponen con una disolución al 0,1% de cloruro de alquil-benzil-dimetil amonio. Cuando la membrana se usa por primera vez es necesario realizar una purga para eliminar las disoluciones de limpieza y almacenamiento. Tras cada uso, se debe llevar a cabo una limpieza, precedida y seguida de purgas para eliminación de disoluciones de trabajo y limpieza. El procedimiento de purga de la membrana comienza por el vaciado de la disolución que contiene, mediante la agitación del cartucho invertido. A continuación se bombean 7 L de agua microfiltrada y desionizada a 45ºC con un caudal de 1 L/min a una presión máxima de 20 psi (1,4 bar), pues a presiones mayores se puede producir la ruptura de las gomas flexibles empleadas en las bombas peristálticas. El volumen total de agua se distribuye de la siguiente manera: en primer lugar se hacen pasar 2 L de agua a través de la línea de retenido, a continuación 4 L a través de la membrana, y por último 1 L de nuevo a través de la línea de retenido. La limpieza se realiza con una disolución de NaOH 0,1 N a 45ºC. Se preparan 4 L de disolución y se bombean a través de la membrana a un caudal de 4 L/min, abriendo la válvula de la línea de permeado de manera que el flujo se reparta entre ambas líneas y que la presión no sea mayor de 20 psi. La disolución se recircula durante los 60 min de limpieza. Esta misma disolución es la que se utiliza para el almacenamiento de la membrana. Degradación en reactor enzimático de membrana 99 Estudio de la eficacia de la membrana La eficacia de la membrana se evaluó por medio del cálculo del coeficiente de rechazo del substrato (Orange II) y de la enzima. Con respecto al tinte Orange II, se hizo pasar una disolución de 100 mg/L a un caudal de 180 mL/min a través de la membrana y se determinó la concentración de tinte en las líneas de retenido y de permeado. Se consideró, además, el caso de que todo el caudal pasase a través de la membrana (Figura 4.2a), comprobándose así la posible adsorción del tinte sobre la superficie de la misma. El coeficiente de rechazo con respecto a MnP se analizó mediante un procedimiento similar. Se bombeó un caudal de 180 mL/min de una disolución conteniendo 125 U/L de MnP, de los cuales 20 mL/min pasaron a través de la membrana. Se consideró el caso de que todo el caudal fuese recirculado (Figura 4.2b), y la pérdida de actividad enzimática se comparó con un control en paralelo en un reactor de tanque agitado sin recirculación, con el objetivo de comprobar la estabilidad de la enzima tras 180 min de estrés mecánico. (a) (b) Figura 4.2. Esquema de los ensayos realizados para la determinación de la eficacia de la membrana: (a) interacción entre Orange II y la membrana; (b) estabilidad de la enzima Ensayos de decoloración en continuo Tras el llenado del reactor y las conducciones con la disolución de alimentación, formada por Orange II, Mn2+ y ácido orgánico, se adiciona la enzima MnP y se ponen en marcha las bombas de alimentación y recirculación, iniciando así el ciclo catalítico de la enzima. El caudal de la bomba de alimentación se mantuvo entre 2,78 y 25 mL/min, para operar a tiempos de residencia hidráulica (TRH) entre 90 min y 10 min. Se trabajó a velocidades de RECIRCULACIÓN ENZIMÁTICA RCTA UF RCT A INFLUENTE EFLUENTE UF Capítulo 4 100 dosificación de H2O2 de 15 a 50 µmol/L·min empleando disoluciones de H2O2 entre 94 y 312 mM con un caudal de 40 µL/min. La adición de enzima se realizó mediante tres estrategias: i) una única adición al comienzo del ensayo; ii) adición en fed-batch (un pulso cada hora); iii) adición en continuo a una velocidad tal que permita mantener la actividad enzimática en un valor deseado. La corriente de salida se bombeó hacia la membrana a una velocidad de recirculación 12 veces superior a la de alimentación. Todos los experimentos se llevaron a cabo a temperatura ambiente. Se tomaron muestras del reactor y del flujo de permeado, y se midió la actividad enzimática y la concentración de Orange II (Figura 4.3). Figura 4.3. Equipo para la decoloración de Orange II en un reactor enzimático de membrana Para comprobar que la decoloración no tenga lugar mediante una reacción no enzimática, se realizaron controles en paralelo con enzima desactivada térmicamente y no se observó cambio en la concentración de tinte en ningún caso. En los casos indicados se realizó el ensayo de decoloración en un fermentador BIOSTAT Q de Braun-Biotech International (Melsungen, Alemania) de 1 L, con 500 mL de medio de reacción. El reactor dispone de medida de pH, temperatura y oxígeno disuelto, con un sistema de adquisición de datos on line controlado por un ordenador. Degradación en reactor enzimático de membrana 101 2.2. Técnicas analíticas La concentración de Orange II se midió espectrofotométricamente y, en los casos indicados, por HPLC. La actividad MnP se midió por espectrofotometría mediante la oxidación de 2,6-dimetoxifenol. Las técnicas fueron descritas en el Capítulo 2 de Materiales y métodos. La concentración de oxígeno disuelto se midió mediante un oxímetro Oxi 340 WTW (Alemania). Carbono orgánico total El carbono orgánico total (COT) es una medida directa del contenido de la materia orgánica total en una muestra. El COT se midió con un analizador Shimadzu TOC-5000, que lo calcula como la diferencia entre el carbono total (CT) e inorgánico (CI). Se utilizó aire de alta pureza como gas portador a 150 mL/min. El equipo determina el carbono total a partir del CO2 que se produce durante la combustión catalítica de la muestra a 680ºC, empleando como catalizador de oxidación platino inmovilizado sobre esferas de alúmina. El carbono inorgánico se obtiene a partir del CO2 que se produce por reacción con H3PO4 al 25%. El CO2 se mide ópticamente, después de haber eliminado la humedad, en un detector de infrarrojo no dispersivo (NDIR). Nitrógeno total Kjeldahl El nitrógeno total Kjeldahl (NTK) comprende el nitrógeno orgánico y el amoniacal. El NTK se midió en un analizador de nitrógeno orgánico total Dohrmann DN-1900. Se determina como la diferencia entre el nitrógeno total (NT) y el nitrógeno inorgánico (NI). El gas portador fue oxígeno con un 99,999% de pureza. El nitrógeno total se calcula a partir del NO2 que se produce durante la combustión catalítica de la muestra a 850ºC. Posteriormente, mediante una reducción química con H2SO4 catalizada por VaCl3 a 80ºC se determina el NI (NO3-, NO2-). Se elimina la humedad y se hace reaccionar con O3 para obtener NO2 en un estado excitado. La vuelta de este óxido a su estado fundamental provoca la emisión de un protón, a partir del cual se puede llevar a cabo la determinación de NI mediante quimioluminiscencia, empleando un tubo multiplicador. Capítulo 4 102 3. Resultados y discusión 3.1. Eficacia de la membrana Con el objetivo de comprobar la idoneidad de la membrana de polietersulfona seleccionada, se calcularon los coeficientes de rechazo con respecto al substrato y a la enzima. Para ello, se hicieron pasar disoluciones de Orange II y de MnP a través de la membrana durante 60 min, y se analizaron las concentraciones en la línea de retenido y permeado al cabo de ese tiempo. En la Tabla 4.2 se muestran los valores de dichas concentraciones y de los coeficientes de rechazo hallados a partir de la Ecuación 1. Tabla 4.2. Coeficientes de rechazo de la membrana con respecto a Orange II y MnP Concentración alimentación Concentración retenido Concentración permeado Coeficiente de rechazo Orange II MnP 92,78 mg/L 120 U/L 92,55 mg/L 120 U/L 90,46 mg/L 0 U/L 0,023 1 Ambos valores de los coeficientes de rechazo (0 para los substratos y productos y 1 para la enzima) resultan idóneos para asegurar la capacidad de la membrana para la separación de substratos y productos y retención de la actividad enzimática dentro del reactor. En experimentos adicionales, en que se forzó a pasar todo el caudal de Orange II a través de la membrana, sin línea de retenido, se comprobó que el 98% del tinte se recuperó en la corriente de permeado, indicativo de que no se produce adsorción física del tinte sobre la membrana. Por otra parte, la estabilidad de la enzima frente al estrés mecánico quedó demostrada en un ensayo en que se hizo recircular enzima durante 180 min a través de la membrana. Tras este tiempo, se conservó el 95% de la actividad enzimática inicial, valor aproximadamente igual al del control en un sistema agitado sin recirculación. Degradación en reactor enzimático de membrana 103 3.2. Estrategias de adición de MnP El principal objetivo de este trabajo se centró en el desarrollo de un sistema de decoloración en continuo en el que se persiguió la maximización de la eficacia del proceso, definida como la relación entre la cantidad de tinte degradado (en mg/h) y los requerimientos de enzima para la degradación (en U/h). Dichos requerimientos comprenden el consumo y la desestabilización de la enzima en la reacción y se pueden establecer como la pérdida de actividad enzimática durante el proceso de degradación. Se hace necesario conocer este valor para establecer la velocidad de adición de enzima necesaria para mantener un valor constante en el reactor y conseguir de esta forma un proceso en continuo. Se realizaron ensayos de degradación de Orange II en el reactor continuo de tanque agitado. Para ello se procedió al llenado del reactor y conducciones con la disolución de alimentación indicada en la Tabla 4.3. Tabla 4.3. Condiciones de los ensayos de decoloración Volumen TRH MnP inicial Velocidad dosificación H2O2 Caudal alimentación 250 mL 60 min 200 U/L 50 µmol/L·min 4,17 mL/min Alimentación Orange II MnSO4 Ácido acético 100 mg/L 33 µM 1 mM Las concentraciones de Mn2+, ácido orgánico, enzima inicial, velocidad de dosificación de H2O2 y el tipo de ácido empleado se eligieron en base a estudios previos realizados en discontinuo (Mielgo et al., 2003). El tiempo de residencia de 1 h se tomó a partir de consideraciones cinéticas, pues en función de la ecuación cinética hallada en el Capítulo 3 se obtuvo que dicho TRH permite una decoloración del efluente entorno al 90%. Adición de MnP en un único pulso El consumo de enzima se determinó mediante un ensayo en que se realizó una única adición inicial de MnP al reactor enzimático. En dicho ensayo se tomaron muestras periódicas para analizar decoloración del tinte, actividad MnP y oxígeno disuelto en el reactor (Figura 4.4). Capítulo 4 104 0 20 40 60 80 100 0 25 50 75 100 125 150 Tiempo (min) Decoloración (%) 0 5 10 15 20 25 MnP/10 (U/L) O 2 (mg/L) c1 c2 Figura 4.4. Decoloración de Orange II en un ensayo con una única adición de MnP: ({) decoloración; (∆) actividad enzimática; (-) oxígeno disuelto; C1: oxígeno disuelto, control sin adición de Orange II; C2: oxígeno disuelto, control sin adición de MnP Al comienzo tuvo lugar una mayor pérdida de actividad enzimática, coincidente con la degradación inicial del tinte. A partir de los 40 min se alcanzó una decoloración del 90%, que se mantuvo prácticamente constante hasta el final del ensayo. El consumo medio de enzima obtenido por evaluación de la pendiente de la curva fue de 37 U/L·h, que permitió establecer la velocidad de adición de MnP para mantener un nivel constante de enzima en el reactor. La constante de desactivación enzimática kd calculada a partir de la Ecuación 2 (Sehanputri & Hill, 2000) tiene un valor de 0,204 h-1. tkd eEE − ⋅= 0 (2) La concentración inicial de oxígeno disuelto en el reactor fue de 8,3 mg/L, que corresponde a la solubilidad de oxígeno en la mezcla de reacción a 23ºC. Durante los primeros 15 min, la concentración de oxígeno disminuyó hasta alcanzar un mínimo de 7,4 mg/L, y dicha disminución se produjo de forma simultánea a la máxima pendiente de decoloración. A continuación tuvo lugar el proceso opuesto, con un aumento en la concentración de oxígeno durante los siguientes 60 min hasta que se alcanzó un valor constante de aproximadamente 12 mg/L. Degradación en reactor enzimático de membrana 105 La influencia de la fuente de oxígeno se investigó en dos ensayos control: uno de ellos sin adición de Orange II (C1 en Figura 4.4) y otro sin adición de MnP (C2 en Figura 4.4). En el primer caso la concentración de oxígeno aumentó linealmente a lo largo de todo el experimento, hasta valores superiores a los alcanzados en presencia de tinte (21 frente a 12 mg/L tras 60 min). El oxígeno se genera en la reacción entre el Mn3+ producido en el ciclo catalítico de la enzima y el H2O2 adicionado, y tiene especial relevancia cuando no hay presencia de substratos que puedan ser oxidados (Aitken & Irvine, 1990; Pérez & Jeffries, 1992; Martínez et al., 1996). Otros trabajos presentan que MnP puede tener cierta actividad catalasa, que es dependiente de Mn2+ y es inhibida por oxalato o cualquier otro substrato de MnP (Timofeevski et al., 1998; Gómez-Toribio et al., 2001). Por último, otra fuente de oxígeno podría ser la reacción entre el compuesto III de MnP con Mn3+, que da lugar a la generación de la enzima nativa y a la liberación de O2 (Timofeevski et al., 1998). El oxígeno generado se utilizó luego en la degradación del tinte (Spadaro & Renganathan, 1994; Chivukula et al., 1995; López et al., 2004). La diferencia entre las pendientes de la curva C1 y la de ensayo informa sobre la cantidad de oxígeno requerido para la oxidación de Orange II. En los experimentos realizados sin adición de MnP, el nivel de oxígeno no varió durante el ensayo, lo que indica que la adición de H2O2 por sí misma no da lugar a la generación de oxígeno. Adición de MnP en fed-batch En un ensayo llevado a cabo en el reactor enzimático se consideraron adiciones de MnP en pulsos. Tras los primeros 200 min de reacción, se adicionaron pulsos de MnP cada hora con el objetivo de mantener el nivel de enzima entre 100 y 200 U/L, durante un tiempo de operación total de 10 h (Figura 4.5). La mayor eficacia de decoloración, superior al 90%, se mantuvo durante los primeros 120 min, mientras la actividad MnP fue superior a 120 U/L; posteriormente, hasta los 200 min, la actividad fue menor de 100 U/L, con lo que la decoloración disminuyó al 80%. La adición de un nuevo pulso de enzima en ese instante favoreció la recuperación de la eficacia de decoloración. Aparentemente, se requiere un mínimo de actividad MnP entorno a 120 U/L, para mantener una operación eficaz. Los porcentajes menores de decoloración Capítulo 4 106 observados a 360 y 440 min correspondieron a fallos operacionales en la bomba de dosificación de H2O2. 0 20 40 60 80 100 120 0 100 200 300 400 500 600 700 Tiempo (min) Decoloración (%) 0 5 10 15 20 25 30 MnP/10 (U/L) O 2 (mg/L) Figura 4.5. Decoloración de Orange II en un ensayo con adición de MnP en pulsos: ({) decoloración; (∆) actividad enzimática; (-) oxígeno disuelto La concentración de oxígeno disuelto siguió un perfil similar a los ensayos anteriores. Se produjo una disminución inicial de oxígeno hasta valores de 7,4 mg/L de forma simultánea a la máxima pendiente de decoloración. A partir de ese momento se produjo un aumento hasta valores de 15 mg/L, que coincidió con los valores más altos de decoloración. Paralelamente a la reducción en la decoloración, la concentración de oxígeno se redujo como consecuencia de la pérdida de actividad enzimática. Los fallos de dosificación de H2O2 a los 360 y 440 min ocasionaron las respectivas caídas en la concentración de oxígeno disuelto hasta alcanzar un nivel de 10 mg/L. Este hecho es debido a que cuando no se adiciona H2O2 al reactor, no se produce oxígeno en la reacción. Adición en continuo de MnP En los siguientes experimentos la enzima MnP se añadió de forma continua al reactor enzimático con el objetivo de mantener una actividad constante dentro del reactor. El ensayo, realizado en las mismas condiciones que los anteriores, dadas por la Tabla 4.3, con un bombeo continuo de MnP para mantener un nivel de 200 U/L en el reactor, fue un proceso estable en que se alcanzó una Degradación en reactor enzimático de membrana 107 decoloración del 96% y una eficacia de 2,6 mg/U. Los datos comparativos de las tres estrategias de adición de enzima se muestran en la Tabla 4.4. Tabla 4.4. Datos comparativos de las distintas estrategias de adición de MnP Estrategia de adición de MnP M nP (U/L) Adición de MnP (U/L·h) Decoloración (%) Eficacia (mg Orange II/U) Único pulso inicial Fed-batch Continuo 200-108 100-250 225 0 62,8 37,2 91,0 96,3 95,7 - 1,53 2,58 Una adición de MnP en continuo favorece la eficacia del proceso, con un menor consumo de enzima, manteniéndose un alto nivel de decoloración. 3.3. Optimización de la operación en continuo Con el objetivo de mejorar el proceso, bien sea mediante la disminución de consumo de enzima o mediante el aumento de la capacidad de degradación de tinte, se estudió el efecto de diversos factores: i) nivel de actividad enzimática; ii) velocidad de dosificación de H2O2; iii) naturaleza de ácido orgánico; iv) tiempo de residencia. Todos los ensayos se realizaron en el reactor enzimático de membrana con un volumen de 250 mL y concentraciones en la alimentación de 100 mg/L de Orange II, 33 µM de MnSO4 y 1 mM de ácido orgánico. Los ensayos tuvieron una duración de entre 4 y 8 h. Efecto de la actividad MnP Se consideraron dos valores de actividad MnP en el reactor: 125 U/L, valor seleccionado a partir de los resultados previos obtenidos en el ensayo de alimentación de MnP en fed-batch; y 225 U/L, valor considerado en los ensayos de decoloración en discontinuo (Mielgo et al., 2003). La velocidad de dosificación de H2O2 fue de 50 µmol/L·min y el ácido empleado fue el ácido acético. En la Tabla 4.5 se muestran los resultados obtenidos una vez alcanzado el estado estacionario. Capítulo 4 114 Oxígeno disuelto en estado estacionario El seguimiento de la concentración de oxígeno disuelto en los diferentes ensayos de decoloración permitió comprobar la influencia de ciertas variables de operación. En los ensayos de alimentación de MnP en pulsos se había observado una variación de la concentración de oxígeno cuando se producían fallos en el caudal de dosificación de H2O2; además, se observó que el valor de oxígeno disuelto cuando se alcanza el estado estacionario depende de la VCO aplicada. En la Figura 4.8 se muestran las concentraciones de oxígeno en el estado estacionario para distintas condiciones de operación, empleando ácido acético. 0 2 4 6 8 10 12 0,133 0,2 0,3 50 25 15 VCO H 2 O 2 (g/L·h) (µmol/L·min) Oxígeno disuelto (mg/L) 0 20 40 60 80 100 120 TRH (min) Decoloración (%) 45 30 20 Figura 4.8. Concentración de oxígeno disuelto (barras) y decoloración (•) en estado estacionario en experimentos llevados a cabo en las siguientes condiciones: (a) velocidad de dosificación de H2O2: 25 µmol/L·min; (b) TRH de 45 min La Figura 4.8a muestra que el oxígeno disuelto en estado estacionario disminuyó a medida que se disminuyó el TRH, hasta valores por debajo de saturación con un TRH de 20 min. El valor de oxígeno disuelto en estado estacionario es el resultado del balance entre el oxígeno consumido en la degradación del tinte y el producido como consecuencia de la actividad enzimática. Este balance da lugar a valores más bajos de oxígeno al aumentar el consumo, es decir, a mayores valores de la VCO. (a) (b) Degradación en reactor enzimático de membrana 115 Por otra parte, un aumento en la velocidad de adición de H2O2 provoca el aumento de la concentración de oxígeno (Figura 4.8b). Así, una dosificación de 50 µmol/L·min ocasionó un exceso de oxígeno comparado con el nivel de saturación, mientras que una dosificación de 15 µmol/L·min mantuvo la concentración de oxígeno entorno a 8 mg/L. Una alta concentración de H2O2 favorece su reacción con el Mn3+ generado enzimáticamente, de manera que se libera una mayor cantidad de oxígeno (Martínez et al., 1996). Esto significa que un valor elevado de oxígeno disuelto indica un exceso de la concentración de H2O2 con respecto a la estequiométricamente necesaria para la reacción enzimática. Las Tablas 4.5, 4.7, 4.8 y 4.9 indican la relación molar de H2O2 y Orange II en cada uno de los ensayos. Para un TRH de 45 min y una dosificación de 15 µmol/L·min de H2O2, cuando se alcanzan 8 mg/L de oxígeno disuelto en el estado estacionario, resulta una relación de 2,4 mol/mol. Un valor superior resulta estequiométricamente excesivo provocando una desactivación innecesaria de la enzima. 3.4. Dinámica del proceso en continuo El estudio del comportamiento dinámico del reactor enzimático se llevó a cabo por medio de operaciones en continuo de larga duración, en que el objetivo no fue únicamente observar los parámetros obtenidos en estado estacionario, sino mantener dicho estado y comprobar la respuesta del sistema a diferentes cambios en las condiciones de operación, y por lo tanto, evaluar la estabilidad del proceso de decoloración. Ensayo continuo con variación de la VCO La optimización de las condiciones de operación del sistema permitió mejorar su eficacia minimizando la pérdida de actividad enzimática y maximizando la capacidad de degradación de tinte. La degradación de tinte se puede incrementar al aumentar la VCO en el sistema, que depende tanto del TRH como de la concentración de Orange II en la alimentación. Para estudiar cómo afecta este último factor a la eficacia del sistema, se llevó a cabo un ensayo de 18 días de duración en que se partió de las condiciones de operación establecidas en los ensayos previos, descritas en la Tabla 4.10, incrementándose secuencialmente la VCO de 0,1 a 0,3 g/L·h. Se determinó regularmente la concentración de oxígeno disuelto, el carbono orgánico total (COT), el nitrógeno total Kjeldahl Capítulo 4 116 (NTK) y las concentraciones de Orange II en el reactor y en la corriente de salida, tanto por espectrofotometría como por HPLC, para poder diferenciar entre Orange II y otros compuestos que podrían formar parte del efluente y absorber a la misma longitud de onda que el tinte. Tabla 4.10. Condiciones de los ensayos de decoloración Volumen TRH MnP Dosificación H2O2 Caudal alimentación 250 mL 60 min 200 U/L 15 µmol/L·min 4,17 mL/min Alimentación Orange II MnSO4 Ácido oxálico 100 mg/L 33 µM 1 mM Se mantuvieron las condiciones en estado estacionario durante los 8 primeros días (Figura 4.9). A partir de ese momento la concentración de Orange II en el influente se fue aumentando de manera paulatina, y tras cada cambio, la concentración a la salida del reactor se estabilizó en un corto período de tiempo, menor que 3 veces el TRH, de manera que el sistema rápidamente recuperó el estado estacionario (Figura 4.9a). A medida que la VCO aumentó desde 0,1 a 0,3 g/L·h, el porcentaje de decoloración del sistema disminuyó de 95,9 a 89,3% (Tabla 4.11), aunque la capacidad de degradación de tinte aumentó considerablemente, lo que debería producir un aumento de la eficacia del sistema. Sin embargo, la estabilidad de la enzima se vio afectada a esta alta carga de tinte, bien sea por un efecto inhibitorio del propio substrato o de los productos formados en la degradación, de manera que la eficacia del sistema disminuyó de 42,5 mg/U para la VCO de 0,23 g/L·h hasta 26,7 mg/U para la VCO de 0,29 g/L·h. Considerando que una concentración de 300 mg/L de Orange II en el influente (a VCO de 0,3 g/L·h) resulta poco frecuente a nivel real, se considera que una VCO entorno a 0,25 g/L·h resulta la más adecuada, pues permite un porcentaje de decoloración elevado, de 92,9%, y una eficacia de 42,5 mg/U, que es un valor 16 veces superior al obtenido en los primeros ensayos de degradación de Orange II en continuo en el reactor enzimático de membrana. Degradación en reactor enzimático de membrana 117 0 30 60 90 120 150 180 210 240 270 300 330 0 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14 15 16 17 18 19 Tiempo (d) Actividad (U/L) Orange II influente (mg/L) 0 10 20 30 40 50 60 70 80 90 100 110 Orange II efluente (mg/L) 0 30 60 90 120 150 180 210 240 270 300 0 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14 15 16 17 18 19 Tiempo (d) Orange II influente (mg/L) Orange II reactor (mg/L) 0 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 Concentración O 2 (mg/L) Figura 4.9. Ensayo de decoloración con incrementos sucesivos de la VCO. (a): (∆) actividad enzimática; (-) Orange II en el influente; ({) Orange II en el efluente (espectrofotometría); (•) Orange II en el efluente (HPLC); (b): (---) Orange II en el influente; ({) Orange II en el reactor (espectrofotometría); (•) Orange II en el reactor (HPLC); (-) oxígeno disuelto La concentración de oxígeno disuelto en el reactor experimentó un descenso paralelo al aumento de la VCO en el sistema (Figura 4.9b), hasta valores de unos 7 mg/L. La mayor capacidad de degradación se obtuvo a la máxima VCO, aplicando una relación de 1 mol H2O2 por mol de Orange II (Tabla 4.11). Esta relación resulta suficiente para la degradación del tinte, ya que cada mol de H2O2 en el ciclo catalítico de la enzima intercambia 2 e-, que son los que libera 1 mol de (a) (b) Capítulo 4 118 Orange II en su mecanismo de degradación (Goszczynski et al., 1994; Spadaro & Renganathan, 1994; Chivukula et al., 1995). Tabla 4.11. Datos comparativos de las distintas etapas de un proceso en continuo con variación de la VCO. Las concentraciones de Orange II fueron determinadas por HPLC Períodos (d) VCO (g/L·h) Degradación (g/L·h) Decoloración (%) Eficacia (mg/U) H2O2/OII (mol/mol) 0-8 9-10 11-12 13-14 15-16 17-18 0,103 0,130 0,192 0,229 0,291 0,103 0,098 0,123 0,183 0,212 0,260 0,102 95,9 95,0 95,2 92,9 89,3 98,8 19,8 24,7 36,6 42,5 26,7 20,4 3,0 2,2 1,5 1,3 1,0 3,0 El color en el reactor se incrementó a medida que se aumentó la VCO (Figura 4.9b). Cuando se recuperó la VCO de 0,1 g/L·h, el color se mantuvo por encima del valor inicial. Sin embargo, la concentración de Orange II medida por HPLC mantuvo una tendencia similar en el reactor y en el efluente. El incremento de color en el reactor pudo deberse a la coloración natural de las proteínas y demás compuestos del crudo enzimático, con tamaño superior al tamaño de corte de la membrana, que quedaron retenidos en el reactor, y se acumularon como consecuencia de la adición continua de enzima. Se analizó el COT y el NTK en el interior del reactor y en la corriente de salida durante 16 d (Figura 4.10), y se observó que el efluente mantuvo niveles muy bajos, mientras que la concentración en el interior del reactor fue creciente. Otra posible causa del color en el reactor pudo ser la formación de un precipitado de Mn. El Mn3+ generado en el ciclo catalítico de la enzima es inestable en disolución acuosa en ausencia de compuestos complejantes, dismutándose en Mn2+ y Mn4+, que precipita como MnO2. Este precipitado tiene un color parduzco, similar al obtenido en el reactor tras varios días de operación. Se realizaron análisis de la concentración de Mn soluble en las corrientes de entrada y salida del reactor, así como en el medio de reacción, tras haber filtrado las muestras. Se obtuvo que las concentraciones medias en el influente y efluente fueron 34 y 30 µM respectivamente, mientras que en el medio fue de 161 µM tras Degradación en reactor enzimático de membrana 119 8 d de reacción. Estos datos parecen indicar que se produce una cierta acumulación de Mn en el interior del reactor. 0 250 500 750 1000 1250 1500 1750 2000 2250 2500 0 1 2 3 4 5 6 7 8 9 101112131415161718 Tiempo (d) COT (mg/L) 0 12 24 36 48 60 72 84 96 108 120 NTK (mg/L) Figura 4.10. Ensayo de decoloración con incrementos sucesivos de la VCO: ({) COT; (∆) NTK; símbolos abiertos: concentraciones en el efluente; símbolos cerrados: concentraciones en el reactor A pesar del color parduzco en el medio, el sistema se mantuvo estable durante los 18 d de operación, sin necesidad de limpiar la membrana. La implementación de este proceso a mayor escala implicaría la necesidad de trabajar con varias membranas, de manera que se procediese a la limpieza de una mientras la otra estuviese en operación. Ensayo continuo con variación de la adición de H2O2 Se realizó un nuevo ensayo de 6 d de duración en el que se estudió la relación entre la adición de H2O2 y Orange II. Para ello se consideraron las condiciones de partida descritas en la Tabla 4.10; al cabo de 1 d se aumentó la VCO a 0,26 g/L·h y con estas condiciones se aumentó paulatinamente la velocidad de dosificación de H2O2. Capítulo 4 120 Tabla 4.12. Datos comparativos de las distintas etapas de un proceso en continuo con variación de H2O2. Las concentraciones de Orange II fueron determinadas por HPLC Períodos (d) VCO (g/L·h) H2O2 ( µ mol/L·min) Decoloración (%) Eficacia (mg/U) H2O2/OII (mol/mol) 0-1 1-2 2-3 3-4 4-6 0,093 0,260 0,260 0,260 0,260 15 15 19,5 22,5 19,5 98,4 91,4 93,7 97,7 91,7 18,3 40,9 27,2 22,2 29,5 3,4 1,0 1,4 1,6 1,4 Una relación equimolar entre H2O2 y Orange II dio lugar a una buena decoloración y una alta eficacia, de 41 mg/U (Tabla 4.12). A medida que se aumentó la adición de H2O2, la velocidad de decoloración aumentó, pero también la pérdida de actividad enzimática, con lo que el resultado global fue una disminución de la eficacia del sistema. Este ensayo corroboró la conclusión de que una relación 1:1 entre H2O2 y Orange II es la más adecuada para realizar la degradación del tinte en un reactor enzimático en continuo. 3.5. Operación en estado no estacionario El estudio del comportamiento del reactor en estado no estacionario aporta información sobre la estabilidad del sistema, pues indica cómo reacciona este ante una sobrecarga similar a la que podría tener lugar en un proceso real y muestra la capacidad del sistema para recuperar el estado estacionario. Se realizó un ensayo de 9 d de duración en un fermentador BIOSTAT Q (Figura 4.11) con 500 mL de medio de reacción, en el que se aplicaron las condiciones de partida descritas en la Tabla 4.13. Cada 24 h se modificaron algunos parámetros de operación tales como VCO, TRH y la velocidad de adición de H2O2, durante períodos de 1 h, de forma que se multiplicaron los valores usuales por factores de 0,5 y 2, y la temperatura varió desde la ambiente (22ºC) hasta 20ºC y 30ºC. Se realizó el seguimiento del oxígeno disuelto, pH y concentración de Orange II en el reactor y el efluente, mediante medidas espectrofotométricas y HPLC. Degradación en reactor enzimático de membrana 121 Figura 4.11. Equipo para la decoloración de Orange II en un fermentador BIOSTAT Q asociado a una membrana de ultrafiltración Tabla 4.13. Condiciones del ensayo de decoloración con sobrecargas Volumen TRH MnP Dosificación H2O2 Caudal alimentación 500 mL 60 min 200 U/L 15 µmol/L·min 8,33 mL/min Alimentación Orange II MnSO4 Ácido oxálico 100 mg/L 33 µM 1 mM Capítulo 4 122 Tras alcanzar el estado estacionario, se alimentó el reactor durante 1 h con una disolución de tinte de 200 mg/L, de manera que la VCO se duplicó (Sobrecarga 1 en Figura 4.12). Se observó un aumento de la concentración de Orange II en el efluente y una disminución de la concentración de oxígeno disuelto, debido al mayor consumo causado por la mayor carga de Orange II. Las respuestas de las variaciones de TRH siguieron los mismos perfiles (Sobrecargas 2 y 9 en Figura 4.12). En conclusión, una disminución del TRH, es decir, un aumento de VCO, da lugar a una menor decoloración y menor concentración de oxígeno disuelto; por el contrario, un aumento del TRH, es decir, una disminución de la VCO, da lugar a un pequeño aumento de la decoloración y de la concentración de oxígeno disuelto. Las perturbaciones en la velocidad de adición de H2O2 ocasionaron las variaciones más altas en la concentración de oxígeno disuelto, por lo tanto este es el parámetro que más influye en el balance entre el oxígeno producido y el consumido (Sobrecargas 3, 4 y 8 en Figura 4.12). Un incremento en la dosificación de H2O2 (Sobrecarga 4) no mejora la decoloración, ya que una relación equimolar H2O2/Orange II es suficiente para alcanzar una buena decoloración. Sin embargo, a partir del día 6 la VCO se duplicó, de manera que la relación H2O2/Orange II disminuyó a 0,5. Al realizar la sobrecarga 8 la relación tomó el valor de 1 y la decoloración mejoró. Se corrobora, por tanto, que una relación equimolar es la más adecuada para realizar la degradación de Orange II. Las variaciones de temperatura, en un rango de 10ºC (Sobrecargas 5, 6, 7 y 10 en Figura 4.12), apenas afectaron a la decoloración, y causaron ligeras variaciones en la concentración de oxígeno disuelto, que fueron debidas al propio efecto de la temperatura sobre la solubilidad del oxígeno. Durante los períodos de sobrecarga los parámetros medidos sufrieron modificaciones, aunque después de cada perturbación el sistema se recuperó rápidamente alcanzando de nuevo el estado estacionario. Estos parámetros son fácilmente medibles on line, de manera que se puede establecer un sistema de control con el fin de evitar tales perturbaciones y mantener las condiciones de estado estacionario en el reactor. Degradación en reactor enzimático de membrana 123 0 30 60 90 120 150 180 210 240 270 300 330 012345678910 Tiempo (d) Actividad (U/L) Orange II influente (mg/L) 0 10 20 30 40 50 60 70 80 90 100 110 Orange II efluente (mg/L) 0 30 60 90 120 150 180 210 240 270 300 012345678910 Tiempo (d) Orange II influente (mg/L) Orange II reactor (mg/L) 6,0 6,4 6,8 7,2 7,6 8,0 8,4 8,8 9,2 9,6 10,0 Concentración O 2 (mg/L) Figura 4.12. Ensayo de decoloración con sobrecargas. (a): (∆) actividad enzimática; (-) Orange II en el influente; ({) Orange II en el efluente; (b): (---) Orange II en el influente; ({) Orange II en el reactor; (-) oxígeno disuelto. Modificaciones: (1) Orange II 200 mg/L; (2) TRH 30 min; (3) H2O2 7,5 µmol/L·min; (4) H2O2 30 µmol/L·min; (5) T 20ºC; (6) T 30ºC; (7) T 20ºC; (8) H2O2 30 µmol/L·min; (9) TRH 90 min; (10) T 30ºC 3.6. Modelización Con el objetivo de obtener una ecuación de diseño que permita simular los datos experimentales y optimizar los resultados, se formuló un modelo para la decoloración enzimática de Orange II en el reactor de membrana. Para obtener las ecuaciones matemáticas que describieron ese modelo se asumieron una serie de consideraciones: i) el contenido del reactor está perfectamente mezclado y se (a) (b) 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 Capítulo 4 130 laccase: application in the defouling of polysulphone membranes. Desalination 149, 275278. Flock, C., Bassi, A. and Gijzen, M. (1999) Removal of aqueous phenol and 2chlorophenol with purified soybean peroxidase and raw soybean hylls. Journal of Chemical Technology and Biotechnology 74, 303-309. Gallifuoco, A., Alfani, F., Cantarella, M. and Viparelli, P. (2001) Studying enzymecatalyzed depolymerization in continuous reactors. Industrial Engineering and Chemical Research 40, 5184-5190. Giorno, L. and Drioli, E. (2000) Biocatalytic membrane reactors: applications and perspectives. Trends in Biotechnology 18(8), 339-349. Gómez-Toribio, V., Martínez, A. T., Martínez, M. J. and Guillén, F. (2001) Oxidation of hydroquinones by the versatile ligninolytic peroxidase from Pleurotus eryngii. European Journal of Biochemistry 268, 4787-4793. Goszczynski, S., Paszczynski, A., Pasti-Grigsby, M. B., Crawford, R. L. and Crawford, D. L. (1994) New pathway for degradation of sulfonated azo dyes by microbial peroxidases of Phanerochaete chrysosporium and Streptomyces chromofuscus. Journal of Bacteriology 176, 1339-1347. Hildebrandt, J. R. (1991) Membranes for bioprocessing: Design considerations. In: Chromatographic and Membrane Processes in Biotechnology. Costa, C. A. and Cabral, J. S. The Netherlands, Kluwer Academic Publishers: 363-378. Hong, J., Tsao, G. T. and Wankat, P. C. (1981) Membrane reactor for enzymatic hydrolysis of cellobiose. Biotechnology and Bioengineering 23, 1501-1516. Iwan, P., Goetz, G., Schmitz, S., Hauer, B., Breuer, M. and Pohl, M. (2001) Studies on the continuous production of (R)-(-)-phenylacetylcarbinol in an enzyme-membrane reactor. Journal of Molecular Catalysis B: Enzymatic 11(4-6), 387-396. Kulbe, K. D., Schmidt, H., Schmidt, K. and Scholze, H. A. (1992) Continuous synthesis of xylitol by NAD(P)H-linked aldose reductase in a charged ultrafiltration membraneenzyme reactor. Progress in Biotechnology 7, 565-572. Kuo, C. H., Chen, C. C. and Chiang, B. H. (2004) Process characteristics of hydrolysis of chitosan in a continuous enzymatic membrane reactor. Journal of Food Science 69(7), E332-E337. López, C., Mielgo, I., Moreira, M. T., Feijoo, G. and Lema, J. M. (2002) Enzymatic membrane reactors for biodegradation of recalcitrant compounds. Application to dye decolourisation. Journal of Biotechnology 99(3), 249-257. López, C., Valade, A. G., Combourieu, B., Mielgo, I., Bouchon, B. and Lema, J. M. (2004) Mechanism of enzymatic degradation of the azo dye Orange II determined by ex situ 1H nuclear magnetic resonance and electrospray ionization-ion trap mass spectrometry. Analytical Biochemistry 335, 135-149. Martin-Orue, C., Henry, G. and Bouhallab, S. (1999) Tryptic hydrolysis of Kcaseinomacropeptide: Control of the enzymatic reaction in a continuous membrane reactor. Enzyme and Microbial Technology 24, 173-180. Degradación en reactor enzimático de membrana 131 Martínez, M. J., Böckle, B., Camarero, S., Guillén, F. and Martínez, A. T. (1996) MnP isoenzymes produced by two Pleurotus species in liquid culture and during wheat-straw solid-state fermentation. 211th ACS National Meeting, New Orleans, LA. Mielgo, I., López, C., Moreira, M. T., Feijoo, G. and Lema, J. M. (2003) Oxidative degradation of azo dyes by manganese peroxidase under optimized conditions. Biotechnology Progress 19(2), 325-331. Mountzouris, K. C., Gilmour, S. G. and Rastall, R. A. (2002) Continuous production of oligodextrans via controlled hydrolysis of dextran in an enzyme membrane reactor. Journal of Food Science 67(5), 1767-1771. Nakajima, N., Shoji, T. and Nabetani, H. (1992) Protease hydrolysis of water soluble fish proteins using a free enzyme membrane reactor. Process in Biochemistry 27, 155-160. Olano-Martin, E., Mountzouris, K. C., Gibson, G. R. and Rastall, R. A. (2001) Continuous production of pectic oligosaccharides in an enzyme membrane reactor. Journal of Food Science 66(7), 966-971. Pasta, P., Carrea, G., Monzani, E., Gaggero, N. and Colonna, S. (1999) Chloroperoxidasecatalyzed enantioselective oxidation of methyl phenyl sulfide with dihydroxyfumaric acid/oxygen or ascorbic acid/oxygen as oxidants. Biotechnology and Bioengineering 62(4), 489-493. Pérez, J. and Jeffries, T. W. (1992) Roles of manganese and organic acid chelators in regulating lignin degradation and biosynthesis of peroxidases by Phanerochaete chrysosporium. Applied and Environmental Microbiology 58, 2402-2409. Prazeres, D. M. F. and Cabral, J. M. S. (1994) Enzymatic membrane bioreactors and their applications. Enzyme and Microbial Technology 16, 738-750. Prazeres, D. M. F. and Cabral, J. M. S. (2001) Enzymatic membrane reactors. In: Multiphase bioreactor design. Cabral, J. M. S., Mota, M. and Tramper, J. London, Taylor&Francis. 16: 135-180. Ríos, G. M., Belleville, M. P., Paolucci, D. and Sánchez, J. (2004) Progress in enzymatic membrane reactors - a review. Journal of Membrane Science 242, 189-196. Rodríguez-Nogales, J. M., Ortega, N., Pérez-Mateos, M. and Busto, M. D. (2005) Operational stability and kinetic study of a membrane reactor with pectinases from Aspergillus niger. Journal of Food Science 70(2), E104-E108. Satory, M., Fürlinger, M., Haltrich, D., Kulbe, K. D., Pittner, F. and Nidetzky, B. (1997) Continuous enzymatic production of lactobionic acid using glucose-fructose oxidoreductase in an ultrafiltration membrane reactor. Biotechnology Letters 19(12), 1205-1208. Sehanputri, P. S. and Hill, C. G. (2000) Biotechnology for the production of nutraceuticals enriched in conjugated linoleic acid: II. Multiresponse kinetics of the hydrolysis of corn oil by a Pseudomonas sp. lipase immobilized in a hollow-fiber reactor. Biotechnology and Bioengineering 69(4), 450-456. Slominska, L., Grajek, W., Grzeskowiak, A. and Gocalek, M. (1998) Enzymatic starch saccharification in an ultrafiltration membrane reactor. Starch 50(9), 390-396. Capítulo 4 132 Spadaro, J. T. and Renganathan, V. (1994) Peroxidase-catalyzed oxidation of azo dyes: mechanism of Disperse Yellow 3 degradation. Archives of Biochemistry and Biophysics 312(1), 301-307. Timofeevski, S. L., Reading, N. S. and Aust, S. D. (1998) Mechanisms for protection against inactivation of manganese peroxidase by hydrogen peroxide. Archives of Biochemistry and Biophysics 356(2), 287-295. Wariishi, H., Akaleswaran, L. and Gold, M. H. (1988) Manganese peroxidase from the basidiomycete Phanerochaete chrysosporium: spectral characterization of oxidized states and the catalytic cycle. Biochemistry 27, 5365-5370. Wichmann, R., Wandrey, C., Buckmann, A. F. and Kula, M. R. (2000) Continuous enzymatic transformation in an enzyme membrane reactor with simultaneous NAD(H) regeneration. Biotechnology and Bioengineering 67(6), 791-804. Inmovilización de MnP 133 Capítulo 5 Inmovilización de MnP Resumen En este capítulo se realiza el estudio de diferentes técnicas de inmovilización enzimática de MnP para su posterior aplicación en la degradación en continuo de Orange II. Se estudiaron soportes basados en interacciones iónicas y en enlaces covalentes, y se analizaron diversos factores: capacidad de retención de enzima, pérdida de actividad enzimática durante el proceso de inmovilización, estabilidad de la enzima inmovilizada, interacción entre el soporte y el tinte Orange II, facilidad del proceso de activación del soporte y coste. Se seleccionó como más adecuado para la inmovilización de MnP un soporte de agarosa-glutaraldehido, en que se produce una unión covalente entre los grupos aldehido del soporte y los grupos amino de la superficie de la enzima. El proceso de activación de este soporte es relativamente sencillo, la retención enzimática es del 100% y la estabilidad térmica es buena; como contrapartida, la pérdida de actividad durante el proceso de inmovilización es de un 50%, la interacción entre el soporte y el tinte es muy elevada y el soporte no es recuperable. Capítulo 5 134 Índice 1. Introducción 2. Materiales y métodos 2.1. Compuestos químicos 2.2. Preparación del crudo enzimático 2.3. Activación de los soportes e inmovilización 2.4. Estudios de estabilidad 2.5. Determinación de conductividades 2.6. Estudios de adsorción de Orange II sobre los derivados 2.7. Técnicas analíticas 3. Resultados y discusión 3.1. Estudios de estabilidad 3.2. Inmovilización de MnP sobre distintos tipos de soportes 3.3. Estabilidad de los derivados frente a la temperatura 3.4. Comparación de conductividades 3.5. Adsorción de Orange II sobre el soporte 4. Conclusiones 5. Referencias 135 144 144 145 145 150 151 151 151 152 152 154 157 158 159 160 162 Inmovilización de MnP 135 1. Introducción Las enzimas han sido ampliamente utilizadas en procesos industriales por su elevada eficacia catalítica, su alto grado de especificidad y su capacidad para trabajar en condiciones suaves de temperatura, presión y pH (Krajewska, 2004). Sin embargo, su aplicación industrial se ha visto generalmente limitada por una serie de factores, tales como su disponibilidad en pequeñas cantidades, sus altos costes y su frecuente inestabilidad en las condiciones de reacción deseadas (van de Velde et al., 2002). Algunas de estas desventajas del uso de enzimas se pueden evitar mediante la inmovilización, proceso mediante el cual se confina a la enzima en una región definida del espacio, de manera que se pueda usar repetida y continuamente (Katchalski-Katzir & Kraemer, 2000). Las ventajas y desventajas de la inmovilización enzimática se presentan en la Tabla 5.1 (van de Velde et al., 2002; Bornscheuer, 2003). Tabla 5.1. Ventajas y desventajas de la inmovilización enzimática Ventajas Fácil separación y recuperación de enzima y productos Reutilización Aumento de la estabilidad térmica y resistencia contra agentes desnaturalizantes Robustez Fácil detención de las reacciones Facilidad de operación en continuo Flexibilidad de diseño de biorreactores Prevención de la contaminación de proteína en el producto Prevención más simple de la contaminación microbiana Desventajas Disminución de la actividad enzimática en el proceso de inmovilización Aumento de la constante de Michaelis-Menten Limitaciones de transferencia de materia Coste extra Aumento del volumen de catalizador Búsqueda de un método adecuado de inmovilización Capítulo 5 136 Los primeros trabajos de inmovilización enzimática se realizaron en 1960 (Bar-Eli & Katchalski, 1960), y desde entonces se han estudiado numerosos métodos de inmovilización sobre una variedad de soportes. Las características que debe tener un soporte para ser la base del proceso de inmovilización enzimática se muestran en la Tabla 5.2 (Krajewska, 2004). Tabla 5.2. Requisitos de un soporte para inmovilización enzimática Alta afinidad por proteínas Disponibilidad de grupos funcionales reactivos Hidrofilicidad Estabilidad mecánica y rigidez Regenerabilidad No toxicidad y biocompatibilidad Biodegradabilidad Coste reducido La selección del soporte y método adecuados para la inmovilización de una determinada enzima y para una aplicación concreta se realiza mediante ensayoerror. Se deben tener en cuenta una serie de consideraciones económicas, prácticas y técnicas: i) El proceso de activación del soporte para promover la unión con la enzima debe ser sencillo ii) El proceso de inmovilización debe realizarse en condiciones suaves, que no provoquen la desactivación de la enzima iii) La inmovilización debe dar como resultado una alta retención enzimática iv) La estabilidad del derivado frente a temperatura, pH y resistencia mecánica debe ser elevada v) Los procesos de activación del soporte e inmovilización deben tener bajo coste vi) En aplicaciones concretas como la de degradación de tintes, el soporte no debería tener interacción con el tinte Según el tipo de enlace entre la enzima y el soporte, los métodos de inmovilización enzimática se pueden clasificar en métodos físicos o químicos. Los métodos físicos proporcionan una unión débil entre la enzima y el soporte, de manera que apenas se modifica la estructura nativa de ambos; debido a eso, la estabilidad de la enzima rara vez aumenta. Como contrapartida, la unión se puede romper dando lugar a una recuperación del soporte (Durán et al., 2002). Los Inmovilización de MnP 137 métodos químicos generan enlaces entre enzima y soporte, produciendo uniones más fuertes. En función de los grupos que entren a formar parte de esta unión y de la conformación de la proteína tras la inmovilización, la estabilidad de la misma puede incrementarse, pues el centro activo de la enzima puede verse protegido de procesos intermoleculares (agregación, proteólisis) o de interacciones con factores externos (aire, disolventes orgánicos inmiscibles) que pueden tener efecto negativo sobre la estabilidad (Mateo et al., 2000a). Sin embargo, en numerosas ocasiones la inmovilización no afecta, o incluso afecta negativamente, a la estabilidad de la enzima (Gianfreda & Scarfi, 1991). Por otra parte, las uniones covalentes son más difíciles de romper, de manera que la reversibilidad del proceso es más compleja y los soportes no son recuperables. Los principales métodos físicos y químicos se esquematizan en la Figura 5.1 (van de Velde et al., 2002). Métodos físicos i) Interacción iónica: Los grupos cargados de la enzima interaccionan con los grupos del soporte de carga opuesta. La estabilidad del preparado es sensible a cambios en pH y fuerza iónica, por lo tanto el soporte es fácil de regenerar. ii) Atrapamiento: Se trata de un método de inmovilización mediante el cual se genera una matriz (gel, membrana…) donde las enzimas quedan retenidas. No se produce enlace o modificación de la estructura de la enzima, por lo tanto el atrapamiento es un método de inmovilización suave. Su principal desventaja es la dificultad para conseguir un tamaño de poro adecuado, pues si el poro es grande hay pérdida de proteína a su través, pero si es pequeño existen problemas de difusión de substratos y productos. iii) Encapsulación: Se lleva a cabo mediante membranas poliméricas, que se crean alrededor de las enzimas de manera que estas quedan retenidas en cápsulas. Su aplicación tiene las mismas limitaciones que el atrapamiento. Métodos químicos i) Enlace covalente: El enlace se produce por reacción entre los grupos reactivos de la superficie de la proteína y del soporte. A menudo es necesaria una activación previa del soporte con grupos adecuados para su unión a la enzima. Las uniones pueden ser uni o multipuntuales: estas son más fuertes pero pueden producir cambios estructurales ocasionando caída de actividad. Capítulo 5 138 Métodos físicos Métodos químicos Interacción iónica Atrapamiento Encapsulación Enlace covalente Entrecruzamiento Figura 5.1. Métodos de inmovilización enzimática Enzima Enzima Enzima Enzima Enzima Enzima Enzima Enzima Enzima Enzima Enzima NH+ NH2+ O OH NH2+ NH+ O OH Enzima Enzima NH 3 + NH 3 + NH 2 + NH 2 + NH2+ NH 2 + NH 2 + NH 2 + NH 2 NH2 NH 2 NH 3 + Enzima Inmovilización de MnP 139 ii) Entrecruzamiento: Esta técnica implica la unión entre moléculas de enzima por medio de enlaces covalentes, empleando compuestos biy multifuncionales como mediadores de dichos enlaces. Al no ser necesario el uso de un soporte, este método puede resultar más económico y no genera residuos, aunque es de difícil control. En la Tabla 5.3 se describen algunos de los métodos empleados para la inmovilización de una gran variedad de enzimas, así como su campo de aplicación. Actualmente son varios los trabajos en que se emplean enzimas inmovilizadas para la eliminación de compuestos recalcitrantes, entre ellos, tintes y efluentes de la industria papelera. Los primeros trabajos acerca del estudio de técnicas de inmovilización de MnP son del año 1995. Grabski et al. (1995) llevaron a cabo una inmovilización covalente entre los grupos carboxilo de la enzima y los grupos amino del soporte polimérico EmphazeTM, obteniendo eficacias de unión de 40-50%. PeraltaZamora et al. (1998) aplicaron un método de intercambio iónico para inmovilizar MnP y LiP en la resina Amberlita IRA-400, obteniendo una retención casi total de la actividad enzimática al cabo de 30 min. Van Aken et al. (2000) coinmovilizaron MnP y glucosa oxidasa mediante un enlace covalente en soporte de sílice, utilizando glutaraldehido como compuesto de unión. Se produjo una pérdida de actividad enzimática del 40% en el proceso de inmovilización, pero aumentó la estabilidad frente a H2O2 y pH. Sasaki et al. (2001) estudiaron la retención de la enzima MnP por adsorción sobre un soporte FSM-16 con diferentes tamaños de poro. En dicho proceso se consiguió una alta estabilidad enzimática cuando el diámetro del poro era aproximadamente igual al tamaño de la enzima. Por último, Mielgo et al. (2003) estudiaron la inmovilización de MnP por enlace covalente con un soporte de agarosa activado con moléculas de glutaraldehido, en el que la unión tiene lugar entre los grupos aldehido del soporte y los grupos amino o amino terminal de la enzima, grupos muy reactivos que se encuentran usualmente en la superficie de la enzima y no suelen formar parte del sitio activo. En este trabajo se encontró que una unión multipuntual realizada a baja fuerza iónica permitió alcanzar un 100% de retención e incrementar la estabilidad de la enzima. En este capítulo se pretende realizar un estudio de diferentes métodos de inmovilización de MnP y analizar el más conveniente de cara a su aplicación en el proceso de degradación en continuo de Orange II. Capítulo 8 242 mayor aportación a estos valores fue realizada por los AGV adicionados, que actúan como substrato de la degradación. Las altas eliminaciones de DQO y COT, entorno al 90% (Figura 8.8), fueron debidas al consumo de substrato realizado por la biomasa anaerobia. Por este motivo se hace difícil determinar cuál fue el consumo de DQO y COT relativos al efluente enzimático en función de estos valores. 0 10 20 30 40 50 60 70 80 90 100 0246810121416 Tiempo (d) Eliminación de DQO, COT y color (%) Figura 8.8. Eliminación de () DQO, (□) COT y ({) color durante la operación en el reactor anaerobio continuo La eliminación de color fue baja, sobre un 20-30%, como se observaba en los ensayos de biodegradabilidad anaerobia. La pérdida de color fue debida a la degradación de Orange II, que se encuentra en pequeñas cantidades en el efluente enzimático, mientras que otros componentes coloreados del mismo no se degradaron por vía anaerobia. La comparación entre los espectros de absorbancia del influente y el efluente del reactor refleja un ligero descenso del color a la longitud de onda de máxima absorbancia, así como un desplazamiento del perfil de absorbancias a la salida en relación con la entrada (Figura 8.9). Dicho desplazamiento podría ser debido a la degradación de unos productos y la generación de otros que absorben a longitudes de onda menores. La composición de las corrientes de entrada y salida se analizó mediante HPLC (Figura 8.10). Se observó la desaparición de Orange II presente en el influente (tr=7,1 min); sin embargo, el compuesto 4-hidroxibencenosulfonato (tr=2,2 min) no fue degradado, tal como sucedía en los ensayos de Postratamiento bacteriano 243 biodegradabilidad. Los cromatogramas de HPLC muestran la disminución de algunos otros compuestos presentes en el efluente enzimático. 0 1 2 3 4 5 6 200 300 400 500 600 700 800 Longitud de onda (nm) Absorbancia Figura 8.9. Comparación de los espectros de absorbancia de influente (línea gruesa) y efluente (línea fina) del tratamiento en un reactor anaerobio continuo Figura 8.10. Composición de las muestras de (a) influente y (b) efluente del reactor anaerobio continuo. Tiempos de retención: 4-hidroxibencenosulfonato: 2,2 min; Orange II: 7,1 min min 1 2 3 4 5 6 7 8 9 mAU 0 50 100 150 200 1.772 1.869 2.191 2.410 3.258 4.246 5.135 7.105 min 1 2 3 4 5 6 7 8 9 mAU 0 50 100 150 200 1.784 2.182 2.474 3.289 4.580 (b) (a) Capítulo 8 244 El tratamiento anaerobio aumentó la toxicidad de las muestras (Tabla 8.11), aunque los valores de EC50 alcanzados tanto para el influente como para el efluente son muy superiores a la concentración de 3000 ppm, por debajo de la cual una muestra se considera tóxica. Tabla 8.11. Toxicidad del influente y efluente del postratamiento anaerobio en continuo Muestra EC50 (ppm) Toxicidad Influente reactor anaerobio Efluente reactor anaerobio 3,5·105 2,5·105 No tóxico No tóxico El aumento de toxicidad puede deberse a la generación de aminas aromáticas tras el tratamiento anaerobio del tinte residual (van der Zee & Villaverde, 2005), pero debido a su pequeña concentración, no aportan carácter tóxico al efluente. La eliminación de DQO, COT, color y degradación de varios compuestos que forman parte del efluente enzimático señalan al sistema anaerobio como adecuado para el postratamiento del mismo. 3.3. Tratamiento aerobio Biodegradabilidad aerobia Los ensayos de DBO5 tuvieron dos objetivos principales: i) comprobar si el tinte Orange II y el efluente enzimático resultan tóxicos para la biomasa aerobia; ii) estudiar la biodegradabilidad de las corrientes analizadas, observando el consumo de oxígeno por las bacterias aerobias. En primer lugar se realizaron ensayos de tanteo, para determinar la concentración de sólidos tal que permita obtener unos valores de consumo de oxígeno adecuados al rango marcado por el método Oxitop que se aplicó. Para ello se realizaron ensayos control (sin fuente de carbono), con Orange II y con efluente, por duplicado, a tres concentraciones diferentes de biomasa: 0,002-0,02 y 0,2 g SSV/L. Dado que la DQO del efluente enzimático es de 200 mg/L, se consideró la dilución de las muestras por un factor de 5 (Tabla 8.4), de manera que el agua de dilución contribuyó a la aportación de nutrientes al medio. Se realizaron controles con biomasa inactivada y se comprobó que no se produjo adsorción del tinte sobre el lodo. Postratamiento bacteriano 245 0 10 20 30 40 50 60 01234567 Tiempo (d) DBO (mg/L) 0 10 20 30 40 50 60 01234567 Tiempo (d) DBO (mg/L) Figura 8.11. Ensayos de DBO5 de: (a) Orange II; (b) efluente de degradación enzimática; (∆) 0,002 g SSV/L; (□) 0,02 g SSV/L; ({) 0,2 g SSV/L; símbolos abiertos: control sin fuente de carbono; símbolos cerrados: ensayos con fuente de carbono Tanto en los controles como en presencia de fuentes de carbono, la concentración de sólidos más elevada implicó un consumo de todo el oxígeno del espacio libre de la botella al cabo de 24 h. La concentración más adecuada de biomasa para que los valores de DBO se sitúen en el rango de medida fue un valor intermedio de 0,02 g SSV/L. Con esta concentración de biomasa, en presencia de Orange II se obtuvieron valores de DBO similares a los obtenidos en los controles sin fuente de carbono. Esto es indicativo de que la biodegradabilidad del tinte es prácticamente nula y de que el tinte no resulta tóxico a la biomasa. El (a) (b) Capítulo 8 246 análisis de las muestras por HPLC confirmó que la concentración de Orange II se mantuvo constante a lo largo de todo el ensayo. En presencia de efluente enzimático, se apreció diferencia en cuanto al consumo de oxígeno con respecto al control. Además los análisis de HPLC mostraron la disminución de algunas señales, como la correspondiente a 4-hidroxibencenosulfonato, que desaparece por completo. Esto indica una cierta biodegradabilidad aerobia del efluente enzimático. El ensayo de DBO 5 se repitió en presencia de efluente con una concentración de biomasa intermedia, de 0,065 g SSV/L, y diluyendo un factor de 2, de manera que el volumen total de ensayo fue de 250 mL (Tabla 8.4). Los resultados confirmaron la biodegradabilidad del efluente con respecto al control, pues se observó una clara diferencia entre ambos consumos de oxígeno (20% superior en presencia de efluente tras 7 d de ensayo). La DQO eliminada en el ensayo control fue de 11,8 mg/L, correspondiente a eliminación de biomasa, como único componente que aporta DQO a la muestra (Tabla 8.12). La DQO eliminada en el ensayo con efluente fue de 47,2 mg/L, lo que implica que parte de los componentes del efluente fueron degradados por las bacterias aerobias. Además, la eliminación de un porcentaje de COT implica la mineralización parcial del efluente. Tabla 8.12. Eliminación de DQO, COT y color tras 7 d en los ensayos de biodegradabilidad aerobia DQO COT Color Muestra DQO0 (mg/L) Eliminación (%) COT0 (mg/L) Eliminación (%) Abs461 nm Eliminación (%) Control Efluente 66,6 100 8,8 23,6 20,8 32,6 9 24,7 - 0,385 - 0 Se realizaron análisis de cromatografía para determinar la degradación de los compuestos constituyentes del efluente (Figura 8.12). La concentración del tinte Orange II (tr=7,7 min) permaneció invariable tras 7 d de operación en el sistema aerobio, de manera que el sistema no experimentó decoloración (Tabla 8.12). Sin Postratamiento bacteriano 247 embargo, otros compuestos tales como 4-hidroxibencenosulfonato (tr=2,0 min) fueron degradados en condiciones aerobias. Figura 8.12. Composición de las muestras del ensayo de biodegradabilidad aerobia: (a) tiempo inicial; (b) tras 7 d. Tiempos de retención: 4-hidroxibencenosulfonato: 2,0 min; Orange II: 7,7 min El tratamiento aerobio no contribuye a la decoloración del efluente de degradación enzimática de Orange II; a pesar de ello, permite la degradación de otros compuestos, que no aportan color, pero pueden aportar toxicidad a las muestras. Por lo tanto, se puede considerar el tratamiento aerobio en continuo como una opción de postratamiento bacteriano de Orange II. Reactor aerobio continuo La operación del reactor de lodos activos se mantuvo durante 42 d (Figura 8.13). En función de las condiciones de trabajo, se dividió en 5 etapas (Tabla 8.6): durante las tres primeras, correspondientes a los primeros 25 d, el reactor trabajó sin efluente enzimático, hasta conseguir una operación estable; durante las dos últimas, además de glucosa, se adicionó efluente como fuente de carbono. Durante todo el funcionamiento del reactor, se analizó la concentración de glucosa en el influente y efluente, y se comprobó que el consumo fue del 100%. min 1 2 3456789 mAU 0 20 40 60 80 100 120 140 160 1.796 1.875 2.040 2.203 2.428 3.267 4.551 7.708 (a) min 1 2 3456789 mAU 0 20 40 60 80 100 120 140 160 1.793 1.881 2.042 2.212 2.454 3.265 4.557 7.708 (b) Capítulo 8 248 La temperatura se mantuvo entre 19 y 23ºC, el oxígeno disuelto entre 6 y 8 mg/L y la biomasa se mantuvo entre 1,5 y 2 g SSV/L. Figura 8.13. Reactor de lodos activos para el tratamiento aerobio del efluente de la degradación enzimática de Orange II La operación comenzó con una DQO de entrada de 800 mg/L, aportada principalmente por 750 mg/L de glucosa, y una concentración de bicarbonato de 100 mg/L. El pH durante esta primera etapa se mantuvo por valores incluso inferiores a 6, con lo cual en el día 5 se aumentó la concentración de bicarbonato hasta 1 g/L. Esta segunda etapa estuvo marcada por la flotación de los lodos en el sedimentador, a consecuencia de lo cual se produjeron pérdidas de biomasa por la salida del reactor, lo que dificultó una operación estable en cuanto a concentración de SSV. Una de las causas comunes de flotación de los lodos es la generación de bacterias filamentosas que se producen cuando la relación F/M (alimentación/microorganismos), tiene un valor elevado, superior a 0,6 g DQO/g SSV·d (Ramalho, 1996). La relación F/M en la etapa 2 del arranque del reactor fue de 0,8 g DQO/g SSV·d. Para evitar este problema, este valor se disminuyó a la mitad en una tercera etapa, disminuyendo la concentración de glucosa a la mitad, y en consecuencia las fuentes de N y P. En estas condiciones, se mantuvo una operación estable durante 14 d, con una concentración de biomasa del orden de 1,5 g SSV/L y un pH de 7,5. Postratamiento bacteriano 249 Con el reactor operando en condiciones estables, se comenzó a alimentar el efluente de la degradación enzimática de Orange II, en el que se añadió la concentración de glucosa necesaria para obtener una DQO igual a la de la etapa 3. Para ello, teniendo en cuenta que la DQO del efluente es de 193 mg/L, se redujo la glucosa a la mitad y se mantuvieron las concentraciones de fuentes de N y P. Durante las etapas 4 y 5 las condiciones de la alimentación fueron las indicadas en la Tabla 8.13. Tabla 8.13. Características de la alimentación del reactor aerobio continuo DQO (mg/L) COT (mg/L) Abs455 nm1 pH 360 128 0,612 7-7,2 1 Muestra diluida 2 veces Durante el tratamiento del efluente enzimático, se realizó el seguimiento de pH y oxígeno disuelto en el reactor, que se mantuvieron estables. Solamente durante los últimos días de operación el pH aumentó a 9 y la concentración de biomasa decreció, debido a nuevas pérdidas por flotación de los lodos. Se midió también la concentración de glucosa a la salida del reactor, observándose que toda la glucosa añadida en la alimentación se consumió en el proceso aerobio. 0 10 20 30 40 50 60 70 80 90 25 27 29 31 33 35 37 39 41 Tiempo (d) Eliminación de DQO, TOC y color (%) Figura 8.14. Eliminación de () DQO, (□) COT y ({) color durante la operación en el reactor aerobio continuo Capítulo 8 250 Los valores de eliminación de DQO, TOC y color se muestran en la Figura 8.14. Durante los 3-4 primeros días, los porcentajes de eliminación fueron elevados, aunque esto fue debido al efecto de dilución que se produce al cambiar la alimentación desde la fase de arranque del reactor al efluente de la degradación enzimática. A partir de los 30 d de operación, se obtuvo una disminución de DQO y COT de un 50%, que fue debida al consumo de glucosa que se empleó como cosubstrato. A partir del día 36 se modificó el TRH del reactor de 12 a 24 h, sin embargo los resultados de eliminación de DQO y TOC no presentaron una mejoría significativa, debido a que la concentración de sólidos en el reactor a partir del día 35 fue menor de 1 g SSV/L. La decoloración prácticamente fue nula a lo largo de todo el proceso, lo que corroboró la teoría de que el compuesto que da color, que es principalmente la cantidad residual de tinte, no se degrada por vía aerobia. Los espectros de absorbancia (Figura 8.15) muestran que disminuyó ligeramente el color, aunque el perfil del espectro no se modificó tras el tratamiento aerobio. 0 1 2 3 4 5 6 200 300 400 500 600 700 800 Longitud de onda (nm) Absorbancia Figura 8.15. Comparación de los espectros de absorbancia de influente (línea gruesa) y efluente (línea fina) del tratamiento en un reactor aerobio continuo Para comparar la composición de las muestras de influente y efluente del reactor de lodos activos, se realizaron análisis por HPLC (Figura 8.16). Aparentemente apenas se produjo eliminación o disminución de las señales. La señal correspondiente a Orange II (tr=7,0 min) apenas sufrió modificación en cuanto a su área, aunque sí en cuanto a su tiempo de retención. Sin embargo, a la Postratamiento bacteriano 251 vista de los espectros de absorbancia de las señales de influente y efluente, se observó que la señal correspondiente a 2,032 min en el cromatograma de la alimentación corresponde a un compuesto diferente al que se obtuvo a los 2,058 min en el cromatograma de efluente. Si los espectros de absorbancia de ambas señales se comparan con compuestos patrón, se puede afirmar que el compuesto constituyente del influente del reactor, 4-hidroxibencenosulfonato, fue degradado durante el tratamiento aerobio, y paralelamente se generó el compuesto bencenosulfonato. Figura 8.16. Composición de las muestras de (a) influente y (b) efluente del reactor aerobio continuo. Tiempos de retención: 4-hidroxibencenosulfonato: 2,0 min; bencenosulfonato, 2,1 min; Orange II: 7,0 min Por último, se analizó la toxicidad de las muestras antes y después del tratamiento aerobio (Tabla 8.14). El efluente de la degradación aerobia presentó prácticamente el mismo valor de EC50 que el influente, con lo cual se puede afirmar que el proceso aerobio no contribuye a aumentar la toxicidad, aunque tampoco ayuda a disminuirla, si bien la corriente procedente de la degradación enzimática del tinte no tenía carácter tóxico. min 1 2 3 4 5 6 7 8 9 mAU 0 50 100 150 200 250 300 350 1.782 1.860 2.032 2.383 3.248 4.234 6.997 min 1 2 3 4 5 6 7 8 9 mAU 0 50 100 150 200 250 300 350 1.801 1.892 2.058 2.229 2.663 3.351 4.641 7.877 (a) (b) Capítulo 9 258 Índice 1. Introducción 2. Materiales y métodos 2.1. Compuestos químicos 2.2. Ensayos de decoloración 2.3. Voltametría cíclica 3. Resultados y discusión 3.1. Decoloración de Orange II en presencia de ácidos quelantes 3.2. Determinación de las energías relativas de quelación de ácidos carboxílicos 3.3. Capacidad quelante de Orange II 4. Conclusiones 5. Referencias 259 262 262 262 262 263 263 264 269 272 273 Estabilización de Mn3+ 259 1. Introducción La capacidad de la enzima MnP para realizar la oxidación de compuestos es debida, en último término, a la generación de la forma Mn3+ a partir de Mn2+, que tiene lugar mediante la reducción de la forma oxidada de la enzima, MnP I, a su forma nativa (Wariishi et al., 1989). Dicha transformación ocurre en dos etapas de oxidación-reducción, de manera que por cada ciclo de la enzima se generan dos iones Mn3+. Este compuesto es un oxidante fuerte (1,5 V) y de pequeño tamaño, por lo tanto tiene acceso a un gran número de compuestos que la enzima por sí misma no podría alcanzar. Sin embargo, Mn3+ es inestable en disolución acuosa, produciéndose reacciones de dismutación que dan lugar a las formas Mn2+ y Mn4+, precipitando esta última como MnO2 (Pérez & Jeffries, 1993). Por tanto, para que el Mn3+ pueda actuar adecuadamente necesita formar un complejo que le confiera estabilidad. El ligando ideal debería cumplir tres funciones: i) facilitar la disociación de Mn3+ de la enzima; ii) estabilizar la forma Mn3+; iii) no tener capacidad de quelación con la forma Mn2+, o que esta sea pequeña, de manera que se permita su acceso a la enzima (Wariishi et al., 1992). Algunos ácidos carboxílicos cumplen estas funciones (Wariishi et al., 1989). Para que un ácido carboxílico tenga acción quelante debería tener más de un grupo capaz de interaccionar con el ion Mn3+, de forma que se genere una red de uniones que dan lugar a la estabilización del ion. Los ácidos di o tricarboxílicos, como malonato, oxalato, tartrato o citrato, tienen potencialmente esa capacidad de quelación (Glenn et al., 1986; Wariishi et al., 1988). Algunos ácidos monocarboxílicos también son capaces de formar complejos debido a que en su estructura cuentan con otro grupo que puede interaccionar con el Mn3+, como es el caso del grupo alcohol que forma parte del lactato (Wariishi et al., 1992). Sin embargo, compuestos monocarboxílicos como el acetato no tienen capacidad quelante (Glenn & Gold, 1985). Diversos autores analizaron el efecto de distintos ácidos carboxílicos en la medida de la actividad enzimática de MnP por oxidación de 2,6-dimetoxifenol (DMP) o ácido 2,2’-azino-bis-3-etilbenz-tiazolin-6-sulfónico (ABTS). En todos los casos, en ausencia de ácido orgánico no se cuantificó actividad enzimática (Glenn & Gold, 1985; Wariishi et al., 1992). A la vista de estos resultados, como parte de nuestra investigación se analizó la decoloración de Orange II en procesos en discontinuo en ausencia de ácidos carboxílicos quelantes. Se empleó enzima Capítulo 9 260 MnP purificada y dializada frente a agua, asegurando así la actuación de dicha enzima en el proceso y la ausencia de cualquier ácido o compuesto con capacidad quelante que pudiera proceder del crudo enzimático. Se realizaron ensayos en presencia de acetato y en ausencia de ácido carboxílico y los resultados se compararon con los obtenidos en presencia de malonato, pues es conocida su fuerte capacidad de quelación. La decoloración alcanzada tras 1 h de ensayo en ausencia de compuestos quelantes fue la misma que la obtenida en presencia de malonato, y la velocidad de decoloración fue prácticamente igual en los tres casos, así como la pérdida de actividad enzimática (Figura 9.1). 0 20 40 60 80 100 120 140 160 180 200 0 10203040506070 Tiempo (min) Actividad (U/L) 0 10 20 30 40 50 60 70 80 90 100 Orange II (mg/L) Figura 9.1. Actividad (símbolos cerrados) y concentración de Orange II (símbolos abiertos) de ensayos de decoloración con MnP purificada y dializada: (□) malonato 1 mM; () acetato 1 mM; ({) ausencia de ácido; adición de H2O2 15 µmol/L·min, pH 4,5 y temperatura ambiente A la vista de los resultados, se plantearon una serie de cuestiones: i) En primer lugar, el hecho de que la decoloración también tenga lugar, y prácticamente en la misma extensión, en ausencia de malonato, hace plantear la posibilidad de que otros ácidos puedan realizar una acción quelante similar. Diversos autores estudiaron la quelación de Mn3+ con diferentes ácidos carboxílicos y establecieron un orden de capacidad de quelación en función de las velocidades iniciales de oxidación de compuestos (Glenn & Gold, 1985; Cui & Dolphin, 1990; Wariishi et al., 1992). Teniendo en cuenta la aplicación de la enzima MnP a la degradación en continuo de compuestos recalcitrantes, se considera importante el factor cinético en presencia de esos Estabilización de Mn3+ 261 ácidos, si bien es de especial relevancia la capacidad de estabilización del Mn3+ que presenta cada uno de ellos. Por ello se intentará establecer la energía de formación relativa de quelatos para diferentes ácidos y el ion Mn3+. ii) En segundo lugar, de la Figura 9.1 se deduce que en presencia de ácidos monocarboxílicos sin poder quelante, como el acetato, o incluso en ausencia de ácidos, la decoloración presenta prácticamente la misma cinética. Esto hace plantear la posibilidad de que algún compuesto presente en el medio de degradación pueda tener cierta capacidad quelante. El tinte Orange II, mediante sus grupos ácido sulfónico e hidroxilo, podría ayudar a formar un complejo con Mn3+. En función de estos puntos de partida, en este capítulo se pretende establecer cualitativamente la capacidad que presentan una serie de ácidos para quelar el ion Mn3+. En segundo lugar, se estudia la posibilidad de que el tinte Orange II pueda, asimismo, estabilizar el Mn3+ mediante quelación. Para determinar la concentración de complejos de Mn3+ se aplicó la técnica de espectrofotometría (Wariishi et al., 1992), que da una medida directa de la concentración de complejo formado. Desgraciadamente, en este caso, el tinte también absorbe a la longitud de onda a la que absorben los complejos de Mn3+, en el rango de 270-300 nm, resultando la señal enmascarada por la del propio colorante. Por ello, se ha ensayado el uso de la voltametría cíclica como técnica muy útil para estudiar especies activas electroquímicamente. Su efectividad reside en su capacidad para observar el comportamiento redox de un compuesto en un intervalo amplio de potenciales (Kissinger & Heineman, 1983; van Benschoten et al., 1983). La técnica ofrece una buena sensibilidad y versatilidad, aunque se debe tener en cuenta que es una técnica de diagnosis, que permite solamente una información cualitativa. Para una determinación cuantitativa de velocidades o concentraciones, se recomienda emplear otras técnicas de voltametría, tales como la voltametría de pulsos o de pasos. En este capítulo se empleó la técnica de voltametría cíclica para determinar la formación de complejos de Mn3+ en presencia de compuestos con posible capacidad quelante, tales como ácidos carboxílicos y el tinte azo Orange II. Capítulo 9 262 2. Materiales y métodos 2.1. Compuestos químicos Los ácidos malónico, oxálico, láctico, tartárico y cítrico fueron suministrados por Sigma-Aldrich (Alemania). Sus estructuras se presentan en la Figura 9.2. OH O CH2 OH O Ácido malónico OH O OH O Ácido oxálico CH2 OH CH OH O Ácido láctico OH OOH CH OH CH OH O Ácido tartárico OH O CH2 OH OH O CH2 OH O Ácido cítrico Figura 9.2. Estructuras de diversos ácidos carboxílicos 2.2. Ensayos de decoloración Se realizaron ensayos de decoloración en discontinuo, en matraces Erlenmeyer de 100 mL con 25 mL de medio conteniendo MnSO4 33 µM, ácido orgánico 1 mM, MnP 200 U/L y Orange II 100 mg/L, a pH 4,5. Se adicionó H2O2 a una velocidad de 50 µmol/L·min. Se trabajó con diferentes ácidos: malónico, oxálico, láctico, tartárico y cítrico. Se tomaron muestras cada 2 min durante 20 min y se analizó la concentración de Orange II por medio de espectrofotometría, como se indica en el Capítulo 2 de Materiales y métodos. 2.3. Voltametría cíclica La voltametría abarca un grupo de métodos electroanalíticos en que se aplica una señal de excitación, que es un potencial variable, a un analito contenido en una celda electroquímica. Esta señal de excitación provoca la respuesta de intensidad de corriente característica del analito. En voltametría cíclica, el potencial varía entre dos valores, de manera que primero aumenta linealmente 3 Estabilización de Mn3+ 263 hasta un máximo y después disminuye linealmente con la misma pendiente hasta su valor original. Los ensayos de voltametría cíclica se llevaron a cabo en una celda de 100 mL de capacidad, empleándose un electrodo de disco de grafito como electrodo de trabajo, un electrodo de calomelanos saturado como electrodo de referencia y un hilo de platino como electrodo auxiliar. El equipo utilizado ha sido un Potentiostat-Galvanostat EG&G (Priceton Applied Research) modelo 273 con un Software Modelo 270/250 v. 4.10 (Gaithersburg, MD, EEUU). Se trabajó a velocidades de barrido de potencial de 0,02 y 0,2 V/s con potenciales entre 0 y 1,2 V. El volumen de trabajo fue de 40 mL, se empleó NaNO3 100 mM como electrolito soporte y la fuente de Mn2+ se obtuvo a partir de MnCl2 1 mM. 3. Resultados y discusión 3.1. Decoloración de Orange II en presencia de ácidos quelantes Tras observar que la decoloración de Orange II tiene lugar en la misma extensión en presencia de otros ácidos, se planteó la posibilidad de estudiar otras alternativas al malonato, que permitan mantener una alta capacidad de decoloración del tinte mediante la enzima MnP. Para ello se realizaron ensayos con malonato, oxalato, lactato, tartrato y citrato (Figura 9.3). 0 10 20 30 40 50 60 70 80 90 100 0 5 10 15 20 Tiempo (min) Decoloración (%) Figura 9.3. Ensayos de degradación enzimática de Orange II: (■) malonato; (•) oxalato; () lactato; (□) tartrato y ({) citrato Capítulo 9 264 A partir de la velocidad de decoloración en presencia de los ácidos carboxílicos empleados, se puede afirmar que todos presentaron una cinética similar, a excepción del cítrico, que dio lugar a una decoloración considerablemente más lenta. Esto podría ser debido a la menor fuerza de quelación del citrato con respecto a los demás ácidos empleados, que repercutiría en una menor energía de disociación entre el Mn3+ y la enzima, que podría dominar la cinética del proceso. 3.2. Determinación de las energías relativas de quelación de ácidos carboxílicos Para determinar la energía de quelación de cada uno de los ácidos propuestos se aplicó la técnica de voltametría cíclica, que permite conocer el estado de oxidación de un analito en una disolución y, en base a un análisis comparativo, establecer cualitativamente el orden de quelación de compuestos. En primer lugar se realizó un voltamograma a una disolución de MnCl2 1 mM con NaNO3 100 mM como electrolito soporte y con un barrido de potenciales entre 0 y 1,2 V (Figura 9.4). -6,E-05 -5,E-05 -4,E-05 -3,E-05 -2,E-05 -1,E-05 0,E+00 1,E-05 2,E-05 3,E-05 0 0,2 0,4 0,6 0,8 1 1,2 Potencial (V) Intensidad (A) Figura 9.4. Voltamograma de una disolución de Mn2+ 1 mM La disolución en el momento inicial sólo contiene Mn2+. A valores inferiores al potencial de oxidación de Mn2+ a Mn3+, se encuentra presente solamente la A B CD E F G Estabilización de Mn3+ 265 forma reducida, de manera que no hay corriente de electrones debida a la oxidación, siendo por tanto nula la intensidad de corriente (zona A-B). Una vez que la diferencia de potencial entre los electrodos de la celda alcanza el punto B, comienza a producirse la oxidación de Mn2+ a Mn3+, de manera que comienza la corriente de electrones entre los electrodos. La intensidad de corriente viene dada por la Ecuación 1. δ )( 0 AA CCk i− = (1) donde i es la intensidad de corriente; k es una constante de proporcionalidad; CA es la concentración del analito en el seno de la disolución; CA0 es la concentración del analito en la superficie del electrodo de medida y δ es el espesor de la capa que se forma en la superficie del electrodo, donde la concentración del analito presenta un gradiente entre la concentración en la superficie y la del seno de la disolución. En cuanto se alcanza el potencial del par redox Mn2+/Mn3+, la concentración de Mn2+ en la superficie del electrodo se anula, aumentando la intensidad hasta un valor límite (il) (punto C). Si la disolución está perfectamente agitada, la concentración en el electrodo seguirá siendo nula, de manera que se mantiene el valor de il. Si la agitación no es completa, la capa de difusión alcanzará un mayor espesor, de manera que la intensidad disminuirá tendiendo de nuevo a 0. Por convenio, la intensidad de la oxidación se toma como negativa y la de la reducción como positiva. Cuando se alcanza el potencial de 1,2 V (punto D) se revierte el barrido, aunque las intensidades siguen siendo negativas mientras el potencial sea suficientemente alto como para que se siga produciendo la oxidación. Al llegar al punto E, el Mn3+ generado en el proceso directo comienza a reducirse, de manera que la concentración de Mn2+ en la superficie del electrodo es superior a la del seno del líquido, produciéndose un paso de corriente en sentido contrario al anterior. Tras un valor máximo (punto F), se agota el Mn3+ en la superficie del electrodo, deteniéndose por tanto el paso de corriente. El potencial del par redox observado en la Figura 9.4 se alejó del potencial normal dado para el par Mn2+/Mn3+ (1,54 V), debido a no se operó en condiciones Capítulo 9 266 normales. La relación entre potencial de trabajo y el potencial normal de oxidación viene dada por la ecuación de Nernst (Ecuación 2). [ ] [] [ ] [] Rd Ox n E Rd Ox nF RT EE log 059,0 ln 00 +=+= (2) donde E es el potencial de trabajo, E0 es el potencial normal del par, R es la constante de los gases ideales (8,31 J/K mol); T es la temperatura en condiciones normales (298 K); n es el número de electrones transferidos; F es la constante de Faraday (96406 J/V mol); [Ox] es la concentración de la especie oxidada y [Rd] es la concentración de la especie reducida (Skoog et al., 2001). Debido a esa desviación de las condiciones normales, la oxidación tiene lugar a un potencial de 0,693 V. Cuando el rango de potencial se amplió a 1,5 V, el voltamograma mostró dos señales de oxidación, correspondientes al paso de Mn2+ a Mn3+ y de Mn3+ a Mn4+. Dado que esta última especie precipita en forma de MnO2, cuando el barrido de potencial se revirtió no se observó ninguna señal de reducción (datos no mostrados). La diferencia entre los potenciales de las señales de oxidación y reducción (puntos C y F) indica el carácter del proceso. En un proceso reversible la reacción redox es muy rápida y no limita la cinética del proceso, siendo la diferencia entre ambos potenciales de 0,059/n (V). En un proceso irreversible la reacción redox es más lenta que la velocidad de barrido de potencial, de manera que la disminución de la velocidad de barrido hace que se retrasen los potenciales de oxidación y reducción. En la Figura 9.4 se observa una diferencia de 0,254 V entre ambos potenciales para una velocidad de barrido de 0,2 V/s. Por otro lado, en un proceso con una velocidad de barrido de 0,02 V/s la diferencia entre ambos potenciales aumentó hasta 0,345 V, lo cual corroboró la irreversibilidad del proceso redox. La incorporación de un electrolito inerte en el medio de reacción tiene como función evitar la influencia del efecto de la migración de analito debida al campo eléctrico, siendo necesario que la concentración de electrolito sea muy superior a la concentración de analito. Por este motivo, se seleccionó NaNO3 a una concentración de 100 mM como electrolito soporte. La decisión de adicionar el analito Mn2+ en forma de MnCl2 se tomó considerando una sal que no tuviese influencia en la modificación de las señales. La concentración de Mn2+ se aumentó con respecto a la empleada en los ensayos de decoloración (de 33 µM a 1 mM) debido al efecto que presenta en la intensidad y potencial de aparición de Estabilización de Mn3+ 267 las señales: una concentración muy baja dio lugar a intensidades de corriente poco significativas (Ecuación 1), mientras que una concentración más elevada dio lugar a una mayor desviación del potencial redox con respecto al potencial normal (Ecuación 2). La presencia de un compuesto quelante de Mn3+ en el medio se detecta cuando la forma oxidada es más estable, y por tanto cuando resulta más favorable su formación que la forma reducida. De ser así, se produciría una desviación de la señal de oxidación hacia valores de potencial menores, y de la misma forma se observaría a potenciales más bajos la señal de reducción. Así, en la Figura 9.5 se observa la desviación de los potenciales de oxidación y reducción en presencia de una concentración de 20 mM de malonato, en comparación con los potenciales obtenidos en ausencia de compuesto quelante (Figura 9.4). Se observó un mayor efecto en la señal de reducción. La concentración de compuesto quelante debe tener un valor como mínimo 10 veces superior a la concentración del analito. -6,E-05 -5,E-05 -4,E-05 -3,E-05 -2,E-05 -1,E-05 0,E+00 1,E-05 2,E-05 3,E-05 0 0,2 0,4 0,6 0,8 1 1,2 Potencial (V) Intensidad (A) Figura 9.5. Voltamograma de una disolución de Mn2+ 1 mM y malonato 20 mM A medida que aumenta la concentración de compuesto quelante con respecto a la del analito, la capacidad de quelación debería ser mayor, de manera que el desplazamiento de las señales debería aumentar. Para determinar la fuerza relativa de quelación de los distintos ácidos, se realizaron voltamogramas a diferentes disoluciones formadas por 1 mM de MnCl2 y concentraciones de 20-25-30-35-4045-50-60-70-80 mM de los diferentes ácidos: malónico, oxálico, láctico, tartárico 274 Estudio económico 275 Anexo Estudio económico del proceso de degradación enzimática Resumen Para que un proceso sea factible a nivel industrial, es necesario que sea económicamente viable con respecto a otras alternativas. En este anexo se realizó una estimación de los costes que implica el tratamiento enzimático de compuestos recalcitrantes, en procesos discontinuos y continuos con enzima en estado libre e inmovilizado. Se encontró que la producción de enzima es el factor más relevante económicamente de los procesos con enzima libre, mientras que el soporte de inmovilización es el factor más caro de los procesos con enzima inmovilizada, lo cual implica un aumento en el coste en un factor de 100. El tratamiento en un reactor enzimático de membrana puede resultar económicamente viable y competitivo en comparación con procesos de oxidación avanzada, necesitando para ello una disminución de los costes de producción de MnP, mediante un escalado del proceso. Anexo 276 Índice 1. Introducción 2. Materiales y métodos 2.1. Ensayos de degradación 2.2. Técnicas analíticas 3. Resultados 3.1. Ensayos de degradación en discontinuo con MnP libre 3.2. Ensayos de degradación en continuo con MnP libre 3.3. Ensayos de degradación en discontinuo con MnP inmovilizada 3.4. Ensayos de degradación en continuo con MnP inmovilizada 3.5. Estimación del coste de producción de MnP 3.6. Estimación de los costes de inmovilización 3.7. Estimación de los costes del proceso 3.8. Comparación económica del proceso enzimático con procesos de oxidación avanzada 4. Conclusiones 5. Referencias 277 277 277 278 279 279 280 281 281 282 284 285 285 286 287 Estudio económico 277 1. Introducción La aplicación de un tratamiento enzimático a la degradación de compuestos recalcitrantes es una alternativa interesante debido a diferentes ventajas: los costes de mantenimiento son bajos, la operación es sencilla, se generan efluentes limpios y no se producen lodos. Sin embargo, para que esta opción sea competitiva frente a otras alternativas de tratamiento, es necesario que sea económicamente viable. Se han realizado estudios económicos de la degradación de compuestos mediante distintos procesos de oxidación avanzada, tales como tratamiento con ozono, luz ultravioleta, reactivo de Fenton o distintas combinaciones de los mismos (Esplugas et al., 2002). El objetivo de este anexo es la estimación de los costes económicos que supone la degradación enzimática en cada uno de los sistemas estudiados: sistema con enzima libre y con enzima inmovilizada, en operación discontinua y continua. El estudio económico tomó como base de cálculo la cantidad de fenol degradado (1 kg) para cada uno de los procesos. 2. Materiales y métodos 2.1. Ensayos de degradación Ensayos de degradación con MnP libre Se realizó un ensayo en discontinuo de degradación de fenol con MnP soluble en un matraz Erlenmeyer de 250 mL con 100 mL de medio consistente en: MnP 200 U/L, oxalato de sodio 1 mM, MnSO4 33 µM, fenol 100 mg/L y una adición de H2O2 en continuo a una velocidad de 15 µmol/L·min. El pH del medio se ajustó a 4,5 y se trabajó a temperatura ambiente. Se tomaron muestras cada 15 min durante 3 h y se analizó la actividad enzimática y la concentración de fenol. Se llevó a cabo la degradación en continuo de fenol con MnP soluble en un reactor enzimático asociado a una membrana de ultrafiltración. El volumen de reacción fue de 250 mL. La alimentación consistió en una disolución de oxalato 1 mM, MnSO4 33 µM y fenol 100 mg/L, que se adicionó mediante una bomba para mantener un tiempo de residencia (TRH) de 2 h. Se bombeó MnP, a una velocidad tal que la actividad en el reactor se mantuvo a 200 U/L, y H2O2, con una velocidad de 15 µmol/L·min. Se tomaron muestras durante 39 h de ensayo y Anexo 278 se midió la actividad enzimática y la concentración de fenol en el reactor y en el efluente del sistema. Ensayos de degradación con MnP inmovilizada La inmovilización de MnP sobre un soporte de agarosa previamente activado con grupos glutaraldehido se realizó mediante el procedimiento indicado en el Capítulo 5. El ensayo de degradación en discontinuo de fenol mediante MnP inmovilizada se llevó a cabo en un matraz Erlenmeyer con 100 mL de medio: MnP 200 U/L, oxalato de sodio 1 mM, MnSO4 33 µM, fenol 100 mg/L y una adición de H2O2 en continuo a una velocidad de 15 µmol/L·min. Cada 15 min se tomaron muestras de sobrenadante para analizar la concentración de fenol y muestras de suspensión para determinar la actividad enzimática. El ensayo de degradación en continuo con MnP inmovilizada tuvo lugar en un reactor de mezcla completa con 100 mL de medio, en que la enzima inmovilizada se retuvo en el reactor por medio de un pequeño filtro. Se adicionó alimentación consistente en oxalato 1 mM, MnSO4 33 µM y fenol 100 mg/L, con una velocidad tal que permitiese un TRH de 3 h. Se adicionó H2O2 en continuo mediante una bomba a 15 µmol/L·min. Se realizó un seguimiento de la concentración de fenol en el efluente, así como de la actividad enzimática en el reactor, aunque no se realizó adición en continuo de MnP inmovilizada para reponer la enzima consumida en el proceso, para igualar las condiciones en que se llevaron a cabo los ensayos de decoloración de Orange II. 2.2. Técnicas analíticas La medida de actividad enzimática de MnP libre se llevó a cabo mediante el proceso indicado en el Capítulo 2 de Materiales y métodos. La actividad de MnP inmovilizada se midió espectrofotométricamente con agitación en la celda de medida, tal como se describió en el Capítulo 5 de Inmovilización de MnP. La concentración de fenol se determinó mediante cromatografía líquida con un equipo Hewlett Packard ChemStation equipado con un detector de array de diodos 1090 M Serie II. Se empleó una columna Spherisorb ODS2 (0,46 cm diámetro interno y 20 cm de longitud) que contiene partículas empacadas de 5 µm (Merck KgaA, Darmstadt, Alemania). Se inyectaron 10 µL de muestra y se Estudio económico 279 empleó como fase móvil una disolución de 50% de acetonitrilo y 50% de agua, a un flujo de 0,4 mL/min en condiciones isocráticas y 30ºC. Los cromatogramas se obtuvieron a una longitud de onda de 270 nm. El tiempo de retención para el fenol fue de 8,1-8,2 min. 3. Resultados 3.1. Ensayo de degradación en discontinuo con MnP libre La Figura A.1 muestra los perfiles de degradación de fenol y de actividad enzimática en el ensayo llevado a cabo en un proceso en discontinuo con adición en continuo de H2O2 y con enzima libre. Las condiciones empleadas fueron las mismas que las utilizadas en los ensayos de decoloración, sin optimización previa para la degradación de fenol. De los perfiles se calcularon los parámetros cinéticos dados en la Tabla A.1. La constante cinética se obtuvo considerando los valores de degradación iniciales, y una cinética de primer orden con respecto al fenol. El valor de t1/2 indica el tiempo para el cual la degradación de la concentración inicial de fenol alcanza el 50% y se obtuvo a partir del valor de la constante cinética. 0 20 40 60 80 100 120 0 50 100 150 200 Tiempo (min) Concentración fenol (mg/L) 0 40 80 120 160 200 240 Actividad (U/L) Figura A.1. Degradación en discontinuo de fenol con MnP libre: ({) concentración de fenol; (∆) actividad enzimática Anexo 280 Tabla A.1. Parámetros de la degradación en discontinuo de fenol con MnP libre k (h-1) t1/2 (h) Consumo enzima (U/L·h) Consumo enzima a t1/2 (U) 0,906 0,765 16,4 1,25 3.2. Ensayo de degradación en continuo con MnP libre La selección del TRH para la degradación de fenol en el reactor enzimático de membrana se llevó a cabo en función de los datos obtenidos en el ensayo en discontinuo. Dado que se degradó todo el fenol en 2 h, se consideró este tiempo como TRH. Los perfiles se muestran en la Figura A.2. 0 20 40 60 80 100 120 0 1020304050 Tiempo (h) Concentración fenol (mg/L) 0 50 100 150 200 250 300 Actividad (U/L) Figura A.2. Degradación en continuo de fenol en un reactor enzimático de membrana con MnP libre: ({) concentración de fenol; (∆) actividad enzimática Tabla A.2. Parámetros de la degradación en continuo de fenol con MnP libre k (h-1) t1/2 (h) Consumo enzima (U/L·h) Consumo enzima a t1/2 (U) 3,67 0,189 11,3 0,53 La Tabla A.2 muestra los parámetros obtenidos a partir de los perfiles de degradación y consumo de enzima. La constante cinética se calculó mediante un Estudio económico 281 balance al reactor enzimático, considerando una reacción de primer orden con respecto al substrato. 3.3. Ensayo de degradación en discontinuo con MnP inmovilizada El ensayo de degradación de fenol en discontinuo con enzima inmovilizada sobre agarosa-glutaraldehido se muestra en la Figura A.3. Considerando una cinética de primer orden, se obtuvieron los parámetros cinéticos y de consumo de enzima dados en la Tabla A.3. 0 20 40 60 80 100 120 0 50 100 150 200 Tiempo (min) Concentración fenol (mg/L) 0 40 80 120 160 200 240 Actividad (U/L) Figura A.3. Degradación en discontinuo de fenol con MnP inmovilizada: ({) concentración de fenol; (∆) actividad enzimática Tabla A.3. Parámetros de la degradación en discontinuo de fenol con MnP inmovilizada k (h-1) t1/2 (h) Consumo enzima (U/L·h) Consumo enzima a t1/2 (U) 0,636 1,09 25,11 2,74 3.4. Ensayo de degradación en continuo con MnP inmovilizada A partir de los perfiles de degradación de fenol en discontinuo con MnP inmovilizada se consideró un TRH de 3 h para la degradación en continuo en un reactor de tanque agitado. Los perfiles de degradación de fenol y consumo de MnP se muestran en la Figura A.4. Anexo 282 0 10 20 30 40 50 60 70 80 90 100 0 1020304050 Tiempo (h) Concentración fenol (mg/L) 0 30 60 90 120 150 180 210 240 270 300 Actividad (U/L) Figura A.4. Degradación en continuo de fenol en un reactor continuo de tanque agitado con MnP inmovilizada: ({) concentración de fenol; (∆) actividad enzimática La Tabla A.4 muestra los parámetros cinéticos y de consumo de enzima. Tabla A.4. Parámetros de la degradación en continuo de fenol con MnP inmovilizada k (h-1) t1/2 (h) Consumo enzima (U/L·h) Consumo enzima a t1/2 (U) 3,00 0,231 8 0,185 3.5. Estimación del coste de producción de MnP Los principales factores que contribuyen al coste que conlleva la producción de la enzima MnP a partir de suero de leche son los reactivos del medio de fermentación, el consumo energético y las membranas de ultrafiltración del crudo enzimático obtenido. Se consideraron los reactivos empleados en el medio de conservación del hongo en tubos inclinados, así como el medio de mantenimiento en placas, el medio de cultivo en matraces Fernsbach y el medio de producción en matraces Erlenmeyer. Dado que los volúmenes de medio empleados son mucho menores que el volumen del medio de producción en el fermentador (se consideran fermentaciones de 100 L), estos reactivos constituyen un porcentaje muy pequeño Estudio económico 283 de los costes aportados por los reactivos, de manera que no fueron considerados en la estimación de costes de reactivos mostrada en la Tabla A.5. Tabla A.5. Estimación del coste de los reactivos empleados en la producción de MnP Reactivo Cantidad (g) Precio (€/g) Precio total (€) Suero de leche Tiamina MnSO4 Peptona 2500 0,225 42,5 230 2,6·10-4 0,45 0,0099 0,075 0,65 0,10 0,42 17,2 TOTAL 18,4 € La estimación de los costes energéticos se realizó teniendo en cuenta que las fermentaciones tienen una duración media de 60 h (Tabla A.6). El precio del kWh se tomó de la referencia con la que se comparan los costes (Esplugas et al., 2002) y fue de 0,0632 €/kWh. Se empleó un factor de cambio de dólares americanos a euros de 1,210 $/€ (01-07-05). Tabla A.6. Estimación del coste energético en la producción de MnP Fuente Potencia (kW) Tiempo consumo (h) Energía (kWh) Precio total (€) Esteriliz. fermentador Consumo fermentador Compresor Agitador Autoclave 4,4 2,5 5,5 0,7 4,5 1 60 3 60 6 4,4 150 16,5 42 27 0,28 9,48 1,04 2,65 1,71 TOTAL 15,2 € Por último, se consideró el coste de amortización de las membranas del proceso de ultrafiltración y concentración del crudo enzimático obtenido en cada fermentación. El resumen de dicho coste se muestra en la Tabla A.7. Conclusiones 290 iv) El reactor enzimático de membrana operó durante 18 d consecutivos sin cambio o limpieza de la membrana. El proceso presenta una operación simple, gran estabilidad y es aplicable a la degradación de otros compuestos. v) El modelo cinético propuesto a partir de los ensayos en discontinuo ajustó adecuadamente los datos experimentales obtenidos en el proceso en continuo, de manera que se confirma su validez para la simulación y optimización del proceso. vi) La inmovilización de MnP mediante enlace covalente con un soporte de agarosa-glutaraldehido es un proceso relativamente simple, que permitió una retención enzimática del 100% y confirió estabilidad a la enzima. Como contrapartida, dado que las condiciones de pH son severas, en el proceso de inmovilización se pierde un 50% de la actividad enzimática. vii) El tratamiento en continuo en un reactor de tanque agitado con enzima inmovilizada permitió obtener un valor elevado de la eficacia del proceso, mediante la minimización del consumo de soporte y enzima. La minimización del consumo de agarosa implicó además una menor adsorción del tinte Orange II sobre el soporte. viii) El modelo cinético obtenido a partir de ensayos en discontinuo con enzima libre se adaptó a la cinética más lenta con enzima inmovilizada. La ecuación resultante simuló adecuadamente los datos experimentales. ix) El reactor continuo de tanque agitado con enzima inmovilizada tiene una operación sencilla, no presenta problemas de aumento de presión por ensuciamiento y requiere menos bombas para su operación. Sin embargo, tiene como desventajas importantes la pérdida de actividad enzimática durante el proceso de inmovilización, la cinética más lenta, el control más complejo de la actividad enzimática presente, la dificultad de un sistema para reemplazar la enzima desactivada y la generación de residuos. x) El estudio del mecanismo de degradación enzimática de Orange II permitió identificar 9 compuestos intermedios y finales, dos de los cuales no habían sido identificados con anterioridad: 4-diazonio bencenosulfonato y 2-naftol. Se cuantificaron dichos productos, que corresponden a un 30% de la concentración inicial de Orange II, lo que indica que, o bien existen otras rutas de degradación, o bien los productos generados continúan su degradación hacia otros productos finales. Conclusiones 291 xi) El postratamiento bacteriano del efluente de degradación enzimática de Orange II se llevó a cabo en condiciones tanto aerobias como anaerobias. El efluente no resultó tóxico para ninguna de las dos cepas bacterianas, se degradó un 25-30% de la DQO y se generaron efluentes no tóxicos. Sin embargo, el proceso anaerobio eliminó un 30% del color, mientras que el proceso aerobio fue es capaz de decolorar el efluente. Debido a esto, se consideró el postratamiento anaerobio como el más adecuado para tratar el efluente de la degradación enzimática de Orange II. xii) El tinte Orange II ejerce cierto efecto de quelación sobre el catión Mn3+, responsable de la oxidación enzimática. Así, no es necesaria la presencia de ácidos orgánicos para que la reacción enzimática tenga lugar, aunque se emplean igualmente como estabilizadores de pH. xiii) La evaluación de los costes de los procesos de degradación enzimática indicó que los costes de inmovilización harían inviable un proceso basado en el uso de enzima inmovilizada, aplicando la metodología estudiada. Sin embargo, el tratamiento en un reactor enzimático de membrana presenta un coste en el rango de otros procesos de oxidación avanzada. En resumen, el tratamiento enzimático del tinte azo Orange II es una alternativa adecuada, ya que su cinética es mucho más rápida que la de los procesos biológicos convencionales, alcanzando una decoloración superior al 90% y disminuyéndose en más de 9 veces la toxicidad del efluente. Para su aplicación a nivel industrial sería conveniente separar del vertido general una corriente concentrada de tinte, por ejemplo mediante membranas. Se debe disponer de dos unidades de ultrafiltración en paralelo, para emplear la segunda durante los períodos de limpieza de la primera. La corriente concentrada sufriría un tratamiento específico de degradación mediante un reactor enzimático de membrana, tras el cual podría añadirse un postratamiento anaerobio. El efluente generado se podría unir al efluente procedente del resto de los procesos de la planta para ser tratado mediante un sistema biológico convencional en una E.D.A.R. (Figura C.1). Conclusiones 292 Corriente coloreada Otras corrientes de proceso UF UFR.E.M. Reactor anaerobio E.D.A.R. Efluente Figura C.1. Esquema del tratamiento de un efluente coloreado mediante un proceso combinado enzimático-bacteriano. UF: membrana de ultrafiltración; R.E.M.: reactor enzimático de membrana; E.D.A.R.: estación depuradora de aguas residuales Corriente coloreada Otras corrientes de proceso UF UFR.E.M. Reactor anaerobio E.D.A.R. Efluente Figura C.1. Esquema del tratamiento de un efluente coloreado mediante un proceso combinado enzimático-bacteriano. UF: membrana de ultrafiltración; R.E.M.: reactor enzimático de membrana; E.D.A.R.: estación depuradora de aguas residuales Conclusións 293 Conclusións A degradación de compostos recalcitrantes cobra especial relevancia a medida que as leis medioambientais fanse máis severas. No presente traballo estudiouse o desenrolo de alternativas de tratamento para a degradación deste tipo de compostos, baseadas en procesos de oxidación en continuo mediante a encima ligninolítica MnP. A continuación preséntanse os logros alcanzados e as conclusións obtidas tras a realización desta tese: i) O estudio cinético da degradación encimática de Orange II empregando MnP indicou que a tinguidura resulta inhibitoria só a concentracións superiores a 750 mg/L. A cinética segue un modelo de Michaelis-Menten con respecto á tinguidura e segue unha función lineal de primeiro orde con respecto á velocidade de adición de H2O2. A velocidade de degradación é máis alta en presencia de oxálico que de acético, para concentracións de tinguidura por debaixo de 500 mg/L. ii) Optimizouse a operación dun reactor encimático de membrana para a degradación en continuo de Orange II. A eficacia depende tanto da estequiometría como da cinética do proceso. O estudio da estequiometría permitiu determinar as concentracións máis adecuadas: unha relación equimolar entre H2O2 e Orange II e unha actividade encimática de 200 U/L no reactor encimático. A cinética do proceso mellorou modificando parámetros tales como a velocidade de adición de H2O2, o tipo de ácido orgánico ou o TRH. Alcanzouse unha eficacia máxima de 42 mg/U cunha eliminación de cor superior ó 90%. iii) O osíxeno disolto é un bo parámetro para o control do proceso: un aumento na súa concentración indica unha dosificación excesiva de H2O2, que implicaría unha maior velocidade de desactivación encimática; pola contra, unha diminución na concentración de osíxeno disolto sería indicativa dunha sobrecarga de tinguidura, fallos de adición de H2O2 ou unha diminución da actividade encimática. Conclusións 294 iv) O reactor encimático de membrana operou durante 18 d consecutivos sen cambio ou limpeza da membrana. O proceso presenta unha operación simple, gran estabilidade e é aplicable á degradación doutros compostos. v) O modelo cinético proposto a partires dos ensaios en descontinuo axustou axeitadamente os datos experimentais obtidos no proceso en continuo, de maneira que se confirma a súa validez para a simulación e optimización do proceso. vi) A inmobilización de MnP mediante enlace covalente cun soporte de agarosa-glutaraldehido é un proceso relativamente simple, que permitiu unha retención encimática do 100% e conferiu estabilidade á encima. Como contrapartida, dado que as condicións de pH son severas, no proceso de inmobilización pérdese un 50% da actividade encimática. vii) O tratamento en continuo nun reactor de tanque axitado con encima inmobilizada permitiu obter un valor elevado da eficacia do proceso, mediante a minimización do consumo de soporte e encima. A minimización do consumo de agarosa implicou ademais unha menor adsorción da tinguidura Orange II sobre o soporte. viii) O modelo cinético obtido a partires de ensaios en descontinuo con encima libre adaptouse á cinética máis lenta con encima inmobilizada. A ecuación resultante simulou axeitadamente os datos experimentais. ix) O reactor continuo de tanque axitado con encima inmobilizada ten unha operación sinxela, non presenta problemas de aumento de presión por ensuciamento e require menos bombas para a súa operación. Sen embargo, ten como desvantaxes importantes a perda de actividade encimática durante o proceso de inmobilización, a cinética máis lenta, o control máis complexo da actividade encimática presente, a dificultade dun sistema para sustituir a encima desactivada e a xeración de residuos. x) O estudio do mecanismo de degradación encimática de Orange II permitiu identificar 9 compostos intermedios e finais, dous dos cales non foran identificados con anterioridade: 4-diazonio bencenosulfonato e 2-naftol. Cuantificáronse os productos, que corresponden a un 30% da concentración inicial de Orange II, o que indica que, ou ben existen outras rutas de degradación, ou ben os productos xerados continúan a súa degradación de cara a outros productos finais. Conclusións 295 xi) O postratamento bacteriano do efluente de degradación encimática de Orange II levouse a cabo en condicións tanto aerobias como anaerobias. O efluente non resultou tóxico para ningunha das dúas cepas bacterianas, degradouse un 25-30% da DQO e xeráronse efluentes non tóxicos. Sen embargo, o proceso anaerobio eliminou un 30% da cor, mentres que o proceso aerobio non foi capaz de decorar o efluente. Debido a isto, considerouse o postratamento anaerobio como o máis axeitado para tratar o efluente da degradación encimática de Orange II. xii) A tinguidura Orange II exerce certo efecto de quelación sobre o catión Mn3+, responsable da oxidación encimática. Así, non é necesaria a presencia de ácidos orgánicos para que a reacción encimática teña lugar, aínda que se empregan igualmente como estabilizadores de pH. xiii) A avaliación dos custes dos procesos de degradación encimática indicou que os custes de inmobilización farían inviable un proceso baseado no emprego de encima inmobilizada, aplicando a metodoloxía estudiada. Sen embargo, o tratamento nun reactor encimático de membrana presenta un custe no rango dos doutros procesos de oxidación avanzada. En resumo, o tratamento encimático da tinguidura azo Orange II é unha alternativa axeitada, xa que a súa cinética é moito máis rápida que a dos procesos biolóxicos convencionais, alcanzando unha eliminación de cor superior ó 90% e diminuíndose en máis de 9 veces a toxicidade do efluente. Para a súa aplicación a nivel industrial sería conveniente separar do vertido xeral unha corrente concentrada de tinguidura, por exemplo mediante membranas. Débese dispor de dúas unidades de ultrafiltración en paralelo, para empregar a segunda durante os períodos de limpeza da primeira. A devandita corrente sufriría un tratamento específico de degradación mediante un reactor encimático de membrana; tras este, poderíase engadir un postratamento anaerobio. O efluente xerado poderíase unir ó efluente procedente do resto dos procesos da planta para ser tratado mediante un sistema biolóxico convencional nunha E.D.A.R. (Figura C.2). Conclusións 296 Corrente coloreada Outras correntes de proceso UF UFR.E.M. Reactor anaerobio E.D.A.R. Efluente Figura C.2. Esquema do tratamento dun efluente coloreado mediante un proceso combinado encimático-bacteriano. UF: membrana de ultrafiltración; R.E.M.: reactor encimático de membrana; E.D.A.R.: estación depuradora de augas residuais Corrente coloreada Outras correntes de proceso UF UFR.E.M. Reactor anaerobio E.D.A.R. Efluente Figura C.2. Esquema do tratamento dun efluente coloreado mediante un proceso combinado encimático-bacteriano. UF: membrana de ultrafiltración; R.E.M.: reactor encimático de membrana; E.D.A.R.: estación depuradora de augas residuais Conclusions 297 Conclusions The degradation of recalcitrant compounds is more and more relevant since the environmental laws are getting stricter and stricter. In this work, some alternatives for the degradation of this kind of compounds, based on continuous oxidation processes by the ligninolytic enzyme MnP, were studied. The aims reached and the conclusions obtained are described below: i) The kinetic study of the enzymatic degradation of Orange II by MnP pointed out that the dye just caused inhibition when the concentration was higher than 750 mg/L. The kinetics followed a Michaelis-Menten model related to Orange II and a first order linear function related to the H2O2 addition rate. The degradation rate in a medium containing oxalic acid was higher than that obtained in a medium containing acetic acid, for concentrations lower than 500 mg/L. ii) The operation of an enzymatic membrane reactor was optimized for the continuous degradation of Orange II. The efficiency depended on both the stoichiometry and kinetics of the process. The stoichiometric study allowed to determine the more suitable concentrations: an equimolar ratio between H2O2 and Orange II and an enzymatic activity of 200 U/L. The kinetics was improved by the modification of parameters such as H2O2 addition rate, the sort of organic acid or the HRT. The maximum efficiency reached 42 mg/U and the decolorization was higher than 90%. iii) The dissolved oxygen is a good parameter for the control of the process: a concentration increase means an excessive dosage of H2O2, which implies a higher enzymatic deactivation rate; otherwise, a concentration decrease indicates a dye overload, failures in H2O2 addition or a decrease of the enzymatic activity. iv) The enzymatic membrane reactor operated for 18 d without changing or cleaning the membrane. The process has a simple operation, high stability and it can be applied to the degradation of other compounds. Conclusions 298 v) The kinetic model that had been proposed from the discontinuous assays, adjusted the experimental data obtained in the continuous operation. This fact verifies its suitability for the process simulation and optimization. vi) The MnP immobilization by covalent binding with a support of agaroseglutaraldehyde is a relatively simple process. It reached an enzymatic retention of 100% and contributed to the enzymatic stability. In contrast, during the immobilization process there was a loss of 50% of the enzymatic activity, as the pH conditions were very strong. vii) The treatment in a continuous stirred tank reactor with immobilized enzyme reached a high efficiency, by means of the minimization of the support and enzyme consumption. The minimization of the agarose consumption involved, furthermore, a lower adsorption of the dye into the support. viii) The kinetic model obtained from the discontinuous operation with free enzyme was adapted to the slower kinetics with immobilized enzyme. The resulting equation simulated the experimental data adequately. ix) The continuous stirred tank reactor with immobilized enzyme has a simple operation, with no problems of fouling and requires a less number of pumps for its operation. However, it has some important disadvantages, such as the enzymatic activity loss during the immobilization process, the slower kinetics, the more complex control of the enzymatic activity, the problem to find a system to replace the deactivated enzyme and the production of waste. x) The study of the enzymatic degradation mechanism of Orange II allowed to identify nine intermediate and final compounds. Two of them had been never identified: 4-diazonium benzenesulfonate and 2-naphtol. These products were quantified and they correspond to 30% of the initial dye concentration. This fact points out that there are some other degradation pathways or the degradation of the generated products goes on to other final compounds. xi) The bacterial postreatment of the Orange II enzymatic degradation effluent was performed in both aerobic and anaerobic conditions. The effluent was not toxic for the bacterial strains, the COD degradation reached 25-30% and the generated effluents were not toxic. However, the anaerobic treatment implied a color removal of 30%, whereas the aerobic process was not able to remove the color of the effluent. Due to this reason, the anaerobic Conclusions 299 postreatment was considered as the most suitable one to treat the Orange II enzymatic degradation effluent. xii) The dye Orange II is able to chelate the cation Mn3+, which is the responsible of the enzymatic oxidation. Therefore, the enzymatic reaction does not require the presence of organic acids, although these acids are used as pH stabilizers. xiii) The economical evaluation of the enzymatic degradation processes points out that the immobilization costs would make unviable a process based on the immobilized enzyme, by applying the established technology. However, the cost of the continuous treatment in an enzymatic membrane reactor is within the costs of other advanced oxidation processes. As a summary, the enzymatic treatment of the azo dye Orange II is a suitable alternative, as the kinetics is much more rapid than that of the conventional biological processes, reaching a decolorization higher than 90% and reducing the toxicity of the effluent more than 9-fold. For the industrial application of this system, it would be convenient to remove a concentrated stream from the main one, for example, by ultrafiltration membranes. Two ultrafiltration units should be in parallel, in order to use the second one when the first one is being cleaned. This strain would be treated specifically by means of an enzymatic membrane reactor, which could be followed by an anaerobic postreatment. The generated effluent could be flowed into the general effluent coming from the rest of the processes in the factory, and the resulting effluent could be treated by a conventional biological treatment process in a W.W.T. P. (Figure C.3).