Oxidación del tinte azo Orange II mediante MnP en reactores enzimáticos operados en continuo

UNIVERSIDADE DE SANTIAGO DE COMPOSTELA
Depa amen o de Ingenie ía Química
Oxidación del in e azo O ange II median e MnP en
eac o es enzimá icos ope ados en con inuo
Memo ia p esen ada po
Ca men López Díaz
Pa a op a al g ado de Doc o po la
Uni e sidade de San iago de Compos ela
San iago de Compos ela, No iemb e de 2005
UNIVERSIDADE DE SANTIAGO DE COMPOSTELA
Depa amen o de Ingenie ía Química
Juan Manuel Lema Rodicio, Ca ed á ico de Ingenie ía Química y Ma ía Te esa
Mo ei a Vila , P o eso a Asociada de Ingenie ía Química de la Uni e sidade de
San iago de Compos ela,
In o man:
Que la memo ia i ulada “Oxidación del in e azo O ange II median e MnP en
eac o es enzimá icos ope ados en con inuo”, que pa a op a al g ado de Doc o
en Ingenie ía Química, P og ama de Doc o ado en Ingenie ía Química y
Ambien al, p esen a Doña Ca men López Díaz, ha sido ealizada bajo nues a
inmedia a di ección en el Depa amen o de Ingenie ía Química de la Uni e sidade
de San iago de Compos ela.
Y pa a que así cons e, i man el p esen e in o me en San iago de Compos ela, el
19 de Julio de 2005.
Juan M. Lema Rodicio M. Te esa Mo ei a Vila

Es a memo ia ue p esen ada el 25 de No iemb e de 2005 en la Escola Técnica
Supe io de Enxeñe ía de la Uni e sidade de San iago de Compos ela an e el
ibunal compues o po :
D . Spy os N. Aga hos. Uni e si é Ca holique de Lou ain, Lou ain-la Neu e,
Bélgica
D . Gume sindo Feijoo Cos a. Uni e sidad de San iago de Compos ela.
D . José Manuel Guisán Seijas. Cen o Supe io de In es igaciones Cien í icas,
Mad id.
D a. Inmaculada O iz U ibe. Uni e sidad de Can ab ia.
D a. He minia Domínguez González. Uni e sidad de Vigo.
Cali icación: Sob esalien e Cum Laude.
Reconocimien o de “Doc o ado Eu opeo” den o del p og ama de Doc o ado
“Ingenie ía Química y Ambien al”.
AGRADECIMIENTOS
Cualquie a que haya enido una esis en sus manos sabe que es a p ime a
página a a se , sin duda, la más leída, y quizás la única. Así que a a é de
esme a me y plasma en palab as mi ag adecimien o a odos los que con ibuis eis
a la ealización de es e abajo.
En p ime luga , quie o da las g acias más since as a mi di ec o Juan
Lema, po u con ianza en mi abajo, u aseso amien o cien í ico y u es ímulo
pa a encamina la in es igación hacia los log os alcanzados. A mi di ec o a Mª
Te esa Mo ei a, po u supe isión cien í ica y li e a ia y u dedicación. G acias al
p o eso Gume sindo Feijoo, po habe e compo ado como un di ec o más.
Es e abajo ha sido inanciado po el Minis e io de Educación, Cul u a y
Depo e, median e una beca de Fo mación de P o eso ado Uni e si a io (AP2000-
1712) y po la Comisión Española de Ciencia y Tecnología (CICYT) median e el
p oyec o PPQ2001-3063.
La ealización de la esis doc o al me pe mi ió c ece in elec ual y
pe sonalmen e. Y a ello con ibuye on, en buena pa e, las es ancias ealizadas.
De odas ellas gua do muy buenos ecue dos, pues he podido ap o echa las,
cien í ica y pe sonalmen e. G acias al g upo de Ingenie ía de Bioca alizado es y
Bio ans o maciones del Ins i u o de Ca álisis y Pe oleoquímica del C.S.I.C. de
Mad id, di igido po José Manuel Guisán. G acias a Robe o, po di igi mi
abajo, y a Lo ena W., Lo ena B., Palomo, Manuel, Rosa, Rod igo, Beni… po
hace de mi p ime a es ancia un boni o ecue do. G acias al Labo a oi e de
Syn hèse e E ude de Sys èmes à In é ê Biologuique, de la Uni e si é Blaise-
Pascal de Cle mon -Fe and (F ancia) di igido po la p o eso a Anne-Ma ie
Delo . G acias, en pa icula , a B uno po u in e és y empeño en ob ene
esul ados y saca el a ículo adelan e. G acias al Fungal Bio echnology G oup de
la Uni e si y o Wes mins e , de Lond es (Reino Unido), di igido po el p o eso
Tajalli Kesha a z. G acias a Romeo, Rakesh, O , Ta i y, muy especialmen e, a la
loqui a de Ta a, po ues as enseñanzas y ues a amis ad.
Además, quisie a ag adece al p o eso Juan Ca los Ga cía Mon eagudo,
del depa amen o de Química Física de la Facul ad de Fa macia, sus enseñanzas
sob e la ol ame ía cíclica y su colabo ación en nues a in es igación, poniendo a
nues a en e a disposición su equipo y su labo a o io.
Gemma, e es la mejo compañe a de abajo del mundo! Mis dudas, mis
quejas, mis p oblemas, mis omas de mues a noc u nas, mis medidas, mis
acasos y mis éxi os han sido ambién uyos. G acias po compa i abajo,
di e sión, cong esos, cenas, con idencias… ¡Te quie o siemp e a mi lado! Iñaki,
Juani, Thelmo, Ángeles, g acias po ues as lecciones. Juanca, Pablo, La a,
Alejand a, Ana, Lo ena, compañe os de “hongos”, g acias po compa i poya a,
isas, penas y aleg ías, log ando el mejo ambien e de abajo. Ana, g acias po se
mi mejo (y única, pe o eso no impo a) discípula, y po la pa e de es e abajo
que e co esponde.
Ma , un “g acias” po cada mues a analizada en el HPLC, y Magda, un
“g acias” po cada medida de oxicidad. Luis, un “g acias” po cada duda esuel a
ace ca de los bichi os esos que se escapan de mi ámbi o más ce cano. Rosa, un
“g acias” po cada duda esuel a, cada dibujo escaneado, cada iaje o ganizado,
cada ca é, cada b oma y cada son isa. Ja i, un “g acias” po cada dibujo, cada
modi icación, cada duda sob e in o má ica y mil “g acias” po cada dibujo en
Flash. ¡Siemp e dan que habla ! Debe ías hace un Copy Righ .
Y aho a necesi a ía 300 páginas más pa a segui dando mis pa icula es
g acias, po que no c eo que sea posible sepa a la ida labo al de la a ec i a, y en
el éxi o de es a úl ima hay mucha gen e in oluc ada. Belén, e es única y c eas
adición. Sé siemp e así. Almu, sé que siemp e puedo ecu i a i, pa a odo.
Ma a, g acias po nues as la gas con e saciones. Man engámoslas. Gonzalo,
sigue sugi iendo chu ascos, haces que es emos unidos. Sonia y Elena, g acias
po que ya sois más amigas que compañe as de abajo. Ch is ian, ¡no dejes de
isi a nos! Jose, g acias po que e es mucho más que mi ex−compañe o de
despacho. Alex, g acias po habe me hecho un huequi o, po lo que hemos i ido
y i i emos jun os. Como ú dices, sob an las palab as…
A los que no apa ecéis aquí, a las de la playa, las de la esi y las de Sa ia.
G acias a mi amilia. A Me ce, po que e es odo lo que puede se una
he mana. Yo in en o segui e… A mis pad es, po es a en cada momen o,
dedica se a mí y po an as cosas que no an a cabe aquí.
An e odos me qui o el somb e o. No dejéis de es a ahí!
Índice
i
Índice
Obje i os y esumen
Obxec i os e esumo
Objec i es and abs ac
Capí ulo 1. In oducción
Resumen
1. Tin es indus iales
1.1. Aplicaciones
1.2. Clasi icación
2. Impac o ambien al de los e luen es colo eados
2.1. E ec os ecológicos
2.2. E ec os oxicológicos
2.3. Minimización de los impac os
3. Tecnologías pa a el a amien o de e luen es colo eados
3.1. T a amien os químicos
3.2. T a amien os ísicos
3.3. T a amien os biológicos
4. T a amien o de e luen es colo eados median e hongos ligninolí icos
4.1. Hongos ligninolí icos
4.2. Aplicaciones
4.3. Deg adación de in es
5. T a amien o de e luen es colo eados median e enzimas ligninolí icas
5.1. Enzimas ligninolí icas
5.2. Manganeso pe oxidasa
5.3. Pe oxidasa e sá il
5.4. Aplicaciones
6. Reac o es enzimá icos
6.1. Reac o es enzimá icos de memb ana
6.2. O os eac o es enzimá icos
6.3. Aplicaciones
7. Re e encias
Capí ulo 2. Ma e iales y mé odos
Resumen
1. Compues os químicos
1
5
9
13
13
15
15
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44
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59
61
Obje i os y esumen
2
i ) Ob ención, a pa i del p oceso en discon inuo, de un modelo ciné ico que
pe mi a el diseño de eac o es, la simulación de p ocesos en con inuo y la
op imización de las condiciones de ope ación (Capí ulos 3, 4 y 6).
) Iden i icación del mecanismo de deg adación enzimá ica del in e O ange II
y cuan i icación de los p oduc os in e medios y inales, pa a e alua la
oxicidad del e luen e gene ado (Capí ulo 7).
i) Es udio del pos a amien o de O ange II, median e p ocesos anae obios y
ae obios, pa a de e mina cuál de los p ocesos bac e ianos es más adecuado
pa a el a amien o del e luen e de la deg adación enzimá ica (Capí ulo 8).
ii) Es udio de la ene gía ela i a de quelación de Mn3+ po dis in os ácidos y
análisis de la posibilidad de que el p opio in e O ange II enga capacidad
quelan e (Capí ulo 9).
iii) Es udio económico de los p ocesos de oxidación median e MnP y
compa ación con o os p ocesos de oxidación a anzada (Anexo).
En el Capí ulo 1 se ealizó una e isión de los in es indus iales y sus
aplicaciones, así como de los dis in os p ocesos de a amien o de e luen es,
p opues os en la bibliog a ía. Más pa icula men e, se es udió la deg adación de
in es con hongos ligninolí icos y sus enzimas oxida i as, haciendo especial
hincapié en el ciclo ca alí ico de la enzima MnP. Po úl imo, se ealizó una
e isión de las dis in as con igu aciones de eac o enzimá ico, con enzima lib e o
inmo ilizada.
En el Capí ulo 2 se desc ibió el p ocedimien o de e men ación del hongo
Bje kande a sp. BOS55, así como la ob ención y a amien o del c udo
enzimá ico. Además, se desc ibie on los p ocedimien os empleados a lo la go de
odo el abajo expe imen al: análisis de la ac i idad MnP y de e minación de las
concen aciones de O ange II y los p oduc os de deg adación.
Como paso p e io al a amien o en con inuo de O ange II, se lle a on a
cabo ensayos de oxidación enzimá ica en discon inuo median e MnP, a di e en es
concen aciones iniciales de in e y di e en es elocidades de adición de H2O2,
pa a ob ene un modelo que desc ibiese el compo amien o ciné ico del p oceso
de decolo ación. Se ob u o una ecuación ciné ica que es la combinación de una
ecuación ipo Michaelis-Men en con espec o a O ange II y una unción lineal con
espec o a la elocidad de adición de H2O2 (Capí ulo 3).

Obje i os y esumen
3
La p ime a con igu ación de eac o p opues a ue un eac o de anque
agi ado asociado a una memb ana de ul a il ación pa a la sepa ación y
eci culación de la enzima (Capí ulo 4). Se es udia on di e sas es a egias de
adición de enzima y el e ec o de pa áme os ales como el ni el de ac i idad
enzimá ica, la elocidad de adición de H2O2, el ipo de ácido o gánico o el iempo
de esidencia hid áulico. El obje i o ue maximiza la e icacia del sis ema, que
alcanzó un alo 16 eces supe io al ob enido en los ensayos p e ios en
discon inuo, con una decolo ación supe io al 90%. Se lle a on a cabo p ocesos
de has a 18 días de du ación, en que el eac o pe maneció es able y no hubo
necesidad de cambio o limpieza de la memb ana. Po úl imo, se aplicó la ecuación
ciné ica ob enida en el Capí ulo 3 a los ensayos ealizados, ob eniendo un buen
ajus e en e los da os expe imen ales y los da os simulados, an o en es ado
es aciona io como no es aciona io.
Se analizó una segunda es a egia de deg adación en con inuo de O ange II
median e enzima inmo ilizada. Pa a ello, se es udia on di e sas posibilidades
pa a la inmo ilización de MnP, median e enlaces iónicos y co alen es en e la
enzima y el sopo e de inmo ilización (Capí ulo 5). Un sopo e de aga osa
ac i ado con g upos glu a aldehido pa a la unión co alen e con la enzima dio
luga a un de i ado es able, con una e ención enzimá ica del 100%, aunque el
p oceso de inmo ilización se ealiza a condiciones se e as que disminuyen la
ac i idad enzimá ica en un 50%. El p oblema de la in e acción en e el in e y el
sopo e se sol en ó en los ensayos en con inuo. Se ope ó un eac o de anque
agi ado en que la enzima se e u o po medio de un pequeño il o de pun a de
pipe a (Capí ulo 6). El in e se adso bió en el sopo e has a que es e se sa u ó; a
pa i de ese momen o, la eliminación de in e en el eac o ue debida a la
deg adación enzimá ica. La e icacia del sis ema se op imizó en unción de dos
ac o es: el sopo e y la enzima. Se maximizó la can idad de enzima inmo ilizada
en el sopo e y se minimizó el consumo de enzima median e la modi icación de
las condiciones de ope ación (TRH y ca ga de O ange II en la alimen ación). Se
alcanzó una decolo ación supe io al 80% con una e icacia lige amen e mayo que
la ob enida en el eac o de memb ana en las mismas condiciones. Po úl imo, se
modi icó la ecuación ciné ica p opues a en el Capí ulo 3 y se aplicó a los ensayos
con enzima inmo ilizada, ob eniéndose un ajus e co ec o en e los da os
expe imen ales y simulados.
Obje i os y esumen
4
En el Capí ulo 7 se de e minó, median e RMN y HPLC, el mecanismo de
deg adación enzimá ica del in e O ange II, con el obje i o de conoce los
p oduc os de deg adación y es udia la oxicidad de los mismos. Se iden i ica on 9
compues os, de los cuales 2 no se habían iden i icado con an e io idad (4-diazonio
bencenosul ona o y 2-na ol). Es o pe mi ió conside a es u as dis in as de
deg adación de O ange II, dos de ellas basadas en una up u a asimé ica del
enlace azo y la e ce a basada en la up u a simé ica. Los compues os gene ados
suponen un 30% de la concen ación de in e de pa ida, lo que indica la exis encia
de o as u as o la deg adación de los p oduc os iden i icados. La deg adación
enzimá ica de O ange II pe mi e la disminución de la oxicidad o iginal.
El e luen e de la deg adación enzimá ica de O ange II se puede a a en una
plan a depu ado a con encional con el obje i o de elimina el in e esidual y los
compues os p oceden es de la oxidación enzimá ica, que apo an DQO y colo . En
el Capí ulo 8 se es udió el pos a amien o anae obio y ae obio del e luen e del
p oceso enzimá ico. En ambos p ocesos se eliminó un 30% de la DQO, aunque a
di e encia del p oceso anae obio, en el ae obio no hubo eliminación de colo . La
oxicidad se inc emen ó en el p oceso anae obio, aunque en alo es muy alejados
de aquellos pa a los cuales un e luen e se conside a óxico.
La capacidad de la enzima MnP pa a deg ada O ange II en ausencia de
compues os quelan es que es abilicen el Mn3+ gene ado en el ciclo ca alí ico hizo
pensa la posibilidad de que el p opio in e enga e ec o quelan e. En el Capí ulo 9
se es udió po ol ame ía cíclica la capacidad de a ios ácidos ca boxílicos pa a
compleja el ion Mn3+, se es ableció un o den de ene gía ela i a de quelación y se
ob u ie on e idencias de que el in e O ange II iene cie a acción quelan e sob e
el Mn3+. Así, no es necesa ia la p esencia de un compues o quelan e pa a ealiza
la deg adación de O ange II median e MnP.
Po úl imo, se ealizó un es udio pa a compa a económicamen e los
p ocesos de deg adación enzimá ica de compues os ecalci an es con o os
p ocesos de oxidación a anzada y analiza en conjun o la mejo al e na i a pa a la
deg adación enzimá ica de compues os (Anexo). Se u o en cuen a p incipalmen e
el cos e de p oducción de la enzima, pues es el ac o más ele an e del p oceso.
Los esul ados indica on que los cos es de ope ación del eac o enzimá ico de
memb ana se si úan en el ango de los p ocesos de oxidación a anzada.
Obxec i os e esumo
5
Obxec i os e esumo
Os e luen es xe ados nas indus ias éx iles con eñen unha acción
signi ica i a de inguidu as, que, po adxun a unha in ensa co , non poden se
e idas ós cauces na u ais. Es as inguidu as son de di ícil a amen o, pois os
p ocesos biolóxicos ae obios con encionais p ac icamen e non son capaces de
deg adalas, men es que median e os p ocesos anae obios xé anse aminas
a omá icas de po encial ca ác e cance íxeno. Nes e aballo p oponse, como
al e na i a, a deg adación de inguidu as median e as encimas oxida i as de
ungos ligninolí icos e, en pa icula , a encima manganeso pe oxidasa (MnP).
O obxec i o global des e aballo é o desen olo de ecnoloxías a anzadas
pa a o a amen o en con inuo de compos os xenobió icos, baseadas en p ocesos
de oxidación enzimá ica in i o. Conside ouse a inguidu a azo O ange II como
compos o modelo, xa que polo seu ca ác e azo pode se ep esen a i a dun
ele ado núme o de inguidu as emp egadas na indus ia éx il. Pa a a consecución
des e obxec i o p opóñense unha se ie de obxec i os especí icos:
i) Desen olo dun eac o encimá ico de memb ana pa a a deg adación en
con inuo de O ange II median e MnP. Maximización da e icacia (de inida
como a can idade de inguidu a deg adada po unidade de encima
consumida) e es udio da es abilidade do sis ema (Capí ulo 4).
ii) Es udio da inmobilización da encima MnP. Ob ención dun sopo e de
inmobilización que pe mi a unha boa capacidade de e ención da encima,
baixa pe da de ac i idade enzimá ica du an e o p oceso de inmobilización,
al a es abilidade da encima inmobilizada, baixa in e acción en e a
inguidu a e o sopo e e baixo cus o (Capí ulo 5).
iii) Desen olo dun eac o en con inuo de anque axi ado pa a a deg adación de
O ange II median e MnP inmobilizada. Maximización da e icacia median e
a minimización do consumo de sopo e e encima (Capí ulo 6).
Obxec i os e esumo
6
i ) Ob ención, a pa i es do p oceso en descon inuo, dun modelo ciné ico que
pe mi a o deseño de eac o es, a simulación de p ocesos en con inuo e a
op imización das condicións de ope ación (Capí ulos 3, 4 e 6).
) Iden i icación do mecanismo de deg adación encimá ica da inguidu a
O ange II e cuan i icación dos p oduc os in e medios e inais, pa a a alia a
oxicidade do e luen e xe ado (Capí ulo 7).
i) Es udio do pos a amen o de O ange II, median e p ocesos anae obios e
ae obios, pa a de e mina cal dos p ocesos bac e ianos é máis axei ado pa a
o a amen o do e luen e da deg adación encimá ica (Capí ulo 8).
ii) Es udio da ene xía ela i a de quelación de Mn3+ po dis in os ácidos e
análise da posibilidade de que a p opia inguidu a O ange II eña capacidade
quelan e (Capí ulo 9).
iii) Es udio económico dos p ocesos de oxidación median e MnP e compa ación
con ou os p ocesos de oxidación a anzada (Anexo).
No Capí ulo 1 ealizouse unha e isión das inguidu as indus iais e as súas
aplicacións, así como dos dis in os p ocesos de a amen o de e luen es p opos os
na bibliog a ía. Máis pa icula men e, es udiouse a deg adación de inguidu as
con ungos ligninolí icos e as súas encimas oxida i as, acendo especial incapé
no ciclo ca alí ico da encima MnP. Po úl imo, ealizouse unha e isión das
dis in as con igu acións de eac o encimá ico, con encima lib e ou inmobilizada.
No Capí ulo 2 desc ibiuse o p ocedemen o de e men ación do ungo
Bje kande a sp. BOS55, así como a ob ención e a amen o do c udo encimá ico.
Ademais, desc ibí onse odos os p ocedemen os emp egados ó longo de odo o
aballo expe imen al: análise da ac i idade MnP e de e minación das
concen acións de O ange II e os p oduc os de deg adación.
Como paso p e io ó a amen o en con inuo de O ange II, le á onse a cabo
ensaios de oxidación enzimá ica en descon inuo median e MnP, a di e en es
concen acións iniciais de inguidu a e di e en es elocidades de adición de H2O2,
pa a ob e un modelo que desc ibise o compo amen o ciné ico do p oceso de
deg adación. Ob í ose unha ecuación ciné ica que é a combinación dunha
ecuación ipo Michaelis-Men en con espec o a O ange II e unha unción lineal
con espec o á elocidade de adición de H2O2 (Capí ulo 3).
Obxec i os e esumo
7
A p imei a con igu ación de eac o p opos a oi un eac o de anque
axi ado asociado a unha memb ana de ul a il ación pa a a sepa ación e
eci culación da encima (Capí ulo 4). Es udiá onse di e sas es a exias de adición
de encima e o e ec o de pa áme os como o ni el de ac i idade encimá ica, a
elocidade de adición de H2O2, o ipo de ácido o gánico ou o empo de esidencia
hid áulico. O obxec i o oi maximiza a e icacia do sis ema, que acadou un alo
16 eces supe io ó ob ido nos ensaios p e ios en descon inuo, cunha eliminación
de co supe io ó 90%. Le á onse a cabo p ocesos de a a 18 días de du ación, en
que o eac o pe maneceu es able y non houbo necesidade de cambio ou limpeza
da memb ana. Po úl imo, aplicouse a ecuación ciné ica ob ida no Capí ulo 3 ós
ensaios ealizados, ob endo un bo axus e en e os da os expe imen ais e os da os
simulados, an o en es ado es aciona io como non es aciona io.
Analizouse unha segunda es a exia de deg adación en con inuo de O ange
II median e encima inmobilizada. Pa a iso, es udiá onse di e sas posibilidades
pa a a inmobilización de MnP, median e enlaces iónicos e co alen es en e a
encima e o sopo e de inmobilización (Capí ulo 5). Un sopo e de aga osa
ac i ado con g upos glu a aldehido pa a a unión co alen e coa encima deu luga a
un de i ado es able, cunha e ención encimá ica do 100%, aínda que o p oceso de
inmobilización ealízase a condicións se e as que diminúen a ac i idade
encimá ica nun 50%. O p oblema da in e acción en e a inguidu a e o sopo e
eliminouse nos ensaios en con inuo. Ope ouse un eac o de anque axi ado no que
a encima se e i o po medio dun pequeno il o de pun a de pipe a (Capí ulo 6).
A inguidu a adso beuse no sopo e a a que es e se sa u ou; a pa i es dese
momen o, a eliminación de inguidu a no eac o oi debida á deg adación
encimá ica. A e icacia do sis ema op imizouse en unción de dous ac o es: o
sopo e e a encima. Maximizouse a can idade de encima inmobilizada no sopo e
e minimizouse o consumo de encima median e a modi icación das condicións de
ope ación (TRH e ca ga de O ange II na alimen ación). Acadouse unha
eliminación de co supe io ó 80% cunha e icacia lixei amen e maio que a ob ida
no eac o de memb ana nas mesmas condicións. Po úl imo, modi icouse a
ecuación ciné ica p opos a no Capí ulo 3 e aplicouse ós ensaios con encima
inmobilizada, ob éndose un axus e co ec o en e os da os expe imen ais e os
simulados.
No Capí ulo 7 de e minouse, median e RMN e HPLC, o mecanismo de
deg adación encimá ica da inguidu a O ange II, co obxec i o de coñece os

Obxec i os e esumo
8
p oduc os de deg adación e es udia a oxicidade dos mesmos. Iden i icá onse 9
compos os, dos cales 2 non se iden i ica an con an e io idade (4-diazonio
bencenosul ona o e 2-na ol). Es o pe mi iu conside a es u as dis in as de
deg adación de O ange II, dúas delas baseadas nunha up u a asimé ica do enlace
azo e a e cei a baseada na up u a simé ica. Os compos os xe ados supoñen un
30% da concen ación de inguidu a de pa ida, o que indica a exis encia dou as
u as ou a deg adación dos p oduc os iden i icados. A deg adación encimá ica de
O ange II pe mi e a diminución da oxicidade o ixinal.
O e luen e da deg adación encimá ica de O ange II pódese a a nunha
plan a depu ado a con encional co obxec i o de elimina a inguidu a esidual e
os compos os p oceden es da oxidación encimá ica, que apo an DQO e co . No
Capí ulo 8 es udiouse o pos a amen o anae obio e ae obio do e luen e do p oceso
encimá ico. En ambos p ocesos eliminouse un 30% da DQO, aínda que, a
di e encia do p oceso anae obio, no ae obio non houbo eliminación de co . A
oxicidade inc emen ouse no p oceso anae obio, aínda que en alo es moi lonxe
daqueles pa a os cales un e luen e considé ase óxico.
A capacidade da encima MnP pa a deg ada O ange II en ausencia de
compos os quelan es que es abilicen o Mn3+ xe ado no ciclo ca alí ico ixo pensa
a posibilidade de que a p opia inguidu a eña e ec o quelan e. No Capí ulo 9
es udiouse po ol ame ía cíclica a capacidade de a ios ácidos ca boxílicos pa a
complexa o ión Mn3+, es ableceuse unha o de de ene xía ela i a de quelación e
ob i é onse e idencias de que O ange II en ce a acción quelan e sob e o Mn3+.
Así, non é necesa ia a p esencia dun compos o quelan e pa a ealiza a
deg adación de O ange II median e MnP.
Po úl imo, ealizouse un es udio pa a compa a economicamen e os
p ocesos de deg adación encimá ica de compos os ecalci an es con ou os
p ocesos de oxidación a anzada e analiza en conxun o a mello al e na i a pa a a
deg adación encimá ica de compos os (Anexo). Tí ose en con a p incipalmen e o
cus e de p oducción da encima, pois é o ac o máis ele an e do p oceso. Os
esul ados indica on que os cus es de ope ación do eac o encimá ico de
memb ana si úanse no ango dos p ocesos de oxidación a anzada.
Objec i es and abs ac
9
Objec i es and abs ac
The e luen s gene a ed in ex ile indus ies p esen a signi ican
concen a ion o dyes, which canno be disposed in o he na u al s eams due o
hei high colo . These dyes a e e y di icul o be ea ed, as he con en ional
ae obic biological p ocesses can ha dly deg ade hem, whe eas po en ial
ca cinogenic a oma ic amines a e gene a ed du ing he anae obic p ocesses. In
his wo k, an al e na i e is p esen ed, based on he deg ada ion o dyes by he
oxida i e enzymes om whi e- o ungi, and especially he enzyme manganese
pe oxidase (MnP).
The main objec i e o his wo k is he de elopmen o ad anced
echnologies o he con inuous ea men o xenobio ic compounds, based on in
i o enzyma ic oxida ion p ocesses. The dye O ange II is conside ed as a model
compound, since i s azo bound can be ep esen a i e o a high numbe o he dyes
used in he ex ile indus y. Some speci ic objec i es a e p oposed o his aim:
i) De elopmen o an enzyma ic memb ane eac o o he con inuous
deg ada ion o O ange II by MnP. Maximiza ion o he e iciency (de ined as
he amoun o dye deg aded pe uni o enzyma ic ac i i y consumed) and
s udy o he s abili y o he sys em (Chap e 4).
ii) S udy o he MnP immobiliza ion. De elopmen o an immobiliza ion
suppo which allows a good enzyme e en ion capaci y, a low ac i i y loss
du ing he immobiliza ion p ocess, a high s abili y o he immobilized
enzyme, a low in e ac ion be ween he dye and he suppo and a low cos
(Chap e 5).
iii) De elopmen o a con inuous s i ed ank eac o o he deg ada ion o
O ange II by immobilized MnP. Maximiza ion o he e iciency by means o
he minimiza ion o bo h he suppo and he enzyme consump ion (Chap e
6).
i ) Es ablishmen o a kine ic model by means o he assays pe o med in a
discon inuous ope a ion. Applica ion o he model o eac o design,
Objec i es and abs ac
10
simula ion o con inuous ope a ion and op imiza ion o he ope a ion
condi ions (Chap e s 3, 4 and 6).
) Iden i ica ion o he enzyma ic deg ada ion mechanism o O ange II,
quan i ica ion o he in e media es and inal p oduc s and e alua ion o he
gene a ed e luen oxici y (Chap e 7).
i) S udy o he O ange II pos ea men , by bo h anae obic and ae obic
p ocesses, aiming o de e mine he mos adequa e biological p ocess o he
ea men o he enzyma ic deg ada ion e luen (Chap e 8).
ii) S udy o he ela i e Mn3+ chela ing ene gy o di e en acids and analysis o
he possible chela ing capaci y o O ange II (Chap e 9).
iii) Economic s udy o he MnP oxida ion p ocesses and compa ison wi h o he
ad anced oxida ion p ocesses (Appendix).
In Chap e 1, a e ision o he di e en indus ial dyes, hei applica ions
and p ocesses o he ea men o e luen s p oposed in he bibliog aphy was
ca ied ou . Speci ically, dye deg ada ion by whi e- o ungi and hei oxida i e
enzymes was e alua ed, wi h special emphasis on he ca aly ic cycle o MnP.
Finally, a e ision o he di e en con igu a ions o enzyma ic eac o s wi h ee
and immobilized enzymes was conside ed.
In Chap e 2, bo h he e men a ion p ocess o he ungus Bje kande a sp.
BOS55 and he ea men o he enzyma ic c ude ob ained we e desc ibed.
Mo eo e , a desc ip ion o he expe imen al p ocedu es applied was made:
de e mina ions o MnP ac i i y and he concen a ions o O ange II and ela ed
deg ada ion p oduc s.
As a p e ious s ep o he con inuous ea men o O ange II, discon inuous
assays by MnP we e pe o med, wi h di e en ini ial dye concen a ions and
di e en H2O2 addi ion a es, aiming o ob ain a model ha could desc ibe he
kine ic beha iou o he decolo iza ion p ocess. A kine ic equa ion was ob ained
as a combina ion o a Michaelis-Men en equa ion ela ed o O ange II and a linea
unc ion ela ed o he H2O2 addi ion a e (Chap e 3).
The i s eac o con igu a ion p oposed is a s i ed ank eac o coupled o
an ul a il a ion memb ane o he e en ion and ecycling o he enzyme (Chap e
4). Some s a egies o he enzyme addi ion and he e ec o pa ame e s such as
enzyma ic ac i i y, H2O2 addi ion a e, o ganic acid and hyd aulic e en ion ime
Objec i es and abs ac
11
we e s udied. The objec i e was o maximize he e iciency o he sys em, which
eached a le el ha was 16- old he one ob ained in he p e ious discon inuous
assays, wi h a decolo iza ion highe han 90%. A 18-day p ocess was ca ied ou ,
and he eac o was s able and he memb ane was no changed o cleaned. Finally,
he kine ic equa ion ha had been ob ained in Chap e 3 was applied o he
con inuous assays pe o med, ob aining a good adjus men be ween he
expe imen al and simula ed da a, in bo h s a iona y and non-s a iona y s a es.
A second s a egy o he con inuous deg ada ion o O ange II was s udied,
using immobilized enzyme. Wi h his pu pose, some possibili ies o MnP
immobiliza ion we e analyzed, by means o ionic o co alen bonds be ween he
enzyme and he suppo (Chap e 5). An aga ose suppo ac i a ed wi h
glu a aldehyde g oups o he co alen a achmen wi h he enzyme ga e a s able
de i a i e, wi h an enzyma ic e en ion o 100%, al hough he immobiliza ion
p ocess was pe o med unde s ong condi ions ha diminish he enzyma ic
ac i i y abou 50%. The p oblem o he in e ac ion be ween he dye and he
suppo was o e come in he con inuous ope a ion. A s i ed ank eac o whe e a
small il e e ained he immobilized enzyme in o he essel was ope a ed
(Chap e 6). The dye was adso bed in o he suppo ill sa u a ion; he ea e , he
emo al o dye was due o he enzyma ic deg ada ion. The e iciency o he
sys em was op imized by means o he modi ica ion o wo ac o s: he suppo
and he enzyme. The amoun o enzyme immobilized on o he suppo was
maximized and he enzyme consump ion was minimized by he a ia ion o he
ope a ional condi ions (HRT and O ange II loading a e). The sys em eached a
decolo iza ion highe han 80% and an e iciency highe han ha ob ained in he
enzyma ic memb ane eac o wi h he same condi ions. Finally, he kine ic
equa ion p oposed in Chap e 3 was modi ied and applied o he assays wi h
immobilized enzyme, ob aining a co ec adjus men be ween he expe imen al
and simula ed da a.
In Chap e 7, he mechanism o he enzyma ic deg ada ion o he dye
O ange II was s udied by NMR and HPLC, aiming o know he deg ada ion
p oduc s and s udy hei oxici y. Nine compounds we e iden i ied: wo o hem
had no been iden i ied be o e (4-diazonium benzenesul ona e and 2-naph ol).
Ha ing hese p oduc s in mind, h ee deg ada ion pa hways we e conside ed: wo
o hem we e based on he asymme ic clea age o he azo bond and he hi d one
was based on he symme ic clea age. The compounds gene a ed accoun ed o
Capí ulo 1
18
NN
Azo
O
O
Ca bonilo
N
N
NN
N N
HH
N
N
F alocianina
R N
2
NR
2
+
Ion a ilca bonio
N
SS
S
O
SR
N
S
O
SR
R
R
RR
Sul u o
R
R
n=0,1,2,...
N
R
R
..
+
N
n
Polime ino
O N
2
2
NO
NO
OH
2
Ni o
Figu a 1.1. Es uc u a de las dis in as clases de in es empleados en la indus ia ex il
Según el modo de aplicación
Dado que la aplicación más común de los in es indus iales es la inción de
ib as en la indus ia ex il, se ha desa ollado una clasi icación de los in es en
unción de su mé odo de aplicación. La o ma de ijación de la molécula de
colo an e a la ib a se ealiza gene almen e en disolución acuosa median e alguna
de las siguien es in e acciones: uniones iónicas, puen es de hid ógeno, ue zas de
Van de Waals o enlaces co alen es. La Tabla 1.2 mues a la clasi icación de los
in es en unción del modo de aplicación a la ib a, así como las ib as a las cuales
se aplican (Wa ing & Hallas, 1990; Gua a ini & Zanoni, 2000).

In oducción
19
Tabla 1.2. Clasi icación de los in es en unción del mé odo de aplicación a las ib as
Clase de in e Desc ipción Tipo de enlace Aplicación
Ácido
Mo dien e
P eme alizado
Di ec o
Reac i o
De ina
Dispe so
Básico
Aniónico con
g upos sul ónicos
Requie e me ales
mo dien es
Complejos con
iones me álicos
Más de un g upo
azo
G upo elec o ílico
eac i o
Insoluble, se educe
y oxida sob e la
ib a
Insoluble, se
hid oliza y p ecipi a
sob e la ib a
Ca iónico
In e acción iónica
In e acción iónica
In e acción iónica
Van de Waals
Enlace co alen e
In e acción iónica
In e acción iónica
In e acción iónica
Lana, seda,
poliamida
Lana, seda
Lana, seda,
poliamida
Algodón
Algodón, lana,
seda, poliamida
Algodón, iscosa
Celulosa, nylon,
poliés e
Poliés e , ac ílicos
Los in es eac i os son los más u ilizados en la indus ia ex il, debido a la
o aleza del enlace co alen e, que los hace pe sis en es y les con ie e buenas
p opiedades de solidez al la ado. Es os in es se in oduje on come cialmen e pa a
su aplicación a ib as de celulosa, aunque en la ac ualidad ambién se aplican a
ib as de p o eína, poliamida o poliés e .
2. Impac o ambien al de los e luen es colo eados
Aunque la indus ia de la ab icación de in es ep esen a una pa e
ela i amen e pequeña de la indus ia química, es impo an e el impac o ambien al
que p oducen los e luen es que se gene an. El a amien o de es os e luen es iene
de e minado po una se ie de ca ac e ís icas de la indus ia de los colo an es:
Capí ulo 1
20
i) P oducción: En el mundo exis en más de 100.000 in es disponibles
come cialmen e (Ki by e al., 1995; Robinson e al., 2001) con una
p oducción de más de 7·105 /año (Meye , 1981; Zollinge , 1987).
ii) Va iabilidad de in es: Un 90% de los in es se come cializan en can idades
in e io es a 100 /año y sólo un 1% lo hacen en can idades mayo es de 1.000
/año (Rei e & F eeman, 1996; O´Neill e al., 1999).
iii) Resis encia: La exigencia ac ual de la indus ia ex il adica en la búsqueda
de in es con es abilidad química y o olí ica cada ez más ele adas. Se
diseñan in es esis en es a la up u a debida a la exposición a la luz, agua,
jabones o lejías.
i ) Al o consumo de agua: La inción es un p oceso húmedo, en el que se
consumen 160 kg de agua/kg de p oduc o acabado. El olumen de e luen e
ep esen a un 90-95% del agua u ilizada (Blánquez, 2005).
) Ele adas pé didas: Sob e un 2% de la p oducción mundial de in es se
pie de en el e luen e en p ocesos de ab icación (O´Neill e al., 1999),
mien as que un 10-15% se pie de en los p ocesos de inción, como
consecuencia de la incomple a ijación de los colo an es a las ib as. Es e
po cen aje ep esen a la desca ga de 200 /d de es os compues os al medio
ambien e (Gua a ini & Zanoni, 2000). Es e po cen aje depende en g an
medida del ipo de in e y ib a que pa icipan en la inción, alcanzando
alo es desde 5% pa a in es básicos has a 50% pa a in es eac i os
(McMullan e al., 2001).
i) Al amen e isible: Valo es del o den de mg/L de in e en las aguas son
isibles pa a el ojo humano. Pa a algunas clases de in es ese alo
disminuye a 0,005 mg/L en un cauce limpio (Gu ié ez & C espi, 1999a).
ii) Va iabilidad en la ca ac e ización de las aguas: En unción del ipo de in e
aplicado, la ib a sob e la que se aplica y las dis in as e apas en el p oceso de
inción, las aguas gene adas p esen an ca ac e ís icas muy di e en es en
cuan o a DQO, DBO, colo , sólidos, C, N, P o sales (Vande i e e e al.,
1998; Bisschops & Spanje s, 2003).
Todas es as ca ac e ís icas hacen que el e ido de e luen es de la indus ia
ex il se haya con e ido en un p oblema ecológico y oxicológico a ni el
mundial.
In oducción
21
2.1. E ec os ecológicos
La baja solubilidad de los pigmen os pe mi e que es os sean mucho más
áciles de elimina de las aguas po a amien os ísico-químicos. Sin emba go, los
in es p esen an al a solubilidad, la cual se e a o ecida po la p esencia de
de e minados g upos, ales como los sul ónicos. El p ime e ec o que causa el
e ido de aguas esiduales con in es disuel os es el isual (Figu a 1.2) y se
p esen a a concen aciones muy bajas de in e. El hecho de ans o ma el en o no
de cauces na u ales es un aspec o nega i o que debe se sol en ado. El uso de esas
aguas ya queda limi ado, no siendo ap as pa a el consumo humano.
Figu a 1.2. E ec o isual del e ido de e luen es colo eados sob e íos
El p incipal p oblema ambien al de i ado del apo e de colo a las aguas de
los íos y lagos se debe a la educción de la anspa encia y la disminución del
oxígeno disuel o, debido a que al as ca gas de colo di icul an la unción
o osin é ica de las plan as.
Adicionalmen e algunos p oblemas asociados a los e luen es ex iles son
debidos a la p esencia de me ales pesados o azu e, que p oducen p oblemas
ambien ales debido a su na u aleza óxica.
Capí ulo 1
22
2.2. E ec os oxicológicos
Los iesgos oxicológicos de los in es sob e la salud humana es án
elacionados con el modo y iempo de exposición. Es os compues os p esen an
una baja oxicidad aguda, que es la esul an e de los iempos de exposición co os.
Es o es debido a que los in es ienen una baja solubilidad en luidos co po ales
(Ch is ie, 2003) y una al a solubilidad en agua, de mane a que es os compues os
suminis ados o almen e son me abolizados en la mic o lo a in es inal y
exc e ados más ápidamen e que los compues os menos solubles (Gua a ini &
Zanoni, 2000). Es os compues os únicamen e p oducen e ec os de poca g a edad,
ales como de ma i is de con ac o o sensibilización espi a o ia.
La oxicidad c ónica debida a exposición con inuada a los in es es baja. Se
ha comp obado que algunos in es de na u aleza azoica p esen an un ca ác e
cance ígeno po encial, y al menos 3.000 colo an es azo come ciales han sido
ca alogados como cance ígenos (Gua a ini & Zanoni, 2000). Su oxicidad adica
en que pueden da luga a las aminas a omá icas de las cuales de i an, debido a
p ocesos de oxidación, hid ólisis o educción del enlace azo. Algunas aminas
a omá icas u ilizadas en la ab icación de los in es son ca cinógenos econocidos
(Weisbu ge , 2002).
Aun así, el análisis del g ado de oxicidad de los in es, medido a pa i de
50% de la dosis le al (LD50) ha demos ado que apenas un núme o educido de
in es p esen a oxicidad aguda (LD50<5 g/kg) y son p incipalmen e in es bis-azo
y básicos (Sho e, 1996).
2.3. Minimización de los impac os
La legislación se es á haciendo cada día más es ic a en la mayo pa e de los
países desa ollados en cuan o a la eliminación de in es de los e luen es ex iles,
lo que se es á con i iendo en un p oblema c ecien e pa a es a indus ia. La
minimización de los impac os causados po es e ipo de e luen es pasa po la
p e ención de la con aminación y la eu ilización del agua y los compues os de
los e luen es gene ados.
P e ención de la con aminación
Exis en una se ie de écnicas de p e ención de la con aminación, es deci , de
educción de la con aminación desde la uen e de o igen, ales como:
In oducción
23
i) Modi icación del p oceso: Los cambios e ec uados en el p oceso y la
implemen ación de ecnología nue a pa a lle a lo a cabo cons i uyen
modi icaciones a las ope aciones básicas de una plan a. Algunas educen el
uso del agua y eliminan o minimizan la desca ga de compues os químicos
óxicos o muy ue es. O as se basan en la ecupe ación de subs ancias y el
ap o echamien o de ene gía. El p ocedimien o con disol en es o las
ope aciones en con inuo son algunos ejemplos.
ii) Aho o del agua de p oceso: La minimización del consumo de agua en las
plan as ex iles da luga a un aho o en los cos es y pe mi e una mejo
ges ión de la con aminación a a és de la educción en o igen.
iii) Subs i ución de compues os químicos: En muchos casos es posible educi la
can idad de compues os químicos u ilizados en el p ocesamien o ex il sin
que ello p oduzca un e ec o signi ica i o en la calidad del p oduc o. O a
solución es la subs i ución de los compues os químicos más con aminan es
po o os con meno oxicidad.
3. Tecnologías pa a el a amien o de e luen es colo eados
El desa ollo de la ecnología adecuada pa a el a amien o de e luen es
ex iles es obje o de g an in e és en los úl imos años debido a un aumen o de la
men alización y la igidez de la eglamen ación ambien al. Las p incipales
écnicas disponibles pa a la decolo ación de es e ipo de aguas se pueden ag upa
en es g andes g upos: a amien os químicos, ísicos y biológicos (Vande i e e
e al., 1998; Robinson e al., 2001; Fo gacs e al., 2004).
3.1. T a amien os químicos
Reac i o de Fen on
El eac i o de Fen on es una combinación de H2O2 y sales de Fe(II). El ion
e oso se oxida a é ico mien as el H2O2 p oduce iones hid óxido y adicales
hid oxilo. Es os úl imos oxidan el in e, y el compues o o mado p ecipi a con el
ion é ico y compues os o gánicos (Lin & Peng, 1995). Con es e mé odo se
consiguen al as elocidades de decolo ación si las concen aciones de los
eac i os implicados son ele adas (Kuo, 1992). Sin emba go, sus p incipales
des en ajas son la gene ación de lodos debida a la loculación de los eac i os con

Capí ulo 1
24
el in e, el cos e de los lodos o mados y el cos e de los eac i os. E en ualmen e
debe á elimina se ambién el hie o empleado (Gu ié ez & C espi, 1999a).
Ozonización
Las écnicas de ozonización consis en en la des ucción de compues os en
base a la ele ada capacidad oxida i a del ozono. La eacción de oxidación es
ápida, se pueden a a al os caudales, no se gene an esiduos ni lodos y se
ob iene un e luen e incolo o y con baja DQO, de mane a que es ap o pa a su
e ido al medio ambien e (Ince & Gonenc, 1997). Sin emba go debe
comp oba se la oxicidad de cada e luen e conc e o, pues en algunos casos los
compues os gene ados ienen mayo ca ác e óxico que los colo an es de pa ida
(Gu ié ez & C espi, 1999a). O a g an des en aja de la ozonización es su co o
iempo de ida media, ap oximadamen e de 20 min, lo cual epe cu e ue emen e
en el cos e del p oceso (Robinson e al., 2001).
Oxidación o oquímica
Es e mé odo se basa en la combinación de la adiación UV con o os
compues os, ales como H2O2 o ca alizado es como TiO2, de mane a que los ayos
UV ac i an dichos compues os y los hacen capaces de oxida los in es. Es e
mé odo p esen a una ele ada e icacia y no gene a lodos ni olo es. Sin emba go las
necesidades de una uen e de adiación, el cos e, la len i ud del p oceso y las
di icul ades de implemen ación a g an escala hacen que es e mé odo sea poco
e ec i o a ni el indus ial (Kunz e al., 2002).
Oxidación elec oquímica
Los p ocesos elec oquímicos se basan en la hid ólisis del colo an e
median e un po encial o co ien e con olada o a a és de agen es secunda ios
gene ados elec olí icamen e. Los p ocesos son limpios, ope an a baja empe a u a
y en muchos casos no equie en la adición de p oduc os químicos a las aguas
esiduales (Ochoa, 1995). El al o consumo de ene gía y la gene ación de
compues os secunda ios po eacciones pa alelas disminuyen la po encialidad del
mé odo (Gua a ini & Zanoni, 2000).
In oducción
25
O os p ocesos químicos
Se han p opues o o os muchos mé odos de eliminación de colo an es de las
aguas, ya sean basados en p ocesos oxida i os con NaOCl (Chang e al., 1996) o
median e la o mación de complejos insolubles con ligandos (Buschmann, 1992).
3.2. T a amien os ísicos
Adso ción
La e icacia del p oceso de adso ción es á in luenciada po una g an a iedad
de pa áme os, en e ellos la in e acción en e el in e y el sopo e, supe icie
especí ica, amaño de la pa ícula, empe a u a, pH o iempo de con ac o (Kuma
e al., 1998). La e icacia del mé odo depende en g an medida del ipo de sopo e
elegido. Se emplean an o sopo es ino gánicos como o gánicos. Los p ime os
ienen una g an es abilidad mecánica y química, al a supe icie especí ica y al a
esis encia a la deg adación mic obiana. Los sopo es o gánicos se gene an a
pa i de uen es eno ables o son esiduos indus iales. Los p ocesos de
adso ción gene an e luen es de al a calidad, pe o ienen una se ie de des en ajas
que los hace ine icaces pa a el a amien o de e luen es colo eados: son p ocesos
len os; no selec i os, de mane a que hay una compe ición en e las moléculas de
in e y o os compues os p esen es en el e luen e; no des uc i os, gene ándose un
esiduo que debe se eliminado; la deso ción es un p oceso muy di ícil y cos oso;
los adso ben es suelen se ca os y en ocasiones equie en un p oceso de
ac i ación p e io (Fo gacs e al., 2004).
Memb anas de il ación
Los mé odos de a amien o basados en el empleo de memb anas pe mi en
una sepa ación e ec i a de las moléculas de colo an e y o os compues os de
amaño mayo al del po o de la memb ana seleccionada. P incipalmen e se
emplean las écnicas de ósmosis in e sa y nano il ación (Rei e & F eeman,
1996). Se log a a a g andes olúmenes de e luen e en con inuo de un modo
ápido y sa is ac o io. La gene ación de un esiduo con una al a concen ación de
con aminan e y la di icul ad y cos e de subs i ución de las memb anas son las
p incipales des en ajas de es as écnicas (Robinson e al., 2001).
Capí ulo 1
26
In e cambio iónico
El e luen e pasa a a és de las memb anas de in e cambio iónico has a su
sa u ación. La p incipal en aja de es a écnica es que no hay pé dida de
adso ben e du an e su egene ación. Sin emba go, el cos e es ele ado, los
disol en es necesa ios pa a la limpieza son ca os y es un mé odo no ap o pa a
odo ipo de in es (Sloka & Le Ma echal, 1997).
Coagulación- loculación
Los mé odos de coagulación- loculación se basan en la adición de
polielec oli os o loculan es ino gánicos (sales de hie o o aluminio), que o man
lóculos con las moléculas de colo an e acili ando su eliminación po
sedimen ación. Las e icacias de eliminación son al as, pe o en el p oceso se
gene an lodos que deben se eliminados. Además los mejo es endimien os se
log an al aplica un exceso de coagulan e, que aumen a la concen ación de
con aminan e en el e luen e (Gah e al., 1994).
La Tabla 1.3 mues a algunas aplicaciones de los dis in os mé odos químicos
y ísicos en la eliminación de colo an es de las aguas esiduales, an o sin é icas
como eales, de la indus ia ex il.
3.3. T a amien os biológicos
La aplicación de mic oo ganismos a la deg adación de aguas que con ienen
in es sin é icos es una opción a ac i a, aunque la mayo pa e de es os
compues os son químicamen e muy es ables y esis en es al a aque mic obiano. El
es udio de a amien os biológicos pa a la biodeg adación de es os compues os
adquie e g an impo ancia po las en ajas que el mé odo p esen a: los p ocesos
son ela i amen e económicos, los cos es de ope ación son bajos y se pueden
gene a e luen es limpios as la deg adación pa cial o o al de los p oduc os
iniciales.
T a amien o bac e iano anae obio
La e icacia de los a amien os anae obios en la deg adación de in es ha sido
ampliamen e es udiada y demos ada, an o con cul i os mix os como con cepas
In oducción
27
Tabla 1.3. Aplicación de dis in os mé odos ísico-químicos al a amien o de aguas
esiduales con eniendo in es
Mé odo Tin e deg adado Re e encia
Reac i o de Fen on
Ozonización
Oxidación o oquímica
Oxidación elec oquímica
Adso ción
Memb anas il ación
In e cambio iónico
Coagulación- loculación
Tin es azo
An aquinona-sul ona o
O ange II
Tin es ácidos y eac i os
Moléculas con doble enlace
Tin es azo
Tin es eac i os
Aminoclo o izinas
Tin es eac i os
O ange II
Acid Blue 40
Aguas esiduales ex iles
Tin es eac i os
Tin es
Tin es azo
Aguas esiduales ex iles
Me hyl O ange
Tin es azo
O ange II
Tin es ácidos
Tin es ácidos
Congo ed
B illian Yellow
Po ción O ange, Congo ed
Me hylene Blue
Remazol B illian Blue
Tin es aniónicos
Aguas esiduales ex iles
Acilan Blue
Solozhenko e al., 1995
Kiwi e al., 1993
Banda a e al., 1997
Hassan & Hawkya d, 2002
Sloka & Le Ma echal, 1997
Shu & Huang, 1995
Pe al a-Zamo a e al., 1999
A slan-Ala on e al., 2004
Pe al a-Zamo a e al., 1999
Vinodgopal e al., 1996
Tang & An, 1995
Kanmani & Thanaseka an, 2003
y 2004
Peleg ini e al., 1999
Gu ié ez & C espi, 1999b
McClung & Lemley, 1994
Lin & Peng, 1996
San omán e al., 2004
Bech old e al., 2002
Jain e al., 2003
Poo s & McKay, 1976
Walke & Wea he ley, 1997
Namasi ayam & A isi, 1997
Yoshida & Takemo i, 1997
Namasi ayam e al., 1996
Dobbs e al., 1995
El-Sha kawy, 2001
Po e & Gomes, 2000
Sloka & Le Ma echal, 1997
Ogu e en e al., 1992
Capí ulo 1
34
5. T a amien o de e luen es colo eados median e enzimas
ligninolí icas
5.1. Enzimas ligninolí icas
Las p incipales enzimas ligninolí icas son oxidasas (lacasa) y pe oxidasas
(LiP y MnP). Son enzimas oxida i as que no equie en o os componen es
celula es pa a pode desa olla su unción, ienen una g an especi icidad po el
subs a o y son capaces de ans o ma una g an a iedad de compues os óxicos.
Además es as enzimas es án ácilmen e disponibles en la na u aleza y han sido
ampliamen e es udiadas a lo la go de los úl imos años como ca alizado as de
eacciones de deg adación de compues os ecalci an es (To es e al., 2003).
Ambos ipos de enzimas ligninolí icas es án glicosiladas, lo que aumen a su
es abilidad (Nie e al., 1999).
Las pe oxidasas son enzimas con un g upo hemo, que equie en la p esencia
de pe óxido de hid ógeno pa a oxida la lignina. Tienen pesos molecula es en e
35 y 47 kDa, pun os isoeléc icos en e 2,8 y 5,4 y po enciales de oxidación de
1450-1510 mV (Mes e & Tien, 2000; Wesenbe g e al., 2003). Las p incipales
pe oxidasas ligninolí icas son: LiP, que oxida compues os enólicos y no
enólicos, y MnP, que oxida compues os enólicos y emplea p e e en emen e
Mn2+ como subs a o educ o . Lacasa es una enoloxidasa que oxida enoles y
aminas a omá icas, u ilizando oxígeno molecula como oxidan e, que se educe a
agua po medio de la ans e encia de cua o elec ones. La enzima lacasa iene
pesos molecula es en e 50 y 300 kDa, pun os isoeléc icos ácidos y po enciales
de oxidación de 500-800 mV (Call & Mücke, 1997; Wesenbe g e al., 2003).
El ciclo ca alí ico de las pe oxidasas ligninolí icas es simila al de o as
pe oxidasas. La o ma é ica na i a de la enzima eacciona con una molécula de
H2O2, de mane a que se gene a el llamado compues o I, que es una o ma de la
enzima con un es ado de oxidación supe io en dos equi alen es a la o ma na i a
(Reacción 1). Du an e la oxidación de la o ma é ica, se oma un elec ón de la
o ma Fe3+ y el o o del anillo po i ínico, de mane a que se gene an Fe4+ y un
adical po i ínico. A con inuación es e compues o I se educe en dos pasos
sucesi os po medio de un subs a o, que ope a como educ o . En un p ime paso
(Reacción 2) se o ma el compues o II, que es un in e media io con un g upo Fe4+,
y la o ma adical del subs a o. En el segundo paso (Reacción 3) se p oduce la

In oducción
35
educción de la enzima a la o ma é ica na i a, y se emplea una nue a molécula
de subs a o, gene ándose po consiguien e una nue a o ma oxidada de la misma
(Nakayama & Amachi, 1999; Mes e & Tien, 2000). Las dos p ime as eacciones
(enzima na i a y compues o I) son ápidas, mien as que la eacción del
compues o II suele se unas 10 eces más len a (Kuan e al., 1993). En exceso de
H2O2 el compues o II da luga a una o ma inac i a de la enzima (Reacción 4).
[
]
OH Fe(IV)· I Compues o OH é ica Enzima 2
k
22 1+⎯→⎯+ (1)
[
]
[
]
R· Fe(IV) II Compues o RH ·Fe(IV) I Compues o 2
k+⎯→⎯+ (2)
[
]
OH R· é ica Enzima RH Fe(IV) II Compues o 2
k3++⎯→⎯+ (3)
[
]
III Compues o OH Fe(IV) II Compues o 4
k
22 ⎯→⎯+ (4)
Debido a que Phane ochae e ch ysospo ium, el hongo de pod edumb e
blanca más comúnmen e es udiado, p oduce una al a ac i idad LiP, es a enzima se
conside ó adicionalmen e la más impo an e en la deg adación de la lignina. Sin
emba go, las condiciones óp imas de p oducción de LiP no son adecuadas pa a
muchos hongos de pod edumb e blanca, y especialmen e los hongos con mayo
e iciencia en la deg adación de lignina no ue on capaces de deg ada la en dichas
condiciones. Además, se encon ó que di e en es hongos ligninolí icos no
p oducen LiP, sino únicamen e MnP o lacasa. El es udio de a ias cepas
di e en es de hongos e idenció la p esencia de MnP en odas ellas, mien as que
la p oducción de LiP ue más di ícil de demos a (Ha akka, 1994). Es e hecho
cen ó el in e és en el empleo de MnP como enzima ligninolí ica adecuada pa a la
deg adación de lignina y o os compues os.
5.2. Manganeso pe oxidasa
La enzima manganeso pe oxidasa se descub ió po p ime a ez en el hongo
de pod edumb e blanca Phane ochae e ch ysospo ium (Kuwaha a e al., 1984;
Glenn & Gold, 1985; Paszczynski e al., 1985). Muchos g upos de hongos son
capaces de p oduci MnP en múl iples o mas, siendo los más comunes los de los
géne os Pleu o us (Asada e al., 1995), T ame es (Johansson & Nyman, 1993),
Phlebia (Ka hunen e al., 1990) o Bje kande a (de Jong e al., 1992).
Capí ulo 1
36
Gene almen e la enzima MnP p oceden e de un mismo hongo se p esen a en
di e en es o mas o isoenzimas, de mane a que ca alizan una misma eacción
ciné ica pe o se di e encian en el peso molecula , la ca ga o las cons an es
ciné icas, y es án codi icadas po di e en es genes. Así, se ha encon ado que el
hongo Ce ipo iopsis sub e mispo a p oduce has a 11 isoenzimas (Ho ich e ,
2002). Bje kande a adus a p oduce dos isoenzimas, con pesos molecula es de 44
kDa. T as la desglicosilación, la masa de la o ma MnP1 se edujo a 42,7 kDa, lo
que signi ica que la o ma glicosilada con iene un 3% de ca bohid a os. Los
pun os isoeléc icos pa a ambas o mas son 3,45 pa a MnP1 y 3,35 pa a MnP2
(Hein ling e al., 1998a).
La es uc u a de MnP se puede di idi en es egiones: zona dis al, egión
p óxima y si io ac i o. La egión dis al con iene una se ie de esiduos (His, A g,
Asp y Leu) que in e ienen en la eacción de la o ma na i a de la enzima con
H2O2. La egión p óxima es esponsable de la eac i idad en e a es abilidad del
g upo hemo. El esiduo enca gado de con e i es abilidad al es ado Fe4+ del g upo
hemo es His. El si io ac i o de MnP con Mn2+ se conside a que es á o mado po
un p opiona o hemo y Glu35, Glu39 y Asp179 (Mes e & Tien, 2000).
El ciclo adicional de la enzima MnP comienza median e una oxidación de
la o ma na i a po medio de una molécula de H2O2, de mane a que se gene a una
o ma oxidada de la enzima (compues o I), con un es ado de oxidación dos
ni eles supe io al de la o ma na i a, y una molécula de agua. El compues o I es
pos e io men e educido po medio de la oxidación de Mn2+, gene ándose Mn3+ y
el compues o II, en un es ado de oxidación supe io al de la enzima o iginal. Po
úl imo se p oduce una nue a educción de la enzima has a ecupe a la o ma
é ica. Es a nue a educción implica la oxidación de o o Mn2+ a Mn3+. El
compues o II, en exceso de H2O2, da luga a una o ma inac i a (compues o III).
En la Figu a 1.3 se mues a el ciclo ca alí ico de la enzima MnP.
MnP es una enzima dependien e del manganeso, pues a pesa de que an o
Mn2+ como a ios compues os enólicos pueden educi la o ma MnP I a MnP II
(Wa iishi e al., 1988), sólo Mn2+ es capaz de ealiza la educción de MnP II a la
o ma na i a MnP (Kuan e al., 1993). Cuando Mn2+ es el subs a o educ o , po
cada ciclo ca alí ico de la enzima se gene an dos o mas de Mn3+, que ac úa como
oxidan e de o os compues os, con un po encial edox de 1,5 V. El Mn3+ es un
oxidan e de pequeño amaño, po an o iene acceso a un g an núme o de
In oducción
37
Figu a 1.3. Ciclo ca alí ico de la enzima manganeso pe oxidasa
compues os que la enzima no pod ía alcanza . Sin emba go, Mn3+ es un
compues o ines able en disolución acuosa, de mane a que necesi a o ma un
complejo es able con algún ácido o gánico. Los α-hid oxiácidos ac úan quelando
el Mn3+ y de es a o ma acili an la disociación de Mn2+-MnP I (Wa iishi e al.,
1989).
La uen e de H2O2 pa a la iniciación del ciclo ca alí ico de la enzima puede
p o eni de dos o ígenes: i) la educción di ec a de O2 po medio de o as enzimas
del p opio hongo, ales como a il alcohol oxidasas (AAO) pa a Bje kande a
adus a o Pleu o us e yngii o glioxal oxidasa en el caso de Phane ochae e
ch ysospo ium (Gómez-To ibio e al., 2001); ii) median e la gene ación de
adicales supe óxido (O2•−) que p oceden de la au ooxidación de p oduc os de
eacción (Guillén e al., 1997).
MnP MnP I
MnP II
H2O2H2O
Mn2+
Mn3+
Mn2+
Mn3+
MnP III
(inac i a)
H2O2
H2O
Capí ulo 1
38
El ciclo ca alí ico de MnP ambién conlle a la gene ación de O2 como
esul ado de la ac i idad pe oxidasa sob e el Mn2+, y es debida a la oxidación
pa cial de H2O2 po pa e del Mn3+ gene ado po la enzima. La p oducción de O2
se hace más pa en e cuando hay ausencia de subs a os suscep ibles de oxidación
po pa e de Mn3+ (Ma ínez e al., 1996a).
La capacidad oxida i a de la enzima MnP se puede e inc emen ada en
p esencia de compues os que ac úen como mediado es, ales como ioles (cis eína
o glu a ion) (Wesenbe g e al., 2003) o ácidos g asos insa u ados (Tween 80)
(Mes e & Tien, 2000).
5.3. Pe oxidasa e sá il
La mayo pa e de las MnP desc i as pa ecen segui el ciclo gene al
mos ado en la Figu a 1.3, pe o hay algunas MnP que en ausencia de Mn2+
ambién oxidan compues os a omá icos enólicos ( ojo enol, 2,6-dime oxi enol)
y no enólicos (alcohol e a ílico) y ienen ac i idad oxidasa con NADH, y po
lo an o se conside an o mas híb idas en e LiP y MnP. Sin emba go la e iciencia
ca alí ica es mucho más ele ada en p esencia de Mn2+ que con subs a os
a omá icos (Hein ling e al., 1998a). Es as enzimas, a las que se les llamó
pe oxidasas e sá iles (VP), ue on desc i as en los hongos Pleu o us e yngii
(Ma ínez e al., 1996a), Bje kande a sp. BOS55 (Mes e & Field, 1998) y
Bje kande a adus a (Hein ling e al., 1998a).
La ac i idad dependien e o independien e de Mn2+ es unción en g an
medida de las condiciones de pH y de la concen ación de subs a os. La ac i idad
independien e de Mn2+ es máxima a pH 3, mien as que en p esencia de Mn2+ el
pH óp imo pa a la oxidación de subs a os es 4,5-5 (Ma ínez e al., 1996b). En
algunos casos Mn2+ ac úa como inhibido no compe i i o en la deg adación de
compues os, como ocu e en la decolo ación de Reac i e Blue 5 po MnP de P.
e yngii. Es o sugie e que es as pe oxidasas e sá iles deben de dispone de al
menos dos si ios ac i os de unión a subs a os (Hein ling e al., 1998a). De es a
mane a las pe oxidasas p oceden es de Bje kande a adus a y Pleu o us e yngii
pueden ealiza una oxidación di ec a de subs a os o una oxidación ía la
gene ación de complejos de Mn3+, que pe mi e el acceso a subs a os en que no
puede pene a la enzima. Ambas oxidaciones pueden se al e na i as o
secuenciales (Hein ling e al., 1998a). A pesa de que la ac i idad de es a enzima
puede se independien e de la p esencia de Mn2+, se man end á el nomb e de
In oducción
39
manganeso pe oxidasa debido a que Mn2+ es su mejo subs a o, que se á el
empleado en el desa ollo de es e abajo.
Las en ajas de emplea MnP p oceden e del hongo Bje kande a adus a
en e a MnP de Phane ochae e ch ysospo ium son: i) MnP iene ac i idad en
p esencia o en ausencia de Mn, aunque la a inidad a o os subs a os y la ciné ica
es meno ; ii) la esis encia en e a al as concen aciones de H2O2 es mayo
(Mielgo e al., 2003b), debido a que la enzima a il alcohol oxidasa del hongo
Bje kande a adus a p oduce concen aciones más al as de H2O2 que la enzima
glioxal oxidasa de Phane ochae e ch ysospo ium (Böckle e al., 1999).
5.4. Aplicaciones
El empleo de enzimas in i o a ni el indus ial es una p ác ica que p esen a
una se ie de en ajas con espec o al empleo de los hongos (López e al., 2002;
To es e al., 2003; Fo gacs e al., 2004):
i) Las enzimas pueden ope a bajo una a iedad de condiciones de pH, ue za
iónica o empe a u a
ii) Conside ando la posible eu ilización de la enzima, los eque imien os
enzimá icos son bajos
iii) Las enzimas se pueden man ene ac i as en p esencia de al as
concen aciones de con aminan es y de concen aciones mode adas de
disol en es o gánicos
i ) El p oceso se puede modi ica ácilmen e en unción del ca ác e de los
subs a os a deg ada
) Los pe íodos de a amien o son mucho más co os que en p esencia de
hongo
i) No exis en e asos causados po la ase de la encia de la biomasa
ii) Se educe conside ablemen e el olumen de lodos, de mane a que el impac o
ambien al es mínimo
iii) La aplicación y el con ol del p oceso son sencillos
Po o a pa e algunos de los incon enien es que conlle a el empleo de
enzimas in i o son la sensibilidad de algunas enzimas a cambios en las

Capí ulo 1
40
condiciones ambien ales, el cos e del p oceso de ob ención de las mismas y, en el
caso de las pe oxidasas, la inac i ación po H2O2. El e ec o de es as a iables
debe se es udiado en cada caso conc e o pa a minimiza el consumo de enzima y
a o ece la e icacia del p oceso.
Las enzimas ligninolí icas se han empleado adicionalmen e en p ocesos in
i o, p incipalmen e en la deg adación de compues os ecalci an es. Algunas de
es as aplicaciones se esquema izan en la Tabla 1.4. Además de es as aplicaciones,
las pe oxidasas se emplean como ca alizado es en exámenes clínicos, en
inmunoensayos enzimá icos y en análisis de quimioluminiscencia (Nakayama &
Amachi, 1999).
6. Reac o es enzimá icos
Si se p e ende desa olla un sis ema económicamen e iable, las eacciones
ca alizadas po enzimas deben conside a no sólo la sepa ación de eac i os y
p oduc os sino ambién la ecupe ación y eu ilización de la enzima (P aze es &
Cab al, 1994; Rios e al., 2004). Po medio de sis emas que pe mi an e ene la
enzima es posible la ope ación de p ocesos enzimá icos en con inuo, con odas las
en ajas que conlle a (López e al., 2002):
i) Es posible abaja con al as ca gas de enzima
ii) Se consigue man ene una ac i idad enzimá ica p olongada
iii) Se educen los cos es, ene gía y p oduc os de desecho
i ) Se consigue educi el iesgo de inhibición po subs a o o po p oduc o
) Se consigue un p oduc o más pu i icado, lib e de enzima
i) La ope ación, con ol y escalado del p oceso son sencillos
Las enzimas pueden es a p esen es en di e en es o mas: i) lib es, solubles
en la mezcla de eacción; ii) inmo ilizadas en la supe icie o la ma iz de una
memb ana; iii) inmo ilizadas median e la o mación de pe las o de i ados sob e
algún sopo e (Figu a 1.4). Si la enzima se man iene lib e, el sis ema debe es a
acoplado a una memb ana y la e ención de la enzima se ealiza median e su
con inamien o en uno de los lados de la misma. Si la enzima es á inmo ilizada
sob e la memb ana o algún sopo e, la inmo ilización se ealiza median e
In oducción
41
Tabla 1.4. Aplicación de enzimas ligninolí icas a la deg adación in i o de compues os
Compues o Enzima Fuen e Re e encia
Lignina
Fenoles
Hid oca bu os
policíclicos
a omá icos
Compues os
ni oa omá icos
Tin es
MnP
MnP
MnP y LiP
LiP
HRP
Lacasa
MnP
LiP
Lacasa
MnP
MnP
LiP
Lacasa
HRP
MnP
Phane ochae e ch ysospo ium
Nema oloma owa dii y Phlebia
adia a
Phane ochae e ch ysospo ium
Phane ochae e ch ysospo ium
Phane ochae e ch ysospo ium
--
--
Rhizoc onia p a icola
Co iolus e sicolo
Nema oloma owa dii
Phane ochae e ch ysospo ium
T ame es e sicolo
Phane ochae e lae is
Nema oloma owa dii
Phane ochae e ch ysospo ium
Nema oloma owa dii y
S opha ia ugosoannula a
Nema oloma owa dii
Phane ochae e ch ysospo ium
Phane ochae e ch ysospo ium
Phane ochae e ch ysospo ium
Py icula ia o yzae
P epa ado come cial
Pycnopo us cinnaba inus
T ame es e sicolo
P epa ado come cial
Bje kande a adus a y Pleu o us
e yngii
Phane ochae e ch ysospo ium
Phane ochae e ch ysospo ium
y Bje kande a sp.
Bje kande a sp.
Wa iishi e al., 1991
Ho ich e e al., 1999
Thompson e al., 1998
Ai ken e al., 1989
Hammel & Ta done, 1988
Wagne & Nicell, 2001
Coope & Nicell, 1996
Bollag e al., 1988
Ullah e al., 2000
Ho ich e e al., 1998
Hammel e al., 1986
Majche czyk e al., 1998
Bogan & Lama , 1996
Sack e al., 1997
Bogan e al., 1996
Scheibne & Ho ich e ,
1998
Ho ich e e al., 1998
an Aken e al., 2000
Chi ukula e al., 1995
Ollikka e al., 1993
Chi ukula & Rengana han,
1995
Soa es e al., 2001
Schliephake e al., 2000
Moldes, 2005
Bhunia e al., 2001
Hein ling e al., 1998b
Glenn & Gold, 1985
Mo ei a e al., 2001a
Mielgo e al., 2003a
Capí ulo 1
42
adso ción ísica, enlace co alen e, ue zas elec os á icas, inclusión o
a apamien o (P aze es & Cab al, 2001). Cuando se abaja con enzima
inmo ilizada, es necesa io el anspo e de los subs a os has a el ca alizado y de
los p oduc os desde el ca alizado al medio de eacción. Po lo an o la
ans e encia de ma e ia juega a eces un papel muy impo an e (Gio no & D ioli,
2000).
6.1. Reac o es enzimá icos de memb ana
Los eac o es enzimá icos de memb ana se de inen como aquellos en que la
sepa ación de la enzima y los p oduc os o subs a os se ealiza po medio de una
memb ana semipe meable que unciona como una ba e a selec i a (P aze es &
Cab al, 1994). Los subs a os y p oduc os pe meables se sepa an de la mezcla de
eacción median e un g adien e a a és de la memb ana (po encial químico,
p esión, campo eléc ico) que causa el mo imien o de los solu os, po di usión,
con ección o mig ación elec o o é ica.
La combinación de la ecnología de memb anas con los eac o es enzimá icos
pe mi e habla de es con igu aciones de eac o : i) eac o de memb ana de
con ac o di ec o; ii) eac o con enzima inmo ilizada en la memb ana; iii) eac o
de memb ana ex ac i a.
Reac o es enzimá icos de con ac o di ec o
En es os eac o es el subs a o se alimen a a la zona del sis ema que con iene
la enzima, de mane a que se p oduce un con ac o di ec o en e ambos, pudiendo
así p oduci se una ac uación enzimá ica inmedia a sob e el subs a o. La enzima
puede es a inmo ilizada o lib e. La sepa ación del ca alizado puede ene luga
en el mismo eac o o puede lle a se a cabo median e el acoplamien o de una
unidad de memb ana ex e na.
La con igu ación más común den o de los eac o es de con ac o di ec o
consis e en un eac o de anque agi ado con enzima lib e asociado a una
memb ana de ul a il ación pa a la e ención del ca alizado (Figu a 1.4.a). El
e luen e e enido se eci cula al eac o , mien as que los p oduc os de eacción
son capaces de a a esa la memb ana y abandonan el sis ema como e luen e
(López e al., 2002).
In oducción
43
RECIRCULACIÓN ENZIMÁTICA
Co ac o es
Enzima
Subs a o
P oduc o
(a)
Co ac o es
Subs a o
Memb an
a
P oduc o
(b)
Memb an
a
Subs a o
Co ac o es P oduc o
(c)
Figu a 1.4. Con igu aciones de eac o es con inuos de memb ana: (a) eac o de anque
agi ado combinado con una memb ana de sepa ación, (b) eac o de anque agi ado con
enzima inmo ilizada en la ma iz de la memb ana y (c) eac o de anque agi ado con
enzima a apada en geles, ib as o mic ocápsulas
Reac o es enzimá icos con enzima inmo ilizada en la memb ana
La p incipal ca ac e ís ica de es os eac o es es que la enzima es á
inmo ilizada en la memb ana, bien den o de la ma iz o bien en su supe icie. La
eacción ocu e de mane a simul ánea a la sepa ación de los p oduc os (Gekas,
1986; P aze es & Cab al, 2001). Cuando la inmo ilización iene luga po unión
co alen e la in e acción se p oduce en e un g upo ac i ado de la memb ana y un
g upo uncional de la p o eína, gene almen e g upos amino de esiduos básicos
(Guisán e al., 1997). Si la inmo ilización es á basada en la adso ción, ienen
luga ue zas de Van de Waals o in e acciones elec os á icas en e la enzima y el
sopo e (Lan e e al., 2000). Po úl imo, las enzimas pueden habe sido a apadas
en una ma iz polimé ica du an e el p oceso de p epa ación de la memb ana
Capí ulo 1
50
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Ma e iales y mé odos
59
Capí ulo 2
Ma e iales y mé odos
Resumen
En es e capí ulo se de allan los ma e iales y mé odos empleados en la
ealización de la esis doc o al. Se desc iben los medios de cul i o pa a la
conse ación y el man enimien o de la cepa de Bje kande a sp. BOS55, así como
los medios aplicados pa a la p oducción de la enzima manganeso pe oxidasa. Se
hace una e isión de las dis in as e apas de p epa ación del c udo enzimá ico pa a
su pos e io aplicación en los ensayos de decolo ación. Se de allan además las
di e sas écnicas analí icas empleadas pa a la medida de la ac i idad enzimá ica,
pa a la de e minación de la p o eína y pa a la de e minación de las
concen aciones del in e O ange II y de los p oduc os ob enidos en su
deg adación. La me odología especí ica de cada capí ulo se desc ibi á
pos e io men e en su co espondien e apa ado de Ma e iales y mé odos.
Capí ulo 2
66
4.2. De e minación de concen aciones po c oma og a ía (HPLC)
El p oblema que p esen a el seguimien o de la deg adación del in e O ange
II median e la écnica espec o o omé ica es que du an e el anscu so de la
eacción se gene an p oduc os que p esen an cie a abso bancia a la longi ud de
onda de abajo. Las señales se supe ponen y la medida de la concen ación de
O ange II puede se lige amen e supe io a la eal. Pa a sol en a es e p oblema se
midió la concen ación de in e median e HPLC, que pe mi ió a su ez de e mina
la concen ación de algunos de los p oduc os de la deg adación.
Los análisis de c oma og a ía líquida se lle a on a cabo en un HPLC
Hewle Packa d ChemS a ion equipado con un de ec o de a ay de diodos HP
1090 M se ie II. Se inyec a on 25 µL de mues a a a és de una columna
LiCh osphe ®100 RP-18 (4 mm d.i. x 250 mm longi ud) que con iene pa ículas
empacadas de 5 µm de amaño (Me ck KgaA, Da ms ad , Alemania). Se empleó
como ase mó il una disolución de 30% de ace oni ilo y 70% de ca bona o
amónico 0,03 M a pH 7,9 con un caudal de 0,8 mL/min en condiciones isoc á icas
a 30ºC. Los c oma og amas se ob u ie on a una longi ud de onda de 231 nm. Los
iempos de e ención en esas condiciones ue on de 2,03-2,04 min pa a ácido 4-
hid oxibencenosul ónico, 2,00-2,01 min pa a ácido sul anílico, 6,8-7,0 min pa a
O ange II y 10,8-10,9 min pa a 1,2-na oquinona. Las ec as de calib ado pa a los
es p ime os compues os se mues an en la Figu a 2.3.

Ma e iales y mé odos
67
y = 0,018x - 0,2486
R
2
= 0,9998
0
20
40
60
80
100
120
0 1000 2000 3000 4000 5000 6000
A ea (mAU·s)
O ange II (mg/L)
y = 0,0198x - 2,6469
R
2
= 0,9987
0
20
40
60
80
100
120
140
160
0 2000 4000 6000 8000
A ea (mAU·s)
Ácido 4-hid oxibencenosul ónico
(mg/L)
y = 0,0351x - 1,8350
R
2
= 0,9940
0
50
100
150
200
250
300
0 1000 2000 3000 4000 5000 6000 7000 8000
A ea (mAU·s)
Ácido sul anílico (mg/L)
Figu a 2.3. Rec as de calib ado po c oma og a ía líquida: (a) O ange II, (b) ácido 4-
hid oxibencenosul ónico, (c) ácido sul anílico
(a)
(b)
(c)
Capí ulo 2
68
5. Re e encias
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Ciné ica de deg adación en discon inuo
69
Capí ulo 3
Ciné ica de la deg adación de O ange II en
discon inuo
Resumen
El modelado de un p oceso es un aspec o básico pa a su pos e io escalado y
con ol. En es e capí ulo se p esen a un modelo ciné ico pa a la deg adación del
in e azo O ange II. Se aplicó el mé odo de las elocidades iniciales en ensayos en
discon inuo, en los que se a ia on las concen aciones iniciales de subs a o y las
elocidades de adición de H2O2. T abajando con concen aciones de subs a o
ele adas, has a alo es de 2 g/L, se obse ó que el subs a o iene un cie o
ca ác e inhibi o io sob e la ciné ica de la deg adación. Los da os de elocidades
de eacción p esen a on un ajus e adecuado a un modelo de Haldane de inhibición
po subs a o. Sin emba go no se ob u o inhibición a concen aciones po debajo
de 500 mg/L de O ange II, condiciones que ep esen an los alo es más comunes
en e luen es de plan as ex iles eales. Po an o a concen aciones in e io es a 500
mg/L es más adecuado habla de una ciné ica de Michaelis-Men en con espec o a
O ange II, y con una dependencia lineal de p ime o den con espec o a la
elocidad de adición de H2O2.
Capí ulo 3
70
Índice
1. In oducción
2. Ma e iales y mé odos
2.1. P epa ación del c udo enzimá ico
2.2. Medio de deg adación
2.3. Ensayos de deg adación
3. Resul ados y discusión
3.1. Ciné ica en unción de la concen ación de O ange II
3.2. Ciné ica en unción de la concen ación de O ange II y H2O2
4. Conclusiones
5. Re e encias
71
73
73
73
74
74
74
79
85
89
Ciné ica de la deg adación en discon inuo
71
1. In oducción
La ob ención de una ecuación ciné ica que modelice la deg adación de
compues os cons i uye la cla e pa a escala los p ocesos y pa a diseña un sis ema
que pe mi a el con ol de los mismos. Cuando se a a de eacciones enzimá icas
la ciné ica se complica debido a la posible desac i ación de la enzima como
consecuencia, bien de condiciones ex e nas o bien de la p esencia de compues os
inhibido es, que pueden se incluso p oduc os de la deg adación o los p opios
subs a os.
En unción del signi icado ísico que p esen en, las ecuaciones ciné icas se
pueden clasi ica en es g upos: i) ecuaciones ísicas, basadas en modelos que
explican las e apas que ienen luga en la eacción enzimá ica; ii) ecuaciones
empí icas o ma emá icas, que in oducen a iables que no ienen signi icado
ísico; iii) ecuaciones mix as, que p oceden de un comp omiso en e las
ecuaciones ciné icas ísicas y los modelos ma emá icos (Galli uoco e al., 2001).
Las ecuaciones ísicas p oceden de modelos más o menos complejos que
in en an desc ibi las eacciones enzimá icas en unción de los pa áme os que
in e ienen en ellas. Los modelos muy complejos y que dependen de un g an
núme o de pa áme os gene almen e consiguen un buen ajus e de los da os
expe imen ales, pe o son poco p ác icos en el diseño de p ocesos. O os modelos
educen el núme o de a iables pa a log a ecuaciones más simples y ú iles. Se
han p opues o a ias exp esiones de elocidad de eacción pa a las eacciones
enzimá icas. El mecanismo de Michaelis-Men en es uno de los más sencillos
(Ecuación 1), y se basa en la o mación de un complejo enzima-subs a o donde
iene luga la ans o mación de dicho subs a o al p oduc o, que se libe a de la
enzima. O os mecanismos conside an inhibiciones debidas a la p esencia de
compues os inhibi o ios ex e nos o al p opio subs a o o p oduc o. Uno de los
modelos p opues os basados en la inhibición po subs a o co esponde al modelo
de Haldane (Ecuación 2).
SK
S
M
m
+
= (1)
2
SKSK
S
IM
m
++
= (2)

Capí ulo 3
72
donde es la elocidad de eacción, S es la concen ación de subs a o, m es la
elocidad máxima, KM es la cons an e de Michaelis-Men en y KI es la cons an e
de inhibición.
Las ecuaciones empí icas son exp esiones ma emá icas que a menudo
esul an muy gene ales y poco p edic i as. Sin emba go, p esen an una se ie de
en ajas que las hacen ú iles pa a el modelado de p ocesos: ajus an bien los da os
expe imen ales y son ecuaciones sencillas de ácil aplicación. Po úl imo las
ecuaciones mix as se usan cuando se conoce la dependencia ísica de la elocidad
de eacción en e a una o a ias a iables, pe o no en e a o as.
Se p oponen dos ipos de mé odos pa a e alua los pa áme os ciné icos de
eacciones enzimá icas: i) mé odos di e enciales, en los que se ob iene la
elocidad de eacción di ec amen e de la pendien e de la cu a de concen ación
de subs a o o de p oduc o en e al iempo; ii) mé odos in eg ales, en los que se
in eg a la ecuación de elocidad y se ob iene una exp esión pa a la a iación de la
concen ación en e al iempo (Bódalo e al., 1999).
Los mé odos di e enciales se aplican sob e ensayos en discon inuo, donde se
ob iene la cu a de la a iación de la concen ación con el iempo. Es os mé odos
p esen an la en aja de que un solo ensayo p opo ciona un g an núme o de pa es
de pun os, aunque cuan o más sua e es la pendien e de la cu a, más di ícil es
de e mina el alo con p ecisión. O o incon enien e de es os mé odos es que la
ac i idad enzimá ica debe pe manece cons an e du an e la eacción. Pa a
sol en a es as des en ajas se abaja con el mé odo de las elocidades iniciales,
en el que las concen aciones de p oduc os, subs a os y enzima se conside an
cons an es y la pendien e inicial de la cu a se puede de e mina ácilmen e.
Como con apa ida, es e mé odo p esen a dos des en ajas: po una pa e, cada
pa de pun os se ob iene en un ensayo di e en e; po o a pa e, en es e mé odo
casi nunca se abaja en las mismas condiciones que aquellas co espondien es a
una si uación eal, pues o que los eac o es en con inuo suelen ope a con
con e siones ele adas (Bódalo e al., 1999).
Los mé odos in eg ales se basan en alo es ob enidos en es ado es aciona io,
po lo que se equie e un ensayo dis in o pa a ob ene cada pa de pun os. Es o
implica una mayo complejidad y un mayo consumo de iempo (Al ani e al.,
1990). O o incon enien e es la di icul ad de in eg ación de algunas ecuaciones
ciné icas. Debido a es o, casi odos los au o es ealizan el modelado de las
Ciné ica de la deg adación en discon inuo
73
eacciones enzimá icas en p ocesos en discon inuo y pos e io men e aplican las
cons an es ciné icas ob enidas a los ensayos en con inuo (Bódalo e al., 2001a;
Galli uoco e al., 2001). Algunos au o es aplican en los ensayos en con inuo un
alo de m di e en e al ob enido en los ensayos en ba ch. Bowski e al. (1972)
u ilizan un alo de m/2 y Nakajima e al. (1992) conside an m/10.
En el p esen e capí ulo se p e ende ob ene el modelo ciné ico de la
deg adación del in e azo O ange II median e la enzima MnP, en p ocesos en
discon inuo, po medio de la aplicación del mé odo de las elocidades iniciales.
2. Ma e iales y mé odos
2.1. P epa ación del c udo enzimá ico
El c udo enzimá ico p oceden e de la e men ación del hongo Bje kande a
sp. BOS55, una ez descongelado, se cen i ugó en ubos de 10 mL a 12.000xg en
cen í uga Labo uge 200, He aeus Sepa ech GMBH (Alemania). T as 5-10 min se
sepa ó el cen i ugado del sob enadan e y es e se il ó a a és de il os de
memb ana de celulosa de 0,45 µm (Millipo e). La ac i idad enzimá ica del c udo
as ambos p ocesos osciló en e 3.000 y 10.000 U/L.
2.2. Medio de deg adación
La selección del medio de deg adación del in e azo O ange II en ensayos en
discon inuo se basó en es udios p e ios en los que se de e mina on las
condiciones más adecuadas pa a consegui una elocidad óp ima de deg adación
del in e (Mielgo e al., 2003). El medio empleado es u o compues o po un ácido
o gánico (acé ico u oxálico), Mn2+, MnP y O ange II en las concen aciones que
se indican en la Tabla 3.1. El pH se ajus ó a 4,5 p e io a la adición de la enzima.
Tabla 3.1. Medio y condiciones pa a la deg adación enzimá ica de O ange II
Ácido o gánico
MnSO4
O ange II
H2O2
1 mM
33 µM
50-2000 mg/L
5-50 µmol/L·min
MnP
Volumen
Tempe a u a
pH
200 U/L
25 mL
22±2ºC
4,5
Capí ulo 3
74
2.3. Ensayos de deg adación
Los ensayos de deg adación se lle a on a cabo en ma aces E lenmeye de
100 mL de capacidad con 25 mL de medio desc i o en la Tabla 3.1. La eacción
se inició al añadi H2O2, que se bombeó en con inuo median e una bomba
pe is ál ica de elocidad a iable Mas e lex®C/L® Cole-Pa me (Illinois, EEUU).
Los caudales de adición de H2O2 ue on de 40 µL/min, de mane a que se
p epa a on disoluciones base de 3,125-31,25 mM pa a consegui elocidades de
adición en e 5 y 50 µmol/L·min. En odos los ensayos se ealizó un seguimien o
de la concen ación de O ange II median e espec o o ome ía, y de la ac i idad
enzimá ica, al y como se desc ibe en el Capí ulo 2 de Ma e iales y mé odos.
Con el obje i o de obse a la posible inhibición po subs a o, se ealiza on
ensayos po duplicado a una única elocidad de adición de H2O2 (50 µmol/L·min)
y un amplio ango de concen aciones iniciales de O ange II (100-250-500-750-
1000-1250-1500-1750-2000 mg/L), u ilizando ácido acé ico, al como se había
conside ado en es udios p e ios (Mielgo e al., 2003).
A con inuación se es udió la ciné ica del p oceso en unción de los dos
pa áme os que a ec an en mayo g ado a la elocidad de eacción, que son la
concen ación de subs a o y la elocidad de adición de H2O2. Pa a ello se
ealiza on ensayos en discon inuo a di e en es concen aciones iniciales de
O ange II (50-100-200-300-500 mg/L) y di e en es elocidades de adición de
H2O2 (5-15-25-50 µmol/L·min), empleando oxálico como ácido ca boxílico.
Pa a exclui la posibilidad de que la decolo ación uese debida a un p oceso
dis in o a la eacción enzimá ica, se ealizó un con ol con MnP inac i ada
é micamen e.
3. Resul ados y discusión
3.1. Ciné ica en unción de la concen ación de O ange II
Teniendo en cuen a el ciclo ca alí ico de la enzima MnP, se puede obse a
que el subs a o que eacciona con cada una de las o mas de la enzima es
di e en e en las dis in as e apas. Así, el subs a o en la oxidación de MnP na i a al
compues o I es H2O2. La p ime a e apa de educción, de MnP I a MnP II, se
ealiza median e la oxidación de una molécula de Mn2+ a Mn3+. Po úl imo, la
Ciné ica de la deg adación en discon inuo
75
e ce a e apa, de educción de la o ma MnP II a MnP na i a, se ealiza median e
la oxidación de o o compues o que ac úa como subs a o (Glenn & Gold, 1985).
Los compues os oxidados ob enidos ac úan a su ez como oxidan es de o os
compues os, que esul an se los dado es inales de elec ones, y po lo an o los
subs a os inales de la oxidación enzimá ica. Cuando la ciné ica de la eacción
enzimá ica p opiamen e dicha es más ápida que la de oxidación de los
compues os inales, es a úl ima eacción se conside a la e apa limi an e del
p oceso, y po ello, la ciné ica global coincide con la ciné ica de deg adación de
dichos compues os inales. Po es e mo i o, en é minos ciné icos, se conside a el
O ange II como el subs a o de la deg adación enzimá ica.
Se ealiza on ensayos de deg adación a dis in as concen aciones iniciales de
O ange II con el in de obse a el e ec o de la concen ación de subs a o en la
ciné ica de deg adación. Se abajó con las mismas concen aciones iniciales de
ácido acé ico, Mn2+ y MnP en odos los ensayos, y se siguió la concen ación de
O ange II du an e 1 h, a in e alos de 1 min du an e los 10 p ime os minu os y de
5 min has a la inalización de los expe imen os. Los pe iles de decolo ación pa a
las concen aciones iniciales de 100-500-1000-1500-2000 mg/L se mues an en la
Figu a 3.1.
0
10
20
30
40
50
60
70
80
90
100
0 10203040506070
Tiempo (min)
Decolo ación (%)
Figu a 3.1. Decolo ación de O ange II en ensayos en discon inuo a di e en es
concen aciones iniciales de in e: () 100 mg/L; () 500 mg/L; (∆) 1000 mg/L;
({) 1500 mg/L; (⎯) 2000 mg/L
Capí ulo 3
82
0
10
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0 10203040506070
Tiempo (min)
Decolo ación (%)
0
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100
0 10203040506070
Tiempo (min)
Decolo ación (%)
Figu a 3.5. Decolo ación de O ange II en ensayos a di e en es elocidades de adición de
H2O2: () 50 µmol/L·min; () 25 µmol/L·min; (∆) 15 µmol/L·min; ({) 5 µmol/L·min; y
di e en es concen aciones de O ange II: (a) 100 mg/L; (b) 50 mg/L
En la mayo ía de las condiciones aplicadas se alcanzó una decolo ación
supe io al 90% as 60 min. Pa a una concen ación de O ange II ele ada ue
necesa ia una mayo can idad de H2O2 pa a log a una decolo ación en o no a ese
alo . Sin emba go, una adición de 5 µmol/L·min no ue su icien e pa a deg ada
el 90% del in e aun cuando la concen ación inicial de es e ue de 50 mg/L.
En la Tabla 3.4 se p esen an los alo es de las elocidades iniciales pa a
cada uno de los ensayos ealizados. Po abaja con concen aciones de subs a o
iguales o in e io es a 500 mg/L, y al como se ha is o en el apa ado an e io , no
cabe espe a enómenos de inhibición po subs a o (O ange II). Sólo en el caso
de una adición de H2O2 ele ada, de 50 µmol/L·min, se pudo obse a cie a
(a)
(b)

Ciné ica de la deg adación en discon inuo
83
inhibición a concen aciones de 500 mg/L de O ange II, debida p obablemen e a
una inhibición pa cial de la enzima. Po o a pa e, se obse a que exis e una
elación en e las elocidades ciné icas y la elocidad de adición de H2O2.
Tabla 3.4. Velocidades de deg adación de O ange II a di e en es concen aciones iniciales
de in e y di e en es elocidades de adición de H2O2
Velocidades de deg adación (mg/L·min)
Velocidad de adición de H2O2 (
µ
mol/L·min)
Concen ación
inicial de O ange II
(mg/L) 5 15 25 50
50
100
200
300
500
0,84
1,10
1,47
1,65
2,24
3,42
4,97
5,48
5,36
6,11
4,93
6,10
6,99
7,24
8,00
7,10
11,6
13,1
15,2
13,3
En las condiciones de ope ación, el é mino de inhibición de la ecuación de
Haldane de e minado an e io men e no se ía signi ica i o con espec o al es o de
los é minos de la ecuación. Se conside ó po ello el modelo más sencillo de
Michaelis-Men en con espec o a la concen ación de O ange II, y una unción
lineal con espec o a la elocidad de adición de H2O2, como se p esen a en la
Ecuación 4.
(
)
2222 OHOH
M
mQK
SK
S
+
+
= (4)
donde 22OH
K es la cons an e de la unción de la adición de H2O2 y 22OH
Qes la
elocidad de adición de H2O2. Si bien la cons an e ciné ica m ya no iene el
signi icado de elocidad máxima, se segui á man eniendo es a nomencla u a. Pa a
una elocidad de adición de H2O2 cons an e, se puede conside a una elocidad
máxima m’ pa a cada uno de los alo es de elocidad de adición, de mane a que
la Ecuación 4 se puede ans o ma en la Ecuación 5, en donde el é mino de la
elocidad máxima apa en e esul a una unción lineal de la elocidad de adición
de H2O2, pa a alo es de es e iguales o in e io es a 50 µmol/L·min.
Capí ulo 3
84
SK
S
M
m
+
=' donde
(
)
2222
'OHOHmm QK
+
=
(5)
Los alo es de m’ y KM pa a cada alo de elocidad de adición se exp esan
en la Tabla 3.5.
Tabla 3.5. Pa áme os ciné icos de la deg adación de O ange II a di e en es elocidades
de adición de H2O2
Velocidad de adición de H2O2 (
µ
mol/L·min)
Pa áme os
ciné icos
5 15 25 50
m’(mg/L·min)
KM (mg/L)
2,20
85,8
6,61
44,3
8,24
34,0
17,5
68,8
Conside ando un alo medio de KM, que no debe a ia con la elocidad de
adición de H2O2, se ob iene una eg esión lineal en e el alo de la elocidad
máxima apa en e m’ y la elocidad de adición de H2O2, de e minándose los
pa áme os ciné icos de la Ecuación 4, que se mues an en la Tabla 3.6.
Tabla 3.6. Pa áme os del modelo ciné ico en unción de la concen ación de O ange II y
la adición de H2O2
m (mg/
µ
mol) KM (mg/L) 22OH
K(
µ
mol/L·min)
0,33 58,2 2,4
A pa i de es os pa áme os ciné icos se puede comp oba cómo el modelo
p opues o ajus a los da os expe imen ales, pa a cada una de las elocidades de
adición de H2O2 de abajo (Figu a 3.6). El e o en e los da os expe imen ales y
los p opues os po el modelo es meno del 5% en la mayo ía de los casos, lo que
indica que el ipo de modelo aplicado y los alo es de las cons an es ciné icas
ob enidos son adecuados pa a desc ibi el sis ema de eacción.
Ciné ica de la deg adación en discon inuo
85
0
2
4
6
8
10
12
14
16
0 100 200 300 400 500 600
Concen ación O ange II (mg/L)
(mg/L·min)
Figu a 3.6. Comp obación del modelo ciné ico en unción de la concen ación de O ange
II y la elocidad de adición de H2O2: () 50 µmol/L·min; () 25 µmol/L·min; (∆) 15
µmol/L·min; ({) 5 µmol/L·min; (—) da os simulados po el modelo ciné ico
4. Conclusiones
La oxidación enzimá ica del in e azo O ange II median e la enzima MnP
cons i uye un mé odo muy e ec i o pa a su deg adación. Las condiciones en las
cuales la oxidación es más ápida y la ac i idad enzimá ica se e menos a ec ada
han sido ampliamen e es udiadas en abajos an e io es (Mo ei a e al., 2001;
Mielgo e al., 2003).
La p esencia del ion Mn2+ juega un papel impo an e en el ciclo ca alí ico de
la enzima MnP. Nume osos au o es man ienen que la enzima comúnmen e
denominada manganeso pe oxidasa iene ac i idad independien e de Mn2+, con lo
cual pod ía ecibi el nomb e más adecuado de pe oxidasa e sá il (Hein ling e
al., 1998; Mes e & Field, 1998), aunque la e iciencia ca alí ica de la enzima es
mucho más ele ada en p esencia de Mn2+ que en p esencia de o os subs a os
a omá icos (Hein ling e al., 1998). Sin emba go una concen ación muy ele ada
de Mn2+ en el medio alen iza la deg adación de O ange II (Mielgo e al., 2003).
Po o a pa e, la p esencia de Mn2+ en el medio a o ece la es abilidad de la
enzima (Palma e al., 1997). Con el in de llega a un comp omiso en e la
ciné ica de la deg adación y la es abilidad enzimá ica, se seleccionó 33 µM como
Capí ulo 3
86
la concen ación más adecuada pa a los ensayos de deg adación (Mielgo e al.,
2003).
El c udo enzimá ico es el ac o más cos oso del p oceso. Po ello, pa a
de e mina el alo de ac i idad enzimá ica más adecuado se conside a on
pa áme os económicos. Po encima de 150-200 U/L de MnP no se ap ecia on
g andes cambios en cuan o a la ciné ica del p oceso. Po ello, se conside ó ese
ango como el más adecuado pa a los p ocesos de deg adación (Mielgo e al.,
2003).
El ácido o gánico juega un doble papel en el medio de deg adación, pues
ayuda a man ene el pH de la disolución en el alo óp imo pa a a o ece la
es abilidad de la enzima, y po o a pa e ac úa como es abilizado del ion Mn3+
gene ado median e la o mación de un complejo. Sin emba go, concen aciones
muy ele adas de ácido o gánico a ec an nega i amen e a la es abilidad de la
enzima, y con ello, al g ado de decolo ación alcanzado (Mielgo e al., 2003). Es o
es debido a que los ácidos son oxidados po el p opio Mn3+ y p oducen adicales
que a ec an a la es abilidad enzimá ica, a la ez que la can idad de Mn3+
disponible pa a la deg adación del subs a o se educe, a ec ando a la ciné ica de
la deg adación (Ho ich e e al., 1998). En es udios p e ios se llegó a una
concen ación óp ima de ácido o gánico de 1 mM (Mielgo e al., 2003).
No sólo se debe conside a la concen ación sino ambién el ipo de ácido,
pues la o mación de un complejo exige la p esencia de un ácido no
monoca boxílico, que no iene capacidad quelan e. Sin emba go, se ope ó en
ausencia de ácido en ensayos p e ios y se alcanza on buenos ni eles de
deg adación de O ange II, aunque se p odujo una mayo deses abilización de la
enzima como consecuencia de la ausencia de un medio ampón (Mielgo e al.,
2003). Se conside ó que pod ía se el p opio O ange II, que iene ca ác e ácido y
es á p esen e en una concen ación conside able, el que u iese una cie a
capacidad quelan e con espec o al Mn3+, de mane a que pudiese es abiliza al ion
y a o ece su p opia deg adación.
Una o ma de ealiza la selección del ácido ca boxílico puede se en unción
de la ciné ica de deg adación en p esencia de cada uno de los ácidos. De es a
o ma, si se conside an ambas ciné icas ob enidas en el p esen e capí ulo y se
compa an pa a una misma elocidad de adición de H2O2, de 50 µmol/L·min, se
ob iene la ep esen ación de la Figu a 3.7, en la que se obse a que la ciné ica de
Ciné ica de la deg adación en discon inuo
87
deg adación en p esencia de ácido oxálico es más ápida que en p esencia de
acé ico. Es e hecho es á co obo ado a su ez po los alo es de la cons an e de
Michaelis pa a los dis in os ácidos. El alo de KM pa a el ácido acé ico es unas
es eces supe io al del ácido oxálico (184 en e a 58 mg/L), lo que indica que a
concen aciones pequeñas de O ange II la elocidad de deg adación es mucho
mayo en p esencia de oxálico. Sin emba go, la elocidad de deg adación máxima
en el caso del acé ico es mayo que pa a el oxálico (23 y 19 mg/L·min,
espec i amen e), lo que signi ica ía que a concen aciones de O ange II mayo es
de las ep esen adas en la g á ica la p esencia de acé ico a o ece ía la elocidad
de deg adación.
0
2
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0 100 200 300 400 500 600
Concen ación O ange II (mg/L)
(mg/L·min)
Figu a 3.7. Compa ación en e los modelos ciné icos de la deg adación de O ange II en
p esencia de: (---) ácido acé ico; (—) ácido oxálico
Pa a acili a la ob ención y pos e io aplicación de las ecuaciones ciné icas
se asumie on una se ie de conside aciones: el p oceso es iso é mico, el olumen
de eacción es cons an e y el eac o es á pe ec amen e agi ado. A pa i de es as
suposiciones se aplicó el mé odo di e encial de elocidades iniciales, en el que se
conside ó la pendien e inicial de deg adación de O ange II pa a cada
concen ación inicial de in e. Se pod ía conside a un mé odo di e encial que
omase odos los pa es de pun os de concen ación en e a iempo pa a ealiza el
cálculo de los pa áme os ciné icos, de o ma que ganasen más peso aquellos
pun os ob enidos a concen aciones bajas de in e, po se los más abundan es. Sin
emba go, el pa áme o ciné ico m es una unción lineal de la concen ación de

Capí ulo 3
88
enzima, que no se man iene cons an e a lo la go del p oceso, sino que su e una
cie a desac i ación. Di e sos au o es conside a on una ciné ica de desac i ación
de la enzima, que pod ía eni dada po la Ecuación 6 (Sehanpu i & Hill, 2000;
Bódalo e al., 2004).
kd
eEE −
⋅= 0 (6)
donde E es la ac i idad enzimá ica a iempo , E0 es la ac i idad enzimá ica
inicial, kd es la cons an e de desac i ación de p ime o den y es el iempo. Es a
ecuación se pod ía aplica a la ecuación ciné ica, aunque di icul a ía el cálculo de
los pa áme os.
El modelo p opues o pa a la deg adación de O ange II es un modelo semi-
empí ico, que esul a de la combinación del modelo de Michaelis-Men en con
espec o a la concen ación de O ange II y un modelo ma emá ico con espec o a
la elocidad de adición de H2O2. Concen aciones muy ele adas de in e p oducen
un e ec o inhibi o io en la eacción enzimá ica, de mane a que la elocidad de
eacción disminuye, aunque muy le emen e. El modelo es ú il pa a de e mina la
concen ación de in e que apo a una ciné ica más ele ada, que es á en o no a
750 mg/L. Sin emba go a medida que la concen ación inicial aumen a, el
po cen aje de decolo ación alcanzado es meno , lo que implica que as la
eacción puede pe manece en el medio una concen ación de in e ele ada. La
concen ación de O ange II se ha de selecciona eniendo en cuen a ambos
ac o es, ciné ica y decolo ación, con el obje i o de alcanza una decolo ación
adecuada en un iempo educido.
El e ec o del H2O2 en la ecuación ciné ica esul a eje ce una dependencia
lineal con espec o, no a su concen ación pun ual (que es p ác icamen e nula),
sino a su elocidad de adición. El modelo indica que a medida que aumen a la
elocidad de adición de H2O2 (has a 50 µmol/L·min) la deg adación de in e iene
luga a mayo elocidad. Pa a elocidades más al as de adición de H2O2 debe á
conside a se el aspec o de desac i ación de MnP debido a concen aciones
ele adas de H2O2. La de e minación del caudal óp imo de H2O2 ha de esul a un
comp omiso en e la elocidad de la deg adación y la desac i ación enzimá ica.
En conclusión, el modelo ciné ico p opues o es una he amien a ú il pa a
conoce la ciné ica del p oceso, ya que po medio de ella se puede es udia cómo
los di e sos pa áme os (ácido ca boxílico, concen ación de O ange II, elocidad
Ciné ica de la deg adación en discon inuo
89
de adición de H2O2) a ec an a la elocidad de deg adación del in e, y pe mi e
decidi cuáles son las condiciones que a o ecen una ciné ica más ápida.
5. Re e encias
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90
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Deg adación en eac o enzimá ico de memb ana
91
Capí ulo 4
Deg adación en con inuo de O ange II en un
eac o enzimá ico de memb ana1
Resumen
En es e capí ulo se p esen a el es udio de un eac o enzimá ico de memb ana
pa a la oxidación en con inuo del in e azo O ange II median e MnP. La
con igu ación consis ió en un eac o de anque agi ado asociado a una memb ana
de ul a il ación, que pe mi ió la e ención y eci culación de la enzima, mien as
que los p oduc os y subs a os pasa on a a és de la memb ana y se elimina on
jun o con el e luen e. Con el obje i o de maximiza la e icacia del sis ema, en
é minos de in e deg adado po unidad de enzima consumida, se es udia on
di e sas es a egias de dosi icación de enzima en un único pulso, pulsos
pe iódicos o bien en con inuo. Adicionalmen e, se es udió la in luencia de
di e sos pa áme os ales como la ac i idad enzimá ica, elocidad de dosi icación
de H2O2, concen ación de ácido o gánico y iempo de esidencia hid áulico. Las
mejo es condiciones pe mi ie on ob ene una decolo ación supe io al 90% con
una mínima pé dida de ac i idad enzimá ica, alcanzándose una e icacia de 42,5
mg de O ange II oxidado po unidad de enzima MnP consumida, alo 16 eces
supe io al máximo ob enido en ensayos en discon inuo. El sis ema se man u o
es able du an e 18 d, sin necesidad de limpieza o eemplazo de la memb ana. Po
úl imo, se ealizó una simulación median e la aplicación de la ecuación ciné ica
p opues a en el Capí ulo 3 a los ensayos en con inuo. El análisis de los da os
mues a un ajus e sa is ac o io en e los da os expe imen ales y los simulados pa a
la ope ación del eac o an o en es ado es aciona io como en no es aciona io.
1 López, C., Mo ei a, M. T., Feijoo, G. and Lema, J. M. (2004) Dye decolo iza ion by
manganese pe oxidase in an enzyma ic memb ane bio eac o . Bio echnology P og ess 20,
74-81.
Capí ulo 4
98
su pa e in e io , po lo an o el lujo es ascenden e y pa alelo a la supe icie de la
memb ana. El caudal de pe meado a a iesa la memb ana y abandona el ca ucho
po un conduc o in e io . La elación en e el caudal de pe meado y de e enido se
es ablece po medio de una ál ula inco po ada en la pa e supe io del sopo e.
El p oceso se inicia po adición de es disoluciones al eac o po medio de
bombas pe is ál icas de elocidad a iable: i) una disolución de O ange II (0,1-0,5
g/L), MnSO4 (33 µM) y ácido o gánico (1 mM), po medio de una bomba
Mas e lex®L/S® Cole-Pa me (Illinois, EEUU) (P1); ii) MnP (7.000 U/L) y iii)
H2O2 (94-312 mM), median e dos bombas Mas e lex®C/L® Cole-Pa me
(Illinois, EEUU) (P2 y P3). Se empleó una cua a bomba pe is ál ica
Mas e lex®L/S® pa a bombea el e luen e del eac o hacia el ca ucho de
ul a il ación (P4).
P epa ación y man enimien o de la memb ana
Los ca uchos P ep/Scale TFF se disponen con una disolución al 0,1% de
clo u o de alquil-benzil-dime il amonio. Cuando la memb ana se usa po p ime a
ez es necesa io ealiza una pu ga pa a elimina las disoluciones de limpieza y
almacenamien o. T as cada uso, se debe lle a a cabo una limpieza, p ecedida y
seguida de pu gas pa a eliminación de disoluciones de abajo y limpieza.
El p ocedimien o de pu ga de la memb ana comienza po el aciado de la
disolución que con iene, median e la agi ación del ca ucho in e ido. A
con inuación se bombean 7 L de agua mic o il ada y desionizada a 45ºC con un
caudal de 1 L/min a una p esión máxima de 20 psi (1,4 ba ), pues a p esiones
mayo es se puede p oduci la up u a de las gomas lexibles empleadas en las
bombas pe is ál icas. El olumen o al de agua se dis ibuye de la siguien e
mane a: en p ime luga se hacen pasa 2 L de agua a a és de la línea de
e enido, a con inuación 4 L a a és de la memb ana, y po úl imo 1 L de nue o a
a és de la línea de e enido.
La limpieza se ealiza con una disolución de NaOH 0,1 N a 45ºC. Se
p epa an 4 L de disolución y se bombean a a és de la memb ana a un caudal de
4 L/min, ab iendo la ál ula de la línea de pe meado de mane a que el lujo se
epa a en e ambas líneas y que la p esión no sea mayo de 20 psi. La disolución
se eci cula du an e los 60 min de limpieza. Es a misma disolución es la que se
u iliza pa a el almacenamien o de la memb ana.

Deg adación en eac o enzimá ico de memb ana
99
Es udio de la e icacia de la memb ana
La e icacia de la memb ana se e aluó po medio del cálculo del coe icien e
de echazo del subs a o (O ange II) y de la enzima. Con espec o al in e O ange
II, se hizo pasa una disolución de 100 mg/L a un caudal de 180 mL/min a a és
de la memb ana y se de e minó la concen ación de in e en las líneas de e enido
y de pe meado. Se conside ó, además, el caso de que odo el caudal pasase a
a és de la memb ana (Figu a 4.2a), comp obándose así la posible adso ción del
in e sob e la supe icie de la misma.
El coe icien e de echazo con espec o a MnP se analizó median e un
p ocedimien o simila . Se bombeó un caudal de 180 mL/min de una disolución
con eniendo 125 U/L de MnP, de los cuales 20 mL/min pasa on a a és de la
memb ana. Se conside ó el caso de que odo el caudal uese eci culado (Figu a
4.2b), y la pé dida de ac i idad enzimá ica se compa ó con un con ol en pa alelo
en un eac o de anque agi ado sin eci culación, con el obje i o de comp oba la
es abilidad de la enzima as 180 min de es és mecánico.
(a) (b)
Figu a 4.2. Esquema de los ensayos ealizados pa a la de e minación de la e icacia de la
memb ana: (a) in e acción en e O ange II y la memb ana; (b) es abilidad de la enzima
Ensayos de decolo ación en con inuo
T as el llenado del eac o y las conducciones con la disolución de
alimen ación, o mada po O ange II, Mn2+ y ácido o gánico, se adiciona la
enzima MnP y se ponen en ma cha las bombas de alimen ación y eci culación,
iniciando así el ciclo ca alí ico de la enzima. El caudal de la bomba de
alimen ación se man u o en e 2,78 y 25 mL/min, pa a ope a a iempos de
esidencia hid áulica (TRH) en e 90 min y 10 min. Se abajó a elocidades de
RECIRCULACIÓN ENZIMÁTICA
RCTA
UF
RCT
A
INFLUENTE
EFLUENTE
UF
Capí ulo 4
100
dosi icación de H2O2 de 15 a 50 µmol/L·min empleando disoluciones de H2O2
en e 94 y 312 mM con un caudal de 40 µL/min. La adición de enzima se ealizó
median e es es a egias: i) una única adición al comienzo del ensayo; ii) adición
en ed-ba ch (un pulso cada ho a); iii) adición en con inuo a una elocidad al que
pe mi a man ene la ac i idad enzimá ica en un alo deseado. La co ien e de
salida se bombeó hacia la memb ana a una elocidad de eci culación 12 eces
supe io a la de alimen ación. Todos los expe imen os se lle a on a cabo a
empe a u a ambien e. Se oma on mues as del eac o y del lujo de pe meado, y
se midió la ac i idad enzimá ica y la concen ación de O ange II (Figu a 4.3).
Figu a 4.3. Equipo pa a la decolo ación de O ange II en un
eac o enzimá ico de memb ana
Pa a comp oba que la decolo ación no enga luga median e una eacción no
enzimá ica, se ealiza on con oles en pa alelo con enzima desac i ada
é micamen e y no se obse ó cambio en la concen ación de in e en ningún caso.
En los casos indicados se ealizó el ensayo de decolo ación en un
e men ado BIOSTAT Q de B aun-Bio ech In e na ional (Melsungen, Alemania)
de 1 L, con 500 mL de medio de eacción. El eac o dispone de medida de pH,
empe a u a y oxígeno disuel o, con un sis ema de adquisición de da os on line
con olado po un o denado .
Deg adación en eac o enzimá ico de memb ana
101
2.2. Técnicas analí icas
La concen ación de O ange II se midió espec o o omé icamen e y, en los
casos indicados, po HPLC. La ac i idad MnP se midió po espec o o ome ía
median e la oxidación de 2,6-dime oxi enol. Las écnicas ue on desc i as en el
Capí ulo 2 de Ma e iales y mé odos.
La concen ación de oxígeno disuel o se midió median e un oxíme o Oxi
340 WTW (Alemania).
Ca bono o gánico o al
El ca bono o gánico o al (COT) es una medida di ec a del con enido de la
ma e ia o gánica o al en una mues a. El COT se midió con un analizado
Shimadzu TOC-5000, que lo calcula como la di e encia en e el ca bono o al
(CT) e ino gánico (CI). Se u ilizó ai e de al a pu eza como gas po ado a 150
mL/min. El equipo de e mina el ca bono o al a pa i del CO2 que se p oduce
du an e la combus ión ca alí ica de la mues a a 680ºC, empleando como
ca alizado de oxidación pla ino inmo ilizado sob e es e as de alúmina. El
ca bono ino gánico se ob iene a pa i del CO2 que se p oduce po eacción con
H3PO4 al 25%. El CO2 se mide óp icamen e, después de habe eliminado la
humedad, en un de ec o de in a ojo no dispe si o (NDIR).
Ni ógeno o al Kjeldahl
El ni ógeno o al Kjeldahl (NTK) comp ende el ni ógeno o gánico y el
amoniacal. El NTK se midió en un analizado de ni ógeno o gánico o al
Doh mann DN-1900. Se de e mina como la di e encia en e el ni ógeno o al
(NT) y el ni ógeno ino gánico (NI). El gas po ado ue oxígeno con un 99,999%
de pu eza. El ni ógeno o al se calcula a pa i del NO2 que se p oduce du an e la
combus ión ca alí ica de la mues a a 850ºC. Pos e io men e, median e una
educción química con H2SO4 ca alizada po VaCl3 a 80ºC se de e mina el NI
(NO3-, NO2-). Se elimina la humedad y se hace eacciona con O3 pa a ob ene
NO2 en un es ado exci ado. La uel a de es e óxido a su es ado undamen al
p o oca la emisión de un p o ón, a pa i del cual se puede lle a a cabo la
de e minación de NI median e quimioluminiscencia, empleando un ubo
mul iplicado .
Capí ulo 4
102
3. Resul ados y discusión
3.1. E icacia de la memb ana
Con el obje i o de comp oba la idoneidad de la memb ana de
polie e sul ona seleccionada, se calcula on los coe icien es de echazo con
espec o al subs a o y a la enzima. Pa a ello, se hicie on pasa disoluciones de
O ange II y de MnP a a és de la memb ana du an e 60 min, y se analiza on las
concen aciones en la línea de e enido y pe meado al cabo de ese iempo. En la
Tabla 4.2 se mues an los alo es de dichas concen aciones y de los coe icien es
de echazo hallados a pa i de la Ecuación 1.
Tabla 4.2. Coe icien es de echazo de la memb ana con espec o a O ange II y MnP
Concen ación
alimen ación
Concen ación
e enido
Concen ación
pe meado
Coe icien e de
echazo
O ange II
MnP
92,78 mg/L
120 U/L
92,55 mg/L
120 U/L
90,46 mg/L
0 U/L
0,023
1
Ambos alo es de los coe icien es de echazo (0 pa a los subs a os y
p oduc os y 1 pa a la enzima) esul an idóneos pa a asegu a la capacidad de la
memb ana pa a la sepa ación de subs a os y p oduc os y e ención de la ac i idad
enzimá ica den o del eac o .
En expe imen os adicionales, en que se o zó a pasa odo el caudal de
O ange II a a és de la memb ana, sin línea de e enido, se comp obó que el 98%
del in e se ecupe ó en la co ien e de pe meado, indica i o de que no se p oduce
adso ción ísica del in e sob e la memb ana.
Po o a pa e, la es abilidad de la enzima en e al es és mecánico quedó
demos ada en un ensayo en que se hizo eci cula enzima du an e 180 min a
a és de la memb ana. T as es e iempo, se conse ó el 95% de la ac i idad
enzimá ica inicial, alo ap oximadamen e igual al del con ol en un sis ema
agi ado sin eci culación.
Deg adación en eac o enzimá ico de memb ana
103
3.2. Es a egias de adición de MnP
El p incipal obje i o de es e abajo se cen ó en el desa ollo de un sis ema
de decolo ación en con inuo en el que se pe siguió la maximización de la e icacia
del p oceso, de inida como la elación en e la can idad de in e deg adado (en
mg/h) y los eque imien os de enzima pa a la deg adación (en U/h). Dichos
eque imien os comp enden el consumo y la deses abilización de la enzima en la
eacción y se pueden es ablece como la pé dida de ac i idad enzimá ica du an e
el p oceso de deg adación. Se hace necesa io conoce es e alo pa a es ablece la
elocidad de adición de enzima necesa ia pa a man ene un alo cons an e en el
eac o y consegui de es a o ma un p oceso en con inuo.
Se ealiza on ensayos de deg adación de O ange II en el eac o con inuo de
anque agi ado. Pa a ello se p ocedió al llenado del eac o y conducciones con la
disolución de alimen ación indicada en la Tabla 4.3.
Tabla 4.3. Condiciones de los ensayos de decolo ación
Volumen
TRH
MnP inicial
Velocidad dosi icación H2O2
Caudal alimen ación
250 mL
60 min
200 U/L
50 µmol/L·min
4,17 mL/min
Alimen ación
O ange II
MnSO4
Ácido acé ico
100 mg/L
33 µM
1 mM
Las concen aciones de Mn2+, ácido o gánico, enzima inicial, elocidad de
dosi icación de H2O2 y el ipo de ácido empleado se eligie on en base a es udios
p e ios ealizados en discon inuo (Mielgo e al., 2003). El iempo de esidencia
de 1 h se omó a pa i de conside aciones ciné icas, pues en unción de la
ecuación ciné ica hallada en el Capí ulo 3 se ob u o que dicho TRH pe mi e una
decolo ación del e luen e en o no al 90%.
Adición de MnP en un único pulso
El consumo de enzima se de e minó median e un ensayo en que se ealizó
una única adición inicial de MnP al eac o enzimá ico. En dicho ensayo se
oma on mues as pe iódicas pa a analiza decolo ación del in e, ac i idad MnP y
oxígeno disuel o en el eac o (Figu a 4.4).

Capí ulo 4
104
0
20
40
60
80
100
0 25 50 75 100 125 150
Tiempo (min)
Decolo ación (%)
0
5
10
15
20
25
MnP/10 (U/L)
O
2
(mg/L)
c1
c2
Figu a 4.4. Decolo ación de O ange II en un ensayo con una única adición de MnP: ({)
decolo ación; (∆) ac i idad enzimá ica; (-) oxígeno disuel o; C1: oxígeno disuel o, con ol
sin adición de O ange II; C2: oxígeno disuel o, con ol sin adición de MnP
Al comienzo u o luga una mayo pé dida de ac i idad enzimá ica,
coinciden e con la deg adación inicial del in e. A pa i de los 40 min se alcanzó
una decolo ación del 90%, que se man u o p ác icamen e cons an e has a el inal
del ensayo. El consumo medio de enzima ob enido po e aluación de la pendien e
de la cu a ue de 37 U/L·h, que pe mi ió es ablece la elocidad de adición de
MnP pa a man ene un ni el cons an e de enzima en el eac o . La cons an e de
desac i ación enzimá ica kd calculada a pa i de la Ecuación 2 (Sehanpu i &
Hill, 2000) iene un alo de 0,204 h-1.
kd
eEE −
⋅= 0 (2)
La concen ación inicial de oxígeno disuel o en el eac o ue de 8,3 mg/L,
que co esponde a la solubilidad de oxígeno en la mezcla de eacción a 23ºC.
Du an e los p ime os 15 min, la concen ación de oxígeno disminuyó has a
alcanza un mínimo de 7,4 mg/L, y dicha disminución se p odujo de o ma
simul ánea a la máxima pendien e de decolo ación. A con inuación u o luga el
p oceso opues o, con un aumen o en la concen ación de oxígeno du an e los
siguien es 60 min has a que se alcanzó un alo cons an e de ap oximadamen e 12
mg/L.
Deg adación en eac o enzimá ico de memb ana
105
La in luencia de la uen e de oxígeno se in es igó en dos ensayos con ol:
uno de ellos sin adición de O ange II (C1 en Figu a 4.4) y o o sin adición de
MnP (C2 en Figu a 4.4). En el p ime caso la concen ación de oxígeno aumen ó
linealmen e a lo la go de odo el expe imen o, has a alo es supe io es a los
alcanzados en p esencia de in e (21 en e a 12 mg/L as 60 min). El oxígeno se
gene a en la eacción en e el Mn3+ p oducido en el ciclo ca alí ico de la enzima y
el H2O2 adicionado, y iene especial ele ancia cuando no hay p esencia de
subs a os que puedan se oxidados (Ai ken & I ine, 1990; Pé ez & Je ies,
1992; Ma ínez e al., 1996). O os abajos p esen an que MnP puede ene cie a
ac i idad ca alasa, que es dependien e de Mn2+ y es inhibida po oxala o o
cualquie o o subs a o de MnP (Timo ee ski e al., 1998; Gómez-To ibio e al.,
2001). Po úl imo, o a uen e de oxígeno pod ía se la eacción en e el
compues o III de MnP con Mn3+, que da luga a la gene ación de la enzima na i a
y a la libe ación de O2 (Timo ee ski e al., 1998). El oxígeno gene ado se u ilizó
luego en la deg adación del in e (Spada o & Rengana han, 1994; Chi ukula e
al., 1995; López e al., 2004). La di e encia en e las pendien es de la cu a C1 y
la de ensayo in o ma sob e la can idad de oxígeno eque ido pa a la oxidación de
O ange II. En los expe imen os ealizados sin adición de MnP, el ni el de oxígeno
no a ió du an e el ensayo, lo que indica que la adición de H2O2 po sí misma no
da luga a la gene ación de oxígeno.
Adición de MnP en ed-ba ch
En un ensayo lle ado a cabo en el eac o enzimá ico se conside a on
adiciones de MnP en pulsos. T as los p ime os 200 min de eacción, se
adiciona on pulsos de MnP cada ho a con el obje i o de man ene el ni el de
enzima en e 100 y 200 U/L, du an e un iempo de ope ación o al de 10 h (Figu a
4.5).
La mayo e icacia de decolo ación, supe io al 90%, se man u o du an e los
p ime os 120 min, mien as la ac i idad MnP ue supe io a 120 U/L;
pos e io men e, has a los 200 min, la ac i idad ue meno de 100 U/L, con lo que
la decolo ación disminuyó al 80%. La adición de un nue o pulso de enzima en
ese ins an e a o eció la ecupe ación de la e icacia de decolo ación.
Apa en emen e, se equie e un mínimo de ac i idad MnP en o no a 120 U/L, pa a
man ene una ope ación e icaz. Los po cen ajes meno es de decolo ación
Capí ulo 4
106
obse ados a 360 y 440 min co espondie on a allos ope acionales en la bomba
de dosi icación de H2O2.
0
20
40
60
80
100
120
0 100 200 300 400 500 600 700
Tiempo (min)
Decolo ación (%)
0
5
10
15
20
25
30
MnP/10 (U/L)
O
2
(mg/L)
Figu a 4.5. Decolo ación de O ange II en un ensayo con adición de MnP en pulsos: ({)
decolo ación; (∆) ac i idad enzimá ica; (-) oxígeno disuel o
La concen ación de oxígeno disuel o siguió un pe il simila a los ensayos
an e io es. Se p odujo una disminución inicial de oxígeno has a alo es de 7,4
mg/L de o ma simul ánea a la máxima pendien e de decolo ación. A pa i de ese
momen o se p odujo un aumen o has a alo es de 15 mg/L, que coincidió con los
alo es más al os de decolo ación. Pa alelamen e a la educción en la
decolo ación, la concen ación de oxígeno se edujo como consecuencia de la
pé dida de ac i idad enzimá ica. Los allos de dosi icación de H2O2 a los 360 y
440 min ocasiona on las espec i as caídas en la concen ación de oxígeno
disuel o has a alcanza un ni el de 10 mg/L. Es e hecho es debido a que cuando
no se adiciona H2O2 al eac o , no se p oduce oxígeno en la eacción.
Adición en con inuo de MnP
En los siguien es expe imen os la enzima MnP se añadió de o ma con inua
al eac o enzimá ico con el obje i o de man ene una ac i idad cons an e den o
del eac o . El ensayo, ealizado en las mismas condiciones que los an e io es,
dadas po la Tabla 4.3, con un bombeo con inuo de MnP pa a man ene un ni el
de 200 U/L en el eac o , ue un p oceso es able en que se alcanzó una
Deg adación en eac o enzimá ico de memb ana
107
decolo ación del 96% y una e icacia de 2,6 mg/U. Los da os compa a i os de las
es es a egias de adición de enzima se mues an en la Tabla 4.4.
Tabla 4.4. Da os compa a i os de las dis in as es a egias de adición de MnP
Es a egia de
adición de MnP
M
nP
(U/L)
Adición de
MnP (U/L·h)
Decolo ación
(%)
E icacia
(mg O ange II/U)
Único pulso inicial
Fed-ba ch
Con inuo
200-108
100-250
225
0
62,8
37,2
91,0
96,3
95,7
-
1,53
2,58
Una adición de MnP en con inuo a o ece la e icacia del p oceso, con un
meno consumo de enzima, man eniéndose un al o ni el de decolo ación.
3.3. Op imización de la ope ación en con inuo
Con el obje i o de mejo a el p oceso, bien sea median e la disminución de
consumo de enzima o median e el aumen o de la capacidad de deg adación de
in e, se es udió el e ec o de di e sos ac o es: i) ni el de ac i idad enzimá ica; ii)
elocidad de dosi icación de H2O2; iii) na u aleza de ácido o gánico; i ) iempo de
esidencia. Todos los ensayos se ealiza on en el eac o enzimá ico de memb ana
con un olumen de 250 mL y concen aciones en la alimen ación de 100 mg/L de
O ange II, 33 µM de MnSO4 y 1 mM de ácido o gánico. Los ensayos u ie on una
du ación de en e 4 y 8 h.
E ec o de la ac i idad MnP
Se conside a on dos alo es de ac i idad MnP en el eac o : 125 U/L, alo
seleccionado a pa i de los esul ados p e ios ob enidos en el ensayo de
alimen ación de MnP en ed-ba ch; y 225 U/L, alo conside ado en los ensayos
de decolo ación en discon inuo (Mielgo e al., 2003). La elocidad de
dosi icación de H2O2 ue de 50 µmol/L·min y el ácido empleado ue el ácido
acé ico. En la Tabla 4.5 se mues an los esul ados ob enidos una ez alcanzado el
es ado es aciona io.
Capí ulo 4
114
Oxígeno disuel o en es ado es aciona io
El seguimien o de la concen ación de oxígeno disuel o en los di e en es
ensayos de decolo ación pe mi ió comp oba la in luencia de cie as a iables de
ope ación. En los ensayos de alimen ación de MnP en pulsos se había obse ado
una a iación de la concen ación de oxígeno cuando se p oducían allos en el
caudal de dosi icación de H2O2; además, se obse ó que el alo de oxígeno
disuel o cuando se alcanza el es ado es aciona io depende de la VCO aplicada. En
la Figu a 4.8 se mues an las concen aciones de oxígeno en el es ado es aciona io
pa a dis in as condiciones de ope ación, empleando ácido acé ico.
0
2
4
6
8
10
12
0,133 0,2 0,3 50 25 15
VCO H
2
O
2
(g/L·h) (µmol/L·min)
Oxígeno disuel o (mg/L)
0
20
40
60
80
100
120
TRH (min)
Decolo ación (%)
45 30 20
Figu a 4.8. Concen ación de oxígeno disuel o (ba as) y decolo ación (•) en es ado
es aciona io en expe imen os lle ados a cabo en las siguien es condiciones: (a) elocidad
de dosi icación de H2O2: 25 µmol/L·min; (b) TRH de 45 min
La Figu a 4.8a mues a que el oxígeno disuel o en es ado es aciona io
disminuyó a medida que se disminuyó el TRH, has a alo es po debajo de
sa u ación con un TRH de 20 min. El alo de oxígeno disuel o en es ado
es aciona io es el esul ado del balance en e el oxígeno consumido en la
deg adación del in e y el p oducido como consecuencia de la ac i idad
enzimá ica. Es e balance da luga a alo es más bajos de oxígeno al aumen a el
consumo, es deci , a mayo es alo es de la VCO.
(a) (b)

Deg adación en eac o enzimá ico de memb ana
115
Po o a pa e, un aumen o en la elocidad de adición de H2O2 p o oca el
aumen o de la concen ación de oxígeno (Figu a 4.8b). Así, una dosi icación de
50 µmol/L·min ocasionó un exceso de oxígeno compa ado con el ni el de
sa u ación, mien as que una dosi icación de 15 µmol/L·min man u o la
concen ación de oxígeno en o no a 8 mg/L. Una al a concen ación de H2O2
a o ece su eacción con el Mn3+ gene ado enzimá icamen e, de mane a que se
libe a una mayo can idad de oxígeno (Ma ínez e al., 1996). Es o signi ica que
un alo ele ado de oxígeno disuel o indica un exceso de la concen ación de
H2O2 con espec o a la es equiomé icamen e necesa ia pa a la eacción
enzimá ica. Las Tablas 4.5, 4.7, 4.8 y 4.9 indican la elación mola de H2O2 y
O ange II en cada uno de los ensayos. Pa a un TRH de 45 min y una dosi icación
de 15 µmol/L·min de H2O2, cuando se alcanzan 8 mg/L de oxígeno disuel o en el
es ado es aciona io, esul a una elación de 2,4 mol/mol. Un alo supe io esul a
es equiomé icamen e excesi o p o ocando una desac i ación innecesa ia de la
enzima.
3.4. Dinámica del p oceso en con inuo
El es udio del compo amien o dinámico del eac o enzimá ico se lle ó a
cabo po medio de ope aciones en con inuo de la ga du ación, en que el obje i o
no ue únicamen e obse a los pa áme os ob enidos en es ado es aciona io, sino
man ene dicho es ado y comp oba la espues a del sis ema a di e en es cambios
en las condiciones de ope ación, y po lo an o, e alua la es abilidad del p oceso
de decolo ación.
Ensayo con inuo con a iación de la VCO
La op imización de las condiciones de ope ación del sis ema pe mi ió
mejo a su e icacia minimizando la pé dida de ac i idad enzimá ica y
maximizando la capacidad de deg adación de in e. La deg adación de in e se
puede inc emen a al aumen a la VCO en el sis ema, que depende an o del TRH
como de la concen ación de O ange II en la alimen ación. Pa a es udia cómo
a ec a es e úl imo ac o a la e icacia del sis ema, se lle ó a cabo un ensayo de 18
días de du ación en que se pa ió de las condiciones de ope ación es ablecidas en
los ensayos p e ios, desc i as en la Tabla 4.10, inc emen ándose secuencialmen e
la VCO de 0,1 a 0,3 g/L·h. Se de e minó egula men e la concen ación de
oxígeno disuel o, el ca bono o gánico o al (COT), el ni ógeno o al Kjeldahl
Capí ulo 4
116
(NTK) y las concen aciones de O ange II en el eac o y en la co ien e de salida,
an o po espec o o ome ía como po HPLC, pa a pode di e encia en e O ange
II y o os compues os que pod ían o ma pa e del e luen e y abso be a la misma
longi ud de onda que el in e.
Tabla 4.10. Condiciones de los ensayos de decolo ación
Volumen
TRH
MnP
Dosi icación H2O2
Caudal alimen ación
250 mL
60 min
200 U/L
15 µmol/L·min
4,17 mL/min
Alimen ación
O ange II
MnSO4
Ácido oxálico
100 mg/L
33 µM
1 mM
Se man u ie on las condiciones en es ado es aciona io du an e los 8
p ime os días (Figu a 4.9). A pa i de ese momen o la concen ación de O ange II
en el in luen e se ue aumen ando de mane a paula ina, y as cada cambio, la
concen ación a la salida del eac o se es abilizó en un co o pe íodo de iempo,
meno que 3 eces el TRH, de mane a que el sis ema ápidamen e ecupe ó el
es ado es aciona io (Figu a 4.9a). A medida que la VCO aumen ó desde 0,1 a 0,3
g/L·h, el po cen aje de decolo ación del sis ema disminuyó de 95,9 a 89,3%
(Tabla 4.11), aunque la capacidad de deg adación de in e aumen ó
conside ablemen e, lo que debe ía p oduci un aumen o de la e icacia del sis ema.
Sin emba go, la es abilidad de la enzima se io a ec ada a es a al a ca ga de in e,
bien sea po un e ec o inhibi o io del p opio subs a o o de los p oduc os
o mados en la deg adación, de mane a que la e icacia del sis ema disminuyó de
42,5 mg/U pa a la VCO de 0,23 g/L·h has a 26,7 mg/U pa a la VCO de 0,29
g/L·h. Conside ando que una concen ación de 300 mg/L de O ange II en el
in luen e (a VCO de 0,3 g/L·h) esul a poco ecuen e a ni el eal, se conside a
que una VCO en o no a 0,25 g/L·h esul a la más adecuada, pues pe mi e un
po cen aje de decolo ación ele ado, de 92,9%, y una e icacia de 42,5 mg/U, que
es un alo 16 eces supe io al ob enido en los p ime os ensayos de deg adación
de O ange II en con inuo en el eac o enzimá ico de memb ana.
Deg adación en eac o enzimá ico de memb ana
117
0
30
60
90
120
150
180
210
240
270
300
330
0 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14 15 16 17 18 19
Tiempo (d)
Ac i idad (U/L)
O ange II in luen e (mg/L)
0
10
20
30
40
50
60
70
80
90
100
110
O ange II e luen e (mg/L)
0
30
60
90
120
150
180
210
240
270
300
0 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14 15 16 17 18 19
Tiempo (d)
O ange II in luen e (mg/L)
O ange II eac o (mg/L)
0
1
2
3
4
5
6
7
8
9
10
Concen ación O
2
(mg/L)
Figu a 4.9. Ensayo de decolo ación con inc emen os sucesi os de la VCO. (a): (∆)
ac i idad enzimá ica; (-) O ange II en el in luen e; ({) O ange II en el e luen e
(espec o o ome ía); (•) O ange II en el e luen e (HPLC); (b): (---) O ange II en el
in luen e; ({) O ange II en el eac o (espec o o ome ía); (•) O ange II en el eac o
(HPLC); (-) oxígeno disuel o
La concen ación de oxígeno disuel o en el eac o expe imen ó un descenso
pa alelo al aumen o de la VCO en el sis ema (Figu a 4.9b), has a alo es de unos
7 mg/L. La mayo capacidad de deg adación se ob u o a la máxima VCO,
aplicando una elación de 1 mol H2O2 po mol de O ange II (Tabla 4.11). Es a
elación esul a su icien e pa a la deg adación del in e, ya que cada mol de H2O2
en el ciclo ca alí ico de la enzima in e cambia 2 e-, que son los que libe a 1 mol de
(a)
(b)
Capí ulo 4
118
O ange II en su mecanismo de deg adación (Goszczynski e al., 1994; Spada o &
Rengana han, 1994; Chi ukula e al., 1995).
Tabla 4.11. Da os compa a i os de las dis in as e apas de un p oceso en con inuo con
a iación de la VCO. Las concen aciones de O ange II ue on de e minadas po HPLC
Pe íodos
(d)
VCO
(g/L·h)
Deg adación
(g/L·h)
Decolo ación
(%)
E icacia
(mg/U)
H2O2/OII
(mol/mol)
0-8
9-10
11-12
13-14
15-16
17-18
0,103
0,130
0,192
0,229
0,291
0,103
0,098
0,123
0,183
0,212
0,260
0,102
95,9
95,0
95,2
92,9
89,3
98,8
19,8
24,7
36,6
42,5
26,7
20,4
3,0
2,2
1,5
1,3
1,0
3,0
El colo en el eac o se inc emen ó a medida que se aumen ó la VCO
(Figu a 4.9b). Cuando se ecupe ó la VCO de 0,1 g/L·h, el colo se man u o po
encima del alo inicial. Sin emba go, la concen ación de O ange II medida po
HPLC man u o una endencia simila en el eac o y en el e luen e.
El inc emen o de colo en el eac o pudo debe se a la colo ación na u al de
las p o eínas y demás compues os del c udo enzimá ico, con amaño supe io al
amaño de co e de la memb ana, que queda on e enidos en el eac o , y se
acumula on como consecuencia de la adición con inua de enzima. Se analizó el
COT y el NTK en el in e io del eac o y en la co ien e de salida du an e 16 d
(Figu a 4.10), y se obse ó que el e luen e man u o ni eles muy bajos, mien as
que la concen ación en el in e io del eac o ue c ecien e.
O a posible causa del colo en el eac o pudo se la o mación de un
p ecipi ado de Mn. El Mn3+ gene ado en el ciclo ca alí ico de la enzima es
ines able en disolución acuosa en ausencia de compues os complejan es,
dismu ándose en Mn2+ y Mn4+, que p ecipi a como MnO2. Es e p ecipi ado iene
un colo pa duzco, simila al ob enido en el eac o as a ios días de ope ación.
Se ealiza on análisis de la concen ación de Mn soluble en las co ien es de
en ada y salida del eac o , así como en el medio de eacción, as habe il ado
las mues as. Se ob u o que las concen aciones medias en el in luen e y e luen e
ue on 34 y 30 µM espec i amen e, mien as que en el medio ue de 161 µM as
Deg adación en eac o enzimá ico de memb ana
119
8 d de eacción. Es os da os pa ecen indica que se p oduce una cie a
acumulación de Mn en el in e io del eac o .
0
250
500
750
1000
1250
1500
1750
2000
2250
2500
0 1 2 3 4 5 6 7 8 9 101112131415161718
Tiempo (d)
COT (mg/L)
0
12
24
36
48
60
72
84
96
108
120
NTK (mg/L)
Figu a 4.10. Ensayo de decolo ación con inc emen os sucesi os de la VCO: ({) COT;
(∆) NTK; símbolos abie os: concen aciones en el e luen e; símbolos ce ados:
concen aciones en el eac o
A pesa del colo pa duzco en el medio, el sis ema se man u o es able
du an e los 18 d de ope ación, sin necesidad de limpia la memb ana. La
implemen ación de es e p oceso a mayo escala implica ía la necesidad de abaja
con a ias memb anas, de mane a que se p ocediese a la limpieza de una mien as
la o a es u iese en ope ación.
Ensayo con inuo con a iación de la adición de H2O2
Se ealizó un nue o ensayo de 6 d de du ación en el que se es udió la
elación en e la adición de H2O2 y O ange II. Pa a ello se conside a on las
condiciones de pa ida desc i as en la Tabla 4.10; al cabo de 1 d se aumen ó la
VCO a 0,26 g/L·h y con es as condiciones se aumen ó paula inamen e la
elocidad de dosi icación de H2O2.

Capí ulo 4
120
Tabla 4.12. Da os compa a i os de las dis in as e apas de un p oceso en con inuo con
a iación de H2O2. Las concen aciones de O ange II ue on de e minadas po HPLC
Pe íodos
(d)
VCO
(g/L·h)
H2O2
(
µ
mol/L·min)
Decolo ación
(%)
E icacia
(mg/U)
H2O2/OII
(mol/mol)
0-1
1-2
2-3
3-4
4-6
0,093
0,260
0,260
0,260
0,260
15
15
19,5
22,5
19,5
98,4
91,4
93,7
97,7
91,7
18,3
40,9
27,2
22,2
29,5
3,4
1,0
1,4
1,6
1,4
Una elación equimola en e H2O2 y O ange II dio luga a una buena
decolo ación y una al a e icacia, de 41 mg/U (Tabla 4.12). A medida que se
aumen ó la adición de H2O2, la elocidad de decolo ación aumen ó, pe o ambién
la pé dida de ac i idad enzimá ica, con lo que el esul ado global ue una
disminución de la e icacia del sis ema. Es e ensayo co obo ó la conclusión de
que una elación 1:1 en e H2O2 y O ange II es la más adecuada pa a ealiza la
deg adación del in e en un eac o enzimá ico en con inuo.
3.5. Ope ación en es ado no es aciona io
El es udio del compo amien o del eac o en es ado no es aciona io apo a
in o mación sob e la es abilidad del sis ema, pues indica cómo eacciona es e an e
una sob eca ga simila a la que pod ía ene luga en un p oceso eal y mues a la
capacidad del sis ema pa a ecupe a el es ado es aciona io. Se ealizó un ensayo
de 9 d de du ación en un e men ado BIOSTAT Q (Figu a 4.11) con 500 mL de
medio de eacción, en el que se aplica on las condiciones de pa ida desc i as en
la Tabla 4.13. Cada 24 h se modi ica on algunos pa áme os de ope ación ales
como VCO, TRH y la elocidad de adición de H2O2, du an e pe íodos de 1 h, de
o ma que se mul iplica on los alo es usuales po ac o es de 0,5 y 2, y la
empe a u a a ió desde la ambien e (22ºC) has a 20ºC y 30ºC. Se ealizó el
seguimien o del oxígeno disuel o, pH y concen ación de O ange II en el eac o y
el e luen e, median e medidas espec o o omé icas y HPLC.
Deg adación en eac o enzimá ico de memb ana
121
Figu a 4.11. Equipo pa a la decolo ación de O ange II en un e men ado BIOSTAT Q
asociado a una memb ana de ul a il ación
Tabla 4.13. Condiciones del ensayo de decolo ación con sob eca gas
Volumen
TRH
MnP
Dosi icación H2O2
Caudal alimen ación
500 mL
60 min
200 U/L
15 µmol/L·min
8,33 mL/min
Alimen ación
O ange II
MnSO4
Ácido oxálico
100 mg/L
33 µM
1 mM
Capí ulo 4
122
T as alcanza el es ado es aciona io, se alimen ó el eac o du an e 1 h con
una disolución de in e de 200 mg/L, de mane a que la VCO se duplicó
(Sob eca ga 1 en Figu a 4.12). Se obse ó un aumen o de la concen ación de
O ange II en el e luen e y una disminución de la concen ación de oxígeno
disuel o, debido al mayo consumo causado po la mayo ca ga de O ange II. Las
espues as de las a iaciones de TRH siguie on los mismos pe iles (Sob eca gas
2 y 9 en Figu a 4.12). En conclusión, una disminución del TRH, es deci , un
aumen o de VCO, da luga a una meno decolo ación y meno concen ación de
oxígeno disuel o; po el con a io, un aumen o del TRH, es deci , una disminución
de la VCO, da luga a un pequeño aumen o de la decolo ación y de la
concen ación de oxígeno disuel o.
Las pe u baciones en la elocidad de adición de H2O2 ocasiona on las
a iaciones más al as en la concen ación de oxígeno disuel o, po lo an o es e es
el pa áme o que más in luye en el balance en e el oxígeno p oducido y el
consumido (Sob eca gas 3, 4 y 8 en Figu a 4.12). Un inc emen o en la
dosi icación de H2O2 (Sob eca ga 4) no mejo a la decolo ación, ya que una
elación equimola H2O2/O ange II es su icien e pa a alcanza una buena
decolo ación. Sin emba go, a pa i del día 6 la VCO se duplicó, de mane a que la
elación H2O2/O ange II disminuyó a 0,5. Al ealiza la sob eca ga 8 la elación
omó el alo de 1 y la decolo ación mejo ó. Se co obo a, po an o, que una
elación equimola es la más adecuada pa a ealiza la deg adación de O ange II.
Las a iaciones de empe a u a, en un ango de 10ºC (Sob eca gas 5, 6, 7 y
10 en Figu a 4.12), apenas a ec a on a la decolo ación, y causa on lige as
a iaciones en la concen ación de oxígeno disuel o, que ue on debidas al p opio
e ec o de la empe a u a sob e la solubilidad del oxígeno.
Du an e los pe íodos de sob eca ga los pa áme os medidos su ie on
modi icaciones, aunque después de cada pe u bación el sis ema se ecupe ó
ápidamen e alcanzando de nue o el es ado es aciona io. Es os pa áme os son
ácilmen e medibles on line, de mane a que se puede es ablece un sis ema de
con ol con el in de e i a ales pe u baciones y man ene las condiciones de
es ado es aciona io en el eac o .
Deg adación en eac o enzimá ico de memb ana
123
0
30
60
90
120
150
180
210
240
270
300
330
012345678910
Tiempo (d)
Ac i idad (U/L)
O ange II in luen e (mg/L)
0
10
20
30
40
50
60
70
80
90
100
110
O ange II e luen e (mg/L)
0
30
60
90
120
150
180
210
240
270
300
012345678910
Tiempo (d)
O ange II in luen e (mg/L)
O ange II eac o (mg/L)
6,0
6,4
6,8
7,2
7,6
8,0
8,4
8,8
9,2
9,6
10,0
Concen ación O
2
(mg/L)
Figu a 4.12. Ensayo de decolo ación con sob eca gas. (a): (∆) ac i idad enzimá ica; (-)
O ange II en el in luen e; ({) O ange II en el e luen e; (b): (---) O ange II en el in luen e;
({) O ange II en el eac o ; (-) oxígeno disuel o. Modi icaciones: (1) O ange II 200 mg/L;
(2) TRH 30 min; (3) H2O2 7,5 µmol/L·min; (4) H2O2 30 µmol/L·min; (5) T 20ºC; (6) T
30ºC; (7) T 20ºC; (8) H2O2 30 µmol/L·min; (9) TRH 90 min; (10) T 30ºC
3.6. Modelización
Con el obje i o de ob ene una ecuación de diseño que pe mi a simula los
da os expe imen ales y op imiza los esul ados, se o muló un modelo pa a la
decolo ación enzimá ica de O ange II en el eac o de memb ana. Pa a ob ene las
ecuaciones ma emá icas que desc ibie on ese modelo se asumie on una se ie de
conside aciones: i) el con enido del eac o es á pe ec amen e mezclado y se
(a)
(b)
1 2 3 4 5 6 7 8 9 10
1 2 3 4 5 6 7 8 9 10
Capí ulo 4
130
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Inmo ilización de MnP
133
Capí ulo 5
Inmo ilización de MnP
Resumen
En es e capí ulo se ealiza el es udio de di e en es écnicas de inmo ilización
enzimá ica de MnP pa a su pos e io aplicación en la deg adación en con inuo de
O ange II. Se es udia on sopo es basados en in e acciones iónicas y en enlaces
co alen es, y se analiza on di e sos ac o es: capacidad de e ención de enzima,
pé dida de ac i idad enzimá ica du an e el p oceso de inmo ilización, es abilidad
de la enzima inmo ilizada, in e acción en e el sopo e y el in e O ange II,
acilidad del p oceso de ac i ación del sopo e y cos e. Se seleccionó como más
adecuado pa a la inmo ilización de MnP un sopo e de aga osa-glu a aldehido, en
que se p oduce una unión co alen e en e los g upos aldehido del sopo e y los
g upos amino de la supe icie de la enzima. El p oceso de ac i ación de es e
sopo e es ela i amen e sencillo, la e ención enzimá ica es del 100% y la
es abilidad é mica es buena; como con apa ida, la pé dida de ac i idad du an e
el p oceso de inmo ilización es de un 50%, la in e acción en e el sopo e y el
in e es muy ele ada y el sopo e no es ecupe able.
Capí ulo 5
134
Índice
1. In oducción
2. Ma e iales y mé odos
2.1. Compues os químicos
2.2. P epa ación del c udo enzimá ico
2.3. Ac i ación de los sopo es e inmo ilización
2.4. Es udios de es abilidad
2.5. De e minación de conduc i idades
2.6. Es udios de adso ción de O ange II sob e los de i ados
2.7. Técnicas analí icas
3. Resul ados y discusión
3.1. Es udios de es abilidad
3.2. Inmo ilización de MnP sob e dis in os ipos de sopo es
3.3. Es abilidad de los de i ados en e a la empe a u a
3.4. Compa ación de conduc i idades
3.5. Adso ción de O ange II sob e el sopo e
4. Conclusiones
5. Re e encias
135
144
144
145
145
150
151
151
151
152
152
154
157
158
159
160
162
Inmo ilización de MnP
135
1. In oducción
Las enzimas han sido ampliamen e u ilizadas en p ocesos indus iales po su
ele ada e icacia ca alí ica, su al o g ado de especi icidad y su capacidad pa a
abaja en condiciones sua es de empe a u a, p esión y pH (K ajewska, 2004).
Sin emba go, su aplicación indus ial se ha is o gene almen e limi ada po una
se ie de ac o es, ales como su disponibilidad en pequeñas can idades, sus al os
cos es y su ecuen e ines abilidad en las condiciones de eacción deseadas ( an
de Velde e al., 2002). Algunas de es as des en ajas del uso de enzimas se pueden
e i a median e la inmo ilización, p oceso median e el cual se con ina a la enzima
en una egión de inida del espacio, de mane a que se pueda usa epe ida y
con inuamen e (Ka chalski-Ka zi & K aeme , 2000). Las en ajas y des en ajas
de la inmo ilización enzimá ica se p esen an en la Tabla 5.1 ( an de Velde e al.,
2002; Bo nscheue , 2003).
Tabla 5.1. Ven ajas y des en ajas de la inmo ilización enzimá ica
Ven ajas
Fácil sepa ación y ecupe ación de enzima y p oduc os
Reu ilización
Aumen o de la es abilidad é mica y esis encia con a agen es desna u alizan es
Robus ez
Fácil de ención de las eacciones
Facilidad de ope ación en con inuo
Flexibilidad de diseño de bio eac o es
P e ención de la con aminación de p o eína en el p oduc o
P e ención más simple de la con aminación mic obiana
Des en ajas
Disminución de la ac i idad enzimá ica en el p oceso de inmo ilización
Aumen o de la cons an e de Michaelis-Men en
Limi aciones de ans e encia de ma e ia
Cos e ex a
Aumen o del olumen de ca alizado
Búsqueda de un mé odo adecuado de inmo ilización

Capí ulo 5
136
Los p ime os abajos de inmo ilización enzimá ica se ealiza on en 1960
(Ba -Eli & Ka chalski, 1960), y desde en onces se han es udiado nume osos
mé odos de inmo ilización sob e una a iedad de sopo es. Las ca ac e ís icas que
debe ene un sopo e pa a se la base del p oceso de inmo ilización enzimá ica se
mues an en la Tabla 5.2 (K ajewska, 2004).
Tabla 5.2. Requisi os de un sopo e pa a inmo ilización enzimá ica
Al a a inidad po p o eínas
Disponibilidad de g upos uncionales eac i os
Hid o ilicidad
Es abilidad mecánica y igidez
Regene abilidad
No oxicidad y biocompa ibilidad
Biodeg adabilidad
Cos e educido
La selección del sopo e y mé odo adecuados pa a la inmo ilización de una
de e minada enzima y pa a una aplicación conc e a se ealiza median e ensayo-
e o . Se deben ene en cuen a una se ie de conside aciones económicas,
p ác icas y écnicas:
i) El p oceso de ac i ación del sopo e pa a p omo e la unión con la enzima
debe se sencillo
ii) El p oceso de inmo ilización debe ealiza se en condiciones sua es, que no
p o oquen la desac i ación de la enzima
iii) La inmo ilización debe da como esul ado una al a e ención enzimá ica
i ) La es abilidad del de i ado en e a empe a u a, pH y esis encia mecánica
debe se ele ada
) Los p ocesos de ac i ación del sopo e e inmo ilización deben ene bajo
cos e
i) En aplicaciones conc e as como la de deg adación de in es, el sopo e no
debe ía ene in e acción con el in e
Según el ipo de enlace en e la enzima y el sopo e, los mé odos de
inmo ilización enzimá ica se pueden clasi ica en mé odos ísicos o químicos.
Los mé odos ísicos p opo cionan una unión débil en e la enzima y el sopo e, de
mane a que apenas se modi ica la es uc u a na i a de ambos; debido a eso, la
es abilidad de la enzima a a ez aumen a. Como con apa ida, la unión se puede
ompe dando luga a una ecupe ación del sopo e (Du án e al., 2002). Los
Inmo ilización de MnP
137
mé odos químicos gene an enlaces en e enzima y sopo e, p oduciendo uniones
más ue es. En unción de los g upos que en en a o ma pa e de es a unión y de
la con o mación de la p o eína as la inmo ilización, la es abilidad de la misma
puede inc emen a se, pues el cen o ac i o de la enzima puede e se p o egido de
p ocesos in e molecula es (ag egación, p o eólisis) o de in e acciones con ac o es
ex e nos (ai e, disol en es o gánicos inmiscibles) que pueden ene e ec o
nega i o sob e la es abilidad (Ma eo e al., 2000a). Sin emba go, en nume osas
ocasiones la inmo ilización no a ec a, o incluso a ec a nega i amen e, a la
es abilidad de la enzima (Gian eda & Sca i, 1991). Po o a pa e, las uniones
co alen es son más di íciles de ompe , de mane a que la e e sibilidad del
p oceso es más compleja y los sopo es no son ecupe ables. Los p incipales
mé odos ísicos y químicos se esquema izan en la Figu a 5.1 ( an de Velde e al.,
2002).
Mé odos ísicos
i) In e acción iónica: Los g upos ca gados de la enzima in e accionan con los
g upos del sopo e de ca ga opues a. La es abilidad del p epa ado es sensible
a cambios en pH y ue za iónica, po lo an o el sopo e es ácil de egene a .
ii) A apamien o: Se a a de un mé odo de inmo ilización median e el cual se
gene a una ma iz (gel, memb ana…) donde las enzimas quedan e enidas.
No se p oduce enlace o modi icación de la es uc u a de la enzima, po lo
an o el a apamien o es un mé odo de inmo ilización sua e. Su p incipal
des en aja es la di icul ad pa a consegui un amaño de po o adecuado, pues
si el po o es g ande hay pé dida de p o eína a su a és, pe o si es pequeño
exis en p oblemas de di usión de subs a os y p oduc os.
iii) Encapsulación: Se lle a a cabo median e memb anas polimé icas, que se
c ean al ededo de las enzimas de mane a que es as quedan e enidas en
cápsulas. Su aplicación iene las mismas limi aciones que el a apamien o.
Mé odos químicos
i) Enlace co alen e: El enlace se p oduce po eacción en e los g upos
eac i os de la supe icie de la p o eína y del sopo e. A menudo es necesa ia
una ac i ación p e ia del sopo e con g upos adecuados pa a su unión a la
enzima. Las uniones pueden se uni o mul ipun uales: es as son más ue es
pe o pueden p oduci cambios es uc u ales ocasionando caída de ac i idad.
Capí ulo 5
138
Mé odos ísicos Mé odos químicos
In e acción iónica
A apamien o
Encapsulación
Enlace co alen e
En ec uzamien o
Figu a 5.1. Mé odos de inmo ilización enzimá ica
Enzima Enzima
Enzima Enzima
Enzima
Enzima
Enzima
Enzima
Enzima
Enzima
Enzima
NH+
NH2+
O OH
NH2+
NH+ O OH
Enzima
Enzima
NH
3
+
NH
3
+
NH
2
+
NH
2
+
NH2+
NH
2
+
NH
2
+
NH
2
+
NH
2
NH2
NH
2
NH
3
+
Enzima
Inmo ilización de MnP
139
ii) En ec uzamien o: Es a écnica implica la unión en e moléculas de enzima
po medio de enlaces co alen es, empleando compues os bi- y
mul i uncionales como mediado es de dichos enlaces. Al no se necesa io el
uso de un sopo e, es e mé odo puede esul a más económico y no gene a
esiduos, aunque es de di ícil con ol.
En la Tabla 5.3 se desc iben algunos de los mé odos empleados pa a la
inmo ilización de una g an a iedad de enzimas, así como su campo de
aplicación. Ac ualmen e son a ios los abajos en que se emplean enzimas
inmo ilizadas pa a la eliminación de compues os ecalci an es, en e ellos, in es
y e luen es de la indus ia papele a.
Los p ime os abajos ace ca del es udio de écnicas de inmo ilización de
MnP son del año 1995. G abski e al. (1995) lle a on a cabo una inmo ilización
co alen e en e los g upos ca boxilo de la enzima y los g upos amino del sopo e
polimé ico EmphazeTM, ob eniendo e icacias de unión de 40-50%. Pe al a-
Zamo a e al. (1998) aplica on un mé odo de in e cambio iónico pa a inmo iliza
MnP y LiP en la esina Ambe li a IRA-400, ob eniendo una e ención casi o al de
la ac i idad enzimá ica al cabo de 30 min. Van Aken e al. (2000)
coinmo iliza on MnP y glucosa oxidasa median e un enlace co alen e en sopo e
de sílice, u ilizando glu a aldehido como compues o de unión. Se p odujo una
pé dida de ac i idad enzimá ica del 40% en el p oceso de inmo ilización, pe o
aumen ó la es abilidad en e a H2O2 y pH. Sasaki e al. (2001) es udia on la
e ención de la enzima MnP po adso ción sob e un sopo e FSM-16 con
di e en es amaños de po o. En dicho p oceso se consiguió una al a es abilidad
enzimá ica cuando el diáme o del po o e a ap oximadamen e igual al amaño de
la enzima. Po úl imo, Mielgo e al. (2003) es udia on la inmo ilización de MnP
po enlace co alen e con un sopo e de aga osa ac i ado con moléculas de
glu a aldehido, en el que la unión iene luga en e los g upos aldehido del sopo e
y los g upos amino o amino e minal de la enzima, g upos muy eac i os que se
encuen an usualmen e en la supe icie de la enzima y no suelen o ma pa e del
si io ac i o. En es e abajo se encon ó que una unión mul ipun ual ealizada a
baja ue za iónica pe mi ió alcanza un 100% de e ención e inc emen a la
es abilidad de la enzima.
En es e capí ulo se p e ende ealiza un es udio de di e en es mé odos de
inmo ilización de MnP y analiza el más con enien e de ca a a su aplicación en el
p oceso de deg adación en con inuo de O ange II.
Capí ulo 8
242
mayo apo ación a es os alo es ue ealizada po los AGV adicionados, que
ac úan como subs a o de la deg adación. Las al as eliminaciones de DQO y COT,
en o no al 90% (Figu a 8.8), ue on debidas al consumo de subs a o ealizado po
la biomasa anae obia. Po es e mo i o se hace di ícil de e mina cuál ue el
consumo de DQO y COT ela i os al e luen e enzimá ico en unción de es os
alo es.
0
10
20
30
40
50
60
70
80
90
100
0246810121416
Tiempo (d)
Eliminación de DQO, COT y colo (%)
Figu a 8.8. Eliminación de () DQO, (□) COT y ({) colo du an e la ope ación en el
eac o anae obio con inuo
La eliminación de colo ue baja, sob e un 20-30%, como se obse aba en
los ensayos de biodeg adabilidad anae obia. La pé dida de colo ue debida a la
deg adación de O ange II, que se encuen a en pequeñas can idades en el e luen e
enzimá ico, mien as que o os componen es colo eados del mismo no se
deg ada on po ía anae obia. La compa ación en e los espec os de abso bancia
del in luen e y el e luen e del eac o e leja un lige o descenso del colo a la
longi ud de onda de máxima abso bancia, así como un desplazamien o del pe il
de abso bancias a la salida en elación con la en ada (Figu a 8.9). Dicho
desplazamien o pod ía se debido a la deg adación de unos p oduc os y la
gene ación de o os que abso ben a longi udes de onda meno es.
La composición de las co ien es de en ada y salida se analizó median e
HPLC (Figu a 8.10). Se obse ó la desapa ición de O ange II p esen e en el
in luen e ( =7,1 min); sin emba go, el compues o 4-hid oxibencenosul ona o
( =2,2 min) no ue deg adado, al como sucedía en los ensayos de

Pos a amien o bac e iano
243
biodeg adabilidad. Los c oma og amas de HPLC mues an la disminución de
algunos o os compues os p esen es en el e luen e enzimá ico.
0
1
2
3
4
5
6
200 300 400 500 600 700 800
Longi ud de onda (nm)
Abso bancia
Figu a 8.9. Compa ación de los espec os de abso bancia de in luen e (línea g uesa) y
e luen e (línea ina) del a amien o en un eac o anae obio con inuo
Figu a 8.10. Composición de las mues as de (a) in luen e y (b) e luen e del eac o
anae obio con inuo. Tiempos de e ención: 4-hid oxibencenosul ona o: 2,2 min;
O ange II: 7,1 min
min
1 2 3 4 5 6 7 8 9
mAU
0
50
100
150
200
1.772
1.869
2.191
2.410
3.258
4.246 5.135
7.105
min
1 2 3 4 5 6 7 8 9
mAU
0
50
100
150
200
1.784
2.182
2.474 3.289
4.580
(b)
(a)
Capí ulo 8
244
El a amien o anae obio aumen ó la oxicidad de las mues as (Tabla 8.11),
aunque los alo es de EC50 alcanzados an o pa a el in luen e como pa a el
e luen e son muy supe io es a la concen ación de 3000 ppm, po debajo de la
cual una mues a se conside a óxica.
Tabla 8.11. Toxicidad del in luen e y e luen e del pos a amien o anae obio en con inuo
Mues a EC50 (ppm) Toxicidad
In luen e eac o anae obio
E luen e eac o anae obio
3,5·105
2,5·105
No óxico
No óxico
El aumen o de oxicidad puede debe se a la gene ación de aminas a omá icas
as el a amien o anae obio del in e esidual ( an de Zee & Villa e de, 2005),
pe o debido a su pequeña concen ación, no apo an ca ác e óxico al e luen e. La
eliminación de DQO, COT, colo y deg adación de a ios compues os que o man
pa e del e luen e enzimá ico señalan al sis ema anae obio como adecuado pa a el
pos a amien o del mismo.
3.3. T a amien o ae obio
Biodeg adabilidad ae obia
Los ensayos de DBO5 u ie on dos obje i os p incipales: i) comp oba si el
in e O ange II y el e luen e enzimá ico esul an óxicos pa a la biomasa ae obia;
ii) es udia la biodeg adabilidad de las co ien es analizadas, obse ando el
consumo de oxígeno po las bac e ias ae obias.
En p ime luga se ealiza on ensayos de an eo, pa a de e mina la
concen ación de sólidos al que pe mi a ob ene unos alo es de consumo de
oxígeno adecuados al ango ma cado po el mé odo Oxi op que se aplicó. Pa a
ello se ealiza on ensayos con ol (sin uen e de ca bono), con O ange II y con
e luen e, po duplicado, a es concen aciones di e en es de biomasa: 0,002-0,02
y 0,2 g SSV/L. Dado que la DQO del e luen e enzimá ico es de 200 mg/L, se
conside ó la dilución de las mues as po un ac o de 5 (Tabla 8.4), de mane a
que el agua de dilución con ibuyó a la apo ación de nu ien es al medio. Se
ealiza on con oles con biomasa inac i ada y se comp obó que no se p odujo
adso ción del in e sob e el lodo.
Pos a amien o bac e iano
245
0
10
20
30
40
50
60
01234567
Tiempo (d)
DBO (mg/L)
0
10
20
30
40
50
60
01234567
Tiempo (d)
DBO (mg/L)
Figu a 8.11. Ensayos de DBO5 de: (a) O ange II; (b) e luen e de deg adación enzimá ica;
(∆) 0,002 g SSV/L; (□) 0,02 g SSV/L; ({) 0,2 g SSV/L; símbolos abie os: con ol sin
uen e de ca bono; símbolos ce ados: ensayos con uen e de ca bono
Tan o en los con oles como en p esencia de uen es de ca bono, la
concen ación de sólidos más ele ada implicó un consumo de odo el oxígeno del
espacio lib e de la bo ella al cabo de 24 h. La concen ación más adecuada de
biomasa pa a que los alo es de DBO se si úen en el ango de medida ue un
alo in e medio de 0,02 g SSV/L. Con es a concen ación de biomasa, en
p esencia de O ange II se ob u ie on alo es de DBO simila es a los ob enidos en
los con oles sin uen e de ca bono. Es o es indica i o de que la biodeg adabilidad
del in e es p ác icamen e nula y de que el in e no esul a óxico a la biomasa. El
(a)
(b)
Capí ulo 8
246
análisis de las mues as po HPLC con i mó que la concen ación de O ange II se
man u o cons an e a lo la go de odo el ensayo. En p esencia de e luen e
enzimá ico, se ap eció di e encia en cuan o al consumo de oxígeno con espec o
al con ol. Además los análisis de HPLC mos a on la disminución de algunas
señales, como la co espondien e a 4-hid oxibencenosul ona o, que desapa ece
po comple o. Es o indica una cie a biodeg adabilidad ae obia del e luen e
enzimá ico.
El ensayo de DBO
5 se epi ió en p esencia de e luen e con una
concen ación de biomasa in e media, de 0,065 g SSV/L, y diluyendo un ac o de
2, de mane a que el olumen o al de ensayo ue de 250 mL (Tabla 8.4). Los
esul ados con i ma on la biodeg adabilidad del e luen e con espec o al con ol,
pues se obse ó una cla a di e encia en e ambos consumos de oxígeno (20%
supe io en p esencia de e luen e as 7 d de ensayo).
La DQO eliminada en el ensayo con ol ue de 11,8 mg/L, co espondien e a
eliminación de biomasa, como único componen e que apo a DQO a la mues a
(Tabla 8.12). La DQO eliminada en el ensayo con e luen e ue de 47,2 mg/L, lo
que implica que pa e de los componen es del e luen e ue on deg adados po las
bac e ias ae obias. Además, la eliminación de un po cen aje de COT implica la
mine alización pa cial del e luen e.
Tabla 8.12. Eliminación de DQO, COT y colo as 7 d en los ensayos de
biodeg adabilidad ae obia
DQO COT Colo
Mues a DQO0
(mg/L)
Eliminación
(%)
COT0
(mg/L)
Eliminación
(%)
Abs461 nm Eliminación
(%)
Con ol
E luen e
66,6
100
8,8
23,6
20,8
32,6
9
24,7
-
0,385
-
0
Se ealiza on análisis de c oma og a ía pa a de e mina la deg adación de los
compues os cons i uyen es del e luen e (Figu a 8.12). La concen ación del in e
O ange II ( =7,7 min) pe maneció in a iable as 7 d de ope ación en el sis ema
ae obio, de mane a que el sis ema no expe imen ó decolo ación (Tabla 8.12). Sin
Pos a amien o bac e iano
247
emba go, o os compues os ales como 4-hid oxibencenosul ona o ( =2,0 min)
ue on deg adados en condiciones ae obias.
Figu a 8.12. Composición de las mues as del ensayo de biodeg adabilidad ae obia: (a)
iempo inicial; (b) as 7 d. Tiempos de e ención: 4-hid oxibencenosul ona o: 2,0 min;
O ange II: 7,7 min
El a amien o ae obio no con ibuye a la decolo ación del e luen e de
deg adación enzimá ica de O ange II; a pesa de ello, pe mi e la deg adación de
o os compues os, que no apo an colo , pe o pueden apo a oxicidad a las
mues as. Po lo an o, se puede conside a el a amien o ae obio en con inuo
como una opción de pos a amien o bac e iano de O ange II.
Reac o ae obio con inuo
La ope ación del eac o de lodos ac i os se man u o du an e 42 d (Figu a
8.13). En unción de las condiciones de abajo, se di idió en 5 e apas (Tabla 8.6):
du an e las es p ime as, co espondien es a los p ime os 25 d, el eac o abajó
sin e luen e enzimá ico, has a consegui una ope ación es able; du an e las dos
úl imas, además de glucosa, se adicionó e luen e como uen e de ca bono.
Du an e odo el uncionamien o del eac o , se analizó la concen ación de
glucosa en el in luen e y e luen e, y se comp obó que el consumo ue del 100%.
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120
140
160
1.796
1.875
2.040
2.203
2.428 3.267
4.551 7.708
(a)
min
1 2 3456789
mAU
0
20
40
60
80
100
120
140
160
1.793
1.881
2.042
2.212
2.454
3.265
4.557 7.708
(b)

Capí ulo 8
248
La empe a u a se man u o en e 19 y 23ºC, el oxígeno disuel o en e 6 y 8 mg/L
y la biomasa se man u o en e 1,5 y 2 g SSV/L.
Figu a 8.13. Reac o de lodos ac i os pa a el a amien o ae obio del e luen e de la
deg adación enzimá ica de O ange II
La ope ación comenzó con una DQO de en ada de 800 mg/L, apo ada
p incipalmen e po 750 mg/L de glucosa, y una concen ación de bica bona o de
100 mg/L. El pH du an e es a p ime a e apa se man u o po alo es incluso
in e io es a 6, con lo cual en el día 5 se aumen ó la concen ación de bica bona o
has a 1 g/L. Es a segunda e apa es u o ma cada po la lo ación de los lodos en el
sedimen ado , a consecuencia de lo cual se p oduje on pé didas de biomasa po la
salida del eac o , lo que di icul ó una ope ación es able en cuan o a
concen ación de SSV. Una de las causas comunes de lo ación de los lodos es la
gene ación de bac e ias ilamen osas que se p oducen cuando la elación F/M
(alimen ación/mic oo ganismos), iene un alo ele ado, supe io a 0,6 g DQO/g
SSV·d (Ramalho, 1996). La elación F/M en la e apa 2 del a anque del eac o
ue de 0,8 g DQO/g SSV·d. Pa a e i a es e p oblema, es e alo se disminuyó a la
mi ad en una e ce a e apa, disminuyendo la concen ación de glucosa a la mi ad,
y en consecuencia las uen es de N y P. En es as condiciones, se man u o una
ope ación es able du an e 14 d, con una concen ación de biomasa del o den de
1,5 g SSV/L y un pH de 7,5.
Pos a amien o bac e iano
249
Con el eac o ope ando en condiciones es ables, se comenzó a alimen a el
e luen e de la deg adación enzimá ica de O ange II, en el que se añadió la
concen ación de glucosa necesa ia pa a ob ene una DQO igual a la de la e apa 3.
Pa a ello, eniendo en cuen a que la DQO del e luen e es de 193 mg/L, se edujo
la glucosa a la mi ad y se man u ie on las concen aciones de uen es de N y P.
Du an e las e apas 4 y 5 las condiciones de la alimen ación ue on las indicadas
en la Tabla 8.13.
Tabla 8.13. Ca ac e ís icas de la alimen ación del eac o ae obio con inuo
DQO (mg/L) COT (mg/L) Abs455 nm1 pH
360 128 0,612 7-7,2
1 Mues a diluida 2 eces
Du an e el a amien o del e luen e enzimá ico, se ealizó el seguimien o de
pH y oxígeno disuel o en el eac o , que se man u ie on es ables. Solamen e
du an e los úl imos días de ope ación el pH aumen ó a 9 y la concen ación de
biomasa dec eció, debido a nue as pé didas po lo ación de los lodos. Se midió
ambién la concen ación de glucosa a la salida del eac o , obse ándose que oda
la glucosa añadida en la alimen ación se consumió en el p oceso ae obio.
0
10
20
30
40
50
60
70
80
90
25 27 29 31 33 35 37 39 41
Tiempo (d)
Eliminación de DQO, TOC y colo (%)
Figu a 8.14. Eliminación de () DQO, (□) COT y ({) colo du an e la ope ación en el
eac o ae obio con inuo
Capí ulo 8
250
Los alo es de eliminación de DQO, TOC y colo se mues an en la Figu a
8.14. Du an e los 3-4 p ime os días, los po cen ajes de eliminación ue on
ele ados, aunque es o ue debido al e ec o de dilución que se p oduce al cambia
la alimen ación desde la ase de a anque del eac o al e luen e de la deg adación
enzimá ica. A pa i de los 30 d de ope ación, se ob u o una disminución de DQO
y COT de un 50%, que ue debida al consumo de glucosa que se empleó como
cosubs a o. A pa i del día 36 se modi icó el TRH del eac o de 12 a 24 h, sin
emba go los esul ados de eliminación de DQO y TOC no p esen a on una
mejo ía signi ica i a, debido a que la concen ación de sólidos en el eac o a
pa i del día 35 ue meno de 1 g SSV/L.
La decolo ación p ác icamen e ue nula a lo la go de odo el p oceso, lo que
co obo ó la eo ía de que el compues o que da colo , que es p incipalmen e la
can idad esidual de in e, no se deg ada po ía ae obia. Los espec os de
abso bancia (Figu a 8.15) mues an que disminuyó lige amen e el colo , aunque
el pe il del espec o no se modi icó as el a amien o ae obio.
0
1
2
3
4
5
6
200 300 400 500 600 700 800
Longi ud de onda (nm)
Abso bancia
Figu a 8.15. Compa ación de los espec os de abso bancia de in luen e (línea g uesa) y
e luen e (línea ina) del a amien o en un eac o ae obio con inuo
Pa a compa a la composición de las mues as de in luen e y e luen e del
eac o de lodos ac i os, se ealiza on análisis po HPLC (Figu a 8.16).
Apa en emen e apenas se p odujo eliminación o disminución de las señales. La
señal co espondien e a O ange II ( =7,0 min) apenas su ió modi icación en
cuan o a su á ea, aunque sí en cuan o a su iempo de e ención. Sin emba go, a la
Pos a amien o bac e iano
251
is a de los espec os de abso bancia de las señales de in luen e y e luen e, se
obse ó que la señal co espondien e a 2,032 min en el c oma og ama de la
alimen ación co esponde a un compues o di e en e al que se ob u o a los 2,058
min en el c oma og ama de e luen e. Si los espec os de abso bancia de ambas
señales se compa an con compues os pa ón, se puede a i ma que el compues o
cons i uyen e del in luen e del eac o , 4-hid oxibencenosul ona o, ue deg adado
du an e el a amien o ae obio, y pa alelamen e se gene ó el compues o
bencenosul ona o.
Figu a 8.16. Composición de las mues as de (a) in luen e y (b) e luen e del eac o
ae obio con inuo. Tiempos de e ención: 4-hid oxibencenosul ona o: 2,0 min;
bencenosul ona o, 2,1 min; O ange II: 7,0 min
Po úl imo, se analizó la oxicidad de las mues as an es y después del
a amien o ae obio (Tabla 8.14). El e luen e de la deg adación ae obia p esen ó
p ác icamen e el mismo alo de EC50 que el in luen e, con lo cual se puede
a i ma que el p oceso ae obio no con ibuye a aumen a la oxicidad, aunque
ampoco ayuda a disminui la, si bien la co ien e p oceden e de la deg adación
enzimá ica del in e no enía ca ác e óxico.
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1.860
2.032
2.383
3.248
4.234
6.997
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50
100
150
200
250
300
350
1.801
1.892
2.058
2.229
2.663
3.351
4.641
7.877
(a)
(b)
Capí ulo 9
258
Índice
1. In oducción
2. Ma e iales y mé odos
2.1. Compues os químicos
2.2. Ensayos de decolo ación
2.3. Vol ame ía cíclica
3. Resul ados y discusión
3.1. Decolo ación de O ange II en p esencia de ácidos quelan es
3.2. De e minación de las ene gías ela i as de quelación de ácidos
ca boxílicos
3.3. Capacidad quelan e de O ange II
4. Conclusiones
5. Re e encias
259
262
262
262
262
263
263
264
269
272
273

Es abilización de Mn3+
259
1. In oducción
La capacidad de la enzima MnP pa a ealiza la oxidación de compues os es
debida, en úl imo é mino, a la gene ación de la o ma Mn3+ a pa i de Mn2+, que
iene luga median e la educción de la o ma oxidada de la enzima, MnP I, a su
o ma na i a (Wa iishi e al., 1989). Dicha ans o mación ocu e en dos e apas de
oxidación- educción, de mane a que po cada ciclo de la enzima se gene an dos
iones Mn3+. Es e compues o es un oxidan e ue e (1,5 V) y de pequeño amaño,
po lo an o iene acceso a un g an núme o de compues os que la enzima po sí
misma no pod ía alcanza . Sin emba go, Mn3+ es ines able en disolución acuosa,
p oduciéndose eacciones de dismu ación que dan luga a las o mas Mn2+ y
Mn4+, p ecipi ando es a úl ima como MnO2 (Pé ez & Je ies, 1993). Po an o,
pa a que el Mn3+ pueda ac ua adecuadamen e necesi a o ma un complejo que le
con ie a es abilidad. El ligando ideal debe ía cumpli es unciones: i) acili a la
disociación de Mn3+ de la enzima; ii) es abiliza la o ma Mn3+; iii) no ene
capacidad de quelación con la o ma Mn2+, o que es a sea pequeña, de mane a que
se pe mi a su acceso a la enzima (Wa iishi e al., 1992). Algunos ácidos
ca boxílicos cumplen es as unciones (Wa iishi e al., 1989).
Pa a que un ácido ca boxílico enga acción quelan e debe ía ene más de un
g upo capaz de in e acciona con el ion Mn3+, de o ma que se gene e una ed de
uniones que dan luga a la es abilización del ion. Los ácidos di o ica boxílicos,
como malona o, oxala o, a a o o ci a o, ienen po encialmen e esa capacidad de
quelación (Glenn e al., 1986; Wa iishi e al., 1988). Algunos ácidos
monoca boxílicos ambién son capaces de o ma complejos debido a que en su
es uc u a cuen an con o o g upo que puede in e acciona con el Mn3+, como es
el caso del g upo alcohol que o ma pa e del lac a o (Wa iishi e al., 1992). Sin
emba go, compues os monoca boxílicos como el ace a o no ienen capacidad
quelan e (Glenn & Gold, 1985).
Di e sos au o es analiza on el e ec o de dis in os ácidos ca boxílicos en la
medida de la ac i idad enzimá ica de MnP po oxidación de 2,6-dime oxi enol
(DMP) o ácido 2,2’-azino-bis-3-e ilbenz- iazolin-6-sul ónico (ABTS). En odos
los casos, en ausencia de ácido o gánico no se cuan i icó ac i idad enzimá ica
(Glenn & Gold, 1985; Wa iishi e al., 1992). A la is a de es os esul ados, como
pa e de nues a in es igación se analizó la decolo ación de O ange II en p ocesos
en discon inuo en ausencia de ácidos ca boxílicos quelan es. Se empleó enzima
Capí ulo 9
260
MnP pu i icada y dializada en e a agua, asegu ando así la ac uación de dicha
enzima en el p oceso y la ausencia de cualquie ácido o compues o con capacidad
quelan e que pudie a p ocede del c udo enzimá ico. Se ealiza on ensayos en
p esencia de ace a o y en ausencia de ácido ca boxílico y los esul ados se
compa a on con los ob enidos en p esencia de malona o, pues es conocida su
ue e capacidad de quelación. La decolo ación alcanzada as 1 h de ensayo en
ausencia de compues os quelan es ue la misma que la ob enida en p esencia de
malona o, y la elocidad de decolo ación ue p ác icamen e igual en los es
casos, así como la pé dida de ac i idad enzimá ica (Figu a 9.1).
0
20
40
60
80
100
120
140
160
180
200
0 10203040506070
Tiempo (min)
Ac i idad (U/L)
0
10
20
30
40
50
60
70
80
90
100
O ange II (mg/L)
Figu a 9.1. Ac i idad (símbolos ce ados) y concen ación de O ange II (símbolos
abie os) de ensayos de decolo ación con MnP pu i icada y dializada: (□) malona o 1 mM;
() ace a o 1 mM; ({) ausencia de ácido; adición de H2O2 15 µmol/L·min, pH 4,5 y
empe a u a ambien e
A la is a de los esul ados, se plan ea on una se ie de cues iones:
i) En p ime luga , el hecho de que la decolo ación ambién enga luga , y
p ác icamen e en la misma ex ensión, en ausencia de malona o, hace plan ea
la posibilidad de que o os ácidos puedan ealiza una acción quelan e
simila . Di e sos au o es es udia on la quelación de Mn3+ con di e en es
ácidos ca boxílicos y es ablecie on un o den de capacidad de quelación en
unción de las elocidades iniciales de oxidación de compues os (Glenn &
Gold, 1985; Cui & Dolphin, 1990; Wa iishi e al., 1992). Teniendo en cuen a
la aplicación de la enzima MnP a la deg adación en con inuo de compues os
ecalci an es, se conside a impo an e el ac o ciné ico en p esencia de esos
Es abilización de Mn3+
261
ácidos, si bien es de especial ele ancia la capacidad de es abilización del
Mn3+ que p esen a cada uno de ellos. Po ello se in en a á es ablece la
ene gía de o mación ela i a de quela os pa a di e en es ácidos y el ion
Mn3+.
ii) En segundo luga , de la Figu a 9.1 se deduce que en p esencia de ácidos
monoca boxílicos sin pode quelan e, como el ace a o, o incluso en ausencia
de ácidos, la decolo ación p esen a p ác icamen e la misma ciné ica. Es o
hace plan ea la posibilidad de que algún compues o p esen e en el medio de
deg adación pueda ene cie a capacidad quelan e. El in e O ange II,
median e sus g upos ácido sul ónico e hid oxilo, pod ía ayuda a o ma un
complejo con Mn3+.
En unción de es os pun os de pa ida, en es e capí ulo se p e ende es ablece
cuali a i amen e la capacidad que p esen an una se ie de ácidos pa a quela el ion
Mn3+. En segundo luga , se es udia la posibilidad de que el in e O ange II pueda,
asimismo, es abiliza el Mn3+ median e quelación.
Pa a de e mina la concen ación de complejos de Mn3+ se aplicó la écnica
de espec o o ome ía (Wa iishi e al., 1992), que da una medida di ec a de la
concen ación de complejo o mado. Desg aciadamen e, en es e caso, el in e
ambién abso be a la longi ud de onda a la que abso ben los complejos de Mn3+,
en el ango de 270-300 nm, esul ando la señal enmasca ada po la del p opio
colo an e.
Po ello, se ha ensayado el uso de la ol ame ía cíclica como écnica muy
ú il pa a es udia especies ac i as elec oquímicamen e. Su e ec i idad eside en
su capacidad pa a obse a el compo amien o edox de un compues o en un
in e alo amplio de po enciales (Kissinge & Heineman, 1983; an Benscho en e
al., 1983). La écnica o ece una buena sensibilidad y e sa ilidad, aunque se debe
ene en cuen a que es una écnica de diagnosis, que pe mi e solamen e una
in o mación cuali a i a. Pa a una de e minación cuan i a i a de elocidades o
concen aciones, se ecomienda emplea o as écnicas de ol ame ía, ales como
la ol ame ía de pulsos o de pasos. En es e capí ulo se empleó la écnica de
ol ame ía cíclica pa a de e mina la o mación de complejos de Mn3+ en
p esencia de compues os con posible capacidad quelan e, ales como ácidos
ca boxílicos y el in e azo O ange II.
Capí ulo 9
262
2. Ma e iales y mé odos
2.1. Compues os químicos
Los ácidos malónico, oxálico, lác ico, a á ico y cí ico ue on
suminis ados po Sigma-Ald ich (Alemania). Sus es uc u as se p esen an en la
Figu a 9.2.
OH
O
CH2
OH
O
Ácido malónico
OH
O
OH
O
Ácido oxálico
CH2
OH
CH
OH
O
Ácido lác ico
OH
OOH
CH
OH
CH
OH
O
Ácido a á ico
OH
O
CH2
OH
OH O
CH2
OH
O
Ácido cí ico
Figu a 9.2. Es uc u as de di e sos ácidos ca boxílicos
2.2. Ensayos de decolo ación
Se ealiza on ensayos de decolo ación en discon inuo, en ma aces
E lenmeye de 100 mL con 25 mL de medio con eniendo MnSO4 33 µM, ácido
o gánico 1 mM, MnP 200 U/L y O ange II 100 mg/L, a pH 4,5. Se adicionó H2O2
a una elocidad de 50 µmol/L·min. Se abajó con di e en es ácidos: malónico,
oxálico, lác ico, a á ico y cí ico. Se oma on mues as cada 2 min du an e 20
min y se analizó la concen ación de O ange II po medio de espec o o ome ía,
como se indica en el Capí ulo 2 de Ma e iales y mé odos.
2.3. Vol ame ía cíclica
La ol ame ía aba ca un g upo de mé odos elec oanalí icos en que se aplica
una señal de exci ación, que es un po encial a iable, a un anali o con enido en
una celda elec oquímica. Es a señal de exci ación p o oca la espues a de
in ensidad de co ien e ca ac e ís ica del anali o. En ol ame ía cíclica, el
po encial a ía en e dos alo es, de mane a que p ime o aumen a linealmen e
3
Es abilización de Mn3+
263
has a un máximo y después disminuye linealmen e con la misma pendien e has a
su alo o iginal.
Los ensayos de ol ame ía cíclica se lle a on a cabo en una celda de 100
mL de capacidad, empleándose un elec odo de disco de g a i o como elec odo
de abajo, un elec odo de calomelanos sa u ado como elec odo de e e encia y
un hilo de pla ino como elec odo auxilia . El equipo u ilizado ha sido un
Po en ios a -Gal anos a EG&G (P ice on Applied Resea ch) modelo 273 con un
So wa e Modelo 270/250 . 4.10 (Gai he sbu g, MD, EEUU). Se abajó a
elocidades de ba ido de po encial de 0,02 y 0,2 V/s con po enciales en e 0 y 1,2
V. El olumen de abajo ue de 40 mL, se empleó NaNO3 100 mM como
elec oli o sopo e y la uen e de Mn2+ se ob u o a pa i de MnCl2 1 mM.
3. Resul ados y discusión
3.1. Decolo ación de O ange II en p esencia de ácidos quelan es
T as obse a que la decolo ación de O ange II iene luga en la misma
ex ensión en p esencia de o os ácidos, se plan eó la posibilidad de es udia o as
al e na i as al malona o, que pe mi an man ene una al a capacidad de
decolo ación del in e median e la enzima MnP. Pa a ello se ealiza on ensayos
con malona o, oxala o, lac a o, a a o y ci a o (Figu a 9.3).
0
10
20
30
40
50
60
70
80
90
100
0 5 10 15 20
Tiempo (min)
Decolo ación (%)
Figu a 9.3. Ensayos de deg adación enzimá ica de O ange II: (■) malona o; (•) oxala o;
() lac a o; (□) a a o y ({) ci a o

Capí ulo 9
264
A pa i de la elocidad de decolo ación en p esencia de los ácidos
ca boxílicos empleados, se puede a i ma que odos p esen a on una ciné ica
simila , a excepción del cí ico, que dio luga a una decolo ación
conside ablemen e más len a. Es o pod ía se debido a la meno ue za de
quelación del ci a o con espec o a los demás ácidos empleados, que epe cu i ía
en una meno ene gía de disociación en e el Mn3+ y la enzima, que pod ía
domina la ciné ica del p oceso.
3.2. De e minación de las ene gías ela i as de quelación de ácidos
ca boxílicos
Pa a de e mina la ene gía de quelación de cada uno de los ácidos
p opues os se aplicó la écnica de ol ame ía cíclica, que pe mi e conoce el
es ado de oxidación de un anali o en una disolución y, en base a un análisis
compa a i o, es ablece cuali a i amen e el o den de quelación de compues os.
En p ime luga se ealizó un ol amog ama a una disolución de MnCl2 1
mM con NaNO3 100 mM como elec oli o sopo e y con un ba ido de po enciales
en e 0 y 1,2 V (Figu a 9.4).
-6,E-05
-5,E-05
-4,E-05
-3,E-05
-2,E-05
-1,E-05
0,E+00
1,E-05
2,E-05
3,E-05
0 0,2 0,4 0,6 0,8 1 1,2
Po encial (V)
In ensidad (A)
Figu a 9.4. Vol amog ama de una disolución de Mn2+ 1 mM
La disolución en el momen o inicial sólo con iene Mn2+. A alo es in e io es
al po encial de oxidación de Mn2+ a Mn3+, se encuen a p esen e solamen e la
A
B
CD
E
F
G
Es abilización de Mn3+
265
o ma educida, de mane a que no hay co ien e de elec ones debida a la
oxidación, siendo po an o nula la in ensidad de co ien e (zona A-B). Una ez
que la di e encia de po encial en e los elec odos de la celda alcanza el pun o B,
comienza a p oduci se la oxidación de Mn2+ a Mn3+, de mane a que comienza la
co ien e de elec ones en e los elec odos. La in ensidad de co ien e iene dada
po la Ecuación 1.
δ
)( 0
AA CCk
i−
= (1)
donde i es la in ensidad de co ien e; k es una cons an e de p opo cionalidad; CA
es la concen ación del anali o en el seno de la disolución; CA0 es la concen ación
del anali o en la supe icie del elec odo de medida y
δ
es el espeso de la capa
que se o ma en la supe icie del elec odo, donde la concen ación del anali o
p esen a un g adien e en e la concen ación en la supe icie y la del seno de la
disolución.
En cuan o se alcanza el po encial del pa edox Mn2+/Mn3+, la concen ación
de Mn2+ en la supe icie del elec odo se anula, aumen ando la in ensidad has a un
alo lími e (il) (pun o C). Si la disolución es á pe ec amen e agi ada, la
concen ación en el elec odo segui á siendo nula, de mane a que se man iene el
alo de il. Si la agi ación no es comple a, la capa de di usión alcanza á un mayo
espeso , de mane a que la in ensidad disminui á endiendo de nue o a 0. Po
con enio, la in ensidad de la oxidación se oma como nega i a y la de la
educción como posi i a.
Cuando se alcanza el po encial de 1,2 V (pun o D) se e ie e el ba ido,
aunque las in ensidades siguen siendo nega i as mien as el po encial sea
su icien emen e al o como pa a que se siga p oduciendo la oxidación. Al llega al
pun o E, el Mn3+ gene ado en el p oceso di ec o comienza a educi se, de mane a
que la concen ación de Mn2+ en la supe icie del elec odo es supe io a la del
seno del líquido, p oduciéndose un paso de co ien e en sen ido con a io al
an e io . T as un alo máximo (pun o F), se ago a el Mn3+ en la supe icie del
elec odo, de eniéndose po an o el paso de co ien e.
El po encial del pa edox obse ado en la Figu a 9.4 se alejó del po encial
no mal dado pa a el pa Mn2+/Mn3+ (1,54 V), debido a no se ope ó en condiciones
Capí ulo 9
266
no males. La elación en e po encial de abajo y el po encial no mal de
oxidación iene dada po la ecuación de Ne ns (Ecuación 2).
[
]
[]
[
]
[]
Rd
Ox
n
E
Rd
Ox
nF
RT
EE log
059,0
ln 00 +=+= (2)
donde E es el po encial de abajo, E0 es el po encial no mal del pa , R es la
cons an e de los gases ideales (8,31 J/K mol); T es la empe a u a en condiciones
no males (298 K); n es el núme o de elec ones ans e idos; F es la cons an e de
Fa aday (96406 J/V mol); [Ox] es la concen ación de la especie oxidada y [Rd]
es la concen ación de la especie educida (Skoog e al., 2001). Debido a esa
des iación de las condiciones no males, la oxidación iene luga a un po encial de
0,693 V. Cuando el ango de po encial se amplió a 1,5 V, el ol amog ama
mos ó dos señales de oxidación, co espondien es al paso de Mn2+ a Mn3+ y de
Mn3+ a Mn4+. Dado que es a úl ima especie p ecipi a en o ma de MnO2, cuando
el ba ido de po encial se e i ió no se obse ó ninguna señal de educción (da os
no mos ados).
La di e encia en e los po enciales de las señales de oxidación y educción
(pun os C y F) indica el ca ác e del p oceso. En un p oceso e e sible la eacción
edox es muy ápida y no limi a la ciné ica del p oceso, siendo la di e encia en e
ambos po enciales de 0,059/n (V). En un p oceso i e e sible la eacción edox es
más len a que la elocidad de ba ido de po encial, de mane a que la disminución
de la elocidad de ba ido hace que se e asen los po enciales de oxidación y
educción. En la Figu a 9.4 se obse a una di e encia de 0,254 V en e ambos
po enciales pa a una elocidad de ba ido de 0,2 V/s. Po o o lado, en un p oceso
con una elocidad de ba ido de 0,02 V/s la di e encia en e ambos po enciales
aumen ó has a 0,345 V, lo cual co obo ó la i e e sibilidad del p oceso edox.
La inco po ación de un elec oli o ine e en el medio de eacción iene como
unción e i a la in luencia del e ec o de la mig ación de anali o debida al campo
eléc ico, siendo necesa io que la concen ación de elec oli o sea muy supe io a
la concen ación de anali o. Po es e mo i o, se seleccionó NaNO3 a una
concen ación de 100 mM como elec oli o sopo e. La decisión de adiciona el
anali o Mn2+ en o ma de MnCl2 se omó conside ando una sal que no u iese
in luencia en la modi icación de las señales. La concen ación de Mn2+ se
aumen ó con espec o a la empleada en los ensayos de decolo ación (de 33 µM a
1 mM) debido al e ec o que p esen a en la in ensidad y po encial de apa ición de
Es abilización de Mn3+
267
las señales: una concen ación muy baja dio luga a in ensidades de co ien e poco
signi ica i as (Ecuación 1), mien as que una concen ación más ele ada dio luga
a una mayo des iación del po encial edox con espec o al po encial no mal
(Ecuación 2).
La p esencia de un compues o quelan e de Mn3+ en el medio se de ec a
cuando la o ma oxidada es más es able, y po an o cuando esul a más a o able
su o mación que la o ma educida. De se así, se p oduci ía una des iación de la
señal de oxidación hacia alo es de po encial meno es, y de la misma o ma se
obse a ía a po enciales más bajos la señal de educción. Así, en la Figu a 9.5 se
obse a la des iación de los po enciales de oxidación y educción en p esencia de
una concen ación de 20 mM de malona o, en compa ación con los po enciales
ob enidos en ausencia de compues o quelan e (Figu a 9.4). Se obse ó un mayo
e ec o en la señal de educción. La concen ación de compues o quelan e debe
ene un alo como mínimo 10 eces supe io a la concen ación del anali o.
-6,E-05
-5,E-05
-4,E-05
-3,E-05
-2,E-05
-1,E-05
0,E+00
1,E-05
2,E-05
3,E-05
0 0,2 0,4 0,6 0,8 1 1,2
Po encial (V)
In ensidad (A)
Figu a 9.5. Vol amog ama de una disolución de Mn2+ 1 mM y malona o 20 mM
A medida que aumen a la concen ación de compues o quelan e con espec o
a la del anali o, la capacidad de quelación debe ía se mayo , de mane a que el
desplazamien o de las señales debe ía aumen a . Pa a de e mina la ue za ela i a
de quelación de los dis in os ácidos, se ealiza on ol amog amas a di e en es
disoluciones o madas po 1 mM de MnCl2 y concen aciones de 20-25-30-35-40-
45-50-60-70-80 mM de los di e en es ácidos: malónico, oxálico, lác ico, a á ico
274

Es udio económico
275
Anexo
Es udio económico del p oceso de deg adación
enzimá ica
Resumen
Pa a que un p oceso sea ac ible a ni el indus ial, es necesa io que sea
económicamen e iable con espec o a o as al e na i as. En es e anexo se ealizó
una es imación de los cos es que implica el a amien o enzimá ico de compues os
ecalci an es, en p ocesos discon inuos y con inuos con enzima en es ado lib e e
inmo ilizado. Se encon ó que la p oducción de enzima es el ac o más ele an e
económicamen e de los p ocesos con enzima lib e, mien as que el sopo e de
inmo ilización es el ac o más ca o de los p ocesos con enzima inmo ilizada, lo
cual implica un aumen o en el cos e en un ac o de 100.
El a amien o en un eac o enzimá ico de memb ana puede esul a
económicamen e iable y compe i i o en compa ación con p ocesos de oxidación
a anzada, necesi ando pa a ello una disminución de los cos es de p oducción de
MnP, median e un escalado del p oceso.
Anexo
276
Índice
1. In oducción
2. Ma e iales y mé odos
2.1. Ensayos de deg adación
2.2. Técnicas analí icas
3. Resul ados
3.1. Ensayos de deg adación en discon inuo con MnP lib e
3.2. Ensayos de deg adación en con inuo con MnP lib e
3.3. Ensayos de deg adación en discon inuo con MnP inmo ilizada
3.4. Ensayos de deg adación en con inuo con MnP inmo ilizada
3.5. Es imación del cos e de p oducción de MnP
3.6. Es imación de los cos es de inmo ilización
3.7. Es imación de los cos es del p oceso
3.8. Compa ación económica del p oceso enzimá ico con p ocesos de
oxidación a anzada
4. Conclusiones
5. Re e encias
277
277
277
278
279
279
280
281
281
282
284
285
285
286
287
Es udio económico
277
1. In oducción
La aplicación de un a amien o enzimá ico a la deg adación de compues os
ecalci an es es una al e na i a in e esan e debido a di e en es en ajas: los cos es
de man enimien o son bajos, la ope ación es sencilla, se gene an e luen es limpios
y no se p oducen lodos. Sin emba go, pa a que es a opción sea compe i i a en e
a o as al e na i as de a amien o, es necesa io que sea económicamen e iable.
Se han ealizado es udios económicos de la deg adación de compues os median e
dis in os p ocesos de oxidación a anzada, ales como a amien o con ozono, luz
ul a iole a, eac i o de Fen on o dis in as combinaciones de los mismos
(Esplugas e al., 2002).
El obje i o de es e anexo es la es imación de los cos es económicos que
supone la deg adación enzimá ica en cada uno de los sis emas es udiados: sis ema
con enzima lib e y con enzima inmo ilizada, en ope ación discon inua y con inua.
El es udio económico omó como base de cálculo la can idad de enol deg adado
(1 kg) pa a cada uno de los p ocesos.
2. Ma e iales y mé odos
2.1. Ensayos de deg adación
Ensayos de deg adación con MnP lib e
Se ealizó un ensayo en discon inuo de deg adación de enol con MnP
soluble en un ma az E lenmeye de 250 mL con 100 mL de medio consis en e
en: MnP 200 U/L, oxala o de sodio 1 mM, MnSO4 33 µM, enol 100 mg/L y una
adición de H2O2 en con inuo a una elocidad de 15 µmol/L·min. El pH del medio
se ajus ó a 4,5 y se abajó a empe a u a ambien e. Se oma on mues as cada 15
min du an e 3 h y se analizó la ac i idad enzimá ica y la concen ación de enol.
Se lle ó a cabo la deg adación en con inuo de enol con MnP soluble en un
eac o enzimá ico asociado a una memb ana de ul a il ación. El olumen de
eacción ue de 250 mL. La alimen ación consis ió en una disolución de oxala o 1
mM, MnSO4 33 µM y enol 100 mg/L, que se adicionó median e una bomba pa a
man ene un iempo de esidencia (TRH) de 2 h. Se bombeó MnP, a una
elocidad al que la ac i idad en el eac o se man u o a 200 U/L, y H2O2, con
una elocidad de 15 µmol/L·min. Se oma on mues as du an e 39 h de ensayo y
Anexo
278
se midió la ac i idad enzimá ica y la concen ación de enol en el eac o y en el
e luen e del sis ema.
Ensayos de deg adación con MnP inmo ilizada
La inmo ilización de MnP sob e un sopo e de aga osa p e iamen e
ac i ado con g upos glu a aldehido se ealizó median e el p ocedimien o indicado
en el Capí ulo 5.
El ensayo de deg adación en discon inuo de enol median e MnP
inmo ilizada se lle ó a cabo en un ma az E lenmeye con 100 mL de medio:
MnP 200 U/L, oxala o de sodio 1 mM, MnSO4 33 µM, enol 100 mg/L y una
adición de H2O2 en con inuo a una elocidad de 15 µmol/L·min. Cada 15 min se
oma on mues as de sob enadan e pa a analiza la concen ación de enol y
mues as de suspensión pa a de e mina la ac i idad enzimá ica.
El ensayo de deg adación en con inuo con MnP inmo ilizada u o luga en
un eac o de mezcla comple a con 100 mL de medio, en que la enzima
inmo ilizada se e u o en el eac o po medio de un pequeño il o. Se adicionó
alimen ación consis en e en oxala o 1 mM, MnSO4 33 µM y enol 100 mg/L, con
una elocidad al que pe mi iese un TRH de 3 h. Se adicionó H2O2 en con inuo
median e una bomba a 15 µmol/L·min. Se ealizó un seguimien o de la
concen ación de enol en el e luen e, así como de la ac i idad enzimá ica en el
eac o , aunque no se ealizó adición en con inuo de MnP inmo ilizada pa a
epone la enzima consumida en el p oceso, pa a iguala las condiciones en que se
lle a on a cabo los ensayos de decolo ación de O ange II.
2.2. Técnicas analí icas
La medida de ac i idad enzimá ica de MnP lib e se lle ó a cabo median e el
p oceso indicado en el Capí ulo 2 de Ma e iales y mé odos. La ac i idad de MnP
inmo ilizada se midió espec o o omé icamen e con agi ación en la celda de
medida, al como se desc ibió en el Capí ulo 5 de Inmo ilización de MnP.
La concen ación de enol se de e minó median e c oma og a ía líquida con
un equipo Hewle Packa d ChemS a ion equipado con un de ec o de a ay de
diodos 1090 M Se ie II. Se empleó una columna Sphe iso b ODS2 (0,46 cm
diáme o in e no y 20 cm de longi ud) que con iene pa ículas empacadas de 5 µm
(Me ck KgaA, Da ms ad , Alemania). Se inyec a on 10 µL de mues a y se
Es udio económico
279
empleó como ase mó il una disolución de 50% de ace oni ilo y 50% de agua, a
un lujo de 0,4 mL/min en condiciones isoc á icas y 30ºC. Los c oma og amas se
ob u ie on a una longi ud de onda de 270 nm. El iempo de e ención pa a el
enol ue de 8,1-8,2 min.
3. Resul ados
3.1. Ensayo de deg adación en discon inuo con MnP lib e
La Figu a A.1 mues a los pe iles de deg adación de enol y de ac i idad
enzimá ica en el ensayo lle ado a cabo en un p oceso en discon inuo con adición
en con inuo de H2O2 y con enzima lib e. Las condiciones empleadas ue on las
mismas que las u ilizadas en los ensayos de decolo ación, sin op imización p e ia
pa a la deg adación de enol. De los pe iles se calcula on los pa áme os
ciné icos dados en la Tabla A.1. La cons an e ciné ica se ob u o conside ando los
alo es de deg adación iniciales, y una ciné ica de p ime o den con espec o al
enol. El alo de 1/2 indica el iempo pa a el cual la deg adación de la
concen ación inicial de enol alcanza el 50% y se ob u o a pa i del alo de la
cons an e ciné ica.
0
20
40
60
80
100
120
0 50 100 150 200
Tiempo (min)
Concen ación enol (mg/L)
0
40
80
120
160
200
240
Ac i idad (U/L)
Figu a A.1. Deg adación en discon inuo de enol con MnP lib e: ({) concen ación de
enol; (∆) ac i idad enzimá ica

Anexo
280
Tabla A.1. Pa áme os de la deg adación en discon inuo de enol con MnP lib e
k (h-1) 1/2 (h) Consumo enzima (U/L·h) Consumo enzima a 1/2 (U)
0,906 0,765 16,4 1,25
3.2. Ensayo de deg adación en con inuo con MnP lib e
La selección del TRH pa a la deg adación de enol en el eac o enzimá ico
de memb ana se lle ó a cabo en unción de los da os ob enidos en el ensayo en
discon inuo. Dado que se deg adó odo el enol en 2 h, se conside ó es e iempo
como TRH. Los pe iles se mues an en la Figu a A.2.
0
20
40
60
80
100
120
0 1020304050
Tiempo (h)
Concen ación enol (mg/L)
0
50
100
150
200
250
300
Ac i idad (U/L)
Figu a A.2. Deg adación en con inuo de enol en un eac o enzimá ico de memb ana con
MnP lib e: ({) concen ación de enol; (∆) ac i idad enzimá ica
Tabla A.2. Pa áme os de la deg adación en con inuo de enol con MnP lib e
k (h-1) 1/2 (h) Consumo enzima (U/L·h) Consumo enzima a 1/2 (U)
3,67 0,189 11,3 0,53
La Tabla A.2 mues a los pa áme os ob enidos a pa i de los pe iles de
deg adación y consumo de enzima. La cons an e ciné ica se calculó median e un
Es udio económico
281
balance al eac o enzimá ico, conside ando una eacción de p ime o den con
espec o al subs a o.
3.3. Ensayo de deg adación en discon inuo con MnP inmo ilizada
El ensayo de deg adación de enol en discon inuo con enzima inmo ilizada
sob e aga osa-glu a aldehido se mues a en la Figu a A.3. Conside ando una
ciné ica de p ime o den, se ob u ie on los pa áme os ciné icos y de consumo de
enzima dados en la Tabla A.3.
0
20
40
60
80
100
120
0 50 100 150 200
Tiempo (min)
Concen ación enol (mg/L)
0
40
80
120
160
200
240
Ac i idad (U/L)
Figu a A.3. Deg adación en discon inuo de enol con MnP inmo ilizada: ({)
concen ación de enol; (∆) ac i idad enzimá ica
Tabla A.3. Pa áme os de la deg adación en discon inuo de enol con MnP inmo ilizada
k (h-1) 1/2 (h) Consumo enzima (U/L·h) Consumo enzima a 1/2 (U)
0,636 1,09 25,11 2,74
3.4. Ensayo de deg adación en con inuo con MnP inmo ilizada
A pa i de los pe iles de deg adación de enol en discon inuo con MnP
inmo ilizada se conside ó un TRH de 3 h pa a la deg adación en con inuo en un
eac o de anque agi ado. Los pe iles de deg adación de enol y consumo de
MnP se mues an en la Figu a A.4.
Anexo
282
0
10
20
30
40
50
60
70
80
90
100
0 1020304050
Tiempo (h)
Concen ación enol (mg/L)
0
30
60
90
120
150
180
210
240
270
300
Ac i idad (U/L)
Figu a A.4. Deg adación en con inuo de enol en un eac o con inuo de anque agi ado
con MnP inmo ilizada: ({) concen ación de enol; (∆) ac i idad enzimá ica
La Tabla A.4 mues a los pa áme os ciné icos y de consumo de enzima.
Tabla A.4. Pa áme os de la deg adación en con inuo de enol con MnP inmo ilizada
k (h-1) 1/2 (h) Consumo enzima (U/L·h) Consumo enzima a 1/2 (U)
3,00 0,231 8 0,185
3.5. Es imación del cos e de p oducción de MnP
Los p incipales ac o es que con ibuyen al cos e que conlle a la p oducción
de la enzima MnP a pa i de sue o de leche son los eac i os del medio de
e men ación, el consumo ene gé ico y las memb anas de ul a il ación del c udo
enzimá ico ob enido.
Se conside a on los eac i os empleados en el medio de conse ación del
hongo en ubos inclinados, así como el medio de man enimien o en placas, el
medio de cul i o en ma aces Fe nsbach y el medio de p oducción en ma aces
E lenmeye . Dado que los olúmenes de medio empleados son mucho meno es
que el olumen del medio de p oducción en el e men ado (se conside an
e men aciones de 100 L), es os eac i os cons i uyen un po cen aje muy pequeño
Es udio económico
283
de los cos es apo ados po los eac i os, de mane a que no ue on conside ados
en la es imación de cos es de eac i os mos ada en la Tabla A.5.
Tabla A.5. Es imación del cos e de los eac i os empleados en la p oducción de MnP
Reac i o Can idad (g) P ecio (€/g) P ecio o al (€)
Sue o de leche
Tiamina
MnSO4
Pep ona
2500
0,225
42,5
230
2,6·10-4
0,45
0,0099
0,075
0,65
0,10
0,42
17,2
TOTAL 18,4 €
La es imación de los cos es ene gé icos se ealizó eniendo en cuen a que las
e men aciones ienen una du ación media de 60 h (Tabla A.6). El p ecio del kWh
se omó de la e e encia con la que se compa an los cos es (Esplugas e al., 2002)
y ue de 0,0632 €/kWh. Se empleó un ac o de cambio de dóla es ame icanos a
eu os de 1,210 $/€ (01-07-05).
Tabla A.6. Es imación del cos e ene gé ico en la p oducción de MnP
Fuen e Po encia
(kW)
Tiempo consumo
(h)
Ene gía
(kWh)
P ecio o al
(€)
Es e iliz. e men ado
Consumo e men ado
Comp eso
Agi ado
Au ocla e
4,4
2,5
5,5
0,7
4,5
1
60
3
60
6
4,4
150
16,5
42
27
0,28
9,48
1,04
2,65
1,71
TOTAL 15,2 €
Po úl imo, se conside ó el cos e de amo ización de las memb anas del
p oceso de ul a il ación y concen ación del c udo enzimá ico ob enido en cada
e men ación. El esumen de dicho cos e se mues a en la Tabla A.7.
Conclusiones
290
i ) El eac o enzimá ico de memb ana ope ó du an e 18 d consecu i os sin
cambio o limpieza de la memb ana. El p oceso p esen a una ope ación
simple, g an es abilidad y es aplicable a la deg adación de o os compues os.
) El modelo ciné ico p opues o a pa i de los ensayos en discon inuo ajus ó
adecuadamen e los da os expe imen ales ob enidos en el p oceso en
con inuo, de mane a que se con i ma su alidez pa a la simulación y
op imización del p oceso.
i) La inmo ilización de MnP median e enlace co alen e con un sopo e de
aga osa-glu a aldehido es un p oceso ela i amen e simple, que pe mi ió una
e ención enzimá ica del 100% y con i ió es abilidad a la enzima. Como
con apa ida, dado que las condiciones de pH son se e as, en el p oceso de
inmo ilización se pie de un 50% de la ac i idad enzimá ica.
ii) El a amien o en con inuo en un eac o de anque agi ado con enzima
inmo ilizada pe mi ió ob ene un alo ele ado de la e icacia del p oceso,
median e la minimización del consumo de sopo e y enzima. La
minimización del consumo de aga osa implicó además una meno adso ción
del in e O ange II sob e el sopo e.
iii) El modelo ciné ico ob enido a pa i de ensayos en discon inuo con enzima
lib e se adap ó a la ciné ica más len a con enzima inmo ilizada. La ecuación
esul an e simuló adecuadamen e los da os expe imen ales.
ix) El eac o con inuo de anque agi ado con enzima inmo ilizada iene una
ope ación sencilla, no p esen a p oblemas de aumen o de p esión po
ensuciamien o y equie e menos bombas pa a su ope ación. Sin emba go,
iene como des en ajas impo an es la pé dida de ac i idad enzimá ica
du an e el p oceso de inmo ilización, la ciné ica más len a, el con ol más
complejo de la ac i idad enzimá ica p esen e, la di icul ad de un sis ema
pa a eemplaza la enzima desac i ada y la gene ación de esiduos.
x) El es udio del mecanismo de deg adación enzimá ica de O ange II pe mi ió
iden i ica 9 compues os in e medios y inales, dos de los cuales no habían
sido iden i icados con an e io idad: 4-diazonio bencenosul ona o y 2-na ol.
Se cuan i ica on dichos p oduc os, que co esponden a un 30% de la
concen ación inicial de O ange II, lo que indica que, o bien exis en o as
u as de deg adación, o bien los p oduc os gene ados con inúan su
deg adación hacia o os p oduc os inales.

Conclusiones
291
xi) El pos a amien o bac e iano del e luen e de deg adación enzimá ica de
O ange II se lle ó a cabo en condiciones an o ae obias como anae obias. El
e luen e no esul ó óxico pa a ninguna de las dos cepas bac e ianas, se
deg adó un 25-30% de la DQO y se gene a on e luen es no óxicos. Sin
emba go, el p oceso anae obio eliminó un 30% del colo , mien as que el
p oceso ae obio ue es capaz de decolo a el e luen e. Debido a es o, se
conside ó el pos a amien o anae obio como el más adecuado pa a a a el
e luen e de la deg adación enzimá ica de O ange II.
xii) El in e O ange II eje ce cie o e ec o de quelación sob e el ca ión Mn3+,
esponsable de la oxidación enzimá ica. Así, no es necesa ia la p esencia de
ácidos o gánicos pa a que la eacción enzimá ica enga luga , aunque se
emplean igualmen e como es abilizado es de pH.
xiii) La e aluación de los cos es de los p ocesos de deg adación enzimá ica
indicó que los cos es de inmo ilización ha ían in iable un p oceso basado en
el uso de enzima inmo ilizada, aplicando la me odología es udiada. Sin
emba go, el a amien o en un eac o enzimá ico de memb ana p esen a un
cos e en el ango de o os p ocesos de oxidación a anzada.
En esumen, el a amien o enzimá ico del in e azo O ange II es una
al e na i a adecuada, ya que su ciné ica es mucho más ápida que la de los
p ocesos biológicos con encionales, alcanzando una decolo ación supe io al
90% y disminuyéndose en más de 9 eces la oxicidad del e luen e.
Pa a su aplicación a ni el indus ial se ía con enien e sepa a del e ido
gene al una co ien e concen ada de in e, po ejemplo median e memb anas. Se
debe dispone de dos unidades de ul a il ación en pa alelo, pa a emplea la
segunda du an e los pe íodos de limpieza de la p ime a. La co ien e concen ada
su i ía un a amien o especí ico de deg adación median e un eac o enzimá ico
de memb ana, as el cual pod ía añadi se un pos a amien o anae obio. El
e luen e gene ado se pod ía uni al e luen e p oceden e del es o de los p ocesos
de la plan a pa a se a ado median e un sis ema biológico con encional en una
E.D.A.R. (Figu a C.1).
Conclusiones
292
Co ien e
colo eada
O as co ien es
de p oceso
UF UFR.E.M.
Reac o
anae obio
E.D.A.R.
E luen e
Figu a C.1. Esquema del a amien o de un e luen e colo eado median e un p oceso combinado enzimá ico-bac e iano. UF:
memb ana de ul a il ación; R.E.M.: eac o enzimá ico de memb ana; E.D.A.R.: es ación depu ado a de aguas esiduales
Co ien e
colo eada
O as co ien es
de p oceso
UF UFR.E.M.
Reac o
anae obio
E.D.A.R.
E luen e
Figu a C.1. Esquema del a amien o de un e luen e colo eado median e un p oceso combinado enzimá ico-bac e iano. UF:
memb ana de ul a il ación; R.E.M.: eac o enzimá ico de memb ana; E.D.A.R.: es ación depu ado a de aguas esiduales
Conclusións
293
Conclusións
A deg adación de compos os ecalci an es cob a especial ele ancia a
medida que as leis medioambien ais anse máis se e as. No p esen e aballo
es udiouse o desen olo de al e na i as de a amen o pa a a deg adación des e ipo
de compos os, baseadas en p ocesos de oxidación en con inuo median e a encima
ligninolí ica MnP. A con inuación p esén anse os log os alcanzados e as
conclusións ob idas as a ealización des a ese:
i) O es udio ciné ico da deg adación encimá ica de O ange II emp egando MnP
indicou que a inguidu a esul a inhibi o ia só a concen acións supe io es a
750 mg/L. A ciné ica segue un modelo de Michaelis-Men en con espec o á
inguidu a e segue unha unción lineal de p imei o o de con espec o á
elocidade de adición de H2O2. A elocidade de deg adación é máis al a en
p esencia de oxálico que de acé ico, pa a concen acións de inguidu a po
debaixo de 500 mg/L.
ii) Op imizouse a ope ación dun eac o encimá ico de memb ana pa a a
deg adación en con inuo de O ange II. A e icacia depende an o da
es equiome ía como da ciné ica do p oceso. O es udio da es equiome ía
pe mi iu de e mina as concen acións máis adecuadas: unha elación
equimola en e H2O2 e O ange II e unha ac i idade encimá ica de 200 U/L
no eac o encimá ico. A ciné ica do p oceso mello ou modi icando
pa áme os ales como a elocidade de adición de H2O2, o ipo de ácido
o gánico ou o TRH. Alcanzouse unha e icacia máxima de 42 mg/U cunha
eliminación de co supe io ó 90%.
iii) O osíxeno disol o é un bo pa áme o pa a o con ol do p oceso: un aumen o
na súa concen ación indica unha dosi icación excesi a de H2O2, que
implica ía unha maio elocidade de desac i ación encimá ica; pola con a,
unha diminución na concen ación de osíxeno disol o se ía indica i a dunha
sob eca ga de inguidu a, allos de adición de H2O2 ou unha diminución da
ac i idade encimá ica.
Conclusións
294
i ) O eac o encimá ico de memb ana ope ou du an e 18 d consecu i os sen
cambio ou limpeza da memb ana. O p oceso p esen a unha ope ación
simple, g an es abilidade e é aplicable á deg adación dou os compos os.
) O modelo ciné ico p opos o a pa i es dos ensaios en descon inuo axus ou
axei adamen e os da os expe imen ais ob idos no p oceso en con inuo, de
manei a que se con i ma a súa alidez pa a a simulación e op imización do
p oceso.
i) A inmobilización de MnP median e enlace co alen e cun sopo e de
aga osa-glu a aldehido é un p oceso ela i amen e simple, que pe mi iu unha
e ención encimá ica do 100% e con e iu es abilidade á encima. Como
con apa ida, dado que as condicións de pH son se e as, no p oceso de
inmobilización pé dese un 50% da ac i idade encimá ica.
ii) O a amen o en con inuo nun eac o de anque axi ado con encima
inmobilizada pe mi iu ob e un alo ele ado da e icacia do p oceso,
median e a minimización do consumo de sopo e e encima. A minimización
do consumo de aga osa implicou ademais unha meno adso ción da
inguidu a O ange II sob e o sopo e.
iii) O modelo ciné ico ob ido a pa i es de ensaios en descon inuo con encima
lib e adap ouse á ciné ica máis len a con encima inmobilizada. A ecuación
esul an e simulou axei adamen e os da os expe imen ais.
ix) O eac o con inuo de anque axi ado con encima inmobilizada en unha
ope ación sinxela, non p esen a p oblemas de aumen o de p esión po
ensuciamen o e equi e menos bombas pa a a súa ope ación. Sen emba go,
en como des an axes impo an es a pe da de ac i idade encimá ica du an e
o p oceso de inmobilización, a ciné ica máis len a, o con ol máis complexo
da ac i idade encimá ica p esen e, a di icul ade dun sis ema pa a sus i ui a
encima desac i ada e a xe ación de esiduos.
x) O es udio do mecanismo de deg adación encimá ica de O ange II pe mi iu
iden i ica 9 compos os in e medios e inais, dous dos cales non o an
iden i icados con an e io idade: 4-diazonio bencenosul ona o e 2-na ol.
Cuan i icá onse os p oduc os, que co esponden a un 30% da concen ación
inicial de O ange II, o que indica que, ou ben exis en ou as u as de
deg adación, ou ben os p oduc os xe ados con inúan a súa deg adación de
ca a a ou os p oduc os inais.
Conclusións
295
xi) O pos a amen o bac e iano do e luen e de deg adación encimá ica de
O ange II le ouse a cabo en condicións an o ae obias como anae obias. O
e luen e non esul ou óxico pa a ningunha das dúas cepas bac e ianas,
deg adouse un 25-30% da DQO e xe á onse e luen es non óxicos. Sen
emba go, o p oceso anae obio eliminou un 30% da co , men es que o
p oceso ae obio non oi capaz de deco a o e luen e. Debido a is o,
conside ouse o pos a amen o anae obio como o máis axei ado pa a a a o
e luen e da deg adación encimá ica de O ange II.
xii) A inguidu a O ange II exe ce ce o e ec o de quelación sob e o ca ión Mn3+,
esponsable da oxidación encimá ica. Así, non é necesa ia a p esencia de
ácidos o gánicos pa a que a eacción encimá ica eña luga , aínda que se
emp egan igualmen e como es abilizado es de pH.
xiii) A a aliación dos cus es dos p ocesos de deg adación encimá ica indicou que
os cus es de inmobilización a ían in iable un p oceso baseado no emp ego
de encima inmobilizada, aplicando a me odoloxía es udiada. Sen emba go, o
a amen o nun eac o encimá ico de memb ana p esen a un cus e no ango
dos dou os p ocesos de oxidación a anzada.
En esumo, o a amen o encimá ico da inguidu a azo O ange II é unha
al e na i a axei ada, xa que a súa ciné ica é moi o máis ápida que a dos p ocesos
biolóxicos con encionais, alcanzando unha eliminación de co supe io ó 90% e
diminuíndose en máis de 9 eces a oxicidade do e luen e.
Pa a a súa aplicación a ni el indus ial se ía con enien e sepa a do e ido
xe al unha co en e concen ada de inguidu a, po exemplo median e memb anas.
Débese dispo de dúas unidades de ul a il ación en pa alelo, pa a emp ega a
segunda du an e os pe íodos de limpeza da p imei a. A de andi a co en e su i ía
un a amen o especí ico de deg adación median e un eac o encimá ico de
memb ana; as es e, pode íase engadi un pos a amen o anae obio. O e luen e
xe ado pode íase uni ó e luen e p oceden e do es o dos p ocesos da plan a pa a
se a ado median e un sis ema biolóxico con encional nunha E.D.A.R. (Figu a
C.2).

Conclusións
296
Co en e
colo eada
Ou as co en es
de p oceso
UF UFR.E.M.
Reac o
anae obio
E.D.A.R.
E luen e
Figu a C.2. Esquema do a amen o dun e luen e colo eado median e un p oceso combinado encimá ico-bac e iano. UF:
memb ana de ul a il ación; R.E.M.: eac o encimá ico de memb ana; E.D.A.R.: es ación depu ado a de augas esiduais
Co en e
colo eada
Ou as co en es
de p oceso
UF UFR.E.M.
Reac o
anae obio
E.D.A.R.
E luen e
Figu a C.2. Esquema do a amen o dun e luen e colo eado median e un p oceso combinado encimá ico-bac e iano. UF:
memb ana de ul a il ación; R.E.M.: eac o encimá ico de memb ana; E.D.A.R.: es ación depu ado a de augas esiduais
Conclusions
297
Conclusions
The deg ada ion o ecalci an compounds is mo e and mo e ele an since
he en i onmen al laws a e ge ing s ic e and s ic e . In his wo k, some
al e na i es o he deg ada ion o his kind o compounds, based on con inuous
oxida ion p ocesses by he ligninoly ic enzyme MnP, we e s udied. The aims
eached and he conclusions ob ained a e desc ibed below:
i) The kine ic s udy o he enzyma ic deg ada ion o O ange II by MnP poin ed
ou ha he dye jus caused inhibi ion when he concen a ion was highe
han 750 mg/L. The kine ics ollowed a Michaelis-Men en model ela ed o
O ange II and a i s o de linea unc ion ela ed o he H2O2 addi ion a e.
The deg ada ion a e in a medium con aining oxalic acid was highe han
ha ob ained in a medium con aining ace ic acid, o concen a ions lowe
han 500 mg/L.
ii) The ope a ion o an enzyma ic memb ane eac o was op imized o he
con inuous deg ada ion o O ange II. The e iciency depended on bo h he
s oichiome y and kine ics o he p ocess. The s oichiome ic s udy allowed
o de e mine he mo e sui able concen a ions: an equimola a io be ween
H2O2 and O ange II and an enzyma ic ac i i y o 200 U/L. The kine ics was
imp o ed by he modi ica ion o pa ame e s such as H2O2 addi ion a e, he
so o o ganic acid o he HRT. The maximum e iciency eached 42 mg/U
and he decolo iza ion was highe han 90%.
iii) The dissol ed oxygen is a good pa ame e o he con ol o he p ocess: a
concen a ion inc ease means an excessi e dosage o H2O2, which implies a
highe enzyma ic deac i a ion a e; o he wise, a concen a ion dec ease
indica es a dye o e load, ailu es in H2O2 addi ion o a dec ease o he
enzyma ic ac i i y.
i ) The enzyma ic memb ane eac o ope a ed o 18 d wi hou changing o
cleaning he memb ane. The p ocess has a simple ope a ion, high s abili y
and i can be applied o he deg ada ion o o he compounds.
Conclusions
298
) The kine ic model ha had been p oposed om he discon inuous assays,
adjus ed he expe imen al da a ob ained in he con inuous ope a ion. This
ac e i ies i s sui abili y o he p ocess simula ion and op imiza ion.
i) The MnP immobiliza ion by co alen binding wi h a suppo o aga ose-
glu a aldehyde is a ela i ely simple p ocess. I eached an enzyma ic
e en ion o 100% and con ibu ed o he enzyma ic s abili y. In con as ,
du ing he immobiliza ion p ocess he e was a loss o 50% o he enzyma ic
ac i i y, as he pH condi ions we e e y s ong.
ii) The ea men in a con inuous s i ed ank eac o wi h immobilized enzyme
eached a high e iciency, by means o he minimiza ion o he suppo and
enzyme consump ion. The minimiza ion o he aga ose consump ion
in ol ed, u he mo e, a lowe adso p ion o he dye in o he suppo .
iii) The kine ic model ob ained om he discon inuous ope a ion wi h ee
enzyme was adap ed o he slowe kine ics wi h immobilized enzyme. The
esul ing equa ion simula ed he expe imen al da a adequa ely.
ix) The con inuous s i ed ank eac o wi h immobilized enzyme has a simple
ope a ion, wi h no p oblems o ouling and equi es a less numbe o pumps
o i s ope a ion. Howe e , i has some impo an disad an ages, such as he
enzyma ic ac i i y loss du ing he immobiliza ion p ocess, he slowe
kine ics, he mo e complex con ol o he enzyma ic ac i i y, he p oblem o
ind a sys em o eplace he deac i a ed enzyme and he p oduc ion o was e.
x) The s udy o he enzyma ic deg ada ion mechanism o O ange II allowed o
iden i y nine in e media e and inal compounds. Two o hem had been
ne e iden i ied: 4-diazonium benzenesul ona e and 2-naph ol. These
p oduc s we e quan i ied and hey co espond o 30% o he ini ial dye
concen a ion. This ac poin s ou ha he e a e some o he deg ada ion
pa hways o he deg ada ion o he gene a ed p oduc s goes on o o he inal
compounds.
xi) The bac e ial pos ea men o he O ange II enzyma ic deg ada ion e luen
was pe o med in bo h ae obic and anae obic condi ions. The e luen was
no oxic o he bac e ial s ains, he COD deg ada ion eached 25-30% and
he gene a ed e luen s we e no oxic. Howe e , he anae obic ea men
implied a colo emo al o 30%, whe eas he ae obic p ocess was no able o
emo e he colo o he e luen . Due o his eason, he anae obic
Conclusions
299
pos ea men was conside ed as he mos sui able one o ea he O ange II
enzyma ic deg ada ion e luen .
xii) The dye O ange II is able o chela e he ca ion Mn3+, which is he
esponsible o he enzyma ic oxida ion. The e o e, he enzyma ic eac ion
does no equi e he p esence o o ganic acids, al hough hese acids a e used
as pH s abilize s.
xiii) The economical e alua ion o he enzyma ic deg ada ion p ocesses poin s
ou ha he immobiliza ion cos s would make un iable a p ocess based on
he immobilized enzyme, by applying he es ablished echnology. Howe e ,
he cos o he con inuous ea men in an enzyma ic memb ane eac o is
wi hin he cos s o o he ad anced oxida ion p ocesses.
As a summa y, he enzyma ic ea men o he azo dye O ange II is a sui able
al e na i e, as he kine ics is much mo e apid han ha o he con en ional
biological p ocesses, eaching a decolo iza ion highe han 90% and educing he
oxici y o he e luen mo e han 9- old.
Fo he indus ial applica ion o his sys em, i would be con enien o
emo e a concen a ed s eam om he main one, o example, by ul a il a ion
memb anes. Two ul a il a ion uni s should be in pa allel, in o de o use he
second one when he i s one is being cleaned. This s ain would be ea ed
speci ically by means o an enzyma ic memb ane eac o , which could be
ollowed by an anae obic pos ea men . The gene a ed e luen could be lowed
in o he gene al e luen coming om he es o he p ocesses in he ac o y, and
he esul ing e luen could be ea ed by a con en ional biological ea men
p ocess in a W.W.T. P. (Figu e C.3).