Efectos de varios tratamientos culinarios sobre la composición de la judia verde

UNIVERSIDAD DE SANTIAGO DE COMPOSTELA FACULTAD DE FARMACIA Departamento de Química Analítica, Nutrición y Bromatología Área de Nutrición y Bromatología EFECTOS DE VARIOS TRATAMIENTOS CULINARIOS SOBRE LA COMPOSICION DE LA JUDIA VERDE CARLOS DE LA CRUZ GARCIA Santiago de Compostela, Junio de 2000 UNIVERSIDAD DE SANTIAGO DE COMPOSTELA FACULTAD DE FARMACIA Departamento de Química Analítica, Nutrición y Bromatología Área de Nutrición y Bromatología EFECTOS DE VARIOS TRATAMIENTOS CULINARIOS SOBRE LA COMPOSICION DE LA JUDIA VERDE CARLOS DE LA CRUZ GARCIA Santiago de Compostela, Junio de 2000 ii PILAR BERMEJO BARRERA, DIRECTORA DEL DEPARTAMENTO DE QUIMICA ANALITICA, NUTRICION Y BROMATOLOGIA DE LA UNIVERSIDAD DE SANTIAGO DE COMPOSTELA INFORMA: Que D. Carlos de la Cruz García presenta el trabajo titulado “EFECTOS DE VARIOS TRATAMIENTOS CULINARIOS SOBRE LA COMPOSICION DE LA JUDIA VERDE” realizado bajo la dirección de la Dra. Julia López Hernández y del Dr. Jesús Simal Lozano, en el laboratorio de Bromatología de la Universidad de Santiago de Compostela. Fdo. Dra. Dña. Pilar Bermejo Barrera Santiago de Compostela, Junio de 2000. iii JULIA LOPEZ HERNANDEZ, PROFESORA TITULAR DE NUTRICION Y BROMATOLOGIA Y JESUS SIMAL LOZANO, CATEDRATICO DE BROMATOLOGIA, TOXICOLOGIA Y ANALISIS QUIMICO AUTORIZAN a Carlos de la Cruz García a presentar la Tesis titulada “EFECTOS DE VARIOS TRATAMIENTOS CULINARIOS SOBRE LA COMPOSICION DE LA JUDIA VERDE” para optar al Grado de Doctor, la cual ha sido realizada bajo nuestra dirección en el laboratorio de Bromatología de la Facultad de Farmacia de la Universidad de Santiago de Compostela. Y para que conste se expide la presente en Santiago de Compostela, en Junio de 2000. Fdo. Dra. Dña. Julia López Hernández Fdo. Dr. D. Jesús Simal Lozano iv AGRADECIMIENTOS Quisiera expresar mi sincero agradecimiento a todos aquellos que han contribuido, de una manera u otra, a la realización de esta memoria: A mis directores, Dra. Julia López Hernández y Dr. Jesús Simal Lozano, por los conocimientos que de forma constante he recibido y sigo recibiendo. A mis compañeras y profesores, que han mantenido un ambiente de trabajo que hemos disfrutado todos, en especial a las Dras. Mª José González y Mª José Oruña y a la futura Dra. Ana I. Rodríguez-Bernaldo de Quirós. A mi familia, a todos los que a mi alrededor han compartido este tiempo y a los que sin saberlo, como los profesores Antonio Carpintero y Víctor Lens, me han seguido desde años. A todos ellos, gracias. v A mis hermanos Álvaro, Elisardo y Luís. vi INDICE GENERAL INDICE DE TABLAS Y FIGURAS ix ABREVIATURAS xii I INTRODUCCION 1 I.1.- Evolución de los tratamientos 2 I.2.- Objetivo 3 I.3.- Referencias bibliográficas 6 II MODIFICACIONES DE COMPONENTES VOLATILES 7 II.1.- Resumen 8 II.2.- Introducción 8 II.3.- Material y Métodos 10 II.3.1.- Muestras 10 II.3.2.- Muestreo mediante Espacio de Cabeza Dinámico 10 II.3.3.- Cromatografía de Gases 10 II.3.4.- Cromatografía de Gases / Espectrometría de Masas 11 II.3.5.- Identificación de Compuestos 11 II.4.- Resultados y Discusión 12 II.4.1.- Aldehidos 12 II.4.2.- Alcoholes 13 II.4.3.- Cetonas 14 II.4.4.- Ésteres 14 II.4.5.- Compuestos Sulfurados 14 II.4.6.- Terpenos 14 II.5.- Tablas y Figuras 16 II.6.- Referencias bibliográficas 21 II.7.- Apéndice 23 III MODIFICACIONES DE PIGMENTOS 38 III.1.- Resumen 39 III.2.- Introducción 39 vii III.3.- Material y Métodos 40 III.3.1.- Muestras 40 III.3.2.- Procesado 40 III.3.3.- Análisis por HPLC 40 III.3.4.- Comparación del Contenido en Pigmentos 42 III.4.- Resultados y Discusión 43 III.5.- Tablas y Figuras 45 III.6.- Referencias bibliográficas 53 IV MODIFICACIONES DE ACIDOS ORGANICOS 55 IV.1.- Resumen 56 IV.2.- Introducción 56 IV.3.- Material y Métodos 57 IV.3.1.- Muestras 57 IV.3.2.- Procesado 57 IV.3.3.- Análisis por HPLC 58 IV.4.- Resultados y Discusión 59 IV.5.- Tablas y Figuras 61 IV.6.- Referencias bibliográficas 71 V MODIFICACIONES DE AMINOACIDOS 72 V.1.- Resumen 73 V.2.- Introducción 73 V.3.- Material y Métodos 74 V.3.1.- Muestras 74 V.3.2.- Procesado 74 V.3.3.- Reactivos 75 V.3.4.- Equipo de Cromatografía 75 V.3.5.- Preparación de Muestras y Estándares 75 V.3.6.- Proceso de Derivatización 76 V.3.7.- Proceso Cromatográfico 76 V.4.- Resultados y Discusión 76 V.5.- Tablas y Figuras 78 V.6.- Referencias bibliográficas 84 viii VI MODIFICACIONES DE CARBOHIDRATOS 85 VI.1.- Resumen 86 VI.2.- Introducción 86 VI.3.- Material y Métodos 87 VI.3.1.- Muestras 87 VI.3.2.- Procesado 87 VI.3.3.- Reactivos 88 VI.3.4.- Procedimiento 88 VI.4.- Resultados y Discusión 89 VI.5.- Tablas y Figuras 91 VI.6.- Referencias bibliográficas 97 VII MODIFICACIONES DE ACIDOS GRASOS 99 VII.1.- Resumen 100 VII.2.- Introducción 100 VII.3.- Material y Métodos 101 VII.3.1.- Muestras 101 VII.3.2.- Procesado 101 VII.3.3.- Procedimiento 102 VII.4.- Resultados y Discusión 103 VII.5.- Tablas y Figuras 105 VII.6.- Referencias bibliográficas 110 VIII CONCLUSIONES GENERALES 111 5 II) y el color (capítulo III). Por otra parte se encuentran los componentes asociados con parámetros nutricionales como los ácidos orgánicos y Vitamina C (capítulo IV), los aminoácidos (capítulo V), los carbohidratos (capítulo VI) y los ácidos grasos (capítulo VII). Todos los capítulos que forman esta tesis han sido enviados a revistas internacionales especializadas, y fruto de ello se han publicado los siguientes artículos:  “Effects of various culinary treatments on the pigment content of green beans (Phaseolus vulgaris, L.)”, Journal of Food Research International, 1997, 30 (10):787-791.  “Effects of various culinary treatments on the organic acid content of green beans (Phaseolus vulgaris, L.)”, Deustche Lebensmittel Rundschau, 1999, 95 (8):323326.  “Effects of various culinary treatments on the amino acid content of green beans”, Deustche Lebensmittel Rundschau, 1999, 95 (12):507-510.  “Comparision of volatile components in raw and cooked green beans using dinamic headspace sampling and microwave desorption”, Eur Food Res Technol, 2000, 210:226-230.  “Gas chromatographic determination of fatty acid content in vegetables during different heat-treatments”, póster en el 9 Symposium on Handling of Environmental and Biological Samples in Chromatography, 1999.  “Gas chromatographic determination of the fatty acid content of heat-treated green beans”, aceptada el 24-Mayo-2000, Journal of Chromatography.  “Effects of various culinary treatments on the carbohydrates content of green beans (Phaseolus vulgaris, L.)”, en prensa. 6 I.3.- Referencias bibliográficas. 1.- Ordoñez-Pereda, J. A., “Tecnología de los Alimentos; Volumen I: Componentes de los alimentos y procesos.” Editorial Síntesis, S.A., Madrid, (1998). 2.- González-Castro, M. J., “Estudio de ditintos componentes de Phaseolus vulgaris, L. Modificación de la composición con diversos procesos de conservación.”, Tesis de la Facultad de Farmacia de la Universidad de Santiago de Compostela, (1996). 3.- Vidal-Valverde, C.; Frías, J. And Esteban, R. (1992). Dietary Fiber in processed Lentils. Journal of Food Science 57(5): 1161-1163. 4.- Ministerio de Agricultura, Pesca y Alimentación. (http:\\www.mapya.es/page/agric/index.htm); “Superficies y producciones agrícolas”. 5.- Consellería de Agricultura, Pesca e Gandería. (http:\\www.xunta.es/conselle/ag/public/aea97.htm); “Anuario de estadística agraria, 1997”. II COMPARACION DE LOS COMPONENTES VOLATILES EN JUDIAS VERDES CRUDAS Y COCINADAS CON GC-MS MEDIANTE ESPACIO DE CABEZA DINAMICO Y DESORCION CON MICROONDAS (“Comparison of volatile components in raw and cooked green beans using dynamic headspace sampling and microwave desorption”, Eur Food Res Technol, 2000, 210:226-230) 8 II.1.- Resumen Se evaluaron los efectos que cuatro tratamientos culinarios (hervido a vapor, en olla tapada, a presión y con horno de microondas) tienen sobre el perfil de componentes volátiles de las judías verdes. Los compuestos volátiles tanto en las judías verdes crudas como en las cocinadas se analizaron por espacio de cabeza dinámico, haciendo pasar el espacio de cabeza a través de un adsorbedor, seguido de una desorción mediante microondas a un cromatógrafo equipado con un detector de masas. Se identificaron veintisiete compuestos, entre ellos alcoholes, aldehidos, cetonas, ésteres, terpenos, compuestos sulfurados y alquenos. Todos los tratamientos térmicos implicaron importantes cambios en el perfil de compuestos volátiles, en particular un incremento en los compuestos carbonílicos y una disminución en los compuestos alcohólicos, que fue más notable en el caso del hervido en olla tapada. Está probado que los cambios en el aroma durante el cocinado de las judías verdes dependen de procesos como la oxidación de los lípidos, así como de otro tipo de reacciones, por ejemplo la degradación de Strecker. II.2.- Introducción El aroma es un factor de aceptabilidad importante para cualquier producto alimenticio. Los vegetales pueden ser comidos crudos, cocinados o procesados, y dependiendo del modo de su preparación el contenido en volátiles puede variar mucho. Muchos de los compuestos volátiles están presentes por todo el vegetal (Oruña-Concha y col., 1998), otros son producidos cuando se rompen al cortarlos (Narain y col. 1990), al masticarlos (Van Ruth y col., 1995) o licuarlos (Buttery y col., 1990), y otros aparecen como productos de reacción durante el cocinado (Wu y col., 1986; Petersen y col., 1998) o el procesado (Nisperos-Carriedo and Shaw, 1990), (Shamalia y col., 1992). El aroma de los alimentos frescos se produce normalmente por compuestos presentes “in vivo” y por otros producidos por degradación enzimática durante el almacenamiento y el procesado. El aroma de los alimentos cocinados es debido a una compleja cadena de reacciones químicas, por ejemplo la degradación de Strecker, dependiente de parámetros como humedad, temperatura y tiempo de cocinado. 9 Los compuestos volátiles están generalmente presentes en las plantas como mezclas complejas y su determinación requiere un método analítico como la cromatografía de gases (GC). Debido a que la muestra a inyectar debe estar libre de compuestos no volátiles, es necesario un paso de separación previo el análisis por GC. El paso de separación puede llevarse a cabo por distintos métodos como destilación a vapor o a vacío (Shimoda y col., 1996), extracción con solventes (Homatidou y col., 1992; Kawakami y col., 1995; Morales y col., 1996), destilación y extracción simultánea (Chitwood y col., 1983; Esteban y col., 1996) y mediante espacio de cabeza estático ( Shinohara y col., 1991; Mc Calley y Torres-Grifol, 1992; Clarkson y Cooke, 1996). Alguna de las limitaciones inherentes a estos procedimientos de extracción, como la formación de compuestos interferentes, la necesidad de concentrar las muestras previo su análisis, y la posibilidad de contaminación de la muestra por los solventes, pueden evitarse usando métodos de muestreo con espacio de cabeza dinámico (purga y trampa). En este trabajo, los compuestos volátiles de las judías verdes fueron extraídos mediante el sistema de purga y trampa, adsorbidos en carbón negro grafitado y rápidamente desorbidos mediante calentamiento con microondas. Técnica aplicada con éxito en el análisis de compuestos volátiles en alimentos (Rektorik J, 1985; Scharf y Sarafin, 1995; Fondville-Bagnol y col., 1995; Riedel y col., 1996). El uso de la energía de microondas para este fin es especialmente atractivo ya que permite un calentamiento de la muestra más uniforme que el conseguido con otros métodos tradicionales y puede desorber compuestos selectivamente en función de sus capacidades individuales de absorción de las microondas (Rektorik J, 1985). Los compuestos volátiles desorbidos se identificaron mediante GC con detector de espectrometría de masas (GC-MS). Las vainas enteras de las judías verdes (Phaseolus vulgaris, L.) son frutos usados comúnmente como alimento que pueden comerse cocinados, bien calientes como plato principal bien fríos en ensalada. En este trabajo hemos examinado los efectos que cuatro tratamientos culinarios (hervido a vapor, en olla tapada, a presión y con horno de microondas) tienen sobre el perfil de componentes volátiles de las judías verdes porque pese a su importancia comercial, existe muy poca información al alcance sobre sus componentes volátiles. 10 II.3.- Material y Métodos II.3.1.- Muestras Se adquirieron judías verdes frescas (Phaseolus vulgaris, L.) (1 Kg) en un local de Santiago de Compostela, pudiendo ser consideradas con igual frescura y calidad a cualquier otra disponible al consumidor. Se eliminaron los tallos y las judías se trocearon en porciones de 1 cm de largo y bien mezcladas para asegurar su homogeneidad. Las judías ya troceadas se dividieron en lotes de 200 g. El lote de judías frescas troceadas se analizó y los restantes lotes se sometieron a uno de los siguientes tratamientos culinarios: 1.- hervido en una olla cubierta con 250 mL de agua durante 30 minutos a 99 ºC. 2.- hervido a vapor en una olla cubierta durante 40 minutos a 97 ºC. 3.- hervido a presión con 150 mL de agua durante 5 minutos tras la primera salida de vapor a 112-120 ºC. 4.- hervido en horno a microondas con 100 mL de agua durante 5 minutos. Todos los análisis se realizaron por duplicado. Todos los tratamientos usaron el menor volumen de agua y el menor tiempo de cocción para alcanzar un grado similar de ternura con una palatabilidad adecuada, siendo el obtenido con microondas el producto menos tierno dadas sus características térmicas. II.3.2.- Muestreo mediante espacio de cabeza dinámico Las judías verdes (4 g) se transfirieron a un frasco de extracción, el cual se calentó en baño de agua a 40 ºC. Durante 30 min. se hizo pasar a través de la muestra una corriente de nitrógeno a 30 mL/min. que en su salida atraviesa una trampa de carbón negro grafitado donde cualquier compuesto volátil liberado es adsorbido. Precediendo a la muestra se colocó una trampa de carbón activado para eliminar posibles impurezas de la línea de nitrógeno. II.3.3.- Cromatografía de Gases Los componentes volátiles se determinaron usando un desorbedor de microondas Rektorik MW-1 A (Rektorik, Geneva, Suiza) unido por una interfase termostatizada al sistema GC-MS (Fisons, Modelo 8000 con MSD 800). Los componentes atrapados se desorbieron térmicamente usando microondas a 350 Mhz durante 0,8 seg., y se dirigieron a una columna capilar de GC (30m X 25 mm id X 1 µm de película 11 compuesta de un 5% difenil-polisiloxano y 95% dimetil-polisiloxano) (DB-5, J&W Scientific). Su eficacia se chequeó importando un cromatograma al “software” ChromCard (versión 1.18, CE Instruments, Milano, Italia) ante la imposibilidad de hacerlo con el “software” MassLab. Como gas portador se usó helio a 2,43 mL/min. El programa de temperatura del horno comienza desde 60 ºC hasta 220 ºC a un ritmo de 4 ºC/min., manteniendo esas temperaturas inicial y final 1 y 3 min. respectivamente. II.3.4.- Cromatografía de Gases/Espectrometría de Masas Las condiciones del Detector de Espectrometría de Masas fueron las siguientes: temperatura de la interfase 250 ºC; temperatura de la fuente de iones 200 ºC; voltaje de ionización 70 eV; rango de masas 35-200 m/z; y tiempos de barrido y de retraso entre los barridos 0,45 y 0,05 seg. respectivamente. Tanto para el manejo del equipo como para la biblioteca de espectros se usó el “software” MassLab versión 1.4 de Finnigan, Reino Unido; instalado en un PC 486 con 20 Mb de RAM. II.3.5.- Identificación de compuestos Los componentes se identificaron por comparación de sus espectros de masas con los que componen la librería Willey de espectros de masas (Versión 1.4). En todos se identificaron 27 compuestos con una similitud en porcentaje ≥ de un 85%. Esta similitud se validó por los dos sistemas de comparación (“For” y “Rew”) tras eliminar las interferencias producidas por las masas constituyentes de la línea base. Varios compuestos (hexanal, benzaldehido, 1-octen-3-ol, octanal, limoneno, nonanal y decanal) se identificaron posteriormente por comparación de sus tiempos de retención con los de sus estándares. Con ayuda del “software” MassLinx, versión 2.0, y Word 2000 (Microsoft, EEUU) se importaron cromatogramas desde el MassLab para posteriores comprobaciones con fragmentaciones teóricas de las moléculas analizadas. Estos “software” permiten también realizar representaciones más avanzadas (ver Figura II.2). 12 II.4.- Resultados y Discusión En la Tabla II.1 se recogen los compuestos volátiles identificados en judías verdes crudas y cocinadas. Sus espectros de masas, número de identificación CAS, fórmula y peso molecular conforman un apéndice al presente capítulo. Éstos compuestos pueden encuadrarse dentro de las siguientes familias químicas: aldehidos (de los que se encontraron 7), alcoholes (8), cetonas (6), ésteres (3), compuestos azufrados (1), terpenos (1) y n-alquenos (1) (Figura II.1). II.4.1.- Aldehidos Los aldehidos lineales, como el 2-butenal (sólo detectado el olla tapada), hexanal, octanal, nonanal y decanal, provienen en su mayoría de la degradación oxidativa de ácidos grasos insaturados (oleico, linoleico y linolénico) y se ha demostrado que están involucrados en la ruta de la lipoxigenasa e hidroperoxidasa (Belitz y Grosch, 1988). Es sabido que son una ruta importante en la contribución al aroma de varias legumbres (De Lumen y col., 1978). Las cantidades de hexanal, octanal, nonanal y decanal se vieron incrementadas en el cocinado; esto puede explicarse por el hecho de que aunque las enzimas sean destruidas durante el procesado térmico, las altas temperaturas aceleran los procesos de oxidación, los cuales no están catalizados enzimáticamente. Este efecto es menor en el hervido a vapor debido a la menor temperatura de cocción (92 ºC). La formación de aldehidos de 6 carbonos (hexanal) y alcoholes (3-hexen-1-ol) en el vegetal está relacionada con la destrucción celular (Wu y Liou, 1986). La presencia de aldehidos de 6 carbonos y alcoholes es altamente responsable del característico olor a verde de las plantas y árboles, y estos compuestos son también constituyentes del aroma de algunas frutas (Olías y col., 1993). La mayor ruta de formación de los aldehidos de cadena ramificada parece ser la desaminación-decarboxilación oxidativa, vía degradación de Strecker (García y col., 1991). El aldehido 3-metil butanal, sólo detectado en las judías verdes cocinadas, se deriva del aminoácido leucina (Belitz y Grosch, 1988). Estas reacciones suceden durante los procesos de secado y cocinado (Whitfield, 1992). Los aldehidos aromáticos como el benzaldehido derivan del metabolismo del ácido shikímico, que produce como paso intermedio la fenilalanina (Dourtoglou y col., 1994). El benzaldehido es conocido por su olor a almendras enteras y a frutos con hueso (Narain et al, 1990) como el melocotón. Todos los tratamientos térmicos, especialmente 13 la cocción a presión, aumentan los niveles de benzaldehido probablemente porque este compuesto es generado térmicamente por la degradación vía Strecker (Hayashi y col., 1990). Los mayores contenidos de aldehidos generados por degradación vía Strecker se observaron en el cocinado a presión, lo cual puede ser explicado por las altas temperaturas inducidas por este tratamiento. II.4.2.- Alcoholes Los alcoholes constituyen desde el punto de vista cuantitativo, la familia más importante de los compuestos volátiles en la judía verde cruda (73%). La presencia de alcoholes con cadena de igual longitud que la de compuestos carbonílicos encontrados entre los volátiles del vegetal es una clara evidencia de la actividad oxidorreductasa en los tejidos. Su umbral de percepción aromático es mayor que el de los aldehidos, así que su influencia en el aroma debe ser menor. Sin embargo, alcoholes insaturados como el 1-octen-3-ol y 3-hexen-1-ol poseen un umbral de percepción menor, y por ello deben jugar un papel más importante en el aroma (Seik y col., 1977). El compuesto más abundante en las muestras crudas es el 1-octen-3-ol (47%), el cual, junto con el hexanal, ha sido descrito como uno de los principales compuestos volátiles derivados del ácido linoleico en judías verdes (De Lumen y col., 1978). La biogénesis del 3-metil-1-butanol está catalizada, vía degradación de Strecker, por la L-leucina aminotransferasa en una reacción asociada con el ácido 2-cetoglutámico, quien actúa como un grupo amino aceptor (Straus y col., 1986). Al igual que los aldehidos generados por degradación vía Strecker, los contenidos más altos de 3-metil1-butanol se hallaron en las judías verdes cocidas a presión. El alcohol 2-butoxi etanol posiblemente no sea un compuesto natural de las judías y su presencia parece sugerir que ha sufrido alguna contaminación por productos químicos agrícolas. Todos los tratamientos térmicos, pero especialmente el cocinado en olla tapada, producen disminuciones en el contenido de compuestos alcohólicos. Las grandes pérdidas de alcoholes son atribuibles a la alta solubilidad de los alcoholes en el agua (Josephson y col., 1987), y este efecto se incrementa en el cocinado en olla tapada debido al mayor volumen de agua empleado (250 mL). 14 II.4.3.- Cetonas Algunas de las cetonas deben derivar de ácidos grasos insaturados, como en la 1-penten3-ona la cual deriva del ácido linolénico (Belitz y Grosch, 1988). Los contenidos en cetonas se incrementan con todos los tratamientos térmicos excepto en la cocción a presión. El compuesto 6-metil-5-hepten-2-ona ha sido descrito como un producto de la degradación hidrolítica por calentamiento del neral y el geranial (Chen y Ho, 1989). Esto puede ser también el resultado división oxidativa de carotenoides como el licopeno y fitoeno (Buttery y col., 1988). II.4.4.- Ésteres Los ésteres se forman por esterificación de ácidos carboxílicos y alcoholes (Mottram, 1991). Se identificaron dos ésteres de 6 carbonos en la muestra cruda. Estos compuestos producen notas frutales (Chyau y col., 1992), en particular aquellos formados por ácidos de cadena corta. Ambos ésteres se degradaron debido al calor, dado que todos los tratamientos térmicos produjeron su completa pérdida. II.4.5.- Compuestos azufrados Estos compuestos provienen de la rotura de aminoácidos sulfurados, reacción que se encuentra acelerada por las altas temperaturas. Deben influir en el aroma global dado que poseen un olor fuerte (Schutte L , 1974). El único compuesto azufrado encontrado fue el sulfuro de dimetilo. Es reconocible por su olor similar a cebolla-repollo (Bouseta y col., 1996). II.4.6.- Terpenos Estos compuestos son constituyentes normales de la fracción insaponificable de la grasa vegetal. Muchos de estos volátiles se reconocen al poseer unas propiedades aromáticas distintivas, contribuyendo así pues al aroma característico de sus respectivas variedades (Horvat y col., 1991). El limoneno, con un aroma cítrico agradable, fresco, ligero y dulce, fue el único terpeno detectado. 21 II.6.- Referencias bibliográficas 1. Belitz H D, Grosch W (1988) Química de los alimentos. Acribia, Zaragoza, Spain. 2. Bouseta A, Scheirman V, Collin S (1996) J Food Sci 61 (4): 683-687 3. Buttery R G, Teranishi R, Ling L C, Flath R A, Stern D J (1988) J Agric Food Chem 36: 1247-1250 4. Buttery R G, Takeoka G, Teranishi R, Ling L C (1990) J Agric Food Chem 38: 2050-2053 5. Chen C C, Ho C T (1989) In: Thermal Generation of Aromas American Chemical Society: Washington, DC 6. Chitwood R L, Pangborn R M, Jennings W (1983) Food Chem 11: 201-216 7. Chyau C C, Chen S Y, Wu C M (1992) J Agric Food Chem 40: 846-849 8. Clarkson P, Cooke M (1996) Anal Chim Acta 335: 253-259 9. De Lumen B O, Stone E J, Kazeniac S J, Forsythe R H (1978) J Food Sci 43: 698702 10. Dourtoglou V G, Yannovits N G, Tychopoulos V G, Vamvakias M M (1994) J Agric Food Chem 42: 338-344 11. Esteban J L, Martínez-Castro I, Morales R, Fabrellas B, Sanz J (1996) Chromatographia 43 (1/2): 63-72 12. Fondville-Bagnol A, Sarris J, Bayonove C, Flanzy C (1995) Sci Aliment 15: 359366 13. García C, Berdagué J L, Antequera T, López-Bote C, Córdoba J J, Ventanas J (1991) Food Chem 41:23-32 14. Hayashi T, Ishii H, Shinoara A (1990) Food Rev Int 6: 521-536 15. Homatidou V I, Karvouni S S, Dourtoglou V G, Poulos C N (1992) J Agric Food Chem 40: 1385-1388 16. Horvat R J, Arrendale R F, Dull G G, Chapman G W, Kays S J (1991) J Food Sci 56 (3): 714-715. 17. Josephson D B, Lindsay R C, Stiber DA (1987) J Food Sci 52 (1): 10-14 18. Kawakami M, Ganguly S N, Banerjee J, Kobayashi A (1995) J Agric Food Chem 43: 200-207 19. Kermasha S, Van de Voort F R, Metche M (1988) J Agric Food Chem 36: 133-137 20. Mc Calley D V, Torres-Grifol J F (1992) Analyst 117: 721-725 22 21. Morales A L, Albarracin D, Rodríguez J, Duque C, Riaño L E, Espitia J (1996) J High Resol Chromatogr 19: 585-587 22. Mottram D S (1991) Meat. In Volatile Compounds in Foods and Beverages H. Maarse. Marcel Dekker, Snc, New York 23. Narain N, Hsieh T C Y, Johnson C E (1990) J Food Sci 55 (5): 1303-1307 24. Nisperos-Carriedo M O, Shaw P E (1990) J Agric Food Chem 38 (4): 1048-1052 25. Olías J M, Pérez A G, Ríos J J, Sanz L C (1993) J Agric Food Chem 41: 23682373 26. Oruña-Concha M J, López-Hernández J, Simal-Lozano J, Simal-Gándara J, González-Castro M J, De la Cruz-García C (1998) J Chromatogr Sci 36: 583-588 27. Petersen M A, Poll L, Larsen M (1998) Food Chem 61 (4): 461-466 28. Rektorik J (1985) Thermal desorption of solid traps by means of microwave energy. Pat sandra, Pub. Huetig Verlag, Heidelberg 29. Riedel K, Ruppert T, Conze C, Scherer G, Adlkofer F (1996) J Chromatogr A 719: 383-389 30. Scharf J, Sarafin R (1995) J High Resol Chromatogr 18: 253-258 31. Schutte L (1974) Critical Reviews in Food Technology 4: 457 32. Seik T J, Albin I A, Sather L A, Lindsay R C (1977) J Dairy Sci 54:1-4 33. Shamaila M, Powrie W D, Skura B J (1992) J Food Sci 57 (5): 1173-1176 34. Shimoda M, Shiratsuchi H, Nakada Y, Wu Y, Osajima Y (1996) J Agric Food Chem 44: 3909-3912 35. Shinohara A, Sato A, Ishii H, Onda N (1991) Chromatographia 32 (7/8): 357-364. 36. Straus C, Wilson B, Gooley P, Williams P (1986) In Biogeneration of Aromas; ACS Symposium Series; American Chemical Society: Washington 37. Van Ruth S M, Roozen J P, Cozijnsen J L (1995) Food Chem 53: 15-22 38. Whitfield F B (1992) Crit Rev Food Sci Nutr 31: 1-58 39. Wu C, Liou S, Wang M (1986) JAOCS 63 (9): 1172-1175 40. Wu C, Liou S (1986) J Agric Food Chem 34: 770-772 II.7 APÉNDICE III EFECTOS DE DISTINTOS TRATAMIENTOS TERMICOS EN EL CONTENIDO DE PIGMENTOS EN JUDIAS VERDES (Phaseolus vulgaris, L.) “Effects of various culinary treatments on the pigment content of green beans (Phaseolus vulgaris, L.)”, Journal of Food Research International, 1997, 30 (10):787-791. 39 III.1.- Resumen Se evaluaron los efectos que cuatro tratamientos culinarios (hervido a vapor y en olla tapada, en olla a presión y con horno de microondas) tienen sobre el contenido de clorofila a y b, all-trans-luteína, feofitina a y b, y all-trans-β-caroteno (provitamina A) en judías verdes (Phaseolus vulgaris, L.). Los pigmentos en judías frescas y cocinadas se determinaron por HPLC en fase reversa con detección UV. El hervido en olla tapada, a presión o con microondas produjo pérdidas de pigmentos menores que con el cocinado a vapor. Dado que el cocinado a presión conlleva menores pérdidas de nutrientes (por ejemplo, vitamina C), se recomienda sobre el método tradicional del hervido en olla tapada. III.2.- Introducción El color de los vegetales es una propiedad sensorial importante y puede usarse como un criterio de calidad del vegetal (Chen y col., 1995). En las plantas la mayoría de los pigmentos son carotenoides y clorofilas, las cuales se encuentran juntas en la mayoría de los tejidos fotosintéticos. Los carotenoides, precursores de la vitamina A, pueden actuar a dosis altas como inhibidores de tumores (Harris y col., 1991) y úlceras (Mozsic y col., 1984). Las clorofilas son la mayor fuente de magnesio en la dieta (Buss y col., 1987). Los carotenoides principales en las judías verdes son la luteína y el β-caroteno (Heinonen y col., 1989), y las clorofilas predominantes son la clorofila a y b, las cuales suelen encontrarse en una proporción entorno a 3:1 (Belitz and Grosch, 1988). Las judías verdes son un componente importante de la dieta española (Moreiras y col., 1988). En este trabajo se examinan los efectos que sobre el contenido de clorofilas y carotenoides de judías verdes frescas, tienen distintos tratamientos térmicos como hervido a vapor y en olla, cocción a presión y en horno a microondas. Las clorofilas y los carotenoides fueron determinados por un método de HPLC desarrollado en nuestro laboratorio (López-Hernández y col., 1993), que ha sido considerada la técnica más rápida, simple y reproducible para el análisis de mezclas de estos pigmentos en alimentos. 40 III.3.- Material y Métodos III.3.1.- Muestras Las judías fueron adquiridas a primera hora de la mañana de cada día de muestreo en un mismo local de venta, y se pueden considerar con igual frescura y calidad a cualquier otra disponible al consumidor. Un total de ocho lotes de judías fueron analizados. Los contenidos de clorofilas a y b, all-trans-luteína, feofitina a y b y all-trans-caroteno fueron también determinados en el vegetal fresco cada día de compra. III.3.2.- Procesado En el mismo día de adquisición se obtuvieron 5 muestras de 10 gramos de judía troceada manualmente representativos del lote. Una de las muestras es inmediatamente analizada (fresco) y las otras cuatro sometidas inmediatamente a uno de los siguientes tratamientos culinarios: 1.- hervido en una olla cubierta con 250 mL de agua durante 30 minutos. 2.- hervido a vapor en una olla cubierta durante 40 minutos. 3.- hervido a presión con 150 mL de agua durante 5 minutos tras la primera salida de vapor. 4.- hervido en horno a microondas con 100 mL de agua durante 5 minutos. Todos los tratamientos usan el menor volumen de agua y el menor tiempo de cocción para alcanzar un grado similar de ternura con una palatabilidad adecuada, siendo las muestra cocinadas mediante microondas el producto menos tierno dadas las características térmicas de las microondas (calientan menos las partes con menos agua, las más correosas). III.3.3.- Análisis por HPLC Los patrones de clorofila a, clorofila b, all-trans-luteína (pureza 70%) y all-trans-βcaroteno (pureza 95%) pertenecen a Sigma-Aldrich (Madrid, España). Los solventes de grado HPLC: metanol, acetonitrilo, diclorometano y hexano pertenecen a Scharlau (Barcelona, España), acetona y éter de petróleo de Normasolv (Madrid, España) y tetrahidrofurano (estabilizado con 2,6-dietaributyl-methylphenol) también de Scharlau. Los patrones de feofitinas a y b se prepararon con clorofilas a y b sometiéndolas a un 41 calentamiento en medio ácido (13% HCl, 70ºC, 5 minutos). Se sabe que la degradación de las clorofilas formando estos compuestos (también feofórbidos) está favorecida por el calor y un medio ácido (Belitz and Grosch, 1988). Las feofitinas se han identificado por su espectro visible (Daood y col., 1989). Las judías, una vez cocinadas, se escurrieron durante un minuto e inmediatamente se homogeneizaron con ayuda de un mortero. Diez gramos del homogeneizado se mezclaron con 1 g de carbonato cálcico, 20 g de sulfato sódico anhidro y una pequeña cantidad de arena de mar. La arena de mar es usada como abrasivo con el objetivo de romper los tejidos vegetales. Se añadió acetona-éter de petróleo (50:50 v/v) al homogeneizado en pequeños volúmenes y se recogieron por filtración a vacío a través de un papel Whatman 541 hasta que el residuo quedase incoloro. Los filtrados fueron diluidos a 100 mL y 10 mL de este extracto evaporados a sequedad en un baño a 37ºC bajo corriente de nitrógeno. El residuo seco es redisuelto en 2 mL de hexano, filtrado (millipore 0.22 µm de tamaño de poro) para retener las partículas insolubles antes de la inyección. Cada una de las muestras homogeneizadas fue analizada por duplicado. El equipo de HPLC comprende un cromatógrafo equipado con una bomba ternaria SP8800, bloque de inyección Reodyne de 20 µL, un detector UV-VIS de barrido y “software” Spectra Focus conectado de modo que no fue necesario el uso de un integrador, la señal del detector se recibe directamente por la puerta en serie de un PC Pentium (cromatógrafo, bomba y detector de Spectra Physics, Madrid, España). La columna, una C18 Spherisorb ODS2 (tamaño de partícula de 5 µm; diámetro interno 4.6 x 250 mm; de Sugelabor, Madrid, España). El proceso comienza en elución isocrática durante 9 minutos con una mezcla de metanol (15%), acetonitrilo (75%), y 1:1 hexano:diclorometano (10%); sigue en gradiente hasta los 16 minutos tras la inyección para alcanzar la composición final de 15% metanol, 40% acetonitrilo y 45% de l:1 hexano:diclorometano, manteniéndose esta mezcla de forma isocrática hasta los 24 minutos. El flujo se mantiene constante a 0.8 mL/min. Tras cada inyección la columna es reequilibrada pasándole la mezcla inicial a 2 mL/min. Para chequear la eficacia de la columna se utilizó la página de cálculo del “software” PC-1000, que incluye con la integración el SST (“System Suitability Test”). La identificación de los pigmentos se basa en la comparación de sus tiempos de retención y sus espectros visibles de absorción con sus respectivos patrones. Las longitudes de onda seleccionadas para la detección de los pigmentos fueron 410 nm 42 para la feofitina a, 430 nm para la feofitina b y clorofila a, 450 nm para all-trans-luteína y β-Caroteno, y 460 nm para la clorofila b. Para la identificación por comparación de espectros de absorción se utilizó el “software” PC 1000 versión 3.0 (Thermo Separation Products, Fremont-California, EEUU) que trabaja sobre el sistema operativo OS/2 Warp versión 3.0 de IBM. Este “software” permite crear una bilbioteca de espectros para su posterior comparación con espectros seleccionados de otras muestras. Para crear esta pequeña biblioteca de espectros se usaron los patrones de Sigma-Aldrich, así como los obtenidos en el laboratorio para las feofitinas. Por otra parte, este “software” permite una presentación en 3D de los cromatogramas (Figura III.4). III.3.4.- Comparación del contenido en pigmentos La comparación entre el contenido en pigmentos de la judía fresca y las cocinadas se llevó a cabo mediante una exploración comparativa de los resultados (“Box and Wisker Plot”) usando los programas informáticos Statistica para Windows, Realase 4.5, Statsoft, Inc. 1993 y Standford Graphics para Windows, versión 2.1c. El sistema de “box and wisker plot” resume la distribución de la variable categorizada por otros grupos o variables independientes mediante tres componentes: 1. Una línea central que indica la tendencia central. 2. Una caja que indica la variabilidad entorno a esta tendencia central. 3. Márgenes o bigotes (“wiskers”) entorno a la caja que indican el rango de variación. En la Figura III.2 se presenta este tipo de análisis para los pigmentos. La caja muestra el cuartil inferior, la mediana (línea central) y el cuartil superior, mientras los bigotes indican el rango donde los valores son aceptables. Los valores fuera de este rango, que equivale a 1.5 veces cada uno de los cuartiles, son considerados “outliers” (fuera de los límites) y si la distancia es mayor de 3 veces el rango intercuartílico entonces son considerados valores extremos o aberrantes (“extreme values”). Tras esto, y para reducir el número de datos comparados, los valores de las medianas de cada uno de los ocho lotes analizados, sometidos a cada uno de los distintos tratamientos, se representaron en una figura comparando el efecto de los distintos tratamientos culinarios en el contenido total de pigmentos (eje de ordenadas), contenido individual de pigmentos (área de los sectores) y contenido total de las judías (áreas de los círculos). 43 III.4.- Resultados y Discusión El contenido en pigmentos de las judías crudas y cocinadas aparece reflejado en la Tabla III.1. El contenido en pigmentos de las judías objeto de estudio está expresado como mg de pigmento por 100 g de muestra fresca. La precisión del método para la medida de los diferentes pigmentos en la judía fresca y tratada por distintos procedimientos se estimó como %RSD de una serie de 10 alícuotas de una sola muestra. Cada una se sometió al proceso completo, obteniendo valores desde 2.32 hasta 3.3 %. Para los diferentes pigmentos de la judía se detectaron valores fuera de rango y valores extremos en los datos usados (mg de pigmentos en 100 g de muestra fresca) al usar el “box-and-whisker-plot” (Figura III.2). Los datos de las medianas se usaron para preparar la Figura III.3. La mediana no se ve seriamente afectada por las variaciones entre las muestras de judías; las grandes variaciones son identificadas como valores extremos. Esta figura muestra que todos los tratamientos térmicos, especialmente con el cocinado a vapor, reducen el total de pigmentos extraídos, a excepción del cocinado con microondas. Las grandes pérdidas de pigmentos son atribuibles a la degradación térmica de las clorofilas en feofitinas, y este efecto es mayor en las cocidas a vapor por su también mayor tiempo de cocinado (40 min). En al figura III.5 se muestra el espectro de la clorofila a. Es conocido que la degradación de clorofilas en feofitinas se ve favorecida por unas condiciones ácidas, las cuales son comunes en los tejidos vegetales (Belitz and Grosch, 1988). Las clorofilas estuvieron mejor protegidas en el hervido en olla, a presión y con microondas. Esto puede explicarse por los relativos bajos niveles de ácidos orgánicos que poseen las judías así tratadas, respecto a las cocidas a vapor (Cruz-García y col., 1999). En contraste con el contenido en clorofilas, el contenido en carotenoides (β-caroteno y luteína) se incrementó por todos los tratamientos culinarios. En al Figura III.6 se muestra el espectro del β-caroteno y su comparación con el producido por un patrón. Este incremento inducido por el calor ya ha sido observado previamente (Granado y col., 1992), y ha sido atribuido a que el calor aumenta la extractibilidad química de los carotenoides (Khachik and Beecher, 1987). El incremento para la luteína es similar en todos los tratamientos térmicos, mientras que en caso del β-caroteno, este incremento es 44 mayor en la olla tapada y en la cocción a vapor que en los otros tratamientos que usan tiempos más cortos. 45 III.5.- Tablas y Figuras Tabla III.1.- Contenido en pigmentos (mg/100 g mf) de judías frescas y cocinadas; rango cuartílico de ocho muestras. Figura III.1.- Cromatogramas de pigmentos de judías cocidas en olla tapada a λ=410 y 430 nm a λ=450 y 460 nm. Figura III.2.- “Box and Whisker plot” de (a) clorofila a, (b) luteína, (c) clorofila b, (d) feofitina b, (e) feofitina a y (f) β-caroteno. Figura III.3.- Representación de los efectos de varios tratamientos culinarios (eje x) en el contenido total de pigmentos en judías verdes (área de los círculos y eje y) y el contenido individual de pigmentos (área de los sectores). Figura III.4.- Cromatograma 3D de pigmentos de judías crudas. Figura III.5.- Espectro de la clorofila a en una muestra de judías cocidas en olla. Figura III.6.- Comparación de espectros de β-caroteno de una muestra de judías (A) y un patrón (B). 46 Pigmento Fresco Olla tapada Vapor Presión Microondas Clorofila a3,66-10,50 2,13-3,55 0,34-6,74 3,33-6,65 3,94-7,85 Luteína 0,47-0,99 1,61-2,50 1,39-2,03 1,12-2,12 1,00-1,54 Clorofila b0,22-0,46 0,13-0,20 0,06-0,09 0,22-0,30 0,17-0,30 Feofitina b0,00-0,03 0,06-0,11 0,07-0,20 0,01-0,03 0,00-0,03 Feofitina a0,08-0,23 0,34-0,52 0,35-0,49 0,19-0,38 0,04-0,25 β-caroteno 1,32-2,32 4,81-6,59 4,56-7,17 3,85-5,79 2,86-4,70 Tabla III.1.- Contenido en pigmentos (mg/100 g mf) de judías crudas y cocinadas; rango cuartílico de ocho muestras. 53 III.6.- Referencias bibliográficas 1. Belitz, H. D. and Grosch, W. (1988) Química de los Alimentos, Capítulo 17. Acribia, Zaragoza, España. 2. Buss, D., Tyler, H., Barber S. and Crawley, H. (1987) Manual of Nutrition, p. 46. Acribia, Zaragoza, España. 3. Chen, B. H., Pene, H. Y. And Chen, H. E. (1995) Changes of carotenoids, color and vitamin A contents during processing of carrot juice. J. Agric. Food Chem. 43, 1912-1918. 4. Daood, H. G., Czincotal, B., Hoschke, A. and Biacs, P. (1989) High performance liquid chromatography of chlorophylls and carotenoids from vegetables. J. Chromatogr. 472, 296-302. 5. De la Cruz-García, C., González-Castro, M. J., Oruña-Concha, M. J., LópezHernández, J., Simal-Lozano, J. and Simal-Gándara, J. (1999) The effects of various culinary treatments on the organic acid content of green beans (Phasolus vulgaris, L.) Deut. Lebensm. Rundsch. 95, 323-326. 6. Granado, F., Olmedilla, B., Blanco, I. and Rojas Hidalgo, E. (1992) Carotenid composition in raw and cooked Spanish vegetables. J. Agric. Food Chem. 40, 21352140. 7. Harris, R. W. C., Key, T. J. A., Silocks, D. B. And Wald, N. J. (1991) A casecontrolstudy of dietary carotene in men with lung cancer and in men with other epithelial cancers. Nutr. Cancer 15, 63-68. 8. Heinonen, M. I., Ollilainen, V., Linkola, E. K., Varo, P. T. and Koivistoinen, P. E. (1989) Carotenoids in Finnish foods: vegetables, fruits and berries. J. Agric. Food Chem. 37, 655-659. 9. Khachik, F. and Beecher, G. R. (1987) Application of a C-45-β-carotene as an internal standard for the quantification of carotenoids in yellow/orange vegetables by liquid chromatography. J. Agric. Food Chem. 35, 732-738. 10. López-Hernández, J., Vázquez-Odériz, M. L., Romero-Rodríguez, A. and SimalLozano, J. (1993) HPLC determination fo major pigments in the bean Phaseolus vulgaris. J. Agric. Food Chem. 41, 1613-1615. 54 11. Moreiras, O., Carbajal, A. and Perea del Pino, I. M. (1988) Evolución de los hábitos alimentarios en España. (1987) Capítulo 3. Secretaría General Técnica, Madrid, España. 12. Mozsic, G., Javor, T., Toth, G., Zsoldos, T. and Tigyy, A. (1984) Interrelationships between the gastric citoproctective effects of vitamin A and β-carotene and the gastric mucosal superoxide IV EFECTOS DE VARIOS TRATAMIENTOS CULINARIOS EN EL CONTENIDO DE ACIDOS ORGANICOS DE LA JUDIA VERDE (Phaseolus vulgaris, L.) “Effects of various culinary treatments on the organic acid content of green beans (Phaseolus vulgaris, L.)”, Deustche Lebensmittel Rundschau, 1999, 95 (8):323-326 56 IV.1.- Resumen Se evaluaron los efectos que el escaldado y cuatro tratamiento culinarios (hervido a vapor, en olla tapada, a presión y con microondas) tienen sobre el contenido en vitamina C y sobre los ácidos oxálico, málico y fumárico. La determinación de los ácidos orgánicos en judías frescas y tratadas se realiza mediante cromatografía líquida de alta resolución en fase reversa (columna ODS2) con detector UV, y una solución de ácido metafosfórico (pH 2.2) como eluyente. El cocinado a vapor y a presión de las judías verdes causan pérdidas de ácidos orgánicos significativamente menores que cociéndolas en olla tapada, y en general también menores que con el cocinado con microondas. Por esto se recomienda el cocinado a vapor o a presión frente al método tradicional de cocerlas en olla tapada. IV.2.- Introducción La elaboración y cocinado de alimentos altera inevitablemente su composición pudiendo también alterar sus propiedades organolépticas y nutritivas. De entre todos los componentes más sensibles a estos efectos están los ácidos orgánicos, en especial el ácido ascórbico (Vit. C), cuyo déficit puede tener consecuencias serias en el hombre al no poder biosintetizarla por lo que debe de incluirla en su dieta. La vitamina C está casi exclusivamente en las frutas y vegetales, variando la cantidad presente según la especie y la variedad (Morrison, M.H. 1975), según factores como el estado de desarrollo (Primo Yúfera, E. 1979), tamaño (Selman, J.D. and Rolfe, E.J 1982), tiempo transcurrido desde la recolección hasta el procesado (Kozar, S., y col., 1988), y de factores locales como el clima (Saccani, G., y col., 1995). La figura IV.6 muestra el espectro ultravioleta de la vitamina C. De los otros ácidos orgánicos encontrados en las frutas y vegetales los más abundantes son, cítrico, málico y quínico. Los vegetales verdes tienen en general un bajo contenido en ácidos orgánicos, de cualquier modo estos componentes merecen su estudio por su importancia como agentes antimicrobianos y aromáticos (Picha, D. H. 1985). 57 Mientras numerosos estudios se han realizado midiendo el contenido en Vit. C en alimentos vegetales (Mueller, H.R. 1990), muy pocos han estudiado al resto de los ácidos orgánicos. En este trabajo se examinan los efectos de cuatro tratamientos culinarios (hervido a vapor, en olla tapada, a presión y con microondas) en el contenido de ácido ascórbico, málico, oxálico y fumárico de judías verdes frescas. Los efectos del escaldado fueron también estudiados pero dado que no es un tratamiento culinario estrictamente hablando si no más bien un tratamiento usado antes de la conservación (Belitz, H.D. and Grosch, W., 1988) se optó por no incluirlo. Los ácidos orgánicos fueron determinados simultáneamente por HPLC con detector de barrido UV (VázquezOdériz, M. L., y col., 1994). El ácido cítrico no pudo determinarse debido al solapamiento de este pico con uno de los productos formados durante el cocinado. IV.3.- Material y Métodos. IV.3.1.- Muestras de Judías. Las judías verdes frescas (Phaseolus vulgaris, L.) se adquirieron en un único establecimiento a primera hora de la mañana de cada día de análisis, y pueden ser consideradas de poseer similares características de frescura a cualquier otra disponible al consumidor. Se analizaron un total de nueve lotes. IV.3.2.- Procesado En cada día de compra se obtuvieron 6 lotes representativos de judías troceadas de 20 g. Se trocearon manualmente para así evitar la posible oxidación de la Vit. C al contacto con el metal de un cuchillo, dado que cataliza la oxidación de la Vit. C. Un lote se apartó para el análisis en crudo y los restantes fueron sometidos a los siguientes tratamientos: 1) escaldado en 250 mL de agua durante 4 min. 2) hervido con tapa en 250 mL de agua durante 30 min. 3) cocido al vapor durante 40 min. 4) cocido a presión en 150 mL de agua durante 5 min. 5) cocido a horno de microondas en 100 mL de agua durante 5 min. 58 Todos los tratamientos usaron agua corriente de la traída. IV.3.3.- Análisis por HPLC Los ácidos L-ascórbico, L-málico y metafosfórico se obtuvieron de Merck (La Coruña, España), y el fumárico y quínico de Sigma (Madrid, España). El ácido oxálico se obtuvo de Panreac (Barcelona, España). Todos los análisis se llevaron a cabo por duplicado en tejido vegetal homogeneizado usando mortero. Los ácidos orgánicos fueron extraídos por el método sugerido por Vázquez-Odériz y col. (1994). Resumiendo, 20g de homogeneizado fueron agitados mecánicamente en 60 mL de una solución al 4,5% (p/v) de ácido metafosfórico durante 15 min., la mezcla fue filtrada (Whatman Nº 541), y el filtrado diluido hasta completar un volumen de 100 mL con agua de grado HPLC. Se tomó una alícuota y, previa a su inyección en la columna, se filtró a través de un filtro Millipore de 0.45 µm. El equipo de HPLC consiste en un cromatógrafo Spectra-Phisics equipado con una bomba ternaria SP8800, bloque de inyección Rheodyne con un bucle de 20 µL y detector de barrido UV-VIS controlado por un “software” Spectra Focus (Spectra Physics, Madrid, España) instalado en un PC Pentium. La columna usada fue una Tracer ODS2 (4.6 mm i.d. X 25 cm) con tamaño de partícula de 5 µm (Theknochroma, Vigo, España) y con una precolumna (Theknochroma TR-015326) empacada con el mismo relleno. Como fase móvil se usó agua de grado HPLC llevada a pH 2.2 con ácido metafosfórico siendo el flujo de 0.5 mL/min. Las longitudes de onda escogidas para el análisis fueron 215 nm para málico y fumárico y 245 nm para el oxálico y la Vit. C. En la Figura IV.1 se muestra un cromatograma típico del perfil de ácidos orgánicos en la judía verde. Para la identificación se usó, al igual que con los pigmentos, un “software” más avanzado (PC 1000) de Thermo Separation Products (California, EEUU), que permite crear una biblioteca de espectros. La figura IV.7 muestra la identificación de la vitamina C por comparación de espectros con los recogidos para la biblioteca de sus respectivos patrones. Este “software” permite también realizar de forma inmediata el SST, chequeando continuamente la eficacia de la columna. Además permite la representación en 3D de los cromatogramas (Figura IV.5). También se usaron los tiempos de retención de los patrones elaborados cada día de muestreo. Para la cuantificación se utilizó el método de patrón externo. La curva de calibración se elaboró cubriendo el rango de 59 concentración de los ácidos orgánicos en las muestras. Estos patrones se prepararon disolviendo convenientemente una solución madre de los ácidos orgánicos en ácido metafosfórico al 4.5% (p/v) con este mismo solvente. IV.4.- Resultados y discusión. Los resultados de los análisis están recogidos en las tablas 1 y 2. La precisión del método (RSD %) para la determinación de los ácidos orgánicos se encuentra en un rango comprendido entre 0.8-1.7 %. Los datos para las judías cocinadas (Tabla IV.2) se presentan como porcentajes (%) tomando como referencia 100% el valor contenido en las judías escaldadas dado que crudas se encuentran (sobre todo la Vit. C) expuestos a la transformación de las enzimas. En las judías escaldadas y cocidas estos enzimas se encuentran inactivados por los tratamientos térmicos. Se utilizó un análisis explorativo mediante el test de “box-and-whisker plot” (Fig. IV.2) para detectar valores fuera de los valores medios (“outliers”) y valores extremadamente alejados (“extreme values”), éstos aparecen marcados en cursiva en la Tabla IV.2. Los criterios seguidos en este método de análisis gráfico se ilustran en la Figura IV.3. Los valores de las medianas (menos susceptibles que la media a los valores fuera de márgenes) se representan en la Figura IV.4. Esta figura muestra a) que las mayores pérdidas de ácidos orgánicos corresponden a las judías hervidas en olla y, en menor medida, a las hervidas con horno microondas; b) que la proporción individual de cada ácido orgánico varía poco con independencia del proceso de cocción utilizado; y que la eficacia para conservar la Vit. C sigue el siguiente orden: Vapor>Presión>Microondas>Olla tradicional. Los efectos que varios tratamientos culinarios tienen en el contenido de ácidos orgánicos de las judías se analizó estadísticamente, aplicando el test de Kruscal-Wallis a los valores en porcentaje del contenido en ácidos orgánicos de las judías cocinadas, excluyendo los valores fuera de márgenes (“outliers” y “extreme values”). Los datos aparecen en la Figura IV.2. Esto indica que hay diferencias significativas entre el contenido de varias de las judías cocidas (p ≤ 0.05; 3 grados de libertad; n = 31 para el ácido oxálico, 34 para el málico, 30 para el ascórbico, y 34 para el fumárico). Para 60 establecer dónde recaen estas diferencias, se aplica el test U de Mann-Withney a los datos de la Tabla IV.2. Esto muestra: a) que no existen diferencias significativas (p ≤ 0.05) entre el contenido en ácidos orgánicos de judías cocidas a vapor y en olla a presión. b) que esos dos últimos métodos citados poseen significativamente mayores contenidos en todos los ácidos orgánicos que las judías cocidas en olla cubierta (p ≤ 0.05). c) que las judías cocidas a vapor contienen valores más altos de málico, ascórbico y fumárico que las cocidas con microondas (p ≤ 0.05). d) que las judías cocidas a presión presentan contenidos en málico y fumárico mayores que los de las cocidas con microondas (p ≤ 0.05). e) que las judías cocidas con microondas contienen valores mayores de ácido ascórbico que las cocinadas en olla cubierta (p ≤ 0.05). El hecho de que las judías cocinadas en olla tapada posean en general los contenidos más bajos de ácidos orgánicos es atribuible al mayor volumen de agua requerida para su cocción (500 mL) y al mayor tiempo empleado (30 min.), lo que incrementa las pérdidas de ácidos orgánicos desde las judías por difusión y degradación térmica respectivamente. Las altas pérdidas de ácidos orgánicos en las judías cocidas con microondas probablemente no se pueden atribuir a estos efectos, dado que el volumen de agua es mucho menor (100 mL) y el tiempo de cocinado fue sólo de 5 min. Más bien estos cambios son atribuibles a la alta temperatura inducida a las judías por este tratamiento, lo que puede incrementar la degradación térmica. El cocinado al vapor se muestra como el más efectivo en la conservación de los ácidos orgánicos de las judías, lo que es debido a la ausencia de contacto directo entre las judías y el agua de cocción, lo que reduce de forma efectiva las pérdidas por difusión. 61 IV.5.- Tablas y Figuras Tabla IV.1.- Contenido en ácidos orgánicos (mg/100 g mf) de judías crudas y cocinadas. Tabla IV.2.- Contenido en ácidos orgánicos de judías verdes cocidas expresado como %, tomando 100% el valor de las judías escaldadas. Figura IV.1.- Cromatograma de judías frescas crudas, mostrando los picos del ácido oxálico (1), ácido málico (2), vitamina C (3) y ácido fumárico (4). Figura IV.2.- “Box and Whisker Plot” de los resultados de la tabla 2. Figura IV.3.- Esquema explicativo del funcionamiento gráfico del test de “Box and Whisker Plot”. Figura IV.4.- Representación que compara los efectos de varios tratamientos culinarios sobre el contenido de vitamina C (eje y) y el valor total e individual del contenido de ácidos orgánicos (áreas de los círculos y los sectores, respectivamente). Figura IV.5.- Representación en 3D de ácidos orgánicos de judías verdes. Figura IV.6.- Espectro ultravioleta de la vitamina C. Figura IV.7.- Comparación de espectros (búsqueda en biblioteca propia). 62 Oxálico Vitamina C Málico Fumárico Total Olla tapada 49.2 3.6 67.2 0.4 120.4 Vapor 65.6 7.4 105.4 0.8 179.3 Presión 75.2 6.0 106.9 0.8 189.0 Microondas 56.1 5.3 84.0 0.5 145.9 Tabla IV.1.- Contenido en ácidos orgánicos (mg/100 g mf) de judías crudas y cocinadas. 69 Figura IV.6.- Espectro ultravioleta de la vitamina C. 70 Figura IV.7.- Comparación de espectros (búsqueda en biblioteca propia). 71 IV.6.- Referencias bibliográficas 1. Belitz, H.D. and Grosch, W. Química de los alimentos. 2nd edn. Acribia, Zaragoza, 1988, pp. 363-365, 612. 2. Kozar, S.; Bujak, A.; Eder-Trifunovic, J. and Knievald, G. Determination of Lascorbic acid in fresh and processed fruit and vegetables by differential pulse polarography. Fresenius Z Anal. Chem. 1988, 329:760-763. 3. Morrison, M.H. The vitamin C content of quick frozen green beans. J. Fd. Technol. 1975, 10: 19-28. 4. Mueller, H.R. The effects of industrial handling on micronutrients. J. Nutr. Sci. Vitaminol. 1990, 36: S47-S55. 5. Picha, D. H. Organic acid determination in sweet potatoes by HPLC. J. Agric. Food Chem. 1985, 33, 743-745. 6. Primo Yúfera, E. Química Agrícola III: Alimentos. Vol. III. 1st edn. Alhambra, S.A., Madrid, 1979. 7. Saccani, G.; Gherardi, S; Trifirò, A.; Soresi Bordini, C.; Calza, M. and Freddi, C. Use of ion chromatography for the measurement of organic acids in fruit juices. J. Chromatography A 1995, 706:395-4033. 8. Selman, J.D. and Rolfe, E.J. Effects of water blanching on pea seeds. II. Changes in vitamin C content. J. Food Technol. 1982, 14:301-313. 9. Vázquez-Odériz, M. L.; Vázquez-Blanco, M. E.; López-Hernández, J.; SimalLozano, J. and Romero-Rodríguez, M. A. Determination of organic acids and vitamin C in green beans by HPLC with simultaneous detection at two UV wavelengths. J AOAC Int. 1994, 77(4):1056-1059. V EFECTOS DE DISTINTOS TRATAMIENTOS CULINARIOS EN EL CONTENIDO DE AMINOACIDOS DE JUDIAS VERDES “Effects of various culinary treatments on the amino acid content of green beans”, Deustche Lebensmittel Rundschau, 1999, 95 (12):507-510 73 V.1.- Resumen Se ha estudiado el efecto de cuatro tratamientos culinarios diferentes (hervido a vapor, en olla tapada, a presión y con microondas) en el contenido de aminoácidos de las judías verdes (Phaseolus vulgaris, L.). Las proteínas se hidrolizaron con ácido clorhídrico y los aminoácidos fueron derivatizados con fenil-isotiocianato, separados en una columna C18 mediante HPLC y determinados con un detector Ultravioleta. Las judías cocidas a vapor y con microondas no mostraron cambios en el contenido de aminoácidos, mientras el hervido de judías en olla tapada y a presión causa importantes pérdidas de aminoácidos respecto a la muestra cruda. V.2.- Introducción El valor nutritivo de las proteínas depende principalmente de su composición en aminoácidos, especialmente de su contenido en los ocho aminoácidos esenciales. Además de su importancia en la dieta, las proteínas también influyen en las propiedades organolépticas de los alimentos: las proteínas afectan a la textura del alimento, y los péptidos pequeños y aminoácidos contribuyen al sabor y aroma, y a los tres les afectan reacciones térmicas y/o enzimáticas que durante la preparación de los alimentos y su almacenamiento generan compuestos aromáticos y coloreados (Belitz and Grosch, 1988). Durante la preparación y almacenamiento de los alimentos las uniones de los aminoácidos en las proteínas pueden reaccionar químicamente entre ellos o con otras moléculas presentes en el alimento (Baudi Dergal, 1981). Las reacciones que rodean a los aminoácidos durante el cocinado y el procesado de los alimentos son de gran importancia en la producción del aroma (Coleman, W. M., y col., 1994), sabor (Yang, S. y col., 1984), y color (Kawashima, K. y col., 1996), aún cuando estas reacciones pueden ir acompañadas de una reducción de su valor nutritivo (Sher, B. y col., 1989). En este trabajo examinamos los efectos de cuatro tratamientos culinarios (hervido a vapor, en olla tapada, a presión y con microondas) en el contenido de aminoácidos de judías verdes. Las vainas enteras de las judías verdes (Phaseolus vulgaris, L.) son frutos 74 usados comúnmente como alimento que suelen comerse cocinados, bien calientes como plato principal bien fríos en ensalada. Los aminoácidos se determinaron mediante un método de cromatografía líquida ultravioleta de alta resolución desarrollado en nuestro laboratorio (González Castro, M. J. y col., 1997). V.3.- Material y Métodos V.3.1.- Muestras Se adquirieron judías verdes frescas (Phaseolus vulgaris, L.) (500 g) en un local de Santiago de Compostela, y se pueden considerar con igual frescura y calidad a cualquier otra disponible al consumidor. V.3.2.- Procesado Se eliminaron los tallos de las judías y éstas fueron troceadas uniformemente. Las judías ya troceadas fueron divididas en 5 lotes de 100 g. Uno de los lotes fue triturado y analizado, cada uno de los cuatro restantes fue inmediatamente sometido a uno de los siguientes tratamientos culinarios: 1.- hervido en una olla cubierta con 250 mL de agua durante 30 minutos. 2.- hervido a vapor en una olla cubierta durante 40 minutos. 3.- hervido a presión con 200 mL de agua durante 5 minutos tras la primera salida de vapor. 4.- hervido en horno a microondas con 100 mL de agua durante 5 minutos. Todos los tratamientos usaron el menor volumen de agua y el menor tiempo posible de cocción para alcanzar un grado similar de ternura con una palatabilidad adecuada, siendo el obtenido con microondas el producto menos tierno dadas las características térmicas de las microondas. Todos los análisis se realizaron por duplicado. 75 V.3.3.- Reactivos. Estándares de aminoácidos: L-alanina (Ala), L-arginina (Arg), L-ácido aspártico (Asp), L-ácido glutámico (Glu), L-glicina (Gly), L-histidina (His), L-isoleucina (Ile), L-leucina (Leu), L-lisina (Lys), L-metionina (Met), L-fenilalanina (Phe), L-hidroxiprolina (HPro), L-prolina (Pro), L-serina (Ser), L-treonina (Thr), L-tirosina (Tyr), L-valina (Val) y el reactivo de derivatización, fenil isotiocianato (PITC) y la trietilamina se obtuvieron de Sigma Chemical (Madrid, España). El acetonitrilo y metanol de grado HPLC se obtuvieron de Scharlau (Barcelona, España). El acetato de sodio trihidratado y el fosfato de sodio fueron reactivos de grado de Merck (La Coruña, España) y el ácido clorhídrico de Normasolv (Barcelona, España). V.3.4.- Equipo de Cromatografía: El equipo de cromatografía usado fue un HPLC compuesto por una bomba ternaria SP 8800, bloque de inyección Rheodyne (Cotati, CA) con bucle de 20 µL, un termostatizador de columnas SP 8792, un detector de barrido UV/VIS unido a un ordenador Pentium con “software” PC-1000 versión 3.0 (bomba, termostatizador y detector de Thermo Separating Products, Fermont, California) sobre un sistema operativo IBM OS/2 Warp, versión 3.0. Para la separación se usó una columna Spheridorb C-18 de 250x4.6 mm con relleno de 5 µm, de Sugelabor (Madrid, España). V.3.5.- Preparación de muestras y patrones: Antes de derivatizar, se hidrolizaron las proteínas de las judías del siguiente modo: se pesó 1 g de la muestra homogeneizada en un tubo Pyrex con tapa de rosca de 16x125 mm, se añadieron 15 mL de HCl 6 N, se pasó corriente de nitrógeno y cerró inmediatamente, y se colocó en un horno a 110ºC durante 24 horas. Tras la hidrólisis se filtró a vacío (Whatman nº 541, Maidstone, Inglaterra) el contenido del tubo para separar los sólidos. El filtrado se enrasó a 25 mL con agua, y una alícuota de esta solución se filtró a través de una membrana de 0.50 µm de tamaño de poro (millipore, Madrid, España). Se preparó una solución estándar conteniendo 1.25 µmol/mL de cada uno de los aminoácidos en HCl 0.1 M. 76 V.3.6.- Procedimiento de derivatización Se pipetearon de la solución patrón (5, 10, 15, 20 µL), o 50 µL si es la solución muestra, a un tubo de 10 x 5 mm y se secaron a vacío a 65ºC. Al residuo se le añadieron 30 µL del reactivo de derivatización 7:1:1:1 (v/v) metanol/agua/TEA/PITC y tras agitar se dejaron durante 20 min. a temperatura ambiente. Finalmente se eliminaron los solventes con corriente de nitrógeno, y el tubo se cerró y almacenó a 4ºC hasta su análisis. Antes de su inyección se añadieron a cada tubo 150 µL de diluyente constituido por una solución 5 mM de fosfato sódico con un 5% de acetonitrilo. V.3.7.- Procedimiento cromatográfico La cromatografía se llevó a cabo a una temperatura constante de 30ºC usando el siguiente gradiente: Fase A, un tampón acuoso preparado añadiendo 0.5 mL/L de TEA a una solución 0.14 M de acetato de sodio, y ajustándola a pH 6.0 con ácido acético glacial; y fase B, acetonitrilo/agua (60:40) (v/v). El programa del gradiente usado se muestra en la Tabla V.1. V.4.- Resultados y Discusión La Figura V.1 muestra un cromatograma típico de los PTC-aminoácidos de una muestra de judía verde y la V.2 una representación tridimensional. Los aminoácidos mayoritarios en judía verde fueron el ácido aspártico (25 %) y el ácido glutámico (14 %). La figura V.3 muestra el espectro ultravioleta del ácido aspártico de una muestra de judías crudas. El contenido en aminoácidos (mg/100 g mf) de judías verdes frescas y cocinadas aparece reflejado en la Tabla V.2. Respecto a los cambios que afectan a los aminoácidos durante el procesado térmico, debe de decirse que las variaciones entre el cocinado a vapor y con microondas no son importantes (la precisión del método para los aminoácidos, % RSD, oscila entre un 1.26 hasta un 3.98 %) (González-Castro y col., 1989), mientras el hervido en olla y a presión causa las mayores pérdidas de aminoácidos (una disminución del 17 % del contenido total de aminoácidos respecto a la muestra fresca). 77 El hecho de que las judías hervidas en olla tapada muestren esta disminución en el contenido total de aminoácidos puede explicarse por el gran volumen de agua (250 mL) y el tiempo de cocinado empleado (30 min.) necesario para este tipo de tratamiento culinario, que incrementa las pérdidas de aminoácidos por difusión y por la degradación térmica. Las pérdidas de aminoácidos en el cocinado a presión pueden ser atribuidas al volumen de agua empleada (200 mL) y a la alta temperatura aplicada a las judías con este tratamiento (112º-120ºC). La metionina fue el aminoácido que mostró una mayor disminución, especialmente en olla tapada. Esto puede explicarse por la reactividad del grupo tioéter de la metionina, que se encuentra relacionada con reacciones de óxido-reducción (Badui Dergal, 1981). La metionina puede también sufrir roturas térmicas produciendo compuestos sulfurados (Belitz y Grosch, 1988). Las pérdidas en ácido aspártico y glutámico pueden ser atribuidas a la alta reactividad de los grupos amino de la asparagina y la glutamina (asparagina y glutamina son convertidas por hidrólisis ácida en ácido aspártico y glutámico respectivamente) (Lehninger, 1981). La disminución de lisina se debe a su grupo ε-amino. Los grupos amino de la asparagina, glutamina y lisina reaccionan muy fácilmente con azúcares reductores (química de Maillard); esta reacción es responsable de muchos de los aromas y colores de alimentos cocinados (Baltes, W., 1986). 78 V.5.- Tablas y Figuras Tabla V.1.- Programa del gradiente empleado en la separación de los PTCaminoácidos. Tabla V.2.- Cambios en el contenido de aminoácidos (mg/100g muestra fresca) de las judías verdes durante diferentes tratamientos térmicos. Figura V.1.- Típico cromatograma mostrando los PTC-aminoácidos de judías verdes. Figura V.2.- Representación en 3D de un cromatograma de judías verdes. Figura V.3.- Espectro ultravioleta del PTC-derivado del ácido aspártico, correspondiente a una muestra de judías crudas. VI EFECTOS DE VARIOS TRATAMIENTOS CULINARIOS EN EL CONTENIDO DE CARBOHIDRATOS EN JUDIAS VERDES (Phaseolus vulgaris, L.) “Effects of various culinary treatments on the carbohydrates content of green beans (Phaseolus vulgaris, L.)”, en prensa 86 VI.1.- Resumen Se determinaron los azúcares solubles, almidón, pectinas (SDF) y la fibra neutro detergente (NDF), en judías verdes (Phaseolus vulgaris, L.) antes y después de su cocinado a vapor, hervido, cocinado a presión, o en horno a microondas. Los azúcares solubles , almidón, y pectinas se determinaron por HPLC con detector de índice de refracción. NDF se determinó por gravimetría. Las concentraciones de cada componente se expresaron como porcentajes de muestra fresca. Todos los tratamientos culinarios usados causaron reducciones en la concentración de azúcares solubles, almidón, y pectinas, y un incremento en la concentración de NDF. El perfil de los carbohidratos del producto final está marcadamente afectado por el método de cocinado usado. La reducción en el contenido de carbohidratos solubles y el incremento del contenido de NDF fue menos marcada en el cocinado a vapor. VI.2.- Introducción El consumo de judías suele ir precedido de algún tratamiento térmico. Procesos tan simples como ponerlas a remojo o el escaldado tienden a modificar tanto la composición como la disponibilidad de los nutrientes (Vidal-Valverde y col., 1992). Por lo tanto es de considerar que procesos más profundos como el cocinado a microondas o a presión altere en mayor medida estas características. Son numerosas las referencias de cómo distintos procesos comerciales como enlatado (Penner y col., 1991), pelado (Camire y col., 1997), esterilizado (Chang y col., 1990; López y col., 1997), por microondas (Chang y col., 1990; Svanberg y col., 1997), calor seco (Tovar y col., 1996) entre otros, modifican de alguna manera el contenido en carbohidratos. Las referencias sobre el cocinado a nivel del consumidor son más escasas, y en general se reducen a uno o dos tratamientos. En este trabajo se investigan los efectos de cuatro procesos de cocinado domésticos en los contenidos de azúcares, almidón, pectinas (fibra soluble), y fibra neutro detergente (NDF, fibra insoluble) de las judías verdes. Los cuatro componentes son de importancia nutricional y se presentan a niveles relativamente altos en judías verdes. Los azúcares solubles, almidón, y pectina se determinaron por HPLC con detector de índice de 87 refracción. La fibra insoluble se determinó mediante un método gravimétrico (OruñaConcha y col., 1996). VI.3.- Materiales y Métodos VI.3.1.- Muestras Las judías verdes frescas (Phaseolus vulgaris, L.) se adquirieron en un único establecimiento a primera hora de la mañana de cada día de análisis, y pueden ser consideradas de poseer similares características de frescura a cualquier otra disponible al consumidor. VI.3.2.- Procesado En cada día de compra se obtuvieron 15 lotes representativos de judías troceadas de 30 g. Cada uno de los lotes fue sujeto entonces a uno de los siguientes tratamientos (3 lotes por tratamiento): 1) hervido con tapa con 350 mL de agua durante 30 min. 2) cocido al vapor durante 40 min. 3) cocido a presión en 200 mL de agua durante 5 min. 4) cocido en horno de microondas en 150 mL de agua durante 5 min. 5) Sin tratamiento. Todos los tratamientos usaron agua corriente de la traída, de mineralización débil, y en todos los casos el volumen de agua usada fue el mínimo necesario. Los tiempos de cocción se seleccionaron para obtener un grado de ternura y cocinado similar, con palatabilidad y gusto aceptables para los consumidores de nuestra región. Estos lotes se analizaron para obtener el contenido en azúcares solubles, almidón y pectinas. Para investigar los efectos del proceso de cocinado en el contenido de NDF, otros 15 lotes adicionales de judías troceadas de 10 g se trataron de igual modo que las anteriores (3 lotes por tratamiento), siendo liofilizadas previo análisis, dado que el agua es causa de interferencia en la determinación de la NDF. 88 VI.3.3.- Reactivos Los patrones de fructosa, glucosa, sacarosa y almidón usados se obtuvieron de Merck (La Coruña, España) y el ácido galacturónico de Sigma (Madrid, España). El ácido cítrico, fosfato disódico, y el acetato de sodio de grado analítico obtenidos también de Merck, el etanol y ácido acético de grado analítico se obtuvieron de Scharlau (Barcelona, España), e hidróxido sódico de grado analítico de Panreac (Barcelona, España). El acetonitrilo, solvente de grado para HPLC se obtuvo de Scharlau. La pectinasa (EC 3.2.1.15, de Aspergilus niger) y celulasa (EC 3.2.1.4, de Penicillium funicolosum) se obtuvieron de Sigma, y la amiloglucosidasa (EC 3.2.1.3, de Aspergilus niger) se obtuvo de Boehringer-Mannheim (Barcelona, España). La solución neutro detergente para la determinación de la NDF se hizo con 1 litro de agua destilada conteniendo 18.61 g de EDTA (Scharlau), 10 mL de 2-etoxietanol (Scharlau) 30 g de lauril sulfato sódico (Merck), 4.56 g de fosfato disódico (Merck), y 6.81 g de borato sódico (Sigma). VI.3.4.- Procedimiento Para el análisis de azúcares, almidón y pectinas, 30 g de muestra se extraen durante 45 min. con 160 mL de etanol al 80 %. El extracto se filtra a vacío (Whatman nº 541). El residuo (sólidos insolubles en alcohol, MIA) se seca a 37ºC durante 24 h y se reserva para la determinación de almidón y pectina. El filtrado se enrasa entonces a 200 mL con etanol. Para la determinación de azúcares solubles, se pasa a través de una columna Waters Sep-Pak C18, 5 mL de alícuota de la solución anterior, se filtra (membrana de 0.45 µm de poro), y se inyecta en el cromatógrafo. Para la determinación de almidón, se mantienen a reflujo durante 2 horas 700 mg de MIA y 40 mL de agua para la gelatinización del almidón. La mezcla se enfría a 40ºC para entonces añadirle 50 mL de tampón citrato/fosfato (pH 4.6) y 20 mg (120 unidades) de amiloglucosidasa, se mezcla y se incuba toda la noche a 55-58ºC para hidrolizar el almidón a glucosa. Para la determinación de la pectina, se llevan a pH 9.5 con hidróxido sódico 0.1 N 30 mL de agua conteniendo 300 mg de MIA. La mezcla se agita, se deja 20 horas a 4ºC, y entonces se lleva a pH 4.5 con ácido acético antes de la adición de celulasa (60 mg, 400 unidades) y pectinasa (0.18 mg, 66 unidades) , y se incuba a 55-58ºC durante 20 horas para hidrolizar la pectina a ácido galacturónico. Estas mezclas se enfrian, se filtran a 89 vacío (Whatman nº 541) y se enrasan a 100 mL con agua. Las soluciones resultantes se filtran de nuevo (0.45 µm de poro) y entonces se inyectan al cromatógrafo. El equipo de HPLC consiste en una bomba Jasco PU-1580 un inyector Rheodyne con bucle de 20µL, un calentador de columnas Spectra Physics 8792, y un integrador SP 4290 unido via Labnet a un ordenador 286 Tandy TL, con “software” SP WINner Work Station Integrator versión 4.00 de Spectra Physics sobre un sistema operativo DoubleDos Top Memory Section MS DOS versión 3.20 (sistema pionero en el trabajo multitárea). Mediante el SST incorporado a este “software” se pudo también chequear la eficacia de la columna. El detector usado, un índice de refracción Shodex RI-71. La columna utilizada Spherisorb-NH2 de 5µm, de dimensiones 250 x 4.6 (i.d.) mm (Sugelabor, Madrid, España). Para los azúcares y el almidón se utiliza una fase móvil de acetonitrilo:agua 80:20 (v/v) a 1.0 mL/min, con al columna termostatizada a 28ºC. Para las pectinas acetato de sodio 0.1 M como fase móvil, que debe filtrarse (0.45 µm de poro) y ajustarse a pH 4.6 con ácido acético a un flujo de 0.8 mL/min. La NDF se determina usando un sistema Fibertec System, Dosi Fiber mediante reflujo de un gramo de muestra seca una hora en la solución neutro detergente, tras lo que se filtra para obtener el residuo sólido. Este residuo se seca a 100ºC durante 8 horas, se pesa (NDF + cenizas insolubles), e incinera para obtener por diferencia con las cenizas el valor de la NDF. VI.4.- Resultados y Discusión Los azúcares solubles encontrados en la judía fueron fructosa (1.26 % p/p de muestra fresca), glucosa (0.58 % p/p de muestra fresca) y sacarosa (0.28 % p/p de muestra fresca). Todos los tratamientos disminuyen los contenidos en estos azúcares siendo la pérdida más notable cuanto mayor era el volumen de agua utilizado. Estos valores aparecen reflejados en la Tabla VI.1. El cocinado a vapor muestra las pérdidas más pequeñas mientras que el hervido en olla (que necesita del mayor volumen de agua) muestra la mayor pérdida. Esta disminución es debida a la disolución de los azúcares en el agua de cocción y ha sido también observada por Oruña-Concha y col. (1996) en el 90 escaldado de judías. La Figura VI.2 muestra un cromatograma típico del contenido de azúcares solubles de una muestra de judía cocida en olla a presión. Al igual que los azúcares solubles, el contenido en almidón de las judías decrece alrededor del 20% con los distintos tratamientos térmicos con excepción del cocinado con microondas, que presenta una disminución entorno al 47%, atribuible a las especiales características de calentamiento (Tabla VI.2). El cocinado produce una gelatinización parcial de las moléculas de almidón, que facilita así su degradación. Esto fue observado por Oruña-Concha y col. (1996) al escaldar judías, y por Camire y col. (1997) en el pelado de la patata. El contenido en pectinas también disminuye en las judías cocidas (Tabla VI.2). Las cocinadas a vapor mostraron una disminución del 19%, microondas y olla sobre un 25%, y presión un 33% respecto al crudo. Disminuciones debidas a la solubilización de la fracción soluble de las pectinas durante el cocinado han sido también observadas por Rojas Hidalgo (1994) en verduras y hortalizas; por Varo y col. (1984) en tomates y por López y col. (1997) en alcachofa. La Figura VI.3 muestra un cromatograma típico del contenido de azúcares solubles de una muestra de judía cocida a vapor. Por lo contrario, el contenido en fibra dietética (NDF) aumenta al someter la judía a los distintos tratamientos térmicos (Tabla VI.2). El cocinado a vapor incrementó la NDF sobre un 10% y el hervido en olla alrededor de un 37%. Este incremento de la NDF con los tratamientos térmicos ha sido observado por numerosos autores y puede ser atribuida: a) a una concentración debida a la anteriormente citada pérdida de componentes solubles durante el cocinado (Penner y col., 1991; Oruña-Concha y col., 1996). b) a que el calentamiento produce reacciones (Maillard) aflorando productos insolubles que son cuantificados como NDF (Chang y col., 1990; Vidal-Valverde y col., 1991; Oruña-Concha y col., 1996). De forma global se aprecia una disminución entorno al 15% en el contenido de carbohidratos en el cocinado con la excepción de la cocción al vapor donde ésta es de algo más de un 6% (Figura VI.1). La progresiva disminución de carbohidratos mostrada en la altura (eje y) parece ir acompañada de un aumento de la NDF en el perfil. Esto confirmaría la idea de una concentración de compuestos insolubles (NDF) por la pérdida de compuestos solubles (azúcares principalmente). 91 VI.5.- Tablas y Figuras Tabla VI.1.- Contenido en azúcares solubles (% mf) en judías verdes crudas y cocinadas. Tabla VI.2.- Contenido en almidón, pectinas y NDF (% mf) de judías verdes crudas y cocinadas. Figura VI.1.- Representación de la modificación en el contenido total de carbohidratos, g/100 g mf (eje y), y en su perfil (área de los respectivos segmentos). Figura VI.2.- Cromatograma que muestra el contenido en azúcares de una muestra de judías cocidas a presión. Figura VI.3.- Cromatograma que muestra el contenido en pectinas (ácido galacturónico) de una muestra de judías cocidas a vapor. 92 Fructosa (%) Glucosa (%) Sacarosa (%) Cruda 1.264 +0.027 0.577 +0.005 0.279 +0.008 Vapor 1.126 +0.042 0.436 +0.012 0.221 +0.011 Presión 0.923 +0.003 0.367 +0.023 0.183 +0.028 Microondas 0.831 +0.053 0.315 +0.025 0.137 +0.010 Olla tapada 0.698 +0.041 0.280 +0.027 0.127 +0.012 * Media + S.D. de 3 determinaciones; base en muestra fresca. Tabla VI.1 – Contenido* en azúcares solubles (% mf) en judías verdes crudas y cocinadas. 93 Almidón Pectinas (SDF) NDF Cruda 0.228 +0.022 0.674 +0.021 1.628 +0.050 Vapor 0.191 +0.027 0.543 +0.023 1.797 +0.011 Presión 0.192 +0.060 0.448 +0.017 1.920 +0.025 Microondas 0.128 +0.061 0.514 +0.023 2.081 +0.248 Olla tapada 0.198 +0.041 0.493 +0.110 2.236 +0.043 * Media + S.D. de 3 determinaciones; base en muestra fresca. Tabla VI.2 – Contenido* en almidón, pectinas y NDF (% mf) de judías verdes crudas y cocinadas. 94 Figura VI.1.- Representación de la modificación en el contenido total de carbohidratos, g/100 g mf (eje y), y en su perfil (área de los respectivos segmentos). 101 han extraído y metilado en sólo un paso y se ha desarrollado un método de GC para determinarlos. VII.3.- Materiales y Métodos VIII.3.1.- Muestras Las judías verdes se adquirieron en un supermercado local. Se obtuvieron cinco lotes representativos de judías troceadas, de 40 g. Un lote fue analizado crudo y cada uno de los restantes sometido a uno de los siguientes tratamientos térmicos: 1.- hervido en una olla cubierta con 1 L de agua durante 30 minutos. 2.- hervido a vapor en una olla cubierta durante 40 minutos. 3.- hervido a presión con 200 mL de agua durante 5 minutos tras la primera salida de vapor. 4.- hervido en horno a microondas con 150 mL de agua durante 5 minutos. Todos los tratamientos usaron el menor volumen de agua y el menor tiempo de cocción para alcanzar un grado similar de ternura con una palatabilidad adecuada, siendo el obtenido con microondas el producto menos tierno dadas las características térmicas de las microondas. Tras los tratamientos térmicos los lotes cocinados y el crudo fueron individualmente homogeneizados y liofilizados. VIII.3.2.- Procesado: Método de extracción y metilación en un paso Después de secadas, los lotes fueron cuidadosamente machacados en un mortero de vidrio y divididos en tres muestras de 0,7 g (5x3 muestras). Entonces las muestras fueron procesadas como describe Sukija y Palmquist. Se pesan 0,7 g de cada muestra en un tubo Pirex 16x160 mm con tapón de politetrafluoruro de etileno y rosca. Entonces se añaden 2 mL de tolueno (Carlos Erba, Milano, Italia) y 3 mL de ácido clorhídrico metanólico al 5% recién preparado (Metanol de grado cromatográfico y HCl, Scharlau, Barcelona, España). Tras un cuidadoso mezclado del contenido y soplar el espacio de cabeza del vial con nitrógeno, los tubos se calientan durante 2 horas a 70 ºC en un baño de agua. Enfriados los tubos se añaden 5 mL de K2CO3 al 6% (Scharlau, Barcelona, España); 1 mL de tolueno y 1 mL de una solución de tolueno conteniendo el éster metílico del ácido nonadecanoico (Sigma, MO, EEUU) como patrón interno, se agitan 102 con ayuda Vortex. La separación de las fases se realiza mediante 5 minutos de centrifugación a 1100 r.p.m. en una centrífuga Ettich EBA 12. La capa orgánica se seca con Na2SO4 (Scharlau, Barcelona, España) y se inyectó 1 µL. VIII.3.3.- Procedimiento: Análisis de los Esteres Metílicos de Acidos Grasos (FAMEs) Para la separación y cuantificación individual de los FAMEs se usa un cromatógrafo Fisons GC-8000 series (Manchester, Reino Unido) equipado con inyector “splitsplitless” y un detector de ionización de llama Fisons EL-980. Los FAMEs se separan individualmente con una columna capilar DB-Wax (60 m x 0,32 mm id x 0,25 µm de película de polietilenglicol) de J&W (Folsom, CA). Las áreas de los picos se procesan mediante el “software” Chrom-Card versión 1.18 (CE Instrument, Milano, Italia) para Windows, instalado en un ordenador Pentium. Con él también se chequea la eficacia de la columna (al incorporar la integración el SST). Las muestras se inyectan (1 µL) en "split" 1:15 con la columna a 110 ºC y el inyector a 250 ºC. Como gas portador se usa helio a un flujo de 1,37 mL/min., velocidad lineal media 22,76 cm/sg y una presión en cabeza de columna de 15 psi. Pasados 5 min. de la inyección la temperatura aumenta a 5 ºC/min. hasta 220 ºC, manteniédose así durante 10 min. (39 min. en total). La temperatura del detector es de 260 ºC. Los FAMEs se identifican por comparación de sus tiempos de retención con los correspondientes a sus patrones (todos de Sigma, MO, EEUU). Esto se confirma por comparación de sus espectros de masas con los de la librería Willey versión 1.4 (New York, EEUU). Para el análisis de los espectros de masas se usa un detector de masas Fisosns MD-800 (Manchester, Reino Unido) y el “software” MassLab de Finnigan GC/MD (Versión 1.4). 103 VII.4.- Resultados y Discusión La precisión del método se calcula como el %RSD de las cantidades de cada FAME en cada una de las 8 porciones obtenidas independientemente de una muestra de judía liofilizada. La precisión de la medida se calcula en base al %RSD de 9 determinaciones por GC de la cantidad de cada FAME en una misma solución. El porcentaje de recuperación del método se calculó usando 10 partes de la misma muestra liofilizada y sobrecargando con distintas cantidades de cada ácido graso. El límite de detección de cada ácido graso se calculó siguiendo las guías ACS (American Chemical Society 1980). Los resultados se reflejan en la Tabla VII.1. El contenido en ácidos grasos aumenta en todos los tratamientos térmicos (ver Tabla VII.2). Las judías verdes cocidas a presión muestran un incremento entorno al 15% respecto a las crudas. Las cocinadas a vapor, olla tapada, y las cocidas con microondas muestran aumentos entre el 42 y el 57% respectivamente. A pesar de estos cambios en el contenido de los ácidos grasos, tras los tratamientos térmicos apenas varía el perfil de los ácidos grasos (ver Figura VII.1). Esto coincide con Samuel R. Minka quien afirma que los tratamientos térmicos no inducen cambios en los niveles de judías negras cocidas (Phaseolus vulgaris, L.) y R.S. Attia quien observó sólo ligeros cambios en la composición de ácidos grasos y el tipo de lípidos presentes tras cocinar y secar garbanzos (Cicer arietinum, L.). Los tratamientos térmicos inhiben la lipasa y producen un marcado descenso en la lipoxigenasa (Attia y col., 1996). Esto puede explicar por qué sólo las judías crudas mostraron un menor contenido de ácido linolénico, porque este ácido graso es un substrato idóneo para la lipoxigenasa y puede degradarse fácilmente. La inhibición térmica de la lipoxigenasa puede producir un aumento de sus substratos, los ácidos linoleico y linolénico, pero no puede explicar el incremento por igual de cada ácido graso. Tampoco explica el perfil tan similar en todos los tratamientos. Este incremento regular de estos compuestos debe producirse por una concentración de los ácidos grasos en la muestra debido a pérdidas de compuestos solubles en agua como azúcares libres, almidón, pectinas, pigmentos o ácidos orgánicos durante los tratamientos térmicos. Los tratamientos que producen menores pérdidas de esos componentes, como es la cocción a presión, mostraron también el menor incremento en ácidos grasos. 104 VII.5.- Tablas y Figuras Tabla VII.1.- Precisión, recuperación y límite de detección de los ácidos grasos analizados. Tabla VII.2.- Composición de ácidos grasos de judías verdes y tratadas térmicamente (mg/100g mf; n=3). Tabla VII.3.- Perfil de ácidos grasos (%) de judías verdes crudas y tratadas térmicamente. Figura VII.1.- Representación gráfica de los datos de la tabla 3. Figura VII.2.- Cromatograma que muestra el contenido en ácidos grasos (FAMEs) de una muestra de judías cocidas en olla tapada. 105 Acido Graso Precisión de la medida RSD (%) Precisión del Método Analítico RSD (%) Recuperación (%) Limite de detección (µg/m L) C16:0 1.429 5.07 100.4 1.19 C18:0 1.097 2.55 100.9 1.98 C18:1 0.850 3.65 101.8 2.97 C18:2 0.743 2.48 104.5 1.98 C18:3 0.665 3.25 99.87 0.99 Media 0.957 3.40 101.5 1.82 Tabla VII.1. Precisión, recuperación y límite de detección de los ácidos grasos analizados. 106 Acido Graso Cruda Presión Vapor Olla Microondas C16:0 18.01 17.93 20.99 21.70 23.79 C18:0 4.06 3.52 4.36 4.98 4.93 C18:1 3.19 1.98 3.12 4.41 4.25 C18:2 17.65 20.30 25.82 27.68 27.85 C18:3 24.21 33.40 41.28 41.50 44.30 Total 67.12 77.13 95.57 100.27 105.11 Tabla VII.2. Composición de ácidos grasos de judías verdes crudas y tratadas térmicamente (mg/100g mf; n = 3). 107 Acido Graso Cruda Presión Vapor Olla Microondas C16:0 26.8 23.2 22.0 21.6 22.6 C18:0 6.1 4.6 4.6 5.0 4.7 C18:1 4.7 2.6 3.3 4.4 4.0 C18:2 26.3 26.3 27.0 27.6 26.5 C18:3 36.1 43.3 43.2 41.4 42.1 Tabla VII.3. Perfil de ácidos grasos (%) de judías verdes crudas y tratadas térmicamente. 108 Figura VII.1.- Representación gráfica de los datos de la Tabla 3. Cruda Microondas Olla Vapor Presión C16:0 C18:0 C18:1 C18:2 C18:3 109 Figura VII.2.- Cromatograma que muestra el contenido en ácidos grasos (FAMEs) de una muestra de judías cocidas en olla tapada. 110 VII.6.- Referencias bibliográficas 1. American Chemical Society, Anal. Chem. 52 (1980) 2242. 2. Attia, R.S; Aman, M.E; El-Tabey, A.M and Hamza, M.A., Food Chem. 56 (1996) 123. 3. Badui Dergal, S. Química de los Alimentos, 1ª edn., Alhambra Mexicana, 1981, p. 185. 4. Cruz, C; González, M.J; Oruña, M.J; López, J; Simal, J.A. and Simal, J., Food Res. Int. 30 (1997) 787. 5. Cruz, C; González, M.J; Oruña, M.J; López, J; Simal, J.A. and Simal, J., Deut. Lebensm-Rundsch. 95 (1999) 323. 6. González, M.J; Oruña, M.J; López, J; Simal, J and Ganza, A., Z Lebensm. Unters Forsch 203 (1996) 370. 7. Lanser, A.C; List, G.R; Holloway, R.K. and Mounts, T.L., J. Am. Oil Chem. 68 (1991) 448. 8. López, J; González, M.J; Simal, J; Vázquez, M.E. and Vázquez, M.L., Grasas Aceites, 47 (1996) 182. 9. Senatore, F., Biochem. Systematics and ecology. 18 (1990) 103. 10. Minka, S.R.; Mbofung, C.M.F; Gandon, C. and Bruneteau, M., Food Chem. 64 (1999) 145. 11. Park, Y.W. and Washington, A.C., J. Food Sci. 58 (1993) 245. 12. Sukhija, P.S. and Palmquist, D.L., J. Agric. Food Chem. 36 (1988) 1202.