Síntesis, estudio estructural y propiedades de péptidos y de N-alquilamidas de β- y γ aminoácidos derivados del ácido ciclohexanocarboxílico y del ácido (-)-shikímico

ESCUELA DE DOCTORADO INTERNACIONAL DE LA USC David Reza Ramos Tesis doctoral Síntesis, estudio estructural y propiedades de péptidos y de N-alquilamidas de β- y γaminoácidos derivados del ácido ciclohexenocarboxílico y del ácido (–)-shikímico Santiago de Compostela, 2023 Programa de doctorado en Ciencia y Tecnología Química TESIS DE DOCTORADO SÍNTESIS, ESTUDIO ESTRUCTURAL Y PROPIEDADES DE PÉPTIDOS Y DE N -ALQUILAMIDAS DE β- Y γ-AMINOÁCIDOS DERIVADOS DEL ÁCIDO CICLOHEXENOCARBOXÍLICO Y DEL ÁCIDO (–)-SHIKÍMICO David Reza Ramos ESCUELA DE DOCTORADO INTERNACIONAL PROGRAMA DE DOCTORADO EN CIENCIA Y TECNOLOXÍA QUÍMICA SANTIAGO DE COMPOSTELA 2023 DECLARACIÓN DEL AUTOR DE LA TESIS SÍNTESIS, ESTUDIO ESTRUCTURAL Y PROPIEDADES DE PÉPTIDOS Y DE N-ALQUILAMIDAS DE β- Y γ-AMINOÁCIDOS DERIVADOS DEL ÁCIDO CICLOHEXENOCARBOXÍLICO Y DEL ÁCIDO (–)-SHIKÍMICO D. David Reza Ramos Presento mi tesis, siguiendo el procedimiento adecuado al Reglamento, y declaro que: 1) La tesis abarca los resultados de la elaboración de mi trabajo. 2) En su caso, en la tesis se hace referencia a las colaboraciones que tuvo este trabajo. 3) La tesis es la versión definitiva presentada para su defensa y coincide con la versión enviada en formato electrónico. 4) Confirmo que la tesis no incurre en ningún tipo de plagio de otros autores ni de trabajos presentados por mí para la obtención de otros títulos. En Santiago de Compostela, el 30 de enero de 2023. Fdo. David Reza Ramos AUTORIZACIÓN DEL DIRECTOR / TUTOR DE LA TESIS D. Juan Carlos Estévez Cabanas y D. Ramón José Estévez Cabanas, En condición de directores (y de tutor el primero): Título de la Tesis: Síntesis, estudio estructural y propiedades de péptidos y de N-alquilamidas de β- y γ-aminoácidos derivados del ácido ciclohexenocarboxílico y del ácido (–)-shikímico INFORMAN: Que la presente Tesis se corresponde con el trabajo realizado por Don David Reza Ramos, bajo nuestra dirección/tutorización, por lo que autorizamos su presentación, considerando que reúne los requisitos exigidos en el Reglamento de Estudios de Doctorado de la USC y que como directores/tutores de ésta no incurrimos en las causas de abstención establecidas en la Ley 40/2015. En Santiago de Compostela, 30 de enero de2023. Fdo: Juan Carlos Estévez Cabanas Fdo: Ramón José Estévez Cabanas. Viaje antes que destino 5.3.3 Espectroscopía de RMN del péptido 70a en DMSO-d6 ............................ 187 5.3.4 Espectroscopía de RMN del péptido 70b en DMSO-d6 ............................ 198 5.3.5 Espectroscopía de RMN del péptido 70c en DMSO-d6 ............................ 206 5.3.6 Espectroscopía de RMN del péptido 70c en metanol-d3 ........................... 216 5.3.7 Espectroscopía de RMN: Tablas ............................................................... 224 5.4 SÍNTESIS DE LOS Α,Β-PÉPTIDOS 75a, 75b, Y 75c ................................................ 232 5.4.1 ((3aR,4S,5S,7R,7aR)-4-(((Aliloxi)carbonil)amino)-7-((terc-butildimetil- silil)oxi)-2,2-dimetilhexahidrobenzo[d][1,3]dioxol-5-carbonil)-L-alaninato de metilo (73a) ................................................................................................................... 232 5.4.2 ((3aR,4S,5S,7R,7aR)-4-(((Aliloxi)carbonil)amino)-7-((terc-butil-dimetilsi- lil)oxi)-2,2-dimetilhexahidrobenzo[d][1,3]dioxol-5-carbonil)-L-alanina (73b) ............. 234 5.4.3 ((3aR,4S,5S,7R,7aR)-4-Amino-7-((terc-butildimetilsilil)oxi)-2,2- dimetilhexahidrobenzo[d][1,3]dioxol-5-carbonil)-L-alaninato de metilo (73c) ............. 234 5.4.4 (R)-2-((3aR,4S,5S,7R,7aR)-4-((R)-2-((3aR,4S,5S,7R,7aR)-4- (((Aliloxi)carbonil)amino)-7-((terc-butildimetilsilil)oxi)-2,2-dimetilhexahidro- benzo[d][1,3]dioxol-5-carboxamido)propanamido)-7-((terc-butildimetilsilil)oxi)-2,2- dimetilhexahidrobenzo[d][1,3]dioxol-5-carboxamido)propanoato de metilo (74a) ....... 235 5.4.5 (R)-2-((3aR,4S,5S,7R,7aR)-4-((R)-2-((3aR,4S,5S,7R,7aR)-4-Amino-7- ((terc-butil-dimetilsilil)oxi)-2,2-dimetilhexahidrobenzo[d][1,3]dioxol-5-carboxami- do)propana-mido)-7-((terc-butildimetilsilil)oxi)-2,2-dimetilhexahidrobenzo[d][1,3]dioxol-5-carboxamido) propanoato de metilo (74b) ............................................................ 238 5.4.6 (R)-2-((3aR,4S,5S,7R,7aR)-4-((R)-2-((3aR,4S,5S,7R,7aR)-4-((R)-2- (((Benciloxi)car-bonil)amino)propanamido)-7-((terc-butildimetilsilil)oxi)-2,2- dimetilhexahidrobenzo[d][1,3]dioxol-5-carboxamido)propanamido)-7-((tercbutildimetilsilil)oxi)-2,2-dimetilhexahidrobenzo[d][1,3]dioxol-5-carboxamido) propanoato de metilo (75a) ............................................................................................. 238 5.4.7 (R)-2-((3aR,4S,5S,7R,7aS)-4-((R)-2-((3aR,4S,5S,7R,7aS)-4-((R)-2- (((Benciloxi)carbonil)amino)propanamido)-7-hidroxi-2,2-dimetilhexahidro- benzo[d][1,3]dioxol-5-carboxamido)propanamido)-7-hidroxi-2,2-dimetilhexahi- drobenzo[d][1,3]dioxol-5-carboxamido) propanoato de metilo (75b) ............................ 241 5.4.8 (R)-2-((1S,2S,3R,4S,5R)-2-((R)-2-((1S,2S,3R,4S,5R)-2-((R)-2-(((Benciloxi)carbo-nil)amino)propanamido)-3,4,5-trihidroxiciclohexanocarboxamida)propanamido)-3,4,5-trihidroxiciclohexanecarboxamido) propanoato de metilo (75c) ............ 243 5.5 ANÁLISIS ESTRUCTURAL DE LOS PENTAPÉPTIDOS 75a, 75b Y 75c ..................... 246 5.5.1 Espectroscopía de Dicroísmo Circular de los péptidos 75a, 75b y 75c .... 246 5.5.2 Espectroscopía de RMN del pentapéptido 75c en CD3CN ....................... 249 5.5.3 Espectroscopía de RMN del pentapéptido 75c en CD3OH ....................... 256 5.6 SÍNTESIS DE LOS HEXAPÉPTIDOS 81a, 81b Y 81c ................................................ 260 5.6.1 Síntesis de la sal de ácido trifluoroacético de la (S)-2-amino-N-((S)-1- (metilamino)-1-oxopropan-2-il) propanamida (78b) ...................................................... 260 5.6.2 Síntesis del (3aR,4R,5R,7R,7aR)-7-((terc-butildimetilsilil)oxi)-2,2-dimetil- 4-(nitro-metil)hexahidrobenzo[d][1,3]dioxolo-5-carboxilato de pentafluorofenol (37d) .... .................................................................................................................. 260 5.6.3 Síntesis de la (3aR,4R,5R,7R,7aR)-7-((terc-butildimetilsilil)oxi)-2,2- dimetil-N-((S)-1-(metilamino)-1-oxopropan-2-il)-4- (nitrometil)hexahidrobenzo[d][1,3]dioxol-5-carboxamida (79a) ................................... 262 5.6.4 Síntesis de la (3aR,4R,5R,7R,7aR)-4-(aminometil)-7-((tercbutildimetilsilil)oxi)-2,2-dimetil-N-((S)-1-(((S)-1-(metilamino)-1-oxopropan-2-yl)amino)- 1-oxopropan-2-il)hexahidrobenzo[d][1,3]dioxol-5-carboxamida (79b) ........................ 264 5.6.5 Síntesis del (3aR,4R,5S,7R,7aR)-7-((terc-butildimetilsilil)oxi)-2,2-dimetil- 4-(nitrometil)hexahidrobenzo[d][1,3]dioxolo-5-carboxilato de pentafluorofenol (37d) ..... .................................................................................................................. 265 5.6.6 Síntesis de la (3aR,4R,5R,7R,7aR)-7-((terc-butildimetilsilil)oxi)-4- (((3aR,4R,5S,7R,7aR)-7-((terc-butildimetilsilil)oxi)-2,2-dimetil-4-(nitrometil)hexahidrobenzo[d][1,3]dioxol-5-carboxamido)metil)-2,2-dimetil-N-((S)-1-(metilamino)-1- oxopropan-2-il)hexahidrobenzo[d][1,3]dioxol-5-carboxamida (80a) ............................ 267 5.6.7 Síntesis de la (3aR,4R,5S,7R,7aR)-4-(aminometil)-7-((tercbutildimetilsilil)oxi)-N-(((3aR,4R,5R,7R,7aR)-7-((terc-butildimetilsilil)oxi)-2,2-dimetil- 5-(((S)-1-(((S)-1-(metilamino)-1-oxopropan-2-il)amino)-1-oxopropan-2-il)carbamoil)hexahidrobenzo[d][1,3]dioxol-4-il)metil)-2,2-dimetilhexahidrobenzo[d][1,3]dioxol-5- carboxamida (80b) .......................................................................................................... 270 5.6.8 Síntesis del (S)-2-acetamido-N-((S)-1-((difluorofosfaneil)oxi)-1-oxopropan- 2-il) propanamida (78d) .................................................................................................. 271 5.6.9 Síntesis de la (3aR,4R,5S,7R,7aR)-4-(((S)-2-((S)-2- acetamidopropanamido)propanamido)metil)-7-((terc-butildimetilsilil)oxi)-N- (((3aR,4R,5R,7R,7aR)-7-((terc-bu-tildimetilsilil)oxi)-2,2-dimetil-5-(((S)-1-(((S)-1- (metilamino)-1-oxopropan-2-il)amino)-1-oxopropan-2-il)carbamoil)hexahidrobenzo[d][1,3]dioxol-4-il)metil)-2,2-dime-tilhexaidrobenzo[d][1,3]dioxole-5-carboxamida (81a) .................................................................................................................. 272 5.6.10 Síntesis de la (3aR,4R,5S,7R,7aS)-4-(((S)-2-acetamidopropanamido)metil)- 7-hidroxi-N-(((3aR,4R,5R,7R,7aS)-7-hidroxi-2,2-dimetil-5-(((S)-1-(metilamino)-1- oxopropan-2-il)carbamoil)hexahidrobenzo[d][1,3]dioxol-4-il)metil)-2,2-dimetilhe- xahidrobenzo[d][1,3]dioxol-5-carboxamida (81b) ......................................................... 274 5.6.11 Síntesis de la (1S,2R,3R,4S,5R)-2-(((S)-2-((S)-2-acetamidopropanamido) propanamido)metil)-3,4,5-trihidroxi-N-(((1R,2R,3S,4R,6R)-2,3,4-trihidroxi-6-(((S)-1- (((S)-1-(metilamino)-1-oxopropan-2-il)amino)-1-oxopropan-2-il)carbamoil)ciclohexil)metil)ciclohexan-1-carboxamida (81c) ..................................................................... 276 5.7 ANÁLISIS ESTRUCTURAL DE LOS HEXAPÉPTIDOS 81a, 81b Y 81c ...................... 278 5.7.1 Espectroscopía de infrarrojo de los hexapéptidos 81a, 81b y 81c ........... 278 5.7.2 Espectroscopía de Dicroísmo Circular de los hexapéptidos 81a, 81b y 81c .. .................................................................................................................. 280 5.7.3 Espectroscopía de RMN del hexapéptido 81a en CDCl3 ......................... 283 5.7.4 Espectroscopía de RMN del hexapéptido 81b en acetonitrilo-d3 ............. 291 5.8 PROCEDIMIENTOS GENERALES ........................................................................... 301 5.9 SÍNTESIS DE N-ALQUILAMIDAS CICLOHEXÁNICAS ............................................. 302 5.9.1 Síntesis del ((1R,2S)-2-(octilcarbamoil)ciclohexil)carbamato de terc-butilo (125) ................................................................................................................... 302 5.9.2 Síntesis del ((1R,2S)-2-(hexadecilcarbamoil)ciclohexil)carbamato tercbutilo (126) ................................................................................................................... 304 5.9.3 Síntesis del ((1R,2R)-2-(butilcarbamoil)ciclohexil)carbamato de terc-butilo (127) ................................................................................................................... 306 5.9.4 Síntesis del ((1R,2R)-2-(octilcarbamoil)ciclohexil)carbamato de terc-butilo ((1R,2R)-128) .................................................................................................................. 308 5.9.5 Síntesis del ((1R,2R)-2-(hexadecilcarbamoil)ciclohexil)carbamato de tercbutilo ((1R,2R)-129) ........................................................................................................ 310 5.9.6 Síntesis del ((1S,2S)-2-(octilcarbamoil)ciclohexil)carbamato terc-butilo ((1S,2S)-128) y del ((1R,2R)-2-(octilcarbamoil)ciclohexil)carbamato de terc-butilo ((1R,2R)-128) (rac-128) .................................................................................................. 312 5.9.7 Síntesis del ((1S,2S)-2-(hexadecilcarbamoil)ciclohexil)carbamato tercbutilo ((1S,2S)-129) y del ((1R,2R)-2-(hexadecilcarbamoil)ciclohexil)carbamato de tercbutilo((1R,2R)-129) (rac-129) ......................................................................................... 312 5.10 ANÁLISIS ESTRUCTURAL DE LAS N-ALQUILAMIDAS Gc8, Gc16, Gt8, Gt16, rGt8 Y rGt16 ............................................................................................................. 313 5.10.1 Estudio de infrarrojo de las N-alquilamidas Gc8, Gc16, Gt8, Gt16, rGt8 y rGt16 ................................................................................................................... 313 5.10.2 Micrografías de SEM de las N-alquilamidas Gc8, Gc16, Gt8, Gt16, rGt8 y rGt16 ................................................................................................................... 317 5.10.3 Microscopía de Fuerza Atómica (AFM) ................................................... 323 5.10.4 Espectroscopía de Rayos X ....................................................................... 324 5.11 SÍNTESIS DE N-ALQUILAMIDAS DEL ÁCIDO (–)-SHIKÍMICO ................................. 330 5.11.1 Síntesis del (3aR,4S,5S,7R,7aR)-4-((terc-butoxicarbonil)amino)-7-((tercbutildimetilsilil)oxi)-2,2-dimetilhexahidrobenzo[d][1,3]dioxol-5-carboxilato de metilo (21e) ................................................................................................................... 330 5.11.2 Síntesis del (3aR,4S,5R,7R,7aR)-4-((terc-butoxicarbonil)amino)-7-((tercbutildimetilsilil)oxi)-2,2-dimetilhexahidrobenzo[d][1,3]dioxol-5-carboxilato de metilo (22e) ................................................................................................................... 332 5.11.3 Síntesis del ácido (3aR,4S,5R,7R,7aR)-4-((terc-butoxicarbonil)amino)-7- ((terc-butildimetilsilil)oxi)-2,2-dimetilhexahidrobenzo[d][1,3]dioxol-5-carboxílico (21f) . ................................................................................................................... 334 5.11.4 Síntesis del ácido (3aR,4S,5R,7R,7aR)-4-((terc-butoxicarbonil)amino)-7- ((terc-butildimetilsilil)oxi)-2,2-dimetilhexahidrobenzo[d][1,3]dioxol-5-carboxílico (22f) . ................................................................................................................... 336 5.11.5 Síntesis del ((3aR,4S,5S,7R,7aR)-7-((terc-butildimetilsilil)oxi)-2,2-dimetil- 5-(octilcarbamoil)hexahidrobenzo[d][1,3]dioxol-4-il)carbamato de terc-butilo (131) ........ .................................................................................................................. 338 5.11.6 ((3aR,4S,5S,7R,7aR)-7-((terc-butildimetilsilil)oxi)-2,2-dimetil-5- (hexadecilcarbamoil)hexahidrobenzo[d][1,3]dioxol-4-il)carbamato de terc-butilo (132) ... .................................................................................................................. 340 5.11.7 Síntesis del ((3aR,4S,5R,7R,7aR)-7-((terc-butildimetilsilil)oxi)-2,2-dimetil- 5-(octilcarbamoil)hexahidrobenzo[d][1,3]dioxol-4-il)carbamato de terc-butilo (133) ........ .................................................................................................................. 342 5.11.8 Síntesis del (3aR,4S,5R,7R,7aR)-7-((terc-butildimetilsilil)oxi)-5- (hexadecilcarbamoil)-2,2-dimetilhexahidrobenzo[d][1,3]dioxol-4-il)carbamato de tercbutilo (134) .................................................................................................................. 344 5.11.9 Síntesis del ((3aR,4S,5S,7R,7aS)-7-hidroxi-2,2-dimetil-5- (octilcarbamoil)hexahidrobenzo[d][1,3]dioxol-4-il)carbamato de terc-butilo (135) ........... .................................................................................................................. 346 5.11.10 Síntesis del ((3aR,4S,5S,7R,7aS)-7-hidroxi-2,2-dimetil-5- (hexadecilcarbamoil)hexahidrobenzo[d][1,3]dioxol-4-il)carbamato de terc-butilo (136) ... ................................................................................................................. 348 5.11.11 Síntesis del ((3aR,4S,5R,7R,7aS)-7-hidroxi-2,2-dimetil-5- (octilcarbamoil)hexahidrobenzo[d][1,3]dioxol-4-il)carbamato de terc-butilo (137) ........... ................................................................................................................. 350 5.11.12 Síntesis del ((3aR,4S,5R,7R,7aS)-5-(hexadecilcarbamoil)-7-hidroxi-2,2- dimetilhexahidrobenzo[d][1,3]dioxol-4-il)carbamato de terc-butilo (138) .................... 352 5.11.13 Síntesis del ((1S,2R,3S,4R,6R)-2,3,4-trihidroxi-6- (octilcarbamoil)ciclohexil)carbamato de terc-butilo (139) ............................................ 354 5.11.14 Síntesis del ((1S,2R,3S,4R,6S)-6-(hexadecilcarbamoil)-2,3,4- trihidroxiciclohexil)car-bamato de terc-butilo (140) ...................................................... 356 5.11.15 Síntesis del ((1S,2R,3S,4R,6S)-2,3,4-trihidroxi-6- (octilcarbamoil)ciclohexil)carbamato de terc-butilo (141) ............................................ 358 5.11.16 Síntesis del ((1S,2R,3S,4R,6R)-6-(hexadecilcarbamoil)2,3,4- trihidroxiciclohexil) carbamato de terc-butilo (142) ...................................................... 360 6 REFERENCIAS ................................................................................................. 363 SUMMARY Summary I This doctoral thesis unveils some unexplored possibilities of cyclohexane-- and -amino acids derived from cyclohexenecarboxylic acid and (–)-shikimic acid, with the aim to: - Generate new peptides with the ability to fold into secondary structures of modulable polarity. - To access new alkyl amides of modulable polarity, with the ability to self-assemble in a wide variety of solvents and to gel them. This has been organised in the following several sections, as follows: 2-AMINECICLOHEXANECARBOXILIC ACID β-PEPTIDES The first chapter of this doctoral thesis describes the synthesis of the new β-pentapeptide 70a and its derivatives 70b and 70c. They consist of a central trisubstituted cyclohexane β-amino acid residue which is attached to two cyclohexane β-amino acid dipeptides. They have been prepared as shown in Scheme 1, starting from the known dipeptides 68b and 68c and the trisubstituted cyclohexane β-amino acid 22b, the latter previously prepared from (–)-shikimic acid by our research group. Scheme 1. Synthesis of pentapeptides 70a, 70b and 70c. David Reza Ramos II Structural studies of these pentapeptides in solution, using FTIR, CD, NMR and DFT calculations, showed that they fold as 14-helices (Figure 1). This is especially relevant, as these 14-helices have three residues per turn, stacking the substituent outside the helix. This structural property opens up opportunities for accessing amphiphilic β-peptides of interest in biological chemistry and molecular materials. Figure 1. 14-helix structure of peptide 70c. HETEROOLIGOMERS OF α-AMINO ACIDS AND 2-AMINOCYCLOHEXANECARBOXYLIC ACIDS The second chapter of this PhD thesis reports the synthesis of the three new α,β-peptides, 75a, 75b and 75c. These peptides were synthesized as shown in Scheme 2, alternating L- alanine units and the trisubstituted β-amino acid derived from (–)-shikimic acid 21c, previously synthesized in our research group. Scheme 2. Synthesis of pentapeptides 75a, 75b and 75c. The structural properties of these three pentapeptides 75a, 75b and 75c in solution have been studied by various spectroscopic techniques, such as FTIR, CD and one- and twodimensional NMR. CD spectra suggest that only compound 75c appears to fold into an 11/9-helix in acetonitrile solution. However, the NOE patterns of this compound in acetonitrile do not in agreement with this folding pattern, suggesting that it folds into a more extended conformation. Summary III HETEROOLIGOMERS OF α-AMINO ACIDS AND 2-AMINOMETHYLCYCLOHEXANE- CARBOXYLIC ACIDS The third chapter of this PhD thesis describes the synthesis and structural studies of the new hexapeptides 81a, 81b and 81c. These hexapeptides consisted of a central γ-dipeptide of trans and cis polyhydroxylated γ-cyclohexane amino acids 37a and 36a, which were previously synthesized by our research group from (–)-shikimic acid. This dipeptide is linked to two L-alanine based α-dipeptides (Scheme 3). Scheme 3. Synthesis of pentapeptides 81a, 81b and 81c. The structural properties of these three α,γ-hexapeptides 81a, 81b and 81c in solution were studied using various spectroscopic techniques (FTIR, CD and mono and bidimensional NMR) and X-ray diffraction. This allowed us to establish that: - Hexapeptide 81a adopts a β-turn folding in CHCl3 solution (Figure 2). - Hexapeptide 81b, with two free hydroxyl groups, folds as an α,β-turn in acetonitrile (Figure 2) and as an extended conformation in water (Figure 2). - Hexapeptide 81c, with three hydroxy substituents, adopts an extended conformation in aqueous solution (Figure 2). David Reza Ramos IV Figure 2. β-turn structure of 81a and α,β-turn structure of peptide 81b. SYNTHESIS, GELATION STUDY AND APPLICATIONS OF N-ALKYL AMIDES DERIVED FROM 2-AMINOCYCLOHEXENECARBOXYLIC ACID The fourth part of this PhD thesis presents the synthesis of cis and trans N-alkyl amides 125-129 derived from unprotected (1S,2R)-2-aminociclohexanecarboxilic acid 71b and (1R,2R)-2-aminociclohexanecarboxilic acid 40b (Scheme 4). Evaluation of the gelling properties of these compounds (Table 1) showed that the gelling capacity depends on both the stereochemistry and the length of the alkyl chain. The trans and longer chain derivatives proved to be much better gelling agents. Scheme 4. Synthesis N-alkyl amides derived from 2-aminocyclohexenecarboxilic acid 125-129. The most effective gelling agents (1R,2R)-128 and (1R,2R)-129 were also synthesized as their racemic form (rac-128 and rac-129) from racemic cyclohexanecarboxylic acid 40b (Scheme 5) and subsequently evaluated for their gelling ability. As shown in Table 1, the racemic mixture of N-octyl chain rac-128 showed a substantial decrease in gelling properties, Introducción 11 1.1 α-AMINOÁCIDOS Los α-aminoácidos son moléculas bifuncionales en las que un grupo CO2H y un grupo NH2 están unidos a un mismo átomo de carbono, denominado carbono α (Cα). Los diferentes sustituyentes unidos al este carbono se denominan cadenas laterales o grupos R. Todos los α-aminoácidos pueden considerarse derivados de la glicina en los que el Cα puede estar mono o disustituido. Todas las proteínas naturales están formadas por solo 19 aminoácidos monosustituidos de la serie L, y la glicina que no está sustituida y por lo tanto es aquiral. La secuencia de aminoácidos de una cadena polipeptídica se denomina estructura primaria. La estructura secundaria de la misma es el plegado tridimensional de esta cadena polipeptídica, que depende de estructura primaria. La estructura secundaría de las proteínas naturales juega un papel fundamental en la actividad biológica de las mismas. Es por ello por lo que se han realizado grandes esfuerzos para entender los factores que determinan el plegamiento de las proteínas en estructuras secundarias estables, así como en el diseño de cadenas polipeptídicas no naturales con las mismas capacidades de plegado que los péptidos naturales.1–4 En los últimos años se han descubierto péptidos cortos con importantes aplicaciones biológicas, desde neurotransmisores, hasta hormonas o inhibidores enzimáticos.5 Estas actividades están relacionadas con las interacciones proteína-proteína, que a su vez dependen de la estructura de las mismas. De hecho, la distorsión de estas interacciones está asociada con numerosas enfermedades, por lo que los péptidos capaces de modular estas interacciones pueden constituir dianas terapéuticas. Tradicionalmente se han utilizado moléculas pequeñas para el tratamiento de estas enfermedades, como pueden ser el nutilina-3 (1) o la benzodiazipinidona 2 (Figura 1), aunque de manera ineficiente, debido a la alta área superficial de contacto que requieren estas interacciones. Es por ello por lo que, el desarrollo de péptidos de tamaño intermedio es de gran interés, ya que presentan una mayor afinidad y selectividad sobre las amplias superficies de las proteínas. Figura 1. Ejemplos de moléculas pequeñas que inhiben las interacciones proteína-proteína. Un ejemplo de estos péptidos cortos con gran actividad biológica es la somatostatina (3, Figura 2), una hormona peptídica que interviene directamente en la regulación de la glucemia, inhibiendo la secreción de insulina y glucagón.6 Se pueden desarrollar nuevos péptidos derivados de α-aminoácidos proteinogénicos como antagonistas efectivos de las David Reza Ramos 12 interacciones proteína-proteína, pero los péptidos formados por los α-aminoácidos proteinogénicos tienen limitaciones para su aplicación in vivo, debido a su rápida degradación por proteasas. Además, la mayoría de estos péptidos no traspasan de manera eficiente las membranas celulares y/o son poco solubles en agua. Figura 2. Estructura química de la somatostatina (3) y su peptidomimético 4. Una solución a este problema es la síntesis de peptidomiméticos, mediante la sustitución de uno o varios residuos de α-aminoácidos de un α-péptido por otras moléculas, generalmente β- o γ-aminoácidos.7 Los péptidos resultantes presentan una gran tendencia a plegarse en estructuras secundarias estables, incluso con pocos residuos, con la ventaja añadida de una mayor resistencia a la proteólisis. Un ejemplo de ello es el peptidomimético de la somatostatina 4 (Figura 2). 1.2 β-AMINOÁCIDOS Los β-aminoácidos son un tipo de aminoácidos no proteinogénicos que difieren de sus análogos naturales, los α-aminoácidos, en que tienen dos átomos de carbono insertados entre el grupo amino y el grupo carboxilo. Cada uno de estos átomos de carbono puede estar funcionalizado, lo que se traduce en una mayor diversidad estructural que la presente en el caso de los α-aminoácidos. Figura 3. Estructuras químicas de un α-aminoácido y un β-aminoácido. Los β-aminoácidos se encuentran presentes en la naturaleza y son los precursores biológicos de diferentes compuestos bioactivos, como el taxol (6),8 que tiene una potente Introducción 13 actividad antitumoral, o la emeriamina (5),9 que inhibe la oxidación de ácidos grasos de cadena larga. Además, encontramos también subunidades de β-aminoácidos en forma de βlactamas en compuestos con una gran actividad antibiótica como la penicilina (8) o la cefalosporina (9). También están presentes en péptidos naturales como la jasplakinolida (7), con actividad antifúngica y la bestatina (10), inhibidor de las aminopeptidasas (Figura 4).10 Sin embargo, la mayor parte de los β-aminoácidos conocidos son de origen sintético. Figura 4. β-aminoácidos naturales, resaltados en azul, que forman parte de moléculas con actividad biológica. Desde el punto de vista estructural, los β-aminoácidos pueden subdividirse en varios tipos, según el grado de sustitución de los átomos de carbono α y β. Entre ellos figuran los β2, β3 y β2,3-aminoácidos (Figura 5), dependiendo de la posición de la cadena o cadenas laterales en su subunidad básica de ácido 2-aminopropanoico. Además, existen β-aminoácidos cíclicos en los que el grupo amino está integrado en un anillo, como es el caso de la β-prolina, y β-aminoácidos cicloalcánicos en los que los dos grupos amino y ácido carboxílico forman parte de un mismo ciclo, como los ácidos 2-aminociclohexanocarboxílicos.11 Los distintos tipos de β-aminoácidos y sus aplicaciones han sido ampliamente estudiados.12 Figura 5. Estructura química de los diferentes tipos de β-aminoácidos. Esta tesis doctoral está centrada en un subgrupo particular de los β2,3-aminoácidos, los -aminoácidos ciclohexánicos. Estos y demás β-aminoácidos cicloalcánicos han adquirido gran interés en los últimos años, debido a su rigidez conformacional, que hace que su David Reza Ramos 14 incorporación en péptidos genere peptidomiméticos de gran estabilidad conformacional. Por lo que estos -aminoácidos tienen un elevado potencial en la química biológica y en la ciencia de materiales, como se verá más adelante en esta tesis. Se han desarrollado numerosos métodos de síntesis de β-aminoácidos ciclohexánicos no sustituidos (carbocíclicos y heterocíclicos), tanto en su forma racémica, como enantioselectiva.13–15 La introducción de grupos funcionales en el carbociclo es de gran interés, ya que puede influenciar enormemente en la actividad biológica y farmacológica de sus péptidos. Sin embargo, se han descrito pocos ejemplos, debido principalmente a la dificultad de este tipo de síntesis,16,17 de los cuales vamos a destacar, por el interés para esta tesis doctoral, la síntesis de aquellos que presentan grupos hidroxilo en su anillo. La mayoría de los ejemplos descritos para la preparación de estos compuestos consisten en la síntesis y funcionalización selectiva del doble enlace de β-aminoácidos ciclohexénicos.18 La funcionalización de este doble enlace endocíclico puede llevarse a cabo a través de una reacción de iodolactonización y posterior apertura controlada de la lactona formada. Es el caso del β-aminoácidos ciclohexénico 11, que pudo ser transformado de esta forma en los β-aminoácidos monohidroxilados 13 y 14 del Esquema 1.19,20 Esquema 1. Síntesis del 5-hidroxi-aminoácido 13 y el 2,5-diaminoácido 15 mediante iodolactonización. Otro método que se ha utilizado para la funcionalización del doble enlace endocíclico de β-aminoácidos ciclohexénicos es la epoxidación estereoselectiva, seguida por una apertura regioselectiva del epóxido. Este método fue utilizado para la transformación del β-aminoácido ciclohexénico 16 en su derivado polihidroxilado 18 (Esquema 2).21 Esquema 2. Síntesis del β-aminoácido ciclohexánico polihidroxilado 18 a partir del β-aminoácido ciclohexénico 16. Introducción 15 En nuestro grupo de investigación hemos desarrollado recientemente un método de síntesis eficiente de los -aminoácidos ciclohexánicos trihidroxilados 21b y 22b con configuración cis y trans respectivamente, partiendo del derivado 19 del ácido (–)-shikímico comercial, haciendo uso para ello del protocolo de adición de Michael de amiduros de litio del Prof. Davies.22,23 Este método de síntesis aparece recogido en el Esquema 3.24 Esquema 3. Síntesis enantioselectiva de cis o trans-β-aminoácidos ciclohexánicos trihidroxilados 21b y 22b. Nuestro método permite la síntesis de -aminoácidos ciclohexánicos trihidroxilados en su configuración cis y trans, con excelentes rendimientos y excesos diastereoméricos. David Reza Ramos 16 1.3 γ-AMINOÁCIDOS Los γ-aminoácidos son aminoácidos no proteinogénicos que presentan tres átomos de carbono insertados entre el grupo amino y el grupo carboxilo (Figura 6), pueden considerarse derivados del ácido 4-aminobutírico o GABA (23). Figura 6. Esquema general de la estructura química de α-,β- y γ-aminoácidos El GABA es el γ-aminoácido natural de mayor interés en Química Médica. Se trata del principal neurotransmisor inhibitorio del sistema nervioso central y uno de los más abundantes en los mamíferos.25 Actúa sobre tres receptores GABAA, GABAB y GABAC. De ellos GABAA y GABAC son canales iónicos responsables de la transmisión sináptica rápida, mientras que GABAB es un receptor ligado a proteína G, que regula la transmisión sináptica a través de sistemas de efectores intracelulares.26 La deficiencia de GABA está asociada a diferentes patologías como pueden ser la epilepsia, las enfermedades de Parkinson y de Huntington y otros desordenes como la ansiedad y el dolor, por lo que sus receptores son una de las dianas terapéuticas más estudiadas en Química Médica.27 Algunos ejemplos de análogos de GABA con actividad farmacológica pueden ser la γ-vinil GABA, la (S)- vigabatrina (24), que se utiliza para tratar convulsiones,28 o el (R)-baclofeno (25), un medicamento con prometedores resultados para el tratamiento de la neuralgia (Figura 7). Figura 7. Estructura química del GABA (23) y de sus análogos biológicos (S)-vigabatrina (24) y (R)-baclofeno (25). Los péptidos que incluyen γ-aminoácidos en su estructura son también de enorme interés. En la Naturaleza podemos encontrar γ-aminoácidos en péptidos con potentes actividades biológicas. Un ejemplo es la norstatina (27, Figura 8), un β-hidroxi-γ-aminoácido que constituye el principal componente de la pepstatina (26), un hexapéptido natural con propiedades antibióticas, que actúa como inhibidor de la proteasa del ácido aspártico.29 El mal funcionamiento de esta proteasa está relacionado con muchas enfermedades, como pueden ser el SIDA, la hipertensión, la malaria y la enfermedad de Alzheimer. En la Figura 8 se incluyen también la norstatina (27), ciclohexilstatina (28), isostatina (29) y la dolaprolina (30), que son ejemplos de -aminoácidos usados para la síntesis de péptidos cortos con potenciales actividades farmacológicas, como puede ser por ejemplo la dolostatina 10 (31) o la hapalosina (32). Introducción 17 Figura 8. Ejemplos de γ-aminoácidos naturales y su presencia en péptidos con actividad biológica. De igual manera que para los β-aminoácidos, desde un punto de vista estructural podemos distinguir diferentes tipos de γ-aminoácidos en función del patrón de sustitución de sus carbonos α, β y γ, los más representativos aparecen recogidos en la Figura 9. Figura 9. Selección de tipos de γ-aminoácidos mono, di y trisustituídos. La inserción de un nuevo átomo de carbono en un β-aminoácido añade mucha mayor diversidad estructural a los γ-aminoácidos que para el caso de los β-aminoácidos. Esto, a su vez, añade una mayor diversidad de γ-aminoácidos cicloalcánicos, en función de la posición en la que se inserta este carbono con respecto a la estructura cíclica. Específicamente, en la Figura 10 se representan los tres tipos de γ-aminoácidos ciclohexánicos que resultan de la inserción de este átomo de carbono en -aminoácidos ciclohexánicos: inserción en el enlace C3-NH2 (Tipo I), o en el enlace C2-CO2H (Tipo II) o en el enlace C2-C3 (Tipo III). David Reza Ramos 18 Figura 10. Tipos de γ-aminoácidos ciclohexánicos. En esta tesis doctoral nos centraremos en los -aminoácidos ciclohexánicos del tipo I, los ácidos 2-(2-aminometil)ciclohexanocarboxílicos. La química de los γ-aminoácidos ha sido también ampliamente explorada, debido sobre todo al gran interés que suscita la síntesis de análogos del GABA.30,31 Sin embargo, se ha prestado mucha menos atención a la síntesis de γ-aminoácidos cicloalcánicos, a pesar de su potencialidad para la síntesis de peptidomiméticos. En esta tesis doctoral vamos a describir únicamente la síntesis de γ-aminoácidos ciclohexánicos sustituidos,32 dado nuestro interés en los γ-aminoácidos ciclohexánicos hidroxilados. Un ejemplo de ello es la síntesis de inositol-amino ácidos realizada por el profesor Lewis.33 Esta síntesis consiste en la oxidación del compuesto bicíclico 33 (obtenido en tres pasos a partir del ácido benzoico) para obtener 34, que al ser tratado con HCl (1M) da lugar al γ-aminoácido ciclohexánico tipo III 35 (Esquema 4). Esquema 4. Síntesis del γ-aminoácido ciclohexánico polihidroxilado tipo III 35. Recientemente en nuestro grupo de investigación ha desarrollado la síntesis eficiente de -aminoácidos ciclohexánicos trihidroxilados tipo I recogida en el Esquema 5, partiendo del éster 19 obtenido a partir del ácido (–)-shikímico. Una reacción de adición de Michael de nitrometano sobre el éster α,β-insaturado 19 da lugar a una mezcla de los compuestos 36a y 37a, los cuales se transformaron fácilmente en los -aminoácidos ciclohexánicos trihidroxilados 36b y 37b.34 Introducción 19 Esquema 5. Síntesis de γ-aminoácidos ciclohexánicos polihidroxilados 36b y 37b a partir del ácido (–)-shikímico. 1.4 PÉPTIDOS DE β-AMINOÁCIDOS Una de las principales aplicaciones de los β-aminoácidos es su incorporación en péptidos, para generar peptidomiméticos que mantengan las propiedades de plegado de los α-aminoácidos, pero con el valor añadido de una mayor diversidad estructural y de resistencia a la degradación por proteasas. Como hemos visto, la presencia de un átomo de carbono adicional aumenta de forma considerable la diversidad estructural de los β-aminoácidos con respecto a los α-aminoácidos, ya que aparece la posibilidad de generar regio- y estereoisómeros, además de una mayor sustitución. Se podría pensar que la presencia de un nuevo enlace carbono-carbono aumentaría la flexibilidad conformacional de β-aminoácidos y por lo tanto debería disminuir la capacidad de plegado de los -péptidos con respecto a los α-péptidos. Sin embargo, se ha descubierto que en la progresión desde los α- a los β-péptidos, la estabilidad de las hélices que forman aumenta a pesar de que disminuye el número de dadores y aceptores de hidrógeno por cadena, uno por cada tres átomos en los α-aminoácidos y uno cada cuatro átomos en los βaminoácidos. Esto se debe a que la correcta elección de los sustituyentes en las posiciones C2 y C3 en los β-aminoácidos puede favorecer conformaciones gauche que inducen la formación de hélices y giros o la conformación anti, que favorecen estructuras extendidas como las láminas (Figura 11).11 David Reza Ramos 20 Figura 11. Rotámeros de β-aminoácidos vistos a través del enlace C2-C3 en una proyección de Newman. Las conformaciones de los β-péptidos pueden ser analizadas a través de los ángulos de torsión ω, ϕ, θ y ψ (Figura 12), según la convención de Balaram.35 Los plegados en forma de hélices o giros requieren una conformación gauche en torno al enlace C2-C3. Los rotámeros con conformación anti dan lugar a conformaciones extendidas o de “random coil”. La influencia de la posición de los sustituyentes en las tendencias de plegado de β-péptidos ha sido ampliamente investigada, tanto experimental36–39 como teóricamente.40,41 Estos efectos de los sustituyentes están resumidos en la Figura 12. Figura 12. Efecto de las sustituciones en el ángulo de torsión θ. La β-alanina es el único β-aminoácido no sustituido y por tanto sin una preferencia energética por la conformación gauche, lo que la hace altamente flexible. La presencia de sustituyentes a las posiciones C2 (β2-aminácidos) y C3 (β3-aminácidos) favorece la conformación gauche en torno al enlace C2-C3 (ángulo θ).36 Mientras que los β-aminoácidos con dos cadenas laterales, una en la posición C2 y otra en el C3 (β2,3-aminoácidos) están conformacionalmente más restringidos y por tanto la conformación gauche es aún más estable que en el caso de los β2- y β3-aminoácidos, cuando la disposición de los sustituyentes es sin ((2R,3S)- o (2S,3R)-β2,3-aminoácidos). Cuando los sustituyentes en C2 y C3 están en disposición anti ((2S,3S)- o (2R,3R)- β2,3-aminoácidos), se favorece una conformación del rotámero antiperiplanar en torno al enlace C2-C3, lo que favorece la formación de estructuras tipo lámina.36,37,42 Introducción 27 Figura 22. Estructura química del α,β-heptapéptido 48, el cual se pliega como hélice-13 en metanol. Gellman y sus colaboradores prepararon α,β-péptidos utilizando residuos de ACHC y ACPC, cuyos homooligómeros habían demostrado una gran tendencia a plegarse en forma de hélices estables (Figura 14 y Figura 15, página 22).11 Estos autores prepararon hexámeros y octámeros que alternan residuos de (1S,2S)-ACPC o (1S,2S)-ACHC con residuos de L- o D-α-aminoácidos. Únicamente el α,β-hexapéptido 49, formado alternando (1S,2S)-ACPC y L-α-aminoácidos se pliega en metanol en una estructura secundaria estable (Figura 23). Los NOEs inter-residuo muestran la formación de enlaces de hidrógeno simultáneos entre los residuos i → (i+3) y los residuos i → (i+4).60 Esta estructura de NOEs es consecuente con una rápida interconversión entre las estructuras de hélice-11 y de hélice-14/15 en la escala de tiempos de RMN, de forma similar a la interconversión entre hélice-310 y hélices-α en los α-péptidos naturales.61 Figura 23. Estructura del α,β-hexapéptido 49, que se pliega en estructuras de hélice-11 y hélice-14/15 en rápida interconversión en metanol. Los profesores Sharma y Kunwar ampliaron la variedad de las estructuras secundarias de los α,β-péptidos 1:1, al reportar que el péptido 50 se pliega en una hélice mixta 9/11 (Figura 24). Esta hélice se caracteriza por estar estabilizada por dos tipos de enlaces de hidrógeno en direcciones opuestas, uno a 9 y otro a 11 átomos de distancia respectivamente.62 Figura 24. Estructura del α,β-péptido 50, que se pliega en forma de hélice-9/11 en disolución. Cabe resaltar que también han sido estudiados otros patrones de cadenas heterooligoméricas, además de las α/β 1:1. La descripción de cada una de ellas está fuera del David Reza Ramos 28 alcance de esta tesis. Sin embargo, dos ejemplos representativos son los heterooligómeros con patrones α/β 2:1 y 1:2, ya que se ha demostrado su tendencia a formar hélices estables también en secuencias peptídicas muy cortas. Tal es el caso de los péptidos 51 y 52, ambos capaces de plegarse en estructuras de hélice-11 en disolución (Figura 25).63 Figura 25. Ejemplos de α,β-péptidos con relación α:β 2:1 51 y 1:2 52, ambas capaces de plegarse como hélices-11 en disolución. Los resultados publicados hasta la fecha apuntan a que los oligómeros de α,β-péptidos tienen una gran tendencia a estabilizarse en estructuras secundarias helicoidales a través de enlaces de hidrógeno C=O···HN entre residuos i → (i+3) (hélice-11 y hélice-11/9) y entre los residuos i → (i+4) (hélice-14/15), independientemente de la relación α:β y su secuencia. Estos patrones de enlaces de hidrógeno son muy importantes, ya que son los presentes en la Naturaleza para las estructuras de hélice-310 y hélice-α, respectivamente.61 Lo cual convierte a los α,β-péptidos en moléculas con un gran potencial para simular las superficies estructurales de las proteínas y puede llevar al desarrollo de inhibidores de las interacciones proteína-proteína más eficientes. 1.6 PÉPTIDOS DE γ-AMINOÁCIDOS Los péptidos de γ-aminoácidos han suscitado un menor interés que los de los β-aminoácidos, a pesar de que la adición de un nuevo carbono amplía de forma considerable la variedad estructural. Este menor interés se debe probablemente a que la adición del nuevo enlace C3-C4 amplía la flexibilidad conformacional de su esqueleto carbonado que ahora tiene tres enlaces C-C y un enlace C-N con libertad de giro a través de sus correspondientes cuatro ángulos diedros: ϕ, θ1, θ2 y ψ (Figura 26). Introducción 29 Figura 26. Ángulos diedros de un γ-péptido. Sin embargo, en los últimos años se ha descrito que también los γ-péptidos son capaces de ordenarse en estructuras secundarias estables de hélices, giros y láminas, aunque para ello es necesaria la correcta elección del patrón de sustitución de sus carbonos C2, C3 y C4, como se verá a continuación.32 Para conocer los efectos del patrón de sustitución de los γ-aminoácidos en la estructura secundaria de los γ-péptidos, Hofmann realizó cálculos teóricos utilizando γ-péptidos no sustituidos y monosustituidos con el grupo metilo en las posiciones α, β y γ, utilizando la teoría de orbitales moleculares ab initio a varios niveles de aproximación.64,65 Estos cálculos mostraron que las estructuras de hélice-14 y hélice-9 son las más estables en γ-péptidos. También mostraron que eran posibles hélices mixtas, de las cuales las más estables son la hélice-24/22 y la hélice-14/12, en las que la dirección de enlaces de hidrógeno se orienta en direcciones opuestas (Figura 27). Figura 27. Estructura de enlaces de hidrógeno para una hélice-14 (verde) o hélice-9 (rojo) y una hélice mixta 14/12 (azul) o 24/22 (naranja). Estos estudios teóricos se han visto corroborados por publicaciones posteriores. Así, la hélice-9 calculada por Hofmann ha sido reportada en la bibliografía por varios grupos de investigación. Un ejemplo de ello es el γ-péptido monosustituidos 53,62 que incorpora un γ-aminoácido derivado de D-glucosa y que presenta una estructura de hélice-9. Así mismo, Balaram reportó varios péptidos que incorporan el residuo aquiral de gabapentina (55) como el tetrámero 54,66 que también se pliega adoptando una estructura de hélice-9 en disolución (Figura 28). David Reza Ramos 30 Figura 28. Ejemplos de γ-péptidos con estructura de hélice-9 (53 y 54). A la derecha estructura de la gabapentina (55). También se ha demostrado que los γ4-péptidos monosustituidos en la posición C4 tienen una gran tendencia a formar hélices-14, debido a que solo cinco de las nueve conformaciones posibles generadas al rotar los enlaces C2-C3 y C3-C4 están permitidas, dando lugar el resto a interacciones sin-pentano desfavorables. Gellman y Hanessian reportaron simultáneamente que el γ4-hexapéptido 56 es capaz de formar hélices estables en disolución.36,67 Éste se estructura en forma de hélice-14, estabilizada por la formación de enlaces de hidrógeno entre el grupo C=O del residuo i y el N-H del residuo (i+3) (Figura 29). Por otro lado, los γ2- y γ3- péptidos monosustituidos no dan lugar a estructuras secundarias estables como demostró Seebach para los péptidos 57 y 58 (Figura 29).68 Figura 29. γ4-péptido 56 que da lugar a una estructura de hélice-14 y γ2-péptido 57 y γ3-péptido 58 que no dan lugar a ninguna estructura secundaria. Flecha azul señala los enlaces de Hidrógeno C=O···H-N característicos de una hélice-14 (i → (i+3)). Las preferencias conformacionales de los γ2,4-péptidos se deben principalmente a que la mayoría de las conformaciones están desfavorecidas por interacciones sin-pentano que surgen en los diferentes rotámeros al girar los enlaces C2-C3 y C3-C4. Así, para diseñar γ-péptidos capaces de plegarse en estructuras estables es necesario minimizar el número de conformaciones en las que no se produzcan interacciones sin-pentano, para que haya el menor número de conformaciones estables en competencia y que estas conformaciones estables sean promotoras de estructuras secundarias. De hecho, está comprobado que este efecto juega un papel fundamental en la fijación de la estructura secundaria de productos naturales que contienen γ-aminoácidos, como es el caso de la bleomicina A2.10 Introducción 31 Figura 30. Conformaciones libres de interacción sin-pentano para γ2,4-péptidos. La tendencia a estabilizar estructuras secundarias es mayor para los γ2,4-péptidos, en los que solo dos de las nueve conformaciones están libres de interacciones cis-pentano. Si la disposición relativa de los sustituyentes es like, una de las dos conformaciones posibles promueve su estructuración como hélice-14 y la otra como lámina. Mientras que, si la disposición relativa es unlike, ambas conformaciones promueven un plegamiento en forma de giro (Figura 30).69–71 Reiser y sus colaboradores demostraron esto para el caso del tripéptido 59 de la Figura 31, en el que la disposición like de sus sustituyentes da lugar a una hélice-14. Mientras que el dipéptido 60, con disposición unlike de sus sustituyentes, se estructura en forma de giro peptídico (Figura 31).58,72 El γ2,3,4-péptido 61 con una misma configuración relativa de las posiciones C2 y C4 que el γ2,4-péptido 59 también ha sido estudiado y se pliega como hélice-14 en disolución, lo cual evidencia que la adición de una sustitución adicional no provoca suficientes impedimentos estéricos para desestabilizar la estructura helicoidal de estos péptidos.68,73 Figura 31. γ2,4-péptido 59 que da lugar a una estructura de hélice-14, γ2,4-péptido 60 que da lugar a una estructura de giro peptídico y γ2,3,4-péptido 61 que da lugar a una estructura de hélice-14. Las conformaciones de giros peptídicos inducidos por γ-péptidos son muy similares a los giros-β tipo II’ de los α-péptidos naturales, lo que sugiere que fragmentos cortos de γ-péptidos con la correcta sustitución podrían dar lugar a peptidomiméticos muy útiles para el diseño de fármacos. David Reza Ramos 32 Los γ-péptidos también pueden generar oligómeros con estructura secundaria tipo lámina-β. Esto fue confirmado a través de la síntesis del oligómero 62 (formado por ácidos trans- y cis-2-amnometilciclopropanocarboxílicos),74 que da lugar a una estructura tipo lámina-β paralela en estado sólido (Figura 32). Estudios posteriores mostraron que la unión de estos oligómeros a moléculas inductoras de giros-β da lugar a horquillas muy estables en disolución, como es el caso del compuestos 63.75 Figura 32. Oligómeros de ácidos trans- y cis-2-aminometilciclopropanocarboxílicos con estructura tipo lámina-β 62 y horquilla 63. 1.7 HETEROOLIGÓMEROS DE γ-AMINOÁCIDOS: α,γ-PÉPTIDOS La combinación de α- y γ-aminoácidos también aumenta considerablemente las posibilidades estructurales de estos péptidos. Gellman demostró que la incorporación de un γ-aminoácido ciclohexánico, conformacionalmente restringido, junto a α-aminoácidos para generar los tetra- y hexapéptidos 64 y 65 da lugar a estructuras que se pliegan como hélices- 12 en disolución (Figura 33). En ambos casos se formaron el máximo número posible de enlaces de hidrógeno entre el C=O del residuo i y el N-H del residuo (i+3).76 Figura 33. Estructura química del tetrapéptido 64 y el hexapéptido 65, que se pliegan como hélice-12 en disolución. Los heterooligómeros de α,γ-aminoácidos también pueden dar lugar a estructuras de horquillas, en los que el γ-aminoácido puede formar parte da la lámina o ser el inductor del giro. Un ejemplo del primer caso es el α,α,α,α,γ,α,α,α-octapéptido de Boc-Leu-Phe-Val-Aib- Introducción 33 Gpn-Leu-Phe-Val-OMe 66, que mostró en estudios cristalográficos que se pliega como una horquilla altamente estabilizada por enlaces de hidrógeno entre los dos segmentos del α-tripéptido Leu-Phe-Va (Figura 34). En este caso el dipéptido Aib-Gpn (resaltado en azul) actúa como inductor del giro a través de un enlace de hidrógeno a 12 átomos.77 Figura 34. Estructura de horquilla inducida por el α,γ-dímero Aib-Gpn 66 y de horquilla formada por el péptido 67. Un ejemplo del segundo caso fue publicado por Balaram, quien demostró que el péptido Boc-Leu-Val-γAbu-Val-DPro-Gly-Leu-γAbu-Val-Val-OMe 67 forma horquillas en las que los γ-aminoácidos no son los inductores del giro, sino que estabilizan la estructura de láminaβ, mientras que el giro es inducido por el dímero DPro-Gly (Figura 34).78 2 OBJETIVOS Y PLAN DE TRABAJO Objetivos y plan de trabajo 43 Figura 40. Estructura de los γ-aminoácido trihidroxilado derivados del ácido (–)-shikímico 36a y 37a y de los tres α,α,γ,γ,α,α-hexapéptidos 81a, 81b y 81c, que lo incorporan, con diferente grado de protección de sus hidroxilos. La propuesta se plantea con objeto de: - Estudiar desde el punto de vista sintético si las predicciones teóricas del Prof. Kang son correctas y, por tanto, confirmar que sus métodos computacionales tienen capacidad predictiva. - Comprobar cómo afecta el grado de desprotección de los grupos OH de nuestros péptidos modelo a su plegamiento como giros peptídicos, dada la importancia que tendría disponer de motivos peptídicos capaces de generar giros modulables en su polaridad y en su interacción con los receptores naturales. Proponemos como plan de trabajo de este tercer llevar a cabo la síntesis de estos tres péptidos 81a-c siguiendo para ello el protocolo descrito en el Esquema 8, en el que se plantean las siguientes operaciones: 1. Acoplamiento del dímero H2NAlaAla 78b con el trans-γ-nitroácido derivado del ácido (–)-shikímico 37d (trans-γ-Shi) para formar el enlace estratégico “a” del tripéptido 79a. 2. Acoplamiento del tripéptido 79b con el cis-γ-nitro ácido derivado del ácido (–)-shikímico 36d (cis-γ-Shi) para dar lugar al enlace estratégico “b” del tetrapéptido 80a. David Reza Ramos 44 3. Acoplamiento del dímero AcN-AlaAla-OPFF 78d con el tetrapéptido 80b para dar lugar al enlace estratégico “c” del hexapéptido 81a. 4. Desprotección selectiva de los grupos OH (protegidos como éter de silicio) del hexapéptido 81a, para dar lugar al hexapéptido dihidroxilado 81b. 5. Desprotección de los grupos OH protegidos como acetónido del hexapéptido del péptido 81b, para generar el hexapéptido polihidroxilado 81c. Esquema 8. Análisis retrosintético de los compuestos 81a, 81b y 81c. De forma similar a los dos apartados anteriores, una vez sintetizados los tres hexapéptidos objetivo 81a, 81b y 81c llevaremos a cabo estudios estructurales de FTIR, CD y RMN mono y bidimensional, así como estudios tóricos, para determinar su plegamiento en disolución. Objetivos y plan de trabajo 45 2.2 SÍNTESIS, ESTUDIO ESTRUCTURAL Y DE GELIFICACIÓN DE N-ALQUILAMIDAS DERIVADAS DEL ÁCIDO 2-AMINOCICLOHEXANOCARBOXÍLICO Y DEL ÁCIDO (–)-SHIKÍMICO El diseño de nuevos agentes gelificantes moleculares (LMWGs), con propiedades mejoradas o nuevas con respecto a los ya existentes ha sido un tema de investigación al que se ha dedicado un gran esfuerzo científico en los últimos años, como ya comentamos en la introducción de este apartado de la Tesis Doctoral. Dentro de este campo de investigación, los LMWGs constituidos por anillos ciclohexánicos 1,2-disustituidos han recibido una especial atención. De ellos, las dialquilamidas derivadas de 1,2-diaminociclohexanos resultaron ser excelentes agentes gelificantes, mientras que las dialquilamidas derivadas de ácidos 1,2-ciclohexanodi- carboxílicos mostraron unas propiedades gelificantes mucho más moderadas, como se expuso previamente. Sorprendentemente, las alquilamidas derivadas de ácidos 2-aminociclohexanocarbo- xíloicos (-aminoácidos ciclohexánicos o ACHC) no han recibido prácticamente atención hasta la fecha, a pesar de que: - deberían presentar buenas propiedades gelificantes. - presentan más versatilidad sintética. - sus agregados podrían tener propiedades más parecidas a los polímeros naturales y/o mayor biocompatibilidad. Es por ello por lo que en esta segunda parte de esta tesis doctoral nos planteamos como objetivo general el estudio de nuevos LMWGs basados en -aminoácidos ciclohexánicos (ACHC) concretamente de N-alquilamidas derivadas éstos. Este objetivo general se concreta en los dos siguientes objetivos específicos: 2.2.1 Objetivo específico nº 4: Teniendo en cuenta que los -aminoácidos ciclohexánicos (ACHC) no sustituidos son comerciales en todas sus estereoquímicas y que la capacidad gelificante de líquidos aquirales no varía entre dos moléculas enantioméricas, decidimos iniciar nuestro estudio con la N-octil- y N-hexadecilamida 125 y 126, derivadas del ácido (1S,2R)-2-((terc-butoxicarbonil)amino) ciclohexano-1-carboxílico (71b) y la N-butil-, N-octil- y N-hexadecilamida 127, (1R,2R)-128 y (1R,2R)-129, derivadas del ácido (1R,2R)-2-((terc-butoxicarbonil)amino)ciclohexano-1- carboxílico ((1R,2R)-40b) (Figura 41). Figura 41. Estructura química de las cis-alquilamidas 125-126 derivadas del β-aminoácido 71b y las trans-alquilamidas 127-129 derivadas del β-aminoácido (1R,2R)-40b. David Reza Ramos 46 Pretendemos con ello conocer la capacidad gelificante que pueden mostrar este tipo de estructuras anfifílicas derivadas de los ACHC en función de sus dos variables más importantes: - la longitud de su cadena alquílica. - la estereoquímica relativa de los sustituyentes de su anillo ciclohexánico. En el caso de que estas estructuras presenten propiedades gelificantes importantes en su forma enantioméricamente pura, estudiaremos también las propiedades gelificantes de sus mezclas racémicas por la importancia que su mayor accesibilidad sintética puede tener para sus posibles aplicaciones. El plan de trabajo que se propone para este objetivo incluye: - La síntesis y estudio de gelificación de la N-octilamida 125 y la N-hexadecilamida 126 del ácido (1S,2R)-2-((terc-butoxicarbonil)amino)ciclohexano-1-carboxílico (71b), por reacción de amidación de éste con n-octilamina y N-hexadecilamina respectivamente, todos ellos productos comerciales (Esquema 9). - La síntesis y estudio de gelificación de la N-butilamida 127, N-octilamida (1R,2R)-128 y la N-hexadecilamida (1R,2R)-129 del ácido (1S,2R)-2-((terc-butoxicarbonil)amino)ciclohexano-1-carboxílico ((1R,2R)-40b), por reacción de amidación de éste con n-butilamina, n-octilamina y N-hexadecilamina respectivamente, todos ellos también productos comerciales (Esquema 9). Esquema 9. Plan de trabajo para la síntesis de las N-octil- y N-hexadecilamidas 125, 126, 127, (1R,2R)-128 y (1R,2R)-129 de los cis-ACHC 71b y trans-ACHC (1R,2R)-40b. - La síntesis y estudio de gelificación de la mezcla racémica de la N-octilamida (1R,2R)-128 y (1S,2S)-128 (rac-128) y de la N-hexadecilamida (1R,2R)-129 y (1S,2S)-129 (rac-129), obtenidas a partir del ácido racémico trans-2-((tercbutoxicarbonil)amino)ciclohexano-1-carboxílico (rac-40b), por reacción de amidación de éste con la n-octilamina y la n-hexadecilamina comerciales respectivamente (Esquema 10). Objetivos y plan de trabajo 47 Esquema 10. Plan de trabajo para la síntesis de los racematos de N-octil- y N-hexadecilamidas rac-128 y rac-129 del rac-40b. - Estudio estructural de los agregados formados por aquellas N-alquilamidas sintetizadas que muestren buenas propiedades organogelantes, utilizando para ello un conjunto de técnicas espectroscópicas (IR, CD), microscópicas (SEM, AFM) y de difracción de Rayos X. - Para aquellas N-alquilamidas que resulten ser buenos agentes gelificantes de disolventes apolares, especialmente alcanos, estudiaremos también su aplicación en la gelificación de aceites industriales y/o petróleo. 2.2.2 Objetivo específico nº 5: Dado que nuestro grupo de investigación llevó a cabo una síntesis eficiente de los -aminoácidos ciclohexánicos trihidroxilados 21a y 22a a partir del ácido (–)-shikímico comercial (página 15), nos planteamos como siguiente objetivo de esta esta tesis doctoral la síntesis y el estudio de la capacidad gelificante de sus N-octil- y N-hexadecilamidas 131-142 (Esquema 11). Estas N-alquilamidas, que mantienen las características estructurales de las alquilamidas del apartado anterior (cadenas alquílicas y estereoquímica de sus grupos -aminoácido), difieren sin embargo de ellas por la presencia en sus anillos ciclohexánicos de sustituyentes hidroxilo. Este cambio no sólo modifica radicalmente su polaridad y por lo tanto sus características de solubilidad cuando los grupos hidroxilo estén libres, sino que permiten modular esta polaridad en función del grado de protección o desprotección de estos grupos, dando lugar así a N-alquilamidas con polaridad intermedia. Pretendemos con ello estudiar la capacidad de estas nuevas alquilamidas para gelificar disolventes polares, especialmente agua, lo que debería conducir a nuevos agentes hidrogelantes. El plan de trabajo que proponemos para este objetivo es el siguiente: - La síntesis y estudio de gelificación de las N-octilamidas 131 y 133 la N-hexadecilamidas 132 y 134 con sus grupos hidroxilo totalmente protegidos, por amidación con la n-octilamina y la n-hexadecilamina comerciales con los β-aminoácidos 21f y 22f sintetizados previamente en nuestro grupo de investigación, para estudiar luego sus propiedades de gelificación (Esquema 11). - Transformación de las N-alquilamidas 131-134 en las alquilamidas 135-138, con un solo grupo hidroxilo libre, por desprotección selectiva de su grupo éter de silicio, para estudiar luego sus propiedades de gelificación. David Reza Ramos 48 - Transformación de las alquilamidas 135-138 en las alquilamidas 139-142, con todos sus grupos hidroxilo libres, por desprotección de su grupo acetónido, para estudiar luego sus propiedades de gelificación. Esquema 11. Plan de trabajo para la síntesis de las N-octil- y N-hexadecilamidas derivadas del ácido (–)-shikímico (131-142). - Para aquellas alquilamidas que resulten ser buenos agentes gelificantes de disolventes polares, especialmente agua, estudiaremos también su aplicación para la encapsulación de sustancias apolares y su posterior liberación en medios polares; concretamente se estudiará el caso del agente antiinflamatorio naproxeno. 3 DISCUSIÓN DE RESULTADOS Discusión de resultados 51 3.1 β-PÉPTIDOS DE ÁCIDOS 2-AMINOCICLOHEXANOCARBOXÍLICOS 3.1.1 Síntesis de los pentapéptidos 70a, 70b y 70c De acuerdo con el plan de trabajo establecido, se comenzó la síntesis de los oligómeros de β-aminoácidos ciclohexánicos 70a, 70b y 70c llevando a cabo un acoplamiento peptídico entre el ácido 68b, obtenido de acuerdo con la bibliografía,83 y la amina 22b, preparada con anterioridad en nuestro grupo de investigación84 (Esquema 12). Para ello se usó EDCI·HCl como agente acoplante y DMAP como base lo que condujo al tripéptido 69a con un 93 % de rendimiento. La obtención de este compuesto fue corroborada gracias a sus propiedades espectroscópicas y espectrométricas. Su espectro de RMN-1H muestra tres señales a 5.83, 6.13 y 7.01 ppm, correspondientes a los tres grupos NH de la molécula. Además, destacan un singlete a 1.40 ppm, correspondiente al grupo protector Boc de su extremo N-terminal, así como un singlete a 3.59 ppm, correspondiente al grupo éster metílico de su extremo C-terminal. En su espectro de RMN-13C aparecen las señales de sus cuatro grupos carbonilo, a 156.18 (C=O, carbamato), 173.26 (2xC=O, amida) y 174.99 (C=O, éster). Su espectro de masas de alta resolución muestra una señal con una relación m/z = 710.4406 (m/z teórico = 710.4405) correspondiente al ion [M+H]+. Por último, en su espectro de IR se observa las bandas de sus grupos carbonilo a 1679.77 y 1736.29 cm-1 y una banda ancha a 3327.38 cm-1, debida a sus grupos NH. Esquema 12. Síntesis del tripéptido 69a. Para llevar a cabo el siguiente acoplamiento peptídico previsto en nuestro plan de trabajo, procediendo como se indica en el Esquema 13, primero se desprotegió el extremo C-terminal del tripéptido 69a, usando LiOH en una mezcla THF/MeOH/H2O (2:1:1), lo que dio lugar al ácido 69b con un 92 % de rendimiento. A continuación, se acopló este ácido con la amina 68c, obtenida de acuerdo con la bibliografía,83 usando EDCI·HCl como agente acoplante y DMAP como base, obteniendo así el pentapéptido objetivo 70a con un 45 % de rendimiento. En su espectro de RMN-1H destacan dos singletes a 0.03 y 0.04 ppm, que integran por tres protones cada uno, que corresponden a los dos grupos CH3 unidos al Si del TBS, así como un singlete a 0.08 ppm, que integra por nueve y que corresponde al grupo terc-butilo unido al Si. Aparecen, además, un singlete a 1.35 ppm correspondiente al grupo terc-butilo del grupo protector Boc de su extremo N-terminal, un quartete ABq a 5.12 ppm (2JCH = 12.5 Hz) correspondiente al CH2 del Cbz y las señales a 6.77, 6.83, 7.40, 7.49 y 7.82 ppm; debidas a sus cinco protones de los grupos NH de amida. Su espectro de masas de alta resolución muestra una señal con relación m/z = 1058.6220 [M+Na]+ (valor teórico m/z = 1058.6218), lo que confirmó la fórmula molecular C56H89N5O11Si del compuesto. Por último, su espectro de IR muestra una banda a 1644.93 cm-1 correspondientes a sus carbonilos de amida, una banda a David Reza Ramos 52 1721.22 cm-1 correspondiente a su carbonilo de éster y una banda ancha a 3281.07 cm-1 correspondiente a sus grupos NH. Esquema 13. Síntesis del pentapéptido 70a. Finalmente, los grupos OH del pentapéptido 70a fueron desprotegidos secuencialmente, como se indica en el Esquema 14. Primero, usando TBAF en THF seco, para dar 70b con un único OH libre, con un 76 % de rendimiento. La estructura de este pentapéptido fue confirmada a partir de su espectro de RMN-1H por la ausencia de las señales características del grupo protector TBS (señales a 0.03, 0.04 y 0.08 ppm en el espectro de RMN-1H de su precursor 70a), así como por la presencia de una señal a 1.35 ppm correspondientes a los metilos de su grupo protector Boc, una señal a 5.28 (2JCH = 12.8 Hz) del sistema ABq correspondiente al CH2 del grupo protector Cbz de su extremos C-terminal y las señales a 6.72, 6.92, 7.49, 7.53 y 7.91 ppm correspondientes a los protones de sus grupos NH de amida. Además, su espectro de masas de alta resolución muestra una señal con una relación m/z = 944.5355 [M+Na]+ (valor teórico m/z = 944.5359), que confirma su fórmula molecular C50H75N5O11. Su espectro de IR muestra una banda a 1649.42 cm-1 correspondiente a sus carbonilos de amida, una señal a 1721.09 cm-1 correspondiente a su carbonilo de éster y una señal ancha a 3369.60 cm-1 correspondientes a los grupos NH de amida. Esquema 14. Desprotección secuencial del pentapéptido 70a para dar lugar a los pentapéptidos 70b y 70c. Discusión de resultados 59 Figura 48. RMN-1H del péptido 70b, 2 mM en DMSO-d6 (500 MHz). El pentámero 70b presenta un patrón muy similar a 70a en sus NH de amida. En su espectro de RMN-1H se observa un único conjunto de señales y una buena dispersión de éstas, lo que indica una alta población de una única estructura secundaria en disolución (Figura 48). Además, se puede observar la señal de protón de OH a campo bajo (5.20 ppm), por lo que podría estar participando en la formación de un enlace de hidrógeno. Esto concuerda con los datos de FTIR y CD. David Reza Ramos 60 Figura 49. RMN-1H del péptido 70c, 1.8 mM en DMSO-d6 (500 MHz). Finalmente, en el espectro RMN-1H del pentapéptido 70c, con los tres grupos hidroxilo libres (Figura 49), se observa también una buena dispersión de los NH de amida que además salen a campo bajo. Este resultado también es compatible con los datos de IR y CD y nos confirma que los tres pentapéptidos presentan una alta población de una única estructura secundaria en DMSO-d6. A la vista de los resultados obtenidos se decidió estudiar en mayor profundidad la estructura secundaria de los tres pentapéptidos. Para ello se asignaron las señales del espectro de RMN-1H, utilizando un conjunto de experimentos de RMN bidimensional (TOCSY, COSY y ROESY). Una vez asignadas las señales, un estudio de coeficientes de temperatura y un estudio de NOE nos permitieron determinar el tipo de plegamiento secundario adoptado por cada pentapéptido. El resultado de este estudio se presenta de manera individual para cada uno de los pentapéptidos 70a-c en los siguientes tres apartados. Discusión de resultados 61 3.1.2.3.1 Estudio de RMN del pentapéptido 70a Figura 50. Pentapéptido 70a con los residuos numerados del 1-5 desde el extremo N-terminal al C-terminal (izquierda). Nomenclatura para los protones utilizada para la asignación (derecha). En primer lugar, se asignaron las señales de NH, Hα y Hβ utilizando una combinación de COSY, TOCSY y ROESY, que aparecen recogidas en la Tabla 3. residuo HN Hβ Hα otros tBu — — — 1.35 1 6.77 3.45 2.27 0.98, 1.01, 1.11, 1.20, 1.31, 1.34, 1.43, 1.65, 1.86 2 7.49 3.67 2.35 1.07, 1.10, 1.12, 1.14, 1.21, 1.30, 1.64, 1.67, 1.77, 1.80 3 6.83 4.02 2.34 0.03 (Si-CH3), 0.04 (Si-CH3), 0.08 (Si-tBu), 1.20 (CH3), 1.48 (CH3), 1.57 y 1.89 (Hζ*), 3.83-3.87 (Hγ, Hδ, Hε) 4 7.40 3.87 2.18 1.10, 1.12, 1.16, 1.30, 1.71, 1.76, 1.78 5 7.82 3.93 2.52 1.19, 1.21, 1.23, 1.68, 1.72, 1.79, 1.88, 1.98 -O-CH2-Ph — — — 4.98 y 5.26 (CH2), 7.32-7.39 (Ph) Tabla 3. Asignaciones del péptido 70a en DMSO-d6 (T = 298 K). El espectro fue referenciado a la resonancia del TMS (δ = 0.00 ppm). Una vez asignadas las señales se realizó un estudio de coeficientes de temperatura y de ROESY para determinar la estructura secundaria de este pentapéptido 70a. • Coeficientes de temperatura (T-coef) del pentapéptido 70a. Uno de los indicadores más ampliamente utilizados para determinar la formación de enlaces de hidrógeno en péptidos son los coeficientes de temperatura de amida (T-coef: Δδ/ΔT). Éstos son los cambios producidos en el desplazamiento químico de los protones NH de amida al cambiar la temperatura y se miden en ppb·K-1.14,88 Al realizar este experimento se suelen distinguir dos clases de situaciones en función del resultado: a) NH de amida expuestos, que son aquellos con un T-coef más negativo que -4 ppb·K-1 y b) NH de amida secuestrados, que son aquellos con un T-coef más positivo que -4 ppb·K-1.89,89,90 El estudio del compuesto 70a se llevó a cabo en DMSO-d6 a c = 1.5 mM y en un rango de temperaturas desde 25 a 65 ºC, tomando una medida cada intervalo de 10 ºC (Figura 51). David Reza Ramos 62 Figura 51. Espectro de RMN-TV del pentapéptido 70a en DMSO-d6 (500 MHz). Temperaturas, de abajo hacia arriba, desde 25 hasta 65 ºC en intervalos de 10 ºC. Los datos obtenidos de estos experimentos junto con los T-coef de NH de amida calculados para el compuesto 70a aparecen recogidos en la Tabla 4. Solo el NH3 (-1.0) tiene un T-coef más positivo que -4 ppb·K-1 lo que evidencia que está formando un enlace de hidrógeno. Tanto NH2 (-5.8) como NH5 (-5.3) podrían estar secuestrados parcialmente ya que tienen valores cercanos a -4 ppb·K-1, mientras que tanto NH1 (-7.3) como NH4 (-9.3) parecen estar expuestos al disolvente, ya que poseen valores muy negativos de T-coef (Figura 52). HN δmax (65 ºC) / ppm δmin (25 ºC) / ppm Rango T / K T-coef / ppb·K-1 H1 6.48 6.77 40 -7.3 H2 7.26 7.49 40 -5.8 H3 6.79 6.83 40 -1.0 H4 7.04 7.41 40 -9.3 H5 7.61 7.82 40 -5.3 Tabla 4. Coeficientes de temperatura del compuesto 70a. Discusión de resultados 63 Figura 52. Valores de los T-coef de los NH del compuesto 70a. • Estudio de ROESY del pentapéptido 70a Para estudiar la estructura secundaria de nuestros pentapéptidos realizamos un estudio de ROESY, que nos permita determinar los contactos NOE a larga distancia (Figura 53). Los contactos relevantes para este trabajo son aquellos contactos típicos de una hélice-14: un NOE fuerte a larga distancia entre Hα (i)/Hβ (i+3) junto con el NOE entre Hα (i)/HN (i+1), que corresponderían a distancias de ≈ 2.6 Å en una hélice-14.45,91 También se podrían observar picos de cruce entre HN (i)/Hβ (i+2) y HN (i)/Hβ (i+3), que serían de intensidad media y corresponderían a distancias de 3.0-3.5 Å. (Para más información consultar las tablas de la parte experimental). El estudio de ROESY del pentapéptido 70a se llevó a cabo en DMSO-d6, a 1.5 mM y 25 ºC. Una ampliación del espectro de ROESY se muestra en la Figura 54. En esta se pueden ver varios de los NOE característicos de una hélice-14: • Hα (i)/Hβ (i+3): Señal fuerte entre Hα1/Hβ4 y Hα2/Hβ5. • Hα (i)/HN (i+1): Señal fuerte entre Hα1/HN2, Hα3/HN4 y Hα4/HN5. • HN (i)/Hβ (i+3): Señal media entre HN1/Hβ4 y HN2/Hβ5. • HN (i)/Hβ (i-1): Señal débil entre HN2/Hβ1 y HN4/Hβ3. Figura 53. NOEs del compuesto 70a típicos de una hélice-14. David Reza Ramos 64 Figura 54. Superposición del espectro de ROESY (rojo/azul, tmix 120 ms) y de TOCSY (negro, tmix 70 ms) del péptido 70a (DMSO-d6, 500 MHz, 298 K). Expansión de la región i) (Hα+Hβ)/HN y ii) Hα/Hβ. De las señales expuestas en la Figura 54 son especialmente relevantes los contactos entre Hα1/Hβ4 y HN1/Hβ4 que indican la proximidad en el espacio de los residuos 1 y 4. Además, los contactos Hα2/Hβ5 y HN2/Hβ5 indican la proximidad en el espacio de los residuos 2 y 5 (a 3 residuos de distancia). Estos datos, junto con los ya aportados de IR y CD, confirman que nuestro pentapéptido 70a se estructura en dilución de DMSO-d6 como una hélice-14. 3.1.2.3.2 Estudio de RMN del pentapéptido 70b Figura 55. Pentapéptido 70b con los residuos numerados del 1-5 desde el extremo N-terminal al C-terminal (izquierda). Nomenclatura para los protones utilizada para la asignación (derecha). Siguiendo la misma metodología que la usada para estudiar el pentapéptido70a, primero se asignaron las señales de NH, Hα y Hβ del péptido 70b utilizando una combinación de COSY, TOCSY y ROESY. Estos datos están recogidos en la Tabla 5. Discusión de resultados 65 residuos HN Hβ Hα Otros tBu — — — 1.35 1 6.92 3.44 2.35 0.99, 1.32, 1.66, 1.91 2 7.49 3.70 2.36 1.09, 1.27, 1.65, 1.76 3 6.72 4.05 2.44 1.21 (CH3), 1.52 (CH3), 1.63 and 1.83 (Hζ*), 3.77 (Hγ), 3.96 (Hδ), 4.02 (Hε), 5.20 (HO-ε) 4 7.53 3.87 2.13 1.12, 1.26, 1.79 5 7.91 3.95 2.54 1.17, 1.24, 1.80 -O-CH2-Ph — — — 5.09 y 5.28 (CH2), 7.29-7.44 (Ph) Tabla 5. Asignaciones del péptido 70b en DMSO-d6 (T = 298 K). El espectro fue referenciado a la resonancia del TMS (δ = 0.00 ppm). También para la determinación de la estructura secundaria del péptido 70b se realizó un estudio de coeficientes de temperatura y de ROESY, de forma similar al caso anterior. • Coeficientes de Temperatura (T-coef) del pentapéptido 70b El estudio de RMN de temperatura variable del compuesto 70b se llevó a cabo en DMSO-d6 a c = 2 mM, tomando un espectro de RMN-1H cada 10 ºC desde 25 hasta 85 ºC. Los espectros obtenidos pueden verse en la Figura 56 y los coeficientes de temperatura en la Tabla 6. Figura 56. Espectro de RMN-TV del pentapéptido 70b en DMSO-d6 (500 MHz). Temperaturas, de abajo hacia arriba, desde 25 hasta 85 ºC en pasos de 10 ºC. David Reza Ramos 66 HN δmax (85 ºC) / ppm δmin (25 ºC) / ppm Rango T / K T coef / ppb·K-1 H1 6.47 6.93 60 -7.7 H2 7.20 7.49 60 -4.8 H3 6.61 6.71 60 -1.7 H4 6.98 7.53 60 -9.2 H5 7.58 7.91 60 -5.5 Tabla 6. Coeficientes de temperatura del compuesto 70b. Como puede observarse, NH2 (-4.8) y NH3 (-1.7) presentan los valores de T-coef menos negativos, lo que indica que deberían estar formando enlaces de hidrógeno. Por otro lado, tanto NH4 (-9.2) como NH5 (-5.5) son los que presentan valores de T-coef más negativos, por lo que deberían estar expuestos al disolvente. Aunque NH1 (-7.7) debería estar formando parte de un enlace de hidrógeno, este está situado en un residuo terminal por lo que está más expuesto al disolvente, lo que explica el valor tan negativo de su T-coef. Estos resultados obtenidos para el pentapéptido 70b son también los esperables para una estructuración de este, en disolución de DMSO, como una hélice-14. Figura 57. Valores de los T-coef de los NH del compuesto 70b. • Estudio de ROESY del pentapéptido 70b Se llevó a cabo también un estudio de ROESY del compuesto 70b en DMSO-d6, a 2 mM y 25 ºC. En la Figura 59 se muestran ampliaciones de las regiones (Hα+Hβ)/HN y Hα/Hβ. Aparecen destacadas las interacciones NOE características de una hélice-14 (Figura 57), las cuales son: • Hα (i)/Hβ (i+3): Señal fuerte entre Hα1/Hβ4 y Hα2/Hβ5. • Hα (i)/HN (i+1): Señal fuerte entre Hα2/HN3, Hα3/HN4 y Hα4/HN5. • HN (i)/Hβ (i+3): Señal media entre HN1/Hβ4. • HN (i)/Hβ (i-1): Señal débil HN2/Hβ1. Discusión de resultados 67 Figura 58. NOEs del compuesto 70b típicos de una hélice-14. Figura 59. Superposición del espectro de ROESY (rojo/azul, tmix 200 ms) y de TOCSY (negro, tmix 70 ms) del péptido 70b (DMSO-d6, 500 MHz, 298 K). Expansión de la región i) (Hα+Hβ)/HN y ii) Hα/Hβ. De estas señales son especialmente relevantes los contactos entre Hα1/Hβ4 y HN1/Hβ4 que indican la proximidad en el espacio entre los residuos 1 y 4, así como el contacto Hα2/Hβ5 que indican la proximidad en el espacio de los residuos 2 y 5. Todos ellos son compatibles con una estructuración de hélice-14, con tres residuos por vuelta. Estos datos son compatibles con los datos de T-coef de protón de amida: a) del HN3 (-1.7), que indica que está formando un enlace de hidrógeno fuerte juntando así los residuos 2 y 5. b) del HN2 (- 4.8), que indica que está formando un enlace de hidrógeno estable y por tanto acerca los residuos 1 y 4 (Figura 60). David Reza Ramos 68 Figura 60. Plegamiento en disolución del compuesto 70b. Todos los datos indican de manera inequívoca que el pentapéptido 70b se pliega en disolución de DMSO-d6 como una hélice-14. 3.1.2.3.3 Estudio de RMN del pentapéptido 70c Figura 61. Pentapéptido 70c con los residuos numerados del 1-5 desde el extremo N-terminal al C-terminal (izquierda). Nomenclatura para los protones utilizada para la asignación (derecha). En último lugar se estudió la estructura secundaria del pentapéptido 70c. Para ello en primer lugar se asignaron las señales de NH, Hα y Hβ, utilizando una combinación de COSY TOCSY y ROESY. Éstas están recogidas en la Tabla 7. residuos HN Hβ Hα otros tBu — — — 1.35 1 6.80 3.46 2.44 1.06, 1.19, 1.32, 1.67, 1.86 2 7.49 3.62 2.41 1.03, 1.08, 1.24, 1.38, 1.62, 1.85 3 6.89 4.19 2.54 1.47 and 1.88 (2xHζ), 3.56 (Hγ), 3.60 (Hδ), 3.76 (Hε), 4.25 (HO-γ), 4.47 (HO-δ), 4.89 (HO-ε) 4 7.61 3.93 2.13 1.09, 1.10, 1.19, 1.30, 1.73, 1.80 5 7.97 3.97 2.50 1.18, 1.21, 1.71, 1.75 -O-CH2-Ph — — — 5.10 y 5.25 (CH2), 7.31-7.44 (Ph) Tabla 7. Asignaciones del péptido 70c en DMSO-d6 (T = 298 K). El espectro fue referenciado a la resonancia del TMS (δ = 0.00 ppm). Discusión de resultados 75 3.2 HETEROOLIGÓMEROS DE α-AMINOÁCIDOS Y ÁCIDOS 2-AMINOCICLOHEXANOCAR- BOXÍLICOS 3.2.1 Síntesis de los pentapéptidos 75a, 75b y 75c Siguiendo el plan de trabajo descrito en el objetivo 2 de esta tesis doctoral, se comenzó la síntesis de pentapéptido 75a llevando a cabo un acoplamiento peptídico entre el hidrocloruro de la alanina-OMe comercial 72c y el β-aminoácido 21d, derivado del ácido (–)-shikímico y sintetizado previamente en el grupo de investigación como ya se indicó,95 para obtener el dipéptido 73a con un 96 % de rendimiento (Esquema 15). Este compuesto fue caracterizado a partir de sus propiedades espectroscópicas y espectrométricas. En su espectro de RMN-1H encontramos señales a 6.14 y 6.56 ppm, debidas a los protones sus dos grupos NH de amida. Destacan también el doblete a 1.37 ppm, debido al grupo CH3 unido al carbono-α de la L-alanina-OMe así como el singlete a 3.68 ppm perteneciente al éster de metilo del extremo C-terminal. En su espectro de RMN-13C se identificaron las señales a 156.3, 172.4, 173.1 ppm como las pertenecientes a los tres grupos carbonilo de la molécula. Su espectro de masas de alta resolución muestra una señal con una relación m/z = 537.2602 (m/z teórico = 537.2603) correspondiente al ion [M+Na]+, que confirmó su fórmula molecular como C24H42N2O8Si. En su espectro de FTIR se observan las bandas a 1534, 1653 y 1723 cm-1 debidas a sus grupos carbonilo y una banda ancha a 3323 cm-1 debida a los grupos NH. Esquema 15. Síntesis del dímero 73a. Para sintetizar el tetrámero 79a se desprotegió el compuesto 73a, en su extremo C- terminal con LiOH en una mezcla de metanol y agua y también en su extremo N-terminal con Pd(PPh3)4, en DCM. Esto dio lugar al ácido 73b y a la amina 73c, respectivamente, que se utilizaron en la siguiente reacción sin purificación adicional (Esquema 16). A continuación, se llevó a cabo un acoplamiento peptídico entre 73b y 73c, utilizando PyBop/HOBt como agente activante y DIEA como base. Esto dio lugar al tetrapéptido 74a con un 57 % de rendimiento global (tres pasos). Este compuesto pudo ser caracterizado a partir de sus propiedades espectroscópicas y espectrométricas entre las que destacan en su espectro de RMN-1H las señales 6.46, 6.88, 7.35, 7.65 ppm, atribuidas a sus cuatro protones NH de amida y un singlete a 3.73 ppm, correspondiente al grupo éster metílico del extremo C-terminal. Su espectro de RMN-13C muestra señales características a 156.4 ppm, debida al carbonilo de la carbamida y a 173.0, 173.0, 173.3, 175.2 ppm, debidas a los otros cuatro carbonos carbonílicos de la molécula. La fórmula molecular C43H76N4O13Si2 fue confirmada mediante su espectro de masas de alta resolución, que muestra una señal con una relación m/z = 935.4839 (m/z teórico = 935.4840) correspondiente al ion [M+Na]+. Su espectro de FTIR muestra señales a 1536, 1650 y 1729 cm-1 correspondientes a los grupos carbonilo de la molécula y una banda ancha a 3313 cm-1 que se atribuyó a los grupos NH. David Reza Ramos 76 Esquema 16. Síntesis del tetrapéptido 74a y desprotección del extremo N-terminal para dar lugar a la amina 74b. Prosiguiendo con nuestro plan, se desprotegió el extremo N-terminal del tetrapéptido 74a mediante una reacción de hidrogenación catalítica, usando Pd(PPh3)4, lo que dio lugar al compuesto 74b con el grupo NH2 terminal libre, para realizar el último acoplamiento peptídico, conducente a nuestro pentámero 75a (Esquema 16), que supuso la incorporación de un monómero de Cbz-N-alanina comercial al extremo N-terminal libre de 74b, utilizando como agente activante PyBop/HOBt y DIEA como base (Esquema 14). Esto dio lugar al primero de nuestros pentapéptidos objetivo 75a con un 94 % de rendimiento, que se caracterizó a partir de sus propiedades espectroscópicas y espectrométricas. En su espectro de RMN-1H muestra cinco señales a 5.61, 7.53, 7.74, 7.89 y 7.98 ppm atribuidas a los cinco protones de sus grupos NH de amida y uretano. También muestra un sistema ABq a 5.06 ppm (2JCH = 12.3 Hz) y un multiplete a 7.31 ppm, que integra por cinco protones, los cuales son atribuidos al grupo Cbz de la molécula. En su espectro de RMN-13C destacan las señales debidas a sus cinco grupos carbonilo, a 156.4 (C=O, carbamato), 173.0 (C=O, amida), 173.1 (C=O, amida), 173.3 (C=O, amida) y 175.2 (C=O, éster). Su espectro de masas de alta resolución muestra una señal con una relación m/z = 1056.5370 (m/z teórico = 1056.5367) correspondiente al ion [M+Na]+, lo cual confirma la formula molecular del compuesto (C50H83N5O14Si2). Por último, en su espectro de FTIR se observa las bandas de sus grupos carbonilo a 1536, 1650 y 1727 cm-1 y una banda ancha a 3315 cm-1 debida a sus grupos NH. Discusión de resultados 77 Esquema 17. Síntesis de los pentapéptidos 75a, 75b y 75c. Una vez obtenido el primero de nuestros pentapéptidos 75a se desprotegieron secuencialmente sus grupos hidroxilo. Para ello se hizo reaccionar el compuesto 75a con TBAF en THF seco durante 24 h para obtener el pentapéptido 75b con un rendimiento del 26 % (Esquema 17). Se confirmó la estructura de este compuesto 75b por la ausencia en su espectro de RMN-1H de las señales características de los metilos de los grupos TBS, que aparecen a 0.05 y 0.87 ppm en el espectro de RMN-1H de su precursor, lo que demuestra la ausencia de este grupo protector. Además, destacan: la señal a 3.78 ppm correspondiente al grupo éster metílico de su extremo C-terminal; un sistema ABq a 5.05 ppm (2JCH = 12.2 Hz) que junto con el multiplete a 7.33 ppm conforman el grupo protector Cbz de su extremo N-terminal y las señales a 5.36, 7.01, 7.10, 7.59 (x2), 8.15 y 8.20 ppm correspondientes a los cinco protones NH de amida y los dos grupos OH libres de la molécula. Además, en su espectro de RMN-13C destacan las señales a 156.6 (C=O, carbamato), 173.8 (C=O, amida), 174.5 (C=O, amida), 174.7 (C=O, amida), 175.8 (C=O, amida) y 176.0 (C=O, éster) ppm debidos a los seis grupos carbonilo de la molécula. Su espectro de masas de alta resolución muestra una señal con una relación m/z = 828.3638 (m/z teórico = 828.3638) correspondiente al ion [M+Na]+, lo que nos permitió confirmar su fórmula molecular C38H55N5O14. Finalmente, en su espectro de FTIR se observan las bandas de flexión de amida a 1546 cm-1, de extensión de éster 1647 cm-1 y de amida 1720 cm-1 y de extensión de NH y OH a 3311 cm-1. Finalmente, se desprotegieron los grupos acetónido del compuesto 75b. Para ello se disolvió este compuesto en una mezcla TFA/MeOH/H2O (2:1:1) y se agitó a t.a. durante 28 h. De esta manera se obtuvo el compuesto 75c con un 33 % de rendimiento (Esquema 17). La estructura del pentapéptido 75c también pudo ser confirmada a partir de sus propiedades espectroscópicas y espectrométricas. En su espectro RMN-1H destacan las señales a 6.48, 7.54, 7.73, 7.93 y 8.12 ppm correspondientes a los protones de sus NH de David Reza Ramos 78 amida y la señal a 3.78 ppm correspondiente al grupo éster metílico de su extremo C-terminal. En el espectro de RMN-13C destaca la ausencia de la señal característica del carbono cuaternario del grupo acetónido, que aparecen a 108 ppm en el espectro de RMN-13C de su precursor. También destacan las señales entre 127.6-133.9 ppm, debidas a los C-H aromáticos del grupo Cbz, además de las señales a 156.7 (C=O, carbamato), 174.3 (2xC=O, amida), 174.9 (2x C=O, amida) y 175.1 (C=O, éster) ppm debidas a los seis grupos carbonilo de la molécula. Su espectro de masas de alta resolución muestra una señal con una relación m/z = 748.3010 [M+Na]+ (valor teórico m/z = 748.3012), que confirmó su fórmula molecular C32H47N5O14. Su espectro de FTIR muestra las señales a 1548, 1654 y 1724 cm-1 debidas a los grupos carbonilo de la molécula, además de una banda ancha a 3310 cm-1 que corresponde a sus grupos NH e hidroxilo. 3.2.2 Estudio estructural de los pentapéptidos 75a, 75b y 75c Una vez sintetizados los pentapéptidos 75a, 75b y 75c se realizó un estudio de su estructura secundaria en disolución, utilizando para ello las técnicas espectroscópicas de FTIR, CD y RMN. 3.2.2.1 Estudio de Infrarrojo Se midieron espectros de ATR-FTIR del dímero 73a, el tetrámero 74a y los pentámeros 75a, 75b y 75c. Para ello se depositó una disolución 1 mM de cada uno de estos compuestos sobre un accesorio de ATR de un espectrómetro FTIR. Los máximos de las bandas de vibración de grupo amida de los cinco péptidos aparecen resumidos en la Tabla 10. Estructura Compuesto Amida A Amida I Amida II 73a 3323 1653 1534 74a 3313 1650 1536 75a 3315 1648 1535 75b 3311 1647 1546 75c 3310 1654 1548 Tabla 10. Máximo (cm-1) de las bandas características de Amida A, Amida I y Amida II para los compuestos 73a, 74a, 75a, 75b y 75c. Discusión de resultados 79 Se observa una disminución del número de onda de la banda de Amida A en el tetrámero 74a (3315 cm-1) y los pentámeros 75a (3315 cm-1), 75b (3311 cm-1) y 75c (3310 cm-1), con respecto al dímero 73a (3323 cm-1). Para la banda de Amida I se ve también una disminución del número de onda desde el dímero 73a (1653 cm-1) al tetrámero 74a (1650 cm-1) y los pentámeros 75a (1648 cm-1) y 75b (1647 cm-1), con una clara excepción para el pentámero con los tres hidroxilos libres 75c (1654 cm-1). Finalmente, se observa también un incremento en el máximo del número de onda de la banda de Amida II desde el dímero 73a (1534 cm-1), el tetrámero 74a (1536 cm-1) y el pentámero 75a (1535 cm-1) hasta los pentámeros 75b (1546 cm-1) y 75c (1548 cm-1) (Figura 68). Figura 68. 𝜈𝑚𝑎𝑥 del espectro de ATR-FTIR de los péptidos 73a, 74a, 75a, 75b y 75c en la región de: A. Amida A, B. Amida I y C. Amida II. Estos datos son indicativos de un aumento en el número de enlaces de hidrógeno a medida que aumenta la longitud de la cadena peptídica desde el dímero al pentámero y al aumentar el número de OH libres en los pentámeros. Lo que sugiere una mayor tendencia a formar algún tipo de estructura secundaria a medida que aumenta la longitud de cadena del péptido y el número de OH libres. Estos datos, que muestran un efecto batocrómico para las señales de Amida A y Amida I e hipsocrómico para a señales de Amida II a medida que aumenta el tamaño de la cadena peptídica, son todos ellos indicativos de la presencia de enlaces de hidrógeno y por lo tanto de estructuración secundaria de nuestros pentámeros, 75a, 75b y 75c. David Reza Ramos 80 3.2.2.2 Estudio de Dicroísmo Circular La siguiente aproximación para determinar la estructura de nuestros tres pentapéptidos fue realizar un estudio de Dicroísmo Circular, para lo cual empezamos estudiando el pentapéptido 75a con todos sus hidroxilos protegidos: Se midió el espectro de CD del pentapéptido 75a en tres disolventes polares: iPrOH, MeOH y MeCN a temperatura ambiente y a una concentración de 100 µM (Figura 69). Tanto en disolución de MeOH como en MeCN presenta un máximo positivo a 200 nm y un hombro entre 210-220 nm. Por el contrario, en nPrOH posee un dicroísmo nulo. Esto sugiere que en MeOH y MeCN el pentapéptido 75a presenta la misma estructura secundaria que da lugar a un espectro de CD muy similar al presente en la hélice-11/9 del péptido 72, descrita por el Prof. Choi (Figura 37, página 40). Mientras que en nPrOH esta estructura parece desmoronarse. Figura 69. Dicroísmo Circular del péptido 75a, en MeOH (negro), MeCN (naranja) y nPrOH (verde) a una temperatura de 20 ºC y a una concentración 100 µM. Se continuó el estudio de CD con el pentapéptido 75b, con dos OH libres, utilizando para ello los tres disolventes polares del experimento anterior (iPrOH, MeOH y MeCN) a temperatura ambiente y a una concentración de 100 µM (Figura 70). El comportamiento del péptido es ligeramente distinto al de 75a, mostrando en MeOH una banda positiva a 200 nm y un hombro entre 210-220 nm, en MeCN una banda positiva a 201 nm y una negativa a 230 nm y en nPrOH ningún efecto Cotton significativo. Estos resultados muestran que el pentapéptido 75b únicamente presenta en MeOH un espectro de CD compatible con la hélice-11/9 de Choi. Discusión de resultados 81 Figura 70. Dicroísmo Circular del péptido 75b, en MeOH (azul), MeCN (naranja) y nPrOH (verde) a una temperatura de 20 ºC y a una concentración 100 µM. Por último, se estudió el pentapéptido 75c, con todos sus grupos hidroxilo libres, utilizando también ahora los tres disolventes polares de los experimentos anteriores (nPrOH, MeOH y MeCN) a temperatura ambiente y a una concentración de 100 µM. Éste compuesto además es soluble en agua, por lo que se estudió también su CD en este disolvente (Figura 71). Se observaron dos tipos de CD diferentes en función del disolvente: en MeOH y MeCN se observan un efecto Cotton positivo a 202 nm y un hombro entre 210-220 nm (típico de hélices-11/9) y en nPrOH y H2O se observa un efecto Cotton negativo a 200 nm y un efecto Cotton positivo a 220 nm y 217 nm respectivamente (típico de estructuras extendidas “random coil”). Figura 71. Dicroísmo Circular del péptido 75c, en MeOH (rojo), MeCN (verde), nPrOH (naranja) y agua (azul) a una temperatura de 20 ºC y a una concentración 100 µM. Vistos los resultados de CD que presentaba el compuesto 75c en disolución metanólica en la cual parece plegarse en una estructura secundaria, posiblemente de hélice-11/9, así como en disolución acuosa en la que parece tener una estructura de “ramdom coil”, decidimos llevar a cabo una valoración añadiendo agua sobre una disolución de 75c en MeOH. Se observó claramente (Figura 72) la pérdida paulatina de intensidad de la banda principal a 200 nm y de su hombro a 217 nm al aumentar la proporción de agua. Esto es compatible con una pérdida David Reza Ramos 82 de la estructura secundaria adoptada por 75c en disolución metanólica a medida que añadimos un competidor por los enlaces de hidrógeno (el agua), que la desestabiliza. Figura 72. Dicroísmo Circular del péptido 75c, en MeOH, MeOH (25 % H2O), MeOH (50 % H2O) y H2O (azul) a una temperatura de 20 ºC y a una concentración 100 µM. Estos resultados de CD ponen de manifiesto que los tres pentapéptidos 75a-c se estructuran en MeOH y MeCN en una misma estructura secundaria, marcada por un CD muy similar al reportado por Choi para su pentapéptido 72 (Figura 37, página 40), y que pierden esta estructuración al ser disueltos en nPrOH o agua. 3.2.2.3 Estudio de RMN Una vez estudiados los tres pentapéptidos 75a, 75b y 75c por FTIR y CD, decidimos estudiar por RMN el compuesto 75c para poder confirmar o descartar nuestra hipótesis sobre su estructuración en forma de hélice-11/9. La elección del péptido 75c, la basamos en que es el que presenta mayores indicios de estructuración de los tres sintetizados. Elegimos para este estudio los dos disolventes en los que parece estar más estructurado: MeCN-d3 y MeOH-d3. Para ello, se comenzó con un estudio de RMN-1H monodimensional usando MeCN-d3 como disolvente, a una concentración de 1.5 mM y a temperatura ambiente. Este espectro muestra un único conjunto de señales de amida con una baja dispersión, indicativo de que el péptido está en una conformación en la que no existen diferencias entre sus entornos químicos, es decir, en una conformación extendida. Al bajar la temperatura observamos una mayor dispersión de los NH, junto con un desplazamiento a campo mayor, lo que puede indicar la formación de enlaces de hidrógeno y por tanto el plegamiento del péptido 75c en una estructura secundaria (Figura 73). Discusión de resultados 83 Figura 73. RMN-1H monodimensional del pentapéptido 75c en MeCN-d3 a 298 K (arriba) y 238 k (abajo). El apilamiento de los NH en el espectro monodimensional a temperatura ambiente hace inviable el estudio de los coeficientes de temperatura, por lo que se decidió realizar directamente un estudio de los NOEs presentes en disolución a 238 K. Figura 74. Pentapéptido 75c con los residuos numerados del 1-5 desde el extremo N-terminal al C-terminal (izquierda). Nomenclatura para los protones utilizada para la asignación (derecha). Para ello, en primer lugar, asignamos las señales de NH, Hα y Hβ (Figura 74) utilizando una combinación de TOCSY, HSQC y ROESY. Éstas están recogidas en la Tabla 11. David Reza Ramos 84 residuo HN Hβ Hα Hγ Hε Hδ Hζ1-Hζ2 1 6.51 1.36 (CH3) 4.15 — — — — 2 7.96 4.48 2.92 3.71 3.78 2.40 2.10-1.68 3 8.15 1.32 (CH3) 4.15 — — — — 4 7.56 4.43 2.95 3.62 3.79 2.40 2.00-1.71 5 7.76 1.34 (CH3) 4.44 — — — — Tabla 11. Asignaciones del péptido 75c en acetonitrilo-d3 (T = 238 K). Una vez asignadas las señales de RMN del compuesto 75c, se llevó a cabo un experimento ROESY para poder determinar las señales de NOE presentes. Lamentablemente en el ROESY solo se observan picos de cruce correspondientes a interacciones intraresiduo, lo cual hizo descartar cualquier tipo de estructuración secundaria de 75c en MeCN (Figura 75). Figura 75. Superposición de los espectros ROESY (rojo/azul, tmix 400 ms) y TOCSY (negro, tmix 60 ms) del péptido 75c (CD3CN, 600 MHz, 238 K). Expansión de la región (Hα+Hβ)/HN. Discusión de resultados 91 3.3.2 Estudio estructural de los hexapéptidos 81a, 81b y 81c Siguiendo con nuestro plan de trabajo, después de sintetizar los tres hexapéptidos 81a, 81b y 81c, se procedió realizar un estudio estructural, para determinar sus estructuras secundarias. 3.3.2.1 Estudio de Infrarrojo Se midieron los espectros de FTIR de los tres hexapéptidos 81a (CHCl3), 81b (MeCN y agua) y 81c (agua). Los máximos de las bandas principales de vibración de amida para los tres pentapéptidos aparecen recogidos en la Tabla 13. Estructura Compuesto Amida A Amida I Amida II 81a (CHCl3) 3287 1633 1542 81b (MeCN) 3302 1648 1544 81b (H2O) 3288 1643 1538 81c (H2O) 3343 1657 1555 Tabla 13. Máximo (cm-1) de las bandas características de Amida A, Amida I y Amida II para los compuestos 81a, 81b y 81c. El espectro IR del péptido 81a en CHCl3 muestra grandes desplazamientos hacia el rojo de las bandas Amida A y Amida I, y un desplazamiento hacia el azul de la banda Amida II en David Reza Ramos 92 relación con el péptido 81c. Esto concuerda con la presencia de fuertes enlaces de hidrógeno intramoleculares en el péptido 81a y la ausencia de tales enlaces de hidrógeno en el péptido 81c (Tabla 10 y Figura 76). El compuesto 81b se estudió en acetonitrilo y en agua, pero el desplazamiento de frecuencia de sus bandas es menos concluyente en cuanto a la presencia de enlaces de hidrógeno. Figura 77. 𝜈𝑚𝑎𝑥 del espectro de FTIR de los péptidos 81a (CHCl3), 81b (MeCN y H2O), y 81c (H2O) en la región de: A. Amida A, B. Amida I y C. Amida II. Discusión de resultados 93 3.3.2.2 Estudio de Dicroísmo Circular A continuación, se llevó a cabo un estudio de Dicroísmo Circular de los tres hexapéptidos en tres disolventes diferentes: MeOH, MeCN y H2O. En MeOH los tres hexapéptidos presentan un espectro de CD muy similar, con dos bandas negativas una a 208 y otra a 227 nm para 81a y 81c, y una a 213 y otra 226 nm para 81b (Figura 78), lo que parece indicar que en los tres hexapéptidos comparten una estructura secundaria común en este disolvente. Figura 78. Espectro de Dicroísmo Circular de los péptidos 81a, 81b y 81c (1 mM, 25 ºC) en metanol. Los espectros de CD de los compuestos 81a y 81b en acetonitrilo (81c es insoluble en acetonitrilo) muestran una banda positiva a 190 nm y una banda negativa más intensa a 220 nm, que es característica de péptidos con estructura secundaria de horquilla (Figura 79).96 Figura 79. Espectro de Dicroísmo Circular de los péptidos 81a y 81b (1 mM, 25 ºC) en acetonitrilo. Por último, se realizó un estudio de 81b y 81c en H2O (81a es insoluble en H2O) observándose que tanto 81b como el 81c presentan espectros de CD muy similares. El David Reza Ramos 94 hexapéptido 81b, con dos OH libres, presenta una banda positiva a 220 nm y una negativa a 205 nm a 1 mM, mientras que el hexapéptido 81c, con todos sus OH libres, presenta una banda positiva a 220 nm y una negativa a 204 nm a 1 mM (Figura 80). Ambos espectros típicos de péptidos con una estructura secundaria extendida. Figura 80. Espectro de Dicroísmo Circular de los péptidos 81b y 81c (1 mM, 25 ºC) en agua. A la vista de los resultados obtenidos en el estudio de CD, parece claro que nuestros péptidos se estructuran en forma de giro peptídico en acetonitrilo, pero que esta estructura desaparece en agua. Para poder confirmar esta observación llevamos a cabo un estudio de RMN de los tres hexapéptidos 81a, 81b y 81c cuyos resultados mostramos a continuación. Discusión de resultados 95 3.3.2.3 Estudio de RMN de los péptidos 81a, 81b y 81c En primer lugar, se llevó a cabo un estudio de RMN-1H monodimensional de los tres hexapéptidos 81a en CDCl3, 81b en CD3CN y 81c en DMSO-d6: Figura 81. RMN-1H del péptido 81a, 1 mM en CDCl3 (500 MHz). Como puede observarse en la Figura 81, el hexámero 81a presenta un único conjunto de señales de NH de amida en su espectro RMN-1H en CDCl3, lo cual es un indicativo de la presencia de una única estructura secundaria en disolución. Además, la dispersión de las señales de amida, junto con el desplazamiento de estas a campo bajo parece indicar la presencia de enlaces de hidrógeno, lo que concuerda con los resultados obtenidos de los estudios de FTIR y CD. David Reza Ramos 96 Figura 82. RMN-1H del péptido 81b, 1 mM en CD3CN (500 MHz). En el caso del compuesto 81b (Figura 82), vemos en su espectro de RMN-1H muestra una buena dispersión de las señales de amida y su desplazamiento a campo bajo, por lo que probablemente tenga una estructura secundaria estable en disolución. Lo cual también concuerda con los datos de FTIR y CD anteriormente expuestos. Discusión de resultados 97 Figura 83. RMN-1H del péptido 81c, 1 mM en DMSO-d6 (500 MHz). El caso del hexapéptido 81c (Figura 83) es diferente al de 81a y 81b ya que también presenta un espectro de RMN-1H con un único conjunto de señales, pero estas aparecen solapadas. Esto puede indicar que el entorno químico de todos sus NH es muy similar, lo cual es un claro signo de la ausencia de estructuración en disolución. Los resultados de los estudios de FTIR, CD y RMN monodimensional concuerdan con una estructura secundaria en disolución de los hexapéptidos 81a y 81b. Mientras que la desprotección total de los grupos hidroxilo parece desestabilizar la estructura secundaria de estos péptidos. De manera que, para poder confirmar estos resultados y determinar el tipo de plegado de estos péptidos se llevó a cabo un estudio de RMN más exhaustivo, el cual se describe a continuación para cada uno de los tres hexapéptidos. David Reza Ramos 98 3.3.2.3.1 Estudio de RMN del hexapéptido 81a Figura 84. Hexapéptido 81a con los residuos numerados del 1-6 desde el extremo N-terminal al C-terminal (izquierda). Nomenclatura para los protones utilizada para la asignación (derecha). En primer lugar, se asignaron las señales de NH, Hα y Hβ utilizando una combinación de TOCSY, ROESY, HSQC y HMBC, lo que aparece recogido en la Tabla 14. residuo HN Hγ (ω) Hβ Hα otros -COCH3 — — — — 2.13 (CH3) 1 7.70 — — 5.28 1.38 (CH3) 2 8.84 — — 5.05 1.45 (CH3) 3 8.18 3.64/3.16 2.10 2.61/1.75 1.31 (CH3), 1.43 (CH3), 1.66/2.06 (Hζ), 3.98 (Hε), 4.06 (Hγ) 4.26 (Hδ) 4 7.31 4.28/2.76 1.95 2.71 1.39 (CH3), 1.51(CH3), 1.75/2.04 (Hζ), 3.74 (Hε), 3.98 (Hγ) 4.17 (Hδ) 5 8.27 — — 5.26 1.39 (CH3) 6 8.01 — — 4.95 1.44 (CH3) -HN-CH3 7.83 — — — 2.81(CH3) OTBS — — — — 0–0.12 (Si(CH3)3), 0.89/0.83 (C(CH3)3) Tabla 14. Asignaciones de las señales del péptido 81a en CDCl3 (T = 298 K). Una vez asignadas las señales se realizó un estudio de coeficientes de temperatura y de ROESY para determinar la estructura secundaria de este pentapéptido 81a. • Coeficientes de Temperatura (T-coef) del pentapéptido 81a El estudio del compuesto 81a se llevó a cabo en CDCl3 a c = 1 mM, en un rango de temperaturas desde 5 a 35 ºC tomando una medida cada intervalo de 5 ºC (Figura 85). Los datos obtenidos de estos experimentos junto con los T-coef de NH de amida aparecen recogidos en la Tabla 15. Discusión de resultados 99 Figura 85. Espectro de RMN-TV del hexapéptido 81a en CDCl3 (500 MHz). Temperaturas, de abajo hacia arriba, desde 5 hasta 35 ºC en intervalos de 5 ºC. HN δmax (35 ºC) / ppm δmin (5 ºC) / ppm Rango T / K T-coef / ppb·K-1 H1 7.67 8.17 30 -16.7 H2 8.81 9.06 30 -8.3 H3 8.15 8.76 30 -20.3 H4 7.29 7.43 30 -4.7 H5 8.25 8.58 30 -11.0 H6 7.99 8.25 30 -8.7 H7 7.80 8.17 30 -12.3 Tabla 15. Coeficientes de temperatura del compuesto 81a. El único coeficiente de temperatura cercano a -4 ppb·K-1 es el del NH4, lo que evidencia que está formando un enlace de hidrógeno. Mientras que el resto de NHs de amida parecen estar expuestos al disolvente. David Reza Ramos 100 Para poder determinar con más precisión la estructura secundaria se llevó a cabo un estudio de NOESY. El espectro de NOESY en CDCl3 muestra contactos NOE entre NH2/NH5, NH4/NH5 y Hα6/NH2, ambos compatibles con una estructura de giro-β (Figura 86 y Figura 87). Figura 86. Estructura de giro-β del péptido 81a y sus interacciones de NOE. Figura 87. Ampliación de la región de NH de amida y Hα del péptido 81a (tmix = 400 ms, CDCl3, 328 K, 600 MHz). Contactos NOE: NH2/NH5, NH4/NH5 y NH2/Hα6. Discusión de resultados 107 3.4 SÍNTESIS, ESTUDIO DE GELIFICACIÓN Y APLICACIONES DE N-ALQUILAMIDAS DERIVADAS DEL ÁCIDO 2-AMINOCICLOHEXENOCARBOXÍLICOY DEL ÁCIDO (–)-SHIKÍMICO 3.4.1 Geles: Aspectos generales Los geles son materiales que encontramos en nuestra vida diaria en productos como lubricantes, adhesivos, jabones, cosméticos, implantes médicos y explosivos (Figura 95).97 La diversidad y el amplio abanico de aplicaciones de los geles pueden atribuirse a sus propiedades físicas únicas: al igual que los sólidos convencionales, los geles son capaces de soportar el peso y mantener su forma, pero presentan un comportamiento similar al de los fluidos bajo tensión y pueden moldearse, imprimirse e inyectarse según sea necesario. Estas propiedades los convierte en materiales muy interesantes en campos como la Medicina, la Biología o la Electrónica. Figura 95. Gel de agar para el cultivo de bacterias, capsulas de gel para la encapsulación de medicamentos y gel de agar agar para la industria alimentaria. Un gel es más fácil de reconocer que de definir. Sin embargo, una definición bastante intuitiva de lo que es un gel es la dada por la RAE: “estado que adopta una materia en dispersión coloidal cuando flocula o se coagula”. Una definición científica del mismo resulta menos intuitiva, debido principalmente a la diversidad química que da lugar a estos sistemas. La primera definición completa que aúna el punto de vista microscópico y macroscópico fue proporcionada por Flory (Nobel de Química en 1974).98 Según Flory un gel es un sistema coloidal que cumple con dos requisitos: - Poseer una estructura microscópica continua, con dimensiones macroscópicas, que sea permanente en la escala de tiempo de un experimento analítico. - Presentar propiedades de sólido en su comportamiento reológico, a pesar de ser un líquido su componente mayoritario. Una definición científica actual de un gel sería la siguiente: un estado de la materia condensada metaestable,99 en el que coexiste una estructura sólida reticular, que se denomina fase continua, dentro de un líquido que se denomina fase dispersa. Los geles se comportan como un sólido elástico a valores pequeños de tensión mecánica y se transforman en líquidos viscosos por encima de esta. Vale la pena señalar que la definición de un gel no requiere que un material se identifique comúnmente como tal. De hecho, esta familia de materiales abarca incluso sistemas David Reza Ramos 108 biológicos complejos que carecen de la apariencia arquetípica de un gel, como citoesqueletos, coágulos de sangre, colonias microbianas y tejidos celulares inflamados.100 En los geles sólo es necesaria una pequeña cantidad de la red sólida para gelificar un volumen relativamente grande de disolvente (típicamente, <1% wt/vol). El disolvente, aunque tiene movilidad a nivel molecular, no es capaz de moverse a nivel macroscópico, ya que está atrapado en los huecos de la red del gelificante mediante una combinación de fuerzas de capilaridad e interacciones con la propia red. Los geles pueden clasificarse atendiendo a su constitución, al tipo de interacción que da lugar a la red tridimensional o al medio en el que se han formado (Figura 96).101 Según la naturaleza de las interacciones que dan lugar al gel podemos clasificarlos en: - Geles poliméricos: Como su nombre indica están constituidos por polímeros (naturales o sintéticos) con pesos moleculares entre 3.000 y 50.000 Dalton. Estos polímeros están formados por una red de enlaces covalentes, lo que hace que el proceso de gelificación no sea reversible, es decir, no pueden redisolverse. - Geles moleculares: Están formados por moléculas orgánicas o inorgánicas discretas y de bajo peso molecular, entre 200 y 400 Dalton. Las fuerzas de enlace que mantienen la estructura tridimensional del gel son de tipo débil (enlaces de hidrógeno, fuerzas de Van der Waals, interacciones tipo π-π, interacciones solvofóbicas, enlaces de coordinación con metales, etc…). La naturaleza débil de estas interacciones hace que el proceso de gelificación sea reversible. Pueden redisolverse. Figura 96. Diagrama de árbol con las diferentes clasificaciones de los geles. También pueden clasificarse atendiendo a su fase dispersa en hidrogeles, en los que ésta es agua (o mezclas de agua y otro disolvente en las que más del 50 % es agua) y organogeles, en los que ésta es un disolvente orgánico. Todos ellos se transforman en xerogeles cuando se les extrae la fase dispersa. A partir de ahora nos referiremos solo a los geles moleculares por ser estos el objeto de estudio de este apartado de la tesis doctoral. Los agentes gelificantes de bajo peso molecular (LMWG, por sus siglas en inglés) son moléculas pequeñas capaces de auto-ensamblarse en estructuras unidimensionales que se agregan y entrecruzan para dar lugar a redes tridimensionales capaces de inmovilizar el Discusión de resultados 109 disolvente a través de fuerzas de capilaridad y de tensión superficial, provocando con ello la formación del gel.102–106 Las propiedades del gel son controladas por la anchura de las fibras, su distribución espacial y el número de entrecruzamientos. Estos gelificantes tienen una sorprendente capacidad de gelificación que puede llegar a valores tan bajos de concentración de agente gelificantes como 0.1 wt%. Los LMWG ofrecen varias ventajas frente a los geles poliméricos, debido a su reversibilidad y su mayor biocompatibilidad. Por ejemplo, en aplicaciones biológicas sigue siendo un desafío encontrar geles poliméricos biodegradables. Muchos geles moleculares pueden estar formados por moléculas biocompatibles, lo que los hacen fácilmente procesables por el organismo. Mientras que la naturaleza reversible de sus enlaces los convierte en potenciales materiales funcionales,107 capaces de responder reversiblemente a estímulos externos tales como la temperatura, la luz, cambios de pH, a ultrasonidos, etc. Además de las aplicaciones industriales,108 se han descrito numerosos avances y usos para la utilización de geles moleculares: Como vehículos en el transporte y distribución de fármacos,109,110 como herramienta en la descontaminación de aguas (contaminadas con hidrocarburos, tintes u otros materiales nocivos),111 como moldes para la fabricación de materiales porosos,112 para el diseño de dispositivos electrónicos,75 para el cultivo celular113 y un largo etcétera (Figura 97). Figura 97. Esquema con las diferentes aplicaciones de los geles moleculares. David Reza Ramos 110 Como ejemplo notable en el campo de la Medicina se han desarrollado compuestos no gelificantes que al reaccionar con encimas liberan un potente agente hidrogelante.114 Este es el caso del compuesto 83, que al reaccionar con la enzima β-lactamasa, presente en las bacterias resistentes a la cefalosporina, genera un gel que engloba la bacteria y permite visualizarla (Esquema 23). Además, este compuesto es biocompatible y puede utilizarse directamente sobre la piel y otros tejidos presentes en el organismo humano sin causar daños. Esquema 23. Sonda para la detección de cefalosporina basada en la molécula 83 que se transforma en el gelificante 84 por acción de la β-lactamasa. Las propiedades de los geles moleculares (materiales sencillos, fácilmente modulables, con alta compatibilidad con disolventes de diferentes polaridades y muy porosos) los convierte en sistemas con un alto potencial para resolver algunos problemas medioambientales relacionados con vertidos de compuestos nocivos al agua.111 Se han descrito gelificantes moleculares capaces de purificar aguas contaminadas con tintes,115 nanopartículas metálicas,116 metales de transición117 o incluso neurotoxinas118. Una de las aplicaciones de remediación ambiental más estudiadas es la capacidad de algunos gelificantes de gelificar selectivamente mezclas de aceite-agua, porque los aceites y principalmente el petróleo son un problema de contaminación del agua recurrente. Discusión de resultados 111 Figura 98. Estructura química de los organogelantes 86 y 87. Proceso de gelificación selectiva de aceite en una mezcla aceite-agua y recuperación del aceite por destilación. Como ejemplo de ello podemos destacar el elegante trabajo del profesor John, donde demostró que los gelificantes moleculares basados en los monosacáridos 86 y 87 son capaces de gelificar selectivamente gasóleo, aceite mineral, aceite de silicona, fracciones de petróleo crudo (alcanos con n > 9 átomos de carbono) e hidrocarburos mixtos (aromáticos y alifáticos) mezclados con agua y así poder separarlos de ésta (Figura 98).119 El proceso se basa en añadir una solución del agente gelificante en etanol a una mezcla aceite/agua (1:1). El gelificante gelifica selectivamente el aceite dejando el agua líquida, lo cual permite separar el aceite del agua. La destilación posterior del gel permite recuperar este aceite y reutilizar el agente gelificante. La gelificación de cristales líquidos (LC por sus siglas en inglés) por medio de LMOG es otra de las aplicaciones de estos materiales de gran interés tecnológico, debido a las propiedades únicas y favorables que los acompañan. Es decir, un alto orden molecular y un estado dinámico que puede ser influenciado por campos eléctricos o magnéticos. Un ejemplo de ello es el trabajo publicado por el grupo del profesor Smith que ha desarrollado films compuestos por un LC nemático comercial (LC-7) gelificado por el organogelante derivado del sorbitol 88. Demostrando que las células electro-ópticamente activas formadas por este gel físico de LC son conmutables entre un estado transparente y uno opaco mediante la aplicación de campos eléctricos de corriente alterna (AC) (Figura 99). David Reza Ramos 112 Figura 99.Estructura química del DBS 88. Esquema de la conmutación entre un estado opaco y un estado transparente en un gel de DBS de un cristal líquido nemático. 3.4.1.1 Proceso de ensamblado de los geles moleculares Como hemos descrito anteriormente, en los geles moleculares, a diferencia de los geles poliméricos, la estructura tridimensional del gel no está soportada por enlaces covalentes, sino por enlaces débiles reversibles, por lo que el proceso de ensamblado es de gran importancia para las propiedades finales de estos materiales. Figura 100. Mecanismo de formación de un gel molecular. El mecanismo de formación de un gel molecular transcurre mediante un proceso de ensamblado jerarquizado de sus moléculas individuales,120,121 a través de varias escalas de magnitud. Este proceso consta de los siguientes pasos (Figura 100): 1. El primero de los procesos tiene lugar a escala molecular. A esta escala las moléculas se autoensamblan a través de múltiples interacciones no covalentes (enlaces de hidrógeno, fuerzas de Van der Waals, apilamientos π-π, etc…), para dar lugar a polímeros supramoleculares denominados fibrillas. 2. El siguiente paso ocurre a escala nanométrica. En esta escala las fibrillas tienden a asociarse en haces denominados fibras, aunque también es posible la formación de otros agregados de diferente morfología (micelas, vesículas, tirabuzones, discos, túbulos o láminas) (Figura 101). Discusión de resultados 113 3. Finalmente, las fibras se entrecruzan e interaccionan entre sí para formar una red sólida autosoportada, que abarca toda la muestra. Esta red es la que sostiene el gel, impidiendo el flujo de disolvente a nivel macroscópico (aunque no a nivel molecular). Figura 101. Tipos de estructuras secundarias de un gel molecular. Algunos autores también definen el proceso de gelificación como una cristalización frustrada.122 Tanto la gelificación como la cristalización se basan en el autoensamblado de las moléculas en una disolución homogénea al ser calentada y luego enfriada. La diferencia es que durante la cristalización las moléculas se empaquetan en las tres direcciones del espacio de forma isotrópica. Mientras que en la gelificación una de las tres dimensiones está más favorecida que las otras dos, dando lugar a un crecimiento anisotrópico que provoca la formación de estructuras fibrilares con capacidad de formar una red que atrape el disolvente (Figura 102). Figura 102. Comparativa entre el proceso de cristalización y de gelificación. Sin embargo, no está nada claro que exista un vínculo entre el proceso de cristalización y gelificación. De hecho, aunque varios autores asumen que este vínculo existe, hay una serie de ejemplos que muestran que el empaquetamiento es diferente en el gel y en los cristales, incluso si crecen en el mismo disolvente.123–125 Un ejemplo específico es el dado por el Prof. Adams, en el que muestra que los datos de difracción de Rayos X de fibras de un gel no coinciden con los datos de la estructura cristalina del mismo compuesto, cuyos cristales crecieron en el propio gel.126 David Reza Ramos 114 Una característica muy importante de los agentes gelificantes es la cantidad mínima requerida para formar un gel en un disolvente dado. A esta cantidad mínima se le denomina concentración mínima de gelificación (cmg). Figura 103. Diagrama de fases de un gel molecular. Como puede observarse en el diagrama de fases de la Figura 103, la formación de las fibras de un gel depende de la temperatura y la concentración. A altas concentraciones el equilibrio del proceso de gelificación está decantado hacia el producto de autoensamblado. Por otro lado, las altas temperaturas generalmente hacen más desfavorable el proceso de ensamblado, ya que la entropía se vuelve dominante, favoreciendo estados desordenados y la solubilización del agente gelificante. La temperatura a la cual un gel pierde su integridad se denomina temperatura de transición gel-sol (Tgel), esta depende de la naturaleza y concentración del agente gelificante, así como del disolvente usado. 3.4.1.2 Diseño de nuevos agentes gelificantes Hasta la fecha se han empleado numerosas estructuras diferentes como gelificantes moleculares, todas ellas tienen la característica común de que su autoensamblado da lugar a estructuras fibrosas y éstas se producen por interacciones no covalentes de tipo Van der Waals, enlaces de hidrógeno, interacciones dipolares, interacciones tipo-π y/o interacciones de Coulomb.101 Los efectos solvofóbicos también juegan un papel importante en el proceso de gelificación. Estos efectos se producen cuando la molécula presenta grupos funcionales altamente insolubles en el disolvente que va a ser gelificado. Un amplio grupo de agentes gelificantes son moléculas anfifílicas. De hecho, uno de los tipos de gelificantes supramoleculares más antiguos que se conocen son los jabones metálicos, como la sal de litio del ácido 3-hidroxi esteárico 89 (Figura 104).127,128 Esta sal se agrega a través de fuerzas de Van der Waals de la cadena alifática, interacciones iónicas de los metales y enlaces de hidrógeno entre los grupos hidroxilo. Otro tipo de agente gelificante muy usado en la industria son los surfactantes catiónicos como la sal de amonio 90. El proceso de agregación en este segundo caso está principalmente fomentado por fuerzas de Coulomb, Discusión de resultados 115 aunque también se produce un importante efecto solvofóbico, debidos ambos a la baja solubilidad del ion de amonio cuaternario en varios disolventes.129 Figura 104. Estructura química de los gelificantes moleculares 89, 90 y 91. Un último ejemplo de gelificante anfifílico es la molécula 91, cuyo gel se estabiliza por la formación de interacciones π-π entre los grupos antraceno de moléculas adyacentes, así como por la formación de interacciones de Van der Waals entre las cadenas alifáticas. Otro aspecto importante a tener en cuenta para el diseño de LMWG eficientes es la rigidez de la estructura. Incluir partes rígidas en la estructura de un agente gelificante puede ayudar a estabilizar el apilamiento de estas moléculas, ya que se reducen las perdidas entrópicas en el proceso de agregación, y por tanto se favorece la formación del gel. Es por ello por lo que muchos esteroides actúan como buenos agentes gelificantes. Por ejemplo, el colesterol 92 es un buen gelificante de un amplio número de disolventes (Figura 105).130,131 Otro ejemplo, en el que la restricción de la libertad conformacional puede ayudar al proceso de gelificación es el del dibencilidén-D-sorbitol (DBS, 88). Este es un derivado de carbohidrato ampliamente utilizado en estudios de gelificación, ya que constituye un agente gelificante muy eficiente de agua. Una de las fuerzas principales que rigen la agregación de este azúcar es su estructura rígida tipo mariposa, que favorece el apilamiento de los grupos aromáticos y la estabilización de sus agregados por interacciones π-π.108 Figura 105. Estructura química de los gelificantes moleculares 92 y 88. Finalmente, una de las interacciones más importantes para estabilizar geles moleculares es la formación de enlaces de hidrógeno, que es la fuerza que rige el autoensamblado de la mayoría de los agentes gelificantes. Un ejemplo lo podemos encontrar en el péptido 94, que se apila por la formación de enlaces de hidrógeno entre sus grupos amida (Figura 106).132 Otro ejemplo es el potente agente gelificante dibenzoilcisteina 95, que es capaz de gelificar agua por debajo de 0.1 wt% lo que la convierte en un super-gelificante de agua (Figura 106).133 En este segundo caso las fuerzas inductoras de la gelificación son la formación de enlaces de David Reza Ramos 116 hidrógeno entre sus grupos ácido carboxílico, pero también un fuerte efecto hidrofóbico de los grupos bencilo, así como el apilamiento de éstos por interacciones π-π. Figura 106. Estructura química de los gelificantes moleculares 94 y 95. Como se pude ver hay una gran diversidad de estructuras moleculares capaces de formar geles moleculares en una gran variedad de disolventes. Se ha comprobado que para que una estructura tenga buenas propiedades como gelificante molecular, necesita ser capaz de establecer múltiples interacciones no covalentes, que han de ser complementarias. Esto lleva que algunos grupos funcionales suelen estar presentes en este tipo de moléculas, entre los que destacan: 1. Amidas (RCONHR') y ureas (RNHCONHR'), que pueden formar interacciones de enlace de hidrógeno autocomplementarias (C=O···H–N). 2. Carbohidratos, que contienen múltiples grupos O–H capaces de unirse mediante enlaces de hidrógeno. 3. Esteroides y sales biliares, que tienen superficies rígidas e hidrófobas. 4. Bases nucleótidas, que pueden formar enlaces de hidrógeno e interacciones de apilamiento π-π. 5. Alcanos de cadena larga, que pueden generar fuerzas de Van der Waals significativas e interacciones solvofóbicas. A pesar de todo lo expuesto, el diseño de nuevos LMWG sigue siendo un desafío, ya que se ha demostrado que incluso pequeños cambios estructurales en una molécula pueden llevar a un comportamiento de gelificación totalmente diferente. Impulsados por las numerosas aplicaciones potenciales de los geles supramoleculares se han desarrollado diferentes enfoques a lo largo de los años para el diseño de nuevos LMWG con propiedades mejoradas o funcionalidades añadidas como el reconocimiento y la capacidad de respuesta. Los primeros estudios sobre gelificantes moleculares se basaron en lo que podría llamarse un enfoque de “diseño basado en las propiedades”. Éste consistía en realizar modificaciones sistemáticas en la estructura de un gelificante molecular para así poder identificar las características estructurales que contribuyen al proceso de gelificación. De esta manera fue posible desarrollar nuevos gelificantes con propiedades o funciones completamente nuevas. Un ejemplo excelente de este método de diseño de nuevos gelificantes moleculares es el elegante estudio de relación estructura-propiedades del antranil butirato de colesterol o CAB (96), realizado por el profesor Weiss (Figura 107).130 En este estudio se realizaron Discusión de resultados 123 realizar estudios de gelificación en un conjunto de trece disolventes de distinta constante dieléctrica (hexano, tolueno, éter etílico, DCM, CHCl3, THF, iPrOH, AcOEt, dioxano, acetona, EtOH, MeCN y MeOH). La concentración mínima de gelificación (cmg en mg/mL) en cada disolvente se determinó mediante el método del test de inversión. El procedimiento típico consiste en la adición de 10 mg de compuesto y 0.2 mL de disolvente (50 mg/mL) a un vial de 1.5 mL con tapa. La mezcla se calienta en una placa hasta disolver el compuesto. A continuación, se deja enfriar en un baño de hielo/agua durante un periodo de tiempo variable que va desde los pocos segundos hasta varios minutos. El compuesto se considera un gel si no se observa ningún flujo de disolvente tras mantener el vial invertido durante al menos 30 segundos. Si se forma el gel, se añaden pequeños incrementos de 0.05 mL de disolvente y se repite el ciclo hasta observar un flujo de disolvente en la prueba de inversión, anotando entonces esa concentración como la cmg. Los resultados obtenidos en el test de gelificación para los compuestos Gc8 y Gc16 en los trece disolventes antes mencionados aparecen recogidos en la Tabla 19. Disolvente Gc8 Gc16 Hexano 17 15 Tolueno 25 — Éter 17 — DCM — 25 CHCl3 — — THF — 50 iPrOH — 50 AcOEt — 5 Dioxano 50 — Acetona 25 25 EtOH 50 50 MeCN 10 0.7 MeOH — 12.5 Tabla 19. Valores de cmg (mg/mL) de las N-alquilamidas Gc8 y Gc16 en trece disolventes de distinta polaridad. Se considera que una molécula es buen agente gelificante de un determinado disolvente si su cmg es igual o inferior a 20 mg/mL, muy buen agente gelificante si su cmg es igual o inferior a 10 mg/mL y un “super-gelificante” si su cmg es igual o inferior a 1 mg/mL. En la Figura 113 están representadas en forma de gráfico de barras las cmg de los dos compuestos Gc8 y Gc16 en los trece disolventes mencionados. Gc8 es un buen agente gelificante de tres de los trece disolventes utilizados, mientras que Gc16 es un es buen agente gelificante de cuatro de los trece disolventes. De estos resultados de gelificación, que David Reza Ramos 124 podemos considerar moderados, cabe destacar sin embargo que Gc16 es un super-gelificante de MeCN (cmg = 0.7 mg/mL). cmg (m g/m L) hexano toluen o éter D C M C H C l 3 TH F iP rO H A c O E t dio xano acetona E tO H M eC N M eO H 0 10 20 30 40 50 cmg (m g/m L) hexano toluen o éter D C M C H C l 3 TH F iP rO H A c O E t dio xano acetona E tO H M eC N M eO H 0 10 20 30 40 50 Figura 113. Valores de cmg en los 13 disolventes estudiados para los gelificantes Gc8 y Gc16, en formato de gráfico de barras. Para el caso de estos dos compuestos observamos que la longitud de la cadena alquílica es determinante en su capacidad gelificante. Siendo el compuesto de cadena de 16 átomos de carbono (Gc16) ligeramente mejor gelificante en disolventes polares comparado con el compuesto de 8 átomos de carbono (Gc8). Tanto Gc16, como Gc8 son gelificantes moderados de los disolventes estudiados, como era de esperar para un derivado ciclohexánico con una disposición relativa 1,2-cis de sus sustituyentes.139,140 Por lo que nos propusimos modificar la otra de las variables objetivo, la estereoquímica de los sustituyentes del anillo ciclohexánico, sintetizando los derivados 1,2-trans. Éstos deberían aumentar la capacidad gelificante de sus N-alquilamidas y así corroborar que existe una gran influencia de la estereoquímica relativa de este tipo de ciclohexanos 1,2-sustituidos en su capacidad gelificante. Discusión de resultados 125 3.4.2.2 Síntesis y estudio de gelificación de la N-butilamida 127, la N-octilamida (1R,2R)-128 y la N-hexadecilamida (1R,2R)-129 del ácido (1R,2R)-2- aminociclohexano-1-carboxílico ((1R,2R)-40b) La síntesis de los derivados de N-alquilamidas con configuración trans (127-129) se llevó a cabo utilizando un procedimiento similar al del caso previo. Partiendo del ácido (1R, 2R)-2- ((terc-butoxicarbonil)amino)ciclohexanocarboxílico ((1R,2R)-40b), protegido como Boc en su extremo N-terminal y haciéndolo reaccionar con la n-butilamina, la n-octilamina y la n-hexadecilamina comerciales, utilizando PyBop como agente acoplante y DIEA como base (Esquema 25). Esto condujo a las N-alquilamidas esperadas 127, (1R,2R)-128 y (1R,2R)-129 con rendimientos del 90 %, 93 % y 86 %, respectivamente. Esquema 25. Síntesis de la N-butilamida 127, la N-octilamida (1R,2R)-128 y la N-hexadecilamida (1R,2R)-129. Las amidas así sintetizadas se caracterizaron a partir de sus propiedades espectroscópicas y espectrométricas. Así, para el compuesto 127 destaca en su espectro de RMN-1H un triplete a 0.91 ppm correspondiente a CH3 terminal de la cadena alquílica, un singlete a 1.45 ppm correspondiente al grupo protector Boc de su extremo N-terminal y las señales a 6.02 y 6.90 ppm debidas a los dos NH de amida de la molécula. En su espectro de RMN-13C destaca la señal a 13.67 ppm correspondiente al metilo terminal de la cadena alquílica, la señal a 28.35 ppm correspondiente a los tres metilos del grupo protector Boc y las señales a 155.48 y 172.16 ppm correspondientes a sus dos grupos C=O. Además, su espectro de masas de alta resolución muestra una señal con una relación m/z = 299.2258 (m/z teórico = 299.2256) correspondiente al ion [M+H]+. En su espectro de IR destacan las señales a 1565, 1650 y 1689 cm-1 correspondientes a sus dos grupos carbonilo y una señal ancha a 3243 cm-1, correspondiente a sus dos grupos NH. Para el compuesto (1R,2R)-128 destaca en su espectro de RMN-1H la señal a 0.87 ppm correspondiente al CH3 de la cadena alquílica, la señal a 1.58 ppm correspondiente al grupo protector Boc y las señales 4.63 y 6.14 ppm, correspondientes a sus grupos NH de amida y de uretano. En su espectro de RMN-13C destaca la señal a 14.21 ppm correspondiente al CH3 terminal de la cadena alquílica, la señal a 28.48 ppm correspondiente a los tres grupos metilo del grupo protector Boc y las señales a 156.04 y 174.53 ppm correspondientes a sus dos grupos C=O. Además, en su espectro de masas de alta resolución muestra una señal con una relación m/z = 355.2955 (m/z teórico = 355.2956) correspondiente al ion [M+H]+. En su espectro de IR destacan las señales a 1534, 1647 y 1683 cm-1 correspondientes a sus dos grupos carbonilo y una señal ancha a 3331 cm-1, correspondiente a sus dos grupos NH. De forma similar a los dos casos anteriores, para el compuesto (1R,2R)-129 podemos destacar en su espectro de RMN-1H la señal a 0.89 ppm correspondiente al CH3 de la cadena alquílica, la señal a 1.46 ppm correspondiente al grupo protector Boc y las señales a 6.02 y 6.91 ppm correspondientes a los grupos NH de amida y de uretano. En su espectro de RMN-13C destaca la señal a 14.21 ppm correspondiente al CH3 terminal de la cadena alquílica David Reza Ramos 126 y la señal a 80.49 ppm correspondiente al carbono cuaternario del grupo protector Boc. Además, en su espectro de masas de alta resolución muestra una señal con una relación m/z = 467.4207 (m/z teórico = 467.4207) correspondiente al ion [M+H]+. En su espectro de IR destacan las señales a 1540, 1645 y 1684 cm-1 correspondientes a sus dos grupos carbonilo y una señal ancha a 3333 cm-1, correspondiente a sus dos grupos NH. A continuación, se llevó a cabo el estudio de gelificación de las tres N-alquilamidas sintetizadas 127, (1R,2R)-128 y (1R,2R)-129 que, de forma similar al caso anterior, a partir de ahora los llamaremos Gt4, Gt8 y Gt16, para facilitar la descripción de sus propiedades. Se utilizó el método del test de inversión, descrito en la página 122, en los mismos trece disolventes, cuyos resultados parecen recogidos en la Tabla 20 por orden creciente de polaridad. Disolvente Gt4 Gt8 Gt16 Hexano — 0.5 1 Tolueno — — 50 Éter — 10 20 DCM — 51 35 CHCl3 — — — THF — — 50 iPrOH — 50 13 AcOEt — 16 10 Dioxano — 25 17 Acetona — 20 3 EtOH — 50 5 MeCN — 10 2 MeOH — — 12 Tabla 20. Valores de cmg (mg/mL) de las N-alquilamidas Gt4, Gt8 y Gt16 en 13 disolventes de distinta polaridad. Como puede observarse en la Tabla 20, la N-alquilamida con cadena de cuatro átomos de carbono Gt4 es incapaz de gelificar ninguno de los disolventes utilizados en el test de gelificación, seguramente debido a la baja anfifilia que le confiere al compuesto una cadena alquílica tan corta. El compuesto Gt8 es buen agente gelificante de cinco de los trece disolventes utilizados para el test de gelificación. Destaca como un buen gelificante de éter (10 mg/mL) y MeCN (10 mg/mL), y de forma muy especial como un super-gelificante1 de hexano (0.5 mg/mL). Mejores resultados se obtuvieron para el compuesto Gt16 que resultó ser buen agente organogelante de nueve de los trece disolventes utilizados. Destaca como un muy buen agente gelificante de disolventes polares, como acetona (3 mg/mL), EtOH (5 mg/mL), MeCN (2 mg/mL) y MeOH (12 mg/mL). Además, sigue siendo es un super-gelificante de hexano (1 mg/mL), con una cmg superior a Gt8. 1 Se consideran super-gelificante de un disolvente si es capaz de gelificar ese disolvente a 𝑐𝑚𝑔 ≤ 1 𝑚𝑔/𝑚𝐿. Discusión de resultados 127 De los resultados obtenidos es particularmente interesante que tanto Gt8 como Gt16 son super-gelificantes de hexano con cmg de 0.5 y de 1 mg/mL respectivamente. El resultado es espectacular en el caso de Gt8, con los valores de gelificación de hexano más bajos reportados hasta la fecha. Este resultado convierte a estos dos agente gelificantes en candidatos ideales para estudiar su aplicación en la recuperación de vertidos de aceites industriales y/o petróleo. Todos los geles formados por Gt8 y Gt16 resultaron ser reversibles. Para comprobar la reversibilidad de estos geles a concentraciones ≥ cmg se calentaron hasta llevarlos a la temperatura de ebullición del disolvente y se volvieron a dejar enfriar a temperatura ambiente. Observamos que al realizar este ciclo siempre se obtiene de nuevo el gel en todos los disolventes probados. Estos ciclos de calentamiento y enfriamiento se repitieron de manera consecutiva al menos tres veces sin que cambie el resultado. Esto demuestra que los geles de los compuestos Gt8 y Gt16 son termorreversibles en todos los disolventes que son capaces de gelificar. Además, los geles Gt8 y Gt16 en hexano fueron estables durante un periodo de al menos un año. cmg (m g/m L ) hexano toluen o éter D C M C H C l 3 TH F iP rO H A c O E t dio xano acetona E tO H M eC N M eO H 0 10 20 30 40 50 cmg (m g/m L ) hexa no toluen o éter D C M C H C l 3 TH F iP rO H A c O E t dio xano acetona E tO H M eC N M eO H 0 10 20 30 40 50 Figura 114. Valores de cmg en los 13 disolventes estudiados para los gelificantes Gt8 y Gt16, en formato de gráfico de barras. En la Figura 114 se pueden observar los resultados de gelificación de Gt8 y Gt16 de la Tabla 20 en forma de gráfico de barras para una mejor visualización de los resultados. Vemos que la longitud de cadena es también en este caso un factor determinante de la capacidad gelificante de estos compuestos. El compuesto de cadena de dieciséis gelifica un mayor número de disolventes y con cmg menores que el de cadena de ocho. La diferencia en las cmg de Gt8 y Gt16 es especialmente relevante para los disolventes más polares. En Gt16 se ve una clara tendencia de disminución de la cmg a medida que aumenta la polaridad de los disolventes, mientras que para Gt8 no hay una tendencia clara, siendo capaz de gelificar solo alguno de los disolventes polares. David Reza Ramos 128 Esto indica que la estabilización de los agregados supramoleculares mediante fuerzas de Van der Waals es más importante en disolventes polares que en apolares, como es lógico, ya que estos últimos debilitan los enlaces e hidrógeno. Mientras que en disolventes apolares no vemos un cambio significativo en la capacidad gelificante al variar la longitud de cadena. De hecho, se obtienen menores cmg para Gt8 que para Gt16 en disolventes apolares. 3.4.2.3 Síntesis y estudio de gelificación de los racematos de la N-octilamida rac-128 y la N-hexadecilamida rac-129 del ácido trans-2-((tercbutoxicarbonil)amino)ciclohexano-1-carboxílico ((+/-)-trans-ACHC) (rac-40b) Debido a los buenos resultados obtenidos en los test de gelificación de estos compuestos, particularmente en hexano, decidimos sintetizar y estudiar también la capacidad de gelificación del racemato de la amida (1R,2R)-128 y su enantiómero (1S,2S)-128 (que llamaremos rac-128) y por el racemato de la amida (1R,2R)-129 y su enantiómero (1S,2S)-129 (que llamaremos rac-129). La razón es que si estas mezclas racémicas rac-128 y rac-129 presentan también las buenas propiedades de gelificación de sus componentes enantioméricamente puros ((1R,2R)-128 y (1R,2R)-129), serían mejores candidatos para la búsqueda de una aplicación industrial, al resultar más asequibles sintéticamente y por lo tanto económicamente. Para la síntesis de estas N-alquilamidas racémicas rac-128 y rac-129 nos planteamos en primer lugar buscar un método de síntesis sencillo, que nos permita sintetizar de forma económica, a escala de multigrano, su precursor, el ácido trans-2-((terc-butoxicarbonil)amino)ciclohexanocarboxílico (rac-40b). Se optó por partir del anhídrido hexahidroftálico 130 comercial (Esquema 26). Esquema 26. Mezcla racémica rac-40b y su anhidrido precursor 130. En primer lugar, se sintetizó el cis-aminoéster racémico rac-71a protegido en su extremo N-terminal como terc-butoxicarbonil siguiendo el procedimiento descrito en la bibliografía (Esquema 27).141 Esquema 27. Síntesis del cis-aminoéster racémico rac-71a. Discusión de resultados 129 A continuación, el β-amino éster rac-71a se sometió a una reacción de epimerización utilizando NaOMe en MeOH a reflujo, lo que dio lugar a una mezcla del racemato del trans-β-amino éster rac-40a y del racemato de partida, en una proporción 10 a 1, con un rendimiento del 75 % (Esquema 28). El racemato mayoritario rac-40a pudo ser aislado mediante la cristalización de esta mezcla. Esquema 28. Epimerización del racemato del cis-β-aminoéster rac-71a al trans-β-aminoéster rac-40a. Una vez obtenido el trans-β-aminoéster racémico rac-40a puro se estudió su reacción de acoplamiento con la n-octilamina para obtener la N-alquilamida racémica rac-128, para lo que fue necesario ensayar varias condiciones de reacción. En un primer lugar se intentó la reacción de amidación directa del éster con la n-butilamina en THF a reflujo, utilizando como catalizador 2-hidroxipiridina (Esquema 29). En estas condiciones se recuperó únicamente el producto de partida, lo que indica que la amidación directa del éster no resulta viable en este caso. Esquema 29. Condiciones de síntesis de rac-128 a partir de rac-40a, utilizando la 2-hidroxipiridina como catalizador. Fue necesario hidrolizar el éster rac-40a, utilizando NaOH en una mezcla MeOH/H2O (2:1), lo que condujo al ácido trans-2-((terc-butoxicarbonil)amino)ciclohexano-1-carboxílico (rac-40b) con un rendimiento del 95 % (Esquema 30). Sus propiedades físicas y espectroscópicas resultaron ser idénticos a los de su componente enantioméricamente puro (1R,2R)-40b, salvo su rotación óptica que fue, obviamente “0”. Esquema 30. Síntesis del ácido trans-2-((terc-butoxicarbonil)amino)ciclohexano-1-carboxílico (rac-40b). Por último, se llevó a cabo el acoplamiento peptídico entre el ácido rac-40b y n-octilamina utilizando PyBop como agente acoplante y DIEA como base en DMF, lo que dio David Reza Ramos 130 lugar a la N-alquilamida deseada rac-128 con un 89 % de rendimiento. De forma totalmente similar se realizó el acoplamiento del ácido rac-40b con la n-hexadecilamina, lo que nos condujo a la N-alquilamida rac-129 esperada, que se obtuvo con un 94 % de rendimiento (Esquema 31). Esquema 31. Síntesis de las N-alquilamidas racémicas rac-128 y rac-129. Una vez sintetizadas ambas N-alquilamidas racémicas rac-128 y rac-129, que llamaremos a partir de ahora rGt8 y rGt16, para facilitar la descripción de sus propiedades, se procedió a realizar estudios de gelificación, procediendo de forma similar a los dos casos anteriormente descritos, en el conjunto usual de trece disolventes de distinta constante dieléctrica (hexano, tolueno, éter etílico, DCM, CHCl3, THF, iPrOH, AcOEt, dioxano, acetona, EtOH, MeCN y MeOH). Los resultados obtenidos en este estudio, expresados con el dato de la cmg (mg/mL), aparecen recogidos en la Tabla 21. Disolvente rGt8 rGt16 Hexano 28.5 5 Tolueno — 6.25 Éter — 5 DCM — 16.7 CHCl3 — — THF — 50 iPrOH — 25 AcOEt 51 8.3 Dioxano 7 12.5 Acetona 25 2.5 EtOH — 16.7 MeCN 25 5 MeOH — 10 Tabla 21. Valores de cmg (mg/mL) de las N-alquilamidas rGt8 y rGt16 en 13 disolventes de distinta polaridad. En el caso del racemato rGt8, los resultados de gelificación son claramente peores que para su análogo enantioméricamente puro Gt8 e incluso peores que los de su análogo con configuración cis Gc8. Solo es capaz de gelificar MeCN (7 mg/mL) por debajo de 20 mg/mL. Por lo tanto, debemos considerarlo como un mal agente gelificante. Sin embargo, como se muestra en la Tabla 21, los resultados obtenidos para el racemato rGt16 fueron diametralmente opuestos al del racemato rGt8, resultando ser un buen agente Discusión de resultados 131 organogelante de diez de los trece disolventes ensayados, superando incluso a su análogo enantioméricamente puro Gt16. Resultó ser capaz de mantener la buena capacidad de éste para gelificar disolventes polares, mejorándola para gelificar disolventes apolares, como tolueno (6.25 mg/mL), éter (5 mg/mL) o DCM (16.7 mg/mL). Además, sigue siendo muy buen agente gelificante de hexano (5 mg/mL). cmg (m g /m L) hexano tolueno éter D C M C H C l 3 TH F iP rO H A c O E t dioxan o ace ton a E tO H M e C N M eO H 0 10 20 30 40 50 cmg (m g /m L) hexano tolueno éter D C M C H C l 3 TH F iP rO H A c O E t dioxan o ace ton a E tO H M e C N M eO H 0 10 20 30 40 50 Figura 115. Valores de cmg en los 13 disolventes estudiados para los gelificantes rGt8 y rGt16, en formato de gráfico de barras. En la Figura 115 se presentan los resultados de gelificación de rGt8 y rGt16 en forma de código de barras. Destaca con claridad rGt16 como un excelente agente gelificante, capaz de gelificar tanto disolventes polares como apolares, siendo peores los resultados para disolventes de polaridad intermedia. Esto puede ser racionalizado asumiendo que: - Los disolventes polares solo interfieren las asociaciones del gelificante por enlaces de hidrógeno entre sus grupos C=O y NH, no afectando a las interacciones de las cadenas alquílicas por fuerzas de Van der Waals. - Los disolventes apolares solo interfieren las asociaciones de las cadenas alquílicas por fuerzas de Van der Waals, no afectando a las interacciones por enlaces de hidrógeno entre sus grupos C=O y NH del gelificante. - Los disolventes de polaridad media interfieren ambas asociaciones del gelificante (enlaces de hidrógeno entre sus grupos C=O y NH y asociaciones de las cadenas alquílicas por fuerzas de Van der Waals), dificultando o incluso imposibilitando el proceso de gelificación. David Reza Ramos 132 3.4.2.4 Estudios estructurales de las N-alquilamidas Gt8, Gt16, rGt8 y rGt16 Los geles moleculares se forman a través de un proceso de autoensamblado jerarquizado cuyo mecanismo, descrito en la introducción de esta segunda parte de la tesis doctoral, sigue los siguientes pasos:142 - En primer lugar, las moléculas discretas del gelificante se ordenan mediante interacciones moleculares no covalentes que dan lugar a la formación de polímeros supramoleculares llamados fibrillas o Nivel 1. - A continuación, estas fibrillas se unen entre sí para formar haces de fibrillas, que denominaremos fibras o Nivel 2. - Finalmente, estas fibras interaccionan entre si entrecruzándose para dar lugar a una red tridimensional que es la que sostiene el gel en su forma macroscópica o Nivel 3. Para conocer cómo ocurre el proceso anteriormente descrito en el caso de nuestros gelificantes (Gt8, Gt16, rGt8 y rGt16) decidimos llevar a cabo un estudio estructural de sus geles en hexano, por ser éste un disolvente que son capaces de gelificar todos ellos y del que dos de ellos son agentes super-gelificantes (Gt8, Gt16). Para determinar el tipo de estructuración de nuestros geles, desde la escala microscópica a la macroscópica, así como el mecanismo de la gelificación, se llevaron a cabo estudios que incluyeron técnicas espectroscópicas (FTIR y CD), microscópicas (SEM y TEM) y de difracción de Rayos X. 3.4.2.4.1 Espectroscopía de Infrarrojo (IR) La Espectroscopía de IR puede utilizarse también para caracterizar el proceso de formación de geles supramoleculares. Proporciona información sobre el ensamblaje de los bloques de construcción a escala molecular y permite determinar las interacciones no covalentes responsables de la gelificación. Esta técnica es especialmente efectiva para caracterizar aquellos gelificantes en los que la principal fuerza impulsora en la formación del gel es la interacción por medio de enlaces de hidrógeno intermoleculares. Si durante la gelificación se forman enlaces de hidrógeno debería observarse un efecto batocrómico para las señales de NH y C=O y un efecto hipsocrómico para la señal C=N, con respecto a las señales en disolución. Para observar estos efectos en la estructura supramolecular del gelificante es necesario realizar al menos dos espectros, uno del agente gelificante en disolución y otro del gel/xerogel. Para determinar la presencia de enlaces de hidrógeno en los geles formados en hexano por nuestros cuatro agentes gelificantes (Gt8, Gt16, rGt8 y rGt16) se realizaron medidas de IR para cada uno ellos: IR del compuesto en disolución de MeOH/DCM 1:10 e IR del xerogel en hexano (gel al que se le retira el disolvente a vacío manteniendo la estructura supramolecular del gel) ambos la cmg correspondiente en hexano a cada uno de los compuestos (Tabla 20, página 126 y Tabla 21, página 130). Los resultados de este estudio se exponen a continuación, presentando las frecuencias a las que aparecen las señales de tensión de los enlaces N-H y C=O (Tabla 22). Parte experimental 235 5.4.4 (R)-2-((3aR,4S,5S,7R,7aR)-4-((R)-2-((3aR,4S,5S,7R,7aR)-4- (((Aliloxi)carbonil)ami-no)-7-((terc-butildimetilsilil)oxi)-2,2-dimetilhexahidro- benzo[d][1,3]dioxol-5-carbo-xamido)propanamido)-7-((terc-butildimetilsilil)oxi)- 2,2-dimetilhexahidroben-zo[d][1,3]dioxol-5-carboxamido)propanoato de metilo (74a) Sobre una disolución del ácido de partida 73b (110 mg, 0.22 mmol) en DCM seco (2.0 mL) se añadieron HOBt (36.0 mg, 0.238 mmol) y PyBOP (124 mg, 0.24 mmol) y la disolución resultante se agitó durante 5 min a t.a. bajo atmósfera de argón. Sobre esta mezcla se añadió una disolución de la amina 73c (78.80 mg, 0.18 mmol) en DCM seco (2.0 mL) y DIEA (96 μL, 0.55 mmol) y se mantuvo la agitación durante 21 h. Al cabo de este tiempo se observó por ccf (AcOEt/Hex 2:3) la desaparición del producto de partida (Rf = 0.4) y la aparición de un producto de reacción de menor polaridad (Rf = 0.3). La reacción se diluyó entonces con DCM (36 mL), se lavó con una disolución acuosa de HCl 1M (40 mL), H2O (40 mL), una disolución acuosa saturada de NaHCO3 (40 mL) y H2O (40 mL). Las fases orgánicas reunidas se secaron con Na2SO4 anhidro, se evaporó el disolvente a vacío y el residuo resultante se purificó por cromatografía en columna eluyendo con una mezcla de (AcOEt/Hex 2:3) para dar lugar a 104 mg (57% en tres pasos) del (R)-2-((3aR,4S,5S,7R,7aR)-4-((R)-2- ((3aR,4S,5S,7R,7aR)-4-(((aliloxi)carbonil)amino)-7-((terc-butildimetilsilil)oxi)-2,2- dimetilhexahidroben-zo[d][1,3]dioxol-5-carboxamido)propanamido)-7-((tercbutildimetilsilil)oxi)-2,2-dimetilhexa-hidrobenzo[d][1,3]dioxol-5-carboxamido)propanoato de metilo (74a) como un sólido amorfo de color blanco. [α]D23: +3.24 (c 0.8, CHCl3). RMN-1H (CDCl3, 300 MHz, ppm): 0.04 (s, 3H, Si-CH3), 0.06 (s, 3H, Si-CH3), 0.09 (s, 6H, Si-(CH3)2), 0.85 (s, 9H, SiC-(CH3)3), 0.87 (s, 9H, SiC-(CH3)3), 1.21–1.38 (m, 12H, 2xC- (CH3)2), 1.38–1.43 (m, 6H, 2x CH3), 1.88–2.03 (m, 4H, 2xCH2), 2.78–2.89 (m, 2H, 2x COCH), 3.73 (s, 3H, OCH3), 3.77–3.84 (m, 1H, N-CH), 3.96–4.02 (m, 1H, N-CH), 4.05–4.30 (m, 6H, 6x O-CH), 4.41–4.48 (m, 2H, O- CH2), 4.48–4.56 (m, 2H, N-CH), 5.15 (d, J = 10.4 Hz, 1H, C=CH2), 5.26 (d, J = 17.2 Hz, 1H, C=CH2), 5.86 (ddt, J = 16.4, 10.7, 5.7 Hz, 1H, C=CH), 6.46 (d, J = 9.4 Hz, 1H, NH), 6.88 (d, J = 5.4 Hz, 1H, NH), 7.35 (d, J = 7.2 Hz, 1H, NH), 7.65 (d, J = 9.4 Hz, 1H, NH). RMN-13C (CDCl3, 75 MHz, ppm): -5.0 (Si-CH3), -5.0 (Si-CH3), -5.0 (Si-CH3), -4.4 (Si- CH3), 16.4 (3x CH3), 17.3 (3x CH3), 18.0 (SiC), 18.1 (SiC), 24.5 (CH3), 25.3 (CH3), 25.7 (CH3), 25.8 (CH3), 27.0 (CH3), 27.6 (CH3), 27.7 (CH2), 29.4 (CH2), 39.1 (CH), 41.2 (CH), 47.9 (N-CH), 48.7 (N-CH), 50.0 (N-CH), 50.2 (N-CH), 52.7 (O-CH3), 65.8 (O-CH2), 68.5 (O- CH), 71.1 (O-CH), 75.5 (O-CH), 75.8 (O-CH), 77.4 (O-CH), 79.7 (O-CH), 108.3 (C), 108.4 David Reza Ramos 236 (C), 117.4 (CH2), 132.8 (CH), 156.4 (C=O, uretano), 173.0 (C=O, amida), 173.1 (C=O, amida), 173.3 (C=O, amida), 175.2 (C=O, éster). EMAR (ESI+): calculado para C43H76N4NaO13Si2 935.4840; encontrado 935.4839. IR (ν, cm-1): 3313 (Amida A), 1729 (éster), 1650 (Amida I), 1536 (Amida II). Parte experimental 237 Figura 191. Espectro de RMN-1H y de RMN-13C y DEPT del compuesto 74a. David Reza Ramos 238 5.4.5 (R)-2-((3aR,4S,5S,7R,7aR)-4-((R)-2-((3aR,4S,5S,7R,7aR)-4-Amino-7-((terc-butil- dimetilsilil)oxi)-2,2-dimetilhexahidrobenzo[d][1,3]dioxol-5- carboxamido)propana-mido)-7-((terc-butildimetilsilil)oxi)-2,2- dimetilhexahidrobenzo[d][1,3]dioxol-5-carboxamido) propanoato de metilo (74b) Sobre una disolución desoxigenada del éster de partida 74a (30 mg, 0.03 mmol) en DCM seco (1 mL) se añadieron PhSiH3 (16 µL, 0.13 mmol) y Pd(PPh3)4 (4 mg, 0.003 mmol). La mezcla resultante se agitó durante 6 h a t.a. bajo atmósfera de argón, al cabo de las cuales se observó por ccf (AcOEt/Hex 1:1) la desaparición del producto de partida (Rf = 0.2) y la aparición del producto de reacción (Rf = 0.1). La disolución resultante se lavó con H2O (3x15 mL), la fase orgánica se secó con Na2SO4 anhidro, se concentró a vacío y el producto obtenido se utilizó en la reacción de formación del pentámero 74b sin purificación adicional. 5.4.6 (R)-2-((3aR,4S,5S,7R,7aR)-4-((R)-2-((3aR,4S,5S,7R,7aR)-4-((R)-2-(((Benciloxi)carbonil)amino)propanamido)-7-((terc-butildimetilsilil)oxi)-2,2- dimetilhexahidroben-zo[d][1,3]dioxol-5-carboxamido)propanamido)-7-((tercbutildimetilsilil)oxi)-2,2-dimetilhexahidrobenzo[d][1,3]dioxol-5-carboxamido) propanoato de metilo (75a) Sobre una disolución del ácido de partida Cbz-N-Ala (72b) (8 mg, 0.03 mmol) en DCM seco (0.6 mL) se añadieron HOBt (6.0 mg, 0.04 mmol) y PyBOP (20.3 mg, 0.04 mmol), la disolución resultante se agitó durante 5 min a t.a. bajo atmósfera de argón. Sobre esta mezcla se añadió una disolución de la amina 74b (27.4 mg, 0.03 mmol) en DCM seco (0.6 mL) y DIEA (16 μL, 0.09 mmol) y se mantuvo la agitación durante 19 h. Al cabo de las cuales se observó por ccf (AcOEt/Hex 2:3) la desaparición del producto de partida (Rf = 0.1) y la aparición de un producto de reacción (Rf = 0.3). La mezcla de reacción se diluyó entonces con DCM (20 mL), se lavó con disolución acuosa de HCl 1M (20 mL), H2O (20 mL), disolución acuosa saturada de NaHCO3 (20 mL) y H2O (20 mL). Las fases orgánicas reunidas se secaron con Na2SO4 anhidro, se evaporó el disolvente a vacío y el residuo resultante se purificó por cromatografía en columna, eluyendo con una mezcla de (AcOEt/Hex 2:3) para dar lugar a 29 Parte experimental 239 mg (94%) del (R)-2-((3aR,4S,5S,7R,7aR)-4-((R)-2-((3aR,4S,5S,7R,7aR)-4-((R)-2- (((benziloxi)carbonil)ami-no)propanamido)-7-((terc-butildimetilsilil)oxi)-2,2- dimetilhexahidrobenzo[d][1,3]dioxol-5-carboxamido)propanamido)-7-((tercbutildimetilsilil)oxi)-2,2-dimetilhexahidrobenzo[d][1,3] dioxol-5-carboxamido) propanoato de metilo (75a) como un sólido amorfo de color blanco. [α]D23: +19.2 (c 0.6, CHCl3) RMN-1H (CDCl3, 300 MHz, ppm): 0.05 (s, 3H, Si-CH3), 0.05 (s, 3H, Si-CH3), 0.08 (s, 6H, 2xSi-CH3), 0.87 (s, 18H, 6xSiC-CH3), 1.33–1.23 (m, 9H, 3x CH3), 1.46–1.38 (m, 12H, 4xCH3), 2.00–1.73 (m, 4H, 2xCH2 ), 2.77–2.68 (m, 1H, CH), 2.89–2.79 (m, 1H, CH), 3.76 (s, 3H, OCH3), 3.92–3.79 (m, 2H, 2xNCH), 4.28–4.02 (m, 6H, 6xOCH), 4.27–4.20 (m, 1H, NCH), 4.36 (dd, J = 14.9, 8.9 Hz, 1H, NCH), 4.53 (dt, J = 14.9, 7.3 Hz, 1H, NCH), 5.06 (ABq, J = 12.3 Hz, 2H, BnO-CH2), 5.61 (d, J = 5.6 Hz, 1H, NH), 7.31 (s, 5H, CH-Ar), 7.53 (d, J = 9.1 Hz, 1H, NH), 7.74 (d, J = 5.2 Hz, 1H, NH), 7.89 (d, J = 9.5 Hz, 1H, NH), 7.98 (d, J = 7.5 Hz, 1H, NH). RMN-13C (CDCl3, 75 MHz, ppm): -4.8 (Si-CH3), -4.4 (Si-CH3), -4.3 (2xSi-CH3), 16.0 (CH3), 16.5 (CH3), 17.7 (CH3), 18.1 (2xSi-C), 24.7 (CH3), 25.1 (CH3), 25.8 (CH3), 27.3 (2xCH3), 29.3 (CH2), 29.3 (CH2), 41.3 (CH), 41.7 (CH), 48.2 (NCH), 49.0 (2xNCH), 51.6 (NCH), 52.0 (NCH), 52.7 (OCH3), 67.0 (OCH2), 70.1 (OCH), 70.2 (OCH), 74.5 (OCH), 74.8 (OCH), 79.5 (OCH), 79.7 (OCH), 108.4 (C), 108.5 (C), 127.8 (CH-Ar), 128.11 (CH-Ar), 128.48 (CH-Ar), 134.00 (2xCH-Ar), 136.3 (C-Ar), 156.4 (C=O, uretano), 173.2 (C=O, amida),173.5 (C=O, amida), 174.1 (C=O, amida), 175.2 (C=O, amida), 176.0 (C=O, éster). EMAR (ESI+): calculado para C50H83N5NaO14Si2 1056.5367; encontrado, 1056.5370. IR (ν, cm-1): 3315 (Amida A), 1727 (éster), 1650 (Amida I), 1536 (Amida II). David Reza Ramos 240 Figura 192. Espectro de RMN-1H y de RMN-13C y DEPT del compuesto 75a. Parte experimental 241 5.4.7 (R)-2-((3aR,4S,5S,7R,7aS)-4-((R)-2-((3aR,4S,5S,7R,7aS)-4-((R)-2-(((Benciloxi)carbonil)amino)propanamido)-7-hidroxi-2,2-dimetilhexahidro-benzo[d][1,3]dioxol- 5-carboxamido)propanamido)-7-hidroxi-2,2-dime- tilhexahidrobenzo[d][1,3]dioxol-5-carboxamido) propanoato de metilo (75b) Sobre una disolución del pentapéptido de partida 75a (40 mg, 0.04 mmol) en THF seco (585 μL) se añadió una disolución de TBAF (1 M) en THF (81 μL, 0.08 mmol) y la mezcla resultante se agitó a t.a. durante 24 h. Al cabo de este tiempo se observó por ccf (AcOEt/Hex 1:1) la desaparición del producto de partida (Rf = 0.5) y la aparición del producto de reacción (Rf = 0.1). La reacción se concentró a sequedad y el residuo obtenido se purificó por cromatografía en columna, eluyendo con una mezcla (AcOEt/Hex 3:1), para dar 8 mg (26 %) del (R)-2-((3aR,4S,5S,7R,7aS)-4-((R)-2-((3aR,4S,5S,7R,7aS)-4-((R)-2-(((benziloxi)carbonil)- amino)propanamido)-7-hidroxi-2,2-dimetilhexahidrobenzo[d][1,3]dioxol-5-carboxamido)propanamido)-7-hidroxi-2,2-dimetilhexahidrobenzo[d][1,3]dioxol-5-carboxamido)propanoato de metilo (75b) como un sólido blanco. [α]D24: +94.1 (c 0.8 CHCl3) RMN-1H (CDCl3, 300 MHz, ppm): 1.25 (s, 3H, CH3), 1.36 (s, 3H, CH3), 1.39 (d, J = 7.6 Hz, 3H, CH3), 1.41 (d, J = 3.0 Hz, 3H, CH3), 1.44 (d, J = 3.5 Hz, 3H, CH3), 1.47 (s, 3H, CH3), 1.51 (s, 3H, CH3), 1.93–2.10 (m, 2H, CH2), 2.12–2.26 (m, 2H, CH2) 2.73 (m, 1H, CH), 2.89 (m, 1H, CH), 3.78 (s, 3H, O-CH3), 3.89–4.01 (m, 2H, 2xCH), 4.05–4.25 (m, 6H, 6xCH), 4.28–4.36 (m, 1H, CH), 4.37–4.45 (m, 1H, CH), 4.47–4.58 (m, 1H, CH), 5.05 (ABq, J = 12.3 Hz, 2H, CH2) 5.36 (d, J = 5.2 Hz, 1H, NH, uretano), 7.01 (m, 1H, OH o NH), 7.10 (m, 1H, OH o NH), 7.33 (m, J = 3.3 Hz, 5H, 5xArCH), 7.59 (m, 2H, 2xOH o 2xNH), 8.15 (d, J = 5.6 Hz, 1H, NH), 8.20 (d, J = 10.1 Hz, 1H, NH). RMN-13C (CDCl3, 75 MHz, ppm): 14.3 (CH3), 16.0 (CH3), 16.5 (CH3), 17.5 (CH3), 26.3 (CH3), 28.3 (CH3), 28.4 (CH3), 28.8 (CH2), 29.1 (CH2), 29.8 (CH2), 44.5 (2xCH-CO), 49.2 (N-CH), 49.5 (N-CH), 50.5 (N-CH), 51.9 (N-CH), 52. 4 (N-CH), 53.2 (O-CH3), 65.4 (O-CH), 65.7 (O-CH), 67.3 (CH2), 73.3 (O-CH), 73.6 (O-CH), 79.7 (O-CH), 80.2 (O-CH), 108.5 (C), 108.8 (C), 128.0 (CH-Ar), 128.4 (CH-Ar), 128.7 (CH-Ar), 129.9 (CH-Ar), 136.2 (C), 156.6 (C=O, uretano), 173.8 (C=O, amida), 174.5 (C=O, amida), 174.7 (C=O, amida), 175.8 (C=O, amida), 176.0 (C=O, éster). EMAR (ESI+): calculado para C38H55N5NaO14 828.3638; encontrado 828.3638. IR (ν, cm-1): 3311 (Amida A), 1720 (éster), 1647 (Amida I), 1546 (Amida II). David Reza Ramos 242 Figura 193. Espectro de RMN-1H y de RMN-13C y DEPT del compuesto 75b. Parte experimental 243 5.4.8 (R)-2-((1S,2S,3R,4S,5R)-2-((R)-2-((1S,2S,3R,4S,5R)-2-((R)-2-(((Bencil-oxi)carbonil)amino)propanamido)-3,4,5-trihidroxiciclohexanocarboxamida)propanamido)- 3,4,5-trihidroxiciclohexanecarboxamido) propanoato de metilo (75c) Una disolución del pentapéptido de partida 75b (51 mg, 0.05 mmol) en una mezcla de TFA/MeOH/H2O 2:1:1 (8 mL) se agitó durante 28 h a t.a., al cabo de este tiempo se observó por ccf (AcOEt/Hex 2:3) la desaparición del producto de partida (Rf = 0.4) y la aparición de un producto de reacción de mayor polaridad (Rf = 0.1). La mezcla de reacción se concentró a sequedad para dar lugar a un sólido blanco que tras ser purificado por cromatografía en fase reversa (Columna C18; eluyente del 5% al 95% en 21 min. en MeCN-agua+0,1% de TFA) dio lugar a 12 mg (33% de rendimiento) del (R)-2-((1S,2S,3R,4S,5R)-2-((R)-2- ((1S,2S,3R,4S,5R)-2-((R)-2-(((benziloxi)carbonil)amino)propanamido)-3,4,5- trihidroxiciclohexanocarboxami-do)propanamido)-3,4,5-trihidroxiciclohexanecarboxamido) propanoato de metilo (75c) como un sólido blanco. [α]D24: +48.4 (c 0.1, CHCl3). RMN-1H (CD3CN, 600 MHz, ppm): 1.17–1.49 (m, 9H, 3x CH3), 1.68 (m, 2H, CH2), 2.90 (s, 2H, CH2), 3.36 (s, 2H, 2xCHC=O), 3.42 (s, 3H, 3xOCH), 3.59 (s, 3H, 3xOCH), 3.78 (s, 3H, OCH3), 4.12 (m, 2H, 2xNCH), 4.40 (m, 3H, 3xONCH), 5.05 (ABq, J = 36.7 Hz, 2H, CH2- Ar), 6.16 (s, 1H, OH), 6.48 (s, 1H, NH), 6.67 (s, 1H, OH), 7.34 (h, J = 7.9 Hz, 9H, 5xCH-Ar + 4xOH), 7.54 (s, 1H, NH), 7.73 (s, 1H, NH), 7.93 (s, 1H, NH), 8.12 (s, 1H, NH). RMN-13C (CDCl3, 75 MHz, ppm): 15.8 (CH3), 16.4 (CH3), 17.3 (CH3), 26.7 (CH2), 29.58 (CH2), 44.6 (2xCH), 48.8 (2xNCH), 51.2 (2xNCH), 52.9 (OCH3), 66.9 (OCH2), 68.8 (2xOCH), 73.8 (4xOCH), 127.6 (2xCH-Ar), 128.0 (CH-Ar), 128.4 (CH-Ar), 133.9(CH-Ar), 136.2 (C-Ar), 156.72 (C=O), 174.3 (2xC=O), 174.9 (2xC=O), 175.1 (2xC=O). EMAR (ESI+): calculado para C32H47N5NaO14 748.3012; encontrado 748.3010. IR (ν, cm-1): 3310 (Amida A), 1724 (éster), 1654 (Amida I), 1548 (Amida II). David Reza Ramos 244 Figura 194. Espectro de RMN-1H y de RMN-13C y DEPT del compuesto 75c. Parte experimental 251 Figura 203. Espectro de TOCSY del péptido 75c, tmix = 60 ms (CD3CN, 600 MHz, 238 K). David Reza Ramos 252 Figura 204. Espectro de HSQC del péptido 75c (CD3CN, 600 MHz, 238 K). Parte experimental 253 Figura 205. Espectro de ROESY del péptido 75c, tmix = 400 ms (CD3CN, 600 MHz, 238 K). David Reza Ramos 254 Figura 206. Superposición de los espectros ROESY (rojo/azul, tmix 400 ms) y TOCSY (negro, tmix 60 ms) del péptido 75c (CD3CN, 600 MHz, 238 K). Parte experimental 255 Figura 207. Superposición de los espectros ROESY (rojo/azul, tmix 400 ms) y TOCSY (negro, tmix 60 ms) del péptido 75c (CD3CN, 600 MHz, 238 K). Expansión de la región (Hα+Hβ)/HN. David Reza Ramos 256 5.5.3 Espectroscopía de RMN del pentapéptido 75c en CD3OH Figura 208. RMN-1H del péptido 75c, 1 mM en CD3OH (500 MHz). Parte experimental 257 Figura 209. Espectro de TOCSY del péptido 75c, tmix = 60 ms (CD3OH, 500 MHz, 318 K). David Reza Ramos 258 Figura 210. Espectro de NOESY del péptido 75c, tmix = 200 ms (CD3OH, 500 MHz, 318 K). Parte experimental 259 Figura 211. Superposición de los espectros NOESY (rojo/azul, tmix 500 ms) y TOCSY (negro, tmix 60 ms) del péptido 75c (CD3OH, 500 MHz, 318 K). David Reza Ramos 260 5.6 SÍNTESIS DE LOS HEXAPÉPTIDOS 81a, 81b Y 81c 5.6.1 Síntesis de la sal de ácido trifluoroacético de la (S)-2-amino-N-((S)-1- (metilamino)-1-oxopropan-2-il) propanamida (78b) Se disuelve 78a (300 mg, 1.10 mmol) en una mezcla TFA/H2O 1:1 (3 mL) y se agitó a t.a. durante 1 h. Al cabo de ese tiempo se observó por ccf (AcOEt/Hex 1:2) la desaparición del producto de partida (Rf = 0.5) y la aparición de un producto de reacción (Rf = 0.1). La reacción se concentró a sequedad en el rotavapor, coevaporando con tolueno. Se obtuvo de esta forma la sal de ácido trifluoroacético de la (S)-2-amino-N-((S)-1-(metilamino)-1- oxopropan-2-il) propanamida (78b) (300 mg, 100 %) como un sólido blanco el cual se usó directamente en la siguiente reacción. 5.6.2 Síntesis del (3aR,4R,5R,7R,7aR)-7-((terc-butildimetilsilil)oxi)-2,2-dimetil-4-(nitrometil)hexahidrobenzo[d][1,3]dioxolo-5-carboxilato de pentafluorofenol (37d) En un matraz de fondo redondo de 50 mL se disolvió el nitro ácido 37c (0.50 g, 1.28 mmoles) en CH2Cl2 seco (30.0 mL). La disolución se enfrió a 0 ºC y sobre ella se añadieron DIC (0.30 mL, 1.92 mmol, 1.5 eq) y PFF (0.71 g, 3.84 mmol, 3.0 eq). La reacción se agitó bajo argón durante 3 h a 0 ºC y 12 h a t.a., tras las cuales se observó por ccf (AcOEt/Hex 1:2) la desaparición del producto de partida (Rf = 0.3) y la aparición de un producto de reacción más apolar (Rf = 0.8). El crudo de reacción se añadió sobre una disolución saturada de NaHCO3 (20 mL), se decantó y la fase acuosa se extrajo con CH2Cl2 (3x15 mL). Los extractos orgánicos reunidos se secaron con Na2SO4 anhidro, se filtraron y se concentraron a sequedad. Se obtuvo de este modo el (3aR,4R,5R,7R,7aR)-7-((terc-butildimetilsilil)oxi)-2,2-dimetil-4- (nitrometil)hexahidrobenzo[d][1,3]dioxolo-5-carboxilato de pentafluorofenol (37d) (0.50 g, 70%) como un sólido amorfo de aspecto blanquecino. RMN-1H (CDCl3, 300 MHz, ppm): 0.13 (s, 6H, CH3), 0.91 (s, 9H, (CH3)3), 1.38 (s, 3H, CH3), 1.50 (s, 3H, CH3), 2.07-2.20 (m, 2H, CH2), 2.40-2.57 (m, 1H, CH), 3.14-3.32 (m, 1H, CH), 4.02-4.11 (m, 1H, CH), 4.24 (dd, J = 9.2, 4.9 Hz, 1H, CH), 4.31-4.39 (m, 1H, CH), 4.58- 4.81 (m, 2H, CH2). Parte experimental 267 5.6.6 Síntesis de la (3aR,4R,5R,7R,7aR)-7-((terc-butildimetilsilil)oxi)-4- (((3aR,4R,5S,7R,7aR)-7-((terc-butildimetilsilil)oxi)-2,2-dimetil-4- (nitrometil)hexahi-drobenzo[d][1,3]dioxol-5-carboxamido)metil)-2,2-dimetil-N- ((S)-1-(metilamino)-1-oxopropan-2-il)hexahidrobenzo[d][1,3]dioxol-5- carboxamida (80a) En un matraz de fondo redondo de 25 mL se disolvió el tripéptido 79b (0.16 g, 0.31 mmol) en DMF seca (3 mL), se añadió DIEA (0.065 mL, 0.37 mmol, 1.2 eq) y se agitó bajo argón a t.a. hasta comprobar que el pH era básico. Sobre esta disolución se añadió el compuesto 36d (0.19 g, 0.34 mmol, 1.1 eq) y se mantuvo la agitación durante 12 h, al cabo de las cuales se comprobó por ccf (AcOEt) la desaparición del producto de partida (Rf = 0.1) y la aparición de un producto de reacción menos polar (Rf = 0.3). La mezcla resultante se diluyó con AcOEt (20 mL), se lavó con disolución acuosa saturada de cloruro amónico (2x25 mL) y con H2O (2x75 mL). La fase orgánica se secó con Na2SO4 anhidro, se filtró y concentró a sequedad. El crudo así obtenido se purificó por cromatografía en columna (AcOEt), para dar lugar la (3aR,4R,5R,7R,7aR)-7-((terc-butildimetilsilil)oxi)-4-(((3aR,4R,5S,7R,7aR)-7-((tercbutildime-tilsilil)oxi)-2,2-dimetil-4-(nitrometil)hexahidrobenzo[d][1,3]dioxol-5- carboxamido)metil)-2,2-dimetil-N-((S)-1-(metilamino)-1-oxopropan-2- il)hexahidrobenzo[d][1,3]dioxol-5-car-boxamida (80a) (0.228 g, 83 %) como un sólido amorfo de color blanco. [α]D24: +10.4 (c 2.1, CHCl3). RMN-1H (CDCl3, 300 MHz, ppm): 0.05 (s, 3H, SiCH3), 0.08 (s, 3H, SiCH3), 0.09 (s, 3H, SiCH3), 0.11 (s, 3H, SiCH3), 0.86 (s, 9H, C(CH3)3), 0.89 (s, 9H, C(CH3)3), 1.32 (6H, 2xCH3), 1.38 (6H, 2xCH3), 1.46 (s, 3H, CH3), 1.49 (3H, CH3), 1.56–1.81 (m, 2H, CH2), 1.96 (t, J = 11.5 Hz, 3H, CH2 + CH), 2.37–2.53 (m, 1H, COCH), 2.65 (p, J = 7.1 Hz, 1H, COCH), 2.79 (d, J = 4.5 Hz, 4H, NCH3 + CH), 3.13–3.44 (m, 2H, NCH2), 3.82–4.15 (m, 4H, 4xCH), 4.22 (s, 1H, CH), 4.36 (t, J = 7.4 Hz, 1H, CH), 4.50 (q, J = 6.7 Hz, 2H, 2xCH), 4.60 (d, J = 6.9 Hz, 2H, NCH2), 6.82 (s, 1H, NH), 6.85 (d, J = 4.9 Hz, 1H, NH), 6.99 (d, J = 7.6 Hz, 1H ,NH), 7.52 (d, J = 6.8 Hz, 1H, NH). RMN-13C (CDCl3, 75 MHz, ppm): -4.9 (CH3), -4.8 (CH3), -4.6 (CH3), -4.5 (CH3), 18.1 (C), 18.2 (C), 18.8 (CH3), 19.2 (CH3), 25.4 (CH3), 25.9 (6xCH3), 26.3 (CH3), 26.4 (CH3), 27.8 (CH3), 28.4 (CH3), 31.4 (CH2), 32.5 (CH2), 38.1 (CH), 39.3 (CH), 39.7 (2xCH), 41.4 (CH), 48.9 (NCH2), 49.4 (CH), 67.9 (CH), 70.2 (CH), 73.6 (CH), 75.0 (NCH2), 76.7 (CH), 77,6 (CH), 79.7 (CH), 108.9 (C), 109.2 (C), 172.1 (C=O), 172.8 (C=O), 173.3 (C=O), 174.7 (C=O). David Reza Ramos 268 IR (ν, cm-1): 3301 (Amida A), 1630 (Amida I) y 1553 (Amida II). EMAR (ESI+): Calculado para C41H76N5O12Si2 [M+H]+, 886.5020; encontrado 886.5024. Parte experimental 269 Figura 215. Espectro de RMN-1H y de RMN-13C y DEPT del compuesto 80a. David Reza Ramos 270 5.6.7 Síntesis de la (3aR,4R,5S,7R,7aR)-4-(aminometil)-7-((terc-butildimetilsilil)oxi)-N- (((3aR,4R,5R,7R,7aR)-7-((terc-butildimetilsilil)oxi)-2,2-dimetil-5-(((S)-1-(((S)-1- (metilamino)-1-oxopropan-2-il)amino)-1-oxopropan-2- il)carbamoil)hexahidroben-zo[d][1,3]dioxol-4-il)metil)-2,2- dimetilhexahidrobenzo[d][1,3]dioxol-5-carboxamida (80b) En un matraz de fondo redondo de 10 mL se disolvió el péptido 80a (0.055 g, 0.062 mmoles) en MeOH (0.31 mL). La disolución se desoxigenó bajo atmósfera de argón y después se añadió Ni-Raney 1% (0.06 ml, 10% en peso). La mezcla resultante se agitó bajo atmósfera de hidrógeno a t.a. durante 12 h, tras las cuales se observó por ccf (AcOEt) la desaparición del producto de partida (Rf = 0.3) y la aparición de un producto más polar (Rf = 0.1). La suspensión se filtró sobre Celita, se lavó con MeOH (3x10 mL) y el filtrado se eliminó a vacío en el rotavapor para dar lugar a la amina 80b como un sólido blanco que se utilizó directamente en la siguiente reacción. Parte experimental 271 5.6.8 Síntesis del (S)-2-acetamido-N-((S)-1-((difluorofosfaneil)oxi)-1-oxopropan-2-il) propanamida (78d) En un matraz de fondo redondo de 50 mL se disolvió el ácido comercial (78c) (0.10 g, 0.50 mmoles) en CH2Cl2 seco (3.9 mL), se enfrió a 0 ºC y se añadieron DIC (0.12 mL, 0.742 mmol, 1.5 eq) y pentafluorofenol (0.137 g, 0.742 mmol, 1.5 eq). La reacción se agitó bajo argón 3 h a 0 ºC y 12 h a t.a., tras las cuales se observó por ccf (AcOEt) la desaparición del producto de partida (Rf = 0.1) y la aparición de un producto de reacción menos polar (Rf = 0.4). El crudo de reacción se añadió sobre una disolución saturada de NaHCO3 (40 mL), se decantó y la fase acuosa se extrajo con CH2Cl2 (3x20 mL). Las fases orgánicas reunidas se secaron con Na2SO4 anhidro, se filtraron y se concentraron a sequedad para dar lugar al (S)-2- acetamido-N-((S)-1-((difluorofosfaneil)oxi)-1-oxopropan-2-il) propanamida (78d) como un sólido blanco (rendimiento cuantitativo), que se utilizó en la siguiente reacción sin mayor purificación. David Reza Ramos 272 5.6.9 Síntesis de la (3aR,4R,5S,7R,7aR)-4-(((S)-2-((S)-2-acetamidopropanamido)propanamido)metil)-7-((terc-butildimetilsilil)oxi)-N-(((3aR,4R,5R,7R,7aR)-7-((tercbu-tildimetilsilil)oxi)-2,2-dimetil-5-(((S)-1-(((S)-1-(metilamino)-1-oxopropan-2- il)ami-no)-1-oxopropan-2-il)carbamoil)hexahidrobenzo[d][1,3]dioxol-4-il)metil)- 2,2-dime-tilhexaidrobenzo[d][1,3]dioxole-5-carboxamida (81a) En un matraz de fondo redondo de 25 mL se disolvió el tetrapéptido 80b (150 mg, 0.18 mmol) en DMF seca (2.5 mL), se añadió DIEA (0.06 mL, 0.44 mmol, 2.5 eq) y se agitó bajo argón a t.a. hasta comprobar que el pH era básico. Sobre esta disolución se añadió el éster de pentafluorofenol 78d (0.12 g, 0.27 mmol, 1.5 eq) y se mantuvo la agitación durante 12 h. Pasadas las cuales la mezcla resultante se diluyó con AcOEt (50 mL), se lavó con una disolución acuosa saturada de cloruro amónico (2x40 mL) y con H2O (40 mL), se secó con Na2SO4 anhidro, se filtró y se concentró a sequedad. El crudo de reacción así obtenido se purificó por cromatografía en columna (CH2Cl2/MeOH 95:5), para dar lugar la (3aR,4R,5S,7R,7aR)-4-(((S)-2-((S)-2-acetamidopropanamido)propanamido)metil)-7-((tercbutildimetilsilil)oxi)-N-(((3aR,4R,5R,7R,7aR)-7-((terc-butildimetilsilil)oxi)-2,2-dimetil-5- (((S)-1-(((S)-1-(metilami-no)-1-oxopropan-2-il)amino)-1-oxopropan-2- il)carbamoil)hexahidrobenzo[d][1,3]dioxol-4-il)metil)-2,2- dimetilhexaidrobenzo[d][1,3]dioxole-5-carboxamida 81a (100 mg, 54 %) como un sólido blanco amorfo. [α]D20: +6.21 (c 1.0, CHCl3). RMN-1H (CDCl3, 300 MHz, ppm): 0–0.12 (m, 1H, Si(CH3)2), 0.83 (m, 1H, C(CH3)3), 0.89 (m, 9H, C(CH3)3), 1.31 (m, 3H, CH3), 1.38 (m, 3H, CH3), 1.39 (m, 6H, 2xCH3), 1.43 (m, 3H, CH3), 1.44 (m, 3H, CH3), 1.45 (m, 3H, CH3), 1.51(m, 1H, CH3), 1.66 (m, 1H, Hζ), 1.75 (m, 1H, Hζ), 2.04 (m, 1H, Hζ), 2.04 (m, 1H, Hζ), 1.95 (m, 1H, Hβ), 2.10 (m, 1H, Hβ), 2.13 (m, 3H, CH3), 1.75 (m, 1H, Hα), 2.61 (m, 1H, Hα), 2.71 (m, 1H, Hα), 2.76 (m, 1H, Hγ (ω)), 2.81(m, 1H, CH3), 3.16 (m, 1H, Hγ (ω)), 3.64 (m, 1H, Hγ (ω)), 3.74 (m, 1H, Hε), 3.98 (m, 1H, Hγ), 3.98 (m, 1H, Hε), 4.06 (m, 1H, Hγ), 4.17 (m, 1H, Hδ), 4.26 (m, 1H, Hδ), 4.28 (m, 1H, Hγ (ω)), 4.95 (m, 1H, Hα), 5.05 (m, 1H, Hα), 5.26 (m, 1H, Hα), (m, 1H, Hα), 5.28 (m, 1H, Hα), 7.31 (d, J = 9.1 Hz, 1H, NH), 7.70 (d, J = 8.3 Hz, 1H, NH), 7.83 (s, 1H, NH), 8.01 (s, 1H, NH), 8.18 (d, J = 8.0 Hz, 1H, NH), 8.27 (s, 1H, NH), 8.84 (d, J = 8.2 Hz, 1H, NH). IR (ν, cm-1): 3288 (Amida A), 1633 (Amida I), 1547 (Amida II) y 1535 (Amida II). EMAR (ESI+): Calculado para C49H89N7NaO13Si2, 1062.5948; encontrado 1062.5949. Parte experimental 273 Figura 216. Espectro de RMN-1H del compuesto 81a. David Reza Ramos 274 5.6.10 Síntesis de la (3aR,4R,5S,7R,7aS)-4-(((S)-2-acetamidopropanamido)metil)-7- hidroxi-N-(((3aR,4R,5R,7R,7aS)-7-hidroxi-2,2-dimetil-5-(((S)-1-(metilamino)-1- oxopropan-2-il)carbamoil)hexahidrobenzo[d][1,3]dioxol-4-il)metil)-2,2- dimetilhexahidrobenzo[d][1,3]dioxol-5-carboxamida (81b) En un matraz de fondo redondo de 1 mL se disolvió el tetrapéptido 81a (0.024 g, 0.023 mmol) en THF seco (0.577 mL), se añadió TBAF (1 M en THF) (0.05 mL, 0.05 mmol, 2.2 eq) y se agitó a t.a. durante 48 h. Al cabo de este tiempo se comprobó por ccf (CH2Cl2/MeOH 10:1) la desaparición del producto de partida (Rf = 0.5) y la aparición de un producto de reacción más polar (Rf = 0.3). La reacción se concentró a sequedad y el residuo resultante se purificó por cromatografía en columna (CH2Cl2/MeOH 10:1), obteniéndose el tetrapéptido (3aR,4R,5S,7R,7aS)-4-(((S)-2-acetamidopropanamido)metil)-7-hidroxi-N- (((3aR,4R,5R,7R,7aS)-7-hidroxi-2,2-dimetil-5-(((S)-1-(metilamino)-1-oxopropan-2-il)carbamoil)hexahidrobenzo[d][1,3]dioxol-4-il)metil)-2,2-dimetilhexahidrobenzo[d][1,3]dioxol-5- carboxamida (81b) (0.013 g, 68 %) como un sólido blanco. [α]D20: 7.72 (c 1.0, MeCN). RMN-1H (CDCl3, 300 MHz, ppm): 1.26 (s, 3H, CH3), 1.32 (s, 3H, CH3), 1.34 (s, 6H, 2xCH3), 1.73 (m, 2H, 2xHζ), 1.81 (m, 1H, Hβ), 1.89 (m, 2H, 2xHζ), 1,97 (m, 3H, CH3), 2.21 (m, 1H, Hβ), 2.56 (m, 1H, Hα), 2.64 (m, 3H, CH3), 2.75 (m, 1H, Hα), 2.8 (m, 1H, Hγ (ω)), 3.16 (m, 1H, Hγ (ω)), 3.31 (m, 1H, Hγ (ω)), 3.87 (Hε), 3.91 (m, 1H, Hγ (ω)), 4.07 (m, 1H, Hε), 4.08 (m, 1H, Hα), 4.10 (m, 1H, Hγ), 4.10 (m, 1H, Hδ), 4.15 (m, 1H, Hδ), 4.16 (m, 1H, Hγ), 4.21 (m, 1H, Hα), 4,25 (m, 1H, Hα), 4,25 (m, 1H, Hα), 4.83 (m, 1H, OH), 5.04 (m, 1H, OH), 6.67 (s, 1H, HN), 6.96 (s, 1H, HN), 6.98 (s, 1H, HN), 7.05 (s, 1H, HN), 7.10 (s, 1H, HN), 7.39 (s, 1H, HN), 7.69 (s, 1H, HN). IR (ν, cm-1): 3302 (Amida A), 1647 (Amida I) y 1543 (Amida II). EMAR (ESI+): Calculado para C37H61N7NaO13, 834.4241; encontrado 834.4220. Parte experimental 275 Figura 217. Espectro de RMN-1H del compuesto 81b. David Reza Ramos 276 5.6.11 Síntesis de la (1S,2R,3R,4S,5R)-2-(((S)-2-((S)-2-acetamidopropanamido) propanamido)metil)-3,4,5-trihidroxi-N-(((1R,2R,3S,4R,6R)-2,3,4-trihidroxi-6- (((S)-1-(((S)-1-(metilamino)-1-oxopropan-2-il)amino)-1-oxopropan-2- il)carbamoil)ciclohe-xil)metil)ciclohexan-1-carboxamida (81c) El hexapéptido 81b (23 mg, 0.022 mmol) se disolvió en 3 mL de una mezcla TFA/H2O/Diox (1:1:1) y se agitó a t.a. durante 24 h. Pasado este tiempo la mezcla se concentró a sequedad y el residuo obtenido se trituró con hexano. Este residuo se purificó por HPLC para obtener 10 mg (50 % de rendimiento) de la (1S,2R,3R,4S,5R)-2-(((S)-2-((S)-2-acetamidopropanamido) propanamido)metil)-3,4,5-trihidroxi-N-(((1R,2R,3S,4R,6R)-2,3,4-trihidroxi-6-(((S)-1-(((S)-1- (metilamino)-1-oxopropan-2-il)amino)-1-oxopropan-2-il)carbamoil)ciclohexil)metil)ciclohexan-1-carboxamida (81c) como un sólido blanco. [α]D20: 8.24 (c 1.0, H2O). RMN-1H (DMSO-d6, 300 MHz, ppm): 1.18 (dd, J = 7.1, 3.8 Hz, 8H, 4xCH3), 1.44 (dt, J = 21.5, 11.8 Hz, 2H, CH2), 1.69 (d, J = 12.5 Hz, 2H, CH2), 2.05 (s, 2H, COCH3), 2.56 (d, J = 4.5 Hz, 2H, NCH2), 2.79 (d, J = 12.2 Hz, 3H, NCH2), 3.51 (m, 4H, 4xNCH), 3.74 (d, J = 11.7 Hz, 2H, 2xOCH), 4.13–4.34 (m, 4H, 4xOCH), 7.57 (s, 1H, NH), 7.73 (dd, J = 11.5, 6.5 Hz, 2H, NH), 7.94 (t, J = 7.4 Hz, 2H, NH), 8.05 (t, J = 8.2 Hz, 2H, NH). IR (ν, cm-1): 3278 (Amida A) 1624 (Amida I) y 1541 (Amida II). EMAR (ESI+): Calculado para C31H54N7O13, 732.3776; encontrado 732.3774. Parte experimental 283 5.7.3 Espectroscopía de RMN del hexapéptido 81a en CDCl3 Figura 225. Hexapéptido 81a con los residuos numerados del 1-6 desde el extremo N-terminal al C-terminal (izquierda). Nomenclatura para los protones utilizada para la asignación (derecha). Figura 226. RMN-1H del péptido 81a, 1 mM en CDCl3 (500 MHz). David Reza Ramos 284 Figura 227. Espectro de RMN-TV del hexapéptido 81a en CDCl3 (500 MHz). Temperaturas, de abajo hacia arriba, desde 5 hasta 35 ºC en intervalos de 5 ºC. Parte experimental 285 Figura 228. Espectro de HMBC del péptido 81a (CDCl3, 500 MHz, 308 K). David Reza Ramos 286 Figura 229. Espectro de TOCSY del péptido 81a, tmix = 60 ms (CDCl3, 500 MHz, 308 K). Parte experimental 287 Figura 230. Espectro de ROESY del péptido 81a, tmix = 500 ms (CDCl3, 500 MHz, 308 K). David Reza Ramos 288 Figura 231. Superposición de los espectros ROESY (rojo/azul, tmix 500 ms) y TOCSY (negro, tmix 60 ms) del péptido 81a (CDCl3, 500 MHz, 308 K). Parte experimental 289 Figura 232. Espectro de NOESY del péptido 81a, tmix = 400 ms (CDCl3, 600 MHz, 328 K). David Reza Ramos 290 Figura 233. Ampliación de la región de NH de amida y Hα del péptido 81a (tmix = 400 ms, CDCl3, 328 K, 600 MHz). Contactos NOE: NH2/NH5, NH4/NH5 y NH2/Hα5. Parte experimental 291 5.7.4 Espectroscopía de RMN del hexapéptido 81b en acetonitrilo-d3 Figura 234. Hexapéptido 81b con los residuos numerados del 1-6 desde el extremo N-terminal al C-terminal (izquierda). Nomenclatura para los protones utilizada para la asignación (derecha). Figura 235. RMN-1H del péptido 81b, 1 mM en acetonitrilo-d3 (750 MHz, 308 K). David Reza Ramos 292 Figura 236. Espectro de RMN-TV del péptido 81b en acetonitrilo-d3 (500 MHz). Temperaturas, de abajo hacia arriba: 273 a 343 K en pasos de 10 K. Parte experimental 299 Figura 243. Superposición de los espectros NOESY (rojo/azul, tmix 600 ms) y TOCSY (negro, tmix 80 ms) del péptido 81b (acetonitrilo-d3, 750 MHz, 308 K). Expansión de la región (Hα+Hβ)/HN. Parte experimental 301 5.8 PROCEDIMIENTOS GENERALES Procedimiento general A: Preparación de las N-alquilamidas. En un balón purgado se disuelve el correspondiente ácido 2- aminociclohexanocarboxílico en DMF seca (0.1 M). Se añaden luego la correspondiente nalquilamina (2.0 eq), DIEA (2.5 eq) y PyBop (1.5 eq), y la mezcla se agita a t.a. durante 18 h. Una vez completada la reacción, se elimina la DMF en el rotavapor, el residuo resultante se disuelve en DCM y la disolución se lava con porciones de HCl (1M), NaCl (sat), NaHCO3 (sat) y NaCl (sat). La fase orgánica se seca con Na2SO4 anhidros, se filtra y se concentra a sequedad en el rotavapor. El crudo así obtenido se purifica mediante cromatografía de columna flash, para dar lugar a la correspondiente N-alquilamida. Procedimiento general B: Retirada del grupo protector TBDMS. A una disolución de la N-alquilamida correspondiente en THF seco (0.06 mM) se le añade una disolución de TBAF 1M en THF (2.0 eq). La mezcla resultante se agita a t.a. hasta la desaparición del producto de partida. Pasado ese tiempo, la mezcla de reacción se concentra a sequedad, el residuo resultante se disuelve en DCM y se lava con HCl 1M y con una disolución saturada de NaCl. La fase orgánica se seca con Na2SO4 anhidro, se filtra y se concentra a sequedad. En el rotavapor. El residuo obtenido se purifica por cromatografía en columna flash, para dar lugar la correspondiente N-alquilamida con un hidroxilo desprotegido. Procedimiento general C: Retirada del grupo protector acetónido. Una disolución del producto de partida en una mezcla AcOH/THF/H2O 2:1:1 (0.01 mM) y se agita a t.a. hasta la desaparición del producto de partida. Al cabo de ese tiempo la disolución se concentra a sequedad en el rotavapor y el residuo resultante se purifica por cromatografía en columna flash, para dar lugar a la correspondiente N-alquilamida con los tres grupos hidroxilo desprotegidos. David Reza Ramos 302 5.9 SÍNTESIS DE N-ALQUILAMIDAS CICLOHEXÁNICAS 5.9.1 Síntesis del ((1R,2S)-2-(octilcarbamoil)ciclohexil) arbamato de terc-butilo (125) Se preparó siguiendo el Procedimiento General A, usando el ácido 71b (250 mg, 1.03 mmol, 1.0 eq), DMF (10 mL), octilamina (339 µL, 2.06 mmol, 2 eq), PyBop (802 mg, 1.54 mmol, 1.5 eq) y DIEA (447 µL, 2.57 mmol, 2.5 eq). La cromatografía de columna (AcOEt/Hex 1:1) permitió aislar el ((1R,2S)-2-(octilcarbamoil)ciclohexil)carbamato de tercbutilo (125) (317 mg, 87 %), como un sólido blanco. [α]D20: -23.4 (c 1, CHCl3). RMN-1H (CDCl3, 300 MHz, ppm): 0.87 (t, J = 6.4 Hz, 3H, CH3), 1.17–1.36 (m, 16H, 8xCH2), 1.41 (s, 9H, C(CH3)3), 1.73 (d, J = 12.8 Hz, 2H, CH2), 2.01 (d, J = 25.3 Hz, 2H, CH2), 2.26 (s, 1H, CHCO), 3.19 (dq, J = 13.1, 6.7 Hz, 2H, CH2N), 3.46 (s, 1H, CHN), 4.70 (s, 1H, NH), 6.22 (s, 1H, NH). RMN-13C (CDCl3, 75 MHz, ppm): 14.19 (CH3), 22.73 (CH2), 25.15 (CH2), 25.34 (CH2), 27.05 (3xCH2), 28.46 (C(CH3)3), 29.30 (CH2), 29.62 (CH2), 31.91 (CH2), 33.43 (CH2), 39.68 (CH2-N), 51.27 (CH-CO), 52.18 (CH-N), 79.51 (Cc, Boc), 155.93 (C=O, Boc), 174.28 (C=O, amida). EMAR (ESI+): Calculado para C20H39N2O3, 355.2966; encontrado 355.2955. IR (ν, cm-1): 3324 (NH, amida A), 1685 (CO, amida I), 1644 (CO, amida I), 1529 (amida II). Parte experimental 303 Figura 244. Espectro de RMN-1H y de RMN-13C y DEPT del compuesto 125. David Reza Ramos 304 5.9.2 Síntesis del ((1R,2S)-2-(hexadecilcarbamoil)ciclohexil)carbamato terc-butilo (126) Se preparó siguiendo el Procedimiento General A, usando el ácido 71b (300 mg, 1.23 mmol, 1.0 eq), DMF (12 mL), hexadecilamina (595 mg, 2.47 mmol, 2 eq), PyBop (963 mg, 1.85 mmol, 1.5 eq) y DIEA (537 μL, 3.09 mmol, 2.5 eq). La cromatografía de (MeOH/DCM(1:15)) dio lugar al ((1R,2S)-2-(hexadecilcarbamoil)ciclohexil)carbamato de terc-butilo (126) (520 mg, 90 %), como un sólido blanco. [α]D19: -19.4 (c 1, CHCl3). RMN-1H (CDCl3, 300 MHz, ppm): 0.74–1.01 (m, 3H, CH3), 1.27 (s, 30H, 15xCH2), 1.44 (s, 11H, C(CH3)3 + CH2), 1.77 (s, 2H, CH2), 1.91–2.19 (m, 2H, CH2), 2.32 (s, 1H, COCH), 3.22 (s, 2H, NCH2), 3.51 (s, 1H, NCH), 4.69 (s, 1H, NH), 6.28 (s, 1H, NH). RMN-13C (CDCl3, 75 MHz, ppm): 14.24 (CH3), 22.83 (CH2), 25.20 (CH2), 25.41 (CH2), 27.11 (CH2), 28.54 (C(CH3)3), 29.46 (CH2), 29.50 (CH2), 29.69 (CH2), 29.75 (CH2), 29.81 (CH2), 29.83 (6xCH2), 30.71 (CH2), 32.07 (CH2), 33.51 (CH2), 39.85 (CH2N), 51.49 (CHCO), 52.23 (CHN), 79.74 (Cc), 155.97 (C=O, Boc), 174.34 (C=O, amida). EMAR (ESI+): Calculado para C28H55N2O3, 467.4201; encontrado 467.4207. IR (ν, cm-1): 3329 (NH, amida A), 1684 (CO, amida I), 1644 (CO, amida I), 1535 (amida II). Parte experimental 305 Figura 245. Espectro de RMN-1H y de RMN-13C y DEPT del compuesto 126. David Reza Ramos 306 5.9.3 Síntesis del ((1R,2R)-2-(butilcarbamoil)ciclohexil)carbamato de terc-butilo (127) Se preparó siguiendo el Procedimiento General A, usando el ácido (1R,2R)-40b (250 mg, 1.03 mmol, 1.0 eq), DMF (10 mL), butilamina (202 µL, 2.06 mmol, 2 eq), PyBop (802 mg, 1.54 mmol, 1.5 eq) y DIEA (447 µL, 2.57 mmol, 2.5 eq). La cromatografía de columna (AcOEt/Hex (1:1)) proporcionó el ((1R,2R)-2-(butilcarbamoil)ciclohexil)carbamato de terc-butilo (127) (275 mg, 90 %), como un sólido blanco. [α]D21: 9.9 (c 1, CH2Cl2). RMN-1H (CDCl3, 300 MHz, ppm): 0.91 (t, J = 7.2 Hz, 3H, CH3), 1.21–1.41 (m, 3H, CH2 + CH-H), 1.45 (s, 13H, C(CH3)3, + 3CH2), 1.87 (s, 3H, CH2 + CH-H), 2.25 (m, 2H, CH2), 3.09– 3.55 (m, 1H, CHCO), 4.24 (s, 3H, NCH + NCH2), 6.02 (s, 1H, NH), 6.90 (s, 1H, NH). RMN-13C (CDCl3, 75 MHz, ppm): 13.67 (CH3), 19.98 (2xCH2), 24.17 (CH2), 28.35 (C(CH3)3), 31.66 (CH2), 39.03 (2xCH2), 47.07 (NCH2), 60.13 (CHCO), 60.94 (CH2N), 80.33 (Cc), 155.48 (C=O, Boc), 172.16 (C=O, amida). EMAR (ESI+): Calculado para C16H31N2O3, 299.2256; encontrado 299.2258. IR (ν, cm-1): 3243 (NH, amida A), 1689 (CO, amida I), 1650 (CO, amida I), 1565 (amida II). Parte experimental 307 Figura 246. Espectro de RMN-1H y de RMN-13C y DEPT del compuesto 127. David Reza Ramos 308 5.9.4 Síntesis del ((1R,2R)-2-(octilcarbamoil)ciclohexil)carbamato de terc-butilo ((1R,2R)-128) Se preparó siguiendo el Procedimiento General A, usando el ácido (1R,2R)-40b (250 mg, 1.03 mmol, 1.0 eq), DMF (10 mL), octilamina (339 µL, 2.06 mmol, 2 eq), PyBop (802 mg, 1.54 mmol, 1.5 eq) y DIEA (447 µL, 2.57 mmol, 2.5 eq). La columna cromatográfica (AcOEt/Hex (1:1)) dio lugar al ((1R,2R)-2-(octilcarbamoil) ciclohexil)carbamato de tercbutilo ((1R,2R)-128) (338 mg, 93 %) como un sólido blanco. [α]D19: -23,4 (c 1, CHCl3). RMN-1H (CDCl3, 300 MHz, ppm): 0.87 (t, J = 6.3 Hz, 3H, CH3), 1.27 (s, 12H, 6xCH2), 1.42 (s, 4H, 2xCH2), 1.58 (s, 9H, C(CH3)3), 1.75 (s, 2H, CH2), 1.98 (d, J = 13.8 Hz, 2H, CH2), 2.25 (s, 1H, CHCO), 3.02–3.29 (m, 2H, NCH2), 3.47 (d, J = 9.6 Hz, 1H, CH-N), 4.63 (s, 1H, NH), 6.14 (s, 1H, NH). RMN-13C (CDCl3, 75 MHz, ppm): 14.17 (CH3), 22.73 (CH2), 25.01(CH2), 25.36 (CH2), 27.08 (CH2), 28.48 (C(CH3)3), 29.31 (CH2), 29.40 (CH2), 29.61 (CH2), 30.25 (CH2), 31.92 (CH2), 33.35 (CH2), 39.72 (NCH2), 51.39 (CHCO), 51.97 (NCH), 79.49 (Cc), 156.04 (C=O, Boc), 174.53 (C=O, amida). EMAR (ESI+): Calculado para C20H39N2O3, 355.2956; encontrado 355.2955. IR (ν, cm-1): 3331 (NH, amida A), 1683 (CO, amida I), 1647 (CO, amida I), 1534 (amida II). Parte experimental 315 Figura 251. Espectro de FTIR del compuesto (1R,2R)-128 en disolución de MeOH/DCM 1:10 (naranja) y en como xerogel formado en hexano (azul). Figura 252. Espectro de FTIR del compuesto (1R,2R)-129 en disolución de MeOH/DCM 1:10 (naranja) y en como xerogel formado en hexano (azul). David Reza Ramos 316 Figura 253. Espectro de FTIR del compuesto rac-128 en disolución de MeOH/DCM 1:10 (naranja) y en como xerogel formado en hexano (azul). Figura 254. Espectro de FTIR del compuesto rac-129 en disolución de MeOH/DCM 1:10 (naranja) y en como xerogel formado en hexano (azul). Parte experimental 317 5.10.2 Micrografías de SEM de las N-alquilamidas Gc8, Gc16, Gt8, Gt16, rGt8 y rGt16 Preparación de las muestras: Se prepara el xerogel de la N-alquilamida a estudiar en hexano a su cmg. A continuación, se deposita este xerogel sobre un soporte y se metaliza con iridio para mejorar su conductividad. Figura 255. Selección de micrografías de SEM del xerogel de Gc8 a su cmg en hexano. David Reza Ramos 318 Figura 256. Selección de micrografías de SEM del xerogel de Gc16 a su cmg en hexano. Parte experimental 319 Figura 257. Selección de micrografías de SEM del xerogel de Gt8 a su cmg en hexano. David Reza Ramos 320 Figura 258. Selección de micrografías de SEM del xerogel de Gt16 a su cmg en hexano. Parte experimental 321 Figura 259. Selección de micrografías de SEM del xerogel de rGt8 a su cmg en hexano. David Reza Ramos 322 Figura 260. Selección de micrografías de SEM del xerogel de rGt16 a su cmg en hexano. Parte experimental 323 5.10.3 Microscopía de Fuerza Atómica (AFM) Preparación de la muestra: Se preparó una disolución de (1R,2R)-128 en una mezcla MeOH/DCM 1:1 a una concentración de 0.01 mg/mL. Una gota de esta disolución se depositó sobre un soporte de mica inclinado 45 º para formar una película lo más fina posible. Se dejó evaporar todo el disolvente antes de efectuar la medida. Figura 261. Imagen de AFM de Gt8 y su ampliación. David Reza Ramos 324 5.10.4 Espectroscopía de Rayos X Figura 262. Rayos X del monocristal del compuesto (1R,2R)-128, con elipsoides térmicos a una probabilidad del 50 %. D—H···A D—H H···A D···A D—H···A N1—H1N···O3i 0.86 (3) 2.19 (3) 3.038 (2) 171 (3) N2—H2N···O2i 0.82 (3) 2.05 (3) 2.819 (2) 156 (3) C10—H24···O2i 1 2.66 3.403 (3) 131 C19—H30···O2 0.98 2.45 2.993 (3) 115 C20—H34···O2 0.98 2.45 2.993 (3) 115 C19—H30···O2 0.98 2.45 2.993 (3) 115 C20—H34···O2 0.98 2.45 2.993 (3) 115 N1—H1N···O3i 0.86 (3) 2.19 (3) 3.038 (2) 171 (3) N2—H2N···O2i 0.82 (3) 2.05 (3) 2.819 (2) 156 (3) Tabla 42. Geometría de los de los enlaces de hidrógeno (Å, °) para el compuesto (1R,2R)-128. Parte experimental 331 Figura 265. Espectro de RMN-1H y de RMN-13C y DEPT del compuesto 21e. David Reza Ramos 332 5.11.2 Síntesis del (3aR,4S,5R,7R,7aR)-4-((terc-butoxicarbonil)amino)-7-((tercbutildime-tilsilil)oxi)-2,2-dimetilhexahidrobenzo[d][1,3]dioxol-5-carboxilato de metilo (22e) A una disolución desoxigenada del compuesto 22a (1.9 g, 3.43 mmol) y Boc2O (0.9 g. 4.11 mmol, 1.2 eq) en MeOH (190 mL) se le añadió de Pd(OH)2/C al 20% (0.95 g, 50% en peso). La mezcla resultante se agitó a t.a., bajo atmósfera de hidrógeno (P = 1 atm), hasta que al cabo de 16 h se observó por ccf (AcOEt/Hex 1:5) la desaparición del producto de partida (Rf = 0.8) y la formación de uno más polar (Rf = 0.3). La mezcla de reacción se filtró a través de Celita, lavando con MeOH y concentrando el filtrado a sequedad en el rotavapor. El crudo obtenido se purificó mediante cromatografía en columna, eluyendo con una mezcla AcOEt/Hex 1:5, obteniéndose 1.51 g (53.29 mmol, 96 % de rendimiento) del (3aR,4S,5R,7R,7aR)-4-((terc-butoxicarbonil)amino)-7-((terc-butildimetilsilil)oxi)-2,2- dimetilhexahidrobenzo[d][1,3]dio-xol-5-carboxilato de metilo (22e) [α]D19: -80.3 (c 3, CH2Cl2). RMN-1H (CDCl3, 300 MHz, ppm): 0.10 (d, J = 3.0 Hz, 6H, 2xSiCH3), 0.90 (s, 9H, SiC(CH3)3), 1.34 (s, 3H, CCH3), 1.42 (s, 9H, CCH3), 1.51 (s, 3H, CCH3), 1.83 (dt, J = 14.3, 4.2 Hz, 1H, CH-H), 2.06–2.27 (m, 1H, CH-H), 2.76 (s, 1H, CHCO), 3.69 (s, 3H, OCH3), 4.04 (s, 1H, NCH), 4.09 (d, J = 7.6 Hz, 3H, 3xOCH), 5.14 (s, 1H, NH). RMN-13C (CDCl3, 75 MHz, ppm): -5.03 (SiCH3), -4.92 (SiCH3), 18.03 (SiCc), 25.82 (SiC(CH3)3), 27.48 (C(CH3)2), 28.41 (C(CH3)3, Boc), 29.33 (CH2), 41.23 (CHCO), 51.06 (OCH3) 52.12 (NCH), 67.55 (OCH), 77.25 (OCH), 79.38 (OCH), 85.21 (Cc), 109.19 (Cc), 155.15 (C=O, uretano), 173.80 (C=O, éster). EMAR (ESI+): Calculado para C22H41NNaO7Si, 482.2540; encontrado 482.2544. IR (ν, cm-1): 3365.15 (NH), 1735.23 (C=O, éster), 1718.69 (C=O uretano) y 1522.43 (C=O). Parte experimental 333 Figura 266. Espectro de RMN-1H y de RMN-13C y DEPT del compuesto 22e. David Reza Ramos 334 5.11.3 Síntesis del ácido (3aR,4S,5R,7R,7aR)-4-((terc-butoxicarbonil)amino)-7-((tercbutildimetilsilil)oxi)-2,2-dimetilhexahidrobenzo[d][1,3]dioxol-5-carboxílico (21f) A una disolución del producto de partida 21e (950 mg, 2.071 mmol) en una mezcla MeOH/H2O 2.5:1 (83 mL) se añadió LiOH·H2O (132 mg, 3.15 mmol, 10 eq) y la mezcla resultante se agitó a t.a. durante 16 h. Al cabo de este tiempo, se comprobó por ccf (AcOEt/Hex 1:5) la desaparición del producto de partida (Rf = 0.4) y la formación de un producto más polar (Rf = 0.1). La mezcla de reacción se acidificó hasta pH = 4 con disolución acuosa de HCl 0.5 M, el MeOH se eliminó en el rotavapor y le mezcla remanente se extrajo con DCM (5x75 mL). Las fases orgánicas reunidas se secaron con sulfato sódico anhidro, se filtraron y se concentraron a sequedad en el rotavapor. El crudo resultante se purificó por cromatografía en columna, eluyendo con una mezcla AcOEt/Hex 1:2, obteniéndose 800 mg (1.798 mmol, 87 % de rendimiento) del ácido (3aR,4S,5R,7R,7aR)-4-((tercbutoxicarbonil)amino)-7-((terc-butildimetilsilil)oxi)-2,2- dimetilhexahidrobenzo[d][1,3]dioxol-5-carboxílico (21f), como un sólido blanco. [α]D20: -24.0° (c 1, CH2Cl2). RMN-1H (CDCl3, 300 MHz, ppm): 0.09 (d, J = 0.9 Hz, 6H, Si(CH3)3), 0.89 (d, J = 9.2 Hz, 9H, SiC(CH3)3), 1.34 (s, 3H, CCH3), 1.42 (s, 9H, C(CH3)3), 1.51 (s, 3H, CCH3), 2.11 (d, J = 12.9 Hz, 2H, CH2), 2.95 (d, J = 5.8 Hz, 1H, CH-CO), 4.04–4.22 (m, 3H, 3xCH-O), 4.35 (t, J = 5.9 Hz, 1H, CH-N), 5.67 (d, J = 10.3 Hz, 1H, NH). RMN-13C (CDCl3, 75 MHz, ppm): -5.15 (SiCH3), -5.06 (SiCH3), 18.10 (SiCc), 25.84 (SiC(CH3)3), 27.69 (C(CH3)2), 28.46 (C(CH3)3, Boc), 29.24 (CH2), 39.57 (CHCO), 49.66 (NCH), 67.58 (OCH), 75.64 (OCH), 77.30 (OCH), 79.55 (Cc), 108.89 (Cc), 155.74 (C=O, uretano), 179.23 (C=O, ácido). EMAR (ESI+): Calculado para C21H40NO7Si, 446.2564; encontrado 446.2569. IR (ν, cm-1): 3360.62 (NH), 1707.88 (C=O) y 1511.92 (C=O). Parte experimental 335 Figura 267. Espectro de RMN-1H y de RMN-13C y DEPT del compuesto 21f. David Reza Ramos 336 5.11.4 Síntesis del ácido (3aR,4S,5R,7R,7aR)-4-((terc-butoxicarbonil)amino)-7-((tercbutildimetilsilil)oxi)-2,2-dimetilhexahidrobenzo[d][1,3]dioxol-5-carboxílico (22f) A una disolución del producto de partida 22e (145 mg, 0.315 mmol) en una mezcla MeOH/H2O 2.5:1 (14 mL) se le añadió LiOH·H2O (132 mg, 3.15 mmol, 10 eq) y la mezcla se agitó a t.a. durante 16 h. Al cabo de este tiempo se comprobó por ccf (AcOEt/Hex 1:5) la desaparición del producto de partida (Rf = 0.3) y la formación de un producto más polar (Rf = 0.1). La mezcla de reacción se acidificó hasta pH = 4 con disolución acuosa de HCl 0.5 M, el MeOH se eliminó bajo presión reducida en el rotavapor y la mezcla remanente se extrajo con DCM (5x75 mL). Las fases orgánicas reunidas se secaron con sulfato sódico anhidro, se filtraron y se concentraron a sequedad en el rotavapor. El crudo resultante se purificó por cromatografía en columna, eluyendo con una mezcla AcOEt/Hex 1:2, obteniéndose 125 mg (0.281 mmol, 84 % de rendimiento) del ácido (3aR,4S,5R,7R,7aR)-4- ((terc-butoxicarbonil)amino)-7-((terc-butildimetilsilil)oxi)-2,2- dimetilhexahidrobenzo[d][1,3]dio-xol-5-carboxílico (22f) como un sólido blanco. [α]D19: -24.1° (c 1, CH2Cl2). RMN-1H (CDCl3, 300 MHz, ppm): 0.13 (d, J = 2.2 Hz, 6H, Si(CH3)3), 0.93 (s, 13H, SiC(CH3)3), 1.36 (s, 3H, CH3), 1.45 (s, 9H, C(CH3)3), 1.52 (s, 3H, CH3), 1.90 (m, 1H, CH-H), 2.16 (m, 2H, CH-H), 2.85 (m, 1H, COCH), 4.07 (m, 2H, 2xOCH), 4.26 (m, 2H, OCH + NCH), 5.44 (s, 1H, NH). RMN-13C (CDCl3, 75 MHz, ppm): -6.12 (SiCH3), -6.05 (SiCH3), 18.24 (SiCc), 25.16 (SiC(CH3)3), 26.01 (C(CH3)2), 27.03 (C(CH3)3, Boc), 27.76 (CH2), 49.13 (CHCO), 51.34 (NCH), 67.65 (OCH), 75.60 (CH), 76.99 (OCH), 79.54 (Cc), 108.71 (Cc), 155.59 (C=O, Boc), 179.05 (C=O, ácido). EMAR (ESI+): Calculado para C21H39NNaO7Si, 468.2387; encontrado 468.2388. IR (ν, cm-1): 3356.23 (NH), 1710.85 (C=O) y 1510.01 (C=O). Parte experimental 337 Figura 268. Espectro de RMN-1H y de RMN-13C y DEPT del compuesto 22f. David Reza Ramos 338 5.11.5 Síntesis del ((3aR,4S,5S,7R,7aR)-7-((terc-butildimetilsilil)oxi)-2,2-dimetil-5-(octilcarbamoil)hexahidrobenzo[d][1,3]dioxol-4-il)carbamato de terc-butilo (131) Se preparó siguiendo el Procedimiento General A, usando el ácido 21f (370 mg, 0.830 mmol, 1.0 eq DCM (8.3 mL), octilamina (273 μL, 1.66 mmol, 2 eq), PyBop (648 mg, 1.25 mmol, 1.5 eq) y DIEA (361 μL, 2.08 mmol, 2.5 eq). La cromatografía de columna cromatográfica (eluyente AcOEt/Hex 1:7 hasta AcOEt/Hex 1:5) permitió aislar el ((3aR,4S,5S,7R,7aR)-7-((terc-butildimetilsilil)oxi)-2,2-dimetil-5-(octilcarbamoil)hexahidrobenzo[d][1,3]dioxol-4-il)carbamato de terc-butilo (131) (310 mg, 67 %), como un sólido blanco. [α]D20: -19.8° (c 5, CH2Cl2). RMN-1H (CDCl3, 300 MHz, ppm): 0.13 (s, 6H, Si(CH3)2), 0.82–1.02 (m, 12H, (SiC(CH3)3 + CH3), 1.28 (s, 10H, 5xCH2), 1.33 (s, 3H, CH3), 1.42 (s, 9H, C(CH3)3), 1.44 (s, 2H, CH2), 1.46 (s, 3H, CH3), 1.76–2.34 (m, 2H, CH2), 2.88 (td, J = 8.9, 4.2 Hz, 1H, CHCO), 3.11–3.29 (m, 2H, NCH2), 4.11 (m, 3H, 3xOCH), 4.32 (dd, J = 6.7, 3.5 Hz, 1H, NCH), 6.06 (d, J = 10.3 Hz, 1H, NH), 6.31 (s, 1H, NH). RMN-13C (CDCl3, 75 MHz, ppm): -4.92 (2xSiCH3), 14.20 (CH3), 18.08 (Cc), 22.76 (CH2), 24.58 (CH3), 25.92(C(CH3)3), 26.99 (CH2), 27.11 (CH2), 28.05 (CH2), 28.48 (C(CH3)3), 29.32 (CH2), 29.40 (CH2), 29.57 (CH2), 31.93 (CH2), 37.94 (COCH), 39.96 (NCH2), 48.56 (NCH), 66.41 (OCH), 76.51 (OCH), 76.85 (OCH), 79.79 (Cc), 108.59 (Cc), 156.24 (C=O, uretano), 172.62 (C=O, amida). EMAR (ESI+): Calculado para C29H57N2O6Si, 557.3978; encontrado 557.3980. IR (ν, cm-1): 3312.33 (amida A), 1696.08 (amida I), 1647.17 (amida I) y 1527.87 (amida II). Parte experimental 339 Figura 269. Espectro de RMN-1H y de RMN-13C y DEPT del compuesto 131. David Reza Ramos 340 5.11.6 ((3aR,4S,5S,7R,7aR)-7-((terc-butildimetilsilil)oxi)-2,2-dimetil-5-(hexadecilcarbamoil)hexahidrobenzo[d][1,3]dioxol-4-il)carbamato de terc-butilo (132) Se preparó siguiendo el Procedimiento General A, usando el ácido 21f (370 mg, 0.830 mmol, 1.0 eq), DCM (8.3 mL), hexadecilamina (400 mg, 1.66 mmol, 1.2 eq), PyBop (648 mg, 1.25 mmol, 1.5 eq) y DIEA (361 μL, 2.08 mmol, 2.5 eq). La cromatografía de columna (AcOEt/Hex 1:5) proporcionó el ((3aR,4S,5S,7R,7aR)-7-((terc-butildimetilsilil)oxi)-2,2-dime- til-5-(hexadecilcarbamoil)hexahidrobenzo[d][1,3]dioxol-4-il)carbamato de terc-butilo (132) (363 mg, 65 %), como un sólido blanco. [α]D20: -16.3 (c 1, CH2Cl2). RMN-1H (CDCl3, 300 MHz, ppm): 0.10 (d, J = 5.5 Hz, 6H, Si(CH3)2), 0.71–0.96 (m, 12 H, SiC(CH3)3, CH2CH3), 1.22–1.27 (m, 28H, 14xCH2), 1.32 (s, 3H, CCH3), 1.40 (s, 9H, C(CH3)3), 1.45 (s, 3H, CCH3), 1.83–2.06 (m, 1H, HCH), 2.21 (dd, J = 15.6, 7.6 Hz, 1H, HCH), 2.87 (td, J = 9.0, 3.5 Hz, 1H, COCH), 3.19 (m, 2H, NCH2), 4.06 (s, 1H, OCH) 4.13 (t, J = 5.4 Hz,, 2H, 2xOCH), 4.31 (dd, J = 6.7, 3.4 Hz, 1H, NCH), 6.08 (d, J = 9.8 Hz, 1H, NH), 6.31 (s, 1H, NH). RMN-13C (CDCl3, 75 MHz, ppm): -4.97 (2xSiCH3), 14.21 (CH3), 18.02 (Cc), 22.78 (CH2), 24.53 (CH3), 25.87 (SiC(CH3)3), 26.93 (CH3), 27.08 (CH2), 28.44 (C(CH3)3), 29.16–29.74 (11xCH2), 32.02 (2xCH2), 37.83 (COCH), 39.91 (NCH2), 48.46 (NCH), 68.30 (OCH), 76.45 (OCH), 76.74 (OCH), 79.72 (Cc), 108.53 (Cc), 156.19 (C=O, uretano), 172.58 (C=O, amida). EMAR (ESI+): Calculado para C37H73N2O6Si, 669.5230; encontrado 669.5232. IR (ν, cm-1): 3319.96 (amida A), 1693.15 y 1634.34 (amida I) y 1533.27 (amida II). Parte experimental 347 Figura 273. Espectro de RMN-1H y de RMN-13C y DEPT del compuesto 135. David Reza Ramos 348 5.11.10Síntesis del ((3aR,4S,5S,7R,7aS)-7-hidroxi-2,2-dimetil-5- (hexadecilcarbamoil)hexa-hidrobenzo[d][1,3]dioxol-4-il)carbamato de terc-butilo (136) Se preparó siguiendo el Procedimiento General B, usando la N-alquilamida 132 (391 mg, 0.584 mmol, 1.0 eq), THF (15 mL) y TBAF 1 M en THF (1.46 mL). La cromatografía de (AcOEt/Hex 1:1) permitió aislar el ((3aR,4S,5S,7R,7aS)-7-hidroxi-2,2-dimetil-5- (hexadecilcar-bamoil)hexahidrobenzo[d][1,3]dioxol-4-il)carbamato de terc-butilo (136) (312 mg, 96 %), como un aceite transparente. [α]D20: -44 (c 3, MeOH). RMN-1H (CDCl3, 300 MHz, ppm): 0.81–0.94 (m, 3H, CH3), 1.25 (s, 28H, 14xCH2), 1.36 (s, 3H, CH3), 1.43 (s, 9H, C(CH3)3), 1.48 (s, 3H, CH3), 1.90–2.12 (m, 2H, CH2), 3.13 (m, 2H, COCH + OH), 3.21 (q, J = 7.0 Hz, 2H, NCH2), 3.87 (t, J = 7.0 Hz, 1H, OCH), 4.01 (td, J = 4.1, 2.6 Hz, 1H, OCH), 4.13–4.34 (m, 2H, OCH + NCH), 5.06 (s, 1H, NH), 5.99 (d, J = 6.2 Hz, 1H, NH). RMN-13C (CDCl3, 75 MHz, ppm): 14.23 (CH3), 22.79 (CH2), 25.84 (CH3), 27.00 (CH2), 27.12 (CH2), 27.87 (CH2), 28.00 (CH3), 28.44 (CH2), 28.48 (C(CH3)3), 29.38 (CH2), 29.47 (CH2), 29.54 (CH2), 29.64 (CH2), 29.79 (5xCH2), 32.03 (CH2), 40.11 (NCH2), 42.48 (COCH), 50.89 (NCH), 66.56 (OCH), 75.00 (OCH), 78.33 (OCH), 79.98 (Cc), 108.90 (Cc), 156.28 (C=O, uretano), 174.26 (C=O, amida). EMAR (ESI+): Calculado para C31H59N2O6, 555.4368; encontrado 555.4367. IR (ν, cm-1): 3318.58 (amida A), 1692.26 (amida I), 1647.17 (amida I) y 1535.15 (amida II). Parte experimental 349 Figura 274. Espectro de RMN-1H y de RMN-13C y DEPT del compuesto 136. David Reza Ramos 350 5.11.11Síntesis del ((3aR,4S,5R,7R,7aS)-7-hidroxi-2,2-dimetil-5- (octilcarbamoil)hexahidro-benzo[d][1,3]dioxol-4-il)carbamato de terc-butilo (137) Se preparó siguiendo el Procedimiento General B, usando la N-alquilamida 133 (130 mg, 0.233 mmol, 1.0 eq), THF (6 mL) y TBAF 1 M en THF (514 μL). La cromatografía de columna (AcOEt/Hex (2:1) permitió aislar el ((3aR,4S,5R,7R,7aS)-7-hidroxi-2,2-dimetil-5- (octilcarba-moil)hexahidrobenzo[d][1,3]dioxol-4-il)carbamato terc-butilo (137) (75 mg, 75 %), como un sólido blanco. [α]D23: 5.5 (c 14, CH2Cl2). RMN-1H (CDCl3, 300 MHz, ppm): 0.77–0.94 (m, 3H, CH3), 1.27 (s, 12H, 6xCH2), 1.37 (s, 3H, CH3), 1.43 (s, 9H, C(CH3)3), 1.53 (s, 3H, CH3), 1.90–2.03 (m, 2H, CH2), 2.98–3.32 (m, 4H, NCH2 + COCH + OH), 3.49 (dd, J = 17.8, 8.1 Hz, 1H, NCH), 4.20 (dd, J = 5.2, 2.4 Hz, 1H, OCH), 4.27 (d, J = 2.8 Hz, 1H, OCH), 4.40 (s, 1H, OCH), 5.39 (d, J = 8.2 Hz, 1H, NH), 6.64 (s, 1H, NH). RMN-13C (CDCl3, 300 MHz, ppm): 14.04 (CH3), 22.60 (CH2), 26.18 (CH3), 26.94 (CH2), 28.10 (CH3), 28.36 (C(CH3)3), 29.16 (CH2), 29.25 (CH2), 29.49 (CH2), 31.79 (CH2), 32.82 (CH2), 39.67 (NCH2), 41.32 (CO-CH), 54.20 (NCH), 66.57 (OCH), 76.08 (OCH), 77.56 (OCH), 79.79 (Cc), 109.01 (Cc), 156.33 (C=O, uretano), 173.52 (C=O, amida). EMAR (ESI+): Calculado para C23H42N2NaO6, 465.2928; encontrado 465.2923. IR (ν, cm-1): 3331.81 (NH), 1687.38 (C=O) y 1536.11 (C=O). Parte experimental 351 Figura 275. Espectro de RMN-1H y de RMN-13C y DEPT del compuesto 137. David Reza Ramos 352 5.11.12Síntesis del ((3aR,4S,5R,7R,7aS)-5-(hexadecilcarbamoil)-7-hidroxi-2,2-dimetil hexa-hidrobenzo[d][1,3]dioxol-4-il)carbamato de terc-butilo (138) Se preparó siguiendo el Procedimiento General B usando la N-alquilamida 134 (160 mg, 0.239 mmol, 1.0 eq), THF (6 mL) y TBAF 1 M en THF (600 μL). La columna cromatográfica AcOEt/Hex (2:1) permitió aislar el ((3aR,4S,5R,7R,7aS)-5- (hexadecilcarbamoil)-7-hidroxi-2,2-dimetil hexahidrobenzo[d][1,3]dioxol-4-il)carbamato de terc-butilo (138) (126 mg, 95 %) como un sólido blanco. [α]D20: -87 (c 1, MeOH). RMN-1H (CDCl3, 300 MHz, ppm): 0.88 (t, J = 6.6 Hz, 3H, CH3), 1.25 (s, 26H, 13xCH2), 1.36 (s, 3H, CCH3), 1.42 (s, 9H, C(CH3)3), 1.52 (s, 3H, CCH3), 1.67 (s, 2H, CH2), 1.98 (dd, J = 33.8, 13.2 Hz, 2H, CH2), 3.04–3.29 (m, 3H, COCH, NCH2), 3.42 (s, 1H, NCH), 4.18 (s, 1H, OCH), 4.26 (s, 1H, OCH), 4.42 (s, 1H, OCH), 5.11 (s, 1H, NH), 6.24 (s, 1H, NH). RMN-13C (CDCl3, 75 MHz, ppm): 14.16 (CH3), 22.75 (CH2), 26.33 (CH3), 28.21 (CH3), 28.46 (C(CH3)3,), 29.43 (CH2), 29.76 (11xCH2), 32.00 (CH2), 33.00 (CH2), 39.81 (NCH2), 41.54 (COCH), 54.18 (NCH) 66.49 (OCH), 76.31 (OCH), 77.59 (OCH), 79.81 (Cc), 109.08 (Cc), 156.51 (C=O, uretano), 173.77 (C=O, amida). EMAR (ESI+): Calculado para C31H59N2O6, 555.4368; encontrado 555.4365. IR (ν, cm-1): 3319.73 (amida A), 1691.63 (amida I), 1689.06 (amida I) y 1550 (amida II). Parte experimental 353 Figura 276. Espectro de RMN-1H y de RMN-13C y DEPT del compuesto 138. David Reza Ramos 354 5.11.13Síntesis del ((1S,2R,3S,4R,6R)-2,3,4-trihidroxi-6-(octilcarbamoil)ciclohexil)carbamato de terc-butilo (139) Se preparó siguiendo el Procedimiento General C, usando la N-alquilamida 135 (180 mg, 0.687 mmol, 1.0 eq) y una mezcla AcOH/THF/H2O 2:1:1 (4 mL). La cromatografía de columna cromatográfica MeOH/DCM (1:10) permitió aislar el ((1S,2R,3S,4R,6R)-2,3,4- trihidroxi-6-(octilcarbamoil)ciclohexil)carbamato de terc-butilo (139) (115 mg, 62 %), como un sólido blanco. [α]D20: -115.1 (c 2, MeOH). RMN-1H (CDCl3, 300 MHz, ppm): 0.77–0.99 (m, 3H, CH3), 1.29 (s, 12H, 6xCH2), 1.44 (s, 9H, C(CH3)3), 1.83 (s, 1H, CH-H), 2.10 (s, 1H, CH-H), 2.81–3.53 (s, 6H, NCH2 + 3xOH + CHCO), 3.87 (d, J = 15.5 Hz, 2H, OCH + NCH), 3.96–4.09 (m, 1H, OCH), 4.15 (s, 1H, OCH), 5.57 (s, 1H, NH), 6.73 (s, 1H, NH). RMN-13C (CDCl3, 75 MHz, ppm): 14.18 (CH3), 22.74 (CH2), 27.14 (CH2), 28.48 (C(CH3)3), 29.38 (3xCH2), 29.43 (CH2), 29.55 (CH2), 31.94 (CH2), 39.95 (NCH2 + COCH), 52.98 (NCH), 69.02 (2xOCH), 73.18 (OCH), 79.94 (Cc), 156.63 (C=O, uretano), 173.34 (C=O, amida). EMAR (ESI+): Calculado para C20H39N2O6, 403.2789; encontrado 403.2802. IR (ν, cm-1): 3312.87 (amida A), 1691.12 y 1647.54 (amida I) y 1535.75 (amida II). Parte experimental 355 Figura 277. Espectro de RMN-1H y de RMN-13C y DEPT del compuesto 139. David Reza Ramos 356 5.11.14Síntesis del ((1S,2R,3S,4R,6S)-6-(hexadecilcarbamoil)-2,3,4- trihidroxiciclohexil)car-bamato de terc-butilo (140) Se preparó siguiendo el Procedimiento General C, usando la N-alquilamida 136 (247 mg, 0.445 mmol, 1.0 eq) y una mezcla AcOH/THF/H2O 2:1:1 (4 mL). La cromatografía de columna (MeOH/DCM 1:15) proporcionó el ((1S,2R,3S,4R,6S)-2,3,4-trihidroxi-6- (hexadecilcarba-moil)ciclohexil)carbamato de terc-butilo (140) (179 mg, 62 %), como un sólido blanco. [α]D19: -8.0 (c 2, MeOH). RMN-1H (CDCl3, 300 MHz, ppm): 0.88 (t, J = 6.6 Hz, 3H, CH3), 1.25 (s, 28H, 14xCH2), 1.42 (s, 9H, C(CH3)3), 1.80 (s, 1H, CH-H), 2.07 (s, 1H, CH-H), 3.18 (s, 3H, NCH2 + CHCO), 3.74–3.91 (m, 5H, OCH+ NCH + 3xOH), 3.98 (s, 1H, OCH), 4.13 (s, 1H, OCH), 5.58 (s, 1H, NH), 6.75 (s, 1H, NH). RMN-13C (CDCl3, 75 MHz, ppm): 14.15 (CH3), 22.73 (CH2), 27.13 (CH2), 28.42 (C(CH3)3), 29.41 (CH2), 29.49 (CH2) 29.75 (11xCH2), 31.97 (NCH2), 39.93 (COCH), 52.43 (NCH), 68.93 (OCH), 73.07 (2xOCH), 79.92 (OCc), 156.58 (C=O, uretano), 173.32 (C=O, amida). EMAR (ESI+): Calculado para C28H55N2O6, 515.4073; encontrado 515.4055. IR (ν, cm-1): 3352.21 (amida A), 1700.38 y 1689.12 (amida I) y 1554.34 (amida II). 6 REFERENCIAS Referencias 365 (1) Izumi, Y.; Chibata, I.; Itoh, T. Production and Utilization of Amino Acids. Angew. Chem. Int. Ed. Engl. 1978, 17 (3), 176–183. https://doi.org/10.1002/anie.197801761. (2) Toniolo, C.; Crisma, M.; Formaggio, F.; Peggion, C. 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La presente tesis doctoral aborda la utilización del ácido ciclohexenocarboxílico y del ácido (-)-shikímico, materiales de partida asequibles, para obtener a escala de multigramos β- y γaminoácidos, con los que se aborda la síntesis de β-péptidos, α,β-péptidos y α,γ-péptidos anfifílicos con potenciales aplicaciones industriales y bioquímicas. También se describe el estudio estructural de estos nuevos péptidos para dilucidar su estructura secundaria. Además, los β-aminoácidos obtenidos se utilizan para la síntesis de N-alquilamidas y se estudia la capacidad gelificante de éstas en disolventes de distinta constante dieléctrica, así como sus aplicaciones para la captura de aceites industriales y para la liberación de fármacos.