Respuesta de siete orígenes ibéricos de "Pinus pinaster" Aiton frente a la inoculación en vivero con "Pisolithus tinctorius" y "Paxillus involutus"

UNIVERSIDADE DE SANTIAGO DE COMPOSTELA ESCOLA POLITÉCNICA SUPERIOR DEPARTAMENTO DE PRODUCCIÓN VEXETAL RESPUESTA DE SIETE ORÍGENES IBÉRICOS DE PINUS PINASTER AITON FRENTE A LA INOCULACIÓN EN VIVERO CON PISOLITHUS TINCTORIUS Y PAXILLUS INVOLUTUS TESIS DOCTORAL SANTIAGO LAMOSA QUINTEIRO INGENIERO AGRÓNOMO DIRECTORES: Dra. Mª ISABEL IGLESIAS DÍAZ Dr. FRANCISCO FERNÁNDEZ DE ANA-MAGÁN Lugo, Enero de 2005 UNIVERSIDADE DE SANTIAGO DE COMPOSTELA ESCOLA POLITÉCNICA SUPERIOR DEPARTAMENTO DE PRODUCCIÓN VEXETAL RESPUESTA DE SIETE ORÍGENES IBÉRICOS DE PINUS PINASTER AITON FRENTE A LA INOCULACIÓN EN VIVERO CON PISOLITHUS TINCTORIUS Y PAXILLUS INVOLUTUS TESIS DOCTORAL SANTIAGO LAMOSA QUINTEIRO INGENIERO AGRÓNOMO Lugo, Enero de 2005 UNIVERSIDAD DE SANTIAGO DE COMPOSTELA ESCUELA POLITÉCNICA SUPERIOR DEPARTAMENTO DE PRODUCCIÓN VEGETAL TESIS DOCTORAL RESPUESTA DE SIETE ORÍGENES IBÉRICOS DE PINUS PINASTER AITON FRENTE A LA INOCULACIÓN EN VIVERO CON PISOLITHUS TINCTORIUS Y PAXILLUS INVOLUTUS Memoria presentada para obtener el Grado de Doctor por Santiago Lamosa Quinteiro VºBº. Directores de Tesis Fdo. Mª Isabel Iglesias Díaz Fdo. Francisco Fernández de Ana-Magán Lugo, Enero de 2005 Mª ISABEL IGLESIAS DÍAZ, PROFESORA E INVESTIGADORA DE LA ESCUELA POLITÉCNICA SUPERIOR DE LUGO DE LA UNIVERSIDAD DE SANTIAGO DE COMPOSTELA, Y FRANCISCO FERNÁNDEZ DE ANA-MAGÁN, PROFESOR DE LA ESCUELA POLITÉCNICA SUPERIOR DE LUGO DE LA UNIVERSIDAD DE SANTIAGO DE COMPOSTELA E INVESTIGADOR DEL CENTRO DE INVESTIGACIONES FORESTALES Y AMBIENTALES DE LOURIZÁN, CERTIFICAN: Que la presente Memoria titulada “Respuesta de siete orígenes ibéricos de Pinus pinaster Aiton frente a la inoculación en vivero con Pisolithus tinctorius y Paxillus involutus”, que para optar al grado de Doctor presenta el Ingeniero Agrónomo Santiago Lamosa Quinteiro ha sido realizada bajo nuestra dirección en el Departamento de Producción Vegetal de la Escuela Politécnica de Lugo, Universidad de Santiago de Compostela, y en el Centro de Investigaciones Forestales y Ambientales de Lourizán. Que consideran que representa un trabajo de Tesis y autorizan su presentación en el Departamento de Producción Vegetal de la Escuela Politécnica Superior de la Universidad de Santiago de Compostela. Y para que conste, expiden el presente certificado en Lugo, a 19 de febrero de 2005 AGRADECIMIENTOS No puedo presentar este trabajo sin mencionar a todas las personas que de algún modo han contribuido a su realización. A todas ellas quiero agradecer su colaboración. El primer recuerdo es para mis directores, Mª Isabel Iglesias Díaz y Francisco Fernández de Ana-Magán, los artífices de la idea y las personas que han estado continuamente a mi lado ofreciéndome todo el apoyo y la ayuda necesaria. No quiero olvidarme de Antonio Rodríguez Fernández, quien me introdujo en el mundo de la micología, sin él saberlo, y de las micorrizas y el primer ideólogo del trabajo que hoy se presenta. Deseo agradecer al Institut de Recerca i Tecnología Agroalimentaries de Cataluña (I.R.T.A.) y, en especial, a Xavier Parladé la cesión de algunas de las cepas utilizadas en este trabajo. A José Manuel Docampo, por su amistad y por suministrarme las semillas de “pino femia” necesarias para los ensayos. Al Centro de Investigacións Forestais e Ambientais de Lourizán (C.I.F.A.L.), en particular a la sección de Fitopatoloxía del departamento de Producción Vexetal, por permitirme trabajar en sus instalaciones, y por la ayuda de todo su personal: Pepe, Mª Carmen, María y Marina. A la Universidad de Santiago de Compostela por la cesión de sus instalaciones. A la Xunta de Galicia, por la financiación a través del Plan Galego de Investigación, Desenvolvemento e Innovación Tecnolóxica. Deseo agradecer, también, profundamente, la ayuda facilitada por Viveros Forestales Mañente, a la familia Candia y a todo su personal, que en todo momento me trataron como una más de la familia. Tengo que nombrar una vez más a Mª Isabel Iglesias, esta vez por su ayuda en los estudios estadísticos y en su interpretación y, por supuesto, por haber estado continuamente a mi lado. Quiero acordarme de todos mis compañeros y amigos que, aunque no han colaborado directamente en la elaboración del trabajo, sí tuvieron que soportar buena parte de su peso aguantando mi presencia, o mi ausencia, en muchos momentos y animándome en otros. Gracias a Chus, Martín, Benjamín, Carmen y Sara, Juan, Nuria, Ángel, Iria, Carlos, Miguel, Merche, Julio, Mª Carmen, Orti, Tere, Nusky, César, Jose, Suso, Cristina, Marcial, Alfredo y Ana, Sali, Pablo, Carlos y Bea, Clara, Laura, Ana y, a la madrina, Toña. Para finalizar, quiero dedicar a mis padres y hermanos este trabajo y agradecerles que estuvieran ahí. Índice Indice general . i INDICE GENERAL 1. Justificación y objetivos …………………………………………..………………… 3 2. Antecedentes …………………………………………………………..……………. 7 2.1. Pinus pinaster Ait. …………………………………………………………….. 7 2.1.1. Descripción …………………………………………………...………… 7 2.1.2. Taxonomía ………………………………………………...…………… 8 2.1.3. Distribución geográfica y natural ……………………………....……… 10 2.1.4. Características agroecológicas ……………………………...….……… 11 2.1.5. Importancia ecológica ………………………………………...….……. 13 2.1.6. Proceso de germinación y desarrollo de las plántulas …………….…… 15 2.1.7. Producción de plantas de Pinus pinaster en vivero ……………….…… 19 2.1.7.1. Producción comercial de Pinus pinaster a raíz desnuda ……...…. 19 2.1.7.2. Producción comercial de Pinus pinaster en contenedor ……….... 20 2.1.8. Aprovechamiento forestal ……………………………………………… 22 2.1.9. Flora micológica del Pinus pinaster ………………………………….... 24 2.1.10. Regiones de procedencia de Pinus pinaster en España……………….... 27 2.1.10.1. Región de procedencia Noroeste (1) …………………………….. 29 2.1.10.2. Región de procedencia Sierra de Oña (3) ……………………….. 32 2.1.10.3. Región de procedencia Sierra de Gredos (6) ……………………. 33 2.1.10.4. Región de procedencia Meseta Castellana (8) ………………...… 34 2.1.10.5. Región de procedencia Serranía de Cuenca (12) ………………... 36 2.1.10.6. Región de procedencia Sierras de Segura-Alcaraz (17) …………. 36 2.1.10.7. Región de procedencia Sierra Bermeja (20) …………………..… 37 2.2. Las micorrizas …………………………………………………………….….. 39 2.2.1. Definición de las micorrizas …………………………………………… 39 2.2.2. Tipos de micorrizas …………………………………………………….. 40 Indice general . ii 2.2.2.1. Micorrizas arbusculares …………………………………………. 40 2.2.2.2. Ectomicorrizas ………………………………………………...… 41 2.2.2.3. Ectendomicorrizas ………………………………………………. 42 2.2.2.4. Ericoides ………………………………………………………... 42 2.2.2.5. Arbutoides ……………………………………………………….. 42 2.2.2.6. Monotropoides …………………………………………………... 42 2.2.3. Las ectomicorrizas …………………………………………………...… 43 2.2.3.1. Funciones de las ectomicorrizas ……………………………….... 43 2.2.3.1.1. Absorción de agua y nutrientes ………………..…………. 43 2.2.3.1.2. Producción de sustancias reguladoras de crecimiento ..….. 44 2.2.3.1.3. Protección contra ataques de hongos patógenos del suelo ... 44 2.2.3.2. Aplicaciones prácticas de las ectomicorrizas …………………… 44 2.2.3.3. Manejo de las ectomicorrizas ……………………………………. 46 2.2.3.3.1. Selección de hongos ectomicorrícicos …………………… 46 2.2.3.3.1.1. Pisolithus tinctorius ……………………………..… 47 2.2.3.3.1.2. Paxillus involutus ………………………………..… 50 2.2.3.3.1.3. Laccaria laccata …………………………………… 51 2.2.3.3.1.4. Boletus badius ……………………………………… 51 2.2.3.3.2. Aislamiento y cultivo de hongos ectomicorrícicos …….… 52 2.3. Literatura científica ………………………………………………….……….. 54 3. Material y métodos …………………………………………………………………. 61 3.1. Influencia del medio de cultivo y el pH sobre el desarrollo de cinco hongos ectomicorrícicos en cultivo in vitro …………………………………………… 61 3.1.1. Especies y cepas seleccionadas ……………………………………...… 61 3.1.2. Medios de cultivo y pH ……………………………………………..… 62 3.1.3. Diseño experimental y análisis estadístico ………………….………… 64 3.1.4. Descripción del ensayo ………………………………………………… 64 Indice general . iii 3.1.5. Control de los ensayos ………………………………………………… 65 3.2. Evaluación de siete orígenes ibéricos de Pinus pinaster Aiton sembrados en suelo e inoculados con Pisolithus tinctorius y Paxillus involutus ………… 67 3.2.1. Orígenes de Pinus pinaster ensayados ……………………………...… 67 3.2.2. Elección de las cepas/especies ectomicorrícicas …………………….… 68 3.2.3. Diseño experimental y análisis estadístico …………………………..… 68 3.2.4. Localización y duración del ensayo ………………………………….… 69 3.2.5. Características climáticas de la zona del ensayo ………………….…… 69 3.2.6. Condiciones climáticas durante el periodo de ensayo ……………….… 71 3.2.7. Características edafológicas de la parcela de ensayo ………………..… 72 3.2.8. Preparación del inóculo …………………………………………...…… 72 3.2.9. Preparación del terreno y siembra ……………………………………... 73 3.2.10. Control de los ensayos ……………………………………………..….. 74 3.2.11. Análisis de laboratorio ……………………………………………..….. 75 3.3. Evaluación de siete orígenes ibéricos de Pinus pinaster Ait. sembrados en contenedor utilizando técnicas convencionales de propagación de planta forestal e inoculados con Pisolithus tinctorius y Paxillus involutus ……..….. 77 3.3.1. Orígenes de Pinus pinaster ensayados …………………..…………….. 77 3.3.2. Elección de las cepas/especies ectomicorrícicas ………………….…… 77 3.3.3. Diseño experimental y análisis estadístico ……………………….…… 77 3.3.4. Localización y duración del ensayo …………………………………… 78 3.3.5. Características climáticas de la zona del ensayo …………………….… 79 3.3.6. Condiciones climáticas durante el periodo de ensayo …………….…… 79 3.3.7. Preparación del inóculo ………………………………………………… 81 3.3.8. Preparación para la siembra ……………………………………….…… 81 3.3.9. Inoculación ……………………………………………………………... 83 3.3.10. Control del ensayo …………………………………………………...… 84 Indice de figuras . x en medio de cultivo PDA ……………………………………………………... 121 Fig. 35. Influencia del medio de cultivo sobre el crecimiento de Laccaria laccata …… 122 Fig. 36. Influencia del pH sobre el crecimiento de Pisolithus tinctorius en medio de cultivo MMN ……………………………………………………. 126 Fig. 37. Influencia del pH sobre el crecimiento de Pisolithus tinctorius en medio de cultivo Raper …………………………………………………….. 126 Fig. 38. Influencia del pH sobre el crecimiento de Pisolithus tinctorius en medio de cultivo agar-malta 4% ……………………………………..…… 127 Fig. 39. Influencia del pH sobre el crecimiento de Pisolithus tinctorius en medio de cultivo PDA ………………………………………………….….. 127 Fig. 40. Influencia del medio de cultivo sobre el crecimiento de Pisolithus tinctorius ... 128 Fig. 41. Modelos de regresión para las distintas procedencias de Pinus pinaster (porcentaje micorrización / peso seco parte aérea) …………………………… 140 Fig. 42. Modelos de regresión para las distintas procedencias de Pinus pinaster (porcentaje micorrización / longitud parte aérea) …………………………….. 141 Fig. 43. Evolución de la germinación de los 7 orígenes ensayados ……………………. 142 Fig. 44. Crecimientos quincenales de los 7 orígenes de Pinus pinaster Ait. ensayados durante todo el periodo de ensayo ………………………………… 146 Fig. 45. Pinus pinaster Ait. Crecimientos quincenales de plantas inoculadas con inóculo miceliar de Paxillus involutus, esporas de Pisolithus tinctorius y control ………………………………………………… 147 Fig. 46. Pinus pinaster Ait. Región de procedencia: Sierra Bermeja. Crecimientos quincenales de plantas inoculadas con inóculo miceliar de Paxillus involutus, esporas de Pisolithus tinctorius y control ………………… 148 Fig. 47. Pinus pinaster Ait. Región de procedencia: Serranía de Cuenca. Crecimientos quincenales de plantas inoculadas con inóculo miceliar de Paxillus involutus, esporas de Pisolithus tinctorius y control …………………. 149 Fig. 48. Pinus pinaster Ait. Región de procedencia: Noroeste (pino “femia”). Crecimientos quincenales de plantas inoculadas con inóculo miceliar de Paxillus involutus, esporas de Pisolithus tinctorius y control ………………… 151 Indice de figuras . xi Fig. 49. Pinus pinaster Ait. Región de procedencia: Sierra de Gredos. Crecimientos quincenales de plantas inoculadas con inóculo miceliar de Paxillus involutus, esporas de Pisolithus tinctorius y control ………………… 152 Fig. 50. Pinus pinaster Ait. Región de procedencia: Meseta Castellana. Crecimientos quincenales de plantas inoculadas con inóculo miceliar de Paxillus involutus, esporas de Pisolithus tinctorius y control …………...……. 153 Fig. 51. Pinus pinaster Ait. Región de procedencia: Sierra de Oña. Crecimientos quincenales de plantas inoculadas con inóculo miceliar de Paxillus involutus, esporas de Pisolithus tinctorius y control ……………..….. 155 Fig. 52. Pinus pinaster Ait. Región de procedencia: Segura-Alcaraz. Crecimientos quincenales de plantas inoculadas con inóculo miceliar de Paxillus involutus, esporas de Pisolithus tinctorius y control ……………….... 156 Fig. 53. Modelos de regresión para las distintas procedencias de P. pinaster (porcentaje micorrización/peso seco parte aérea) …………………………….. 171 Indice de fotografías . xii INDICE DE FOTOGRAFÍAS Foto 1. Parte inferior del tronco de un ejemplar de Pinus pinaster de la Meseta Castellana, aprovechado para la producción de resina ……………….. 22 Foto 2. Ejemplar de pino femia ……………………………………………………..… 30 Foto 3. Pinar en Arévalo, Región de procedencia Meseta Castellana ………………… 35 Foto 4. Corteza de un ejemplar de “pino femia” y de otro de la Meseta Castellana ….. 35 Foto 5. Placa 347 BcP5R6, Boletus badius (S. Vicente), en PDA a pH 5.0 con el eje de coordenadas y las marcas de crecimiento en cada una de las fechas de la toma de datos ………………………………………………………….… 66 Foto 6. Placa 429 PiM5.5A2, Paxillus involutus, en MMN a pH 5.5, muestra utilizada para la descripción morfológica, junto con la carta de colores (RHS) ……….. 66 Foto 7. Inóculo de Paxillus involutus en medio de turba-vermiculita ………………… 73 Foto 8. Parcela de ensayo ……………………………………………………………… 73 Foto 9. Detalle de las plántulas de pino ……………………………………………….. 74 Foto 10. Extracción de las muestras ……………………………………………………. 75 Foto 11. Parcela de ensayo en el interior del invernadero ……………………………… 81 Foto 12. Ensayo listo para ser trasladado al exterior …………………………………… 82 Foto 13. Parcela de ensayo en el exterior ………………………………………………. 82 Foto 14. Bandejas sembradas y etiquetadas, listas para ser llevadas a la cámara de cultivo ……………………………………………………………… 84 Foto 15. Boletus badius, Sarria, en MMN a pH = 5.5, a los 60 días. Reverso y anverso . 90 Foto 16. Boletus badius, Sarria, a los 45 días …………………………………………... 91 Foto 17. Boletus badius, Sarria, en agar-malta, a pH = 4.5, a los 45 días ………...…… 92 Foto 18. Boletus badius, Sarria, en PDA, a los 45 días ………………………………… 93 Foto 19. Boletus badius, San Vicente, en MMN, a pH = 5.0, a los 60 días Reverso y anverso …………………………………………………………….. 99 Foto 20. Boletus badius, San Vicente, en Raper, a pH = 6.5, a los 60 días. Reverso y anverso ……………………………………………………….……. 100 Indice de fotografías . xiii Foto 21. Boletus badius, San Vicente, en agar-malta, a pH = 5.0, a los 60 días ………. 100 Foto 22. Boletus badius, San Vicente, en PDA, a pH = 5.0, 5.5 y 6.0, a los 60 días Reverso y anverso …………………………………………………………..… 101 Foto 23. Paxillus involutus, a los 60 días ……………………………………………… 108 Foto 24. Paxillus involutus, en MMN, a pH = 6.0 y en Raper a pH = 7.5, a los 60 días .. 108 Foto 25. Laccaria laccata, en MMN, a los 30 días. pH = 5.0, 5.5 y 6.0 ……………….. 114 Foto 26. Laccaria laccata, en MMN, a los 60 días. pH = 5.0, 5.5 y 6.0, reverso y anverso ……………………………………………………………… 115 Foto 27. Laccaria laccata, en Raper, a pH = 7.5, a los 60 días. Reverso y anverso …… 116 Foto 28. Laccaria laccata, en agar-malta, a pH = 5.0, a los 60 días. Reverso y anverso . 116 Foto 29. Laccaria laccata, en PDA, a pH = 6.0, a los 45 días. Reverso y anverso …….. 117 Foto 30. Pisolithus tinctorius, en Raper, a pH = 7.0, a los 60 días. Anverso ………...… 122 Foto 31. RHS COLOUR CHART, carta de colores utilizada en la descripción de las colonias ……………………………………………………. 130 Foto 32. Morfotipo L1. Micorriza en estado incipiente ……………………………...…. 135 Foto 33. Morfotipo L1. Micorriza dicotómica ………………………………………….. 135 Foto 34. Morfotipo L1. Cortes transversales de una micorriza (1) ……………………... 135 Foto 35. Morfotipo L1. Cortes transversales de una micorriza (2) ……………………... 135 Foto 36. Morfotipo L2. Micorriza con rizomorfos (1) ………………………………..… 136 Foto 37. Morfotipo L2. Micorriza con rizomorfos (2) ………………………………..… 136 Foto 38. Morfotipo L2. Micorriza (1) ………………………………………………...… 136 Foto 39. Morfotipo L2. Micorriza (1) ............................................................................... 136 Foto 40. Morfotipo L2. Corte transversal de una micorriza apreciándose la red de Hartig y el manto ……………………………………………………. 136 Foto 41. Morfotipo L2. Rizomorfo …………………………………………………...… 136 Foto 42. Morfotipo L14. Micorrizas (1) ............................................................................ 137 Fotos 43. Morfotipo L14. Micorrizas (2) ........................................................................... 137 Indice de fotografías . xiv Foto 44. Morfotipo L14. Corte longitudinal de una micorriza ......................................... 137 Foto 45. Morfotipo L14. Corte transversal de una micorriza ........................................... 137 Foto 46. Morfotipo L14. Manto externo plectenquimático en puzle ………................… 137 Foto 47. Morfotipo LN. Micorrizas (1) ............................................................................. 138 Foto 48. Morfotipo LN. Micorrizas (2) ............................................................................. 138 Foto 49. Morfotipo LN. Corte longitudinal de una micorriza .......................................... 138 Foto 50. Morfotipo LN. Manto externo plectenquimático de forma radial ...................... 138 Foto 51. Morfotipo LN. Hifas de emanación …………………………………………… 138 Foto 52. Plántula de “pino femia” albina ……………………………………………….. 144 Foto 53. Plántula de Sierra Bermeja, caracterizada por la dificultad de apertura de la semilla …………………………………………………………………… 144 Foto 54. Plántula de Sierra Bermeja, daños ocasionados ……………………………….. 144 Foto 55. Detalle de las plantas 45 días después de la siembra. Sierra Bermeja y Sierra de Oña ……………………………………………….. 148 Foto 56. Morfotipo F1. Micorriza ……………………………………………………..... 167 Foto 57. Morfotipo F1. Micorriza ……………………………………………………..... 167 Foto 58. Morfotipo F1. Cistidios (1) ……………………………………………………. 167 Foto 59. Morfotipo F1. Cistidios (2) ……………………………………………………. 167 Foto 60. Morfotipo F1. Corte longitudinal de una micorriza apreciándose el manto y la red de Hartig (1) ………………………………………………………….. 167 Foto 61. Morfotipo F1. Corte longitudinal de una micorriza apreciándose el manto y la red de Hartig (2) ……………………………………………………..…… 167 Foto 62. Morfotipo F1. Corte transversal una micorriza apreciándose el manto, la red de Hartig e hifas intercelulares …………………………………………. 167 Foto 63. Morfotipo F1. Hifas de emanación ……………………………………………. 167 Foto 64. Morfotipo F5. Micorriza con rizomorfo (1) …………………………………… 169 Foto 65. Morfotipo F5. Micorriza con rizomorfo (2) …………………………………… 169 Foto 66. Morfotipo F5. Corte longitudinal de una micorriza apreciándose el manto Indice de fotografías . xv y la red de Hartig (1) ………………………………………………………..… 169 Foto 67. Morfotipo F5. Corte longitudinal de una micorriza apreciándose el manto y la red de Hartig (2) ………………………………………………………..… 169 Foto 68. Morfotipo F5. Corte transversal una micorriza apreciándose el manto, la red de Hartig e hifas intercelulares …………………………………………. 169 Foto 69. Morfotipo F5. Rizomorfo ………………………………………………...……. 169 Foto 70. Morfotipo F5. Hifas ……...……………………………………………………. 169 Indice de tablas . xvi INDICE DE TABLAS Tabla 1. Tabla resumen de las características de los distintos orígenes de Pinus pinaster ……………………………………………………………. 38 Tabla 2. Características de las especies/cepas utilizadas …………………………..… 61 Tabla 3. Composición de los medios de cultivo utilizados en el ensayo ……………... 63 Tabla 4. Combinación de pH y medios de cultivo ensayados ……………………...… 63 Tabla 5. Fuentes de variación y grados de libertad del modelo empleado en el ensayo de medios de cultivo y pH en laboratorio …………………………………... 64 Tabla 6. Características de las semillas ensayadas …………………………………… 68 Tabla 7. Fuentes de variación y grados de libertad del modelo empleado en el ensayo de orígenes (procedencias) en suelo ………………………………………… 69 Tabla 8. Tabla resumen de los datos climáticos de Lourizán de un periodo de 30 años …………………………………………………………………… 70 Tabla 9. Fuentes de variación y grados de libertad del modelo empleado para los porcentajes de germinación en el ensayo de orígenes (procedencias) en contenedor ……………………………………………………………….. 78 Tabla 10. Fuentes de variación y grados de libertad del modelo empleado para los incrementos quincenales de la altura en el ensayo de orígenes (procedencias) en contenedor ……………………………………………………………….. 78 Tabla 11. Fuentes de variación y grados de libertad del modelo empleado para los datos finales en el ensayo de orígenes (procedencias) en contenedor ……… 78 Tabla 12. Tabla resumen de los datos climáticos de Benquerencia de un periodo de 10 años ……………………………………………………. 79 Tabla 13. Influencia del pH sobre el radio de las colonias de Boletus badius (Sarria) para los diferentes medios de cultivo ……………………………………….. 94 Tabla 14. Influencia de la combinación medio-pH sobre el radio de las colonias de Boletus badius (Sarria) ……………………………………………………… 95 Tabla 15. Influencia del pH sobre el radio de las colonias de Boletus badius (San Vicente) para los diferentes medios de cultivo ……………………….. 103 Indice de tablas . xvii Tabla 16. Influencia de la combinación medio-pH sobre el radio de las colonias de Boletus badius (San Vicente) ……………………………………………….. 104 Tabla 17. Influencia del pH sobre el radio de las colonias de Paxillus involutus para los diferentes medios de cultivo ……………………………………….. 110 Tabla 18. Influencia de la combinación medio-pH sobre el radio de las colonias de Paxillus involutus ………………………………………………………...…. 111 Tabla 19. Influencia del pH sobre el radio de las colonias de Laccaria laccata para los diferentes medios de cultivo …………………………………………….. 118 Tabla 20. Influencia de la combinación medio-pH sobre el radio de las colonias de Laccaria laccata ……………………………………………………………. 119 Tabla 21. Influencia del pH sobre el radio de las colonias de Pisolithus tinctorius para los diferentes medios de cultivo ………………………………….……. 124 Tabla 22. Influencia de la combinación medio-pH sobre el radio de las colonias de Pisolithus tinctorius ……………………………………………………...…. 125 Tabla 23. Tabla resumen de las descripciones morfológicas ………………………….. 129 Tabla 24. Influencia del tipo de inóculo y de la procedencia de las semillas de P. pinaster sobre el peso seco de la parte aérea, longitud de la parte aérea, relación entre longitud y peso seco de la parte aérea, supervivencia, porcentaje de micorrización total, porcentaje del micotipo L1, porcentaje del micotipo L2, porcentaje del micotipo L14 y porcentaje del micotipo LN ………..…………………………………………………….…. 133 Tabla 25. Velocidad de germinación de las semillas …………………………………. 143 Tabla 26. Influencia del origen de la semilla sobre la germinación …………….…….. 143 Tabla 27. Influencia de las procedencias sobre el crecimiento de plantas de Pinus pinaster cultivadas en contenedor ………………………………… 145 Tabla 28. Influencia del inóculo sobre el crecimiento de plantas de Pinus pinaster cultivadas en contenedor ………………………………... 147 Tabla 29. Influencia del inóculo sobre el crecimiento de plantasde Pinus pinaster Ait., región de procedencia Sierra Bermeja, cultivadas en contenedor ……….… 149 Indice de tablas . xviii Tabla 30. Influencia del inóculo sobre el crecimiento de plantas de Pinus pinaster Ait., región de procedencia Serranía de Cuenca, cultivadas en contenedor …….. 150 Tabla 31. Influencia del inóculo sobre el crecimiento de plantas de Pinus pinaster Ait., región de procedencia Noroeste “pino femia”, cultivadas en contenedor …. 151 Tabla 32. Influencia del inóculo sobre el crecimiento de plantas de Pinus pinaster Ait., región de procedencia Sierra de Gredos, cultivadas en contenedor ……….. 152 Tabla 33. Influencia del inóculo sobre el crecimiento de plantas de Pinus pinaster Ait., región de procedencia Meseta Castellana, cultivadas en contenedor ………154 Tabla 34. Influencia del inóculo sobre el crecimiento de plantas de Pinus pinaster Ait., región de procedencia Sierra de Oña, cultivadas en contenedor ………..….. 155 Tabla 35. Influencia del inóculo sobre el crecimiento de plantas de Pinus pinaster Ait., región de procedencia Segura-Alcaraz, cultivadas en contenedor ………… 156 Tabla 36. Influencia del inóculo sobre el crecimiento de plantas de Pinus pinaster, en función del origen de la semilla ………………………… 158 Tabla 37. Influencia del origen de las semillas sobre el crecimiento de plantas de Pinus pinaster, en función del inóculo utilizado ……………………………. 162 1. Justificación y objetivos Antecedentes Pinus pinaster Ait. . 10 (Schvester, 1982; Harfouche et al., 1995 a, b) y en la variación de sistemas enzimáticos (Petit, 1988). 2.1.3. Distribución geográfica y natural P. pinaster se extiende de forma natural por las regiones costeras, europeas y africanas del Mediterráneo occidental, llegando al litoral atlántico de Portugal, España y Francia (Fig. 1), aunque actualmente se ha extendido a otros países de la Unión Europea, como Bélgica, Dinamarca y Grecia (Matziris, 1982), y por varios continentes por medio de repoblaciones, como Australia (Nicholls et al., 1963), California (Rehder, 1940), Nueva Zelanda (Sweet y Thulin, 1962) y Sudáfrica (Duff, 1928; Rycroft y Wicht, 1947). Las especulaciones sobre el carácter autóctono de las representaciones actuales de P. pinaster han originado múltiples polémicas. Rikly (1943) y más tarde Destremau et al. (1982), sitúan el centro de diseminación de la especie en “un sector de montañas medias de la Península Ibérica en la confluencia de las corrientes climáticas mediterránea y atlántica”. Teixeira (1944) considera que P. pinaster se habría diferenciado del P. praepinaster Teix., encontrado en el Plioceno de Río Maior en Portugal, y que se habría refugiado durante la glaciación würmiense en el norte de Africa o en el Algarve, desplazándose posteriormente hacia el norte y alcanzando su distribución actual. Baradat y Marpeau (1988), estudiando la composición terpénica de las poblaciones, señalan que éstas quedaron reducidas a un pequeño número de individuos situados en la misma área geográfica, y localizan en la sierra de Ronda y en el norte de África el refugio de esta especie durante el Würm III (35.000 años). Gil et al. (1990), considerando la distribución actual de la especie y los estudios realizados por Alía (Alía, 1989 cit. Alía et al., 1996), en los que evaluó el comportamiento de 52 orígenes de P. pinaster en parcelas en el centro de España, sitúan en la Serranía de Cuenca el núcleo fundamental de la especie, a partir del cual se derivaron los distintos grupos o razas en que se encuentra diferenciada. Salvador et al. (1996) confirmarían este refugio en la parte sur del Sistema Ibérico mediante análisis de isoenzimas. A pesar de estas discusiones sobre el origen o sobre el carácter autóctono de P. pinaster, sí se puede afirmar que su distribución espontánea actual se sitúa en territorios altamente humanizados desde antiguo, lo cual influyó sustancialmente en la conformación final del paisaje vegetal, tanto mediante la realización de repoblaciones, fuera y dentro de su área de distribución primitiva, como mediante talas, roturaciones, fuego y/o pastoreo, originando la distribución actual de P. pinaster, discontinua y fragmentada. En todo caso, se Antecedentes. Pinus pinaster Ait.. . 11 debería aceptar que más de la mitad de los pinares españoles actuales son manifestaciones antiguas (Gil et al., 1990). Fig. 1.- Distribución de Pinus pinaster Ait. en su área natural (Alía y Martín, 2003) 2.1.4. Características agroecológicas Los pinos, en general, son árboles frugales, xerófilos, de carácter pionero en la progresión vegetal, heliófilos, de temperamento robusto e invasor, sencillos de manejar en vivero y de fácil implantación y pervivencia. Respecto al P. pinaster en particular, una de las características más sobresalientes es su tolerancia a suelos con escasa fertilidad y poco evolucionados y aunque abunda en suelos bien drenados, también soporta suelos escasamente drenados como ocurre en Las Landas, o en los suelos arcillosos de la Serranía de Ronda (Nicolás y Gandullo, 1967). Como buen representante de los pinos, es una especie pionera o colonizadora de espacios vacíos, ocupando las primeras etapas de la sucesión hacia formaciones más complejas, debido a su reducido nivel de exigencia y a su facilidad de adaptación a las variaciones de suelo y clima. Estas escasas exigencias y la rapidez con que se desarrolla le permiten colonizar suelos desnudos, donde aún no han podido instalarse otras especies. Por este motivo, se ha utilizado, ofreciendo buenos resultados, para la fijación de dunas, la protección del suelo frente a la erosión (Moore, 1988) y la recuperación de zonas forestales (de Braganca y Havel, 1987). Por otro lado, necesita para su desarrollo la ausencia de cubierta arbórea, debido al carácter heliófilo de sus plántulas, por lo que no puede regenerarse o implantarse espontáneamente más que en suelos casi desprovistos de Antecedentes Pinus pinaster Ait. . 12 vegetación, en los que sus semillas puedan caer directamente sobre el suelo mineral. Además, ha desarrollado una gran proporción de corteza, una fructificación precoz y un gran reservorio de semillas, almacenadas en las piñas cerradas de las copas con el fin de adaptarse al fuego. Sus semillas tienen un gran poder de diseminación, germinando perfectamente sobre un suelo quemado y aventajando al resto de la vegetación debido a su rápido crecimiento. A pesar de que se le considera una especie de suelos arenosos y ácidos, y por tanto calcífuga, también se le puede encontrar en suelos muy arcillosos e incluso suelos muy calcáreos como en las montañas iberolevantinas y en las de las cordilleras béticas (Ceballos, 1933; Hughet del Villar, 1933; Nicolás y Gandullo, 1967). Sin embargo, crece mejor en suelos arenosos que en limosos o arcillosos debido a que la fracción horizontal de su sistema radical se desarrolla mucho mejor en suelos fácilmente penetrables. La fracción vertical, en cambio, presenta un gran poder de penetración y puede adaptarse a la presencia de un horizonte compacto siempre que no se encuentre demasiado cerca de la superficie del suelo. Su sistema absorbente funciona mejor en un medio ácido, de pH 5 e incluso inferior (Maugè, 1987). Aunque prefiere suelos ricos, ligeros y profundos (Schafer, 1988), con una buena disponibilidad de agua, una de las características más importantes de este pino es su tolerancia a los suelos poco fértiles, en los que pueden desarrollarse muy pocas especies forestales de interés económico (Scott, 1962). Esta característica, y la ocupación espontánea de las zonas más fértiles por especies con las que se encuentra en desventaja competitiva, lo han relegado a zonas relativamente pobres. Las raíces de P. pinaster parecen capaces de extraer los elementos nutritivos del suelo con una gran eficacia, incluso bajo formas inaccesibles a la mayoría de los vegetales (Maugè, 1987), tal como sucede en las dunas de Aquitania (Chaperon, 1986) en las que viven sobre suelos con trazas de elementos nutritivos. A pesar de su gran frugalidad, responde de forma notable a la fertilización (Bonneau et al., 1973; Gelpe y Guinadeau, 1974; Maugè, 1973, 1974; Otha et al., 1985). En la mayoría de los casos el elemento limitante es el fósforo, aunque en los suelos muy arenosos, donde la corrección por aporte de fertilizantes resulta casi imposible, la limitación principal se presenta por la carencia de nitrógeno (Maugè, 1987). El comportamiento de la especie en conjunto frente a los distintos factores climáticos está profundamente influenciado por la constitución genética del individuo y varía notablemente según la procedencia, por lo que resulta difícil generalizar sus características. De los 20 fitoclimas establecidos por Allué Andrade (1990) en el territorio español, en 9 nos encontramos manifestaciones relativamente importantes de P. pinaster, y no aparece en condiciones áridas o subáridas. Todas las razas estudiadas soportan sin dificultades las altas Antecedentes. Pinus pinaster Ait.. . 13 temperaturas (más de 40° C) pero el comportamiento frente a las bajas temperaturas difiere mucho entre las razas del norte, más resistentes al frío (llegando a superar periodos de hasta - 25° C), y las del sur, muy sensibles a las bajas temperaturas (Bouvarel, 1960; Illy, 1966). Los daños producidos por el frío no sólo afectan a las hojas, sino también al cambium y al sistema radical, por lo que los síntomas pueden manifestarse más tarde, cuando el árbol ya ha agotado todas sus reservas. Otro efecto importante de las bajas temperaturas es la ralentización del crecimiento y la mayor susceptibilidad al ataque de los parásitos y patógenos. Estos fenómenos pueden llevar a la desaparición progresiva de plantaciones enteras después de un periodo de frío extremo. A nivel general, P. pinaster es poco sensible a la cantidad y a1 reparto de la pluviometría, aunque se observan diferencias entre procedencias. Así, las procedencias de Las Landas y del Noroeste de la Peninsula Ibérica son menos resistentes al estrés hídrico que las procedencias del sur de la Península Ibérica y el norte de Africa (Guyon y Kremer, 1982; Sarrauste, 1982; Nguyen, 1986). Ello se debe a que las razas meridionales poseen una menor tasa de transpiración, además de una protección cerosa en sus acículas y una mayor proporción de biomasa radical. Pero, a pesar de estas adaptaciones, el crecimiento se ve muy afectado si no dispone de una cantidad suficiente de agua y de nutrientes en disolución durante los periodos de vegetación activa. Esto es debido a que las plantas reaccionan a la baja humedad ambiental, que suele acompañar a los periodos estivales, cerrando sus estomas (Loustau y Moussa, 1989), consiguiendo una reducción del consumo de agua pero bloqueando, a la vez, el intercambio gaseoso y por tanto la fotosíntesis. Por este motivo, las sequías estivales y otoñales provocan una gran reducción en el crecimiento, especialmente en suelos arenosos con baja capacidad de retención. 2.1.5. Importancia ecológica Respecto a la idoneidad de P. pinaster en el medio natural español, las opiniones son divergentes. Gil et al. (1990), intentando conciliar posturas, opinan que “se deben abandonar opiniones simplistas, como la aceptación global de la especie o su aceptación incondicional”. Habría que valorar las virtudes y limitaciones de la especie y emplearla en aquellas zonas en que su implantación pueda ser útil, desde el punto de vista ecológico y/o productivo, sin ocasionar una regresión en las etapas evolutivas del suelo. Las mayores críticas del P. pinaster, se han basado en: - ser una especie introducida en muchos de sus enclaves ibéricos (Taborda de Morais, 1940; Bellot y Viéitez, 1945; Hopfner, 1954; Costa, 1974; Rivas Antecedentes Pinus pinaster Ait. . 14 Martínez, 1975; Sánchez Mata, 1986) y procedente de repoblaciones antiguas (Costa, 1974; Bellot et al., 1983; Izco, 1984; Peinado y Martínez, 1985; Navarro y Valle, 1987) - favorecer los incendios forestales (Sanz Fernández, 1986; Costa, 1988; Sánchez Mata y Fernández González, 1989) - dudosa viabilidad biológica de su cultivo ya que su utilización es siempre regresiva desde el punto de vista ecológico (Alvarado, 1983; Rivas Martínez, 1987) - acción negativa sobre la evolución del suelo (Velasco y López Martínez, 1973; Velasco, 1975; Izco, 1984; Sánchez Mata y Fernández González, 1989) Debido a las características propias de los pinos, que poseen una gran capacidad de resistir el frío y las sequías pero tienen una escasa capacidad de competencia, bajo las copas de un pinar adulto, principalmente aquellas razas de copa amplia que impiden la iluminación del sotobosque, no existen plantas jóvenes ya que se ahilan ante la falta de luz y acaban desapareciendo, impidiendo su regeneración e iniciando, así, la evolución hacia formaciones más diversificadas. Las frondosas, en cambio, si existe suficiente profundidad de suelo, se desarrollan a la sombra de los pinos a la espera de la muerte de los ejemplares más viejos, ocupando el dosel arbóreo y dando lugar a una etapa umbrógena e higrófila, de mayor densidad y resistencia a los incendios, quedando los pinos relegados a las situaciones más difíciles: aquellas zonas donde la precipitación, el sustrato o el relieve resultan limitantes a las frondosas para volver a extenderse cuando el fuego deja lugares vacíos (Gil et al., 1990). Sánchez Mata y Fernández González (1989), comentan que para evitar la desertización o la erosión de los suelos, se deben reimplantar las especies arbóreas de los bosques autóctonos dado que están mejor adaptadas ecológica y evolutivamente para ello, por lo que, en la actualidad, el uso de las frondosas sería una alternativa deseable a la de los pinos. En cambio Gil et al. (1990), afirman que utilizar frondosas en las repoblaciones sería una estrategia suicida, tal como lo denomina Laguna (1988) en términos de ecología general, pues conlleva para la especie costes energéticos muy elevados a cambio de logros muy reducidos. Los pinos en general son especies frugales, poco exigentes en cuanto a humedad edáfica y ambiental, con un potente sistema radical que ejerce una acción mecánica favorable sobre suelos poco evolucionados. Son especies capaces de iniciar la creación del suelo y protegerlo, deteniendo su degradación, pero incapaces de mejorarlo en la misma medida que lo hacen las frondosas (Gil et al., 1990). Conviene añadir, además, que el carácter xerófilo del Antecedentes. Pinus pinaster Ait.. . 15 P. pinaster le confiere una mayor probabilidad de arder que otras formaciones más nemorales e higrófilas, sin embargo, es precisamente esta característica la que le permite soportar las condiciones de alta iluminación y la pobreza de los suelos degradados. Blanco (1986) afirma que es un hecho probado que la instalación de P. pinaster supone una reducción notable de la tasa erosiva de los suelos en que vegeta, debido a la fragilidad textural (suelos excesivamente arenosos) y estructural (debido al bajo contenido de arcilla y humus) de esos suelos, siempre que la repoblación se efectúe sobre suelos desnudos o escasamente poblados y por medios no traumáticos. Este hecho pone de manifiesto la idoneidad del P. pinaster para la repoblación de suelos degradados, pero en ningún caso para sustituír formaciones más evolucionadas. Incidiendo en este aspecto, Braun Blanquet (1964) subralla el papel favorecedor que representa P. pinaster en la regeneración del robledal climácico en Portugal. Como opinión contraria, cabe señalar la postura de Rivas Martínez (1987) que considera el uso del P. pinaster inadecuado o regresivo para su empleo en repoblaciones en toda su área española y pone de manifiesto la dudosa viabilidad de esta especie para un gran número de pinares actuales, a pesar de que existen numerosas zonas con buenos pinares espontáneos como Cuéllar (Segovia), Bayubas (Soria), Villanueva de Gubiel (Burgos), Almodóvar y Poyatos (Cuenca), Benicasim (Castellón), Moratalla (Murcia), Paterna del Madera (Albacete) y Sierra Bermeja (Málaga) (Gil et al., 1990). 2.1.6. Proceso de germinación y desarrollo de las plántulas El proceso de la germinación consiste en el reinicio del crecimiento del embrión y su desarrollo en una plántula independiente. Las semillas de la gran mayoría de las especies de pinos germinan normalmente durante la primavera del año siguiente a su dispersión (McLemore, 1959), aunque existen especies cuyas semillas no germinan hasta el segundo o tercer año. El fenómeno de la germinación comienza poco tiempo después de que la semilla haya absorbido agua a través del micropilo. El primer indicio de la germinación se manifiesta con la ruptura de la testa cerca del extremo micropilar. Esta ruptura es causada en primer lugar por la presión de imbibición de agua y posteriormente por el crecimiento del embrión. A medida que el embrión inicia su crecimiento, la radícula es la primera en emerger de la semilla. En los pinos la germinación es epigea, es decir, los cotiledones se desarrollan sobre la superficie del suelo debido a la elongación del hipocótilo. Los procesos bioquímicos y fisiológicos que tienen lugar durante la germinación han sido ampliamente tratados por Antecedentes Pinus pinaster Ait. . 16 Toole et al. (1956), Koller et al. (1962), Mayer y Shain (1974), McDonough (McDonough, 1977 cit. Niembro, 1986). En ocasiones se producen anomalías como germinación invertida, en la cual los cotiledones emergen antes que la radícula; formación de plántulas albinas, débiles o mucilaginosas; ruptura de la testa sin la emergencia del embrión (Kozlowski, 1971; Pollock y Ross, 1972). Por lo general estos tipos de germinación producen plántulas que morirán poco tiempo después de haber germinado. A medida que transcurre la germinación, las reservas alimenticias contenidas en las células del gametofito femenino, van siendo asimiladas por el embrión en el curso de su crecimiento y desarrollo. La germinación llega a su término cuando el embrión se ha convertido en una plántula independiente con facultad para sintetizar su propio alimento (Kozlowski, 1971). El tiempo requerido por las semillas de Pinus para germinar varía de acuerdo con la especie, aunque en términos generales la germinación se completa en el curso de 12 a 30 días. En concreto, las semillas de Pinus pinaster germinan lentamente y sobre todo poco homogéneamente si no se les somete a tratamientos previos. Incluso se ha comprobado que tanto la capacidad como la energía germinativa varía en el mismo lote en el curso de un año (Catalán, 1991). Los factores ambientales que mayor influencia ejercen en la germinación en condiciones naturales son la humedad, la temperatura, la luz, el oxígeno y las características del suelo (Niembro, 1986). La humedad contenida en el suelo es necesaria para hidratar los coloides gelificados contenidos en las células del embrión y del gametofito femenino. La cantidad de agua que requieren las semillas para germinar varía de acuerdo con la especie, pero en términos generales un suelo que tenga un 40 % de humedad es adecuado para que germine normalmente la mayoría de las semillas de pino (Baker, 1950). Debido a que el proceso de germinación va acompañado de una intensa actividad metabólica, es necesario un suministro continuo de oxígeno. Con sustratos excesivamente húmedos las semillas por lo general no germinan a causa de la deficiencia de oxígeno (Baker, 1950). La temperatura es uno de los factores más importantes que controlan la germinación de las semillas de los pinos (Fraser, 1970 cit. Niembro, 1986), ejerciendo también una notable Antecedentes. Pinus pinaster Ait.. . 17 influencia en el crecimiento inicial de las plántulas. Todas las plantas tienen un intervalo de temperatura entre un máximo y un mínimo fuera del cual no germinan, entre ambas existe una temperatura óptima de germinación que varía entre las especies y entre las diferentes procedencias de la misma especie (Fraser, 1970). Los estudios de Kintigh (1949) demostraron que a medida que aumenta la temperatura del suelo se incrementa la actividad metabó1ica del embrión. Temperaturas por encima del óptimo ocasionan que las reservas del gametofito femenino sean consumidas con mayor rapidez y no sean debidamente asimiladas por el embrión, por lo que las plántulas resultantes son pequeñas y débiles. De igual manera, las bajas temperaturas reducen la actividad metabólica del embrión, por lo que al final de la germinación se encuentran porciones de tejido nutritivo sin ser utilizado. Las características del sustrato también ejercen una notable influencia tanto en la germinación como en el posterior crecimiento y desarrollo de las plántulas. Básicamente, se debe a la posibilidad de transferir humedad a la semilla con facilidad, a las diferencias de temperatura, disponibilidad de agua y nutrientes y a la penetrabilidad del suelo por parte de la radícula (Kozlowski, 1971). El número de semillas de Pinus pinaster por kilogramo oscila entre 15.000 y 28.600. El tamaño de las semillas influye notablemente en su germinación y en el posterior desarrollo de las plántulas (Caballero, 1967). Las semillas grandes, superiores a la media de la población, presentan la tendencia a germinar con mayor rapidez y con mayor porcentaje que las semillas de mediano y pequeño tamaño. Una vez que se ha producido la germinación, las plántulas presentan una consistencia frágil y quebradiza. En esta etapa inicial de desarrollo las plántulas carecen de estructuras especializadas así como de un sistema vascular completamente organizado. En los pinos la germinación es precedida por el desarrollo secuencial de tres tipos de apéndices foliares: las hojas cotiledonares, las hojas primarias y las hojas secundarias (Kozlowski, 1971). Las hojas cotiledonares son las hojas del embrión y alcanzan su máximo desarrollo durante la germinación. En condiciones favorables, 2 ó 3 semanas después de la germinación, se manifiesta el crecimiento del epicótilo con el consiguiente desarrollo de las hojas primarias (Tepper, 1964). A medida que las hojas primarias inician su crecimiento y desarrollo, en las axilas de algunas de estas hojas se producen los meristemos que posteriormente darán origen a las hojas secundarias. A partir de este momento las diferencias en la morfología y la tasa de crecimiento y desarrollo de las plántulas de las diferentes especies de pinos comienza a ser evidente. Las hojas primarias crecen rápidamente, el Antecedentes Pinus pinaster Ait. . 18 epicótilo se hace más resistente y la radícula incrementa su tamaño y desarrollo (Baker, 1950). Las hojas primarias comprenden el tipo principal de hojas que tienen las plántulas durante la primera estación de crecimiento. Al iniciarse la segunda estación aparecen las hojas secundarias, mientras que las primarias se reducen a catafilos. Las primeras etapas del desarrollo de las plántulas básicamente están constituidas por crecimiento primario. Antes de que finalice la primera estación de crecimiento se forma en la plántula el cambium vascular a partir de las células del procambium. Una vez constituido el cambium vascular comienza el crecimiento secundario o en diámetro que es el resultado de las divisiones de las células del cambium para producir xilema hacia el interior y floema hacia el exterior. A medida que la plántula incrementa en diámetro la epidermis va siendo reemplazada por la peridermis (Esau, 1965 cit. Niembro, 1986). Con la formación de la peridermis el hipocótilo adquiere una consistencia leñosa y resistente, finalizando así el estado suculento de la plántula, alcanzando una mayor resistencia a plagas y enfermedades, desecación, fuego, ataque de insectos, pastoreo, etc. El fenómeno de la germinación descrito puede ser explicado y cuantificado desde diferentes puntos de vista, como pueden ser la capacidad germinativa, el coeficiente de nascencia, la energía de germinación, etc. La capacidad germinativa se refiere al porcentaje de semillas de un lote determinado que dan lugar a plántulas normales en condiciones de laboratorio. El coeficiente de nascencia, es una medida semejante a la capacidad germinativa pero las semillas no se desarrollan en condiciones controladas de laboratorio sino en las condiciones normales de campo. Un criterio especialmente interesante que nos permite caracterizar el proceso de germinación, es la energía germinativa que es una medida de la velocidad con la que las semillas germinan y puede ser expresada de varias maneras (Willan, 1991): - porcentaje de semillas que germinan dentro de un periodo determinado en óptimas o determinadas condiciones, por ejemplo 7 ó 14 días - el porcentaje de semillas germinadas hasta llegar al momento de germinación máxima, que normalmente viene dado como el número máximo de germinaciones en 24 horas - el número de días preciso para que se alcance el 50 % de la capacidad de germinación (Allen, 1958) Antecedentes. Pinus pinaster Ait.. . 19 La energía germinativa es un índice del vigor de las semillas y, desde un punto de vista práctico, tiene una importancia tan grande como la capacidad germinativa. Una semilla con una rápida germinación tendrá más oportunidades de eludir las adversidades ambientales que una semilla con una germinación más lenta o irregular, que podría tener consecuencias fatales (Aldhous, 1972). 2.1.7. Producción de plantas de Pinus pinaster en vivero Hasta finales del siglo XIX o principios del XX, en el que comienzan a usarse envases prismáticos fabricados en barro o con lámina de corteza de chopo, la tipología de planta forestal utilizada en reforestación era a raíz desnuda. En la actualidad la práctica de esta modalidad de cultivo es muy escasa. Esta evolución, de la producción de planta a raíz desnuda a la producción de planta en contenedor, es lógica si pensamos en las condiciones climáticas y edafológicas normales del territorio español, como la escasa y/o gran variabilidad de la pluviometría, las fuertes evapotranspiraciones potenciales, la alta insolación, los suelos pocos profundos o la presencia de matorral heliófilo invasor que provoca fuertes competencias. Estas características del entorno, unidas a la utilización de una planta con su sistema radicular amputado que provocaba una sequía fisiológica temporal hasta que el sistema radical conseguía regenerarse, pone en evidencia la necesidad de la transformación sufrida en los métodos de producción de planta forestal hacia sistemas que produjesen un mínimo daño al sistema radical y que permitieran mantener una humedad localizada en el entorno de la planta. 2.1.7.1. Producción comercial de Pinus pinaster a raíz desnuda Un aspecto importante en la producción de planta forestal de P. pinaster a raíz desnuda es la elección del emplazamiento del vivero (Morby, 1984) atendiendo a sus características climáticas, tipo de suelo, preferentemente ligero y bien drenado (Eavis, 1972; Davey, 1984; Warkentin, 1984), la topografía y la calidad del agua (ligeramente ácida) (Landis, 1982; Day, 1984). Antes de la siembra se procede a la preparación del terreno, la eliminación de la vegetación existente, la fertilización de fondo según las necesidades del suelo y la preparación y desinfección de los bancales de siembra. La siembra suele realizarse a principios de primavera, a una densidad de 80-100 plantas/m2. El control de malas hierbas puede realizarse mediante escarda química cuando las plantas están suficientemente desarrolladas (6-8 cm) utilizando herbicidas selectivos. Antecedentes Pinus pinaster Ait. . . 26 - Lactarius subdulcis* - Russula cyanoxantha - Tricholoma ustale* - Xerocomus subtomentosus Hongos micorrícicos indiferentes al tipo de bosque: - Amanita aspera - Amanita boudieri* - Amanita citrina - Amanita gemmata - Amanita muscaria - Amanita ovoidea* - Amanita pantherina - Amanita phalloides - Amanita porphyria** - Amanita rubescens - Amanita vaginata** - Amanita valens - Boletopsis leucomelaena** - Boletus calopus** - Boletus edulis - Boletus luridus** - Boletus pulverulentus* - Camarophyllus niveus* - Cantharellus cibarius - Cantharellus cinereus* - Chalciporus piperatus** - Clitopilus prunulus - Cortinarius alboviolaceus* - Cortinarius cinnamomeoluteus** - Cortinarius elatior - Cortinarius obtusus** - Cortinarius purpurascens** - Cortinarius subvalidus** - Cystoderma granulosum* - Geastrum vulgatum** - Gyroporus castaneus* - Hebeloma cistophyllum* - Hebeloma crustuliniforme** - Hebeloma edurum* - Hebeloma hiemale* - Hebeloma sinapizans** - Hydnum rufescens** - Hygrocybe coccinea* - Hygrocybe conica* - Hygrocybe insipida* - Hygrophorus chrysodon** - Hygrophorus gliocyclus** - Hygrotrama schulzeri* - Laccaria amethystina** - Laccaria laccata** - Lactarius aurantiacus* - Lactarius camphoratus** - Lactarius fuliginosus** - Lactarius quietus* - Lactarius theiogalus* - Lactarius vellereus** - Lactarius violascens* - Lactarius volemus** - Lycoperdon molle - Lycoperdon perlatum - Lycoperdon umbrinum - Paxillus involutus ** - Rozites caperata** - Russula aeruginea** - Russula albonigra - Russula amoena* - Russula atropurpurea** Antecedentes. Pinus pinaster Ait.. . 27 - Russula aurata** - Russula azurea** - Russula chloroides** - Russula cicatricata* - Russula delica** - Russula densifolia - Russula fragilis** - Russula luteotacta* - Russula nigricans - Russula ochroleuca** - Russula pumila* - Sarcodon scabrosus** - Scleroderma areolatum* - Scleroderma cepa** - Scleroderma citrinum* - Scleroderma meridionale* - Tricholoma columbeta** - Tricholoma flavobruneum** - Tricholoma imbricatum** - Tricholoma pardinum** - Tricholoma pseudonictitans** - Tricholoma sejunctum** - Tricholoma sulphureum** - Tricholoma terreum** - Tricholoma virgatum** - Tylopilus felleus** - Xerocomus chrysenteron La productividad de este micotopo a menudo se ve limitada por las condiciones de altitud y por la sequía, que reducen tanto la cantidad como la diversidad de las especies fúngicas presentes. A pesar de ello, la gran extensión de los pinares existentes en España hace de éstos unas de las áreas más importantes para la recogida de hongos comestibles (Fernández de Ana-Magán y Rodríguez, 2000). 2.1.10. Regiones de procedencia de Pinus pinaster Ait. en España La elevada variabilidad genética, la gran diversidad ecológica y el aislamiento entre masas de P. pinaster, ha desembocado en la existencia de razas geográficas con morfologías, comportamientos (Sweet y Thulin, 1962; Molina, 1965; Alía et al., 1995, 1996) y características genéticas diferentes. A partir de los resultados obtenidos por Alía et al. (1991), se ha comprobado que existe una interacción genotipo-ambiente para caracteres como la supervivencia o el crecimiento en altura. Estas características, unidas a las características geográficas, climáticas y edáficas de los pinares, han conducido a la delimitación de 20 regiones de procedencia (Fig. 3), definidas como un territorio o un conjunto de territorios sometidos a condiciones ecológicas prácticamente uniformes y en los que hay poblaciones de una determinada especie que presentan características fenotípicas o genéticas análogas (OM 21-1-89, BOE nº 33 del 8-2-1989), y 7 procedencias de área restringida, definidas por Díaz Fernández et al. (1995) como las manifestaciones de la especie en el interior de la Península, Antecedentes Pinus pinaster Ait. . 28 acantonadas en pequeños enclaves ambientalmente favorables y alejadas del área principal de la especie. La creación de regiones de procedencia ha sido fundamental para caracterizar comportamientos diferenciales de P. pinaster, como base para programas de mejora o de producción de semilla, para el mantenimiento de los recursos genéticos de la especie y para delimitar las zonas de utilización de semilla y evitar, así, resultados peores de los esperados. REGIONES DE PROCEDENCIA PROCEDENCIAS DE ÁREA RESTRINGIDA 1. Noroeste: A. Litoral 11. Páramos de Molina B. Interior 12. Serranía de Cuenca A. Benicas im 2. Sª del Teleno 13. Albarracín B. Sierra de Pradell 3. Sª de Oña 14. Maestrazgo C. Litoral catalán 4. Sª de Gata – Las Hurdes 15. Sª de Espadán D. La Safor 5. Bajo Tietar 16. Levante E. Fuencaliente 6. Sª de Gredos 17. Sªs de Segura-Alcaraz F. Sierra de Oria 7. Sª de Guadarrama 18. Moratalla G. Serranía de Ronda 8. Meseta Castellana 19. Sª de Almijara-Nevada 9. Montaña Soria-Burgos 20. Sª Bermeja 10. Ibérico Central Fig. 3.- Regiones de procedencia de Pinus pinaster Ait. (Alía et al., 1996). En rojo las regiones de procedencia origen del material vegetal utilizado en el trabajo. Antecedentes. Pinus pinaster Ait.. . 29 2.1.10.1. Región de procedencia Noroeste (1) Esta región de procedencia se subdivide en dos regiones en función, fundamentalmente, de la altitud: la región costera (1a-Noroeste Litoral) que discurre desde el litoral hasta los 600 m de altitud (Toval, 1987) y la región interior (1b-Noroeste Interior) que se sitúa por encima de dicha cota. Posee unas 620.000 ha de masas puras y mezcladas en Galicia y 50.000 ha en Asturias (Xunta de Galicia, 2001). La subregión Noroeste Costera incluye todo el litoral desde el río Miño, al sur, hasta la ribera occidental del río Aboño, próximo a Gijón, al norte, recorriendo las provincias de Pontevedra, A Coruña, Lugo y Asturias. El límite inferior se fija en la isohipsa de 600 metros que coincide con el piedemonte noroccidental de las Sierras del Macizo Galaico-Duriense y la Cordillera Cantábrica. Se extiende entre 5º35’ y 9º15’ longitud W, y 41º53’ y 43º46’ latitud N. 2 El clima en esta subregión es muy favorable para el crecimiento del P. pinaster debido a las abundantes precipitaciones y a las temperaturas suaves, y corresponde a fitoclimas nemorales genuinos frescos y nemoromediterráneo subnemoral. La geología esta conformada por rocas graníticas y sedimentos del Paleozoico Inferior muy consolidados, con litofacies de areniscas, cuarcitas y pizarras. En general son suelos de media a elevada evolución (cambisoles y luvisoles respectivamente), fuertemente ácidos, con texturas de francas a francoarenosas. Las mejores calidades se corresponden a las texturas más arenosas (Nicolás y Gandullo, 1967; Bara y Toval, 1983). Clave del climodiagrama de Gaussen-Walter Tma.- temperatura media anual Pa.- precipitación anual TMa.- temperatura máxima absoluta del periodo TmM.- temperatura media de las máximas del mes de media más alta Osc.- media anual de la oscilación térmica diaria Tmm.- temperatura media de las mínimas del mes de media más baja Tma.- temperatura mínima absoluta del periodo Ti.- temperatura media de cada mes Pi.- precipitación en cada mes Hs.- meses de helada segura (Tmm ≤ 0ºC) Hp.- meses de helada probable (Tmm > 0ºC y Tma ≤ ºC) Figura 2. Climograma de Carballiño-Ourense. Región de procedencia Noroeste. (Allue Andrade, 1990) Antecedentes Pinus pinaster Ait. . 30 Esta subregión es la más importante debido tanto a su productividad como a la mejora de la especie, dado que se ha instalado un huerto semillero a partir de 128 árboles de esta zona y se han realizado ensayos de progenies. Este pino destaca por su rápido crecimiento, con un turno de aprovechamiento de 30- 40 años, con una productividad mayor que las obtenidas en Las Landas o Leiría. Desde el punto de vista morfológico es muy parecido al de Las Landas (Guinadeau, 1956) aunque con fustes más rectos en conjunto y con un crecimiento más rápido. Suele presentar copas pequeñas con ramas finas y ángulos muy agudos, lo que propicia la existencia de abundante vegetación de sotobosque, y se caracteriza por una fructificación menos abundante que otras poblaciones. La subregión Noroeste Interior se sitúa en las sierras interiores gallegas y los piedemontes más occidentales de la Cordillera Cantábrica, distribuyéndose a través de las provincias de Pontevedra, A Coruña, Lugo, Ourense, Asturias, Zamora y León. En cuanto a la climatología corresponde al subtipo fitoclimático nemoromediterráneo genuino VI(IV)2 y a nemoral genuino fresco tibio VI(V) con tendencia a subtipos más fríos y áridos, como nemoromediterráneo subnemoral VI(IV)3 y mediterráneo genuino IV4. Las condiciones geológicas y edáficas son básicamente las mismas que las de la subregión litoral. Respecto a la foraneidad del Pinus pinaster en Galicia ya, Laguna, en 1883 (cit. Alía et al., 1996), apoyaba el origen antrópico de las masas existentes escribiendo que “es común en gran parte de Galicia, donde, sin embargo, no es, probablemente, espontáneo, sino procedente de siembras y plantaciones”. Esta idea fue corroborada por Bellot y Viéitez (1945), quienes Foto 2.- Ejemplar de pino femia en el Parque Natural del Monte Aloia en Tui ( Pontevedra ) Antecedentes. Pinus pinaster Ait.. . 31 concluyeron que Pinus pinaster no era espontáneo en esta región, al no haberse encontrado polen de pino a profundidades inferiores a 20 cm en turberas más o menos localizadas hacia el interior. En cuanto a su introducción en Galicia, Valdés y Gil (2002) aceptan el carácter autóctono del Pinus pinaster, y consideran que debió perdurar a lo largo de los siglos en forma de grupos o rodales más o menos aislados en suelos de baja calidad, sin que en ningún momento hubiese desaparecido por completo, y que en los últimos siglos se habrían extendido a partir de las pequeñas manchas que habrían sobrevivido. González Garcés (1987), en cambio, afirma que fue en la época medieval cuando “empezaron a poblarse de pinos grandes cantidades de terreno, pero solamente en las zonas costeras”. Ruiz Zorrilla (1980) considera que fue durante el siglo XVIII cuando se generaliza este árbol, aunque admite que debió introducirse a finales del siglo XVII por la zona del Miño. Esta tesis es apoyada en parte por Calderón (1993) quien apunta hacia las reforestaciones efectuadas desde finales del siglo XVII. También Fernández de Ana-Magán (2001) afirma que el Pinus pinaster fue introducido en Galicia a finales del siglo XVII desde Val do Miño y las zonas costeras más meridionales y aporta documentos del Catastro de Ensenada de 1753 que constatan la presencia de esta especie en dichas zonas. Esta área inicial con presencia de Pinus pinaster habría aumentado debido a plantaciones hechas por los propietarios de montes particulares (1850), a partir de los cuales se habría extendido de forma natural por los montes vecinales colindantes (Jenaro, 1887 cit. Fernández de Ana, 2001). Su avance continuaría fundamentalmente por la zona costera asociado a la industria de la salazón, actividad muy demandante de este tipo de madera en aquella época. En cuanto al origen del material vegetal empleado, tal como recoge el mismo autor, el avance del Pinus pinaster, parece ser hecho con “semente do país” por lo que se estaría empleando una raza con buena adaptación al medio. Posteriormente, a partir de 1950, las repoblaciones hechas por el Patrimonio Forestal del Estado introducirían en Galicia nuevas razas de Pinus pinaster procedentes del interior de la península, que crearían problemas de adaptación al medio y producciones de menor calidad (Fernández de Ana-Magán, 2001). El denominado “pino femia”, es un calificativo propio utilizado en Galicia y que hace referencia a árboles sobresalientes, de excelente crecimiento y forma, con fustes rectos y corteza muy fina y lisa, que aparecen aislados o en bosquetes (Rodríguez Soalleiro et al., 1997) (Fotos 2 y 4). Los pinos de esta región se recomiendan para su uso en Galicia y zonas costeras con clima VI(V). Antecedentes Pinus pinaster Ait. . 32 Baradat y Marpeau (1988) incluyen esta población dentro del grupo Atlántico, junto con las poblaciones de Portugal, Noroeste de España, Tabuyo, Oña y Castilla la Vieja, basándose en el estudio de terpenos. 2.1.10.2. Región de procedencia Sierra de Oña (3) Esta región se sitúa hacia el norte de la provincia de Burgos, concretamente en la Depresión de La Bureba, con algunos rodales de pequeña extensión, inferiores a 5 hectáreas, en Álava y con ejemplares dispersos en la vertiente cantábrica hasta una altitud de 230 m en el Valle de Ayala, siendo el intervalo altitudinal entre 500 y 1.000 m. Es una procedencia aislada y de extensión reducida, unas 15.000 ha. Fitoclimáticamente es una zona heterogénea, alternando el nemoromediterráneo genuino VI(IV)1 y el VI(IV)2. Desde el punto de vista geológico, se encuentran diversas rocas madre que proporcionan suelos de características variadas (Nicolás y Gandullo, 1967), aunque la mayor parte de los pinares viven en suelos formados a partir de calizas y margas del Mesozoico, que poseen una textura arenosa y pH moderado o fuertemente básico. Los suelos son de evolución media con un horizonte cámbico que en función de la acumulación de carbonato cálcico forman calcisoles o cambisoles calcáreos. Estos árboles son poco rectos, de forma rechoncha, con acículas más rígidas que los procedentes de la región del Teleno (2) (Fig. 4), con un ángulo de inserción de las ramas de aproximadamente 90º y con un crecimiento lento (Guinadeau, 1956). En ensayos realizados en el centro de España (Baradat y Marpeau, 1988), esta procedencia destaca por su escaso crecimiento en altura, crecimiento medio en diámetro, copa amplia, fustes de muy baja calidad, con un gran porcentaje de pies demasiado torcidos, con una gran tendencia al policiclismo y con gran cantidad de piñas y de gran espesor. Baradat y Marpeau (1988) incluyen esta población dentro del grupo Atlántico. Es una procedencia de uso local únicamente. Fig. 4.- Climograma de Oña (Allué Andrade, 1990) Antecedentes. Pinus pinaster Ait.. . 33 2.1.10.3. Región de procedencia Sierra de Gredos (6) Esta zona ocupa las laderas meridionales de la Sierra de Gredos, colonizando las laderas septentrionales en su extremo meridional (Sierra del Valle) y llegando hasta la Meseta Norte. Tiene una superficie aproximada de 39.000 ha distribuyéndose por el sureste de la provincia de Ávila, oeste de Madrid y norte de Toledo, desde los 400 m de altitud hasta los 1.800 m. Las zonas ocupadas por P. pinaster corresponden a un fitoclima nemoromediterráneo genuino VI(IV)2, aunque debido a la diferente altitud y longitud coexisten otros climas de transición como son el mediterráneo genuino IV4 en las partes bajas y el oroborealoide subnemoral VIII(VI) en las altas. Los suelos de esta zona son muy homogéneos, desarrollados sobre litologías graníticas, síliceos, con granulometría arenosa, horizonte de alteración cámbico y acidez moderada. Destaca por una copa pequeña y un espesor de corteza medio. Tienen tendencia al policiclismo, buena calidad de fuste y crecimiento (Sierra de Grado, 1993) y tienen cierta similitud con las procedencias atlánticas (Nicolás y Gandullo, 1967), aunque en situaciones nemoromediterráneas su crecimiento es ampliamente superado por las procedencias gallegas y portuguesas. El interés de esta población fue demostrado por Alía (1989) quien, analizando 52 poblaciones de toda el área de distribución de la especie, en 5 parcelas de ensayo situadas en distintos puntos de la región central de España, atendiendo al crecimiento, supervivencia, rectitud de fustes y conformación de copa, observó que esta procedencia se encontraba entre las mejores en el conjunto de las 5 parcelas. Debido a su buen comportamiento en cuanto a crecimiento, forma y supervivencia es muy importante desde el punto de vista de la mejora genética. Es la procedencia de más amplia utilización en la España mediterránea. Actualmente se está desarrollando un plan de mejora con esta población. Se piensa que la población de Pinus pinaster de Gredos es espontánea, si por ello se entiende que llegó allí en algún momento lejano de la historia, sin que el hombre conscientemente la introdujera. Parece probable que el Pinus pinaster tuviera una extensión Fig. 5.- Climograma de Arenas de San Pedro. Región de procedencia Sierra de Gredos (Allué Andrade, 1990) Antecedentes Pinus pinaster Ait. . 34 más reducida que fue ampliada de manera artificial en los últimos tiempos a expensas de quercíneas en las cotas bajas y de P. sylvestris y P. nigra en las altas. En todo caso, los rasgos distintivos citados que caracterizan esta población sugieren que estos pinares han permanecido en la Sierra de Gredos al menos el tiempo suficiente como para evolucionar de forma distinta que el resto de las poblaciones españolas (Sierra de Grado, 1996). Baradat y Marpeau (1988) incluyen esta población dentro del grupo Atlántico, junto con las poblaciones de Portugal, Noroeste de España, Tabuyo, Oña y Castilla la Vieja, basándose en el estudio de terpenos. Dentro de esta raza hay ciertas diferencias que la distinguen del resto de las poblaciones, como las proteínas de reserva de la semilla (Allona et al., 1987 cit. Sierra de Grado, 1996) y su comportamiento en los ensayos de procedencia citados anteriormente (Alía, 1989), observando, este último, un comportamiento general diferente que lo separa de una manera clara del resto de las poblaciones de la Meseta Castellana. 2.1.10.4. Región de procedencia Meseta Castellana (8) Es una de las regiones de procedencia de P. pinaster más extensas, 120.000 ha. Se extiende por los arenales a ambas orillas del río Duero, dando lugar a tres subunidades: Almazán-Bayubas, Tierra de Aranda y Meseta sur del Duero. Ocupa parte de las provincias de Zamora, Salamanca, Valladolid, Ávila, Segovia, Burgos y Soria. Desde una altitud de 700 m hasta 1.300 m aproximadamente. El clima es nemoromediterráneo genuino, VI(IV)1, que pasa a mediterráneo nemoral, IV(VI), en zonas de mayor aridez como en los pinares de la provincia de Ávila y en pequeñas zonas de las de Salamanca y Zamora. Mayoritariamente los pinares se sitúan sobre depósitos diluviales del Cuaternario formados, principalmente, por arenas silíceas de espesor muy variable. Los suelos son muy característicos, de textura arenosa y de gran permeabilidad. Son suelos de poca o media evolución, del grupo de los arenosoles, dando suelos más evolucionados, luvisoles, en zonas con mayores precipitaciones. Fig. 6.- Climograma de Aranda de Duero. Región de procedencia Meseta Castellana. (Allué Andrade, 1990) Antecedentes. Pinus pinaster Ait.. . 35 En conjunto, presentan fustes muy curvos y retorcidos y son de porte achaparrado y muy resistentes a la sequía (Goor y Barney, 1968), aunque presentan una cierta heterogeneidad, principalmente en la rectitud del fuste (Alía et al., 2001). Las ramas son gruesas, horizontales, de conos sésiles, de follaje tupido y acículas rígidas y casi punzantes. Las copas son medianamente grandes y la corteza relativamente gruesa. La gran importancia del aprovechamiento resinero en esta zona, condicionó decisivamente las características de los pinos de esta región, al realizarse una selección negativa motivada por la extracción de los pies rectos de mayor utilidad y manteniendo árboles con más tendencia a la pérdida de la guía o de la dominancia apical en las primeras edades. Este hecho se muestra más importante debido a que la rectitud del fuste es una característica altamente heredable, dependiendo en gran medida de la procedencia y no presentando interacción procedencia-sitio (Alía et al., 1995). Su uso debe ser restringido localmente debido a la baja calidad de los fustes, aunque debe ser considerada la más adecuada para la producción de resina. Al igual que las regiones de procedencia Noroeste, Sierra de Oña y Sierra de Gredos, pertenece al grupo Atlántico (Baradat y Marpeau, 1988). Foto 4.- Corteza de un ejemplar de “pino femia” (izq.) y de otro de la Meseta Castellana (dcha.) Foto 3.- Pinar en Arévalo, Región de procedencia Meseta Castellana Antecedentes Las micorrizas . 42 - La red de Hartig, estructura formada por la penetración de las hifas en los espacios intercelulares del córtex de la raíz pero sin penetración celular. - El micelio extraradical, formado por las hifas que se desarrollan de forma más o menos densa en la zona periradicular. En algunas ocasiones pueden llegar a formarse cordones miceliares y rizomorfos con función de transporte. 2.2.2.3. Ectendomicorrizas Es un tipo intermedio de asociación micorrícica caracterizada por un manto reducido o ausente, una red de Hartig bien desarrollada y penetración de hifas en el interior de las células de la raíz (Harley y Smith, 1983). Se ha descrito en viveros de coníferas. 2.2.2.4. Ericoides Las características fundamentales son la formación de un manto rudimentario y la existencia de hifas inter e intracelulares. Los hongos responsables suelen ser un Basidiomiceto y, a veces, un Ascomiceto, encontrándose en Ericaceae, Epacridaceae y Empetraceae. Este tipo de simbiosis tiene un especial interés debido a su adaptación a determinados tipos de suelos ácidos y a su incidencia en la absorción y acumulación de nutrientes, especialmente el nitrógeno (Read, 1978 cit. Harley y Smith, 1983). 2.2.2.5. Arbutoides Están constituídas por un manto perfectamente definido, micelio externo, normalmente posee red de Hartig, y existe penetración de hifas en el interior de las células radiculares. Es de difícil catalogación debido a este carácter mixto y a su localización tan restringida, ya que las plantas huésped pertenecen a los géneros Arbutus y Arctostaphylos, y a que el componente fúngico es único: un Basidiomiceto. Molina y Trappe (1982) las consideran un tipo especial de ectomicorriza. 2.2.2.6. Monotropoides Este tipo de simbiosis aparece en plantas parásitas carentes de clorofila, pertenecientes a la familia Monotropaceae (Orden Ericales). Las raíces están rodeadas de un manto fúngico de varias capas de hifas que están conectadas a la red de Hartig. Presenta pequeños haustorios que penetran en el interior de las células. En este caso, debido al parasitismo de la planta, el carbono necesario para la nutrición del hongo procede de otra planta (Harley y Smith, 1983). Antecedentes. Las micorrizas. . 43 2.2.3. Las ectomicorrizas 2.2.3.1. Funciones de las ectomicorrizas 2.2.3.1.1. Absorción de agua y nutrientes Muchas de las funciones de las ectomicorrizas derivan de su propia estructura. En este sentido el amplio terreno explorado por el micelio extraradicular, tanto por las hifas como por cordones miceliares o rizomorfos, proporciona a la planta una mayor facilidad para la absorción de agua y nutrientes, tanto por facilitar el transporte como por explorar zonas de suelo a la que las raíces no llegarían por si mismas. Harley y Smith (1983) demostraron que las raíces nutridoras de las plantas micorrizadas tienen una mayor longevidad, con lo que la función de absorción se ve potenciada. En árboles no micorrizados estas raíces se renuevan de 2 a 3 veces al año (Marshall, 1986) o incluso más, sin embargo, en árboles micorrizados las ectomicorrizas persisten aparentemente en estado funcional desde varios meses hasta 8 años (Hermann, 1977; Trappe y Fogel, 1977). En cuanto a la gran superficie de absorción adicional que el hongo confiere a la planta, se han llegado a encontrar hifas a 5 metros de la raíz (Schramm, 1966 cit. Alvarez, 1993). De esta forma se puede comprender el papel fundamental que el micelio extraradicular desempeña en las relaciones hídricas con la planta, aumentando el transporte de agua (Duddridge et al., 1980; Finlay y Read, 1986 a, 1986 b) y la resistencia en condiciones hídricas limitantes (Sands y Theodorou, 1978; Dixon et al., 1980). La absorción de nutrientes también se ve incrementada por la presencia de micorrizas, destacando el aumento en la captación de nitrógeno (Waring y Schlesinger, 1985), debido, entre otras causas, a que son capaces de absorber fuentes de nitrógeno que la planta no puede como nitrógeno amoniacal o en forma de nitrato e incluso nitrógeno orgánico en forma de aminoácidos y otros compuestos (Bowen, 1973; Cooke y Whipps, 1993). Otro elemento del que se ven beneficiadas las plantas micorrizadas es el fósforo debido a un incremento de su absorción por la acción de hongos micorrícicos, capaces de asimilar fuentes de fosfatos que no serían asimilables por las raíces de las plantas en otras circunstancias. El fósforo se almacena en el manto en forma de gránulos y se moviliza cuando es requerido por la planta (Strullu et al., 1983). Otros elementos como el potasio (Harley y Smith, 1983), sodio (Bowen, 1973) y zinc (Skinner et al., 1972 cit. Bowen, 1973) también se incrementan en plantas micorrizadas. Además, las micorrizas incluso son capaces de ejercer una acción limitante en la absorción de Antecedentes Las micorrizas . 44 ciertos elementos que se encuentran en concentraciones excesivas en algunos suelos permitiendo la supervivencia y el desarrollo de las plantas, como ocurre con el calcio en suelos calcáreos (Clement et al., 1977). 2.2.3.1.2. Producción de sustancias reguladoras de crecimiento Los hongos micorrícicos producen sustancias reguladoras de crecimiento (auxinas) (Slankis, 1973), principalmente ácido indolacético (Ulrich, 1960), citoquininas y giberelinas (Miller, 1971) y vitaminas como biotina, tiamina y ácido pantoténico (Shemakhanova, 1962). Esto tiene una gran importancia ya que estas sustancias influyen decisivamente en muchos procesos relacionados con el desarrollo de las plantas como la translocación de nutrientes, el desarrollo de cloroplastos, la inducción en la iniciación del crecimiento y la dicotomía de las raíces o la inhibición de la suberización de las raíces nutridoras. 2.2.3.1.3. Protección contra ataques de hongos patógenos del suelo Es una faceta de estudio muy importante en los últimos años debido al interés que presenta la acción protectora de las micorrizas sobre la infección de hongos patógenos del suelo, sobre todo por sus implicaciones económicas y ecológicas. La resistencia de las micorrizas a las infecciones de agentes patógenos se ha atribuído a las siguientes causas: - la barrera física constituída por el manto fúngico (Marx, 1972). - la producción de sustancias antibióticas por la micorriza (Marx, 1973). - la producción de compuestos fungiestáticos, como fenoles, terpenos, ácido isobutírico y etileno, entre otros (Marx, 1973; Krupa y Fries, 1971; Graham y Linderman, 1980). - modificaciones en los exudados de las raíces micorrizadas que dificultan el establecimiento de los agentes patógenos en la rizosfera (Malajzuk y McComb, 1977; Linderman, 1988). - la presencia de poblaciones microbianas en la rizosfera de la planta, antagonistas a los agentes patógenos (Marx, 1973). 2.2.3.2. Aplicaciones prácticas de las ectomicorrizas En dos aspectos podemos dividir las aplicaciones prácticas e inmediatas de las micorrizas: todas aquellas aplicaciones que van destinadas a la mejora directa de la planta y Antecedentes. Las micorrizas. . 45 sus condiciones de cultivo (supervivencia al trasplante, velocidad de crecimiento, ahorro de fertilizantes, defensa frente a agentes patógenos...) y las encaminadas a la producción de carpóforos de hongos comestibles. Respecto al primer punto, está ya generalizado que las micorrizas deberían constituír un elemento de vital importancia en las operaciones de un vivero forestal, sobre todo teniendo en cuenta que su efecto sobre la planta puede ser variable, debido a que depende del hongo, de la planta y de las manipulaciones concretas del vivero (Castellano y Molina, 1989). Habría que hacer también hincapié en todas aquellas labores que inciden negativamente en la micorrización como el uso de herbicidas, el uso de sustratos artificiales carentes de inóculo, uso excesivo de fertilizantes, etc. En general las especies forestales a las que va dirigido este tipo de micorrización son coníferas (Pinus, Picea, Abies, Pseudotsuga...) y los hongos con los que se suelen inocular son fundamentalmente Pisolithus tinctorius, Laccaria laccata, L. bicolor, Cenoccocum geophilum y Hebeloma crustuliniforme, todas ellas sin valor comercial desde el punto de vista gastronómico. Respecto a la importancia de las ectomicorrizas por la producción de carpóforos comestibles, actualmente no es muy importante en relación con el conjunto de trabajos realizados con micorrizas, aunque históricamente la primera aplicación de las micorrizas fuera de cara al desarrollo del cultivo de la trufa. En la actualidad dada la importancia económica que tienen estos hongos en algunos países como Francia, Italia, España y, en menor medida, Portugal, los trabajos sobre hongos ectomicorrícicos comestibles van dirigidos, fundamentalmente, al aumento de la producción de trufa. Con relación a otras especies, la mayor parte de los trabajos versan sobre especies muy apreciadas en los mercados, pertenecientes al género Boletus (B. edulis (Tozzi et al., 1980; Zuccherelli, 1988), B. aereus (Cerruti et al., 1985), B. fragrans (Fernández de Ana-Magán et al., 1989; Rodríguez, 1995) y Lactarius (L. deliciosus (Poitou et al., 1984; Gracia cit. Gracia et al., 1993)). Con todo, el principal problema viene a la hora de mantener los hongos inoculados en el sistema radicular de la planta micorrizada, una vez que ésta ha sido trasplantada al campo, ya que a menudo son desplazados por los hongos nativos. Antecedentes Las micorrizas . 46 2.2.3.3. Manejo de las ectomicorrizas La selección, aislamiento, cultivo e inoculación de los hongos ectomicorrícicos son fases indispensables para la micorrización, y exigen la puesta a punto de una serie de técnicas que permitan la producción de planta micorrizada adecuada y con garantías. 2.2.3.3.1. Selección de hongos ectomicorrícicos En general, la mayoría de las especies vegetales susceptibles de formar ectomicorrizas pueden asociarse con un amplio espectro de hongos ectomicorrícicos. Sin embargo cada especie fúngica e incluso las diferentes cepas de una misma especie originan respuestas diferentes en la planta. De ahí que uno de los pasos más importantes en los programas de inoculación sea la fase de selección (Trappe, 1977). Molina y Trappe (1982), clasifican los hongos en tres grupos según su capacidad de formar ectomicorrizas con diferentes huéspedes: - hongos con un amplio potencial de huéspedes, de baja especificidad, en el que los esporocarpos se encuentran asociados a diferentes huéspedes en el campo - hongos con un potencial de huéspedes intermedio o con limitaciones en las asociaciones esporocarpo-huésped - hongos con un estrecho abanico de huéspedes que sólo son capaces de formar ectomicorrizas con una especie de huésped específica o con especies de un género determinado Según esta clasificación, Molina y Trappe (1982), clasifica a Laccaria laccata, Paxillus involutus y Pisolithus tinctorius dentro del primer grupo (hongos con un amplio potencial de huéspedes o de baja especificidad). Estas especies resultan especialmente interesantes debido a su gran capacidad de infección independientemente de donde se hayan recogido. Las características más importantes que debería reunir un buen hongo micorrícico (Trappe, 1977; Kropp y Langlois, 1990; Marx y Kenney, 1982) son: - la capacidad fisiológica para la producción de ectomicorrizas con la especie vegetal en cuestión - la adaptación del hongo al lugar donde la planta va a ser implantada Antecedentes. Las micorrizas. . 47 - la capacidad colonizadora y competitiva de la cepa introducida - su grado de adaptación a las condiciones ambientales, tanto en vivero como en plantación - su efecto sobre la supervivencia y el crecimiento de los árboles - en cuanto al aspecto operativo, la capacidad de obtener o producir cantidades suficientes de inóculo viable y efectivo En este sentido, diversos autores (Thivolle-Cazat, 1987; Kropp y Langlois, 1990) señalan la importancia de seleccionar cepas de hongos que presenten un amplio espectro de hospedantes y una gran adaptabilidad a los lugares donde van a ser implantados. A continuación se describen con detalle las características de los hongos ectomicorrícicos seleccionados. 2.2.3.3.1.1. Pisolithus tinctorius Pisolithus tinctorius (Pers.) Cok. y Couch. (= P. arhizus (Scop.: Pers) Rausch.) Pisolithus tinctorius es uno de los hongos ectomicorrícicos más estudiados y mejor conocidos. Ha sido ampliamente utilizado en la inoculación de plantas en viveros forestales (Marx et al., 1982, 1984). De los trabajos de investigación destinados a determinar el efecto de la micorrización controlada en el establecimiento de masas forestales, más de la mitad se han realizado con esta especie fúngica (Castellano, 1990; Trotimov, 1990, Pera et al., 1994). La reforestación con plantas micorrizadas con P. tinctorius ha dado buenos resultados en la introducción de especies exóticas y en la recuperación de zonas degradadas de diverso origen (Marx, 1980; Ruehle, 1989; Marx et al., 1991). La compatibilidad e infectividad entre hongo y planta varían con el origen geográfico y genético de los simbiontes (Marx, 1981; Malajezuk et al., 1990) y distintas cepas de una misma especie fúngica producen diversos efectos sobre el crecimiento del árbol (Laiho, 1970; Molina, 1979; Le Tacon, Bouchard, 1986; Perry et al., 1987). Este hongo posee un amplio espectro de huéspedes (Molina y Trappe, 1982). Se han descrito las siguientes especies vegetales asociadas: Abies procera (Molina y Trappe, 1982) Arbutus menziesii (Molina, 1979) Betula lenta (Meyer, 1968) Betula nigra (Molina y Trappe, 1982) Antecedentes Las micorrizas . 48 Betula pendula (Nicholas, 1971) Betula populifolia (Meyer, 1968) Carya illionoensis (Molina y Trappe, 1982) Eucalyptus bidgesiana (Chilvers, 1973) Eucalyptus camaldulensis (Neumann, 1959) Eucalyptus dalrympleana (Chilvers, 1973) Eucalyptus fastigiata (Chilvers, 1973) Eucalyptus gummifera (Mullette, 1976) Eucalyptus leucoxylon (Chilvers, 1973) Eucalyptus masculata (Chilvers, 1973) Eucalyptus microcorys (Molina y Trappe, 1982) Eucalyptus polyanthemos (Chilvers, 1973) Eucalyptus radiata (Chilvers, 1973) Eucalyptus robusta (Molina y Trappe, 1982) Eucalyptus sieberi (Chilvers, 1973) Lithocarpus densiflorus (Molina, 1979) Pinus ayacahuite (Marx, 1975) Pinus banksiana (Lampky y Peterson, 1963; Marx y Bryan, 1973) Pinus caribea (Mikola, 1969; Molina y Trappe, 1982) Pinus caribea var. bahamensis (Molina y Trappe, 1982) Pinus caribea var. caribea (Molina y Trappe, 1982) Pinus caribea var. hondurensis (Molina y Trappe, 1982) Pinus cembra (Molina y Trappe, 1982) Pinus clausa var. clausa (Ross y Marx, 1972) Pinus clausa var. immuginata (Ross y Marx, 1972) Pinus contoria (Molina y Trappe, 1982) Pinus densiflora (Marx y Bryan, 1973) Pinus echinata (Bryan y Zak, 1961; Molina y Trappe, 1982) Pinus elliottii (Lamb y Richards, 1974) Pinus ellitottii var. elliottii (Marx y Bryan, 1973) Pinus halepensis (Ruehle et. al., 1981) Pinus khasya (Molina y Trappe, 1982) Pinus lambertiana (Molina y Trappe, 1982) Pinus leiophylla (Marx, 1975) Pinus merkusii (Van Suchtelen, 1962) Antecedentes. Las micorrizas. . 49 Pinus michoacana (Marx, 1975) Pinus montana (Molina y Trappe, 1982) Pinus mugo (Molina y Trappe, 1982) Pinus nigra (Marx y Bryan, 1970) Pinus occidentalis (Molina y Trappe, 1982) Pinus oocarpa (Molina y Trappe, 1982) Pinus palustris (Marx y Bryan, 1970; Lampky y Lampky, 1973) Pinus patula (Van Suchtelen, 1962; Molina y Trappe, 1982) Pinus pinaster (Van Suchtelen, 1962; Pera, 1993) Pinus ponderosa (Molina, 1979; Molina y Trappe, 1982) Pinus pseudostrobus (Marx, 1975) Pinus radiata (Lamb y Richards, 1974) Pinus resinosa (Marx y Bryan, 1970; Molina y Trappe, 1982) Pinus rigida (Marx y Bryan, 1970) Pinus rudis (Marx, 1975) Pinus serotina (Suggs y Bryan, 1973) Pinus strobus (Marx y Bryan, 1970) Pinus sylvestris (Marx y Bryan, 1970) Pinus taeda (Lowry, 1964; Marx y Bryan, 1970; Molina, 1979; Molina y Trappe, 1982) Pinus teocote (Marx, 1975) Pinus tremuloides (Schramm, 1966) Pinus virginiana (Marx y Bryan, 1970) Populus tremuloides (Meyer, 1968) Pseudotsuga menziesii (Trappe, 1963; Molina, 1979) Quercus acutissima (Molina y Trappe, 1982) Quercus agrifolia (Molina y Trappe, 1982) Quercus alba (Molina y Trappe, 1982) Quercus gambelii (Molina y Trappe, 1982) Quercus garryana (Molina, 1979) Quercus lobata (Molina y Trappe, 1982) Quercus palustris (Molina y Trappe, 1982) Quercus rubra (Molina y Trappe, 1982) Quercus velutina (Schamm, 1966) Quercus virginiana (Lowy, 1964) Antecedentes Las micorrizas . 50 Salix humilis (Meyer, 1968) Tsuga heterophyla (Molina y Trappe, 1982) 2.2.3.3.1.2. Paxillus involutus Paxillus involutus (Batsch ex Fr.) Fr. P. involutus fue ampliamente estudiado por Laiho (1970) en Europa. Este autor describió la formación de micorrizas, tanto bajo condiciones asépticas como semiasépticas con numerosos géneros de especies vegetales. Lo observó prosperando, únicamente, sobre suelos ricos en nitrógeno asimilable. Malajczuk et al. (1982) la describió también con varias especies de Eucalyptus e incluso se ha descrito formando micorrizas arbutoides con Arbutus menziesii y Arctostaphylos uva-ursi (Molina y Trappe, 1982). Los estudios de Laiho (1970) y otros han demostrado la existencia de un amplio espectro de huéspedes de P. involutus, así como su gran efectividad en la colonización de raíces, llegando a superar el 75% de ápices radicales micorrizados en la totalidad de las especies ensayadas en algún caso (Molina y Trappe, 1982). Se ha descrito en los siguientes géneros y/o especies: Alnus (Laiho, 1970) Arbutus menziesii (Molina y Trappe, 1982) Arctostaphylos uva-ursi (Molina y Trappe, 1982) Betula (Laiho, 1970) Betula pendula (Molina y Trappe, 1982) Castanea sativa (Strullu et al., 1986) Castanea crenata x Castanea sativa (Chauvin, 1988) Eucalyptus (Malajczuk et al., 1982) Fagus (Laiho, 1970) Picea (Laiho, 1970) Pinus contorta (Molina y Trappe, 1982) Pinus pinaster (Branzanti y Zambonelli, 1987; Pera y Alvarez, 1995) Populus (Laiho, 1970) Populus trichocarpa (Molina y Trappe, 1982) Pseudotsuga (Laiho, 1970) Pyrus (Laiho, 1970) Quercus (Laiho, 1970) Antecedentes. Las micorrizas. . 51 Rhamnus (Laiho, 1970) Salix (Laiho, 1970) Tsuga (Laiho, 1970) Tsuga heterophylla (Molina y Trappe, 1982) 2.2.3.3.1.3. Laccaria laccata Laccaria laccata (Scop. ex Fr.) Bk. y Br Es un hongo ectomicorrícico bien conocido. Trappe (1962) lo cita en asociación con siete géneros distintos de huésped. Se ha descrito, al igual que Paxillus involutus, formando micorrizas arbutoides con Arbutus menziesii y Arctostaphylos uva-ursi (Molina y Trappe, 1982). En estudios realizados por Molina y Trappe, 1982, L. laccata formó ectomicorrizas bien desarrolladas con todos los huéspedes ensayados, colonizando a menudo el sistema radicular completo. Molina y Trappe, 1982, definen a L. laccata como hongo micorrícico poco específico, con amplio potencial de huéspedes. Se ha descrito en los siguientes géneros y/o especies: Abies spp. (Molina y Trappe, 1982) Arbutus menziesii (Molina y Trappe, 1982) Arctostaphylos uva-ursi (Molina y Trappe, 1982) Picea sitchensis (Molina y Trappe, 1982) Pinus contorta (Molina y Trappe, 1982) Pinus pinaster (Pera, 1993) Pinus ponderosa (Molina y Trappe, 1982) Pseudotsuga menziesii (Molina y Trappe, 1982) Tsuga mertensiana (Molina y Trappe, 1982) 2.2.3.3.1.4. Boletus badius Boletus badius Fries (=Xerocomus badius) Es un hongo escasamente estudiado. Se ha descrito en pocas especies de huésped, algunas de ellas son Castanea sativa y Pinus pinaster (Fernández de Ana Magán et al., 2000). La amplia difusión de esta especie en Galicia así como sus excepcionales propiedades organolépticas, la hace especialmente interesante en esta región donde sus especies arbóreas asociadas están ampliamente extendidas. Se ha descrito en las siguientes especies: 3. Material y métodos Material y métodos. Influencia del medio de cultivo y el pH sobre el desarrollo de cinco hongos ectomicorrícicos en cultivo in vitro. . 61 3. Material y métodos 3.1. Influencia del medio de cultivo y el pH sobre el desarrollo de cinco hongos ectomicorrícicos en cultivo in vitro 3.1.1. Especies y cepas seleccionadas Se han seleccionado 5 especies y/o cepas de hongos micorrícicos. Tres de ellos, Pisolithus tinctorius, Laccaria laccata y Paxillus involutus, son especialmente interesantes debido al amplio espectro de huéspedes y a la intensa investigación que sobre ellos se ha venido desarrollando en los últimos años, acreditando una influencia positiva sobre la mayor parte de las plantas huésped en las que se ha descrito. Las cepas de Pisolithus tinctorius y Laccaria laccata fueron cedidas por el Institut de Recerca i Tecnología Agroalimentaries de Cataluña (I.R.T.A.) y la de Paxillus involutus fue recogida por el Centro de Investigacions Forestais e Ambientais de Lourizán (C.I.F.A.L.) y se encuentra depositada en su cepario. La otra especie seleccionada, Boletus badius, resulta interesante por su asociación con Pinus pinaster en estado juvenil, por la alta frecuencia con la que se encuentra en los bosques gallegos y, sobre todo, por sus características gastronómicas, que la hacen una seta muy interesante desde el punto de vista comercial. Una de las cepas de Boletus badius seleccionadas había sido recogida por el C.I.F.A.L. en Sarria (Lugo) en 1999. Con el fin de obtener una mayor variedad de aislamientos de Boletus badius, particularmente de cepas provenientes de carpóforos recogidos en parcelas de Pinus pinaster , se realizaron muestreos de una forma sistemática y durante todas las épocas de los años 2002 y 2003, pero con mayor intensidad en los meses de Tabla 2. Características de las especies/cepas utilizadas especie / cepa: Boletus badius (Sarria) localidad: Sarria (Lugo) planta huésped: Quercus robur colección: CIFA Lourizán Nº aislamiento: 9699 Año: 1999 especie / cepa: Boletus badius (S. Vicente) localidad: S. Vicente do Mar (Pontevedra) planta huésped: Pinus pinaster colección: CIFA Lourizán Nº aislamiento: 9700 Año: 2002 especie / cepa: Paxillus involutus localidad: Lourizán (Pontevedra) planta huésped: Pinus pinaster, Eucalyptus spp. colección: CIFA Lourizán Nº aislamiento: 9993 Año: 1999 especie / cepa: Laccaria laccata localidad: Montseny (Barcelona) planta huésped: Quercus ilex colección: IRTA Nº aislamiento: 270 Año: 1989 especie / cepa: Pisolithus tinctorius localidad: Fitor (Girona) planta huésped: Quercus suber colección: IRTA Nº aislamiento: 435 Año: 1994 Material y métodos Influencia del medio de cultivo y el pH sobre el desarrollo de cinco hongos ectomicorrícicos en cultivo in vitro . 62 otoño de 2002, en plantaciones forestales de Pinus pinaster de diferentes localidades del interior y de la costa gallega. Se recogían ejemplares jóvenes de carpóforos, se guardaban en bolsas de papel y se anotaban los datos referentes a las características de la zona de recolección, así como las posibles especies vegetales hospedadoras. Una vez en el laboratorio se procedía a su identificación exacta. El aislamiento en cultivo puro se realizó a partir de los tejidos internos del esporocarpo, utilizando aquellas zonas que no evidenciaban ningún contacto con posibles fuentes de contaminación externa (Molina y Palmer, 1982). Asépticamente se transferían fragmentos de micelio de esporocarpo (2-5 mm3 de tamaño) a las placas Petri, con medio de cultivo Melin-Norkrans modificado (MMN) (Marx, 1969) autoclavado a 120 ºC durante 15 minutos. Los ejemplares, a partir de los que se habían realizado aislamientos, se secaban a una temperatura de 40-50 ºC durante 3-4 días en una estufa de desecación por aire forzado, y se conservaban en la micoteca del C.I.F.A.L. como especímenes de herbario para posteriores comprobaciones y confirmaciones taxonómicas. Los cultivos se mantenían en cámara de cultivo a 25 ºC de temperatura. Los aislamientos realizados con éxito se repicaban a las pocas semanas, repicado de purificación, a nuevas placas Petri. Las cepas se mantuvieron en placas Petri, realizando los repicados necesarios, hasta el momento de su utilización en el ensayo. Durante el año 2002 se consiguieron aislar con éxito dos cepas de Boletus badius, una procedente de A Barrela (Lugo), en el interior de Galicia, número de aislamiento 9702, y otra procedente de la costa, de San Vicente do Mar (Pontevedra), aislamiento número 9700, ambas asociadas a Pinus pinaster. Para el actual ensayo de medios de cultivo se desestimó la cepa procedente del interior (9702) debido a que su crecimiento en cultivo puro era menos vigoroso que el de la cepa de la costa (9700) y la de Sarria (9699). En la Tabla 2 se muestran las características de cada una de las especies/cepas: localidad, planta huésped, entidad donde se encuentra depositada, número de aislamiento y año de recolección. 3.1.2. Medios de cultivo y pH Se han seleccionado para este ensayo cuatro de los medios de cultivo más utilizados, debido a sus buenos resultados con una amplia gama de hongos ectomicorrícicos. Los medios seleccionados son: - MMN (Marx, 1969) Material y métodos. Influencia del medio de cultivo y el pH sobre el desarrollo de cinco hongos ectomicorrícicos en cultivo in vitro. . 63 - Raper (Raper y Raper, 1972) - Agar-malta 4% - PDA (patata-dextrosa agar) MMN es el más utilizado y suele ofrecer buenos resultados con la mayoría de los hongos ectomicorrícicos (Marx, 1969; Molina y Palmer, 1982). Raper y Agar-malta han dado buenos crecimientos con diversas cepas del género Boletus (Poitou, 1978). En el Centro de Investigacions Forestais e Ambientais de Lourizán (C.I.F.A.L.) se aisla Boletus badius con éxito en Agar-malta y MMN dando el primero un medio de conservación de larga duración. PDA se ha revelado como un medio de cultivo excelente en cepas del género Suillus (Torres y Honrubia, 1991). En la tabla 3 se describe la composición de cada uno de los medios de cultivo seleccionados. En los trabajos de aislamiento y propagación de hongos micorrícicos realizados en el C.I.F.A.L. se venía observando una respuesta diferencial en el crecimiento de algunas especies a diferentes pH del medio. Por esta razón dentro de cada medio se seleccionó un rango de pH con una desviación de medio punto entorno al pH recomendado Tabla 3. Composición de los medios de cultivo utilizados en el ensayo MMN Raper Malta 4% PDA Peptona 2,0 g Extr. De levadura 2,0 g extracto de malta 3,0 g d-Glucosa 10,0 g Malta 40,0 g Glucosa 20, 0 g (NH4)2HPO40,25 g KH2PO40,5 g 0,46 g MgSO4·7H2O0,15 g 0,5 g CaCl20,05 FeCl31,2 ml (1% solución) NaCl 0,025 g PO4HK21 g Tiamina 100 mg Patata 4,0 g Dextrosa 20,0 g H2O destilada Agar 10,0 g 15, 0 g 15, 0 g p H des p ués autoclave 5.5-5.7 7 5 5,5 hasta 1000 ml Tabla 4. Combinación de pH y medios de cultivo ensayados pH Medio de cultivo 4,5 5,0 5,5 6,0 6,5 7,0 7,5 Raper MMN AM PDA Material y métodos Influencia del medio de cultivo y el pH sobre el desarrollo de cinco hongos ectomicorrícicos en cultivo in vitro . 64 en cada caso. Todos los pH fueron corregidos con ácido clorhídrico o hidróxido sódico antes de la esterilización. En la tabla 4 se muestran los pH ensayados en cada medio. 3.1.3. Diseño experimental y análisis estadístico Se utilizó un diseño experimental completamente aleatorizado, con 60 tratamientos (combinación de 5 hongos, 4 medios y 3 pH) y 6 repeticiones por tratamiento. Se calculó el radio medio de la colonia de las 6 repeticiones para cada una de las fechas de toma de datos. Los datos así obtenidos se procesaron mediante un análisis de varianza (SAS Institute, 1999), utilizando el test de Duncan para la comparación de medias (P=0,05). El análisis estadístico se realizó para los cinco hongos por separado en cada una de las fechas, estudiando la influencia del pH en cada medio de cultivo y la influencia del medio de cultivo y la combinación medio de cultivo-pH sobre el radio medio de la colonia. No se investigó la influencia del pH sobre cada hongo debido a que se usaron diferentes pH para cada medio de cultivo. El modelo de análisis de varianza utilizado fue un experimento factorial de 2 factores que responde al siguiente cuadro: Tabla 5.- Fuentes de variación y grados de libertad del modelo empleado en el ensayo de medios de cultivo y pH en laboratorio FUENTE DE VARIACIÓN GRADOS DE LIBERTAD medio de cultivo 3 pH 2 medio de cultivo * pH 6 3.1.4. Descripción del ensayo Para la realización del ensayo se partió de colonias ya establecidas en placas Petri en medio MMN y cultivadas a 25 ºC. Dos meses antes del comienzo del ensayo se replicaron las cepas más lentas, ambas cepas de Boletus badius y Laccaria laccata, en 10 placas Petri con el propósito de tener una cantidad suficiente de inóculo en el momento del ensayo, y un mes antes del ensayo las cepas más rápidas: Paxillus involutus y Pisolithus tinctorius. Durante la semana del 7 al 11 de abril de 2003 se preparó el medio de cultivo necesario y se dispensó en las placas Petri para su siembra. Una vez preparado el medio de cultivo y rectificado el pH mediante ácido clorhídrico o hidróxido sódico, se esterilizaba a 120 ºC durante 15 minutos y a continuación se llenaban Foto 1. Material y métodos. Influencia del medio de cultivo y el pH sobre el desarrollo de cinco hongos ectomicorrícicos en cultivo in vitro. . 65 las placas Petri de forma aséptica en la cámara de flujo laminar. Las placas Petri utilizadas fueron de 8,5 cm de diámetro y contenían 20 ml de medio cada una. Se llenaron un total de 50 placas Petri por cada combinación de medio de cultivo-pH, haciendo un total de 600 placas. A continuación, una vez preparadas todas las placas, en la cámara de flujo laminar se procedió a su inoculación con discos de 8 mm de diámetro recogidos del borde de zonas de crecimiento activo de las colonias previamente incubadas, cerrándolas a continuación con “Parafilm”. De cada aislamiento, medio y pH se prepararon diez placas, seis de las cuales se utilizarían para el ensayo de crecimiento y las cuatro restantes para la descripción morfológica de las colonias con el fin de poderlas manipular con cierta libertad sin que afectara a su crecimiento. 3.1.5. Control de los ensayos El control de los datos de crecimiento se realizó a los 7, 14, 23, 29, 37, 44, 50, 57, 68, 77, 85 y 90 días del comienzo del ensayo. La dimensión de las colonias se determinó calculando la media de los 4 radios de las colonias en las fechas correspondientes. Para ello, las placas destinadas al estudio del crecimiento (6 por tratamiento) fueron marcadas con un eje de coordenadas con el fin de tomar periódicamente las medidas de los 4 radios de la colonia, en milímetros, hasta un total de 12 controles, durante 3 meses (Foto 5). También se realizaron descripciones morfológicas de las colonias a los 15, 30 y 45 días atendiendo a criterios de textura del micelio, borde de las colonias, pigmentación del medio, coloración del mismo, por el anverso y el reverso de la placa, etc. El color se caracterizó mediante la carta de colores de la Royal Horticultural Society (RHS Colour Chart) que posee un total de 808 colores diferentes (Foto 6). Material y métodos Influencia del medio de cultivo y el pH sobre el desarrollo de cinco hongos ectomicorrícicos en cultivo in vitro . 66 Foto 5.- Placa 347 BcP5R6, Boletus badius (S. Vicente), en PDA a pH 5,0 con el eje de coordenadas y las marcas de crecimiento en cada una de las fechas de la toma de datos. Foto 6.- Placa 429 PiM5.5A2, Paxillus involutus, en MMN a pH 5,5, muestra utilizada para la descripción morfológica, junto con la carta de colores (RHS). Foto 5 Foto 6 Material y métodos. Evaluación de siete orígenes ibéricos de Pinus pinaster Ait.. sembrados en suelo e inoculados con Pisolithus tinctorius y Paxillus involutus. . 67 3.2. Evaluación de siete orígenes ibéricos de Pinus pinaster Aiton sembrados en suelo e inoculados con Pisolithus tinctorius y Paxillus involutus 3.2.1. Orígenes de Pinus pinaster ensayados La selección del material vegetal a ensayar se hizo de forma que estuvieran representadas las tres grupos de P. pinaster existentes en España, según Baradat y Marpeau (1988): Atlántico, Perimediterráneo y Maghrebí. En cuanto a la región Noroeste, se decidió escoger un tipo peculiar de Pinus pinaster existente en el sur de Galicia, localizado en la provincia de Pontevedra, con unas características propias de corteza, fuste y crecimiento, conocido vulgarmente como “pino femia” o “piñeiro femia”. Las regiones de procedencia selecionadas fueron las siguientes: - Noroeste Interior, “pino femia” (Atlántico) - Sierra de Oña (Atlántico) - Sierra de Gredos (Atlántico) - Meseta Castellana (Atlántico) - Serranía de Cuenca (Perimediterráneo) - Sierras de Segura-Alcaraz (Perimediterráneo) - Sierra Bermeja (Maghrebí) Todos los lotes, excepto la semilla de pino “femia”, fueron suministrados por el Centro Nacional de Mejora Forestal "El Serranillo", Guadalajara, dependiente del Ministerio de Medio Ambiente. Las semillas de “pino femia” procedían de un ejemplar aislado situado en el pueblo de Taboazas, Sierra do Suído, en la provincia de Ourense, que había sido localizado con anterioridad y que en abril de 2003 apareció talado. Se recogieron las piñas y se mantuvieron en el sequero del Centro de Investigación Forestal y Ambiental de Lourizán (C.I.F.A.L.) hasta su eclosión. Todas las semillas se conservaron en frío hasta el momento de la siembra o de la estratificación. Todos los lotes de semillas fueron sometidos a un test de germinación y se tomaron datos de peso específico y pureza. Las características oficiales de los lotes y los resultados obtenidos por los tests realizados están reflejados en la tabla 6. Material y métodos Evaluación de siete orígenes ibéricos de Pinus pinaster Ait. sembrados en suelo e inoculados con Pisolithus tinctorius y Paxillus involutus . . 68 3.2.2. Elección de las cepas/especies ectomicorrícicas Con el fin de probar diferentes métodos de inoculación, se decidió utilizar un inóculo miceliar y otro esporal. Tras el ensayo previo sobre la influencia del medio de cultivo y el pH sobre la producción de inóculo de hongos ectomicorrícicos (“Influencia del medio de cultivo y el pH sobre el desarrollo de cinco hongos ectomicorrícicos en cultivo in vitro”), se decidió utilizar la cepa 9.993 de Paxillus involutus, como inóculo miceliar, por ser la que mejor resultado ofreció en su cultivo in vitro y por ser una especie muy cosmopolita. El Pisolithus tinctorius se seleccionó debido a la facilidad de lograr grandes cantidades de inóculo esporal y porque es un hongo que ha ofrecido buenos resultados en un gran número de ensayos (Ruehle, 1982; Pera et al., 1994; Torres y Honrubia, 1994; Niemi et al., 2004). Todos los carpóforos fueron recolectados en verano-otoño de 2003 en terrenos del C.I.F.A.L. sobre suelos de bosques mixtos. 3.2.3. Diseño experimental y análisis estadístico Se utilizó un diseño experimental en parcela subdividida (“split-plot”), con 4 repeticiones. La parcelas principales fueron los inóculos (inóculo esporal de Pisolithus tinctorius, inóculo miceliar de Paxillus involutus y control) y las subparcelas estuvieron formadas por los distintos orígenes de Pinus pinaster (Sierra Bermeja, Serranía de Cuenca, Sierras de Segura-Alcaraz, Sierra de Gredos, Meseta Castellana, Sierra de Oña y “pino femia” de Noroeste Interior). La combinación de los dos tipos de inóculos y el control con los siete orígenes de semilla, hacían un total de 21 tratamientos diferentes. Al final del ensayo se muestrearon 12 plantas por tratamiento, aunque en algunos tratamientos no se alcanzó esta cifra debido a la escasa tasa supervivencia de algunas subparcelas. Cuando no se disponía de observaciones suficientes debido al elevado número de marras, se estimó el dato mediante la fórmula de estimación de datos perdidos para un diseño en Tabla 6.- Características de las semillas ensayadas (MFRI.- material forestal de reproducción identificado; MFRS.- material forestal de reproducción seleccionado; Germ.- % germinación en etiqueta; P.1000.- peso en gramos de 1.000 semillas en etiqueta; *.- resultados obtenidos de los lotes utilizados en el ensayo. Origen Tipo Nº lote Cosecha Germ. *Germ. Pureza *Pureza P. 1000 *P. 1000 Noroeste, "femia" 2002-03 75,1 99,6 70,70 Sierra de Oña MFRI 2043a 1998-99 72,0 74,0 98,9 98,9 49,39 51,30 Sierra de Gredos MFRI 2175 1999-00 66,9 99,2 52,00 Meseta Castellana MFRI 2047b 1998-99 74,0 78,2 99,5 99,5 63,11 63,30 Serranía de Cuenca MFRI 2050a 1998-99 80,0 76,2 99,6 99,5 50,10 54,70 Segura-Alcaraz MFRS 2281a 2000-01 92,0 87,1 99,6 99,6 66,60 65,31 Sierra Berme j aMFRI 430 1989-90 78,0 62,4 99,5 99,5 69,49 67,31 Material y métodos. Evaluación de siete orígenes ibéricos de Pinus pinaster Ait.. sembrados en suelo e inoculados con Pisolithus tinctorius y Paxillus involutus. . 69 parcelas subdivididas (Cochran y Cox, 1991)1. Se tomaron datos de peso verde, peso seco y altura de la parte aérea, porcentaje de micorrización total y de los diferentes morfotipos y supervivencia de plantas al final del ensayo. Todos los datos (peso seco de la parte aérea, longitud de la parte aérea, porcentaje de supervivencia, porcentaje de germinación total y porcentaje de micorrización por morfotipos, estos tres últimos corregidos por la transformación arcoseno2) se sometieron a un análisis de varianza (SAS Institute, 1999) utilizando el test de Duncan para la comparación de medias (P=0,05). El modelo de análisis de varianza utilizado fue un experimento en parcelas subdivididas (split-plot) que responde al siguiente cuadro: Tabla 7.- Fuentes de variación y grados de libertad del modelo empleado en el ensayo de orígenes (procedencias) en suelo FUENTE DE VARIACIÓN GRADOS DE LIBERTAD parcela 3 inóculo 2 parcela * inóculo 6 origen semilla 6 inóculo * origen semilla 12 error 54 3.2.4. Localización y duración del ensayo El ensayo se desarrolló en la localidad de Lourizán, ayuntamiento de Pontevedra, provincia de Pontevedra, en una parcela perteneciente al C.I.F.A.L. La siembra comenzó el día 9 de noviembre de 2003 y el último muestreo se realizó el 5 de julio de 2004. 3.2.5. Características climáticas de la zona del ensayo A continuación se muestran los datos climáticos de la zona de ensayo para un periodo de 30 años tomados en la estación meteorológica de Lourizán. 1 La ausencia de observaciones se estimó mediante la fórmula de estimación de datos perdidos para un diseño en parcelas subdivididas: Y = [ rW + b (ajbk) – (aj) ] / [ (r-1) (b-1) ] Donde: r, número de bloques de la procedencia donde falta b, número de subparcelas de la parcela donde falta W, total de las subparcelas observadas de la parcela donde falta (a jbk), total observado del tratamiento que falta (a j), total observado de las parcelas que recibieron en el nivel j de A 2 La transformación arcoseno es especialmente apropiada para porcentajes y proporciones, en particular cuando los datos sobrepasan el intervalo entre 30 % y 70 % (Sokal y Rohlf, 1984). La transformación halla θ = arcsen (p)1/2, donde p es el porcentaje en tanto por uno. Material y métodos Evaluación de siete orígenes ibéricos de Pinus pinaster Ait. sembrados en suelo e inoculados con Pisolithus tinctorius y Paxillus involutus . . 76 agrupando aquellos morfotipos que se habían considerado diferentes en una misma clase cuando las características microscópicas así lo evidenciaran. La descripción de las micorrizas se realizó siguiendo las pautas establecidas por Agerer (1994). De cada morfotipo se anotaban las siguientes características: - sistema micorrícico: longitud y tipo de ramificación - eje principal: diámetro - terminaciones no ramificadas: forma, longitud, diámetro y color - superficie de las terminaciones no ramificadas - abundancia de las hifas que emanan - rizomorfos: abundancia, color, forma de conexión con el manto - manto: tipo y color - cistidios: abundancia, forma y dimensiones Material y métodos. Evaluación de siete orígenes ibéricos de Pinus pinaster Ait. sembrados en contenedor utilizando técnicas. convencionales de propagación de planta forestal e inoculados con Pisolithus tinctorius y Paxillus involutus. . 77 3.3. Evaluación de siete orígenes ibéricos de Pinus pinaster sembrados en contenedor utilizando técnicas convencionales de propagación de planta forestal e inoculados con Pisolithus tinctorius y Paxillus involutus 3.3.1. Orígenes de Pinus pinaster ensayados Los orígenes de Pinus pinaster utilizados en este ensayo fueron los mismos del Epígrafe 3.2.1. “Orígenes de Pinus pinaster ensayados”. 3.3.2. Elección de las cepas/especies ectomicorrícicas Al igual que el material vegetal, las cepas/especies de hongos ectomicorrícicos utilizados en este ensayo fueron los mismos que en el Epígrafe 3.2.2. “Elección de las cepas/especies ectomicorrícicas”. 3.3.3. Diseño experimental y análisis estadístico Se realizó un experimento factorial con 3 niveles del factor inóculo y 7 niveles del factor origen (procedencias) dando un total de 21 tratamientos diferentes. Cada tratamiento se distribuyó en dos bandejas de 48 alveolos, resultando un total de 96 plantas por tratamiento. Las bandejas se situaron en el interior del invernadero con una distribución completamente aleatorizada. La misma distribución se conservó cuando el ensayo se trasladó a su emplazamiento definitivo en el exterior. Se tomaron datos semanales del porcentaje de germinación de la totalidad del espacio muestral. Los datos quincenales de longitud de la parte aérea se determinaron sobre una muestra de 24 plantas seleccionadas al azar para cada tratamiento. Los datos finales de peso seco, peso verde y altura de la parte aérea, peso seco del sistema radicular, porcentaje de micorrización total y de los diferentes morfotipos hallados se determinaron de una muestra de 20 plantas seleccionadas al azar para cada tratamiento. Los datos de porcentaje de germinación se analizaron separadamente para cada fecha al igual que los datos de altura. En la tabla 9 se indica el análisis de varianza utilizado en los porcentajes de germinación. En cuando al incremento quincenal de la altura, los grados de libertad varían respecto a los porcentajes de germinación ya que la muestra fue de 24 plantas por tratamiento en lugar de 96 (tabla 10). Material y métodos Evaluación de siete orígenes ibéricos de Pinus pinaster Ait. sembrados en contenedor utilizando técnicas convencionales de propagación de planta forestal e inoculados con Pisolithus tinctorius y Paxillus involutus . 78 Tabla 9.- Fuentes de variación y grados de libertad del modelo empleado para los porcentajes de germinación en el ensayo de orígenes (procedencias) en contenedor FUENTE DE VARIACIÓN GRADOS DE LIBERTAD origen semilla 6 error 35 Tabla 10.- Fuentes de variación y grados de libertad del modelo empleado para los incrementos quincenales de la altura en el ensayo de orígenes (procedencias) en contenedor FUENTE DE VARIACIÓN GRADOS DE LIBERTAD inóculo 2 origen semilla 6 inóculo * origen semilla 12 error 483 Para los datos finales de longitud y peso seco de la parte aérea, peso seco de las raíces, peso seco de la planta, relación del peso seco de la parte aérea y peso seco de la raíz, relación de la longitud y el peso seco de la parte aérea, porcentaje de micorrización total y porcentaje de cada uno de los morfotipos se utilizó el análisis de varianza que se indica en la tabla 11: Tabla 11.- Fuentes de variación y grados de libertad del modelo empleado para los datos finales en el ensayo de orígenes (procedencias) en contenedor FUENTE DE VARIACIÓN GRADOS DE LIBERTAD inóculo 2 origen semilla 6 inóculo * origen semilla 12 error 399 En todos los casos los datos expresados en porcentaje (%) fueron transformados mediante la función arcseno como se explicó en el epígrafe 3.2.3. “Diseño experimental y análisis estadístico”. Todos los datos se sometieron a un análisis de varianza (SAS Institute, 1999), utilizando el test de Duncan para la comparación de medias (P=0,05). 3.3.4. Localización y duración del ensayo El ensayo se desarrolló en las instalaciones que Viveros Forestales Mañente posee en la localidad de Mañente, ayuntamiento de Foz, en la provincia de Lugo. El ensayo duró desde el 18 de marzo de 2004, día en que se realizó la siembra, hasta el 30 julio de 2004, día del muestreo final. Constó de dos fases, la primera, de cultivo protegido bajo invernadero, desde el 18 de marzo hasta el 9 de junio, y, la segunda, de cultivo en el exterior, desde el 9 de junio hasta el final del ensayo. Material y métodos. Evaluación de siete orígenes ibéricos de Pinus pinaster Ait. sembrados en contenedor utilizando técnicas. convencionales de propagación de planta forestal e inoculados con Pisolithus tinctorius y Paxillus involutus. . 79 3.3.5. Características climáticas de la zona del ensayo A continuación se exponen las características climáticas de la estación meteorológica más cercana a la zona de ensayo. El periodo de toma de datos es escaso, 10 años, pero se ha considerado el más apropiado debido a la cercanía al vivero (9 km). La siguiente estación meteorológica más cercana (Pedro Murias) no disponía de datos con antigüedad suficiente para que resultaran representativos. Situación: San Pedro de Benquerencia Latitud: 43º 33’ N Longitud: 7º 12’ W Altitud: 25 m La zona de ensayo, según la clasificación climática de Allué (1966), pertenece a la región fitoclimática Atlántico europeo V(VI) y según Thornthwaite (1948), pertenecería a un clima B3 r B1’ a’. 3.3.6. Condiciones climáticas durante el periodo de ensayo Entre el 2 de abril y el 9 de junio, periodo en el que las plantas se mantuvieron bajo abrigo, se tomaron datos diarios de temperatura máxima y mínima en el interior del invernadero (Fig. 14). A partir del 9 de junio, momento en el que el ensayo se trasladó al exterior y hasta la finalización del ensayo, la información climática diaria fue facilitada por la Consellería de Medio Ambiente de la Xunta de Galicia de datos tomados en la estación meteorológica Pedro Murias, situada en Vilaframil (Ribadeo) a 18 kilómetros del vivero, por ser la estación meteorológica más cercana a la zona de ensayo con datos climatológicos diarios (Fig. 15). A continuación se facilitan las gráficas de la variación de temperatura en el interior (Fig. 14) y en el exterior del invernadero (Fig. 15) en cada una de las fases del periodo de ensayo. Tabla 12.- Tabla resumen de los datos climáticos de Benquerencia de un periodo de 10 años. t.- temperatura media (ºC); tm.- temperatura media de las mínimas (ºC); tM.- temperatura media de las máximas (ºC); P.- precipitación (mm) en feb mar abr may jun jul ago sep oct nov dic med.an. t9,4 9,4 11 11,7 13,7 16,6 18,9 19,2 18,1 15 12,3 10,6 13,9 tm 5,7 5,5 7,5 8,4 10,4 13,6 16 15,8 14,5 11,5 8,7 7,2 10,8 tM 13,1 13,4 14,5 14,9 16,9 19,4 21,7 22,5 21,6 18,5 15,9 13,9 17 P112 109 81 114 79 59 29 39 47 135 106 103 1052 Material y métodos Evaluación de siete orígenes ibéricos de Pinus pinaster Ait. sembrados en contenedor utilizando técnicas convencionales de propagación de planta forestal e inoculados con Pisolithus tinctorius y Paxillus involutus . 80 0 5 10 15 20 25 30 35 2-abr 9-abr 16-abr 23-abr 30-abr 7-may 14-may 21-may 28-may 4-jun fecha temperatura (ºC) Tª med.diaria Tª máx.diaria Tª mín.diaria Tª med.mensual Tª máx.mensual Tª mín.m. Fig. 14.- Variación de la temperatura media, máxima y mínima, diaria y mensual, en el interior del invernadero desde el 2 de abril al 9 de junio de 200 0 5 10 15 20 25 30 35 10-jun 17-jun 24-jun 1-jul 8-jul 15-jul 22-jul 29-jul 5-ago 12-ago 19-ago fecha temperatura (ºC) Tª med.diaria Tª máx.diaria Tª mín.diaria Tª med.mensual Tª máx.mensual Tª mín.mensual Fig. 15.- Variación de la temperatura media, máxima y mínima, diaria y mensual, en el exterior (Observatorio de Pedro Muruais, Ribadeo) desde el 9 de junio hasta el 26 de agosto de 2004 1 2 3 4 5 quincena 6 7 8 9 10 11 quincena Material y métodos. Evaluación de siete orígenes ibéricos de Pinus pinaster Ait. sembrados en contenedor utilizando técnicas. convencionales de propagación de planta forestal e inoculados con Pisolithus tinctorius y Paxillus involutus. . 81 3.3.7. Preparación del inóculo El proceso utilizado en la preparación del inóculo de Paxillus involutus y Pisolithus tinctorius, fue el mismo que el del ensayo en suelo (Epígrafe 3.2.8. “Preparación del inóculo”). 3.3.8. Preparación de la siembra El proceso de producción, técnicas y materiales utilizados en el ensayo intentaron reproducir en todo momento el proceso productivo comercial de Viveros Forestales Mañente, aunque se hicieron una serie de modificaciones para conseguir unas mejores condiciones del ensayo: - las semillas fueron desinfectadas sumergiéndolas durante una hora en una disolución de 2 g/l de thiram (80 % pp) y posteriormente se estratificaron en arena húmeda a 4 ºC durante 40 días con objeto de obtener una germinación más precoz y homogénea - debido a la complejidad de la sembradora automática y a la gran cantidad de elementos mecánicos en contacto con el sustrato, la siembra se llevó a cabo manualmente con las máximas condiciones de esterilidad con el fin de evitar posibles contaminaciones - el abonado de fondo del sustrato se redujo a la mitad, respecto a la dosis normal empleada en el vivero, con objeto de facilitar la micorrización (Molina, 1979), aplicándose 0,28 g de superfosfato de cal, 0,32 g de Osmocote Start (12-11-17 + 2 MgO + Te) y 0,28 g de Ficote (15-8-12 + 2 MgO + Te) por cada litro de sustrato. A una temperatura de 21 ºC el Osmocote Start tiene un periodo de liberación de 6 semanas y el Ficote de 3 ó 4 meses - no se aplicó ningún tipo de tratamiento fitosanitario preventivo con el fin de evitar posibles interacciones con el proceso de micorrización El resto del proceso del cultivo fue exactamente igual al empleado normalmente en el vivero: - el sustrato se elaboró en una mezcladora de sustratos utilizando 26 % de turba negra, 55 % de turba rubia, 15 % de corteza de pino triturada y compostada, 2 % de perlita y Foto 11.- Parcela de ensayo en el interior del invernadero Material y métodos Evaluación de siete orígenes ibéricos de Pinus pinaster Ait. sembrados en contenedor utilizando técnicas convencionales de propagación de planta forestal e inoculados con Pisolithus tinctorius y Paxillus involutus . 82 2 % de poliespán triturado, con adición de 0,03 litros de agua al 0,1 % de Beltanol (Quinosol 50 %) y 0,04 litros de agua al 0,15 % de hipoclorito sódico por cada litro de sustrato, además del abonado de fondo. Finalmente dio un pH de 4,58 - los envases utilizados consistieron en bandejas reutilizables rígidas de polietileno de 48 alveolos de 150 cc de capacidad, de Arnabat, previamente desinfectadas con hipoclorito sódico al 10 % - se sembraron dos semillas por alveolo a una profundidad de 1 cm aproximadamente cubriéndolas posteriormente con vermiculita (grado 2) y aplicando un abundante riego de humectación - una vez realizada la siembra, las bandejas se introdujeron en una cámara de cultivo oscura, a 25 ºC de temperatura y 98 % de humedad relativa, durante un periodo de 15 días, hasta que se produjo la germinación del 10 % de las semillas aproximadamente, momento en el que se trasladaron a un invernadero de cristal con regulación del sombreo y de la apertura cenital automatizados - tras un periodo de crecimiento de 68 días en el interior del invernadero, cuando las plantas habían alcanzado una altura media cercana a los 10 cm, las bandejas se trasladaron a su emplazamiento definitivo en el exterior para la fase de endurecimiento - a lo largo de todo el proceso se aplicó una pequeña dosis de fertirrigación diaria consistente en 0,006 mg de Peters Plant Starter (10-52-10) por planta - el sustrato no se esterilizó con el fin de mantener en todo momento unas condiciones de producción lo más semejantes posible al proceso productivo Foto 12.- Ensayo listo para ser trasladado al exterior Foto 13.- Parcela de ensa y o en el exterior Material y métodos. Evaluación de siete orígenes ibéricos de Pinus pinaster Ait. sembrados en contenedor utilizando técnicas. convencionales de propagación de planta forestal e inoculados con Pisolithus tinctorius y Paxillus involutus. . 83 normal del vivero. Respecto a este punto, cabe señalar que se han realizado ensayos que demuestran la existencia de bacterias beneficiosas para el proceso de la micorrización en coníferas (Garbaye y Bowen, 1989; Duponnois y Garbaye, 1991a,b) y que la desinfección del suelo o la aplicación de pesticidas puede desequilibrar las comunidades microbianas del suelo influyendo decisivamente en la formación de ectomicorrizas (Trappe et al., 1984; De Oliveira y Garbaye, 1989; Garbaye, 1991). En otros estudios, en los que se inocularon plántulas de Quercus robur en contenedor con inóculo miceliar de Laccaria laccata (Garbaye et al., 1991), la esterilización del sustrato provocó una reducción significativa en la formación de ectomicorrizas respecto al sustrato no esterilizado, lo que sugiere la presencia en la turba de comunidades microbianas que favorecen la micorrización (Garbaye y Bowen, 1987) o la liberación de sustancias inhibidoras como consecuencia del tratamiento de calor (Rovira y Bowen, 1966). Founoune et al. (2002) demostraron que ciertas bacterias presentes en el suelo, a las que denominan “Mycorrhiza Helper Bacteria”, en concreto del género Pseudomonas, pueden estimular la simbiosis micorrícica en condiciones tropicales. 3.3.9. Inoculación La dosis de inoculación se determinó en base a los ensayos de inoculación de Pinus pinaster realizados por Pera (Pera, 1993), en los que evaluó las dosis más convenientes de inóculo esporal e inóculo miceliar en sustrato de turba-vermiculita y en alginato polimerizado de varios hongos ectomicorrícicos. Finalmente se optó por una dosis 1:16 de inóculo de Paxillus involutus / sustrato dado que fue una de las dosis que mejor resultados ofreció en la generalidad de todos los hongos ectomicorrícicos ensayados en el trabajo mencionado, a pesar de que esta cepa y especie en concreto no había sido ensayada. El sustrato definitivo, inoculado con Paxillus involutus, se elaboró mezclando 8 litros de medio de cultivo MMN turba-vermiculita, perfectamente colonizado por el hongo, con 128 litros del sustrato elaborado en Viveros Forestales Mañente. La dosis de inóculo de Pisolithus tinctorius, se estableció, al igual que en el caso anterior, a partir de los resultados obtenidos por Pera (Pera, 1993), escogiendo una dosis de 1.000.000 de basidiosporas por planta (5.714 basidiosporas/cm3) por ser una de las dosis que mejor resultados había ofrecido. El inóculo base se preparó mezclando 4 g de esporas con 1.000 cm3 de vermiculita grado 3 previamente humedecido al 20 % con agua. Como la dosis esporal elegida fue de 5.714 basisiosporas/cm3, se hizo una dilución de 80 cm3 de inóculo base en 7,9 litros de vermiculita (grado 3), que se mezcló con 128 litros de sustrato, obteniendo así el Material y métodos Evaluación de siete orígenes ibéricos de Pinus pinaster Ait. sembrados en contenedor utilizando técnicas convencionales de propagación de planta forestal e inoculados con Pisolithus tinctorius y Paxillus involutus . 84 sustrato definitivo, inoculado con Pisolithus tinctorius, con una dosis esporal de 5.714 basidiosporas/cm3. Para obtener el tercer tipo de sustrato, el sustrato control, se mezcló la misma cantidad de vermiculita pura (grado 3) que en los dos casos anteriores. El 18 de marzo de 2004, se realizó manualmente la mezcla del sustrato con cada uno de los inóculos, a la dosis descrita, en contenedores de 100 litros previamente desinfectados con hipoclorito sódico al 20 % y evitando en todo momento cualquier foco de contaminación. Inmediatamente después, una vez elaborados los tres tipos de sutrato (sustrato inoculado con Paxillus involutus, sustrato inoculado con Pisolithus tinctorius y el sustrato control) se procedió al llenado y codificación de las bandejas que ya estarían listas para la siembra. 3.3.10. Control del ensayo Durante los tres primeros meses se llevó a cabo un seguimiento semanal del ensayo en el que se contaba el número de semillas germinadas por tratamiento y se eliminaban las plántulas enfermas así como las necesarias para dejar una única plántula por alveolo. Además, durante toda la duración del ensayo, cada dos semanas, se medía la longitud de 12 plantas por bandeja, desde la superficie del sustrato hasta el extremo del meristemo apical, y se recogieron todas aquellas plantas enfermas para proceder a su posterior análisis en el laboratorio. El 26 de agosto se extrajeron 10 plántulas completas por bandeja, 20 por tratamiento. En el momento del muestreo se cortaba la parte aérea al nivel del suelo y se tomaban datos del peso verde y de su altura y se introducían en sobres etiquetados. Los cepellones perfectamente humectados se lavaban bajo un suave chorro de agua corriente sobre un tamiz de 5 mm, se introducían en botes perfectamente etiquetados y se llenaban con una mezcla al 75 % de etanol y 25 % de agua para su perfecta conservación. Las partes aéreas tras desecarlas en una estufa a 70 ºC durante 48 horas, momento en el que ya habían alcanzado el peso seco constante, se pesaban en una balanza de precisión de hasta 10 centésimas de gramo. Foto 14.- Bandejas sembradas y eiquetadas, listas para ser llevadas a la cámara de cultivo Material y métodos. Evaluación de siete orígenes ibéricos de Pinus pinaster Ait. sembrados en contenedor utilizando técnicas. convencionales de propagación de planta forestal e inoculados con Pisolithus tinctorius y Paxillus involutus. . 85 3.3.11. Análisis de laboratorio Una vez en el laboratorio se analizó la totalidad del sistema radicular de cada una de las plantas exactamente igual que en el experimento realizado en suelo (Epígrafe. 3.2.11. “Análisis de laboratorio”). Nota: Letras diferentes en la misma columna indican diferencias significativas para el test de Duncan (P<0,05). "a".- representa el valor más alto, "DMS".- diferencia mínima significativa MMN 5.0 4,350 ab 7,833 a 15,700 a 19,417 a 21,883 a 23,683 a 24,567 a 26,400 a 27,600 a 28,217 a 28,219 a 28,688 a MMN 5.5 4,967 a 11,000 a 21,767 a 26,617 a 30,517 a 32,850 a 34,750 a 36,567 a 40,117 a 40,617 a 40,715 a 40,896 a MMN 6.0 4,017 b 7,567 a 15,533 a 21,650 a 26,033 a 28,683 a 30,467 a 31,867 a 33,517 a 34,133 a 34,150 a 34,150 a DMS 0,713 3,914 8,619 10,950 12,770 13,990 14,780 15,810 16,630 17,000 17,250 17,695 RAPER 6.5 4,000 a 4,000 a 4,000 a 4,000 a 4,000 a 4,000 a 4,000 a 4,000 a 4,083 a 4,333 a 5,004 a 5,146 a RAPER 7.0 4,000 a 4,000 a 4,000 a 4,000 a 4,000 a 4,000 a 4,000 a 4,000 a 4,000 a 4,000 a 4,000 b 4,108 b RAPER 7.5 4,000 a 4,000 a 4,000 a 4,000 a 4,000 a 4,000 a 4,000 a 4,000 a 4,000 a 4,000 a 4,000 b 4,000 b MDS 0,000 0,000 0,000 0,000 0,000 0,000 0,000 0,000 0,145 0,370 0,456 0,562 AM 4.5 4,000 a 4,183 b 5,783 a 8,117 a 12,900 a 18,300 a 22,083 a 24,683 a 26,100 a 26,717 a 27,735 a 27,750 a AM 5.0 4,000 a 4,500 a 5,183 a 5,517 b 6,433 b 7,150 b 8,400 b 9,400 b 12,233 b 13,983 b 15,042 b 16,392 ab AM 5.5 4,000 a 4,267 b 4,533 b 4,883 b 5,633 b 6,283 b 7,217 b 8,433 b 10,583 b 11,617 b 12,738 b 13,046 b DMS 0,000 0,281 1,128 2,463 5,139 8,391 10,850 12,280 12,540 12,390 12,256 12,065 PDA 5.0 4,017 a 4,133 a 5,017 a 6,217 a 9,000 a 12,133 a 14,967 a 17,550 a 24,900 a 27,800 a 28,783 a 29,504 a PDA 5.5 4,000 a 4,083 a 4,233 b 4,300 b 4,367 b 4,650 b 5,217 b 6,383 b 8,900 b 11,167 b 13,788 b 15,704 b PDA 6.0 4,000 a 4,000 a 4,000 b 4,000 b 4,067 b 4,267 b 4,517 b 4,933 b 6,600 b 7,850 b 9,671 b 10,417 b DMS 0,029 0,221 0,463 1,227 2,839 4,512 4,492 6,529 10,440 11,830 12,526 12,968 MMN 4,446 a 8,786 a 17,656 a 22,556 a 26,142 a 28,390 a 29,925 a 31,599 a 33,733 a 33,798 a 34,315 a 34,315 a RAPER 4,000 b 4,000 b 4,000 b 4,000 b 4,000 c 4,000 c 4,000 c 4,000 c 4,025 c 4,035 c 4,111 c 4,335 c AM 4,000 b 4,301 b 5,157 b 6,174 b 8,310 b 10,564 b 12,547 b 14,167 b 16,290 b 16,415 b 17,414 b 18,478 b PDA 4,004 b 4,071 b 4,417 b 4,833 b 5,808 bc 7,006 bc 8,229 bc 9,604 bc 13,450 b 13,689 b 15,599 b 17,414 b DMS 0,226 1,133 2,433 3,101 4,003 5,016 5,800 6,389 7,174 7,391 7,856 8,026 Tabla 13.- Influencia del pH sobre el radio de las colonias de Boletus badius (Sarria) para los diferentes medios de cultivo día 57 día 68 día 77 día 85medio/pH Boletus badius (Sarria) RADIO MEDIO día 7 día 14 día 23 día 29 día 37 día 44 día 50 día 90 "DMS".- diferencia mínima significativa AM 4.5 4,000 b 4,183 c 5,783 c 8,117 c 12,900 c 18,300 cd 22,083 bc 24,683 bc 26,100 b 26,717 b 27,735 b 27,750 bc AM 5.0 4,000 b 4,500 c 5,183 c 5,517 c 6,433 cd 7,150 e 8,400 de 9,400 de 12,233 c 13,983 c 15,042 c 16,392 d AM 5.5 4,000 b 4,267 c 4,533 c 4,883 c 5,633 d 6,283 e 7,217 de 8,433 de 10,583 c 11,617 c 12,738 c 13,046 d MMN 5.0 4,350 b 7,833 b 15,700 b 19,417 b 21,883 b 23,683 bc 24,567 b 26,400 abc 27,600 b 28,217 b 28,219 b 28,688 ab MMN 5.5 4,967 a 11,000 a 21,767 a 26,617 a 30,517 a 32,850 a 34,750 a 36,567 a 40,117 a 40,617 a 40,715 a 40,896 a MMN 6.0 4,017 b 7,567 b 15,533 b 21,650 ab 26,033 ab 28,683 ab 30,467 ab 31,867 ab 33,517 ab 34,133 ab 34,150 ab 34,150 ab PDA 5.0 4,017 b 4,133 c 5,017 c 6,217 c 9,000 cd 12,133 de 14,967 cd 17,550 cd 24,900 b 27,800 b 28,783 b 29,504 ab PDA 5.5 4,000 b 4,083 c 4,233 c 4,300 c 4,367 d 4,650 e 5,217 de 6,383 e 8,900 c 11,167 c 13,788 c 15,704 cd PDA 6.0 4,000 b 4,000 c 4,000 c 4,000 c 4,067 d 4,267 e 4,517 e 4,933 e 6,600 c 7,850 c 9,671 c 10,417 d RAPER 6.5 4,000 b 4,000 c 4,000 c 4,000 c 4,000 d 4,000 e 4,000 e 4,000 e 4,083 c 4,333 c 5,004 c 5,146 d RAPER 7.0 4,000 b 4,000 c 4,000 c 4,000 c 4,000 d 4,000 e 4,000 e 4,000 e 4,000 c 4,000 c 4,000 c 4,108 d RAPER 7.5 4,000 b 4,000 c 4,000 c 4,000 c 4,000 d 4,000 e 4,000 e 4,000 e 4,000 c 4,000 c 4,000 c 4,000 d DMS 0,335 1,844 4,085 5,297 6,595 7,944 8,980 9,880 10,930 11,330 11,658 11,956 Nota: Letras diferentes en la misma columna indican diferencias significativas para el test de Duncan (P<0,05). "a".- representa el valor más alto, Tabla 14.- Influencia de la combinación medio-pH sobre el radio de las colonias de Boletus badius (Sarria) Boletus badius (Sarria) RADIO MEDIO medio/pH día 7 día 14 día 23 día 29 día 37 día 44 día 50 día 57 día 68 día 77 día 85 día 90 Resultados Influencia del medio de cultivo y el pH sobre el desarrollo de cinco hongos ectomicorrícicos en cultivo in vitro . 96 0 5 10 15 20 25 30 35 40 45 0 7 14 23 29 37 44 50 57 68 77 85 90 días radio (mm) Bi R 6.5 Bi R 7.0 Bi R 7.5 ns ns ns ns ns ns ns a ns ns ns b b a b b 0 5 10 15 20 25 30 35 40 45 0 7 14 23 29 37 44 50 57 68 77 85 90 días radio (mm) Bi M 5.0 Bi M 5.5 Bi M 6.0 ns ns ns ns ns ns ns ns ns ns a ns ab b Fig. 16.- Influencia del pH sobre el crecimiento de Boletus badius (Sarria) en medio de cultivo MMN. Diferentes letras dentro de la misma columna indica que existen diferencias significativas para el test de Duncan (P<0.05). “a”-representa el valor superior; “ns”- indica que no existen diferencias significativas dentro de esa columna ;”Bi”- Boletus badius (Sarria); ”M+nº”- medio de cultivo MMN y pH. Fig 17.- Influencia del pH sobre el crecimiento de Boletus badius (Sarria) en medio de cultivo Raper. Diferentes letras dentro de la misma columna indica que existen diferencias significativas para el test de Duncan (P<0.05). “a”-representa el valor superior; “ns”- indica que no existen diferencias significativas dentro de esa columna;”Bi”- Boletus badius (Sarria); ”R+nº”- medio de cultivo Raper y pH. Resultados. Influencia del medio de cultivo y el pH sobre el desarrollo de cinco hongos ectomicorrícicos en cultivo in vitro. . 97 0 5 10 15 20 25 30 35 40 45 0 7 14 23 29 37 44 50 57 68 77 85 90 días radio (mm) Bi P 5.0 Bi P 5.5 Bi P 6.0 ns a ns b b a b b a b b a b b a b b a b b a b b a b b a b b a b b 0 5 10 15 20 25 30 35 40 45 0 7 14 23 29 37 44 50 57 68 77 85 90 días radio (mm) Bi A 4.5 Bi A 5.5 Bi A 6.0 ns b b b b a b ab b a b a a b b b a b a b a b a b a b a b b ab b b a b Fig. 18.- Influencia del pH sobre el crecimiento de Boletus badius (Sarria) en medio de cultivo Agar-malta 4%. Diferentes letras dentro de la misma columna indica que existen diferencias significativas para el test de Duncan (P<0.05). “a”-representa el valor superior; “ns”- indica que no existen diferencias significativas dentro de esa columna;”Bi”- Boletus badius (Sarria); ”A+nº”- medio de cultivo Agarmalta 4% y pH. Fig. 19.- Influencia del pH sobre el crecimiento de Boletus badius (Sarria) en medio de cultivo PDA. Diferentes letras dentro de la misma columna indica que existen diferencias significativas para el test de Duncan (P<0.05). “a”-representa el valor superior; “ns”- indica que no existen diferencias significativas dentro de esa columna;”Bi”- Boletus badius (Sarria); ”P+nº”- medio de cultivo PDA y pH. Resultados Influencia del medio de cultivo y el pH sobre el desarrollo de cinco hongos ectomicorrícicos en cultivo in vitro . 98 radio medio), seguido de 5.5 y 6.0 (15,7 y 10,4 mm de radio medio respectivamente) (fig. 19). Se observa que los medios de cultivo más ácidos favorecen el crecimiento tanto en PDA como en AM. 4.1.1.2. Boletus badius (San Vicente do Mar) 4.1.1.2.1. Boletus badius (San Vicente) en MMN La morfología es similar en los tres pH (foto 19). A los 15 días la colonia es perfectamente circular, de textura algodonosa, muy densa, margen algo difuso debido a la menor densidad de hifas. Por el anverso, micelio aéreo de color blanco, bien desarrollado, deprimido en el centro. Por el reverso, de color blanco marfil más claro en el margen (158 D) y oscuro hacia el centro (158 A) formando círculos concéntricos. A los 30 días la apariencia es similar aunque el micelio aéreo se ha extendido más, alcanzando en algunos casos la tapa superior de la placa. Presenta al reverso cambios de 0 5 10 15 20 25 30 35 40 45 0 7 14 23 29 37 44 50 57 68 77 85 90 días radio (mm) Bi M Bi R Bi A Bi P b b b a b c c c b b b c b b b bc bc b bc a b bc a b a b a b b a b c b a c a a b a b a b a b b c b c Fig. 20.- Influencia del medio de cultivo sobre el crecimiento de Boletus badius (Sarria). Diferentes letras dentro de la misma columna indica que existen diferencias significativas para el test de Duncan (P<0.05). “a”-representa el valor superior; “ns”- indica que no existen diferencias significativas dentro de esa columna;”Bi”- Boletus badius (Sarria); ”M”- MMN; “R”- Raper; “A”- Agar-malta 4%; “P”- PDA. Resultados. Influencia del medio de cultivo y el pH sobre el desarrollo de cinco hongos ectomicorrícicos en cultivo 99 tonalidad concéntricas, siempre blanco marfil, en el centro color 158 A – 162 D que se vuelve más claro hacia el margen. 4.1.1.2.2. Boletus badius (San Vicente) en Raper A los 15 días el crecimiento es escaso. El disco de siembra está cubierto por un micelio algodonoso muy denso, más laxo a pH 7.0 y sin desarrollo perceptible a pH 7.5 (fig. 22). A los 30 días, las colonias de pH 6.5 tienen un escaso crecimiento y apenas invaden el agar, son de forma irregular por desarrollarse a partir de escasos puntos activos del disco de siembra. Presentan micelio aéreo, blanco y algodonoso, y los márgenes son precisos. Por el reverso son de color gris amarillento (162 C) (foto 20). Las colonias de pH 7.0, en cambio, presentan menos crecimiento, mostrando el disco de siembra completamente cubierto por un micelio blanco, aterciopelado, muy denso, sin apenas desarrollo en el agar, con márgenes muy precisos y de color, al reverso, gris amarillento (162 C), al igual que las de pH 6.5. A pH 7.5 el crecimiento es prácticamente nulo, aunque se han iniciado algunas colonias de color blanco a partir de puntos activos del inóculo, pero en ningún caso invaden el medio de cultivo. Foto 19. Boletus badius, San Vicente, en MMN, a pH = 5.0, a los 60 días. Reverso y anverso. Resultados Influencia del medio de cultivo y el pH sobre el desarrollo de cinco hongos ectomicorrícicos en cultivo in vitro . 100 4.1.1.2.3. Boletus badius (San Vicente) en agar-malta 4% A los 15 días las colonias son muy irregulares, de color blanco, algodonosas y muy densas excepto a pH 5.5 que son más laxas y de escaso crecimiento. Sólo las colonias que crecen a pH 5.0 presentan micelio aéreo. A los 30 días continúan con una forma muy irregular debido a su desarrollo a partir de algunos puntos activos del inóculo. Por el reverso tienen un color amarillo verdoso grisáceo (160 D) hacia el centro y márgenes blanquecinos. A pH 5.0 y 5.5 el micelio aéreo se ha desarrollado considerablemente formando una colonia algodonosa y abovedada en el centro. A los 45 días el micelio ha ido envejeciendo tomando en los márgenes una coloración gris amarillenta (161 A). Las colonias a pH 4.5 continúan sin micelio aéreo. Al reverso son de color gris amarillento claro (162 D más oscuro). Foto 21. Boletus badius, San Vicente, en agar-malta, a pH = 5.0, a los 60 días. Foto 20. Boletus badius, San Vicente, en Raper, a pH = 6.5, a los 60 días. Reverso y anverso. Resultados. Influencia del medio de cultivo y el pH sobre el desarrollo de cinco hongos ectomicorrícicos en cultivo 101 4.1.1.2.4. Boletus badius (San Vicente) en PDA A los 15 días las colonias son perfectamente circulares, de textura algodonosa, muy densas y de color blanco puro. A medida que las colonias van creciendo se vuelven más irregulares, compactas y de márgenes precisos. Por el reverso son de color blanco marfil. A los 30 días se detectan en algunas colonias hendiduras radiales muy pronunciadas y diminutos exudados traslúcidos o de color ámbar (foto 22). Por el anverso, al envejecer se vuelve de color gris (156 C) o gris amarillento (161 C). Al reverso, el centro es de color pardo oscuro (165 A), volviéndose marrón grisáceo (199 A) y margen más claro, gris amarillento (161 D). A pH 5.0 y 5.5, pueden presentar o no, tanto hendiduras radiales como exudados. A pH 6.0 el crecimiento es mucho menor y presentan micelio blanco y compacto (foto 22). 4.1.1.2.5. Crecimiento de Boletus badius (San Vicente) A diferencia de la cepa de Sarria, en MMN las colonias no se desarrollaron bien, siendo el pH 5.5 el que tuvo peores resultados (8,9 mm de radio medio); en pH 5.0 y 6.0 se obtuvieron Foto 22. Boletus badius, San Vicente, en PDA, a pH = 5.0, 5.5 y 6.0, a los 60 días. Reverso y anverso. pH = 5.0 pH = 5.5 pH = 6.0 Resultados Influencia del medio de cultivo y el pH sobre el desarrollo de cinco hongos ectomicorrícicos en cultivo in vitro . 102 colonias similares (fig. 21) aunque con un tamaño medio al final del ensayo (25,2 y 34,2 mm de radio medio respectivamente a los 90 días de cultivo). Cuando se utilizó Raper, las colonias fueron en general muy pequeñas, de hasta 11 mm de radio (fig. 22). Las colonias mayores se obtuvieron en PDA (33,3 mm de radio medio) aunque sin alcanzar, en ningún caso, a ocupar la placa Petri por completo; los mejores pH resultaron 5.0 y 5.5 (33,3 mm de radio medio) que fueron significativamente mejores que pH 6,0 (20,9 mm de radio medio) (fig. 24). En AM las colonias fueron muy pequeñas, similares al cabo de 90 días a las desarrolladas en Raper, aunque tuvieron un crecimiento inicial muy fuerte, estancándose al cabo de un mes aproximadamente (fig. 23). 4.1.1.3. Paxillus involutus 4.1.1.3.1. Paxillus involutus en MMN La morfología fue similar en los tres pH (foto 24). A los 15 días las colonias son, por el anverso, algodonoso-lanosas salpicadas por un micelio aéreo formado por puntos dispersos más densos que les confieren un aspecto pulverulento. La forma de las colonias es irregular y los bordes difusos. El color por el reverso es pardo oscuro en el centro (200 A) aclarándose y tomando una coloración cremosa hacia el exterior (165 A – 165 B) y más claro en el margen (161 A). A pH 6.0 presentan estos mismos colores pero con tonalidades más oscuras. El medio se tiñe de anaranjado grisáceo (175 A). 4.1.1.3.2. Paxillus involutus en Raper A los 15 días el crecimiento es desigual. Se forman colonias diminutas, de color grisáceo, a partir de puntos activos en la periferia del punto de siembra. Por el anverso el micelio es gris verdoso (197 D) y en algún caso amarillento (4 D). No produce exudados, excepto a pH 7.0, y alguna placa presenta arrugas radiales aunque poco numerosas. Por el reverso es de color marrón oscuro (200 A). Tiñe el medio de color marrón claro (164 B) que, más adelante, a los 30 días, se transforma en una aureola aceitosa alrededor de la colonia. A los 45 días los márgenes se vuelven más difusos. Por el anverso el micelio presenta muy diferentes coloraciones distribuídas normalmente de forma concéntrica: márgenes de color crema (198 D) y zonas intermedias amarillas (2 D) también presentes a veces en el margen. Tiene micelio aéreo poco denso y aspecto pulverulento de distintas coloraciones. Por el reverso es de color verde oliva a marrón en el centro (199 A más oscuro) y zonado de negro. A veces presentan líneas concéntricas de diferentes tonalidades siempre entre amarillo verdoso y marrón-grisáceo-oliváceo. A pH 7.0 han aparecido más coloraciones diferentes por el anverso, Nota: Letras diferentes en la misma columna indican diferencias significativas para el test de Duncan (P<0,05). "a".- representa el valor más alto, "DMS".- diferencia mínima significativa MMN 5.0 4,033 a 7,050 a 11,350 a 15,700 a 18,333 a 20,800 a 21,883 ab 23,017 ab 23,583 ab 24,250 ab 25,196 ab 25,196 ab MMN 5.5 4,000 a 4,000 b 4,367 b 5,217 b 6,300 b 7,150 b 7,733 b 8,083 b 8,483 b 8,650 b 8,642 b 8,904 b MMN 6.0 4,033 a 4,800 b 8,667 ab 12,733 ab 18,150 a 23,000 a 26,250 a 28,683 a 31,183 a 33,283 a 33,938 a 34,238 a DMS 0,082 1,973 5,055 7,998 10,810 12,830 14,240 15,420 16,420 17,180 17,554 17,965 RAPER 6.5 4,000 a 4,550 a 5,183 a 5,533 a 5,917 a 6,367 a 7,017 a 7,683 a 8,917 a 9,717 a 10,792 a 10,883 a RAPER 7.0 4,033 a 4,217 b 4,817 b 4,867 b 4,867 b 5,017 b 5,483 b 5,650 b 6,500 b 6,800 b 7,838 b 7,992 b RAPER 7.5 4,000 a 4,000 b 4,000 c 4,000 c 4,000 c 4,000 c 4,000 c 4,000 c 4,000 c 4,000 c 4,000 c 4,000 c DMS 0,058 0,318 0,327 0,289 0,277 0,450 0,601 0,511 0,937 1,164 1,259 1,985 AM 4.5 5,017 a 7,950 a 10,717 a 11,433 a 12,017 a 12,350 12,433 a 12,783 a 13,017 a 13,533 a 13,758 a 13,813 a AM 5.0 4,883 a 7,450 a 9,317 b 9,850 b 10,250 b 10,433 10,583 b 10,850 b 11,083 b 11,467 b 11,475 b 11,863 b AM 5.5 4,067 b 4,883 b 5,600 c 6,067 c 6,600 c 6,883 7,233 c 7,933 c 8,417 c 8,933 c 9,525 c 9,696 c DMS 0,437 0,702 1,381 1,387 1,423 1,315 1,356 1,222 1,031 1,251 1,369 1,968 PDA 5.0 4,817 a 7,667 a 11,650 a 14,750 a 18,267 a 21,733 a 24,700 a 27,933 a 32,317 a 33,200 a 33,267 a 33,267 a PDA 5.5 4,950 a 8,033 b 11,817 a 14,033 a 16,600 a 19,067 a 21,633 a 24,750 a 30,517 a 32,967 a 33,179 a 33,263 a PDA 6.0 4,583 a 6,100 a 8,067 b 9,833 b 11,267 b 12,300 b 13,417 b 14,533 b 16,667 b 17,233 b 18,600 b 19,513 b DMS 0,820 1,156 1,294 1,653 2,550 3,440 4,238 4,832 6,380 7,436 8,126 9,025 MMN 4,018 b 5,279 b 8,121 b 11,196 ab 14,258 a 16,983 a 18,617 a 19,915 a 21,069 a 22,057 a 22,592 a 22,779 a RAPER 4,013 b 4,239 c 4,664 c 4,797 c 4,933 c 5,132 c 5,494 b 5,774 b 6,463 b 6,826 b 7,543 b 7,625 b AM 4,653 a 6,742 a 8,535 b 9,107 b 9,608 b 9,881 b 10,036 b 10,483 b 10,750 b 11,218 b 11,586 b 11,790 b PDA 4,781 a 7,260 a 10,496 a 12,867 a 15,363 a 17,688 a 19,908 a 22,400 a 26,490 a 27,786 a 28,349 a 28,681 a DMS 0,282 0,933 1,944 2,811 3,675 4,451 5,005 5,508 6,096 6,519 7,025 7,890 día 90día 50 día 57 día 68 día 77 Tabla 15.- Influencia del pH sobre el radio de las colonias de Boletus badius (San Vicente) para los diferentes medios de cultivo Boletus badius (S. Vicente) RADIO MEDIO día 7 día 14 día 23 día 29 día 37 día 44medio/pH día 85 Nota: Letras diferentes en la misma columna indican diferencias significativas para el test de Duncan (P<0,05). "a".- representa el valor más alto, "DMS".- diferencia mínima significativa MMN 5.0 6,700 a 20,617 a 33,050 a 37,367 a 40,867 a 41,750 a 41,783 a 41,783 a 41,783 a 41,783 a 41,783 a 41,783 a MMN 5.5 7,033 a 18,183 a 29,267 b 35,167 a 39,933 a 41,017 a 41,017 a 41,017 a 41,017 a 41,017 a 41,017 a 41,017 a MMN 6.0 6,933 a 18,050 a 30,483 b 35,483 a 40,633 a 40,783 a 40,783 a 40,783 a 40,783 a 40,783 a 40,783 a 40,783 a MDS 0,707 2,282 4,787 3,608 1,615 1,046 1,050 1,050 1,050 1,050 1,050 1,050 RAPER 6.5 4,367 a 5,183 a 10,050 a 13,433 a 17,333 a 21,183 a 24,883 a 30,133 a 37,783 a 38,717 a 40,246 a 40,996 a RAPER 7.0 4,000 a 4,000 a 4,400 b 6,200 b 9,200 b 12,550 b 15,683 b 20,133 b 28,117 ab 32,067 ab 33,558 a 33,938 a RAPER 7.5 4,000 a 4,000 a 4,000 b 4,383 b 5,800 b 8,183 b 10,950 b 14,533 b 21,450 b 25,167 b 29,204 a 30,867 a MDS 0,512 1,202 0,958 2,527 3,674 4,764 5,876 7,633 10,010 10,910 11,142 11,256 AM 4.5 4,083 a 4,483 a 5,583 a 8,483 a 12,700 a 16,550 a 19,783 a 24,233 a 31,100 a 32,900 a 32,883 a 32,933 a AM 5.0 4,067 a 4,233 a 5,267 a 7,500 a 11,533 a 14,850 ab 17,750 ab 21,517 ab 26,300 ab 28,400 ab 27,354 ab 29,217 ab AM 5.5 4,083 a 4,383 a 5,517 a 7,150 a 10,450 a 13,317 b 15,567 b 18,133 b 21,600 b 23,550 b 23,729 b 23,729 b MDS 0,159 0,557 1,444 2,147 2,256 2,469 3,501 4,848 6,474 7,103 7,236 7,865 PDA 5.0 4,367 a 10,783 a 19,933 a 23,383 a 28,033 a 30,783 a 32,767 a 34,200 a 38,800 a 41,917 a 41,913 a 41,913 a PDA 5.5 4,717 a 10,667 a 16,217 ab 18,200 ab 20,900 b 24,117 b 26,550 b 29,400 ab 36,083 a 40,533 a 41,108 a 41,108 a PDA 6.0 4,650 a 7,500 b 10,417 b 12,917 b 16,550 b 20,100 b 23,250 b 27,550 b 36,233 a 40,167 a 41,783 a 41,783 a MDS 0,573 2,927 6,204 6,395 6,731 6,327 6,191 6,019 6,113 3,889 3,225 3,225 MMN 6,875 a 18,944 a 30,919 a 35,986 a 40,474 a 41,171 a 41,178 a 41,178 a 41,178 a 41,178 a 41,178 a 41,178 a RAPER 4,117 c 4,392 c 6,146 c 8,000 c 10,765 c 13,963 c 17,161 c 21,590 c 29,119 b 31,967 b 34,336 b 35,267 b AM 4,071 c 4,367 c 5,449 c 7,704 c 11,546 c 14,693 c 17,407 c 20,813 c 25,867 b 27,763 b 27,989 c 28,626 c PDA 4,565 b 9,638 b 15,513 b 18,158 b 21,811 b 24,985 b 27,515 b 30,389 b 37,031 a 40,850 a 41,601 a 41,601 a Tabla 17.- Influencia del pH sobre el radio de las colonias de Paxillus involutus para los diferentes medios de cultivo día 57 día 68 día 77 día 85medio/pH Paxillus involutus RADIO MEDIO día 7 día 14 día 23 día 29 día 37 día 44 día 50 día 90 "DMS".- diferencia mínima significativa AM 4.5 4,083 c 4,483 e 5,583 d 8,483 e 12,700 e 16,550 de 19,783 de 24,233 de 31,100 bc 32,900 bc 32,883 b 32,933 b AM 5.0 4,067 c 4,233 e 5,267 d 7,500 e 11,533 e 14,850 e 17,750 e 21,517 ef 26,300 cd 28,400 cd 27,354 bc 29,217 bc AM 5.5 4,083 c 4,383 e 5,517 d 7,150 e 10,450 e 13,317 e 15,567 e 18,133 fg 21,600 d 23,550 d 23,729 c 23,729 c MMN 5.0 6,700 a 20,617 a 33,050 a 37,367 a 40,867 a 41,750 a 41,783 a 41,783 a 41,783 a 41,783 a 41,783 a 41,783 a MMN 5.5 7,033 a 18,183 b 29,267 a 35,167 a 39,933 a 41,017 a 41,017 a 41,017 a 41,017 a 41,017 a 41,017 a 41,017 a MMN 6.0 6,933 a 18,050 b 30,483 a 35,483 a 40,633 a 40,783 a 40,783 a 40,783 a 40,783 a 40,783 a 40,783 a 40,783 a PDA 5.0 4,367 bc 10,783 c 19,933 b 23,383 b 28,033 b 30,783 b 32,767 b 34,200 b 38,800 a 41,917 a 41,913 a 41,913 a PDA 5.5 4,717 b 10,667 c 16,217 b 18,200 c 20,900 c 24,117 c 26,550 c 29,400 bcd 36,083 ab 40,533 a 41,108 a 41,108 a PDA 6.0 4,650 b 7,500 d 10,417 c 12,917 d 16,550 d 20,100 cd 23,250 cd 27,550 cd 36,233 ab 40,167 a 41,783 a 41,783 a RAPER 6.5 4,367 bc 5,183 e 10,050 c 13,433 d 17,333 cd 21,183 c 24,883 c 30,133 bc 37,783 ab 38,717 ab 40,246 a 40,996 a RAPER 7.0 4,000 c 4,000 e 4,400 d 6,200 e 9,200 ef 12,550 e 15,683 e 20,133 ef 28,117 cd 32,067 bc 33,558 b 33,938 b RAPER 7.5 4,000 c 4,000 e 4,000 d 4,383 e 5,800 f 8,183 f 10,950 f 14,533 g 21,450 d 25,167 d 29,204 bc 30,867 b DMS 0,496 1,849 3,766 3,781 3,826 3,924 4,357 5,121 6,307 6,395 7,025 7,256 Nota: Letras diferentes en la misma columna indican diferencias significativas para el test de Duncan (P<0,05). "a".- representa el valor más alto, Tabla 18.- Influencia de la combinación medio-pH sobre el radio de las colonias de Paxillus involutus Paxillus involutus RADIO MEDIO medio/pH día 7 día 14 día 23 día 29 día 37 día 44 día 50 día 57 día 68 día 77 día 85 día 90 Resultados Influencia del medio de cultivo y el pH sobre el desarrollo de cinco hongos ectomicorrícicos en cultivo in vitro . 112 0 5 10 15 20 25 30 35 40 45 0 7 14 23 29 37 44 50 57 68 77 85 90 días radio (mm) Pi M 5.0 Pi M 5.5 Pi M 6.0 ns ns ns ns ns ns ns ns ns ns b ns a a 0 5 10 15 20 25 30 35 40 45 0 7 14 23 29 37 44 50 57 68 77 85 90 días radio (mm) Pi R 6.5 Pi R 7.0 Pi R 7.5 a ns ns b b ns ns a b b a b b a b b a b b a b b a ab b a ab b Fig. 26.- Influencia del pH sobre el crecimiento de Paxillus involutus en medio de cultivo MMN. Diferentes letras dentro de la misma columna indica que existen diferencias significativas para el test de Duncan (P<0.05). “a”-representa el valor superior; “ns”- indica que no existen diferencias significativas dentro de esa columna;”Pi”- Paxillus involutus; ”M+nº”- medio de cultivo MMN y pH. Fig. 27.- Influencia del pH sobre el crecimiento de Paxillus involutus en medio de cultivo Raper. Diferentes letras dentro de la misma columna indica que existen diferencias significativas para el test de Duncan (P<0.05). “a”-representa el valor superior; “ns”- indica que no existen diferencias significativas dentro de esa columna; ”Pi”- Paxillus involutus; ”R+nº”- medio de cultivo Raper y pH. Resultados. Influencia del medio de cultivo y el pH sobre el desarrollo de cinco hongos ectomicorrícicos en cultivo in vitro. . 113 Con formato: Derecha 0 5 10 15 20 25 30 35 40 45 0 7 14 23 29 37 44 50 57 68 77 85 90 días radio (mm) Pi A 4.5 Pi A 5.0 Pi A 5.5 ns ns ns ns b b a a a a b b a a b b ab ab ab ab ab b ab ab a ns 0 5 10 15 20 25 30 35 40 45 0 7 14 23 29 37 44 50 57 68 77 85 90 días radio (mm) Pi P 5.0 Pi P 5.5 Pi P 6.0 ns b a b b a ab ab a b a b a b a b b a b a b ab ns ns ns ns Fig. 28.- Influencia del pH sobre el crecimiento de Paxillus involutus en medio de cultivo Agar-malta 4%. Diferentes letras dentro de la misma columna indica que existen diferencias significativas para el test de Duncan (P<0.05). “a”-representa el valor superior; “ns”- indica que no existen diferencias significativas dentro de esa columna; ”Pi”- Paxillus involutus; ”A+nº”- medio de cultivo Agarmalta 4% y pH. Fig. 29.- Influencia del pH sobre el crecimiento de Paxillus involutus en medio de cultivo PDA. Diferentes letras dentro de la misma columna indica que existen diferencias significativas para el test de Duncan (P<0.05). “a”-representa el valor superior; “ns”- indica que no existen diferencias significativas dentro de esa columna; ”Pi”- Paxillus involutus; ”P+nº”- medio de cultivo PDA y pH. Resultados Influencia del medio de cultivo y el pH sobre el desarrollo de cinco hongos ectomicorrícicos en cultivo in vitro . 114 A los 30 días exhibe un aspecto algodonoso. Se observan arrugas radiales con tonalidades tenuemente asalmonadas en las colonias más envejecidas así como micelio algodonoso pulverulento, no aceitoso, color violeta pálido (85 D). Todavía muestra por el reverso la coloración malva en la periferia del disco del inóculo pero considerablemente más oscuro, hacia violeta (94 B) que pierde intensidad con el tiempo volviéndose más claro (85 D). Foto 25. Laccaria laccata, en MMN, a los 30 días. De izquierda a derecha pH = 5.0, 5.5 y 6.0 0 5 10 15 20 25 30 35 40 45 0 7 14 23 29 37 44 50 57 68 77 85 90 días radio (mm) Pi M Pi R Pi A Pi P b c c a b c c a b c c a b c c a b c c a b c c a b c c a b c c a a a b a a a b a a b c a a b c a Fig. 30.- Influencia del medio de cultivo sobre el crecimiento de Paxillus involutus. Diferentes letras dentro de la misma columna indica que existen diferencias significativas para el test de Duncan (P<0.05). “A”- representa el valor superior; “ns”- indica que no existen diferencias significativas dentro de esa columna; ”Pi”- Paxillus involutus; ”M”- MMN; “R”- Raper; “A”- Agar-malta 4%; “P”- PDA. Resultados. Influencia del medio de cultivo y el pH sobre el desarrollo de cinco hongos ectomicorrícicos en cultivo in vitro. . 115 A los 45 días presenta un gradiente de color en círculos concéntricos que disminuye de intensidad hacia el margen: cambia de amarillo grisáceo (161 C) en el centro a cremoso o blanco anaranjado (159 B) hacia el margen. Ha perdido la coloración malva o violeta y el micelio se ha vuelto aceitoso mostrando, a veces, costras aterciopeladas oleosas distribuídas irregularmente. Sin micelio aéreo. 4.1.1.4.2. Laccaria laccata en Raper A los 15 días todavía no había actividad. A los 30 días, se aprecia un crecimiento radial del micelio formando cordones ondulados de aspecto aceitoso, sin micelio aéreo y con bordes difusos constituído por hifas hialinas. Presenta algunas arrugas radiales de forma ondulada. Al reverso es de color blanquecino (155 A) sin cambios de tonalidad concéntricos (foto 27). 4.1.1.4.3. Laccaria laccata en agar-malta 4% A los 15 días se observa el micelio formado por superposición de hifas largas, hialinas, rectilíneas, que se observan mejor por reflexión, creciendo radialmente, paralelas y muy ordenadas, pegadas al medio, formando abundantes cordones ondulados de hifas. De color blanquecino (155 A) al reverso. El crecimiento de la colonia es circular, de aspecto algodonoso y de bordes difusos. Sin micelio aéreo. Foto 26. Laccaria laccata, en MMN, a los 60 días. De izquierda a derecha pH = 5.0, 5.5 y 6.0, reverso y anverso. Resultados Influencia del medio de cultivo y el pH sobre el desarrollo de cinco hongos ectomicorrícicos en cultivo in vitro . 116 A los 45 días el micelio se vuelve más denso, agrupándose en cordones que discurren radialmente de forma más o menos ondulada y de aspecto aceitoso (foto 28). 4.1.1.4.4. Laccaria laccata en PDA Sólo se han desarrollado 3 colonias de las 18 repeticiones, y todas a pH 6.0, aunque aquellas que lo hicieron crecieron de forma rápida y alcanzando tamaños de colonia considerables. A los 15 días, las 3 colonias que crecieron presentan un micelio muy poco denso de color blanquecino (155 A) al reverso. Se observan hifas hialinas, rectilíneas, individuales, más visibles por reflexión, que crecen radialmente pegadas al medio, con mayor densidad hacia el centro debido a la superposición de hifas y con aspecto de fibras sintéticas. El crecimiento de las colonias es circular y con bordes difusos. Sin micelio aéreo. Foto 27. Laccaria laccata, en Raper, a pH = 7.5, a los 60 días. Reverso y anverso. Foto 28. Laccaria laccata, en agar-malta, a pH = 5.0, a los 60 días. Reverso y anverso. Resultados. Influencia del medio de cultivo y el pH sobre el desarrollo de cinco hongos ectomicorrícicos en cultivo in vitro. . 117 A los 30 días las hifas continúan creciendo radialmente y ya se han formado cordones ondulados, densos y de aspecto aceitoso. Por el reverso, las colonias son de color blanquecino (155 A) y sin cambios de tonalidad concéntricos. A los 45 días los cordones descritos han evolucionado hacia arrugas radiales que desaparecen hacia el margen. El micelio adopta un aspecto aterciopelado cubierto por un diminuto micelio aéreo formado por hifas muy cortas que en ciertos puntos presenta acumulaciones más densas que le da un aspecto pulverulento (foto 29). 4.1.1.4.5. Crecimiento de Laccaria laccata El crecimiento de Laccaria laccata fue en general muy variable. En muchos tratamientos sólo se llegaron a desarrollar 1 ó ninguna de las 6 repeticiones. El único medio en que crecieron todas las colonias de cada tratamiento fue MMN, obteniéndose los mayores tamaños a pH 6.0 (37,1 mm de radio medio) (fig. 31). 4.1.1.5. Pisolithus tinctorius 4.1.1.5.1. Pisolithus tinctorius en MMN Únicamente se observó alguna actividad al cabo de 45 días en dos placas de pH 5.0 y cuatro placas de pH 6.0, dando colonias regulares a pH 5.0 e irregulares a pH 6.0, con márgenes difusos, de color marrón oscuro (199 C). Desarrolla colonias de color marrón oscuro (200 C más oscuro) al reverso, y más claro en el margen (199 A). Foto 29. Laccaria laccata, en PDA, a pH = 6.0, a los 45 días. Reverso y anverso. Se observan las arrugas radiales y el aspecto pulverulento del micelio. Nota: Letras diferentes en la misma columna indican diferencias significativas para el test de Duncan (P<0,05). "a".- representa el valor más alto, "DMS".- diferencia mínima significativa MMN 5.0 6,233 a 12,800 b 22,183 a 25,117 b 26,350 b 26,767 b 26,900 b 26,900 b 26,900 b 26,900 b 27,096 c 27,096 c MMN 5.5 6,800 a 15,533 a 23,950 a 26,317 b 27,217 b 27,700 b 28,333 b 28,800 b 28,817 b 29,083 b 30,650 b 30,692 b MMN 6.0 6,683 a 16,717 a 26,667 a 30,533 a 32,700 a 33,267 a 33,867 a 35,583 a 35,583 a 35,983 a 36,950 a 37,113 a DMS 1,299 1,634 2,243 2,749 3,099 3,244 3,180 3,517 3,524 3,322 3,256 3,369 RAPER 6.5 4,000 a 4,000 a 4,000 a 4,000 a 4,350 a 5,133 a 6,133 a 7,167 a 9,233 a 10,133 a 10,350 a 10,350 a RAPER 7.0 4,000 a 4,000 a 4,133 a 5,433 a 7,650 a 9,917 a 10,467 a 10,467 a 10,467 a 10,467 a 10,467 a 10,467 a RAPER 7.5 4,000 a 4,000 a 4,000 a 4,000 a 4,817 a 6,417 a 7,617 a 8,883 a 9,933 a 10,400 a 10,392 a 10,392 a DMS 0,000 0,000 0,232 2,494 6,853 11,300 13,420 15,140 17,780 19,100 20,125 20,125 AM 4.5 4,000 a 4,000 a 4,133 b 4,317 b 4,733 b 5,483 a 6,283 a 7,550 a 10,100 a 10,100 a 10,100 a 10,100 a AM 5.0 4,000 a 4,000 a 4,283 b 4,950 b 6,000 ab 7,533 a 8,650 a 9,900 a 10,367 a 10,367 a 10,367 a 10,367 a AM 5.5 4,000 a 4,083 a 6,567 a 10,567 a 15,650 a 20,067 a 20,383 a 20,383 a 20,383 a 20,383 a 20,383 a 20,383 a DMS 0,000 0,145 2,262 5,525 9,890 14,230 15,660 17,540 19,980 19,980 19,980 19,980 PDA 5.0 4,000 a 4,000 a 4,000 a 4,000 a 4,000 a 4,000 a 4,000 a 4,000 a 4,000 a 4,000 a 4,000 b 4,000 b PDA 5.5 4,000 a 4,000 a 4,000 a 4,000 a 4,000 a 4,000 a 4,000 a 4,000 a 4,000 a 4,000 a 4,000 b 4,000 b PDA 6.0 4,000 a 4,133 a 5,433 a 6,633 a 7,833 a 9,800 a 11,467 a 12,733 a 14,200 a 14,733 a 22,108 a 22,683 a DMS 0,000 0,232 2,494 4,583 6,671 8,931 10,210 11,000 11,720 12,110 14,125 14,269 MMN 6,558 a 15,000 a 24,244 a 27,307 a 28,738 a 29,237 a 29,691 a 30,426 a 30,429 a 30,647 a 31,565 a 31,633 a RAPER 4,000 b 4,000 b 4,046 b 4,475 b 5,606 b 7,153 b 8,074 b 8,839 b 9,881 b 10,332 b 10,403 b 10,403 b AM 4,000 b 4,026 b 4,990 b 6,608 b 8,786 b 11,024 b 11,774 b 12,611 b 13,615 b 13,615 b 13,615 b 13,615 b PDA 4,000 b 4,044 b 4,475 b 4,876 b 5,279 b 5,928 b 6,489 b 6,908 b 7,399 b 7,575 b 10,036 b 10,228 b DMS 0,340 0,702 1,287 2,449 4,109 5,855 6,490 7,118 7,926 8,176 9,126 9,126 Tabla 19.- Influencia del pH sobre el radio de las colonias de Laccaria laccata para los diferentes medios de cultivo día 68 día 77 día 85 día 90medio/pH Laccaria laccata RADIO MEDIO día 7 día 14 día 23 día 29 día 37 día 44 día 50 día 57 "DMS".- diferencia mínima significativa AM 4.5 4,000 b 4,000 d 4,133 d 4,317 d 4,733 c 5,483 c 6,283 d 7,550 cd 10,100 cd 10,100 c 10,100 c 10,100 cd AM 5.0 4,000 b 4,000 d 4,283 d 4,950 d 6,000 c 7,533 c 8,650 cd 9,900 cd 10,367 cd 10,367 c 10,367 c 10,367 cd AM 5.5 4,000 b 4,083 d 6,567 c 10,567 c 15,650 b 20,067 b 20,383 bc 20,383 bc 20,383 bc 20,383 bc 20,383 bc 20,383 bcd MMN 5.0 6,233 a 12,800 c 22,183 b 25,117 b 26,350 a 26,767 ab 26,900 ab 26,900 ab 26,900 ab 26,900 ab 27,096 ab 27,096 abc MMN 5.5 6,800 a 15,533 b 23,950 b 26,317 b 27,217 a 27,700 ab 28,333 ab 28,800 ab 28,817 ab 29,083 ab 30,650 ab 30,692 ab MMN 6.0 6,683 a 16,717 a 26,667 a 30,533 a 32,700 a 33,267 a 33,867 a 35,583 a 35,583 a 35,983 a 36,950 a 37,113 a PDA 5.0 4,000 b 4,000 d 4,000 d 4,000 d 4,000 c 4,000 c 4,000 d 4,000 d 4,000 d 4,000 c 4,000 c 4,000 d PDA 5.5 4,000 b 4,000 d 4,000 d 4,000 d 4,000 c 4,000 c 4,000 d 4,000 d 4,000 d 4,000 c 4,000 c 4,000 d PDA 6.0 4,000 b 4,133 d 5,433 cd 6,633 d 7,833 c 9,800 c 11,467 cd 12,733 cd 14,200 bcd 14,733 bc 22,108 bc 22,683 bcd RAPER 6.5 4,000 b 4,000 d 4,000 d 4,000 d 4,350 c 5,133 c 6,133 d 7,167 cd 9,233 cd 10,133 c 10,350 c 10,350 cd RAPER 7.0 4,000 b 4,000 d 4,133 d 5,433 d 7,650 c 9,917 c 10,467 cd 10,467 cd 10,467 cd 10,467 c 10,467 c 10,467 cd RAPER 7.5 4,000 b 4,000 d 4,000 d 4,000 d 4,817 c 6,417 c 7,617 d 8,883 cd 9,933 cd 10,400 c 10,392 c 10,392 cd DMS 0,610 0,778 1,902 3,792 6,546 9,620 10,900 12,150 13,800 14,250 14,526 14,705 Laccaria laccata RADIO MEDIO medio/pH día 7 día 14 día 23 día 29 día 37 día 44 día 50 día 57 Nota: Letras diferentes en la misma columna indican diferencias significativas para el test de Duncan (P<0,05). "a".- representa el valor más alto, Tabla 20.- Influencia de la combinación medio-pH sobre el radio de las colonias de Laccaria laccata día 68 día 77 día 85 día 90 Resultados Influencia del medio de cultivo y el pH sobre el desarrollo de cinco hongos ectomicorrícicos en cultivo in vitro . 126 0 5 10 15 20 25 30 35 40 45 0 7 14 23 29 37 44 50 57 68 77 85 90 días radio (mm) Pt M 5.0 Pt M 5.5 Pt M 6.0 ns ns ns ns ns ns ns ns ns ns ns ns 0 5 10 15 20 25 30 35 40 45 0 7 14 23 29 37 44 50 57 68 77 85 90 días radio (mm) Pt R 6.5 Pt R 7.0 Pt R 7.5 ns ns ns ns ns ns ns ns ns ns ns ns Fig. 36.- Influencia del pH sobre el crecimiento de Pisolithus tinctorius en medio de cultivo MMN. Diferentes letras dentro de la misma columna indica que existen diferencias significativas para el test de Duncan (P<0.05). “a”-representa el valor superior; “ns”- indica que no existen diferencias significativas dentro de esa columna; ”Pt”- Pisolithus tinctorius; ”M+nº”- medio de cultivo MMN y pH. Fig. 37.- Influencia del pH sobre el crecimiento de Pisolithus tinctorius en medio de cultivo Raper. Diferentes letras dentro de la misma columna indica que existen diferencias significativas para el test de Duncan (P<0.05). “A”-representa el valor superior; “ns”- indica que no existen diferencias significativas dentro de esa columna; ”Pt”- Pisolithus tinctorius; ”R+nº”- medio de cultivo Raper y pH. Resultados. Influencia del medio de cultivo y el pH sobre el desarrollo de cinco hongos ectomicorrícicos en cultivo in vitro. . 127 0 5 10 15 20 25 30 35 40 45 0 7 14 23 29 37 44 50 57 68 77 85 90 días radio (mm) Pt A 4.5 Pt A 5.0 Pt A 5.5 ns a b a b a c a b b ns ns ns c a b c a b c a b a b b a b b 0 5 10 15 20 25 30 35 40 45 0 7 14 23 29 37 44 50 57 68 77 85 90 días radio (mm) Pt P 5.0 Pt P 5.5 Pt P 6.0 ns b b b a b a b a b b b a ns ns ns ns ns ns ns Fig. 38.- Influencia del pH sobre el crecimiento de Pisolithus tinctorius en medio de cultivo Agar-malta 4%. Diferentes letras dentro de la misma columna indica que existen diferencias significativas para el test de Duncan (P<0.05). “a”-representa el valor superior; “ns”- indica que no existen diferencias significativas dentro de esa columna; ”Pt”- Pisolithus tinctorius; ”A+nº”- medio de cultivo Agarmalta 4% y pH. Fig. 39.- Influencia del pH sobre el crecimiento de Pisolithus tinctorius en medio de cultivo PDA. Diferentes letras dentro de la misma columna indica que existen diferencias significativas para el test de Duncan (P<0.05). “a”-representa el valor superior; “ns”- indica que no existen diferencias significativas dentro de esa columna; ”Pt”- Pisolithus tinctorius; ”P+nº”- medio de cultivo PDA y pH. Resultados Influencia del medio de cultivo y el pH sobre el desarrollo de cinco hongos ectomicorrícicos en cultivo in vitro . 128 0 5 10 15 20 25 30 35 40 45 0 7 14 23 29 37 44 50 57 68 77 85 90 días radio (mm) Pt M Pt R Pt A Pt P a bc c ab a a b a b b a a bc c ab a b b a a b b a a b b a a b b a a b b a a b b a a b b a a b b a a Fig. 40.- Influencia del medio de cultivo sobre el crecimiento de Pisolithus tinctorius. Diferentes letras dentro de la misma columna indica que existen diferencias significativas para el test de Duncan (P<0.05). “a”-representa el valor superior; “ns”- indica que no existen diferencias significativas dentro de esa columna; ”Pt”- Pisolithus tinctorius; ”M”- MMN; “R”- Raper; “A”- Agar-malta 4%; “P”- PDA. Resultados. Influencia del medio de cultivo y el pH sobre el desarrollo de cinco hongos ectomicorrícicos en cultivo in vitro. . 129 especie o cepa medio de cultivo pH color del micelio color del margen color al reverso micelio aéreo textura colorea medio exudados hendiduras radiales margen 5,0 B 158D, 159D 11D, 158A, 159D + A, d - p - N 5,5 B 158D, 159D 11D, 158A, 159D + A, d - p - N MMN 6,0 B 158D, 159D 158A, 159D + A, d - p - N 6,5 - 7,0 - Raper 7,5 - 4,5 B (1) 13D (1)177A, 163A, 13D, 161C (2)165A, 164B + (1) A (2) At - p - N 5,0 B 165A, 164B - At - - - N Agar-malta 5,5 B 165A, 164B - At - - - N 5,0 B 161C 161A, 161C - A - - - N 5,5 B 161C 161A, 161C - A - - - N Boletus badius (Sarria) PDA 6,0 B 161C 161A - At - - - N 5,0 B 158D 158A, 158D, 162D + A, d - - - N 5,5 B 158D 158A, 158D, 162D + A, d - - - N MMN 6,0 B 158D 158A, 158D, 162D + A, d - - - N 6,5 B 162C - At, d - - - N 7,0 B 162C - At - - - N Raper 7,5 - 4,5 B 162D 160D, 162D - A, d - - - N 5,0 B 162D 160D, 162D - A, d - - - N Agar-malta 5,5 B 162D 160D, 162D + A, d - - - N 5,0 B 199A 159C, 161C - A, d - p, a, T/163A + N 5,5 B 161D 165A, 199A - A, d - p, a, T/163A + N Boletus badius (S. Vicente Mar) PDA 6,0 B 161A 165A, 161D, 199A - A - p, a, T/163A + N 5,0 85D, 94B, 156D, 165D 85A, 85B, 159B, 161C - A, O - - - D 5,5 85D, 94B, 156D, 165D 85A, 85B, 159B, 161C - A, O - - - D MMN 6,0 85D, 94B, 156D, 165D 85A, 85B, 159B, 161C - A, O - - - D 6,5 155A 155A - O - - + D 7,0 155A 155A - O - - + D Raper 7,5 155A 155A - O - - + D 4,5 155A 155A - O - - - D 5,0 90B, 155A 155A, 89B - O - - - D Agar-malta 5,5 90B, 155A 155A, 89B - O - - - D 5,0 5,5 Laccaria laccata PDA 6,0 155A 155A p A, P, O - - + D 5,0 161A, 165B 200A, 165A, 165B + L, A, P 175A - - D 5,5 161A, 165B 200A, 165A, 165B + L, A, P 175A - - D MMN 6,0 161A, 165B 200A, 165A, 165B + L, A, P 175A - - D 6,5 4D, 197D, 2D, 199A 198D 164B, 200A, 200C p L, A, P 164B + + N 7,0 4D, 197D, 2D, 158C, 197B 198D 164B, 200AC - L, A, P + + - N Raper 7,5 4D, 197D, 2D, 156B, 158C, 197B 198D 164B, 200AC - L, A, P + + - N 4,5 156B, 197C, 199A 165A 161A, 161B, 165A, 200A + L, O 163A p + N 5,0 156B, 197C, 199A 165A 161A, 161B, 165A, 200A + L, O 163A p + N Agar-malta 5,5 156B, 197C, 199A 165A 161A, 161B, 165A, 200A + L, O 163A p + N 5,0 199A 202B + L, A, P 163A, 166A + - N 5,5 199A 202B + L, A, P 163A, 166A + - N Paxillus involutus PDA 6,0 199A 202B + L, A, P 163A, 166A + - N 5,0 - 5,5 199C 199A 200C - D MMN 6,0 200B, 199A, 162C 199B + 6,5 151A + A + - D 7,0 151A + A + - D Raper 7,5 151A + A + - D 4,5 5,0 3D, 161A, 199C 199A 200C + At - D Agar-malta 5,5 199C 199A 160A, 199A + At, O + p - D 5,0 199D 200A, 160B At, P 163A p - D 5,5 199B, 199D 200A, 160B At, P 163A p - D Pisolithus tinctorius PDA 6,0 160B, 199B, 199D 200A, 160B At, P 163A p - D Tabla 23. Tabla resumen de las descripciones morfológicas. Abreviaturas: A. algodonoso; a. color ambarino; At. aterciopelado; B. blanco; D. difuso; d. denso; L. lanoso; N. nítido; O. oleoso; P. pulverulento; p. pequeño; +. existe; -. no existe; (1). morfología nº 1; nº+letra. clave de color (RHS Colour Chart) Resultados Influencia del medio de cultivo y el pH sobre el desarrollo de cinco hongos ectomicorrícicos en cultivo in vitro . 130 Foto 31.- RHS COLOUR CHART, carta de colores utilizada en la descripción de las colonia Resultados. Evaluación de siete orígenes ibéricos de Pinus pinaster Ait.. sembrados en suelo e inoculados con Pisolithus tinctorius y Paxillus involutus. . 131 4.2. Evaluación de siete orígenes ibéricos de Pinus pinaster Ait. sembrados en suelo e inoculados con Pisolithus tinctorius y Paxillus involutus A continuación se detallan los datos de crecimiento y de micorrización para los diferentes orígenes de Pinus pinaster Ait. ensayados. En la tabla 24 se encuentran los resultados obtenidos. El análisis de varianza se mostró altamente significativo (P < 0,005) entre parcelas, tratamientos de inoculación, procedencias y en la interacción parcela x tratamiento inoculación, mientras que no lo fue en la interacción inóculo x origen. Entre procedencias hubo diferencias significativas en todas las variables determinadas excepto en los porcentajes de los morfotipos L14 y LN. Sin embargo no hubo diferencias significativas entre los tratamientos de inoculación en ninguna de las variables analizadas. 4.2.1. Peso seco de la parte aérea Las plantas inoculadas con Paxillus involutus y con Pisolithus tinctorius fueron similares en cuanto al peso seco de la parte aérea a las plantas no inoculadas, no se detectaron diferencias significativas. Sin embargo, hubo diferencias significativas entre orígenes. Los mayores pesos secos correspondieron a Meseta Castellana, Sierra de Gredos y “pino femia”, con cifras del orden de 254 mg, mientras que los menores fueron Sierra de Oña y Sierra Bermeja, con pesos que no superaban los 200 mg (tabla 24). 4.2.2. Longitud de la parte aérea La longitud de la parte aérea mostró un comportamiento similar al peso seco, sin diferencias entre las plantas inoculadas y el control y con diferencias significativas entre procedencias. “Femia” alcanzó la mayor altura de todos los orígenes (104,0 mm), seguida de Sierra de Gredos y Meseta Castellana (98,9 mm y 96,8 mm respectivamente). La procedencia de menor altura fue Sierra Bermeja (79,1 mm) seguida de Sierra de Oña (87,1 mm) y Sierras de Segura-Alcaraz (89,0 mm). 4.2.3. Relación entre la longitud y el peso seco de la parte aérea Esta variable refleja la relación existente entre la altura y el tamaño de la parte aérea. Es una variable que se podría asimilar a la esbeltez, aunque en este caso, en vez de utilizar el diámetro del tallo se utiliza el peso seco. Cabe señalar que no se han recogido datos del diámetro del tallo puesto que, después de haber tomado gran número de medidas repetidas, se observó que había un elevado error que dependía de la presión ejercida por el pie de rey sobre el Resultados Evaluación de siete orígenes ibéricos de Pinus pinaster Ait. sembrados en suelo e inoculados con Pisolithus tinctorius y Paxillus involutus . 132 tallo y de la altura a la que se tomara la medida, debido a la conicidad del tallo. Estos errores se incrementaban ya que las diferencias entre medidas eran a menudo del orden de décimas de milímetro, diferencias que podían ser debido a cualquiera de las razones mencionadas. Por consiguiente, se optó por definir una nueva relación, resultado del cociente entre la altura de la parte aérea en decímetros y su peso seco en gramos. Valores altos de este cociente indicarían que la planta tiene una longitud elevada en comparación con su peso, mientras que valores bajos supondría lo contrario: plantas de escasa altura y elevado diámetro y/o superficie foliar. No se han observado diferencias significativas entre las plantas inoculadas y el control, aunque sí entre orígenes. La región de procedencia (origen) que alcanzó los valores más bajos fue Meseta Castellana (3,95) debido a su elevado peso seco, el mayor de todas las procedencias, y a su longitud intermedia. La que ha obtenido el valor mayor fue Oña (4,84) que, aunque no ha alcanzado longitudes elevadas, fue la procedencia que menor peso seco alcanzó. El resto de los orígenes tuvieron valores intermedios y similares entre sí. 4.2.4. Porcentaje de supervivencia Todos los datos de porcentaje de supervivencia, relación porcentual entre las plantas que se mantuvieron vivas hasta la finalización del ensayo y la totalidad de las semillas sembradas, son valores a los que se le ha aplicado la transformación angular o arcoseno, para el tratamiento estadístico. No se obtuvieron diferencias significativas entre las plantas inoculadas y el control. En cuanto al origen de las plantas, el “pino femia” tuvo la mayor tasa de supervivencia (20,77) seguida de Sierra de Oña, Meseta Castellana y Sierra de Gredos aunque sin apreciarse diferencias significativas entre ellas. Las peores procedencias fueron Sierra Bermeja (6,17), Sierras de Segura-Alcaraz (13,95) y Serranía de Cuenca (16,69). 4.2.5. Porcentaje de ápices micorrizados Al igual que el porcentaje de supervivencia, los datos de porcentaje de micorrización, relación porcentual entre el número de raíces cortas micorrizadas y el número total de raíces cortas analizadas, fue corregido mediante la función arcoseno. Tabla 24.- Influencia del tipo de inóculo y de la procedencia de las semillas de P. pinaster sobre el peso seco de la parte aérea (PS-PA) (mg); longitud de la parte aérea (LONG) (mm); relación entre longitud y el peso seco de la parte aérea (R-PA) (dm/g); supervivencia (SUPERV) (%); porcentaje de micorrización total (MIC) (%); porcentaje del micotipo L1 (MIC-L1) (%); porcentaje del micotipo L2 (MIC-L2) (%); porcentaje del micotipo L14 (MIC-L14) (%) y porcentaje del micotipo LN (MIC-LN) (%). Los valores de SUPERV, MIC, MIC-L1, MIC-L2, MIC-L14 y MIC-LN están transformados por la función “arcosen” (θ = arcsen (p)1/2). DMS.- diferencia mínima significativa. INOCULO control 259.630 a 100.713 a 4.000 a 17.195 a 58.400 a 57.686 a 0.925 a 0.127 a 0.869 a P. involutus 192.290 a 80.420 a 4.300 a 14.387 a 51.940 a 46.192a7.006a0.000a0.705a P. tinctorius 242.910 a 96.026 a 4.385 a 16.613 a 54.630 a 53.657 a 1.960 a 0.000 a 0.269 a DMS 67.110 20.380 0.8017.130 6.81011.560 10.500 0.250 1.830 PROCEDENCIAS Sierra Bermeja 198.140 b 79.125 c 4.218ab 6.166 d 47.870 b 39.107 b 10.261a 0.000 a 1.226 a Serranía de Cuenca 236.280 ab 91.802 abc 4.037 ab 16.686 bc 56.000 a 54.496 a 2.470 b 0.000 a 0.224 a Noroeste, "femia" 254.170 a 104.019 a 4.261ab 20.769 a 53.040 ab 51.776a2.589b0.000a0.596a Sierra de Gredos 253.910 a 98.903 ab 3.999 ab 17.521abc 57.490 a 57.151a0.673b0.242a0.626a Meseta Castellana 254.670 a 96.753 ab 3.950 b 17.905 ab 54.930 ab 54.294 a 0.900 b 0.000 a 0.334 a Sierra de Oña 188.900 b 87.077 bc 4.836 a 19.457 ab 60.120 a 58.369 a 2.777 b 0.000 a 0.320 a Segura-Alcaraz 235.190 ab 89.026 bc 4.297 ab 13.953 c 55.490 a 52.388 a 3.407 ab 0.054 a 0.973 a DMS 44.180 12.110 0.766 3.540 6.830 6.090 7.000 0.260 1.100 Nota: Letras diferentes en la misma columna indican diferencias significativas para el test de Duncan (P<0,05). "a".- representa el valor más alto PS-PA (mg) LONG (mm) R-PA (dm/g) MIC MIC-L1 MIC-L2 MIC-L14 MIC-L1 MIC-L2PS-PA (mg) MIC-L14 MIC-LN MIC-LN SUPERV SUPERVLONG (mm) R-PA (dm/g) MIC Resultados Evaluación de siete orígenes ibéricos de Pinus pinaster Ait. sembrados en suelo e inoculados con Pisolithus tinctorius y Paxillus involutus . 134 El porcentaje de micorrización total, sin diferenciar morfotipos, fue similar para las plantas inoculadas y el control. Entre procedencias, la única que se distanció significativamente de las demás fue Sierra Bermeja, que tuvo el porcentaje de micorrización menor (47,87), mientras que el resto de las procedencias respondieron de una forma análoga. La procedencia que mayor valor alcanzó fue Sierra de Oña (60,12) aunque sin separarse significativamente del resto. Se identificaron 4 morfotipos diferentes, nombrados como L1, L2, L14 y LN. L1 fue el más abundante y común a todos los tratamientos. L14 y LN tuvieron una presencia casi testimonial y L2, aún encontrándose en todas las procedencias, siempre lo hizo en muy baja proporción. Sin embargo, no presentaron diferencias significativas entre inóculos aunque sí entre orígenes. 4.2.5.1. Morfotipo L1 4.2.5.1.1. Morfología Micorrizas de color marrón amarillento, las más jóvenes, a marrón más oscuro las más viejas, de superficie lisa brillante, a veces reticulada debido a la presencia de escasas hifas adheridas al manto exterior. Células corticales no visibles. Normalmente dicotómicas o doblemente dicotómicas que pueden llegar a formar estructuras coraloides, con terminaciones más o menos irrregulares o tortuosas. Manto externo plectenquimático. Sin partículas de suelo adheridas. No se observa emanación de hifas, rizomorfos o esclerocios. Longitud de los sistemas micorrícicos: 2,3-2,5 mm Diámetro del eje principal: 0,5 mm Longitud de las terminaciones no ramificadas: 0,8-1,2 mm Diámetro de las terminaciones no ramificadas: 0,3 mm 4.2.5.1.2. Presencia Fue la micorriza más común. Se manifestó en todos los tratamientos y con una elevada presencia, con valores medios entre 39,11 y 58,37. No fueron detectadas diferencias significativas entre las plantas inoculadas y el control, pero sí entre orígenes con un valor significativamente más bajo en Sierra Bermeja (39,11) frente al resto. Resultados. Evaluación de siete orígenes ibéricos de Pinus pinaster Ait.. sembrados en suelo e inoculados con Pisolithus tinctorius y Paxillus involutus. . 135 4.2.5.2. Morfotipo L2 4.2.5.2.1. Morfología Micorrizas dicotómicas o doblemente dicotómicas, llegando a formar estructuras coraloides, de color marrón grisáceo o amarillento, más oscuras en las más viejas. Superficie lisa, brillante, células corticales no visibles. Frecuentemente con adherencias de partículas de suelo. Terminaciones regulares. Gran profusión de hifas de emanación y rizomorfos tipo “e” que crecen a partir de los extremos de las terminaciones micorrizadas, creando una estructura algodonosa alrededor de ellas. Manto plectenquimático. No se observan esclerocios ni cistidios. Longitud de los sistemas micorrícicos: 1,3-3,1 mm Diámetro del eje principal: 0,6 mm Longitud de las terminaciones no ramificadas: 0,2-0,4 mm Diámetro de las terminaciones no ramificadas: 0,2 mm 4.2.5.2.2. Presencia Se observó en gran número de tratamientos aunque en pequeño porcentaje. No hubo diferencias significativas entre plantas inoculadas y el control. Apareció con mayor frecuencia Fotos 32-35.- Morfotipo L1. Foto 32.- Micorriza en estado incipiente (marca: 1 mm). Foto 33.- Micorriza dicotómica (marca: 1 mm). Fotos 34 y 35.- Cortes transversales de una micorriza apreciándose la red de Hartig y el manto más (Foto 34) o menos grueso (Foto 35) (marca: 50 mm) Foto 33 Foto 32 Foto 35 Foto 34