Síntesis y caracterización de surfactantes derivados de sales biliares, éteres corona, adamantanos y cadenas hidrocarbonadas

TESE DE DOUTORAMENTO SÍNTESIS Y CARACTERIZACIÓN DE SURFACTANTES DERIVADOS DE SALES BILIARES, ÉTERES CORONA, ADAMANTANOS Y CADENAS HIDROCARBONADAS Juan Ventura Trillo Novo DEPARTAMENTO DE QUÍMICA FÍSICA FACULTADE DE CIENCIAS LUGO 2014 TESE DE DOUTORAMENTO SÍNTESIS Y CARACTERIZACIÓN DE SURFACTANTES DERIVADOS DE SALES BILIARES, ÉTERES CORONA, ADAMANTANOS Y CADENAS HIDROCARBONADAS Asdo. Juan Ventura Trillo Novo DEPARTAMENTO DE QUÍMICA FÍSICA FACULTADE DE CIENCIAS LUGO 2014 AUTORIZACIÓN DOS DIRECTORES DA TESE D. José Vázquez Tato, Catedrático do Departamento de Química Física e D. Francisco Meijide del Río, Profesor Titular do Departamento de Química Física Como Directores da tese de Doutoramento titulada “SÍNTESIS Y CARACTERIZACIÓN DE SURFACTANTES DERIVADOS DE SALES BILIARES, ÉTERES CORONA, ADAMANTANOS Y CADENAS HIDROCARBONADAS” Presentada por D. Juan Ventura Trillo Novo Alumno do Programa de Doutoramento de Ciencia e Enxeñaría dos Alimentos (R.D. 778/1998) Autorizan a presentación da Tese indicada, considerando que reúne os requisitos esixidos no artígo 34 do regulamento de Estudos de Doutoramento, e que como Directores da mesma non incurre nas causas de abstención establecidas na lei 30/1992. Asdo. José Vázquez Tato Asdo. Francisco Meijide del Río Síntesis y caracterización de surfactantes derivados de sales biliares, éteres corona, adamantanos y cadenas hidrocarbonadas RESUMO Esta tese de doutoramento aborda aspectos da Química supramolecular, Biomimetismo molecular e Fisicoquímica de coloides. O estudo implica o deseño, síntese e caracterización en disolución acuosa de moitos compostos, entre os cales sobresaen derivados de sales biliares, éteres coroa e grupos hidrófobos, como adamantanos e cadeas hidrocarboadas. En comparación con surfactantes convencionais, os novos compostos presentan unha mellora na capacidade surfactante e por riba da súa concentración de agregación crítica forman agregados de xeometría variable coma tubos moleculares, vesículas, micelas, etc. Algúns derivados de éteres coroa mostran unha mellora significativa na capacidade de extracción de ións de metais alcalinos e outros, derivados do ácido nitrilotriacético, mimetizan o comportamento dos fosfolípidos naturais. Nalgúns casos, foi posible resolver a estrutura cristalina do composto. PALABRAS CHAVE Surfactantes, sales biliares, éteres coroa, adamantanos, cadeas hidrocarboadas, ácido nitrilotriacético, tetrakis carboxifenilmetano RESUMEN La presente Tesis doctoral abarca aspectos relacionados con la Química supramolecular, el Biomimetismo molecular y la Fisicoquímica de coloides. El estudio ha implicado el diseño, la síntesis y la caracterización en disolución acuosa de numerosos compuestos entre los que sobresalen los derivados de las sales biliares, los éteres corona y grupos hidrófobos como los adamantanos y las cadenas hidrocarbonadas. Comparados con los surfactantes clásicos, los nuevos compuestos evidencian una mejor capacidad surfactante y por encima de su concentración de agregación crítica forman agregados de geometría diversa como tubos moleculares, vesículas, micelas, etc. Algunos derivados de éteres corona muestran una mejora significativa de la capacidad de extracción de iones alcalinos y otros, derivados del ácido nitrilotriacético, mimetizan el comportamiento de los fosfolípidos naturales. En algún caso se ha podido resolver la estructura cristalina del compuesto. PALABRAS CLAVE Surfactantes, sales biliares, éteres corona, adamantanos, cadenas hidrocarbonadas, ácido nitrilotriacético, tetrakis carboxifenilmetano ABSTRAC This thesis covers aspects of Supramolecular Chemistry, Molecular Biomimetism and Physical Chemistry of Colloids. The study involves the design, synthesis and characterization (in aqueous solution) of derivatives of bile salts, crown ethers and hydrophobic groups such as adamantane and hydrocarbon chains. Compared to conventional surfactants, the new compounds show a better surfactant ability and above their critical aggregation concentrations form aggregates of different geometries as molecular tubes, vesicles, micelles, etc. Some derivatives of crown ethers show significant improvement of the extraction capacity of alkali ions and others, derived from nitrilotriacetic acid, mimic the behavior of natural phospholipids. In some cases it was possible to solve the crystal structure of the compound. KEYWORDS Surfactants, bile salts, crown ethers, adamantane, hydrocarbon chain, nitrilotriacetic acid, tetrakis carboyphenylmethane AGRADECIMIENTOS En primer lugar me gustaría agradecer a los profesores Dr. José Vázquez Tato y Dr. Francisco Meijide del Río, por su constante ayuda y por haberme permitido disfrutar del trabajo realizado durante todos estos años. Quisiera dar las gracias también a los profesores de la Facultad de Ciencias de Lugo, Dra. Aida Jover Ramos y Dr. Francisco Fraga López por su gran disposición a la hora de colaborar conmigo. Quisiera agradecer de una manera muy especial al profesor de la Universidad de Costa Rica, Dr. Víctor Hugo Soto Tellini, por haberme enseñado tantas cosas dentro y fuera del laboratorio, por haberme permitido disfrutar de este trabajo durante todas las horas que hemos pasado juntos, por su gran amistad y por enseñarme su país durante el tiempo que disfruté allí. Asimismo quiero agradecer a los que fueron mis compañeros de laboratorio durante tanto tiempo, Santiago, Javi y, muy especialmente, a Cris por su inestimable ayuda, por todos los buenos ratos que hemos pasado tanto “entre columnas” como de cenas y que algunos de ellos quedan reflejados en las notas de la nevera del laboratorio. Por haberme aguantado cuando los días no eran tan buenos y por hacer que durante todos estos años fuéramos una pequeña familia. A toda la gente que conocí en Costa Rica, ¡Pura vida!, que hicieron que mis estancias allí fueran como estar en casa. No debo olvidar a todos los compañeros que han estado en la antigua tercera planta de la Facultad de Ciencias con los que he compartido muchos años de investigación, así como también a aquellos alumnos que han realizado el proyecto fin de carrera en el laboratorio de Química-Física. También me gustaría expresar mi agradecimiento a todas las personas que en menor o mayor medida me han ayudado a la realización de este trabajo. Del mismo modo merece mi reconocimiento la RIAIDT de la USC por las facilidades ofrecidas para la obtención de los diferentes espectros e imágenes de microscopia electrónica. Por último agradezco al Ministerio de Ciencia e Innovación por los proyectos MAT2001-2911, MAT2004-04606, MAT2007-61721 y MAT2010-19440, y a la Xunta de Galicia por los proyectos PGIDIT02PXIC26202PN, PGIDIT05PXIC26201PN y PGIDIT07PXIB262147PR gracias a los cuales ha sido posible desarrollar la presente investigación. Asimismo agradezco la ayuda Predoctoral de Formación de Personal Investigador (referencia BES-2008-004021) asociada al proyecto de investigación MAT2007-61721. GLOSARIO AcOEt Acetato de etilo Ad Adamantano (adamantilo) AFM Microscopía de fuerza atómica AEDT Ácido etilendiaminotetraacético ar Aromático β-CD β-Ciclodextrina BOC t-butoxicarbonil CA Ácido Cólico cac Concentración de agregación crítica cmc Concentración micelar crítica CONTIN Non-negatively constrained least squares: regularized DCA Ácido desoxicólico DEPC Dietilcianofosfonato Dh Diámetro hidrodrinámico DHB Ácido 2,5-dihidroxibenzoico o ácido gentísico DIAD Di-isopropil azo dicarboxilato DIBOC Di-t-Butiloxocarbonil DIC Diisopropilcarbodiimida DITHRANOL 1,8,9-Trihidroxiantraceno DLS (QELS) Dispersión de luz dinámica DMAP Dimetilaminopiridina DMF Dimetilformamida DMSO Dimetilsulfóxido DPPA Difenilfosforil azida DTAB Bromuro de dodeciltrimetilamonio ECF Etilcloroformiato EDCI 1-etil-3-(3-dimetilaminopropil)carbodiimida ESI-FIA-TOF Electrospray ionization-flow injection analysis- Time Of Flight FAB Bombardeo con Átomos Rápidos HOBt 4-hidroxibenzotriazol HRTEM High resolution transmission electronic microscopy HSBA Hard and Soft Acids and Bases LS Dispersión de luz MALDI-TOF Matrix-Assisted Laser Desorption/Ionization-Time Of Flight MRI Resonancia Magnética de Imagen m/z Relación masa/carga NaC Colato sódico NaCDC Quenodesoxicolato sódico NaDC Desoxicolato sódico nag Número de agregación NaLC Litocolato sódico NNLS Non-negatively constrained least squares: multiple pass NaTC Taurocolato sódico NaTCDC Tauroquenodesoxiolato sódico NaTDC Taurodesoxicolato sódico NaUDC Ursodesoxicolato sódico PAMAM Poliamido amina PDT Terapia fotodinámica PPh3 (TPP) Trifenilfosfina PPI Polipropileno-imina Rh Radio hidrodinámico RMN Resonancia Magnética Nuclear TA Temperatura ambiente SAXS Small Angle X-Ray Scattering SB Sal biliar SDS Dodecil sulfato sódico σ90 Polidispersidad a un ángulo de 90º TEA Trietilamina TEM Microscopía Electrónica de Transmisión TFA Ácido trifluoroacético THF Tetrahidrofurano TLC Cromatografía en capa fina 4 la independencia existente entre estas familias; sin embargo existe un nexo de unión entre ellas: sus propiedades surfactantes. No es tanto el caso de los éteres corona per se, pero si cuando se les acopla una cadena hidrocarbonada. En este último caso nos encontramos ante un nuevo tipo de derivado en el que se combinan las propiedades de complejación (debidas al éter corona) y las surfactantes (originadas por la cadena hidrocarbonada). Así pues, el trabajo que se expone se centra fundamentalmente en el estudio de las propiedades surfactantes de los derivados sintetizados, así como en el esclarecimiento de las estructuras que forman en disolución acuosa. (a) (b) (c) Figura I.3.-(a) Unión del ion potasio al éter corona 18 corona 6. El huésped se mantiene en el centro del éter corona debido a las interacciones electrostáticas producidas entre la carga del ion potasio y los seis átomos de oxígeno dispuestos simétricamente alrededor del mismo. La estructura del complejo ha sido resuelta por Seiler.5 (b) Representación estructural de un ion de litio unido dentro de la cavidad de un esferando. (c) Estructura de la cavidad formada en un cavitando vista desde arriba y desde un lateral, respectivamente. El grupo de investigación en cuyo seno se ha desarrollado la presente Tesis Doctoral, denominado Fisicoquímica de Coloides y Química Supramolecular (Grupo GI-1589 de la Universidad de Santiago de Compostela), ubicado en la Facultad de Ciencias del Campus de Lugo, y dirigido por el catedrático José Vázquez Tato de la Universidad de Santiago de Compostela, lleva dedicándose al campo de las sales biliares más de 20 años. El punto de partida de este trabajo es una consecuencia natural de anteriores Tesis Doctorales y proyectos de investigación del grupo, que han aconsejado explorar el diseño, la síntesis y el estudio de nuevos derivados con propiedades surfactantes basados en nuevas moléculas de partida. Durante el presente trabajo se usa de manera indistinta, como suele suceder en la bibliografía sobre el particular, la denominación de ácido biliar o sal biliar de un modo genérico, sin que ello indique su estado de ionización concreto. Las sales biliares son surfactantes naturales (véase capítulo II) y a la hora de comenzar la presente Tesis Doctoral, el grupo de investigación había publicado ya varios estudios sistemáticos sobre el efecto que ejercía la extensión de la región hidrófoba, modificando el balance 5 hidrófilo/hidrófobo de la sal biliar, a través de la posición 3 del sistema de anillos de la misma mediante los grupos hidrófobos adamantilo6 y p-t-butilfenilo7,8, sobre las propiedades en disolución acuosa de los ácidos cólico y desoxicólico, en particular, en lo referido a sus características surfactantes y al tipo de estructuras supramoleculares generadas. Siguiendo esta misma línea de trabajo, hemos sintetizado dos nuevos derivados usando como ácidos biliares los ácidos quenodesoxicólico y ursodesoxicólico9 y también hemos estudiado las arquitecturas supramoleculares a que dan lugar en disolución acuosa (capítulo II). Por otra parte, también hemos sintetizado y estudiado un derivado catiónico de una sal biliar como continuación de estudios de este tipo de compuestos y de sus mezclas cataniónicas10. Todos estos estudios se presentan en el capítulo II. Otra línea de aproximación a la modificación de las características surfactantes de los ácidos biliares naturales consiste en la obtención de oligómeros. Debido a que en el grupo ya existía una amplia experiencia en la obtención de dímeros11-15 y trímeros16 de sales biliares usando diferentes puentes de unión, nos hemos centrado en la obtención y estudio de las características fisicoquímicas de derivados de un orden superior, esto es, tetrámeros de sales biliares. Los resultados se presentan en el capítulo III, aunque allí hemos preferido darles la denominación de dendrímeros de primera generación ya que al mismo tiempo se presentan estructuras que, usando el mismo núcleo que los dendrímeros de sales biliares, corresponden a nuevos derivados de adamantano de tipo octámero. De esta manera se observa la interconexión planteada inicialmente de las diferentes familias de compuestos. Dentro de la química de surfactantes el grupo adamantilo se ha venido usando de múltiples maneras: (i) como núcleo a partir del cual emergen cadenas alquílicas y grupos iónicos17-19; (ii) para aumentar la región hidrófoba de otros surfactantes modificando de esta manera el balance hidrófobo/hidrófilo6,20, como ya se ha realizado dentro de nuestro grupo de investigación, y (iii) como grupo hidrófobo por sí mismo21,22. Este punto es ampliamente analizado en el capítulo IV con la síntesis de nuevos surfactantes con uno, dos, tres y cuatro grupos adamantilo. Es posible diseñar nuevos materiales mediante la utilización de puentes específicos y apropiados que, al ser portadores de funcionalidades añadidas, permitan ampliar la gama de aplicaciones de los materiales en los que se aplican. En este caso hemos diseñado un puente de unión apropiado, derivado del ácido nitrilotriacético (aunque sintéticamente no se parte de él), que permite incluir en la estructura del surfactante la funcionalidad deseada. La estructura general consiste en un puente de unión portador del grupo hidrófilo al que se unirán dos residuos funcionales de marcado carácter hidrófobo, siendo uno de ellos un grupo adamantilo y el segundo grupo se varía uniendo una cadena hidrocarbonada larga con diferente número de átomos de carbono. Los resultados se exponen también en el capítulo IV. La obtención de este tipo de derivados no obedece a una búsqueda al azar sino que se inicia con la Tesis Doctoral de Álvaro Antelo23, en la que se sintetizaron derivados de sales biliares que portan una única carga junto con dos residuos biliares unidos con un mismo puente, que en su caso era el ácido 1-3 diamino benzoico. Usando el mismo puente desarrollado en el capítulo IV introducimos en el capítulo V la familia de los éteres corona. En este caso, la estructura general consiste en el mismo puente de unión, que porta el grupo hidrófilo, al que se unirán dos residuos funcionales, 6 siendo uno de ellos de carácter hidrófobo (adamantano o cadena hidrocarbonada) y el otro el encargado de conferir la funcionalidad adicional, en este caso un éter corona. Surgen así nuevos surfactantes con propiedades a priori no inherentes a los mismos. Al mismo tiempo y aprovechando uno de los núcleos usados para la generación de dendrímeros en el capítulo III, obtendremos dos tetrámeros de éteres corona con los que estudiaremos la capacidad de extracción de iones en disolución acuosa. En la búsqueda de la mimetización de estructuras generadas en la naturaleza, concretamente estructuras de tipo bicapa, hemos sintetizado los compuestos que se presentan el capítulo VI. Siguiendo la idea de capítulos anteriores y usando el mismo puente de unión derivado del ácido nitrilotriacético nos centramos en la síntesis de compuestos con dos cadenas alquílicas de igual o diferente tamaño, constituyendo de este modo anfífilos que recuerdan en su estructura a los fosfolípidos naturales. Sin embargo, al aumentar el número de átomos de carbono de la cadena los compuestos se vuelven muy poco solubles en medios acuosos, por lo que decidimos añadir al ácido carboxílico libre presente en la molécula una alquil-sulfobetaína con el objetivo de intentar mejorar la solubilidad de los surfactantes sintetizados. De esta manera generamos tres nuevos derivados con los que, sin duda, se mimetiza aún más la estructura de los fosfolípidos naturales. Antes de finalizar esta introducción deseo presentar una reflexión de carácter general y derivada de la experiencia acumulada durante la realización de la presente Tesis Doctoral. Como laboratorio dedicado a la Química Supramolecular tenemos que mencionar la necesidad del diseño y síntesis de los nuevos compuestos aquí presentes. Esto entraña tremendas dificultades adicionales que se suman a la cantidad de tiempo requerido para efectuar la síntesis de los componentes moleculares. Tales dificultades conciernen a la obtención del producto final y a que, una vez obtenido este, puede ocurrir que, cuando ya se han aplicado todos los esfuerzos necesarios, la entidad no genere un resultado óptimo o el deseado. Este aspecto ha sido descrito perfectamente por Menger24: “es muy fácil diseñar en el papel una molécula que cumpla las especificaciones deseadas….. el problema es sintetizar tal molécula y durante el proceso sintético las preguntas ¿funcionará?¿no nos decepcionará? nos asaltarán continuamente”. Tenemos que tener en cuenta que cualquier Tesis Doctoral se desarrolla en un contexto que viene limitado por sus objetivos, que comúnmente suelen ser parte de un proyecto de investigación más amplio, el cual, a su vez, se enmarca en una disciplina científica cuyas fronteras están generalmente definidas de un modo difuso. Asimismo, la disponibilidad de técnicas instrumentales, en caso de que sean necesarias, o la capacidad de financiación del grupo de investigación en el que se realiza, son variables que la ciñen. Este último aspecto está siendo actualmente el factor decisivo a la hora de su desarrollo, con lo que su ejecución queda muchas veces limitada a las ayudas económicas que reciben por una parte el doctorando (usualmente en forma de beca de investigación y desgraciadamente cada vez en menor número) y por otra el grupo de investigación (que actualmente también están siendo recortadas) en el que aquel se encuadra. De esta manera los límites definidos por estas variables externas no pueden ser sobrepasados, con lo que muchas veces el trabajo desarrollado en las Tesis Doctorales no puede tener una continuidad y acaban cayendo, desgraciadamente, en el olvido, por lo que inicialmente se considera un ahorro mediante recortes se acaba convirtiendo, de esta manera, en una desinversión a largo plazo. 7 Por último, debo indicar que en el Apéndice A se detallan los procedimientos sintéticos, utilizados para la obtención de los diferentes productos explorados a lo largo de esta Tesis así como su caracterización estructural. Asimismo en el Apéndice B se detalla la metodología empleada para el cálculo de las diferentes áreas moleculares de los compuestos aquí sintetizados y en el Apéndice C se presenta un compendio de las diferentes técnicas instrumentales usadas a lo largo de toda la Tesis Doctoral para la caracterización y estudio de todas las moléculas aquí presentes. Debido a la variedad de las nuevas moléculas sintetizadas y, sobre todo, a las diferentes asociaciones supramoleculares que generan, hemos decidido no realizar una introducción que abarque de una manera global todos los aspectos generales de esta Tesis, sino que hemos realizado una introducción específica a la temática desarrollada en cada capítulo. Asimismo, en vez de asignar un nombre a cada una de las moléculas sintetizadas, hemos preferido nombrarlas mediante el número del capítulo en el que aparecen (en números romanos) seguido de un número ordinal, separados ambos con un guión y escritos en negrita (I-1, I-2, I-3…), favoreciendo de este manera la rápida ubicación tanto en el texto como en el apéndice sintético. I.1 BIBLIOGRAFÍA (1) Pedersen, C. J. J. Am. Chem. Soc. 1967, 89, 7017. (2) Cram, D. J.; Cram, J. M. Container Molecules and Their Guests; Royal Society of Chemistry: Cambridge, 1997. (3) Lehn, J. M. Pure Appl. Chem. 1978, 50, 871. (4) Bergmann, M. Angew, Chem. 1925, 38, 1141. (5) Seiler, P.; Dobler, M.; Dunitz, J. D. Acta Crystal. B 1974, B30, 2744. (6) Soto, V. H.; Jover, A.; Galantini, L.; Pavel, N. V.; Meijide, F.; Vázquez Tato, J. J. Phys. Chem. B 2006, 110, 13679. (7) Soto, V. H.; Jover, A.; Meijide, F.; Vázquez Tato, J.; Galantini, L.; Pavel, N. V. Adv. Mater. 2007, 19, 1752. (8) Meijide, F.; Antelo, A.; Alvarez, M.; Jover, A.; Galantini, L.; Pavel, N. V.; Vázquez Tato, J. Langmuir 2010, 26, 7768. (9) Meijide, F.; Trillo, J. V.; de Frutos, S.; Galantini, L.; Pavel, N. V.; Soto, V. H.; Jover, A.; Vázquez Tato, J. Steroids 2012, 77, 1205. (10) Manghisi, N.; Galantini, L.; Leggio, C.; Jover, A.; Meijide, F.; Pavel, N. V.; Soto, V. H.; Vázquez Tato, J.; Agostino, R. Angew. Chem. Int. Ed. 2010, 49, 6604. (11) Vázquez Tato, J.; Soto, V. H.; Trillo, J. V.; Alvarez, M.; Antelo, A.; Carrazana, J.; Jover, A.; Meijide, F. patente 2005, ES2318927A1. (12) Vázquez Tato, J.; Soto, V. H.; Trillo, J. V.; Meijide, F.; Alvarez, M.; Antelo, A.; Carrazana, J.; Jover, A.; De Frutos, S. patente 2005, ES2318922A1. (13) Alvarez, M.; Jover, A.; Meijide, F.; Galantini, L.; Pavel, N. V.; Antelo, A.; Vázquez Tato, J. Langmuir 2008, 24, 6060. (14) Álvarez, M.; Jover, A.; Meijide, F.; Galantini, L.; Pavel, N. V.; Antelo, Á.; Vázquez Tato, J. Langmuir 2009, 25, 9037. (15) Meijide, F.; Trillo, J. V.; de Frutos, S.; Galantini, L.; Pavel, N. V.; Soto, V. H.; Jover, A.; Vázquez Tato, J. Steroids 2013, 78. (16) Soto, V. H. Estructuras supramoleculares generadas por ciclodextrinas, adamantanos y ácidos biliares, Tesis Doctoral 2006. (17) Menger, F. M.; Migulin, V. A. J. Org. Chem. 1999, 64, 8916. 8 (18) Zhu, H.; Guo, J.; Yang, C.; Liu, S.; Cui, Y.; Zhong, X. Synth. Commun. 2013, 43, 1161. (19) Guo, J. W.; Zhong, X.; Zhu, H.; Feng, L. J.; Cui, Y. D. Chin. Chem. Lett. 2012, 23, 653. (20) Armstrong, M. J.; Carey, M. C. J. Lipid Res. 1982, 23, 70. (21) Vashkevich, E. V.; Yurashevich, N. Y.; Kozlov, N. G.; Potkin, V. I.; Potkina, T. N. Russ. J. Appl. Chem. (Translation of Zhurnal Prikladnoi Khimii) 2001, 74, 1892. (22) Meijide, F.; Trillo, J. V.; de Frutos, S.; Jover, A.; Vázquez Tato, J.; Soto, V. H.; Galantini, L. EDTA: Synthesis, Uses and Environmental Concerns, Nova Publishers New York, 2013 2013, Molnar, Andris, Editor, Chapter 1. (23) Antelo, A. Arquitecturas supramoleculares generadas por nuevos derivados de ciclodextrinas y ácidos biliares, Tesis Doctoral, USC 2008. (24) Menger, F. M. Proc. Nat. Acad. Sci. USA 2002, 99, 4819. 9 II SURFACTANTES DERIVADOS DE SALES BILIARES II.1 INTRODUCCIÓN Los ácidos biliares son compuestos anfipáticos de tipo esteroide (derivados del núcleo ciclopentanoperhidrofenantreno o esterano) que constituyen los principales componentes de la bilis y que derivan de la bioconversión o modificación química del colesterol en el hígado1. La formación de bilis es esencial para una normal digestión y absorción de lípidos a nivel intestinal, para la homeostasis del colesterol y para la excreción hepática de xenobióticos solubles en grasas, fármacos y metales pesados. La bilis secretada por el hígado está compuesta principalmente por aproximadamente un 67% de sales biliares, un 22% de lecitina, un 4% de colesterol libre, un 4.5% de proteínas y el resto es agua. La bilis se secreta a través de los conductos biliares hacia el intestino cuando la comida pasa desde el estómago hasta el duodeno. La gran mayoría de las sales biliares son eficientemente reabsorbidas a lo largo del intestino delgado, devueltas al hígado mediante la circulación portal y secretadas de nuevo a la bilis. Este flujo continuo de sales biliares, que está limitado a los hepatocitos, a los conductos biliares, al intestino y a la sangre portal, es denominado circulación enterohepática (figura II.1). La circulación enterohepática asegura que del total de sales biliares de un humano adulto (3-4 g) que circulan de 6-8 veces cada 24 h a través de la ruta enterohepática, únicamente se pierdan en torno a 0.5 g por día mediante excreción fecal, representando esto un 5% del total. Esta pérdida es compensada por la síntesis de nueva sal biliar hepática a partir del colesterol, representando ésta solo un 3% de la sal biliar secretada con la bilis hepática y situándose como una ruta importante para la eliminación de colesterol del cuerpo. Si en algún momento el nivel de las sales biliares presentes aumenta (por ejemplo, por la ingesta de comida) se produce una supresión de la síntesis de las sales biliares afectando esto a la ruta de eliminación del colesterol. Figura II.1.- Circulación enterohepática de las sales biliares. 10 Recientemente se descubrió que los ácidos biliares pueden actuar como hormonas y, por tanto, enlazar receptores nucleares y modular la expresión de proteínas que también repercuten en la homeostasis del colesterol.1 El colesterol es un lípido que forma parte de las membranas celulares en los vertebrados. Niveles altos de este compuesto en el plasma sanguíneo suponen un grave riesgo para la salud, siendo la causa principal de enfermedades tan peligrosas como la arteriosclerosis. El nivel adecuado de colesterol debe ser mantenido mediante un balance correcto entre su entrada y salida del organismo. La entrada de colesterol tiene dos fuentes diferentes: colesterol de origen endógeno, que es el sintetizado en el cuerpo a partir de determinados precursores, y colesterol de origen exógeno, que es el adquirido a través de la dieta. La salida de colesterol se produce principalmente mediante la excreción del mismo o mediante su transformación en otros productos en diversas rutas metabólicas. Dado que el colesterol es una molécula prácticamente insoluble en agua, la presencia de sales biliares y lecitina en la bilis es fundamental para mantener en disolución al colesterol biliar. En condiciones fisiológicas esto se logra formando agregados moleculares donde se asocian estos tres lípidos en relaciones de concentración definidas que le dan estabilidad en disolución acuosa. Estos agregados moleculares son denominados micelas mixtas (sales biliares, lecitina y colesterol) y vesículas o liposomas (lecitina y colesterol)2-3 (figura II.2). Se cree que en el canalículo biliar el colesterol es transportado casi exclusivamente en vesículas y luego, a medida que la bilis se concentra e incrementa la concentración relativa de sales biliares, predomina el transporte en estructuras micelares. El fluido biliar es más estable desde un punto de vista termodinámico cuando el colesterol presente es solubilizado en micelas mixtas. Figura II.2.- Proceso de formación de micelas mixtas (sales biliares, lecitina y colesterol). La capacidad de formación de micelas mixtas de las sales biliares con el colesterol es una de las propiedades fisicoquímicas y biológicas más importante de los ácidos biliares. Debido a su naturaleza anfipática, orientan sus regiones polares hacia la fase acuosa manteniendo sus regiones apolares alejadas de la misma creando un centro hidrófobo donde se disuelve el colesterol. El tamaño de las micelas mixtas es mayor que el de las 11 micelas de sales naturales puras, y este aumento en el área superficial de la grasa es lo que hace que sea posible su digestión por las lipasas, que de otra manera no podrían acceder al interior de los agregados lipídicos. La solubilidad del colesterol en agua puede verse incrementada en más de un millón de veces en presencia de micelas de sales biliares, y son las dihidroxílicas (como el desoxicolato sódico) las que poseen una mayor capacidad de solubilización frente a las trihidroxílicas4-5 (como el colato sódico), como se observa en la tabla II.1. Tabla II.1.- Datos experimentales de solubilización de colesterol en presencia de sales biliares en disolución acuosa obtenidos en la Tesis Doctoral de Antelo6. Las disoluciones se mantuvieron 24 horas en agitación continua a 25.0±0.1ºC y posteriormente se filtraron a través de una membrana con tamaño de poro de 0.22μm. Sal biliar Concentración/ 10-3 mol·L-1 Concentración colesterol solubilizado / 10 -3 ·mol·L -1 Colato sódico 5.99 0.39±0.06 60.20 0.91±0.10 Desoxicolato sódico 6.13 0.72±0.08 60.11 3.91±0.10 La estructura de los ácidos biliares deriva del ácido colánico que es una molécula de 24 átomos de carbono cuya base es el núcleo ciclopentanoperhidrofenantreno (tres anillos de seis miembros, A, B y C, y uno de cinco, D, todos ellos saturados), que se caracteriza por tener en el carbono 17 una cadena alifática ramificada de 5 átomos de carbono que finaliza en un grupo ácido carboxílico, así como dos metilos en las posiciones 18 y 19 (figura II.3). 17OH O 18 19 AB CD Figura II.3.- Estructura química del ácido colánico. En los vertebrados superiores el núcleo del ácido biliar esta curvado porque los anillos A y B, están en posición cis, hecho que constituye una diferenciación con respecto a algunos vertebrados inferiores donde dichos anillos se sitúan en trans, denominándose este tipo como ácidos biliares allo. En los vertebrados superiores tanto el ácido cólico como el ácido quenodesoxicólico suelen estar conjugados con los aminoácidos glicina o taurina (figura II.4). Esta conjugación aumenta la solubilidad en disolución acuosa en condiciones fisiológicas, lo que conduce a: (i) evitar su precipitación bajo las condiciones ácidas que se dan en las proximidades del duodeno y las altas concentraciones de Ca+2 en la vesícula biliar, y (ii) permitir que los ácidos biliares puedan estar en concentraciones bastante elevadas en el tracto intestinal sin atravesar las membranas celulares. Los principales ácidos biliares que existen en los vertebrados superiores, se diferencian en el número, posición y orientación (α ó β) de los grupos hidroxilo presentes en las posiciones 3, 7 y 12, y su denominación se resume en la figura II.5. La cara α es la que queda hacia la superficie cóncava de la molécula y la β la correspondiente a la convexa. 12 O N H OH OH OH COOH O N H OH OH OH SO 3 H (a) (b) Figura II.4.- Estructura del ácido cólico conjugado con glicina (a, ácido glicocólico) y con taurina (b, ácido taurocólico). CH 3 COOH CH 3 CH 3 H 1 2 345 6 7 8 9 10 11 12 13 14 15 16 17 2022 23 (18) (19) (21) (24) R 1 R 3 R 2 AB CD (a) (b) Ácido biliar R1 R2 R3 Ácido cólico OH OH OH Ácido desoxicólico OH H OH Ácido litocólico OH H H Ácido ursodesoxicólico OH(α) OH(β) H Ácido quenodesoxicólico OH(α) OH(α) H Figura II.5.-(a) Estructura química y numeración del esqueleto de un ácido biliar y (b) estructura en perspectiva. En la tabla se recoge la denominación de algunos ácidos biliares. Como hemos comentado anteriormente, las sales biliares son biosintetizadas a partir del colesterol. Esta molécula posee 27 átomos de carbono y sólo una posición hidroxilada (figura II.6), por lo que son necesarias diversas modificaciones estructurales para obtener los diferentes ácidos biliares. Esta transformación se realiza mediante un número de pasos complejos tanto en el núcleo del esteroide como en la cadena. HO Figura II.6.- Estructura del colesterol. Existen dos rutas biosintéticas que realizan esta transformación, denominadas clásica y alternativa7. La ruta clásica también es conocida como neutral, ya que los metabolitos implicados son esteroides neutrales. En este caso, la modificación del núcleo del esteroide precede a la ruptura oxidativa de su cadena lateral (figura II.7), y con ella se sintetizan el ácido cólico y el acido desoxicólico en los seres humanos. El último paso de esta ruta implica la conjugación del ácido carboxílico de la cadena lateral con los aminoácidos glicina o taurina. Por el contrario, en la ruta alternativa la oxidación de la cadena lateral del colesterol precede a la modificación del anillo esteroide, formándose así metabolitos OH 13 intermedios ácidos, con lo que esta ruta también es conocida como ruta ácida. En esta ruta el ácido quenodesoxicólico es el principal acido biliar que se forma. HO I OOH HOOH O OH OH O HOOC OH OH O HOOC OH OH H HO HOOC OH OH HO COOH OH OH III O HOOC OH O HOOC OH H HO HOOC OH HO COOH OH II IVIV V VI VII V VI VII Glico o Tauro CAGlico o Tauro CDCA I.- Hidroxilación en la posición 7α mediante la enzima colesterol 7α- hidrolasa. Esta es la etapa limitante. II.-Oxidación e isomerización (con una reductasa y una isomerasa) a una 3-ona. III.- 12α hidroxilación. IV.- Oxidación en la posición 27. V.- Saturación de los anillos A/B dando una configuración cis. VI.- Reducción de la 3- ona selectivamente a 3α-OH. VII.- Ruptura oxidativa de la cadena lateral. Se pasa de 27 a 24 átomos de carbono. Ácido cólico (CA) Ácido quenodesoxicólico (CDCA) Figura II.7.- Ruta metabólica de obtención de los ácidos biliares primarios presentes en el organismo humano. Los ácidos biliares que se obtienen a partir del colesterol se dividen en tres grupos: (i) los ácidos biliares primarios, que corresponden al ácido cólico y al ácido quenodesoxicólico, obtenidos directamente de la bioconversión del colesterol, (ii) los ácidos biliares secundarios, como son el ácido desoxicólico y el ácido litocólico, que se obtienen de la conversión de los ácidos primarios, y (iii) la modificación químicobacteriana de los ácidos biliares secundarios en el hígado o en el intestino da lugar a una serie de derivados denominados ácidos biliares terciarios, entre los que se encuentran, por ejemplo, el ácido ursodesoxicólico8, que es la forma epimérica en la posición 7 del ácido quenodesoxicólico (recuérdese la figura II.5). Cuando los ácidos biliares se encuentran en un medio de pH superior a su pKa se forman las correspondientes sales biliares, es decir que el ácido carboxílico está ionizado en forma de sal. Las sales biliares son moléculas de naturaleza anfífila (véase más adelante) que, por lo tanto, presentan propiedades surfactantes. Hay que tener en cuenta que debido al gran poder surfactante de las sales biliares, éstas pueden volverse potencialmente tóxicas, ya que todas las membranas biológicas están compuestas de una 20 II.2 MODIFICACIÓN DE ÁCIDOS BILIARES POR LA POSICIÓN 3. ANTECEDENTES EN EL ESTUDIO DE ESTOS COMPUESTOS. Una primera modificación de la estructura de los ácidos biliares para mejorar sus funciones fue llevada a cabo por la naturaleza mediante su unión por el extremo de la cadena lateral (posición 24) a los aminoácidos glicina y taurina, tal y como ya hemos comentado anteriormente. Otras modificaciones que se producen en el organismo son, por ejemplo, la 7α-deshidroxilación para obtener los ácidos biliares secundarios desoxicólico y litocólico (que tienen mejor capacidad de formación de micelas mixtas en presencia de lípidos y colesterol) y la hidroxilación en 3β (en lugar de la posición 3α) que da lugar a colestasis (detención del flujo de bilis hacia el duodeno, lo que provoca ictericia. A pesar del elevado número de publicaciones en las que están presentes los ácidos biliares cabe destacar la ausencia de estudios sistemáticos conducentes a analizar los efectos que una modificación del balance hidrófilo-hidrófobo de las sales biliares naturales pueda tener en sus propiedades asociativas. Los ácidos biliares naturales tienen una gran tendencia a la autoasociación, originando diferentes estructuras como pueden ser por ejemplo micelas16, fibras31, geles32 y/o nanotubos33. Es de esperar, por lo tanto, que su modificación química tenga consecuencias sobre sus características asociativas incluyendo la morfología de los agregados formados, siendo a priori este último aspecto difícil de predecir. Analicemos entonces en este apartado algunas modificaciones estructurales que se han realizado previamente dentro de nuestro grupo de investigación con la filosofía general de mantener la cadena lateral de la sal biliar y aumentar la hidrofobia uniendo un sustituyente de marcado carácter hidrófobo por la posición 3. La secuencia sintética implica un cambio en la conformación de esta posición, pasándose de ser 3α en la sal biliar de partida a 3β en el derivado sintetizado. Uno de los primeros derivados obtenidos siguiendo esta estrategia ha sido el resultante de la unión de un grupo adamantilo a la posición 3 del ácido cólico por medio de un enlace amida (compuesto II-1, figura II.13a). II-1 (a) (b) Figura II.13.- (a) Estructura del compuesto II-1 (b) Imagen TEM de una muestra del compuesto II-1 en disolución acuosa a 25 ºC. Este nuevo compuesto posee una cac (concentración crítica de agregación) unas cuarenta veces inferior con respecto al colato sódico20, con lo que se mejora notablemente la capacidad surfactante de la sal biliar de la que deriva. Mediante estudios de dispersión de luz dinámica se observó la formación de agregados muy grandes en disolución acuosa, cuya estructura fue determinada mediante medidas de TEM y de SAXS. Estas técnicas corroboraron la formación de una fase laminar con una separación interlaminar promedio igual a 7.4±0.3 nm (figura II.13b), siendo ésta la primera vez que se describe una O O OHOH H N Na O 21 estructura de este tipo para un derivado de una sal biliar. Asimismo en colaboración con el grupo de investigación del profesor J. J. G. Marín de la Universidad de Salamanca34 se ha comprobado que este nuevo derivado inhibe el transporte de ácido taurocólico por OATP1B1, un miembro de la familia de polipéptidos transportadores de aniones orgánicos (OATP) al que pertenecen los transportadores implicados en la absorción de faloidina por hepatocitos. La faloidina es la toxina del hongo amanita phalloides responsable del 20% de las muertes en adultos intoxicados y del 50% en niños. Una incorporación similar a la del adamantilo por el grupo p-tert-butilfenilo (compuesto II-2, figura II.14) da lugar a un derivado del ácido cólico con una cac de 4×10-4 M,35 que es del orden de 50 veces menor que el del colato sódico. O O OHOH H N Na O II-2 Figura II.14.- Estructura del derivado p-t-butilfenílico del ácido cólico, II-2. Mediante imágenes TEM se determinaron las estructuras que se generan en disolución acuosa, pudiéndose observar un proceso de transformación de vesículas en tubos moleculares a lo largo del tiempo (figura II.15). (a) (b) (c) (d) Figura II.15.- Imágenes TEM obtenidas de una disolución 7 ×10-3 M del compuesto II-2 donde se observa el proceso de transformación de vesículas en tubos moleculares: a) vesículas, b) rosarios, c) estructuras tubulares, d) tubos moleculares. Tiempo transcurrido: 0, 42, 66 y 96 horas respectivamente. Al final del proceso, la mayoría de los tubos tienen una pared sencilla aunque también se detectaron algunos de doble pared. Los diámetros externos medidos en las imágenes realizadas proporcionan un valor medio de 449±36 nm, valor que es del orden de 9 veces mayor que el de los tubos formados por el litocolato sódico (figura II.16), 22 hasta ahora la única sal biliar libre que forma tubos moleculares,36-39 lo que parece ser debido al mayor carácter hidrófobo que el de las sales biliares di- y trihidroxílicas. Figura II.16.- Imagen crio-TEM de nanotubos de litocolato sódico en agua36. La barra representa 100 nm. El mecanismo de formación que se propuso para la formación de tubos moleculares a los que dio lugar el derivado del colato II-2 consiste en que una vez formadas las vesículas iniciales, éstas se aproximan originando rosarios de longitud bastante uniforme. Las vesículas se fusionan entre sí en el sentido longitudinal, originando una estructura tipo cacahuete (o unduloide) en la que todavía se puede distinguir cada vesícula. Tal fusión tiene lugar simultáneamente en los dos extremos de la cadena, lo que hace que este sistema sea realmente inusual. Este mecanismo se ve favorecido por el bajo valor de la constante de curvatura efectiva, que implica que la membrana de la vesícula tiene una gran fluidez. A partir de las medidas geométricas realizadas sobre los radios de las vesículas y de las estructuras tubulares se deduce que el proceso de fusión sucede conservando el área superficial y el volumen encerrado en el agregado. Finalmente, las estructuras tubulares tienden a ordenarse de un modo paralelo, permitiendo una fusión lateral que culmina con la formación de los tubos moleculares. La figura II.17 resume esquemáticamente todo el proceso de formación comentado.35 Figura II.17.- Resumen esquemático del proceso de agregación del compuesto II-2 en disolución acuosa, deducido a partir de las imágenes TEM de la cinética del proceso, y que comprende los siguientes pasos: (1) vesículas aisladas; (2) vesículas en proceso de agregación en forma de collar de perlas; (3) túbulos originados por la agregación de las vesículas; (4) tubos formados a partir de túbulos de menor diámetro. En un siguiente paso se incorporó este mismo grupo p-t-butilfenilo al ácido desoxicólico (compuesto II-3, figura II.18). La similitud entre II-2 y II-3 unida al hecho de que el desoxicolato sódico en determinadas condiciones da lugar a la formación de superhélices a derechas y agregados cilíndricos40 (responsables éstos de que este compuesto gelifique17,32,41) sugeriría a priori la formación también de tubos moleculares. Los estudios realizados pusieron de manifiesto, efectivamente, que II-3 también forma tubos moleculares42, si bien el mecanismo de formación es diferente al del derivado II-2. Las imágenes TEM muestran que en las etapas iniciales se forman láminas planas, que 23 son precursoras de cintas helicoidales, que se acaban transformando en tubos (figura II.19). El valor medio de su diámetro externo resultó ser de 546±59 nm, algo superior al del análogo II-2. II-3 Figura II.18.- Estructura del derivado p-t-butilfenílico del ácido desoxicólico, denominado II-3. (a) (b) (c) (d) (e) Figura II.19.- Imágenes TEM obtenidas a diferentes tiempos en una disolución 2.79×10-3 M del compuesto II-3 a 25ºC: (a) cintas planas a las 24-48 horas; (b) cintas helicoidales a los 2-4 días; (c) cintas helicoidales a los 4-6 días, y (d) tubos moleculares a los 7 días. (e) Esquema representativo del proceso de formación de tubos moleculares para el compuesto II-3. N H OH O O O Na 1000 nm 1000 nm 1000 nm 1000 nm1000 nm 24 Por otra parte, el valor de la cac obtenido para este derivado fue de 4.5×10-5 M, es decir, 130 veces menor que la concentración a la que comienza la agregación del desoxicolato sódico,16 sal biliar de la que deriva. Se vuelve a comprobar cómo un aumento de la hidrofobia en la sal biliar modificada mejora la capacidad surfactante. Chung et al43 observaron que conforme envejecían las muestras de colesterol se producía un acortamiento del paso de hélice en las cintas. En la figura II.20a se definen los parámetros característicos de una cinta helicoidal, y en la figura II.20 se representan las medidas del paso de hélice frente al diámetro de las hélices en función del tiempo de maduración de las disoluciones de II-3. Se observa poca diferencia entre los tiempos iniciales de plegamiento y los más avanzados, aunque se pueden agrupar en dos poblaciones donde se manifiesta una disminución del paso de hélice. De las pendientes de la figura II.20b se obtiene un ángulo de avance medio de 39º a tiempos cortos y de 26º a tiempos largos de maduración. Además, en la figura II.20c se observa que al madurar, las hélices presentan un aumento acusado en el ancho de cinta. (a) (b) (c) Figura II.20.- (a) Geometría de una cinta helicoidal. ρ, radio de la hélice; ψ, ángulo de avance; P, paso de hélice; ω, ancho de la cinta; δ, ancho a lo largo del eje z. (b) Representación del paso de hélice frente al diámetro de las cintas que se forman en una disolución de II.3 4.65×10-3 M en D2O a 37ºC después de 90 minutos y 4-6 horas a esa temperatura. Sólo se hicieron medidas sobre las hélices más regulares y con más de dos bucles. (c) Evolución del ancho de las cintas en función del tiempo de envejecimiento frente al paso de hélice: (●) 90 minutos, (●) 4-6 horas. La formación de tubos moleculares a partir de cintas (intermedios metaestables) implica una de las dos rutas siguientes: 1. Acortamiento del paso de hélice manteniendo constante la anchura de las cintas (figura II.21a). 2. Ensanchamiento de las cintas manteniendo constante el paso de hélice (figura II.21b).44 ρ ω δ= ω/cosψ ψ P= 2πρtanψ z x y ρ ω δ= ω/cosψ ψ P= 2πρtanψ z x y 050 100 150 200 250 300 350 400 450 0 100 200 300 400 500 600 700 800 900 1000 1100 Paso de hélice( P) / nm Diámetro ( 2·ρ) / nm 400 500 600 700 800 900 1000 120 140 160 180 200 220 240 260 280 300 320 340 360 380 400 420 Ancho de cinta (ω) / nm Paso de hélice (P) / nm 25 Figura II.21.- Representación de los mecanismos de formación de tubos moleculares a partir de hélices cuando el tubo se forma: (a) por un cambio en el paso de hélice, y (b) por un crecimiento del ancho de cinta. 44 Del análisis de las gráficas anteriores se puede decir que los dos mecanismos propuestos en la figura II.21 contribuyen a la formación de los tubos moleculares, aunque el mecanismo que transcurre a través de un cambio en el ancho de la cinta parece tener mayor peso. II.3. ESTUDIO DE LOS DERIVADOS p-t-BUTILFENÍLICOS DE LOS ÁCIDOS URSO- Y QUENODESOXICÓLICO. La formación de tubos moleculares por parte de derivados de sales biliares nos hace pensar que en el empaquetamiento helicoidal hay implicados ángulos de torsión entre moléculas vecinas de diferente magnitud porque al tener diferentes grupos hidroxilo los enlaces de hidrógeno responsables de aquellos (junto a las fuerzas de interacción hidrófobas) son diferentes. Al transmitirse el requerimiento espacial de los enlaces de hidrógeno (distancias y ángulos de enlace) de forma helicoidal en las tres dimensiones espaciales se obtendrán tubos con diferente diámetro. Por lo tanto, esta hipótesis de partida de que los requerimientos de formación de enlaces de hidrógeno conducirán a diámetros probablemente diferentes de los obtenidos por los derivados anteriores (tabla II.5) está presente en el diseño, síntesis y estudio de los derivados II-4 y II-5. Son éstos los derivados p-t-butilfenílicos de los ácidos urso- y quenodesoxicólico, respectivamente, y se caracterizan por suponer modificaciones en el número de grupos hidroxilo respecto a II-2 y en la posición y orientación de los mismos respecto a II-3 (figura II.22). Según la hipótesis establecida, podrían llegar a diseñarse derivados de sales biliares que originasen tubos con tamaños adecuados para diferentes ajustes finos en la encapsulación (compatibilidad de tamaños) de huéspedes de tamaño submicrométrico (mesoescala). A este respecto, Shimizu et al45 han publicado la encapsulación de ferritina con carga negativa por un tubo lipídico de glucopiranosilamina con una carga interior positiva. Tabla II.5. Diámetros de los tubos moleculares formados por el litocolato sódico y los compuestos II-2 y II-3. compuesto litocolato II-2 II-3 d (nm) 50 450 546 (a) (b) (a) (b) 26 O ONa R 12 HN O 3 7 12 24a 24b R 7 AB CD 25 26 R7=α OH R12= α OH II-2 R7=H R12= α OH II-3 R7= β OH R12=H II-4 R7= α OH R12=H II-5 Figura II.22.- Derivados p-t-butifenílicos de sales biliares naturales. Los compuestos II-4 y II-5 son los que se estudian en este apartado. Debemos comentar que habíamos diseñado igualmente el derivado p-t-butilfenílico del ácido litocólico; sin embargo, no resultó adecuado ya que no daba origen a estructuras tubulares aun habiendo probado multitud de condiciones experimentales de concentración, pH, temperatura y tiempo de maduración de las disoluciones. La primera magnitud a determinar en compuestos surfactantes es su cac. Para ello, realizamos medidas de tensión superficial, γ, utilizando el método del plato de Wilhelmy. La figura II.23 recoge los datos experimentales obtenidos y representados en forma de la tensión superficial frente al logaritmo neperiano de la concentración del derivado en forma de sal sódica a una temperatura de 25ºC. Esto último se logra preparando las disoluciones de los compuestos II-4 y II-5 en una disolución tampón de carbonato/bicarbonato sódico de concentración total 0.015 M (pH ≈ 10.25). (a) (b) Figura II.23.- Representación gráfica de la tensión superficial, γ, frente al logaritmo neperiano de la concentración para los compuestos (a) II-4 y (b) II-5 en disolución tampón de carbonato/bicarbonato sódico de concentración total 0.015 M a 25ºC. Las dos representaciones de la figura ponen de manifiesto el comportamiento habitual con dos regiones lineales, una de descenso acusado de la tensión superficial que corresponde a la zona de concentración donde sólo existen monómeros (y refleja la adsorción del surfactante en la interfase disolución-aire), y otra donde el descenso es poco acusado o nulo y que indica que la interfase se encuentra saturada y tiene lugar la formación agregados del surfactante (que no son superficialmente activos). El punto de corte de ambas rectas corresponde a la concentración crítica de agregación, cac, y sus valores se recogen en la tabla II.6. 27 Tabla II.6.- Parámetros deducidos de los experimentos de tensión superficial para la agregación y adsorción en la interfase aire-agua de los compuestos II-4 y II-5. 105cac (M) 106 Γ (mol m-2) a0 (Å2) II-4 5.1 3.08 54 II-5 2.2 2.15 77 Los valores de la cac que hemos obtenido para los nuevos surfactantes son mucho menores que los correspondientes a las sales sódicas de los ácidos biliares naturales de los que derivan. Así, para el ursodesoxicolato sódico se han publicado valores de cac en el rango de 5-10×10-3 M46-47 y para el quenodesoxicolato sódico de 2-4×10-3 M,46,48-49 lo que nos lleva a concluir que la presencia del grupo hidrófobo p-t-butilfenilo aumenta las propiedades surfactantes de estos derivados de sales biliares. Los datos experimentales de la figura II.23 correspondiente a los nuevos derivados fueron analizados según la isoterma adsorción de Gibbs.50 Para un surfactante electrólito fuerte formado por ν+ iones positivos y νiones negativos, de cargas iónicas z+ y z-, respectivamente, la concentración superficial en exceso, Γ, viene dada por: s c Cd d RTn       −=Γ ln 1 γ Ecuación [II.1] donde C es la concentración de surfactante, Cs la concentración de sal inerte añadida, R la constante de los gases ideales, T la temperatura absoluta y n un factor que depende de la estequiometría y de las concentraciones del surfactante y de la sal añadida:51 C C n s s ++ + − + += νν ν ν 2 Ecuación [II.2] En esta última expresión νS+ es el coeficiente estequiométrico del catión de la sal inerte añadida. En el caso de realizarse medidas en agua libre de electrolito el factor n se ve simplificado a n= ν+ + ν-. Por otra parte, cuando el electrolito está presente, pero su concentración es bastante mayor que la del surfactante (Cs>>C), resulta que n = ν-. Esta es la situación ante la que nos encontramos y, por lo tanto, n = 1. De esta manera la ecuación II.1 se transforma en: s c Cd d RT       −=Γ ln 1 γ Ecuación [II.3] La concentración C se refiere a concentraciones de surfactante en la región donde solo hay monómeros que es donde se aplica la ecuación de Gibbs, y el análisis de los datos correspondientes a esta región de las dos gráficas de la figura II.23 permite obtener la concentración superficial de exceso para los dos nuevos surfactantes. Los valores se recogen en la tabla II.6. A partir de ellos se puede calcular ahora el área por molécula en la interfase, a0, por medio de la conocida ecuación: ( ) )/(10 202 0A Na Γ=Α  Ecuación [II.4] 28 donde NA es el número de Avogadro. Los valores obtenidos de a0 se recopilan también en la tabla II.6. Carey et al48 han publicado valores para las áreas superficiales del ursodesoxicolato sódico y quenodesoxicolato sódico de 88 y 85 Å2 respectivamente, lo que indica que las moléculas de surfactante se disponen horizontalmente en la interfase aire-agua con los grupos polares dirigidos hacia la disolución ya que las medidas de las dimensiones teóricas de la molécula a partir de modelos moleculares arrojan valores de entre 85-95 Å2 por molécula.48 Si los nuevos derivados sintetizados se situaran de igual manera en la interfase se esperarían unas áreas más grandes, ya que la incorporación del grupo p-t-butilfenilo y del puente amida a la posición 3 del esqueleto esteroide supone un aumento apreciable del área de la molécula. Pueden realizarse aproximaciones razonables a las áreas superficiales, a0, a partir de la resolución de estructuras cristalinas. Por este motivo, recristalizamos la forma ácida del compuesto II-5 en tolueno. La metodología empleada para el cálculo del área que ocupa la molécula en la interfase aire-agua se presenta en el apéndice B, por lo que no profundizaremos aquí en su obtención. La figura II.24 muestra el área ocupada por la molécula si se dispusiera perpendicular y paralela respectivamente al plano horizontal definido por los átomos de carbono C1/C6-C17/C20 (es decir, los anillos B, C y D del esqueleto de la sal biliar), tal y como se explica en el apéndice B. (a) (b) Figura II.24.- Áreas teóricas del compuesto II-5 cuando la molécula se dispone en posición (a) perpendicular o (b) paralela al plano horizontal definido por los átomos de carbono C1/C6-C17/C20. Las orientaciones que hemos definido corresponden aproximadamente a que la molécula de surfactante se coloque de forma vertical u horizontal en la interfase, de manera que la molécula ocuparía áreas aproximadas de 66.2 Å2 y de 149 Å2 respectivamente. Si se comparan estas estimaciones con los datos obtenidos mediante las medidas experimentales de la tensión superficial mostradas en la tabla II.6, podemos concluir que el compuesto II-5 forma una monocapa en la interfase aire-disolución con la cadena lateral polar hacia la fase acuosa mientras que el grupo hidrófobo p-t-butilfenilo se encuentra en la dirección contraria (figura II.25). Hemos intentado recristalizar el compuesto II-4, pero aunque se probaron multitud de disolventes y diferentes métodos de cristalización no hemos podido obtener sus cristales. Sin embargo, la similitud estructural entre ambos derivados y el también 29 pequeño valor de a0 obtenido para el compuesto II-4, permite sugerir que la disposición en la interfase aire-agua deducida para II-5 es también válida para II-4. (a) (b) Figura II.25.- (a) Representación molecular de la disposición en la interfase aire-agua del compuesto II-5; (b) ilustración esquemática de la misma disposición. La diferente orientación en la interfase de las sales biliares constituyentes de estos dos derivados (queno y ursodesoxicolato), que recordemos era de manera horizontal, respecto a los nuevos derivados sintetizados se puede atribuir a: (i) el incremento de la superficie hidrófoba, y (ii) a la sustitución del grupo hidroxilo del carbono 3 con una orientación α por un grupo amida con una orientación β. De esta manera, las superficies hidrófilas en los nuevos derivados no son suficientemente grandes para que las moléculas se sitúen horizontales en la interfase aire-agua. Este hecho se asemeja al producido en el caso del litocolato sódico (con un solo grupo hidroxilo), que se coloca de manera vertical, mientras que las sales biliares di- y trihidroxílicas (como el colato y el desoxicolato) se disponen de manera horizontal en la interfase.13 Para obtener una información inicial acerca de la naturaleza de los agregados, recurrimos en primer lugar a la técnica de fluorescencia en estado estacionario en presencia de pireno como molécula sonda añadida a las disoluciones de los nuevos surfactantes. La característica espectral que se analiza es la relación entre las intensidades de los picos vibracionales 1 y 3 (I1/I3) de la sonda que, como bien se sabe, es muy sensible a la polaridad del medio52 (tabla II.7). Los valores obtenidos serán indicativos, por lo tanto, del carácter más o menos polar del microentorno donde el pireno se encuentre incorporado, empleándose esta sonda con muchísima frecuencia para obtener información sobre las micelas formadas por los surfactantes, incluyéndose las de sales biliares32 (piénsese en las diferencias entre un medio acuoso y el interior marcadamente apolar de una micela). Los valores de I1/I3 son dependientes de la arquitectura o morfología concreta que presenten dichos agregados, ya que no siempre son micelas. Tabla II.7. Valores de la relación de intensidades I1/I3 del espectro de fluorescencia del pireno en disolventes de diferente polaridad. disolvente H2O CH3CN CH3OH n-butanol clorobenceno hexano ciclohexano I 1 /I 3 2 1.85 1.33 1.02 0.92 0.61 0.60 En las figuras II.26a y II.26b se representa la variación de I1/I3 frente a la concentración de los compuestos II-4 y II-5, respectivamente. 36 equilibrio. Para su cálculo se necesita conocer el volumen de la cola del surfactante, su longitud y el área de equilibrio por molécula en la superficie del agregado. Esta área por molécula es un dato termodinámico,62 que se obtiene a partir de consideraciones de equilibrio, pero no es una variable que esta simplemente ligada a la forma y tamaño de la cabeza polar del surfactante. Tal y como recoge Nagarajan,62 la idea predominante es que esta cabeza polar determina el área de equilibrio por molécula en la superficie del agregado, y el papel de la cola apolar del surfactante prácticamente se ha ignorado en la bibliografía. La tendencia de surfactantes con dos cadenas alquílicas como los fosfolípidos para formar vesículas (esféricas o cilíndricas) y bicapas queda reflejada en que los valores del parámetro de empaquetamiento son cercanos a la unidad. Por otro lado, la proximidad de los valores de las áreas determinadas por medidas de tensión superficial (tabla II.6), que no dejan de ser valores termodinámicos, y los obtenidos a partir de la resolución cristalina del surfactante (figura II.32), nos indica que las restricciones impuestas por la geometría hidrófoba en forma de cilindro de estos surfactantes, limitan el grado de empaquetamiento en estas estructuras y no las interacciones cabeza-cabeza como ocurre en los surfactantes clásicos. Esto es equivalente a decir que el parámetro de empaquetamiento es muy cercano a la unidad. Por lo tanto: (i) el mayor diámetro de la región hidrófoba de estos p-t-butilfenilderivados en comparación con los surfactantes con una cadena alquílica, (ii) la imposibilidad de formar pequeños agregados sin dejar grandes áreas apolares expuestas al disolvente, y (iii) un parámetro de empaquetamiento próximo a uno, nos indican que la geometría del empaquetamiento de estos agregados debería ser similar a la de aquellos surfactantes con dos cadenas alquílicas, esto es, que originarían estructuras planas o cuasi planas, como son los cilindros moleculares con diámetros grandes que realmente se han puesto de manifiesto mediante TEM (figura II.27). Cuando se determina el espesor de la pared de estructuras curvas (como vesículas y tubos) a partir de imágenes TEM, hay que tener en cuenta que la fracción de electrones dispersada depende (entre otros efectos visuales) de las longitudes proyectadas de la estructura en la superficie plana sobre la cual se deposita la muestra, ya que cuando los electrones atraviesan la muestra recorren diferentes espesores debidos a la curvatura de la pared; y cuanto mayor sea el espesor, más oscura será la imagen. Este fenómeno ha sido explicado perfectamente para el caso particular de las vesículas.63 El espesor proyectado de una corona cilíndrica es similar al de una vesícula. Desde el radio externo hacia el centro del tubo, la proyección del espesor de la corona se incrementa bruscamente alcanzando un máximo en el radio interior. Desde este punto la proyección del espesor de la corona disminuye hasta alcanzar un mínimo en el centro del tubo (figura II.33). Las consecuencias de esto son: (i) la medida del diámetro externo de un tubo es fácil de medir siempre y cuando el contraste sea fuerte, (ii) la determinación del diámetro interno se vuelve imprecisa ya que el contraste es menor, (iii) el espesor aparente de la corona, ζaparente, es significativamente mayor que el espesor real, ζreal, y (iv) el efecto es menor para radios más grandes de la superficie y espesores más pequeños de la pared. Por lo tanto, obtener medidas precisas es difícil y los resultados se tienen que considerar como estimaciones. Si aceptamos que la proyección del borde interior del tubo se hace distinguible cuando la oscuridad de la corona es dos veces el nivel de fondo (hemos adoptado este criterio después de observar un elevado número de tubos superpuestos, hecho que es bastante común en las imágenes TEM de este tipo de sistemas), seremos capaces de estimar el espesor real de la corona mediante la modelización de diferentes proyecciones. Por ejemplo, para un tubo de radio 49 nm (valor medio para los tubos del compuesto II-4) con ζreal 5 y 10 nm, ζaparente sería de 8 y 17 nm respectivamente. Siguiendo 37 este procedimiento, para un valor experimental de ζaparente de 14.4 nm (27 tubos examinados), hemos estimado que ζactual es igual a 8±2 nm (casi la mitad de la aparente) para el espesor de la corona de los tubos de II-4. El espesor de una capa formada por la disposición de moléculas paralelas apiladas, tal y como discutimos para la interfase aireagua, debería ser de aproximadamente 3 nm y, consecuentemente, el espesor de una bicapa sería alrededor de 6 nm, en buena concordancia con el espesor calculado de la pared de los tubos. Figura II.33.- Proyección del ancho de la corona de una vesícula esférica de 4 nm de ancho para coronas esféricas de (a) 80 nm de radio interno y (b) 20 nm de radio interno. Nótese que la longitud proyectada es máxima en el radio interno de la corona y que la proyección va disminuyendo poco a poco hacia el interior de la vesícula. Estos argumentos permiten proponer una estructura en forma de bicapa para las paredes de los tubos. Tubos moleculares de pared múltiple (por ejemplo, a partir de laminas planas enrolladas sobre sí mismas)33 han sido obtenidos para otros derivados de sales biliares.33,64 En la bibliografía está descrita también la coexistencia entre tubos de pared múltiple con tubos de una única pared, y la transformación con el tiempo de los primeros hacia tubos de una pared.33,64 Estos hechos son probablemente debidos a los diferentes mecanismos que se observan para la formación de los tubos moleculares de los derivados de ácidos biliares.33,35,42,64-65 Tal y como ya mencionamos anteriormente, los tubos moleculares cargados podrían alojar en su interior huéspedes con el tamaño y la carga adecuados. Para elegir un huésped adecuado para el compuesto II-4 tenemos que tener presente dos hechos. En primer lugar, que el diámetro de los tubos que genera son de aproximadamente 100 nm y, en segundo lugar, que los tubos están cargados negativamente. Por este motivo, hemos elegido un látex de poliestireno modificado en forma de amina. Se trata de una dispersión acuosa comercial al 2,5% con un tamaño medio de partícula de 50 nm, que parece adecuado a las dimensiones de los tubos. Por otro lado, esperamos que los grupos amino al pH de trabajo (10.25) estén parcialmente protonados, con lo que las interacciones electrostáticas entre el huésped y el hospedador favorecerán el proceso.66 Como paso previo al estudio de la inclusión, observamos al microscopio electrónico la dispersión resultante de diluir 100 veces el látex comercial. De esta manera, no sólo tendremos una guía para decidir qué concentración de látex puede ser adecuada para diseñar los experimentos siguientes, sino que también comprobaremos el tamaño de las partículas. La figura II.34 recoge dos imágenes representativas, que muestran una buena monodispersidad de partículas esféricas con un tamaño medio que reproduce el especificado. Así, hemos llevado a cabo dos tipos de experimentos: 38 1º) A una disolución de tubos del compuesto II-4 con una concentración 3×10-3 M a 25oC le agregamos la cantidad necesaria de látex para que quede 1000 veces diluido respecto al original. De esta manera podremos comprobar si las partículas son capaces de penetrar en el interior de los tubos. 2º) La cantidad necesaria de látex (para lograr la misma dilución del experimento anterior) la agregamos en el momento de preparar la disolución 3×10-3 M del compuesto II-4, es decir, con anterioridad a la formación de los tubos moleculares del derivado de la sal biliar. Figura II.34.- Imágenes TEM de la dispersión comercial de látex diluida 100 veces. En ambos casos tomamos imágenes TEM después de 1, 3 y 14 días, no habiendo diferencias significativas entre los resultados de los dos procedimientos de trabajo. Las partículas esféricas de látex aparecen localizadas fuera de los tubos, en sus paredes exteriores, en los extremos de los mismos y sólo algunas en el interior de ellos (figura II.35). Figura II.35.-Imágenes TEM representativas de los experimentos de encapsulación de látex en tubos del compuesto II-4. Las flechas indican la presencia de látex en el interior de los tubos. 200 nm 500 nm 39 Estos resultados sugieren que la superficie externa de los tubos está cargada negativamente, lo cual fue comprobado mediante medidas de movilidad electroforética en tubos cataniónicos formados por mezclas binarias de derivados de ácidos biliares.65 La estructura de bicapa que hemos propuesto para las paredes de los tubos moleculares de II- 4 implica que la parte interna del tubo también esté cargada negativamente y las partículas esféricas de látex deberían también observarse en el interior de los mismos. El hecho de que sólo hayamos encontrado un número pequeño de partículas de látex en el interior de los tubos se puede entender como un factor de probabilidad, ya que la superficie lateral de los tubos es mucho más grande que la de los extremos abiertos. La interacción electrostática favorable entre el tubo y las partículas de látex previene que estas se desplacen hacia otras localizaciones. II.4. ESTUDIO DE UN DERIVADO CATIÓNICO DEL ÁCIDO CÓLICO CON UN GRUPO NAFTILO UNIDO POR LA POSICIÓN 3. Todos los derivados que hemos sintetizado y estudiado hasta este momento son derivados aniónicos de sales biliares, y en este momento planteamos la síntesis y caracterización fisicoquímica de un derivado catiónico. En comparación con los derivados aniónicos, el estudio de la agregación en disoluciones acuosas por parte de los derivados catiónicos de sales biliares ha sido mucho más escaso y, en general, el tamaño, la morfología de estos agregados, y el mecanismo por el que se forman son prácticamente desconocidos. Sin embargo, la elevada funcionalidad que presentan nos permite el diseño de diferentes derivados catiónicos.65,67 Pueden darse numerosos motivos para justificar el interés de la síntesis y la caracterización de este tipo de derivados. Por ejemplo la interacción entre el ADN y surfactantes catiónicos ha sido objeto de una enorme atención en la última década y, por ende, el interés científico de este tipo de estudios que se desarrollan con los derivados catiónicos de las sales biliares probablemente despegue en un futuro no muy lejano. La importancia de estos derivados también radica en que se han obtenido algunos derivados catiónicos esteroideos que actúan como antibióticos68-69 que mimetizan las propiedades de la escualamina (un antibiótico natural que se aísla de la mielga*)70 y el péptido polimixina B. Finalmente, algunos derivados catiónicos obtenidos por Maitra et al (figura II.36) son excelentes agentes gelificantes.71-74 Figura II.36.- Estructuras químicas de derivados catiónicos de sales biliares sintetizados por Maitra et al.73- 74 Por otra parte, las mezclas cataniónicas son muy interesantes debido a sus potenciales aplicaciones prácticas.75-76 El término mezcla cataniónica, que se refiere a la mezcla de dos surfactantes cargados de manera opuesta; fue acuñado en 1987 por Jokela et al,77 si * La mielga (Squalus acanthias) es un pequeño tiburón de la familia Squalidae que puede llegar a medir 1.25 metros; posee un cuerpo estilizado con espinas venenosas y muy afiladas en las aletas dorsales. 40 bien tales mezclas de surfactantes se habían estudiado con anterioridad a esa fecha. La figura II.37 nos muestra el creciente interés en este campo cuando el término cataniónico se introduce en el programa de búsqueda Scifinder y refleja la potencialidad de aquel. 88/90 91/93 94/96 97/99 00/02 03/05 06/08 09/11 0 20 40 60 80 100 120 140 160 número de publicaciones año Figura II.37.- Número de publicaciones que incluyen el término “cataniónico” durante el período comprendido entre 1988 y 2011 usando el programa de búsqueda Scifinder. La terminología también ha evolucionado durante los años, y hoy no sólo uno, sino dos términos describen mezclas de surfactantes cargados de manera opuesta: (i) las mezclas cataniónicas y (ii) los anfífilos de par iónico (IPA’s), cuyo término lo utilizó por primera vez Fukuda et al78 en 1990. Durante los primeros años hubo cierta confusión acerca del significado de los dos términos, pero hoy en día se está de acuerdo en que la diferencia radica en que los contraiones de los dos surfactantes se han eliminado en los IPA’s, mientras que coexisten en una mezcla cataniónica. Las sales biliares naturales, cargadas negativamente, se han mezclado con surfactantes de cadena larga con carga positiva. Este es el caso del desoxicolato sódico y el bromuro de cetiltrimetilamonio, mezcla estudiada por Manna y Panda,79 quienes se percataron de la fuerte sinergia existente entre surfactantes cargados opuestamente. De una manera similar, Manna et al80 estudiaron mezclas cataniónicas formadas por bromuros de trimetilamonio con cadenas largas (CnTABr, donde n = 12,14 y 16) y colato y desoxicolato sódicos. Liu et al81 han observado que con una proporción equimolar de la mezcla cataniónica del ácido litocólico (LCA) y el hidróxido de tetradecil- y cetiltrimetilamonio se produce la formación de vesículas unilaminares. En el caso del tetradecil-trimetilamonio (TTAOH) las vesículas se transforman en tubos a las pocas horas de preparar la muestra, siendo este proceso reversible cuando se aumenta la temperatura (figura II.38a). Cuando se usa cetil-trimetilamonio (CTAOH) las vesículas se convierten en cintas helicoidales después de varios días (figura II.38b). También se ha estudiado la influencia de los ácidos cólico y desoxicólico en las propiedades de los sistemas surfactantes cataniónicos sin la presencia de sales.82-83 Por otro lado, las sales biliares pueden jugar papeles importantes en la agregación de los sistemas de los surfactantes cataniónicos, tales como el aumento del área media de la cabeza del surfactante.84 Hasta donde sabemos, sólo se ha estudiado una única mezcla cataniónica formada exclusivamente por derivados de sales biliares. El estudio ha sido llevado a cabo por Manghisi et al,65 quienes emplearon dos derivados p-t-butilfenílicos del colato de sodio con carga opuesta (figura II.39). Su síntesis ha sido desarrollada en nuestro grupo de 41 investigación (uno de ellos se corresponde con el compuesto II-2). Esta mezcla forma tubos a concentraciones (≈8×10-4 M) a las que cada uno de los derivados por sí mismo no lo hace, y la carga de aquellos puede ser controlada con la proporción de los derivados catiónico y aniónico. (a) (b) Figura II.38.- (a) Formación de vesículas y su posterior transformación en tubos en la mezcla LCA/TTAOH, y (b) formación de vesículas y su transformación en cintas helicoidales en la mezcla LCA/CTAOH, observadas por Liu et al.81 Figura II.39.- Derivados del colato sódico que forman la mezcla cataniónica estudiada por Manghisi et al65 que da lugar a la formación de tubos moleculares. A la izquierda se puede ver el derivado aniónico (II- 2) y a la derecha el derivado catiónico. Como ya hemos dicho, se conocen diferentes mecanismos en la formación de tubos moleculares por parte de derivados hidrófobos de sales biliares cargados negativamente.35,42,64,85 Sin embargo, para los derivados cargados positivamente, ni se ha descrito la formación de estas estructuras ni, por supuesto, el mecanismo de su formación. Como hemos visto en el apartado anterior, se sabe que tanto la estructura del grupo hidrófobo como el número y localización de los grupos hidroxilo en el núcleo esteroide tienen influencia tanto en los mecanismos de formación de los tubos como en sus diámetros resultantes. Sin embargo, aun no es posible realizar predicciones y cada nuevo derivado precisa de una caracterización completa. Con mayor motivo sucede esto para los derivados catiónicos, por lo que el siguiente objetivo planteado fue el estudio de la agregación en agua y de la morfología de los agregados formados por un compuesto de este tipo, el II-6 (figura II.40), cuya síntesis se detalla en el apéndice A. Se ha elegido este derivado porque recientemente ha sido publicado un estudio similar de su análogo aniónico.86 O ONa O HO OH NH O N HO OH NH I 42 N OH HN OH I O Figura II.40.- Estructura molecular del nuevo derivado catiónico del colato sódico, denominado II-6. En agua, a 25ºC, la solubilidad del compuesto II-6 es baja y esta se encuentra por debajo de su cac. Sin embargo, la solubilidad se ve incrementada cuando añadimos a la disolución electrolitos inertes, lo que nos permitirá la determinación de dicha característica. Así, el estudio se llevó a cabo en presencia de NaCl 0.1 M. Las medidas de tensión superficial se realizaron en un tensiómetro de gota a dos temperaturas, 25 y 50ºC. La elección de este equipo se debe a que a una temperatura de 50ºC, con el método de la placa de Wilhelmy, se pueden producir efectos no deseados de evaporación del disolvente con los consiguientes errores en las medidas. En la figura II.41 se representan los resultados experimentales obtenidos, donde podemos observar de nuevo el comportamiento típico de un surfactante en disolución acuosa. A partir de los puntos de ruptura de la tensión superficial, γ, con el logaritmo neperiano de la concentración del compuesto II-6, se determina la cac y la tensión superficial en la cac, γcac. Los resultados obtenidos se muestran en la tabla II.11. Figura II.41.- Representacion de los datos de tension superficial para el compuesto II-6 en NaCl 0.1 M a 25ºC (cuadrados) y a 50ºC (rombos). Tabla II.11.- Parámetros deducidos de los experimentos de tensión superficial para la adsorción en la interfase aire-agua del compuesto II-6 en NaCl 0.1 M. T (oC) 103cac (M) 106Γ (mol/m2) ao (Å2) 25 0.80 1.52 109 50 1.39 1.55 107 43 Los valores de cac obtenidos son próximos a los encontrados para otros derivados hidrófobos del ácido cólico (como II-1 y II-2, vide supra).35,56 Por otra parte, los valores de la cac para el derivado II-6 son inferiores a los del colato sódico,16 lo que demuestra que presenta un carácter más hidrófobo y es un mejor surfactante. El comportamiento superficial se analiza por medio de la isoterma de adsorción de Gibbs (ecuación [II.3]), y el área por molécula en la interfase aire-agua se determina a través de la ecuación [II.4], obteniéndose los resultados recogidos en la Tabla II.11. Recientemente hemos resuelto las estructuras cristalinas de la forma ácida del surfactante II-2 recristalizado tanto de clorobenceno como de acetona87. De sus análisis se obtienen valores de 147 y 145 Å2, respectivamente, para el área molecular proyectada de una molécula que se disponga horizontalmente en la superficie. Como el área del esteroide con la cadena lateral parcialmente plegada, estimada a partir de numerosos datos cristalinos obtenidos en nuestro grupo de investigación,† es de unos 100 Å2, significa que la adición de la región hidrófoba representa un aumento de 46 Å2 con respecto al área del esteroide, aunque el área del grupo p-t-butilfenilo en una disposición horizontal en la superficie sea de 55 Å2. Esta diferencia se debe a que el grupo fenilo forma un ángulo de entre 44 y 59º con respecto al plano horizontal que forman los anillo B, C y D del esteroide.55 Puesto que el área del grupo naftilo es de 62 Å2 en una disposición horizontal y de 35 Å2 en una orientación vertical (apéndice B), podemos estimar que el valor teórico del área ocupada por la molécula en la interfase estaría en torno a los 135-162 Å2, un valor que se encuentra claramente por encima del valor obtenido experimentalmente, que es de 108 Å2. Este hecho puede ser interpretado como el resultado del apilamiento de dos a cuatro grupos naftilo en la interfase, con lo que de esta manera se reduce la contribución de este grupo al área total por molécula. Por lo tanto, el área superficial obtenida a partir de las medidas de tensión superficial nos sugiere que las moléculas están dispuestas horizontalmente sobre la superficie con un apilamiento de los grupos aromáticos formando una capa estrechamente empaquetada tal y como sucede en los cristales líquidos. Recordemos que una manera adecuada de describir la membrana bicapa lipídica es como si se tratase de una doble capa esméctica- A de un cristal líquido.88 Cuando elevamos la temperatura a 50ºC no observamos ningún cambio en el área superficial, aunque la cac aumenta hasta un valor de 1.39×10-3 M (tabla II.11). Hemos realizado los espectros de fluorescencia de pireno solubilizado en disoluciones del compuesto II-6 en presencia de 0.1 M de NaCl a 50ºC. A partir de ellos se ha calculado la relación de intensidades I1/I3, y su representación frente a la concentración de surfactante se observa en la figura II.42, mostrando el típico perfil sigmoide con un punto de inflexión en 1.68×10-3 M. Este valor corresponde a la cac del surfactante y es similar al obtenido mediante medidas de tensión superficial. A elevadas concentraciones de surfactante la relación I1/I3 alcanza un valor límite igual a 1.3, que es comparable con el observado para el compuesto II-2 a 45-55 ºC35, y sugiere que la sonda se encuentra en un entorno más polar que en las sales biliares naturales como que el compuesto II-6 forma agregados diferentes a los pequeños agregados formados por el NaC y el NaDC.16 El valor mencionado es compatible con estructuras menos cerradas, como vesículas y tubos moleculares, donde la sonda se encuentra en ambientes menos apolares. † Tesis Doctoral de Santiago de Frutos del Río, desarrollada paralelamente a la presente. 44 Figura II.42.- Dependencia de la relación de intensidades I1/I3 de fluorescencia del pireno con la concentración del compuesto II-6. De los resultados de cac obtenidos a 25 y 50ºC, podemos determinar ahora las magnitudes termodinámicas asociadas al proceso de agregación en este intervalo de temperatura mediante las siguientes ecuaciones bien conocidas para un surfactante de estequiometria 1:1: ∆ 𝐺𝑎𝑔𝑔 0=𝑅𝑇(1 + β )ln 𝑐𝑎𝑐 ecuación [II.6] ∆ 𝐻𝑎𝑔𝑔 0=−𝑅(1 + β )𝜕ln𝑐𝑎𝑐 𝜕(1 𝑇) ecuación [II.7] ∆ 𝐺𝑎𝑔𝑔 0= ∆ 𝐻𝑎𝑔𝑔 0−𝑇 ∆ 𝑆𝑎𝑔𝑔 0 ecuación [II.8] donde β es la fracción de contraiones asociados al agregado, y ∆ 𝐺𝑎𝑔𝑔 0 , ∆ 𝐻𝑎𝑔𝑔 0 y ∆ 𝑆𝑎𝑔𝑔 0 la energía libre de Gibbs, la entalpía y la entropía para la agregación, respectivamente. La fracción de contraiones asociados a los agregados se puede deducir a partir de los valores de cac obtenidos a diferentes concentraciones de un electrolito inerte añadido al sistema mediante la ecuación:89 log 𝑐𝑎𝑐 = 1 𝑁𝑙𝑜𝑔[𝑎𝑔𝑟𝑒𝑔𝑎𝑑𝑜𝑠] 𝐾− β log[𝑋] ecuación [II.9] donde K es la constante de equilibrio entre monómeros y agregados que tienen un número de agregación medio de N, y [X] es la concentración de contraiones. En este caso hemos utilizado los datos obtenidos a 50ºC en presencia de 0.1 M (tabla II.11) y 0.050 M de NaCl. Para esta última concentración de electrólito hemos obtenido una cac de 1.92×10-3 M. Los cálculos dan un valor de β = 0.47, que podemos utilizar en la ecuación [II.6] para obtener ∆ 𝐺𝑎𝑔𝑔 0 a las dos temperaturas estudiadas, siendo ambos valores prácticamente idénticos e iguales a -26 kJ mol-1. Por otra lado, la aplicación de la ecuación [II.7] conduce a un valor de -26 kJ mol-1 para ∆ 𝐻𝑎𝑔𝑔 0, lo que significa que dentro del error experimental, la entropía asociada al proceso de agregación es ∆ 𝑆𝑎𝑔𝑔 0 ≈ 0. El valor obtenido para β es igual a los obtenidos para los surfactantes tetracarboxílicos formados por dímeros de los ácidos cólico y desoxicólico con un puente de unión basado en el ácido etilendiaminotetraacético,90 y dentro del rango de los valores publicados ( β = 0.3- 0.6) para las sales biliares naturales y compuestos relacionados.16,22,47,91-95 Blume et al96-97 0 1 2 3 4 5 1,3 1,4 1,5 1,6 1,7 1,8 I 1 /I 3 c (mM) 45 han medido los parámetros termodinámicos de desmicelización del NaC y del NaDC por calorimetría de valoración isotérmica, encontrando valores medios de 21.8 y 24.9 kJ mol- 1, respectivamente, en un intervalo de 60ºC (de hecho, la energía libre de desmicelización aumenta lentamente con la temperatura, a pesar de que este incremento representa una desviación máxima de sólo un 8% de los valores medios). Se concluyó que como el NaDC es más hidrófobo que el NaC, la formación de micelas se ve favorecida cuando la hidrofobia de los surfactantes aumenta. Los resultados que aquí se presentan están de acuerdo tanto con esta interpretación como con los estudios anteriores de los surfactantes tetracarboxílicos mencionados.90 Sin embargo, para el surfactante II-6 el proceso es entálpicamente dirigido mientras que para las sales biliares naturales el término entrópico es más importante96-97 e incluso compensa los valores de entalpía endotérmica. Hemos estudiado la morfología de los agregados del compuesto II-6, mediante TEM. Sabiendo de antemano que en los derivados aniónicos de sales biliares la morfología del agregado puede depender, incluso significativamente, del tiempo, concentración de surfactante, pH, concentración de sales inertes y temperatura, se realizaron unos estudios preliminares modificando algunas de estas condiciones. Se concluyó que una concentración de 4.98×10-3 M de II-6 en 0.1 M de NaCl a 50ºC corresponden a condiciones experimentales ideales para el estudio. En estas condiciones las imágenes TEM ponen de manifiesto la coexistencia de fibras y de cintas helicoidales una hora después de preparada la muestra (figura II.43a). El ancho de las fibras está entre los 20 y 60 nm, y en el caso de las cintas helicoidales su ancho es de entre 60 y 100 nm, con un paso de hélice de entre 500 y 700 nm. Asimismo se observa una fusión lateral de fibras que da lugar a fibras más anchas. Se sabe que derivados neutros de sales biliares también forman fibras.98 Después de 3.3 horas las cintas helicoidales se convierten en las estructuras predominantes (figura II.43b). La linealidad del eje se sigue manteniendo, pero su ancho aumenta hasta los 190 nm mientras que el paso de hélice disminuye. Este hecho nos sugiere una evolución de las cintas helicoidales hacia tubos moleculares, y de hecho podemos observar algunos en las imágenes TEM, cuyos diámetros oscilan entre los 100 y 150 nm. En una menor proporción hemos observado hojas enrolladas, con uno o varios giros y cuyos diámetros varían considerablemente desde los 190 hasta los 1500 nm. Después de 6.8 horas (figura II.43c) podemos observar como coexisten cintas helicoidales, tubos y cintas enrolladas. Observamos también como una gran proporción de cintas helicoidales se encuentran en un estado avanzado hacia su transformación a tubos moleculares, algunos de los cuales presentan marcas helicoidales. Como consecuencia, la proporción de tubos ha aumentado, al mismo tiempo que los anchos de las láminas enrolladas han disminuido. Al cabo de un día (figura II.43d) se hace evidente el incremento en la proporción de tubos y la contracción de las láminas enrolladas. El diámetro de estas últimas está ahora entre los 200 y 300 nm. Después de 2 días, los porcentajes de los tubos, cintas helicoidales y láminas enrolladas son de >85%, <14% y <1% respectivamente. Todos los comentarios realizados a partir de las imágenes TEM se resumen en la figura II.44. 52 (69) Savage, P. B. Eur. J. Org. Chem. 2002, 759. (70) Moore, K. S.; Wehrli, S.; Roder, H.; Rogers, M.; Forrest, J. N., Jr.;; McCrimmon, D.; Zasloff, M. Proc. Nat. Acad. Sci. 1993, 90, 1354. (71) Bhattacharya, S.; Maitra, U.; Mukhopadhyay, S.; Srivastava, A. Molecular Gels.Materials with Self-Assembled Fibrillar Networks. G. Weiss and P. Terech (eds.), 2006, Chapter 17. Springer, 613. (72) Maitra, U.; Chakrabarty, A. Beilstein J. Org. Chem. 2011, 7, 304. (73) Sangeetha, N. M.; Balasubramanian, R.; Maitra, U.; Ghosh, S.; Raju, A. R. Langmuir 2002, 18, 7154. (74) Bhat, S.; Leikin-Gobbi, D.; Konikoff, F. M.; Maitra, U. Biochim. Biophys. Acta 2006, 1760, 1489. (75) Hao, J.; Hoffmann, H. Current Opinion Colloid Interface Sci. 2004, 9, 279. (76) Bramer, T.; Dew, N.; Edsman, K. J. Pharm. Pharmacol. 2008, 59, 1319. (77) Jokela, P.; Jonsson, B.; Khan, A. J. Phys. Chem 1987, 91, 3291. 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C.; Small, D. M. J. Colloid Interface Sci. 1969, 31, 382. (90) Álvarez Alcalde, M.; Jover, A.; Meijide, F.; Galantini, L.; Pavel, N. V.; Antelo, Á.; Vázquez Tato, J. Langmuir 2009, 25, 9037. (91) Coello, A.; Meijide, F.; Rodríguez Núñez, E.; Vázquez Tato, J. J. Pharm. Sci. 1994, 83, 828. (92) Galantini, L.; Giampaolo, S. M.; Mannina, L.; Pavel, N. V.; Viel, S. J. Phys. Chem. B 2004, 108, 4799. (93) Galantini, L.; Giglio, E.; Leonelli, A.; Pavel, N. V. J. Phys. Chem. B 2004, 108, 3078. (94) Cozzolino, S.; Galantini, L.; Leggio, C.; Pavel, N. V. J. Phys. Chem. B 2005, 109, 6111. (95) Matsuoka, K.; Suzuki, M.; Honda, C.; Endo, K.; Moroi, Y. Chem. Phys. Lipids 2006, 139, 1. (96) Paula, S.; Sues, W.; Tuchtenhagen, J.; Blume, A. J. Phys. Chem. 1995, 99, 11742. (97) Garidel, P.; Hildebrand, A.; Neubert, R.; Blume, A. Langmuir 2000, 16, 5267. (98) Nonappa; Maitra, U. Soft Matter 2007, 3, 1428. (99) Terech, P.; Sangeetha, N. M.; Bhat, S.; Allegraud, J.-J.; Buhler, E. Soft Matter 2006, 2, 517. 53 III DENDRÍMEROS En los últimos años, nuestro grupo de investigación ha venido diseñando y caracterizando nuevos monómeros1-4 y oligómeros de sales biliares, como dímeros4-8 y trímeros,9 en los que los residuos esteroides están ligados mediante puentes de unión apropiados. Del mismo modo, si se parte de un puente tetrafuncionalizado se podrán obtener tetrámeros y, dependiendo de la estructura de aquel, el nuevo oligómero podra ser contemplado como un dendrímero de primera generación. Hemos preferido dar esta segunda visión por considerarla más acorde con el perfil de la investigación que hemos venido desarrollando en este capítulo. Además de los dendrímeros de sales biliares, inicialmente hemos diseñado también compuestos de la misma naturaleza dendrímera pero que, sin tener la naturaleza esteroide; están basados en el mismo núcleo empleado para la obtención de los oligómeros de sal biliar. Aunque cronológicamente fueron sintetizados antes, por cuestiones simplemente organizativas, se verán al final del capítulo ya que nos parece lógico establecer una continuidad en el tratamiento de los derivados de sales biliares comenzado en el capítulo anterior. III.1 INTRODUCCIÓN GENERAL A LOS DENDRÍMEROS En química orgánica sintética, las estructuras dendríticas emergieron como una nueva clase de polímeros llamados moléculas “cascada”, primeramente reseñadas por Vötgle y su grupo.10 Más tarde, el desarrollo de estos diseños moleculares, junto con técnicas sintéticas avanzadas, dieron lugar a estructuras dendríticas,11 y esta clase de moléculas se renombraron como dendrímeros. La palabra dendrímero proviene del Griego dendrón, que significa “árbol” o “rama”, y meros que significa “parte”.12 Otros nombres con los que se conocen los dendrímeros son arboroles,13 por su semejanza con las raíces de los árboles, y moléculas tipo cascada o coliflor (figura III.1). Los dendrímeros son macromoléculas monodispersas, globulares, altamente ramificadas y cuyos tamaños oscilan típicamente entre 1 y 10 nm. Esta macroestructura globular es el resultado de la estructura interna en la cual, todos los enlaces emergen de forma radial desde un núcleo central o punto focal al que se unen grupos que constituyen, a su vez, puntos de ramificación, de modo que se produce un patrón regular de capas arborescentes alrededor del mismo. Así, podemos decir que los dendrímeros se obtienen por la polimerización iterativa y radial de los monómeros alrededor del núcleo. La figura III.2 muestra los parámetros esenciales de un dendrímero: (i) número de ramas que surgen del núcleo, (ii) número de ramas que surgen en cada punto de ramificación, (iii) longitud de cada rama, y (iv) número de capas de ramas que nacen en cada punto de ramificación. Estos parámetros están relacionados entre sí ya que ramas demasiado cortas o un excesivo número de ramificaciones en cada nudo puede conducir a una congestión de la superficie que impida el posterior crecimiento de todas las ramas. El resultado sería la formación de un dendrímero polidisperso. Las diversas “capas” de monómeros reciben el nombre de generaciones pudiéndose obtener de 2 (G2), 3 (G3), 4 (G4), 5(G5) o más generaciones según la cantidad de monómeros alrededor del núcleo central (a veces el núcleo se denota como generación cero, (G0). Alternativamente, la estructura dendrítica puede ser visualizada como la unión 54 de una serie de grupos altamente ramificados denominados dendrones a un núcleo central. Figura III.1.- Similitud entre un árbol y una estructura dendrítica. Figura III.2.- Representación esquemática de un dendrímero14 con los conceptos generales que lo definen. El diseño de dendrímeros puede basarse en una gran variedad de uniones. Así tenemos, por ejemplo, poliaminos (dendrímeros tipo polipropileno-imina, PPI), mezclas de poliamidas y aminas (dendrímeros tipo poliamidoamina, PAMAM11) (figura III.3) o aquellos construidos con subunidades más hidrófobas como poli(aril éteres).15 Ejemplos más recientes de dendrímeros son los basados en carbohidratos,16 los que usan como núcleo los calixarenos,17 o los que contienen elementos del tercer periodo como silicio o fósforo18 (figura III.4). (a) (b) Figura III.3.- (a) dendrímero tipo poliamido amina (PAMAM) de 3ª generación, y (b) dendrímero tipo polipropileno-imina (PPI) de 5ª generación. 55 (a) (b) (c) Figura III.4.- Varios diseños de dendrímeros: (a) dendrímero con carbohidratos, (b) dendrímero poli (aril éter), y (c) dendrímero basado en el silicio. Para la obtención de dendrímeros se han empleado una serie de procedimientos que pueden agruparse en tres estrategias básicas: (i) convergente,19 (ii) divergente11,20 (figura III.5), y (iii) en un solo paso o hiper-ramificada21 (figura III.6). En la estrategia divergente la construcción está basada en una adición secuencial de monómeros que comienza en la molécula empleada como núcleo y que se extiende radialmente hacia la superficie de la macromolécula, produciendo las capas o generaciones del dendrímero. Sin embargo, el elevado número de reacciones que tienen que realizarse demanda transformaciones muy efectivas (>99% de rendimiento) para evitar defectos. Incluso para transformaciones muy eficientes por generación, el rendimiento de un dendrímero G5-PPI “perfecto” será sólo aproximadamente del 25%. Figura III.5.- Síntesis de dendrímeros: estrategias divergente (arriba) y convergente (abajo). Br Br Br B(OH) 2 Br Br Br Br MgBr Ni(II) Na2CO3(aq) Pd(PPh 3 ) 4 Disolvente Orgánico X X X X X X X X X X Figura III.6.- Dendrímero obtenido por el método de la policondensación. 56 En la síntesis convergente, los dendrones que componen la estructura total, se construyen de adentro hacia afuera partiendo de una molécula central, o bien, se sintetizan convenientemente y, posteriormente, se unen al núcleo seleccionado. Mediante esta estrategia, sólo un número pequeño de centros reactivos son funcionalizados en cada paso, lo que origina un número pequeño de reacciones laterales. Con la purificación adecuada se pueden obtener, por este método, dendrímeros sin defectos. La estrategia de un solo paso (hiper-ramificada) genera los dendrímeros en una sola etapa a partir de un proceso de policondensación. Aunque las estructuras obtenidas poseen un carácter dendrítico, no tienen una estructura tan perfecta como la de los compuestos obtenidos por los anteriores métodos. Así, suelen poseer de un 55 a un 70% de hiper-ramificación, independientemente de su peso molecular. A medida que la estructura dendrítica crece, se produce la generación de diferentes “compartimentos”, de manera que la estructura del dendrímero se puede dividir en tres partes: (i) la superficie, con un elevado número de sitios reactivos, (ii) la “barrera exterior”, justo debajo de la superficie, que posee un microentorno protegido del exterior por la superficie del dendrímero, y (iii) el núcleo, que en dendrímeros de muchas generaciones, está protegido de los alrededores en un microentorno rodeado por las ramas del dendrímero. El interior se convierte así en un lugar ideal para la encapsulación de moléculas huésped de distinto tamaño, hecho que fue descrito por primera vez por Meijer et al22 en el año 1995 (figura III.7). Figura III.7.- Encapsulación de diversas moléculas en dendrímeros tipo polietilenglicol (PEG). La superficie del dendrímero contiene una elevada cantidad de grupos funcionales que, en el caso de los dendrimeros PPI y PAMAM, son grupos amino primarios. Como estos grupos son protonables, dependiendo del valor de pH del medio, el dendrímero podrá exhibir diferentes conformaciones como resultado de las interacciones electrostáticas repulsivas entre grupos cargados con el mismo signo. En consecuencia, los dendrímeros se convierten en prometedores dosificadores de fármacos, con dos características importantes: (i) poseen un lugar donde albergarlos, y (ii) se pueden producir cambios conformacionales (que ayudan a expulsar el huésped) debido a la interacción con el entorno. También cabe destacar que la multifuncionalidad superficial facilita la interacción con receptores. METOTREXATO( MTX) ADRIAMICINA NANOPARTÍCULA DE ORO PROTOPORFIRINA IX ROSA BENGALA FULLERENO METOTREXATO( MTX) ADRIAMICINA NANOPARTÍCULA DE ORO PROTOPORFIRINA IX ROSA BENGALA FULLERENO 57 Tras la aparición de las estructuras dendríticas, se sugirió que la nanoestructura tridimensional de mayor generación haría a estas estructuras similares en cierta forma a las proteínas.23 Sin embargo, a diferencia de éstas, que consisten en cadenas polipeptídicas plegadas, la estructura poli-ramificada del interior de los dendrímeros es menos flexible ya que está mayoritariamente formada por enlaces covalentes. Además, un dendrímero es en promedio menos compacto que una proteína (el interior no está compactado tan eficientemente como en una proteína) y, por último, el dendrímero contiene un número sustancialmente mayor de grupos funcionales en la superficie que una proteína de un peso molecular similar. La técnica TEM, permite obtener una imagen individual de un dendrímero, dando así información directa de su tamaño, forma, polidispersidad y alineamiento de las moléculas. Jackson et al24 consiguieron visualizar con éxito diferentes generaciones del dendrímero PAMAM utilizando esta técnica (figura III.8). Figura III.8.- Imágenes TEM de dendrímeros de PAMAM teñidos positivamente con una disolución acuosa al 2% de fosfotungstato sódico. Dendrímeros de diferentes generaciones (a) G10, (b) G9, (c) G8, (d) G7 (e) G6 (f) G5. Para (e) y (f), se ha añadido un dendrímero G10 con fines comparativos. La escala corresponde a 50 nm. Debido a estas características estructurales y rasgos funcionales, los dendrímeros están siendo empleados en diversos campos del quehacer científico como Ciencia de Materiales, Física, Química, Ingeniería o Ciencias Biológicas. Hasta la fecha,* se han publicado mas de 35000 trabajos referentes a la síntesis y propiedades de estas moléculas, y es de resaltar el hecho de que mas de la mitad se han publicado en los últimos 7 años, lo cual es una muestra clara del auge que ha tomado el estudio de estas especies. Otro hecho que propicia el aumento de los estudios mencionados es que ya se puede disponer de dendrímeros comerciales con precios asequibles. III.1.1 Dendrímeros y sus aplicaciones La figura III.9 muestra un metalo-dendrímero generado por el autoensamblaje de tres ligandos dendríticos de tipo carboxilato. Estos dendrones poseen funcionalidades aromáticas y de tipo éter que permiten el aislamiento de los átomos emisores con lo cual se evita el auto-quenching y se mejora la calidad y la intensidad de la señal. Los *01-10-2014 58 lantánidos son ampliamente usados como emisores en comunicaciones vía fibra óptica, de manera que, debido a las características mencionadas, el dendrímero podría ser usado como un amplificador de señales ópticas.25 Figura III.9.- Metalo-dendrímero de interés en la transmisión de datos por fibra óptica. Los dendrímeros se pueden emplear también como antenas receptoras de fotones capaces de emitir posteriormente la energía en forma de radiación o convertirla en electricidad o energía química. En una antena dendrítica, los grupos terminales donadores colectan los fotones y los transfieren a una unidad receptora localizada en el núcleo o en algún punto focal del dendrímero. Esta región participa también en la captación de los fotones por ser excitada de forma independiente. Las antenas descritas se constituyen entonces en concentradores de energía. La figura III.10 muestra de un modo esquemático el proceso descrito.26 La figura III.11 muestra otra antena dendrítica capaz de absorber fotones de diferente frecuencia y emitirlos reconvertidos por un proceso no radiactivo de resonancia fluorescente. Figura III.10.- Esquema del modo de funcionamiento de un recolector fotónico o antena recolectora de fotones. Figura III.11.- Molécula receptora-emisora de fotones. 26 El desarrollo de nuevos dendrímeros biocompatibles se ha convertido en un importante objetivo de las compañías dedicadas a la Biotecnología. Las posibles aplicaciones biofarmacéuticas de estos nuevos derivados han mostrado ser múltiples. Por ejemplo, en el campo de los antivirales actúan como imitadores artificiales de las superficies aniónicas de las células. De esta manera los dendrímeros se diseñan para que tengan en su superficie grupos aniónicos, como sulfonatos, o restos de ácido siálico, que Antena dendrítica acumuladorliberador de fotones Emisión luz Transferencia de energía Antena dendrítica acumuladorliberador de fotones Emisión luz Emisión luz Transferencia de energía FRET hν(NARANJA ) 2hν(IR) hν(UV-VIS) Ó FRET hν(NARANJA ) 2hν(IR) hν(UV-VIS) Ó 59 son carbohidratos presentes en las superficies celulares de los mamíferos, y así los dendrímeros compiten con la superficie celular para unirse al virus lo que se traduce en una menor probabilidad de infección (figura III.12). Figura III.12.- Esquema de actuación de un dendrímero antiviral. Algunos dendrímeros de polilisina modificados con residuos naftilo y que poseen grupos sulfonato en la superficie son inhibidores del virus del Herpes Simplex in vitro (figura III.13a),27 inhibiendo no sólo la entrada sino también pasos posteriores de la replicación viral.28 Lo mismo ocurre con dendrímeros PAMAM modificados covalentemente con residuos naftil-sulfonato que, en este caso, son capaces de inhibir la replicación del VIH tanto a nivel de la entrada celular como también en pasos posteriores.29 Se ha diseñado asimismo un dendrímero con una superficie amida que es un inhibidor del virus respiratorio sincitial (VRS)30 (figura III.13b). Dendrímeros PAMAM funcionalizados con ácido siálico inhiben eficientemente la infección por influenza A H3N2.31 (a) (b) Figura III.13.- (a) Dendrímero antiviral contra el virus Herpes Simplex; (b) dendrímero antiviral contra el virus respiratorio Sincitial. Otra aplicación de los dendrímeros es en el campo de los antibacterianos. Aquí poseen grupos terminales catiónicos, como aminas o grupos tetraalquilamonio, en contraposición con los dendrímeros antivirales. El modo de acción de este tipo de dendrímeros es adhiriéndose y dañando la membrana aniónica bacteriana causando su lisis. Dendrímeros tipo PPI con grupos terciarios alquilamonio son potentes biocidas antibacterianos contra bacterias Gram-positivas y Gram-negativas (figura III.14).32-34 Es importante mencionar además que los contraiones son fundamentales en este proceso, siendo los bromuros, en el caso de las sales de alquilamonio, más activos que los correspondientes cloruros.33 60 Figura III.14.- Dendrímero antibacteriano contra la E. coli.33 El carácter multivalente de los dendrímeros ha posicionado a estas macromoléculas a la vanguardia en el desarrollo de nuevos agentes de contraste para la técnica de MRI. Esta técnica de imagen se ha convertido en una de las mejores para el diagnóstico de enfermedades. La mayor limitación de la misma es debida a su inherente baja sensibilidad, por lo que para lograr incrementarla se han venido diseñando durante las últimas décadas agentes de contraste. Actualmente sólo está aprobado el uso de complejos con Gd (III) de bajo peso molecular, los cuales tienen una rápida eliminación renal, por lo que al requerirse elevadas dosis el uso de estos complejos en MRI es limitado. Por ello, se están proponiendo dendrímeros que forman complejos robustos con gadolinio que poseen el tamaño apropiado para estar en la corriente sanguínea el tiempo suficiente como para lograr imágenes apropiadas para los estudios de MRI. Además, los dendrímeros logran acrecentar los parámetros de contraste de forma drástica, alcanzándose una mayor resolución en un tiempo de análisis más corto (figura III.15).35 Figura III.15.- Complejos de Gd (III) propuestos como agentes de contraste para MRI.35 Como ya hemos comentado, los dendrímeros de tipo PAMAM y PPI con pesos moleculares grandes y superficies multivalentes son macromoléculas con potencial aplicación en el transporte de fármacos. La interacción con el fármaco puede tener lugar bien en las cavidades del núcleo del dendrímero (endo-receptor) o bien en la superficie multivalente del armazón externo del dendrímero (exo-receptor). Un ejemplo de dendrímero endo-receptor es la “caja dendrítica”36 de la figura III.16, donde un PPI G5 es 61 modificado en su superficie con grupos fenil-alanina que protegen el armazón externo haciéndolo más denso. Durante el proceso de crecimiento del dendrímero se encapsulan en su interior moléculas de diferente tamaño. El dendrímero puede portar 4 moléculas grandes (Rosa de Bengala) y 8-10 pequeñas. Cuando este dendrímero se trata con ácido fórmico, el armazón exterior se abre permitiendo la liberación de las moléculas hospedadas en su interior. Figura III.16.- Caja dendrítica que contiene moléculas grandes de Rosa Bengala y otras más pequeñas. Una forma de direccionar los dendrímeros hacia las células deseadas es la de funcionalizarlos con ácido fólico, que es captado por las células por la vía del receptor de folato, el cual está sobre-expresado en las células tumorales. Los dendrímeros funcionalizados de esta forma tendrían preferencia por entrar en las células tumorales sobre las células normales, con lo cual se convertirían en excelentes moléculas base para el transporte de fármacos citotóxicos.37-38 Recientemente, en terapias anticancerígenas mediante captura de neutrones, se han utilizado dendrímeros PAMAM modificados con folato en su superficie como transportadores de isótopos de boro.39 Los dendrímeros PAMAM conjugados con cisplatino actúan como un transportador macromolecular de platino, un fármaco antitumoral. Uno de los mayores efectos secundarios de este medicamento es su citotoxicidad en los tejidos no cancerosos. Por lo tanto, el encapsulamiento de cisplatino con dendrímeros confiere a estos complejos una menor toxicidad, una mayor acumulación en los tumores sólidos y una liberación más lenta del medicamento con respecto al cisplatino sin complejar.40 Este tipo de complejos están formados por uniones no covalentes. Otro tipo de aproximación es la unión covalente vía formación de enlaces biodegradables, como por ejemplo dendrímeros basados en el núcleo 1,4,7,10-tetraazociclododecano con aminas primarias. Su superficie ha sido parcialmente modificada con 1-bromoacetil-5-fluorouracilo (figura III.17) para formar una unión imina lábil. En condiciones fisiológicas, se produce la hidrólisis del enlace imida y se libera in vitro el potente medicamento anticancerígeno 5-fluoro-uracilo.41 Por último, podemos citar el empleo de dendrímeros en la terapia fotodinámica (PDT) para el tratamiento del cáncer. Esta técnica se basa en la excitación, mediante irradiación de luz, de un fotosensibilizador que transfiere la energía a una molécula de oxígeno cercana para generar una molécula de oxígeno singulete que reacciona rápidamente con células cancerosas cercanas (figura III.18). 68 Figura III.29.- Dendrón III-1 sintetizado que consta de tres residuos de sal biliar Una vez obtenido III-1 se procedió a la síntesis de los dendrímeros III-2 (que consta de seis residuos biliares) y III-3 (que tiene 9 residuos biliares) empleando los puentes y condiciones de acoplamiento descritas en la figura III.30. Los rendimientos de ambos dendrímeros fueron del 30 y del 5%, respectivamente. Este último bajo rendimiento es probablemente debido a que el puente es demasiado pequeño para la unión de los tres dendrones aminados. Aunque se han obtenido buenos resultados en las síntesis de los compuestos diseñados, no se ha realizado una caracterización fisicoquímica de los mismos. HN O O OCH 3 O OH OH HN OCH 3 O HO OH HN O OH HO H 2 N +O OH O HO O O H N O O OCH 3 O OH HO HN H 3 CO O OH HO NH OHO HO H N HN OO OCH 3 O OH HO HN H 3 CO O HO HO NH O OH HO HN DEPC/TEA DMF III-2 HN O O OCH 3 O OH OH HN OCH 3 O HO OH HN O OH HO H2N + DEPC/TEA DMF OOH HOOH OO O OO N HO O H 3 CO O HO OH NH OCH 3 O HO OH HN O OH OH HN HN O O OCH 3 O OH OH HN OCH 3 O HO OH HN O OH HO HN HN OO OCH 3 O OH HO HN H 3 CO O HO HO NH O OH HO HN III-3 Figura III.30.- Rutas de obtención de los dendrímeros III-2 y III-3 (anteriores a esta Tesis) que se llevaron a cabo en el seno de nuestro grupo de investigación. HN O O OCH 3 O OH HO HN OCH 3 O HO HO H N O OH HO H 2 N 69 III.2.3 Nuevos dendrímeros sintetizados en la presente Tesis Los buenos resultados sintéticos obtenidos con los dendrímeros III-2 y III-3, acabados de comentar, nos impulsó hacia la obtencion de nuevos dendrímeros derivados de sales biliares. El primer problema al que nos enfrentamos era el de seleccionar un núcleo adecuado que pudiera portar los residuos biliares, tratando de evitar bajos rendimientos como el comentado en la obtención de III-3 (achacado al gran impedimento estérico que supone unir a un núcleo tan pequeño tantas moléculas de sal biliar). Por ello, se pensó en un núcleo aromático que, por otra parte, constituiría un magnífico punto de apoyo para la caracterización de los nuevos derivados ya que posee señales muy bien diferenciables por la técnica de RMN y, al mismo tiempo, fáciles de interpretar. Aunque lo ideal sería tener un núcleo que fuera comercial, no encontramos ninguno que reuniera las características que buscábamos, por lo que el candidato seleccionado fue el ácido 4,4',4'',4'''-metanotetrailtetrabenzoico, sintetizado por Grimm et al,61 que denominaremos de ahora en adelante como III-4 (figura III.31). O O O O HO HO OH HO Figura III.31.- Núcleo empleado para la síntesis de dendrímeros derivados de sales biliares denominado 4,4',4'',4'''- metanotetrailtetrabenzoico, III-4. Sirva como ejemplo el uso del ácido III-4 como ligando para construir redes unidas por coordinación de metales (MOF’s: metal-organic frameworks), con lo que se originan estructuras de una, dos o tres dimensiones que pueden ser porosas. En algunos casos estos poros son estables cuando se eliminan las moléculas de disolvente por lo que, de esta manera, los nuevos materiales pueden tener aplicaciones potenciales en el intercambio iónico, catálisis heterogénea, almacenamiento de gases o fabricación de nanopartículas metálicas.62-65 Por ejemplo, presentan un comportamiento selectivo en la adsorción de gases como el H2, O2 o CO2 sobre el N2 y CH4, lo que sugiere posibles aplicaciones en la separación de estos gases del aire. En la figura III.32a se muestra un ejemplo de un MOF formado por el 4,4',4'',4'''-metanotetrabenzoato (MTB4-) y un complejo macrocíclico de NiII. Se origina una red donde cada ion metálico está coordinado con dos ligandos de MTB- diferentes formando una geometría de coordinación octaédrica y una red de tipo diamantoide, con unas dimensiones de las cavidades formadas de 34 Å2 (figura III.32b). Una vez que hemos seleccionado el núcleo, sólo nos queda unir éste con cuatro unidades del derivado aminado por la posición 3 del ácido cólico y así obtendremos el dendrímero de primera generación III-5 (figura III.33). Su síntesis se explica detalladamente en el apéndice A y sus propiedades fisicoquímicas son estudiadas más adelante. Una vez obtenido este nuevo derivado, pensamos en aumentar el número de residuos biliares unidos al núcleo III-4. Para ello, como grupo amino reactivo usamos el dendrón derivado del ácido cólico III-6 (figura III.34), sintetizado previamente en nuestro grupo de investigación.9 En este caso, tras probar varios métodos de acoplamiento usados habitualmente en nuestro laboratorio (DEPC/TEA; DIC/HOBt; cloroformiato de etilo/trin-butilamina) se comprobó que los mejores resultados se obtenían preparando el cloruro de ácido de III-4 y haciéndolo reaccionar con el dendrón III-6. El nuevo dendrímero de primera generación III-7 con 8 residuos biliares (figura III.35) se obtiene con un 70 rendimiento del 78%. En la figura III.36 se muestra el espectro de masas que corrobora la obtencion del dendrímero III-7. (a) (b) (c) Figura III.32.- (a) Ejemplo de un MOF sintetizado por Cheon y Suh64. (b) Estructura cristalina del mismo donde se observa el tamaño de las cavidades formadas. (c) Vista del plano ab donde se observa la generación de canales de una dimensión en la red. O O O O OH O OH OH HN HO O HO HO NH HOO OH HO HN OH O HO OH HN Figura III.33.- Dendrímero con 4 residuos de sal biliar, III-5. NH 2 O O H 3 CO O HO HO NH OCH 3 O OH OH HN Figura III.34.- Estructura del dendrón aminado III-6 usado en la síntesis de dendrímeros de sales biliares. 71 x 4 N HO O H 3 CO O HO OH NH OCH 3 O HO OH HN = III-7 o Figura III.35.- Dendrímero III-7 con 8 residuos de sal biliar. Figura III.36.- Espectro MALDI-TOF del dendrímero III-7 con 8 residuos de sal biliar. Llegados a este punto, sólo queda desproteger los metilos terminales de las sales biliares para poder tener los grupos carboxílicos libres. Este paso, que a priori debería ser el más fácil (ya que así sucede con todos los derivados de sales biliares, monómeros, dímeros y trímeros que se habían sintetizado anteriormente en el grupo de investigación), se convirtió en imposible a pesar de haber intentado diferentes métodos y condiciones de hidrólisis: (i) el clásico con KOH/MeOH 1M (con el que habíamos hidrolizado todos los compuestos derivados de sales biliares hasta ahora), en el que se variaron tiempos de reacción y concentraciones de KOH; y (ii) un método más suave con LiOH/MeOH- H2O.66 Los resultados obtenidos fueron siempre los mismos: a medida que transcurre la reacción de desprotección de los metilos terminales se observaba mediante cromatografía de capa fina la formación de un nuevo compuesto con un Rf = 0.36 (figura III.37), que mediante RMN comprobamos que era el dendrón III-6. Por lo tanto, podemos concluir que a medida que transcurre la reacción de desprotección de los metilos terminales del dendrímero III-7 se va produciendo la rotura de los enlaces amida de la molécula. Este hecho, que era la primera vez que nos ocurría, y difícil de asimilar debido a la estabilidad química que creíamos que poseía el enlace amida, fue también reportado recientemente por Arrieta et al,67 en cuyo trabajo se describe la rotura de enlaces amida en el Kevlar© para dar ácidos carboxílicos terminales mediante una degradación fotoquímica. Este estudio se realizó mediante ensayos de envejecimiento de las muestras [M]+=4377[M-2H]+=4375 [M+7Na-2H]+=4536 x 4 N HO O H3CO O HO OH NH OCH3 O HO OH HN B.7 o III-7 72 sometiéndolas a diferentes grados de humedad y temperaturas bajo la aplicación de radiación UV. La causa de la rotura de los enlaces amida parace ser una combinación de un proceso oxidativo y una reacción de reordenamiento de enlaces (del tipo Photo-Fries) sufrido por las moléculas de Kevlar© e iniciado por la rotura del enlace amida inducido por la radiacion UV (figura III.38). 1 hora 2 horas 3 horas 4 horas Figura III.37.- Secuencia temporal de la cromatografía de capa fina en la reacción de desprotección de los metilos terminales del dendrímero III-7 en una mezcla 1:1 acetato de etilo:metanol. Se observa la aparición de una nueva mancha con un Rf = 0.36, que mediante RMN se determinó que era el dendrón III- 6. Figura III.38.- Mecanismo propuesto por Arrieta et al67 para el envejecimiento fotoquímico del Kevlar©. Asimismo, en el estudio de Arrieta et al se indica la necesidad de la presencia de medios ácidos o básicos como catalizadores de la reacción de hidrólisis ya que en medios neutros ésta no ocurre. Como se puede ver en la figura III.39, la estructura del Kevlar© es, en su parte aromática, similar a la del compuesto III-7. Pensamos por ello que en nuestro caso puede estar sucediendo un proceso similar ya que la reaccion de hidrólisis de III-7 se llevó a cabo en presencia de luz natural. (a) (b) Figura III.39.-Similitud en las estructuras del (a) Kevlar© y (b) dendrímero III-7. Este hecho nos mostró que no debíamos seguir usando la base III-4 para generar nuevos dendrímeros de mayores generaciones, tal y como planteamos inicialmente. 73 Pensando en la obtención de estos derivados, recordemos que nuestra filosofía se basa en hacer reaccionar un derivado aminado con una base que tenga grupos carboxilo libres para poder forman un enlace amida. Pero… ¿y si pensamos al revés? Podríamos modificar nuestro derivado aminado de sal biliar uniendo un grupo carboxilo en la posición 3, buscar una nueva base que porte los grupos amino libres, y hacer reaccionar ambos compuestos. La primera parte no representa ningun problema, puesto que el derivado planteado ya había sido sintetizado dentro de nuestro grupo de investigación.68 En cuanto a la segunda parte tampoco se esperarían problemas ya que, como se ha visto al inicio del presente capítulo, existen dendrímeros comerciales tipo PAMAM (poliamido amina) de diferentes generaciones con grupos amino libres en su superficie (recuérdese la figura III.3, por ejemplo). Para la síntesis de estos nuevos dendrímeros seguiremos la ruta de la figura III.40 donde, en primer lugar, el 3β-amino colato de metilo se hace reaccionar con anhídrido succínico para generar el compuesto III-8 con un grupo carboxilo libre en la posición 3 del esqueleto biliar, el cual se hace reaccionar con un PAMAM de generación 0 mediante el sistema DEPC/TEA para obtener un nuevo dendrímero de tipo G-1 con un núcleo de tipo PAMAM y cuatro residuos de sal biliar (compuesto III-9). El espectro de MALDI (figura III.41) así lo confirma. NH 2 4 = OCH 3 O OH OH H 2 N + OCH 3 O OH OH HN O OH O + O O ODMF/ TEA 50ºC NH 2 4 NH OCH 3 O OH OH N H O O 4 NN O H N O HN O NH O HN NH 2 NH 2 H 2 N H 2 N DEPC,TEA DMF 24h T.A. III-8PAMAM III-9 Figura III.40.- Ruta sintética seguida para la obtención del dendrímero III-9, derivado de un PAMAM de generación 0 con cuatro sales biliares. Las esperanzas obtenidas a la vista de los resultados logrados con la síntesis del compuesto III-9 se desvanecieron nuevamente al realizar la hidrólisis de los grupos metilos de la posición 24 de las sales biliares, ya que se constató la obtención de una señal a 51 ppm en el espectro de 13C-RMN y de otra a 3.6 ppm en el espectro 1H-RMN, que corresponden a los grupos metilo de la sal biliar. Desconocemos los motivos por los que en este caso no se produce la hidrólisis, y por falta de tiempo no se pudo profundizar en otros posibles métodos para llevarla a cabo. 74 Figura III.41.- Espectro MALDI-TOF del dendrímero III-9 Como alternativa decidimos entonces sintetizar un nuevo dendrímero con 8 sales biliares usando como núcleo un PAMAM de generación 1. Siguiendo la misma estrategia que en el dendrímero III-9, sintetizamos el dendrímero III-10 (figura III.42). Aunque en el espectro de masas (figura III.43) se confirma la presencia del mismo, se observan también multitud de picos algunos de los cuales corresponden a fragmentos de la molécula y otros son de procedencia sin esclarecer, aunque pensamos que son debidos a impurezas que no han podido ser eliminadas con el tratamiento de purificación habitual mediante cromatografía en columna. Para este tipo de compuestos de elevado peso molecular sería más adecuada una purificación mediante dialisis52,65 o ultrafiltración con un equipo Amicon©. Desgraciadamente, al no disponer del equipamiento necesario, tuvimos que abandonar la obtencion de este derivado. Figura III.42.- Ruta para la obtención de un dendrímero G-1 usando como núcleo un PAMAN de primera generación con 8 sales biliares, denominado III-10. [M] + =2531 [M+Na] + =2554 NH OCH3 O OH OH N H O O 4 III-9 NH 28 = OCH 3 O OH OH HN O OH O + NH 28 NH OCH 3 O OH OH N H O O 8 DEPC,TEA DMF 24 h T.A. III-8PAMAMIII-10 75 Figura III.43.- Espectro MALDI-TOF del dendrímero III-10 derivado de un PAMAN de primera generación con 8 sales biliares. III.3 ESTUDIO FISICOQUÍMICO DE UN DENDRÍMERO G-1 DERIVADO DEL ÁCIDO CÓLICO, III-5 Quedó pendiente en el apartado III.2.3 el estudio fisicoquímico de disoluciones del dendrímero III-5, y es momento de abordarlo. Se realizaron medidas de tensión superficial con el método del plato de Wilhelmy de disoluciones acuosas de III-5 preparadas en NaOH 0.010 M (pH 12) para asegurar que el dendrímero se encuentre completamente en su forma aniónica. Con respecto al pH, debemos mencionar que inicialmente se trabajó con una disolucion de NaOH 0.1 M (pH 13), ya que podría suceder que un pH de 12 no fuese suficiente para garantizar la ionizacion completa de los cuatro grupos carboxílicos de la molécula. Sin embargo, las medidas realizadas no eran reproducibles, lo que nos llevó a pensar que se estuviera produciendo la rotura del enlace amida, como ya había ocurrido anteriormente con del dendrímero III-7. De esta manera, estaríamos realizando medidas sobre una disolución que podría contener tetrámero, trímero, dímero o monómero en diferentes cantidades, afectando cada uno de ellos de manera diferente a la tensión superficial. La confirmación de la rotura del enlace amida se realizó a través de una cromatografía de capa fina de una de las disoluciones de surfactante. El revelado con ninhidrina, reactivo específico de grupos amino, arrojó un resultado positivo. La rotura del enlace amida a pH elevado y a temperatura ambiente fue observada también recientemente por Jackson et al69 en amidas polifluorinadas que se rompen dando ácido perfluoro-octanoico. Esta rotura del enlace amida se produce en un 98% al cabo de 24 horas. Por otra parte, inicialmente el experimento se llevó a cabo a 25 ºC, pero en estas condiciones observamos que con una concentración de 3×10-3 M de III- 5 la disolución formaba un gel (figura III.44), y las medidas de tensión superficial no son realistas, tal y como se observa en la figura III.45, por encima de una concentración de 1.5×10-3 M. La capacidad de formacion de geles en derivados de sales biliares no debe sorprendernos, ya que este es un fenómeno que se conoce desde hace décadas,70 aunque su estudio cayó en el olvido y no se retomó hasta hace relativamente poco.71 Quizás la sal biliar no modificada mas estudiada en este aspecto sea el desoxicolato sódico.72-74 76 Figura III.44. Fotografía del gel que se forma en una disolución de III-5 a 25ºC y pH = 12 (NaOH 0.010 M). -6 -5 -4 -3 -2 -1 012 54 56 58 60 62 64 66 68 70 72 74 γ (mN/m) Ln C (mM) Figura III.45.- Representación gráfica de la tensión superficial γ frente al logaritmo neperiano de la concentración para el compuesto III-5 en NaOH 0.010 M a 25ºC. Se observa que las medidas a concentraciones elevadas son completamente incoherentes con el comportamiento normal de un surfactante. Es debido a la formación de un gel a concentraciones altas. Los resultados experimentales obtenidos ya a pH 12 y a 35oC se muestran en la figura III.46. Los mismos muestran que al menos hasta una concentración de 2.8×10-3 M no se observa ningún proceso de agregación crítico. Por otra parte, la tensión superficial sólo disminuye hasta unos 55 mN/m, lo que indica que el compuesto III-5 no es muy buen surfactante. Esto mismo sucede con dos tetrámeros de sales biliares con núcleos aromático, uno, y porfirínico, el otro, estudiados por nuestro grupo de investigación† (figura III.47). † Santiago de Frutos, Tesis realizada simultáneamente con la que aquí se presenta. 77 -5 -4 -3 -2 -1 012 52 54 56 58 60 62 64 66 68 70 γ (mN/m) Ln C(mM) Figura III.46.- Representación gráfica de la tensión superficial γ frente al logaritmo neperiano de la concentración para el compuesto III-5 en NaOH 0.010 M a 35ºC. O HOOH HO H N O O OOH OH OH H N OOH OH OH N H OO O HOOH HO N HNH O ONH O OH OH HO HN O N N HN H N O HO OH HO H NO OOH HO OH N H O OOH HO OH NH O Figura III.47.- Tetrámeros sintetizados por Santiago de Frutos (ver nota a pié de página). La ausencia de una agregación crítica no significa que el surfactante no forme agregados en disolución, ya que estos pueden originarse en un proceso no crítico o continuo. Para estudiar la naturaleza de los posibles agregados formados por III-5 en disolución (35ºC y pH 12) recurrimos a la técnica de fluorescencia empleando como sonda el pireno, ya que como hemos comentado anteriormente es muy sensible a la polaridad del medio. La representación de la variación de la relación I1/I3 de fluorescencia del pireno con el logaritmo neperiano de la concentración de III-5 se muestra en la figura III.48. -4 -3 -2 -1 0 1 2 1,2 1,4 1,6 1,8 I 1 /I 3 Ln C(mM) Figura III.48.- Variación de la relación I1/I3 de fluorescencia del pireno con el logaritmo neperiano de la concentración de III-5 a una temperatura de 35ºC y pH 12. 84 unidades de construcción activas que poseen información de reconocimiento y son capaces de reconocerse los unos a los otros.80 Al mismo tiempo, poseen multitud de sitios de enlace unidos a un núcleo que los mantiene en una orientación adecuada.82 Los tectones tienden a formar redes abiertas en las que se encuentran disponibles grandes volúmenes para la inclusión de huéspedes.83 La generación de redes moleculares debe ser atribuida a un proceso de ensamblaje iterativo, bien debido a un tectón autocomplementario (sistema monocomponente formado por un único motivo) o bien por varios módulos complementarios (sistema multicomponente). En este último caso el enfoque más viable sería unir dos tectones complementarios (figura III.58). (a) (b) Figura III.58.- Representación esquemática de una red (a) mono y (b) bidimensional, basadas en la asocioación de tectones auto-complementarios.84 El tetrafenilmetano se puede considerar como la molécula de referencia a la hora del diseño de tectones con cuatro brazos o ramas. Su estructura cristalina fue publicada por Sumsion y McLachlan en 195085 y refinada más tarde por Robbins et al.86 Los estudios de difracción de rayos X muestran que el cristal es tetragonal, del grupo espacial P4 �21c. Se han diseñado varios tectones mediante la unión de grupos funcionales, capaces de formar enlaces de hidrógeno, en los anillos aromáticos. Ejemplos de ello son grupos hidroxilo,83 halógeno,87 carboxilo,88 etinilpiridinona,89 acetamido y aminobenzamido,90 y sus estructuras cristalinas ya han sido resueltas. Por lo general, poseen grandes compartimientos,88 y en ellas el enlace de hidrógeno, la coordinación con metales o las interacciones débiles juegan un papel decisivo. El átomo de carbono central se ha sustituido por Si, Sn y Pb,81,83,91-92 y además también se han usado otros núcleos como adamantilos tetra-armados,93 2,2',6,6'-tetracarboxibifenilos94 y éteres de pentaeritritiltetrafenil.82,95 También se han sintetizado compuestos en los que los brazos no implican restos fenilo96, así como otros núcleos con diferentes grados de ramificación.76 La estructura cristalina del ácido 4,4',4'',4'''-metanotetrailtetrabenzoico ha sido publicada por Malek et al88 así como la del compuesto análogo con silano.91 El cristal de III-11, recistalizado de etanol, es tetragonal (al igual que el del ácido 4,4',4'',4'''-metanotetrailtetrabenzoico), del grupo espacial I4 �2d. La estructura cristalina se muestra en la figura III.59 y en la tabla III.2 se muestran los datos de la celda unidad del cristal y otros parámetros de interés. El átomo central de la molécula es un carbono tetraédrico y por ello la estructura cristalina es de tipo diamantoide.97 Los angulos C-C-C poseen valores de 113.4 y 101.9º (figura III.60), lejos de los de un tetraedro regular (109.5º). Los anillos aromáticos que están directamente unidos al átomo central son cuasiplanos, siendo la distancia máxima desde cualquier átomo de carbono al plano de 0.005 Å. Por otro lado, estas distancias son mayores en los anillos isoftálicos, alcanzando valores máximos de 0.019 Å. Los ángulos entre los planos de los anillos aromáticos interiores son de 88.9º y 60.8º (figura III.61), y el ángulo entre los planos de los dos anillos aromáticos que pertenecen a la misma rama es de 70.9º. 85 Figura III.59.- Estructura cristalina del dendrímero III-11. Los puntos rojos representan moléculas de agua. Tabla III.2.-. Datos cristalográficos del compuesto III-11. Formula empírica C 61 H 40 N 4 O 20 Coeficiente de absorción (mm -1 ) 0.068 Peso molecular 1148.99 F(000) 2376 Temperatura (K) 100(2) Tamaño del cristal (mm3) 0.30×0.25×0.14 Longitud de onda (Å) 0.71073 Intervalo Theta (recogida de datos) (º) 1.38 a 26.46 Sistema cristalino Tetragonal Intervalo de los índices -16<=h<=16 - 23<=k<=23 - 29<=l<=29 Grupo espacial I -4 2 d Datos/ restricciones/ parametros 2402/1/196 a (Å) 18.9585(16) Bondad del ajuste en F2 1.113 b (Å) 18.9585(16) Índices R finales [I>2σ(I)] R1 = 0.0342 wR2 = 0.1049 c (Å) 23.703(2) Índices R (datos completos) R1 = 0.0377 wR2 = 0.1065 α, β, γ (º) 90° Coeficiente de extinción 2.2(12) Volumen (Å3) 8519.6(12) Máxima diferencia (Å-3) 0.168 y -0.299 Z/ densidad calculada (g/cm 3 ) 0.896 Figura III.60.- Detalle del átomo de carbono central en la molécula de III-11. 86 (a) (b) Figura III.61.- Ángulos formados por los planos de los anillos aromáticos interiores. Los enlaces de hidrógeno presentes en el cristal se muestran en la figura III.62 junto con sus parámetros geométricos al pié de la misma. En realidad sólo existe un único tipo de enlace de hidrógeno, N-H→O, en el que el átomo de nitrógeno actúa como donante y un átomo de oxígeno de uno de los grupos carboxilo del amino isoftálico actúa como aceptor. De esta forma, cada rama de la molécula queda unida a otras dos moléculas, siendo de destacar que el otro grupo carboxílico no participa en la formación de los enlaces de hidrógeno. Donante  H··Aceptor D  H H ·· A D ·· A Ángulo D  H A N(1)  H(1)···O(2) 0.863(18) 2.185(18) 3.024(2) 164(2) Figura III.62.- Enlaces de hidrógeno en el cristal de III-11 y sus correspondientes parámetros geométricos. En la figura III.63a-b se muestra el empaquetamiento de las moléculas en el cristal visto a lo largo de los ejes cristalográficos b y c (el empaquetamineto a lo largo del eje a es igual al empaquetamiento a lo largo de b pero girado 90º). En ella puede observarse la existencia de canales a lo largo de los ejes b y c. En la figura III.63c se muestra una vista ampliada de la seccion transversal a lo largo del eje b (o su equivalente a lo largo del eje a). La sección transversal del canal es casi una elipse perfecta con radios de 6.1 y 3.7 Å, lo que da un área de 71 Å2. En estos canales hay espacio suficiente para la inclusión de casi tres moléculas de agua desordenadas (figura III.63d y e). 87 (a) (b) (c) (d) (e) Figura III.63.- (a)-(b) Vistas de la estructura cristalina del dendrímero III-11 a lo largo de los ejes b y c, respectivamente (se ha omitido la inclusión del disolvente para una mayor claridad). (c) Dimensiones de los canales formados según las vistas de los ejes a y b. (d)-(e) Vistas de los canales que se forman en el empaquetamiento de III-11 a lo largo de los ejes a y b con moléculas de agua en su interior. La tabla III.3 contiene un resumen de los resultados encontrados en la bibliografía de los sistemas cristalinos, grupos espaciales y valores de secciones transversales para tectones similares. Asimismo, la figura III.64 muestra, a modo de ejemplo, la estructura cristalina de los canales que forman algunos derivados de pentaeritritil-tetrafenil éter, así como los valores de sus secciones tranversales. 6.1 Å 3.7 Å 88 Tabla III.3- Sistemas cristalinos, grupos espaciales y valores para las secciones transversales publicados para varios cristales de tectones. COMPUESTO Sistema cristalino Grupo espacial Sección/Å2 Ref. III-4 Monoclínico C2/c 5.4×4 = 22 88 NN NNH2 NH2 X= O OO O X XX X Ortorrómbico P21212 9×5 = 45 82 O OO OX X X X Tetragonal I1/a 4×2 = 8 O OO O N NN N Complejo con Cu(NO 3 ) 2 a partir de CH 3 CH 2 OH/H 2 O Ortorrómbico Cccm 6.4×7.3 = 47 95 Complejo con Cu(OOCCH3)2 a partir de CH3CH2OH/CH3OH/H2O Tetragonal I41/a 8.5×8.5 = 72 CuBF4 y PETPE* a partir de CH2Cl2/CH3CN PETPE=pentaeritritil tetrakis(4-piridil) éter. Monoclínico C2/c 4.4×4.4 = 19 O O O O N N N N R R R R Complejo con CuBF4 a partir de CH2Cl2/CH3CN CuBF4 Tetragonal P4/n 6.9×6.9 = 48 R = H. Cu(NO3)2 a partir de DMF/H2O Ortorrómbico Pban 5.5×5.5 = 30 R = CH 3. Cu(OOCCH 3 ) 2 a partir de etanol/metanol Tetragonal P42/n 22.7×22.7 = 515 Tetragonal P4/n Cavidades tipo jarra con una entrada estrecha (2.05×2.05 = 4.2) y una cavidad interior más amplia (13.36×13.3 6 = 178) 97 III-11 Tetragonal I-4 2d 6.1×3.7 = 71 89 Figura III.64.- Moléculas derivadas de pentaeritritil-tetrafenil éter que forman canales en la estructura cristalina.82,95 En la ampliación se muestran las dimensiones de la sección transversal de los canales más grandes. III.5 BIBLIOGRAFÍA (1) Soto Tellini, V. H.; Jover, A.; Meijide, F.; Vázquez Tato, J.; Galantini, L.; Pavel, N. V. Adv. Mater. 2007, 19, 1752. (2) Meijide, F.; Antelo, A.; Alvarez Alcalde, M.; Jover, A.; Galantini, L.; Pavel, N. V.; Vázquez Tato, J. Langmuir 2010, 26, 7768. (3) Soto Tellini, V. H.; Jover, A.; Galantini, L.; Pavel, N. V.; Meijide, F.; Vázquez Tato, J. J. Phys. Chem. B 2006, 110, 13679. (4) Alvarez Alcalde, M.; Jover, A.; Meijide, F.; Galantini, L.; Pavel, N. V.; Antelo, A.; Vázquez Tato, J. 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El adamantano es la molécula más simple de una familia de moléculas denominadas diamantoides, a la que pertenecen también sus homólogos diamantano y triamantano, que no son más que la unión de 2 y 3 celdas de adamantano respectivamente (figura IV.2). Existen también estructuras más complejas en las que el ordenamiento espacial de la celda del adamantano puede dar lugar a estructuras isómeras. Por ejemplo el tetramantano posee tres estructuras isómeras distintas (figura IV.3). El número de isómeros de los diamantoides, como cabría esperar, aumenta considerablemente después del tetramantano. Figura IV.2.- Estructuras moleculares del adamantano, diamantano y triamantano, los diamantoides más sencillos. No están representados los átomos de hidrogeno para una mayor claridad. 100 (a) (b) Figura IV.16.- (a) Estructuras de los precursores usados para la obtención de polímeros supramoleculares basados en β-CD y adamantano. (b) Imagen AFM del polímero supramolecular del tipo árbol de Cayley formado por la reacción entre el dímero huésped de adamantano y el trímero hospedador β-CD3. Más recientemente, Tao et al30 han sintetizado moléculas anfífilas lineales hiperramificadas consistentes por un lado en una β-CD que tiene injertado un poliglicerol ramificado y por otro lado se acopla un adamantano con una cadena alquílica larga de 18 átomos de carbono (figura IV.17a). Estas nuevas entidades sintetizadas se autoasocian en agua generando vesículas, que se puede desmontar fácilmente mediante la introducción de huéspedes competitivos. Las vesículas son unilaminares con una estructura de bicapa tal y como se muestra en la figura IV.17b, y presentan una gran estabilidad persistiendo incluso hasta medio año después de preparar la muestra. También son flexibles y muestran una gran ductilidad bajo una fuerza externa, por ejemplo bajo la acción de la punta en los experimentos de AFM. (a) (b) Figura VI.17.- Obtención de vesículas mediante moléculas anfifílicas lineales ramificadas. (a) Esquema de síntesis. (b) imagen crio-TEM de las vesículas formadas. Uno de los objetivos particulares de atención por parte de nuestro grupo de investigación y por ende del presente trabajo, es la síntesis de nuevos derivados de adamantano con cualidades surfactantes que presenten bajos valores de cac3 aprovechando la naturaleza hidrófoba de dicho grupo. De esta manera podríamos conseguir compuestos con potenciales aplicaciones en el campo industrial, como por ejemplo como agentes de flotación en minería, demulsificantes o precursores de superficies superhidrofobas,31 sin olvidar las aplicaciones ya vistas en los campos farmacológico y médico (antivirales y liberación y absorción de fármacos). 101 Como ya hemos comentado, la naturaleza hidrófoba del adamantano hace que sus compuestos sean muy poco solubles en agua (excepto que posean grupos cargados en la molécula), lo que dificulta el estudio de sus propiedades surfactantes en disolución acuosa. Por este motivo, son pocos los trabajos publicados a este respecto. Uno de los primeros se debe a Menger y Migulin,1 quienes sintetizan moléculas gemini usando como núcleo un adamantano al cual le unen cuatro cadenas alquílicas que poseen nitrógenos cuaternarios que le aportan solubilidad (figura IV.18). Aun así, no todos los derivados que sintetizaron pudieron ser estudiados ya que algunos presentaban una solubilidad muy baja en agua, sobre todo los derivados con cadenas a partir de 10 átomos de carbono. Los resultados obtenidos para los compuestos solubles presentaban, efectivamente, valores bajos de cac. Por ejemplo, en el caso del gemini con una cadena de 8 átomos de carbono el valor de la misma es 6×10-3 M, claramente inferior a la del bromuro de trimetiloctilamonio (0.5 M), surfactante con que comparan los autores los derivados sintetizados. Figura IV.18.- Ruta sintética para la obtención de moléculas gemini con adamantano utilizada por Menger y Migulin.1 Posteriormente, en año 2001, Vashkevich et al4 sintetizaron sales cuaternarias de amonio derivadas de adamantano (figura IV.19) con muy buenas solubilidades y características surfactantes. Estudiaron sus capacidades de flotación, siendo uno de los derivados capaz de extraer el KCl en los minerales de silvinita. Este hecho es importante porque las sales cuaternarias de amonio son ampliamente utilizadas en diversas ramas de la industria como antiestáticos, detergentes o como reactivos que confieren hidrofobia a las impurezas de la arcilla para su posterior separación. Figura IV.19.- Derivados de adamantano sintetizados por Vashkevich et al.4 No es hasta el año 2012 cuando Guo et al3 retoman de nuevo la síntesis de nuevas sales cuaternarias de amonio derivadas de adamantano con cadenas alquílicas de diferente longitud (figura IV.20). Llevan a cabo estudios de tensión superficial, y encuentran valores de cac en el intervalor 12-2×10-3 M, respectivamente para los derivados con las cadena más corta (8 átomos de carbono) y más larga (16 átomos de carbono). Puesto que la cac del surfactante DTAB (catiónico con una cadena alquílica de 12 átomos de carbono) es de 0.016 M, comprueban que la incorporación del grupo adamantano mejora claramente el comportamiento superficial. 102 Figura IV.20.- Surfactantes derivados de sales cuaternarias de amonio con distintas longitudes de cadenas alquílicas sintetizados por Guo et al.3 Recientemente, Zhu et al2 han sintetizado surfactantes catiónicos triméricos basados en el adamantano con cadenas de ocho a doce átomos de carbono, cuya cac posee valores en el intervalo 2-0.5×10-3 M, figura IV.21. Figura IV.21.- Surfactantes sintetizados por Guo et al. 3 Hasta ahora hemos visto ejemplos de surfactantes catiónicos a los que se añade un grupo adamantilo, o bien se emplea el adamantano como un núcleo al que se le unen residuos catiónicos para obtener nuevos derivados con una actividad superficial mejorada. Sin embargo, en nuestro grupo investigación se ha sintetizado un dímero de adamantano de naturaleza aniónica (con un puente de AEDT, IV-1, figura IV.22a) perfectamente soluble en agua y con buenas cualidades surfactantes. En una concentración de 0.020 M, este derivado rebaja la tensión superficial del agua29 hasta un valor de 49 mN m-1, cuando el ácido adamantano acético a la misma concentración5 la reduce tan sólo hasta 62 mN m- 1. Recordemos que este derivado se empleó también para la obtención de polímeros supramoleculares mediante la complejación con β-CD. (a) (b) Figura IV.22.- (a) Dímero de adamantano (IV-1) sintetizado en nuestro grupo de investigación, y (b) estructura del producto comercial, ácido adamantano acético. Por último el grupo adamantilo, tal y como se comentó al inicio de este capítulo, se ha usado para modificar el balance hidrófobo/hidrófilo de las sales biliares.7 Debido a esta modificación se produce una fuerte reducción de la cac al mismo tiempo que se produce la formación de nuevas estructuras laminares (recuérdese figura II.13 del capítulo II). IV.2 ESTUDIO DE SURFACTANTES DERIVADOS DEL ADAMANTANO Y CADENAS ALQUÍLICAS DE DIFERENTE LONGITUD USANDO COMO GRUPO DE CABEZA EL ÁCIDO NITRILOTRIACÉTICO Los fosfolípidos son diglicéridos que pueden ser considerados como derivados de las grasas en las que uno de los ácidos grasos ha sido sustituido por un resto fosfórico y, probablemente, son los surfactantes más importantes de las membranas biológicas. Tanto en los ácidos grasos como en los fosfolípidos la columna vertebral es el glicerol. El N H N HO O O H N N OH O O IV-1 HOO 103 residuo fosfórico incorpora aminas como la colina (lecitinas), etanolamina (cefalina), o serina (fosfátidos serina) como grupos de cabeza. A partir de glicerol, se pueden diseñar muchos surfactantes diferentes. Por ejemplo, Zhu et al32 han preparado series de surfactantes con dobles y triples cadenas basados en glicerol con dos grupos iónicos (ya sea sulfonato, sulfato o carboxilato). En comparación con los correspondientes surfactantes de cadena simple y doble, los surfactantes de cadena de triple muestran excelentes propiedades surfactantes. La naturaleza nos ofrece otras alternativas en el uso del glicerol como columna vertebral. Ejemplo de ello son los esfingolípidos que se derivan de la esfingosina, en lugar de glicerol. En la esfingomielina el grupo hidroxilo terminal está unido a fosfocolina mientras que el grupo amino está unido a un ácido graso a través de un enlace amida, figura IV.23. Muchos otros derivados se encuentran en la naturaleza como son las ceramidas y glicoesfingolípidos (cerebrósidos y globósidos). (a) (b) Figura IV.23.- (a) Estructura general de un esfingolípido y (b) estructura de la esfingomielina. Estos surfactantes presentes en la naturaleza han inspirado un trabajo que se discutirá ampliamente en el capítulo VI en el que se diseñan nuevos surfactantes en los que el ácido nitrilotriacético constituye la columna vertebral de dichas moléculas. La estrategia sintética llevada a cabo es un ejemplo de la biomimética molecular ya que el diseño está inspirado en el conocimiento de la estructura y las propiedades de los fosfolípidos naturales. El glicerol y el ácido nitrilotriacético poseen en común un átomo central, carbono para el glicerol y nitrógeno para el ácido nitrilotriacético, del que emergen tres funciones orgánicas (que son grupos hidroxilo o carboxilo, respectivamente), figura IV.24. OHNOH O HO O O OH H C OH HO (a) (b) (c) Figura IV.24.-Estructuras del (a) ácido nitrilotriacético, (b) glicerol y (c) un fosfolípido En este apartado se da cuenta de los resultados alcanzados con surfactantes que hemos diseñado a partir del ácido nitrilotriacético con sustituyentes hidrófobos a base de adamantano y cadenas alquílicas de diferente naturaleza y longitud. De esta manera, hemos sintetizado un derivado simétrico en el cual R1 = R2 = adamantilo, y tres derivados asimétricos (R1 = CH3(CH2)11, CH3(CH2)17, CH3(CH2)7CH=(CH2)8; R2 = adamantilo), todos ellos recogidos en la figura IV.25. Ácido graso esfingosina ácido graso fosfocolina 104 NO - O NH HN O O R 1 R 2 R 1 =R 2 = (CH 2 ) 11 CH 3 R 2 = (CH 2 ) 17 CH 3 (CH 2 ) 8 CHCH(CH 2 ) 7 CH 3 R1= R1= R1= IV-10 IV-8 IV-9* * IV-3 Figura IV.25.- Estructura general de los surfactantes sintetizados y estudiados en este apartado. El grupo adamantilo fue elegido ya que este grupo hidrófobo apenas ha sido el núcleo de la investigación sistemática en química de surfactantes, aunque todos los ejemplos conocidos sugieren que se debería prestar más atención a este grupo voluminoso. Todos los experimentos descritos en este apartado se han llevado a cabo a 25 ºC y en una disolución de NaOH 0.010 M (pH=12) para asegurar la completa ionización del grupo carboxílico, ya que hemos estimado valores de pKa de 3.01 para IV-3 y 3.03 para los derivados IV-8 a IV-10 mediante el software MarvinSketch. Los resultados obtenidos de las medidas de tensión superficial con el método del plato de Wilhelmy se muestran en la figura IV.26, en la que se observa la presencia de dos regiones lineales cuyo punto de corte nos permite obtener el valor de la cac así como la tensión superficial correspondiente a esta cac, γ cac. -6 -5 -4 -3 -2 -1 0 1 2 36 40 44 48 52 56 60 64 68 72 γ (mN/m) Ln C (mM) IV-3 -10 -9 -8 -7 -6 -5 -4 -3 -2 -1 012 32 36 40 44 48 52 56 60 64 68 72 76 80 IV-8 IV-10 IV-9 γ (mN/m) Ln C (mM) Figura IV.26.- Dependencia de la tensión superficial de los surfactantes IV-3 (izquierda) y la serie IV-8 a IV-10 (derecha) con la concentración en disoluciones de NaOH 0.010 M a una temperatura de 25 ºC. Los valores obtenidos se resumen en la tabla IV.1, así como otros datos bibliográficos para surfactantes similares. De acuerdo con la figura IV.26 y lo recogido en la tabla IV.1 se pueden observar tres hechos fundamentales: (i) El derivado IV-3 posee una cac de 1.3×10-3 M, por encima de la cual se forman agregados. Este hecho no se observa en el derivado IV-1 de la figura IV.22a que posee un puente de AEDT. Aunque ambos compuestos poseen dos grupos adamantilo, difieren en el número de grupos iónicos. El derivado IV-3, con un único grupo iónico, es más hidrófobo que el dímero IV-1, que posee dos y, por lo tanto posee un carácter más hidrófilo. De hecho IV-3 a una concentración de 1×10-3 M rebaja la tensión superficial del agua a 44 mN m-1, mientras que el valor que se alcanza con IV-1 es 64 mN m-1. Para 105 el caso del adamantil carboxilato se obtiene prácticamente el valor del agua, usando las mencionadas condiciones experimentales. Tabla IV.1.- Parámetros deducidos de experimentos de tensión superficial para la agregación y adsorción en la interfase aire-agua del dímero de adamantano IV-3, de los derivados IV-8, IV-9 y IV-10, y de otros compuestos publicados. Surfactante 10 3 cac (M) γ cac (mNm -1 ) a o (Å 2 ) Área molecular proyectada (Å 2* ) Ref. Sodio-2- dodecanoaminoacetato 8.3-14 39 63 33-34 Lauraeato sodico(25ºC) 25.2 36.8 46.9 35 Oleato sódico (con NaCl) 0.40-2.7 47, 40 H 2 O/ben ceno 36- 38,39 Estearato sódico 1.8 37 VI-1 0.0476 40.2 49 40 IV-3 1.3 41 47 96 IV-8 0.010 37 40 83 IV-9 0.16 50 72 80 IV-10 0.03 44 31 93 C8H17 C10H21 C12H25 C 16 H 33 12 8 4 2 3 1a= 2 1b= 1 1c=0,5 2 (ii) El valor de la cac correspondiente a IV-8 es tres órdenes de magnitud inferior que la cac del sodio-2-dodecanoaminoacetato,33 que es el N-dodecil derivado de la glicina y que posee un grupo amida como puente entre la cadena hidrófoba de 12 átomos de carbono y el grupo hidrófilo. Por otra parte, la cac de IV-10 es al menos un orden de magnitud más baja que la del oleato sódico (para el que se han publicado valores en el intervalo 0.4-2.7×10-3 M)36-39 y la cac de IV-9 es 10 veces menor que para el estearato sódico.37 Por lo tanto, los nuevos derivados sintetizados son del orden de 1 a 3 órdenes de magnitud más eficientes en la formación de agregados con respecto a surfactantes alquilcarboxilato con una longitud de cadena similar. No es fácil comparar los valores de cac obtenidos por los surfactantes sintetizados con otros surfactantes ramificados (incluyendo a los gemini) ya que todos ellos llevan dos cadenas hidrocarbonadas y la comparación, al no ser directa, sería de alguna manera artificial. Los surfactantes más cercanos a los estudiados aquí pertenecen a una serie de surfactantes de amonio cuaternario sintetizados por Guo et al,3 a partir del ácido 1- adamantanocarboxilico (ver tabla IV.1, penúltima fila). En este caso tanto el grupo adamantilo como las cadenas alquílicas están unidos directamente a un átomo de nitrógeno que posee la carga positiva. Los valores de cac están en el rango de 2-12×10-3 M a lo largo de la serie C8-C16 y siguen la tendencia esperada para los surfactantes convencionales, en los cuales se asocia una cac elevada con una cadena hidrocarbonada * Calculadas según lo comentado en el apéndice B. NR Br 106 corta,41-42 Los valores que se han obtenido para los surfactantes aquí sintetizados son mucho más pequeños que los publicados por Guo et al. Por ejemplo el valor para IV-8 es 400 veces más pequeño que el derivado C12 amonio cuaternario. (iii) Si se comparan los valores de las cac de los derivados IV-8, IV-9 y IV-10, se observan anomalías evidentes, ya que IV-8 (con una cadena de 12 átomos de carbono) posee una cac menor que IV-9 (con 18 átomos de carbono), es decir la cadena más corta va asociada al valor de cac más bajo, hecho contrario al observado en surfactantes con una cadena alquílica sin ramificaciones (en los que la cac disminuye siguiendo un patrón regular con el aumento del número de átomos de carbonos en la cadena).41 Además, los derivados IV-9 y IV-10, que únicamente se diferencian en un doble enlace en la cadena hidrocarbonada, vuelven a presentar un comportamiento anómalo en sus cac, puesto que es un hecho conocido que la introducción de un doble enlace en la cadena tiende a incrementar el valor de la cac en comparación con el surfactante correspondiente sin el doble enlace37 y, en este caso, se observa el comportamiento inverso: cac IV-10 ˂˂ cac IV-9. El comportamiento superficial fue analizado mediante la isoterma de adsorción de Gibss (ecuación [A.4]) para la obtención del área que ocupa cada una de las moléculas en la interfase, ao. Los valores obtenidos para cada uno de los surfactantes se resumen en la tabla IV.1. Resulta ilustrativo comparar algunos parámetros geométricos con el área de equilibrio en la interfase, a0. La sección transversal de una cadena hidrocarbonada,43 Ac≈20 Å2, coincide con el área que ocupa una molécula en una monocapa de alcoholes de cadena alquílica larga. Por ejemplo, para el 1-octadecanol44 se ha obtenido un valor de 23 ± 0.1 Å2/molécula, una coincidencia esperada ya que la monocapa se encuentra altamente ordenada. Sin embargo el valor de Ac es mucho más pequeño que los valores de a0 (47 Å2) para las sales sódicas del laureato, oleato45-50 y 2-dodecanoaminoacetato (63 Å2).34 La diferencia se debe principalmente a las repulsiones electrostáticas entre los grupos de cabeza iónicos. Incluso para los fosfolípidos, portadores de una doble cadena, la sección transversal de las dos cadenas (2Ac≈42 Å2)51 es también menor que los valores de a0, que se encuentran en el intervalo de 60-67 Å2.52-54 Podemos adelantar que para el caso del compuesto VI-140 (véase figura VI-5 en el capítulo VI para su estructura), con dos cadenas de doce átomos de carbono, 2Ac ≈ a0 = 49 Å2. Por otra parte, la sección transversal correspondiente a dos grupos adamantilo cercanamente empaquetados deducida de la estructura cristalina55 del dímero de adamantano IV-1 posee un valor de 89.7 Å2. A partir de modelos moleculares obtenemos un valor de 96 Å2 para IV-3 (figura IV.27) muy cercano al anterior. Por lo tanto, se puede aceptar un valor de Aad ≈ 45 Å2 para cada residuo de adamantano. Para el caso de IV-3, si se formara una monocapa de residuos adamantilo, incluso sin considerar ninguna repulsión ion-ion, 2Aad debería ser el valor mínimo que presentase a0, debido a requerimientos estéricos. Sin embargo el valor experimental de a0 (=47 Å2) está más próximo a Aad. Este hecho sugiere que se está produciendo la formación de una bicapa en la interfase aire-agua estructura que implica una disposición óptima de empaquetamiento que favorece la interacción hidrófoba entre los residuos de adamantilo y que al mismo tiempo no impide la interacción del grupo carboxilato con el agua (figura IV.28). 107 Figura IV.27.- Área teórica que ocuparía la molécula de IV-3, calculada según métodos moleculares indicados en el apéndice B. Figura IV.28.- Representación esquemática de la bicapa formada por IV-3 en la interfase aire-agua. Para el caso de los surfactantes IV-8 y IV-10 podemos asumir los mismos comentarios que para IV-3 toda vez que sus áreas proyectadas serían 20+45 = 65 Å2, mientras que los valores de a0 determinados fueron de 40 y 31 Å2, respectivamente. Efectivamente, estos valores vuelven a sugerir la formación de una multicapa en la interfase aire/disolución (probablemente con dos o tres capas), que podría ser por superposición de los grupos adamantilo de moléculas adyacentes tal y como se muestra en la figura IV.29. Por el contrario, el valor obtenido para el surfactante IV-9, a0 = 72 Å2, es comparable al del área proyectada (65 Å2) y compatible con la formación de una monocapa en la interfase. Este comportamiento diferente al de los otros dos derivados IV- 8 y IV-10 se justifica más adelante. La agregación de estos surfactantes también se estudió mediante medidas de fluorescencia en presencia de pireno. La dependencia de la relación I1/I3 con la concentración de cada uno de los surfactantes se representa en la figura IV-30, y los valores de cac obtenidos a partir de los puntos de inflexión de cada gráfica con el típico perfil sigmoide56 son del orden de magnitud que los obtenidos a partir de las medidas de tensión superficial. La relación I1/I3 toma valores entre 1.7 y 1.9 cuando la concentración de los surfactante es baja y sólo existen monómeros en la disolución, encontrándose el pireno en un medio acuoso polar.57 Por otra parte, a concentraciones de surfactante elevadas, la relación I1/I3 toma valores entre 0.95 y 1.1, que son aproximadamente iguales a los obtenidos para el caso del derivado VI-1 (I1/I3 = 1.0) que estudiaremos más detalladamente en el capítulo VI, y a los correspondientes al laureato sódico58 (1.1) y al dodecil sulfato sódico57 (1.16). Estos valores sugieren que el pireno se acomoda en un Aire Agua Bicapa 108 microentorno ligeramente apolar generado por los agregados de los nuevos compuestos sintetizados.59-61 Figura IV.29.- Disposiciones propuestas para las moléculas de surfactante en la interfase aire/disolución para los derivados IV-9 (monocapa), y IV-8 y IV-10 (multicapa). -1,6 -0,8 0,0 0,8 1,6 2,4 3,2 4,0 0,8 1,0 1,2 1,4 1,6 1,8 I 1 /I 3 LnC(mM) IV-3 Figura IV.30.- Dependencia de la relación de intensidades de fluorescencia, I1/I3 para cada uno de los cuatro surfactantes (en disoluciones de NaOH 0,01 M) estudiados en este apartado. Al estudiar el comportamiento de la formación de micelas de dos series de surfactantes catiónicos gemini mediante medidas de tensión superficial, Song y Rosen62 observaron el aumento esperado en la actividad superficial al aumentar la longitud de la cadena alquílica con respecto al homólogo de cadena más corta. Esta es la misma tendencia observada para los surfactantes convencionales, ya que es bien sabido que existe una relación lineal entre el logaritmo de la cmc y el número de átomos de carbono en la cadena de alquilo.63 Sin embargo, se observaron desviaciones de esta regularidad con un aumento de la longitud de la cadena cuando el número de átomos de carbono excede de un cierto número (que varía con el contenido de electrolito y la temperatura de la disolución). Ejemplos de este comportamiento aberrante atañen tanto a la cac como al área por molécula. Anomalías similares han sido observadas por Menger y Littau64 y Li et al65 para surfactantes gemini, en particular para los que tienen cadenas alquílicas de 18 átomos de carbono. El comportamiento anormal en cuanto a la agregación fue confirmado posteriormente por Rosen et al66 mediante medidas de fluorescencia en estado estacionario usando el pireno-3-carboxaldehído como sonda. Observaron perfiles sigmoidales y notaron que el grado de curvatura entre las dos mesetas es muy diferente para algunos surfactantes gemini convencionales. De esta manera, la pendiente en el punto de inflexión permanece Agua Aire Monocapa Bicapa Tricapa (CH 2 ) 8 CH CH 3 (CH 2 ) 7 CH -7 -6 -5 -4 -3 -2 -1 0 1 2 0,8 1,0 1,2 1,4 1,6 1,8 2,0 12-ida-ad 18-ida-ad 18=-ida-ad I 1 /I 3 Ln C(mM) IV-8 IV-9 IV-10 109 relativamente constante (independientemente de la longitud de cadena) para los surfactantes monoalquilo pero se vuelve progresivamente más suave cuando aumenta la longitud de la cadena de los gemini. Todos estos y otros comportamientos anormales62,64-67 se han interpretado sobre la base de la formación de estructuras multicapa o submicelas y agregados no activos superficialmente, previos a la formación de las verdaderas micelas. La propuesta de formación de multicapas o agregación pre-micelar puede ser válida para entender el comportamiento de IV-8 y IV-10 y también explicaría la ausencia de puntos de inflexión pronunciados en las gráficas de tensión superficial (Figura IV.26). A concentraciones cerca de la cac, la composición de la interfase aire-agua podría cambiar debido a una migración gradual de moléculas hacia agregados sub-micelares en solución, lo que resulta en un incremento del área superficial por molécula y pendientes progresivamente más bajas cerca de la cac, tal y como se observó. Por otro lado, de acuerdo con Menger y Littau64 este comportamiento anómalo está ligado a la estructura de los surfactantes gemini ya que estos podrían auto-enrollarse debido a interacciones intermoleculares68 y las cadenas largas podrían verse afectadas por los requerimientos energéticos para desenrollarse y reorganizarse antes de la formación de las micelas. Consideramos que esta interpretación es también aplicable a los surfactantes que estamos estudiando en este apartado. La cadena grande y flexible del compuesto IV-9 puede auto-enrollarse sobre los adamantanos (Figura IV.29, izquierda) evitando así un apilamiento de grupos adamantilo de moléculas adyacentes y la formación de multicapas en la interfase aire-agua. Sin embargo, las cadenas de los compuestos IV-8 y IV-10 serían demasiado cortas o demasiado rígidas, respectivamente, para el proceso de auto-enrollamiento, por lo que sería posible la superposición de grupos adamantilo y la consiguiente formación de multicapas. Hemos estudiado la morfología y tamaño de estos agregados mediante experimentos de dispersión de luz y microscopía TEM en disolución. Por encima de la cac se observa que todos los surfactantes forman grandes agregados que crecen con el tiempo. En la figura IV.31 se muestran algunas imágenes TEM, típicas entre las registradas, para el compuesto IV-3. A la vista de ellas podemos decir que: (1) coexisten pequeños agregados (40-50 nm), con una forma globular y un contorno difuminado, con agregados de mayor tamaño, incluso superior a 1µm (figura IV.31a); y (2) con el tiempo los agregados más pequeños tienden a asociarse para formar agregados más grandes (figura IV.31b). Las estructuras generadas por este compuesto recuerdan enormemente las estructuras (figura IV.32) del dímero de adamantano IV-1.55 El compuesto IV-8 también da lugar a agregados esféricos cuyos tamaños varían en el intervalo de 10 a 280 nm (figura IV.33a), con un diámetro medio de 131±57 nm (obtenido a partir del análisis de 80 agregados). Este valor concuerda con el valor del radio hidrodinámico deducido a partir de medidas de DLS (159±3 nm, obtenido después de 19 horas). Asimismo, se observa un proceso de agregación con el paso del tiempo que da lugar a partículas de tamaño micrométrico (figura IV.33b). Las imágenes registradas permiten hacer una propuesta más detallada de este proceso: cuando las partículas se aproximan se produce una deformación de la membrana, que después se rompe originando la fusión de agregados pequeños en otros más grandes. 116 (5) Meijide, F.; Trillo, J. V.; de Frutos, S.; Jover, A.; Vázquez Tato, J.; Soto, V. H.; Galantini, L. EDTA: Synthesis, Uses and Environmental Concerns, Nova Publishers New York, 2013 2013, Molnar, Andris, Editor, Chapter 1. (6) Soto Tellini, V. H.; Jover, A.; Galantini, L.; Pavel, N. V.; Meijide, F.; Vázquez Tato, J. J. Phys. Chem. B 2006, 110, 13679. (7) Armstrong, M. J.; Carey, M. C. J. Lipid Res. 1982, 23, 70. (8) McIntosh, G. C.; Yoon, M.; Berber, S.; Tománek, D. Phys. Rev. B 2004, 70. (9) Yao, M.; Stenmark, P.; Abou-Hamad, E.; Nitze, F.; Qin, J.; Goze-Bac, C.; Wagberg, T. Carbon 2011, 49, 1159. (10) Vazquez, D.; Mansoori, G. A. J. Petroleum Sci. Eng. 2000, 26, 49. (11) Dahl, J. E.; Liu, S. G.; Carlson, R. M. K. 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Esta propiedad la explotaremos con la síntesis de dos nuevos derivados tipo dendrímero usando como base el ácido 4,4',4'',4'''-metanotetrailtetrabenzoico (III-4), empleada anteriormente para la síntesis de dendrímeros derivados de sales biliares (capítulo III). La unión de una cadena alquílica de naturaleza hidrófoba al éter corona, tal y como hicimos en los surfactantes con un grupo adamantilo del capítulo anterior, genera los denominados surfactantes derivados de éteres corona, capaces de formar micelas de una manera similar a los surfactantes iónicos o estructuras supramoleculares más complejas en agua.1 Desde un punto de vista de la ciencia de surfactantes los éteres corona funcionalizados con cadenas alquílicas son importantes ionóforos* que permiten el transporte iónico a través de membranas.2 V.1 ÉTERES CORONA. HISTORIA Antes del descubrimiento de los éteres corona por Pedersen en el año 1961, la literatura científica contaba con referencias a poliéteres macrocíclicos que contenían cuatro o más átomos de oxígeno. Desafortunadamente, los autores de estos trabajos no se percataron de la potencialidad de los compuestos cuyas síntesis habían descrito. Los primeros poliéteres macrocíclicos fueron obtenidos en 1937 por Lüttringhaus3 en forma de ciclos de múltiples eslabones con bajo rendimiento en la reacción de derivados del 1,3- dihidroxibenceno (resorcinol) monosustituido (figura V.1). O XBr OH O X OO X O K 2 CO 3 1-pentanol Figura V.1.- Poliéter macrocíclico obtenido por Lüttringhaus. En el año 1955 Ackman3 sintetizó el derivado de tetrafuranilo de la figura V.2 a partir de la condensación de furano con acetona en medio ácido, y representa el primer sistema en el que existía un nivel de organización relativamente alto en el que los cuatro átomos de oxígeno están orientados hacia el centro de la cavidad. Estos nuevos derivados se denominaron anhidrotetrámeros y, aunque la estructura es similar a las porfirinas, en este compuesto no existe realmente una conjugación extendida (figura V.2). En el año 1957 Stewart et al4 llevaron a cabo el proceso de ciclooligomerización del óxido de etileno. El tratamiento del oxido de etileno con ácidos de Lewis (AlEt3 y ZnEt2) en benceno produjo dioxano y otra serie de compuestos macrocíclicos, entre los que se * Moléculas solubles en lípidos que generalmente son sintetizadas por microorganismos y que se encargan del transporte de iones a través de la doble capa lipídica de la membrana celular. 120 encontraba el tetrámero del óxido de etileno (figura V.3). Llegaron a intuir que este macrociclo poseía propiedades interesantes, pero no descubrieron su potencial, indicando únicamente las posibilidades de empleo como disolvente de alto punto de ebullición. Sin embargo, Down et al5 encontraron que este tetrámero disolvía pequeñas cantidades de potasio para dar disoluciones azules inestables de electrones y cationes solvatados. Figura V.2.- Similitud entre el derivado de tetrafuranilo sintetizado por Ackman (izquierda) y el núcleo de la porfirina (derecha), aunque en el tetrafuranilo no existe una conjugación extendida. O AlEt 3 o ZnEt 2 OO O O Figura V.3.- Tetrámero del óxido de etileno obtenido por Stewart et al. 4 Ninguna de las especies que se habían descrito hasta ese momento hacía referencia a la formación de complejos estables entre los compuestos sintetizados y sales de elementos alcalinos y alcalino-térreos. Tuvo que ser en 1961 cuando el químico industrial Charles J. Pedersen (Premio Nobel en 1987), que se encontraba trabajando en el laboratorio de elastómeros de la compañía Dupont Chemical, descubriera de forma accidental unos compuestos que denominó como ‘compuestos corona’.6-7† Su objetivo se centraba inicialmente en la síntesis de compuestos fenólicos acíclicos que pudieran complejar o coordinar complejos catiónicos y, asumiendo que sería necesaria la presencia de cargas negativas para estabilizar los cationes, comenzó la síntesis de bisfenol derivados que pudieran desprotonarse a pH moderado. Durante la preparación del compuesto difenólico a partir del catecol monoprotegido y del bis(2-cloroetil) éter obtuvo, después de la desprotección de los grupos fenólicos, los dos compuestos de la figura V.4. El minoritario cristalizaba muy bien en forma de cristales blancos fibrosos y era poco soluble en metanol, pero si se añadían sales de sodio se disolvía sorprendentemente rápido, hecho que llamó su atención hasta el punto de afirmar que: ‘el ion sodio había caído en un agujero en el centro de la molécula’.7 La obtención de este producto derivaba de la presencia de catecol desprotegido como contaminante del catecol monoprotegido. Por lo tanto, el descubrimiento de esta familia de oligo-etilen-glicol éteres y de sus propiedades de complejación de cationes supuso un hecho ciertamente fortuito pero de ningún modo casual. † “My excitement, which had been rising during this investigation, now reached its peak and ideas swarmed in my brain. I applied the epithet CROWN to the first member of this class of macrocyclic polyethers because its molecular model looked like one, and with it, cations could be crowned and uncrowned without physical damage to either, just as the heads of royalty” O O O O 121 OH OO + O ClCl OH O O HO O con catecol desprotegido + O O O O O O 1. NaOH/n-BuOH 2. H2O/H+ Figura V.4.- Secuencia sintética empleada para la obtención del primer éter corona descubierto por Pedersen. Es evidente3 la importancia de estas moléculas como compuestos modelo para actuar como portadores de iones en las membranas, y su similitud fundamental con los antibióticos naturales como la nonactina y la valinomicina de la figura V.5 (que son capaces de incorporar los metales alcalinos Na+ y K+ y, de esta manera, introducirlos en el interior de sistemas biológicos, por ejemplo a través de membranas). El trabajo pionero de Pedersen proporcionó así un sistema crucial para hacer frente a los conceptos clásicos de la química y medidas con el campo recién abierto de la permeación de iones en las membranas lipídicas. El conocimiento de cómo los iones interactúan selectivamente con las moléculas descubiertas por Pedersen sigue siendo fundamental para entender la unión de los iones al esqueleto peptídico, una característica importante de los sitios de unión de iones en enzimas proteicas y sus canales.8 (a) (b) Figura V.5.- Ionóforos naturales: (a) nonactina y (b) valinomicina. A día de hoy, aún no se ha llegado a proponer una definición estricta de los compuestos corona. La definición original descrita por Pedersen se refiere a compuestos con átomos de oxígeno incorporados en un esqueleto monocíclico. Sin embargo, existe la ambigüedad entre los términos éter corona y compuesto macrocíclico, por lo que de un modo más general se pueden describir como compuestos macrocíclicos que poseen en su estructura átomos de O, N, ó S como dadores de electrones, porque todavía no se ha llegado a un acuerdo sobre qué tipo de compuestos macrocíclicos deben ser excluidos de la categoría de los éteres corona. Los compuestos corona se clasifican en tres grupos distintos según el tipo de estructura que tengan:9 (i) sistemas monociclos conocidos como coronandos, que pueden contener cualquier heteroátomo; (ii) ligandos oligociclos que se denominan criptandos, que también pueden contener cualquier heteroátomo y que fueron introducidos por Lehn10 en la década de los 70; y (iii) compuestos de cadena abierta conocidos como podandos (análogos de coronandos y criptandos). Por motivos históricos aquellos coronandos que 122 contienen únicamente oxígenos como heteroátomos se conocen como éteres corona. La figura V.6 nos da una idea de las múltiples estructuras posibles con ejemplos de las estructuras descritas. El tamaño de los anillos de los éteres corona varía generalmente desde los 12 a los 30 átomos, teniendo de 4 a 10 átomos dadores. Cadena abierta Ligando monociclo Ligando oligociclo Podando Coronando Criptando D: átomo dador D = O: éter corona B: átomo puente (a) (b) Figura V.6.- (arriba) Clasificación de los compuestos corona. (abajo) Estructuras moleculares de dos compuestos corona, (a) un podando y (b) un criptando. A la hora de nombrar los compuestos corona, Pedersen siguió una serie de normas que siguen usándose actualmente debido a su tremenda sencillez.6 Así, el tamaño del anillo se escribe con un número entre corchetes que corresponde al número total de átomos de la molécula; después se añade el nombre corona, y por último se da el número de heteroátomos. Las ventajas de esta nomenclatura se hacen evidentes cuando comparamos, por ejemplo, el nombre trivial propuesto para el dibenzo[18] corona 6 con su nombre IUPAC: 2,5,8,15,18,21-hexaoxatriciclo[20.4.0.0]hexacosa-1(22),9,11,13,23,25 hexaeno. También es habitual usar acrónimos como ‘18C6’, para nombrar al [18]-corona- 6 o ‘DB18C6’, para nombrar al dibenzo[18]-corona-6. La figura V.7 recoge algunos ejemplos de estas nomenclaturas. [18] corona 6 18C6 Diciclohexano[18] corona 6 DCH18C6 Dibenzo[18] corona 6 DB18C6 Figura V.7.- Ejemplos de la nomenclatura usada en éteres corona. Una de las desventajas de esta nomenclatura es que no hace referencia a la posición de los átomos de oxígeno en el anillo. Aún así, su simplicidad y el hecho de que obtengamos información sobre el tamaño del anillo y el número de heteroátomos O O O O O O O O O O O O O O O O O O 123 presentes hace que esta nomenclatura siga siendo muy usada en la actualidad. Cuando tenemos macrociclos con heteroátomos distintos de oxígeno, como pueden ser azufre o nitrógeno, el nombre que se le da a los compuestos es el de tioéteres corona o azaéteres corona respectivamente (figura V.8a). También existen sistemas mixtos en donde están presentes oxígeno, azufre y nitrógeno dentro de la misma molécula, o incluso se pueden introducir en los anillos ésteres, amidas y cetonas como grupos donantes (figura V.8b). S S S SS S O N HO OO H N NH N HHN HNNH H N S O SNH (a) O O O OO O OO OO NH N HN OO O O O (b) Figura V.8.- (a) Ejemplos de tioéteres corona, azaéteres corona y compuestos mixtos donde están presentes átomos de O, N y S. (b) Éteres corona con grupos funcionales como cetonas y amidas. V.2 PROPIEDADES DE LOS COMPUESTOS CORONA La característica más interesante de los compuestos corona es su habilidad para formar complejos estables con cationes de sales metálicas, sales de amonio o compuestos orgánicos iónicos que se unen al compuesto corona. La influencia de las propiedades físicas del disolvente, el tamaño del anillo del éter corona con respecto al tamaño del ion, el número y tipo de átomos donantes (íntimamente ligados con el tamaño del anillo), la flexibilidad del anillo, sus sustituyentes, la naturaleza del catión, y la densidad electrónica de la cavidad del anillo son factores a tener en cuenta en la formación de dichos complejos.11 Aún con todo, uno de los factores más importantes a la hora de la complejación y la selectividad de iones es la compatibilidad de tamaños entre el catión y la cavidad del éter corona, sobre todo para cationes pequeños que entran completamente en la cavidad del éter corona. Sin embargo, para cationes más grandes, los factores más importantes son una mezcla entre la relación de tamaños del ion/éter corona y la flexibilidad que pueda tener el anillo debido principalmente a la presencia de sustituyentes en el ciclo. Según la escala de lipofília de Hansch, los éteres corona presentan un valor de cero, es decir, existe un equilibrio entre hidrofília y lipofília, lo que explica que sean fácilmente solubles tanto en medios hidrófilos (agua y alcoholes) como en medios hidrófobos (benceno y cloroformo). En este tipo de medios, los pares solitarios de los oxígenos apuntan hacia dentro de la cavidad formándose, de esta manera, una zona hidrófila rica en electrones (figura V.9) con lo que se favorece la complejación con los cationes. Es por ello que el tipo de disolvente ejerce una gran influencia a la hora de formar complejos. Por ejemplo, un mismo complejo será más estable en un disolvente no polar que en uno polar,12-13 como se puede observar en la tabla V.1. 124 Figura V.9.- Distribución de carga del éter corona 12C4. En la zona roja se indican regiones de carga negativa, las zonas verdes corresponden a áreas neutras y las azules son regiones de carga positiva. Tabla V.1.- Efecto del disolvente en la complejación de cationes con éteres corona. a Datos obtenidos con un electrodo selectivo de iones a 25ºC.13 O O O O O O CH18C6 Log K a Na+ K+ H2O 0.80 1.90 MeOH 4.09 5.89 Como ya hemos indicado, uno de los factores más importantes a la hora de formar complejos por parte de estos compuestos es la relación de tamaños entre el ion y el anillo del éter corona. Cuando el radio del catión coincide con el radio de la cavidad del éter corona el complejo que se forma suele ser más estable que los complejos que se forman con otros cationes de diferente tamaño pero de igual carga. Parece lógico pensar que cuando sus radios coinciden, el catión se posiciona en el centro de la cavidad y del plano del éter corona, obteniéndose así una distancia óptima entre el ión y los átomos donantes y produciéndose, de esta manera, la máxima estabilidad del complejo. Por ejemplo, el catión potasio posee el diámetro óptimo (2.66 Å) para acomodarse dentro de la cavidad del 18C6 (2.6-3.2 Å). La figura V.10 muestra esquemáticamente el tamaño de las cavidades de diferentes éteres corona y los valores del diámetro de algunos cationes. Cuando el diámetro del catión coincide con el del éter corona se forma un complejo de tipo 1:1.14 Si la cavidad es demasiado pequeña para el catión se pueden formar un complejo tipo “sándwich” 2:1 o incluso complejos 3:2.14 Si la cavidad es muy grande, se pueden acomodar dos cationes simultáneamente dentro de la misma (complejos binucleares).15 La figura V.11 muestra esquemas de estas situaciones. Diámetro del catión (Å) Li+(1.56) Na+(1.94) K+(2.66) Cs+(3.34) Figura V.10.- Esquema del diámetro de la cavidad de diferentes éteres corona y valores de diámetros de cationes.16-17 125 (a) (b) (c) (d) Figura V.11.- Representación esquemática de diferentes tipos de complejos que se pueden formar en la complejación de un catión por un éter corona: (a) 1:1, (b) 2:1 o “sándwich”, (c) 3:2, y (d) binuclear. A medida que el tamaño de la cavidad del éter corona aumenta, los cationes mas grandes deberían tener unas constantes de complejación más elevadas, y en la tabla V.2 se recogen algunos ejemplos de la selectividad de éteres corona frente a algunos cationes.17 En el trabajo de Arnaud-Neu et al18 se puede encontrar una recopilación mucho más extensa de datos de constantes, entalpías y entropías para la complejación de muchos cationes con diferentes éteres corona. Tabla V.2.- Influencia del tamaño del anillo en la constante de complejación de algunos éteres corona con diversos cationes. Datos a 25ºC y en MeOH.17 Ligando y radio de la cavidad (Å) Radio del catión (Å) Na + : 1.02 K + : 1.38 Cs + : 1.70 Ag + : 1.15 Sr 2+ :1.16 Log K O O O O O 15C5 (0.86-0.92) 3.48 3.72 2.18 3.62 2.63 O O O OO O 18C6 (1.34-1.43) 4.36 6.06 4.79 4.58 ›5.5 O O O O O O O 21C7 (≈1.70) 1.73 4.22 5.01 2.46 1.73 Tal y como se puede comprobar en dicha tabla, la selectividad mostrada por algunos éteres corona hacia algunos cationes no sigue el principio del tamaño que hemos comentado. Y aunque es difícil en muchos casos estimar el tamaño de la cavidad de los macrociclos, es probable que la selectividad hacia los diferentes cationes este influenciada también por otros factores, como pueden ser: (i) la solvatación de las especies involucradas (el compuesto corona, el ion y el complejo), (ii) la conformación del compuesto corona antes y después de la complejación, y (iii) el número y naturaleza de los anillos formados en la complejación.11 De entre estos tres factores, el efecto de la solvatación merece una explicación adicional. En disolventes suficientemente polares, donde las interacciones con los contraiones son despreciables, la estabilidad del complejo está relacionada con la energía libre de Gibbs de solvatación de las diferentes especies a través de la ecuación [V-1]: 132 conforman los derivados. El primer compuesto objeto de estudio es el que se representa en la figura V.20 en su forma de sal sódica, V-3. H N ON O O NaO O O O O O O H N Figura V.20.- Surfactante sintetizado (V-3) en su forma de sal sódica, con una cadena alquílica de 12 átomos de carbono y con un grupo 4-aminobenzo 18C6. La determinación de su cac se llevó a cabo mediante medidas de la tensión superficial, γ, de disoluciones de diferente concentración con el método del plato de Wilhelmy. La figura V.21 recoge los resultados experimentales obtenidos a una temperatura de 25ºC y representados en la forma habitual. Las disoluciones de V-3 se prepararon en la presencia de NaOH 0.010 M (pH ≈ 12) para asegurar que el surfactante se encuentre completamente en su forma aniónica. Es importante destacar que en los valores de γ cercanos a la cac1 no se manifiesta un mínimo, lo que es indicativo de la ausencia de contaminantes superficialmente activos en el sistema que se estudia. -11 -10 -9 -8 -7 -6 -5 -4 -3 -2 -1 0 1 2 3 36 40 44 48 52 56 60 64 68 72 76 γ (mN/m) LnC (mM) (1) (2) Figura V.21.- Representación gráfica de la tensión superficial, γ, frente al logaritmo neperiano de la concentración de V-3 en una disolución de NaOH 0.010 M a 25ºC. En la representación podemos considerar dos regiones lineales antes de alcanzar el mínimo de tensión superficial. Del análisis de los datos experimentales en la región (1) con las ecuaciones [II-1] a [II-4] se obtiene un área superficial por molécula en la interfase de 127 Å2. Este valor coincide aproximadamente con el valor teórico del área calculado a partir de modelos moleculares siguiendo la forma de proceder explicada en el apéndice B para una disposición de la molécula en la que el macrociclo y la cadena hidrocarbonada están perpendicularmente orientadas (figura V.22a). De esta manera, la molécula formaría una monocapa en la interfase con el éter corona yaciendo sobre la superficie y la cadena hidrocarbonada dispuesta hacia la fase aire, tal y como se muestra en la figura V.22b. Al aumentar la concentración de surfactante se llega a la región (2), donde el análisis con la isoterma de adsorción de Gibbs arroja ahora un área superficial de 62 Å2, aproximadamente la mitad del área superficial de la región (1). Para explicar este hecho 133 resulta lógico pensar que, a medida que la concentración de surfactante aumenta y la interfase se va saturando con menos espacio disponible en la superficie para que las moléculas se acomoden, éstas adopten disposiciones más adecuadas sobre la interfase antes de producirse la agregación en disolución. (a) (b) Figura V.22.- (a) Área superficial teórica calculada mediante métodos moleculares; (b) disposición propuesta para V-3 en la interfase en el primer tramo de la gráfica de la tensión superficial (región (1) en el texto). Podemos pensar entonces en una disposición tal que dos moléculas de surfactante ocuparían aproximadamente el área de una. Esta posibilidad se describe mediante el apilamiento de los éteres corona, formando una bicapa de moléculas con las cadenas alquílicas aproximadamente paralelas hacia el aire, tal y como se representa en la figura V.23. Por ejemplo, para disoluciones acuosas del surfactante 18 corona 6 unido mediante un enlace éter a una cadena hidrocarbonada de 12 átomos de carbono Ozeky et al22 justifican el área superficial por molécula obtenida (29 Å2) suponiendo que los éteres corona poseen una cara hidrófoba donde se sitúan los grupos metileno y una cara hidrófila donde se disponen los oxígenos. De esta manera las caras hidrófobas de dos éteres corona se enfrentarían la una con la otra quedando los oxígenos expuestos hacia la fase acuosa, al mismo tiempo las cadenas alquílicas se disponen verticalmente hacia la fase aire, como se muestra en la figura V.24a (el área del anillo de éter corona es de aproximadamente de 78,5 Å2 estimada mediante el modelo CPK§).39 Por otra parte, Wojciechowski et al40 también han propuesto para un derivado del diaza éter corona con dos cadenas alquílicas de 10 átomos de carbono disposiciones similares en una interfase aire-tolueno, tal y como se muestra en la figura V.24b. Finalmente, la resolución cristalina del compuesto N-N’- didodeciladiaza 18C6 refuerza la disposición propuesta para V-3 en la interfase ya que pone de manifiesto que las cadenas alquílicas se disponen de manera alineada una con la otra (figura V.25).39 § En química, el esquema o sistema de colores CPK es una popular convención de colores para distinguir átomos de diferentes elementos químicos en modelos moleculares. El esquema recibe su nombre de los químicos Robert Corey, Linus Pauling y Walter Koltun, creadores del modelo de espacio lleno y su paleta de colores. El esquema de colores incluye: blanco para el hidrógeno, negro para el carbono, rojo para el oxígeno y azul para el nitrógeno. Aire Agua O - 134 Figura V.23.- Representación esquemática de la disposición en la interfase aire-disolución para el compuesto V-3. Los éteres corona se apilan uno encima del otro formando una bicapa con las cadenas alquílicas paralelas hacia el aire. (a) (b) Figura V.24.- (a) Estructura del derivado sintetizado y estudiado por Ozeki et al22 (izquierda) y disposición propuesta en la interfase aire-agua (derecha). (b) Posibles disposiciones en la interfase tolueno-agua que proponen Wojciechowski et al40 para el derivado estudiado. (a) (b) (c) Figura V.25.- (a) Estructura de la molécula N-N’-didodeciladiaza 18C6. (b) Estructura cristalina donde se observa que las cadenas alquílicas se disponen de forma paralela. (c) Empaquetamiento del cristal obtenido por De Wall.39 Aire Agua O - O - 135 Continuando con el análisis de la figura V.21, al seguir aumentando la concentración de surfactante la tensión superficial se hace constante a partir de un valor de 9.0×10-5 M, valor que se puede considerar como la cac. La tabla V.4 resume todos los resultados obtenidos mediante la técnica de tensión superficial. En la bibliografía se han determinado los valores de cmc de algunos surfactantes basados en éteres corona. Uno de los primeros fue el compuesto ya presentado en la figura V.24a para el que Ozeki et al22 obtuvieron una cmc de 8.5×10-5 M, muy similar a la obtenida por nosotros para V-3. Otros valores se indican a continuación con fines comparativos. Turro et al41 determinaron por medidas de fluorescencia una cmc de 3×10-3 M en agua para el surfactante catiónico con una cadena de 10 átomos de carbono de la figura V.26a; Shinkai et al,42 también por fluorescencia, determinaron una cmc en agua de 7.5×10-4 M para el surfactante de la figura V.26b que posee un grupo sulfonato y una cadena de 11 átomos de carbono; y, por último, para el surfactante tipo “bolaform”1 con dos éteres corona unidos por una cadena de 16 átomos de carbono de la figura V.26c se determinó una cmc de 4.7×10-3 M mediante medidas de tensión superficial con el método del anillo de Du Noüy. La comparación entre todos estos surfactantes permite concluir que el sintetizado por nosotros, V-3, junto al de la figura V.24a de Ozeki et al son los mejores surfactantes. Tabla V.4.- Parámetros deducidos de los experimentos de tensión superficial para la agregación y adsorción en la interfase aire-agua de V-3. 105 cac (M) 106 Γ1 (mol m-2) a1 (Å2) 106 Γ2 (mol m-2) a2 (Å2) V-3 9.0 1.3 127 2.68 62 (a) (b) (c) Figura V.26.- (a) Surfactante estudiado por Turro et al.41 (b) Surfactante sintetizado por Shinkai et al.42 (c) Ejemplo de un surfactante tipo “bolaform”. Por último, para determinar la estructura de los agregados formados, hemos usado la técnica TEM tomando imágenes de una disolución de concentración 7.8×10-4 M de V-3 en NaOH 0.010 M, a una temperatura de 25ºC, y tras un día después de haber preparado la disolución. En ellas observamos la presencia de agregados esféricos con diámetros que oscilan entre 55 nm (figura V.27a) y 140 nm (figura V.27b). (a) (b) Figura V.27.- Imágenes TEM tomadas sobre una muestra de V-3 con una concentración 7.8×10-4 en NaOH 0.010 M a 25 ºC y un día después de preparada la disolución. CON OO HN OO (H2C) 10 H3CSO3 136 V.5.2 Estudio del derivado adamantil-benzo18C6, V-4 A la vista de los buenos resultados obtenidos para el compuesto anterior en lo que a sus propiedades surfactantes se refiere, decidimos sintetizar un nuevo derivado en el que sustituimos la cadena alquílica por un grupo adamantilo manteniendo la parte del éter corona. El nuevo derivado sintetizado, denominado V-4, se presenta en la figura V.28 en su forma de sal sódica. N H O N O O ONa O O O O O O HN Figura V.28.- Surfactante sintetizado en su forma de sal sódica, denominado V-4, con el grupo 4- aminobenzo 18C6 y un adamantano. Los resultados de las medidas de la tensión superficial con el método del plato de Wilhelmy encaminadas a la determinación de la cac se muestran en la figura V.29 como representación de γ frente al logaritmo neperiano de la concentración del surfactante a la temperatura de 25ºC y en una disolución de NaOH 0.010 M (pH≈12) para asegurar que aquel se encuentre completamente en su forma aniónica. -7 -6 -5 -4 -3 -2 -1 0 1 2 3 4 5 20 24 28 32 36 40 44 48 52 56 60 64 68 72 76 80 γ (mN/m) Ln C (mM) Figura V.29.- Representación gráfica de la tensión superficial, γ, frente al logaritmo neperiano de la concentración para el derivado V-4 en una disolución de NaOH 0.010 M a 25ºC. En la representación se observa ahora el perfil más típico de los surfactantes, con una primera zona de descenso de la tensión superficial que corresponde a la región de concentraciones donde sólo existen monómeros y que refleja la adsorción del surfactante en la interfase disolución-aire, y una segunda donde la tensión superficial no varía con el aumento de concentración, que indica que la interfase se encuentra saturada y que tiene lugar la formación de agregados del surfactante (que no son superficialmente activos). El punto de corte de ambas rectas corresponde a la concentración crítica de agregación cac, cuyo valor se recoge en la tabla V.5, y es del orden de 100 veces superior al correspondiente al derivado V-3, resultado de haber cambiado una cadena alquílica por un grupo adamantilo. Tabla V.5.- Parámetros deducidos de los experimentos de tensión superficial para la agregación y adsorción en la interfase aire-agua de V-4. 103cac (M) 106 Γ1 (mol m-2) a0 (Å2) V-4 9.9 2.44 68 137 La isoterma de adsorción de Gibss, ecuaciones [II-1] a [II-4], aplicada a este caso permite obtener la concentración superficial de exceso y el área superficial por molécula de V-4. Los valores se recogen también en la tabla V.5. Con el fin de tener una guía para estimar áreas superficiales se intentó recristalizar el compuesto como paso previo a su resolución cristalina mediante difracción de rayos X. Sin embargo, ello no fue posible aun habiendo empleado multitud de disolventes y condiciones. La estimación del área superficial se llevó a cabo haciendo uso de información cristalina pero de una manera diferente a lo explicado en el apéndice B. Se calculó por un lado el área que ocuparía la parte del 4 amino-benzo18C6 junto con el enlace amida (114 Å2) y, por otro, el área del grupo adamantilo (37 Å2, valor obtenido a partir del cristal del dímero de adamantano sintetizado por Soto).43 Sumando ambos valores se obtiene un área total aproximada para V-4 de 151 Å2 (figura V.30). Al comparar este valor con el experimental (68 Å2), podemos concluir que el compuesto V-4 se dispone en la interfase de una manera muy similar a como lo hacía el compuesto V-3, esto es, formando una bicapa donde los éteres corona se apilan uno encima del otro y los grupos adamantilo se disponen alineados y enfrentados hacia el aire, (figura V.31). Figura V.30.- Área superficial teórica calculada para la molécula V-4, suponiendo que está formada por dos fragmentos: el resto 4 amino-benzo18C6 junto con el enlace amida, y el grupo adamantilo. Figura V.31.- Representación esquemática de la disposición propuesta en la interfase aire-disolución para el compuesto V-4. Los éteres corona se disponen apilados uno encima del otro formando una bicapa con los grupos adamantilo hacia el aire. Por último, hemos estudiado la geometría que muestran en disolución los agregados de V-4 mediante la técnica de TEM. Las imágenes se recogieron después de 24 horas de haber preparado la disolución, con una concentración de 0.0104 M. Se puede observar la presencia de agregados cuasi-esféricos, más pequeños que en el compuesto anterior, con Agua Aire O-O- 138 diámetros que varían entre los 15 y los 50 nm (figura V.32). La distribución de tamaños correspondiente, obtenida sobre un recuento de 110 agregados, se muestra en la figura V.33, y supone un diámetro medio de 28.0±8.1 nm. Figura V.32.- Imágenes TEM tomadas de una muestra de V-4 con una concentración de 0.0104 M (en NaOH 0.010 M a 25ºC) a las 24 horas de ser preparada. 10 20 30 40 50 0 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 nº de agregados Diámetro (nm) Figura V.33.- Distribución de tamaños obtenida tras el análisis de 110 de agregados de una muestra de V-4 de concentración de 0.0104 M (en NaOH 0.010 M y a 25ºC), después de 24 horas. V.5.3 Estudio del derivado alquíl-diaza18C6, V-5 Habiendo comprobado que el mejor surfactante es el derivado con la cadena alquílica de 12 átomos de carbono (V-3), y teniendo en mente además el hecho de que la introducción de nitrógenos en el éter corona mejora la constante de complejación con los metales de transición (recuérdese la figura V.12), decidimos sintetizar un nuevo compuesto en el cual se mantiene dicha cadena y se sustituye el benzo 18C6 por un diaza 18C6 (derivado V-5, figura V.34). Desgraciadamente no pudimos llegar a realizar estudios con este compuesto debido básicamente a que el bajo rendimiento de la reacción (10%, véase apéndice A), unido al hecho de que el compuesto comercial de partida posee un elevado precio (200€+IVA, 1g), los harían demasiado caros y, por lo tanto, inviables dada la situación económica del grupo de investigación. Figura V.34.- Surfactante V-5 con el grupo 1,10-diaza 18C6 y una cadena alquílica de 12 átomos de carbono. H N ON O O OH O N O O O NH 139 V.6 BIBLIOGRAFÍA (1) Tavano, L.; Muzzalupo, R.; Trombino, S.; Nicotera, I.; Oliviero Rossi, C.; La Mesa, C. Colloids Surfaces B: 2008, 61, 30. (2) Glendening, E. D.; Feller, D.; Thompson, M. A. J. Am. Chem. Soc. 1994, 116, 10657. (3) Vögtle, F. Supramolecular chemistry; Wiley, 1991. (4) Stewart, D. G.; Waddan, D. Y.; Borrows, E. T.; patent US 2870100, 1959. (5) Down, J. L.; Lewis, J.; Moore, B.; Wilkinson, G. Proc. Chem. Soc. 1957, 209. (6) Pedersen, C. J. J. Am. Chem. Soc. 1967, 89, 7017. 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(42) Shinkai, S.; Nakamura, S.; Manabe, O.; Yamada, T.; Nakashima, N.; Kunitake, T. Chem. Lett. 1986, 49. (43) Soto Tellini, V. H. Estructuras supramoleculares generadas por ciclodextrinas, adamantanos y ácidos biliares, Tesis Doctoral 2006. 141 VI SURFACTANTES DIALQUÍLICOS Y ALQUIL-SULFOBETAÍNICOS DERIVADOS DEL ÁCIDO NITRILOTRIACÉTICO COMO GRUPO DE CABEZA VI.1 INTRODUCCIÓN Inspeccionando la bibliografía de los últimos años se puede constatar que los surfactantes diméricos (géminis,1 híbridos2 y fosfolípidos) están atrayendo un gran interés debido a que las concentraciones de agregación críticas que presentan son uno o dos órdenes de magnitud inferiores a las de los correspondientes surfactantes monoméricos. Al mismo tiempo, son mucho más eficientes en la disminución de la tensión superficial del agua.1 Algunos surfactantes zwitteriónicos tipo gemini con grupos iónicos de tipo fosfato y amonio recogidos por Menger3 presentan propiedades extraordinarias y estructuras que forman geles, micelas, vesículas y coacervados. En la región del diagrama de fases de los coacervados, cuando estos se disuelven en agua, aparecen gotas de naturaleza aceitosa. Estas gotas están formadas por un 85% de agua, y son inmiscibles en ella. La explicación se obtiene con la ayuda de imágenes registradas con la técnica crio- SEM de alta resolución, que ponen de manifiesto una morfología que se asemeja a una esponja (figura VI.1) en la que las moléculas gemini se auto-asocian en una red porosa compuesta de bicapas planas altamente interconectadas que impiden la mezcla del agua atrapada en el interior con la del disolvente donde las gotas de coacervado se encuentran en suspensión. Como resultado del análisis de diferentes derivados, Menger es capaz de predecir qué compuestos desconocidos se auto-asociarán con una morfología de tipo esponja. Figura VI.1.- Estructura tipo esponja que forman algunas moléculas gemini en la región de los coacervados estudiados por Menger.3 La fosfatidilcolina es un derivado graso del glicerol que está compuesto por ácido palmítico (ácido saturado), ácido oleico (insaturado) y un grupo fosfato que forma un enlace éster con la colina (figura VI.2). La fosfatidilcolina es el fosfolípido más abundante en las plantas y los animales. Como consecuencia de su estructura, en la cual la cabeza hidrófila posee tanto una carga positiva como otra negativa, la fosfatidilcolina es un surfactante zwitteriónico. Se debe destacar también la diferente naturaleza de las dos cadenas grasas. Este y otros fosfolípidos tienen una fuerte tendencia a la auto-agregación en agua formando bicapas,