Caracterización longitudinal de la composición de membrana de las células sanguíneas del ganado bovino

FACULTADE DE CIENCIAS GRAO EN BIOQUÍMICA D.ª Carla Muyo Sanz CARACTERIZACIÓN LONGITUDINAL DE LA COMPOSICIÓN DE MEMBRANA DE LAS CÉLULAS SANGUÍNEAS DEL GANADO BOVINO Traballo Fin de Grao Xuño 2024 1 Índice Índice de figuras ........................................................................................................... 3 Índice de tablas ............................................................................................................. 5 Abreviaturas ................................................................................................................. 6 Resumen ...................................................................................................................... 7 Resumo ........................................................................................................................ 8 Abstract ........................................................................................................................ 9 1. Introducción ............................................................................................................ 10 1.1 Componentes celulares de la sangre ................................................................ 10 1.2 Ácidos grasos de membrana ............................................................................. 11 1.3 Función de los ácidos grasos en las membranas .............................................. 13 1.3.1 Fluidez de membrana ................................................................................. 13 1.3.2 Enzimas unidas a membranas .................................................................... 14 1.3.3 Efectos en los receptores de membrana ..................................................... 14 1.3.4 Fusión de membrana .................................................................................. 14 1.4 Factores que afectan al metabolismo de los ácidos grasos en ganado bovino .. 15 1.4.1 Aumento de la temperatura ambiental ........................................................ 15 1.4.2 Momento de lactación y gestación .............................................................. 16 1.4.3 Tratamientos veterinarios ............................................................................ 16 1.4.4 Dieta del ganado bovino ............................................................................. 17 1.5 Ácidos grasos de las membranas de los eritrocitos ........................................... 17 1.6 Ácidos grasos de las membranas de los leucocitos ........................................... 18 2 2. Objetivos ................................................................................................................. 20 3. Material y métodos .................................................................................................. 21 3.1 Estudio animal y recolección de muestras ......................................................... 21 3.2 Aislamiento de glóbulos rojos y blancos ............................................................ 22 3.3 Extracción de ácidos grasos de membrana ....................................................... 23 3.4 Determinación de ácidos grasos mediante GC-FID ........................................... 24 3.5 Análisis estadístico ............................................................................................ 25 4. Resultados y discusión ........................................................................................... 26 4.1 Composición de ácidos grasos de la membrana de las células sanguíneas bovinas ................................................................................................................................ 27 4.1.1 Eritrocitos .................................................................................................... 27 4.1.2 Linfocitos .................................................................................................... 31 4.2 Evolución temporal de los ácidos grasos de membrana de células sanguíneas bovinas .................................................................................................................... 33 4.2.1 Eritrocitos .................................................................................................... 33 4.2.2 Linfocitos .................................................................................................... 38 4.2.3 Comparación entre eritrocitos y linfocitos .................................................... 43 4.3 Influencia del tratamiento con rbST en los ácidos grasos de membrana de células sanguíneas bovinas ................................................................................................ 44 5. Conclusión .............................................................................................................. 49 6. Bibliografía .............................................................................................................. 50 3 Índice de figuras Figura 1: Diferencias entre las células sanguíneas analizadas. Elaborado con biorender.com. ............................................................................................................ 11 Figura 2: Membrana plasmática formada por lípidos y proteínas. Elaborado con biorender.com. ............................................................................................................ 11 Figura 3: Clasificación de los ácidos grasos. Elaborado con biorender.com a partir de (Tvrzicka et al., 2011) ................................................................................................. 12 Figura 4: a) Gráfico de puntuación del PCA realizado con la abundancia relativa de los grasos de la membrana de eritrocitos bovinos (1=control; 2=tratadas con rbST). b) Gráfico de cargas de cada componente graso para la distribución del PCA en eritrocitos. ................................................................................................................................... 27 Figura 5: a) Gráfico de puntuación del PCA realizado con la abundancia relativa de los grasos de la membrana de eritrocitos bovinos (1=control; 2=tratadas con rbST). b) Gráfico de cargas de cada componente graso para la distribución del PCA en eritrocitos. ................................................................................................................................... 31 Figura 6: Evolución ácidos grasos saturados (a), poliinsaturados (b) y ω-6 (c) en la membrana de los eritrocitos en ganado bovino de leche. ........................................... 33 Figura 7: Evolución ácidos grasos monoinsaturados en la membrana de los eritrocitos en ganado bovino de leche. ........................................................................................ 36 Figura 8: Evolución ácidos grasos ω-3 en la membrana de los eritrocitos en ganado bovino de leche. .......................................................................................................... 37 Figura 9: Evolución ácidos grasos CLAs en la membrana de los eritrocitos en ganado bovino de leche. .......................................................................................................... 37 Figura 10: Evolución ácidos grasos saturados en la membrana de los linfocitos del ganado bovino de leche. ............................................................................................. 39 Figura 11: Evolución ácidos grasos monoinsaturados en la membrana de los linfocitos en ganado bovino de leche. ........................................................................................ 39 Figura 12: Evolución ácidos grasos poliinsaturados en la membrana de los linfocitos en ganado bovino de leche. ............................................................................................. 40 4 Figura 13: Evolución ácidos grasos ω-3 en la membrana de los linfocitos en ganado bovino de leche. .......................................................................................................... 41 Figura 14: Evolución ácidos grasos ω-6 en la membrana de los linfocitos en ganado bovino de leche. .......................................................................................................... 41 Figura 15: Evolución ácidos grasos CLAs en la membrana de los linfocitos en ganado bovino de leche. .......................................................................................................... 42 Figura 16: Comparación de la evolución de los diferentes ácidos grasos en las membranas plasmáticas de eritrocitos y linfocitos en ganado bovino de leche. .......... 43 Figura 17: Comparación del porcentaje de los distintos ácidos grasos en la membrana de los eritrocitos entre las vacas control y las tratadas con somatotropina recombinante. ................................................................................................................................... 46 Figura 18: Comparación del porcentaje de los distintos ácidos grasos en la membrana de los linfocitos entre las vacas control y las tratadas con somatotropina recombinante. ................................................................................................................................... 47 5 Índice de tablas Tabla 1: Composición alimentaria analítica del ganado bovino objeto de estudio (datos cedidos por la explotación). ........................................................................................ 21 Tabla 2: Temperatura registrada durante los días del estudio. Información obtenida de la AEMET. .................................................................................................................. 22 Tabla 3: Valores medios de cada grupo de ácidos grasos en la membrana de las células sanguíneas obtenidas de vacas lactantes. .................................................................. 26 Tabla 4: Comparación de valores medios de los ácidos grasos en la membrana de los RBCs y de los valores de los ácidos grasos de los RCB del control externo diferenciado. ................................................................................................................................... 30 Tabla 5: Comparación valores medios entre linfocitos y eritrocitos del ganado bovino de leche y significación de sus diferencias....................................................................... 44 Tabla 6: Comparación valores medios ácidos grasos de los eritrocitos de las vacas control y de las vacas tratadas con Lactotropina y significación de sus diferencias. ... 46 Tabla 7: Comparación valores medios ácidos grasos de linfocitos de las vacas control y de las vacas tratadas y significación de sus diferencias. ............................................. 48 6 Abreviaturas - AA: Ácido araquidónico. - ACAT: Acil-CoA Colesterol Acil-Transferasa. - AEMET: Agencia Estatal de Meteorología. - ANOVA: Análisis de la Varianza. - CLA: Ácido linoleico conjugado. - DHA: Ácido docosahexaenoico. - FAME: Éster Metílico de los Ácidos Grasos. - FID: Detector de Ionización de Llama. - GC: Cromatografía de Gases. - MHC: Complejo Mayor de Histocompatibilidad. - MUFA: Ácido graso monoinsaturado. - NK: Células natural killer. - PBS. - PCA: Análisis de Componentes Principales. - PEG: Polietilenglicol. - PUFA: Ácido graso poliinsaturado. - RBC: Glóbulos rojos o eritrocitos (red blood cells). - rbST: Somatotropina bovina recombinante. - SFA: Ácido graso saturado. - WBC: Glóbulos blancos o leucocitos (white blood cells). 7 Resumen Caracterización longitudinal de la composición de membrana de las células sanguíneas del ganado bovino. La sangre es un tipo especializado de tejido conectivo compuesto de elementos celulares y una matriz líquida denominada plasma. Estos componentes celulares sanguíneos están expuestos a los cambios metabólicos que se producen en el plasma y en el cuerpo. En cuanto a su abundancia en la sangre, los eritrocitos constituyen el mayor volumen, seguidos de una fracción mucho menor de leucocitos y plaquetas. Su interacción con el medio externo está mediada por una membrana plasmática de contenido particular, en el que destacan los ácidos grasos como componentes indicadores del estado de salud de estos elementos y del organismo por el que circulan. La composición de la membrana es dependiente del medio, que depende de múltiples factores tanto endógenos como exógenos. En este trabajo experimental se analiza la composición de ácidos grasos de la membrana de dos componentes celulares sanguíneos, los eritrocitos y los leucocitos, en ganado bovino lechero en régimen intensivo. Se utiliza un equipo de cromatografía de gases acoplado a un detector de ionización en llama (GC-FID). El objetivo es realizar la caracterización longitudinal de los ácidos grasos de membrana de eritrocitos y leucocitos bovinos, a fin de comprender su naturaleza y variabilidad. Se ha observado que los principales factores que producen cambios en la membrana de los eritrocitos son la temperatura ambiental y el estado de gestación del animal. Así mismo, se puede concluir que tanto los perfiles como el patrón de cambio longitudinal de los ácidos grasos en las membranas son distintos entre los dos tipos de células sanguíneas, debido posiblemente a las diferencias en su vida media y en su función celular. Por último, se ha observado que los tratamientos veterinarios potenciadores de la producción láctea basados en somatotropina recombinante no influyen significativamente en la composición de membrana, a pesar de tener un impacto demostrado en el metabolismo lipídico del animal. Palabras clave: bovino, célula sanguínea, eritrocito, leucocito, evolución, tiempo, ácidos grasos, membrana. 8 Resumo Caracterización lonxitudinal da composición de membrana das células sanguíneas do gando bovino. O sangue é un tipo especializado de tecido conectivo composto de elementos celulares e una matriz líquida denominada plasma. Estes compoñentes celulares sanguíneos están expostos aos cambios metabólicos que se producen no plasma e no corpo. En canto á súa abundancia no sangue, os eritrocitos constitúen o maior volume, seguidos dunha fracción moito menor de leucocitos e plaquetas. A súa interacción co medio externo está mediada por una membrana plasmática de contido particular, no que destacan os ácidos graxos como compoñentes indicadores do estado de saúde destes elementos e do organismo polo que circulan. A composición da membrana é dependente do medio, que depende á súa vez de múltiples factores tanto endóxenos como esóxenos. Neste traballo experimental analízase a composición de ácidos graxos da membrana de dous compoñentes celulares sanguíneos, os glóbulos vermellos e brancos, en gando bovino leiteiro en réxime intensivo. Utilízase un equipo de cromatografía de gases combinado cun detector de ionización en chama (GC-FID). O obxectivo é realizar a caracterización lonxitudinal dos ácidos graxos de membrana de eritrocitos e leucocitos bovinos, co fin de comprender a súa natureza e variabilidade. Observouse que os principais factores que producen cambios na membrana dos eritrocitos son a temperatura ambiental e o estado de xestación do animal. Así mesmo, pódese concluír que tanto os perfís como o patrón de cambio lonxitudinal dos ácidos graxos nas membranas é distinto entre os dous tipos de células sanguíneas, debido posiblemente ás diferenzas na súa vida media e na súa función celular. Por último, observouse que os tratamentos veterinarios promotores da produción láctea baseados en somatotropina recombinante, non inflúen significativamente na composición de membrana, a pesar de ter un impacto demostrado no metabolismo lipídico do animal. Palabras clave: bovino, célula sanguínea, eritrocito, leucocito, evolución, tempo, ácidos graxos, membrana. 15 La posibilidad de analizar los ácidos grasos de la membrana celular de las células sanguíneas, como los eritrocitos y linfocitos, en lugar de los que están libres en el plasma, es que aportan una información más estable sobre los cambios metabólicos que se han producido en el individuo, y que se producen bajo unas condiciones concretas, como un cambio de dieta o de tratamiento con algún fármaco (Ferreri et al., 2016). 1.4 Factores que afectan al metabolismo de los ácidos grasos en ganado bovino Debida a la importancia del ganado bovino en la alimentación humana, es importante estudiar la evolución longitudinal de sus células sanguíneas para conocer los factores que provocan cambios en ellas y así estudiar el estado de salud del animal. Existe una serie de factores que afecta al metabolismo de los ácidos grasos del ganado bovino y que por tanto cambia su concentración en sangre. Estos factores son: los genes, la edad, el género, el estado de salud, los cambios epigenéticos y su interacción con los genes y la interacción entre los distintos genes (Lankinen et al., 2018). Además de todos estos factores, también encontramos algunos ambientales como el calor estacional o aumento de temperatura (Joo et al., 2021), el momento de lactación (Veshkini et al., 2023) y el estado de gestación en el que se encuentre el animal (Ghebremeskel et al., 2000), la dieta que sigue el animal (Revskij, et al., 2019) y, posiblemente, el efecto de tratamientos veterinarios exógenos. 1.4.1 Aumento de la temperatura ambiental Los aumentos de temperatura pueden causar estrés al ganado produciendo así una disminución de la ingesta diaria de comida. Esto afecta también a la producción láctea del ganado bovino, la cual se verá disminuida en cantidades claramente apreciables (Joo et al., 2021). Al reducir su ingesta alimentaria, las vacas pueden llegar a experimentar un balance energético negativo, ya que no ingieren la cantidad de comida suficiente como para cubrir su producción láctica, lo que supone una movilización de grasas de las reservas corporales. Los adipocitos liberan su contenido haciendo que aumenten los ácidos grasos no esterificados en sangre. La mayoría de estos ácidos grasos liberados son ácidos grasos saturados. Al aumentar su concentración en plasma, las células sanguíneas captan más ácidos grasos saturados en sus membranas que en épocas más frescas (Joo et al., 2021). 16 1.4.2 Momento de lactación y gestación Durante el período de lactación ocurre una situación parecida a la que se produce con el aumento de temperatura ambiental en la que el animal también experimenta un balance energético negativo en la primera fase de la producción (Veshkini et al., 2023). Tras el parto, las vacas experimentan una movilización de las reservas energéticas, haciendo que se pierda una parte importante de su masa grasa. Esta movilización grasa produce la liberación de ácidos grasos al torrente sanguíneo, de donde las células sanguíneas van a captar los ácidos grasos para incorporarlos a su composición. A partir de la semana 14, las reservas grasas comienzan a recuperarse muy lentamente hasta que en torno a la semana 40 después del parto, recuperan los valores previos al parto (Nielsen et al., 2003). El momento de gestación también influye en la composición de la membrana de las células sanguíneas de la línea roja (RBC), ya que el feto necesita incorporar mayoritariamente ácido araquidónico (AA) y ácido docosahexaenoico (DHA), por lo que la concentración de ácidos grasos ω-3 y ω-6 en las membranas se ven afectados por la gestación (Ghebremeskel et al., 2000). 1.4.3 Tratamientos veterinarios Otro factor a tener en cuenta respecto a la movilización de grasas en el ganado lechero es el uso de fármacos veterinarios, como por ejemplo la somatotropina recombinante o Lactotropina (rbST), un fármaco veterinario que administran algunos productores de leche a sus animales y que tiene la misma función que la hormona del crecimiento o somatotropina natural. Esta hormona regula muchos procesos fisiológicos relacionados con el crecimiento, el metabolismo y la reproducción (Robert et al., 2017). En este sentido, se ha demostrado que en las vacas produce un aumento en la producción láctea debido a su parecido estructural con la prolactina (hormona encargada de la síntesis de leche en mamíferos), de manera que es capaz de unirse a su receptor produciendo el mismo efecto fisiológico (Chilton & Hewetson, 2005). Existen otros tratamientos veterinarios que mejoran el rendimiento animal en la producción lechera, como los antibióticos, que se administran al ganado cuando sufre mastitis, la enfermedad más común en el ganado bovino. Con la administración de los antibióticos se consigue una reacción de inflamación menos pronunciada y una mayor producción láctea sin que la composición lipídica de la leche se vea afectada. Las principales especies de bacterias asociadas a la mastitis que pueden causar 17 alteraciones en la composición lipídica de la leche son: Bifidobacterium, Ureaplasma, Atopococcus, Mycoplasma, Psychrobacter, Ruminobacter y Trepome, que cambian la composición láctea mediante la alteración del metabolismo del ácido araquidónico, del ácido α-linolénico y de los glicerofosfolípidos (Luo et al., 2023). 1.4.4 Dieta del ganado bovino La dieta del ganado influye en el perfil lipídico de las membranas plasmáticas de los eritrocitos de los animales. Se ha demostrado que en función de la dieta que sigan, la ratio de ácidos grasos ω-6/ω-3 de las vacas se ve afectado. La variación de esta ratio influye sobre la liberación de ATP de este tipo celular, haciendo que se reduzca (Revskij, et al., 2019). 1.5 Ácidos grasos de las membranas de los eritrocitos Debido a su función en el cuerpo, los eritrocitos deben reunir unas características únicas, y, como es lógico, su membrana también debe reunirlas: debe ser una membrana muy elástica, capaz de responder a las tensiones aplicadas de fluidos y poseer una inmensa resistencia estructural. Por otro lado, un glóbulo rojo debe ser capaz de deformarse hasta un 250 %, pero siempre sin modificar su superficie de membrana, ya que una pequeña modificación de su superficie (de entre un 3 o un 4 %) conduce a la lisis celular. Llevar a cabo estas deformaciones es posible gracias a la asociación entre una red elástica bidimensional de proteínas esqueléticas unidas a proteínas ancladas en la membrana plasmática o a fosfolípidos aniónicos (aunque estas últimas uniones son menos frecuentes) (Mohandas & Gallagher, 2008). En el caso de los hematíes, la bicapa lipídica está formada en la misma proporción por colesterol y fosfolípidos. El colesterol se distribuye en ambas caras de la bicapa en proporciones similares, sin embargo, los fosfolípidos se disponen de forma asimétrica (Mohandas & Gallagher, 2008). Por otro lado, en este tipo de células, la fluidez es una característica clave, ya que afecta a la agregación de los glóbulos rojos y al comportamiento físico, en general, de las células, de manera que, si hay algún problema en las membranas celulares de los eritrocitos, podrían darse problemas anémicos por agregación de los glóbulos rojos (Ferlazzo et al., 2011). Los eritrocitos son células que tienen una vida media de 120 días (Nguyen et al., 2023) y reponen sus lípidos de membrana gracias a los ácidos grasos libres que encuentran 18 en plasma. Por tanto, en función de los ácidos grasos presentes en sangre de manera prolongada en el tiempo, los eritrocitos captarán dichos ácidos grasos para formar parte de sus membranas. Así, se puede saber la proporción estable de ácidos grasos que circulan en sangre. Además, se debe tener en cuenta que los RBC son células circulantes, y, por esta razón están en contacto con todos los tejidos corporales, lo que les confiere la capacidad de adquirir los ácidos grasos de membrana de otros tejidos además de los presentes en la sangre. La composición grasa de la membrana de los eritrocitos varía entre unas especies y otras. Se pueden observar cambios en la composición dependiendo del animal que se analice (Plasenzotti et al., 2007). 1.6 Ácidos grasos de las membranas de los leucocitos El motivo por el que en este trabajo se analizan los linfocitos y no los leucocitos en general, es que los linfocitos son unos glóbulos blancos muy abundantes en sangre bovina (1,700-5,600 células/μL) (Orakpoghenor et al., 2019), como la obtención de los leucocitos en general, es bastante compleja, el estudio se desarrolla sobre las células más abundantes: los linfocitos. Los ácidos grasos de membrana de los linfocitos afectan a sus características, esta vez no solo a la fluidez de su membrana, sino que también intervienen en otros procesos importantísimos como la adherencia del linfocito a los tejidos o a su migración (Pompéia et al., 2000). Los linfocitos, cuando maduran, aumentan considerablemente su tamaño, por tanto, necesitan aumentar superficie de membrana incorporando ácidos grasos en ellas, que, obviamente afectan a su estructura y a su función. En estudios in vitro se observó que cambiaba la adherencia de los linfocitos al endotelio dependiendo de en qué características se incubaban los linfocitos, es decir, si estaban rodeados de unos ácidos grasos u otros, puesto que cambiaba su membrana plasmática. Es cierto, que, incubados in vitro, los linfocitos siguen patrones de incorporación de ácidos grasos a su membrana que no siguen in vivo, puesto que, si incubamos linfocitos en un medio enriquecido con ácido α-linolénico, su proporción en la membrana alcanzará el 12 %, mientras que in vivo, su proporción en la membrana de los linfocitos no supera el 3 % (Calder et al., 1994). La migración a los linfocitos desde la sangre a los órganos linfáticos, y viceversa, puede deberse a varias causas, como las condiciones hemodinámicas y físicas del cuerpo o el 19 estado bioquímico de las células. Sin embargo, las alteraciones de las membranas celulares cambian el patrón normal de migración de los linfocitos debido a su influencia sobre la deformabilidad de las células (muy relacionada con la fluidez), la adhesión celular, y, en general la composición lipídica, que puede intervenir en la actividad enzimática de las células (Pompéia et al., 2000). La adherencia de los linfocitos a los tejidos es un paso crucial para el correcto desarrollo de la función de estas células, la cual está directamente relacionada con la fluidez de la membrana, ya que, para unirse a los tejidos, son necesarios unos receptores que están embebidos en la membrana plasmática de los linfocitos. Cuanto más fluida es una membrana, más fácilmente se adhieren los linfocitos a los tejidos, porque más fácilmente se insertan los receptores en la membrana celular (Twisk et al., 1991). Sin embargo, en su trabajo, Novo et al., (1987) vieron que no había una relación lineal entre el aumento de la concentración de ácidos grasos insaturados y el aumento de la adherencia de los linfocitos, sino que la adherencia dependía más de las propiedades específicas de los ácidos grasos poliinsaturados que se encontraban en la membrana. Los linfocitos desempeñan la importante función de la presentación de antígenos, y su función se ve afectada por los ácidos grasos que componen su membrana. Se ha demostrado que los ácidos grasos saturados no influyen de manera directa en la función inmunitaria, sin embargo, los PUFA sí que intervienen en diferentes procesos de producción de interleucinas (IL-2) y en algunas funciones de las células NK, mejorando así la respuesta inmunitaria. Para conseguir la mejora inmunitaria, las concentraciones de ácidos grasos poliinsaturados deben mantenerse elevadas en el tiempo, y, a través de una dieta normal, es difícil adquirirlas (Calder et al., 2002). 20 2. Objetivos El objetivo de este trabajo experimental es realizar una caracterización longitudinal de la membrana de las células sanguíneas del ganado bovino de leche, en particular, valorando la composición de los glóbulos rojos (RBC) y los glóbulos blancos (WBC) en cuanto a su contenido en ácidos grasos de membrana. Para alcanzar este objetivo, se han establecido los siguientes objetivos específicos: - Analizar los perfiles de ácidos grasos de membrana de RBC y WBC en hembras bovinas en lactación mediante GC-FID. - Determinar la evolución longitudinal de los ácidos grasos de membrana de RBC y WBC en hembras bovinas en lactación, en régimen intensivo. - Determinar el impacto de factores exógenos (temperatura, tratamientos veterinarios) en la composición de los ácidos grasos de membrana de RBC y WBC en hembras bovinas en lactación. 21 3. Material y métodos 3.1 Estudio animal y recolección de muestras Este estudio incluyó nueve vacas de raza Holstein de primera o segunda lactación seleccionadas de una granja de producción lechera de la provincia de Lugo en régimen intensivo, con edades comprendidas entre 1,5 y 4 años. Estos animales se alojaron separados del resto del ganado bovino de la granja, con acceso al agua ad libitum, y dos veces al día recibieron una ración optimizada para vacas lecheras. La ración de comida contenía: alfalfa, maíz, cáscara de soja, harina de extracción de simiente de colza, cebada, paja de cereal, melaza, trigo, sales cálcicas de ácidos grasos palma, harina de extracción de soja tostada, carbonato cálcico, bicarbonato de sodio, cloruro sódico y óxido de magnesio. Los componentes analíticos se muestran en la Tabla 1 representada a continuación: Tabla 1: Composición alimentaria analítica del ganado bovino objeto de estudio (datos cedidos por la explotación). Componente analítico Cantidad (%) Proteína bruta 14.5 Celulosa bruta 13.6 Cenizas 7.3 Grasa bruta 3.9 Sodio 0.4 Para obtener las muestras de sangre de los animales, se utilizaron sets de recolección de sangre Vacuette® con adaptador Luer. La sangre se recogió en tubos con EDTA en los días 1, 7, 50, 95 y 214 de este estudio, considerándose el inicio del seguimiento de los animales como tiempo 0. A tiempo 0 las vacas seleccionadas llevaban lactando 75±15 días. La temperatura registrada durante los días de estudio de la muestra según la Agencia Estatal de Meteorología (AEMET) se recoge en la Tabla 2 que se muestra a continuación. 22 Tabla 2: Temperatura registrada durante los días del estudio. Información obtenida de la AEMET. Día de estudio Temperatura registrada (máxima/mínima) (ºC) 1 19.4º/11.4º 7 16.1º/8.6º 50 24.4º/12.7º 95 20.9ºC/9.2ºC 214 12.9º/4.3º De las nueve vacas seleccionadas, tres de ellas no se sometieron a ningún tipo de tratamiento veterinario, es decir, se utilizaron como vacas control en cuanto a este factor, mientras que las otras seis vacas restantes se trataron con 500 mg de rbST (Lactotropina, Elanco, Eli Lilly, México) cada 14 días para aumentar su producción lechera. El primer día de tratamiento con Lactotropina fue a tiempo 0, coincidiendo con 10 semanas de lactación (75±15 días) tal y como indica el fabricante. Se administraron un total de 12 dosis de Lactotropina a cada vaca tratada, cubriendo así, prácticamente, todo el período de lactación, con un intervalo de 168 días entre la primera y la última dosis. Entre la quinta y la sexta dosis, hubo un período de descanso de 28 días sin tratamiento (en vez de 14 días) para comprobar si la producción de leche disminuía debido a la retirada del medicamento. Todos los procedimientos con los animales se realizaron de acuerdo con la Directiva 2010/63/UE sobre la protección de los animales utilizados para fines científicos, y su transposición a la legislación nacional. En particular, todos los procedimientos se realizaron respetando el bienestar animal y sin causar más dolor, sufrimiento, angustia o daño duradero que el equivalente al causado por la introducción de una aguja, de acuerdo con la buena práctica veterinaria. Los animales fueron supervisados en todo momento por personal veterinario, quienes se encargaron de recoger las muestras de sangre. 3.2 Aislamiento de glóbulos rojos y blancos Los glóbulos blancos y los glóbulos rojos se aislaron y recolectaron en cinco puntos temporales diferentes del estudio. Se recogieron por igual datos de las membranas de las células sanguíneas de las vacas tratadas, y de las vacas control en los días 1, 7, 50, 95 y 214. Por último, también se tomaron datos de los componentes grasos de las 23 membranas de las células sanguíneas de dos vacas (10 y 11) de la misma granja el día 98, que actuarían como animales de control para validación de los resultados obtenidos. Para separar las células sanguíneas se aplicó un protocolo de fraccionamiento basado en la centrifugación de la sangre recogida en tubos con EDTA. Se utilizó una adaptación del protocolo descrito por Chamorro López et al. (2013). Las muestras de sangre fueron centrifugadas a 2000 xg durante 15 minutos a temperatura ambiente. Con esto, se dividen por capas las distintas fracciones sanguíneas. En la parte superior queda el plasma sanguíneo, como un líquido transparentoso o, ligeramente amarillento, ya que quien aporta el color a la sangre son los glóbulos rojos. La segunda capa que se puede apreciar son los glóbulos blancos o linfocitos, siendo esta una capa muy fina de color blanco y de apariencia viscosa. Por último, en la capa inferior se recogen los glóbulos rojos, mucho más abundantes que los linfocitos por lo que crean una capa mucho más gruesa. Tras el fraccionamiento de la sangre, se procede a la separación de los distintos componentes con una pipeta Pasteur de plástico de 2 mL. El primer paso es la retirada del plasma sanguíneo, y a continuación se separan los glóbulos blancos de los eritrocitos para depositarlos en un microtubo Eppendorf de 1.5 mL. Una vez transferidos los linfocitos al microtubo, se añade 1 mL de PBS (pH 7,4, sin ARNasa de la línea de productos Ambion™, ThermoFisher Scientific) para su lavado y eliminación de posibles restos de glóbulos rojos que hayan sido arrastrados en el paso anterior (Barreiro et al. 2020). Tras añadir el PBS, se agita y centrifuga el tubo, y con pipeta Pasteur se separan de nuevo los glóbulos blancos de los glóbulos rojos que pueda haber presentes y se transfieren a un microtubo limpio. Cuando ya solo quedan glóbulos blancos en la disolución, la fracción se redisuelve en 200 μL de PBS y se congela a -20ºC hasta su análisis. Por último, se recolecta 1mL de la capa de eritrocitos, se mezcla con 2 mL de PBS y se conserva también a -20 ºC (Barreiro et al. 2020). 3.3 Extracción de ácidos grasos de membrana La extracción de los ácidos grasos de las membranas sanguíneas se llevó a cabo siguiendo el método descrito por Sanjulián et al. (2021). Se realizó el mismo procedimiento para glóbulos rojos y blancos. 24 El primer paso consiste en mezclar 10 μL de la solución de células sanguíneas preparada en el paso anterior con 2 mL de ácido sulfúrico (H2SO4) al 2,5 % en metanol y un estándar interno C23:0. La mezcla se mantuvo durante 18 horas a una temperatura constante de 50ºC para que ocurriese así la transesterificación de los ácidos grasos. Tras esto, se añade a la mezcla 1 mL de n-hexano, el cual permite llevar a cabo la extracción de los ésteres metílicos de los ácidos grasos (FAMEs). Se separa el hexano de la fase acuosa mediante pipeta Pasteur de vidrio, y se transfiere a un vial de inyección para cromatografía de gases. 3.4 Determinación de ácidos grasos mediante GC-FID Para determinar el perfil de ácidos grasos de las membranas, se realiza una cromatografía de gases de alto rendimiento utilizando un sistema de GC Agilent 6850 (Algient Technologies, Palo Alto, CA, USA). Este sistema está equipado con una columna capilar DB-Wax (dimensiones: 60m x 0,25 μm x 0’25 μm) y con un detector de llama (FID) de Agilent (Santa Clara, CA, USA). Tras la separación y detección GC-FID de los ácidos grasos (Barreiro et al. 2020), cada uno de los picos cromatográficos se integran (primero automáticamente y después se hacen comprobaciones y las correspondientes correcciones para que el pico esté bien integrado) obteniendo así un número que equivale al área del pico. Se realiza después una corrección mediante patrón interno. El software que se utilizó para visualizar y analizar los resultados obtenidos fue GC ChemStation version B.03.02, de Agilent Technologies. Los datos obtenidos de cada integración se expresarán como porcentaje en peso de cada tipo de ácido graso sobre el total de ácidos grasos de la muestra (% w/w del total de ácidos grasos). Finalmente, se identificaron un total de 34 ácidos grasos diferentes que podemos dividir en tres grupos: ácidos grasos saturados (SFA), que son: C14:0, C15:0, C16:0, C17:0, C18:0, C20:0, C22:0 y C24:0; ácidos grasos monoinsaturados (MUFA), que son: C14:1n-5, C16:1n-9, C16:1n-7, C16:1n-5, C16:1n-13t, C17:1n-9, C18:1n-9, C18:1n-7, C20:1n-11, C20:1n-9, C22:1n-11 y C22:1n-9; y los ácidos grasos poliinsaturados (PUFA), que son: C18:2n-6, C18:2n-6 9-12t, C18:2n-6 9t-12, CLA18:2n-7 9t-11t, CLA18:2n-6 10t-12, C18:3n-6, C20:2n-6, C20:3n-6, C20:4n-6, C18:3n-3, C18:4n-3, C20:5n-3, C22:5n-3 y C22:6n-3. 31 externo está gestando, puesto que los ácidos grasos que poseen una importancia menor son, como ya se mencionaba anteriormente, los ácidos ω-3 y ω-6 (Ghebremeskel et al., 2000). Este descenso producido en los PUFA es un importante indicador de que el animal se encuentra en un estado de embarazo (Ghebremeskel et al., 2000). El segundo de los controles externos sí que tiene un perfil similar al del resto de animales, casi llegando a agruparse con los animales objetos de estudio los días 50 y 95. Aunque se trate de un perfil lipídico cercano a estos días, se ve que hay un mayor porcentaje de ácidos grasos saturados y monoinsaturados en la membrana de los eritrocitos de la vaca control externo que en las vacas del estudio. Esto demuestra que el hecho de que las vacas no se encuentren en el mismo momento posparto, de lactación, de edad, etc., no tienen por qué experimentar los mismos cambios en las membranas de los eritrocitos, independientemente de la temperatura ambiental, ya que hay otros factores que intervienen en la incorporación de ácidos grasos a las membranas plasmáticas de las células sanguíneas en general, y, en particular, de los glóbulos rojos. 4.1.2 Linfocitos Los estudios también se desarrollaron en los ácidos grasos de membrana de linfocitos, que, como muestra la Figura 5, en esta ocasión, no se encuentra una separación clara entre los linfocitos en función del tiempo. Tampoco se aprecia una agrupación en función del tratamiento o no. En el caso de los linfocitos, la separación no está clara, es decir, apenas hay diferenciación entre los días del estudio. Se puede decir que durante los primeros días Figura 5: a) Gráfico de puntuación del PCA realizado con la abundancia relativa de los grasos de la membrana de eritrocitos bovinos (1=control; 2=tratadas con rbST). b) Gráfico de cargas de cada componente graso para la distribución del PCA en eritrocitos. a) b) 32 hay una tendencia positiva en el eje Y, pero no hay demasiada diferencia entre los días 1 y 7, ya que no encontramos una distribución homogénea para ninguno de los dos grupos. Se puede intuir vagamente que el día 1 los animales tenían una mayor concentración de ácidos grasos saturados y monoinsaturados en la membrana de sus linfocitos. Por su parte, los puntos del día 7, están más próximos entre sí, que los del día 1, por tanto, podemos decir que hay más uniformidad en la distribución de los ácidos grasos de las membranas de los linfocitos el día 7 que el día 1. Como de forma general, los puntos del día 7 aparecen más próximos al eje Y, se puede intuir que la concentración de ácidos grasos monoinsaturados y saturados disminuye con respecto al día anterior, y, como consecuencia, que los ácidos grasos poliinsaturados y/o los ω- 6, aumentan su concentración. La distribución de los puntos de los ácidos grasos del día 50, tampoco es demasiado uniforme, pero sí se puede ver que más o menos, se encuentran entre los primeros (1 y 7) y los últimos días (95 y 214) si se observa el eje Y. Por último, en cuanto a los dos últimos días de análisis (95 y 214 días), se ve que apenas hay diferencia entre ambos. Los dos tienen una distribución similar tanto en el eje X como en el Y. Si se quisiera precisar un poco, se podría decir que es probable que en el día 214 haya una proporción ligeramente mayor de ácidos grasos poliinsaturados y de ω-6, aunque las diferencias que se pueden apreciar con este análisis no son evidentes. Tras el análisis del PCA de la línea roja y el de la línea blanca, se puede hacer una comparación de ambos para ver si las células sanguíneas de la línea roja y las de la línea blanca siguen un patrón similar de captación de ácidos grasos de membrana. A priori, podemos observar que los glóbulos rojos sí que siguen un patrón de captación de ácidos grasos en función del tiempo, mientras que los linfocitos, no siguen este patrón tan diferenciado. Es cierto que sí que se puede intuir una tendencia a la adquisición de ácidos grasos poliinsaturados y ω-6 por parte de los linfocitos con el paso del tiempo, mientras que se pierden ácidos grasos saturados y monoinsaturados, pero esta tendencia no es lo suficientemente clara como para separar por días los perfiles lipídicos como en el caso anterior. 33 4.2 Evolución temporal de los ácidos grasos de membrana de células sanguíneas bovinas 4.2.1 Eritrocitos Tras el primer análisis, se estudiaron los cambios de los seis grupos de los que se hablaba anteriormente en función del tiempo (SFAs, MUFAs, PUFAs, ω-6, ω-3 y CLAs), ya que, dependiendo del tratamiento, ya se ha observado que los ácidos grasos de membrana de los dos tipos celulares utilizados no cambian de manera uniforme. Los primeros grupos de ácidos grasos de membrana de los eritrocitos que se sometieron al análisis fueron los ácidos grasos saturados y poliinsaturados, y con los poliinsaturados, los ω-6, que son los PUFAs con mayor presencia. En la Figura 6 se muestran los cambios experimentados por estos grupos de ácidos en la membrana de los eritrocitos. Si se analizan los cambios en función del tiempo de los ácidos grasos saturados en los glóbulos rojos, se ve cómo los primeros días el porcentaje de ácidos grasos saturados en la membrana es mucho menor que el día 50, donde se detecta un pico en el que el porcentaje de ácidos grasos saturados en la membrana supera el 45 %. El día 95 sigue habiendo en la membrana un porcentaje de ácidos grasos saturados muy alto, ya que alcanza el 40 %, pero es menor que en el día 50. Por último, el día 214, vemos que la importancia de los ácidos grasos saturados desciende considerablemente, alcanzando su punto más bajo en el estudio, con un porcentaje un poco superior al 30 %. En los gráficos de la Figura 6, se puede observar que los ácidos grasos saturados no son los únicos que cambian su concentración. Esto es lógico, ya que la membrana de los eritrocitos, aunque sea muy flexible, debe mantener siempre la misma superficie, por lo que si aumenta la concentración de un tipo de ácidos grasos en la membrana, debe Figura 6: Evolución ácidos grasos saturados (a), poliinsaturados (b) y ω-6 (c) en la membrana de los eritrocitos en ganado bovino de leche. a) b) c) 34 disminuir en la misma proporción el conjunto de ácidos grasos restantes. Los ácidos grasos que tienen un patrón inverso a los SFAs son los PUFAs y los ácidos grasos ω- 6. Los ácidos grasos ω-6, son un tipo de PUFAs, por lo que es normal que cambien siguiendo el mismo patrón. En la Figura 6b, se ve la evolución del porcentaje de los ácidos grasos poliinsaturados en función de los días de análisis, y, por tanto, en función del tiempo. La primera observación que se puede hacer en este gráfico, es que es varía de forma inversa al gráfico de los ácidos grasos saturados, por tanto cuando estos últimos aumentan su porcentaje, los PUFAs disminuyen su porcentaje, y viceversa: cuando los ácidos grasos poliinsaturados aumentan su concentración en la membrana plasmática de los eritrocitos, los saturados disminuyen la suya. Como se predecía en la Figura 4, la suma de estas dos variantes diferencia la posición en la que se encontraban, ya que son los grupos de ácidos grasos con mayor porcentaje en la membrana plasmática de los hematíes. Aun así, si se mantuviesen estables y no fluctuasen, no serían el elemento diferenciador. Tras la deducción realizada con el PCA, se puede ver que los resultados predichos eran correctos, ya que los ácidos grasos ω-6 siguen un patrón muy similar al de los ácidos grasos poliinsaturados. La variabilidad mostrada en el gráfico es la misma, lo único, que los porcentajes de ácidos grasos ω-6 son inferiores que los de los ácidos grasos poliinsaturados. Los ácidos grasos ω-6 son un tipo de ácido graso poliinsaturado, concretamente, el que más peso tiene en la membrana celular de los eritrocitos, por eso sigue el mismo patrón que los PUFAs. La mayoría de los ácidos grasos poliinsaturados no pueden ser sitetizados por los mamíferos, sino que, a partir de la incorporación de los ácidos linoleico y linolénico, los animales son capaces de sintetizar el resto de ácidos grasos poliinsaturados necesarios (Sardesai, V.M.,1992). Estos ácidos son ácidos grasos esenciales, por lo que al reducir la ingesta diaria, los ácidos grasos poliinsaturados también disminuyen su concentración tanto en sangre, como en las membranas de las células sanguíneas de la línea roja. En el caso de los eritrocitos, se ve cómo los patrones de cambio en las membranas siguen los patrones del calor a los que se someten los animales, puesto que los primeros días de estudio (día 1 y día 7) son los primeros días de junio, época en la que comienza a hacer calor, pero no demasiado. En el día 50 se observa un gran pico que indica un aumento muy considerable de los ácidos grasos saturados en sangre, este día se corresponde con la fecha del 26 de julio, 35 en la que hace mucho calor: ese día, según los registros de la estación meteorológica de Becerreá de la AEMET, hubo una temperatura máxima de 25ºC, y los días anteriores 26 y 27ºC. No se trata de un calor excesivo en el que los animales se encuentren en condiciones de estrés severo, sin embargo, al no estar acostumbrados a dichas temperaturas, es muy probable que experimentasen un ligero estrés durante esos días del verano, y por eso, aumentase la concentración de ácidos grasos saturados en las membranas de sus glóbulos rojos. Lógicamente, este cambio no se produce por el efecto del calor en tres días, sino los cambios se producen por todo el estrés generado durante el verano. El día 95 los niveles de SFA son más bajos que en pleno verano, sin embargo, no es una variación demasiado grande. Esto se debe a que las vacas se han sometido durante todo el verano a calor, y el patrón de cambio de los ácidos grasos de las membranas eritrocitarias no es lo suficientemente rápido como para que varíe demasiado en un periodo de tiempo tan corto. El día 9 de septiembre de 2016 se registraron unas temperaturas máximas de 16ºC, por lo que los animales ya comenzaban a no sufrir estrés por las altas temperaturas. Por último, el último día de registro, se corresponde con la época invernal, una época fría del año en la esta movilización de grasas generada por la disminución de la ingesta, no se produce, y, en la que los ácidos grasos saturados de las membranas eritrocitarias alcanzan la concentración mínima registrada. Esta variación en los ácidos grasos saturados se debe a un aumento de la movilización de las reservas grasas del animal, experimentado debido a los cambios de temperatura asociados a la época del año. Los días en los que el animal se ha expuesto a más calor, el balance energético de los animales es más negativo, ya que ingieren una menor cantidad de comida. La energía necesaria para realizar todos los procesos fisiológicos proviene de las reservas energéticas, haciendo así que aumenten las concentraciones de ácidos grasos saturados en sangre, y, que los eritrocitos, capten este tipo de ácidos grasos en sus membranas (Joo et al., 2021). Los ácidos grasos poliinsaturados también siguen el patrón de cambio estacional que se observaba en los ácidos grasos saturados. Sin embargo, estos ácidos grasos disminuyen su concentración en la membrana eritrocitaritaria durante los períodos más calurosos de año. Por tanto, se puede decir que cuando los ácidos grasos poliinsaturados reducen su concentración en la membrana plasmática, los ácidos grasos 36 que los sustituyen son los saturados, puesto que son los más abundantes en las reservas energéticas. En segundo lugar, los datos de los ácidos grasos monoinsaturados y su evolución se analizarán en función del tiempo. Los datos se muestran en la Figura 7. Como bien se aprecia en la Figura 7, y bien se dedujo a partir de la Figura 4, los ácidos grasos monoinsaturados, no fluctúan demasiado en función del tiempo, se aprecia que varían entre el 15 y el 18 % en la composición de la membrana. Sí que se observa una ligera tendencia a la disminución de esta familia lipídica, ya que el día 1 el porcentaje de MUFA es superior al del último día. Aun así, este descenso no ocurre de una forma pronunciada y constante. A diferencia de los ácidos grasos saturados, los monoinsaturados no se ven afectados por los cambios de temperatura producidos debido a la época del año, sino que se mantienen estables. En todos los días de estudio solo hay variaciones del 3 %, y no hay diferencia significativa (p<0.05) entre los valores obtenidos durante los diferentes días del estudio, por lo que se puede afirmar que esta familia lipídica no adquiere valores diferentes ni en función del tiempo, ni en función de si el animal se ha sometido a tratamiento o no, ni una combinación de ambas. En períodos de tiempo inferiores a un año en los que el animal adulto no sufre cambios dietéticos, cambios hormonales asociados a la edad (menarquia, menopausia, estrés continuado, etc.) ni cambios en las condiciones externas más allá de la temperatura ambiental y el ciclo normal de lactación, los ácidos grasos monoinsaturados se mantienen estables en las membranas plasmáticas eritrocitarias. Figura 7: Evolución ácidos grasos monoinsaturados en la membrana de los eritrocitos en ganado bovino de leche. 37 El siguiente de los grupos en los que se dividió a los ácidos grasos de membrana se corresponde a los ácidos grasos ω-3, cuyo porcentaje en las membranas de los eritrocitos en función del tiempo está representada en la Figura 8, que se presenta a continuación: En esta Figura 8 se puede ver cómo el porcentaje de ácidos grasos ω-3 no es muy elevado en general (si se compara con la presencia de otros ácidos grasos), aun así, se aprecia un claro patrón de disminución de los ácidos grasos ω-3 hasta el día 50, donde se alcanza el porcentaje mínimo. A partir de este punto, el porcentaje de ácidos grasos ω-3 en la membrana de los eritrocitos va a aumentar, pero no hasta los niveles iniciales. El último de los gráficos representativos de la evolución de los ácidos grasos de la membrana de los eritrocitos en función del tiempo se presenta a continuación, y muestra la evolución de los CLAs. La Figura 9 muestra que los CLAs no son un tipo de ácido graso que tenga una abundancia especialmente notable en las membranas de los eritrocitos, puesto que el porcentaje máximo alcanzado por este grupo molecular está por debajo del 2 %. En Figura 8: Evolución ácidos grasos ω-3 en la membrana de los eritrocitos en ganado bovino de leche. Figura 9: Evolución ácidos grasos CLAs en la membrana de los eritrocitos en ganado bovino de leche. 38 cuanto a su evolución temporal, se aprecia que se mantienen estables en el tiempo hasta el día 95. Es cierto que su porcentaje va disminuyendo muy ligeramente hasta el cuarto día de análisis, pero la disminución no se produce de manera brusca. Por otro lado, el día 214 de análisis se ve que el porcentaje de CLAs en la membrana del glóbulo rojo aumenta de manera exagerada, llegando a alcanzar casi el doble del valor del día 95. Los CLAs y los ácidos grasos ω-3 son metabolitos que intervienen en el estrés oxidativo generado por el balance energético negativo. El hecho de que los CLAs se mantengan estables en la membrana de los eritrocitos durante todos los días de análisis excepto durante los últimos, apunta a que los CLAs presentes en sangre se estén utilizando para evitar daños importantes en las células y el ADN, y solo se mantenga en la membrana la concentración mínima necesaria su el correcto funcionamiento. Cuando el estrés oxidativo es menor, debido a que es invierno, las temperaturas son más bajas, y, por tanto, no existe el factor externo de balance energético negativo causado por una reducción del consumo de comida, se ve cómo la concentración de CLAs alcanza niveles que doblan los registrados anteriormente (Veshkini et al., 2023). Los ácidos grasos monoinsaturados, los CLAs y los ω-3 siguen un patrón de cambio diferente al de los SFA, PUFA y ω-6. El hecho de que varíen siguiendo un patrón diferente indica que este tipo de lípidos presentes en las membranas eritrocitarias no se ven afectados por las variaciones estacionales de la temperatura. El calor no es el único factor que afecta al balance energético negativo, sino que el momento de la lactación también influye, y también supone un balance negativo energéticamente hablando durante la época de lactancia (Nielsen et al., 2003). Sin embargo, en los animales objeto de estudio no se aprecia diferencia entre unos y otros porque todos se encuentran en el mismo momento de lactación. 4.2.2 Linfocitos A continuación, se analizan los gráficos del porcentaje de ácidos grasos en las membranas de las células de la línea blanca en función del tiempo. Se podrán observar así los cambios que se producen en la membrana plasmática de los linfocitos del ganado bovino a lo largo del tiempo. 39 El primero de los grupos que será comentado es el de los ácidos grasos saturados, cuyos resultados se muestran en la Figura 10. En la Figura 10 se ve cómo el porcentaje de los ácidos grasos saturados de la membrana de los linfocitos se mantiene relativamente estable durante todo el tiempo de análisis, ya que sus valores medios no fluctúan mucho y se mantienen entre el 30 y el 38 % de los ácidos grasos totales. El punto más bajo se observa el día 7, donde el porcentaje medio de ácidos grasos en la membrana es un poco superior al 30 %. Por otro lado, el porcentaje más alto se encuentra el primer día, en el que su valor medio fue casi del 40 %. La Figura 11 es la que se muestra bajo este párrafo. En ella se aprecia la evolución del porcentaje de los ácidos grasos monoinsaturados que conforman la membrana celular de los glóbulos blancos del ganado bovino. Al igual que en el caso de los eritrocitos, el gráfico no fluctúa demasiado, sino que más bien se mantiene constante en el tiempo, pues todos los valores entran en el rango de entre el 15 y el 20 % de la composición total de este tipo lipídico. El valor más alto se Figura 10: Evolución ácidos grasos saturados en la membrana de los linfocitos del ganado bovino de leche. Figura 11: Evolución ácidos grasos monoinsaturados en la membrana de los linfocitos en ganado bovino de leche. 40 sitúa en torno a una composición del 17 %, y el mínimo, no está muy claro en qué día se produce, aun así, los tres posibles mínimos (días 7, 50 y 214) están en torno al 15 %. Si se compara este gráfico (Figura 11) y el anterior (Figura 10), se ve que la forma de las fluctuaciones es muy similar, por lo que se podría decir que estos dos tipos de ácidos grasos varían siguiendo el mismo patrón. Esto se ve en el día 1, donde en ambos gráficos se sitúa el máximo absoluto de la gráfica, los días siguientes de análisis desciende el porcentaje de ambos ácidos grasos, aunque en este punto el patrón difiere un poco, ya que el día 50 los ácidos grasos saturados aumentan su presencia en la membrana, mientras que los monoinsaturados se mantienen. Sin embargo, el día 95 se vuelve a apreciar un máximo relativo en ambos casos para que, finalmente, el último día de análisis ambos porcentajes desciendan. Por tanto, se puede establecer que la evolución entre la concentración de ácidos grasos saturados y monoinsaturados en la membrana de los linfocitos sigue un patrón evolutivo similar. El siguiente gráfico que se muestra (Figura 12) representa la evolución del porcentaje de los ácidos grasos poliinsaturados en el mismo tipo celular que las dos figuras anteriores: los linfocitos. En el gráfico se observa que los ácidos grasos poliinsaturados conforman una parte muy importante de la membrana celular de los linfocitos, ya que su proporción está entre el 40 y el 55 % de los ácidos grasos totales. Los dos primeros días de análisis, los ácidos grasos poliinsaturados tienen los valores más bajos, cerca del 40 %, sin embargo, a partir del día 50, el porcentaje de PUFAs Figura 12: Evolución ácidos grasos poliinsaturados en la membrana de los linfocitos en ganado bovino de leche. 47 Para asegurar que la información observada en los gráficos de la Figura 17 era estadísticamente correcta, se realizó un estudio ANOVA en dos direcciones para ver si en algún punto del estudio había diferencias significativas entre las vacas control y las vacas tratadas, y se estableció de forma estadística, que efectivamente, en las membranas eritrocitarias, los efectos de la somatotropina no influían en ninguno de los casos. El mismo estudio realizado en los eritrocitos, se repitió para los linfocitos, con el mismo objetivo, ya que, al ser células diferentes, los patrones de cambio y la captación de lípidos es igual en los dos tipos celulares, y, aunque en los eritrocitos no se hubiese resultados positivos para la influencia de la somatotropina, podría haberlos en los linfocitos. En el caso de los linfocitos, simplemente observando los gráficos que se muestran en la Figura 18, se puede observar que las vacas tratadas sufren más fluctuaciones en función del tiempo que las vacas control, que de manera generalizada se mantienen más estables en cada uno de los ácidos grasos. Los ácidos grasos en los que se observan fluctuaciones diferentes entre las vacas tratadas con Lactotropina y aquellas Figura 18: Comparación del porcentaje de los distintos ácidos grasos en la membrana de los linfocitos entre las vacas control y las tratadas con somatotropina recombinante. 48 que se utilizan como control, son los ácidos grasos, saturados, los poliinsaturados y los ω-6. El resto de ácidos grasos varían de una manera muy similar, aunque no tan parecido como en el caso de los eritrocitos. Tabla 7: Comparación valores medios ácidos grasos de linfocitos de las vacas control y de las vacas tratadas con Lactotropina y significación de sus diferencias. Tipo de ácido graso Control Tratadas Valores P Media (%w/w) SD Media (%w/w) SD Tiempo Tratamiento Interacción SFA 34.89 1.94 34.54 1.94 0.005** 0.68 0.03* MUFA 15.32 1.94 16.54 1.29 0.01* 0.03* 0.49 PUFA 48.62 2.33 47.25 2.78 0.002** 0.11 0.07 ω-3 4.05 2.31 3.83 0.95 0.02* 0.26 0.40 ω-6 43.12 2.5 42.03 2.92 <0.0001**** 0.10 0.06 CLA 1.29 2.4 1.23 0.46 0.003** 0.47 0.97 Aunque a simple vista en la Figura 18 se aprecian diferencias aparentemente grandes entre las vacas tratadas y las control en los SFA, los PUFA y los ω-6, el test ANOVA, representado en la Tabla 7, desveló que no había diferencia significativa causada por el tratamiento en ninguno de los tres casos, solo que en los ácidos grasos saturados influía significativamente (p < 0.05) la interacción de tiempo y tratamiento. Otro dato relevante que develó el análisis ANOVA de los ácidos grasos monoinsaturados, es que, aunque aparentemente en el gráfico mostrado en la Figura 19 no se vea una diferencia evidente entre las vacas control y las tratadas, sí que hay una diferencia estadística entre ellas, puesto que el tratamiento sí que interviene en los cambios producidos en los ácidos grasos monoinsaturados de las membranas plasmáticas de los linfocitos, aunque esta diferencia significativa es menor (p = 0.03) que la diferencia significativa producida por el paso del tiempo (p = 0.01). La principal conclusión que podemos sacar de estos análisis es que la somatotropina recombinante administrada de manera exógena no tiene influencia sobre la composición de la membrana de las células sanguíneas de las vacas, a pesar de tener influencia sobre el metabolismo lipídico del animal. 49 5. Conclusión Las membranas de las células sanguíneas experimentan cambios en función del tiempo, como se ha comprobado a lo largo del estudio. Estos cambios son debidos a múltiples factores como pueden ser la lactancia, la temperatura externa, la influencia de las hormonas o la gestación. En este estudio, el factor más relevante a la hora de producir cambios en las membranas de los eritrocitos en función del tiempo ha demostrado ser la temperatura ambiental. Debido al estrés oxidativo generado por el calor experimentado en la época estival, las vacas aumentan su porcentaje de ácidos grasos saturados en la membrana de los RBC, mientras que se observa un claro descenso de los ácidos grasos ω-6, lo que claramente afecta a la proporción de PUFAs en la membrana eritrocitaria. Los cambios experimentados en las membranas de las células de la línea roja no se han producido a una gran velocidad, puesto que siempre han ido de la mano con la estación del año (y la temperatura asociada a ella). Estos cambios asociados a la gestación se relacionan con una concentración de SFA muy alta y una concentración de PUFA exageradamente baja, disminuyendo, sobre todo, su concentración de ω-3 y ω-6. Por el contrario, no se ha observado un patrón de cambio claro en las células blancas, en comparación con los eritrocitos. Al hacer un estudio comparativo entre ambos tipos de células sanguíneas, se observó que los cambios producidos en las membranas de los linfocitos eran mucho menores, y, por tanto, que sus membranas eran más estables a lo largo del tiempo. Finalmente, se comprobó que la potenciación de la lactación con somatotropina bovina recombinante no afecta a la composición grasa de las membranas de glóbulos rojos y blancos del ganado bovino de leche, a pesar de tener esta hormona un efecto demostrado sobre el metabolismo lipídico del animal. 50 6. Bibliografía AEMET. Base de datos meteorológica. consulta datos diarios. https://datosclima.es/Aemethistorico/Meteosingleday.php Aktas, M., Elmastas, M., Ozcicek, F., & Yilmaz, N. (2016). Erythrocyte Membrane Fatty Acid Composition in Premenopausal Patients with Iron Deficiency Anemia. Journal of Oleo Science, 65(3), 225–231. https://doi.org/10.5650/jos.ess15211 Barreiro, R., Regal, P., López-Racamonde, O., Cepeda, A., & Fente, C. (2020). Evolution of breast milk fatty acids in Spanish mothers after one year of uninterrupted lactation. Prostaglandins, Leukotrienes and Essential Fatty Acids, 159, 102141. https://doi.org/10.1016/j.plefa.2020.102141 Body, D. R. (1988). The lipid composition of adipose tissue. Progress in Lipid Research, 27(1), 39–60. https://doi.org/10.1016/0163-7827(88)90004-5 Calder, P. C., Yaqoob, P., Harvey, D. J., Watts, A., & Newsholme, E. A. (1994). Incorporation of fatty acids by concanavalin A-stimulated lymphocytes and the effect on fatty acid composition and membrane fluidity. Biochemical Journal, 300(2), 509–518.https://doi.org/10.1042/bj3000509 Calder, P. C., Yaqoob, P., Thies, F., Wallace, F. A., & Miles, E. A. (2002). Fatty acids and lymphocyte functions. British Journal of Nutrition, 87(S1), S31–S48. https://doi.org/10.1079/BJN2001455 Chamorro López, L., Martínez González, J., García Cano, A. M., Busto Durán, R., Albillos Martínez, A., & Pastor Rojo, Ó. (2013). Análisis de la composición de ácido araquidónico y ácidos grasos omega-3 en plasma, membrana eritrocitaria y células inmunitarias de pacientes con cirrosis. Revista Del Laboratorio Clinico, 6(1), 10–17. https://doi.org/10.1016/j.labcli.2012.05.004 Chilton, B. S., & Hewetson, A. (2005). Prolactin and Growth Hormone Signaling (pp. 1–23). https://doi.org/10.1016/S0070-2153(05)68001-5 De Carvalho CCCR, Caramujo MJ (2018). The Various Roles of Fatty Acids. Molecules, 23(10):2583. https://doi.org/10.3390/molecules23102583 Ferlazzo, A. M., Bruschetta, G., di Pietro, P., Medica, P., Notti, A., & Rotondo, E. (2011). Phospholipid composition of plasma and erythrocyte membranes in animal species by 31P NMR. Veterinary Research Communications, 35(8), 521–530. https://doi.org/10.1007/s11259-011- 9496-4 Ferreri, C., Masi, A., Sansone, A., Giacometti, G., Larocca, A., Menounou, G., Scanferlato, R., Tortorella, S., Rota, D., Conti, M., Deplano, S., Louka, M., Maranini, A., Salati, A., Sunda, V., & 51 Chatgilialoglu, C. (2016). Fatty Acids in Membranes as Homeostatic, Metabolic and Nutritional Biomarkers: Recent Advancements in Analytics and Diagnostics. Diagnostics, 7(1), 1. https://doi.org/10.3390/diagnostics7010001 Ghebremeskel, K., Min, Y., Crawford, M. A., Nam, J., Kim, A., Koo, J., & Suzuki, H. (2000). Blood fatty acid composition of pregnant and nonpregnant Korean women: Red cells may act as a reservoir of arachidonic acid and docosahexaenoic acid for utilization by the developing fetus. Lipids, 35(5), 567–574. https://doi.org/10.1007/s11745-000-557-3 Joo, S. S., Lee, S. J., Park, D. S., Kim, D. H., Gu, B. H., Park, Y. J., Rim, C. Y., Kim, M., & Kim, E. T. (2021). Article changes in blood metabolites and immune cells in Holstein and Jersey dairy cows by heat stress. Animals, 11(4). https://doi.org/10.3390/ani11040974 Lankinen, M., Uusitupa, M., & Schwab, U. (2018). Genes and Dietary Fatty Acids in Regulation of Fatty Acid Composition of Plasma and Erythrocyte Membranes. Nutrients, 10(11), 1785. https://doi.org/10.3390/nu10111785 Luo Y, Kong Z, Yang B, He F, Huan C, Li J, Yi K. (2023). Relationship between Microflora Changes and Mammary Lipid Metabolism in Dairy Cows with Mastitis. Animals, 13(17):2773. https://doi.org/10.3390/ani13172773 Matorras, R., Ruiz, J. I., Mendoza, R., Ruiz, N., Sanjurjo, P., & Rodriguez-Escudero, F. J. (1998). Fatty acid composition of fertilization-failed human oocytes. Human Reproduction, 13(8), 2227-2230. https://doi.org/10.1093/humrep/13.8.2227 Mishra, S., Panda, M. S., & Chakraborty, H. (2023). Fusion peptide induced modification of membrane organization and dynamics: Implications in developing fusion inhibitors. Chemical Physics Impact, 100287. https://doi.org/10.1016/j.chphi.2023.100287 Mohandas, N., & Gallagher, P. G. (2008). Red cell membrane: past, present, and future. Blood, 112(10), 3939–3948. https://doi.org/10.1182/blood-2008-07-161166 Nguyen, T. D., Bordeau, B. M., Zhang, Y., Mattle, A. G., & Balthasar, J. P. (2022). Half-Life Extension and Biodistribution Modulation of Biotherapeutics via Red Blood Cell Hitch-Hiking with Novel Anti-Band 3 Single-Domain Antibodies. International Journal of Molecular Sciences, 24(1), 475. https://doi.org/10.3390/ijms24010475 Nielsen, H. M., Friggens, N. C., Løvendahl, P., Jensen, J., & Ingvartsen, K. L. (2003). Influence of breed, parity, and stage of lactation on lactational performance and relationship between body fatness and live weight. Livestock Production Science, 79(2–3), 119–133. https://doi.org/10.1016/S0301-6226(02)00146-X 52 Novo, C., Fonseca, E., & Freitas, A. A. (1987). Altered fatty acid membrane composition modifies lymphocyte localization in vivo. Cellular Immunology, 106(2), 387– 396. https://doi.org/10.1016/0008-8749(87)90181-x Orakpoghenor, O., Avazi, D. O., Markus, T. P., & Olaolu, O. S. (2019). Lymphocytes: a brief review. SCIRES Lit, 3(1), 005-8. https://www.sciresliterature.org/Immunology/SJII-ID17.pdf Pearson, K. (1901). LIII. On lines and planes of closest fit to systems of points in space. The London, Edinburgh, and Dublin Philosophical Magazine and Journal of Science, 2(11), 559–572. https://doi.org/10.1080/14786440109462720 Plasenzotti, R., Windberger, U., Ulberth, F., Osterode, W., & Losert, U. (2007). Influence of fatty acid composition in mammalian erythrocytes on cellular aggregation. Clinical hemorheology and microcirculation, 37(3), 237-243. Influence of fatty acid composition in mammalian erythrocytes on cellular aggregation - IOS Press Poggi, P., Mirabella, R., Neri, S., Assirelli, E., Dolzani, P., Mariani, E., Calder, P. C., & Chatgilialoglu, A. (2015). Membrane fatty acid heterogeneity of leukocyte classes is altered during in vitro cultivation but can be restored with ad-hoc lipid supplementation. Lipids in Health and Disease, 14(1), 165. https://doi.org/10.1186/s12944-015-0166-3 Pompéia, C., Lopes, L. R., Miyasaka, C. K., Procópio, J., Sannomiya, P., & Curi, R. (2000). Effect of fatty acids on leukocyte function. Brazilian Journal of Medical and Biological Research, 33, 1255-1268. https://doi.org/10.1590/S0100-879X2000001100001 Revskij, D., Haubold, S., Viergutz, T., Kröger-Koch, C., Tuchscherer, A., Kienberger, H., ... & Mielenz, M. (2019). Dietary fatty acids affect red blood cell membrane composition and red blood cell ATP release in dairy cows. International journal of molecular sciences, 20(11), 2769. https://doi.org/10.3390/ijms20112769 Robert, C., Huet, A. C., Suárez-Pantaleón, C., Brasseur, A., Delahaut, P., & Gillard, N. (2017). Development of a confirmatory method for detecting recombinant bovine somatotropin in plasma by immunomagnetic precipitation followed by ultra-high performance liquid chromatography coupled to tandem mass spectrometry. Food Additives & Contaminants: Part A, 34(11), 1925– 1934. https://doi.org/10.1080/19440049.2017.1364429 Sanjulián, L., Lamas, A., Barreiro, R., Cepeda, A., Fente, C. A., & Regal, P. (2021). Bacterial Diversity of Breast Milk in Healthy Spanish Women: Evolution from Birth to Five Years Postpartum. Nutrients, 13(7), 2414. https://doi.org/10.3390/nu13072414 Sardesai, V.M. (1992), The Essential Fatty Acids. Nutrition in Clinical Practice, 7: 179-186. https://doi.org/10.1177/0115426592007004179 53 Scott, J.L., McMillan, R., Marino, J. V. & Davidson G. (1973). Leukocyte labeling with 51chromium. IV. The kinetics of chronic lymphocytic leukemic lymphocytes. Blood, 41 (1): 155- 162. https://doi.org/10.1182/blood.V41.1.155.155 Silverthorn, D. U., (2019a). Anatomía del sistema inmunitario en Morando A. (Ed.) Human physiology: an integrated approach (8ª ed., pp. 757-760). Editorial Médica Panamá. Silverthorn, D. U., (2019b). Compartimentación: células y tejidos en Morando A. (Ed.) Human physiology: an integrated approach (8ª ed., pp. 61-64). Editorial Médica Panamá. Silverthorn, D. U., (2019c). La sangre en Morando A. (Ed.) Human physiology: an integrated approach (8ª ed., pp. 510-515). Editorial Médica Panamá. Tvrzicka, E., Kremmyda, L. S., Stankova, B., & Zak, A. (2011). Fatty acids as biocompounds: their role in human metabolism, health and disease-a review. part 1: classification, dietary sources and biological functions. Biomedical Papers of the Medical Faculty of Palacky University in Olomouc, 155(2). DOI: 10.5507/bp.2011.038 Biomedical Papers: fatty acids as biocompounds: their role in human metabolism, health and disease – a review. part 1: classification, dietary sources and biological functions (upol.cz) Twisk, A. J. T., Detering, F., & Kraal, G. (1991). The Fatty Acid Composition of the Lymphocyte Cell Membrane. Influence on Interactions with High Endothelium and the Expression of Homing Receptors. Immunobiology, 183(5), 386–395. https://doi.org/10.1016/S0171-2985(11)80523-1 UE, Directiva 2010/63/UE del Parlamento Europeo y del Consejo, de 22 de septiembre de 2010, relativa a la protección de los animales utilizados para fines científicos. DO L 276 de 20.10.2010, p. 33/79 http://data.europa.eu/eli/dir/2010/63/oj Vance, D., & Vance, J. (1996). Physical properties and functional roles of lipids in membranes. Biochemistry of lipids, lipoproteins and membranes, 31, 1-33. Biochemistry of Lipids, Lipoproteins and Membranes - Google Libros Veshkini, A., Gnott, M., Vogel, L., Kröger-Koch, C., Tuchscherer, A., Tröscher, A., Bernabucci, U., Trevisi, E., Starke, A., Mielenz, M., Bachmann, L., & Hammon, H. M. (2023). Abomasal infusion of essential fatty acids and conjugated linoleic acid during late pregnancy and early lactation affects immunohematological and oxidative stress markers in dairy cows. Journal of Dairy Science, 106(7), 5096–5114. https://doi.org/10.3168/jds.2022-22514 Weijers, R. N. M. (2015). Membrane flexibility, free fatty acids, and the onset of vascular and neurological lesions in type 2 diabetes. Journal of Diabetes & Metabolic Disorders, 15(1), 13. https://doi.org/10.1186/s40200-016-0235-9