Análisis en la artritis reumatoide de anticuerpos atípicos frente a proteínas modificadas postraduccionalmente

ESCUELA DE DOCTORADO INTERNACIONAL DE LA USC Lorena Rodríguez Martínez Tesis doctoral Análisis en la artritis reumatoide de anticuerpos atípicos frente a proteínas modificadas postraduccionalmente Santiago de Compostela, 2022 Programa de doctorado en Medicina Molecular TESIS DE DOCTORADO ANÁLISIS EN LA ARTRITIS REUMATOIDE DE ANTICUERPOS ATÍPICOS FRENTE A PROTEÍNAS MODIFICADAS POSTRADUCCIONALMENTE Lorena Rodríguez Martínez ESCUELA DE DOCTORADO INTERNACIONAL DE LA UNIVERSIDAD DE SANTIAGO DE COMPOSTELA PROGRAMA DE DOCTORADO EN MEDICINA MOLECULAR SANTIAGO DE COMPOSTELA 2022 DECLARACIÓN DE LA AUTORA DE LA TESIS D./Dña. Lorena Rodríguez Martínez Título de la tesis: Análisis en la artritis reumatoide de anticuerpos atípicos frente a proteínas modificadas postraduccionalmente Presento mi tesis, siguiendo el procedimiento adecuado al Reglamento y declaro que: 1) La tesis abarca los resultados de la elaboración de mi trabajo. 2) De ser el caso, en la tesis se hace referencia a las colaboraciones que tuvo este trabajo. 3) Confirmo que la tesis no incurre en ningún tipo de plagio de otros autores ni de trabajos presentados por mí para la obtención de otros títulos. 4) La tesis es la versión definitiva presentada para su defensa y coincide la versión impresa con la presentada en formato electrónico- Y me comprometo a presentar el Compromiso Documental de Supervisión en el caso que el original no esté depositado en la Escuela. En Santiago de Compostela, 22 de noviembre de 2021. Fdo. Lorena Rodríguez Martínez AUTORIZACIÓN DEL DIRECTOR / TUTOR DE LA TESIS Análisis en la artritis reumatoide de anticuerpos atípicos frente a proteínas modificadas postraduccionalmente D. Antonio González Martínez-Pedrayo Dª. Celia María Pombo Ramos INFORMAN: Que la presente tesis, se corresponde con el trabajo realizado por Dª. Lorena Rodríguez Martínez, bajo mi dirección/tutorización, y autorizo su presentación, considerando que reúne los requisitos exigidos en el Reglamento de Estudios de Doctorado de la USC, y que como director de esta no incurre en las causas de abstención establecidas en la Ley 40/2015. De acuerdo con lo indicado en el Reglamento de Estudios de Doctorado, declara también que la presente tesis doctoral es idónea para ser defendida en base a la modalidad de Monográfica con reproducción de publicaciones, en los que la participación de la doctoranda fue decisiva para su elaboración y las publicaciones se ajustan al Plan de Investigación. En Santiago de Compostela, 19 de noviembre de 2021 Fdo. Antonio González Martínez-Pedrayo Fdo. Celia María Pombo Ramos (director) (tutora) DECLARACIÓN DE CONFLICTOS DE INTERÉS D./Dña. Lorena Rodríguez Martínez Título de la tesis: Análisis en la artritis reumatoide de anticuerpos atípicos frente a proteínas modificadas postraduccionalmente Declaro que no tengo ningún conflicto de interés en relación con esta tesis doctoral. En Santiago de Compostela, 22 de noviembre de 2021. Fdo. Lorena Rodríguez Martínez RESUMEN La artritis reumatoide es una enfermedad muy compleja y heterogénea que a pesar de una investigación intensa sigue presentando muchas incógnitas. Aquí, se ha tratado de resolver algunas de las preguntas pendientes en relación con los autoanticuerpos, en particular los autoanticuerpos que no se analizan en la clínica diaria y que no están bien caracterizados por lo que se pueden denominar atípicos. Estos anticuerpos atípicos siempre se estudian comparados y relacionados con los anticuerpos típicos de la AR: el factor reumatoide y los anticuerpos anti-CCP. Esto es así porque los dos tipos de anticuerpos están muy bien establecidos en la clínica como biomarcadores y se conoce bien su evolución y relación con la patogenia de la AR. El test que ha mostrado más valor tanto como biomarcador como en la comprensión de la enfermedad ha sido el de anticuerpos anti-CCP. Este ensayo contiene una veintena de péptidos intentando cubrir todo el repertorio de anticuerpos anti-proteínas citrulinadas específicos de la AR. El descubrimiento de estos anticuerpos fue el origen de la idea de que las modificaciones postraduccionales de las proteínas podían ser autoantígenos específicamente en los pacientes con AR. Una hipótesis que se ha confirmado al demostrar de forma consistente que hay otros anticuerpos como los dirigidos a las proteínas carbamiladas o los péptidos acetilados que están presentes en una fracción significativa de pacientes con AR y son específicos de la enfermedad. Sin embargo, quedan dudas sin resolver en relación con las proteínas citrulinadas, la utilidad de los anticuerpos anti-péptidos acetilados y la extensión de las modificaciones postraduccionales que son autoantígenos específicos de la AR. En este proyecto hemos tratado de responder a las cuestiones anteriores para determinar la relevancia de la histona H4 citrulinada como antígeno de los anticuerpos anti-proteínas citrulinadas, conocer la utilidad de los anticuerpos anti-péptidos acetilados para clasificar pacientes con artritis de reciente comienzo como AR y definir mejor los anticuerpos atípicos frente a modificaciones postraduccionales con relevancia en la AR. La primera duda, referida a la naturaleza de las proteínas citrulinadas, está sin resolver pues aunque hay indicios que señalan a varias proteínas citrulinadas como dianas no se conoce ni su repertorio, ni su importancia relativa. Por ello, hemos analizado un nuevo autoantígeno citrulinado propuesto con características muy llamativas, buscando los anticuerpos que reconocen un péptido citrulinado derivado de la histona H4 (anti-cH4/39-40). Hemos observado una prevalencia superior a la de los anticuerpos dirigidos frente a otras especificidades finas citrulinadas. Con este resultado confirmamos la inmunodominancia de los anticuerpos anti-cH4/39-40 en el repertorio total de anticuerpos anti-proteínas citrulinadas, aunque no hasta el extremo de que los anticuerpos anti-cH4/39-40 y los anti-CCP sean reactividades equivalentes. También hemos encontrado una asociación significativa de los anticuerpos anti-cH4/39-40 con las erosiones independiente de los anticuerpos anti-CCP y con el alelo de riesgo de PTPN22, por lo que es posible que los anticuerpos anti-cH4/39-40 tengan una relación independiente con la patogenia y la etiología de la AR. Otra cuestión analizada es la utilidad de los anticuerpos anti-péptidos acetilados para clasificar a los pacientes como AR, ya que existen evidencias tanto a favor como en contra. Nuestra contribución ha consistido en evaluar los anticuerpos anti-péptidos acetilados (AAPA), concretamente los que reconocen la lisina (anti-AcLys) y la ornitina (anti-AcOrn) acetiladas, en un estudio longitudinal de 1062 pacientes con artritis de reciente comienzo del Hospital Universitario La Paz y del Hospital Universitario La Princesa, ambos en Madrid, y que fueron seguidos durante dos años. Los resultados muestran que los dos AAPA presentan un valor inferior al del FR y los ACPA en la clasificación de los pacientes como AR. Además, la inclusión individual de los AAPA en los criterios ACR/EULAR 2010 no mejora la clasificación. En cambio, tras considerar la triple positividad para los anticuerpos anti-AcOrn, el FR y los ACPA hemos observado una mejoría en la clasificación incluso mayor que la que se obtiene con la triple concordancia considerando los anticuerpos anti-CarP. Esta es la primera evidencia convincente de que los anticuerpos anti-AcOrn presentan valor como biomarcador cuando se consideran en concordancia con FR y ACPA, resultado que refuerza la idea de incluir la triple positividad en los criterios de clasificación. Otra parte del estudio ha buscado definir el repertorio de anticuerpos atípicos frente a modificaciones postraduccionales. En esta cuestión hemos diferenciado por un lado los anticuerpos frente a aductos de malondialdehído-acetaldehído (anti-MAA) o de malondialdehído (anti-MDA), y por otro los anticuerpos anti-proteínas carboniladas, antiproteínas nitradas y anti-proteínas homocisteiniladas. En relación con los primeros, hemos detectado la presencia de anticuerpos anti-MAA y anti-MDA de diferentes isotipos en los pacientes con AR. Sin embargo, no hemos observado la extraordinaria sensibilidad que se había descrito en dos de los trabajos previos para el conjunto de los pacientes y, especialmente, en los pacientes seronegativos, sin FR y sin ACPA. Este resultado, sumado a su falta de especificidad por la AR, cuestiona la utilidad de los anticuerpos anti-MAA y anti- MDA como biomarcadores diagnósticos. Nuestros resultados también mostraron la primera evidencia de la independencia en estado y en niveles entre estos dos tipos de anticuerpos obtenida de su evaluación en los mismos pacientes. En cuanto al segundo grupo de anticuerpos analizados, solo hemos detectado reactividad específica frente a colágeno tipo II modificado con ribosa, uno de los dos tipos de anticuerpos anti-proteínas carboniladas analizados. Como la reactividad detectada fue muy baja y los análisis para anticuerpos anticolágeno II carbonilado con ácido hipocloroso, anti-proteínas nitradas y anti-proteínas homocisteiniladas no han detectado reactividad específica en nuestros pacientes con AR, concluimos que estas modificaciones postraduccionales no se pueden considerar como autoantígenos en la AR. Conjuntamente, los hallazgos de este proyecto refuerzan la relevancia de las histonas como autoantígenos citrulinados en la AR, identifican a los anticuerpos anti-AcOrn como los AAPA con mayor utilidad como biomarcadores para la clasificación de pacientes, muestran que los anticuerpos anti-MAA y anti-MDA son dos sistemas de anticuerpos independientes que carecen de utilidad como biomarcadores, y contribuyen a definir mejor el patrón de anticuerpos frente a modificaciones postraduccionales que son relevantes en la AR, entre los que no se encuentran los anticuerpos anti-proteínas carboniladas, anti-proteínas nitradas y anti-proteínas homocisteiniladas. ÍNDICE ABREVIATURAS ............................................................................................................ 1 INTRODUCCIÓN ............................................................................................................ 7 1. LA ARTRITIS REUMATOIDE.QUÉ ES.............................................................................. 9 2. ETIOLOGÍA DE LA ARTRITIS REUMATOIDE.............................................................. 11 2.1. FACTORES GENÉTICOS ................................................................................................ 11 2.1.1. HLA ........................................................................................................................ 11 2.1.2. PTPN22 .................................................................................................................. 13 2.2. FACTORES AMBIENTALES ............................................................................................ 13 2.2.1. TABACO .................................................................................................................. 13 2.2.2. MUCOSAS ................................................................................................................ 14 3. PAPEL PATOGÉNICO DE LOS AUTOANTICUERPOS EN LA AR .............................. 16 3.1. AUTOINMUNIDAD HUMORAL EN LA ETAPA ASINTOMÁTICA DE LA AR ........................ 16 3.2. PROGRESIÓN RADIOLÓGICA ........................................................................................ 18 4. BIOMARCADORES DE DIAGNÓSTICO Y CLASIFICACIÓN ..................................... 19 5. BIOMARCADORES DE PRONÓSTICO ........................................................................... 23 6. SISTEMAS DE AUTOANTICUERPOS EN LA AR .......................................................... 25 6.1. FACTOR REUMATOIDE ................................................................................................. 27 6.2. ANTICUERPOS ANTI-PROTEÍNAS CITRULINADAS .......................................................... 27 6.3. ANTICUERPOS ANTI-PROTEÍNAS CARBAMILADAS ........................................................ 28 6.4. ANTICUERPOS ANTI-PÉPTIDOS ACETILADOS ................................................................ 28 6.5. ANTICUERPOS FRENTE A ADUCTOS DE MALONDIALDEHÍDO-ACETALDEHÍDO .............. 30 6.6. ANTICUERPOS FRENTE A ADUCTOS DE MALONDIALDEHÍDO ........................................ 32 6.7. ANTICUERPOS FRENTE A PROTEÍNAS CARBONILADAS ................................................. 32 6.8. ANTICUERPOS ANTI-PROTEÍNAS NITRADAS ................................................................. 33 6.9. ANTICUERPOS ANTI-PROTEÍNAS HOMOCISTEINILADAS ................................................ 34 OBJETIVOS...................................................................................................................... 37 MATERIAL Y MÉTODOS ....................................................................................... 41 1. MUESTRAS DE PACIENTES Y CONTROLES ........................................................ 43 1.1. PACIENTES CON ARTRITIS DE RECIENTE COMIENZO ................................................. 43 1.2. PACIENTES CON ARTRITIS REUMATOIDE TEMPRANA ESTUDIADOS TRANSVERSALMENTE ......................................................................................................... 43 1.3. PACIENTES CON ARTRITIS REUMATOIDE ESTABLECIDA ............................................ 43 1.4. CONTROLES ............................................................................................................. 44 2. CONSIDERACIONES ÉTICAS ................................................................................... 44 3. OBTENCIÓN DE PROTEÍNAS Y PÉPTIDOS MODIFICADOS POSTRADUCCIONALMENTE .......................................................................................... 45 3.1. SÍNTESIS DE PÉPTIDOS CITRULINADOS Y NATIVOS ................................................... 46 3.2. OBTENCIÓN DE PÉPTIDOS ACETILADOS .................................................................... 46 3.3. GENERACIÓN DE ADUCTOS OXIDADOS CON MALONDIALDEHÍDO ............................. 47 3.4. GENERACIÓN DE ESPECIES CARBONILADAS DE COLÁGENO TIPO II .......................... 48 3.5. GENERACIÓN DE PROTEÍNAS NITRADAS ................................................................... 49 3.6. SÍNTESIS DE PÉPTIDOS NITRADOS Y NATIVOS ........................................................... 49 3.7. GENERACIÓN DE PROTEÍNAS HOMOCISTEINILADAS ................................................. 51 4. VERIFICACIÓN DE LA MODIFICACIÓN DE PROTEÍNAS Y PÉPTIDOS ........... 51 4.1. VERIFICACIÓN DE LOS PÉPTIDOS SINTETIZADOS ...................................................... 53 4.2. VERIFICACIÓN DE LA ADUCCIÓN CON MALONDIALDEHÍDO Y ACETALDEHÍDO ......... 53 4.3. COMPROBACIÓN DE LA CARBONILACIÓN CON HOCL Y RIBOSA ................................ 55 4.4. VERIFICACIÓN DE LA NITRACIÓN CON PEROXINITRITO DE SODIO ............................. 56 4.5. EVALUACIÓN DE LA HOMOCISTEINILACIÓN CON HIDROCLORURO DE L-HOMOCISTEÍNA TIOLACTONA .......................................................................................... 57 5. DETERMINACIÓN DE AUTOANTICUERPOS CLÁSICOS DE LA AR: FACTOR REUMATOIDE Y ANTICUERPOS FRENTE A PÉPTIDOS CÍCLICOS CITRULINADOS ................................................................................................................. 58 6. DETERMINACIÓN DE ANTICUERPOS FRENTE A NUEVAS MODIFICACIONES POSTRADUCCIONALES ................................................................ 58 6.1. ANTICUERPOS FRENTE A PROTEÍNAS CARBAMILADAS ............................................. 61 6.2. ANTICUERPOS FRENTE A ANTÍGENOS CITRULINADOS ESPECÍFICOS .......................... 61 6.3. ANTICUERPOS FRENTE A PÉPTIDOS ACETILADOS ..................................................... 62 6.4. ANTICUERPOS FRENTE A ADUCTOS DE MALONDIALDEHÍDO-ACETALDEHÍDO ........... 62 6.5. ANTICUERPOS FRENTE A ADUCTOS DE MALONDIALDEHÍDO ..................................... 63 6.6. ANTICUERPOS FRENTE A ESPECIES CARBONILADAS DE COLÁGENO TIPO II .............. 63 6.7. ANTICUERPOS FRENTE A PROTEÍNAS NITRADAS ....................................................... 63 6.8. ANTICUERPOS FRENTE A PÉPTIDOS NITRADOS ......................................................... 64 6.9. ANTICUERPOS FRENTE A PROTEÍNAS HOMOCISTEINILADAS ..................................... 64 7. GENOTIPADO ............................................................................................................. 64 8. ANÁLISIS ESTADÍSTICO .......................................................................................... 65 8.1. ANÁLISIS DESCRIPTIVO ........................................................................................... 65 8.2. ANÁLISIS DE COMPONENTES PRINCIPALES ............................................................... 65 8.3. ANÁLISIS DE REGRESIÓN ......................................................................................... 66 8.4. ANÁLISIS DEL RENDIMIENTO DIAGNÓSTICO ............................................................. 67 8.5. ANÁLISIS DE LA MORTALIDAD DE LOS CONTROLES SANOS ...................................... 67 RESULTADOS ................................................................................................................ 71 CAPÍTULO 1. EVALUACIÓN DE LA PROPUESTA INMUNODOMINANCIA DE UN PÉPTIDO CITRULINADO DE LA HISTONA H4 EN LOS PACIENTES CON AR QUE TIENEN ANTICUERPOS ANTI-CCP ................................................................................ 73 1.1. ANTICUERPOS FRENTE A ESPECIFICIDADES FINAS CITRULINADAS EN PACIENTES CON AR Y CONTROLES ............................................................................................................... 75 1.2. RELACIÓN ENTRE LOS AUTOANTICUERPOS ANTI-CH4/39-40 Y OTROS ANTICUERPOS FRENTE A ESPECIFICIDADES FINAS CITRULINADAS .............................................................. 76 1.3. RELACIÓN DE LOS ANTICUERPOS FRENTE A PÉPTIDOS CITRULINADOS CON CARACTERÍSTICAS DE LA AR .............................................................................................. 80 CAPÍTULO 2. POTENCIAL PARA UNA MEJOR CLASIFICACIÓN DE LOS PACIENTES CON EA CON LOS ANTICUERPOS ANTI-PÉPTIDOS ACETILADOS .. 85 2.1. PREVALENCIA DE LOS ANTICUERPOS ANTI-PÉPTIDOS ACETILADOS EN LOS PACIENTES CON EA .............................................................................................................................. 87 2.2. RELACIÓN ENTRE LOS AUTOANTICUERPOS .............................................................. 92 2.3. PARÁMETROS DIAGNÓSTICOS DE LOS AAPA .......................................................... 93 2.4. MEJORA DE LA CLASIFICACIÓN SEROLÓGICA BASADA EN LA CONCORDANCIA DE ANTICUERPOS ..................................................................................................................... 96 2.5. MEJORA DE LA CLASIFICACIÓN DE LA AR CON LOS ANTICUERPOS ANTI-ACORN .... 97 CAPÍTULO 3. PRESENCIA DE ANTICUERPOS FRENTE A ADUCTOS OXIDADOS CON MALONDIALDEHÍDO EN EL SUERO DE PACIENTES CON AR ESTABLECIDA ................................................................................................................. 101 3.1. VERIFICACIÓN DE LA FORMACIÓN DE ADUCTOS DE MAA ..................................... 103 3.2. ANTICUERPOS ANTI-MAA EN PACIENTES CON AR Y CONTROLES ......................... 105 3.3. ANTICUERPOS ANTI-MAA DERIVADOS DE DOS PREPARACIONES DIFERENTES ....... 109 3.4. ANTICUERPOS ANTI-MDA EN PACIENTES CON AR Y CONTROLES ......................... 110 3.5. RELACIÓN ENTRE LOS ANTICUERPOS ANTI-MAA Y ANTI-MDA ............................ 113 3.6. RELACIÓN DE LOS ANTICUERPOS ANTI-MAA Y ANTI-MDA CON LAS CARACTERÍSTICAS CLÍNICAS Y SEROLÓGICAS ................................................................... 116 CAPÍTULO 4. PRESENCIA DE ANTICUERPOS FRENTE A PROTEÍNAS CARBONILADAS, NITRADAS Y HOMOCISTEINILADAS EN PACIENTES CON AR TEMPRANA Y ESTABLECIDA .......................................................................................... 119 4.1. VERIFICACIÓN DE LA CARBONILACIÓN DE CII Y BSA ........................................... 121 4.2. VERIFICACIÓN DE LA NITRACIÓN ........................................................................... 123 4.3. VERIFICACIÓN DE LA HOMOCISTEINILACIÓN ......................................................... 125 4.4. PREVALENCIA DE LOS ANTICUERPOS ANTI-CII CARBONILADO EN PACIENTES CON AR TEMPRANA ................................................................................................................. 125 4.5. PREVALENCIA DE LOS ANTICUERPOS ANTI-PROTEÍNAS/PÉPTIDOS NITRADOS EN PACIENTES CON AR ESTABLECIDA.................................................................................... 128 4.6. PREVALENCIA DE LOS ANTICUERPOS ANTI-PROTEÍNAS HOMOCISTEINILADAS EN PACIENTES CON AR ESTABLECIDA.................................................................................... 130 4.7. RELACIÓN DE LOS ANTICUERPOS ANTI-CII CARBONILADO CON EL TRATAMIENTO .................................................................................................................. 132 DISCUSIÓN .................................................................................................................... 135 1. LOS ANTICUERPOS ANTI-cH4/39-40 MUESTRAN ELEVADA CONCORDANCIA CON EL ENSAYO DE ANTI-CCP2 PERO NO SUFICIENTE COMO PARA EXPLICARLO O REEMPLAZARLO .................................................................................. 139 2. VALOR DE LOS ANTICUERPOS ANTI-AcOrn PARA MEJORAR LA CLASIFICACIÓN DE LOS PACIENTES CON EA ............................................................ 145 3. POTENCIAL DE LOS ANTICUERPOS FRENTE A ADUCTOS PROTEICOS DERIVADOS DE LA OXIDACIÓN CON MALONDIALDEHÍDO EN EL ESTUDIO DE LOS PACIENTES CON AR .................................................................................................. 149 4. RELEVANCIA DE LOS ANTICUERPOS FRENTE A ANTÍGENOS CARBONILADOS, NITRADOS Y HOMOCISTEINILADOS EN PACIENTES CON AR ............................... 155 CONCLUSIONES ........................................................................................................ 167 BIBLIOGRAFÍA ........................................................................................................... 171 ANEXOS ........................................................................................................................... 199 ABREVIATURAS 1 ABREVIATURAS 1H-RMN resonancia magnética nuclear de protón 3-NT 3-nitrotirosina 3-NT-pep péptidos nitrados 3-NT-PS proteínas sinoviales nitradas AAPA anticuerpos anti-proteínas/péptidos acetilados Ab anticuerpo Abs.máx absorbancia máxima de medición ACP análisis de componentes principales ACPA anticuerpos anti-proteínas citrulinadas ACR colegio americano de reumatología AGEs productos de glicación avanzados AIC Criterio de Información de Akaike AI artritis indiferenciada AMPA anticuerpos frente a proteínas modificadas postraduccionalmente anti-AcLys anticuerpos frente a un péptido derivado de la vimentina mutada citrulinada con lisina acetilada anti-AcOrn anticuerpos frente a un péptido derivado de la vimentina mutada citrulinada con ornitina acetilada anti-Carbo anticuerpos anti-proteínas carboniladas anti-CarP anticuerpos anti-proteínas carbamiladas anti-CCP anticuerpos anti-péptidos cíclicos citrulinados anti-cH4/39-40 anticuerpos frente a un péptido de la histona H4 citrulinado en las posiciones 39 y 40 anti-Hci anticuerpos anti-proteínas homocisteiniladas anti-MAA anticuerpos frente a aductos de malondialdehído-acetaldehído anti-MDA anticuerpos frente a aductos de malondialdehído anti-Nitra anticuerpos anti-proteínas/péptidos nitrados AP fosfatasa alcalina AR artritis reumatoide AUC área bajo la curva AUC área bajo la curva BCR receptor de linfocitos B BSA albúmina sérica bovina Lorena Rodríguez Martínez 2 CaFBS suero bovino fetal carbamilado Ccd. concordancia CCP péptidos cíclicos citrulinados CDAI índice clínico de actividad de la enfermedad CEIC comité ético de investigación clínica CII colágeno tipo II CTR control DAS28 índice de actividad de la enfermedad DNPH dinitrofenilhidrazina DS desviación estándar EA artritis de reciente comienzo EC epítopo compartido EIRA epidemiological investigation of rheumatoid arthritis ELISA ensayo por inmunoabsorción ligado a enzima EULAR liga europea contra el reumatismo FAME fármacos modificadores de la enfermedad FBS suero bovino fetal Fc fragmento cristalizable FcγR receptor Fc gamma Fr relación de frentes FR factor reumatoide GLI-CII colágeno tipo II bovino glicado HAQ cuestionario de evaluación de salud Hci-PS proteínas sinoviales homocisteiniladas hexil-MAA 1-hexil-4-metil-1,4-dihidro-3,5-piridindicarboxaldeído HLA antígeno leucocitario humano HLA-DRB1 cadena beta 1 de la molécula HLA-DR HOCl ácido hipocloroso HOCl-CII colágeno tipo II bovino carbonilado con ácido hipocloroso HPLC cromatografía líquida de alta resolución HRP peroxidasa de rábano HSA albúmina sérica humana IC inmunocomplejo ABREVIATURAS 3 IC 95% intervalo de confianza del 95% IgA inmunoglobulina del isotipo A IgG inmunoglobulina del isotipo G IgM inmunoglobulina del isotipo M IL-17F interleuquina 17F IL-6 interleuquina 6 IQR rango intercuartílico L-Hci-tiolactona hidrocloruro de L-homocisteína tiolactona LPO peroxidación lipídica m/z relación masa/carga MAA-HSA aductos de malondialdehído-acetaldehído de albúmina humana MCV vimentina mutada citrulinada MDA-BSA aductos de malondialdehído de albúmina bovina MDS escalado multidimensional MPO mieloperoxidasa NaOCl hipoclorito de sodio NaONO2 Peroxinitrito de sodio NET trampas extracelulares de neutrófilos OClanión hipoclorito OD densidad óptica OEA otras artritis de reciente comienzo OR odds ratio PAD peptidil arginina deiminasa PCR proteína C reactiva PCR reacción en cadena de la polimerasa PEARL registro de artritis temprana del Hospital Universitario La Princesa pNPP p-nitrofenilfosfato PS proteínas sinoviales PTM modificación postraduccional PTP productos de tipo pentosidina PTPN22 gen de la proteína tirosina fosfatasa 22 ROC curva operativa del receptor RV- razón de verosimilitud negativa Lorena Rodríguez Martínez 4 RV+ razón de verosimilitud positiva SDAI índice simplificado de actividad de la enfermedad SDS-PAGE electroforesis en gel de poliacrilamida y dodecilsulfato de sodio SEM error estándar de la media SNP polimorfismo de nucleótido único TCR receptor de linfocitos T TMB 3,3',5,5'-Tetrametilbencidina TNF-α factor de necrosis tumoral α TMS Tetrametilsilano UA unidades arbitrarias VAMC Veterans Affairs Medical Centers VARA Veterans Affairs Rheumatoid Arthritis VPN valor predictivo negativo VPP valor predictivo positivo VSG velocidad de sedimentación globular ε coeficiente de extinción molar λ máx.em. longitud de onda de máxima emisión λexc longitud de onda de excitación INTRODUCCIÓN 11 define un subgrupo de pacientes denominados seropositivos que presentan un fenotipo más grave de AR en comparación con los pacientes seronegativos que carecen de ambos anticuerpos. Los ACPA y el FR son los dos tipos de anticuerpos más estudiados en relación con la AR y existe una extensa bibliografía con evidencias convincentes de su relevancia en la enfermedad y de su utilidad como biomarcadores, cuestiones que se comentarán más adelante. Además de los ACPA, se han descrito otros sistemas de anticuerpos dirigidos frente a PTM. Algunos han sido muy bien estudiados como los anticuerpos anti-proteínas carbamiladas (anti-CarP) 43. Otros ya se han confirmado de una forma suficiente pero todavía no se ha definido su lugar en la enfermedad como los anticuerpos anti-péptidos/proteínas acetiladas (AAPA) 44, los anticuerpos frente a aductos de malondialdehído-acetaldehído (anti-MAA) 32, y los anticuerpos frente a aductos de malondialdehído (anti-MDA) 33, mientras que hay un último grupo que se han descrito en algún estudio pero todavía no están suficientemente confirmados como los anticuerpos anti-proteínas carboniladas (anti-Carbo) 37, los anticuerpos anti-proteínas nitradas (anti-Nitra) 35 y los anticuerpos anti-proteínas homocisteiniladas (anti- Hci) 38. Si todo este repertorio tan amplio de autoanticuerpos se confirma, será un reflejo de la complejidad de la respuesta inmune en la AR. Sin embargo, por el momento se desconocen muchos aspectos, incluyendo la necesidad de confirmar su presencia y la especificidad de su asociación con la AR, y la posible relación con severidad u otras características de la enfermedad. Tampoco conocemos cuáles son los factores etiológicos que predisponen al desarrollo de estos autoanticuerpos atípicos a diferencia de lo que ocurre con los ACPA, para los que se conocen los factores genéticos y ambientales que predisponen a su desarrollo y que se detallarán en el siguiente apartado. 2. ETIOLOGÍA DE LA ARTRITIS REUMATOIDE En la etiología de la AR participan tanto factores genéticos como ambientales, aunque los mecanismos que desencadenan la enfermedad se desconocen por el momento. Es posible que los mecanismos involucrados en la aparición de la AR seropositiva y seronegativa sean diferentes ya que los factores de riesgo genéticos y ambientales que predisponen al desarrollo de la AR seropositiva difieren de los factores que predisponen hacia la forma seronegativa de la enfermedad 45–48. A continuación se describen los factores de riesgo genéticos y ambientales más importantes que se conocen de la AR. 2.1. FACTORES GENÉTICOS 2.1.1. HLA La susceptibilidad al desarrollo de la AR está fuertemente influenciada por factores genéticos siendo el más importante el sistema del antígeno leucocitario humano (HLA, human leukocyte antigen) o complejo mayor de histocompatibilidad de clase II (MHC II, major histocompatibility complex). La asociación más fuerte con la AR se ha observado para las posiciones de aminoácidos 11, 13, 71 y 74 de la cadena β de la molécula HLA-DR (HLA- DRβ1) 49. El aminoácido que se encuentra en estas posiciones determina si la asociación es de riesgo o de protección frente a la AR y difiere entre la forma seropositiva y seronegativa 49,50. Dos de esas posiciones, la 71 y la 74, se encuentran dentro del epítopo compartido (EC) que hace referencia a una agrupación de secuencias consenso de aminoácidos en las posiciones Lorena Rodríguez Martínez 12 70-74 de la molécula HLA-DRβ1, concretamente QRRAA, RRRAA y QKRAA 51. Estas secuencias están codificadas por alelos pertenecientes principalmente a los grupos *01 y *04, aunque también están incluidos algunos alelos de los grupos *10 y *14 51. En total son 22 los alelos identificados que codifican para las secuencias del EC (Tabla 1). La identificación de los aminoácidos en las posiciones 11, 13, 71 y 74 más asociados con la susceptibilidad a la AR concuerda casi completamente con los alelos que codifican el EC, luego solo supone un refinamiento en la forma de describirla. Estos alelos predisponen específicamente para el desarrollo de la forma ACPA positiva 52–54. Tabla 1. Alelos HLA-DRB1 que codifican las secuencias de aminoácidos más comunes en las posiciones 70-74 de la molécula HLA-DRβ1. Posición de aminoácidos Alelos HLA-DRB1 70 71 72 73 74 EC Q K R A A *0401;*0409;*0413;*0416; *0421;*1419;*1421 Q R R A A *0101;*0102;*0105;*0404;*0405;*0408;*0410; *0419; *1402;*1406;*1409;*1413;*1417;*1420 R R R A A *1001 No EC D E R A A *0402;*0414;*0103;*1102;*1116;*1120;*1121;*1301; *1302;*1304;*1308;*1315;*1317; *1319;*1322;*1416 Q R R A E *0403;*0406;*0407;*0417;*0420 R R R A E *09;*1401;*1404;*1405;*1407;*1408;*1410; *1411;*1414;*1418 D R R A A *0415;*0805;*11011;*11012;*11041;*11042; *1105;*1106; *11081;*11082*1109;*1110;*1112; *1115;*1118;*1119; *1122;*1201;*12021;*12022; *12031;*12032;*1305; *1306; *1307;*1311;*1312; *1314;*1321;*1601;*1602;*1605 Q A R A A *15;*1309 Q K R G R *03; *0422;*1107 La susceptibilidad hacia la AR no se restringe a los alelos del HLA-DRB1, sino que se han identificado alelos en otras moléculas del HLA de clase II y de clase I: del HLA-A, HLA-B y HLA-DP que están asociados con la AR, aunque el efecto de estas asociaciones con la AR ACPA positiva no es tan marcado 49,50. En el caso de la AR ACPA negativa, el factor genético predominante es el HLA-B seguido del HLA-DP 50,55. INTRODUCCIÓN 13 En relación con el resto de anticuerpos frente a PTM, sólo se ha definido una asociación específica para los anticuerpos anti-CarP con el HLA-B, ya que la asociación con el HLA-DR no se puede diferenciar de la observada con los ACPA 56. Los factores de riesgo genéticos que predisponen a la producción de otros anticuerpos frente a PTM relacionados con la AR todavía no se han identificado. El HLA-DRB1 es el principal factor genético que predispone a la AR pero por sí solo no explica todo el componente genético que contribuye al desarrollo de la enfermedad 57. Esta observación ha motivado el estudio de factores genéticos de susceptibilidad adicionales fuera de la región MHC llegando a identificarse más de 100 genes asociados con la AR, aunque con un efecto menor que el de la molécula HLA 58. 2.1.2. PTPN22 Entre los factores de riesgo genéticos localizados fuera de la región del MHC que confieren susceptibilidad al desarrollo de la AR destaca el gen PTPN22, identificado como el segundo más importante después del HLA-DRB1. Concretamente, el polimorfismo de nucleótido único (SNP, Single Nucleotide Polymorphism) rs2476601 de este gen que codifica para la variante R620W de la proteína fosfatasa de tirosina no receptora de tipo 22 (PTPN22) es el más fuertemente asociado con la AR 59, en especial con el fenotipo ACPA positivo y con un efecto menos marcado con el fenotipo ACPA negativo 46,60,61. La variante R620W presenta una actividad fosfatasa alterada respecto de la proteína nativa, pero mantiene la funcionalidad. Aunque el papel de esta variante en la susceptibilidad de la AR no está completamente definido, las evidencias obtenidas hasta el momento sugieren que podría ejercer su efecto a través de varios mecanismos complementarios 62. Por un lado, la variante R620W aumentaría la producción de ROS 63 y la NETosis 64, un proceso de muerte celular de los neutrófilos en el que se liberan al medio extracelular enzimas con capacidad para generar PTM 65,66. Por otro lado, esta variante R620W promovería la expansión del repertorio de células T y B autorreactivas en la periferia al permitir que sobrevivan a los mecanismos de control de la tolerancia 67–69. Por el momento, los anticuerpos anti-CarP han sido los únicos aparte de los ACPA estudiados en relación con el polimorfismo PTPN22, pero no se ha detectado una asociación significativa 70,71. 2.2. FACTORES AMBIENTALES 2.2.1. Tabaco A la etiología de la AR contribuye un componente ambiental además de un componente genético. El factor ambiental mejor estudiado y más reconocido es el tabaco. Principalmente se asocia con la forma seropositiva de la AR 72,73. Se ha descrito además una fuerte interacción entre el tabaco y los alelos del EC que potenciaría el riesgo de desarrollar AR ACPA positiva en los pacientes fumadores que también presentan estos alelos 74,75. Lorena Rodríguez Martínez 14 La relación del tabaco con la AR seropositiva se ha atribuido específicamente a la presencia de ACPA. Sin embargo, varios trabajos recientes han aportado evidencias convincentes que cuestionan la especificidad de la asociación del tabaco y los ACPA. Los resultados de estos trabajos indican que el tabaco se asocia con la presencia concordante de varios autoanticuerpos, específicamente FR, ACPA y anti-CarP 47,48,76 y que cuando se considera únicamente la positividad para un tipo de anticuerpo el tabaco se asocia con la presencia de FR pero no de ACPA 48,76. En otras palabras, el tabaco predispone principalmente al desarrollo de la AR caracterizada por la presencia de múltiples autoanticuerpos más que a la AR ACPA positiva. Estos hallazgos se suman al conjunto de evidencias previas 77–82 que ponen en duda el modelo patogénico que relaciona el tabaco con los alelos de riesgo del EC y la producción de ACPA. Este modelo propone que la exposición al humo del tabaco provoca la citrulinación de proteínas que son presentadas en el contexto del EC con la consiguiente ruptura de la tolerancia y producción de ACPA a nivel pulmonar 83. La citrulinación de proteínas no es la única PTM que puede verse potenciada por el tabaco. La carbamilación de proteínas también está favorecida por el tabaquismo al aumentar la disponibilidad del precursor tiocianato necesario para la reacción 84. De forma análoga, la carbonilación, la nitración o la aducción de proteínas también pueden verse potenciadas por el efecto del humo del tabaco, ya sea por su alto contenido de compuestos reactivos o por su capacidad para inducir la producción de especies reactivas como HOCl, ONO2-, acetaldehído y malondialdehído 84–88. A pesar de que el tabaco es capaz de potenciar diversas PTM, su relación con la presencia de los anticuerpos que reconocen estas PTM ha sido poco estudiada y cuando lo ha sido no parece estar asociado. Así, los anticuerpos anti-CarP no están asociados con el tabaquismo 70,71. En el caso de los anticuerpos anti-MAA, se ha observado una asociación entre el isotipo IgM y el tabaquismo pero únicamente en los pacientes que fuman en el momento del estudio 32. Sin embargo, esta asociación no se replicó en un trabajo posterior realizado por los mismos autores, siendo el isotipo IgA el asociado con el tabaquismo 39. Por su parte, los anticuerpos anti-Hci no se asociaron con el hábito tabáquico 38, mientras que la relación con la presencia de anticuerpos anti-MDA, anti-Carbo y anti-Nitra no ha sido estudiada por el momento. 2.2.2. Mucosas Las mucosas han emergido como un nuevo factor etiológico de la AR 89. La principal evidencia que sugiere que la autoinmunidad en la AR se origina en una localización diferente de las articulaciones es la presencia de ACPA, FR y anticuerpos anti-CarP en el suero de algunos pacientes años antes de que manifiesten síntomas articulares 90,91. Otras evidencias que apoyan la idea anterior son la identificación del isotipo IgA de ACPA y de FR, el principal isotipo producido en las mucosas 92, en la etapa preclínica de la enfermedad y su asociación con el desarrollo de la AR 90,93,94. Los estudios se han centrado en las mucosas oral e intestinal en relación con la microbiota, así como en la mucosa de las vías aéreas en relación con el humo del tabaco, el factor ambiental más importante de la enfermedad. Para testar la hipótesis del pulmón como desencadenante de la autoinmunidad en la AR se han realizado estudios en pacientes en riesgo de desarrollar AR o con AR reciente pero sin síntomas de artritis. Los resultados de estos estudios han aportado evidencias que apoyan la hipótesis anterior. Una de ellas es la identificación de anomalías en la estructura pulmonar en INTRODUCCIÓN 15 pacientes ACPA y/o FR positivos pero sin artritis similares a las que presentan pacientes con artritis 79. Otra evidencia a favor es la presencia de niveles detectables de ACPA y FR en el esputo inducido, pero no en el suero y el aumento de los niveles de ACPA en el esputo inducido en comparación con el suero tras normalizar por la cantidad de Ig total 82. Además, se ha descrito un aumento de los niveles de ACPA en muestras pulmonares respecto de los niveles séricos en pacientes con AR de reciente comienzo 80. Estos resultados sugieren que la producción de ACPA se inicia en el pulmón en la fase preclínica de la AR y que persiste durante la evolución de la enfermedad. Como ya se ha comentado, la exposición al tabaco puede potenciar la generación de diversas PTM sobre las proteínas pulmonares más allá de la citrulinación 95. La presencia de aductos de MAA en muestras pulmonares de pacientes con AR concuerda con una posible producción de anticuerpos anti-MAA a nivel pulmonar 96. A pesar de las evidencias a favor del pulmón como origen de la producción de ACPA en la AR, también existen evidencias en contra. No todos los pacientes que desarrollan AR ACPA positiva presentan alteraciones en los pulmones o niveles detectables de ACPA o FR en fluidos de muestras pulmonares ni tienen un historial de exposición al tabaco 79,80,82. Estos resultados cuestionan el modelo patogénico del pulmón como origen de la autoinmunidad en la AR y sugieren que la ruptura de la tolerancia podría producirse en otras localizaciones. La mucosa oral también se ha estudiado en relación con la etiología de la AR. Al igual que se ha comentado para el pulmón, las encías están en contacto directo con el humo del tabaco que provoca la inflamación del tejido. Sin embargo, el énfasis se ha situado en la relación entre periodontitis y AR ya que hay evidencias epidemiológicas de la asociación entre las dos enfermedades que, además, comparten factores de riesgo 97–100. También se ha observado una asociación entre la presencia de periodontitis y ACPA 101–103. Esta asociación se ha hipotetizado que estaría relacionada con que dos de las bacterias implicadas en la patogénesis de la periodontitis, concretamente Porphyromonas gingivalis (P.gingivalis) y Aggregatibacter actinomycetemcomitans (A. actinomycetemcomitans), son capaces de promover la citrulinación de proteínas en las encías 104,105. Esta generación de autoantígenos citrulinados podría desencadenar la producción de ACPA en la mucosa oral dando lugar al inicio de la autoinmunidad en la AR 106. La citrulinación no es la única PTM que se encuentra aumentada en los pacientes con periodontitis, sino que también se ha detectado un aumento de proteínas carbamiladas y modificadas con MAA en comparación con las encías de sujetos sanos 107,108. La presencia de estas tres PTM en las encías de los pacientes con periodontitis concuerda con el aumento de la NETosis detectado en el mismo tejido 65,109, proceso que es capaz de promover la generación de diferentes PTM como ya se ha comentado. Aunque estas evidencias sugieren que la autoinmunidad en la AR podría originarse en las encías como consecuencia de la periodontitis, los resultados de los trabajos que han evaluado la relación entre estas dos enfermedades son inconsistentes con datos tanto a favor como en contra 110 y no permiten sacar ninguna conclusión. La mucosa intestinal también se ha propuesto como origen de la autoinmunidad en la AR. Esta hipótesis surge de la alteración del equilibrio de la flora intestinal (disbiosis) detectado en los pacientes con AR en comparación con sujetos control 111–113. La causa de este desequilibrio se ha atribuido tanto a un aumento de la población de bacterias potencialmente patogénicas114 como a una disminución de la población de bacterias beneficiosas 115, aunque las bacterias implicadas en la disbiosis difieren entre estudios. Por el momento, las evidencias Lorena Rodríguez Martínez 16 que implican a la mucosa intestinal en la etiología de la AR son indirectas o poco concluyentes 89, por lo que son necesarios más estudios que clarifiquen el papel del microbioma intestinal en el desarrollo de la autoinmunidad en la AR. Además, ninguno de los estudios ha relacionado la disbiosis intestinal con la producción de autoanticuerpos. La implicación de las mucosas en la etiología de la AR todavía no se ha definido con claridad. Entre las muchas posibilidades se incluyen el efecto de las mucosas en la diferenciación de las subpoblaciones de linfocitos T, la posibilidad de mimetismo molecular entre las bacterias y autoantígenos y otras relacionadas con metabolitos bacterianos y el sistema inmune innato 116,117. Pero también es posible que los factores ambientales como el tabaco o la presencia de bacterias patogénicas provoquen la inflamación del tejido pulmonar, oral e intestinal y que como resultado se generen PTM que son reconocidas por el sistema inmune de sujetos susceptibles iniciando la fase autoinmune de la AR. Sin embargo, todavía son muchas las incógnitas que quedan por aclarar como cuál es la localización en la que se desencadena la producción de autoanticuerpos en la AR y cuáles son los mecanismos responsables de dirigir la respuesta inmune a las articulaciones. 3. PAPEL PATOGÉNICO DE LOS AUTOANTICUERPOS EN LA AR La presencia de autoanticuerpos no es suficiente para demostrar que tienen una participación importante en la patogenia de la AR. Además, los autoanticuerpos no son necesarios en todos los pacientes, pues hay una fracción de pacientes que no tienen anticuerpos y que, individualmente, son indistinguibles desde el punto de vista clínico de los que los tienen. Sin embargo, hay evidencias que indican que los autoanticuerpos podrían estar implicados. Su presencia en las fases iniciales de la AR en las que todavía no existe inflamación articular se interpreta a favor de su papel patogénico. Además, las asociaciones descritas para el FR y los ACPA con el daño radiológico y el descubrimiento de los mecanismos subyacentes refuerzan la idea de que los autoanticuerpos intervienen activamente en la patogenia de la AR. En las siguientes secciones se describen con más detalle estos hallazgos. 3.1. AUTOINMUNIDAD HUMORAL EN LA ETAPA ASINTOMÁTICA DE LA AR La AR es una enfermedad con una evolución altamente heterogénea que puede progresar de forma lenta desde una etapa preclínica asintomática hacia una sintomática sin presencia de artritis clínicamente detectable y finalmente a una etapa clínica en la que ya se ha desarrollado artritis. Cada una de estas fases del desarrollo de la AR se definen empleando la terminología establecida por la Liga Europea Contra el Reumatismo (EULAR) para obtener grupos homogéneos de pacientes y así facilitar la reproducibilidad y la comparación de los resultados entre estudios 118. En total se han definido 5 fases: factores de riesgo genéticos y ambientales, autoinmunidad sistémica asociada con la AR, síntomas en ausencia de artritis clínica, artritis no clasificable y finalmente AR (Figura 2). El primer término hace referencia a la fase en la que los sujetos presentan una susceptibilidad a desarrollar AR debido a la presencia de factores de riesgo genéticos y ambientales. Posteriormente, aparece la autoinmunidad INTRODUCCIÓN 17 sistémica asociada con la AR en la que los individuos presentan autoanticuerpos pero sin signos ni síntomas articulares 119. En la siguiente fase aparecen los primeros síntomas que pueden consistir únicamente en artralgia, pero no se observa inflamación articular clínicamente detectable 120. A pesar de que no hay evidencia de artritis, en esta etapa puede producirse la infiltración de células inmunes inflamatorias en la sinovia 121. A continuación, aparecen las primeras manifestaciones clínicas de artritis en los pacientes. Durante el primer año de evolución desde la aparición de artritis se habla de pacientes con artritis de reciente comienzo (EA) 122–125, aunque en algunos estudios el tiempo de evolución de los pacientes considerados como EA se amplía hasta los 2 años 126,127. Si los pacientes cumplen los criterios de clasificación de la AR 128 se les denomina como AR temprana para distinguirlos de los que ya tienen una AR establecida. La AR temprana identifica pacientes con un tiempo de evolución menor de 6 meses según la definición propuesta por el Colegio Americano de Reumatología (ACR) 129, aunque algunos trabajos incluyen pacientes definidos como AR temprana que presentan tiempos de evolución de hasta 2 años 37,130. Figura 2. Fases del desarrollo de la AR. La imagen representa las 5 fases de la evolución hacia AR nombradas según la terminología recomendada por el EULAR junto con los factores de riesgo de desarrollar AR asociados y los sujetos que se encuentran en cada fase. El riesgo de AR en la primera fase lo confieren factores genéticos y ambientales como el HLA, PTPN22, el tabaco o la disbiosis en las mucosas. En la segunda fase, la presencia de los autoanticuerpos FR y ACPA refleja el inicio de la autoinmunidad sistémica. Los individuos que se encuentran en estas fases son asintomáticos. La tercera fase se define por la presencia de síntomas en ausencia de artritis clínica: artralgia con dolor articular. La cuarta fase empieza con el inicio de la artritis. Mientras no es posible la clasificación de los pacientes se habla de pacientes con EA. La quinta fase se corresponde con pacientes que ya cumplen los criterios clasificación como AR. Imagen de autoría propia creada con BioRender.com. Los pacientes con EA forman un grupo heterogéneo y solo una fracción están en una de las fases de la AR. Por ello, estos pacientes presentan una evolución muy variable. En el caso más favorable la inflamación puede resolverse de forma espontánea. Otra posibilidad es que la inflamación persista pero sin que los pacientes cumplan los criterios de clasificación establecidos para una forma específica de artritis, en cuyo caso se dice que presentan una artritis indiferenciada (AI). Finalmente, los pacientes pueden evolucionar hacia una enfermedad más definida como la AR 131,132 para la que se han desarrollado criterios de Lorena Rodríguez Martínez 18 clasificación específicos. Identificar qué pacientes con EA desarrollarán en el futuro AR es complicado. Por un lado los síntomas clínicos que presentan los pacientes con EA no son específicos de la AR, sino que se comparten con otras enfermedades inflamatorias 1. Por otro lado, la falta de pruebas diagnósticas supone una dificultad añadida 133. También hay que tener en cuenta que no todos los individuos que finalmente desarrollan AR siguen el esquema de fases definido por el EULAR (Figura 2) 118. Este escenario tan complejo hace necesaria la identificación de biomarcadores en las fases iniciales de la AR que permitan predecir qué pacientes van a desarrollar AR con el tiempo. Los anticuerpos, en concreto el FR, los ACPA y los anti-CarP, son excelentes candidatos para su uso como biomarcadores dado que los tres se encuentran presentes en las fases iniciales de la AR. Se han encontrado tanto en sujetos asintomáticos hasta una década antes la aparición de los primeros síntomas clínicos 90,94,119,134–137, como en pacientes con artralgia 90,136–139 y en pacientes con EA 140–142. Otra característica que comparten el FR, los ACPA y los anticuerpos anti-CarP y que justifica su uso como biomarcadores es el aumento que experimentan sus niveles a medida que se progresa hacia la AR, un aumento que se ve intensificado dos años antes del inicio de la artritis 90,94,119,136. Durante la evolución hacia la AR se produce además la propagación de epítopos de los ACPA, es decir, se expande el patrón de proteínas citrulinadas que pueden reconocer estos anticuerpos, mostrando una expansión más marcada de forma paralela al incremento de los títulos 91,143–145. Por lo tanto, estos anticuerpos se consideran factores de riesgo asociados a la AR de forma que los sujetos que presentan estos anticuerpos tienen un riesgo mayor de desarrollar AR en comparación con los individuos que carecen de ambos anticuerpos 118 (Figura 2). Otros anticuerpos además del FR, los ACPA y los anti-CarP están presentes en las etapas previas al desarrollo de la AR, como los AAPA que se detectan en pacientes con EA 44 o los anticuerpos anti-MAA presentes en sujetos asintomáticos que posteriormente desarrollan AR 146. La presencia de estos anticuerpos frente a PTM en las fases iniciales de la AR indica que podrían ser de utilidad para identificar pacientes que van a evolucionar hacia AR. Sin embargo, todavía es necesario confirmar la relación de los nuevos anticuerpos con la AR con estudios independientes. 3.2. PROGRESIÓN RADIOLÓGICA Los pacientes con AR desarrollan daño articular y óseo de forma progresiva con consecuencias cada vez más graves a medida que avanza la enfermedad y de forma más marcada si no se administra tratamiento. El daño articular conlleva la aparición de dolor, pérdida ósea, deformidades en las articulaciones y finalmente provoca un alto grado de incapacidad física que afecta negativamente a la calidad de vida de los pacientes 147. La pérdida ósea en la AR es localizada y generalizada. La pérdida local de hueso a nivel articular se denomina erosión ósea y se produce de forma preferente en los sitios de contacto directo del hueso con la sinovia inflamada. Por su parte, la pérdida de hueso generalizada resulta en una pérdida a nivel sistémico de densidad mineral ósea (DMO), lo que aumenta el riesgo de fracturas y de osteoporosis 148. En la sinovia inflamada se expresan diversos mediadores inflamatorios que alteran la homeostasis del metabolismo óseo favoreciendo por un lado la diferenciación y la activación local de los osteoclastos y por otro la inhibición de los osteoblastos, lo que resulta en un INTRODUCCIÓN 19 aumento de la resorción ósea 149–151. Además de la participación de moléculas inflamatorias, en la pérdida ósea también se han implicado a los autoanticuerpos. Aunque los procesos específicos que inician y perpetúan la destrucción ósea en la AR se desconocen por el momento149,152, se han propuesto dos posibles vías a través de las cuales los anticuerpos podrían ejercer su función patogénica. En una, los anticuerpos promueven la diferenciación de los precursores de osteoclastos a osteoclastos maduros al interaccionar con proteínas citrulinadas presentes en la superficie celular a través de la región de reconocimiento antigénico Fab, provocando un aumento de la resorción ósea tanto in vitro como in vivo 153– 155. En la otra, la diferenciación a osteoclastos se induce tras la interacción de los receptores FcγR expresados en la superficie de múltiples células incluyendo monocitos, que potencian la inflamación, y los precursores de osteoclastos con la región Fc de los anticuerpos que están formando inmunocomplejos (IC) 156. Las erosiones son el tipo de lesión más estudiada en relación con la AR. Su presencia se asocia con la positividad para el FR y con los ACPA, siendo esta asociación significativamente superior cuando se considera la presencia concordante de ambos anticuerpos respecto de la asociación que se obtiene de considerar cada anticuerpo individualmente 157. Este hallazgo se ha explicado con una hipótesis que implica el mecanismo de activación de la osteoclastogénesis a través de los receptores para el Fc de las inmunoglobulinas mencionado antes. Las señales de activación son más intensas y duraderas cuando se produce entrecruzamiento de múltiples receptores Fc en la superficie del osteoclasto o del monocito. A su vez, el entrecruzamiento se favorece por la presencia de agregados de IC. Los IC se formarían al unirse los ACPA con sus proteínas diana y se agregan al unirse con el FR, ya que cada molécula de FR que puede reconocer 5 moléculas de IgG. Hay experimentos in vitro que apoyan este mecanismo 158. El FR y los ACPA no solo muestran una asociación con la presencia de erosiones, sino que también muestran una asociación con la progresión hacia una artritis erosiva en estudios longitudinales, aunque aquí el efecto observado para los ACPA es mayor que para el FR 149,152. La fuerte asociación del FR y los ACPA con el daño óseo y la progresión radiológica es una de las razones de que se consideren biomarcadores de predicción de una peor evolución de la AR y de que se reconozcan así por el EULAR 159. La relación entre el daño radiológico y los nuevos anticuerpos frente a PTM descritos en la AR ha sido poco estudiada y pretende ampliarse como parte del trabajo de este proyecto. 4. BIOMARCADORES DE DIAGNÓSTICO Y CLASIFICACIÓN La identificación precoz de pacientes con un alto riesgo de desarrollar AR es de vital importancia para su manejo clínico. Sin embargo, clasificar a los pacientes en las etapas más tempranas de su evolución resulta complicado debido a la falta de manifestaciones clínicas discriminatorias y pruebas diagnósticas 1,133. Precisamente durante estas etapas iniciales en las que se desarrollan los primeros síntomas es donde el tratamiento de los pacientes que finalmente serán clasificados como AR aporta los mayores beneficios 160,161. La necesidad de identificar pacientes con AR en las fases iniciales para así iniciar el tratamiento lo antes posible y mejorar su pronóstico impulsó la creación de los nuevos criterios de clasificación de la AR en el año 2010 por la ACR y por el EULAR 128. Estos criterios prescinden de las Lorena Rodríguez Martínez 20 características típicas de una enfermedad más establecida, como la presencia de cambios radiográficos, incluidas en el criterio de la ACR de 1987 cuyo objetivo era diferenciar los pacientes con AR de otras enfermedades reumáticas 162. Los nuevos criterios ACR/EULAR 2010 ponen más énfasis en el diagnóstico precoz e incorporan características presentes en etapas tempranas de la enfermedad atribuyendo más peso a ciertas características sobre otras. Un ejemplo claro es la puntuación asignada a la serología tal y como se muestra en la Tabla 2, en la que se incluyen los autoanticuerpos FR y ACPA. La puntuación recibida difiere en función de los títulos de estos dos anticuerpos 163. Concretamente, los pacientes con títulos altos de cualquiera de los dos anticuerpos reciben 3 puntos mientras que los pacientes positivos pero con títulos bajos reciben 2 puntos. Para determinar si el título de un anticuerpo es alto o bajo se emplea como umbral el valor de 3 veces el límite superior normal. Los títulos altos están por encima de ese valor mientras que los títulos bajos se consideran aquellos que están por debajo de este umbral pero por encima del límite superior normal que define la positividad 164. La puntuación asignada a los anticuerpos representa una fracción importante de los 6 puntos totales que se requieren para la clasificación como AR. Tabla 2. Criterios de clasificación de la AR. A la izquierda se muestran los criterios de clasificación de 1987 y a la derecha los nuevos criterios del 2010. Los reactantes de fase aguda son la proteína C reactiva (PCR) o la velocidad de sedimentación globuar (VSG). Criterios de Clasificación de la AR ACR 1987 ACR/EULAR 2010 1. Rigidez matutina: duración ≥ 1 hora antes de observar mejoría 1. Afectación articular 1 articulación grande: 0 puntos 2-10 articulaciones grandes: 1 punto 2. Artritis en ≥ 3 articulaciones 1-3 articulaciones pequeñas: 2 puntos 4-10 articulaciones pequeñas: 3 puntos 3. Artritis en las articulaciones de la mano > 10 articulaciones pequeñas: 5 puntos 2. Serología 4. Artritis simétrica FR y ACPA negativos: 0 puntos FR y/o ACPA positivos bajos: 2 puntos Los criterios 1-4 deben presentarse durante ≥ 6 semanas. FR y/o ACPA positivos altos: 3 puntos 3. Reactantes de fase aguda 5. Presencia de nódulos reumatoides PCR o VSG normales: 0 puntos PCR o VSG elevadas: 1 punto 6. FR positivo 4. Duración de los síntomas 7. Cambios radiográficos < 6 semanas: 0 puntos ≥ 6 semanas: 1 punto AR si ≥ 4 criterios AR si ≥ 6 puntos INTRODUCCIÓN 27 6.1. FACTOR REUMATOIDE El FR es un autoanticuerpo asociado con la AR que no está dirigido frente a una PTM, sino que reconoce las IgG a través de la región Fc 41. El isotipo predominante detectado en el suero de los pacientes con AR es el IgM aunque también están presentes los isotipos IgA e IgG 206. El FR no es un anticuerpo detectado exclusivamente en el suero de pacientes con AR, sino que se encuentra además en pacientes con otras enfermedades autoinmunes o del tejido conectivo y en sujetos sanos, aunque con una prevalencia menor que en la AR, lo que se traduce en una sensibilidad en torno al 70-90% 207 y una especificidad del 85% 207. La elevada sensibilidad y especificidad por la AR lo convierten en un excelente biomarcador de diagnóstico mientras que su asociación con la progresión radiológica y con una peor evolución de la enfermedad ha llevado a su uso como biomarcador de pronóstico. 6.2. ANTICUERPOS ANTI-PROTEÍNAS CITRULINADAS La diana de los ACPA es la citrulina 42 (Figura 3) que surge de la modificación postraduccional de la arginina en la secuencia peptídica mediante un proceso denominado citrulinación y que está catalizado por las PAD 208. Los ACPA pueden reconocer varios epítopos citrulinados presentes en diferentes regiones de la misma proteína. Cada epítopo citrulinado se denomina especificidad fina y en conjunto, contribuyen al repertorio total de ACPA presente en los pacientes. Una fracción muy importante de ese repertorio es lo que se detecta con las pruebas comerciales anti-CCP empleadas en la práctica clínica que incluyen una veintena de péptidos gracias a que existe reactividad cruzada entre distintas especificidades finas 209–211. Se desconoce el conjunto total de proteínas citrulinadas frente a las que los pacientes con AR desarrollan ACPA, aunque el fibrinógeno 212, la vimentina 213 y la enolasa α 214 destacan entre las proteínas citrulinadas identificadas como potenciales autoantígenos. El patrón de especificidades finas que reconocen los ACPA es altamente heterogéneo 91,145,209 y su reactividad se encuentra mayoritariamente en los pacientes ACPA positivos 209. Sin embargo, existen pacientes que se detectan como ACPA positivos mediante el test anti-CCP pero dan resultados negativos cuando se emplean como antígenos proteínas/péptidos citrulinados concretos, lo que sugiere la existencia de más autoantígenos citrulinados 209. Las histonas han surgido como nuevos autoantígenos en la AR. Estas proteínas en su versión citrulinada se detectan en el tejido sinovial y en el líquido sinovial de pacientes con AR 215–218. En este punto cabe destacar el trabajo de Meng X y col. en el que las histonas citrulinadas fueron las proteínas más frecuentemente aisladas de los IC formados por ACPA provenientes del líquido sinovial de pacientes con AR, especialmente la histona H4 (89%) 217. La importancia de este hallazgo reside en que de todos los autoantígenos propuestos en la AR hasta el momento, sólo la vimentina se aisló de los IC obtenidos de los líquidos sinoviales en este trabajo, aunque con una frecuencia considerablemente menor (5%) que la de las histonas. Además, las histonas han sido identificadas como la diana principal de ACPA monoclonales aislados de células B provenientes de la sinovia de pacientes con AR 219. También se han detectado ACPA dirigidos frente a histonas citrulinadas en el suero de pacientes con AR, tanto en la fase preclínica 91,220 como en la fase clínica de la enfermedad 217,221–223 al igual que se ha observado para los ACPA que reconocen otras proteínas citrulinadas. Uno de los resultados más llamativos sobre la relevancia de las histonas como autoantígenos es la Lorena Rodríguez Martínez 28 marcada inmunodominancia de los anticuerpos que reconocen un péptido citrulinado derivado de la histona H4 (cH4/39-40) cuya prevalencia fue del 92 – 95% en los pacientes con AR ACPA positivos de dos colecciones diferentes 217, muy superior a la descrita para otros autoantígenos citrulinados 209,224,225. Sin embargo, esta frecuencia tan llamativa no ha sido confirmada de forma independiente. Tampoco se ha explorado la posible asociación de los anticuerpos anti-cH4/39-40 con las características clínicas de la AR ni su relación con los anticuerpos anti-CCP ni con los anticuerpos que reconocen otras especificidades finas citrulinadas a pesar de identificarse como un anticuerpo predominante. Todas estas cuestiones se abordarán en este proyecto de tesis. 6.3. ANTICUERPOS ANTI-PROTEÍNAS CARBAMILADAS Los anticuerpos anti-CarP se detectan con una sensibilidad reproducible en cohortes de pacientes con AR de diferente origen, cuantificada en torno al 30 – 40% 47,70,71,226,227 y presentan una elevada especificidad 228 . Sin embargo, la utilidad de los anticuerpos anti-CarP como biomarcadores en la AR no está tan clara ya que se cuestiona si añaden información útil a la proporcionada por el FR y los ACPA. La diana de los anticuerpos anti-CarP es la homocitrulina (Figura 3), un aminoácido que surge de la carbamilación de proteínas 43, una reacción no enzimática en la que el cianato (OCN-) interacciona preferentemente con los grupos amino de las lisinas de las proteínas para formar homocitrulina 229 Otros aminoácidos y grupos funcionales son susceptibles de reaccionar con el cianato aunque en menor medida que la lisina 230,231. Las fuentes fisiológicas de cianato son la urea y el tiocianato (SCN-). El cianato y la urea se encuentran en equilibrio químico, por lo que un aumento de la concentración de urea como el que se produce en los pacientes urémicos con síndrome renal crónico 232 provoca un aumento en la concentración de cianato. El tiocianato también puede verse aumentado por la dieta y el tabaco 229, lo que favorece su conversión a cianato a través de la acción enzimática de la MPO 84 . La homocitrulina reconocida por los anticuerpos anti-CarP presenta una elevada similitud estructural con la citrulina (Figura 3). En vista de la homología entre homocitrulina y citrulina, no sorprende que los anticuerpos anti-CarP y los ACPA muestren un cierto nivel de reactividad cruzada 44,233,234. A pesar de ello, los anticuerpos anti-CarP conforman un sistema de autoanticuerpos independiente de los ACPA como evidencian varios trabajos que muestran que los factores de riesgo genéticos y ambientales asociados con la AR anti-CarP positiva difieren de los asociados con la AR ACPA positiva 56,70,71. Además, aunque los anticuerpos anti-CarP se encuentran preferentemente en pacientes ACPA positivos, su presencia en aproximadamente el 20% de los pacientes ACPA negativos 43,70,137 refuerza la independencia de los ACPA y los anticuerpos anti-CarP. 6.4. ANTICUERPOS ANTI-PÉPTIDOS ACETILADOS Los AAPA reconocen péptidos acetilados en diferentes aminoácidos, en concreto la lisina y la ornitina 44,235. La acetilación es una reacción enzimática reversible que introduce un grupo acetilo en los aminoácidos, preferentemente en las lisinas, aunque otros residuos que contienen aminas también son susceptibles de modificarse. A nivel fisiológico la acetilación está catalizada por las acetiltranferasas mientras que las deacetilasas catalizan la reacción INTRODUCCIÓN 29 inversa 236. También puede producirse la acetilación no enzimática de proteínas en presencia de altas concentraciones de acetil coenzima A y a pH básico 237. La determinación de los AAPA se ha evaluado con un ELISA que emplea como antígeno un péptido derivado de la secuencia de la vimentina mutada empleada en el kit MCV (Figura 4) en el que la citrulina en posición 7 se ha sustituido por una lisina acetilada (anti-AcLys) o una ornitina acetilada (anti-AcOrn) 44,235. Se han diseñado otros péptidos adicionales que incluyen esas mismas PTM en la posición 2 del péptido MCV, pero la acetilación en posición 7 es la que captura más reactividad 130,235. Los anticuerpos anti-AcLys presentan niveles bajos de reactividad cruzada con los ACPA y con los anticuerpos anti-CarP 44 a pesar de la alta analogía estructural existente entre la lisina acetilada, la citrulina y la homocitrulina (Figura 3), lo que indica que conforman un sistema de autoanticuerpos independiente. Otra evidencia a favor de la independencia de los AAPA es su presencia en torno al 13 – 55% de pacientes seronegativos 44,178,179,235. Figura 4. Péptidos acetilados empleados como antígenos para la determinación de AAPA. La citrulina en posición 7 del péptido MCV se ha sustituido por una lisina acetilada o por una ornitina acetilada mientras que el resto de la secuencia es idéntica. En el péptido MCV se muestra la estructura del grupo amida presente en la citrulina mientras que en los péptidos AcLys y AcOrn se muestra la estructura del grupo acetilo. Los aminoácidos se representan con el código de una letra excepto para la ornitina designada como Orn 235 desde el extremo amino terminal hasta el C terminal. Los números indican la posición de cada aminoácido en la secuencia del péptido. MCV = péptido de vimentina mutada citrulinada, AcLys = péptido con lisina acetilada, AcOrn = péptido con ornitina acetilada, H2N– = extremo amino terminal, –OH = extremo carboxilo terminal. Imagen de autoría propia creada con BioRender.com. Aunque los AAPA parecen ser un nuevo sistema de anticuerpos presentes en la AR todavía se desconocen muchas de sus características, como las proteínas endógenas acetiladas que reconocen, su relación con los factores genéticos de riesgo, su posible implicación en la patogénesis de la enfermedad, su relevancia para el manejo de los pacientes o su utilidad para la clasificación de la AR. Esclarecer esta última incógnita es uno de los objetivos principales de este proyecto de tesis. Lorena Rodríguez Martínez 30 6.5. ANTICUERPOS FRENTE A ADUCTOS DE MALONDIALDEHÍDO-ACETALDEHÍDO Los anticuerpos anti-MAA reconocen aductos de MAA generados por la oxidación no enzimática de proteínas con malondialdehído y acetaldehído. Esta modificación ocurre principalmente en el grupo amina en posición ε de la lisina 238 y difieren de los aductos que se forman en la reacción de cada aldehído por separado 239. El análisis estructural y la caracterización química de los aductos de MAA muestran que tras la reacción in vitro se generan dos estructuras predominantes (Figura 5). Una de ellas es el compuesto 4-metil-1,4- dihidropiridina-3,5-dicarbaldehído también denominado aducto MDHDC que resulta de la reacción de dos moléculas de malondialdehído con una de acetaldehído y una lisina 240,241. El anillo de piridina le confiere propiedades fluorescentes y su estructura cíclica le proporciona una alta estabilidad. La otra estructura mayoritaria es el compuesto 2-formil-3- (alquilamino)butanal o aducto FAAB formado a partir de la reacción equimolecular de malondialdehído con acetaldehído y una lisina (Figura 5). Este aducto carece de propiedades fluorescentes y es más lábil en comparación con el aducto MDHDC 241. La fuente fisiológica de malondialdehído y de acetaldehído es la LPO de ácidos grasos 242 ya que el malondialdehído puede descomponerse de forma espontánea para generar acetaldehído 243. El tabaco también contribuye al aumento de los niveles de aldehídos reactivos lo que aumenta la disponibilidad tanto de malondialdehído como de acetaldehído. No se ha detectado reactividad cruzada entre los anticuerpos anti-MAA y los ACPA, probablemente porque los epítopos que reconoce cada autoanticuerpo no están relacionados estructuralmente (Figura 3) y se consideran anticuerpos independientes. Figura 5. Formación de los dos aductos mayoritarios de MAA en las proteínas. Se muestra una representación simplificada de las reacciones propuestas para la formación de los dos aductos de MAA mayoritarios, el aducto FAAB y el aducto MDHDC. La generación del aducto FAAB se produce por la reacción de la lisina de las proteínas con una molécula de malondialdehído y una de acetaldehído, mientras que la formación del aducto MDHDC se produce por la reacción de dos moléculas de malondialdehído con una de acetaldehído. Una vez formado, el aducto FAAB menos estable puede reaccionar con otra molécula de malondialdehído para formar el aducto MDHDC más estable. R1 y R2 = cadena de aminoácidos de la proteína. Imagen de autoría propia creada con BioRender.com. INTRODUCCIÓN 31 La presencia de anticuerpos anti-MAA en relación con la AR se ha descrito por primera vez en pacientes con una enfermedad establecida procedentes del registro Veterans Affairs Rheumatoid Arthritis (VARA) que recopila información de veteranos de guerra de varios centros médicos de Estados Unidos 32. En estos pacientes, Thiele y col. detectaron los isotipos IgG, IgM e IgA de los anticuerpos anti-MAA con una sensibilidad sorprendentemente superior a la de los anticuerpos descritos hasta el momento en la AR, incluidos los ACPA 32. Más del 90% de los pacientes presentaron anticuerpos del isotipo IgG, mientras que la presencia de los isotipos IgA e IgM fue menor, del 73% y 38% respectivamente. Un hallazgo de gran relevancia potencial fue la notable presencia de los anticuerpos anti-MAA en los pacientes ACPA negativos: 88% para el isotipo IgG, 63% para el isotipo IgA y 29% para el isotipo IgM, de nuevo muy superior a la descrita para otros anticuerpos. Los mismos autores de este trabajo ampliaron el estudio de los anticuerpos anti-MAA en pacientes con varias enfermedades reumáticas incluyendo pacientes con AR reclutados de cuatro centros médicos de veteranos estadounidenses (VAMC, Veterans Affairs Medical Centers) 39. En estos pacientes volvieron a observar una elevada sensibilidad de los anticuerpos anti-MAA. especialmente de los isotipos IgG e IgA 39. Sin embargo, no se replicó la asociación con el tabaquismo descrita con el isotipo IgM en el estudio de Thiele y col. 32, siendo el isotipo IgA el asociado con el tabaco en el estudio de Mikuls y col. 39. Los anticuerpos anti-MAA de isotipo IgG también se han evaluado en pacientes con AR de la cohorte Epidemiological Investigation of Rheumatoid Arthritis (EIRA) procedentes de la población de Suecia 204,244. Empleando un enfoque algo distinto para definir la positividad, los autores de este trabajo han descrito una sensibilidad para los anticuerpos IgG anti-MAA del 44% en el conjunto de pacientes con AR y del 33% en el subgrupo anti-CCP negativo, valores notablemente inferiores a los descritos para el isotipo IgG en los dos trabajos previos. La sorprendente sensibilidad descrita en los pacientes seronegativos no sólo cambia la perspectiva acerca de la existencia de la AR sin autoanticuerpos sino que abre la posibilidad de utilizar a los anticuerpos anti-MAA como biomarcadores en ese subgrupo de pacientes. Sin embargo, los anticuerpos anti-MAA no son específicos de la AR detectándose además en pacientes con otras enfermedades reumáticas 39, enfermedades cardiovasculares 245–248, daño hepático 249,250, daño pulmonar 251–253 o diabetes 254, lo que pone en duda su utilidad como biomarcador. La falta de replicación y de validación independiente de los hallazgos en relación con la sensibilidad unida a la falta de especificidad de los anticuerpos anti-MAA impide sacar conclusiones claras acerca del papel de estos anticuerpos en la AR. Por ello, otro de los objetivos enmarcados en este proyecto de tesis es el estudio de los anticuerpos anti- MAA en una colección independiente de pacientes con AR con el fin de establecer la sensibilidad de estos anticuerpos, identificar asociaciones relevantes con las características clínicas de los pacientes y determinar su posible utilidad como biomarcadores, en especial en los pacientes seronegativos. Lorena Rodríguez Martínez 32 6.6. ANTICUERPOS FRENTE A ADUCTOS DE MALONDIALDEHÍDO Los anticuerpos anti-MDA reconocen aductos de MDA generados en las proteínas a través de la reacción de oxidación no enzimática con malondialdehído. La estructura mayoritaria de estos aductos es la 2-(propenal)lisina (Figura 3) formada tras modificación de la lisina 255, aunque otros aminoácidos también son susceptibles de modificarse 26,256. Los anticuerpos anti-MDA no reconocen antígenos citrulinados mientras que su interacción con proteínas carbamiladas es mínima 33, por lo que los anticuerpos anti-MDA se consideran independientes de los ACPA y de los anticuerpos anti-CarP. Los anticuerpos anti-MDA y los anti-MAA reconocen epítopos formados a partir de un precursor común, el malondialdehído, pero están dirigidos frente a epítopos poco relacionados estructuralmente (Figura 3) 239 por lo que no se espera que exista reactividad cruzada. Efectivamente, existe poca interferencia entre los anticuerpos anti-MDA y los anti-MAA cuando se evalúa mediante ensayos de competición 257. Además, también se ha observado que los anticuerpos anti-MDA presentes en el suero de pacientes con enfermedad hepática inducida por alcohol reconocen mayoritariamente los aductos de MDA mostrando un reconocimiento mínimo de la estructura MAA 250. Sin embargo, hasta ahora ningún trabajo ha evaluado estos anticuerpos en la misma colección de pacientes con AR y se desconoce con seguridad si son anticuerpos independientes o no. Esta incógnita pretende resolverse como parte de los objetivos de este trabajo. También se pretende validar la prevalencia descrita para los anticuerpos anti-MDA en pacientes con AR, que es del 28% para el isotipo IgG y algo inferior para el isotipo IgM 33, así como identificar posibles asociaciones con factores de riesgo de la enfermedad y características clínicas de los pacientes. Otro de nuestros objetivos es determinar si estos anticuerpos podrían ser de utilidad como biomarcadores en la AR, aunque su detección en otras enfermedades reumáticas 258–261 y en enfermedades pulmonares 262 indica que no son específicos. 6.7. ANTICUERPOS FRENTE A PROTEÍNAS CARBONILADAS La carbonilación de proteínas se produce a través de reacciones no enzimáticas en las que intervienen diferentes agentes carbonilantes y como consecuencia aumenta el número de grupos carbonilos (C=O) presentes en las proteínas. Así, dos tipos de reacciones de carbonilación de proteínas son las reacciones de oxidación con algunas ROS y las reacciones de glicación con carbohidratos reductores como la ribosa 263. La carbonilación de proteínas da lugar a la formación de un grupo heterogéneo de compuestos y entrecruzamientos denominados en su conjunto productos finales de glicación avanzada (AGEs, advanced glication end products) 8,264. La formación de AGEs se produce principalmente sobre la lisina, aunque otros aminoácidos también son susceptibles de modificarse dependiendo de las condiciones de reacción y del tipo de proteína 265. Algunos AGEs han sido ampliamente caracterizados como es el caso de la pentosidina, un entrecruzamiento entre lisina y arginina cuya estructura está bien definida (Figura 6). La pentosidina, así como otros compuestos estructuralmente relacionados, presentan propiedades fluorescentes idénticas, lo que ha llevado a nombrarlos en conjunto como productos de tipo pentosidina (PTP) 266. Bajo condiciones de reacción agresivas como una concentración elevada de agentes carbonilantes o una exposición prolongada, los enlaces peptídicos de las proteínas también pueden llegar a romperse lo que resulta en la fragmentación de la proteína 267. INTRODUCCIÓN 33 Figura 6. Estructura de la pentosidina. La pentosidina es un entrecruzamiento entre lisina y arginina que puede formarse tras la carbonilación de proteínas. Su estructura (sombreada en gris) es la que le confiere propiedades fluorescentes características. R1 y R2 = cadena de aminoácidos de la proteína. Imagen de autoría propia creada con BioRender.com. Algunos estudios han mostrado que los pacientes con AR presentan en el suero anticuerpos anti-Carbo frente a diversas proteínas carboniladas entre las que se encuentran la albúmina sérica humana (HSA) 268, la IgG 269–272 y el CII 30,37. Los estudios que emplean CII como antígeno carbonilado han proporcionado resultados especialmente llamativos. Destaca especialmente el trabajo realizado por Strollo y col. 37. Estos autores estudiaron pacientes con AR temprana en los que detectaron la presencia de anticuerpos que reconocen el CII carbonilado con HOCl (anti-HOCl) con una sensibilidad del 92.9% en el total de los pacientes y del 91.6% en los pacientes ACPA negativos. Este resultado supone la desaparición del concepto de seronegatividad en la AR y presenta a los anticuerpos anti-HOCl-CII como potenciales biomarcadores, especialmente en los pacientes con AR que carecen de otros autoanticuerpos. Los autores de este trabajo también detectaron la presencia de anticuerpos que reconocen el CII modificado con ribosa (anti-GLI-CII) aunque con una sensibilidad inferior: 64.7% en los pacientes con AR temprana y 55.5% en los pacientes ACPA negativos 37. Además, los anticuerpos anti-HOCl-CII y anti-GLI-CII no sólo presentan una elevada sensibilidad sino que muestran especificidad por la AR 30,37. Estos resultados, aunque prometedores, necesitan ser confirmados y validados de forma independiente, por lo que uno de los objetivos de este trabajo es evaluar la presencia de anticuerpos anti-Carbo, concretamente los anti-HOCl-CII y los anti-GLI-CII. 6.8. ANTICUERPOS ANTI-PROTEÍNAS NITRADAS Los anticuerpos anti-Nitra reconocen la 3-nitrotirosina (3-NT) generada a partir de la nitración de la tirosina con el ONO2- (Figura 3), aunque otros aminoácidos como el triptófano, la fenilalanina y la cisteína también son susceptibles de nitrarse 273,274. Al igual que se ha comentado para las reacciones de carbonilación con HOCl, unas condiciones agresivas de nitración pueden producir la fragmentación de las proteínas 274. La presencia de anticuerpos anti-Nitra en relación con la AR se ha descrito en dos trabajos diferentes en colecciones de pacientes que proceden de la India utilizando un Lorena Rodríguez Martínez 34 polipéptido de tirosina en un caso y la histona H2A en el otro. En ambos estudios, la reactividad frente a la 3-NT fue muy superior en los pacientes con AR, pero no se llegó a especificar su sensibilidad 35,275. Aunque estos resultados sugieren que los anticuerpos anti- Nitra podrían constituir un nuevo sistema de anticuerpos en la AR, necesitan ser validados en otras colecciones de pacientes. Por otra parte, se han descrito anticuerpos anti-Nitra en pacientes con otras enfermedades reumáticas como el LES y la artrosis a un nivel comparable al detectado en pacientes con AR 35,276,277, además de detectarse en pacientes con enfermedad coronaria 278 y con daño pulmonar 279. Esta baja especificidad de los anticuerpos anti-Nitra por la AR cuestiona su utilidad como biomarcador en la enfermedad. En consecuencia, uno de los objetivos de este proyecto de tesis consiste en analizar las características de los anticuerpos anti-Nitra en una colección independiente de pacientes con AR establecida. 6.9. ANTICUERPOS ANTI-PROTEÍNAS HOMOCISTEINILADAS La homocisteinilación es una reacción no enzimática en la que la homocisteína libre o su tioéster cíclico homocisteína tiolactona se unen de forma covalente a las proteínas 280. La homocisteína tiolactona favorece la reacción de N-homocisteinilación sobre las lisinas, mientras que la homocisteína libre favorece la reacción de S-homocisteinilación sobre las cisteínas, lo que da lugar a la formación de dos estructuras diferentes, lisina homocisteinilada y cisteína homocisteinilada, respectivamente 280 (Figura 7). Figura 7. Homocisteinilación de proteínas. Esquema simplificado de la reacción de N- homocisteinilación sobre la lisina y de S-homocisteinilación sobre la cisteína. La tiolactona de L- homocisteína da lugar a la reacción de N-homocisteinilación mientras que la homocisteína da lugar a la S-homocisteinilación. R1 y R2 = cadena de aminoácidos de la proteína. Imagen de autoría propia creada con BioRender.com. INTRODUCCIÓN 35 La homocisteína es un aminoácido que participa en el metabolismo de la metionina y a diferencia de éste, no forma parte de la estructura de las proteínas. Su conversión a homocisteína tiolactona evita la incorporación de la homocisteína a la secuencia de las proteínas que puede tener lugar debido a su semejanza estructural con la metionina 281. Algunos factores que contribuyen al aumento de la concentración fisiológica de homocisteína son la alteración de las rutas metabólicas en las que participa, defectos en su eliminación, la dieta y el consumo de tabaco 282,283. La presencia de anticuerpos anti-Hci se ha detectado en un trabajo estudiando pacientes con AR que mostraron un aumento de los niveles del 21 – 22% respecto de los niveles detectados en los controles sanos, aunque no se ha determinado el porcentaje de positivos 38. La estratificación de los pacientes según su seropositividad para el FR o los anticuerpos anti- CCP no mostró diferencias en los niveles de los anticuerpos anti-Hci. Aunque estos resultados relacionan a los anticuerpos anti-Hci con la AR, provienen de un único estudio y necesitan ser validados. Además, existen evidencias que indican que los anticuerpos anti-Hci no son específicos de la AR, detectándose también en pacientes con LES 284, enfermedades renales 285,286, enfermedades cardiovasculares 287 y enfermedades cerebrovasculares 288. Por ello, otro de los objetivos enmarcados en este trabajo es confirmar de forma independiente la presencia de anticuerpos anti-Hci en pacientes con AR y obtener información adicional que contribuya a definir la importancia de estos anticuerpos en la enfermedad. Aunque el FR y los ACPA han mostrado ser de gran utilidad clínica, todavía existe una fracción importante de pacientes con AR seronegativos que requieren de biomarcadores adicionales. La identificación de nuevos anticuerpos frente a PTM puede contribuir a resolver la necesidad de biomarcadores de diagnóstico, de pronóstico y de respuesta al tratamiento en la AR. En este sentido, los anticuerpos anti-MAA y los anti-Carbo son altamente prometedores dada la elevada prevalencia descrita en los pacientes seronegativos. Otros anticuerpos como los anti-MDA, los anti-Hci y los anti-Nitra también podrían mostrar utilidad clínica. Sin embargo, todavía es indispensable resolver las incógnitas acerca de la prevalencia de estos anticuerpos en la AR. Por el momento, se desconoce si los anticuerpos atípicos o nuevos frente a PTM se detectan en otras colecciones de pacientes con AR con la elevada sensibilidad descrita, ni tampoco se ha evaluado su asociación con los factores de riesgo o las características clínicas de la AR. La única excepción se aplica a los AAPA, cuya presencia se ha confirmado en varias colecciones. Sin embargo, una cuestión importante aún sin respuesta de los AAPA es si tienen valor para mejorar la clasificación de los pacientes con EA. El único estudio que ha abordado esta cuestión indica que carecen de potencial para mejorar la clasificación, aunque algunas evidencias de otros trabajos apuntan hacia una posible mejoría de la clasificación de los pacientes seronegativos. En relación con los anticuerpos anti-cH4-39/40 son varias las cuestiones todavía por aclarar, como su extraordinaria inmunodominancia, con gran solapamiento con los anti-CCP, su relación con otros anticuerpos frente a proteínas citrulinadas y su posible asociación con factores de riesgo de la AR. Todas estas incógnitas se abordarán en el presente proyecto. MATERIAL Y MÉTODOS 43 1. MUESTRAS DE PACIENTES Y CONTROLES Se han incluido muestras de suero de pacientes procedentes de dos hospitales de Madrid, pacientes de la cohorte de EA del Hospital Universitario La Paz 122 y pacientes del registro longitudinal de artritis reciente del Hospital Universitario La Princesa 123. También se han incluido sueros de pacientes con AR temprana y AR establecida del Hospital Clínico Universitario de Santiago que fueron estudiados de forma transversal 70. Los sujetos sanos considerados como controles procedieron del Hospital Clínico Universitario de Santiago. En el apartado de resultados se detallarán las características de los pacientes. 1.1. PACIENTES CON ARTRITIS DE RECIENTE COMIENZO Los pacientes con EA empleados en el proyecto provienen de dos centros diferentes, el Hospital Universitario La Paz y el Hospital Universitario La Princesa, ambos situados en Madrid. Los pacientes se han reclutado de manera prospectiva desde julio del 2001 hasta diciembre del 2014 en el estudio PEARL (Princesa Early Arthritis Register Longitudinal study, por sus siglas en inglés) 123 en el Hospital Universitario La Princesa y desde enero del 1993 hasta diciembre del 2013 en el Hospital Universitario La Paz 122. Estos pacientes presentaron dos o más articulaciones inflamadas durante un periodo inferior a un año y no recibieron tratamiento con fármacos modificadores de la enfermedad (FAME) en el momento de la primera visita. En las dos cohortes se ha realizado un seguimiento protocolizado de los pacientes de al menos dos años, con visitas programadas cada 6 meses. Para el estudio del papel de los anticuerpos anti-péptidos acetilados en el diagnóstico de la AR se utilizaron 525 muestras de la cohorte de La Paz y 537 de la cohorte PEARL. Estos pacientes se seleccionaron por haber completado dos años de seguimiento y por disponer de muestra de suero de la visita basal. Al final del seguimiento, se clasificaron los pacientes de acuerdo con los criterios ACR de 1987 para la clasificación de la AR 162. 1.2. PACIENTES CON ARTRITIS REUMATOIDE TEMPRANA ESTUDIADOS TRANSVERSALMENTE Estos pacientes provienen del Hospital Clínico Universitario de Santiago y fueron examinados por un reumatólogo experimentado que los clasificó de acuerdo a los criterios ACR de 1987 para la clasificación de la AR 162. Un total de 182 pacientes reclutados antes de que hubiesen pasado dos años desde el inicio de los síntomas fueron utilizados para el estudio de los anticuerpos anti-colágeno II. Los pacientes seleccionados presentaron una edad de inicio de los síntomas de 58 años y el 61.5% eran mujeres. 1.3. PACIENTES CON ARTRITIS REUMATOIDE ESTABLECIDA La colección de pacientes con AR establecida del Hospital Clínico Universitario de Santiago se obtuvo de forma transversal e incluye pacientes con AR clasificados de acuerdo con los criterios ACR de 1987 162. Esta colección está formada por 520 pacientes que al diagnóstico tenían 48.6 años, el 76.7% son mujeres y al ser reclutados llevaban 12.1 años de evolución. Estos pacientes se incluyeron en los análisis para evaluar la presencia de anticuerpos frente a Lorena Rodríguez Martínez 44 varias modificaciones postraduccionales de las proteínas: los anticuerpos anti-MAA y anti- MDA dirigidos frente a aductos de malondialdehído-acetaldehído y de malondialdehído respectivamente; los anticuerpos anti-cH4/39-40 frente a un péptido citrulinado de la histona H4; y los anticuerpos anti-Hci y anti-Nitra frente a proteínas sinoviales homocisteiniladas y nitradas y contra péptidos nitrados. 1.4. CONTROLES Los controles se reclutaron en el Hospital Clínico Universitario de Santiago. Se emplearon un total de 272 sujetos sin enfermedades inflamatorias o autoinmunes. Estos sujetos presentaron una edad de reclutamiento de 69.8 años, siendo el 48.2% mujeres. Los sueros se emplearon para establecer el punto de corte para definir la positividad para los diferentes anticuerpos estudiados en este proyecto. 2. CONSIDERACIONES ÉTICAS El trabajo de esta tesis doctoral ha sido realizado de acuerdo con la Declaración de Helsinki y al informe Belmont, y de acuerdo a ley biomédica española (Ley Española de Investigación Biomédica nº 14/2007). En consecuencia, todas las muestras utilizadas se han obtenido con consentimiento informado y en el marco de proyectos cuyo protocolo ha sido aprobado por el Comité Ético de Investigación Clínica (CEIC) de Galicia (código de registro nº 2014/387 y nº 2017/514; Anexos 2 y 3). MATERIAL Y MÉTODOS 45 3. OBTENCIÓN DE PROTEÍNAS Y PÉPTIDOS MODIFICADOS POSTRADUCCIONALMENTE Para la realización de este trabajo se han empleado una gran variedad de proteínas y péptidos así como de agentes modificantes. Estos agentes se han utilizado para generar las distintas modificaciones postraduccionales mediante reacciones químicas in vitro en el caso de las proteínas. Los péptidos se han obtenido ya modificados bajo demanda. Estos antígenos se emplearon en su forma modificada y en su forma nativa sin modificar en ensayos ELISA con el objetivo de evaluar si las modificaciones postraduccionales son reconocidas de forma específica por los anticuerpos presentes en el suero de los pacientes con AR. En esta sección se describen con detalle los protocolos empleados para la obtención de cada una de las modificaciones postraduccionales, información que se encuentra resumida en la Tabla 3. Tabla 3. Modificaciones postraduccionales estudiadas. Se muestra la modificación, el reactivo utilizado, la proteína diana modificada, la abreviatura empleada para referirse a cada uno de los antígenos (proteínas/péptidos) modificados y la referencia de la que se ha obtenido la metodología para generar las modificaciones postraduccionales. Los péptidos se obtuvieron modificados de forma comercial. c(péptido): péptido citrulinado, Ac(aminoácido): aminoácido acetilado en la posición 7 de la secuencia del péptido MCV, MAA-HSA: aductos de malondialdehído-acetaldehído de albúmina humana, MDA-BSA: aductos de malondialdehído de albúmina bovina, HOCl-CII: colágeno tipo II bovino carbonilado con HOCl, GLI-CII: colágeno tipo II bovino glicado, 3-NT-PS: proteínas sinoviales nitradas, 3-NT-(péptido): péptido nitrado, Hci-PS: proteínas sinoviales homocisteiniladas. MCV = vimentina mutada citrulinada. Los péptidos citrulinados utilizados se encuentran en la Tabla 4 y los péptidos nitrados en la Tabla 5. Modificación Agente modificante Proteína / péptido Abreviatura Citrulinación 144,217,289,290 - Péptidos seleccionados c(péptido) Acetilación 44,235 - Péptidos de MCV Ac(aminoácido) Aducción oxidativa 32 Malondialdehído y acetaldehído Albúmina humana (HSA) MAA-HSA Malondialdehído Albúmina bovina (BSA) MDA-BSA Carbonilación 30 Ácido hipocloroso (HOCl) Colágeno tipo II bovino (CII) HOCl-CII Ribosa Colágeno tipo II bovino (CII) GLI-CII Nitración 35 Peroxinitrito de sodio (NaONO2) Proteínas sinoviales 3-NT-PS - Péptidos seleccionados 3-NT-(péptido) Homocisteinilación 38 L-homocisteína tiolactona (L-Hci-tiolactona) Proteínas sinoviales Hci-PS Lorena Rodríguez Martínez 46 3.1. SÍNTESIS DE PÉPTIDOS CITRULINADOS Y NATIVOS La presencia de anticuerpos frente a la histona H4 citrulinada se evaluó empleando un péptido sintético citrulinado y el correspondiente péptido con arginina a modo de control. Los resultados se compararon con los anticuerpos frente a otros péptidos citrulinados reconocidos como autoantígenos en la AR: la enolasa, el fibrinógeno y la vimentina. Estos anticuerpos han sido determinados previamente en nuestro grupo 291, pero algunos resultados no han sido publicados (A. Montes, no publicado). Las características de los péptidos empleados se recogen en la Tabla 4. Todos los péptidos se sintetizaron biotinilados en el extremo carboxilo terminal por Schafer-N (Copenhagen, Denmark) con una pureza superior al 90%, a excepción del péptido cíclico citrulinado de la enolasa (CEP-1) que se obtuvo de Abcam (Cambridge, UK) sin biotinilar y con una pureza superior al 95%. Tabla 4. Características de los péptidos citrulinados empleados. Los péptidos citrulinados contienen citrulina (cit) en vez de las argininas (R) presentes en los péptidos nativos. Péptido Proteína Estructura Secuencia de aminoácidos cH4/39-40 217 Histona H4 Lineal AIRRLA(cit)(cit)GGVKRIS H4/39-40 217 Histona H4 Lineal AIRRLARRGGVKRIS CEP-1 289 α-enolasa Cíclico CKIHA(cit)EIFDS(cit)GNPTVECK cVim60-75 290 Vimentina Lineal VYAT(cit)SSAV(cit)L (cit)SSVP cVim2-17 144 Vimentina Lineal ST(cit)SVSSSSY(cit) (cit)MFGG cFibβ36-52 290 Fibrinógeno, cadena β Lineal NEEGFFSA(cit)GHRPLDKK cFibα27-43 144 Fibrinógeno, cadena α Lineal FLAEGGGV(cit)GPRVVERH 3.2. OBTENCIÓN DE PÉPTIDOS ACETILADOS Los anticuerpos frente a péptidos acetilados se evaluaron usando un kit no comercializado facilitado por Orgentec (Orgentec Diagnostika GmbH, Mainz, Germany) en el que se proporcionaban placas de ELISA con cada uno de los péptidos conjugados por separado. Los dos péptidos acetilados incluidos en el kit presentan una secuencia de amino ácidos derivada de la vimentina mutada empleada en el ensayo MCV 292. La arginina en la posición 7 del péptido de la vimentina mutada (GRVYATRSSAVR) se encuentra modificada para obtener los dos péptidos acetilados, uno de los cuales contenía una lisina acetilada (AcLys) y el otro una ornitina acetilada (AcOrn) en la misma posición 44,235. MATERIAL Y MÉTODOS 47 3.3. GENERACIÓN DE ADUCTOS OXIDADOS CON MALONDIALDEHÍDO 3.3.1. Aductos de malondialdehído Los anticuerpos frente a aductos de MDA se determinaron mediante un ELISA casero siguiendo el protocolo que se detalla en el trabajo original en el que se describen estos anticuerpos en pacientes con AR 33. Como antígeno se utilizó albúmina bovina sérica modificada con malondialdehído in vitro (MDA-BSA) comercial (#20P-MD-BS110, Academy Bio-medical Company, Houston, Texas, USA). 3.3.2. Aductos de malondialdehído-acetaldehído La determinación de anticuerpos frente a aductos de MAA se realizó empleando albúmina humana sérica (HSA) modificada in vitro químicamente en el laboratorio tal y como se describe a continuación. En primer lugar se obtuvo el malondialdehído en forma de sal de sodio, preparado en fresco siguiendo el protocolo descrito en Kikugawa y col. 293 con algunas modificaciones 294. En una campana de extracción de gases se añadieron 5 mL de 1,1,3,3- tetrametoxipropano (Sigma-Aldrich, St.Louis, Missouri, USA) en un matraz y sobre ese volumen se adicionaron lentamente 2.5 mL de 1 M ácido clorhídrico (HCl) (Sigma-Aldrich, St.Louis, Missouri, USA) en una proporción molar de 1:1. El matraz se tapó, se selló con parafilm y se mantuvo en agitación durante 30 minutos a temperatura ambiente. La solución se dejó enfriar en hielo durante 15 minutos y se ajustó a pH 10 con 6 M hidróxido de sodio (NaOH) (Sigma-Aldrich, St.Louis, Missouri, USA) monitorizando el cambio de pH con un pHmetro Crison basic20 (Hach, Loveland, Colorado, USA). A continuación, se precipitó el malondialdehído con la adición de 100 mL de acetona fría dejando enfriar la mezcla durante 1 hora en hielo. Los cristales de malondialdehído se obtuvieron por filtración y se mantuvieron a -20 ºC durante 1.5 horas antes de su purificación mediante recristalización con agua-acetona en una proporción 1:1 en volumen (v/v). Tras su purificación, el malondialdehído purificado se dejó 24 horas en un desecador protegido de la luz para eliminar el líquido restante y se almacenó en estado sólido a -20 ºC protegido de la luz hasta un máximo de 1 semana. La formación de aductos de MAA se llevó a cabo empleando HSA liofilizada (Sigma- Aldrich, St.Louis, Missouri, USA). La proteína (2 mg/mL) se incubó con 2 mM malondialdehído y 1 mM acetaldehído (Sigma-Aldrich, St.Louis, Missouri, USA) en un ratio molar de 2:1 (MAA-HSA) y en presencia de 2 mM ácido dietilentriaminopentaacético (DTPA) y 2 mM ácido fítico (PA) (Sigma-Aldrich, St.Louis, Missouri, USA) en 0.1 M buffer fosfato pH 7.2 durante 72 horas a 37 ºC en tubos protegidos de la luz y sellados con parafilm. Simultáneamente se preparó un tubo con HSA en las mismas condiciones, pero en ausencia de malondialdehído y acetaldehído a modo de antígeno control (CTR-HSA). Además, se empleó otra fuente de HSA (Albunorm 5%) ya disuelta en disolución acuosa (Octapharma, Lachen, Switzerland) que se modificó de forma similar, pero empleando una concentración de 4 mM malondialdehído y manteniendo la concentración de acetaldehído en 1 mM (ratio molar 4:1). En este caso también se preparó un tubo con HSA a modo de control. Tras la reacción, las proteínas se dializaron en 0.1 M buffer fosfato pH 7.2 durante 24 horas a 4ºC con al menos tres cambios de buffer para eliminar los restos de aldehídos sin reaccionar, así como los ácidos incluidos en la reacción. Tras la diálisis, los aductos se concentraron empleando el sistema Amicon (Merck Millipore, Darmstadt, Germany) usando filtros de 30 kDa como Lorena Rodríguez Martínez 48 punto de corte siguiendo las especificaciones del manual. Alternativamente, las proteínas se purificaron con el sistema Amicon en lugar de dializarse. De esta forma, se realizó la purificación y la concentración de los aductos de forma simultánea. Los posibles agregados proteicos formados durante la reacción se eliminaron mediante filtración a través de un filtro de 0.22 micras con membrana de polietersulfona (PES). Esta filtración esterilizó las preparaciones. Las proteínas se cuantificaron mediante el método colorimétrico de Bradford (Bio-Rad, Hercules, California, USA) de acuerdo con las instrucciones del fabricante. En algunos experimentos, se utilizaron los aductos de forma inmediata, manteniéndose siempre a 4ºC y protegidos de la luz. En caso contrario, se almacenaron a -20 ºC protegidos de la luz hasta su uso. 3.4. GENERACIÓN DE ESPECIES CARBONILADAS DE COLÁGENO TIPO II Las reacciones de carbonilación se realizaron empleando dos agentes oxidantes de distinta naturaleza química, el HOCl y la ribosa, siguiendo la metodología descrita previamente 30. El HOCl es una especie altamente oxidante, con una cinética de reacción rápida, mientras que la ribosa es una especie oxidante más suave, con una cinética más lenta y cuyo mecanismo de reacción con las proteínas difiere del mecanismo del HOCl. Para la modificación con D-(-)- ribosa (Sigma-Aldrich, St.Louis, Missouri, USA) se preparó un stock a 4 M en PBS pH 7.4 que se almacenó protegido de la luz a 4 ºC. Para la modificación con HOCl se preparó inmediatamente antes de su uso un stock a 10 mM en PBS pH 7.4 (100 mM monohidrógeno fosfato de sodio [Na2HPO4], 140 mM cloruro de sodio [NaCl], 3 mM cloruro de potasio [KCl]) (Acros Organics, Thermo Fisher Scientific, Waltham, Massachusetts, USA) a partir de una solución concentrada de hipoclorito de sodio (NaOCl) (Merck Millipore, Darmstadt, Germany) 295. La concentración del anión OClse midió por espectrofotometría empleando el coeficiente de extinción molar a 292 nm (ε292) de 350 M-1 cm-1 en la ecuación de la ley de Beer-Lambert 296. El rango lineal en el que se puede aplicar la ecuación se determinó mediante diluciones seriadas de NaOCl en PBS pH 7.4, seleccionando la dilución 1:1000 como óptima al encontrarse en la zona intermedia del rango lineal. A continuación, se midió la absorbancia por triplicado de la dilución 1:1000 del NaOCl recien preparado en un espectrofotómetro Ultrospec 1100pro (Amershan Biosciences, GE Healthcare, Chicago, Illinois, USA) obteniendo la concentración del ión OCl- a pH 7.4. Este pH es necesario porque dependiendo del pH el anión OClse encuentra formando diferentes especies en disolución acuosa: a pH ácido forma mayoritariamente HOCl mientras que a pH básico se encuentra disociado en su forma aniónica. La constante de disociación ácida (Ka) del HOCl es de 7.5 297 por lo que según la ecuación de esta constante (ecuación 1), a pH 7.4 se puede asumir que la concentración de las especies HOCl y OClque se encuentran en disolución es idéntica (ecuación 3). Por lo tanto, la concentración obtenida espectrofotométricamente de la especie OCl- a pH 7.4 es equivalente a la concentración de HOCl. 𝐾𝑎=[H+]·[OCl−] [HOCl] (ecuación 1) Si aplicamos el –log10 a los dos términos de la ecuación: 𝑝𝐾𝑎=pH·(−log[OCl−]) (−log[HOCl]) (ecuación 2) MATERIAL Y MÉTODOS 49 Si pH ≈ pKa entonces: [HOCl] ≈[OCl−] (ecuación 3) La carbonilación se realizó sobre colágeno tipo II (CII) comercial liofilizado y de alta pureza obtenido a partir de cartílago bovino (#804001, MDbioproducts, Oakdale, Minnesota, USA). En primer lugar, el CII se reconstituyó según las instrucciones del proveedor en 50 mM ácido acético durante 24 horas a 4 ºC en condiciones estériles y se almacenó protegido de la luz a 4 ºC. Posteriormente se prepararon alícuotas en PBS pH 7.4 en condiciones estériles y se almacenaron a -20 ºC hasta su uso. El CII carbonilado se obtuvo mediante su reacción (2 mg/mL en PBS pH 7.4) con 1 mM HOCl preparado en fresco a partir del stock a 10 mM (HOCl-CII), o con 2 M ribosa a partir del stock a 4 M (GLI-CII). Estas reacciones se incubaron durante 24 horas a 37 ºC en condiciones estériles y en oscuridad. En paralelo se incubó CII en ausencia de los agentes carbonilantes para emplearlo como antígeno control (CTR-CII). También se modificó BSA (Sigma-Aldrich, St.Louis, Missouri, USA) en las mismas condiciones que el CII para un uso comparativo 30. Tras las reacciones, los preparados se dializaron en PBS pH 7.4 a 4 ºC durante 24 horas con al menos tres cambios de PBS. La concentración de las proteínas se determinó mediante el método de Bradford (Bio-Rad, Hercules, California, USA) según las instrucciones del fabricante y los antígenos se utilizaron a continuación manteniéndolos a 4 ºC y protegidos de la luz. 3.5. GENERACIÓN DE PROTEÍNAS NITRADAS La reacción de nitración para producir 3-nitrotirosina (3-NT) se realizó sobre alícuotas de las mismas preparaciones de PS empleadas para la reacción de homocisteinilación. En primer lugar, las PS se diluyeron a 3-5 mg/mL en PBS 1X y se ajustaron a pH 3.5 utilizando 6 M y 0.6 M ácido acético. A continuación, se añadió 10 mM peroxinitrito de sodio (NaONO2) (Sigma-Aldrich, St.Louis, Missouri, USA), concentración determinada como óptima en experimentos previos y se dejó reaccionar durante 24 h a 37 ºC 35 para obtener PS nitradas (3- NT-PS). Se incubó además una muestra de PS sin el agente nitrante para obtener antígeno control (CTR-PS). También se nitró suero fetal bovino (FBS) (Gibco, Thermo Fisher Scientific, Waltham, Massachusetts, USA) para usar como control de la reacción de nitración. Las proteínas se filtraron con un sistema Amicon (Merck Millipore, Darmstadt, Germany) usando filtros de 3 kDa para las PS y de 30 kDa para el FBS a 5000 rpm durante 30 min y a 4 ºC para eliminar el NaONO2 sin reaccionar y otros subproductos de la reacción. Posteriormente se realizó el cambio de buffer de las proteínas por PBS 1X pH 9, se centrifugaron como se indica anteriormente y se almacenaron a -20 ºC tras determinar su concentración usando el método de Bradford (Bio-Rad, Hercules, California, USA). 3.6. SÍNTESIS DE PÉPTIDOS NITRADOS Y NATIVOS La determinación de anticuerpos anti-Nitra que reconocen la 3-NT también se realizó empleando péptidos nitrados en lugar de proteínas completas, como ya se ha hecho en un estudio previo 278. Los péptidos se seleccionaron a partir de proteínas descritas como relevantes en la AR. La búsqueda se centró en proteínas con un peso molecular en el rango de 20-80 kDa ya que se han observado residuos nitrados en proteínas sinoviales de ese rango aisladas de pacientes con AR 28. Además, considerando que la nitración in vivo ocurre Lorena Rodríguez Martínez 50 principalmente en los residuos de tirosina sólo se seleccionaron péptidos que contenían tirosinas susceptibles de ser nitradas. Para la selección de péptidos se emplearon dos programas informáticos que predicen los sitios en los que existe mayor probabilidad de encontrar tirosinas nitradas: el programa iNitro-Tyr 298 y el programa GPS-YNO2 1.0 299, ambos disponibles de forma gratuita. Se consideró que la predicción era de confianza cuando aparecía el mismo sitio con la tirosina nitrada en ambos programas y además ese sitio presentaba un valor Δ > 0.5 en iNitro-Tyr y una puntuación > 1.0 para un umbral medio en GPS-YNO2, parámetros cuyo valor es directamente proporcional a la probabilidad de encontrar 3-NT en un sitio específico. En total se seleccionaron 10 péptidos con una longitud de 21 residuos basándonos en hallazgos previos 300. La secuencia de los péptidos se seleccionó de forma que la posición de la 3-NT se encontraba en el medio de la secuencia de aminoácidos. Se sintetizaron en una versión nativa y otra nitrada en un único residuo de tirosina. Todos se sintetizaron biotinilados en el extremo amino terminal por Schafer-N (Copenhagen, Denmark) con una pureza superior al 80%. Dos péptidos nitrados, uno derivado de la peoteína BiP y otro de la tenascina, no se obtuvieron con la suficiente pureza y fueron descartados del estudio junto con los péptidos nativos correspondientes. La Tabla 5 muestra las características de los péptidos, así como los valores de los parámetros indicativos de la probabilidad de nitración obtenidos de cada programa. Tabla 5. Péptidos derivados de proteínas relevantes en la AR que contienen una tirosina susceptible de encontrarse nitrada in vivo. Las secuencias de los péptidos nitrados en los residuos de tirosina (3-NO2-Y) se muestran desde el extremo amino hacia el carboxilo terminal indicando la posición en la proteína del péptido. Los péptidos nativos contienen una tirosina (Y) en la misma posición que la 3-NO2-Y en la versión nitrada. El parámetro Δ se obtiene del programa iNitro-Tyr mientras que el programa GPS-YNO2 1.0 proporciona la puntuación indicada en la última columna. Cuanto mayor es el valor de cualquiera de estos parámetros mayor es la probabilidad de nitración. Péptido Secuencia de aminoácidos Pureza (%) nitrado/nativo Δ Puntuación Enolasa 1 247AASEFFRSGK(3-NO2-Y)DLDFKSPDDP267 >90 / >90 0.999 2.881 Enolasa 2 34AVPSGASTGI(3-NO2-Y)EALELRDNDK54 >85 / >90 0.584 1.498 Fibrinógeno 312GKNYCGLPGE(3-NO2-Y)WLGNDKISQL332 >90 / >95 0.903 1.611 Vimentina 20TASRPSSSRS(3-NO2-Y)VTTSTRTYSL40 >90 / >87 0.963 2.693 14-3-3 η 206AELDTLNEDS(3-NO2-Y)KDSTLIMQLL226 >90 / >90 1.061 1.695 BiP 165VTHAVVTVPA(3-NO2-Y)FNDAQRQATK185 >66 / >90 3.237 2.824 Tenascina 1676DITGLREATE(3-NO2-Y)EIELYGISKG1696 >46 / >90 0.457 0.912 Histona H3 32ATGGVKKPHR(3-NO2-Y)RPGTVALREI52 >90 / >90 1.319 1.679 Histona H4 1 63LENVIRDAVT(3-NO2-Y)TEHAKRKTVT83 >90 / >90 0.731 1.866 Histona H4 2 42GGVKRISGLI(3-NO2-Y)YEETRGVLKVF62 >90 / >80 0.546 1.448 MATERIAL Y MÉTODOS 51 3.7. GENERACIÓN DE PROTEÍNAS HOMOCISTEINILADAS La homocisteinilación se llevó a cabo mediante la reacción del hidrocloruro de L- homocisteína tiolactona (L-Hci-tiolactona) (Sigma-Aldrich, St.Louis, Missouri, USA) con proteínas extraídas de tejido sinovial (PS). Las muestras de tejido sinovial se recolectaron de tres pacientes con artrosis durante operaciones de reemplazo de la articulación de la rodilla realizadas en el Hospital Provincial de Conxo o en el Hospital Clínico Universitario de Santiago, ambos en Santiago de Compostela. Esta parte del estudio también fue aprobada por el Comité Ético de Investigación de Galicia y se contó con el consentimiento informado por escrito de los pacientes. La sinovia se diseccionó del tejido conectivo y se homogeneizó empleando un equipo Polytron PT 1200 E (Kinematica AG) mediante la adición de buffer lisis (1 mM ortovanadato de sodio [Na3VO4], Tritón X-100 1X, 50 mM tris(hidroximetil)aminometano-HCl [Tris-HCl], 250 mM NaCl, 30 mM pirofosfato de sodio [Na4P2O7], 5 mM ácido etilendiaminotetraacético [EDTA], 100 mM fluoruro de sodio [NaF], 1 mM ditiotreitol [DTT], cóctel inhibidor de proteasas [PIC] 1X) empleando 3 mL por miligramo de tejido sinovial. Posteriormente las preparaciones se incubaron en hielo durante 30 minutos y se centrifugaron a 10000 x g a 4 ºC. Las PS se recogieron del sobrenadante, se determinó su concentración mediante el método de Bradford (Bio-Rad, Hercules, California, USA) y se almacenaron en alícuotas a -80 ºC. La concentración de las PS se ajustó a 10 mg/mL en 0.05 M buffer fosfato de potasio pH 7.4 con 0.2 mM EDTA antes de la adición de 1 mM L-Hci-tiolactona, concentración determinada como óptima para la homocisteinilación en experimentos previos. La reacción se llevó a cabo durante 16 h a 37 ºC 285 para generar PS N-ε-homocisteiniladas (Hci-PS). En paralelo se incubó una muestra de PS siguiendo la metodología anterior, pero en ausencia de L-Hci-tiolactona para su uso como antígeno control (CTR-PS). También se modificó HSA de forma similar a las PS pero empleando 0.4 mM L-Hci-tiolactona (Hci-HSA) 285,287, concentración a la cual se generó un nivel de homocisteínas similar al observado en las PS. La Hci-HSA se utilizó como proteína control de la modificación. Las preparaciones se filtraron mediante un sistema Amicon (Merck Millipore, Darmstadt, Germany) usando filtros de 3 kDa como punto de corte para las PS y de 30 kDa para la HSA a 5000 revoluciones por minuto (rpm) durante 30 min y a 4 ºC para eliminar la L-Hci-tiolactona sin reaccionar. Finalmente, se cambió el buffer de las proteínas por PBS 1X pH 9, se centrifugaron de nuevo como se ha descrito y se midió su concentración con el método de Bradford (Bio-Rad, Hercules, California, USA) antes de almacenarse a -20 ºC. 4. VERIFICACIÓN DE LA MODIFICACIÓN DE PROTEÍNAS Y PÉPTIDOS Tras la generación de las modificaciones postraduccionales mencionadas en la sección anterior se procedió a verificar la correcta formación de las estructuras correspondientes a cada modificación. En la Tabla 8 aparece un breve resumen de los protocolos utilizados para la caracterización de la formación de las estructuras correspondientes a cada modificación postraduccional. Además, en casos seleccionados se modificó y se caracterizó una proteína estándar a modo de control de calidad de la reacción. Lorena Rodríguez Martínez 52 Tabla 6. Metodología empleada en la verificación de la formación de las estructuras correspondientes para cada modificación postraduccional estudiada. m/z = relación masa/carga, hexil-MAA = 1-hexil-4-metil-1,4-dihidro-3,5-piridindicarboxaldeído, 1H-RMN = resonancia magnética nuclear de protón, λexc = longitud de onda de excitación, Abs.máx = absorbancia máxima de medición, PTP = productos de tipo pentosidina, AGEs = productos de glicación avanzados. El resto de abreviaturas están disponibles en la Tabla 3. * Estas determinaciones han sido realizadas por los proveedores Antígeno modificado Técnicas Parámetros Resultado Ref. c(péptido) Espectrometría de masas* - Cambio m/z modificado vs. control indicativo de la presencia de citrulina Ac(aminoácido) Espectrometría de masas* - Cambio m/z modificado vs. control indicativo de la presencia de lisina/ornitina acetilada MAA-HSA Fluorescencia Estándar hexil-MAA caracterizado por 1H-RMN Estructura MAA: λexc = 398 nm Curva calibrado con hexil-MAA para calcular ratio modificado vs. control indicativo de formación de MAA 32,294 HOCl-CII y GLI-CII SDS-PAGE 4%-8% condiciones reductoras Cambio migración y patrón de bandas informativo de la integridad estructural y del peso molecular 30 Fluorescencia Triptófano: λexc = 295nm PTP: λexc = 335 nm AGEs: λexc = 370 nm Ratio modificado vs. control indicativo de pérdida de estructura (triptófano), formación de PTP, formación de AGEs Espectrofotometría Abs.máx = 370 nm Nivel de grupos carbonilo 3-NT-PS Fluorescencia Estándar 3-NT comercial: λexc = 275 nm Pérdida de tirosina 35,301 Espectrofotometría Estándar 3-NT comercial: Abs.máx = 420 nm Nivel de tirosina nitrada Inmunoensayo Comercial Nivel de tirosina nitrada 3-NT-(péptido) Espectrometría de masas* - Cambio m/z modificado vs. control indicativo de la presencia de tirosina nitrada Hci-PS Inmunoensayo Comercial Nivel de homocisteína 302 MATERIAL Y MÉTODOS 59 Las condiciones de cada ELISA casero variaron en función de la modificación postraduccional frente a la cual se determinaron los anticuerpos de acuerdo con la metodología publicada y con las variaciones introducidas en la puesta a punto con el objetivo de aumentar la sensibilidad del ensayo. En la Tabla 7 se recogen los parámetros más relevantes de cada ELISA empleado en este trabajo. Los protocolos de ELISA específicos para cada autoanticuerpo se detallan en el apartado correspondiente. Todas las determinaciones de anticuerpos incluyeron sueros de pacientes y controles analizados por duplicado. En una misma placa se evaluaron tanto sueros de pacientes como de controles para evitar posibles sesgos en las determinaciones. Además, se empleó el mismo lote de proteína modificada y proteína control para evitar posibles sesgos derivados de la preparación del antígeno. En cada placa se incluyó también un control positivo y un control negativo específicos para cada antígeno modificado y para cada isotipo de anticuerpo secundario obtenidos de los análisis previos de reactividad, así como un blanco. Los coeficientes de variación (CV) intraensayo e interensayo con un valor < 15% se consideraron aceptables. En los ensayos ELISA para los anticuerpos anti-cH4/39-40, anti-MAA y anti- MDA se incluyeron en cada placa dos diluciones de la curva de calibrado construida a partir de diluciones seriadas de una mezcla de sueros positivos que presentaban una reactividad elevada para cada anticuerpo secundario y para cada PTM como punto de control adicional para evaluar posibles sesgos en las determinaciones a lo largo del tiempo. La OD específica de cada PTM se calculó restando el valor obtenido para la proteína no modificada del valor obtenido para la proteína modificada. Las OD específicas se transformaron en títulos de anticuerpo expresados como UA tras su interpolación en una curva de calibrado como se detalla en la sección de análisis estadístico. La reactividad frente a CII carbonilado, PS nitradas, péptidos nitrados y PS homocisteiniladas se analizó empleando las OD en lugar de utilizar títulos de anticuerpos tal y como han hecho los trabajos previos 35,37,38. Lorena Rodríguez Martínez 60 Tabla 7. Parámetros de los ELISA empleados para la determinación de anticuerpos frente a modificaciones postraduccionales. Anti-CCP: anticuerpos anti-péptidos cíclicos citrulinados, anti-CarP: anticuerpos anti-proteínas carbamiladas, anti-péptidos citrulinados: anticuerpos frente a los péptidos citrulinados incluidos en la Tabla 4, anti-péptidos acetilados: anticuerpos frente a un péptido derivado de MCV con lisina acetilada u ornitina acetilada en la posición 7, anti- MAA: anticuerpos anti-malondialdehído-acetaldehído, anti-MDA: anticuerpos anti-malondialdehído, anti-Carbo: anticuerpos anti-proteíans carboniladas, anti- Nitra: anticuerpos anti-proteínas/péptidos nitrados, anti-Hci: anticuerpos anti-proteínas homocisteiniladas. MCV = vimentina mutada citrulinada. AP = fosfatasa alcalina. HRP = peroxidasa de rábano. Anti-IgG (H+L) = anticuerpo frente a las cadenas pesadas y ligeras de las IgG humanas, anti-IgG Fcγ = anticuerpo frente a la región Fc de la cadena γ específica de IgG humana, anti-IgM 5μ Fc = anticuerpo frente a la región 5μ Fc específica de IgM humana, anti-IgA cadena α = anticuerpo frente a la cadena α específica de IgA humana, (Fab’)2 anti-IgG = anticuerpo frente a IgG humana compuesto únicamente por la región (Fab’)2. *Los reactivos para estos ELISA fueron cedidos por la casa comercial pero todavía no se comercializan. Anticuerpo Tipo ELISA Antígeno modificado Antígeno control Bloqueo Dilución suero Anticuerpo secundario Dilución Ab 2º Punto de corte Anti-CCP comercial CCP2 - - 1:100 Anti-IgG-AP - >5 UA/mL Anti-CarP casero CarP-FBS CTR-FBS 1% BSA 1:50 Anti-IgG (H+L)-AP 1:5000 Percentil 98 Anti-péptidos citruilnados casero cH4/39-40 H4/39-40 2% BSA 1:100 Anti-IgG (H+L)-AP 1:5000 Media+2DS casero cFibβ36-52 - 2% BSA 1:50 Anti-IgG (H+L)-AP 1:10000 Media+2DS casero cFibα27-43, CEP-1, cVim60-75, cVim2-17 - 2% BSA 1:100 Anti-IgG (H+L)-AP 1:10000 Media+2DS Anti-péptidos acetilados comercial* AcLys, AcOrn - BSA 1:100 Anti-IgG-HRP - Percentil 98 Anti-MAA casero MAA-HSA CTR-HSA 2% BSA 1:100 Anti-IgG (H+L)-AP Anti-IgM 5μ Fc-AP Anti-IgA cadena α-AP 1:5000 1:8000 1:1000 Percentil 98 Anti-MDA casero MDA-BSA CTR-BSA 3% BSA 1:100 (Fab’)2 anti-IgG (H+L)-AP Anti-IgM 5μ Fc-AP 1:1000 1:2000 Percentil 98 Anti-Carbo casero HOCl-CII, GLI-CII CTR-CII 2% leche 1:100 Anti-IgG Fcγ-AP 1:2000 - Anti-Nitra casero 3-NT-PS CTR-PS 1% BSA 1:100 (Fab’)2 anti-IgG (H+L)-AP 1:10000 - casero Mezcla 3-NT-pep Mezcla CTR-pep 1% BSA 1:100 Anti-IgG (H+L)-AP 1:5000 - Anti-Hci casero Hci-PS CTR-PS 0.5% gelatina 1:200 (Fab’)2 anti-IgG (H+L)-AP 1:5000 - MATERIAL Y MÉTODOS 61 6.1. ANTICUERPOS FRENTE A PROTEÍNAS CARBAMILADAS Los datos de anti-CarP para los pacientes del Hospital Clínico Universitario de Santiago, del Hospital Universitario La Paz y del Hospital Universitario La Princesa estaban disponibles de estudios previos realizados por nuestro grupo 70,176. Estos anticuerpos se determinaron con el ELISA casero que emplea como antígeno suero fetal de ternero (FBS) carbamilado in vitro (CaFBS). Brevemente, se añadieron 50 µL por pocillo de CaFBS o de FBS no modificado a una concentración de 10 µg/mL en buffer 0.1 M carbonato pH 9.6 a placas de 96 pocillos con el fondo plano Nunc Maxisorp y se incubaron toda la noche a 4ºC en agitación. Se realizaron 3 lavados con 200 µL de PBS-Tween20 0.05% (PBS-T) antes de bloquear con 100 µL por pocillo de 1% BSA en PBS (1% BSA+PBS) durante 6 h a 4ºC en agitación. Tras un paso de lavado se añadieron 50 μL de suero diluido 1:50 en 1% BSA+PBS-T. Las placas se incubaron en hielo durante toda la noche, se lavaron 3 veces con PBS-T y a continuación se añadieron 50 μL del anticuerpo secundario frente a IgG humana (cadenas pesadas y ligeras, H+L, #109- 055-003) conjugado con AP a una dilución 1:5000 en 1% BSA+PBS-T. Después de 3.5 h de incubación en hielo, se realizó un último paso de lavado antes de añadir 100 μL del sustrato. 6.2. ANTICUERPOS FRENTE A ANTÍGENOS CITRULINADOS ESPECÍFICOS 6.2.1. Anticuerpos frente a un péptido citrulinado de la histona H4 Para evaluar la reactividad frente al péptido cH4/39-40 de la histona H4 se empleó el protocolo descrito 217 con mínimas modificaciones. Se añadieron 100 μL del péptido citrulinado cH4/39-40 o del péptido control H4/39-40 disueltos en buffer 50 mM carbonato pH 9.6 a 25 μg/mL. Las placas se incubaron a 4ºC durante toda la noche, se lavaron 3 veces con 200 μL de PBS-T y se bloquearon con 200 μl de 2% BSA+PBS durante 2 h a temperatura ambiente. Los sueros se diluyeron 1:100 en 1% BSA+ PBS y se añadieron 100 μL/pocillo seguido de una incubación de 2 h a temperatura ambiente. Tras 3 lavados se añadieron 100 μL de un anticuerpo secundario frente a IgG (H+L) conjugado con AP (#109-055-003) diluido 1:5000 en 1% BSA+PBS y se incubó 1 h a temperatura ambiente. Finalmente las placas se lavaron 5 veces antes de añadir 100 μL de pNPP. 6.2.2. Anticuerpos frente a péptidos citrulinados de enolasa, vimentina y fibrinógeno Los datos de estado para los anticuerpos que reconocen los péptidos CEP-1, cVim60-75, cVim2-17, cFibβ36-52 y cFibα27-43 estaban disponibles antes de la realización de esta tesis doctoral. La determinación de anticuerpos frente a los péptidos CEP-1 y cVim60-75 se ha descrito en trabajos previos realizados por el grupo 291,317. La determinación de anticuerpos frente a los péptidos cVim2-17, cFibβ36-52 y cFibα27-43 se realizó mediante ELISAs siguiendo la metodología previamente publicada 144 y se describe aquí brevemente (A. Montes, no publicado). Los péptidos se utilizaron a 10 μg/mL en 100 μL/pocillo. Los sueros se diluyeron 1:50 en el ensayo con el péptido cFibβ36-52 y 1:100 para el resto de péptidos en buffer de radioinmunoensayo (RIA: 1% BSA, 350 mM NaCl, 10 mM Tris-HCl pH 7.6, 1% Triton X-100, 0.5% desoxicolato de sodio, 0.1% SDS) (Sigma-Aldrich, St.Louis, Missouri, USA) y 100 μL de esta dilución se incubaron 2 h a temperatura ambiente. El anticuerpo secundario utilizado era anti-IgG (H+L) conjugado con AP (#109-055-003) diluido 1:10000 Lorena Rodríguez Martínez 62 en buffer RIA. El punto de corte se calculó para cada péptido citrulinado por separado como el valor medio del título de anticuerpos (UA) para los controles sanos más 2 veces la desviación estándar (DS). 6.3. ANTICUERPOS FRENTE A PÉPTIDOS ACETILADOS La detección de autoanticuerpos del isotipo IgG frente a los péptidos de AcLys (anti-AcLys) y de AcOrn (anti-AcOrn) se realizó siguiendo el protocolo de Orgentec (Orgentec Diagnostika GmbH, Mainz, Germany) 44 y empleando los reactivos provenientes de dos lotes, que incluyen buffer de lavado y de dilución de muestras, anticuerpo secundario frente a IgG humana conjugado con HRP, sustrato 3,3′,5,5′-tetrametilbencidina (TMB) y disolución de parada de la reacción enzimática. No se incluyeron péptidos control sin la modificación en los respectivos aminoácidos dada la baja reactividad encontrada frente a ellos en un estudio previo 44. Brevemente, las placas que contenían cada uno de los péptidos acetilados y el resto de reactivos se dejaron atemperar antes de su uso. Los sueros se diluyeron 1:100 en el buffer de dilución proporcionado y se añadieron 100 μL a la placa junto con los puntos de la curva de calibrado y los controles del kit. Tras una incubación de 30 min a temperatura ambiente las placas se lavaron 3 veces con 300 μL del buffer de lavado y se añadió el anticuerpo secundario frente a IgG conjugado con HRP (100 μL) seguido de una incubación de 15 min a temperatura ambiente. Las placas se lavaron de nuevo antes de añadir 100 μL del sustrato TMB, que se dejó actuar durante 15 min a temperatura ambiente. Finalmente se añadieron 100 μL de la disolución de parada y tras 5 min se procedió a la lectura de las placas. El punto de corte del kit viene establecido en 20 UA/mL. Puesto que se tuvo que modificar la calibración, se decidió emplear el suero de controles recogidos en el Hospital Clínico Universitario de Santiago para obtener un nuevo punto de corte tal y como se realizó para el resto de autoanticuerpos. Usando el percentil 98 de la reactividad de los controles se estableció un punto de corte de 64 UA/mL para los anticuerpos anti-AcLys y de 55 UA/mL para los anticuerpos anti-AcOrn. 6.4. ANTICUERPOS FRENTE A ADUCTOS DE MALONDIALDEHÍDO-ACETALDEHÍDO Los anticuerpos anti-MAA se determinaron mediante un ELISA indirecto realizando todos los pasos en agitación siguiendo el protocolo previamente descrito 32. En cada pocillo, se añadieron 100 μL de MAA-HSA modificada (reacción de modificación con ratio 2:1) o HSA no modificada a 20 μg/mL en 0.1 M buffer carbonato pH 9.6 toda la noche a 4ºC. Las placas se lavaron 3 veces con 200 μL de PBS-T y se bloquearon con 200 μL de 2% BSA+PBS durante 2 h a 4 ºC. Después de otro paso de lavado se añadieron 100 μL de suero diluido 1:100 en 1% BSA+PBS-T, incubándose toda la noche a 4 ºC. Tras otro lavado, se añadieron 100 μL de uno de los anticuerpos secundarios conjugados con AP dirigidos frente a: IgG (H+L, #109-055-003), IgM (específico de las cadenas pesadas μ de la región constante Fc, 5μ Fc, #109-055-043) o IgA (específico de las cadenas α, #109-055-011) diluidos 1:5000, 1:8000 y 1:1000 respectivamente en 1% BSA+PBS-T. Tras 1 h de incubación a temperatura ambiente, se realizó un último paso de lavado antes de añadir 100 μL del sustrato. Los sueros se consideraron positivos para valores de títulos de anticuerpo en UA superiores al percentil 98 de los títulos obtenidos para los controles. MATERIAL Y MÉTODOS 63 Se probaron otras condiciones para analizar los anticuerpos frente a aductos MAA: utilizar como antígeno MAA-HSA modificada con un ratio 4:1, bloquear con caseína 2% en agua ultrapura obtenida de un sistema de purificación de agua MilliQ Advantage A10 Total Organic Carbon (Merck KGaA, Darmstadt, Alemania) durante 1.5 horas a temperatura ambiente; diluir los sueros en caseína 1% seguidos de una incubación de 1.5 h a temperatura ambiente; y utilizar como anticuerpo secundario un anticuerpo frente a IgG específico de la cadena γ de la región constante, (Fcγ, #109-055-008) conjugado con AP y diluído 1:5000 en caseína 2%. 6.5. ANTICUERPOS FRENTE A ADUCTOS DE MALONDIALDEHÍDO Los anticuerpos anti-MDA se determinaron mediante un ELISA indirecto empleando como antígeno MDA-BSA comercial y siguiendo el protocolo descrito en un trabajo previo 33 con pequeñas variaciones. La BSA modificada o nativa se añadió (50 μL) a una concentración de 3 μg/mL en PBS 1X pH 7.4 y se dejó incubar toda la noche a 4ºC. Tras un lavado con 200 μL de PBS-T se bloquearon las placas con 150 μl de 3% BSA+PBS durante 1 h a temperatura ambiente sin agitación. Después de otro lavado se añadieron los sueros (50 μL) a una dilución 1:100 en 1% BSA+PBS y se incubaron 1.5 h a temperatura ambiente en agitación. Las placas se lavaron de nuevo 3 veces antes de añadir 50 μL de un anticuerpo formado por el fragmento que contiene las dos regiones de unión a antígeno, (Fab’)2 dirigido frente a IgG (H+L) (#309- 056-003) o de un anticuerpo completo frente a IgM (5μ Fc, #109-055-043), ambos conjugados con AP, a una dilución de 1:1000 y 1:2000 en 1% BSA+PBS, respectivamente. Tras 1 h de incubación a temperatura ambiente sin agitación se realizaron 4 lavados antes de añadir 100 μL de pNPP, que se incubó durante 60 min antes de la lectura de las placas. El punto de corte para definir la positividad se estableció en percentil 98 de los títulos en UA obtenidos para los controles. 6.6. ANTICUERPOS FRENTE A ESPECIES CARBONILADAS DE COLÁGENO TIPO II La determinación de anticuerpos frente a CII carbonilado siguió el protocolo de ELISA indirecto descrito previamente 30,37. En breve, se incubaron 100 μL/pocillo de HOCl-CII, GLICII o CTR-CII a una concentración de 5 μg/mL en PBS pH 7.4 durante toda la noche a 4 ºC. Después de realizar 3 lavados con 200 μL de PBS-T las placas se bloquearon con leche desgrasada al 2% en PBS durante 2 h a temperatura ambiente. Tras otro paso de lavado, se añadieron los sueros a una dilución 1:100 en 100 μL de buffer de bloqueo y se incubaron 2 h a 37 ºC. Después de lavar las placas, se añadieron 100 μL de un anticuerpo secundario frente a IgG Fcγ conjugado con AP (#109-055-008) a una dilución 1:2000 en buffer de bloqueo. Al finalizar la incubación de 2 h a 37 ºC, se lavaron de nuevo las placas antes de añadir 100 μL de pNPP. 6.7. ANTICUERPOS FRENTE A PROTEÍNAS NITRADAS La evaluación de anticuerpos anti-Nitra se realizó con un ELISA casero 35. A cada pocillo se añadieron 50 μL de 3-NT-PS o CTR-PS a una concentración de 2.5 μg/mL en buffer 0.1 M carbonato pH 9.6 y las placas se incubaron durante toda la noche a 4 ºC. El bloqueo se realizó tras lavar 3 veces con PBS-T añadiendo 100 μL de 1% BSA+PBS-T y dejando incubar Lorena Rodríguez Martínez 64 durante 2 h a temperatura ambiente. Posteriormente se lavaron las placas y se añadieron 50 μL de suero diluido 1:100 en buffer bloqueo que se dejó incubar otras 2 h a temperatura ambiente. Después de un paso adicional de lavado se añadieron 50 μL de un anticuerpo secundario F(ab’)2 frente a IgG (H+L) conjugado con AP (#309-056-003) a una dilución 1:10000 en buffer bloqueo. Tras incubar 1 h a temperatura ambiente se lavaron las placas y se añadió a cada pocillo 100 μL de pNPP. 6.8. ANTICUERPOS FRENTE A PÉPTIDOS NITRADOS La presencia de anticuerpos anti-Nitra se evaluó también empleando péptidos nitrados como antígeno en un ELISA casero 278. En primer lugar, se mezclaron los 8 péptidos nitrados por un lado y los 8 péptidos nativos correspondientes por otro lado, todos a la misma concentración en la mezcla. A cada pocillo se añadieron 50 μL de la mezcla de péptidos nitrados o nativos diluidos a 20 μg/mL (2.5 μg/mL de cada péptido en la mezcla) en buffer 0.1 M carbonato pH 9.6 dejando incubar las placas a 4 ºC durante toda la noche. El bloqueo y la adición de los sueros se realizaron como se describe en el protocolo que emplea PS nitradas y control. Posteriormente se añadieron 50 μL de un anticuerpo secundario frente a IgG (H+L) conjugado con la AP (#109-055-003) a una dilución 1:5000 en buffer bloqueo y se dejó incubar a 2 h a temperatura ambiente antes de realizar el último paso de lavado y de añadir 100 μL de pNPP. 6.9. ANTICUERPOS FRENTE A PROTEÍNAS HOMOCISTEINILADAS La presencia de anticuerpos anti-Hci que reconocen la N-ε-homocisteína se determinó mediante un ELISA casero 38. Primero, se añadieron 100 μL de Hci-PS o CTR-PS diluidas a 10 μg/mL en buffer 0.1 M carbonato pH 9.6 y se incubaron a 4 ºC durante toda la noche. A continuación, se lavaron las placas 3 veces con PBS-T y se bloquearon con 200 μL de gelatina de pez 0.5% en PBS durante 6 h a 4 ºC. Tras otro paso de lavado se añadieron 100 μL de suero diluido 1:200 en 1% BSA+PBS-T a 4 ºC durante toda la noche. Después de otro lavado, se adicionaron 100 μL de un anticuerpo secundario F(ab’)2 frente a IgG (H+L) conjugado con AP (#309-056-003) a una dilución 1:20000 en 1% BSA+PBS-T. Las placas se incubaron a 4 ºC durante 3.5 h y se lavaron de nuevo antes de añadir 100 μL de pNPP. 7. GENOTIPADO Los datos de tipado de las muestras del Hospital Clínico Universitario de Santiago estaban disponibles con anterioridad a la realización de esta tesis doctoral 317. Los alelos del HLADRB1 se determinaron mediante un método de tipado basado en secuenciación utilizando el kit AlleleSEQR HLA–DRB1 Typing Kit (Abbott Diagnostics, Abbott Park, Illinois, USA). Este kit discrimina los alelos mediante la secuenciación del exón 2 del locus DRB1 utilizando el software Assign-SBT 3.2.7 (Abbott Diagnostics, Abbott Park, Illinois, USA) para la interpretación de los resultados. Los alelos que no se resolvieron en este paso se volvieron a secuenciar tras amplificación con cebadores específicos de grupo (GSSP, group-specific sequencing primers). El tipado del SNP rs2476601 en el que se introduce el cambio C1858T en el gen PTPN22 se realizó con un ensayo TaqMan (Applied Biosystems, Foster City, California, USA). MATERIAL Y MÉTODOS 65 8. ANÁLISIS ESTADÍSTICO Los análisis estadísticos se realizaron con el software Statistica 7.0 (StatSoft Inc., Tulsa, Oklahoma, USA) excepto donde se indica otro software específico. Los valores de P inferiores a 0.05 se consideraron estadísticamente significativos. La representación gráfica de las variables cuantitativas se realizó empleando Statistica 7.0 o GraphPad Prism v5.01 (La Jolla, California, USA). 8.1. ANÁLISIS DESCRIPTIVO Las variables cuantitativas se representaron como el valor medio y la desviación estándar (DS) cuando los datos se ajustaron a una distribución normal o como la mediana y el rango intercuartílico (IQR) si los datos no se ajustaron a dicha distribución. Por su parte, las variables cualitativas se representaron a partir de su frecuencia (%). La comparación de las variables cuantitativas se realizó con la prueba t de Student si cumplían criterios de normalidad o con la prueba U de Mann-Whitney en caso de no cumplir con esos criterios. La prueba chi-cuadrado (χ2) se empleó para comparar las frecuencias de las variables cualitativas en muestras independientes, mientras que para muestras pareadas se empleó la prueba McNemar. La reactividad de los anticuerpos medida como OD en el ELISA se transformó en UA de títulos de anticuerpo interpolando los valores en una curva de regresión logística de 4 parámetros empleando el paquete drc 318 del software R 3.4.1 (R Foundation for Statistical Computing, Vienna, Austria). La corrección de la variabilidad detectada entre los lotes del kit para determinar los anticuerpos frente a péptidos acetilados se realizó mediante una normalización por cuantiles de las OD. Las relaciones entre los diferentes anticuerpos se evaluaron empleando el coeficiente de correlación rho (ρ) de Spearman y el coeficiente de concordancia gamma (γ) de Goodman y Kruskal. El coeficiente ρ muestra el grado de correlación entre los títulos de los anticuerpos mientras que el coeficiente γ indica el grado de concordancia en el estado para cada anticuerpo definido como positivo o negativo. Ambos coeficientes pueden tomar valores desde +1 si la asociación entre las variables es positiva, hasta -1 si la asociación es negativa. 8.2. ANÁLISIS DE COMPONENTES PRINCIPALES El análisis de componentes principales (ACP) se empleó para reducir el número de anticuerpos al combinar aquellos que poseen información redundante en una nueva variable (componente) no correlacionada con el resto. El número de componentes generados en el ACP es por lo tanto menor que el número de variables iniciales. Al reducir el número de variables que explican la varianza de una muestra se reduce también la dimensionalidad de los datos facilitando su manejo. El estatus para cada uno de los seis anticuerpos frente a antígenos citrulinados específicos (especificidades finas) se introdujo como variable en el análisis. Además, los anticuerpos anti-CCP se analizaron como variable suplementaria. Por otra parte, la matriz de concordancias de los anticuerpos se empleó para representar cada anticuerpo en un gráfico bidimensional empleando el escalado multidimensional (MDS, Multidimensional Scaling por sus siglas en inglés) en el que la distancia que separa dos anticuerpos (variables) está inversamente relacionada con su grado de correlación. Adicionalmente, la representación de la relación entre los niveles de los anticuerpos se obtuvo con MDS a partir de la matriz de correlaciones obtenida de los pacientes positivos para los dos anticuerpos analizados. Lorena Rodríguez Martínez 66 8.3. ANÁLISIS DE REGRESIÓN La asociación de la presencia de los anticuerpos con las características clínicas de los pacientes o con los genotipos se analizó mediante regresión logística multivariante con variables de confusión. En estos análisis se consideraron sólo los efectos principales (sin interacciones). Se presentan la odds ratio (OR) de los anticuerpos y su intervalo de confianza del 95% (IC 95%). Las variables de confusión consideradas no fueron las mismas en todos los apartados del estudio, lo que está indicado al presentar los resultados. Habitualmente, se incluyeron la edad de inicio de los síntomas, el tiempo de evolución de la enfermedad, el sexo y el hospital o cohorte de origen. El tiempo de evolución se considera el tiempo desde la primera visita al reumatólogo hasta la inclusión en el estudio. Además, el estado (positivo o negativo) para los anticuerpos anti-CCP o el FR se incluyó como covariables para evaluar la independencia de las asociaciones de los otros autoanticuerpos. En los análisis de los factores genéticos se consideraron dos niveles para el alelo o alelos de riesgo, portador o no portador, sin diferenciar entre homocigotos y heterocigotos. La mayoría de los análisis consideraron dos niveles para el estado de cada anticuerpo, negativo o positivo, aunque en otros análisis se consideraron 3 niveles siguiendo el protocolo usado en el desarrollo de los criterios ACR/EULAR del 2010 para la clasificación de la AR 128. Estos tres niveles se definieron como positivo por encima de 3 veces el punto de corte del ensayo para ese anticuerpo (positivo alto), positivo por debajo de 3 veces el punto de corte (positivo bajo) y negativo. El estado negativo para el anticuerpo o combinaciones de anticuerpos se tomó siempre como referencia en los análisis. Algunos de los análisis para evaluar el papel de los anticuerpos anti-AcOrn se hicieron mediante regresión logística. Las variables fueron las puntuaciones otorgadas a los anticuerpos según los criterios de clasificación ACR/EULAR 2010 (2 o 3 puntos), o una puntuación igual al número de anticuerpos (presencia de 1, 2 o 3 anticuerpos considerando anti-CCP, FR y anti-AcOrn), o una combinación de los dos modelos. Como referencia en estos tres modelos serológicos se tomó la ausencia simultánea de anticuerpos anti-CCP, FR y anti-AcOrn. Además, el impacto en la clasificación de los tres modelos se evaluó teniendo en cuenta el componente no serológico de los criterios de clasificación ACR/EULAR 2010. Para ello se emplearon dos estrategias distintas. La primera consistió en sumar las puntuaciones no serológica y serológica. En este análisis, los criterios ACR/EULAR del 2010 se compararon con una puntuación basada en la concordancia: 5 puntos para la presencia de 3 anticuerpos, 3 puntos para 2 anticuerpos, 1 punto para 1 anticuerpo y 0 puntos para la ausencia de anticuerpos; y otra puntuación con una combinación de concordancia con los criterios del 2010: 5 puntos para la presencia de 3 o 2 anticuerpos con títulos altos de anti-CCP o FR, 3 puntos para 3 o 2 anticuerpos con títulos bajos de anti-CCP o FR, 1 punto para la presencia de 1 anticuerpo independientemente de los títulos y 0 puntos para el resto. La segunda estrategia consistió en clasificar los pacientes mediante regresión logística empleando como variables la parte serológica de cada modelo y cada uno de los componentes de la parte no serológica (articulaciones implicadas, reactantes de fase aguda y duración de los síntomas) y fijando la sensibilidad en el 80%. El nivel de ajuste de los modelos de regresión logística se evaluó empleando dos estadísticos, la R2 de Nagelkerke y el Criterio de Información de Akaike (AIC). La R2 de Nagelkerke estima el valor predictivo del modelo como la reducción proporcional del error de MATERIAL Y MÉTODOS 67 la varianza, de forma que cuanto mayor es su valor mayor es la reducción del error y por lo tanto mejor es el ajuste del modelo a los datos. El AIC realiza una estimación relativa de la información que se pierde en cada modelo por lo que valores más pequeños indican un mejor modelo. Una diferencia >2 en el valor de AIC indica que un modelo se ajusta mejor a los datos en comparación con el otro, pero la diferencia no se considera notable hasta que es >10 319. Estos análisis se realizaron empleando el software Statistica 7.0 (StatSoft Inc., Tulsa, Oklahoma, USA) o empleando la aplicación Jamovi de R 320,321. 8.4. ANÁLISIS DEL RENDIMIENTO DIAGNÓSTICO Los parámetros utilizados para evaluar la utilidad de los anticuerpos o combinaciones de anticuerpos en la clasificación de los pacientes con EA fueron la sensibilidad, la especificidad, el valor predictivo positivo (VPP), el valor predictivo negativo (VPN), la razón de verosimilitud positiva (RV+), la razón de verosimilitud negativa (RV-) y el área bajo la curva (AUC) de la curva operativa del receptor (ROC). La sensibilidad indica la capacidad de la prueba diagnóstica para detectar un sujeto que padece la enfermedad, mientras que la especificidad es la capacidad de la prueba diagnóstica para detectar un sujeto sin la enfermedad. Los valores predictivos indican la probabilidad de padecer o no una enfermedad una vez que se conoce el resultado de la prueba diagnóstica. Estos valores miden la eficacia real de una prueba diagnóstica y dependen de la prevalencia de la enfermedad en la población. La razón de verosimilitud combina la sensibilidad y la especificidad de una prueba diagnóstica. Se define como la relación de la probabilidad de obtener un resultado positivo o negativo en sujetos enfermos y la probabilidad de obtener ese mismo resultado en sujetos sin la enfermedad. Una prueba diagnóstica útil debe tener un valor de RV- cercano a 0 y un valor de RV+ alto. La curva ROC se construye mediante la representación de la sensibilidad de una prueba diagnóstica en el eje de las ordenadas y el valor 1-especificidad en el eje de abscisas para diferentes puntos de corte de la prueba diagnóstica. La representación de estos valores es una curva que contiene un área determinada denominada AUC. Una AUC de 0.5 indica que la prueba no tiene valor diagnóstico, mientras que una AUC de 1 indica un valor diagnóstico perfecto. Las curvas ROC de las que se obtuvieron los valores de AUC se realizaron el programa SPSS 15.0 (SPSS Inc., Chicago, Illinois, USA). Los resultados de la clasificación de pacientes a partir de modelos de clasificación que combinan un componente serológico y no serológico se expresaron como sensibilidad (verdaderos positivos/pacientes con AR observados), especificidad (verdaderos negativos/pacientes sin AR observados) y exactitud ([verdaderos positivos + verdaderos negativos]/todos los pacientes). Los valores de sensibilidad y especificidad se compararon con la prueba de McNemar para tablas de contingencia pareadas. 8.5. ANÁLISIS DE LA MORTALIDAD DE LOS CONTROLES SANOS Se utilizó la valoración del estado de salud de los controles mediante un análisis de la mortalidad como una garantía adicional 322. Para ello se calculó la tasa de mortalidad estandarizada (SMR, Standardized Mortality Rate por sus siglas en inglés) que corresponde a la relación entre las defunciones observadas en los controles y las defunciones esperadas en Lorena Rodríguez Martínez 68 una población de referencia según la tasa de mortalidad estratificada por sexo y edad. Una SMR >1 indica que la mortalidad de los controles es superior a la de la población de referencia, y por lo tanto su estado de salud es peor que el estado de salud general y podrían no ser considerados como sujetos sanos. Como población de referencia se seleccionó la de la provincia de A Coruña, donde la mayoría de los controles incluidos en este proyecto tenían su residencia. Los controles se reclutaron desde el 2001 hasta el 2009 y la valoración del estado final se realizó en noviembre de 2015. Como punto final para cada individuo se consideró el año de fallecimiento o la fecha de la última visita o análisis médico recopilada en la base de datos del JANUS (datos censurados). No se analizaron las causas específicas de fallecimiento ya que la finalidad de este análisis era obtener una idea general del estado de salud. El año de referencia para evaluar la SMR fue 2013, calculado como el promedio del último año en el que se disponían datos de los controles. Las tasas de mortalidad de la población de A Coruña se obtuvieron del Instituto Nacional de Estadística (INE), expresadas como defunciones por cada 1000 habitantes en función del sexo y de la edad agrupada en categorías de 5 años. RESULTADOS 75 1.1. ANTICUERPOS FRENTE A ESPECIFICIDADES FINAS CITRULINADAS EN PACIENTES CON AR Y CONTROLES Los anticuerpos frente a un péptido citrulinado derivado de la histona H4 (cH4/39-40) se evaluaron en pacientes con AR y controles provenientes del Hospital Clínico Universitario de Santiago de los que se disponía de muestra de suero suficiente. Los pacientes con AR presentaban algunas características diferentes de las de los pacientes de las dos colecciones estudiadas en el trabajo que describió la inmunodominancia del péptido cH4/39-40 (Tabla 8): nuestros pacientes eran más jóvenes que los pacientes de la colección INA y la frecuencia de fumadores era notablemente más baja en comparación con las otras dos colecciones Además, nuestros pacientes pertenecen a un grupo étnico diferente de los pacientes de la colección INA. Tabla 8. Comparación de las características clínicas de los pacientes con AR utilizados para estudiar los anticuerpos anti-cH4/39-40 en Santiago y en Manitoba. Las variables de edad y tiempo de evolución se representan como la media y la DS mientras que el resto de variables se representan como porcentaje (%). Los datos de las colecciones de Manitoba e INA (Indigenous North American) se obtuvieron del trabajo de Meng y col. 217. Dato disponible para < 98% de los pacientes de la colección de Santiago: tiempo de evolución 95.6%, fumadores 92.1%, erosiones 95.2% y FR 96.0%. El primer valor de P corresponde a la comparación entre los pacientes con AR de las colecciones de Santiago y de Manitoba. El segundo valor de P muestra la comparación de los pacientes de la colección de Santiago y los de la colección INA. Características clínicas Santiago (n = 520) Manitoba (n = 116) INA ( n = 130) PSantiago vs Manitoba PSantiago vs INA Edad, años 61 (14) 59 (13) 46 (13) 0.16 <1.0x10-4 Tiempo de evolución de la enfermedad, años 14 (11) - - - - Grupo étnico Europeos Europeo- Americanos Indígenos Norteamericanos - - Mujeres 77 80 84 0.42 0.08 Fumadores 20 57 77 2.0x10-15 1.7x10-34 Erosiones 66 - - - - Anti-CCP positivo 64 67 69 0.54 0.28 FR positivo 60 - - - - La reactividad frente al péptido control (H4/39-40, el mismo péptido sin citrulinar) fue mínima tanto en los pacientes con AR como en los controles (Figura 8). En cambio, la reactividad frente el péptido citrulinado cH4/39-40 fue significativamente superior en los pacientes con AR en comparación con los controles (título de anticuerpos anti-cH4/39-40: mediana [IQR] = 3.01 [0.82-17.4] vs. 0.60 [0.33-1.07] en pacientes con AR y controles respectivamente; P = 2.5x10-38, Figura 8). Los niveles de anticuerpos anti-cH4/39-40 fueron notablemente más elevados en los pacientes anti-CCP positivos en comparación con los pacientes anti-CCP negativos (título de anticuerpos anti-cH4/39-40: mediana [IQR] = 11.67 [3.11-29.30] vs. 0.68 [0.36-1.27] en pacientes anti-CCP+ y anti-CCP- respectivamente; P = Lorena Rodríguez Martínez 76 2.8x10-55), y no se observaron diferencias entre los títulos detectados en los pacientes anti- CCP negativos y los controles. Figura 8. Niveles de anticuerpos frente al péptido control H4/39-40 y citrulinado cH4/39-40 en los pacientes con AR estratificados en función a su estado para los anticuerpos anti-CCP y en los controles de la colección de Santiago. La línea roja representa la mediana de los títulos (UA) en cada grupo. La sensibilidad detectada para los anticuerpos anti-cH4/39-40 en los pacientes con AR de Santiago fue del 48.1% en el total y del 72.8% en el subgrupo de pacientes con anticuerpos anti-CCP. Estas cifras son inferiores a las descritas previamente. Especialmente importante es el porcentaje en los anti-CCP positivos, inferior al 94.9% y al 92.2% descritos en los pacientes de la colección de Manitoba e INA respectivamente (P <1.1x10-4 para la comparación vs. Santiago) y que es la base para su propuesta inmunodominancia. 1.2. RELACIÓN ENTRE LOS AUTOANTICUERPOS ANTI-CH4/39-40 Y OTROS ANTICUERPOS FRENTE A ESPECIFICIDADES FINAS CITRULINADAS Los pacientes con AR de la colección de Santiago también disponían de información sobre el título y estado de otros anticuerpos frente a diferentes péptidos citrulinados (Tabla 9). Aproximadamente la mitad de los pacientes presentaron anticuerpos anti-cFibB36-52 y anticVim60-75, una fracción similar a la detectada para los anticuerpos anti-cH4/39-40. Los anticuerpos que reconocen el péptido citrulinado de la enolasa CEP-1 estuvieron presentes en un tercio de los pacientes, mientras que los anticuerpos anti-cFibA27-43 y anti-cVim2-17 fueron positivos en menos del 20% de los pacientes. La reactividad de los anticuerpos frente a RESULTADOS 77 las especificidades finas citrulinadas se encontró preferentemente en el subgrupo anti-CCP positivo (Tabla 9). Los anticuerpos más prevalentes en este subgrupo fueron los que reconocían el péptido cH4/39-40, pero estuvieron seguidos de cerca por los que reconocían cFibB36-52. Los demás anticuerpos presentaron frecuencias menores en este subgrupo de pacientes siguiendo la misma distribución que en el conjunto total de los pacientes (Tabla 9). Tabla 9. Prevalencia de los anticuerpos frente a diferentes especificidades finas en todos los pacientes con AR y en los pacientes anti-CCP positivos de la colección de Santiago. La prevalencia se representa como porcentaje (%). Los anticuerpos se muestran en orden descendente de prevalencia en el subgrupo AR anti-CCP positivo. El primer valor de P se ha calculado con la prueba de McNemar en todos los pacientes con AR, mientras que el segundo valor de P se ha calculado en los pacientes con AR anti-CCP positivos. AR Anticuerpos Todos anti-CCP+ P P anti-cH4/39-40 247 (48.1) 238 (72.8) ref ref anti-cFibB36-52 249 (48.0) 216 (64.9) 0.9 6.4x10-3 anti-cVim60-75 252 (48.6) 196 (58.9) 0.9 3.0x10-5 anti-CEP-1 169 (32.9) 157 (47.7) 1.6 x10-10 2.0 x10-12 anti-cFibA27-43 79 (15.2) 62 (18.6) 8.1 x10-33 2.4 x10-38 anti-cVim2-17 41 (7.9) 37 (11.1) 1.9 x10-43 3.9 x10-43 Los análisis previos no confirmaban de forma clara la inmunodominancia de los anticuerpos anti-cH4/39-40 en comparación con las otras especificidades finas. Para completar el estudio se exploró la relación de los seis anticuerpos frente a péptidos citrulinados entre sí y con los anticuerpos anti-CCP es un análisis de componentes principales (ACP). Este análisis mostró que los dos primeros componentes eran capaces de explicar cerca del 60% de la variabilidad total. El número de componentes necesarios para explicar el 80% de variabilidad fue cuatro. Por lo tanto, la reducción de 6 anticuerpos a 4 componentes principales indica que los anticuerpos no son redundantes. Otra representación gráfica de la relación entre los distintos ACPA más inexacta pero más sencilla de interpretar se obtuvo mediante MDS de la matriz de concordancias de los anticuerpos (Tabla 10). En este gráfico (Figura 9), los anticuerpos frente a péptidos citrulinados mostraron una dispersión considerable, sin subgrupos claramente definidos. Ni siquiera entre los anticuerpos que reconocen péptidos citrulinados derivados de la misma proteína, como los dirigidos frente a los péptidos cFibB36-52 y cFibA27-43 del fibrinógeno o los péptidos cVim2-17 y cVim60-75 de la vimentina, a pesar de que todos mostraron concordancias significativas. Cabe destacar que los anticuerpos frente a péptidos citrulinados más cercanos a los anti-CCP en la representación fueron los anticuerpos anti-cH4/39-40 Lorena Rodríguez Martínez 78 (Figura 9), lo que concuerda con la notable concordancia de los anti-cH4/39-40 (γ = 0.96) con los anti-CCP sobre la del resto de los anticuerpos. Tabla 10. Matriz de concordancias de los anticuerpos frente a especificidades finas citrulinadas y los anti-CCP. La concordancia se ha evaluado con el coeficiente γ de Goodman y Kruskal. cH4/39-40 cFibB36-52 cVim60-75 CEP-1 cFibA27-43 cVim2-17 CCP cH4/39-40 1.00 cFibB36-52 0.85 1.00 cVim60-75 0.60 0.52 1.00 CEP-1 0.80 0.64 0.49 1.00 cFibA27-43 0.67 0.91 0.53 0.32 1.00 cVim2-17 0.70 0.84 0.61 0.35 0.80 1.00 CCP 0.96 0.79 0.54 0.86 0.39 0.70 1.00 Figura 9. Representación de la concordancia de los anticuerpos frente a seis péptidos citrulinados y los anticuerpos anti-CCP en pacientes con AR de la colección de Santiago. Para facilitar la interpretación de la figura se muestra el nombre del antígeno que reconocen los anticuerpos. Un hallazgo similar se obtuvo al emplear la matriz de correlaciones en la representación MDS en lugar de la matriz de concordancias (Tabla 11 y Figura 10). La correlación entre los títulos de los anticuerpos anti-cH4/39-40 y anti-CCP fue similar a la observada entre estos últimos y Scatterplot 2D Final Configuration, dimension 1 vs. dimension 2 cH4/39-40 CEP1 cFibB36-52 cVim60-75 cFibA27-43 cVim2-17 CCP -1.2 -0.8 -0.4 0.0 0.4 0.8 1.2 1.6 Dimension 1 -1.2 -0.8 -0.4 0.0 0.4 0.8 1.2 1.6 Dimension 2 RESULTADOS 79 los anticuerpos anti-cFibB36-52 (rho = 0.40 y 0.41, respectivamente) aunque ambas fueron superiores a las observadas en el análisis de los otros anticuerpos. Tabla 11. Matriz de correlaciones de los anticuerpos frente a especificidades finas citrulinadas y los anti-CCP. Las correlaciones se han evaluado con el coeficiente de correlación ρ de Spearman en los pacientes con AR positivos para cada par de anticuerpos. En negrita se resaltan las correlaciones significativas. cH4/39-40 cFibB36-52 cVim60-75 CEP-1 cFibA27-43 cVim2-17 CCP cH4/39-40 1.00 cFibB36-52 0.43 1.00 cVim60-75 0.21 0.33 1.00 CEP-1 0.24 0.24 0.18 1.00 cFibA27-43 0.01 0.13 0.29 0.00 1.00 cVim2-17 -0.31 0.17 -0.04 -0.18 0.45 1.00 CCP 0.40 0.41 0.13 0.21 0.03 0.18 1.00 Figura 10. Representación de la correlación entre los títulos de los anticuerpos frente a seis péptidos citrulinados y los anticuerpos anti-CCP en pacientes con AR de la colección de Santiago. La distancia entre dos puntos en la representación tiene una relación inversa con la correlación de los dos anticuerpos. Para facilitar la interpretación de la figura se muestra el nombre del antígeno que reconocen los anticuerpos. Scatterplot 2D Final Configuration, dimension 1 vs. dimension 2 cH4/39-40 CEP1 cFibB36-52 cVim60-75 cFibA27-43 cVim2-17 CCP -1.2 -0.8 -0.4 0.0 0.4 0.8 1.2 1.6 Dimension 1 -1.2 -0.8 -0.4 0.0 0.4 0.8 1.2 1.6 Dimension 2 Lorena Rodríguez Martínez 80 Un análisis adicional consistió en comparar la prevalencia de los anticuerpos anti-CCP y frente a especificidades finas citrulinadas en los pacientes con AR de la colección de Santiago con las de otras colecciones de pacientes para evaluar la representatividad de los resultados anteriores (Tabla 12). En este análisis se observó que aunque existe variabilidad entre estudios, las tres especificidades finas más comunes en nuestros pacientes son las más comunes en las demás colecciones, pero ninguna de ellas muestra un papel destacado reproducible. Tabla 12. Prevalencia de los anticuerpos anti-CCP y los anticuerpos frente a péptidos citrulinados incluidos en el presente estudio en varias colecciones de pacientes con AR. La prevalencia de los anticuerpos se representa como porcentaje (%). Colecciones de pacientes con AR en las que se han evaluado alguno de los anticuerpos frente a especificidades finas citrulinadas de este trabajo: STG, Hospital Clínico Universitario de Santiago (España); CCH, Charing Cross Hospital (Reino Unido) 289; UUH, Umeå University Hospital (Suecia) 323; WTCCC, Wellcome Trust Case Control Consortium (Reino Unido) 323; NARAC, North American Rheumatoid Arthritis Consortium (E.E.U.U) 323; LEAC, Leiden Early Arthritis Clinic (Países Bajos) 324; MB, Medical Biobank (Suecia) 143; EIRA, Epidemiological Investigation of Rheumatoid Arthritis (Suecia) 325. Anticuerpos STG 520 CCH 102 UUH 538 LEAC 661 MB 199 EIRA 2825 WTCCC 1948 NARAC 1866 anti-CCP 64 71 69 53 75 64 78 72 anti-CEP-1 33 37 51 - 67 47 55 55 anti-cFibB36-52 48 - 34 36 65 46 46 48 anti-cVim60-75 49 - 46 26 29 44 64 60 anti-cFibA27-43 15 - - 14 - - - - anti-cVim2-17 8 - 12 6 11 31 30 51 1.3. RELACIÓN DE LOS ANTICUERPOS FRENTE A PÉPTIDOS CITRULINADOS CON CARACTERÍSTICAS DE LA AR Los anticuerpos anti-CCP se detectaron con mayor frecuencia en los pacientes con AR con erosiones en comparación con los que no tenían erosiones, así como en los portadores de algún alelo del EC respecto de los no portadores (Tabla 13 y Tabla 15). Sin embargo, la frecuencia fue similar independientemente del hábito tabáquico (Tabla 14) o de la presencia o ausencia del alelo de riesgo PTPN22 (Tabla 16). En cuanto a los anticuerpos frente a los péptidos citrulinados específicos, su frecuencia también fue en general significativamente mayor en los pacientes con erosiones y con EC (Tabla 13 y Tabla 15). Solo la frecuencia de los anticuerpos anti-cVim2-17 no estuvo significativamente aumentada en los pacientes con erosiones, y la de los anticuerpos anti-cFibA27-43 en los pacientes portadores del EC. La relación de los anticuerpos con el hábito tabáquico y con alelo de riesgo PTPN22 fue diferente, siendo los anticuerpos anti-cFib36-52 los únicos que mostraron una prevalencia RESULTADOS 81 significativamente superior en los pacientes fumadores en comparación con los no fumadores (Tabla 14) y los anticuerpos anti-cH4/39-40 en los pacientes portadores en comparación con los no portadores (Tabla 16). Los anticuerpos anti-CCP fueron los más fuertemente asociados con la presencia de erosiones y EC tanto en valor nominal como en significación, seguidos de los anticuerpos anti-cH4/39-40 y anti-CEP-1 en el caso de las erosiones y en el orden inverso en el caso del EC (Tabla 13 y Tabla 15). La asociación con las erosiones en el análisis condicional con los anticuerpos anti-CCP se mantuvo significativa para los anticuerpos anticH4/39-40 (OR = 1.87, IC 95% = 1.11 – 3.16; P = 0.02) y anti-CEP-1, aunque con un valor nominal y una significación menor. En cambio, la asociación con el EC se mantuvo para los anticuerpos anti-CEP-1, pero no para los anticuerpos anti-cH4/39-40 (OR = 1.06, IC 95% = 0.66 – 1.71; P = 0.8). La asociación de los anticuerpos anti-cH4/39-40 con el alelo de riesgo PTPN22 rozó la significación en el análisis condicional con los anticuerpos anti-CCP (OR = 1.69, IC 95% = 0.99 – 2.88; P = 0.056), mientras que la asociación con el tabaco siguió sin ser significativa (OR = 0.87, IC 95% = 0.48 – 1.59; P = 0.7). Tabla 13. Asociación de los anticuerpos anti-CCP y de los anticuerpos frente a péptidos citrulinados con la presencia de erosiones en pacientes con AR. Las frecuencias de los anticuerpos se representan como porcentaje (%). Positividad Sin erosiones (n = 170) Con erosiones (n = 325) OR (IC 95%) P anti-CCP 42.4 75.7 4.24 (2.85-6.30) 9.0x10-13 anti-cH4/39-40 28.4 58.6 3.57 (2.39-5.34) 5.4x10-10 anti-CEP-1 17.9 39.6 3.01 (1.91-4.75) 1.9x10-6 anti-cFibB36-52 34.7 54.3 2.24 (1.52-3.29) 4.0x10-5 anti-cVim60-75 39.4 52.8 1.72 (1.18-2.51) 4.9x10-3 anti-cFibA27-43 10 17.2 1.87 (1.05-3.34) 0.03 anti-cVim2-17 5.3 8.7 1.70 (0.78-3.69) 0.2 Tabla 14. Asociación de los anticuerpos anti-CCP y de los anticuerpos frente a péptidos citrulinados con el tabaquismo en pacientes con AR. Las frecuencias de los anticuerpos se representan como porcentaje (%). Positividad No fumadores (n = 382) Fumadores (n = 97) OR (IC 95%) P anti-CCP 64.4 60.8 0.86 (0.54 - 1.36) 0.5 anti-cH4/39-40 49.1 44.8 0.84 (0.54 - 1.32) 0.5 anti-CEP-1 32.8 29.2 0.84 (0.52 - 1.38) 0.5 anti-cFibB36-52 45.7 58.8 1.70 (1.08 - 2.67) 0.02 anti-cVim60-75 47.8 47.4 0.99 (0.62 - 1.58) 0.95 anti-cFibA27-43 13.6 20.6 1.65 (0.93 - 2.93) 0.09 anti-cVim2-17 6.6 12.4 2.00 (0.97 - 4.16) 0.06 Lorena Rodríguez Martínez 82 Tabla 15. Asociación de los anticuerpos anti-CCP y de los anticuerpos frente a péptidos citrulinados con la presencia de algún alelo del EC en pacientes con AR. Las frecuencias de los anticuerpos se representan como porcentaje (%). Positividad EC no portador (n = 221) EC portador (n = 299) OR (IC 95%) P anti-CCP 51.6 73.6 2.61 (1.81-3.78) 3.2x10-7 anti-cH4/39-40 39.0 54.9 1.91 (1.33-2.72) 3.8x10-4 anti-CEP-1 22.4 40.7 2.38 (1.60-3.53) 1.6x10-5 anti-cFibB36-52 41.4 52.8 1.59 (1.12-2.26) 7.3x10-3 anti-cVim60-75 39.8 55.0 1.85 (1.30-2.64) 6.4x10-4 anti-cFibA27-43 14.0 16.1 1.17 (0.72-1.91) 0.5 anti-cVim2-17 5.0 10.1 2.13 (1.04-4.35) 0.04 Tabla 16. Asociación de los anticuerpos anti-CCP y de los anticuerpos frente a péptidos citrulinados con la presencia del alelo PTPN22 en pacientes con AR. Las frecuencias de los anticuerpos se representan como porcentaje (%). Positividad PTPN22 no portador (n = 380) PTPN22 portador (n = 137) OR (IC 95%) P anti-CCP 62.6 68.6 1.30 (0.86-1.98) 0.2 anti-cH4/39-40 44.9 56.6 1.60 (1.08-2.38) 0.02 anti-CEP-1 32.4 33.6 1.06 (0.69-1.61) 0.8 anti-cFibB36-52 45.4 54.0 1.41 (0.95-2.09) 0.08 anti-cVim60-75 47.5 51.8 1.19 (0.80-1.76) 0.4 anti-cFibA27-43 16.3 11.7 0.68 (0.38-1.22) 0.2 anti-cVim2-17 7.4 8.8 1.21 (0.60-2.46) 0.6 RESULTADOS 91 otros autoanticuerpos. Por el contrario, los anticuerpos anti-AcOrn permanecieron asociados con la AR cuando se incluyeron los anticuerpos anti-CCP y FR en el modelo de regresión logística, incluso cuando se añadieron los anticuerpos anti-CarP (Tabla 20), lo que indica que los anticuerpos anti-AcOrn contienen información estadísticamente independiente de los otros autoanticuerpos. En el análisis más completo incluyendo cuatro autoanticuerpos, la fuerza de la asociación con la AR fue en orden decreciente desde los anticuerpos anti-CCP (OR=10.0) hasta el FR (OR=2.9), los anticuerpos anti-AcOrn (OR=1.6) y los anticuerpos anti-CarP (OR=1.6). La combinación de los dos AAPA sólo mostró una asociación marginalmente más fuerte que la de los anticuerpos anti-AcOrn por separado (Tabla 20). Tabla 20. Análisis de regresión logística de la asociación de los anticuerpos anti-péptidos acetilados con la AR. Todos los modelos de regresión incluyeron como variables de ajuste adicionales la edad, el género y la cohorte de los pacientes con EA. Ajustado por Anticuerpos antipéptidos acetilados OR IC 95% P Ningún anticuerpo anti-AcLys 4.4 2.9-6.7 7.0 x10-12 anti-AcOrn 6.5 4.5-9.3 2.3 x10-24 AAPA 6.8 4.8-9.6 3.8 x10-27 anti-CCP/FR anti-AcLys 1.4 0.8-2.5 0.2 anti-AcOrn 1.7 1.1-2.8 2.1 x10-02 AAPA 1.8 1.1-2.8 1.2 x10-02 anti-CCP/FR/anti-CarP anti-AcLys 1.4 0.8-2.4 0.3 anti-AcOrn 1.6 1.0-2.6 4.5 x10-02 AAPA 1.7 1.1-2.7 2.5 x10-02 También se exploró si la estratificación de los AAPA por sus títulos podría aumentar su valor discriminatorio. Para ello se definieron tres niveles para los títulos como se describe en los criterios de clasificación ACR/EULAR del 2010: negativo y por encima o por debajo de 3 veces el punto de corte de los pacientes positivos (Tabla 21). A diferencia de lo observado para los anticuerpos anti-CCP y el FR, los títulos altos de los AAPA no estaban más asociados con la AR que los títulos bajos. Estos resultados excluyen la estratificación por el título de los AAPA de las reglas de clasificación. Lorena Rodríguez Martínez 92 Tabla 21. Asociación de los anticuerpos anti-péptidos acetilados estratificados por el título con la clasificación como AR. Los títulos de los anticuerpos se dividieron en alto y bajo relativo a tres veces el punto de corte para definir pacientes positivos. Los análisis de regresión logística incluyeron la edad, el género y la cohorte como variables adicionales. OR IC 95% P anti-CCP o FR bajo vs. negativo 2.2 1.4-3.4 4.6x10-4 alto vs. negativo 30.4 20.5-45.2 1.5 x10-64 alto vs. bajo 12.5 7.3-21.3 1.4 x10-20 anti-AcLys bajo vs. negativo 3.4 1.9-6.0 3.8x10-5 alto vs. negativo 5.7 3.1-10.4 1.2x10-8 alto vs. bajo 2.0 0.9-4.9 0.1 anti-AcOrn bajo vs. negativo 7.1 3.9-13.0 1.9x10-10 alto vs. negativo 6.3 4.1-9.6 2.0 x10-17 alto vs. bajo 0.9 0.4-1.8 0.7 2.2. RELACIÓN ENTRE LOS AUTOANTICUERPOS Los dos AAPA mostraron una concordancia notablemente alta en el estado, tanto en los pacientes con AR (γ = 0.89, P = 8.9 x10-70) como en los no AR (γ = 0.98, P = 1.5 x10-119). Como consecuencia, sus relaciones con los anticuerpos anti-CCP y FR fueron similares (Figura 12). Para los anticuerpos anti-AcOrn, los dos subgrupos más grandes en los pacientes con AR estaban formados por los triple positivos y por los doble positivos para anti-CCP y FR (Figura 12A). El subgrupo de pacientes positivos únicamente para los anticuerpos anti- AcOrn, que es particularmente importante para aumentar la sensibilidad de la clasificación de pacientes con AR, representó sólo el 2.3% del total (o el 9.3% de los pacientes con AR seronegativos para FR y anticuerpos anti-CCP). En cambio, en los pacientes no AR se observó una distribución completamente diferente (Figura 12B) en los que el subgrupo más grande se correspondía con el de pacientes negativos para los tres anticuerpos, seguidos por los pacientes positivos para un único anticuerpo: FR, anti-AcOrn o anti-CCP. El análisis de la relación de los anticuerpos empleando los anticuerpos anti-AcLys mostró una distribución idéntica a la observada con los anticuerpos anti-AcOrn en los pacientes del subgrupo no AR (Figura 12D). Por el contrario, la distribución de los anticuerpos anti-AcLys en los pacientes con AR no se asemejó a la de los anticuerpos anti-AcOrn: estaba dominada por el subgrupo de pacientes doble positivos para los anticuerpos anti-CCP y FR seguido de los pacientes triple negativos y un reducido subgrupo de pacientes triple positivos (Figura 12C). Cabe destacar que los dos subgrupos críticos para mejorar la clasificación como AR RESULTADOS 93 fueron menos frecuentes al evaluar los anticuerpos anti-AcLys en comparación con los anti- AcOrn (Figura 12A y Figura 12C): los pacientes positivos sólo para el AAPA y los pacientes triple positivos que contribuyen a la clasificación basada en la concordancia de anticuerpos. Figura 12. Relaciones de los AAPA con FR y anticuerpos anti-CCP en los pacientes con EA. Las relaciones de los anticuerpos anti-AcOrn se muestran en las figuras A y B, mientras que las relaciones de los anticuerpos anti-AcLys se muestran en las figuras C y D. Las figuras A y C representan los pacientes con AR, mientras que las figuras B y D muestran los pacientes no AR. Los porcentajes mostrados en los gráficos se refieren al total de pacientes. 2.3. PARÁMETROS DIAGNÓSTICOS DE LOS AAPA La capacidad de los AAPA para identificar los pacientes con EA que finalmente desarrollarán AR se evaluó empleando parámetros utilizados comúnmente para valorar marcadores diagnósticos. Los dos parámetros más importantes, sensibilidad y especificidad, se compararon con el estándar actual de los criterios de clasificación ACR/EULAR 2010 que combina la positividad para los anticuerpos anti-CCP y/o FR (“anti-CCP o FR”) 164 (Tabla 22). Este análisis mostró que los AAPA fueron notablemente menos sensibles en comparación con el estándar actual cuando se consideraron todos los pacientes con AR. Además, los AAPA estuvieron presentes en menos del 11% de los pacientes anti-CCP negativos o anti- CCP/FR doble negativos. Por el contrario, los AAPA mostraron una elevada especificidad (Tabla 22). Su valor fue superior al de la especificidad de la combinación “anti-CCP o FR” y se mantuvo en los dos subgrupos de pacientes seronegativos. Esta elevada especificidad Lorena Rodríguez Martínez 94 sugirió la posibilidad de obtener una mejor clasificación al incluir un nuevo anticuerpo con el operador o en la combinación “anti-CCP o FR”. Las combinaciones de tres y cuatro anticuerpos mostraron un aumento modesto, aunque significativo en la sensibilidad (Tabla 22). El aumento fue de 1.4% para los anticuerpos anti- AcLys, 2.2% para los anticuerpos anti-AcOrn y 2.5% para los AAPA (P < 0.015 para todas las comparaciones empleando como referencia el criterio “anti-CCP o FR”). Estas mejoras se asociaron con un descenso en la especificidad de 3.7% para los anticuerpos anti-AcLys, 4.9% para los anticuerpos anti-AcOrn y 5.4% para los AAPA (P < 2.5x10-5 para todas las comparaciones empleando como referencia el criterio “anti-CCP o FR”). En otras palabras, la relación coste-beneficio de las combinaciones de anticuerpos fue de 1:2.2 para la combinación “anti-CCP o FR o anti-AcOrn” y “anti-CCP o FR o anti-AcOrn o anti-AcLys”. Este ratio indica que por cada nuevo paciente correctamente clasificado como AR se clasificarán incorrectamente 2.2 pacientes sin AR como si tuvieran AR. Por su parte, el ratio costebeneficio con la combinación “anti-CCP o FR o anti-AcLys” fue de 1:2.6 y el ratio recientemente descrito para la combinación “anti-CCP o FR o anti-CarP” fue de 1:3.7 176. Estos valores no fueron significativamente diferentes entre ellos. Tabla 22. Sensibilidad y especificidad de los AAPA para la clasificación como AR de los pacientes con EA. Los anticuerpos se consideraron por separado y en combinaciones con el operador o. Los parámetros de sensibilidad, especificidad se evaluaron en todos los pacientes con EA (todos), en el subgrupo de pacientes anti-CCP negativo (anti-CCP-) y en subgrupo de pacientes anti-CCP y FR doble negativos (anti-CCP-/FR-). na = no aplicable. anti- AcLys anti- AcOrn AAPA anti-CCP o FR Anti-CCP o FR o anti-AcLys Anti-CCP o FR o anti-AcOrn anti-CCP o FR o AAPA Sensibilidad todos 21.1 36.1 39.7 75.7 77.1 77.9 78.2 anti-CCP- 5.6 8.4 9.6 27.9 32.6 34.6 35.4 anti-CCP-/FR- 6.3 9.3 10.2 na 6.3 9.3 10.2 Especificidad todos 94.2 91.5 90.6 79.5 75.8 74.6 74.1 anti-CCP- 95.1 93.4 92.6 87 82.9 81.7 81.1 anti-CCP-/FR- 95.3 93.9 93.1 na 95.3 93.9 93.1 Como alternativa, se evaluó el valor de la combinación de los AAPA con el FR y los anticuerpos anti-CCP empleando el operador y, pero este enfoque resultó en una disminución considerable en la sensibilidad, el parámetro que necesita ser mejorado para detectar pacientes con AR (Tabla 23). Ninguno de los otros parámetros analizados (VPP, VPN, RV+, RV- y AUC) mostró una mejoría significativa al incluir los AAPA respecto del estándar “anti-CCP o FR” (Tabla 24). RESULTADOS 95 Tabla 23. Sensibilidad y especificidad de los AAPA en las combinaciones con el FR y los anticuerpos anti-CCP usando el operador y para la clasificación como AR de los pacientes con EA. La sensibilidad y la especificidad se evaluaron en todos los pacientes con EA (todos) y en el subgrupo de pacientes anti-CCP negativos (anti-CCP-). anti-CCP o FR (FR o anti-CCP) y anti-AcLys (FR o anti-CCP) y anti-AcOrn (FR o anti-CCP) y AAPA Sensibilidad todos 75.7 19.6 33.8 37.2 anti-CCP- 27.9 1.1 1.7 2.2 Especificidad todos 79.5 97.9 96.4 96.1 anti-CCP- 87.0 99.2 98.8 98.6 Tabla 24. Parámetros para evaluar el valor diagnóstico de los AAPA y sus combinaciones. Los anticuerpos se consideraron por separado y en las combinaciones con el operador o. Los parámetros de valor predictivo positivo (VPP) y negativo (VPN), razón de verosimilitud positiva (RV+) y negativa (RV-) y área bajo la curva (AUC) se evaluaron en todos los pacientes con EA (todos), en el subgrupo de pacientes anti-CCP negativos (anti-CCP-) y en el subgrupo de pacientes anti-CCP y FR doble negativos (anti-CCP-/FR-). na = no aplicable. anti-AcLys anti-AcOrn anti-CCP o FR Anti-CCP o FR o anti-AcLys Anti-CCP o FR o anti-AcOrn VPP todos 78.2 80.9 78.6 75.8 75.3 anti-CCP- 29.4 31.9 44.2 41.1 41.1 anti-CCP-/FR- 28.6 31.6 na 28.6 31.6 VPN todos 54.8 59.0 76.6 77.1 77.2 anti-CCP- 73.3 73.5 76.6 77.1 77.2 anti-CCP-/FR- 77.1 77.2 na 77.1 77.2 RV+ todos 3.6 4.3 3.7 3.2 3.1 anti-CCP- 1.1 1.3 2.2 1.9 1.9 anti-CCP-/FR- 1.3 1.5 na 1.3 1.5 RV- todos 0.8 0.7 0.3 0.3 0.3 anti-CCP- 1.0 1.0 0.8 0.8 0.8 anti-CCP-/FR- 1.0 1.0 na 1.0 1.0 AUC todos 0.58 0.64 0.78 0.77 0.76 anti-CCP- 0.50 0.51 0.58 0.58 0.58 anti-CCP-/FR- 0.51 0.52 na 0.51 0.52 Lorena Rodríguez Martínez 96 2.4. MEJORA DE LA CLASIFICACIÓN SEROLÓGICA BASADA EN LA CONCORDANCIA DE ANTICUERPOS Las relaciones de los anticuerpos anti-CCP, FR y anti-AcOrn presentadas anteriormente (Figura 12A y Figura 12B) sugirieron que su concordancia podría ser útil para la clasificación de la AR. Esta hipótesis estaba apoyada además por la discriminación que ofrece el número de anticuerpos positivos en relación con el componente serológico de los criterios de clasificación ACR/EULAR del 2010 (Tabla 25). Por lo tanto, se comparó directamente el componente serológico de los criterios del 2010 con la concordancia de anticuerpos en relación con su asociación con la AR en dos modelos de regresión logística separados y en un modelo que combinaba los dos componentes (Tabla 26). En las regresiones logísticas realizadas por separado, el valor más alto de OR (48.7) fue para la presencia concordante de tres anticuerpos (FR, anti-CCP y anti-AcOrn). El siguiente valor más elevado fue para la presencia concordante de dos anticuerpos (OR = 28.5) y a un nivel similar para los títulos altos de anticuerpos anti-CCP o FR (OR = 25.9). Este mismo orden se observó en el modelo de regresión que combinaba los dos componentes serológicos (OR = 11.4, 7.9 y 4.4 respectivamente, Tabla 26). Esta jerarquía indica que la concordancia de anticuerpos tiene un peso mayor que el nivel más alto de la serología de los criterios del 2010, por lo que la concordancia podría mejorar la clasificación que se obtiene con el componente serológico del 2010. Tabla 25. Tabla de contingencia de los pacientes con EA según la puntuación serológica de los criterios de clasificación del 2010 y el número de anticuerpos positivos concordantes (FR, anti- CCP y anti-AcOrn). Cada celda de la tabla contiene el número de pacientes con EA y, entre paréntesis, el porcentaje del total de la fila que representan. Concordancia de anticuerpos puntuación 0Ab 1Ab 2Ab 3Ab Criterio serológico 2010 3 0 (0) 57 (14.5) 169 (43.1) 166 (42.3) 2 0 (0) 90 (80.4) 19 (17.0) 3 (2.7) 0 514 (93.1) 38 (6.9) 0 (0) 0 (0) RESULTADOS 97 Tabla 26. Comparación de los modelos de regresión logística para la clasificación de la AR basados en el componente serológico de los criterios del 2010, la concordancia de anticuerpos y la combinación de los dos. Se muestra la OR y el intervalo de confianza del 95%. Los estratos en cursiva no contribuyeron de forma significativa a la clasificación de la AR. 2010 ACR/EULAR: componente serológico de los criterios ACR/EULAR de clasificación de la AR del 2010; Ccdc. anti- AcOrn: concordancia de anticuerpos anti-CCP, FR y anti-AcOrn; 2010 + Ccdc. Anti-AcOrn: combinación de los dos componentes serológicos anteriores. 2010 ACR/EULAR Ccdc. anti-AcOrn 2010 + Ccdc. anti-AcOrn Categoría OR (IC 95%) OR (IC 95%) OR (IC 95%) 3 25.9 (17.9-37.6) - 4.4 (1.9-10.4) 2 2.5 (1.6-3.8) - 1.2 (0.5-2.6) 3Ab - 48.7 (25.5-93.0) 11.4 (4.0-32.9) 2Ab - 28.5 (17.1-47.4) 7.9 (3.0-20.4) 1Ab - 2.7 (1.9-3.9) 1.6 (0.8-3.2) Para demostrar que realmente se obtiene una mejoría se comparó la calidad del ajuste de los modelos de regresión con los parámetros R2 y AIC. El valor de R2 es mejor cuando es más alto, como en el modelo de la concordancia (0.451) comparado con el componente serológico del 2010 (0.422). Por el contrario, el AIC es mejor cuando su valor es menor, como sucede de nuevo en el modelo de la concordancia (1037) en relación con el criterio serológico del 2010 (1067). Esta última diferencia (>10) indica que se puede considerar sin ninguna duda que el modelo del 2010 se ajusta peor a los datos. En el modelo que combina los dos criterios se obtuvo una mejoría de estos parámetros todavía mayor (R2 = 0.456, AIC = 1027). Por el contrario, ninguno de los modelos basados en la concordancia con otros anticuerpos, anti- AcLys (R2 = 0.446, AIC = 1038) o anti-CarP (R2 = 0.442, AIC = 1048), fue mejor que el modelo que incluyó a los anticuerpos anti-AcOrn. 2.5. MEJORA DE LA CLASIFICACIÓN DE LA AR CON LOS ANTICUERPOS ANTI-ACORN La prueba final para verificar la contribución a la clasificación de la AR consiste en la combinación de los modelos serológicos con los componentes no serológicos de los criterios ACR/EULAR de la clasificación de la AR del 2010 (Tabla 27). Este análisis sólo fue posible en los pacientes de la cohorte PEARL (537 pacientes con EA) que disponían de todos los datos. Los resultados mostraron una mejora en la especificidad y la exactitud con la concordancia de anticuerpos anti-CCP, FR y anti-AcOrn. Con más detalle, la especificidad fue significativamente mayor que con los criterios del 2010 (77.6% vs. 72.6%, P = 0.003). Este aumento se vio acompañado de una sensibilidad nominalmente mayor (80.2% vs. 78.8%, P = 0.25) y una exactitud significativamente mejor (79.0% vs.75.8%, P = 0.002). Esta mejora no fue atribuible a la puntuación específica empleada ya que se replicó con los modelos de regresión logística en los que no se utilizan puntuaciones predeterminadas (Tabla 27; especificidad: 79.2% vs. 73.8%, P = 9.5 x10-6; exactitud: 80.0% vs. 77.1%, P = 0.007). Otro resultado a destacar de estos análisis es que la clasificación que incorpora la combinación de Lorena Rodríguez Martínez 98 los criterios serológicos del 2010 y la concordancia (Ccdc. anti-AcOrn + 2010 en la Tabla 27) no fue mejor que la basada únicamente en la concordancia (Ccdc. Anti-AcOrn en la Tabla 27). La mejoría en la clasificación de la AR con los anticuerpos anti-AcOrn fue significativamente mayor que la que se obtuvo con los anticuerpos anti-CarP descrita recientemente en un trabajo realizado en nuestro laboratorio 176 y que se muestra aquí para facilitar una comparación directa (Tabla 27; puntuación especificidad: 77.6% vs. 75.3%, P = 0.03 y exactitud: 79.0% vs. 77.1%, P = 0.01; regresión logística especificidad: 79.2% vs. 75.7%, P = 0.002 y exactitud: 80.0% vs. 77.8%, P = 0.01). Tabla 27. Clasificación de los pacientes con AR empleando diferentes componentes serológicos. 2010 ACR/EULAR = FR o anticuerpos anti-CCP como se indica en los criterios de clasificación ACR/EULAR de la AR del 2010; Ccdc. Anti-AcOrn = concordancia para los anticuerpos anti-CCP, FR y anti-AcOrn; Ccdc. Anti-CarP = concordancia para los anticuerpos anti-CCP, FR y anti-CarP. La puntuación para cada nivel fue la que se indica en los criterios de clasificación ACR/EULAR de la AR del 2010 para el componente serológico 2010 ACR/EULAR y como se describe en Regueiro C y col.176 dependiendo del número de anticuerpos concordantes: 5 puntos para 3 anticuerpos, 3 puntos para 2 anticuerpos y 1 punto para 1 anticuerpo para los componentes serológicos basados en la concordancia; o 5 puntos para 3 o 2 anticuerpos con títulos altos de anticuerpos anti-CCP o FR, 3 puntos para 3 o 2 anticuerpos con títulos bajos y 1 para 1 anticuerpo independientemente de los títulos para la combinación de los componentes serológicos del 2010 y la concordancia. La clasificación con los modelos de regresión se realizó incluyendo cada componente individual: afectación articular, serología, duración de los síntomas y reactantes de fase aguda con un punto de corte ajustado para obtener un 80% de sensibilidad. Este análisis es ligeramente diferente al que se indica en Regueiro C y col.176 donde los factores del componente no serológico se agruparon en una única variable. Componente serológico Puntuación Regresión logística especificidad sensibilidad exactitud especificidad exactitud 2010 ACR/EULAR 72.6 78.8 75.8 73.8 77.1 Ccdc. anti-AcOrn 77.6 80.2 79.0 79.2 80.0 Ccdc. anti-AcOrn + 2010 77.6 81.3 79.5 80.3 80.6 Ccdc. Anti-CarP 75.3 78.8 77.1 75.7 77.8 Ccdc. Anti-CarP + 2010 76.4 80.6 78.8 79.5 80.0 RESULTADOS 107 Treinta y un pacientes con AR (6.0%) fueron positivos para los anticuerpos anti-MAA del isotipo IgG, 76 (14.8%) para el IgM y 37 (7.2%) para el IgA. Estas frecuencias son inferiores a las descritas en los pacientes con AR del registro VARA 32 y en los pacientes con AR de la colección VAMC 39. Las frecuencias de los tres isotipos en esta última colección 39 también fueron inferiores a las descritas en el registro VARA, aunque la magnitud de la diferencia fue más marcada en nuestros pacientes (Tabla 29). En la cohorte EIRA sólo se evaluó el isotipo IgG de los anticuerpos anti-MAA, que también mostró una prevalencia superior en comparación con la observada en nuestra colección. Las características clínicas de los pacientes con AR de la colección de Santiago, del registro VARA, de la colección VAMC y de la cohorte EIRA se muestran en la Tabla 29. Cabe destacar que las cuatro colecciones de pacientes con AR muestran diferencias considerables en las características clínicas y serológicas. La colección de Santiago estaba conformada principalmente por mujeres y no fumadores de ascendencia europea (españoles) con una menor frecuencia de alelos del epítopo compartido y un mayor tiempo de evolución de la enfermedad. Además, la frecuencia de seropositivos para el FR fue menor que la descrita en las otras colecciones, mientras que la frecuencia de seropositivos para los anticuerpos anti-CCP fue menor en comparación con las dos colecciones estadounidenses, pero comparable a la observada en la cohorte EIRA (Tabla 29). La cohorte EIRA mostró características más similares a las de la colección de Santiago: mayoría de mujeres y de pacientes con ascendencia europea aunque no se dispone del dato exacto para los pacientes incluidos en el estudio de los anticuerpos anti-MAA. Por el contrario, el registro VARA y la colección VAMC estaban formadas predominantemente por hombres fumadores con un significativo componente de minorías étnicas de origen no europeo (Tabla 29). Lorena Rodríguez Martínez 108 Tabla 29. Características clínicas y serológicas de los pacientes con AR de cuatro colecciones en los que se han evaluado los anticuerpos anti-MAA. Las variables edad y tiempo de evolución se representan como la media y la DS mientras que el resto de variables se representan como porcentaje (%). La frecuencia de pacientes con AR considerados positivos para cada isotipo de los anticuerpos anti-MAA se determinó empleando el punto de corte establecido en cada estudio: nuestro estudio (Santiago) percentil 98; en el estudio de Thiele y col. 32 (VARA) valor medio más 2.5 veces la DS; en el estudio de Mikuls y col. 39 (VAMC) percentil 95; en el estudio de Grönwall y col. 204 (EIRA) percentil 85. Los datos de hábito tabáquico, frecuencia de anticuerpos anti-CCP y FR y frecuencia del EC para la colección VAMC se obtuvieron del trabajo realizado por Mikuls y col. 103 de 287 pacientes con AR. Dato disponible para <98% de los pacientes con AR del presente estudio: tiempo de evolución 95.7%, fumadores 92.3%, erosiones 95.2% y FR 95.9%. El primer valor de P se muestra para la comparación entre las colecciones de Santiago y VARA, el segundo valor de P para la comparación entre Santiago y VAMC, el tercer valor de P para la comparación entre Santiago y EIRA y el cuarto valor de P para la comparación entre VARA y VAMC. Características Santiago (n = 517) VARA (n = 1720) VAMC (n = 285) EIRA (n = 403) P Santiago vs. VARA P Santiago vs. VAMC P Santiago vs. EIRA P VARA vs. VAMC Ascendencia europea 100 78 75 - 1.9x10-32 4.6x10-33 - 0.30 Edad, años 61 (14) 63 (11) 59 (12) 50 (13) 7.0x10-4 0.04 <1.0x10-4 <1.0x10-4 Tiempo de evolución, años 14 (11) 12 (12) 13 (10) - 9.0x10-4 0.21 - 0.18 Mujeres 77 9 37 70 2.1x10-214 4.6x10-29 0.02 7.8x10-38 Fumadores Nunca 80 20 38 28 ref ref ref ref Previo 11 53 43 72 5.0x10-65 9.0x10-27 6.1x10-53 1.0x10-3 Actual 10 26 19 5.5x10-13 1.0x10-3 9.1x10-3 EC, portador 58 - 76 77 - 2.1x10-7 7.6x10-10 - FR positivo 60 80 77 71 1.1x10-18 2.4x10-6 1.0x10-3 0.27 anti-CCP positivo 64 78 85 69 3.3x10-10 6.9x10-10 0.13 6.3x10-4 IgG anti-MAA positivo 6 92 80 44 1.1x10-319 4.4x10-102 5.4x10-42 2.6x10-10 IgM anti-MAA positivo 15 38 18 - 5.3x10-23 0.24 - 4.3x10-11 IgA anti-MAA positivo 7 73 52 - 1.9x10-154 1.5x10-46 - 6.1x10-13 RESULTADOS 109 En nuestro estudio, los anticuerpos IgM anti-MAA se detectaron con mayor frecuencia en el subgrupo de pacientes con AR anti-CCP positivo en comparación con el subgrupo anti-CCP negativo, mientras que el isotipo IgA mostró una tendencia hacia una mayor prevalencia en el subgrupo anti-CCP positivo (P = 0.06, Tabla 28). En línea con lo observado en todos los pacientes con AR, la prevalencia de los anticuerpos anti-MAA descrita en los pacientes anti- CCP positivos varió considerablemente entre las cuatro colecciones, con los valores más bajos observados en la colección de Santiago (Tabla 30, P <1.0x10-12 para todas las comparaciones vs. Santiago excepto para la comparación del isotipo IgM de VAMC vs. Santiago; P = 0.38). Una situación similar se observó en el subgrupo anti-CCP negativo en el que la necesidad de encontrar biomarcadores es más urgente. Mientras que la prevalencia de los anticuerpos anti- MAA en los pacientes anti-CCP negativos del registro VARA fue del 29-88%, en la colección VAMC del 18-66% dependiendo del isotipo evaluado y en la colección de EIRA fue del 33% para el isotipo IgG, en nuestros pacientes ninguno de los tres isotipos se encontró en una frecuencia superior al 10% (Tabla 30, P <0.02 para todas las comparaciones vs. Santiago). Tabla 30. Prevalencia de los anticuerpos anti-MAA en cuatro colecciones de pacientes con AR estratificados en función de la presencia de los anticuerpos anti-CCP. Las variables se representan como porcentaje (%). La frecuencia de pacientes con AR considerados positivos para cada isotipo de los anticuerpos anti-MAA se determinó como de describe en la Tabla 29. Los datos de frecuencia de anticuerpos anti-CCP para la colección VAMC se obtuvieron del trabajo realizado por Mikuls y col. 103 de 287 pacientes con AR. 3.3. ANTICUERPOS ANTI-MAA DERIVADOS DE DOS PREPARACIONES DIFERENTES La baja prevalencia de los anticuerpos anti-MAA en los pacientes con AR de Santiago podría deberse a un nivel subóptimo de modificación. Aunque el antígeno MAA-HSA (2:1) mostró un ratio F/M suficiente para considerarlo correctamente modificado, se probó a utilizar una preparación con un mayor nivel de aducción. Por lo tanto, se modificó la HSA aumentando la cantidad de malondialdehído a 4 mM y manteniendo el acetaldehído a 1 mM, lo que resultó en un ratio F/M = 1.68 ± 0.07 294. Empleando como antígeno esta nueva preparación [HSAMAA (4:1)] se determinaron los anticuerpos anti-MAA del isotipo IgG con un anticuerpo secundario frente a IgG (H+L) en el suero de pacientes con AR y controles sanos seleccionados al azar en los que se habían determinado los anticuerpos empleando el antígeno modificado 2:1. No se encontró ninguna diferencia en el porcentaje de pacientes con AR positivos para los anticuerpos anti-MAA del isotipo IgG (8.3% con ambos antígenos), por lo Anti-CCP positivo Anti-CCP negativo Características Santiago (n = 332) VARA (n = 1340) VAMC (n = 244) EIRA (n = 278) Santiago (n = 185) VARA (n = 380) VAMC (n = 41) EIRA (n = 125) IgG anti-MAA positivo 5 93 83 49 7 88 66 33 IgM anti-MAA positivo 20 41 17 - 6 29 18 - IgA anti-MAA positivo 9 76 52 - 4 63 52 - Lorena Rodríguez Martínez 110 que un mayor nivel de aducción del antígeno no aumentó su habilidad para capturar los anticuerpos IgG anti-MAA. El efecto del nivel de aducción en la detección de anticuerpos anti-MAA también se evaluó para los isotipos IgM e IgA, dando lugar a resultados diferentes. Por un lado, la prevalencia de los anticuerpos IgM anti-MAA se vio disminuida considerablemente cuando se empleó como antígeno la MAA-HSA (4:1), pasando de un 12.5% con la MAA-HSA (2:1) a un 2.1%. En cambio, los anticuerpos IgA anti-MAA mostraron una prevalencia similar (6.3%) independientemente del antígeno utilizado en el ELISA, tal y como se observó para el isotipo IgG. 3.4. ANTICUERPOS ANTI-MDA EN PACIENTES CON AR Y CONTROLES En el presente trabajo también se ha estudiado la presencia de anticuerpos IgG e IgM que reconocen otros aductos derivados de la modificación con malondialdehído (anticuerpos anti- MDA) que habían sido descritos previamente en pacientes con AR 33. Para ello se emplearon las mismas muestras de suero de pacientes con AR y controles del Hospital Clínico de Santiago en las que se evaluaron los anticuerpos anti-MAA. Los anticuerpos anti-MDA mostraron niveles superiores para los dos isotipos evaluados en los pacientes con AR en comparación con los mostrados en los controles sanos (Figura 16 y Tabla 31). Los niveles de anticuerpos anti-MDA estaban incrementados en los pacientes con AR del subgrupo anti-CCP positivo en comparación con el subgrupo anti-CCP negativo. Sin embargo, esto no se tradujo en una mayor prevalencia de anticuerpos anti-MDA en los pacientes seropositivos (Tabla 31). A pesar de esta tendencia, tanto el título como la frecuencia de los isotipos IgG e IgM fueron superiores en los pacientes con AR anti-CCP negativos que en los controles sanos. De nuestros pacientes con AR, 43 (8.3%) fueron positivos para el isotipo IgG y 86 (16.6%) para el isotipo IgM de los anticuerpos anti-MDA. La sensibilidad del isotipo IgM fue comparable al observado en los 162 pacientes con AR de un estudio previo 33. Por el contrario, los anticuerpos anti-MDA de isotipo IgG mostraron una frecuencia considerablemente menor en los pacientes de Santiago en comparación con el 28% detectado en el estudio anterior. La comparación directa de las características clínicas de nuestros pacientes y de los 162 pacientes con AR del estudio previo no fue posible porque los datos no se encuentran disponibles 33. RESULTADOS 111 Figura 16. Títulos de los anticuerpos anti-MDA estratificados por el isotipo en pacientes con AR y controles sanos incluidos en el presente estudio empleando MDA-BSA como antígeno. Los títulos se muestran en escala logarítmica. Los pacientes con AR se han dividido en función del estado para los anticuerpos anti-CCP. Las líneas horizontales rojas representan la mediana de los títulos de anticuerpo en cada grupo. Lorena Rodríguez Martínez 112 Tabla 31. Frecuencia y niveles de los anticuerpos IgG e IgM anti-MDA en los controles sanos, en todos los pacientes con AR y en los pacientes estratificados en función de la presencia de los anticuerpos anti-CCP. Los títulos (UA) de los dos isotipos de anticuerpos anti-MDA se expresan como la mediana (IQR) mientras que la frecuencia de pacientes positivos se expresa en porcentaje (%). El primer valor de P corresponde a la comparación entre todos los pacientes con AR y los controles sanos. El segundo valor de P resulta de la comparación de los dos subgrupos anti-CCP de pacientes con AR y el tercero muestra los valores obtenidos para la comparación entre los pacientes anti-CCP negativos y los controles. Isotipo anti-MDA Controles AR PControles vs. AR AR anti-CCP- AR anti-CCP+ Panti-CCP+ vs. anti-CCP- Panti-CCP- vs. controles Título IgG 24.1 (16.3-36.5) 38.7 (25.6-55.1) 3.4x10-22 36.8 (24.4-51.3) 40.1 (26.9-56.7) 4.8x10-2 6.1x10-11 IgM 8.4 (3.9-16.5) 26.2 (13.9-46.2) 4.9x10-41 24.4 (10.9-40.8) 27.8 (16.8-49.1) 1.2x10-2 6.9x10-20 Frecuencia IgG positivo 6/271 (2.2) 43/517 (8.3) 7.5x10-4 12/185 (6.5) 31/332 (9.3) 0.26 0.03 IgM positivo 6/271 (2.2) 86/517 (16.6) 2.1x10-9 26/185 (14.1) 60/332 (18.1) 0.24 1.2x10-6 RESULTADOS 113 3.5. RELACIÓN ENTRE LOS ANTICUERPOS ANTI-MAA Y ANTI-MDA La relación entre los anticuerpos anti-MAA y anti-MDA no ha sido directamente explorada a pesar de que los dos tienen como diana aductos formados por vías compartidas. Por ello analizamos su concordancia en estado y correlación en títulos considerando todos los isotipos analizados en nuestras muestras. Las concordancias más elevadas en la comparación por separado de los anticuerpos anti- MAA y los anti-MDA se observaron entre isotipos de anticuerpos con la misma especificidad. Así, una fracción importante de los pacientes con AR mostró el mismo estado para los dos isotipos, IgG e IgM, de los anticuerpos anti-MDA (γ = 0.76, Tabla 32) y entre los isotipos IgG e IgA de los anticuerpos anti-MAA (γ = 0.78). Cuando se comparó el estado de los anticuerpos anti-MDA y anti-MAA, se observó una concordancia notable entre aquellos que presentaban el mismo isotipo (Tabla 32). En la comparación de anticuerpos con isotipos distintos hubo menos pacientes con el mismo estado, aunque la mayoría de estas comparaciones alcanzaron valores de concordancia estadísticamente significativos Sin embargo, este solapamiento en estado no fue superior al mostrado entre otros anticuerpos específicos de la AR, como los anticuerpos anti-CCP y el FR (γ = 0.82) o con los anticuerpos anti-CarP. El análisis de la correlación de los títulos se restringió a los pacientes positivos lo que redujo notablemente el número de pacientes incluido en cada comparación. Aun así, los dos isotipos de los anticuerpos anti-MDA se encontraron positivamente correlacionados de forma significativa, al igual que los títulos de los anticuerpos IgG anti-MDA e IgA anti-MAA. Sin embargo, el resto de las comparaciones de anticuerpos no resultaron en correlaciones significativas, incluso aquellas que mostraron mayor concordancia en estado (Tabla 32). Esta falta de correlación en los títulos entre los anticuerpos anti-MDA y anti-MAA y especialmente la tendencia a correlaciones inversa entre IgG anti-MDA y anti-MAA indica que se tratan de dos sistemas de autoanticuerpos independientes y no cros-reactivos. En relación con otros autoanticuerpos de la AR, los dos isotipos de los anticuerpos anti- MDA mostraron concordancia con el FR y los anticuerpos anti-CarP pero no con los anti- CCP. Por su parte, los isotipos IgM e IgA de los anticuerpos anti-MAA mostraron concordancias significativas con los tres autoanticuerpos, FR, anti-CCP y anti-CarP, mientras que los de isotipo IgG no fueron concordantes con ninguno de ellos (Tabla 32). A pesar de la presencia de valores de concordancia significativos en algunas de estas comparaciones, los títulos de los anticuerpos anti-CCP y anti-CarP no se correlacionaron con los títulos de los anticuerpos anti-MDA ni de los anti-MAA. Lorena Rodríguez Martínez 114 Tabla 32. Relaciones entre los anticuerpos anti-MDA y anti-MAA, y de éstos con los autoanticuerpos FR, anti-CCP y anti-CarP. Los anticuerpos se han considerados en pares evaluando la concordancia de estado y la correlación de títulos. El parámetro γ se refiere al coeficiente gamma de Goodman y Kruskal mientas que ρ es el coeficiente de correlación de Spearman. No se dispone de valor de título para FR por lo que no se ha podido calcular el coeficiente ρ. Ab = anticuerpo. na = no aplicable. 1er Ab 2º Ab n γ P n ρ P Anti-MDA IgG IgM anti-MDA 517 0.76 4.0x10-24 23 0.64 1.1x10-3 IgG IgG Anti-MAA 517 0.57 9.2x10-6 7 -0.64 0.12 IgM IgM Anti-MAA 515 0.56 1.0x10-12 27 0.00 0.99 IgG IgM Anti-MAA 515 0.49 3.9x10-6 13 -0.19 0.54 IgG IgA Anti-MAA 512 0.42 4.3x10-3 6 0.94 4.8x10-3 IgM IgA Anti-MAA 512 0.39 8.7x10-4 11 -0.05 0.87 IgM IgG Anti-MAA 517 0.20 0.17 7 0.07 0.88 Anti-MAA IgM IgA Anti-MAA 512 0.78 1.1x10-22 19 0.10 0.69 IgG IgM Anti-MAA 515 0.52 9.9x10-6 10 0.21 0.56 IgG IgA Anti-MAA 512 0.48 2.1x10-3 5 0.10 0.87 Anticuerpos en la AR Anti-CCP FR 496 0.82 4.0x10-63 - na na Anti-CCP Anti-CarP 517 0.60 2.2x10-19 131 0.09 0.29 FR Anti-CarP 496 0.55 6.9x10-17 - na na Anti-MDA Anticuerpos en la AR IgM FR 496 0.39 4.6x10-6 - na na IgG Anti-CarP 517 0.36 3.3x10-4 20 -0.31 0.18 IgM Anti-CarP 517 0.32 2.9x10-5 37 -0.05 0.77 IgG FR 496 0.30 9.5x10-3 - na na IgG Anti-CCP 517 0.20 0.09 31 0.12 0.52 IgM Anti-CCP 517 0.15 0.08 60 -0.03 0.82 Anti-MAA Anticuerpos en la AR IgM Anti-CCP 515 0.59 2.8x10-10 65 -0.01 0.91 IgM FR 494 0.55 1.3x10-9 - na na IgM Anti-CarP 515 0.53 3.7x10-13 41 0.20 0.20 IgA Anti-CarP 512 0.50 1.0x10-6 20 -0.15 0.52 IgA FR 491 0.47 2.2x10-4 - na na IgA Anti-CCP 512 0.36 4.9x10-3 29 0.10 0.59 IgG Anti-CarP 517 0.20 0.12 12 -0.14 0.66 IgG Anti-CCP 517 -0.14 0.27 18 0.11 0.66 IgG FR 496 -0.15 0.25 - na na RESULTADOS 115 A continuación, se exploró por separado la relación entre los isotipos de los anticuerpos anti- MAA y anti-MDA en los pacientes con AR seropositivos y seronegativos en función de anti- CCP y FR. En el subgrupo de pacientes seropositivos (anti-CCP+ y/o FR+) se detectó un modesto nivel de solapamiento (< 30% de los positivos) entre los isotipos de los anticuerpos anti-MAA (Figura 17A). Los pacientes positivos sólo para el isotipo IgM conformaron el grupo más grande, representando cerca del 50% de todos los pacientes anti-MAA positivos, seguido del subgrupo de pacientes IgM/IgA doble positivos, lo que refleja la elevada concordancia detectada para estos dos isotipos. En los pacientes seronegativos, la distribución fue bastante diferente, con escaso solapamiento y una frecuencia más igualada de los tres isotipos (Figura 17B). Figura 17. Frecuencia relativa de los tres isotipos de los anticuerpos anti-MAA y de los dos isotipos de los anticuerpos anti-MDA en los pacientes con AR. Los diagramas de Venn representando los isotipos IgG, IgM e IgA de los anticuerpos anti-MAA se muestran en las figuras A y B, mientras que los de los isotipos IgG e IgM de los anticuerpos anti-MDA se muestran en las figuras C y D. Las figuras A y C representan los pacientes con AR seropositivos (anti-CCP+ y/o FR+), mientras que las figuras B y D muestran los pacientes con AR seronegativos (anti-CCP- y FR-). Las áreas de las elipses y los porcentajes son proporcionales a la fracción de pacientes positivos, mientras que en el margen inferior se muestra el porcentaje del total de pacientes que eran negativos para todos los anticuerpos considerados. Lorena Rodríguez Martínez 116 Los isotipos de los anticuerpos anti-MDA mostraron una distribución similar en los pacientes con AR seropositivos y seronegativos (Figura 17C y D). En ambos subgrupos, los pacientes positivos sólo para el isotipo IgM conformaron el estrato mayoritario (60.7% y 53.8% en los pacientes con AR seropositivos y seronegativos respectivamente), seguidos son similar frecuencias por los que presentaban solo el isotipo IgG o los dos isotipos. Por último, se analizó de forma específica la presencia de los anticuerpos anti-MAA y anti-MDA en los pacientes seronegativos (anti-CCP-/FR-). Los anticuerpos anti-MAA (isotipo IgG y/o IgM y/o IgA) fueron más abundantes, 16.5%, que los anti-MDA (isotipo IgG y/o IgM), 10.2%, aunque esta diferencia no fue significativa (P McNemar = 0.2). En conjunto, los dos tipos de anticuerpos se detectaron en el 25.2% de los pacientes seronegativos, una fracción significativamente mayor que la detectada únicamente con los anticuerpos anti-MAA (P McNemar = 0.003). 3.6. RELACIÓN DE LOS ANTICUERPOS ANTI-MAA Y ANTI-MDA CON LAS CARACTERÍSTICAS CLÍNICAS Y SEROLÓGICAS Para completar el análisis se ha explorado la posible correlación y asociación de los anticuerpos anti-MAA y anti-MDA con algunas características de la AR. El único resultado significativo ha sido que la presencia de los anticuerpos IgM anti-MAA se asoció con el tabaquismo (OR = 2.81; 95% CI = 1.39-5.72; P = 4.1x10-3) en el análisis incluyendo sexo, edad de diagnóstico y tiempo de evolución como covariables. Además, los pacientes con AR fumadores presentaron una prevalencia y unos títulos más altos de estos anticuerpos IgM anti- MAA que los no fumadores (25.8% vs. 12.2% respectivamente; P = 8.0x10-4; mediana [IQR] = 27.3 [17.8-48.7] vs. 20.3 [13.3-31.9]; P = 2.2x10-4). La magnitud de la asociación se incrementó cuando se consideraron los pacientes que seguían fumando (OR = 3.04; 95% CI = 1.22-7.56; P = 1.7x10-2) en comparación con los habían dejado de fumar (OR = 1.95; 95% CI = 1.22-3.12; P = 5.4x10-3), aunque los niveles y la prevalencia de los anticuerpos IgM anti- MAA no fueron significativamente diferentes entre estos dos subgrupos de pacientes. Por otra parte, no se observaron asociaciones entre la presencia de los anticuerpos anti-MAA o anti- MDA y la presencia del EC, el alelo de riesgo PTPN22 o la presencia de erosiones. RESULTADOS 123 Finalmente, el ensayo con DNPH permitió cuantificar la presencia de grupos carbonilo en las proteínas modificadas. El contenido de carbonilos del CII nativo fue de 12.6 nmol/mg proteína. Tras su modificación, este contenido se incrementó hasta 40.5 nmol/mg para el HOCl-CII y 121.6 nmol/mg para el GLI-CII. Por su parte, el nivel de grupos carbonilo en la BSA nativa fue bastante inferior al del CII, 3.0 nmol/mg, aumentando considerablemente hasta 21.1 nmol/mg y 35.6 nmol/mg al modificarse con HOCl y ribosa respectivamente. Aunque la cantidad absoluta de grupos carbonilo (en nmol/mg) medidos en el CII modificado eran mayores que en la BSA modificada, es la BSA la que mostró un mayor aumento respecto de su estado nativo (Figura 20). El alto contenido de grupos carbonilos observado en el CII nativo podría explicarse por la presencia de entrecruzamientos intramoleculares 329, de grupos amino glicosilados 330 y de PTP que contienen carbonilos y que están ausentes en la BSA. Figura 20. Concentración de grupos carbonilo en el CII y la BSA modificados con HOCl y ribosa y control. Las barras representan la media y el SEM de al menos 4 experimentos independientes. 4.2. VERIFICACIÓN DE LA NITRACIÓN La presencia de 3-NT en las PS nitradas se verificó mediante tres técnicas complementarias: espectrofotometría, ELISA y análisis de fluorescencia. El ensayo espectrofotométrico del estándar comercial mostró un pico ancho de máxima absorción a 420 nm. El espectro del FBS nitrado y de las PS nitradas también mostró un pico a 420 nm aunque éste no estaba tan definido como el del estándar 3-NT, probablemente en relación con la mayor complejidad de estas muestras. El FBS se modificó con varias concentraciones de agente nitrante (5, 10, 20 and 40 mM NaONO2) y posteriormente se cuantificaron los niveles de 3-NT interpolando en la recta patrón construida con el estándar comercial 3-NT. Los niveles de 3-NT en el FBS nitrado aumentaron al emplear 10 mM en vez de 5 mM de NaONO2 (13 ug 3-NT/mg vs. 5 ug 3-NT/mg, respectivamente). En cambio, concentraciones mayores de NaONO2 no resultaron en una mayor formación de 3-NT, lo que indica que con una concentración de 10 mM la nitración del FBS es óptima. Los niveles de 3-NT en el CTR-FBS fueron de 1 ug 3-NT/mg, considerablemente menores que en las muestras nitradas. Por lo tanto se utilizó esta concentración de NaONO2 para modificar las PS resultando en una concentración de 17.0 ug Lorena Rodríguez Martínez 124 3-NT/mg en comparación con los 5.5 ug 3-NT/mg de las PS sin tratar. La cuantificación realizada con el ELISA comercial que es más específico de la modificación mostró una mayor diferencia entre las PS tratadas y sin tratar, con un nivel de 3-NT en las PS nitradas de 22.0 ug 3-NT/mg y de 1.9 ug 3-NT/mg en las PS sin nitrar. El análisis de fluorescencia realizado proporcionó información complementaria sobre el proceso de nitración ya que refleja la presencia de tirosinas no modificadas (Figura 21). La intensidad de fluorescencia emitida por el FBS no modificado fue considerablemente superior a la registrada para el 3-NT-FBS, cuya emisión de fluorescencia fue similar a la del blanco. Esta completa disminución de la intensidad de fluorescencia indica que la mayoría de las tirosinas del FBS se han nitrado. Por el contrario, la nitración de las PS no produjo una disminución tan completa de la señal fluorescente correspondiente a la tirosina (Figura 21B). La presencia de este pico de emisión en las PS nitradas indica que una fracción significativa de las tirosinas no se modificó, probablemente porque se encuentran en un entorno químico no favorable. Figura 21. Espectros de emisión de fluorescencia específica de la tirosina de las muestras de FBS y de PS nitradas y nativas. El gráfico A muestra los espectros de emisión superpuestos del 3-NT- FBS, el CTR-FBS y el blanco. El gráfico B muestra los espectros de emisión superpuestos de las 3- NT-PS, el CTR-PS y el blanco. Se muestra un espectro representativo de cada muestra. Las muestras se analizaron por duplicado. RESULTADOS 125 4.3. VERIFICACIÓN DE LA HOMOCISTEINILACIÓN La cantidad de Hci incorporada a la HSA o a las proteínas sinoviales (PS) se evaluó por cuantificación de la S-adenosil-L-homocisteína (SAH). Las muestras control de HSA y PS estuvieron por debajo del límite de detección del ensayo. Las proteínas se incubaron con 0.4, 1.0 y 10 mM de L-Hci-tiolactona durante 16 h y con 0.4 mM L-Hci-tiolactona por 32 h. Ninguna condición fue mejor que la de 0.4 mM por 16 h para la HSA que incorporó 0.81 nmol Hci/mg sin degradación significativa. Sin embargo, las PS mostraron el máximo sin degradación al incubar con L-Hci-tiolactona a 1 mM dando lugar a 2.26 nmol Hci/mg. Esta preparación de PS fue la seleccionada como antígeno para los ELISA. 4.4. PREVALENCIA DE LOS ANTICUERPOS ANTI-CII CARBONILADO EN PACIENTES CON AR TEMPRANA Para el estudio de anticuerpos frente a especies carboniladas de CII (anti-CII carbonilado) se seleccionaron 182 pacientes con AR temprana y 164 controles del Hospital Clínico Universitario de Santiago. La inclusión únicamente de pacientes con AR temprana se debe a que los anticuerpos se describieron por primera vez en este tipo de pacientes 37. Además se comprobó que las características de las dos colecciones de pacientes eran bastante similares (Tabla 33). Tabla 33. Características clínicas de los pacientes con AR temprana incluidos en el estudio de los anticuerpos anti-CII carbonilado. El tiempo de evolución y la edad de diagnóstico se representan como la mediana y el IQR. El resto de variables se representan como porcentaje (%). El valor de P se muestra para la comparación entre las dos colecciones de pacientes. Dato disponible para < 98% de los pacientes del estudio actual: FAME previo 73%, erosiones 68.7%, FR 91.8% y anti-CarP 85.2%. El valor de P se muestra para la comparación entre las dos colecciones. na = no aplicable Características clínicas Estudio actual (n = 182) Strollo y col. (n = 85) P Edad, años 58 (48 – 71) 51 (22 – 70) na Tiempo de evolución, años 0 (0 – 1) <1 na Sin FAME previo 109 (82) 85 (100) 3.3x10-5 Mujeres 112 (62) 61 (72) 0.1 Fumadores 54 (30) - - Erosiones 17 (14) - - Anti-CCP, positivo 119 (65) 49 (58) 0.5 FR, positivo 94 (56) - - Anti-CarP, positivo 63 (41) - - Lorena Rodríguez Martínez 126 Como ya se ha descrito, se buscaron anticuerpos frente a CII carbonilado con HOCl (anti- HOCl-CII) o con ribosa (anti-GLI-CII) y se compararon con la inmunorreactividad frente a CII sin modificar (anti-CTR-CII) (Figura 22 y Tabla 34). Los resultados mostraron una frecuente reactividad frente al CII sin modificar que fue similar a la observada frente a HOCl- CII tanto en los controles como en los pacientes con AR y solo ligeramente inferior a la observada frente a GLI-CII. Además, la reactividad anti-CTR-CII fue significativamente mayor en los controles que en los pacientes. Estas características de la reactividad frente a CTR-CII afecta a la interpretación de las señales obtenidas frente a las dos formas carboniladas de CII. Por una parte, la reactividad frente a HOCl-CII fue un mero reflejo de la reactividad frente al CII sin modificar en la gran mayoría de las muestras estudiadas como se evidenció tras restar los valores frente a CTR-CII para obtener la señal específica. En cuanto a la reactividad frente a GLI-CII, se observó una cierta reactividad específica tras restar la reactividad frente a CTR-CII. Esta reactividad específica anti-GLI-CII fue significativamente mayor en los pacientes con AR que en los controles. Sin embargo, esta diferencia debe tomarse con mucha cautela por la pequeña magnitud de la señal y porque la reactividad frente a anti-GLI-CII sin corrección no fue diferente en pacientes y controles. Estos resultados contrastan considerablemente con los descritos por Strollo y col. 37: 92.9% pacientes positivos para los anticuerpos anti-HOCl-CII y 64.7% para los anticuerpos anti-GLI-CII. Tabla 34. Niveles de anticuerpos anti-CII carbonilado en pacientes con AR temprana y controles sanos. La reactividad se determinó empleando como antígeno HOCl-CII o GLI-CII y se expresa como la mediana de la señal en OD y el IQR. La corrección de la reactividad se realizó restando a la reactividad del antígeno modificado la reactividad del antígeno nativo CTR-CII. El valor de P se muestra para la comparación entre los controles sanos y los pacientes con AR temprana. Controles AR temprana Antígeno Corrección OD mediana IQR OD mediana IQR P CTR-CII - 0.174 0.147 – 0.201 0.143 0.128 – 0.169 5.0x10-9 HOCl-CII no 0.160 0.142 – 0.187 0.141 0.127 – 0.173 3.1x10-5 HOCl-CII sí -0.004 -0.020 – 0.005 -0.003 -0.011 – 0.008 0.01 GLI-CII no 0.221 0.163 – 0.305 0.234 0.171 – 0.285 0.5 GLI-CII sí 0.027 -0.010 – 0.099 0.072 0.016 – 0.115 3.1x10-4 RESULTADOS 127 Figura 22. Reactividad frente a CII carbonilado en pacientes con AR temprana y controles. La reactividad se determinó como se indica en la Tabla 34. El gráfico A muestra la reactividad medida como OD antes de corregir y el gráfico B muestra la reactividad específica después de corregir por la reactividad basal frente a CTR-CII. La línea roja representa la mediana del valor OD en cada grupo. Lorena Rodríguez Martínez 128 4.5. PREVALENCIA DE LOS ANTICUERPOS ANTI-PROTEÍNAS/PÉPTIDOS NITRADOS EN PACIENTES CON AR ESTABLECIDA Para el estudio de los anticuerpos anti-proteínas/péptidos nitrados (anti-Nitra) del isotipo IgG que reconocen la 3-NT se seleccionaron 57 controles sanos y 143 pacientes con AR establecida del Hospital Clínico Universitario de Santiago cuyas características se recogen en la Tabla 35. La mayoría de los pacientes eran mujeres, presentaban erosiones y eran seropositivos para los autoanticuerpos anti-CCP o FR. La prevalencia de fumadores fue baja, rasgo característico de los pacientes con AR de Santiago. Tabla 35. Características clínicas de los 143 pacientes con AR establecida seleccionados para estudiar los anticuerpos anti-proteínas/péptidos nitrados y anti-proteínas homocisteiniladas. Las variables de edad de diagnóstico y tiempo de evolución se representan como la mediana y el IQR mientras que el resto de variables se representan como porcentaje (%). Dato disponible para <98% de los pacientes: fumadores 90.9% y FR 96.5%. Caracteristicas clínicas AR Edad, años 61 (50 – 72) Tiempo de evolución de la enfermedad, años 11 (5 – 21) Mujeres 112 (78) Fumadores 23 (18) Erosiones 92 (66) Portador EC 87 (61) Anti-CCP positivo 97 (68) FR positivo 84 (61) Anti-CarP, positivo 48 (34) La reactividad frente a las PS nitradas (3-NT-PS) fue escasa, (Figura 23A y Tabla 36). Más en detalle, los niveles de anticuerpos frente a 3-NT-PS detectados en los pacientes con AR no fueron significativamente diferentes de los niveles detectados en los controles (Tabla 36). Además, la corrección por la señal frente al antígeno nativo (CTR-PS) resultó su práctica anulación (Figura 23B). En vista de estos resultados, se completó el estudio con el análisis de la reactividad frente a péptidos nitrados sintéticos (3-NT-pep). Los resultados mostraron algo de reactividad que fue más elevada en los pacientes que en los controles, tanto frente a los péptidos nitrados como frente a los péptidos control (Figura 23 y Tabla 36). La diferencia de reactividad frente a 3-NT-pep desapareció después de corregir por la señal frente a CTR-pep (Tabla 36). Por lo tanto, tampoco se observó reactividad específica frente a la nitración en el suero de los pacientes AR, replicando los hallazgos obtenidos con las PS nitradas. RESULTADOS 129 Figura 23. Reactividad frente a proteínas y péptidos nitrados en pacientes con AR y controles sanos incluidos en el presente estudio empleando 3-NT-PS o 3-NT-pep como antígenos. Los gráficos A y B muestran la reactividad medida como OD empleando como antígeno PS nitradas in vitro mientras que los gráficos C y D muestran la reactividad empleando como antígeno una mezcla de péptidos sintéticos nitrados. Los gráficos A y C muestran la reactividad antes de corregir por la reactividad basal de los correspondientes antígenos nativos. Los gráficos B y D muestran la reactividad específica después de corregir por la reactividad basal correspondiente. La línea roja representa la mediana del valor OD en cada grupo. Lorena Rodríguez Martínez 130 Tabla 36. Niveles de anticuerpos anti-Nitra en pacientes con AR establecida y controles sanos. La reactividad de los anticuerpos anti-Nitra se determinó empleando como antígeno 3-NT-PS o una mezcla de péptidos sintéticos nitrados (3-NT-pep) y se expresa como la mediana de la OD y el IQR. La corrección de la reactividad se realizó restando a la reactividad del antígeno nitrado la reactividad del antígeno nativo correspondiente. El valor de P se muestra para la comparación entre los controles sanos y los pacientes con AR. Controles AR Antígeno Corrección OD mediana IQR OD mediana IQR P CTR-PS - 0.020 0.008 – 0.026 0.022 0.009 – 0.033 0.1 3-NT-PS no 0.011 0.008 – 0.035 0.018 0.009 – 0.028 0.1 3-NT-PS sí 0.009 0.008 – 0.021 0.008 0.001 – 0.018 0.03 CTR-pep no 0.097 0.090 – 0.106 0.111 0.089 – 0.150 0.02 3-NT-pep no 0.209 0.190 – 0.230 0.250 0.201 – 0.329 0.02 3-NT-pep sí 0.113 0.100 – 0.133 0.137 0.097 – 0.185 0.1 4.6. PREVALENCIA DE LOS ANTICUERPOS ANTI-PROTEÍNAS HOMOCISTEINILADAS EN PACIENTES CON AR ESTABLECIDA Para el estudio de los anticuerpos anti-proteínas homocisteiniladas (anti-Hci) del isotipo IgG se emplearon los mismos controles sanos y pacientes con AR del estudio de los anticuerpos anti-Nitra (Tabla 35). Se analizó la reactividad frente a las PS homocisteiniladas (Hci-PS) y nativas (CTR-PS) en el suero de los pacientes con AR y de los controles. Los niveles de los anticuerpos fueron superiores en los pacientes en comparación con los controles tanto frente al antígeno modificado como frente al nativo (Figura 24A y Tabla 37), por lo que es imprescindible considerar los dos anticuerpos de forma conjunta. Otra característica notable es que la reactividad frente a CTR-PS fue mayor que frente a Hci-PS, tanto en los controles como en los pacientes, indicando que la reactividad detectada no es específica de la homocisteinilación. RESULTADOS 131 Figura 24. Reactividad frente a PS homocisteiniladas en pacientes con AR y controles sanos. El gráfico A muestra la reactividad medida como OD antes de corregir por la reactividad frente a CTRPS y el gráfico B muestra la reactividad específica después de la corrección. La línea roja representa la mediana del valor OD en cada grupo. Tabla 37. Niveles de anticuerpos anti-Hci-PS en pacientes con AR establecida y controles sanos. La reactividad de los anticuerpos anti-Hci-PS se expresa como la mediana de la OD y el IQR. La corrección de la reactividad se realizó restando a la reactividad del antígeno modificado la reactividad del antígeno nativo. El valor de P se muestra para la comparación entre los controles sanos y los pacientes con AR. Controles AR Antígeno Corrección OD mediana IQR OD mediana IQR P CTR-PS - 0.186 0.171 – 0.221 0.211 0.181 – 0.229 0.04 Hci-PS no 0.145 0.130 – 0.155 0.160 0.145 – 0.178 1.1x10-4 Hci-PS sí -0.038 -0.069 – -0.020 -0.041 -0.074 – -0.015 0.5 Lorena Rodríguez Martínez 132 4.7. RELACIÓN DE LOS ANTICUERPOS ANTI-CII CARBONILADO CON EL TRATAMIENTO Finalmente, hemos analizado si el tratamiento previo con FAME de los pacientes con AR temprana ha tenido una influencia sobre los niveles de anticuerpos anti-Carbo dado que la alta sensibilidad de estos anticuerpos se ha descrito en pacientes con AR temprana que no estaban tratados con FAME. La reactividad frente a HOCl-CII estuvo significativamente aumentada en los pacientes sin tratamiento con FAME (OD mediana [IQR] = 0.141 [0.129-0.169] vs. 0.137 [0.121-0.178]; P = 0.02, pacientes no tratados con FAME vs. tratados). Sin embargo, después de corregir por la reactividad frente a CTR-CII la situación fue la inversa, observándose una reactividad más alta en los pacientes tratados (OD mediana [IQR] = -0.005 [-0.014–0.004] vs. 0.004 [-0.005–0.012]; P = 0.004, pacientes no tratados con FAME vs. tratados). Contrariamente, no se observaron diferencias en la reactividad frente a GLI-CII antes y después de corregir entre los pacientes tratados con FAME y los no tratados (OD anti- GLI-CII sin corregir: mediana [IQR] = 0.245 [0.191-0.288] vs. 0.223 [0.160-0.274]; P = 0.2; OD anti-GLI-CII corregida: mediana [IQR] = 0.086 [0.026-0.123] vs. 0.073 [0.031-0.133]; P = 1.0, no tratados con FAME vs. tratados en todas las comparaciones). Adicionalmente, hemos comparado la reactividad frente al CII carbonilado entre los pacientes sin tratamiento con FAME y los controles sanos. Este análisis mostró que la reactividad frente a HOCl-CII fue significativamente más alta en los controles que en los pacientes no tratados (OD anti-HOCl-CII sin corregir: mediana [IQR] = 0.160 [0.142-0.187] vs. 0.141 [0.129-0.169]; P = 3.2x10-4, controles vs. pacientes no tratados con FAME), replicando los resultados obtenidos en todos los pacientes con AR temprana (Tabla 34). Sin embargo, esta diferencia desapareció después de corregir por la reactividad frente a CTR-CII (P = 1.0). En cambio, la reactividad frente a GLI-CII fue significativamente mayor en los pacientes no tratados con FAME en comparación con los controles sanos al considerar tanto los valores sin corregir como los corregidos (OD anti-GLI-CII sin corregir: mediana [IQR] = 0.221 [0.163-0.305] vs. 0.245 [0.191-0.288]; P = 0.02; OD anti-GLI-CII corregida: mediana [IQR] = 0.027 [-0.010–0.099] vs. 0.086 [0.026-0.123]; P = 2.4x10-5, controles sanos vs. no tratados con FAME en todas las comparaciones). De nuevo, este resultado replica los hallazgos obtenidos en todos los pacientes con AR temprana e indica que la falta de diferencias en la reactividad frente a GLI-CII detectada entre los controles sanos y el conjunto de pacientes con AR temprana (Tabla 34) es atribuible, al menos en parte, a la menor reactividad mostrada por los pacientes tratados.